MXPA98002384A - Citostatina ii - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a los péptidos moduladores del crecimiento de la citostatina II, a los polinucleótidos que codifican los polipéptidos, a los métodos para producir los polipéptidos, en particular por la expresión de los polinucleótidos, y a los agonistas y antagonistas de los polipéptidos. La invención se refiere además a los métodos para utilizar tales polinucleótidos, polipéptidos, agonistas y antagonistas para las aplicaciones las cuales están relacionadas, en parte, con las técnicas clínicas, de investigación y de diagnóstico.

Description

CITOSTATINA II Antecedentes de la Invención Esta invención se refiere, en parte, a polinucleótidos y polipéptidos identificados recientemente; a variantes y derivados de los polinucleótidos y polipéptidos; a procesos para fabricar los polinucleótidos y los polipéptidos, y a sus variantes y derivados; a los agonistas y antagonistas de los polipéptidos; y a los usos de los polinucleótidos, polipéptidos, variantes, derivados, agonistas y antagonistas. En particular, en estos y otros aspectos, la invención se refiere a los polinucleótidos y polipéptidos de la citostatina II humana.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El crecimiento y la diferenciación de las células y el desarrollo de los tejidos y las glándulas es controlado por factores autocrinos y paracrinos, tales como, tales como factores y hormonas sistémicos o sistemáticos que modulan o tienen un papel mediador en la acción de las hormonas, tales como los factores del crecimiento, los cuales por si mismos pueden ser las hormonas. Ref.27137 Por ejemplo, los péptidos que hacen terminar el crecimiento de la señal localmente y que estimulan la diferenciación de las células del epitelio en desarrollo, son muy importantes para el desarrollo de la glándula mamaria. Estos factores no han sido identificados o caracterizados ampliamente, de manera particular no en los seres humanos. Una cantidad pequeña de los factores que desempeñan un papel en la mediación humoral del crecimiento y diferenciación de las células en los tejidos y las glándulas, de las glándulas mamarias en particular, ha sido identificada en los organismos no humanos. Uno de tales factores es el inhibidor del crecimiento derivado de las glándulas mamarias ("MDGI"), el cual, el menos en los ratones y las vacas, inhibe el crecimiento de las células epiteliales y estimula la diferenciación de las células epiteliales. El MDGI se identificó primero en la leche y las glándulas mamarias de las vacas. Subsiguientemente, se identificó en los ratones. El MDGI está presente en al menos dos formas producidas por rutas alternativas de procesamiento pos-translacional. La forma original es referida como un MDGI y la segunda forma es llamada MDGI-2. El MDGI está asociado principalmente con las membranas de los glóbulos grasos de la leche ("MFGM"), como es evaluado por los ensayos inmunológicos que utilizan los anticuerpos anti-MDGI. Los estudios del transcurso del tiempo similares, muestran que la MDGI se incrementa dramáticamente en las glándulas mamarias cuando se inicia la lactancia, a continuación del suministro. El MGDI-2 difiere del MDGI a este respecto. El mismo se encontró en las glándulas mamarias durante el embarazo pero no durante la lactancia. Los papeles de las dos formas de MGDI y su(s) mecanismo (s) de acción no están definidos claramente. El MDGI del ratón y del bovino son homólogos entre si y con respecto a la familia de las proteínas de unión del ligando hidrofóbico de masa molecular baja ("HLBP(s) de PM bajo") las cuales incluyen proteínas de unión del ácido graso ("FABP(s)") del cerebro, el corazón, el hígado y el intestino, la proteina P2 de la mielina, la diferenciación de la proteina asociada de los adipocitos llamados gastrotropina p422 y la proteina de unión del ácido retinóico ("CRABP") . Estas proteínas, las cuales unen los ligandos hidrofóbicos tales como los ácidos grasos de cadena larga, los retinoides y los eiconsanoides, se piensa que desempeñan papeles en el transporte, secuestro, o metabolismo de los ácidos grasos y los derivados del ácido graso. Sin embargo, los mismos son expresados en una manera específica de diferenciación, en las células de la glándula mamaria, el corazón, el hígado, el cerebro y el intestino, y los mismos parece que no solamente desempeñan papeles en el metabolismo basal sino que también tienen papeles importantes en la diferenciación y el desarrollo. La homología del MDGI con respecto a los HHLBPs de PM bajo eleva la posibilidad de que el MDGI, al menos como parte de su función, se una al ligando hidrofóbico, y está unión a este ligando es importante para los mecanismos por los cuales el MDGI inhibe el crecimiento celular y estimula la diferenciación; aunque todos los otros HLBPs de PM bajo excepto la gastrotropina, actúan intracelularmente, mientras que el MDGI actúa extracelularmente, in vitro. Entre los HLBPs de PM bajo, el MDGI se asemeja más estrechamente a las proteínas de unión del ácido graso {"FABP") . Los FABPs han sido identificados en el cerebro, el corazón, el hígado y el intestino. El FABP del corazón, en forma semejante al MDGI, ya sea producidos a partir de recursos naturales o por la expresión de un gen clonado en un huésped heterólogo, inhibe el crecimiento de las células epiteliales mamarias normales ("MEC") del origen del ratón. Además, el mismo estimula la síntesis de la proteína de la leche y estimula su propia expresión en estas células. Sin embargo, a diferencia del FABP del corazón del bovino, el MDGI del bovino no se une a los ácidos grasos, aunque las dos proteínas s,on 95% homologas y se ha sugerido que el FABP del corazón realmente puede ser de una forma de MDGI. Por consiguiente, aún si el MDGI es un HLBP de PM bajo, sus afinidades del substrato son distintas de sus miembros relativos cercanos en la familia, y por lo tanto desempeñan probablemente un papel fisiológico diferente. El MDGI in vivo se encuentra en las células endoteliales capilares y en el parénquima mamaria, en los ratones y ls vacas. El MDGI aparece primero en las células endoteliales capilares y por último en las células epiteliales secretorias. La localización del MDGI en el endotelio capilar mamario es consistente con un papel en la regulación de la proliferación de las células endoteliales. Varias de las actividades de MDGI han sido demostradas in vitro. Por ejemplo, se ha demostrado que el MDGI inhibe la supersensibilidad inducida por el L (+) -lactato-, ácido araquidónico- y ácido 15-S-hidroxieicosatetranóico, de las células del corazón de la rata neonatal con respecto a la estimulación beta-adrenérgica. La hipersensiblidad inducida es mediada por una población pequeña de los receptores 2-adrenérgicos y, por lo tanto, se ha sugerido que el MDGI interfiere con la función normal de estos receptores. La interacción con estos receptores también puede ser parte del mecanismo por el cual el MDGI inhibe el crecimiento de las células.

Esta actividad . también eleva la posibilidad de que el MDGI module naturalmente la sensibilidad beta-adrenérgica de los miocitos cardiacos. El efecto del MDGI en la diferenciación de las células epiteliales mamarias ("MEC") ha sido demostrada adicionalmente por experimentos de inhibición antisentido que utilizan los oligonucleótidos de fosforotioato. Estos experimentos muestran que las moléculas antisentido de MDGI reducen los niveles de la beta-caseína y suprimen la aparición de las yemas de los extremos alveolares en los cultivos orgánicos. Además, el MDGI suprime los efectos mitogénicos del factor de crecimiento epidérmico, y el factor de crecimiento epidérmico antagoniza las actividades del MDGI. El MDGI es el primer inhibidor del crecimiento conocido que promueve la diferenciación de las glándulas mamarias. Las propiedades reguladoras del MDGI pueden ser minimizadas completamente por una secuencia de 11 aminoácidos, la cual está representada en el extremo o terminal de carboxilo del MDGI y una subfamilia de los HLBPs de PM bajo. No todas las líneas celulares epiteliales mamarias responden al MDGI de la misma manera. El MDGF inhibe el crecimiento del MEC humano normal, que se ha hecho pasar durante períodos de tiempo variables. El mismo también inhibe el crecimiento de las mMaCa 20177 de las líneas celulares epiteliales malignas mamarias del ratón, las líneas celulares mamarias MaTu y T47D malignas del ser humano e inhibe la reanudación del crecimiento de las células del carcinoma de ascitis de Ehrlich estacionarias ("EAC") in vitro. En contraste, el MDGF estimula ligeramente el crecimiento de la línea celular epitelial mamaria MCF7 maligna, humana. Finalmente, el MDGI promueve la diferenciación de las células del tallo embriónico pluripotentes del ratón. El mecanismo de los efectos del MDGI sobre las células no es conocido todavía. La reanudación del crecimiento de las células del carcinoma de ascitis de Ehrlich ("EAC") estacionarias, in vitro, es efectuada por un incremento rápido en el ARNm de c-fos, c-myc y c-ras celulares. La inducción rápida de estos genes durante la exposición al MDGI, acentúa la importancia de la expresión oncógena con respecto a la regulación del crecimiento y pone de manifiesto una correlación positiva entre el crecimiento de la célula y la expresión de c-fos, c-myc y c-ras. Además, el efecto del MDGI sobre la expresión de estos genes indica que el mismo es un efecto positivo de la expresión protooncógena celular, ya sea directamente o a través de una o más rutas de señalización, o ambas. También se ha mostrado que el MDGI puede funcionar como un gen supresor potente de los tumores.

Las células del cáncer del pecho, humanas, transfectadas con una construcción de expresión de MDGI exhibieron una morfología diferenciada, una velocidad de proliferación reducida, una clonogenicidad reducida en el agar blando o suave, y redujeron la tumorgenicidad en el ratón desnudo. Al homólogo humano de este gen se le asignaron coordenadas con respecto al cromosoma lp33-35, un sitio que se mostró previamente que exhibe una pérdida frecuente de heterozigosidad en el cáncer del pecho humano (aproximadamente 40% de los tumores) . La magnitud de la actividad supresora de los tumores in vivo e in vitro del MDGI es comparable con aquella observada previamente para BRCA1, p53, Rb, y H19. Los efectos del MDGF sobre el crecimiento y la diferenciación celular, y sobre la expresión del protooncógeno celular, reitera la importancia de los factores solubles en el crecimiento y diferenciación normal de las células, los tejidos, las glándulas y los órganos, y sus papeles en el crecimiento de las células aberrantes, la disfunción y la enfermedad. Claramente, existe una necesidad de factores que regulan el crecimiento y la diferenciación de las células normales y anormales. Por lo tanto existe una necesidad de la identificación y caracterización de factores tales que modulen el crecimiento y la diferenciación de las células, tanto normalmente como en los estados de enfermedad. En particular, existe una necesidad de aislar y caracterizar citostatinas adicionales que modulen el crecimiento y la diferenciación de las células tales como las células epiteliales, particularmente las células epiteliales mamarias, que son esenciales para el desarrollo apropiado y la salud de los tejidos y los órganos tales como las glándulas mamarias de mujeres humanas adultas y en desarrollo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Para estos fines y otros, es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos, inter alia, que han sido identificados como citostatinas novedosas, por la homología con respecto a las citostatinas conocidas, tales como MDGI, de la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 1. Es un objeto adicional de la invención, además, proporcionar polinucleótidos que codifican las citostatinas, particularmente polinucleótidos que codifican el polipéptido designado aquí citos'tatina II. En una modalidad preferida particularmente de este aspecto de la invención, el polinucleótido comprende la región que codifica la citostatina II humana en la secuencia descrita en la figura 1 o en el ADNc en el depósito No. 97.287 del ATCC (referido aquí como el clon depositado) . De acuerdo con este aspecto de la invención se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la citostatina II humana, incluyendo los ARNms, ADNs, ADNcs, ADNs genómicos y, en las modalidades adicionales de este aspecto de la invención, las variantes, análogos o derivados de los mismos útiles biológica, diagnóstica, clínica o terapéuticamente, incluyendo los fragmentos de las variantes, los análogos y los derivados. Entre las modalidades preferidas particularmente de este aspecto de la invención están las variantes alélicas que están presentes en forma natural, de la citostatina II humana. También es un objeto de la invención proporcionar polipéptidos de la citostatina II, particularmente los polipéptidos de la citostatina II humana, que modulan la actividad de crecimiento de las células epiteliales. De acuerdo con este aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos novedosos de origen humano, referidos aquí como la citostatina II así como los fragmentos, variantes, homólogos, análogos, y derivados de los mismo, útiles biológica, diagnóstica o terapéuticamente .

Entre, las modalidades preferidas particularmente de este aspecto de la invención están las variantes de la citostatina II humana codificada por los alelos que están presentes en forma natural del gen de la citostatina II humana. Es otro objeto de la invención proporcionar un proceso para producir los polipéptidos, las variantes de los fragmentos de polipéptidos, los análogos, los derivados y los fragmentos de los mismos. En una modalidad preferida de este aspecto de la invención, se proporcionan métodos para producir los polipéptidos de citostatina II mencionados anteriormente, que comprenden cultivar las células huésped que tienen expresamente incorporado en las mismas el polinucleótido que codifica la citostatina II humana derivada exógenamente, bajo condiciones para la expresión de la citostatina humana II en el huésped y luego recuperar el polipéptido expresado. Es otro objeto de la invención proporcionar productos, composiciones, procesos y métodos para utilizar los polipéptidos y polinucleótidos mencionados anteriormente para propósitos biológicos, clínicos y terapéuticos, inter alia. De acuerdo con ciertas modalidades preferidas de este aspecto de la invención, se proporcionan métodos para, entre otras cosas: modular el crecimiento de las células in vitro, ex vivo o in vivo; evaluar la expresión de la citostatina II determinando la proteína o la ARNm; y evaluar la variación y las aberraciones genéticas, tales como los defectos, en los genes de la citostatina II. De acuerdo con ciertas modalidades preferidas de este y otros aspectos de la invención, se proporcionan sondas que se hibridizan específicamente a las secuencias de la citostatina II humana. En ciertas modalidades preferidas adicionales de este aspecto de la invención, se proporcionan anticuerpos contra los polipéptidos de la citostatina II. En ciertas modalidades preferidas particularmente a este respecto, los anticuerpos son altamente selectivos para la citostatina II humana. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan agonistas de la citostatina II, tales como aquellas las cuales minimizan la citostatina II, se unen a los receptores de la citostatina II y producen las respuestas inducidas por la citostatina II. También entre tales agonistas están aquellos los cuales interactúan con la citostatina II, o con otros moduladores o receptores, y por lo cual se potencian los efectos de la citostatina II humana. De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se proporcionan antagonistas de la citostatina II,. tales como aquellos los cuales minimizan la citostatina II, se unen a los receptores de la citostatina II pero no producen las respuestas inducidas por la citostatina II, y aquellos que se unen a, o interactúan con la citostatina II humana para inhibir sus efectos. Los agonistas y antagonistas pueden ser utilizados para minimizar, aumentar o inhibir la acción de tales polipéptidos, por ejemplo, y los mismos pueden ser utilizados en el tratamiento de los desórdenes asociados con el crecimiento aberrante de las células afectadas por las citostatinas, particularmente la citostatina II. Otros objetos, características, ventajas y aspectos de la presente invención llegarán a ser evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la siguiente descripción. Se debe sobreentender, sin embargo, que la siguiente descripción y los ejemplos específicos, aunque indican modalidades preferidas de la invención, se dan solamente a manera de ilustración. Varios cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención descrita llegarán a ser fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la lectura de la siguiente descripción y 'de la lectura de las otras partes de la presente descripción.

Breve Descripción de los Dibujos Los siguientes dibujos muestras ciertas modalidades de la invención. Las mismas son solamente ilustrativas y no limitan la invención de otra manera descrita aquí. La Figura 1 muestra el nucléotido y la secuencia de aminoácidos deducida de la citostatina II humana.

GLOSARIO Las siguientes explicaciones ilustrativas son provistas para facilitar el entendimiento de ciertos términos utilizados frecuentemente aquí, particularmente en los ejemplos. Las explicaciones son provistas como una conveniencia y no como una limitación de la invención.

La DIGESTIÓN del ADN se refiere al desdoblamiento catalítico del ADN con una enzima de restricción que actúa solamente en ciertas secuencias en el ADN. Las diversas enzimas de restricción referidas aquí están disponibles comercialmente y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos para su uso ya son conocidas y rutinarias para el artesano experto. Para propósitos analíticos, típicamente 1 µg del plásmido o fragmento de ADN es digerido con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 µl de la solución amortiguadora. Con el propósito de aislar los fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, típicamente 5 a 50 µg del ADN son diferidos con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen proporcionalmente más grande. Los amortiguadores apropiados y las cantidades del substrato para las enzimas de restricción particulares se describen en los manuales de laboratorio estándares, tales como aquellos referidos posteriormente, y los mismos son especificados por los proveedores comerciales. Los tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37 °C son utilizados ordinariamente, pero las condiciones pueden variar de acuerdo con los procedimientos estándares, las instrucciones del proveedor y los tópicos particulares de la reacción. Después de la digestión, las reacciones pueden ser sometidas a electrofóresis directamente sobre un gel de poliacrilamida para el análisis o para aislar un fragmento deseado o para ambos propósitos. ELEMENTO GENÉTICO significa generalmente un polinucleótido que comprende una región que codifica un polipéptido o una región que regula la transcripción o translación u otros procesos importantes para la expresión del polipéptido en una célula huésped, o un polinucleótido que comprende tanto una región que codifica un palipéptido como una región que regula la expresión. Los elementos genéticos pueden estar comprendidos dentro de un vector que se replica como un elemento episomal; es decir, como una molécula independiente físicamente del genoma de la célula huésped. Los elementos pueden estar comprendidos dentro de los minimicrosomas, tales como aquellos que surgen durante la amplificación del ADN transfectado por la selección del metotrexato en las células eucarióticas.' Los elementos genéticos también pueden estar comprendidos dentro de un genoma de la célula huésped; no en su estado natural sino, más bien, a continuación de la manipulación tal como el aislamiento, clonación e introducción en una célula huésped en la forma del ADN purificado o en un vector, entre otros. AISLADO significa que el material ha sido alterado desde su estado natural; por ejemplo, si el mismo está presente en la naturaleza, que ha sido removido de su medio ambiente original. Por ejemplo, un polinucleótido que está presente en forma natural o un polipéptido que está presente en forma natural en un animal vivo en su estado natural, no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido separado de algunos o de la totalidad de los materiales coexistentes en el sistema natural está "aislado" cuando el término es empleado aquí.

Como . parte de, o a continuación del aislamiento, tales polinucleótidos pueden ser unidos a otros polinucleótidos, tales como los ADNs, para la mutagénesis, para formar proteínas de fusión, y para la propagación o expresión en un huésped, .por ejemplo. Los polinucleótidos aislados, solos o unidos a otros polinucleótidos tales como vectores, pueden ser introducidos en las células huésped, en cultivos o en organismos enteros. Introducidos en las células huésped en cultivo o en organismos enteros, tales ADNs todavía podrían ser aislados, cuando el término es utilizado aquí, a causa de que los mismos podrían no estar en su forma que está presente en forma natural o en su medio ambiente. En forma similar, los polinucleótidos y los polipéptidos pueden estar presentes en una composición, tal como uen formulación del medio, soluciones para la introducción de polinucleótidos o polipéptidos, por ejemplo, en células, composiciones o soluciones para reacciones químicas o enzimáticas, por ejemplo, las cuales son composiciones que no están presentes en forma natural, y, en las mismas permanecieron polinucleótidos o polipéptidos aislados dentro del significado de este término cuando los mismos son empleados aquí. LIGAMIENTO o UNION se refiere al proceso de formar uniones de fosforodiéster entre dos o más polinucleótidos, los cuales más frecuentemente son ADNs de doble hebra., Las técnicas para la ligación o unión son bien conocidas en el arte y los protocolos para la ligación o unión se describen en los manuales de laboratorio y referencias estándares, tales como, por ejemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2/a. Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) y Maniatis et al., página 146, como se cita posteriormente. OLIGONUCLEÓTIDO(S) se refiere a polinucleótidos relativamente cortos. Más frecuentemente los términos se refieren a desoxirribonucleótidos de una sola hebra, pero se puede referir también a ribonucleótidos de una sola hebra o de doble hebra, a híbridos de ARN:ADN cortos y a ADNs de doble hebra, cortos, entre otros. Los oligonucleótidos, tales como los oligonucleótidos de la sonda de ADN de una sola hebra, frecuentemente son sintetizados por métodos químicos, tales como aquellos implementados sobre sintetizadores de oligonucleótidos automatizados. Sin embargo, los oligonucleótidos se pueden hacer por una variedad de otros métodos, incluyendo las técnicas mediadas por el ADN recombinante in vitro y por la expresión de los ADNs en las células y los organismos. Inicialmente, los ADNs sintetizados químicamente son obtenidos sin un fosfato en 5' . Los extremos 5' de tales oligonucleótidos no son substratos para la formación de la unión de fosforodiéster por las reacciones de ligación o unión que emplean las ligasas de ADN utilizadas para formar las moléculas de ADN recombinantes. En donde la ligación o unión de tales oligonucleótidos es deseada, se puede agregar un fosfato por técnicas estándares, tales como aquellas que emplean una cinasa y ATP. Los extremos 3' de los oligonucleótidos sintetizados químicamente, generalmente tienen un grupo hidróxilo libre y, en la presencia de una ligasa, tales como la ligasa de ADN de T4, forman fácilmente enlaces de fosforodiéster con el fosfato de 5' de otros polinucleótidos. Como se sabe bien, esta reacción puede ser prevenida, en donde se desee, por la desfosforilación en 5' de otros polinucleótidos en una reacción. Los PLÁSMIDOS son designados generalmente aquí por una p de subíndice precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números, de acuerdo con las convenciones de nomenclatura estándares que son familiares para aquellos expertos en la técnica. Partiendo de que los plásmidos descritos están ya sea disponibles comercialmente, disponibles públicamente sobre una base no restringida, o pueden ser construidos a partir de los plásmidos disponibles por la aplicación de rutina de los procedimientos publicados, bien conocidos. Muchos plásmidos y otros vectores de clonación y de expresión que pueden ser, utilizados de acuerdo con la presente invención son bien conocidos y están fácilmente disponibles para aquellos expertos en la técnica. Además, aquellos expertos en la técnica pueden construir fácilmente cualquier número de otros plásmidos adecuados para su uso en la invención. Las propiedades, la construcción y el uso de tales plásmidos, así como otros vectores, en la presente invención, serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la presente descripción. Los POLINUCLEÓTIDO(s) se refieren generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, el cual puede ser un ARN o ADN no modificado, o ADN o ARN modificado. Por consiguiente, por ejemplo, los polinucleótidos son utilizados aquí para referirse a, entre otros, ADN de una sola hebra y de doble hebra, el ADN es una mezcla de las regiones de una sola hebra y de doble -hebra, ADN de una sola hebra y de doble hebra, y ARN que es una mezcla de regiones de una sola hebra y de doble hebra, las moléculas híbridas que comprenden el ADN y el ARN que pueden ser de una sola hebra o, más típicamente, de doble hebra o una mezcla de las regiones de una sola hebra y de doble hebra. Además, el polinucleótido como se utiliza aquí se refiere a regiones de triple hebra que comprenden el ARN o el ADN o tanto el ARN como el ADN. Las hebras en tales regiones, pueden ser de la misma molécula o de moléculas diferentes. Las regiones pueden incluir la totalidad de una o más de las moléculas, pero más típicamente involucran solamente una región de alguna de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice frecuentemente es un oligonucleótido. Cuando se utilice aquí, el término polinucleótido incluye los ADNs o los ARNs que se describieron anteriormente, que contienen una o más bases modificadas. Por consiguiente, ADNs o ARNs con esqueletos modificados por razones de estabilidad o por otras razones, son "polinucleótidos" como este término está propuesto aquí. Además, los ADNs o ARNs que comprenden bases inusuales, tales como la inosina, o las bases modificadas, tales como las bases tritiladas, por nombrar solo dos ejemplos, son polinucleótidos cuando se utiliza el término aquí. Será apreciado que una gran variedad de modificaciones se han hecho al ADN o al ARN que sirven a muchos propósitos útiles conocidos por aquellos expertos en la técnica. El término polinucleótido cuando se emplea aquí abarca tanto formas modificadas química, enzimática o metabólicamente de los polinucleótidos, como las formas químicas del ADN o ARN característico de los virus y las células, incluyendo células simples y complejas, inter alia.

Descripción de la Invención La presente invención se refiere a nuevos polipéptidos y polinucleótidos de la citostatina II, entre otras cosas, como se describe con mayor detalle posteriormente. En particular, la invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos de una nueva citostatina II humana, la cual está relacionada por una homología de la secuencia de aminoácidos con el inhibidor del crecimiento derivado de la glándula mamaria ("MDGF") encontrado en las vacas y los ratones. La invención se refiere especialmente a las secuencias de aminoácidos y de polinucleótidos de la citostatina II descritos en la Figura 1.

Polinucleótidos De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan polinucleótidos aislados los cuales codifican el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 o el polipéptido maduro codificado por el ADNc humano en el depósito No. 97287 del ATCC referido aquí como el "clon depositado". Utilizando la información provista aquí, tal como la secuencia de polinucleótidos descrita en la Figura 1, un pßlinucleótido de la presente invención que codifica el polipéptido de la citostatina II humana puede ser obtenido utilizando procedimientos de clonación y selección estándares, tales como aquellos para la clonación de los ADNcs que utilizan el ARNm de las células epiteliales como el material de partida. Ilustrativo de la invención, el polinucleótido descrito en la Figura 1 se descubrió en una biblioteca de ADNc derivada del ARNm del tejido del cerebro fetal humano. La citostatina II humana de la invención está relacionada estrechamente con otras proteínas de la familia de la citostatina de los factores moduladores del crecimiento, como se muestra por los resultados del secuenciamiento del ADNc que codifica la citostatina II humana en el Depósito No. 97287 del ATCC. Esta secuencia de ADNc, descrita en la Figura 1, contiene un marco de lectura abierta que codifica una proteína de aproximadamente 132 residuos de aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 14.8 kDa. La proteína exhibe el grado más elevado de homología hacia el inhibidor del crecimiento derivado de la glándula mamaria del ratón (también llamado "MDGI"), con el cual el mismo comparte una identidad del 64% y una similaridad del 79% sobre una longitud de 132 aminoácidos. Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en la forma del ARN, tal como el ARNm, o en la forma del APN, incluyendo, por ejemplo, el ADNc y el ADN genómico obtenido por la clonación o producida por las técnicas sintéticas químicas o por una combinación de las mismas. El ADN puede ser de una sola hebra o de doble hebra, y si es de una sola hebra puede ser la hebra de codificación o la hebra no codificadora (antisentido) . Los polinucleótidos pueden tener secuencias que están presentes en forma natural, tales como aquellas de las variantes alélicas que están presentes en forma natural, s las mismas pueden tener las secuencias que han sido alteradas, por ejemplo, por técnicas de mutagénesis in vitro. La secuencia de codificación la cual codifica el polipéptido puede ser idéntica a la secuencia de codificación del polinucleótido mostrado en la Figura 1 o aquella del clon depositado. La misma también puede ser un polinucleótido con una secuencia diferente, la cual, co o un resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, codifica el polipéptido del ADN de la Figura 1 o del ADNc depositado. Los polinucleótidos de la presente invención los cuales codifican el polipéptido de la Figura 1 o el polipéptido codificado por el ADNc depositado pueden incluir, pero no están limitado a la secuencia de codificación para el polipéptido maduro, por sí mismo; la secuencia de codificación para el polipéptido maduro y las secuencias . de codificación adicionales, tales como aquellas que codifican una secuencia delantera o secretoria, tal como una secuencia pre-, o pro- o preproproteína; la secuencia de codificación del polipéptido maduro, con o sin las secuencias de codificación adicionales mencionadas anteriormente, junto con secuencias no codificadoras, adicionales, que incluyen por ejemplo, pero que no están limitadas a intrones y secuencias no codificadoras 5' y 3' , tales como las secuencias no transladadas o traducidas, transcritas, que desempeñan un papel en la transcripción, el procesamiento del ARNm - incluyendo las señales de separación y de poliadenilación, por ejemplo - la unión del ribosoma y la estabilidad del ARNm. De acuerdo con lo anterior, el término "polinucleótido que codifica un polipéptido" cuando se utiliza aquí, abarca polinucleótidos los cuales incluyen una secuencia que codifica un polipéptido de la presente invención, particularmente la citostatina II humana que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 1 o la secuencia de aminoácidos de la citostatina II humana codificada por el ADNc en el ATCC No. 97287. El término abarca los polinucleótidos que incluyen una región continua única o las regiones discontinuas que codifican el polipéptido, junto con regiones adicionales que también pueden .contener secuencias de codificación o de ns codificación. La presente invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente aquí, los cuales codifican para fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 o el polipéptido codificado por el ADNc del clon depositado. Una variante del polinucleótido puede ser una variante que está presente en forma natural, tal como una variante alélica que está presente en forma natural, o la misma puede ser una variante que no se sabe que está presente en forma natural. Tales variantes que no están presentes en forma natural de los polinucleótidos, se pueden hacer por técnicas de mutagénesis, incluyendo aquellas aplicadas a los polinucleótidos, células u organismos. La presente invención incluye polinucleótidos que codifican el mismo polipéptido maduro que se muestra en la Figura 1 o el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc del clon depositado. Además, la invención incluye variantes de tales polinucleótidos que codifican un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 o el polipéptido codificado por el ADNc del clon depositado. Entre las variantes a este respecto están las variantes que difieren de los polinucleótidos mencionados anteriormente por las substituciones, deleciones o adiciones de nucleótidos. Las substituciones, deleciones o adiciones pueden involucrar uno o más nucleótidos. Las variantes pueden ser alteradas en las regiones de codificación o de no codificación o en ambas. Las alteraciones en las regiones de codificación pueden producir substituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos, conservadoras o no conservadoras. Las variantes de la invención pueden tener una secuencia que está presente en la naturaleza o las mismas pueden tener una secuencia que no está presente en forma natural. Como se indicó aquí anteriormente, el polinucleótido puede tener una secuencia de codificación la cual es una variante alélica que está presente en forma natural, de la secuencia de codificación mostrada en la Figura 1 o de la secuencia de codificación del clon depositado. Como se sabe en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótidos la cual puede tener una substitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos. Entre las modalidades preferidas particularmente de la invención a este respecto están los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de la citostatina II descrita en la Figura 1 o la secuencia de aminoácidos de la citostatina II del ADNc del clon depositado; las variantes, análogos, derivados y fragmentos de los mismos, y los -fragmentos de las variantes, análogos y derivados. Adicionalmente, son particularmente preferidos a este respecto los polinucleótidos que codifican las variantes, análogos, derivados y fragmentos de la citostatina II, y las variantes, análogos y derivados de los fragmentos, los cuales tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la citostatina II de la Figura 1 o del depósito en el cual varios, un valor pequeño de 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácidos están substituidos, delecionados o agregados, en cualquier combinación. Son especialmente preferidos entre estos las substituciones, adiciones y deleciones inactivas, las cuales no alteran las propiedades y actividades de la citostatina II. También se prefieren especialmente a este respecto las substituciones conservadoras. Se prefieren más altamente los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 o del depósito, sin substituciones. Las modalidades preferidas adicionalmente de la invención son los polinucleótidos que son más del 85% idénticos a un polinucleótido que codifica al polipéptido de la citostatina II que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la Figura 1, o las variantes, homólogos estrechos, derivados y análogos de los mismos, como se describió anteriormente. Alternativamente, se prefieren más- altamente los polinucleótidos que comprenden una región que es más del 85% idéntica a un polinucleótido que codifica el polipéptido de la citostatina II del ADNc del clon depositado. A este respecto, los polinucleótidos que son más del 90% idénticos al mismo son particularmente preferidos, y entre estos polinucleótidos preferidos particularmente, aquellos con 95% o más de identidad son especialmente preferidos. Además, aquellos con 97% o más de identidad son altamente preferidos entre aquellos con 95% o más de identidad, y entre éstos, aquellos con 98% o más y 99% o más de identidad son altamente preferidos de manera particular, con 99% o más que es más preferido. También son particularmente preferidos a este respecto los polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de la citostatina descrita en la Figura 1 o del clon depositado. Como se describe en otra parte aquí, el polinucleótido puede codificar el polipéptido en una región continua o en una pluralidad de dos o más exones discontinuos, y el mismo puede comprender también regiones adicionales, las cuales no están relacionadas con la región o las regiones de codificación. Son más altamente preferidos a este respecto los polinucleótidos que comprenden una región que es más del 85% idéntica a la porción que codifica la citostatina II del polirucleótido descrito en la Figura 1. Alternativamente, son más altamente preferidos los polinucleótidos que comprenden una región que es más del 85% idéntica a la porción que codifica la citostatina II del ADNc del clon depositado. Entre tales polinucleótidos, aquellos más del 90% idénticos a los mismos son particularmente preferidos, y, entre estos polinucleótidos preferidos particularmente, aquellos con 95% o más de identidad son especialmente preferidos. Además, aquellos con 97% o más de identidad son altamente preferidos entre aquellos con 95% o más de identidad, y entre estos aquellos con 98% o más y 99% o más de identidad son altamente preferidos de manera particular, con el 99% o más que es el más preferido de estos. La presente invención también incluye los polinucleótidos en los cuales la secuencia que codifica el polipéptido maduro es fusionada en el mismo marco de lectura con respecto a las secuencias adicionales. Tales secuencias incluyen las secuencias de la señal, las cuales facilitan el transporte de la proteína naciente en del retículo endoplásmico, las prosecuencias están asociadas con las formas precursoras inactivas del polipéptido, las cuales pueden facilitar el tráfico de la proteína en una célula o fuera de una célula o pueden mejorar la persistencia de la proteína en una célula o en un compartimiento extracelular. Tales secuencias también pueden ser agregadas para facilitar la producción y la purificación, o para agregar dominios funcionales adicionales, como se describe en otra parte aquí. Por consiguiente, los polinucleótidos de la invención pueden codificar, además de una citostina madura, particularmente la citostatina II, por ejemplo, una secuencia delantera o directora, tal como un péptido de la señal el cual funciona como una secuencia secretoria para controlar el transporte del polipéptido hacia el lumen del retículo endoplásmico. La secuencia delantera o directora puede ser removida de la célula huésped, como es generalmente el caso para los péptidos de la señal, produciendo otra proteína precursora o el polipéptido maduro. Una proteína precursora que tiene una secuencia delantera frecuentemente es llamada una preproteína. Los polinucleótidos también pueden codificar un polipéptido el cual es la proteína madura más los aminoácidos de la terminal de amino o de carboxilo adicionales, o los aminoácidos interiores al polipéptido maduro (cuando la forma madura tiene más de una cadena de polipéptidos, por ejemplo) . Tales secuencias pueden desempeñar un papel en el procesamiento de una proteína del precursor hasta una forma madura, pueden facilitar el tráfico o transporte de la proteína, pueden prolongar o acortar la vida media de la proteína o pueden facilitar la manipulación* de una proteína para la evaluación o la producción, entre otras cosas. Como es generalmente el caso in situ, los aminoácidos adicionales pueden ser procesados aparte de la proteína madura por las enzimas celulares. Una proteína precursora, que tiene la forma madura del polipéptido fusionado a una o más prosecuencias, puede ser una forma inactiva del polipéptido. Cuando las prosecuencias son removidas, tales precursores inactivos generalmente son activados. Algunas o la totalidad de las prosecuencias pueden ser removidas antes de la activación. En general, tales precursores son llamados proproteínas. En resumen, un polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína madura, una proteína madura más una secuencia delantera o directora (la cual puede ser referida como una preproteína), un precursor de una proteína madura que tiene una o más prosecuencias las cuales no son las secuencias delanteras o directoras de una preproteína, o una preproteína, la cual es un precursor para una proproteína, que tiene una secuencia delantera o directora y una o más prosecuencias, las cuales generalmente son removidas durante los pasos de procesamiento que producen las formas activas y maduras del polipéptido.

Un polinucleótido de la presente invención puede codificar un pre-, pro- o prepropolipéptido maduro o precursor como se describió anteriormente, entre otros, fusionado a los aminoácidos adicionales, tales como aquellos los cuales proporcionan funcionalidades adicionales. Así, por ejemplo, el polipéptido puede ser fusionado a una secuencia marcadora, tal como un péptido, el cual facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas modalidades preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, tales como la etiqueta provista en el vector pQE-9, entre otros, muchos de los cuales están disponibles comercialmente. Como se describió en Gentz et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA 86: 821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona la purificación conveniente de la proteína de fusión. Típicamente, la misma no afecta adversamente la estructura o función de la proteína, y se une eficiente, selectiva y estrechamente a las resinas del quelato metálico, particularmente las resinas del quelato de níquel. Por ejemplo, como se sabe bien, las etiquetas de hexa-histidina frecuentemente se unen especialmente bien a la resina de níquel-NTA, la cual es bien conocida y está disponible fácilmente, y puede ser obtenida comercialmente, por ejemplo, de Qiagen. Además, la interacción del metal-histidina no solamente es estable para una variedad de condiciones útiles para remover el material unido no específicamente, sino también el polipéptido de la fusión puede ser unido y removido bajo condiciones no desnaturalizantes, suaves. La etiqueta de hexa-histidina puede ser fusionada más convenientemente a la terminal de amino o de carboxilo del polipéptido de citostatina. Una etiqueta del tipo de la hexa-histidina es particularmente útil para la expresión bacteriana. Otra secuencia marcadora útil en ciertas otras modalidades preferidas es una etiqueta de hemaglutinina ("HA"), particularmente cuando una célula de mamífero es utilizada para la expresión; por ejemplo, las células de COS-7. La etiqueta HA corresponde con un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina de la influenza, la cual ha sido descrita por ilson et al., Cell 37: 767 (1984), por ejemplo.

Sondas La presente invención se refiere además a los polinucleótidos que se hibridizan a las secuencias de citostatina descritas aquí anteriormente, particularmente las secuencias de la citostatina 2. Son preferidos a este respecto los polinucleótidos que tienen al menos 50% de identidad con respecto a las secuencias descritas aquí anteriormente. Son particularmente preferidas las secuencias que . tienen al menos el 70% de identidad. A este respecto, la presente invención se refiere especialmente a los polinucleótidos los cuales se hibridizan bajo condiciones estrictas a los polinucleótidos descritos aquí anteriormente. Cuando se utilice aquí, el término "condiciones estrictas" significa que la hibridización ocurrirá solamente si existe al menos 95% y preferiblemente al menos 97% de identidad entre las secuencias. Las modalidades particularmente preferidas a este respecto, además, son los polinucleótidos los cuales se hibridizan a los polinucleótidos descritos anteriormente y codifican los polipéptidos los cuales retienen substancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por el ADNc de la Figura 1 o el ADNc del clon depositado.

Materiales Depositados Un depósito que contiene un ADNc de la citostatina II humana fue depositada en el American Type Culture Collection ("ATCC") el 26 de septiembre de 1995. El depósito, al cual se le ha dado el número 97287, es referido aquí como "el clon depositado". El depósito será mantenido bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de los Micro-organismos para los propósitos del Procedimiento de Patentes. Este depósito es provisto solamente como una conveniencia para aquellos expertos en la técnica y no es una indicación o una admisión de que un depósito sea requerido para la habilitación o autorización, tal como aquella requerida bajo 35 U.S.C. § 112. La secuencia de los polinucleótidos contenida en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por la presente, sin incorporados aquí para referencia y son controlantes en el caso de cualquier conflicto con cualquier descripción de las secuencias de aquí. Se puede requerir una licencia para tomar, usar o vender los materiales depositados, y ninguna de tales licencias es otorgada por la presente.

Polipéptidos La presente invención se refiere además a un polipéptido de la citostatina II humana la cual tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 o la cual tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el clon depositado. La invención también se refiere a los fragmentos, análogos y derivados de estos polipéptidos.

Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren al polipéptido de la Figura l o a aquel codificado por el ADNc depositado, significa un polipéptido que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica de tal polipéptido. Por consiguiente, un análogo incluye una proproteína la cual puede ser activada por el desdoblamiento de la porción de la proproteína para producir un polipéptido maduro activo. El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético. En ciertas modalidades preferidas el mismo es un polipéptido recombinante. El fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 o aquel codificado por el ADNc en el clon depositado puede ser (i) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos están substituidos con un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo de aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido substituido puede o no puede ser codificado por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los residuos de aminoácidos incluya un grupo substituyente, o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal como un compuesto para incrementar la vida media del polipéptido (por ejemplo, el polietilenglicol), o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales están fusionados al polipéptido maduro, tales como una secuencia directora o secretoria o una secuencia la cual es empleada para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de la proproteína. Tales fragmentos, derivados y análogos se considera que van a estar dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de aquí. Entre las modalidades preferidas particularmente de la invención a este respecto están los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de la citostatina II descrita en la Figura 1, las variantes, los análogos, los derivados y los fragmentos de los mismos, y las variantes, los análogos y los derivados de los fragmentos. Alternativamente, las modalidades preferidas particularmente de la invención a este respecto son los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de la citostatina II del ADNc en el clon depositado, las variantes, los análogos, los derivados y los fragmentos de los mismos, y las variantes, los análogos y los derivados de los fragmentos. Son preferidos particularmente de la manera adicional a este respecto las variantes, análogos, derivados y fragmentos, y las variantes, los análogos y los derivados de los fragmentos, que tienen la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la citostatina II de la figura 1 o del ADNc en el clon depositado, en el cual varias, de un número pequeño, de 5 a 10, 1 a 5, 1 a 3, 2, 1 o ningún residuo de aminoácidos están substituidos, delecionados o agregados, en cualquier combinación. Son especialmente preferidas entre estas las substituciones, adiciones y deleciones inactivas, las cuales no alteren las propiedades y actividades de la citostatina II. También son especialmente preferidas a este respecto las substituciones conservadoras. Son más altamente preferidos los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de la Figura 1 o del clon depositado sin las substituciones . Los polipéptidos y los polinucleótidos de la presente invención son provistos preferiblemente en una forma aislada, y preferiblemente son purificados hasta la homogeneidad. El término "aislado" significa que el material ha sido alterado de su estado natural; por ejemplo, que, si el mismo está presente en la naturaleza, entonces ha sido removido de su medio ambiente original. Por ejemplo, un polinucleótido que está presente en forma natural o polipéptido que está presente en forma natural en un animal viviente en su estado natural, no está "aislado", sino que el mismo polinucleótido o polipéptido separado de algo o de la totalidad de los materiales coexistentes en el sistema natural está "aislado", cuando el término sea empleado aquí.

Como parte de, o a continuación del aislamiento, tales polinucleótidos pueden ser unidos a otros polinucleótidos, tales como los ADNs, para la mutagénesis, para formar proteínas de fusión, y para la propagación o la expresión en un huésped, por ejemplo. Los polinucleótidos aislados, solos o unidos a los otros polinucleótidos tales como vectores, pueden ser introducidos en las células huésped, en cultivos o en organismos enteros. Introducidos en las células huésped en el cultivo o en los organismos enteros, tales ADNcs todavía estarían aislados, cuando el término sea utilizado aquí, a causa de que los mismos podrían no estar en su forma que está presente de manera natural o en su medio ambiente. De manera similar, los polinucleótidos y los polipéptidos pueden estar presentes en una composición, tal como una formulación del medio, una solución para la introducción en las células, una composición o solución para la reacción química o enzimática, y semejantes, las cuales no sean composiciones que están presentes en forma natural, y allí permanecen polinucleótidos o polipéptidos aislados dentro del significado de este término cuando el mismo es empleado aquí.

Vectores, células huésped, expresión La presente invención también se refiere a vectores los cuales incluyen los polinucleótidos de la presente invención, las células huésped las cuales son diseñadas genéticamente con los vectores de la invención y la producción de los polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. Las células huésped pueden ser diseñadas genéticamente para incorporar los polinucleótidos y para expresar los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden ser introducidos en las células huésped utilizando técnicas bien conocidas de infección, transducción, transfección, trasvección y transformación. Los polinucleótidos pueden ser introducidos solos o con otros polinucleótidos. Tales otros polinucleótidos pueden ser introducidos independientemente, cointroducidos o introducidos unidos a los polinucleótidos de la invención. Así, por ejemplo, los polinucleótidos de la invención pueden ser transfectados en células huésped con otro polinucleótido separado que codifica un marcador seleccionable, utilizando técnicas estándares para la cotransfección y la selección en, por ejemplo, las células de mamíferos. En este caso los polinucleótidos generalmente serán incorporados establemente en el genoma de la célula huésped. Alternativamente, los polinucleótidos pueden ser unidos a un vector que contiene un marcador seleccionable para la propagación en un huésped. La construcción del vector puede ser introducida en las células huésped por las técnicas mencionadas anteriormente. En general, un vector de plásmido es introducido como el ADN en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio, o en un complejo con un lípido cargado. La electroporación también puede ser utilizada para introducir los polinucleótidos en un huésped. Si el vector es un virus, el mismo puede ser empacado in vitro o introducido en una célula de empaque y el virus empacado puede ser transducido en las células. Una amplia variedad de técnicas adecuadas para fabricar polinucleótidos y para introducir polinucleótidos en las células de acuerdo con este aspecto de la invención son bien conocidas y rutinarias para aquellos expertos en la técnica. Tales técnicas son revisadas extensamente en Sambrook et al., citado en otra parte de aquí, las cuales son ilustrativas de muchos de los manuales de laboratorio que detallan estas técnicas. De acuerdo con este aspecto de la invención el vector puede ser, por ejemplo, un vector de plásmido, un vector de fago de una sola hebra o de doble hebra, un vector viral de. ADN o de ARN de una sola hebra o de doble hebra. Tales vectores pueden ser introducidos en células como polinucleótidos, preferiblemente el ADN, por técnicas bien conocidas para introducir el ADN y el ARN en las células. Los vectores, en el caso del fago y de los vectores virales también pueden ser y preferiblemente son introducidos en células como un virus empacado o encapsidado por técnicas bien conocidas para la infección y transducción. Los vectores virales pueden ser competentes en la replicación o defectuosos en la replicación. En este último caso la propagación viral generalmente ocurrirá solamente en las células huésped de complemento. Preferidos entre los vectores, en ciertos aspectos, son aquellos para la expresión de los polinucleótidos y los polipéptidos de la presente invención. En general, tales vectores comprenden regiones de control de actuación cis para la expresión en un huésped unido operativamente al polinucleótido que va a ser expresado. Los factores de trans-accionamiento apropiados ya sea son suministrados por el huésped, suministrados por un vector complementario o suministrados por el propio vector durante la introducción en el huésped. En ciertas modalidades preferidas a este respecto, los vectores proporcionan la expresión específica. Tal expresión específica puede ser la expresión o la expresión inducible solamente en ciertos tipos de células o tanto inducible como específicamente para las células. Son particularmente preferidos entre los vectores inducibles los vectores que pueden ser inducidos para la expresión por factores del medio ambiente que son fáciles de manipular, tales como la temperatura y los aditivos nutrientes. Una variedad de vectores adecuados para este aspecto de la invención, incluyendo los vectores de la expresión constitutivos e inducibles para su uso en los huéspedes procarióticos y eucarióticos, son bien conocidos y empleados rutinariamente por aquellos expertos en la técnica. Las células huésped diseñadas pueden ser cultivadas en el medio nutriente convencional, el cual puede ser modificado cuando sea apropiado para, inter alia, activar los promotores, seleccionar los transformante o amplificar los genes. Las condiciones del cultivo, tales como la temperatura, el pH y semejantes, utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión generalmente serán adecuadas para la expresión de los polipéptidos de la presente invención como será evidente para aquellos expertos en la técnica. Una gran variedad de vectores de expresión puede ser utilizada para expresar un polipéptido de la invención. Tales vectores incluyen los vectores cromosómicos, episómicos y derivados del virus, por ejemplo, los vectores derivados de los plásmidos bacterianos, del bacteriófago, de los episomas de la levadura, de los elementos cromosómicos de la levadura, de los virus tales como los baculovirus, papovirus tales como SV40, virus de las vacunas, adenovirus, virus de epitelioma contagioso, virus y retrovirus de pseudorrabia, y vectores derivados de las combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de los elementos genéticos del plásmido y del bacteriófago, tales como los cósmidos y los fagemidos, todos pueden ser utilizados para la expresión de acuerdo con este aspecto de la presente invención. En general, cualquier vector adecuado para mantener, propagar o expresar los polinucleótidos para expresar un polipéptido en un huésped, puede ser utilizado para la expresión a este respecto. La secuencia de ADN apropiada puede ser insertada en el vector por cualquiera de una variedad de técnicas rutinarias y bien conocidas. En general, una secuencia de ADN para la expresión está unida a un vector de expresión por el desdoblamiento o separación de la secuencia de ADN y el vector de expresión con una o más endonucleasas de restricción y luego unir los fragmentos de la restricción conjuntamente utilizando la ligasa del ADN de T4. Los procedimientos para la restricción y el ligamiento que pueden ser utilizados para este fin son bien conocidos y rutinarios para aquellas personas con experiencia en la técnica. Los procedimientos adecuados a este respecto, y para la construcción de los vectores de expresión que utilizan técnicas alternativas, las cuales también son bien conocidas y rutinarias por aquellos expertos en la técnica, se describen con mayor detalle en Sambrook et al., citado en otra parte aquí. La secuencia de ADN en el vector de expresión está enlazada o unida operativamente a la(s) secuencia (s) de control de la expresión, apropiadas, incluyendo, por ejemplo, un promotor para dirigir la transcripción del ARNm. Los elementos representativos de tales promotores incluyen el promotor lambda PL del fago, el lac de E. coli, los promotores de trp y tac, los promotores inicial y final de SV40 y los promotores de los LTRs retrovirales, por nombrar solo algunos de los promotores bien conocidos. Se sobreentenderá que numerosos promotores no mencionados, que son adecuados para su uso en este aspecto de la invención, son bien conocidos y pueden ser empleados fácilmente por aquellos expertos en la técnica de la manera ilustrada por la descripción y los ejemplos de aquí. En general, las construcciones de la expresión contendrán sitios para el inicio y la terminación de la transcripción y, en la región transcrita, un sitio de unión del ribosoma para la translación o traducción. La porción de codificación de los elementos transcritos maduros expresados por las construcciones incluirá un AUG de inicio de la translación o traducción en el codón de inicio y terminación colocado apropiadamente al final del polipéptido que va a ser transladado o traducido. Además, las construcciones pueden contener las regiones de control que regulan así como engendran la expresión. En general, de acuerdo con . muchos procedimientos practicados comúnmente, tales regiones operarán controlando la transcripción, tales como los sitios y los mejoradores de unión de los represores, entre otros. Los vectores para la propagación y la expresión generalmente incluirán marcadores seleccionables. Tales marcadores también pueden pueden ser adecuados para la amplificación o los vectores pueden contener marcadores adicionales para este propósito. A este respecto, los vectores de la expresión contienen preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un carácter fenotípico para la selección de las células huésped transformadas. Los marcadores preferidos incluyen los genes de resistencia de la dihidrofolato reductasa o de la neomicina para el cultivo de las células eucarióticas, y los genes de resistencia a la tetraciclina o .la ampicilina para el cultivo del E. coli y otras bacterias. El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se describe en otra parte aquí, así como un promotor apropiado, y otras secuencias de control apropiadas, puede ser introducido en un huésped apropiado utilizando una variedad de técnicas bien conocidas, adecuadas para la expresión en las mismas de un polipéptido deseado. Los ejemplos representativos de los huéspedes apropiados incluyen las células bacterianas, tales como las células de E. coli, Streptomyces y Salmonella typhimurium; células fungosas, tales como las células de levadura; las células de insectos tales como las células de Drosophila S2 y de Spodoptera Sf9; las células de animales tales como las células de CHO, COS y de melanoma de Bowes; y células de plantas. Los huéspedes para una gran variedad de construcciones de la expresión ya son conocidos, y aquellas personas con experiencia en la técnica serán habilitadas por la presente descripción para seleccionar fácilmente un huésped para la expresión de un polipéptido de acuerdo con este aspecto de la presente invención. Más particularmente, la presente invención también incluye construcciones recombinantes, tales como las construcciones de la expresión, que comprenden una o más de las secuencias descritas anteriormente. Las construcciones comprenden un vector, tal como un plásmido o un vector viral, dentro del cual tal secuencia de la invención ha sido insertada. La secuencia puede ser insertada en una orientación delantera o inversa. En ciertas modalidades preferidas a este respecto, la construcción comprende además las secuencias reguladoras, que incluyen, por ejemplo, un promotor, unido operativamente a la secuencia. Se conocen grandes números de vectores y promotores adecuados por aquellas personas con exeriencia en la técnica, y existen muchos vectores disponibles comercialmente, adecuados para su uso en la presente invención. Los siguientes vectores, los cuales están disponibles comercialmente, son provistos a manera de ejemplo. Entre los vectores preferidos para su uso en las bacterias están pQE70, pQE60 y PQE-9, disponibles de Qiagen; pBs, pDlO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponibles de Stratagene; y ?trc99a, pKK223-3, pKK233-3, ?DR540, pRIT5 disponibles de Pharmacia. Entre los vectores eucarióticos preferidos están pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl y pSG disponibles de Stratagene; y pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL disponibles de Pharmacia. Estos vectores son listados solamente a manera de ilustración de los muchos vectores disponibles comercialmente y bien conocidos que están disponibles para los expertos en la técnica para su uso de acuerdo con, este aspecto de la presente invención. Será apreciado que cualquier otro plásmido o vector adecuado para, por ejemplo, la introducción, el mantenimiento, la propagación o la expresión de un polinucleótido o polipéptido de la invención en un huésped puede ser utilizado en este aspecto de la invención. Las regiones promotoras pueden ser seleccionadas de cualquier gen deseado que utilice los vectores que contienen una unidad de transcripción reportera que carece de una región promotora, tal como una unidad de transcripción de la cloranfenicol acetil transferasa ("cat"), corriente abajo de un sitio o sitios de restricción para la introducción de un fragmento promotor candidato; es decir, un fragmento que puede contener un promotor. Como se sabe bien, la introducción en el vector de un fragmento que contiene el promotor en el sitio de restricción corriente arriba del gen de cat engendra la producción de la actividad de CAT, la cual puede ser detectada por ensayos de CAT estándares. Los vectores adecuados para este fin son bien conocidos y están disponibles fácilmente. Dos de tales vectores son pKK232-8 y pCM7. Por consiguiente, los promotores para la expresión de los polinucleótidos de la presente invención incluyen no solamente los promotores bien conocidos y disponibles fácilmente, sino también los promotores que puedan ser obtenidos fácilmente por la técnica anterior, utilizando un gen reportero. Entre los promotores bacterianos conocidos, adecuados para la expresión de los polinucleótidos y los polipéptidos de acuerdo con la presente invención, están los promotores de lacl y lacZ del E. coli, los promotores de T3 y T7, el promotor de gpt, los promotores lamba PR, PL y el promotor trp. Entre los promotores eucarióticos conocidos, adecuados a este respecto están el promotor inicial inmediato de CMV, el promotor de la timidina cinasa de HSV, los promotores de SV40 inicial y final, los promotores del LTRs retroviral, y los promotores de metalotioneína tales como el promotor I-metalotioneína del ratón. La selección de los vectores y promotores apropiados para la expresión en una célula huésped, es un procedimiento bien conocido y las técnicas requeridas para la construcción del vector de la expresión, la introducción del vector en el huésped y la expresión en el huésped son de la experiencia rutinaria en la técnica. La presente invención también se refiere a células huésped que contienen las construcciones descritas anteriormente. La célula huésped puede ser una célula eucariótica más elevada, tal como una célula de mamífero, o una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la célula huésped puede ser efectuada por la transfección del fosfato de calcio, la transfección mediada por el dextrano-DEAE, la transfección mediada por lípidos, la electroporación, la transducción, la infección u otros métodos. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio estándares, tales como Davis et al. BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986). Las construcciones en las células huésped pueden ser utilizadas de una manera convencional para producir el producto del gen codificado por la secuencia recombinante. Alternativamente, los polipéptidos de la invención pueden ser producidos sintéticamente por los sintetizadores de péptidos convencionales. Las proteínas maduras pueden ser expresadas en células de mamíferos, levaduras, bacterias, u otras células bajo el control de los promotores apropiados. Se pueden emplear también los sistemas de translación o traducción libres de células, para producir tales proteínas utilizando los ARNs derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Los vectores de expresión y clonación apropiados para su uso con los huéspedes procarióticos y eucarióticos se describen por Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2/a. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Presa, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989). En general, ios vectores de expresión recombinantes incluirán los orígenes de la replicación, un promotor derivado de un gen altamente expresado para la transcripción directa de una secuencia estructural corriente abajo, y un marcador seleccionable para permitir el aislamiento del vector que contiene las células después de la exposición al vector. Entre los promotores adecuados están aquellos derivados de los genes que codifican las enzimas glicolíticas tales como la 3-fosfoglicerato cinasa ("PGK"), el factor a, la fosfatasa acida, y las proteínas para el choque térmico, entre otros. Los marcadores seleccionables incluyen el gen de resistencia a la penicilina del E. coli y el gen de trpl del S. cerevisiae. La transcripción del ADN que codifica los polipéptidos de la presente invención por los eucariotas más elevados, pueden ser incrementados por la inserción de una secuencia mejoradora en el vector. Los mejoradores son elementos de funcionamiento o accionamiento cis del ADN, usualmente alrededor desde 10 hasta 300 bp que actúan para incrementar la actividad transcripcional de un promotor en un tipo de célula huésped dada. Los ejemplos de los mejoradores incluyen el mejorador de SV40, el cual está localizado sobre el lado final del origen de replicación en los pares base (pb) 100 a 270, el mejorador del promotor inicial del citomegalovirus, el mejorador del polioma sobre el lado final del origen de la replicación, y los mejoradores del adenovirus. Los polinucleótidos de la invención, que codifican la secuencia estructural heteróloga de un polipéptido de la invención, en general serán insertados en el vector utilizando técnicas estándares de modo que el mismo esté unido o enlazado operativamente al promotor para la expresión. El polinucleótido será colocado de modo que el sitio de inicio de la transcripción esté localizado apropiadamente en 5' con respecto al sitio de unión del ribosoma. El sitio de unión del ribosoma estará en 5' con respecto al AUG que inicia la translación o traducción del polipéptido que va a ser expresado. En general, no existirán otros marcos de lectura abierta que empiecen con el codón de iniciación, usualmente UAG, y estén entre el sitio de unión del ribosoma y el AUG de iniciación. También de manera general, -existirá un codón de parada de la translación o traducción al . final del polipéptido y existirá una señal de poliadenilación y un señal de terminación de la transcripción colocada apropiadamente en el extremo 3' de la región transcrita. Para la secreción de la proteína transladada o traducida en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el medio ambiente extracelular, las señales de la secreción apropiadas pueden ser incorporadas en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas con respecto al polipéptido y las mismas pueden ser señales heterólogas. El polipéptido puede ser expresado en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solamente señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. Así, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, particularmente aminoácidos cargados, puede ser agregada a la extremidad N del polipéptido para mejorar la estabilidad y la persistencia en la célula huésped, durante la purificación o durante la manipulación y el almacenamiento subsiguientes. También, la región puede ser agregada al polipéptido para facilitar la purificación. Tales regiones pueden ser removidas previo a la preparación final del polipéptido. La adición de porciones del péptido a los polipéptidos para engendrar la secreción o excreción, para mejorar la estabilidad y para facilitar la purificación, entre otras cosas, son técnicas familiares y de rutina en la técnica. Los huéspedes procarióticos adecuados para la propagación, el mantenimiento o la expresión de los polinucleótidos y los polipéptidos de acuerdo con la invención, incluyen Escherischia coli, Bacillus subtilis y Salmonella typhimurium. Varias especies de Pseudomonas, Streptomyces, y Staphylococcus son huéspedes adecuados a este respecto. Además, muchos otros huéspedes también conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden ser empleados a este respecto. Como un ejemplo representativo pero no limitativo, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y el origen bacteriano de replicación derivado de los plásmidos disponibles comercialmente que comprenden los elementos genéticos del vector de clonación pBR322 bien conocido (ATCC 37017) . Tales vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEMÍ (Promega Biotec, Madison, Wl, EUA) . Estas secciones de "esqueleto" del pBR322 son combinadas con un promotor apropiado y la secuencia estructural que va a ser expresada. A continuación de la transformación de una cepa huésped apropiada y el crecimiento de la cepa huésped a una densidad celular apropiada, en donde el promotor seleccionable que es inducible es inducido por los medios apropiados (por ejemplo, el desplazamiento de la temperatura o la exposición al inductor químico) y las células son cultivadas durante un período adicional. Las células típicamente son colectadas entonces por centrifugación, rotas o alteradas por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante retenido para purificación adicional. Las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas, pueden ser rotas o alteradas por cualquier método conveniente, incluyendo la ciclización de congelamiento-descongelamiento, la aplicación de sonido, la alteración o ruptura mecánica, o el uso de agentes para la lisis de las células, tales métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Varios sistemas de cultivo de las células de mamíferos pueden ser empleadas también para la expresión. Los ejemplos de los sistemas de expresión de los mamíferos incluyen las líneas de COS-7 de los fibroblastos del riñon del mono, descritas en Gluzman, Cell 2_3: 175 (1981). Otras líneas celulares capaces de la expresión de un vector compatible incluyen por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de los mamíferos comprenderán un origen de la replicación, un promotor y mejorador adecuado, y también cualesquiera sitios de unión de los ribosomas, necesarios, sitios de poliadenilación, sitios aceptores y donadores de los empalmes, las secuencias de terminación transcripcional, y las secuencias no transcritas de flanqueo de 5' , que son necesarias para la expresión. En ciertas modalidades preferidas para este respecto, las secuencias de ADN derivadas de los sitios de empalme de SV40, y los sitios de poliadenilación de SV40 son utilizados para los elementos genéticos no transcritos, requeridos, de estos tipos. El polipéptido de la citostatina II puede ser recuperado y purificado a partir de los cultivos de las células recombinantes por métodos bien conocidos que incluyen el sulfato de amonio o la precipitación con etanol, la extracción con ácido, la cromatografía de intercambio aniónica o catiónica, la cromatografía de la fosfocelulosa, la cromatografía de interacción hidrofóbica, la cromatografía por afinidad, la cromatografía de hidroxiapatita y la cromatografía de lectina. La cromatografía líquida de alta resolución ("CLAR") también puede ser empleada especialmente para los pasos finales de la purificación. Las técnicas bien conocidas para el repliegue de la proteína pueden ser empleadas para regenerar la conformación activa cuando el polipéptido es desnaturalizado durante el aislamiento y/o la purificación. Los polipéptidos de la presente invención incluyen los productos purificados de manera natural, los productos de los procedimientos sintéticos químicos, y los productos producidos por las técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico, incluyendo, por ejemplo, las células bacterianas, de levadura, de plantas más elevadas, de insectos y de mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden ser glicosilados o pueden ser no glicosilados. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo de metionina modificado, en algunos casos como un resultado de los procesos mediados por el huésped.

Aplicaciones ilustrativas adicionales Los polinucleótidos y los polipéptidos de la citostatina II pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención para una variedad de aplicaciones, particularmente aquellas que hacen uso de las propiedades químicas y biológicas de la citostatina II. Entre estas aplicaciones en la caracterización de células y organismos y en crecimiento o desarrollo de las células y los organismos. Las aplicaciones adicionales se refieren al diagnóstico o el tratamiento o a los desórdenes de las células, los tejidos y los organismos. Por consiguiente, entre otros, la actividad estimulante inhibitoria y de diferenciación del crecimiento de la citostatina II, es útil para inhibir el crecimiento y estimular la diferenciación de las células tumorígenas, tales como las células tumorígenas in vitro, así como para propósitos de tratamiento. Las mismas actividades pueden ser aplicadas para el tratamiento del crecimiento de las células aberrantes en un organismo, tales como las células de un tumor. A este respecto, los polipéptidos de la citostatina II son preferidos, particularmente la citostatina II que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la figura 1 o la secuencia de aminoácidos de la citostatina II del ADNc del clon depositado. De manera similar, la capacidad de la citostatina II para inhibir el crecimiento de las células endoteliales, tales como las células endoteliales de las vénulas pueden ser utilizadas para prevenir, alterar o hacer lenta la angiogénesis en el cultivo o in situ. En una vena relacionada, puesto que las células tumorígenas en los sitios de la metástasis, así como aquellas en un sitio original, deben atraer nuevos vasos sanguíneos para el crecimiento, la inhibición de la citostatina II de las células endoteliales de las vénulas pueden ser útiles para reducir el potencial metastático o para hacer lenta la progresión de la enfermedad metastática. Además, la actividad de la citostatina II que inhibe el crecimiento de las células epiteliales mamarias y la diferenciación de la glándula mamaria de modulación también puede ser utilizada. para promover la formación de las yemas alveolares, ayudar al desarrollo de los lobuloalveolos diferenciados, y estimular la producción de la proteína de la leche y la acumulación de las gotitas de grasa. Tal actividad estimulante de la lactancia puede ayudar a la producción de la leche en los mamíferos que producen la leche comercial, y puede ser útil para ayudar a la producción de la leche por las madres humanas, por ejemplo. En una solicitud relacionada, la actividad moduladora de la citostatina II que afecta el tamaño del pecho puede ser útil para ayudar a regresar de un pecho agrandado al tamaño normal después de la parturición o parto. La inhibición de la actividad de la citostatina II, por ejemplo, por los fosforotioatos antisentido o por los anticuerpos, puede ser útil para la inhibición selectiva de la actividad de la citostatina II endógena en las células epiteliales mamarias para suprimir la apariencia de las yemas de las extremidades o terminales alveolares y para reducir el nivel de la beta-caseína. Como se describe posteriormente, estas y otras actividades y propiedades de los polinucleótidos y polipéptidos de la citostatina II de la invención tienen varias aplicaciones y usos en numerosos campos incluyendo las aplicaciones que involucran el crecimiento de las células in vitro, la producción comercial de leche y los productos de la leche, y el diagnóstico y los tratamientos que se relacionan con los campos de la oncología, cardiología, inmunología, endocrinología, hematología, desórdenes metabólicos, problemas músculoesqueléticos y la ginecología y obstetricia, por nombrar solo algunos. El ADNc de la citostatina II de la longitud completa, puede ser utilizado parcial o completamente como una sonda de hibridación para el ADNc y el ADN genómico para aislar los ADNcs de longitud completa y los clones genómicos que codifican la citostatina II y para aislar el ADNc y los clones genómicos de otros genes que tienen una alta similaridad de la secuencia con respecto al gen de la citostatina II humana. Tales sondas tienen generalmente al menos 20- bases. Preferiblemente, sin embargo, las sondas tienen al menos 30 bases y no exceden 50 bases. Tales sondas también pueden ser utilizadas para identificar los clones de ADNc adicionales que corresponden a una transcripción de longitud completa y un clon o clones genómicos que contienen el gen de la citostatina II humana completa, incluyendo las regiones reguladoras y promotoras, los exones, y los intrones. Por ejemplo, la región de codificación del gen de la citostatina II puede ser aislado por selección o tamización utilizando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda de oligonucleótidos. Una vez que se ha etiquetado un oligonucleótido que tiene una secuencia complementaria con respecto a aquella de un gen de la presente invención, es utilizado entonces para seleccionar una biblioteca del ADNc humano, el ADN genómico o el ARNm genómico para determinar para cuales miembros de la biblioteca se hibridiza la sonda. Los polinucleótidos y los polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados como reactivos y materiales de búsqueda para descubrir tratamientos y diagnósticos para las enfermedades humanas.

Moléculas de unión de la Citostatina II Esta invención también proporciona un método para la identificación de moléculas, tales como las moléculas receptoras, que se unen a la citostatina II. Las proteínas que codifican los genes, que se unen a la citostatina II, tales como las proteínas del receptor, pueden ser identificadas por numerosos métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, el encuadre o acomodo de los ligandos y la clasificación de FACS. Tales métodos se describen en muchos manuales de laboratorio tales como, por ejemplo, Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1_(2) :Capítulo 5 (1991) .

Por ejemplo, la clonación de la expresión puede ser empleada para este propósito. Para este fin el ARN poliadenilado es preparado a partir de una célula de respuesta a la citostatina II, una bibioteca de ADNc es creada a partir de este ARN, la bibioteca es dividida en los grupos o conjuntos y los grupos o conjuntos son transfectados individualmente en células que no funcionan en respuesta a la citostatina II. Las células transfectadas son expuestas entonces a una citostatina II etiquetada. (La citostatina II puede ser etiquetada por una variedad de técnicas bien conocidas incluyendo los métodos estándares de la radio-yodación o la inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica para el sitio) . A continuación de la exposición, las células son fijadas y se determina la unión de la citostatina. Estos procedimientos se llevan a cabo convenientemente sobre portaobjetos de vidrio. Los grupos o conjuntos son identificados a partir del ADNc que produjo las células de unión de la citostatina II producida. Los subgrupos son preparados a partir de aquellos que son positivos, transfectados en las células huésped y seleccionados como se describió anteriormente. Utilizando un proceso de reselección y de reagrupación iterativo, se pueden aislar uno o más clones únicos que codifican las moléculas de unión putativa o supuesta, tales como de un receptor.

Alternativamente, un ligando etiquetado puede ser unido o enlazado por fotoafinidad a un extracto celular, tal como una membrana o un extracto de la membrana, preparado a partir de las células que expresan una molécula a la cual se unen, tal como una molécula receptora. El material reticulado es resuelto por la electrofóresis del gel de poliacrilamida ("PAGE") y expuesto a una película de rayos X. El complejo etiquetado que contiene el ligando-receptor puede ser escindido, resuelto en fragmentos del péptido, y sometido al microsecuenciamiento de la proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida del microsecuenciamiento pueda ser utilizada para diseñar sondas de oligonucleótidos únicas o degeneradas para selecccionar bibliotecas de ADNc para identificar los genes que codifican el receptor putativo. Los polipéptidos de la invención también pueden ser utilizados para evaluar la capacidad de unión de la citostatina II de las moléculas de unión de la citostatina II, tales como los receptores, en las preparaciones de las células o en las preparaciones libres de las células.

Agonistas y antagonistas y ensayos o evaluaciones para los mismos La invención proporciona un método de selección de los compuestos para identificar aquellos los cuales mejoran o bloquean la acción de la citostatina II sobre las células, tales como su interacción con las moléculas de unión de la citostatina II como los receptores. Un agonista es un compuesto el cual incrementa las funciones biológicas naturales de la citostatina II, aunque los antagonistas reducen o eliminan tales funciones. Por ejemplo, un compartimiento celular, tal como una membrana o una preparación de la misma, tal como una preparación de la membrana, puede ser preparada a partir de una célula que expresa una molécula que se une a la citostatina II, tal como una molécula de una ruta reguladora o de señalización modulada por la citostatina II. La preparación es incubada con la citostatina II etiquetada en la ausencia o la presencia de una molécula candidata la cual pueda ser un agonista o antagonista de la citostatina II. La capacidad de la molécula candidata para unirse a la molécula de unión es reflejada en la unión reducida del ligando etiquetado. Las moléculas que se unen gratuitamente, es decir, sin inducir los efectos de la citostatina II durante la unión de la molécula de unión de la citostatina II, es más probable que sean buenos antagonistas. Las moléculas se unen bien y producen efectos que son los mismos o que se asemejan estrechamente. Los efectos semejantes a la citostatina II de los agonistas y antagonistas potenciales pueden ser medidos, por ejemplo, determinando la actividad de un segundo sistema mensajero a continuación de la interacción de la molécula candidata con una célula o preparación celular apropiada, y comparando el efecto con aquel de la citostatina II o de las moléculas que producen los mismos efectos que la citostatina II. Los segundos sistemas mensajeros que pueden ser útiles a este respecto incluyen pero no están limitados a los segundos sistemas mensajeros de la hidrólisis de la guanilato ciclasa de AMP, del canal iónico o de la fosfoinositida. Otro ejemplo de un ensayo o evaluación para los antagonistas de la citostatina II es un ensayo competitivo que combina la citostatina II y un antagonista potencial con los receptores de la citostatina II unidos a la membrana o los receptores de la citostatina II recombinante bajo condiciones apropiadas para un ensayo de inhibición competitivo. La citostatina II puede ser etiquetada, tal como por radioactividad, de tal modo que el número de moléculas de citostatina II unidas al receptor puedan ser determinadas en forma exacta para evaluar la efectividad del antagonista potencial. Los antagonistas potenciales incluyen moléculas orgánicas pequeñas, péptidos, polipéptidos y anticuerpos que se unen a un polipéptido de la invención y por lo cual se inhibe o se extingue su actividad. Los antagonistas potenciales también pueden ser moléculas orgánicas pequeñas, un péptido, un polipéptido tal como una proteína o anticuerpo relacionado estrechamente que se une a los mismos sitios sobre la molécula de unión, tal como un receptor, sin inducir las actividades inducidas por la citostatina II, por lo cual se previene la acción de la citostatina II excluyendo la citostatina II de la unión. Los antagonistas potenciales incluyen una molécula pequeña la cual se une a y ocupa el sitio de unión del polipéptido por lo cual se previene la unión a las moléculas de unión o aglutinación celular, tales como los receptores, de tal modo que la actividad biológica normal sea prevenida. Los ejemplos de las moléculas pequeñas incluyen pero no están limitadas a moléculas orgánicas pequeñas, péptidos o moléculas semejantes a los péptidos. Otros antagonistas potenciales incluyen las moléculas antisentido. La tecnología antisentido puede ser utilizada para controlar la expresión del gen a través del ADN o ARN antisentido o a través de la formación de una triple hélice. Las técnicas antisentido se describen, por ejemplo, en - Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXINUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Ratón, FL (1988). La formación de la triple hélice se describe, por ejemplo, en Lee et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988); y Dervan et al., Science 251 : 1360 (1991). Los métodos están basados en la unión de un polinucleótido a un ADN o ARN complementario. Por ejemplo, la porción de codificación de 5' de un polinucleótido que codifica el polipéptido maduro de la presente invención puede ser utilizado para diseñar un oligonucleótido de ARN antisentido desde aproximadamente 10 hasta 40 pares base de longitud. Un oligonucleótido de ADN está diseñado para ser complementario con una región del gen involucrada en la transcripción, por lo cual se previene la transcripción y la producción de la citostatina II. El oligonucleótido del ARN antisentido se hibridiza al ARNm in vivo y bloquea la translación o traducción de la molécula de ARNm en el polipéptido de la citostatina II. El oligonucleótido descrito anteriormente también puede ser suministrado a las células de tal modo que el ARN o ADN antisentido pueda ser expresado in vivo para inhibir la producción de la citostatina II.

Los antagonistas pueden ser empleados en una composición con un portador aceptable farmacéuticamente, por ejemplo, como se describe aquí posteriormente. Los antagonistas pueden ser empleados por ejemplo para tratar la hipertrofia de los miocitos cardiacos o la leucemia.

Composiciones La invención también se refiere a composiciones que comprenden el polinucleótido o los polipéptidos descritos anteriormente o los agonistas o los antagonistas. Por consiguiente, los polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados en combinación con un portador o portadores estériles o no estériles para su uso con células, tejidos u organismos, tales como un portador farmacéutico adecuado para la administración a un sujeto o paciente. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un aditivo para el medio o una cantidad efectiva terapéuticamente de un polipéptido de la invención y un portador o excipiente aceptable farmacéuticamente. Tales portadores pueden incluir, pero no están limitados a, una solución salada, una solución salada amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de la administración.

Juegos o Conjuntos La invención se refiere además a los juegos o empaques farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes rellenos con uno o más de los ingredientes de las composiciones mencionadas anteriormente de la invención. Asociado con tal (es) recipiente (s) , puede estar un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de productos farmacéuticos o biológicos, que reflejan la aprobación por la agencia para la fabricación, el uso o la venta del producto para la administración humana.

Administración Los polipéptidos de la presente invención pueden ser empleados solos o en conjunción con otros compuestos, tales como los compuestos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas de cualquier manera efectiva, conveniente, que incluye, por ejemplo, la administración por las rutas tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica, entre otras.

Las composiciones farmacéuticas generalmente son administradas en una cantidad efectiva para el tratamiento o profilaxis de una indicación o indicaciones específicas. En general, las composiciones son administradas en un cantidad de al menos aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal. En la mayoría de los casos los mismos serán administrados en una cantidad que no exceda aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día. Preferiblemente, en la mayoría de los casos, la dosis es desde aproximadamente 10 µg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, diariamente. Será apreciado que la dosificación óptima será determinada por métodos estándares para cada modalidad e indicación del tratamiento, tomando en cuenta la indicación, su severidad, la ruta de administración, las condiciones de complicación y semejantes.

Terapia del Gen Los polinucleótidos de la citostatina II, los polipéptidos, los agonistas y los antagonistas que son polipéptidos, pueden ser empleados de acuerdo con la presente invención por la expresión de tales polipéptidos in vivo, en las modalidades de tratamiento referidas frecuentemente como "terapia del gen".

Así, por ejemplo, las células de un paciente pueden ser diseñadas con un polinucleótido, tal como un ADN o ARN, que codifica un polipéptido ex vivo, y las células diseñadas pueden ser provistas entonces a un paciente que va a ser tratado con el polipéptido. Por ejemplo, las células pueden ser diseñadas ex vivo por el uso de un vector del plásmido retroviral que contiene el ARN que codifica un polipéptido de la presente invención. Tales métodos son bien conocidos en la técnica y su uso en la presente invención será evidente a partir de las enseñanzas de aquí. De manera similar, las células pueden ser diseñadas in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo por los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede ser diseñado para la expresión en un vector retroviral defectuoso de la replicación, como se describió anteriormente. La construcción de la expresión retroviral puede ser aislada e introducida entonces en una célula de empaque que es transducida con un vector de plásmido retroviral que contiene el ARN que codifica un polipéptido de la presente invención de tal modo que la célula de empaque produzca ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen de interés. Estas células productoras pueden ser administradas a un paciente para diseñar células in vivo y la expresión del polipéptido in vivo. Estos y otros métodos de administración de un polipéptido de la presente invención por tal método, deben ser evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Los retrovirus a partir de los cuales los vectores de los plásmidos retrovirales mencionados anteriormente aquí pueden ser derivados incluyen, pero no están limitados a, Virus de Leucemia de Murino de Moloney, el virus de la necrosis del bazo, los retrovirus tales como el Virus de Sarcoma de Rous, el Virus de Sarcoma de Harvey, el virus de leucosis de las aves, el virus de la leucemia del mono gibón, el virus de inmunodeficiencia humana, el adenovirus, el Virus del Sarcoma Mieloproliferativo, y el virus del tumor mamario. En una modalidad, el vector del plásmido retroviral es derivado del Virus de la Leucemia del Murino de Moloney. Tales vectores incluyen también uno o más promotores para la expresión del polipéptido. Los promotores adecuados los cuales pueden ser empleados incluyen, pero no están limitados a, el ITR retroviral; el promotor de SV40; y el promotor de citomegalovirus humano (CMV) descrito en Miller et al., Biotechniques 7: 980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, los promotores celulares tales como los promotores celulares eucarióticos incluyen, pero no están limitados a, la histona, la polimerasa III del ARN, y los promotores de la ß-actina) . Otros promotores virales los cuales pueden ser empleados incluyen, pero no están limitados a, los promotores de los adenovirus, los promotores de la timidina cinasa (TK) , y los promotores del parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas aquí. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido de la presente invención será colocada bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados los cuales pueden ser empleados incluyen, pero no están limitados a, los promotores adenovirales, tales como el promotor final mayor adenoviral; o los promotores heterólogos, tales como el promotor del citomegalovirus (CMV) ; el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV); los promotores inducibles, tales como el promotor de MMT, el promotor de la metalotioneína; los promotores de choques térmicos, el promotor de la albúmina; el promotor de ApoAI; los promotores de la globina humana; los promotores de la timidina cinasa viral, tales como el promotor de la timidina cinasa del Herpes Simplex; los LTRs retrovirales (incluyendo los LTRs retrovirales modificados descritos aquí anteriormente); el promotor de la ß-actina; y los promotores de las hormonas del crecimiento humano. El promotor también puede ser el promotor natural el cual controla el gen que codifica los polipéptidos. El vector del plásmido retroviral es empleado para transducir las líneas celulares de empaque para formar las líneas celulares productoras. Los ejemplos de las células de empaque que pueden ser transfectadas incluyen, pero no están limitadas a, las líneas celulares de PE501, PA317, ?-2, ?-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ?CRE, ?CRIP, GP+E-86, Gp+envAml2, y DAN como se describió en Miller, A., Human Gene Therapy 1 : 5-14 (1990). El vector puede ser transducido en las células de empaque a través de cualquier medio conocido en la técnica. Tales medios incluyen, pero no están limitados a, la electroporación, el uso de liposomas, y la precipitación con CaP0. En una alternativa, el vector del plásmido retroviral puede ser encapsulado en un liposoma, o acoplado a un lípido, y luego administrado a un huésped. La línea celular productora generará partículas del vector retroviral infeccioso, las cuales incluyen la(s) secuencia (s) del ácido nucleico que codifican los polipéptidos. Tales partículas del vector retroviral pueden ser empleadas entonces para transducir las células eucarióticas, ya sea in vitro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresan la(s) secuencia (s) de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden ser transducidas incluyen, pero no están limitadas a, las células del tallo embriónico, las células del carcinoma embriónico, así como las células del tallo hematopoyético, los hepatocitos, los fibroblastos, los mioblastos, los queratinocitos, las células endoteliales, y las células epiteliales bronquiales.

Ensayos de Polinucleótidos Esta invención también está relacionada con el uso de los polinucleótidos de la citostatina II para detectar los polinucleótidos complementarios tales como, por ejemplo, un reactivo de diagnóstico. La detección de la forma mutada de la citostatina II proporciona una herramienta de diagnóstico que puede agregar o definir un diagnóstico de una enfermedad o susceptibilidad para una enfermedad que resulta de la subexpresión, la sobreexpresión o la expresión alterada de la citostatina II, tal como, por ejemplo, el cáncer del pecho. Los individuos que llevan mutaciones en el gen de la citostatina II humana, pueden ser detectados al nivel del ADN por una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos para el diagnóstico pueden ser obtenidos de las células de un paciente, tales como de la sangre, de la orina, de la saliva, de las biopsias del tejido y del material de la autopsia. El ADN genómico puede ser utilizado directamente para la detección o puede ser amplificado enzimáticamente utilizando el PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986)) previo al análisis. El ARN o el ADNc también pueden ser utilizados en las mismas rutas. Como un ejemplo, los cebadores de PCR complementarios para el ácido nucleico que codifica la citostatina II pueden ser utilizados para identificar y analizar la expresión y las mutaciones de la citostatina II. Por ejemplo, las deleciones e inserciones pueden ser detectadas por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden ser identificadas hibridizando el ADN amplificado al ARN de la citostatina II radioetiquetada o alternativamente, las secuencias de ADN antisentido de la citostatina II radioetiquetada. Las secuencias apareadas o perfectamente correspondientes, pueden ser distinguidas de los duplicados no correspondientes o no ajustados por la digestión de la RNasa A o por diferencias en las temperaturas de la fusión. Las diferencias de la secuencia entre un gen de referencia y los genes que tienen las mutaciones, también pueden ser relevadas por el secuenciamiento del ADN directo. Además, los segmentos de ADN clonado pueden ser empleados como sondas para detectar los segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de tales métodos puede ser mejorada ampliamente por el uso apropiado de la PCR o de otro método de amplificación. Por ejemplo, un cebador de secuenciamiento es utilizado con el producto de PCR de doble hebra o una molécula del modelo o matriz de una sola hebra generado por el PCR modificado. La determinación de la secuencia es efectuada por procedimientos convencionales con el nucleótido radioetiquetado o por procedimientos de secuenciamiento automático con etiquetas fluorescentes. La prueba genética basada en las diferencias de las secuencias de ADN puede ser lograda por la detección de la alteración en la movilidad electroforética de los fragmentos de ADN en los geles, con o sin agentes desnaturalizantes. Las deleciones e inserciones pequeñas de las secuencias pueden ser visualizadas por la electrofóresis del gel de resolución elevada. Los fragmentos de ADN de diferentes secuencias pueden ser distinguidos sobre los geles de gradiente de formamida desnaturalizante en los cuales las movilidades de diferentes fragmentos de ADN son retardados en el gel en diferentes posiciones de acuerdo con sus temperaturas de fusión específicas o de fusión parcial (véase, por ejemplo, Myers et al., Science, 230: 1242 (1985)). Los cambios de la secuencia en los lugares específicos también pueden ser revelados por los ensayos de protección de la nucleasa, tales como la protección de RNasa y SI o el método de desdoblamiento químico (por ejemplo, Cotton et al., Proc. Nati. Acad. Sci., EUA, 85 4397-4401 (1985)). Por consiguiente, la detección de la secuencia de ADN específica puede ser lograda por los métodos tales como la hibridación, la protección de la RNasa, el desdoblamiento químico, el secuenciamiento del ADN directo o el uso de enzimas de restricción, (por ejemplo, los polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción ("RFLP") y el manchado de Southern del ADN genómico. Además del secuenciamiento del ADN y la electrofóresis del gel más convencionales, las mutaciones también pueden ser detectadas por el análisis in situ.

Ensayos del Polipéptido La presente invención también se refiere a ensayos de diagnóstico tales como los ensayos cuantitativos y de diagnóstico para detectar los niveles de la proteína de la citostatina II en las células y los tejidos, incluyendo la determinación de los niveles normales y anormales. Por consiguiente, por ejemplo, un ensayo de diagnóstico de acuerdo con la invención para detectar la sobreexpresión de la proteína de la citostatina II comparado con las muestras del tejido de control normal puede ser utilizado para detectar la presencia de un infarto al miocardio, por ejemplo. Las técnicas de ensayo que pueden ser utilizadas para determinar los niveles de una proteína, tales como una proteína de la citostatina II de la presente invención, en una muestra derivada de un huésped, son bien conocidas por aquellas personas con experiencia en la técnica. Tales métodos de ensayo incluyen los radioinmunoensayos, los ensayos de unión competitivos, el análisis del Manchado de Western y los ensayos de ELISA. Entre estos, los ensayos de ELISA son preferidos frecuentemente. Un ensayo de ELISA comprende inicialmente preparar un anticuerpo específico para la citostatina II, preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además generalmente un anticuerpo reportero es preparado, el cual se une al anticuerpo monoclonal. El anticuerpo reportero es fijado a un reactivo detectable tal como un reactivo radioactivo, fluorescente o enzimático, en este ejemplo la enzima peroxidasa del rábano picante. Para llevar a cabo un ensayo de ELISA, una muestra es removida de un huésped e incubada sobre un soporte sólido, por ejemplo un plato o disco de poliestireno, que une las proteínas en la muestra. Cualquiera de los sitios libres de unión de la proteína sobre el disco o plato son cubiertos entonces por la incubación con una proteína no específica tal como la albúmina del suero de bovino. A continuación, el anticuerpo monoclonal es incubado en el disco o plato, tiempo durante el cual los anticuerpos monoclonales se fijan a cualquiera de las proteínas de la citostatina II fijadas al disco o plato de poliestireno. El anticuerpo monoclonal no unido es retirado por lavado con una solución amortiguadora. El anticuerpo reportero unido o enlazado a la peroxidasa del rábano picante es colocado en el plato o disco, conduciendo a la unión del anticuerpo reportero con cualquier anticuerpo monoclonal unido a la citostatina II. El anticuerpo del reportero no fijado es retirado entonces por lavado. Los reactivos para verificar la actividad de la peroxidasa, incluyendo un substrato colorimétrico, son agregados entonces al plato o disco. La peroxidasa inmovilizada, unida o enlazada a la citostatina II a través de los anticuerpos primarios o secundarios, produce un producto de reacción coloreado. La cantidad del color desarrollado en un período de tiempo dado indica la cantidad de la proteína de la citostatina II presente en la muestra. Los resultados cuantitativos son obtenidos típicamente por la referencia a una curva estándar. Un ensayo de competición puede ser empleado en donde los anticuerpos específicos para la citostatina II fijada o unida a un soporte sólido y la citostatina II etiquetada y una muestra derivada del huésped se hace pasar sobre el soporte sólido y la cantidad de la etiqueta detectada fijada al soporte sólido puede ser correlacionada con una cantidad de la citostatina II en la muestra.

Ensayos del cromosoma Las secuencias de la presente invención también son valiosas para la identificación de los cromosomas. La secuencia es ubicada como un blanco u objetivo específicamente para y puede ser hibridizada con una localización particular sobre un cromosoma humano individual. Además, existe una necesidad actual de identificar sitios particulares sobre el cromosoma. Pocos reactivos de marcación del cromosoma, basados en los datos de la secuencia real (polimorfismos repetidos) están disponibles actualmente para la la marcación de la localización cromosómica. La asignación de cromosomas de los ADNs a los cromosomas de acuerdo con la presente invención, es un primer paso importante en la correlación de estas secuencias con los genes asociados con la enfermedad. De manera breve, a las secuencias se les pueden asignar coordenadas con respecto a los cromosomas por la preparación de los cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 bp) a partir del ADNc. El análisis por computadora de la región 3' no transladada o traducida del gen es utilizada para seleccionar rápidamente los cebadores que no se extienden más de un exon en el ADN genómico, complicando por consiguiente el proceso de amplificación. Estos cebadores son utilizados entonces para la selección por PCR de los híbridos de las células somáticas que contienen los cromosomas humanos individuales. Solamente aquellos híbridos que contienen el gen humano correspondiente al cebador producirán un fragmento amplificado. La asignación de coordenadas por PCR de los híbridos de las células somáticas es un procedimiento rápido para asignar un ADN particular para un cromosoma particular. Utilizando la presente invención con los mismos cebadores de los oligonucleótidos, se puede lograr la sublocalización con los paneles de los fragmentos a partir de los cromosomas o grupos específicos de los clones genómicos grandes de una manera análoga. Otras estrategias de asignación de coordenadas que pueden ser utilizadas similarmente para la asignación de coordenadas con respecto a su cromosoma incluyen la hibridización in situ, la preselección con los cromosomas clasificados por el flujo, etiquetados y la preselección por la hibridación para construir las bibliotecas de ADNc específicas para los cromosomas.

La hibridación in situ por fluorescencia ("FISH") de un clon de ADNc para una difusión cromosómica de la metafase puede ser utilizada para proporcionar una localización cromosómica precisa en un paso. Esta técnica puede ser utilizada con un ADNc tan corto como 500 o 600 bases; sin embargo, los clones más grandes que 2,000 pb tienen una probabilidad más elevada de unión a una localización cromosómica única con una intensidad suficiente de la señal para la detección simple. El FISH requiere el uso de los clones a partir de los cuales se deriva la etiqueta de la secuencia de la expresión (EST), y mientras más largo mejor. Por ejemplo, 2,000 pb es bueno, 4,000 es mejor, y más de 4,000 probablemente no sea necesario para dar buenos resultados en un porcentaje razonable del tiempo. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., HUMAN CHROMOSOMES: A MANUAL OF BASIC TECHNIQUES, Pergamon Press, New York (1988). Una vez que a una secuencia se le han asignado coordenadas con respecto a una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma puede ser correlacionada con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, MENDELIAN INHERITANCE IN MAN, disponible en la línea a través de Johns Hopkins University, Welch Medical Library. La relación entre los genes y las enfermedades a los cuales se les han asignados coordenadas con respecto a la misma región cromosómica, son identificados a través del análisis de unión o enlace (codescendencia de los genes adyacentes físicamente) . A continuación, es necesario determinar las diferencias en el ADNc o la secuencia genómica entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunas o en la totalidad de los individuos afectados pero no en cualquiera de los individuos normales, entonces es probable que la mutación sea el agente causante de la enfermedad. Con la resolución común de las técnicas de asignación de coordenadas físicas y la asignación de coordenadas genéticas, un ADNc localizado de manera precisa con respecto a una región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser una de entre 50 y 500 genes causantes potenciales. (Esto supone una relación de la asignación de coordenadas de 1 megabase y un gen por 20 kb) .

Aplicaciones Inmunológicas Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de los mismos, o las células que los expresan, pueden ser utilizados como un inmunógeno para producir los anticuerpos para los mismos. Estos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, de una sola cadena, y humanizados, así como fragmentos de Fab, o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. Se pueden utilizar varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de tales anticuerpos y fragmentos. Los anticuerpos generados contra los polipéptidos que corresponden a una secuencia de la presente invención pueden ser obtenidos por la inyección directa de los polipéptidos en un animal o por la administración de los polipéptidos a un animal, preferiblemente diferente de un ser humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces a los propios polipéptidos. De esta manera, aún una secuencia que codifica solamente un fragmento de los polipéptidos puede ser utilizada para generar los anticuerpos que se unen a los polipéptidos naturales completos. Tales anticuerpos pueden ser utilizados entonces para aislar el polipéptido del tejido que expresa este polipéptido. Para la expresión de los anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica la cual proporcione los anticuerpos producidos por los cultivos de las líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler, G. y Milstein, C, Nature 256: 495-497 (1975), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de la célula B humana (Kozbor et al., Immunology Today _ : 72 (1983) y la técnica del hibridoma-EBV para producir los anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., páginas 77-96 en MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÁNCER THERAPY, Alan R. Liss. Inc. (1985). Las técnicas descritas para la producción de los anticuerpos de una sola cadena (Patente U.S. No. 4,946,778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de una sola cadena para los productos de polipéptido inmunogénico de esta invención. También, los ratones transgénicos, u otros organismos tales como otros mamíferos, pueden ser utilizados para expresar los anticuerpos humanizados para los productos de los polipéptidos inmunogénicos de esta invención.

EJEMPLOS La presente invención es descrita adicionalmente por los siguientes ejemplos. Los ejemplos son provistos solamente para ilustrar la invención por la referencia a las modalidades específicas. Estas amplificaciones, aunque ilustran ciertos aspectos específicos de la invención, no representan las limitaciones o circunscriben el alcance de la invención descrita. ciertos términos utixizados aquí son explicados en el siguiente glosario.

Todas las partes o cantidades descritas en los siguientes ejemplos son en peso, a menos que se especifique de otra manera. A menos que se especifique de otra manera, la preparación del tamaño de los fragmentos en los ejemplos de abajo se llevó a cabo utilizando las técnicas estándares de la electrofóresis del gel de poliacrilamida ("PAGE") en geles al 8 por ciento, como se describe, por ejemplo, por Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8_: 4057 (1980). A menos que se describa de otra manera, las uniones o enlaces se efectuaron utilizando soluciones amortiguadoras, temperaturas de incubación y tiempos estándares, cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que van a ser unidas o ligadas y aproximadamente 10 unidades de la ligasa del ADN de T4 ("ligasa") por 0.5 µg del ADN. Todos los ejemplos se llevaron a cabo utilizando técnicas estándares, las cuales son bien conocidas y rutinarias para aquellas personas con experiencia en la técnica, excepto en donde se describe de otra manera detalladamente.

Ejemplo 1 Expresión y purificación de la citostatina II humana utilizando bacterias La secuencia de ADN que codifica la citostatina II humana en el polinucleótido depositado se amplificó utilizando los cebadores de oligonucleótidos de PCR específicos para la secuencia terminal de carboxilo de los aminoácidos de la proteína de la citostatina II humana y para las secuencias 3' del vector con respecto al gen. Los nucleótidos adicionales que contienen los sitios de la restricción para facilitar la clonación fueron agregados a las secuencias 5' y 3' respectivamente . El cebador del oligonucleótido de 5' tuvo la secuencia 5' CGC GGA TCC GTG GAG GCT TTC TG 3' que contiene el sitio de restricción de BamHl subrayado, seguido por 14 nucleótidos de la secuencia de codificación de la citostatina II humana que inicia desde el segundo codón; es decir, el codón que sigue del AUG para la metionina N-terminal presunta o probable. El cebador 3' tiene la secuencia 5' CGC AAG CTT TTA TGC CTT CTC ATA GTG 3' que contiene el sitio de restricción Hind III subrayado, seguido por 18 nucleótidos complementarios con los últimos 6 codones de la citostatina II incluyendo el codón de parada.

Los sitios de restricción fueron convenientes para los sitios de la enzima de restricción en los vectores pQE-70 de la expresión bacteriana, los cuales fueron utilizados para la expresión bacteriana en estos ejemplos. {Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311) . La pQE-70 codifica la resistencia de los antibióticos a la ampicilina ("Ampr") y contiene un origen bacteriano de replicación ("ori") , un promotor inducible de IPTG, un sitio de unión del ribosoma ("RBS"), una etiqueta de 6-His y los sitios de la enzima de restricción. La pQE-70 se digerió con BamHl y HindIII y el ADN de la citostatina II humana amplificada se ligó o unió en el ADN del vector digerido de BamHl/HindIII . La inserción en el vector restringido de BamHl/HindIII colocó la región de codificación de la citostatina II corriente abajo del promotor inducible por IPTG y en el marco con un AUG de iniciación para la translación o traducción. La mezcla de ligación o unión se transformó en las células de E. coli competentes utilizando procedimientos estándares. Tales procedimientos son descritos en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2ND Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). La cepa M15/re?4 del E. coli, que contiene copias múltiples del plásmido pREP4, el cual expresa el represor lac y confiere resistencia a la kanamicina ("Kanr), se utilizó para llevar a cabo el ejemplo ilustrativo descrito aquí. Esta cepa, la cual es solamente una de muchas que son adecuadas para la expresión de la citostatina II, está disponible comercialmente de Qiagen. Los transformantes fueron identificados por su capacidad para crecer sobre placas de LB en la presencia de la ampicilina. El plásmido del ADN se aisló a partir de las colonias resistentes y la identidad del ADN clonado se confirmó por el análisis de restricción. Los clones que contienen las construcciones deseadas se hicieron crecer durante la noche ("0/N") en un cultivo líquido en un medio de LB suplementado tanto con ampicilina (110 ug/ml) como con kanamicina (25 ug/ml) . El cultivo O/N se utilizó para inocular un cultivo grande, a una dilución de aproximadamente 1:100 a 1:250. Las células se hicieron crecer a una densidad óptica de 600 hm (O.D.600) de entre 0.4 y 0.6. La isopropil-B-D-tiogalactopiranosida ("IPTG") se agregó entonces a una concentración final de 1 mM para inducir la transcripción desde los promotores sensibles al represor lac, inactivando el represor de lacl. Las células se incubaron subiguientemente de manera adicional durante 3 a 4 horas. Las células fueron colectadas entonces por centrifugación y se rompieron o alteraron, por métodos estándares. Los cuerpos de inclusión fueron purificados a partir de las células rotas o alteradas utilizando las técnicas de colección de rutina, y ia proteína se solubilizó desde los cuerpos de inclusión en la urea 8. La urea 8M se intercambió en la solución salada amortiguada con fosfato 2X ("PBS") y la proteína se replegó entonces en una solución de PD-10 estándar. La proteína se purificó adicionalmente por cromatografía de exclusión de tamaño y luego por xm paso adicional de cromatografía para remover la endotoxina. La preparación de la proteína estéril se almacenó en PBS 2X a una concentración de 95 microgramos por ml» El análisis de la preparación por métodos estándares de la electrofóresis del gel de poliacrilamida reveló que la preparación contuvo aproximadamente 80 % de citostatina ii monomérica que tiene el peso molecular esperado de, aproximadamente, 14 kDa.

Ejemplo 2 Clonación y expresión de la citostatina II humana en un sistema de expresión baculovirus La secuencia de ADNc que codifica la proteína de la citostatina II humana de longitud completa, en el cion depositado, es amplificada utilizando los cebadores de oligonucleótidos de PCR que corresponden a las secuencias 5' y 3' del gen: El cebador 5' tiene la secuencia GC GGA TCC CGT GGA GGC TTT CTG TGC que contiene ei sitio de la enzima de restricción de BamIIl seguido por los codones 2-5 y 2 bases del codón 6 de la secuencia de la citostatina II de la Figura 1. Insertado en un vector de expresión, como se describe posteriormente, el extremo 5' del fragmento amplificado que codifica la citostatina ll humana, proporciona una señal eficiente para la iniciación de la translación o traducción en ..as células euca ioticas, como se describió por Kozac, M., J. Mol. Biol., 196: 947-950 (1987), entre otros. El cebador 3' tiene la secuencia 5' GC GGT ACC TTA TGC CTT CTC ATA GTG' 3' que contiene la restricción ae Asp718 subrayada seguido por los nucieótidos complementarios para ei c?dón de ara a y ios c?d?nes para los últimos cinco aminoácidos del ADNc de la citostatina II humana de la Figura 1. El fragmento amplificado es aislado a partir de un gel de agarosa al 1% utilizando un juego o conjunto disponible comercialmente ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento es digerido entonces con BamHl y Asp718 y nuevamente se purifica sobre un gei de agarosa ai 1%. Este IraymenLo se designó aquí como F2.

El vector pA2-GP es utilizado para expresar la proteína de la citostatina II en el sistema de expresión del bacuiovirus, utilizando métodos estándares, tales como aquellos descritos en Summer et ai, A MANUAL OF PROCEDURES, Texas Agricultural Experimental Station Rulletin No. 1 55 (1987). Fste vector de expresión contiene el promotor de polihedrina fuerte del virus de polihedrosis nuclear Autographa californica (AcMNPV) seguido por los sitios de restricción convenientes. El péptido de la señal del AcMNPV gi67, incluyendo la meti?niua N- terminal, est localizado justo corriente arriba de un sitio de BamHl. El sitio de poliadenilación del virus 40 del simio ("SV40") es utilizado para la pol i adeni 1 ari ón eficiente. Para una selección facilitada del virus recombínante, el gen de beta-galactosidasa del E. coli es insertado en la misma orientación que el promotor de polihedrina y está seguido por la señal de poliadeniiacion del gen de polihedrina. Las secuencias de polihedrina están flanqueadas en ambos lados por ias secuencias virales para la recombinación homologa mediada por la célula, con el ADN viral de tipo silvestre para generar el virus viable o disponible que expresa el polinucleótido clonado. Muchos otros vectores de baculovirus podrían ser utilizados en lugar del pA2-GP, tales como pAc373, pVL941 y pAcIMl. Tales vectores se describen en Luckow et al., Virology 170: 31-39, entre otros. Ei plasmido es digerido con las enzimas de restricción BamHl y Asp7i8 y luego es desf?sr?rilad? u Lij.± ?auau xa l?oiaLd ia luLco t iiidi Uc icl iicl ü , u ?. ? ? ? -aüu? los procedimientos de rutina conocidos en la técnica. El ADN es aislado entonces a partir de ?n gel de agarosa al 1% utilizando un juego o conjunto disponible comercialmente ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). Este ADN del vector es designado aquí "V2". Ei fragmento F2 y el plasmido desfosfoplado V2 son iiyad?s junto con la liyasa del ADN de T . Las células de HB101 del E. coli se transformaron con la mezcla de ligación o unión y se dispersaron sobre las piaras de cultivo. Son i en ificadas las barferias que contienen el plásmido con el gen de citostatina II humana por la digestión de ADN a partir de las colonias individuales utilizando el BamHl y el Asp718 y luego se analiza el producto de la digestión por la electrofóresis del gel. La secuencia del fragmento clonado es confirmada por el secuenciamiento del ADN. Este plásmido es designado aquí pBacCytostatin II. 5 µg del plásmido pBacCytostatin II es cotransfectado con 1.0 µg de un ADN de baculovirus linealizado disponible comercialmente (ADN de baculovirus "BaculoGold™", Pharmingen, San Diego, CA. ) , utilizando el método de lipofección descrito por Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417 (1987). 1 µg del ADN del virus de BaculoGold™ y 5 µg del plásmido pBacCytostatin II se mezclan en una cavidad estéril de una placa de microtitulación que contiene 50 µl del medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) . Después de esto se agregan 10 µl de Lipofectina más 90 µl del medio de Grace, se mezclan y se incuban durante 15 minutos a temperatura ambiente. Luego la mezcla de transfección es agregada por goteo a las células de los insectos de Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo del tejido de 35 mm con 1 ml del medio de Grace sin suero. La placa es sacudida hacia adelante y hacia atrás para mezclar la solución agregada recientemente. La placa es incubada entonces durante 5 horas a 27 °C. Después de 5 horas la solución de la transfección es removida de la placa y 1 ml del medio de insecto de Grace suplementado con suero de bovino fetal al 10 % es agregado. La placa es colocada nuevamente en un incubador y se continua el cultivo a 27 °C durante cuatro días. Después de cuatro días el sobrenadante es colectado y se efectúa un ensayo de la placa, como se describió por Summers y Smith (supra) . Un gel de agarosa con "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) es utilizado para permitir la identificación y el aislamiento facilitado del clon de la expresión del gal, el cual produce las placas teñidas de azul. (Una descripción detallada de un "ensayo de la placa" de este tipo también pueden ser encontrado en la guía del usuario para el cultivo de las células del insecto y baculovirología distribuida por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10) . Cuatro días después de la dilución en serie, el virus es agregado a las células. Las placas teñidas de azul son recolectadas con la punta de una pipeta de Eppendorf. El agar que contiene los virus recombinantes es resuspendido entonces en un tubo de Eppendorf que contiene 200 µl del medio de Grace. El agar es removido por una centrifugación breve y el sobrenadante que contiene el baculovirus recombinante es utilizado para infectar las células Sf9 sembradas en discos o platos de 35 mm. Cuatro días más tarde los sobrenadantes de estos discos o platos de cultivo son recolectados y luego se almacenan los mismos a 4 °C. Un clon que contiene la citostatina II insertada apropiadamente es identificada por el análisis de ADN que incluye el secuenciamiento y la asignación de coordenadas de la restricción. Esto se designa aquí como V-citostatina II. Las células de Sf9 se hacen crecer en el medio de Grace suplementado con FBS inactivado con calor al 10%. Las células son infectadas con la V-Citostatina II del baculovirus recombinante en una multiplicidad de sitios de infección ("MOI") de 2. Seis horas más tarde el medio es removido y se reemplaza con el medio de SF900 menos la metionina y la cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg) . 42 Horas más tarde se agregan 5 µCi de 35S-metionina y 5 µCi de 35S cisteína (Amersham) . Las células son incubadas adicionalmente durante 16 horas y las mismas son colectadas entonces por centrifugación, usadas y las proteínas etiquetadas son visualizadas por SDS-PAGE y autorradiografía.

Ejemplo 3 Expresión de la citostatina II humana en las células de COS El plásmido de la expresión, la Citostatina II HA, es derivada del vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) el origen de SV40 de la replicación, 2 el gen de resistencia a la ampicilina, 3) el origen de la replicación del E. coli, 4) el promotor de CMV seguido por la región polienlazadora, un intron de SV40 y el sitio de poliadenilación. Un fragmento de ADN que codifica el precursor de la Citostatina II completa y una etiqueta de HA fusionada en el marco a su extremo 3' es clonado en la región polienlazadora del vector de modo que la expresión de la proteína recombinante sea dirigida por el promotor de CMV. La etiqueta de HA corresponde a un epítope derivado de la proteína de hemaglutinina influenza descrita por Wilson et al., Cell 37_: 7^7 (1984). La fusión de la etiqueta de HA a la proteína de blanco u objetivo permite una fácil detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epítope de HA. La estrategia para la construcción del plásmido es como sigue. La secuencia de ADN que codifica la citostatina II del clon depositado fue construida por PCR sobre el EST clonado original utilizando dos cebadores. El cebador en 5' es GCGC GGATCC GCC ACC ATG GTG GAG GCT TTC TGT, que contiene el sitio de BamHl subrayado seguido por 8 nucleótidos de la secuencia de codificación de la citostatina II que parte del codón de iniciación. La secuencia 3' es GCGC TCTAGA TCA AGC GTA GTC TGG GAC GTC GTA TGG GTA TGC CTT ATA GTG que contiene el sitio de Bbal subrayado, un codón de parada de la translación o traducción, una etiqueta de HA y los últimos 12 nucleótidos de la secuencia de codificación de la citostatina II (que no incluye el codón de parada) . Por lo tanto, el producto de PCR contiene un sitio de BamHl, la secuencia de codificación de la citostatina II seguido por una etiqueta de HA fusionada a la citostatina II en el marco, un codón de parada de terminación de la translación o traducción a continuación de la etiqueta de HA, y un sitio de Xbal. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNAI/Amp, son diferidos con BamHl y Xbal y luego se ligan o unen. La mezcla de unión es transformada en la cepa SURE del E. coli (disponible de Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, la Jolla, CA 92037) el cultivo transformado es colocado en placas sobre las placas del medio de ampicilina y se seleccionan las colonias resistentes. El ADN del plásmido es aislado de los transformantes y examinado por el análisis de restricción para verificar la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de la citostatina II recombinante, las células de COS son transfectadas con el vector de la expresión utilizando los métodos descritos, por ejemplo, en DEAE-DEXTRAN, como se describió por ejemplo en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) . La expresión de la proteína de fusión de HA-citostatina II se detectó por radioetiquetación e inmunoprecipitación, utilizando los métodos descritos en, por ejemplo, Harlow et al., ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, 2/a. Ed.; Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988). Las células son etiquetadas durante 8 horas con la 35S-cisteína dos días después de la transfección. El medio del cultivo es colectado entonces y las células son usadas con detergente (solución amortiguadora RIPA (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50mM Tris, pH 7.5) (Wilson et al., id.). Tanto el lisato celular como el medio de cultivo son precipitados con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas son analizadas sobre geles de SDS-PAGE al 15%, los cuales muestran un producto de expresión del tamaño esperado.

Ejemplo 4 Distribución del tejido de la expresión de la citostatina II El análisis de manchado de Northern se lleva a cabo para examinar los niveles de la expresión de la citostatina II en los tejidos humanos, utilizando los métodos descritos, entre otros, por Sambrook et al, citado anteriormente. Las muestras de ARN celular completo son aisladas con el sistema RNAzol™ (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, Tx 77033) . Aproximadamente 10 µg del ARN total aislado de cada tejido humano especificado son separados sobre un gel de agarosa al 1%. El gel es impregnado o manchado sobre un gen de citostatina II de longitud completa de un filtro de nilón y se hibridiza a una sonda de polinucleótidos etiquetada. La reacción de etiquetación se hace de acuerdo con el juego o conjunto Prime-It de Stratagene con el fragmento de ADN de 50 ng. El ADN etiquetado es purificado con una columna Select-G-50 (5 Primer - 3 Primer, Inc. 5603 Araphos Road, Boulder, CO 80303) . El filtro es hibridizado entonces con el gen de la citostatina II de longitud completa, etiquetado, radioactivo, a 1,000,000 cpm/ml en 0.5 M NaP04, pH 7.4 y 7% SDS toda la noche a 65 °C. Después del lavado dos veces a temperatura ambiente y dos veces a 60 °C con 0.5 x SSC, 0.1% SDS, el filtro se seca y luego se expone a una película a -70 °C toda la noche con un tamiz o rejilla intensificadora. El ARNm para la citostatina II es abundante en el cerebro.

Ejemplo 5 Expresión terapéutica del gen de la citostatina II Humana Los fibroblastos son obtenidos de un sujeto por biopsia de la piel. El tejido resultante se coloca en un medio de tejido-cultivo y se separa en piezas pequeñas. Se colocan trozos pequeños del tejido sobre una superficie húmeda de un frasco de cultivo del tejido, aproximadamente diez piezas son colocadas en cada frasco o recipiente. El frasco es girado de arriba a abajo, se cierra herméticamente y se deja a temperatura ambiente toda la noche. Después de 24 horas a temperatura ambiente, el recipiente es invertido - los trozos del tejido permanecen fijos en el fondo del recipiente - y se agrega medio fresco (por ejemplo, el medio F12 de Ham, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina) . El tejido es incubado entonces a 37 °C durante aproximadamente una semana. En este tiempo, se agrega medio fresco y subsiguientemente se cambia cada varios días. Después de unas dos semanas adicionales en el cultivo, suge una monocapa de fibroblastos. La monocapa es tripsinizada y escalada en frascos más grandes. Un vector para la terapia del gen es diferido con las enzimas de restricción para la clonación de un fragmento que va a ser expresado. El vector digerido es tratado con la fosfatasa intestinal del bovino para prevenir la autounión o autoadherencia. El vector lineal, desfosforilado, es fraccionado sobre un gel de agarosa y purificado. El ADNc de la citostatina capaz de la expresión de la citostatina II activa, es aislado. Los extremos del fragmento son modificados, si es necesario, para la clonación en el vector. Por ejemplo, el sobrecolgante de 5" puede ser tratado con la polimerasa del ADN para crear extremos desaliñados. Los extremos sobrecolgantes de 3' pueden ser removido utilizando la nucleasa SI. Los enlazadores pueden ser unidos a los extremos desafilados con la ligasa del ADN de T4.

Cantidades iguales del esqueleto lineal del virus de la leucemia del murino de Moloney y el fragmento de la citostatina II son mezcladas conjuntamente y unidas utilizando la ligasa del ADN de T4. La mezcla de unión es utilizada para transformar el E. coli y las bacterias son colocadas entonces sobre placas, sobre la kanamicina que contiene el agar. El análisis de restricción y del fenotipo de la kanamicina confirman que el vector tiene el gen insertado apropiadamente. Las células de empaque se hicieron crecer en el cultivo del tejido a una densidad confluente en el Medio de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM) con suero de bovino al 10% (CS) , penicilina y estreptomicina. El vector que contiene el gen de la citostatina II es introducido en las células de empaque o envase por técnicas estándares. Las partículas virales infecciosas que contienen el gen de la citostatina II son colectadas a partir de las células de empaque o envase, las cuales son llamadas ahora las células productoras. El medio fresco es agregado a las células productoras, y después de un período de incubación apropiado el medio es colectado desde las placas de las células productoras confluentes. El medio, que contiene las partículas virales infecciosas, es filtrado a través de un filtro Millipore para remover las células productoras desunidas. El medio filtrado es utilizado entonces para infectar las células de los fibroblastos. El medio es removido de una placa subconfluente de fibroblastos y se reemplaza rápidamente con el medio filtrado. El polibreno (Aldrich) puede ser incluido en el medio para facilitar la transducción. Después de la incubación apropiada, el medio es removido y reemplazado con un medio fresco. Si la concentración del virus es elevada, entonces virtualmente todos los fibroblastos serán infectados y no se requiere ninguna selección. Si la concentración es baja, entonces es necesario utilizar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como neo o his, para seleccionar las células transducidas para la expansión. Los fibroblastos diseñados pueden ser inyectados en ratas, ya sea solos o después de que se hayan hecho crecer para que confluyan sobre las perlas o glóbulos microportadores, tales como 3 perlas o glóbulos de citodex. Los fibroblastos inyectados producen el producto de la citostatina II, y las acciones biológicas de la proteína son transportadas al huésped. Será claro que la invención puede ser practicada de otra manera diferente que aquella descrita particularmente en la descripción y ejemplos precedentes. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, están dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una región al menos 95% idéntica en susecuencia a un ARN o ADN que codifica los aminoácidos 1-132 en la Figura 1.

2. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región es continua o está formada por una pluralidad de exones no contiguos.

3. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región es un ADN genómico o un ADNc.

4. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3 caracterizado porque la secuencia de la región es aquella de los nucleótidos 16-411 en la figura 1.

5. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región es al menos 95% idéntica en su secuencia a un ARN o ADN que codifica los aminoácidos 1-132 en la Figura 1.

6. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la secuencia de la región es aquella de los nucleótidos 16-396 en la Figura 1.

7. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende una región al menos 95% idéntica en su secuencia a un ARN o ADN que codifica el polipéptido de la citostatina II del inserto de ADNc humano del Depósito No. : 97287 del ATCC.

8. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el ARN o ADN codifica el polipéptido maduro del inserto de ADNc humano del Depósito No.: 97287 del ATCC.

9. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la región es la región de codificación del inserto de ADNc del Depósito No.: 97287 del ATCC.

10. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la región es el inserto de ADNc del Depósito No.: 97287 del ATCC.

11. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende elementos de control de funcionamiento cis, efectivos para la expresión en una célula huésped de un polinucleótido enlazado operativamente, en donde el polinucleótido es un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.

12. Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque los elementos de control son efectivos para una expresión inducible del polinucleótido en la célula huésped.

13. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende los elementos de control de funcionamiento, efectivos para la expresión en una célula huésped de un polinucleótido enlazado operativamente, en donde el polinucleótido es un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7.

14. Una célula huésped, caracterizada porque tiene incorporado establemente en la misma un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.

15. Una célula huésped, caracterizada porque tiene incorporado establemente en la misma un inserto de ADNc de conformidad con la reivindicación 7.

16. Una célula huésped, caracterizada porque tiene incorporado expresablemente en la misma un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 11.

17. Una célula huésped, caracterizada porque tiene incorporada expresablemente en la misma un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 13.

18. Un proceso para fabricar un polipéptido, caracterizado porque comprende el paso de expresar en una célula huésped un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.

19. Un proceso para fabricar un polipéptido, caracterizado porque comprende el paso de expresar en una célula huésped un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7.

20. Un polipéptido, caracterizado porque está codificado por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1.

21. Un polipéptido, caracterizado porque está codificado por un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 7.