MXPA98001645A - Oocitos inactivados como receptores de citoplastopara transferencia nuclear - Google Patents

Abstract

Un método para reconstituir un embrión de animal implica transferir un núcleo diploide a un oocito, el cual estádetenido en la metafase de la segunda división meiótica. El oocito no es activado en el momento de la transferencia, de manera que el núcleo donador se mantiene expuesto al citoplasma receptor durante un período. El núcleo diploide puede ser donado por una célula ya sea en la fase G0 o G1 del ciclo de la célula en el momento de la transferencia. Subsecuentemente, el embrión reconstituido es activado. La ploidía correcta es mantenida durante la activación, por ejemplo, incubando el embrión reconstituido en presencia de un inhibidor de microtúbulo, tal como nocodazol. El embrión reconstituido entonces puede dar surgimiento a uno o más nacimientos de animales vivos. La invención esútil en la producción de animales transgénicos, asícomo no transgénicos, de alto mérito genético.

Description

OOCITOS INACTIVADOS COMO RECEPTORES DE CITOPLASTO PARA TRANSFERENCIA NUCLEAR DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a la generación de animales, incluyen, pero no limitándose a animales genéticamente seleccionados y/o modificados, y a células útiles en su generación. La reconstrucción de embriones de mamíferos a través de la transferencia de un núcleo donador a un oocito enucleado o un cigoto de célula permite la producción de individuos genéticamente idénticos. Esto presenta claras ventajas tanto para la investigación (es decir, como controles biológicos) y también en aplicaciones comerciales (es decir multiplicación de ganado genéticamente valioso, uniformidad en los productos de carne, manejo del animal).

Primero se propuso la reconstrucción de embrión a través de transferencia nuclear (Spemann, Embryonic Development and Induction 210-2111 Hofner Publishing Co., Nueva York (1938)) con el fin de responder a la pregunta de la equivalencia nuclear o '¿si los núcleos cambian durante el desarrollo?'. Mediante la transferencia de núcleos de etapas embriónicas enormemente avanzadas, estos experimentos fueron diseñados para determinar en que punto los núcleos quedan restringidos en su desarrollo potencial. Debido a limitaciones técnicas y a la infortunada muerte de Spemann, estos estudios no se completaron hasta 1952, cuando se demostró en la rana que ciertos núcleos pueden dirigir el desarrollo a un adulto sexualmente maduro (Briggs y King, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 38 455-461 (1952)). Sus hallazgos condujeron al concepto actual de que los núcleos totipotentes equivalentes de un sólo individuo pueden, cuando son transferidos a un huevo enucleado, dar surgimiento a individuos "genéticamente idénticos". En el sentido verdadero del significado, estos individuos no podrían ser clones ya que las contribuciones c?toplásmicas desconocidas en cada uno pueden variar y también la ausencia de cualesquiera redisposiciones cromosomales pudieron haber sido demostradas. Desde la demostración de la clonación de embrión en anfibios, se han aplicado técnicas similares a especies de mamíferos. Estas técnicas caen en dos categorías: 1) transferencia de un núcleo donador a ún oocito de metafase II maduro, al cual se le ha removido su ADN cromosomal y 2) transferencia de un núcleo donador a un cigoto de célula fertilizado, al cual se le han removido ambos pronúcleos. En ungulados, el primer procedimiento se volvió el método de elección ya que no se reportó ningún desarrollo usando el último diferente cuando se intercambian los pronúcleos. La transferencia del núcleo donador al citoplasma de oocito generalmente se logra induciendo la fusión celular. En ungulados, la fusión es inducida a través de la aplicación de un pulso eléctrico DC (corriente directa) a través del plano de contacto/fusión del par. El mismo pulso, el cual induce la fusión de célula también activa el oocito receptor. Después de la reconstrucción del embrión, el desarrollo adicional depende de un gran número de factores, incluyendo la habilidad del núcleo para dirigir el desarrollo, es decir, totipotencia, competencia de desarrollo del citoplasto receptor (es decir, maduración del oocito), activación del oocito, cultivo del embrión (revisado por Campbell y Wilmut en Vth World Congress on Genetics as Applied to Livestock 20 180-187 (1994)). Además de lo anterior, se ha mostrado que el mantenimiento correcto de la ploidía durante el primer ciclo de la célula del embrión reconstruido es de gran importancia (Campbell et al., Biol. Reprod. 49 933-942 (1993); Campbell et al., Biol. Reprod. 50 1385-1393 (1994)). Durante un ciclo de célula individual, todo el ADN genómico debe ser replicado a la vez y solamente una vez antes de la mitosis. Si cualquiera del ADN falla en la replicación o es replicado más de una vez, entonces la ploidía de ese núcleo en el momento de la mitosis será incorrecta. Los mecanismos a través de los cuales se restringe la replicación a una vuelta individual durante cada ciclo de célula son no claros, sin embargo, varias líneas de evidencia han implicado que el mantenimiento de una membrana nuclear intacta es crucial a este control. Los casos morfológicos que ocurren en el núcleo donador después de la transferencia a un oocito de metafase II enucleado, han sido estudiados en un número de especies, incluyendo ratón (Czolowiska et al., J. Cell Sci. 69 19-34 (1984)), conejo (Collas y Robl, Biol. Reprod. 45 455-465 (1991)), cerdo (Prather et al., J. Exp. Zoo!. 225355-358 (1990)), vaca (Kanka et al., Mol. Reprod. Dev. 29 110-116 (1991)). Inmediatamente después de la fusión la envoltura nuclear donadora se rompe (NEBD), y los cromosomas prematuramente se condensa (PCC). Estos efectos son catalizados a través de una actividad citoplásmica denominada factor promotor de maduración/mitosis/meiosis (MPF). Esta actividad se encontró en todas las células mitóticas y meióticas que alcanzan una actividad máxima en la metafase. Los oocitos de mamífero maduros son detenidos en la metafase de la 2a división meiótica (metafase II) y tiene MPF de alta actividad. Después de la fertilización o activación, la actividad del MPF declina, la segunda división meiótica es completada y el segundo cuerpo polar es extruído, la cromatina entonces se descondensa y ocurre la formación pronuclear. En la transferencia nuclear, ocurren embriones reconstruidos cuando los de MPF son altos en NEBD y PCC; estos casos son seguidos, cuando la actividad de MPF declina, por la descondensación de la cromatina y la reformación nuclear y la subsecuente replicación de ADN. En embriones reconstruidos, se puede mantener una ploidía correcta en una de estas dos maneras; en primer lugar, transfiriendo núcleos en una etapa de ciclo de célula definida, por ejemplo, núcleos diploides de células en G1, a oocitos de metafase II en el momento de la activación; o en segundo lugar activando el oocito receptor y transfiriendo el núcleo donador después de la desaparición de la actividad de MPF. En la oveja, este último aspecto ha producido un incremento en la frecuencia de desarrollo a la etapa de blastocisto de 21% a 55% de embriones reconstruidos, cuando se usan blastómeros de embriones de 16 células como donadores nucleares (Campbell et al., Biol. Reprod. 50 1385-1393 (1994)). Estas mejoras en la frecuencia de desarrollo de embriones reconstruidos aún no han sido dirigidas a la cuestión de la reprogramación nuclear. Durante el desarrollo, ciertos genes quedan "marcados", es decir, son alterados, de manera que ya no son transcritos. Estudios sobre la marcación han mostrado que esta "marcación" es removida durante la formación de la célula germinal (es decir, reprogramación). Una posibilidad es que esta reprogramación es afectada por la exposición de la cromatina a factores citoplásmicos, los cuales están presentes en células que sufre meiosis. Esto incrementa la cuestión de cómo se puede imitar esta situación durante la reconstrucción de embriones a través de la transferencia nuclear, con el fin de reprogramar el reloj del desarrollo del núcleo donador. Se ha encontrado ahora que la transferencia nuclear a un oocito detenido en la metafase II puede dar surgimiento a un embrión viable, si una ploidía normal (es decir, diploidía) se mantiene y si el embrión no es activado en el momento de la transferencia nuclear. El retraso en la activación permite que el núcleo permanezca expuesto al citoplasma receptor. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se provee un método para reconstruir un embrión de animal, el método comprende transferir un núcleo diploide a un oocito, el cual está detenido en la metafase de la segunda división meiótica son activar concomitantemente el oocito, mantener al núcleo expuesto al citoplasma del receptor durante un período suficiente para que el embrión reconstituido sea capaz de dar surgimiento a un nacimiento vivo y subsecuentemente activar al embrión reconstituido, mientras se mantiene la ploidía correcta. En esta etapa, el embrión reconstituido es una célula individual. En principio, la invención es aplicable a todos los animales, incluyendo aves, tales como aves de corral, especies anfibias y especies acuáticas (peces). En la práctica, sin embargo, serán animales no humanos, especialmente mamíferos (no humanos), particularmente mamíferos de placenta, en donde se observará la mayor aplicabilidad comercialmente útil. Esto es con los ungulados, particularmente ungulados económicamente importantes tales como ganado, ovejas, cabras, búfalo de la India, camellos y cerdos, en donde la invención probablemente es muy útil, tanto como medios para clonar animales y como medios para generar animales transgénicos. Se debe observar también que la invención probablemente también es aplicable a otras especies animales económicamente importantes tales como, por ejemplo, caballos, llamas o roedores, por ejemplo, ratas o ratones, o conejos. La invención es igualmente aplicable en la producción de animales transgénicos, así como de no transgénicos. Los animales transgénicos pueden ser producidos a partir de células donadoras genéticamente alteradas. Todo el procedimiento tiene un número de ventajas sobre los procedimientos convencionales para la producción de animales transgénicos (es decir, genéticamente modificados), las cuales pueden ser resumidas como sigue: (1) se requerirán muy pocos receptores; (2) se pueden generar múltiples fundadores singénicos usando células donadoras clónales; (3) se permite la alteración genética sutil a través del gen objetivo; (4) todos los animales producidos a partir de embriones preparados por medio de la invención deben transmitir la modificación genética relevante a través de la línea germinal ya que cada animal se deriva de un núcleo individual; en contraste, la producción de animales transgénicos a través de inyección pronuclear o quimerismo después de la inclusión de poblaciones de célula del tallo modificada mediante inyección de blastocisto produce una proporción de animales mosaico, en los cuales todas las células no contienen la modificación y el animal resultante no puede transmitir la modificación a través de la línea germinal; y (5) las células pueden ser seleccionadas para el sitio de modificación genética (por ejemplo, integración) antes de la generación del animal completo. Se debe observar que el término "transgénico", con relación a animales, no debe ser tomado como limitante con referencia a animales que contienen en su línea germinal uno o más genes de otra especie, aunque muchos animales transgénicos contendrán dicho gen o genes. Más bien, el término se refiere más ampliamente a cualquier animal cuya línea germinal haya sido el tema de intervención técnica por la tecnología de ADN recombinante. Así, por ejemplo, un animal en cuya línea germinal un gen endógeno ha sido eliminado, duplicado, activado o modificado, es un animal transgénico para los propósitos de esta invención, tanto como un animal para cuya línea germinal ha sido agregada una secuencia de ADN exógeno. En las modalidades de la invención, en donde el animai es transgénico, el núcleo donador es genéticamente modificado. El núcleo donador puede contener uno o más transgenes y la modificación genética puede presentarse antes de la transferencia nuclear y de la reconstitución del embrión. Aunque la microinyección, análoga a la inyección al pronúcleo del macho o de la hembra de un cigoto, puede ser utilizada como un método de modificación genética, la invención no está limitada a esa metodología; también se pueden utilizar técnicas de transformación y de transfección, por ejemplo, electroporación, transfección o lipofección viral. En el método de la invención descrito anteriormente, un núcleo diploide es transferido de un donador ai oocito receptor enucleado. Los donadores que son diploides en el momento de la transferencia son necesarios con el fin de mantener la ploidía correcta del embrión reconstituido; por lo tanto, los donadores pueden estar ya sea en la fase G1 o preferiblemente, como es el tema de nuestra solicitud de patente de PCT co-pendiente No. PCT/GB96/02099, presentada ahora (reclamar prioridad de GB 9517780.4), en la fase GO del ciclo de la célula. El ciclo de la célula mitótica tiene cuatro fases distintas, G, S, G2 y M. El principio en el ciclo de la célula, denominado inicio, toma lugar en la fase G1 y tiene una función única. La decisión o compromiso para sufrir otro ciclo de célula se hace en inicio. Una vez que una célula ha pasado a través de inicio, ésta pasa a través del resto de la fase G1, la cual es la fase de síntesis de pre-ADN. La segunda etapa, la fase S, es cuando se presenta la síntesis del ADN. Esto es seguido por la fase G2, la cual es el período entre la síntesis de ADN y mitosis. La mitosis por si misma ocurre en la fase M. Las células inactivas (las cuales incluyen células en donde la inactividad ha sido inducida, así como aquellas células, las cuales son naturalmente inactivas, tales como ciertas células totalmente diferenciadas) son generalmente consideradas como no siendo de ninguna de estas cuatro fases del ciclo; usualmente son descritas como estando en el estado GO, para indicar que no podrían normalmente progresar a través del ciclo. Los núcleos de las células GO inactivas, como los núcleos de las células G1, tienen un contenido de ADN diploide; ambos núcleos diploides pueden ser usados en la presente invención. Con respecto a lo anterior, se cree que no existe limitación significativa en las células que pueden ser usadas en donadores nucleares: se pueden utilizar células total o parcialmente diferenciadas o no diferenciadas, ya que las células que son cultivadas in vitro o abstraídas ex vivo. La única limitación- es que las células donadoras tienen un contenido normal de ADN y son cariotípicamente normales. U na fuente preferida de células se describe en la solicitud de patente de PCT co-pendiente No. PCT/GB95/02095, publicada como WO 96/07732. Se cree que todas las células normales contienen toda la información genética requerida para la producción de un animal adulto. La presente invención permite que esta información sea provista al embrión en desarrollo alterando la estructura de la cromatina, de manera que el material genético puede re-dirigir el desarrollo. Las células receptoras útiles en la invención son oocitos enucleados, los cuales están detenidos en la metafase de la segunda división meiótica. En la mayoría de los vertebrados, la maduración de oocitos prosigue in vivo a esta etapa definitivamente final del procedimiento de maduración de huevo y después se detiene. En la ovulación, el oocito detenido es liberado del ovario (y, si ocurre la fertilización , el oocito es naturalmente estimulado para completar la meiosis) . En la práctica de la invención , los oocitos pueden ser madurados ya sea in vitro o in vivo y so recogidos al aparecer el primer cuerpo polar o lo más pronto posible después de la ovulación , respectivamente. Se prefiere que el receptor sea enucleado . Ya que generalmente se ha asumido que la enucleación de oocitos receptores en procedimientos de transferencia nuclear es esencial , no existe ninguna confirmación experimental publicada de este juicio.

El procedimiento original descrito para ungulados involucró la división de la célula en dos mitades, una de las cuales probablemente estaba enucleada (Willadsen Nature 320 (6) 63-65 (1986)). Este procedimiento tiene la desventaja de que otra la mitad desconocida seguirá teniendo el aparato de metafase y que la reducción en volumen del citoplasma se cree que acelera el patrón de diferenciación del nuevo embrión (Eviskov et al. , Development 109 322-328 (1990)) . Más recientemente, se han utilizado diferentes procedimientos con el intento de remover los cromosomas con un mínimo de citoplasma. Se encontró que la aspiración del primer cuerpo polar y citoplasma circundante remueve el aparato de metafase I I en un 67% de los oocitos de ovejas (Smith & Wilmut Bio. Reprod. 40 1027-1035 (1989)). Solamente con el uso de fluorocromo específico para AD N (Hoechst 33342) fue un método provisto mediante el cual la enucleación podría ser garantizada con el mínimo de reducción en el volumen citoplasmático (Tsunoda et al. , J. Reprod. Fértil. 82 173 (1988)). En especies de ganado, este es probablemente el método de uso de rutina en la actualidad (Prather & First J. Reprod. Fértil. Sppl. 41 125 (1990) , Westhusin et al . , Biol. Reprod. (Suppl.) 42 176 (1990)) . Ha habido muy pocos reportes de aspectos no agresivos para la enucleación en mam íferos , mientras q ue en anfibios, se usa la irradiación con luz ultravioleta como un procedimiento de ruti na (Gurdon Q. J. Microsc. Soc. 101 299-31 1 (1960)) . No hay reportes detallados con respecto al uso de este aspecto en mamíferos, aunque durante el uso de fluorocromo específico para ADN, se observó que la exposición de oocitos de ratón a la luz ultravioleta durante más de 30 segundos redujo el potencial de desarrollo de la célula (Tsunoda et al., J. Reprod. F rtil. 82 173 (1988)). Como se describió anteriormente, la enucleación puede ser lograda físicamente, mediante remoción real del núcleo, pro-núcleos placa de metafase (dependiendo de la célula receptora), o funcionalmente, tal como mediante la aplicación de radiación ultravioleta u otra influencia de enucleación. Después de la enucleación, el núcleo donador es introducida ya sea a través de fusión a células donadoras bajo condiciones, las cuales no inducen la activación del oocito o mediante ia inyección bajo condiciones no activadoras. Con el fin de mantener la ploidía correcta del embrión reconstruido, el núcleo donador debe ser diploide (es decir, en la fase GO o G1 del ciclo de la célula) en el momento de la fusión. Una vez que las células donadoras y receptoras adecuadas han sido detectadas, es necesario que el núcleo de las anteriores sea transferido a las últimas. Más convenientemente, la transferencia nuclear es efectuada mediante fusión. La activación no debe presentarse en el momento de la fusión. Tres métodos establecidos, los cuales han sido utilizados para inducir la fusión son: (1) exponer la células a compuestos químicos promotores de fusión, tales como glicol polietilénico; (2) usar virus inactivados, tales como el virus de Sendai; y (3) usar estimulación eléctrica. La exposición de las células a compuestos químicos promotores de fusión, tales como glicol polietilénico u otros glicoles, es un procedimiento de rutina para la fusión de células somáticas, pero no ha sido ampliamente utilizado con embriones. Ya que el glicol polietilénico es tóxico, es necesario exponer las células durante un período mínimo y la necesidad de ser capaces de remover el compuesto químico rápidamente, puede necesitar la remoción de la zona pellucida (Kanka et al., Mol. Reprod. Dev. 29 110-116 (1991)). En experimentos con embriones de ratón, el virus de Sendai inactivado proporciona medios eficientes para la fusión de células a partir de embriones de etapa de escisión (Graham Wistar Inst. Symp. Monogr. 9 19 (1969)), con la ventaja experimental adicional de que la activación no es inducida. En ungulados, la fusión se logra comúnmente a través de la misma estimulación eléctrica que se usa para inducir la activación partogenética (Willadsen Nature 320 (6) 63-65 (1986), Prather et al., Biol. Reprod. 37 859-866 (1987)). En estas especies, el virus de Sendai induce la fusión en una proporción de casos, pero no es suficientemente confiable para aplicación de rutina (Willadsen Nature 320 (6) 63-65 (1986)). Ya que la fusión de célula-célula es un método preferido para efectuar la transferencia nuclear, no solamente es el método que puede ser usado. Otras técnicas adecuadas incluyen microinyección (Ritchie y Campbell, J. Reproduction and Fertility, Abstract Series No. 15, p60). En una modalidad preferida de la invención, la fusión del par de carioplasto de oocito se logra en ausencia de la activación a través de electropulsación en una solución de 0.3M de manitol o una solución de 0.27M de sacarosa; alternativamente, el núcleo puede ser introducido mediante inyección en un medio libre de calcio. La edad de los oocitos en el momento de la fusión/inyección y la ausencia de iones de calcio del medio de fusión/inyección evitan la activación del oocito receptor. En la práctica, es mejor enuclear y conducir la transferencia lo más pronto posible después de que el oocito alcance la metafase I I . El tiempo que esto será posterior al inicio de la maduración (in vitro) o del tratamiento con hormona (in vivo) dependerá de las especies . Para ganado vacuno u ovejas, la transferencia nuclear debe presentarse preferiblemente en 24 horas; para cerdos en 48 horas ; ratones, en 12 horas; y conejos en 20-24 horas. Aunque la transferencia puede presentarse después, se vuelve progresivamente más difícil lograr a medida que se envejece el oocito . Se desea una alta actividad de MPF. Subsecuentemente, el embrión reconstruido fusionado, el cual generalmente es regresado al medio de maduración , es mantenido sin ser activado, de manera que el núcleo donador está expuesto a! citoplasma receptor durante un período suficiente para permitir que el embrión reconstruido sea capaz de, finalmente, dar surgimiento a un nacimiento vivo (de preferencia de una descendencia fértil). El período óptimo antes de la activación varía de especie a especie y puede ser fácilmente determinado mediante experimentación. Para ganado vacuno, es apropiado un período de 6 a 20 horas. El período probablemente no debe ser menor que aquel que permitirá que la formación del cromosoma, y no debe ser lo suficientemente largo que el par se active espontáneamente, en casos extremos que muera. Cuando es el momento de la activación , se puede utilizar cualquier protocolo de activación convencional u otro adecuado. Experimentos recientes han mostrado que los requerimientos para la activación partogenética sean más complicados que lo que se había imaginado. Se ha dicho que la activación es un fenómeno todo o nada y que el gran número de tratamientos capaces de inducir la formación de un pronúcleo todos fueron causa de "activación". Sine embargo, la exposición de oocitos de conejo a pulsos eléctricos repetidos reveló que solamente la selección de una serie apropiada de pulsos y el control de Ca2+ fue capaz de promover el desarrollo de oocitos diploidizados a gestación media (Ozil Deveolpment 109 1 17-127 (1990)) . Durante la fertilización , se presentan incrementos pasajeros , repetidos en la concentración del calcio intracelular (Cutbertson & Cobbold Natura 31 6 541 -542 ( 1 985)) y se cree que los pulsos eléctricos ocasionan incrementos análogos en la concentración del calcio. Existe la evidencia de que el patrón de concentraciones pasajeras de calcio varía con las especies , y se puede anticipar que el patrón óptimo de pulsos eléctricos variará en una forma similar. El intervalo entre pulsos en el conejo es de aproximadamente 4 minutos (Ozil Development 109 117-127 (1990)), y en el ratón de 10 a 20 minutos (Cutbertson & Cobbold Nature 316 541-542 (1985)), mientras que existen observaciones preliminares en la vaca de que el intervalo es de aproximadamente 20 a 30 minutos (Robl et al., en Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation (Seidel ed.) Colorado State University, 24-27 (1992)). En la mayoría de los experimentos publicados, la activación fue inducida con un sólo pulso eléctrico, pero nuevas observaciones sugieren que la proporción de embriones reconstituidos que se desarrollan se incrementa a través de la exposición a varios pulsos (Collas & RobI Biol. Reprod. 43 877-884 (1990)). En cualquier caso individual, se pueden hacer ajustes de rutina para optimizar el número de pulsos, la resistencia de campo y la duración de los pulsos y la concentración de calcio en el medio. En la práctica de la invención, la ploidía correcta debe ser mantenida durante la activación. Es deseable inhibir o estabilizar la polimerización de microtúbulo con el fin de evitar la producción de pronúcleos múltiples, para mantener así la ploidía correcta. Esto puede lograrse a través de la aplicación de un inhibidor de microtúbulo tal como nocodazol a una concentración efectiva (tal como aproximadamente 5 µg/ml). Otros inhibidores de microtúbulo son colchicina y colcemid. Alternativamente, se puede utilizar un estabilizador de microtúbulo, tal como, por ejemplo, taxol.

El componente molecular de los microtúbulos (tubilina) está en un estado de equilibrio dinámico entre los estados polimerizado y no polimerizado. Los inhibidores de microtúbulo, tales como nocodazol, evitan la adición de moléculas de tubulina a los microtúbulos, alterando así ei equilibrio y conduciendo a la despolimerización del microtúbulo y a la destrucción del huso. Se prefiere agregar al microtúbulo un inhibidor, durante un tiempo suficiente antes de la activación para asegurar una completa despolimerización, o casi completa, de los microtúbulos. En la mayoría de los casos, es probable que 30 minutos sean suficientes. Un estabilizador de microtúbulo, tal como taxol, evita la ruptura del huso y también puede evitar, por lo tanto, la producción de pronúcleos múltiples. El uso de un estabilizador de microtúbulo es preferiblemente bajo condiciones similares a aquellas usadas para inhibidores de microtúbulo. El inhibidor de microtúbulo o estabilizador debe permanecer presente después de la activación hasta la formación de pronúcleos. Este debe ser removido después, y en cualquier caso, antes de que se presente la primera división. En una modalidad preferida de la invención, a las 30-42 horas después del inicio de la maduración (bovino y ovino, es decir 6-18 horas después de la transferencia nuclear), los oocitos reconstruidos son colocados en un medio que contiene nocodazol (5 µg/ml) y activados utilizando protocolos convencionales. La incubación en nocodazol puede ser continuada durante 4-6 horas después del estímulo de activación (dependiendo de la especie y la edad del oocito). De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se provee un embrión de animal reconstituido, viable, preparado a través de un método como se describió previamente. De acuerdo a un tercer aspecto de la presente invención, se provee un método para preparar un animal, que comprende: (a) reconstituir un embrión de animal como se describió anteriormente; y (b) hacer que un animal se desarrolle a término a partir del embrión; y (c) opcionalmente, engendrar del animal así formado. El paso (a) ha sido descrito con profundidad anteriormente. El segundo paso, el paso (b) en el método de este aspecto de la invención es hacer que un animal se desarrolle a término a partir del embrión. Esto puede realizarse directa o indirectamente. En el desarrollo directo, el embrión reconstituido del paso (a) simplemente se deja desarrollar sin una intervención adicional más allá de cualquiera que sea necesaria para permitir que el desarrollo se presente. En el desarrollo indirecto, sin embargo, el embrión puede ser manipulado adicionalmente antes de que se presente totalmente el desarrollo. Por ejemplo, el embrión puede ser dividido y las células clonalmente expandirse, con el propósito de mejorar el rendimiento. Alternativa o adicionalmente, puede ser posible que se obtengan rendimientos incrementados de embriones viables a través de la presente invención mediante expansión clonal de donadores y/o si se hace uso de el procedimiento de transferencia en serie (nuclear). Una limitación en la velocidad de formación de blastocisto actualmente lograda, se debe al hecho de que la gran mayoría de los embriones no se "reprograman" (aunque un número aceptable lo hace). Si este es el caso, entonces la velocidad puede ser mejorada como sigue. Cada embrión que se desarrolla por sí mismo puede ser usado como un donador nuclear, tal como, por ejemplo, en la mórula o en la etapa de célula 32-64; alternativamente, se pueden usar células de masa celular interna en la etapa del blastocisto. Si estos embriones en realidad reflejan aquellos los cuales tienen expresión de gen reprogramada y aquellos núcleos en realidad son reprogramados (como parece ser lo más probable), entonces cada embrión en desarrollo debe ser multiplicado de esta manera a través de la eficiencia del procedimiento de transferencia nuclear. El grado de mejoramiento probablemente que será logrado depende del tipo de célula. En ovejas, es fácilmente posible obtener un 55% de embriones en etapa de blastocisto a través de transferencia de un blastómero individual a partir de un embrión de 16 células para un oocito de "Receptor Universal" preactivado. Por lo que es razonable hipotetizar que cada embrión desarrollado a partir de una célula individual puede dar surgimiento a ocho en la etapa de 16 células. Aunque estas cifras son sólo una guía aproximada, es claro que en las últimas etapas de desarrollo, el grado de beneficio podría depender de la eficiencia del procedimiento a esa etapa. Además de la emisión de conveniencias para mejorar el rendimiento, el embrión reconstituido puede ser cultivado, in vivo o in vitro al blastocisto. La experiencia sugiere que los embriones derivados mediante transferencia nuclear son diferentes de embriones normales y algunas veces se benefician de o aún requieren condiciones de cultivo in vivo diferentes a aquellas en las cuales los embriones son usualmente cultivados (por lo menos in vivo). La razón de esto no es conocida. En la multiplicación de rutina de embriones de bovino, se han cultivado embriones reconstituidos (muchos de ellos una vez) en oviductos de oveja durante 5 a 6 días (como se describe por Willadsen, en Mammalian Egg Transfer (Adams, E.E., ed.) 185 CRC Press, Boca Ratón, Florida (1982)). En la práctica de la presente invención, no obstante, con el fin de proteger el embrión, éste preferiblemente debe ser embebido en un medio protector tal como agar antes de la transferencia y después disecarlo del agar después de la recuperación a partir del receptor temporal. La función del agar protector u otro medio es doble: en primer lugar, actúa como un auxiliar estructural para el embrión manteniendo la zona pellucida unida; y en segundo lugar, actúa como una barrera para células del sistema inmune del animal receptor. Aunque este aspecto incrementa la proporción de embriones que forman blastocistos, existe la desventaja de que se puede perder un número de embriones. Si se usan condiciones in vitro, aquellas empleadas por rutina en la técnica son totalmente aceptables. En la etapa de blastocisto, el embrión puede ser clasificado para ser adecuado para el desarrollo a término. Típicamente, esto será realizado cuando el embrión es transgénico y se hayan realizado la clasificación y la selección de integrantes estables. También se puede llevar a cabo en esta etapa la clasificación de marcadores genéticos no transgénicos. Sin embargo, ya que el método de la invención permite la clasificación de donadores en una etapa temprana, que será generalmente preferida. Después de la clasificación, si la clasificación se realiza, el embrión de blastocisto se deja desarrollar a término. Esto generalmente será in vivo. Si ei desarrollo hasta blastocisto se presenta in vitro, entonces la transferencia al animal receptor final se presenta en esta etapa. Si el desarrollo de blastocisto se ha presentado in vivo, aunque en principio el blastocisto se deje desarrollar a término en el huésped de pre-blastocisto, en la práctica el blastocisto usualmente será removido del receptor de pre-blastocisto (temporal) y, después de la disección del medio protector, será transferido al receptor de pre-blastocisto (permanente). En el paso opcional (c) de esta aspecto de la invención, se pueden criar animales a partir del animal preparado mediante los pasos precedentes. De esta manera, se puede utilizar un animal para establecer una manada o hato de animales teniendo las características genéticas deseadas.

Los animales producidos a través de la transferencia de núcleos de una fuente de células genéticamente idénticas, comparten el mismo núcleo, pero no son estrictamente idénticos ya que se derivan de diferentes oocitos. La importancia de este origen diferente no es clara, pero puede afectar aspectos comerciales. Análisis recientes de ADN mitocondrial de ganado lechero, en lowa State University Breeding Hard, revelaron asociación con el rendimiento de leche y de reproducción (Freeman & Beitz, én Symposium on Cloning Mammals by Nuclear Transplantation (Seidel, G. E. Jr., ed.) 17-20, Colorado State University, Colorado (1992)). Esta por confirmarse que efectos similares están presentes a través de la población de ganado y considerar si es posible o necesario en situaciones específicas considerar la selección de oocitos. En el área de la crianza de ganado, la habilidad para producir grandes números de embriones a partir de donadores de alto mérito genético pueden tener un considerable valor potencial para diseminar la mejora genética a través de la manada nacional. La escala de aplicación dependerá del costo de cada embrión y la proporción de embriones transferidos capaces de desarrollarse a término. A manera de ilustración y de resumen, el siguiente esquema establece un procedimiento típico mediante el cual se pueden preparar animales transgénicos y no transgénicos. Se puede considerar que el procedimiento implica siete pasos: (1) aislamiento de células donadoras diploides; (2) opcionalmente, transgénesis, por ejemplo, a través de transfección con construcciones adecuadas, con o sin marcadores seleccionables; (2a) opcionalmente clasificar o seleccionar integrantes estables - salto para micro-inyección; (3) reconstitución del embrión a través de transferencia nuclear; (4) cultivar, in vivo o in vitro, al blastocisto; (4a) opcionalmente clasificar y seleccionar para integrantes estables - omitir si se realiza 2a - u otras características deseadas; (5) transferir, si es necesario, al receptor final. Este protocolo tiene un nú mero de ventajas sobre los métodos previamente publicados de la transferencia nuclear: 1 ) La cromatina del núcleo donador puede ser expuesta al citoplasma meiótico del oocito receptor en ausencia de activación durante períodos apropiados. Esto puede incrementar la "reprogramación" del núcleo donador alterando la estructura de la cromatina. 2) La ploidía correcta del embrión reconstruido es mantenido cuando los núcleos G0/G 1 son transferidos. 3) Estudios previos han mostrado que la sensibilidad de activación de oocitos de bovino/ovino se incrementa con la edad. U n problema , él cual ha sido previamente observado, es que en occitos envejecidos no enucleados, la duplicación de los cuerpos del polo de huso meiótico ocurre y se observan husos multipolares. Sin embargo , se reporta que en embriones reconstruidos y mantenidos con altos niveles de MPF, y aunque ocurrió la ruptura de la envoltura nuclear y la condensación de cromatina, no se observó ningún huso organizado. Los cromosomas prematuramente condensados permanecen en un grupo apretado, por lo tanto, se puede tomar ventaja del procedimiento de añejamiento e incrementar la respuesta de activación del oocito reconstruido son afectar adversamente la ploid ía del embrión reconstruido. De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención , se provee un animal preparada como se describió anteriormente. Las características preferidas para cada aspecto de la invención son como para cada aspecto entre sí, mutatis mutandis. La presente invención ahora será descrita haciendo referencia a los Ejemplos anexos, los cuales se proveen para propósitos de ilustración y no están construidos como limitantes de la presente invención . En la siguiente descripción , se hace referencia al dibujo anexo, en el cual: La Figura 1 muestra la velocidad de maduración de oocitos de bovino in vitro.

EJEMPLO 1 Procedimiento " MAGIC" Utilizando Oocitos de Bovino Los oocitos receptores, el tema de este procedimiento experimental, son designados como Receptores MAGIC (Metaphase Arrested G.1/G0 Acceplng Cytoplast) (Citoplasto de Aceptación G1/G0 Detenido en la Metafase). Se estudiaron los casos nucleares y citoplásmicos durante la maduración del oocito in vitro. Además, se investigaron los papeles de fusión y de activación en embriones reconstruidos a diferentes edades. Los estudios mostraron que la maduración del oocito es asincrónica; sin embargo, una población de oocitos maduros puede ser morfológicamente seleccionada a las 18 horas (Figura 1).

Selección Morfológica de Oocitos En la Figura 1, se obtuvieron ovarios de un matadero de reses ¡ocal y se mantuvieron a 28-32°C durante el transporte al laboratorio. Se aspiraron los complejos de oocitos cumulus (COC) de folículos con un diámetro de 3-10 mm utilizando una aguja hipodérmica (1.2 mm de diámetro interno) y se colocaron en contenedores universales de plástico, estériles. Los contenedores universales fueron colocados en una cámara caliente (35°C) y el material folicular se dejó sedimentar durante 10-15 minutos antes de vaciar tres cuartos del sobrenadante. El material folicular restante se diluyó con un volumen igual de medio de disección (TCM 199 con sales de Earles (Gibco), 75.0 mg/l de canamicina, 30.0mM de Hepes, pH 7.4, osmolaridad de 280 nOsmoles/Kg de H 0) suplementado con 10% de suero de bovino, se transfirieron a una caja de Petri de 85 mm y se buscaron los COC bajo un microscopio de disección. Se seleccionaron los complejos con por lo menos 2-3 capas compactas de células cumulus, se lavaron tres veces en el medio de disección y se transfirieron al medio de maduración (medio TC 199 con sales de Eagles (Gibco), 75 mg/l de canamicina, 30.0mM de Hepes, 7.69mM de NaHCO3, pH 7.8, osmolaridad de 280 nOsmoles/Kg de H2O) suplementado con 10% de suero de bovino y 1x106 de células de granulosa/ml y se cultivaron hasta requerirse en una tabla oscilante a 39°C en una atmósfera de 5% de C02 en aire. Los oocitos fueron removidos de la caja de maduración y humedecieron montados sobre portaobjetos de vidrio limpiados con etanol bajo cubreobjetos, los cuales se unieron utilizando una mezcla de 5% de jalea de petróleo y 95% de cera. Después los embriones montados se fijaron durante 24 horas en metanol recientemente preparado: ácido acético glacial (3:1), se tiñeron con 45% de aceto-orceína (Sigma) y se examinaron a través de contraste de fase y microscopio DIC utilizando Nikon Micropht-SA, la gráfica en la Figura 1 muestra el porcentaje de oocitos en la Mil y aquellos con un cuerpo polar visible.

Activación de Oocitos Foliculares de Bovino Si la maduración es entonces continuada hasta 24 horas, estos oocitos se activan a una velocidad muy baja (24%) en manitol conteniendo calcio (Cuadro 1a). Sin embargo, la remoción del calcio y magnesio del medio de electropulsación evita cualquier activación.

El Cuadro 1a muestra la activación de oocitos foliculares de bovino madurados in vitro durante diferentes períodos. Los oocitos fueron removidos del medio de maduración, se lavaron una vez en medio de activación, se colocaron en la cámara de activación y se les aplicó un sólo pulso eléctrico de 1.25 kV/cm durante 80 µs.

CUADRO 1a 2 o muchos más pronúcleos Respuesta de Activación de Oocitos de bovino enucleados en copia El Cuadro 1b muestra la respuesta de activación de una copia de oocitos de bovino madurados in vitro enucleados a aproximadamente 22 horas después del inicio de la maduración (hpm). Los oocitos fueron tratados exactamente como para la enucleación, un pequeño volumen de citoplasma fue aspirado sin contener la placa de metafase. Después de la manipulación, a los oocitos se les aplicó un sólo pulso DC (corriente directa) de 1.25 KV/cm y se regresaron al medio de maduración, a 30 hpm y 42 hpm se montaron grupos de oocitos, se fijaron y se tiñeron con aceto- orceína. Los resultados muestran el número de oocitos en cada punto del tiempo a partir de cinco experimentos como el número de células que tienen pronúcleos con respecto al número total de células.

CUADRO 1 b hpm = horas después del inicio de la maduración Formación Pronuclear en Occitos Enucleados El Cuadro 2 muestra la formación pronuclear en oocitos enucieados fusionados a fibroblastos de bovino primarios (24 h pm) y subsecuentemente activados (42 hpm) . Los resultados representa n cinco experimentos por separado. Los oocitos se dividieron en dos grupos, el grupo A fueron incubados en nocodazol durante 1 hora antes de la activación y durante 6 horas después de la activación . El grupo B, no se trataron con nocodazol . Los oocitos activados fueron fijados y teñidos con aceto-orceína 12 horas después de la activación . El número de pronúcleos (PN) en cada partenota después se clasificó bajo contraste de fase. Los resultados se expresan como el porcentaje de oocitos activados conteniendo 1 o más pronúcleos.

CUADRO 2 La ausencia de un huso organizado y la ausencia de un cuerpo polar sugiere que con el fin de mantener la ploidía en el embrión reconstruido entonces solamente un diploide, es decir, el núcleo G0/G1, deber transferido a esta situación citoplásmica. La incubación de oocitos activados en presencia del inhibidor de microtúbulo, nocodazol, durante 5 horas, 1 hora antes de y después del estímulo de activación evita la formación de micronúcleos (Cuadro 2) y así cuando el núcleo donador está en la fase G0/G1 del ciclo de célula, se mantiene la ploidía correcta del embrión reconstruido.

Resultados: Estos resultados muestran: i) estos oocitos pueden ser enucleados a las 18 horas después del inicio de la maduración (Figura 1); ii) los oocitos enucleados pueden ser fusionados a los blastómeros/células donadores, ya sean 0.3 M de manitol o 0.27 M de sacarosa, alternativamente el donador, las células o los núcleos pueden ser inyectados en el medio libre de calcio en ausencia de cualquier respuesta de activación . iii) los embriones reconstruidos u oocitos pulsados enucleados pueden ser cultivados en un medio de maduración y no sufrir activación espontánea; iv) el núcleo transferido se ve que sufre la ruptura de la envoltura nuclear (N EBD) y la condensación del cromosoma. No se observó ningún huso meiótico/mitótico organizado, sin considerar la etapa del ciclo de la célula del núcleo transferido; v) dichos pares manipulados se activarán en 30 horas y 42 horas con una frecuencia igual a los oocitos de control man ipulados; vi) no se observó ningún cuerpo polar después de la activación subsecuente, sin considerar la etapa del ciclo de la célula del núcleo transferido; viii) después de la activación , se formaron 1 -5 micronúcleos por cigoto reconstruido (Cuadro 2) .

Reconstrucción de Embriones de Bovino Utilizando el Procedimiento de "MAGIC" En experimentos preliminares, esta técnica ha sido aplicada la reconstrucción de embriones de bovino utilizando fibroblastos primarios en la fase GO del ciclo de la célula a través de inanición de suero durante cinco días. Los resultados se resumen en el Cuadro 3. El Cuadro 3 muestra el desarrollo de embriones de bovino reconstruidos a través de transferencia nuclear de fibroblastos primarios de bovino (GO) con inanición de suero a oocito de Mi l inactivados, enucleados. Los embriones fueron reconstruidos a 24 hpm y los pares fusionados fueron activados a 42 hpm. Los pares fusionados se incubaron en nocodazol (5 µg/ml) en el medio M2 durante 1 hora antes de la activación y 5 horas después de la activación. Los pares se activaron con un sólo pulso de DC de 1 .25 KV/cm durante 80 µseg .

CUADRO 3 EJEMPLO 2 Procedimiento "MAGIC" Utilizando Oocitos de Ovino También se hicieron observaciones similares a aquellas del Ejemplo 1 en oocitos de ovina , los cuales se madu raron in vivo. Se pudieron recuperar oocitos recientemente ovulados lavando de los oviductos de ovejas hembra superestim uladas , 24 horas después del tratamiento con prostaglandina. El uso de PBS libre de calcio-magnesio/1 .0% de FCS como un medio de lavado evita la activación del oocito. Los oocitos pueden ser enucleados en un medios libre de calcio y se introdujeron células donadoras, como se hizo anteriormente, en ausencia de activación. No se observó ningún huso organizado, se formaron múltiples núcleos después de la activación y esto puede ser suprimido a través del tratamiento con nocodazol.

Resultados: En experimentos preliminares con ovejas , un embarazo individual dio como resultado en el nacimiento de un sólo cordero vivo. Los resultados se resumen en los Cuadros 4 y 5. El Cuadro 4 muestra el desarrollo de embriones de ovino reconstruidos a través de la transferencia de una línea de célula establecida derivada de embrión a oocitos de ovino madurados in vivo, enucleados, inactivados. Los oocitos fueron obtenidos de ovejas hembra Scottisk Blackface superestimuladas , la l ínea de célula se estableció del disco embriónico de un embrión de 9 d ías de una oveja hembra Weish Mountain . Los embriones reconstruidos fueron cultivados en el oviducto ligado de una oveja hembra receptora temporal durante 6 días , recuperados y analizados para desarrollo.

CUADRO 4 El Cuadro 5 muestra la inducción del embarazo después de la transferencia de todos los embriones reconstruidos de la etapa de mórula/blastocisto hacia la trompa uterina de ovejas hembra Blackface receptoras finales. El Cuadro muestra el número total de embriones de cada grupo transferido a la frecuencia de embarazo en términos de hembras y embriones, en la mayoría de los casos 2 embriones fueron transferidos a cada hembra. Se estableció un sólo embarazo doble, el cual dio como resultado el nacimiento de un sólo cordero vivo.

CUADRO 5

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1.- Un método para reconstruir un embrión de animal, el procedimiento comprendiendo transferir un núcleo diploide a un oocito, el cual está detenido en la metafase de la segunda división meiótica sin activar concomitantemente al oocito, mantener al núcleo expuesto al citoplasma del receptor durante un período suficiente para que el embrión sea capaz de dar surgimiento a un nacimiento vivo y subsecuentemente activar el embrión reconstituido mientras se mantiene una ploidía correcta.

2.- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el animal es una especie de ungulado.

3.- Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el animal es una vaca o toro, cerdo, cabra, oveja, camello o búfalo de la India.

4.- Un método de acuerdo con cualquiera de ias reivindicaciones 1 a 3, en donde el núcleo donador está genéticamente modificado.

5.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el núcleo diploide es donado por una célula inactiva.

6.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el oocito es enucleado. 7 '.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la transferencia nuclear se logra a través de la fusión de la célula. 8.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el animal es una vaca o toro, y en donde el núcleo donador se mantiene expuesto al citoplasma receptor durante un período de 6 a 20 horas antes de la activación. 9.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la ploidía correcta es mantenida durante la activación a través de la inhibición del microtúbulo. 10.- Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la inhibición del microtúbulo se logra a través de la aplicación de nocodazol. 11.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la ploidía correcta es mantenida durante la activación a través de la estabilización del microtúbulo. 12.- Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la estabilización del microtúbulo se logra a través de la aplicación de taxol. 13.- Un método para preparar un animal, el método comprende: (a) reconstituir un embrión de animal como se describió en la reivindicación precedente; y (b) hacer que un animal se desarrolle a término a partir del embrión; y (c) opcionalmente, engendrar del animal así formado. 14.- Un método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el embrión de animal es además manipulado antes del desarrollo completo del embrión. 15.- Un método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde más de un animal se deriva del embrión. 16.- Un embrión de animal reconstituido, el cual es capaz de dar surgimiento a un nacimiento vivo y se prepara a través de un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12. 1

7.- Un animal preparado a través del método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15. 1

8.- Un animal desarrollado a partir de un embrión de acuerdo con la reivindicación 16.