MXPA98000419A - Haloperoxidasas de curvularia verruculosa y acidos nucleicos que codifican para los mismos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a haloperoxidasas de Curvularia verruculosa y fragmentos deácido nucleico aislados que comprenden secuencias deácido nucleico que codifican para las haloperoxidasas asícomo constructos deácido nucleico, vectores y células huésped recombinantes que comprenden las secuencias deácido nucleico. La invención también se relaciona con métodos para la producción recombinante de la haloperoxidasa. La invención se relaciona adicionalmente con composiciones que comprenden las haloperoxidasas y métodos de utilización de las composiciones para destruir células microbianas o inhibir el crecimiento de células microbianas.

Description

DE Curvularia vertuculosa Y ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN PARA LAS MISMAS AH,1?<---?ÜEWTSS DE IA ---NVE-NCIOH CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con haloperoxidasas de Curvularia verruculosa y núcleos aislados; fragmentos de ácido que comprende secuencias de ácido nucleico que codifica para las haloperoxidasas. La invención también se relaciona con constructos de ácido nucleico, vectores y células huésped que comprenden las secuencias de ácido nucleico de núcleos así como con métodos para producir las haloperoxidasas. La invencidn se relaciona adicionalmente con métodos de uso de las haloperoxidasas.

DESCRIPCIÓN DS LA TROTTC-ft FKTACIQNM? Las haloperoxidasas catalizan la oxidación de un ion haluro (X = Cl", Br" o í") en presencia de un peróxido de hidrógeno (H,02) al ácido hipohaloso correspondiente (HOX) : H202 + X + H* -> H20 + HOX REF: 26704 Si está presente un compuesto aceptor nucleofílico apropiado, el ácido hipohaloso reaccionará con el compuesto para formar un compuesto halogenado. Las haloperoxidasas también pueden catalizar las reacciones de peroxidasa en ciertos sustratos en ausencia de iones haluro, pero el espectro de sustratos se amplia en presencia de iones haluro debido a reacciones inespecíficas de sustrato y en ion hipohaluro . Las haloperoxidasas están ampliamente distribuidas en la naturaleza y se producen por mamíferos, plantas, algas, liqúenes, bacterias y hongos. Probablemente las haloperoxidasas son las enzimas responsables para la formación de compuestos halogenados que se presentan de manera natural. Existen tres tipos de haloperoxidasas, clasificadas de acuerdo con su especificidad por iones haluro: cloroperoxidasas (E.C. ;.11.1.10) , las cuales catalizan la cloracidn, bromación y yodación de compuestos; bromoperoxidasas, las cuales muestran especificidad con iones bromuro y yoduro y yodoperoxidasas (E. C. ; .11.1.8) , las cuales únicamente catalizan la oxidación de iones yoduro. Las haloperoxidasas descubiertas por primera vez se determino que contenían hemo como el grupo prostético o cofactor. Sin embargo, más recientemente, se ha hecho evidente que también existen muchas haloperoxidasas sin grupo hemo. Se han encontrado haloperoxidasas bacterianas sin grupo prostético. Además, se ha demostrado que muchas otras haloperoxidasas sin hemo poseen un grupo prostético vanadio. Las haloperoxidasas que contienen un grupo prostético vanadio se sabe incluyen bromoperoxidasas de alga marina, y por lo menos un tipo de cloroperoxidasa micótica de Curvularia inaequalis (van Schijndel et al., 1993, Biochipdca Bicphysica Acta 1161:249-256; simons et al., 1995, European Journal of Bioc emistry 229: 566-574; wo 95/27046. Las haloperoxidasas, como otras oxidorreductasas, son de actual interés debido a su amplia gama de usos industriales potenciales. Por ejemplo, se ha propuesto las haloperoxidasas para uso como un agente antimicrobiano. Es un objetivo de la presente invención proporcionar nuevas haloperoxidasas las cuales se pueden producir en cantidades comercialmente útiles.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVEHC-TÓN La presente invención se relaciona con haloperoxidasas aisladas obtenidas de Curvularia verruculosa y con fragmentos de ácido nucleico aislados que comprenden una secuencia de ácido nucleico la cual codifica para una haloperoxidasa de Curvularia verruculosa. La presente invención proporciona adicionalmente constructos de ácido nucleico, vectores y células huésped recombinantes que comprenden un fragmento de ácido nucleico de la presente invencidn. Además, la presente invención proporciona métodos para producir una haloperoxidasa de la presente invención, composiciones y métodos para destruir células microbianas o para inhibir el crecimiento de células microbianas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIC-IDRAS La figura 1 ilustra el efecto de zinc, vanadio y hierro sobre la actividad de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63. La figura 2 muestra el efecto del pH a 30°C sobre la actividad de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63. La figura 3 ilustra el efecto de la temperatura a pH 5.5 sobre la actividad de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63. La figura 4 muestra el efecto de la temperatura a pH 7 sobre la estabilidad de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63. La figura 5 ilustra el efecto de pH a 30°C sobre la estabilidad de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63.

La figura 6 muestra el efecto de la concentración de H202 a pH 7 y 60°C sobre la estabilidad de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63. La figura 7 ilustra un gel electroforético en agarosa del producto de amplificación de PCR de las secuencias del gen específico para haloperoxidasa utilizando el ADN genómico de Curvularia verruculosa CBS 147.63 como la plantilla. La figura 8 muestra un autorradiograma de una transferencia Southern del ADN gendmico de Curvularia verruculosa sondeado con un segmento derivado de PCR del gen para haloperoxidasa. La figura 9 ilustra un gel electroforético en agarosa de clonas de haloperoxidasas digeridas con Bsil más HindIII ó Xhol más HindIII. La figura 10 muestra la secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos deducida de haloperoxidasa de Curvularia verruculosa. La figura 11 ilustra una alineación de las secuencias de aminoácidos de haloperoxidasa de Curvularia verruculosa y de Curvularia inaequalis. La figura 12 muestra un mapa de restricción de pBANed . La figura 13 muestra un mapa de restricción de pAJ014-l.

La figura 14 muestra el curso en el tiempo de la producción de haloperoxidasa durante la fermentación.

DESCRIPCIÓN DETAT.T-ADA DE LA INVEMCl?W Como se ha mencionado antes, la presente invención se relaciona con haloperoxidasas obtenidas de la cepa Curvularia verruculosa. En una modalidad preferida, la presente invención se relaciona con haloperoxidasas obtenidas de Curvularia verruculosa CBS 147.63 o una cepa mutante de la misma, por ejemplo la haloperoxidasa que tiene la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEC. DE IDENT. NO:2. En otra modalidad preferida, la presente invencidn se relaciona con haloperoxidasas obtenidas de Curvularia verruculosa CBS 444.70 o una cepa mutante de la misma. Las propiedades fisicoquímicas de las haloperoxidasas de la presente invencidn se pueden determinar utilizando diversas técnicas bien conocidas en el arte. En una modalidad preferida, las haloperoxidasas de la presente invención contienen un grupo prostético vanadio (véase la figura 1) . En otra modalidad preferida, las haloperoxidasas tienen una masa en el intervalo entre aproximadamente 2 kDa y aproximadamente 66 kDa, determinado por espectrometría de masas. En otra modalidad preferida, las haloperoxidasas de la presente invención prefieren ion bromo sobre ion cloro, como un sustrato. En otra modalidad preferida, las haloperoxidasas de la presente invención tienen actividad sobre un intervalo de pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 11, de manera preferible entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8. En otra modalidad preferida, las haloperoxidasas de la presente invencidn tienen un pH óptimo en el intervalo desde aproximadamente 5.25 hasta aproximadamente 6.25, de manera preferible a aproximadamente 5.75 (véase la figura 2). En otra modalidad preferida, las haloperoxidasas de la presente invención tienen una temperatura óptima en el intervalo de 50-70°C, de manera más preferible en el intervalo de 55-65°C, de manera más preferible a aproximadamente 60°C (véase la figura 3) . En otra modalidad preferida, las haloperoxidasas de la presente invención retienen por lo menos 50% de actividad, de manera preferible por lo menos 80% de actividad, después de la incubación durante 1 hora a pH 7 y 60°C (véase la figura 4) . En otra modalidad preferida, las haloperoxidasas de la presente invención retienen por lo menos 50% de actividad, de manera preferible por lo menos 80% de actividad después de la incubación durante 1 hora a cualguier pH en el intervalo desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 11 a 30°C (véase la figura 5) . En otra modalidad preferida, las haloperoxidasas de la presente invencidn retienen por lo menos 50% de actividad, de manera preferible por lo menos 75% de actividad, después de incubación en presencia de H202 al 0.1% o una hora a pH 7 y 60°C (véase la figura 6) . La presente invencidn también se relaciona con haloperoxidasas obtenidas de hongos los cuales son sinónimos de Curvularia verruculosa como se define por M.B. Ellis en -Dematiacesus Hy?phcmycetes, Commonwealtrh Mycological Institute, Surrey, Inglaterra, 1971. El género Curvularia es un miembro terrestre del grupo de los hongos hifomiceto dematiaceous. Las esporas de Curvularia verruculosa habitualmente son curvas, que adquieren una pared rugosa y habitualmente tienen únicamente tres septos. Las cepas de Curvularia verruculosa son accesibles fácilmente al público en muchas colecciones de cultivo, tales como American Type Culture Collection (ATCC) , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) , por ejemplo, ATCC 60943-60948, DSM 1157, CBS 147.63 y CBS 444.70. La presente invencidn también se relaciona con haloperoxidasas las cuales son codificadas por secuencias de ácido nucleico las cuales son capaces de hibridizacidn bajo condiciones de restricción elevada (por ejemplo, prehibridización e hibridización a 45°C en 5 X SSPE, SDS 0.3%, 200 µg/ml de ADN de esperma de salmón sometido a corte y desnaturalizado, y formamida al 50%) con una sonda la cual hibridiza con la secuencia de ácido nucleico que se establece en la SEC. DE IDENT. NO:l bajo las mismas condiciones. El gen, o un oligonucledtido basado en el mismo, puede ser utilizado como una sonda en la hibridizacidn Southern para aislar genes homólogos de cualquier especie de Curvularia verruculosa. En particular, tales sondas pueden ser utilizadas para la utilización con el ADNc o ADN gendmico de la especie de interés, siguiendo procedimientos de transferencia Southern estándar o convencionales, con el fin de identificar y aislar el gen para haloperoxidasa correspondiente en el mismo. Una reacción de PCR utilizando la sonda degenerada mencionada en la presente y ADN gendmico o ADNc de primera hebra de especies de Curvularia verruculosa también puede proporcionar un producto específico de haloperoxidasa de Curvularia verruculosa el cual después puede ser utilizado como una sonda para clonar el ADN gendmico o ADNc correspondiente . La identificación y aislamiento de genes para haloperoxidasa a partir de una fuente diferente de las ejemplificadas de manera específica en la presente se puede llevar a cabo por utilización de la metodología descrita en los presentes ejemplos, de cepas de Curvularia verruculosa disponibles públicamente. Para propósitos de la presente invención, el término "obtenido de" significa que la haloperoxidasa es producida por una fuente específica, por ejemplo, una cepa de Curvularia verruculosa, o por una célula en la cual se ha insertado un gen de la fuente que codifica para haloperoxidasa . La invención también comprende variantes de haloperoxidasas las cuales tienen por lo menos aproximadamente 93%, de manera preferible aproximadamente 95%, de manera más preferible aproximadamente 97% e incluso de manera más preferible 99% de homología con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la figura 10 (SEC. DE IDENT. NO: 2) , y la cual retiene de manera equivalente la actividad de las proteínas descritas en la presente. La invención también está dirigida a variantes de haloperoxidasas las cuales tienen una secuencia de aminoácidos la cual difiere en no más de tres aminoácidos, de manera más preferible en no más de dos aminoácidos, y de manera mucho más preferible en un aminoácido de la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 2.

Cada diferencia puede ser una inserción o supresión de un aminoácido o la sustitución de un residuo aminoácido por un aminoácido diferente. Las sustituciones útiles incluyen aquellos en las cuales se han realizado sustituciones conservadoras de aminoácidos, sustituciones las cuales no alteren de manera significativa la actividad de la proteína. Por sustitución conservadora se quiere significar aquella en la que los aminoácidos de la misma clase pueden ser sustituidos por otro aminoácido de esa clase. Por ejemplo, los residuos alifáti os no polares Ala, Val, Leu e lie se pueden intercambiar, como también pueden hacerlos los residuos básicos Lys y Arg, o los residuos ácidos Asp y Glu. De manera similar Ser y Thr son sustituciones conservadoras entre si, como los son Asn y Gln. La haloperoxidasa de la presente invencidn se puede purificar por diversos procedimientos conocidos en la técnica que incluyen, pero que no se limitan a cromatografía (por ejemplo de intercambio iónico, de afinidad, hidrofdbica, de cromatoenfoque y de exclusión por tamaño) , procedimientos electroforéticos (por ejemplo enfoque isoeléctrico preparativo (IEF)), solubilidad diferencial (por ejemplo precipitación con sulfato de amonio) , o extracción (véase, por ejemplo, Protein Purification, eds. J.-C. Janson y Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989) . Como se define en la presente, una haloperoxidasa "aislada" es una haloperoxidasa la cual está esencialmente libre de otras proteínas diferentes de haloperoxidasa, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20% pura, de manera preferible por lo menos aproximadamente 40% pura, de manera más preferible por lo menos aproximadamente 60% pura, e incluso de manera más preferible aproximadamente 80% pura, de manera más preferible aproximadamente 90% pura, y de manera mucho más preferible aproximadamente 95% pura, determinada por SDS-PAGE. gR-M-MENTOS DB -ftfTOO NptT-WTCO Y UUtfl'KU'- S La presente invencidn también se relaciona con fragmentos de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico la cual codifica para una haloperoxidasa de la presente invencidn y con constructos de ácido nucleico que comprens-en un fragmento de ácido nucleico de la presente invención. En una modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica para una haloperoxidasa obtenida de Curvularia verruculosa CBS 147.63, por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que se establecen en la SEC. DE IDENT. NO:l o CBS 444.70. La presente invención también incluye secuencias de ácido nucleico las cuales codifican para una haloperoxidasa que tiene la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEC. DE IDENT. NO: 2, la cual difiere de la SEC. DE IDENT. NO:l en virtud de la degeneración del código genético. Las secuencias de ácido nucleico de la presente invencidn abarcan adicionalmente tanto la secuencia genómica descrita en la misma así como las secuencias de ADNc y ARN correspondientes, y la frase "secuencias de ácido nucleico" como se utiliza en la presente se comprenderá que abarca la totalidad de tales variaciones que incluyen ADN sintético. La presente invencidn también se relaciona con constructos de ácido nucleico que comprenden un fragmento de ácido nucleico de la invención. Se comprenderá de manera general que "constructo de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra sencilla o doble, la cual se aisla de un gen que se presenta de manera natural o la cual ha sido modificada para contener segmentos de ácido nucleico los cuales se combinan y yuxtaponen de una manera la cual no existirían en la naturaleza de otro modo. En una modalidad preferida, los co?structos de ácido nucleico se unen de manera operable a regiones reguladoras capaces de dirigir la expresión de la haloperoxidasa en un huésped de expresión adecuado. La presente invencidn también proporciona vectores recombinantes que comprenden un constructo de ácido nucleico de la presente invención. En una modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico se une de manera operable a una secuencia promotor. En otra modalidad preferida, los vectores de la presente invención comprenden adicionalmente una señal de terminación de transcripción y/o un marcador seleccionable. Los vectores recombinantes de la invención son útiles para la expresión del gen para haloperoxidasa de Curvularia verruculosa en forma activa. Un vector de expresión útil contiene un elemento que permite la integración estable del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en una célula huésped independiente del genoma de la célula huésped, y de manera preferible uno o más marcadores fenotípicos los cuales permiten la selección fácil de las células huésped transformadas. El vector también puede incluir secuencias de control tales como un promotor, sitios de unión de ribosoma, un sitio de inicio de traducción y, opcionalmente, un gen represor, un marcador seleccionable u otros genes activadores diversos. Para permitir la secreción de la proteína expresada, se pueden insertar ácidos nucleicos que codifiquen para una secuencia de señal antes de la secuencia codificante del gen. Para la expresión bajo secuencias de dirección o de control, un gen para haloperoxidasa que se va a utilizar de acuerdo con la presente invención se une operablemente a secuencias de control en el marco de lectura apropiado . El vector que transporta el constructo de ácido nucleico de la presente invención puede ser cualquier vector el cual se puede someter convenientemente a procedimientos de ADN recombinante. La elección de un vector dependerá típicamente de la célula huésped en la cual se va a introducir el vector. El vector puede ser un vector que se replique de manera autónoma, es decir, un vector el cual existe como una entidad extracromosómica, la replicación de la cual es independiente de la replicación cromosdmica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosdmico, un monicromosoma o un cromosoma artificial . De manera alternativa, el vector puede ser uno el cual, cuando se introduce en una célula huésped, se integra en el genoma de células huésped y se replica junto con el cromosoma o cromosomas en el cual se ha integrado. El sistema de vector puede ser un vector solo o un plásmido, o dos o más vectores o plásmidos los cuales, juntos, contienen el ADN total que se va a integrar en el genoma. En el vector, la secuencia de ADN puede estar unida de manera operable a una secuencia promotora adecuada. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN la cual muestra actividad de transcripción en la célula huésped de elección y se puede obtener de genes que codifican para proteínas homologas o heterdlogas para la célula huésped. Los ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de constructos de ácido nucleico de la invención, especialmente en un huésped bacteriano, son el promotor del operón lac de E. coli, los promotores dagA del gen de agarasa de Streptomyces coelicolor, los promotores del gen para a-amilasa ( amyL) de Bacillus lichenifo?mis, los promotores del gen para amilasa maltogénica (amyM) de Bacillus steauTOthermophilus, los promotores de a-amilasa (amyQ de Bacillus a yloliquefaciens, los promotores de los genes para xylA y xylB de Bacillus subtilis, el promotor procaridtico para ß-latamasa (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Acade y of Sciences USA 75:3727-3731) o el promotor tac (DeBoer et al, 1983, Proceeding of the National Academy of Sciences USA 80:21-25) . Se describen promotores adicionales en "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242-74-94; y en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2d ed., Cold Spring Habor, New York, 1989. En un huésped de levadura, un promotor útil es el promotor eno-1. Para transcripción en un huésped micótico, los ejemplos de promotores útiles son a?p-iellos obtenidos de un gen que codifica para la amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, proteinasa aspártica de Rhizcmucor miehei, a-amilasa neutra de Aspergillus niger, a-amilasa estable en ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa (glaA) de Aspergillus niger o de Aspergillus awamori, lipasa de Rhizcmucor miéhie, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae o acetamidasa de Aspergillus nydulans. Los promotores preferidos son los promotores para TAKA-amilasa y glaA. El vector de la invención también puede comprender un terminador de transcripción adecuado y, en eucariotes, secuencias de poliadenilación conectadas de manera operable a una secuencia de ADN que codifica para la haloperoxidasa de la presente invención. Las secuencias de terminación y de poliadenilación se pueden obtener de las mismas fuentes que el promotor. El vector puede comprender adicionalmente una secuencia de ADN que permite que el vector se replique en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de tales secuencias son los orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUBUO, pE194, pAMBl, y pIJ702. El vector también puede comprender un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen, el producto del cual complementa un defecto en la célula huésped, tal como los genes «ial de Bacillus subtilis o Bacillus lichenif ormis, o uno el cual confiere resistencia a antibióticos tales como resistencia a ampicilina, canamicina, cloramfenicol o tetraciclina. Los ejemplos de marcadores de selección para Aspergillus incluyen a dS, pyrG, argB, niaD, sC, trpC y hygB, un marcador da lugar a resistencia a higromicina. Los marcadores que se prefieren para uso en una célula huésped de Aspergillus son los marcadores a dS y pyrG de Aspergillus nydulans y Aspergillus oryzae. Un marcador de mamífero utilizado con frecuencia es el gen dihidrofolato reductasa (DHFR) . Además, la selección se puede llevar a cabo por una cotransformación, por ejemplo, como se describe en WO 91/17243. Para evitar la necesidad de romper la célula para obtener la haloperoxidasa expresada, y para minimizar la cantidad de degradación posible de la haloperoxidasa expresada dentro de la célula, se prefiere que la expresión del gen para haloperoxidasa de lugar a un producto secretado fuera de la célula. Para este fin las haloperoxidasas de la presente invencidn pueden comprender una prerregidn que permite la secreción de la proteína expresada a un medio de fermentación. Si es deseable, esta prerregión puede ser nativa a una haloperoxidasa de la invención o se puede sustituir con una pre-región o secuencia de señal diferente, lo cual se lleva a cabo convenientemente por sustitución de las secuencias de ADN que codifica para las prerregiones respectivas. Por ejemplo, la prerregión se puede obtener a partir de un gen para glucoamilasa o para amilasa de una especie de Aspergillus, un gen para amilasa de especie de Bacillus, un gen para lipasa o proteinasa de Rhizapucor miehie, el gen para el factor a de Saccharcmyces cerevisiae o el gen para preproquimosina bovina. Se prefiere particularmente la prerregión de amilasa TAKA de Aspergillus oryzae, amilasa neutra de Aspergillus niger, la amilada maltogénica de Bacillus NCIB 11837, la a-amilasa de Bacillus stearothermophilus o subtilisina de Bacillus lichenif ormis. Una secuencia de señal efectiva para huéspedes micóticos es la señal de amilasa TAKA de Aspezgrillus oryzae, la señal de proteinasa aspártica de hizomucor iehie o la señal de lipasa de Rhizcmucor miéhie. Los procedimientos utilizados para unir el constructo de ácido nucleico de la invencidn, el promotor, el terminador y otros elementos, respectivamente, y para insertarlos en un vector adecuado qµe contiene la información necesaria para replicación son bien conocidos por aquellos familiarizados con la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., supra) . La presente invención también se relaciona con células huésped que comprenden un constructo de ácido nucleico o un vector de expresión de la invención el cual se utiliza ventajosamente en la producción recombinante de las haloperoxidasas de la invención. La célula se puede transformar con el constructo de ácido nucleico de la invencidn, convenientemente por integración del constructo en el cromosoma huésped. Esta integración generalmente se considera una ventaja pues es más probable que la secuencia se mantenga de manera estable en la célula. La integración del constructo en el cromosoma huésped se puede llevar a cabo de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, por recombinacidn homologa o heteróloga. De manera alternativa, la célula se puede transformar con un vector de expresión como se describe abajo en relación con tipos diferentes de células huésped. La elección de células huésped y vectores dependerá en gran medida de la haloperoxidasa y su fuente. La célula huésped se puede seleccionar de células procaridticas, tales como células bacterianas. Los ejemplos de bacterias adecuadas son bacterias grampositivas tales como Bacillus subtili, Bacillus lichenif ormis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus laurus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis o Streptomyces lividans o Streptomyces murinus, o bacterias gram negativas tales como E. coli . La transformación de las bacterias puede llevarse a cabo, por ejemplo, por transformación de protoplasto o mediante la utilización de células competentes de una manera conocida per se. De manera preferible, la célula huésped es eucariótica, tal como una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula vegetal o de manera preferible una célula micdtica, que incluye levaduras y hongos filamentosos. Por ejemplo, las células de mamífero útiles incluyen células CHO o COS. Se puede seleccionar una célula huésped de levadura a partir de especies de Saccharomyces o Schizosaccharcmyces, por ejemplo, Saccharcmyces cerevisiae. Los hongos filamentosos útiles se pueden seleccionar de especies de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus oryzae o Aspergillus .niger. De manera alternativa, se puede utilizar como una célula huésped una cepa de especie Fusarium, por ejemplo Fusarium axysporium o Fusarium graminearxm. Las células micóticas se pueden transformar por un proceso que involucra formación de protoplastos, transformación de los protoplastos seguidos por regeneración de la pared celular de una manera conocida per se. Un procedimiento adecuado para la transformación de células huésped de Aspergillus se describe en la EP 238 023. Un método adecuado para transformación de especies JFlisarium se describe por Malardier et al., 1989, Gene 78:147-156 o la solicitud norteamericana copendiente número de serie 08/269,449. En una modalidad particularmente preferida, la expresión del gen para haloperoxidasa se lleva a cabo en una célula huésped micótica, tal como Aspergillus. El gen para haloperoxidasa se liga a un plásmido que contiene de manera preferible el promotor TAKA amilasa de Aspergillus oryzae o el promotor amilasa neutra NA2 de Aspergillus niger y amdS o pyrG como el marcador seleccionable. De manera alternativa, el marcador seleccionable puede estar en un plásmido separado y se puede utilizar en cotransformacidn. El plásmido (o plásmidos) se utilizan para transformar células huésped de especie Aspergillus, tales como Aspergillus oryzae o Aspergillus niger de acuerdo con métodos descritos en Yelon et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474.

MÉTODOS PARA PRQEOCIR LAS HAT-OPEROXT-nASAS DE TA PRBSEWTE J¡____ __ La presente invencidn también se relaciona con métodos para producir una haloperoxidasa de la presente invención «que comprende: (a) fermentar una cepa de Curvularia verruculosa para producir un sobrenadante que comprenda a la haloperoxidasa; y (b) recuperar la haloperoxidasa. La presente invencidn también se relaciona con métodos para reproducir de manera recombinante una haloperoxidasa de la presente invención que comprende: (a) fermentar una célula huésped que comprende un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para la haloperoxidasa bajo condiciones que llevan a la producción de la enzima, y (b) recuperar la haloperoxidasa. Si el sistema de expresión secreta la haloperoxidasa al medio de fermentación, la enzima se puede recuperar directamente del medio. Si no se secreta la haloperoxidasa recombinante, se recupera de lisados celulares. Como se define en la presente, el término "fermentación" es cualquier método de cultivo de una célula que resulte en la expresión o aislamiento de haloperoxidasa. Por lo tanto, la fermentación se puede entender que comprende cultivo en matraz de agitación, fermentación a pequeña o a gran escala (incluye fermentación continua, por lotes, de alimentación por lotes o en estado sólido) en laboratorio o en fermentadores industriales llevada a cabo en un medio adecuado y bajo condiciones que permiten que se exprese o aislé la haloperoxidasa. La fermentación tiene lugar en un medio nutritivo adecuado que comprende fuentes de carbono y de nitrógeno y sales inorgánicas, utilizando procedimientos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo Bennett J.W. y LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulation in Fungí, Academic Press, CA, 1991) . Están disponibles medios adecuados de proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo a composiciones publicadas (por ejemplo, en los catálogos de American Type Culture Collection) . Las haloperoxidasas resultantes producidas por los métodos descritos en lo anterior se pueden recuperar del medio de fermentación por procedimientos convencionales que incluyen, pero que no se limitan a centrifugación, filtración, liofilización, evaporación o precipitación. La proteína recuperada después se puede purificar adicionalmente por diversos procedimientos cromatográficos, por ejemplo cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de afinidad o similares.

USOS La presente invención se dirige adicionalmente a métodos de oxidar un ion haluro o el ácido hipohaloso correspondiente, que comprende hacer reaccionar el ion haluro y una fuente de peróxido de hidrógeno en presencia de una haloperoxidasa de la invencidn. La presente invencidn también se relaciona con métodos de halogenación de un compuesto que comprende hacer reaccionar el compuesto, un ion haluro y una fuente de peróxido de hidrógeno en presencia de una haloperoxidasa de la invención. La presente invencidn también se relaciona con métodos para destruir o inhibir el crecimiento de células microbianas, que comprende poner en contacto las células con una haloperoxidasa de la invención, una fuente de peróxido de hidrógeno y una fuente de tiocianato en una solución acuosa.

La fuente de peróxido de hidrógeno puede ser peróxido de hidrógeno mismo o un precursor de peróxido de hidrógeno tales como un percarbonato, perborato, ácido peroxicarboxílico o una sal de los mismos. Además, la fuente puede ser un sistema enzimático que genere peróxido de hidrógeno tal como una oxidasa, por ejemplo una glucosa oxidasa, glicerol oxidasa o aminoácido oxidasa, y su sustrato. Se puede agregar la fuente de peróxido de hidrógeno en una concentración que corresponda a una concentración de peróxido de hidrógeno en el intervalo desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 10 mM, de manera preferible desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 1 mM. La fuente de tiocianato puede ser tiocianato mismo o una sal del mismo, por ejemplo, sodio o potasio. Además, si la reacción se lleva a cabo oralmente, el tiocianato es endógeno a la saliva. Se puede agregar una fuente de tiocianato en una concentración que corresponda a una concentración de tiocianato en el intervalo desde aproximadamente 0.001 hasta aproximadamente 10 mM, de manera preferible desde aproximadamente 0.01 hasta aproximadamente 1 mM. Las haloperoxidasas se pueden utilizar como agentes de preservación o conservadores y agentes de desinfección por ejemplo en pinturas basadas en agua y productos para el cuidado personal, por ejemplo, pasta dentífrica, enjuague bucal, cremas para el cuidado de la piel y lociones, formulaciones para el cuidado del pelo y cuidado del cuerpo, soluciones para la limpieza de lentes de contacto y dentaduras . Las haloperoxidasas también se pueden utilizar para limpiar superficies y utensilios de cocina en plantas de procesamiento de alimentos y en cualquier área en la cual se preparan o sirven alimentos. Las haloperoxidasas también se pueden utilizar en aplicaciones de blanqueado enzimático, por ejemplo, blanqueado de pulpa y blanqueado de teñido (en composiciones detergentes) . La concentración de la haloperoxidasa en los métodos de uso de la presente invención de manera preferible está en el intervalo desde 0.001 HU/ml-10 HU/ml, de manera más preferible en el intervalo de 0.001-1 HU/ml (como se define después) . La presente invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos los cuales de manera alguna se consideran como limitantes del alcance de la invencidn como se reivindica.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Cultivo de Curvuleuria verruculosa CBS 147.63 Se hace crecer Curvularia verruculosa CBS 147.63 durante 165 horas a 26°C y 250 rpm en un fermentador de 2 1 que tiene un medio de fermentación constituido de los siguientes componentes: Glucosa 15 g/1 Extracto de levadura 4 g/1 K2HP0« 1 g/1 MgS04-7H20 0.5 g/1 V0S04 167 mg/l El medio se ajusta a pH 7.2 antes de someterlo a autoclave. El fermentador se inocula directamente a partir de sembrados de agar suspendidos con 10 ml de H20 esterilizada que contiene Tween al 0.01% en donde se utilizan 2.5 ml de la suspensión para inocular cada matraz de agitación. Se recupera el sobrenadante al centrifugar la totalidad del caldo, y se lava y concentra 24 veces utilizando un aparato Piltron con una membrana de umbral o límite de 10 kDa.

Ejenplo 2: Ensayos para haloperoxidasa Se realizan ensayos de microtitulación al mezclar 100 µl de muestras de haloperoxidasa (aproximadamente 0.2 µg/ml) y 100 µl de amortiguador de fosfato de sodio 0.3 M, pH 7, bromuro de potasio 0.5M, -rojo de fenol al 0.08%, al agregar la solución a 10 µl de H202 al 0.3% y medir la absorción a 595 nM, como una función del tiempo. Se realizan como se describe los siguientes ensayos utilizando monoclorodimedona (Sigma M 4632, e -20000 M^cm"1 a 290 nm) como sustrato. Se mide la disminución en la absorción a 290 nm, como una función del tiempo. Se realizan ensayos en fosfato de sodio 0.1 M o acetato de sodio 0.1M, monoclorodimedona 50 µM, KBr 10 mM/KCl y H202 1 M utilizando una concentración de .haloperoxidasa de aproximadamente 1 µg/ml. Se define una HU como una micromol de monoclorodimedona clorada o bromada por minuto a pH 5 y 30°C. Se llevan a cabo los experimentos de temperatura, pH y estabilidad de H202 al preincubar la haloperoxidasa bajo las condiciones indicadas y después realizando ensayo de actividad residual en el ensayo de microtitulación.

Ejemplo 3: Purificación de la haloperoxidasa de Cuxvularia verruculosa CBS 147.63 Se cargan 30 ml de sobrenadante concentrado del caldo completo descrito en el Ejemplo 1 en una columna A-Sepharose de 30 ml (XK 16/60) equilibrada con amortiguador de fosfato de potasio 10 mM, pH 7.0 y que se eluye con un gradiente lineal de 300 ml de cloruro de sodio desde 0 hasta 1 M a un flujo de 2 ml/minuto. Se recolectan fracciones de 3 ml, y las fracciones que contienen actividad de haloperoxidasa se acumulan, concentran (Centricon-10, Amicon) y se someten a filtración en gel en una columna HiLoad Superdex 75 (16/60) (Pharmacia) equilibrada con amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, pH 7.1, y se eluye en el mismo amortiguador a un régimen de 1 ml/minuto. Se recolectan fracciones de 1.5 ml. Los ensayos de haloperoxidasa se llevan a cabo como se describe en el Ejemplo 2.

Ejemplo 4: Caracterización de haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 1476.63 La haloperoxidasa purificada como se describe en el Ejemplo 3 se pretrata durante 45 minutos con amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M, pH 7 (control) o en citrato de sodio 0.1 M-EDTA 10 mM, pH 3.8. Después del pretratamiento, la haloperoxidasa se trata durante 2 horas con un aditivo 10 mM en Tris-HCl 0.2 M, pH 7.5, en donde el aditivo es Na3V04, FeCl2 o ZnCl2. La figura 1 muestra que la haloperoxidasa pierde actividad cuando se trata con EDTA, lo que indica la presencia de un grupo prostético necesario para actividad. La adición de zinc o hierro no tiene efecto sobre la actividad de haloperoxidasa. Sin embargo, la adición de vanadato resulta en recuperación de actividad de haloperoxidasa, lo que indica que contiene un grupo prostético vanadio. Se determina el pH óptimo y especificidad hacia Br" y Cl" de la haloperoxidasa en un amortiguador de acetato de sodio 0.1 M que contiene monoclorodimedona 50 M, H202 1 mM, KBr o KCl 10 mM y 0.4 µg/ml de haloperoxidasa (coeficiente de extinción - 2.6 l/g*cm) , 30°C. Como se muestra en la figura 2, la haloperoxidasa prefiere Br" que Cl" como sustrato y tiene un pH óptimo de aproximadamente 5.75. La temperatura óptima de ha haloperoxidasa en amortiguador de acetato de sodio 0.1 M, pH 5.5 que contiene monoclorodimedona 50 mM, KBr 10 mM, H202 1 mM y 0.1 µg/ml de enzima, es de aproximadamente 60°C (figura 3) . Se determinó la estabilidad de la haloperoxidasa como función de temperatura al preincubar la haloperoxidasa durante 1 hora a una temperatura dada en amortiguador de fosfato de sodio 20 mM, pH 7. Los resultados muestran que la haloperoxidasa permanece estable durante por lo menos una hora a temperaturas de hasta 60°C (figura 4) . La haloperoxidasa (4 µg/ml) también es estable sobre una amplia gama de pH, como se muestra en la figura 5, y que retiene más de 80% de actividad después de incubación durante una hora a 30°C en amortiguador de Britter-Robinson 20 mM a pH variable desde 5 hasta 11 (control a pH 7, 4°C) . Además, la haloperoxidasa (3 µg/ml) es muy estable en presencia de H202, y retiene 75% de actividad residual después de una hora de incubación a 60°C en presencia de H202 al 0.1% en fosfato de sodio 50 mM, pH 7 (figura 6) .

Ejemplo 5: Determinación de la secuencia de aminoácidos de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 La haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 reducida y S-carboxilmetilada (= 1 ng) se digiere con 10 µg de proteasa específica para lisilo de Achrcmobacter en NH4HC03 20 mM durante 16 horas a 37°C. Los péptidos resultantes se separan por CLAP de fase inversa utilizando una columna Vydac C18 y ácido trifluoroacético TFA) al 0.1% como solvente A y 2-propanol al 80% que contiene TFA al 0.8%, como solvente B. La columna se equilibra primero con solvente B al 5%, lo cual es igual a 95% de solvente A. Posteriormente la columna se lava con solvente B al 5% durante 5 minutos después de la inyección de la mezcla del péptido. Los péptidos unidos eluyen finalmente a una velocidad de flujo de 150 µl/minuto con un gradiente lineal de solvente B en donde el gradiente corre durante 85 minutos y termina a los 95 minutos de tiempo total con 90% de solvente B (lo cual es igual a 10% de solvente A) . Los péptidos se purifican utilizando un gradiente lineal que involucra TFA al 0.1% como solvente A y 80% de acetonitrilo que contiene TFA al 0.8% como solvente B a un régimen de 250 µl/minuto. La determinación de la secuencia de aminoácidos se lleva cabo en un determinador de secuencia de proteína Applied Biosystems 473A, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el proceso de determinación de secuencia directa de aminoácidos, se vuelve evidente que la parte N terminal de la proteína está bloqueada, y por lo tanto no es accesible para que se determine su secuencia. Sin embargo, se determina la secuencia de ocho péptidos internos. Las secuencias obtenidas con como sigue (SEC. DE IDENT. NO:3-10) .

Péptido 1: Xaa-Phe-Ala-Thr-Gln-Ser-Glu-His-Ile-Leu-Ala-Asp-Pro-Pro-Gly-Leu-Arg-Ser-Asn-Ala-Asp-Glu-Thr-Ala-Glu-Tyr-Asp-Asp-Ser-Ile-Arg-Val-Ala-lie-Ala-Met-Gly-Gly-Ala-Gln-Asp-Leu-Asn (SEC. DE IDENT. N0:3) Péptido 2 : Phe-Arg-Gln-Tyr-His-Ala-Pro-Phe-Tyr-Gly-Met-Thr-Thr-Lys (SEC. DE IDENT. N0:4) Pépdtido 3 : Asp-Val-Tyr-Ala-Val-Asp-Ser-Asn-Gly-Ala-Thr-Val-Phe-Gln-Asn-Val-Glu-Asp-Val-Arg-Tyr-Ser-Thr-Lys (SEC. DE IDENT. NO: 5) Péptido 4 Arg-Ser-Pro-Trp-Gln-Thr-Ala-Gln-Gly-Leu-Tyr-Trp-Ala-Tyr-Asp-Gly-Ser-Asn-Leu-Val-Gly-Thr-Pro-Pro-Arg-Phe-Tyr-Asn-Gln-Ile-Val-Arg-Arg-Ile-Ala-Val-Thr-Tyr-Lys-Lys (SEC. DE IDENT. NO: 6) Péptido 5: Phe-Asp-Asp-Glu-Pro-Thr-His-Pro-Val-Val-Leu-Val-Pro-Val-Asp- Pro-Asn-Asn-Asn-Asn-Gly-Gly-Lys(SEC. DE IDENT. NO: 7) Péptido 6 : Pro-Ala-Asp-Pro-Asn-Thr-Gly-Thr-Asn-Ile-Ser-Asp-Asn-Ala-Tyr-Ala-Gln-Leu-Ala-Leu-Val-Leu-Glu-Arg-Ala-Val-Val-Lys (SEC. DE IDENT. NO: 8) Péptido 7: Met-Leu-Ser-Ser-Leu-Tyr-Met-Lys (SEC. DE IDENT. NO: 9) Péptido 8: Met-Pro-Phe-Arg-Gln-Tyr-His-Ala-Pro-Phe-Tyr-Gly-Met-Thr-Thr-Lys (SEC. DE IDENT. NO: 10) El péptido 8 es idéntico al péptido 2, excepto por dos residuos aminoácidos adicionales en la parte N terminal.

Ejespío 6: Análisis de aminoácidos de halsperaxidasa de Curvularia vezxuculosa CBS 147.63 La hidrólisis para el análisis de aminoácidos se lleva a cabo por duplicado. Se hidrolizan muestras liofilizadas en frascos de vidrio sellados y purgados que contienen 100 µl de HCl 6 N, fenol al 0.1%, durante 16 horas a 110°C. El análisis se lleva a cabo utilizando un sistema de análisis de aminoácidos de Applied Biosystems 420A, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los resultados de la determinación de la composición de aminoácidos se presentan en la Tabla 1 (los valores son un promedio de cuatro determinaciones) .

Tabla 1. Composición de aminoácidos de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa. ND =» No determinado ?jespío 7: Análisis por SDS-PAGE y IEF de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 Se realizan las pruebas de SDS-PAGE (Novex) y IEF (Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes. El gel para IEF se tiñe para determinar actividad de haloperoxidasa utilizando el reactivo rojo de fenol y H202. La prueba por SDS-PAGE demuestra que la haloperoxidasa tiene un peso molecular de aproximadamente 68 kDa, mientras que la prueba por IEF indica que la haloperoxidasa tiene un punto isoeléctrico de aproximadamente 3.8.

Ejemplo 8: Análisis de carbohidratos de halsperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 Se realiza por duplicado hidrólisis de carbohidratos unidos a proteína para análisis de la composición de monosacáridos. Se hidrolizan muestras liofilizadas en tubos de vidrio sellados y purgados con 100 µl de TFA 2 M durante 1 hora y 4 horas, a 100ßC. Se separan los monosacáridos por cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución utilizando una columna Diones PAl eluida con NaOH 16 mM y se detectan por detección amperométrica de impulsos. El análisis de la composición de monosacáridos muestra «que la haloperoxidasa está glicosilada como se muestra en la tabla 2 (los valores son un promedio de cuatro determinaciones) . La ausencia de glucosamina en el análisis sugiere que el carbohidrato probablemente esté unido a 0. Lo qµe resulta interesante, es «que la glucosa habitualmente no se encuentra en las glicoproteínas.

Tabla 2. Composición de monosacáridos de la haloperoxidasa de Curvularia verruculssa Ejepplo 9: Espectrometría de masas de haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 Se realiza espectrometría de masas utilizando espectrometría de masas por ionización de desorción láser auxiliada de matriz de tiempo de vuelo en un VO analítico TofSpec. Para espectrometría de masas, se mezclan 2 µl de haloperoxidasa con 2 µl de solución de matriz saturada (ácido a-ciano-4-hidroxisuccinámico en TFA al 0.1%:acetonitrilo (70:30)) y 2 µl de la mezcla colocada sobre la placa objetivo. Antes de la introducción en el espectrómetro de masas, se retira el solvente por evaporación. Las muestras se desorben y ionizan por pulsos de láser de 4 ns (337 nm) a una potencia umbral láser y se aceleran en un tubo de vuelo libre de campo por un voltaje de aceleración de 25 kV. Los iones se detectan por una placa de microcanal que se establece a 1850 V. Se analizan la haloperoxidasa intacta así como todas las fracciones peptídicas iniciales por espectrometría de masas. La espectrometría de masas muestra claramente que la glicosilación de la haloperoxidasa es heterogénea. La masa promedio de la haloperoxidasa es de aproximadamente 64,500 Da, lo cual concuerda de manera razonable con el peso molecular de 68 kDa determinado por SDS-PAGE. La masa de haloperoxidasa varía desde 62 kDa hasta 66 kDa.

Ejemplo 10: Determinación de actividad específica de haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 Se determino la actividad específica de haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 bajo las siguientes condiciones: acetato de sodio 0.1 M, monoclorodimedona 50 µM, H202 1 mM y KCl 10 mM, a pH 5 y °C. Se determinó una actividad específica de 13 HU/Ajgo, «que corresponde con una actividad específica de 33.8 U/mg de haloperoxidasa, en base al coeficiente de extinción medido de 2.6 1/ (g*cm) . Bajo condiciones similares, la actividad específica reportada por Simons et al., supra, para la haloperoxidasa de «lirvularia inaequalis es de 7.5 U/mg. Por lo tanto, al parecer la enzima de Curvularia verruculosa tiene aproximadamente una actividad específica cuatro veces mayor que la de Curvularia inaequalis.

Ejepplo 11: Extracción de AEN genómico Se hace crecer Curvularia verruculosa CBS 147.63 en 25 ml de medio de extracto de levadura al 0.5%-glucosa al 2% (YEG) durante 24 horas a 32°C y 250 rpm. Después se recolectan los micelios por filtración a través de Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) y se lava una vez con 25 ml de amortiguador Tris 10 mM-EDTA 1 nM (TE) . Se drena el exceso de amortiguador de la preparación de micelios, la cual se congela posteriormente en nitrógeno líquido. La preparación de micelios congelados se muele hasta un polvo fino en un molino eléctrico de café, y el polvo se agrega a un tubo de centrífuga de plástico desechable que contiene 20 ml de amortiguador TE y 5 ml de dodecilsulfato de sodio al 20% p/v (SDS) . La muestra se invierte suavemente varias veces para asegurar el mezclado, y se extrae dos veces con un volumen igual de fenol ¡cloroformo: alcohol isoamílico (25:24:1 v/v/v) . Se agrega acetato de sodio (solución 3 M) a la muestra extraída, hasta una concentración final de 0.3 M seguido por 2.5 volúmenes de etanol enfriado con hielo para precipitar el ADN. El tubo se centrifuga a 15,000 x g durante 30 minutos para sedimentar el ADN. Se permite que el sedimento de ADN seque al aire durante 30 minutos antes de la resuspensión en 0.5 ml de amortiguador TE. Se agrega ribonucleasa A libre de ADNasa al sedimento de ADN resuspendido, a una concentración de 100 µg/ml y la mezcla se incuba posteriormente a 37°C durante 30 minutos. Se agrega proteinasa K (200 µg/ml) y se incuba en tubo durante una hora adicional a 37°C. Finalmente, la muestra se extrae dos veces con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico y se precipita el ADN con metanol. El ADN precipitado se lava con etanol al 70%, se seca bajo vacío, se resuspende en amortiguador TE y se almacena a 4°C.

Ejemplo 12: Amplificación por PCR de los segmentos de gen para haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 En base a la secuencia de aminoácidos de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 descritas antes y de la haloperoxidasa de Curvularia inaequalis descrita por Simón et al., supra, se sintetizan los iniciadores o cebadores de oligonucledtidos que se muestran a continuación con un sintetizador de ADN/AJRN de Applied Biosystems modelo 394, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para uso para amplificar por PCR los fragmentos del gen para haloperoxidasa de C rvularia verruculosa CBS 147.63 : Iniciador delantero-- dGAAGAGTACAACACCAACTACATA Iniciador trasero; dCCCATCGTAGGCCCAGTATAGGCCCTG Se preparan reacciones de amplificación (100 µl) utilizando aproximadamente 1 µg de ADN genómico de Curvularia verru«rulosa CBS 147.63 como la plantilla. Cada reacción contiene los siguientes componentes: 1 µg de ADN genómico, 40 pmol de iniciador delantero, 40 pmol de iniciador inverso, 200 µM de cada uno de dNTP, amortiguador para Taqpolimerasa 1 x (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ) y 5 unidades de polimerasa Taq {Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ) . Se coloca aceite mineral estéril (100 µl) sobre cada mezcla de reacción y las reacciones se incuban en un ciclador térmico Perkin-Elmer modelo 480 programado como sigue: ciclo 1 » 95°C durante 5 minutos, 45°C durante 2 minutos y 67°C durante 5 minutos; ciclos 2-30 » 95°C durante 2 minutos; 45°C durante 2 minutos y 67°C durante 2 minutos; y ciclo de enjuagado a 4°C. Los productos de reacción se aislan en un gel de agarosa con un punto de fusión bajo al 1% (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) . Se cortan las bandas de producto del gel y se purifican utilizando ß-agarasa (New England Biolabs, Beverly, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Los productos purificados de PCR se clonan subsecuentemente en el vector pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) y se determinan las secuencias de ADN utilizando los iniciadores delantero y trasero lac (New England BioLabs, Beverly, MA) . Se amplifica un segmento de gen para haloperoxidasa que consiste en aproximadamente 278 codones (834 pb) de Curvularia verruculosa CBS 147.63, como se muestra en la figura 7, con los iniciadores para PCR específicos para haloperoxidasa descritos antes. El análisis de la secuencia de ADN muestra que los segmentos de gen amplificados codifican para una porción del gen para haloperoxidasa correspondiente de Curvularia verruculosa. El segmento de gen para haloperoxidasa se utiliza para sondear una transferencia Southern del ADN genómico de Curvularia verruculosa CBS 147.63.

Ejepplo 13: Análisis por hibridación de AEN gen?mico Se preparan muestras de ADN celular total de Curvularia verruculosa CBS 147.63 descrito en el ejemplo 11 y se analizan mediante hibridización Southern (Maniatis et al., 1982, Mlecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) . Se digieren aproximadamente 2-5 µg de ADN con Xbal, BamHl más HindIII, Ba Hl más PstI o BamHl más Xbal y se fraccionan en gel de agarosa al 1%. El gel se fotografía bajo luz UV de longitud de onda corta y se humedecen durante 15 minutos en NaOH 0.5 M-NaCl 1.5 M seguido por 15 minutos en Tris-HCl 1 M, pH 8-NaCl 1.5 M. El ADN en el gel se transfiere a una membrana de hibridización Nytran"* (Schleicher & Schuell, Keene, NH) mediante transferencia capilar en SSPE 20 X (cloruro de sodio a 3 M-fosfato dibásico de sodio 0.2 M, EDTA disddico 0.02 M) de acuerdo con Davis et al, (1980, Ac?vance Bacterial Genetics, A Manual for Genetic Engineering, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) . El ADN se retícula sobre la membrana utilizando un Stratalinker UV (Stratagene, La Jolla, CA) , y la membrana se humedece durante 2 horas en el siguiente amortiguador de hibridización a 45°C con agitación suave: SSPE 5 X, formamida al 50% (v/v), SDS al 0.03% y 200 µg/ml de ADN de testículo de salmón es naturalizado y sometido a cizallamiento. El fragmento de gel para haloperoxidasa aislado de Curvularia verruculosa CBS 147.63 por PCR-clona como se describe en el Ejemplo 2 es radiomarcado y se utiliza para sondear la transferencia Southern del ADN genómico de Curvularia verruculosa CBS 147.63. Específicamente, el fragmento del gen es radiomarcado por traducción por muescas (Maniatis et al., supra) con [32P]dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) , se desnaturaliza al agregar NaOH hasta una concentración final de 0.1 M y se agrega al amortiguador de hibridización a una actividad de aproximadamente 1 x 10ß cpm por ml de amortiguador. La mezcla se incuba durante la noche a 45°C en un baño de agua en agitación. Después de la incubación, las membranas se lavan una vez en SSPE 0.2 X con SDS al 0.1% a 45°C, seguido por dos lavados en SSPE 0.2 X (sin SDS) a la misma temperatura. Se permite que las membranas sequen sobre toallas de papel durante 15 minutos, después de envuelven en Saran-WrapMR y se exponen a una película de rayos X durante la noche a -70°C con pantallas de intensificación (Kodak. Rochester, NY) . El análisis de las muestras de ADN celular total de Curvularia verruculosa CBS 147.63 por transferencia Southern bajo condiciones de restricción moderada utilizando la sonda de segmento del gen para haloperoxidasa derivada de PCR de Curvularia verruculosa CBS 147.63 muestra una sola señal de hibridización (figura 8) . La señal de hibridización única sugiere que existe una sola copia del gen para haloperoxidasa presente en el genoma de Curvularia verruculosa CBS 147.63.

Ejemplo 14: Bibliotecas de AEN e identificación de clonas de haloperoxidasa Se construye una biblioteca de ADN gendmico en el vector de clonación de bacteriófago ?ZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . En primer lugar, el ADN celular total se digiere parcialmente con Tsp509I y se fracciona por tamaño en geles de agarosa al 1%. Se cortan los fragmentos de ADN que migran en el intervalo de tamaño de 3-7 kb y se eluyen del gel utilizando reactivos Prep-a-gene (BioRad Laboratories, Hercules, CA) . Se ligan los fragmentos de ADN eluidos con EcoRI-se separan y se desfosforilan con brazos de vector ?ZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MD) , y las mezclas de ligación se empacan utilizando extractos de empacado comerciales (Stratagene, La Jolla, CA) . Las bibliotecas de ADN empacado se colocan en placas y se amplifican en células de Escherichia coli Y1090ZL (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . La biblioteca de ADN genómico no amplificado contiene 3.1 x 105 ufp/ml (títulos de fondo sin ADN de 2.0 x 10* ufp/ml). Se examinan aproximadamente 60,000 placas de la biblioteca mediante hibridización por placa utilizando el fragmento de PCR específico para operoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 como sonda (Davis et al., 1980, Advanced Bacterial Genetics, A Manual for Genetic Engineering, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York) . Se purifican 6 placas, las cuales tienen señales de hibridización fuertes con la sonda, dos veces en células de E. coli Y1090ZL y los genes para haloperoxidasa posteriormente se separan del vector ?ZipLox como derivados pZLl (D'Alessio et al., 1992, Focu?* 14:76) utilizando el corte ip vivo por infección de células E. coli DH1090zip (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Se prepara ADN Miniprep a partir de cada una de estas clonas y se determinan los tamaños de los insertos de haloperoxidasa por electroforesis en gel de agarosa, como se muestra en la figura 9. Varias de las clonas parecen ser consanguíneas e incluyen dos clonas designadas 4A1 y 4A2, las cuales albergan insertos que co igran con la banda del plásmido (ca. 4.3 kb) . La clona 4A de haloperoxidasa ( E. coli DH10B-pHAP4A.l) se selecciona para análisis de secuencia de ADN utilizando un equipo de purificación de ADN Wizard 373 (Promega, Madison, Wl) .

Ejemplo 15: Análisis de secuencia de ADN de el gen para haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 La determinación de secuencia de ADN de la clona de haloperoxidasa 4A (E. coli DH10B - pHAP4A.l) descrita en el ejemplo 14 se lleva a cabo con un determinador de secuencia de ADN automatizado Applied Biosystem modelo 373A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) en ambas hebras utilizando una combinación de determinación de secuencia de ADN de disparo y la técnica de caminado de iniciador con química de terminador de colorante (Giesecke et al., 1992, Journal of Virol . Methods 38: 47-60). Además de los iniciadores delantero lac y trasero lac, se sintetizan los siguientes iniciadores para determinación de secuencia de oligonucleótidos utilizados para la determinación de la secuencia del gen en un sintetizador de ADN/ARN de Applied Biosystems modelo 394, de acuerdo con las instrucciones del fabricante : Iniciador de determin-ador secuencia -^i tninia-inr <=> asmiencia 951337 dCATGTGGGACGAGCAGGTGCCGTTG (SEC. DE IDENT. NO: 11) 951338 dGATAGAAAAGTAGGCATCGTGGATA (SEC. DE IDENT. NO: 12) 951367 dCAGAGCTCTGGCAGAGAGAGGCGGTCC (SEC. DE IDENT. NO: 13) 951368 dCATTGGGGCTAGGCAGACGGTACGC (SEC. DE IDENT. NO: 14) 951369 dGAAGACAGCAYCYYGAGAGCAGCTC (SEC. DE IDENT. NO:15) 951455 dCAAGCGTAAGCAGCCAAACTGATCT (SEC. DE IDENT. NO: 16) 951456 dGAGATGTACATACGTCAGACCTGGC (SEC. DE IDENT. NO: 17) En la figura 10 se muestra la secuencia de nucleótidos del gen que codifica para haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63. El análisis de secuencia del inserto clonado denominado pxl muestra un marco de lectura abierta grande de 1800 nr (que excluye al coddn de detención) que codifica para una proteína de 600 aminoácidos. NO están presentes en el gen intrones. El contenido G+C de este marco de lectura abierta es de 57%. La secuencia deducida de aminoácidos de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 como se muestra en la figura 10 indica que el peso molecular calculado del producto de traducción principal es de 66,593, lo cual concuerda con el estimado de 68 kDa en base a la movilidad de la proteína purificada en SDS-PAGE y las secuencias de aminoácidos de los péptidos derivados de la haloperoxidasa purificada descrita antes. La secuencia deducida de aminoácidos predice la presencia de únicamente dos residuos Cys en la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa los cuales probablemente estén presentes como tioles libres en la enzima activa lo cual es consistente con la haloperoxidasa de Curvularia inaequalis (Simons et al., 1995 European Journal of Biochemistry 229:566-574) . Existen tres sitios potenciales para N glicosilación. El análisis de la composición de monosacáridos de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa, como se describe en el ejemplo 8, indica que la haloperoxidasa está glicosilada con 1 pmol de galactosa, 16 pmol de glucosa y 29 pmol de mañosa por pmol de haloperoxidasa. Sin embargo, puesto que el peso molecular observado de la haloperoxidasa de Curvularia verruculssa (68 kDa) es muy cercano al tamaño calculado (P.M. = 66,573) , probablemente el grado de glicosilación es muy pequeño. Además, la ausencia de glucosa ina en este análisis sugiere que las porciones de carbohidratos están unidas a 0. Esto contrasta con la haloperoxidasa de Curvularia inaequalis la cual se ha informado que no está glicosilada (Simons et al., 1995, European Journal of Chemistry 229:566-574) .

La secuencia deducida de aminoácidos de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa es 90.9% idéntica a la de haloperoxidasa de Curvularia inaequalis, como se muestra en la figura 11. De manera interesante, la haloperoxidasa de Curvularia inaequalis es nueve residuos más grande que la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa y está presente como dos grupos, uno cerca de la parte N terminal y el otro en la parte C terminal de la haloperoxidasa de Curvularia inaequalis.

Ejemplo 16: Producción de haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 444.70 Se produce un cultivo de semilla o siembra de Curvularia verruculosa CBS 444.70 en un matraz de agitación de 500 ml que contiene 100 ml de medio con la siguiente composición: Licor de infusión de maíz (seco) 1.2 g Glucosa 2.4 g CaC03 0.5 g Aceite de soya 0.5 ml Se ajusta el pH a 5.5 antes de someter a autoclave.

Después de 3 días de crecimiento a 26°C y 250 rpm, se inocula un fermentador de laboratorio de 10 litros con el cultivo de siembra descrito antes. La composición del medio en el fermentador es: Extracto de levadura (Difco 0127) 8 g/1 K2HP04 (Merck 5101) 2 g/1 MgS04.7H20 (Merck 5886) 1 g/1 Dextrosa (Roquelle 101-0441) 30 g/1 Na3V04 1 mg/l No se ajusta el pH, pero se mide y es de 6.2. La fermentación tiene lugar a 26°C, 550 rpm, durante 7 días.

Ejepplo 17: Purificación de la haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 444.70 El caldo de cultivo preparado como se describe en el ejemplo 16 se centrifuga, se filtra (GF/F Whatman) , y se concentra adicionalmente aproximadamente 80 veces en un aparato Filtron (límite de membrana: 10000 Da) , y se concentra adicionalmente en una celda Amicon (PM 10) . El caldo concentrado se carga en una columna Q-Sepharose FF (100 ml, XK26, Pharmacia) equilibrada previamente en fosfato de potasio 10 mM, pH 7 (amortiguador A) a un régimen de 5 ml/min. La columna se lava con 200 mol de fosfato de potasio 10 mM, pH 7 y después se eluye con un gradiente de NaCl 0 -> 1 M del mismo amortiguador durante 200 minutos. Se recolectan y acumulan fracciones de 10 ml de acuerdo a la presencia de actividad de haloperoxidasa, como se describe en el Ejemplo 2. Las fracciones 36-45 se acumulan y concentran en una celda Amicon (PM 10) y Cennicon-10. Se cargan muestras de 1.5 ml del concentrado en una columna HiLoad Superdex 75 (Pharmacia) equilibrado con fosfato de sodio 50 mM, pH 7.1, la haloperoxidasa se eluye a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se recolectan y ensayan fracciones de 1.5 ml para determinar actividad de haloperoxidasa, como se describe en el Ejemplo 2. Se acumulan las fracciones que contienen actividad de haloperoxidasa.

Ejemplo 18: Actividad anti-bacteriana de haloperaxidasa de Curvularia verruculosa CBS 444.70 Se prueba la actividad antibacteriana de haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 444.70 preparada como se describe en el Ejemplo 17, contra las siguientes cuatro bacterias no patógenas diferentes: Bacterias gramnega ivas Pseudamapas -fluorescens (ATCC 13525) Vibrio alginolyticus (ATCC 17749) Bacterias gramposi ivas Listeria innocua (ATCC 33090) Micrococcus luteus (ATCC 10240) .

Los organismos de prueba se cultivan en medio TY (ajustado a pH 7.3 con hidróxido de potasio) que comprende los siguientes componentes: Tripticasa 20 g/litro Extracto de levadura 5 g/litro FeCl2.4H20 6 mg/litro MnCl2.7H20 1 mg/litro MgS047H20 15 mg/litro Actividad antibacteriana Se incuban los organismos de prueba (107-108 UFC/ml, donde UFC = unidades formadoras de colonias) en medio TY, a 30°C con una de las siguientes soluciones (soluciones de haloperoxidasa que están filtradas en una membrana de 0.2 µ) : (1) cloruro de benzalconio, 10 ppm; (2) glucosa oxidasa obtenida de Aspergillus niger que tiene una actividad de 0.2 GODU/ml (Sigma) + glucosa 10 mM; (3) una glucosa oxidasa que se obtiene de Aspergillus niger que tiene una actividad de 0.2 GODU/ml (Sigma) + glucosa 10 mM + SCN' 1 mM; (4) una glucosa oxidasa obtenida de Aspergillus niger «que tiene una actividad de 0.2 GODU/ml (Sigma) + glucosa 10 mM + 0.1 HU/ml de haloperoxidasa de C. verruculosa; y (5) una glucosa oxidasa obtenida de Aspergillus niger que tiene una actividad de 0.2 GODU/ml (Sigma) + glucosa 10 mM + SCN* 1 mM + 0.1 HU/ml de haloperoxidasa de C. verruculosa. Se determinó la actividad de glucosa oxidasa por oxidación de D-glucosa por oxígeno a ácido glucurdnico y peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno producido de esta manera se reduce por peroxidasa y 2, 2 ' -azinobis (3-etilbenzotiazolin-6 -sulfonato) a agua. El color verduzco-azul producido se mide a 418 nm. Las condiciones analíticas son: acetato de sodio 0.1 M, ß-D-glucosa 90 mM, pH 5.6, 30 "C y 20 minutos de reacción. Una unidad de glucosa oxidasa (GODU) se define como la cantidad de glucosa oxidasa que cataliza la conversión de 1 µmol de peróxido de hidrógeno por minuto, bajo estas condiciones. La inhibición de crecimiento de Listeria y Micrococcus es seguida a 30 °C y la turbidez se mide a 490 nm.

Los resultados que se presentan en la Tabla 3 muestran que se inhibe el crecimiento de Listeria o Micrococcus después del tratamiento con la solución 5, aunque el crecimiento de Microccus es sensible a la solución 2.

Tabla 3: Crecimiento de bacterias grampositivas, expresado en % en relación al control; se mide el incremento de turbidez a 490 nm después de 24 horas de incubación.

Incuban una cantidad menor de células de los organismos de prueba (105-106 UFC/ml) con las soluciones anteriores en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, pH 7 durante 1 hora y se colocan en agar TY. Cuando se utiliza la solución 5, las bacterias gramnegativas {Pseu amapas y ViJbrio) son afectadas gravemente, mientras que las bacterias grampositivas sobreviven bajo las condiciones dadas, como se muestra en la Tabla 4. La supervivencia de las bacterias grampositivas puede deberse al tiempo de incubación limitado (1 hora) .

Tabla 4 : Actividad antibacteriana de haloperoxidasa purificada, como % de supervivencia, basado en la cuenta de UFC: Ejemplo 19: Construcción de un plásmido de expresión de Aspa-rgillus oryzae (hpxl) para halspßroxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 Se amplifica la región codificante del gen para haloperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 ( px) y se clona el fragmento resultante en pBANed para expresión en Aspergí!lus oryzae. pBANeß proporciona el promotor TAKA/NA2-tpi, el terminador AMG 3' y el gen marcador seleccionable anuas (figura 12) . Específicamente, el fragmento se amplifica por PCR utilizando un iniciador con sentido (aHaPl) diseñado para el iniciador ATG en marco que se extiende 20 pb corriente abajo, y un iniciador antisentido (aHaPlA) diseñado para una región 14 pb corriente abajo del codón de detención de transcripción y que se extiende 19 pb corriente abajo. Para facilitar la clonación del fragmento amplificado los iniciadores con sentido y antisentido contienen un sitio de restricción Swal y Pací , respectivamente. Los iniciadores de oligonucledtido mostrados abajo se sintetizan mostrando un sintetizador de ADN/ARN ABI modo 394 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) . Swal aHaP: 5» GCATATTTAAATGATGGGGTCCGTTACACCAAT (SEC. DE IDENT. NO: 18) Pací aHaPlA 5' ATATTAATTAATCACTGGTAAACTCTGCCG (SEC. DE IDENT. NO: 19) La solución de 50 µl de PCR (Tris-HCl 10 mM, pH 8.3, KCl 50 mM, MgCl2 1.5 mM, 0.01% p/v de gelatina) contiene aproximadamente 200 ng de ADN hpxl, 200 µM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, y 50 pmol de cada iniciador de PCR descrito antes. Se agregan cinco unidades de polimerasa PWO (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) y la región se incuba a 95°C durante 3 minutos y se enfría a 80°C. Después se cicla la reacción 30 veces cada ciclo a 95ßC durante 30 segundos, 57°C durante 1 minuto y 72"C durante 1 minuto, en un ciclador térmico Perkin-Elmer 9600. Después del último ciclo, la reacción se incuba durante 5 minutos a 72 ßC. Se aisla un fragmento predicho de 1.8 kb por digestión con Swal y Pací y se clona en pBANed digerido con las mismas endonucleasas de restricción para generar pAJ014-1 (Figura 13) . Con el fin de verificar la fidelidad del fragmento de PCR clonado, se determina la secuencia del fragmento de acuerdo con el método de Hattori y Sakaki (1986, Analytical Biochemistry 152:232-237) utilizando un secuenciador automatizado de Applied Biosystems Modelo 373A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) . La determinación de la secuencia del inserto amplificado de hapxl clonado de pAJ014-l confirma que no existen diferencias en la secuencia descrita en la SEC. DE IDENT. NO:l.

Ejepplo 20: Transformación de Aspergillus oryzae cepa JaL142 con Se transforma Aspergillus oryzae cepa JaL142 con pAJ014-l, de acuerdo con el siguiente procedimiento. La transformación se lleva a cabo con protoplastos a una concentración de 2 x 107 protoplastos por ml . Se incuban 100 µl de protoplastos a 34 ßC con 10 µg de ADN y 200 µl de una solución de PEG 4000 al 60%-HEPES 10 mM-CaCl2 10 mM durante 30 minutos. Se agregan 3 ml de SPTC (PEG 4000 al 40%, sorbitol 0.8 M, Tris 0.05 M, pH 8.0, CaCl2 0.05) y los protoplastos se colocan en placas directamente sobre placas de transformación COVE (342.3 g de sacarosa, 25 g de agar Noble, 10 ml de acetamida 1 M, 20 ml de solución de sales COVE y 10 ml de CsCl 3 M por litro) para transformaciones amdS. La solución de sales de cobre (50X) está constituida de 26 g de KCl, 26 g de MgS04-7H20, 76 g de KH2P04, y 50 ml de solución de metales en trazas COVE. La solución de metales en trazas COVE está constituida de 0.04 g de NaB407-10 H20 0.04 g de CuS04-5H20, 0.70 g de FeS04H20, 0.80 de Na2Mo02-2H20 y 10 g de ZnS04 por litro. Las placas se incuban a 5-7 días a 34 "C. Los transformantes se transfieren a placas del mismo medio y se incuban 3-5 días a 34°C. Posteriormente se purifican los transformantes por sembrado en línea de esporas y al tomar colonias aisladas utilizando las mismas placas bajo las mismas condiciones.

Ejespío 21: Expresión de halsperoxidasa de Curvularia verruculosa CBS 147.63 en Aspergillus oryzae Se inoculan 24 transformantes del Ejemplo 20, cada uno en 1 ml de medio MY50N con 1/4 de fuerza suplementado con V205 1 mM en una placa de 24 pozos. El medio MY50N está constituido por litro de 62.5 de nutriosa, 2 g de MgS04-7H20, 2 g de KH2P04, 4 g de ácido cítrico , 8 g de extracto de levadura, 2 g de urea, 0.2 g de CaCl2 y 0.5 ml de metales en trazas. La solución de metales en trazas está constituida de 22 g de ZnS04-7H20, 11 g de H3B03, 5 g de FeS04-7H20, 1.6 g de CoCl2-5H20, 1.6 g de (NH4) sMo7024, y 50 g de Na4EDTA por litro. Se hacen crecer los cultivos durante 5 días a 34 °C con agitación a 150 rpm y después se realizan ensayos para determinar la actividad de haloperoxidasa buscando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2 , excepto que el amortiguador del ensayo también contiene V205 1.25 mM para activación de la enzima. Los ensayos se inician por la adición de 10 µl de H202 al 0.3% y se verifica la absorción a 600 nm como una función de tiempo durante la incubación a 30 ßC. La actividad se expresa como el cambio en la absorbancia a 600 nm por minuto, por ml (mOD600/minuto-ml) . La totalidad de los anticuerpos transformantes presenta actividad detectable de haloperoxidasa, que varía desde 250 a 8 , 390mOD600/minuto-ml . El análisis por SDS-PAGE de las muestras de la placa de 24 pozos demuestra fácilmente la presencia de una banda de 66 kDa que corresponde con la haloperoxidasa cuya abundancia se correlaciona bien con los resultados del ensayo. Los ocho mejores transformantes se purifican por esporas y se inoculan en matraces de agitación con deflectores de 125 ml, que contienen 25 ml de medio MY50N suplementado con V205 1 mM, y se hacen crecer durante 5 días a 34 °C con agitación a 250 rpm. Se ensayan estos cultivos después de 5 días de crecimiento y se prueba el mejor aislado, HaP14, en un fermentador. Se fermenta HaP14 en un medio de tanque constituido de 30 g de Nutriosa, 10 g de extracto de levadura, 2 g de MgS04-7H20, 2 g de K2S04, 2 g de ácido cítrico, 3 g de CaCl2 y 0.5 ml de solución de metales en trazas (descrita antes) por litro y se alimenta durante el curso de la fermentación con un medio constituido de 400 g de nutriosa, 20 g de urea y 1 g de ácido cítrico por litro. Se permite que la fermentación se lleve a cabo durante 7 días a 34 °C, pH 7.2, tiempo en el cual se recolectan aproximadamente 1.2 litros de calcio. Los ensayos realizados en ambas muestras durante los días a de la fermentación sugieren que la producción de haloperoxidasa alcance un máximo en el día 4 y declina posteriormente, aunque la producción parece recuperarse ligeramente en el día 7 (Figura 14) .

DEPOSITO DE MICROORGANISMOS Se ha depositado la siguiente cepa de acuerdo con el Tratado de Budapest en la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) , Northern Regional Research Laboratory, 1815 University Street, Peoría, Illinois 61604, Estados Unidos.

Q_V_ NÚ rQ de aCCeSQ Fecha * diapósit-r-E. coli DH10B (pHAP4A.l) NRRL B-21519 18 de enero de 1996 La cepa se ha depositado bajo las condiciones que aseguran que estará disponible el acceso al cultivo durante la tendencia de esta solicitud para patente a una persona determinada por el comisionado de la Oficina de Patentes y Marcas nombrada por el mismo bajo 37 C.F.R. §1.14 y 35 U.S.C. §122. El depósito representa un cultivo sustancialmente puro de cada cepa depositada. El depósito está disponible a solicitud para leyes para patentes extranjeras en países en los que se presenten sus contrapartes de la presente solicitud, o sus dependencias. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad del depósito no constituye una licencia para llevar a la práctica la presente invención en derogación de los derechos de patente otorgados por la acción gubernamental . La invención descrita y reivindicada en la presente no se limita en cuanto a alcance por las modalidades específicas y descritas en la presente, puesto que estas modalidades se consideran como ilustraciones de diversos aspectos de la invención. Se considera que cualquier modalidad equivalente está dentro del alcance de esta invención. En realidad, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente, se volverán evidentes para una persona familiarizada con la técnica a partir de la descripción anterior. Se considera que tales modificaciones se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. En la presente se mencionan diversas referencias, la descripción de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Novo Nordisk A/S (B) CALLE: NOVO Alié (C) CIUDAD: Bagsvaerd (D) ESTADO: (E) PAÍS: Dinamarca (F) C.P. : DK-2880 (G) TELÉFONO: 45-4444-8888 (H) TELEFAX: 45-4449-0555 (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: Novo Nordisk Biotech, Inc. (B) CALLE: 1445 Drew Avenue (C) CIUDAD: Davis (D) ESTADO: California (E) PAÍS: Estados Unidos (F) C.P. : 95616-4880 (G) TELÉFONO: (916) 757-8100 (H) TELEFAX: (916) 758-0317 (;i) TÍTULO DE LA INVENCIÓN Haloperoxidasas de Curvularia varruculosa y (i: i) NUMERO DE SECUENCIAS: 10 (;v) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Novo Nordisk of North America, Inc. (B) CALLE: 405 Lexington Avenue, Suite 6400 (C) CIUDAD: New York (D) ESTADO: New York (E) PAÍS: Estados Unidos (F) C.P. : 10174 v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible (B) COMPUTADORA: PC IBM compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) ELEMENTO DE PROGRAMACIÓN: PatentIn Reléase # 1.0, Versión # 1.30 (vi) FECHA DE APLICACIÓN ACTUAL: (A) SOLICITUD NUMERO: 10 (B) FECHA DE DEPÓSITO: 9-JUL-1996 (C) CLASIFICACIÓN: (v.. i) FECHA DE APLICACIÓN (A) SOLICITUD NÚMERO: 60/001,194 15 (B) FECHA DE DEPÓSITO: 14-JUL-1995 (v.. i) FECHA DE APLICACIÓN (A) SOLICITUD NÚMERO: 08/603,534 20 (B) FECHA DE DEPÓSITO: 21-FEB-1996 (vi. i) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Lambiris, Elias J. (B) REGISTRO NÚMERO: 33,728 25 (O REFERENCIA/NO. DE EXPEDIENTE: 4441.204- O (.x) INFORMACIÓN POR TELECOMUNICACIÓN: (A) TELÉFONO: (212) 867-0123 (B) TELEFAX: (212) 878-9655 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO.: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 2822 Pares de bases (B) TIPO: Ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: Simple (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 477..2276 (xi) DESCRIPCIÓN DE j(SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO.

GAGA GTACA TACGTCAGAC CTGGCCATCC AACATTTATC CCAGTCGGAC ACCGGCTCCT 6 TTCG CACCA GTTGGTCACC GAGTTTTAAT ATCACATGTG GTTCACGCCA AGCGTAAGCA 12 GCCA ACTGA TCTCCCTAGA TCCGTCTTGG TTACCGCCTC AGGACAATTT CCATTTGACG 18 GCAG GGTCT GCCACACCGC TGCAATGCGG CTGTGGCTTC ACGTCTGCCT TGCGCCCTTG 24 CATG GAATA GCAGTTCCCC GTAACTTTGT GGCTTGACTA TGGTTCACCT GATAGCGACG 30 AGTG ACCAT TCTAAGAGTC TTCAAGGGTC TTTTGAACGG AACAGAGTGG ATGTGTGTGT 360 GTGT CTGAT ATCCTTGAAG AATTGACTAT AAAGTCTGTG AGCTCTCGCA TTCTTTGTTG 420 CAAT TCACA ATTCATCTAC TCATTCTGTG CACCACATAT CATCATCACA CCTACT 476 ATG GG TCC GTT ACA CCA ATT CCG TTG CCT ACG ATC GAT GAA CCC GAA 524 Met Gly Ser Val Thr Pro lie Pro Leu Pro Thr lie Asp Glu Pro Glu 1 5 10 15 GAG AT AAC AAC AAC TAC ATA TCT TTC TGG AAT AAT GTC GGG CTG GAA 572 Glu Tyr Asn Asn Asn Tyr lie Leu Phe Trp Asn Asn Val Gly Leu Glu 20 25 30 CTG AC CGC CTA ACT CAC ACT GTG GGA GGC CCC TTG ACG GGA CCG CGT 620 Leu Asn Arg Leu Thr His Thr Val Gly Gly Pro Leu Thr Gly Pro Pro 35 40 45 CTC CT GCC AGA GCT CTG GGC ATG CTG CAC TTG GCT ATC CAC GAT GCC 668 Leu er Ala Arg Ala Leu Gly Met Leu His Leu Ala lie His Asp Ala 50 55 60 TAC TT TCT ATC TGT CCT CCT ACT GAG TTT ACC ACC TTT CTC TCC CCT 716 Tyr Phe Ser lie Cys Pro Pro Thr Glu Phe Thr Thr Phe Leu Ser Pro 65 70 75 80 GAT CT GAG AAT CCC CGG TAC CGT CTG CCT AGC CCC AAT GGG GCA GAC 764 Asp la Glu Asn Pro Ala Tyr Arg Leu Pro Ser Pro Asn Gly Ala Asp 85 90 95 GAT CC CGC CAA GCA GTC GCT GGA GCT GCT CTC AAG ATG CTG TCT TCG 812 Asp la Arg Gln Ala Val Ala Gly Ala Ala Leu Lys Met Leu Ser Ser 100 105 110 CTA AC ATG AAG CCT GCC GAC CCC AAT ACC GGC ACC AAC ATC TCC GAC 860 Leu yr Met Lys Pro Ala Asp Pro Asn Thr Gly Thr Asn He Ser Asp 115 120 125 AAT CC TAT GCT CAG CTT GCC CTG GTT CTC GAA CGA GCA GTC GTA AAG 908 Asn la Tyr Ala Gln Leu Ala Leu Val Leu Glu Arg Ala Val Val Lys 130 135 140 GTA CG GGT GGT GTT GAT CGA GAG TCA GTC AGC TTC ATG TTT GGT GAG 956 Val Pro Gly Gly Val Asp Arg Glu Ser Val Ser Phe Met Phe Gly Glu 145 150 155 160 GCT TC GCC GAT GTC TTC TTT GCA TCT CTC AAC GAT CCT CGA GGT GCT 100 Ala Val Ala Asp Val Phe Phe Ala Leu Leu Asn Asp Pro Arg Gly Ala 165 170 175 TCA CAG GAG GGC TAC CAG CCT ACC CCC GGT CGT TAT AAA TTC GAC GAT 105 Ser Gln Glu Gly Tyr Gln Pro Thr Pro Gly Arg Tyr Lys Phe Asp Asp 180 185 190 GAG CGT ACT CAC CCA GTC GTC CTA GTC CCC GTA GAC CCC AAC AAC CCC 1100 Glu Pro Thr His Pro Val Val Leu Val Pro Val Asp Pro Asn Asn Pro 195 200 205 AAC GGC CCC AAG ATG CCT TTC CGC CAG TAT CAT GCC CCA TTC TAC GGC 1148 Asn Gly Pro Lys Met Pro Phe Arg Gin Tyr His Ala Pro Phe Tyr Gly 210 215 220 ATG ACA ACG AAG CGT TTT GCC ACG CAG TCC GAG CAC ATC CTT GCA GAC 1196 Met Thr Thr Lys Arg Phe Ala Thr Gln Ser Glu His He Leu Ala Asp 225 230 235 240 CCA CCG GGT CTC CGT TCT AAT GCG GAT GAG ACT GCT GAG TAT GAC GAC 1244 Pro Pro Gly Leu Arg Ser Asn Ala Asp Glu Thr Ala Glu Tyr Asp Asp 245 250 255 TCT ATC CGC GTG GCC ATC GCC ATG GGA GGT GCC CAG GAT TCT AAC TCC 1292 Ser He Arg Val Ala He Ala Met Gly Gly Ala Gln Asp Leu Asn Ser 260 265 270 ACC AAG CGT AGC CCA TGG CAG ACG GCA CAA GGT CTG TAC TGG GCC TAT 1340 Thr Lys Arg Ser Pro Trp Gln Thr Ala Gln Gly Leu Tyr Trp Ala Tyr 275 280 285 GAT GGG TCA AAC CTT GTT GGA ACC CCA CCG CGA TTC TAC AAT CAG ATT 1388 Asp Gly Ser Asn Leu Val Gly Thr Pro Pro Arg Phe Tyr Asn Gln He 290 295 300 GTG CGT CGC ATC GCA GTG ACT TAC AAG AAG GAA GAT GAC CTT GCC AAC 1436 Val Arg Arg He Ala Val Thr Tyr Lys Lys Glu Asp Asp Leu Ala Asn 305 310 315 320 AGC GAA GTC AAC AAT GCT GAT TTT GCC CGC CTC TTC GCC CTC GTC AAC 1484 Ser Glu Val Asn Asn Ala Asp Phe Ala Arg Leu Phe Ala Leu Val Asn 325 330 335 GTC GCC TGC ACA GAC GCC GGC ATC TTT TCC TGG AAG GAA AAA TGG GAG 1532 Val Ala Cys Thr Asp Ala Gly He Phe Ser Trp Lys Glu Lys Trp Glu 340 345 350 TTT GAA TTC TGG CGC CCT TTG TCT GGT GTG AGA GAC GAT GGC CGT CCA 1580 Phe Glu Phe Trp Arg Pro Leu Ser Gly Val Arg Asp Asp Gly Arg Pro 355 360 365 GAC CAC GGA GAT CCT TTC TGG CTT ACC CTC GGT GCC CCA GCT ACA AAC 1628 Asp His Gly Asp Pro Phe Trp Leu Thr Leu Gly Ala Pro Ala Thr Asn 370 375 380 ACA AGC GAC ATA CCC TTC AAG CCT CCT TTC CCC GCC TAC CCA TCT GGC 1676 Thr Asn Asp He Pro Phe Lys Pro Pro Phe Pro Ala Tyr Pro Ser Gly 385 390 395 400 CAC GCC ACC TTT GGC GGT GCT GTA TTC CAG ATG GTC GCG GCG TAC TAC 1724 His Ala Thr Phe Gly Gly Ala Val Phe Gln Met Val Arg Arg Tyr Tyr 405 410 415 AAC GGG CGC GTA GGC ACC TGG AAG GAC GAC GAA CCA GAC AAC ATT GCC 1772 Asn Gly Arg Val Gly Thr Trp Lys Asp Asp Glu Pro Asp Asn He Ala 420 425 430 ATT GAC ATG ATG ATA TCC GAG GAG CTC AAC GGC GTG AAC CGC GAC CTG 1820 He Asp Met Met He Ser Glu Glu Leu Asn Gly Val Asn Arg Asp Leu 435 440 445 CGC CAG CCC TAC GAC CCG ACT GCC CCC ATC GAA GAC CAA CCA GGT ATC 1868 Arg Gln Pro Tyr Asp Pro Thr Ala Pro He Glu Asp Gln Pro Gly He 450 455 460 GTC CGC ACC CGC ATC GTG CGC CAC TTT GAC TCA GCC TGG GAA ATG ATG 1916 Val Arg Thr Arg He Val Arg His Phe Asp Ser Ala Trp Glu Met Met 465 470 475 480 TTC GAA AAC GCC ATT TCT GCG ATC TTC CTC GGC GTC CAC TGG CGC TTC 1964 Phe Glu Asn Ala He Ser Arg He Phe Leu Gly Val His Trp Arg Phe 485 490 495 GAT GCC GCC GCC GCT CGC GAC ATT CTG ATC CCC ACC AAC ACA AAG GAT 2012 Asp Ala Ala Ala Ala Arg Asp He Leu He Pro Thr Asn Thr Lys Asp 500 505 510 GTG TAT GCC GTC GAC AGC AAC GGC GCG ACA GTG TTC CAG AAT GTA GAG 2060 Val Tyr Ala Val Asp Ser Asn Gly Ala Thr Val Phe Gln Asn Val Glu 515 520 525 GAT GTC AGG TAC TCG ACC AAG GGC ACG CGT GAG GGC CGC GAG GGC CTC 2108 Asp Val Arg Tyr Ser Thr Lys Gly Thr Arg slu Gly Arg Glu Gly Leu 530 535 540 TTC CCT ATC GGT GGT GTG CCG CTG GGT ATC GAG ATT GCC GAT GAG ATT 2156 Phe Pro He Gly Gly Val Pro Leu Gly He Glu He Ala Asp Glu He 545 550 555 560 TTT AAT AAT GGA CTT AGG CCC ACG CCG CCG GAG CTT CAG CCT ATG CCG 2204 Phe Asn Asn Gly Leu Arg Pro Thr Pro Pro Glu Leu Gln Pro Met Pro 565 570 575 CAG GAT ACC CCG GTG CAG AAG CCG GTT CAG GGC ATG TGG GAC GAG CAG 2252 Gln Asp Thr Pro Val Gln Lys Pro Val Gln Gly Met Trp Asp Glu Gln 580 585 590 GTG CCG TTG GTT AAG GAG GCG CCG TAGATGGAGA GGTTTTTCGGC AGAGTTTACC 23 Val Pro Leu Val Lys Glu Ala Pro 595 600 AGTGACGCTG ATGGGCGGTG GAAGGATGTC TGATTTGGCT GAATGTCTTA ATTTGTCAAA 23 ATTTGGGGTT TGGTTTAGGA TGCTTGCTTG ATACTCTGCG ATTAATACTC CTATTTTGAT 24 ATTACATAAA TAGAATGCTT TCGGTAGCTG GAATCTGCTG GTTCACTTAT CTTTGTGTCC 24 GCGT GCAT GCTATGAGTG GTTTGCATGT GAGGCTCGAA TTGATATCTG ACCAATTATT 25 GTTCAGTAAG GCTTGCTTAA ACCTTTTTGG TTTCGCAGGA GGGATGGAAA CTGATATATT 26 TGAC CAGTA GCTAGACACA TAGCAAATGA AATTAAAAAA AAAAAAACTC TATCCTTAAA 26 GAAAAATTAA ACAAACAAAA ATCAGGACAT ATACCATGCG TCTTTCCAGC TCCAAAACAC 27 CTACCACGTT TTATCTTCTG AAACTTTCAC AATGACAGCA CCCACACCCG GCCCCTTCGC 2786 CCACATGCAA GCGCCTCCGG GACCTCCTCA AGCGTC 2822 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 600 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína {iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 2: Met Gly Ser Val Thr Pro He Pro Leu Pro Thr He Asp Glu Pro Glu 1 5 10 15 Glu Tyr Asn Asn Asn Tyr He Leu Phe Trp Asn Asn Val Gly Leu Glu 20 25 30 Leu Asn Arg Leu Thr His Thr Val Gly Gly Pro Leu Thr Gly Pro Pro 35 40 45 Leu Ser Ala Arg Ala Leu Gly Met Leu His Leu Ala He His Asp Ala 50 55 60 Tyr Phe Ser He Cys Pro Pro Thr Glu Phe Thr Thr Phe Leu Ser Pro 65 70 75 80 Asp Ala Glu Asn Pro Ala Tyr Arg Leu Pro Ser Pro Asn Gly Ala Asp 85 90 95 Asp Ala Arg Gln Ala Val Ala Gly Ala Ala Leu Lys Met Leu Ser Ser 100 105 110 Leu Tyr Met Lys Pro Ala Asp Pro Asn Thr Gly Thr Asn He Ser Asp 115 120 125 Asn Ala Tyr Ala Gln Leu Ala Leu Val Leu Glu Arg Ala Val Val Lys 130 135 140 Val Pro Gly Gly Val Asp Arg Glu Ser Val Ser Phe Met Phe Gly Glu 145 150 155 160 Ala Val Ala Asp Val Phe Phe Ala Leu Leu Asn Asp Pro Arg Gly Ala 165 170 175 Ser Gln Glu Gly Tyr Gln Pro Thr Pro Gly Arg Tyr Lys Phe Asp Asp 180 185 190 Glu Pro Thr His Pro Val Val Leu Val Pro Val Asp Pro Asn Asn Pro 195 200 205 Asn Gly Pro Lys Met Pro Phe Arg Gln Tyr His Ala Pro Phe Tyr Gly 210 215 220 Met Tyr Thr Lys Arg Phe Ala Thr Gln Ser Glu His He Leu Ala Asp 225 230 235 240 Pro Pro Gly Leu Arg Ser Asn Ala Asp Glu Thr Ala Glu Tyr Asp Asp 245 250 255 Ser He Arg Val Ala He Ala Met Gly Gly Ala Gln Asp Leu Asn Ser 260 265 270 Thr Lys Arg Ser Pro Trp Gln Thr Ala Gln Gly Leu Tyr Trp Ala Tyr 275 280 285 Asp Gly Ser Asn Leu Val Gly Thr Pro Pro Arg Phe Tyr Asn Gln He 290 295 300 Val Arg Arg He Ala Val Thr Tyr Lys Lys Glu Asp Asp Leu Ala Asn 305 310 315 320 Ser Glu Val Asn Asn Ala Asp Phe Ala Arg Leu Phe Ala Leu Val Asn 325 330 335 Val Ala Cys Thr Asp Ala Gly He Phe Ser Trp Lys Glu Lys Trp Glu 340 345 350 Phe Glu Phe Trp Arg Pro Leu Ser Gly Val Arg Asp Asp Gly Arg Pro 355 360 365 Asp His Gly Asp Pro Phe Trp Leu Thr Leu Gly Ala Pro Ala Thr Asn 370 375 380 Thr Asn Asp He Pro Phe Lys Pro Pro Phe Pro Ala Tyr Pro Ser Gly 385 390 395 400 His Ala Thr Phe Gly Gly Ala Val Phe Gln Met Val Arg Arg Tyr Tyr 405 410 415 Asn Gly Arg Val Gly Thr Trp Lys Asp Asp Glu Pro Asp Asn He Ala 420 425 430 He Asp met Met He Ser Glu Glu Leu Asn Gly Val Asn Arg Asp Leu 435 440 445 Arg Gln Pro Tyr Asp Pro Thr Ala Pro He Glu Asp Gln Pro Gly He 450 455 460 Val Arg Thr Arg He Val Arg His Phe Asp Ser Ala Trp Glu Met Met 465 470 475 480 Phe Glu Asn Ala He Ser Arg He Phe Leu Gly Val His Trp Arg Phe 485 490 495 Asp Ala Ala Ala Ala Arg Asp He Leu He Pro Thr Asn Thr Lys Asp 500 505 510 Val Tyr Ala Val Asp Ser Asn Gly Ala Thr Val Phe Gln Asn Val Glu 515 520 525 Asp Val Arg Tyr Ser Thr Lys Gly Thr Arg Glu Gly Arg Glu Gly Leu 530 535 540 Phe Pro He Gly Gly Val Pro Leu Gly He Glu He Ala Asp Glu He 545 550 555 560 Phe Asn Asn Gly Leu Arg Pro Thr Pro Pro Glu Leu Gln Pro Met Pro 565 570 575 Gln Asp Thr Pro Val Gln Lys Pro Val Gln Gly Met Trp Asp Glu Gln 580 585 590 Val Pro Leu Val Lys Glu Ala Pro 595 600 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 43 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (Üi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 3: Xaa Phe Ala Thr Gln Ser Glu His He Leu Ala Asp Pro Pro Gly Leu 1 5 10 15 Arg Ser Asn Ala Asp Glu Thr Ala Glu Tyr Asp Asp Ser He Arg Val 25 30 Ala He Ala Met Gly Gly Ala Gln Asp Leu Asn 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 4 Phe Arg Gln Tyr His Ala Pro Phe Tyr Gly Met Thr Thr Lys 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. N0:5: Asp Val Tyr Ala Val Asp Ser Asn Gly Ala Thr Val Phe Gln Asn Val 1 5 10 15 Glu Asp Val Arg Tyr Ser Thr Lys 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 40 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (Üi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 6: Arg Ser Pro Trp Gln Thr Ala Gln Gly Leu Tyr Trp Ala Tyr Asp Gly 1 5 10 15 Ser Asn Leu Val Gly Thr Pro Pro Arg Phe Tyr Asn Gln He Val Arg 20 25 30 Arg He Ala Val Thr Tyr Lys Lys 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO:7¡ Phe Asp Asp Glu Pro Thr His Pro Val Val Leu Val Pro Val Asp Pro 1 5 10 15 Asn Asn Asn Asn Gly Gly Lys 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 8: Pro Ala Asp Pro Asn Thr Gly Thr Asn He Ser Asp Asn Ala Tyr Ala 1 5 10 15 Gln Leu Ala Leu Val Leu Glu Arg Ala Val Val Lys 20 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 9: Met Leu Ser Ser Leu Tyr Met Lys 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. DE IDENT. NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 aminoácidos. (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal ' (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO-.10: Met Pro Phe Arg Gln Tyr His Ala Pro Phe Tyr Gly Met Thr Thr Lys 1 5 10 15 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejo método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (36)

REIVINDICACIONES

1. Una haloperoxidasa aislada que se obtiene de una cepa de Curvularia verruculosa .

2 . La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se obtiene de Curvularia verruculosa CBS 147.63 o una cepa mutante de la misma.

3. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque se obtiene de Curvularia verruculosa CBS 444.70 o una cepa mutante de la misma.

4. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque retiene por lo menos 50% de actividad después de una hora de incubación a pH 7.0 y 60 °C en presencia de H202 0.1%.

5. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque retiene por lo menos 75% de actividad después de una hora de incubación a pH 7.0 y 60 °C en presencia de H202 0.1%.

6. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque requiere por lo menos 50% de actividad a 30 °C sobre un intervalo de pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 11.

7. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque requiere por lo menos 80% de actividad a 30°C sobre un intervalo de pH entre aproximadamente 4 y aproximadamente 11.

8. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene un óptimo de temperatura en el intervalo de 50-70°C.

9. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene un óptimo de temperatura en el intervalo de 55-65"C.

10. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque tiene un óptimo de temperatura de aproximadamente 60°C a pH 5.5.

11. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene un pH óptimo en el intervalo desde aproximadamente 5.25 hasta aproximadamente 6.25.

12. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque tiene un pH óptimo de aproximadamente 5.75 a 30°C.

13. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque prefiere Br" sobre Cl* como un sustrato.

14. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene la secuencia peptídica parcial que se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 3.

15. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene la secuencia peptídica parcial que se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 4.

16. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene la secuencia peptídica parcial que se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 5.

17. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque contiene la secuencia peptídica parcial que se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 6.

18. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene la secuencia peptídica parcial que se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 7.

19. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene la secuencia peptídica parcial que se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 8.

20. La haloperoxidasa de Conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene la secuencia peptídica parcial que se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 9.

21. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque contiene la secuencia peptídica parcial que se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 10.

22. Una haloperoxidasa aislada, caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácidos la cual es por lo menos 93% homologa con la secuencia de aminoácidos que se establece en la SEC. DE IDENT. NO.: 2.

23. La haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque tiene una secuencia de aminoácidos que se establece en la SEC. DE IDENT. NO. : 2.

24. Una haloperoxidasa aislada, caracterizada porque es codificada por la región codificante de la secuencia de ácido nucleico contenida en el plásmido pHAP4A.l de E. coli DH10B, NRRL B-21519.

25. Un fragmento de ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico la cual codifica para una haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1.

26. Un fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico codifica para una haloperoxidasa obtenida de Curvularia verruculosa CBS 147.63.

27. Un fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico codifica para una haloperoxidasa obtenida de Curvularia verruculosa CBS 444.70.

28. Un fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico se establece en la SEC. DE IDENT. NO.: 1.

29. Un constructo de ácido nucleico, caracterizado porque comprende un fragmento de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 25, unido de manera operable a regiones reguladoras capaces de dirigir la expresión de la haloperoxidasa en un huésped de expresión adecuado.

30. Un vector recombinante, caracterizado porque comprende un constructo de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 29.

31. Una célula huésped recombinante, caracterizada porque comprende el constructo de ácido nucleico de conformidad con la reivindicacidn 29.

32. Un método para producir la haloperoxidasa de conformidad con la reivindicacidn 1, caracterizado porque comprende : (a) fermentar una cepa de Curvularia verruculosa para producir un sobrenadante que tiene operoxidasa; y (b) recuperar la haloperoxidasa.

33. Un método para producir la haloperoxidasa de conformidad con la reivindicacidn 1, caracterizado porque comprende: (a) fermentar una célula huésped que comprende un constructo de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica para la haloperoxidasa bajo condiciones que conducen a la expresión de la haloperoxidasa; y (b) recuperar la haloperoxidasa.

34. Un método para oxidar un ion haluro, caracterizado porque comprende hacer reaccionar el ion haluro y una fuente de peróxido de hidrógeno en presencia de una haloperoxidasa de conformidad con la reivindicacidn 1.

35. Un método para halogenar un compuesto, caracterizado porque comprende hacer reaccionar el compuesto, un ion haluro y una fuente de peróxido de hidrógeno en presencia de una haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1.

36. Un método para destruir células microbianas o para inhibir el crecimiento de células microbianas, el método está caracterizado porque comprende poner en contacto las células con una haloperoxidasa de conformidad con la reivindicación 1, una fuente de peróxido de hidrógeno y una fuente de tiocianato en una solución acuosa.