MXPA98000191A - Peptidos novedosos derivados de proteina humana 60 producida por choque termico, para tratamiento de diabetes, composiciones, metodos y equipos - Google Patents

Abstract

Péptidos novedosos que son epitopes de la proteína humana de choque térmico de 60 kDa (hsp60) se pueden usar para el diagnóstico y tratamiento de diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM);también se describen composiciones farmacéuticas que contienen dichos péptidos y equipos para usarse en el diagnóstico de IDDM.

Description

PEPTIDOS NOVEDOSOS DERIVADOS DE PROTEINA HUMANA 60 PRODUCIDA POR CHOQUE TÉRMICO. PARA TRATAMIENTO DE DIABETES: COMPOSICIONES, MÉTODOS Y EQUIPOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a péptidos novedosos que son epítopes de la proteína de choque térmico de 60 KDa (hsp 60) humana, y a composiciones farmacéuticas que los comprenden, para el diagnóstico y el tratamiento de la diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diabetes de tipo I, o IDDM, es una enfermedad autoinmunológica provocada por células T que atacan y destruyen las células beta, productoras de insulina, ubicadas en las isletas del páncreas (Castaño y Eisenbarth, 1990). El proceso autoinmunológico que culmina en IDDM comienza y avanza sin síntomas. La enfermedad emerge clínicamente sólo cuando la pérdida acumulativa de células beta sobrepasa la capacidad de las células beta residuales para suministrar insulina. En realidad se cree que ocurre el colapso de la homeostasis de glucosa y la IDDM clínica sólo después que el 80 a 90 por ciento de las células beta han sido inactivadas por el sistema inmunológico. Así pues, los pacientes a quienes se identifica como padeciendo IDDM, probablemente están en una etapa avanzada de destrucción autoinmunológica de sus células beta. Además, el diagnóstico de diabetes incipiente, preclínica, mediante la detección de marcadores in unológicos de la autoinmunidad de células beta, se puede efectuar únicamente después del inicio del proceso autoinmunológico. Por consiguiente, el objetivo terapéutico es encontrar una manera segura, específica y efectiva de hacer aparecer un proceso autoinmunológico que ya esté bien establecido de manera oculta. Los inventores de la presente han examinado esta cuestión antes de estudiar el desarrollo espontáneo de la diabetes en ratones de la cepa NOD, que se considera que es un modelo fiel de IDDM humana (Castaño y Eisenbarth, 1990). Los ratones NOD desarrollan insulitis aproximadamente a las cuatro semanas de edad, que comienza como un infiltrado peri-islético moderado y avanza a inflamación intra-isleta severa. La hiperglicemia, que hace patente la insuficiencia de insulina, comienza en las hembras de la colonia aproximadamente a las 14-17 semanas de edad. A las 35-40 semanas de edad, casi todas las hembras de los ratones NOD habían desarrollado diabetes severa y la mayoría mueren en ausencia de un tratamiento con insulina. Los ratones NOD machos tienen menor incidencia de enfermedad, por razones que no están claras. Se ha demostrado que la diabetes de los ratones NOD es provocada por las células T autoin unológicas (Bendelac y coautores, 1987). La reactividad de las células T y los autoanticuerpos para diversos antígenos han sido detectados en pacientes de IDDM humana, así como en ratones NOD (Elias, 1994) y no está claro si la inmunidad a cualquier antígeno de destino individual de los posibles, es la causa primaria de la enfermedad. Más allá de la cuestión de cuál es la causa, es cuestión de terapia. Se ha demostrado que el inicio del proceso autoinmunológico en los ratones NOD se puede prevenir sometiendo los ratones, antes de que se inicie la diabetes, a diversas manipulaciones, tales como una dieta restringida, infecciones virales o estímulo no específico del sistema inmunológico (Bo man y coautores, 1994). También se puede prevenir la diabetes en NOD mediante la inducción de tolerancia inmunológica en ratones prediabéticos, a la desea rboxilasa de ácido glutámico antigénica (Kaufman y coautores, 1993; Tish y coautores, 1993). La diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) que se desarrolla espontáneamente en ratones hembras NOD ha estado asociada con reactividad inmunológica a una variedad autoantígenos (Bach, 1994). Es notable entre esos antígenos el péptido p277 de la secuencia de la molécula de la proteína de choque térmico de 60 kDa (hsp60) de mamífero. Esto corresponde a los residuos 437-460 de la molécula hsp60 humana (Elias y coautores, 1991, solicitud de patente israelí No. 94241, publicación de patente del TCP W090/10449. El péptido p277 humano tiene la siguiente secuencia: Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys Ile-Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp (aminoácidos 437-460 de SEQ ID N0:1). Los ratones NOD prediabéticos manifiestan respuestas espontáneas de la célula T diabetogénica a hsp60 y a las variantes humanas (2) o de ratón, del péptido p277 (3). Los péptidos de ratón y humano difieren en un aminoácido y son inmunológicamente reactivos (3) entre sí. Algunas cepas de ratón, no susceptibles a la diabetes, tales como C57BL/6, desarrollan hiperglicemia transitoria e insulitis transitoria cuando son inmunizados a p277 conjugado covalentemente con una molécula portadora inmunogénica ajena (4). Y los ratones de la cepa C57BL/KsJ desarrollan respuestas de célula T espontáneas a hsp60 y a p277 después de tratamiento con una dosis muy baja de la toxina estreptozotocina (STZ) de célula beta, que induce la diabetes autoinmunológica (5). Además de estar involucrado en la expresión de la enfermedad, el péptido p277 parecer ser funcional en la cicatrización del proceso autoinmunológico: la administración subcutánea de p277 en adyuvante incompleto de Freund (IFA, aceite mineral) conduce a la detención del avance de la enfermedad en ratones NOD jóvenes (2) o en ratones NOD de 12-17 semanas de edad, con insulitis avanzada (6, 7). Tanto la variante humana (6, 7) como la de ratón (3) de p277 fueron efectivas. Los ratones NOD transgénicos para el gene hsp60 de ratón en un promotor MHC de clase II, mostraron una regulación descendente de su respuesta proliferativa de célula T espontánea a p277 y una proporción importante de los ratones no tuvieron desarrollo de diabetes (8). Adicionalmente, la administración de p277 a ratones C57BL/KsJ abortó el desarrollo de diabetes autoinmunológica en ratones que había recibido tempranamente una dosis muy baja de STZ; el tratamiento de esos ratones con un péptido de la molécula GAD65 no fue efectivo (9). Las variantes del péptido p277 en las que uno o ambos residuos cisteína en las posiciones 6 y 11 fueron reemplazados por residuos valina, designados p277(Val6), p277(Valii) y p277(Val6-Val11 ) , respectivamente, fueron descritos en la solicitud de patente israelí correspondiente No. 112094, y demostraron ser tan activos como p277 en el tratamiento de la diabetes. Es un objetivo de la presente invención proveer péptidos adicionales de hsp60 humana; siendo útiles dichos péptidos para el diagnóstico y el tratamiento de IDDM.

BREVE ESCRIPCIttN DE LA INVENCIÓN En un estudio de fragmentos y péptidos de molécula shp60 humana, se encontró inesperadamente que los pacientes con IDDM y los ratones NOD con IDDM respondían a otros epítopes de célula T de hsp60, que pueden ser usados para el diagnóstico y la terapia de IDDM. Esos epítopes, por sí mismos o conjuntamente con p277 o con una variante de p277, seleccionada de p277(Val6), p277(val11) y p277(Val6 -Val*1 ) pueden mejorar la eficacia del tratamiento. Estos nuevos péptidos están identificados en el cuadro 1, CUADRO 1 PEPTIDOS SINTÉTICOS DE Hsp60 Y SU SECUENCIA Residuos No. de Secuencia de aminoácidos Péptidos SEQ ID NO: 1. — (código de una sola letra) P3 31-50 KFGADARALMLQGVDLLADA plO 136-155 NPVEIRRGVMLAVDAV?AEL p PH11 1 15511--117700 VIAELKKQSKPVTTPEEIAQ P12 166-185 EEIAQVATISANGDKEIGNI pi« 195-214 RKGVITVKDGKTLNDELEII p18 255-274 QSIVPALEIANAHRKPLVIIA p20 286-305 LVLNRLKVGLQVVAVKAPGF pp22*« 3 34466--336655 GEVIVTKDDAMLLKGKGDKA P29 421-440 VTDALNATRAAVEEGIVLGG p30 436-455 IVLGGGCALLRCIPALDSLT p32 466-485 EIIKRTLKIPAMTIAKNAGV p35 511-530 VNMVEKGIIDPTKWRTALL pp3399 3 34433--336666 GKVGEVIVTKDDAM Se demostró que otros péptidos de hsp60, incluyendo los designados p278 (que corresponden a las posiciones 458-474 de la secuencia de hsp60 humana), pl9 (que corresponde a las posiciones 271-290 de la secuencia de hsp60 humana) y p21 (que corresponde a las posiciones 301-320 de la secuencia de hsp60 humana) no eran tan efectivos. Es de notar que el extremo amino de p278 se traslapa con el péptido p277 efectivo en tres residuos (NED) y el extremo carboxi de p278 se traslapa con el péptido p32 efectivo en 9 residuos (EIIKRTLKI). Así pues, los restantes 11 residuos de p32 son críticos (PAMTIAKNAGV) . De esa manera, la presente invención se refiere a los péptidos identificados en el cuadro 1, y a sus sales y derivados funcionales. Es otro objetivo de la presente invención proveer métodos y equipos para el diagnóstico precoz de IDDM, utilizando los péptidos de la invención. En el curso del desarrollo de IDDM, los animales expresan moléculas de hsp60 o moléculas que son mutuamente reactivas con ellas, que encuentran camino hacia la sangre y la orina de los animales. También expresan anticuerpos y células T específicamente dirigidos a tales moléculas. De ese modo, la presencia de hsp60 (o de moléculas que son mutuamente reactivas con ella) o anticuerpos o células T específicas para ellos, en la sangre o en la orina, sirve como un análisis para la detección del proceso de IDDM, antes que se complete la destrucción de las células beta y el individuo esté sentenciado a la diabetes de por vida.

La presencia o incipiencia de IDDM en un paciente puede ser diagnosticada al analizar la sangre o la orina del paciente en busca de la presencia de anticuerpos o de células T que son inmunológicamente reactivas con hsp60 humana, usando como antígeno un péptido pl2 o p32 de la invención. Consecuentemente, la presente invención provee un método para diagnosticar la presencia o la incipiencia de IDDM en un paciente, que comprende analizar a dicho paciente en cuanto a la presencia de anticuerpos anti-hsp60 o de una célula T que inmuno- reacciona con hsp60, utilizando como antígeno un péptido de la presente invención, de manera que un resultado que indique la presencia positiva de anticuerpos anti-hsp60 o de una célula T que inmuno-reaccione con hsp60, indique una alta probabilidad de la presencia o la incipiencia de IDDM. En el método para diagnosticar IDDM, se puede analizar el paciente en cuanto a la presencia de anticuerpos anti-hsp60, en donde el método de análisis puede comprender un radioinmunoanálisis o una prueba ELISA. También se puede analizar el paciente en cuanto a la presencia de una célula T que inmuno-reacciona con hsp60. En una modalidad de este aspecto, el método de prueba comprende una prueba de proliferación de célula T, que comprende los pasos de: (i) preparar una fracción de célula mononuclear que contiene células T procedentes de una muestra de sangre obtenida del paciente; (ii) añadir a la fracción de célula mononuclear un antígeno seleccionado del péptido de la invención; (iii) incubar la fracción de célula en presencia del antígeno durante un periodo de tiempo adecuado y bajo condiciones de cultivo adecuadas; (iv) añadir un nucleótido marcado al cultivo de células incubadas de (iii), en un momento adecuado antes de finalizar el periodo de incubación, para proveer la incorporación del nucleótido marcado en el ADN de las células T proliferantes; y (v) determinar la cantidad de células T proliferantes, analizando la cantidad de nucleótido marcado, incorporado en las células T. En el paso (iv) anterior, el nucleótido marcado preferiblemente es 3H-timidina. La determinación de la cantidad de células T proliferantes se efectúa calculando el índice de estímulo de las células T mediante métodos comunes y corrientes. En otra modalidad de este aspecto de la invención, el método de prueba comprende una prueba de respuesta a la citoquina de célula T, en donde los pasos (i) a (iii) son como en la prueba de proliferación de célula T anterior, y en un cuarto paso (iv), se detecta la presencia de citoquina, tal como IFN-gamma, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFalfa o TGFbeta, secretada por los linfocitos que responden, presentes en el medio; por medio de métodos comunes y corrientes, con equipos obtenibles en el comercio.

En otro aspecto, la invención provee un método in vivo en el cual se inyecta subcutáneamente un antígeno seleccionado de los péptidos de esta invención, a un paciente; y se observa la ocurrencia de una reacción cutánea detectable (hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). La presente invención se refiere también a medios para llevar a cabo dichos análisis, así como a equipos para efectuar esos análisis. Se puede preparar los equipos para efectuar cualquiera de los diversos análisis usados para realizar la presente invención. Cada estuche incluye todos los materiales necesarios para llevar a cabo un solo análisis, o un número fijo de análisis. Por ejemplo, dicho equipo para determinar la presencia de anticuerpos anti-hsp60 puede contener un péptido inmovilizado en fase sólida, de la invención, y un anticuerpo marcado, capaz de reconocer la región no variable del anticuefo anti-hsp60 que se va a detectar, tal como Fab anti-humano marcado. El estuche también puede contener instrucciones para usar el estuche y recipientes para contener los materiales del estuche. Se puede usar cualquier marbete o etiqueta convencional, tal como un radioisótopo, una enzima, un cro óforo o un fluoróforo. Un radioisótopo típico es el yodo 125 o el azufre 35. Las enzimas típicas para ese propósito incluyen la peroxidasa de rábano picante, la galactosidasa de rábano picante y la fosfatasa alcalina. Un equipo para diagnosticar la presencia de IDDM analizando la p resencia de anticuerpos anti-hsp60 , comp rende : (i) un antígeno seleccionado de los péptidos de la presente invención; y (ii) un anticuerpo marcado, capaz de reconocer la región no variable de los anticuerpos anti-hsp60 que van a ser detectados. Un equipo para diagnosticar la presencia de IDDM analizando la presencia de una célula T que inmuno-reacciona con hsp60, comprenderá: (i) un antígeno seleccionado de los péptidos de la presente invención; (ii) un medio adecuado para el cultivo de linfocitos (células T); y (iii) un nucleótido marcado para la prueba de proliferación de célula T o bien una citoquina, por ejemplo, equipo de análisis de interferón-gamma, para la prueba de citoquina. Para la prueba in vivo, el equipo comprenderá únicamente un péptido de la invención, en forma adecuada para inyección. La presente invención se refiere adicionalmente a medios para prevenir o tratar la IDDM. La vacuna con un péptido antigénico de la presente invención puede proveer una regulación descendente específica de la autoinmunidad al antígeno y crea efectivamente una resistencia al proceso autoinmunológico de la IDDM. Lo mismo se aplica con respecto a la vacuna con células T específicas para tales antígenos, en forma atenuada o avirulenta, o después de haber sido tratadas para mejorar su antigenicidad, o bien fragmentos o fracciones activas de los mismos. Si se demuestra que el paciente ya está en las etapas incipientes, preclínicas, de IDDM, la inyección con dicho antígeno o célula T (o fracción) puede crear una regulación descendente de la autoinmunidad para ese antígeno y, de tal manera, detener el proceso autoinmunológico antes de que provoque daños importantes y permanentes. También se puede usar el péptido como agente terapéutico para detener el proceso autoinmunológico, aun después de que esté bastante avanzado, tal como se mostró recientemente en el laboratorio de los inventores de la presente, con respecto al tratamiento de ratones NOD con el péptido p277 (Elias y Cohén, 1994). Consecuentemente, la presente invención provee una preparación para prevenir o tratar la diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), que comprende: (a) células T que han desarrollado especificidad para una proteína o un péptido que sea inmunológicamente reactivo con un péptido de la invención; células que han sido activadas incubándolas en presencia del péptido; (b) dichas células T que han sido irradiadas o atenuadas de otra manera; (c) dichas células T, que han sido sometidas a un tratamiento a presión, por medio de presión hidrostática, tratamiento con un agente entrelazador químico y/o tratamiento con un agente entrelazador citoesqueletal; (d) fragmentos de, o proteínas de superficie desprendidas de (a), (b) o (c); o (e) un péptido que consiste esencialmente de la región variable del receptor de (a), específico para esa proteína; o una sal, un derivado funcional, un precursor o una fracción activa del mismo. En una modalidad preferida de la invención, la preparación comprende células T humanas que han desarrollado especificidad mediante contacto in vitro con el péptido de la invención. La presente invención provee también una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento de IDDM, que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y, como principio activo, una cantidad efectiva de un péptido de la invención, una sal o un derivado funcional del mismo. La invención se refiere adicionalmente a un método para prevenir o tratar IDDM, que comprende administrar a un paciente que necesite de ello, una composición farmacéutica que comprende un péptido de la invención, una sal o un derivado funcional del mismo, o una preparación que comprende células T que han desarrollado especificidad hacia el péptido de la invención.

BREVE DESCRIPCIaN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra las posiciones de los péptidos a los que se hace referencia aquí, en la secuencia completa de la molécula hsp60 humana. La figura 2 muestra la proliferación de células T de ratón NOD para los péptidos pl2, p32, p277(Val« - ain ) y p278 de hsp60 humana. La figura 3 es una gráfica que muestra las respuestas proliferativas de célula T de ratones NOD a los péptidos. Se sumergió grupos de tres ratones NOD con los péptidos pl2 de ratón, p277 de ratón, GAD-p35 y MT-p278 en IFA, cada uno a una dosis de 25 µg en IFA. Se retiró los nodos linfáticos de drene 10 días después y se los analizó para respuestas proliferativas al péptido correspondiente, a concentraciones de 5, 10, 20 y 50 µg/ml. El estímulo a la concentración óptima de 20 µg/ml está mostrado. Se obtuvo las siguientes escalas de cpm en controles de medio: pl2 de ratón, 881, p277 de ratón, 1243, MT-p278, 698 y GAD-p35 1430. El péptido p38 de ratón es un péptido derivado de hsp60 de ratón (556-573), que no tiene homología de secuencia con los péptidos probados y que sirve como control negativo de especificidad. Estos resultados son representativos de los tres experimentos efectuados. Cada análisis fue efectuado por triplicado, para los cuales se indica mediante las barras los valores de desviación de norma (DN). No hubo reactividad mutua entre los péptidos (no mostrados) . La figura 4 es una gráfica que muestra el efecto de la administración del péptido sobre la diabetes. Se trató grupos de 10-20 ratones NOD a las 10 semanas de edad, con 100 µg de pl2 de ratón, p277, p35-GAD o MT-p278 en IFA, o con IFA solamente. Se sangró mensualmente los ratones y se les hizo seguimiento para el inicio de la hiperglicemia. En comparación con el grupo de control, tratado con IFA, los ratones tratados con P12 y con P277 fueron protegidos significativamente, P < 0.05. La figura 5 muestra los isotipos de anticuerpo IgGl, IgG2a e IgG2b, en respuesta al tratamiento de péptidos. Se trató los ratones como se describe en la leyenda de la figura 4. Se analizó las muestras individuales para anticuefos a P12 A de ratón, p277 B, GAD-p35 C y MT-p278 D, de los isotipos IgGl, IgG2a e IgG2b. Se obtuvo efectos similares en dos experimentos. Los resultados están presentados como la absorbencia a 405 nm (OD) de 10 ratones individuales en cada grupo. El nivel de significancia de la prevalencia de los anticuerpos IgGl e IgG2b en los grupos A y B, en comparación con C y D, es P < 0.001. Las diferencias entre los niveles de los anticuefos IgGl e IgG2b, en comparación con los anticuerpos IgG2a, en los grupos A y B, fueron significativas (P < 0.001). No hubo reactividad mutua entre los anticuefos (no mostrada) . La figura 6 muestra la correlación negativa entre anticuefos y glucosa en la sangre. Se trató un grupo de ratones hembras NOD con pl2 (10 ratones) o con IFA únicamente (9 ratones) tal como se describe en la leyenda de la figura 4. Se gráfica la cantidad de anticuefo específico anti-pl2 (unidades O.D. de ELISA en sueros, diluido 1:50, medido a los 7 meses de edad) junto con la concentración de glucosa en la sangre, medida a los 7 meses de edad. El grado de correlación entre los niveles elevados de anticuefos y glucosa en la sangre es P < 0.002. La figura 7 es una gráfica que muestra las respuestas de proliferación de célula T (S.I.) de un donador paciente de IDDM a los antígenos de recuperación, a la proteína hsp60 y a los péptidos sintéticos hsp60. La figura 8 es una gráfica que muestra las respuestas de proliferación de célula T (S.I. de un donador sano a los antígenos de recuperación, a hsp60 y a los péptidos sintéticos hsp60. La figura 9 es una gráfica que muestra las respuestas de proliferación de célula T (S. I . ) de otro donador paciente de IDDM, al antígeno de recuperación, a hsp60 y a péptidos sintéticos de hsp60. Las figuras 10A y 10B son gráficas que muestran las respuestas de proliferación de célula T (S. I.) de dos donadores pacientes de IDDM a los péptidos sintéticos de hsp60.

DESCRIPCIocN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Siempre que se mencione en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones un "péptido de la invención" o cualquiera de las designaciones individuales, tales como "péptido pl2" o "péptido p32", también están contemplados sus sales y sus derivados funcionales, siempre y cuando se mantenga la actividad biológica del péptido con respecto a la diabetes. Las "sales" de los péptidos de la invención contempladas por la presente invención, son las sales orgánicas e inorgánicas fisiológicamente aceptables. Los "derivados funcionales" de los péptidos de la invención, tal como se usa en la presente, cubren los derivados que pueden ser preparados a partir de los grupos funcionales que ocurren como cadenas laterales en los residuos o los grupos terminales N o C, por medios conocidos en la técnica, y están incluidos en la invención siempre y cuando sigan siendo farmacéuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la actividad del péptido ni impartan propiedades tóxicas a las composiciones que los contienen ni afecten adversamente sus propiedades antigénicas. Estos derivados, por ejemplo, pueden incluir los esteres alifáticos de los grupos caFoxilo; las amidas de los grupos caFoxilo producidas mediante reacción con amoniaco o con aminas primarias o secundarias; los derivados N-acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoácido, formados por reacción con porciones acilo (por ejemplo, grupos alcanoílo o aroílo caFocíclico) o derivados O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, los de los residuos serilo o treonilo), formados por reacción con porciones acilo. Se puede usar los péptidos de la invención como inmunógenos en composiciones farmacéuticas, particularmente en vacunas para aliviar y tratar IDDM, así como a la manera de un antígeno en las composiciones de diagnóstico para diagnosticar IDDM. Estas composiciones farmacéuticas y de diagnóstico, que pueden ser preparadas de una manera conocida en la técnica, también forman parte de la presente invención. La composición terapéutica de conformidad con la presente invención puede ser administrada oral o parenteralmente, por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intranasal o intra-rectal . Se ilustrará ahora la invención de una manera no limitativa por medio de los siguientes ejemplos y de las figuras anexas.

EJEMPLOS MATERIALES Y MÉTODOS (i ) Los ratones Los ratones hembras de cruza interna, de la cepa NOD/lt, fueron suministrados por el Centro de Cría de Animales del Instituto Weizmann de Ciencias, Rehovot, Israel, o por el Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, E.U.A. Estos ratones desarrollan espontáneamente diabetes autoinmunológica a las 14 a 17 semanas de edad, que imita la IDDM en humanos. (ii) Los antigenos Se sintetizó los péptidos en el Departamento de Química Orgánica del Instituto Weizmann de Ciencias, utilizando un sintetizador de péptidos múltiples, automático (Abimed, modelo AMS 422; Langenfeld, Alemania), siguiendo los protocolos de la compañía, para la síntesis de N-alfa-fluorenil etoxicaFonilo (Fmoc). Se purificó los productos crudos mediante HPLC de fase inversa en una columna C8 semipreparatoria (LichrosoF RP-8, 7 mm, 250 x 10 mm, Merck, Darmstadt, Alemania). Se obtuvo la elución de los péptidos mediante gradientes lineales establecidos entre 0.1% de ácido trifluoroacético en agua y 0.1% de ácido trifluoroacético en 75% de acetonitrilo en agua (en volumen/volumen). Se determinó la pureza de los productos péptidos individuales mediante HPLC de fase inversa, analítica, y mediante análisis de aminoácidos. El péptido MT-p278 procede de la secuencia de hsp60 microbacteriana (431-447). El péptido p277 tiene reemplazadas las posiciones 6 y 11 con valina (V) en lugar de la cisteína (C) de la secuencia natural. El reemplazo de los dos residuos C por V incrementa en gran medida la estabilidad del péptido, sin afectar su actividad inmunológica: el péptido con reemplazo de V es mutuamente reactivo por completo con el péptido natural por medio de análisis de la célula T y del anticuefo. Siempre que no se especifique, se quiere hacer referencia a la secuencia humana. Los péptidos pl2 de ratón y p38 de ratón son derivados de la molécula hsp60 de ratón y corresponden a sus secuencias 168-188, 437-460 y 556-573, respectivamente. El péptido GAD-p35 procede de la molécula GAD65 (524-543). Las secuencias de aminoácidos de todos los péptidos usados en la presente están mostradas en el cuadro 2. Secuencia de Secuencia de aminoácidos Pépticdos SEQ ID NO: .-- (código de una sola letra) P3 1 (31-50) KFGADARALMLQGVDLLADA plO 1 (136-155) NPVEIRRGVMLAVDAVIAEL pll 1 (151-170) VIAELKKQSKPVTTPEEIAQ pl2 1 (166-185) EEIAQVATISANGDKEIGNI pl4 1 (195-214) RKGVITVKDGKTLNDELEII pl8 1 (255-274) QSIVPALEIANAHRKPLVIIA p20 1 (286-305) LVLNRLKVGLQ VAVKAPGF p24 1 (346-365) GEVIVTKDDAMLLKGKGDKA p29 1 (421-440) VTDALNATRAAVEEGIVLGG p30 1 (436-455) IVLGGGCALLRCIPALDSLT p32 1 (466-485) EIIKRTLKIPAMTIAKNAGV p35 1 (511-530) VNMVEKGIIDPTKWRTALL p39 1 (343-366) GKVGEVIVTKDDAM pl9 1 (271-290) LVIIAEDVDGEALSTLVLNR p21 1 (301-320) KAPGFGDNRKNQLKDMAIAT p278 1 (458-474) NEDQKIGIEIIKRTLKI p277(Val) 2 VLGGGVALLRVIPALDSLTPANED mouse pl2 3 EEIAQVATISANGDKDIGNI MT-p278 4 EGDEATGANIVKVALEA GAD-p35 5 SRLSKVAPVIKARMMEYGTT mouse p38 6 PGMGAMGGMGGGMGGGMF (iii) Proliferación de célula T a péptidos Ratones: Se inmunizó ratones NOD de nueve semanas de edad o ratones de otras cepas, en las plantas de las patas delanteras con 0.1 ml de una emulsión que contenía 25 µg de péptido en adyuvante completo de Freund (CFA; Difco, Detroit, MI, E. U. A.), mezclado con un volumen igual de salina regulada con fosfato (PBS). Se retiró los nodos linfáticos poplíteos, que drenaron, 10 después y se probó las suspensiones de linfocitos, en cultivos por triplicado, en cuanto a la proliferación en presencia de diversos péptidos (5 µg/ml) usando la incoforación de C3H]-timidina, tal como fue descrito (Elias y coautores, 1991). Los resultados están mostrados como el índice de estímulo (IE): la relación del cpm medio en presencia del péptido de prueba, con respecto al cpm medio de los cultivos de control, sin el péptido. Los errores de norma fueron siempre inferiores al 10% de las medias. (iv) Tratamiento y seguimiento: Se e ulsificó 100 mg de péptidos en PBS con un volumen igual de IFA y se los inyectó subcutáneamente en hembras NOD de 10 semanas de edad, como se describió (Elias y Cohén, 1995). Los ratones de control recibieron un volumen igual de PBS emulsificado en IFA. Se vigiló mensualmente los ratones en cuanto a la glucosa en sangre, sin ayuno, a las 10 a.m., usando el sensor de glucosa en la sangre SMediSense Inc., Waltham, MA) . Se consideró que los ratones con glucosa en la sangre a más de 11.1 mmoles/L eran diabéticos; esta concentración de glucosa fue mayor que tres desviaciones de norma por encima de la concentración media de glucosa en la sangre, medida en ratones no diabéticos (Elias y Cohén, 1995). Se efectuó el examen histológico de las isletas del páncreas en secciones teñidas con he atoxilina y eosina. Se marcó independientemente las secciones por dos observadores, quienes no tenían noticia de la identidad de los grupos. Se usó la prueba chi cuadrada para determinar las diferencias estadísticas entre los diversos tratamientos. (v) Anticuefos en suero Se sangró mensualmente los ratones para detectar expuestas al anticuefo. Se efectuó análisis ELISA tal como se describe (Elias y coautores, 1991). Brevemente, se revistió placas MaxisoF de fondo plano (Nunc, Roskilde, Dinamarca), para la detección de anticuefos anti-péptido, con 100 ml/concavidad de péptido en PBS, a una concentración de 10 mg/ml durante 2 horas, a la temperatura ambiente, y luego se incubó durante la noche a 4°C. Después de incubar con el péptido se lavó las placas y se las bloqueó durante dos horas a 37°C con 7% de BSA (Sigma) en PBS. Se diluyó los sueros 1:50, luego se añadió durante dos horas a 37°C, y luego se incubó durante dos horas con 100 ml por concavidad de IgG anti-ratón de chivo (específico para Fc de cadena gamma), conjugada con fosfatasa alcalina (Jackson, Philadelphia, PA, E.U.A.) Después de lavar, se incubó las placas con el substrato, dietanolamina (Sigma) y se leyó usando un rector ELISA a 405 nm.

EJEMPLO 1 FORMACIttN DE MAPA DE EPITOPES hSP60 EN RATONES NOD Se probó la inmunogenicidad de los péptidos pl2, p32, p277(Val* -Valí1) de hsp60 y p278 en ratones NOD, inmunizando los ratones con los péptidos emulsificados en CFA, en las plantas de las patas delanteras, y analizando las respuestas de proliferación de las células de nodo linfático que escurren, después de 10 días, tal como se describió en la sección iii(a) anterior. Tal como se muestra en la figura 2, los péptidos p277(Val6-Val11 ) , pl2 y p32 fueron fuertemente inmunogénicos, mientras que p278 no fue inmunogénico.

EJEMPLO 2 TRATAMIENTO DE RATONES NOD CON p277 (Val -Val** ) . Pl20 P32 Para probar si los péptidos pl2 y p32 pueden bloquear el avance de la diabetes como p277(Val6 -Val11 ) , se administró subcutáneamente los péptidos p277(Val6-Val11 ) , pl2 o p32 (100 µg en 0.1 cc de emulsión de IFA) a grupos de ratones hembras NOD/Lt de 10-12 semanas de edad, procedentes del Jackson Laboratory, Bar-Ha rbor, ME, E.U.A. Se probó la diabetes, determinada como niveles persistentes de glucosa en la sangre de más de 11.1 mmoles/l, a las 25 semanas de edad. Los ratones de control no fueron tratados o lo fueron con p278.

Como se muestra en el cuadro 1, p277(Val6 -Val11 ) , pl2 y p32 fueron efectivos en el tratamiento de la diabetes, siendo la incidencia de diabetes en ratones sin tratar o en ratones tratados con p278, de 90%; mientras que los ratones tratados con p277(Val6-Val1:l ) , pl2 y p32 muestran una incidencia de 10%, 20% y 30%, respectivamente. Por otra parte, el péptido de control p278 no tuvo efecto terapéutico.

CUADRO 3 EFECTO TERAPÉUTICO DE LOS PEPTIDOS DE hsp60 DiabeMortanNo. de Péptido tes (%) dad (%) receptores ninguno 90 50 100 p278 90 45 100 p277(Val6--Val11) 10* 5* 100 pl2 20* 10* 10 p32 50* 25* 20 * P < 0.05 Es posible que una combinación de dos o tres péptidos epítopes de hsp60 sea más efectiva que un solo péptido, ya que más poblaciones de célula T serán afectadas por la terapia.

EJEMPLO 3 PACIENTES CON IDM RECIÉN DIAGNOSTICADA MUESTRAN RESPUESTAS DE PROLIFERACIaN DE CÉLULA T A hsp60. p277(Val* -Val***) . Pl2 Y p32 Para determinar las respuestas de célula T a los diversos péptidos de hsp60, se probó los linfocitos de la sangre periférica de pacientes a quienes se acababa de diagnosticar IDDM (2 semanas-4 meses) en un análisis de proliferación. Se sacó 10 a 20 ml de sangre a un tubo estéril que contenía heparina como anticoagulante y se diluyó en PBS 1:2. Se aisló células mononucleares periféricas (PBMC) centrifugando la sangre sobre una capa de linfoprep. Se probó las PBMC en cuanto a la proliferación, por triplicado, en presencia de los diversos antígenos (10 µg/ml) durante seis días, utilizando la incorporación de [3H]-timidina como medida de la proliferación. Los antígenos probados fueron hsp60 humana o los péptidos p277(Val6 -Val11 ) , pl2, p32 de hsp60 y el péptido de control p278. Se ilustra la respuesta de proliferación de célula T como el índice de estímulo (IE): la relación entre la incoforación de timidina estimulada por el péptido y la incoforación de timidina de fondo (sin antígeno añadido) por las células T. Los resultados están resumidos a continuación en el cuadro 4.

CUADRO 4 Pacien(IE) de respuesta de proliferación d e célula T te No. hsp60 P277(V) P12 P32 P278 1 5 5..66 4 4..55 4.0 1.1 0.5 2 7 7..55 5 5..00 4.5 1.3 0.8 3 8 8..00 5 5..66 1.2 7.1 0.7 4 3 3..44 1 1..00 1.9 2.9 0.9 11..22 11..11 1.7 1.0 ND 6 66..77 11..33 5.2 4.5 ND 7 1100..33 33..99 1.2 6.0 ND 8 11..33 11..22 1.5 1.1 ND Se considera que un índice de estímulo (IE) de más de 2.0 es una respuesta positiva. ND = no determinado; p277(V) = p277(Val* -Val11 ) . Se puede ver que la mayoría de los pacientes respondió a hsp60 (6/8) y que los seis que respondieron a hsp60 también respondieron a por lo menos uno de los tres péptidos de hsp60: pl2, p32 o p277(Val* -Val11 ) . De tal manera, una respuesta al grupo de los péptidos puede servir para caracterizar a los individuos que responden a la molécula de hsp60 entera.

EJEMPLO 4 RESPUESTAS PROLIFERATIVAS DE CÉLULA T Se detectó respuestas espontáneas de célula T en ratones NOD prediabéticos al péptido p277 de ratón (Elias y coautores, 1991; Birk y coautores, 1996) y a fragmentos mayores de la molécula hsp60 de ratón que contenía la secuencia p277 de ratón (Birk y coautores, 1996). Para detectar otros epítopes de célula T en la molécula hsp60 de ratón, se sumergió ratones NOD en reuniones de péptidos que traslapan la secuencia hsp60 y se encontró que todos los ratones hacían respuesta fuerte a p277 de ratón y a pl2 de ratón (figura 3). Otros inmunogénicos de péptidos para ratones NOD son el péptido MT-p278 (residuos 458-474 en la molécula hsp60 microbacteriana) y GAD-p35 (residuos 524-543 en la molécula GAD65). La figura 3 muestra que MT-p278 es tan fuertemente inmunogénico como p277 de ratón y pl2 de ratón; GAD-p35 también es inmunogénico, pero menos. Un estudio longitudinal de ratones NOD hembras a las 3-16 semanas no mostró respuestas espontáneas a pl2 de ratón en sus bazos (no mostrados), si bien se vio respuestas a p277 de ratón y a hsp60 entera de ratón. De tal manera, de cuatro péptidos inmunogénicos: pl2 y p277 de la molécula de hsp60 de ratón; GAD-p35 de la molécula GAD65 asociada con la diabetes y MT-p278, un inmunógeno extraño, se detectó respuestas espontáneas únicamente a p277 de ratón y a MT-p278.

EL TRATAMIENTO CON EL PEPTIDO Con un protocolo que demostró ser efectivo ccn p277 de ratón (Elias y coautores, 1991; Elias y Cohén, 1994; Elias y Cohén, 1995), se trató grupos de ratones NOD hembras de 10 semanas, con una sola inyección subcutánea de cada péptido (100 mg), emulsificado en IFA. Se observó los ratones para el desarrollo de diabetes hasta los 8 meses de edad. La figura 4 muestra que tanto p277 de ratón como pl2 de ratón fueron péptidos efectivos para inhibir el desarrollo de la diabetes (P < 0.05). En contraste, el tratamiento con los péptidos MT-p278 o GAD-p35 no fue diferente que el tratamiento con IFA solo. Un total de tres experimentos mostró esencialmente los mismos resultados.

LOS ANTICUERPOS El tratamiento satisfactorio de la diabetes inducida por STZ con el péptido p277 de ratón, estuvo asociado con la aparición de anticuefos antipéptido predominantemente de los isotipos IgGl e IgG2b (Elias y Cohén, 1996). Se examinó, por lo tanto, ratones NOD tratados con péptido para sus anticuefos de suero. La figura 5 muestra que los dos péptidos efectivos para detener la diabetes, pl2 de ratón y p277 de ratón, también fueron efectivos para inducir los títulos fuertes de anticuerpo de los isotipos IgGl e IgG2b (P < 0.001). Los títulos de anticuefo de IgGl e IgG2b también fueron significativamente mayores que los títulos de anticuefo de IgG2a, en estos grupos (p < 0.001). Los ratones tratados con los péptidos MT-p278 o GAD-p35 no respondieron tan fuertemente; ninguno de los ratones tratados con GAD-p35, hizo anticuerpos IgGl específicos, y únicamente dos de los diez ratones tratados con MT-p278 hizo anticuefos del isotipo IgGl. Los ratones tratados con MT-p278 o GAD-p35 hicieron títulos significativa-mente menores de anticuerpos IgG2b (P < 0.001). De tal manera, la efectividad para inhibir la diabetes estuvo asociada con la inducción de una respuesta de anticuefo, principalmente de los isotipos IgGl e IgG2b. La relación entre la respuesta terapéutica efectiva y el título de anticuefo fue confirmada mediante una comparación de la concentración de la glucosa en la sangre, con la concentración de anticuefos en ratones individuales, a los 7 meses de edad. La figura 6 muestra que los ratones con mayores títulos de anticuefos pl2 anti-ratón tendieron a tener menores concentraciones de glucosa en la sangre; inversamente, los ratones tratados con pl2 de ratón, que tuvieron poco anticuerpo a pl2 de ratón, tendieron a tener elevado contenido de glucosa en la sangre (P < 0.002).

DISCUSIÓN Los resultados presentados en este ejemplo indican que el péptido P12 de la molécula hsp60 de ratón, al igual que el péptido p277, puede ser efectivo para tratar los ratones a punto de entrar en hiperglicemia declarada. En contraste con p277, no se observó respuestas de proliferación de célula T espontáneas a pl2 en los bazos de ratones NOD p rediabéticos. Así pues, una respuesta de proliferación anti-péptido espontánea, detectable en la periferia, no es un requisito para que un péptido sea efectivo en el bloqueo de los procedimientos autoinmunológico diabético. El descubrimiento de que el péptido p277 no es el único péptido de hsp60 que puede modular la diabetes en NOD, es importante. Era concebible que la implicación de hsp60 en la diabetes de NOD pudiera efectuarse mediante un parecido entre el péptido p277 de hsp60 y cierta molécula desconocida, más específica para las células beta (Cohén, 1991). Sin embargo, es sumamente improbable que dos segmentos diferentes de hsp60: p277 y pl2, pudieran reproducir segmentos de la molécula de célula beta propuesta, pero desconocida. La efectividad de pl2 en el tratamiento de los péptidos apoya la conclusión de que la molécula parecida a hsp60, funcional en la diabetes, es la propia hsp60 (Birk y coautores, 1996). El que ni el péptido MT-p278 ni el péptido GAD-p35 puedan detener el desarrollo de la diabetes indica que no cualquier auto-antígeno ni cualquier antígeno de proliferación espontánea de célula T, puede ser usado para abortar el proceso autoinmunológico. Es interesante que MT-p278 falló en inducir títulos elevados de anticuefos o proteger, a pesar del hecho de que el péptido es fuertemente in unógeno para las células T (observación no publicada). Sin embargo, la inducción de los anticuefos de cualquier especificidad no necesariamente afecta la diabetes de NOD; el tratamiento de los ratones NOD con BSA, que induce títulos elevados de anticuefos, así como respuestas fuertes de célula T (no mostradas) no afecta el desarrollo de la diabetes (Elias y Cohén, 1994). Si bien no se encontró por los inventores de la presente que GAD-p35 fuese tan fuertemente inmunogénico para las células T como lo eran los otros péptidos (figura 3), se ha informado que los ratones NOD manifiestan respuestas espontáneas de célula T a su péptido (Kaufman y coautores, 1989). Finalmente, la asociación de un tratamiento efectivo con la inducción de anticuefos específicos para el péptido, sugiere que los efectos terapéuticos de pl2 y p277 pudieran relacionarse con la activación de células T del tipo Th2, que son responsables de ayudar a la inducción de anticuefos IgGl específicos, anticuerpos regulados por la producción de IL-4 (Mossman y Coffman, 1993). Dichas células T podrían suprimir las células T Thl, si bien se ha propuesto que son responsables del daño a las células beta (latz y coautores, 1995; Liblau y coautores, 1995). En realidad, se ha descubierto que la terapia con el péptido p277, en la diabetes de NOD, está asociada con una descarga de células T que producen IL-4 e IL-10 en el bazo, y una falla en las células T que producen INF-gamma, tanto en el bazo como en las isletas (observación no publicada). La aparición de anticuefos específicos para el péptido, que llevan isotipos Th2, en respuesta a la terapia con el péptido, parece ser un indicador de una respuesta benéfica.

EJEMPLO 5 PEPTIDOS ADICIONALES A LOS CUALES LOS PACIENTES CON I DM PUEDEN MANIFESTAR RESPUESTAS DE CÉLULA T Se enroló veintiséis pacientes a los que se acababa de diagnosticar IDDM (1 a 16 semanas después del diagnóstico de IDDM). La edad de los pacientes variaba entre 5 y 60 años. Se discriminó a los pacientes en cuanto a sus respuestas proliferantes de célula T en la sangre periférica, a hsp60 humana y a los péptidos sintéticos de hsp60 humano, mostrados en los cuadros 1 y 5, que son porciones de la secuencia de la proteína hsp60 humana. Se analizó las células T de los pacientes en cuanto a sus respuestas de proliferación a los antígenos de actualización normales, tales como el toxoide del tétanos, Candida albicans e influenza y se registró las respuestas como positivas si el índice de estímulo (I.E.) fue 2 o más (véase más adelante) .

Se analizó la proliferación usando el siguiente protocolo: PREPARACIttN DE CÉLULAS Y PROTOCOLO DE PROLIFERACIttN DE LAS CÉLULAS Se extrajo a los pacientes con IDDM 50 ml de sangre periférica, complementada con 10 Ul/ml de heparina, o bien de los controles sanos. Se añadió dos volúmenes de PBS (libre de calcio y de magnesio). Se mezcló la preparación de sangre-PBS usando una pipeta de 10 ml. Se tendió un volumen de 10 ml de Ficoll en la mezcla de sangre, seguida por centrifugación a 2,000 fm durante 30 minutos, a la temperatura ambiente (T.A), 20-24°C (sin freno). Se cosechó las células T de sangre periférica en el revestimiento algodonoso, utilizando una pipeta de 10 ml , y se lo transfirió a un nuevo tubo de ensayo de 50 ml. Se añadió un volumen de 30 a 40 ml de PBS (libre de calcio y de magnesio) a las células T cosechadas. Esto se mezcló a continuación y se centrifugó a 1,000 fm durante 20 minutos a T.A. (con el freno puesto). Se aspiró el sobrenadante y se volvió a suspender la pella de células en medio de cultivo libre de suero AIM-V (GIBC0, EUA). El medio de cultivo contiene AIM-V complementado con 1% de piruvato de sodio, 1% de L-glutamina (200 mM de cada uno), 1% de penicilina/estreptomicina (10,000 U/ml / 10,000 mg/ml y 2% de Hepes (1 M, pH 7.3). Alternativamente, se usó RPMI complementado con 10% de suero AB procedente del banco de sangre. Luego se centrifugó la mezcla de células a 2,000 rpm durante 10 minutos a T.A. (freno puesto). Se volvió a aspirar el sobrenadante y se volvió a suspender la pella de células en un volumen menor de AIM-V fresco (10-20 ml). Se suspendió de nuevo las células y se las contó. La cuenta de células y los análisis de viabilidad fueron efectuados usando azul de tripano. Para este paso se usó un hemoci ó etro y un microscopio de luz. Luego se ajustó la concentración de células a 2 x 106 células/ml en medios AIM-V. Se transfirió un volumen de 100 µl de las células por concavidad, a cada concavidad de una placa de microtitulación de 96 concavidades. Luego se añadió 100 µl de medio que contiene el doble de la concentración recomendada de antígeno (véase la lista de antígenos y concentraciones más abajo). Se efectuó el análisis por cuadruplicado. Se analizó cuatro concavidades con células y medio sin antígeno, como un control Se cultivó las placas a 37°C en un incubador humidificado, con 5% de CO2 , durante 18 horas, y luego se cosechó. Se analizó la proliferación de células mediante incorporación de 3H-timidina al ADN, determinada usando líquido de destello y un lector de contador beta.

Antígenos probados Concen ración toxoide del tétanos (Connaught Lab., 5 g/ml Pen. EUA. Candida albicans 20 µg/ml hsp60 humana recombinante (StressGen, 2-5 µg/ml Canadá) . péptidos sintéticos de hsp60 humana 20 µg/ml Se midió las respuestas de proliferación de acuerdo con la 3H-timidina incoforada por el ADN de las células T (Elias y coautores, 1991). Se comparó las cuentas radioactivas por minuto (Cpm) entre las células cultivadas con los antígenos probados o sin antígeno (únicamente medio) como control. Los valores de proliferación fueron representados como un valor de índice de estímulo (I.E.):CPM medio, con el antígeno dividido entre el CPM medio sin el antígeno. Los valores de I.E. de más de 2, o iguales a 2, fueron considerados positivos. Los resultados mostraron que la incidencia de los individuos reactivos a hsp60 humana o al péptido de hsp60 humana, fue mayor entre los pacientes con IDDM (84) que entre la gente sana (30%). El valor p de la prueba exacta de Fisher, de la diferencia, es 0.0044, que es sumamente significativo. Las respuestas de proliferación de dos pacientes representativos con IDDM y un individuo sano, a la proteína hsp60 humana, a los péptidos sintéticos de hsp60 y a diversos antígenos de refuerzo, están mostradas en las figuras 7, 8 y 9. El cuadro 5 muestra dos ejemplos individuales de los péptidos sintéticos de hsp60 (pl9, p21) a los que no respondieron los pacientes con IDDM (véase también las figuras 10A y 10B) . Se puede ver que cada uno de los pacientes respondió a los antígenos de refuerzo (Candida, tétanos o influenza) y a la proteína humana hsp60 y a diversos péptidos de hsp60 humana. La persona de control respondió únicamente a los antígenos de refuerzo de control. Las secuencias de los péptidos sintéticos de hsp60 a los que por lo menos uno de los pacientes con IDDM respondió, están mostradas en el cuadro 1. Cada uno de esos péptidos tiene potencial terapéutico para tratar IDDM.

CUADRO 5 PEPTIDOS SINTÉTICOS DE hsp60 Y SU SECUENCIA. A LA QUE NO RESPONDIERON LOS PACIENTES CON IDDM Residuos No. Secuencia de aminoácidos Péptidos de SEQ ID N0:1 (código de una sola letra) pl9 271-290 LVIIAEDVDGEALSTLVLNR p21 301-320 KAPGFGDNRKNQLKDMAIAT La descripción precedente de las modalidades específicas revelará tan completamente la naturaleza general de la invención que, al aplicar el conocimiento dentro de la experiencia de la técnica (incluyendo los contenidos de las referencias aquí citadas), otros pueden modificar fácilmente y/o adaptar para diversas aplicaciones dichas modalidades específicas, sin experimentación indebida, sin salirse del concepto general de la presente invención. Por consiguiente, se pretende que dichas adaptaciones y modificaciones estén dentro del significado y la escala de equivalencias de las modalidades descritas, con base en la enseñanza y la guía aquí presentadas. Se debe entender que la fraseología y la terminología de la presente tiene como propósito ser descriptiva y no una limitación, de manera que la terminología o la fraseología de la presente memoria descriptiva debe ser intefretada por los expertos en la materia a la luz de las enseñanzas y la guía aquí presentada, en combinación con el conocimiento de quien sea experto en la materia.

REFERENCIAS Bach JF. (1994) Insulin-Dependent Diabetes Mellitus as an Autoimmune Disease. Endocrine Reviews 15:516-542. Bendelac A, Carnaud C, Boitard C, Bach JF. (1987) Syngeneic transfer of autoimmune diabetes from diabetic NOD ice to healthy noenates. Requirement for both L3T4+ y Ly+-2+ T cells. J Exp Med. 166: 823-32. Birk OS, Elias D, Weiss AS, Rosen A, Rosen A, van-der Zee R, Walter MD, Cohén IR. (1996) NOD mouse diabetes: The ubiquitous mouse hsp60 is a beta-cell target antigen of autoimmune T cells. J. Autoimmun. 9:159-166.

Bowman MA, Leiter EH y Atkinson MA. (1994) Prevention of diabetes in the NOD mouse: implications for therapeutic intervention in human disease. Inmmunology Today. 15:115-20. Castaño L, Eieenbarth GS. (1990) Type-I diabetes: a chronic autoimmune disease of human, mouse, and rat. Annu Rev Im inol. 8:647-79. Cohén IR. (1991) Autoimmunity to chaperonins in the pathogenesis of arthristis an diabetes. Annu Rev Immunol 9:567- 589. Elias, Dana. (1994) The NOD mouse: A model for autoimmune insulin-dependent diabetes. Autoimmune Disease Models, A Guidebook, pp 147-61. Elias D, Cohén IR. (1995) Treatment of autoimmune diabetes and isulitis in NOD mice with heat shock protein 60 peptide p277. Diabetes 44:1132-1138. Elias D, Reshef T, Birk OS, van der Zee R, Walker MD, Cohén IR. (1991) Vaccination against autoimmune mouse diabetes with a T-cell epitope of the human 65 kDa heat shock protein. Proc. Nati Acad Sci USA. 88:3088-91. Elias D. y Cohén IR. (1994) Peptide therapy for deabetes in NOd mice. The Lancet. 343:704-706. Elias D, Cohén IR. (1996) The hsp60 peptide p277 arrests the autoimmune diabetes induced by the toxin streptozocin. Diabetes (en prensa). Katz Jd, Benoist C, Mathis D. (1995) T helper cell subsets in insulin-dependent diabetes. Science 268:1185-1188.

Kaufman DL, Clare-Salzler M, Tian J, Forsthuber T, Ting GSP, Robinson P, Atkinson MA, Sercarz EE, Tobin AJ, Lehmann PV. (1993) Spontaneous loss of T-cell tolerance to glutamic acid decaFoxilase in murine insulin-dependent deabetes. Nature. 366:69-72. Lablau RS, Singer SM, McDevitt HO. (1995) Thl and Th2 CD4+ T cells in the pathogenesis of organ-specific autoimmune diseases. Immunol Today 16:34-38. Mossman TR, Coffman RL. (1989) THl and TH2 cells: Different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 9:145-173. Tisch R, Yang XD, Singer SM, Liblay RS, Fuggar L, McDevitt HO. (1993) Immune response to glutamic acid decarboxylase correlates with insulitis in non-obese diabetic mice. Nature. 366:72-75.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIocN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: YEDA RESEARCH & DEVELOPMENT CO. LTD., en el Instituto Weizmann de Ciencias. (B) DIRECCIÓN: P. 0. Box 95 (C) CIUDAD: Rehovot.- (E) PAÍS: Israel (F) CÓDIGO POSTAL: (CP) 76100 (G) TELEFONO: 972-8-9470617 (H) TELEFAX: 972-8-9470739 (A NOMBRE: I run R. COHÉN (B DIRECCIÓN: 11 Hankin Street (C CIUDAD: Rehovot.- (E) PAÍS: Israel CF. CÓDIGO POSTAL: (CP) 76354 (A NOMBRE: Dana ELIAS (B DIRECCIÓN: 57 Derech Yavne (C CIUDAD: Rehovot.- (E) PAÍS: Israel (F CÓDIGO POSTAL: (CP) 78344 (A NOMBRE: Rivka BULAFIA (B DIRECCIÓN: 31/11 Weizmann Street (C CIUDAD: Yahud.- (E) PAÍS: Israel (F CÓDIGO POSTAL: (CP) 56000 (A NOMBRE: Jana BOCKOVA a/c Ms Joan Fraser NYS/Pediatrics, SUNY Health Sciences Center (B DIRECCIÓN: 11 Floor, Room 040 (C CIUDAD: Stony Brook (D ESTADO: N.Y. (E PAÍS: E. U. A. (F CÓDIGO POSTAL: (CP) 11794 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: PEPTIDOS NOVEDOSOS DERIVADOS DE PROTEINA 60 DE CHOQUE TÉRMICO HUMANA, PARA EL TRATAMIENTO DE LA DIABETES; COMPOSICIONES, MÉTODOS Y EQUIPOS. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 6 (iv) FORMA QUE PUEDE SER LEÍDA POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA DE APLICACIÓN: Patentln Reléase #1.0, Versión # 1.30 (EPO). (vi) DATOS DE SOLICITUD PREVIA: (A) NUMERO DE SOLICITUD: IL 114407 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 de junio de 1995 5 (2) INFORMACIaN PARA SEQ. ID. NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 573 aminoácidos (B) TIPO: Aminoácido (C) No. DE FILAMENTOS: uno solo 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal. (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIocN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: Met Leu Arg Leu Pro Thr Val Phe Arg Gln Met Arg Pro Val Ser Arq 1 5 10 15 Val Leu Ala Pro His Leu Thr Arg Ala Tyr Ala Lys Asp Val Lys Phe 1 -5? ' 25 30 Gly Ala Asp Ala Arg Ala Leu Met Leu Gln Gly Val Asp Leu Leu Ala 35 40 45 Asp Ala Val Ala Val Thr Met Gly Pro Lys Gly Arg Thr Val lie nß 50 55 60 Glu Gln Gly Trp Gly Ser Pro Lys Val Thr Lys Asp Gly Val Thr Val 75 80 Ala Lys Ser He Asp Leu Lys Asp Lys Tyr Lys Asn He Gly Ala Lys 0 T5 90 95 Leu Val Gln Asp Val Ala Asn Asn Thr Asn Glu 100 Glu Ala Gly Asp Gly 105 110 Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Arg Ser He Ala Lys Glu Gly Phe 115 120 125 Glu Lys He Ser Lys Gly Ala Asn Pro Val Glu 11 135 e Arg Arg Gly Val 140 Met Leu Ala Val Asp Ala Val He Ala Glu Leu Lys Lys Gln Ser Lys 5 145 150 155 160 Pro Val Thr Thr Pro Glu Glu He Ala Gln Val Ala Thr He Ser Ala 165 170 175 Asn Gly Asp Lys Glu He Gly Asn He He Ser Asp Ala Met Lys Lys 180 185 190 Val Gly Arg Lys Gly Val He Thr Val Lys Asp Gly Lys Thr Leu Asn 195 200 205 Aßp Glu Leu Glu He He Glu Gly Met Lys Phe Asp Arg Gly Tyr He 210 215 220 Ser Pro Tyr Phe He Asn Thr Ser Lys Gly Gln Lys Cys Glu Phe Gln 225 230 235 240 Aso Ala Tyr Val Leu Leu Ser Glu Lys Lys He Ser Ser He Gln Ser 245 250 255 He Val Pro Ala Leu Glu He Ala Asn Ala His Arg Lys Pro Leu Val 260 265 270 He He Ala Glu Asp Val Asp Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Leu 275 280 285 Asn Arg Leu Lys Val Gly Leu Gln Val Val Ala Val Lys Ala Pro Gly 290 295 300 Phe Gly Asp Asn Arg Lys Asn Gln Leu Lys Asp Met Ala He Ala Thr 305 310 315 320 Gly Gly Ala Val Phe Gly Glu Glu Gly Leu Thr Leu Asn Leu Glu Asp 325 330 335 Val Gln Pro His Asp Leu Gly Lys Val Gly Glu Val He Val Thr Lys 340 345 350 Asp Asp Ala Met Leu Leu Lys Gly Lys Gly Asp Lys Ala Gln He Glu 355 360 365 Lys Arg He Gln Glu He He Glu Gln Leu Asp Val Thr Thr Ser Glu 370 375 380 Tyr Glu Lys Glu Lys Leu Asn Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ser Asp Gly 85 390 395 400 Val Ala Val Leu Lys Val Gly Gly Thr Ser Aso Val Glu Val Asn Glu 405 ?o 4?s Lys Lys Asp Arg Val Thr Asp Ala Leu Asn Ala Thr Arg Ala Ala Val 420 25 430 Glu Glu Gly He Val Leu Gly Gly Gly Cys Ala Leu Leu Arg Cys He 435 4 o 44S Pro Ala Leu Asp Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp Gln Lys He Gly 450 455 460 He Glu He He Lys Arg Thr Leu Lys He Pro Ala Met Thr He Ala 465 470 475 480 Lys Asn Ala Gly Val Glu Gly Ser Leu He Val Glu Lys He Met Gln 485 490 495 Ser Ser Ser Glu Val Gly Tyr Asp Ala Met Ala Gly Asp Phe Val Asn 500 505 510 Met Val Glu Lys Gly He He Asp Pro Thr Lys Val Val Arg Thr Ala 515 520 525 Leu Leu Asp Ala Ala Gly Val Ala Ser Leu Leu Thr Thr Ala 530 Glu Val 535 540 Val Val Thr Glu He Pro Lys Glu Glu Lys Aso Pro Gly 545 Met Gly Ala 550 555 560 Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Phe 565 570 (2) INFORMACIocN PARA SEQ ID NO: 2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) No. DE FILAMENTOS: uno solo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIocN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val He Pro Ala Leu Asp 1 5 10 15 Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp 20 (2) INFORMACIaN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) No. DE FILAMENTOS: uno solo (D) TOPOLOGÍA: lineal, (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIaN DE SECUENCIA: SEQ. ID. NO. 3: Gl u Glu He Ala Gl n Val Ala Th r He Se r Ala Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Asp He Gly Asn He 20 ( 2) INFORMACIocN PARA SEQ ID NO : 4 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) No. DE FILAMENTOS: uno solo (D) TOPOLOGÍA: lineal. (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCI N DE SECUENCIA: SEQ. ID. NO. 4: Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly Ala Asn He Val Lys Val Ala Leu 1 5 10 15 Glu Ala (2) INFORMACIaN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) No. DE FILAMENTOS: uno solo (D) TOPOLOGÍA: lineal. (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIaN DE SECUENCIA: SEQ. ID. NO. 5: Ser Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro Val He Lys Ala Arg Met Met 1 5 10 15 Glu Tyr Gly Thr Thr 20 (2) INFORMACI N PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) No. DE FILAMENTOS: uno solo (D) TOPOLOGÍA: lineal. (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIocN DE SECUENCIA: SEQ. ID. NO. 6: Pro Gly Met Gly Ala Met Gly Gly Met Gly Gly Gly Met Gly Gly 1 5 10 15 Gly Met Phe

Claims (32)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un péptido, caracterizado porque está seleccionado de los péptidos identificados en el cuadro 1, y sus sales y sus derivados funcionales.

2.- El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque está designado aquí pl2.

3.- El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque está designado aquí p32.

4.- El uso de un péptido de conformidad con la reivindicación 1 para el diagnóstico de diabetes mellitus, dependiente de insulina (en lo sucesivo denominada IDDM).

5.- Un método para diagnosticar la presencia o la incipiencia de IDDM en un paciente, caracterizado porque comprende probar la sangre o la orina del paciente con un péptido de conformidad con la reivindicación 1, como antígeno para la presencia de anticuerpos o células T, que son inmunológicamente reactivos con hsp60 humana.

6.- Un método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende probar los pacientes en cuanto a la presencia de anticuerpos anti-hsp60 o de una célula T que inmuno- reacciona con hsp60, con lo que un resultado que indica la presencia positiva de anticuerpos anti-hsp60 o de una célula T, que inmuno-reacciona con hsp60, indica una alta probabilidad de la presencia o la incipiencia de IDDM.

7.- Un método de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado además porque se prueba el paciente en cuanto a la presencia de anticuerpos anti-hsp60.

8.- Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el método de prueba comprende un radioinmunoanálisis.

9.- Un método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el método de prueba comprende un análisis ELISA.

10.- Un equipo para diagnosticar la presencia de IDDM analizando la presencia de anticuerpos anti-hsp60 de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, caracterizado porque comprende: (i) un antígeno que es un péptido de las secuencias de la reivindicación 1; y (ii) un anticuerpo marcado, capaz de reconocer la región no variable de dichos anticuerpos anti-hsp60 que van a ser detectados.

11.- Un equipo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el antígeno es el péptido de acuerdo con la reivindicación 2.

12.- Un equipo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el antígeno es el péptido de conformidad con la reivindicación 3.

13.- Un equipo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado además porque el antígeno está inmovilizado sobre una fase sólida.

14.- Un estuche de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado además porque incluye adicionalmente instrucciones para el uso del equipo en el diagnóstico de IDDM.

15.- Un equipo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado además porque se selecciona un marcador del grupo que consiste de radioisótopos, enzimas, cro óforos y fluoróforos.

16.- Un método de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado además porque se prueba al paciente en cuanto a la presencia de una célula T que inmuno-reacciona con hsp60.

17.- Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el método de prueba comprende una prueba de proliferación de célula T, que comprende los siguientes pasos: (i) preparar una fracción de célula mononuclear, que contiene células T, a partir de una muestra de sangre obtenida del paciente; (ii) añadir a la fracción de célula mononuclear un antígeno seleccionado del péptido de acuerdo con la reivindicación 1; (iii) incubar la fracción de célula en presencia del antígeno, durante un periodo de tiempo adecuado y bajo condiciones de cultivo adecuadas; (iv) añadir un nucleótido marcado al cultivo de células incubado de (iii) en un momento adecuado, antes de que finalice el periodo de incubación, para proveer la incorporación del nucleótido marcado en el ADN de las células T que proliferan; y (v) determinar la cantidad de células T que proliferan, mediante análisis de la cantidad de nucleótido marcado incorporado en las células T.

18.- Un equipo para diagnosticar la presencia de IDDM probando la presencia de una célula T que inmuno-reacciona con hsp60 de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 y 17, caracterizado porque comprende: (i) un antígeno seleccionado del péptido de acuerdo con la reivindicación 1; (ii) un nucleótido marcado; y (iii) un medio adecuado para el cultivo de linfocitos.

19.- Un equipo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque incluye instrucciones para el uso del estuche en el diagnóstico de IDDM.

20.- Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque el método de prueba comprende una prueba de respuesta de citoquina de célula T, que comprende los siguientes pasos: (i) preparar una fracción de célula mononuclear que contiene células T procedentes de una muestra de sangre obtenida del paciente; (ii) añadir a dicha fracción de célula mononuclear un antígeno seleccionado del péptido de acuerdo con la reivindicación 1; (iii) incubar la fracción de célula en presencia del antígeno, durante un periodo de tiempo adecuado y bajo condiciones de cultivo adecuadas; y (iv) medir la presencia de una citoquina secretada por los linfocitos que responden, en el medio.

21.- Un método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la citoquina es IFN-gamma, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNFalfa o TGFbeta.

22.- Un equipo para diagnosticar la presencia de IDDM probando la presencia de una célula T que inmuno-reacciona con hsp60 de acuerdo con el método de cualquiera de las reivindicaciones 5, 6, 20 y 21, caracterizado porque comprende: (i) un antígeno, seleccionado del péptido de acuerdo con la reivindicación 1; (ii) un medio adecuado para el cultivo de linfocitos; y (ii) un equipo de análisis para medir la presencia de la citoquina secretada por los linfocitos que responden, en el medio.

23.- Un equipo de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque incluye adicionalmente instrucciones para el uso del equipo en el diagnóstico de IDDM.

24.- Un método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado además porque se inyecta un antígeno seleccionado de un péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en un paciente, subcutáneamente; y se observa la ocurrencia de una reacción detectable en la piel.

25.- Una preparación para prevenir o tratar IDDM, caracterizada porque comprende: (a) células T que tienen especificidad desarrollada para una proteína o un péptido, que es inmunológicamente reactivo de manera mutua con un péptido de acuerdo con la reivindicación 1; dichas células han sido activadas incubándolas en presencia del péptido; (b) las células T que han sido irradiadas o atenuadas de otra manera; (c9 las células T que han sido sometidas a un tratamiento a presión, por medio de presión hidrostática, tratamiento con agente entrelazador químico y/o tratamiento con un agente entrelazador citoesquelético; (d) fragmentos de o proteínas de superficie, desprendidos de (a), (b) o (c); o (e) un péptido que consiste esencialmente de la región variable del receptor de (a) específico para dicha proteína o una sal, un derivado funcional, un precursor o una fracción activa del mismo.

26.- Una preparación de conformidad con la reivindi-cación 25, caracterizada además porque las células T de (a) son células T humanas; y la especificidad de las células T se ha desarrollado mediante contacto in vitro con el péptido.

27.- Una preparación de conformidad con la reivindicación 2 o 26, caracterizada además porque las células T han desarrollado especificidad in vitro para un péptido de acuerdo con la reivindicación 1.

28.- Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un péptido de acuerdo con la reivindicación 1¡ y un portador farmacéuticamente aceptable.

29.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, para la prevención o el tratamiento de IDDM.

30.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizada además porque el péptido es el péptido de conformidad con la reivindicación 2.

31.- Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28 o 29, caracterizada además porque el péptido es el péptido de conformidad con la reivindicación 3.

32.- El uso de un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a 3, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de IDDM.