MXPA97009452A

MXPA97009452A - Proceso para controlar la sialilacion de proteinas producidas por cultivo de celulas de mamiferos

Info

Publication number: MXPA97009452A
Application number: MXPA/A/1997/009452A
Authority: MX
Inventors: Etcheverry Tina; Ryll Thomas; Lesslauer Wemer; Schreitmuller Thomas; Richter Wolfgang
Original assignee: F Hoffmannla Rocheag; Genentech Inc
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1997-12-03
Publication date: 1998-10-30

Abstract

La presente invención se refiere a un proceso novedoso para la preparación de glicoproteínas por cultivo de células de mamíferos en donde el contenido deácido sialico de la glicoproteína producida se controla sobre una amplia escala de valores manipulando el ambiente de cultivo de células. La invención provee procesos en los cuales el contenido deácido sialico de la glicoproteína se modifica por cambios en parámetros de cultivo celular que afectan la productividad específica de células. Las modalidades preferidas de la invención incluyen procesos de cultivo celular en la osmolalidad del cultivo celular se controla asícomo la concentración de un incrementador de transcripción durante la fase de reproducción del cultivo celular. La invención además provee preparaciones novedosas de factor de necrosis tumoral tipo 1 GI y sus usos en el tratamiento de trastornos inflamatorios o inmunes relacionados.

Description

Proceso Para Controlar la Sialilación de Proteínas Producidas por Cultivo de Células de Mamíferos Campo de la invención Esta invención se refiere a procesos para controlar el contenido de ácido siálico de glicoproteínas producidas en cultivos de células de mamíferos. La invención provee procesos para incrementar y disminuir en contenido de ácido siálico de glicoproteínas producidas por cultivos de células de mamíferos. La invención además se refiere a proceso para producir quimeras de receptor de factor de necrosis tumoral (RFNT)-inmunoglobulina (Ig) así como preparaciones novedosas de TNFR1-lgG? y sus usos en el diagnóstico y tratamiento de varios trastornos inflamatorios e inmunes. Descripción de la Técnica Relacionada Las diferencias en patrones de glicosilación de glicoproteínas producidas recombinantemente, recientemente han sido el tópico de mucha atención en la comunidad científica como proteínas recombinantes producidas como enfoque clínico profiláctico y terapéutico probables. Las cadenas laterales de oligosacáridos de las glicoproteínas afectan la función de la proteína (Witwer A., y Howard, S.C. (1990) Biochem. 29-4175-4180) y la interacción intramolecular entre las porciones de la glicoproteína que resulta de la conformación y la superficie tridimensional presentada de la glicoproteína (Hart. (1992) Curr. Op. Cell Biol., 4:1017-1023; Goochee, y otros, (1991) Bio/Technology, 9:1347-1355: Parekh, R.B., (1991) Curr. Op. Struct. Biol., 1:750-754). También los oligosacáridos pueden servir para dirigir a un polipéptido dado a ciertas estructuras basadas en receptores de carbohidrato celulares específicos (Bevilacque, M.P. y Nelson, R M., (1993) J. Clin. Invest. 91:379-387; Nelson, R.M. y otros (1993) J. Clin. Invest 91:1157-1166. Norgard, K.E. y otros (1993) Proc. Nati Acad. Sci. EUA 90:1068-1072; Imai, Y. Y otros (199) Nature 361.555-557) El componente de ácido siálico terminal de la cadena lateral del oligosacárido de glicoproteína afecta la absorción, vida media del suero, y eliminación del suero, así como las propiedades físicas, químicas e inmunogénicas de la glicoproteína (Parekh, R.B , supra, Varki, A , (1993) Glycobiology 397-100 Paulson, J (1989). TIBS, 14:272-276, Goochee, y otros, (1991) Biotechnology 9.1347-1355, Kobata, A (1992) Eur. J. Biochem. 209.483-501) Por lo tanto es importante mantener el contenido de ácido siálico de las glícoproteínas, particularmente de aquellas proteínas que se pretenden usar como terapéuticos. Se ha prestado mucha atención a los factores que afectan la glicosilación durante producción de proteína recombinante tal como modo de crecimiento (adherente o suspensión), suero de bovino fetal en formulación del medio, densidad de cultivo, oxigenación, pH, esquemas de purificación y similares (Werner, R Y Noe, W (1993), Drug. Res 43 1134-1249, Hayter y otros (1992) Biotech And Bioeng 39327-335, Borys y otros (1994) Biotech, and Bioeng 43505-514, Borys y otros, (1993) Biotechnology 11 720-724, Heapn y otros, (1989) J Cell Biol 108.339353, Goochee y otros, En Frontieres in Bioprocessing II, Todd y otros, Eds (1992) American Chemical Society pags 199-240; Patente de E.U.A NO 5,096,816; Chotigeat, W., (1994) Citotech. 15:217-221). Varios grupos han investigado los parámetros del proceso que rodean la producción de proteínas recombinantes y especialmente el efecto de la composición del medio en la producción de proteínas recombinantes (Park y otros, (1992) Biotech, Bioeng. 40686-696: Cox y McCIure, (1993) In Vitro, 19:1-6; Mizutam y otros, (1992) Biochem, Biophys Res Comm 187:664-669; Le Gros y otros (1985) Lumph Res. 4(3).221-227). La adición de ácidos alcanóicos tal como ácido butírico se sabe que efectúa la expresión temporal de ADN extraño en cultivo celular recombinante (Prasad y Sinha, (1976) In Vitro, 12:125-132, Solicitud de Patente Japonesa No 62-48935, Solicitud de Patente Japonesa No 55-150440, Klehr y otros, (1992) Biochem 31 3322-3329 Gorman y Howard, (1983) Nucleic acid Res 11 7631-7648) Sin embargo, el butirato de sodio tiene una escala de efectos sobre la expresión de genes a través de varias líneas celulares y composiciones del medio (D'Anna y otros, (1980) Biochem 192656-2671, Hagopian, H K, (1977) Cell 12,855-860) Cell 12855-860) y producción de proteína (Milhard (1980) J Cell Physiol 104 163-170 Solicitud de Patente del R.U No GB 2 122 207 A) sugieren que el butirato puede modificar la expresión de genes (Yuan y otros, (1985) J Biol Chem 3778-3783) o inhiben la expresión de ciertos genes (Yuan y otros, supra) La Patente Europea No 0 239 292 B1, describe un proceso para la producción mejorada de proteína en presencia de un ácido alcanóico o una sal del mismo tal como ácido butírico. Sin embargo, la publicación proporciona poca guía para seleccionar las concentraciones apropiadas del aditivo y además no dirige el efecto del aditivo sobre la glicosilación de proteínas. Otros han descrito que la adición de los niveles bajos (0-1.5 mM) de butirato de sodio al medio de producción de cultivo celular para incrementar la productividad celular específica, conduce a un incremento concomitante en glicoformas acidas (que corresponden al contenido de ácido siálico incrementado) de la proteína recombinante producida (Chotigeat, y otros (1994) Cytotech. 15:217-221). Varios grupos han buscado los efectos de osmolaridad de crecimiento celular y producción de polipéptidos (Ozturk y Palsson (1991) Biotech. And Bioeng. 37:989-993; Stubblefield y otros, (1960) Cáncer Research. 20:1646-1655; García-Pérez y otros (1989) Journal of biological Chemistry, 264(28):16815-16821 ; Miner y otros (1981) Invasión Metástasis. 1:158-174; GB 2,251,249; EP 481,791; Patente de E.U.A. No. 5,151,359; Patente de E.U.A. No. 4,724,206; Patente de E.U.A. No. 5,122,469; y WO 89/04867). Se han propuesto varias escalas de osmolaridad para el desarrollo celular o producción de polipéptidos. Generalmente, la osmolaridad del medio de cultivo celular se incrementa vía la adición de NaCI o aminoácidos. Las tensiones ambientales tales como concentraciones de sal incrementadas conducen, en algunos casos, a la producción de productos celulares incrementada. La noción de que la expresión incrementada de productos de proteína de mamíferos se puede lograr en cultivos celulares de mamíferos a través de tensión de solutos, v.gr., se ha reportado la adición de sal, ácido láctico, amoníaco para el medio de cultivo (Publicación Internacional No. WO 89/04867). Estas tensiones generalmente inhiben el crecimiento pero favorecen la productividad específica de las células. Otros han tratado el efecto de concentración de glucosa en desarrollo celular y/o producción de polipéptidos en cultivo celular recombinante. Ver, por ejemplo, Park y otros, (1992) Biotechnology and Bioengineering, 40:686-696; Huang y otros, (1991) Journal of Biotechnology, 18:161-162; EP 387,840; Reuveny y otros (1986) Journal of Immunological Methods, 86:53-59; fine y otros (1976) in Vitro; 12(10):693-7901; Dircks y otros (1987) Exp. Eye Res., 44:951-958; Mizutani y otros (1992) Biochemical and Biophysical Research Communications, 187(2):664-669; Sugiura, (1992) Biotechnology and Bioengineering, 39:953-959; WO 88/01643; Graf y otros, (1989) DECHEMA Biotechnol. Conf., 3:615-618; Solicitud de Patente Japonesa No. JP 1-101882; Patente de E.U.A. No. 3,926,723; WO 87/00195; y Fleishaker, Jr., Ph.D. Thesis, Massachusetts Institute of Technology, págs. 196-229 (Junio de 1982). Sin embargo, los estudios previos no han estudiado el efecto de varios parámetros del proceso en el contenido de ácido siálico de la proteína madura, un factor en la producción de glicoproteína que cuenta para el éxito clínico. La presente invención provee proceso para controlar el contenido de ácido siálico de glicoproteinas producidas por cultivos celular de mamíferos.

Compendio de la Invención Los inventores presentes han descubierto que ciertos parámetros del proceso de cultivo de células de mamíferos afecta la productividad específica para células así como el grado y tipo de glicosilación de las proteínas producidas. Más particularmente, los inventores presentes han encontrado que ciertos factores que aumentan la productividad específica para células tienen un efecto inverso sobre el contenido de ácido siálico de la proteína producida. Los inventores presentes por lo tanto han desarrollado varios procesos de cultivo celular para enriquecer las glicoformas particulares de glicoproteínas producidas en cultivos celulares de mamíferos. Consecuentemente, la invención provee un proceso para controlar el contenido de ácido siálico de una glicoproteína producida por cultivo celular de mamíferos. De acuerdo con este aspecto de la invención, la variación del régimen de producción de la glicoproteína en la fase de producción del cultivo celular conduce a variaciones en el contenido de ácido siálico de la glicoproteína madura. Más particularmente, un incremento en la productividad específica para células durante la fase de producción de glicoproteína da como resultado una disminución en el contenido de ácido siálico de la proteína madura. Inversamente, una disminución en la productividad específica de células da como resultado un incremento en contenido de ácido siálico en la proteína madura. La presente invención provee, en una modalidad particular, para variar la productividad específica para células de una célula huésped de mamíferos durante la fase de producción de proteína de cultivo celular de mamíferos controlando factores que afectan la productividad específica para células. De acuerdo con un aspecto de la invención, se controla la concentración de factores que aumentan la transcripción de ADN. En otra modalidad, la productividad específica para células se controla manteniendo la osmolalidad del cultivo celular dentro de ciertos márgenes. De acuerdo con la invención, cualquiera de los parámetros anteriores se controla, solo o en combinación, para afectar el contenido de ácido siálico de glicoproteínas maduras. En una modalidad particular de la presente invención, el factor que aumenta la transcripción de ADN es un ácido alcanóico o sal del mismo tal como butirato de sodio a una concentración de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM. De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, la osmolalidad del cultivo celular se mantiene entre aproximadamente 250-500 mOsm. En un aspecto adicional, la temperatura del cultivo celular se controla entre aproximadamente 30°C y 37°C. En una modalidad preferida, la invención provee un proceso para incrementar el contenido de ácido siálico de la glicoproteína madura producida por el cultivo celular de mamíferos comprendiendo mantener una productividad específica para células inferior controlando cualquier o todos los parámetros del proceso identificado antes, opcionalmente junto con otros parámetros conocidos en la materia. De acuerdo con este aspecto de la presente invención, el cultivo de la célula huésped a una concentración del ácido alcanóico o sal del mismo de aproximadamente 0.1mM a alrededor de 6 mM, y opcionalmente junto con el mantenimiento de osmolalidad del cultivo celular a aproximadamente 300-450 mOsm produce una proteína con un contenido de ácido siálico incrementado. En una modalidad adicional preferida, la invención provee un proceso para disminuir el contenido de ácido siálico de la glicoproteína madura producida por cultivo celular de mamíferos comprendiendo aumentar la productividad específica del cultivo celular. La productividad específica de células se incrementa, en una modalidad preferida, proveyendo un proceso de cultivo celular el cual comprende cualquiera de, cultivar la célula huésped a una concentración de un ácido alcanóico o sal del mismo de aproximadamente 6 mM a aproximadamente 12 mM; y manteniendo la osmolalidad del cultivo celular a aproximadamente 450-600 mOsm. La invención además provee, en una modalidad particular, un proceso de cultivo celular con tres fases del cultivo celular. La invención por lo tanto provee un proceso para controlar el contenido de ácido siálico de una glicoproteína producida por el cultivo celular de mamíferos comprendiendo los pasos de cultivar una célula huésped que expresa la proteína en una fase de crecimiento durante un periodo y bajo dichas condiciones que se aumenta al máximo el crecimiento celular. De acuerdo con este aspecto de la presente invención, la fase de crecimiento es seguida por una fase de transición en la cual se seleccionan y acoplan los parámetros del cultivo celular para el contenido de ácido siálico deseado de la glicoproteína madura. La fase de transición se sigue por una fase de producción del cultivo celular en donde los parámetros seleccionados en la fase de transición se mantienen y el producto de glicoproteína se produce y recoge. Variando la productividad específica de las células de la fase de producción del cultivo celular adicionando un ácido alcanóico o una sal del mismo al cultivo celular a una concentración de aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 20 mM y acoplando una osmolalidad del cultivo celular a aproximadamente entre 250 y 600 mOsm, opcionalmente en combinación uno con el otro durante la fase de transición produce una proteína con cantidades diferentes de ácido siálico. En una modalidad adicional preferida, la presente invención provee un proceso para controlar la cantidad de ácido siálico presente en un receptor de proteína quimérica soluble de factor de necrosis tumoral de tipo 1 (RFNT1 )-¡nmunoglobulina G (I gG 1 ) . Los inventores de la presente han descubierto que, bajo ciertas condiciones de producción, se pueden obtener las preparaciones de glicoformas novedosas de RFNT1-lgd las cuales exhiben las propiedades deseables de desalojo prolongado de la sangre mientras que retienen actividad funcional significativa. Una vida media funcional larga permite la administración de dosis de bolos simplificada y contribuye a la potencia in vivo de la glicoproteína producida permitiendo formas de dosis inferiores de la glicoproteína.

De acuerdo con este aspecto de la presente invención, se produce una molécula de glicoproteína de RFNT1-lgd la cual contiene residuos de ácido siálico incrementados. Los parámetros de cultivo celular para la fase de producción del RFNT1-lgd se seleccionan para obtener el contenido de ácido siálico deseado. En una modalidad preferida, el butirato de sodio está presente en la fase de producción a una concentración de aproximadamente 0.1 a alrededor de 6 mM y la osmolalidad se mantiene aproximadamente a 300-450 mOsm. En un aspecto más preferido, la concentración de butirato de sodio es de aproximadamente 1 mM y la osmolalidad se mantiene a aproximadamente 350-400 mOsm. En aún otra modalidad, la presente invención provee una preparación de glicoproteína de RFNT1-lgd producida por el proceso de la presente invención. De acuerdo con este aspecto de la invención, se provee una preparación comprendiendo RFNT1-lgd en la cual la escala de pl de la preparación está entre aproximadamente 5.5 y 7.5. Además se provee una preparación de RFNT1-lgG? que tiene una relación molar de ácido siálico a proteína de aproximadamente 4 a alrededor de 7 y especialmente de aproximadamente 5 a alrededor de 6. En aún otro aspecto, la preparación de RFNT1-lgd tiene de aproximadamente 1 a alrededor de 2 moles de residuos de N-acetilglucosamina expuestos por mol de proteína. En un aspecto adicional, la preparación tiene una relación molar de ácido siálico a N-acetilglucosamina de aproximadamente 0.35 a alrededor de 0.5 y más preferiblemente de aproximadamente 0.4 a alrededor de 0.45. La presente invención también provee una composición terapéutica que comprende la preparación anterior útil en el tratamiento de condiciones patológicas mediadas por FNT. Descripción de los dibujos Figura 1A y Figura 1B. Las Figuras 1A y 1B muestran el método usado para calcular la productividad específica de un proceso de cultivo de células normal en la fase de producción. La productividad específica puede expresarse como una función de los conteos de células viables (días de células viables) como se muestra en la Figura 1A; o volumen de células empacadas (VCE) como se muestra en la Figura 1B. El régimen de producción específico se da con la escala para un intervalo de 90% de confianza. Figura 2A y Figura 2B. Las Figuras 2A y 2B muestran la correlación entre la productividad específica basada en días de células viables (Figura 2A) y volumen de células empacadas (VCE) (Figura 2B) durante la fase de producción y el contenido ácido siálico (NANA) del producto recogido. Se muestran los valores para 9 procesos diferentes (A-1). Los puntos de datos representan proceso de producción independientes como se describió en la Tabla 1. Descripción Detallada de la Invención 1- Definiciones Las oraciones de carbohidratos de la presente invención serán descritas con referencia a la nomenclatura comúnmente usada para la descripción de oligosacáridos. Una revisión de la química de carbohidratos que usa eta nomenclatura se encuentra en Hubbard y Ivatt (1981) Ann. Rev. Biochem. 50:555-583. Esta nomenclatura incluye, por ejemplo, Man, que representa mañosa, GIcNAc, que representa 2-N-acetilglucosamina; Gal que representa galactosa y Glc, que representa glucosa. Los ácidos siálicos se describen con referencia a la notación manuscrita NeuNAc, para ácido 5-N-acetilneuraminico y NeuNGc para ácido 5-glicolilneuraminico (J. Biol. Chem, 1982, 257;3347; J. Biol. Chem., 1982, 257;3352). "Osmolalildad" es una medida de la presión osmótica de partículas de solutos disueltas en una solución acuosa. Las partículas de solutos incluyen tanto iones como moléculas no ionizadas. La osmolalidad se expresa como la concentración de partículas osmóticamente activas (es decir, osmoles) disueltas en 1 kg de solución (1 mOsm/kg H2O a 38°C es equivalente para una presión osmótica de 19 mm Hg). "Osmolaridad" en contraste, se refiere al número de partículas de soluto disueltas en 1 litro de solución. Cuando se usa en la presente, la abreviatura "oOsm" significa una "solución de miliosmoles/kg". Como se usa en la presente, "glicoproteína" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos y por lo menos una cadena lateral de oligosacáridos. Las glicoproteínas pueden ser homologas a la célula huésped, o preferiblemente, son heterólogas, es decir, extrañas para la célula huésped que se está utilizando, tal como una proteína humana producida por una célula de ovario de hámster Chino. Preferiblemente, se usan las glicoproteínas de mamíferos (glicoproteínas que se derivaron originalmente de un organismo de mamíferos), más preferiblemente, aquellas que se secretan directamente en el medio. Ejemplos de glicoproteínas de mamíferos incluyen moléculas tales como citoquinas y sus receptores, así como proteínas quiméricas que comprenden citoquinas o sus receptores, incluyendo, por ejemplo, alfa y beta del factor de necrosis tumoral, sus receptores (RFNT-1; EP 417,563 publicada el 20 de marzo de 1991; y RFNT-1, EP 417,014 publicada el 20 de marzo de 1991) y sus derivados; renina; una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humano y hormona de crecimiento de bovinos; factor de liberación de la hormona de crecimiento, Hormona paratiroidea; hormona estimuladora de tiroides; lipoproteínas, alfa-1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimuladora de folículos, Calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; factores de formación de coágulos tales como factor VI II C , factor IX, factor de tejido y factor de von Willebrands; factores anticoagulantes tales como Proteína C; factor natriuretíco atrial; agente tensoactivo de pulmones; un activador de plasminógeno, tal como uroquinasa o murina humana o activador de plasminógeno de tipo de tejido (t-AP); bombesina; trombina; factor de crecimiento hemopoyético; encefalinasa; RANTES (regulado en activación expresada y secretada normalmente en células T); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (PIM-1-alfa); una albúmina de suero tal como albúmina de suero humano; substancia inhibidora de muleriano; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorelaxina; péptido asociado con gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; DNasa; inhibina; ativina; factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV); receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrofico derivado de huesos (FNDH), neurotrofina-3, -4, -5 ó -6 (NT-3, NT-4, Nt-5 o NT-6) o un factor de crecimiento de nervios tal como FCN-ß, factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), factor de crecimiento de fibroblastos tales como FCFa y FCFb, factor de crecimiento epidérmico (FCE), factor de crecimiento de transformación (FCT) tal como FCT-alfa y FCT-beta, incluyendo FCT-ß1, FCT-p2, FCT-ß3, FCTß4 o FCTßd, factor de crecimiento similar a insulina I y II (FCI-I y FCI-II), des(1-3)-FCI-1 (FCI-1 de cerebro), proteínas de unión de factor de crecimiento similar a insulina, proteínas CD tales como SD-3, CD-4, CD-8 y CD-19, eptropoyetina, factores osteoinductivos, inmunotoxinas, una protema orfogenética de huesos (PMH), un interferon tal como interferon-alfa, -beta, y -gama, factores estimulantes de colonia (FEC), v gr , M-FEC, GM-FEC y G-FEC, interleucinas (lis), v gr , IL-1 a IL-10, dismutasa superoxido, receptores de células T, proteínas de membrana superficial, factor de aceleración de desintegración, antigeno viral tal como, por ejemplo, una porción de cubierta de SIDA, proteínas de transporte, receptores dirigidos, adhesmas, proteínas reguladoras, anticuerpos, proteínas quiméricas, tales como inmunoadhesinas y fragmentos de cualquiera de los pohpéptidos listados antes Los términos "medio de cultivo celular" y "medio de cultivo" se refieren a una solución de nutrieres usada para células de mamíferos en crecimiento que normalmente proveen por lo menos un componente de una o más de las siguientes categorías 1) una fuente de energía, usualmente en la forma de un carbohidrato tal como glucosa, 2) todos los aminoácidos esenciales, y usualmente el grupo básico de veinte aminoácidos más cisteína; 3) vitaminas y/o otros compuestos orgánicos requeridos a bajas concentraciones, 4) ácidos grasos libres; y 5) elementos traza, en donde los elementos traza se definen como compuestos inorgánicos o elementos presentes en la naturaleza que normalmente se requieren a concentraciones muy bajas, usualmente en la escala micromolar. La solución de nutrientes opcionalmente puede suplementarse con uno o más componentes de cualquiera de las siguientes categorías: 1) hormonas y otros factores de crecimiento como, por ejemplo, insulina, transferina, y factor de crecimiento epidérmico; 2) sales y soluciones reguladoras de pH, por ejemplo, calcio, magnesio y fosfato; 3) nucleosidos y bases tales como, por ejemplo, adenosina, timidina y hipoxantina; y 4) hidrolisatos de proteína y de tejidos. El término "célula huésped de mamíferos", "célula huésped", "célula de mamíferos" y similares, se refiere a líneas celulares derivadas de mamíferos que son capaces de crecer y sobrevivir cuando se colocan en cualquier cultivo de una capa o en cultivo en suspensión en un medio que contiene los nutrientes apropiados y factores de crecimiento. Los factores de crecimiento necesarios para una línea celular particular se determinan fácilmente empíricamente sin experimentación indebida, como se describió, por ejemplo en Mammalian Cell Culture (Mather. J.P. ed. Plenum Press, N.Y. [1984]) y Barnes y Sato, (1980) Cell, 22:649. Normalmente, las células son capaces de expresar y secretar grandes cantidades de una glicoproteína particular de interés en el medio de cultivo. Ejemplos de células huésped de mamíferos adecuadas dentro del contexto de la presente invención pueden incluir células de ovario de hámster Chino/DHFR (CHO, Uriaub y Chasin, Proc. Nati, Acad. Sci. EUA, 77:4216 [1980]); células dp12.CHO (EP 307.247 publicada el 15 de marzo de 1989): línea CVI de riñon de mono transformada por SV40 (COSA, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y otros, J. Gen Virol., 3659 [1977]); células de riñon de hámster bebe (BHK. ATCC CCL 10); células de Bertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 [1980]); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76. ATCC CRL-1587): células ce carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon caninas (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A. ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratones (MMT 060562. ATCC CCL51); células de TRI (Mather y otros, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]); células MRC 5; células FS4; una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped preferidas incluyen células de ovarios de hámster chinos /DHFR (CHO, Uriaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci, EUA, 77:4216 [1980]; células dp12.CHO (EP 307,247 publicada el 15 de marzo de 1989). Se entiende que el término "peptona" dentro del contexto de la presente invención se refiere a un suplemento de medio que es proteína animal esencialmente hidrolizada. La fuente de esta proteína pueden ser subproductos animales de casas de carne, gelatina purificada o materiales para plantas. La proteína normalmente se hidroliza usando ácido, calor o varias preparaciones de enzimas. Las mezclas de peptona preferidas son, por ejemplo, "Primatone RL" y "Primatone HS", ambas de las cuales están comercialmente disponibles (Sheffield, Inglaterra). "Productividad específica para células", "régimen específico para células" y similares, se usan en la presente para referirse al régimen de expresión de productos específico, es decir, por célula o por medida de masa o volumen celular. La productividad específica para células se mide, por ejemplo, en gramos de proteína producida por célula por día. La productividad específica para células se puede medir convenientemente de acuerdo con el método integral: dP/dt=qpX, o P = qp f: Xdt en donde qp es la productividad específica para células constante, X es el número de células o volumen celular, o equivalentes de masa celular, y dP/dt es el régimen de producción de proteínas. Por lo tanto, qp puede obtenerse de una gráfica de concentración de producto contra la integral de tiempo de células viables (J Xdt "días de células viables") De acuerdo con esta fórmula, cuando la cantidad de producto de glicoproteína producida se gráfica contra los días de células viables, la inclinación es equivalente al régimen específicos para células Las células viables se pueden determinar por varias medidas, por ejemplo, biomasa. régimen de absorción de O2l lactasa deshidrogenasa (LKDH), volumen de células empacadas o turbidez "Fase de crecimiento" del cultivo celular se refiere al período de crecimiento celular exponencial (la fase log) en donde las células se dividen generalmente de manera rápida Durante esta fase, las células se cultivan durante un tiempo, usualmente entre 1 y 4 días y bajo tales condiciones que se aumenta al máximo el crecimiento celular La determinación del ciclo de crecimiento para la célula huésped puede determinarse para la célula huésped particular prevista sin experimentación indebida El "tiempo y bajo dichas condiciones en que el crecimiento celular se aumenta al máximo" y similares, se refiere a aquellas condiciones de cultivo que para una línea celular particular se determinó que son óptimas para el crecimiento y división celular Durante la fase de crecimiento, las células se cultivan en medio nutriente que contiene los aditivos necesarios generalmente de aproximadamente 30-40°C en una atmósfera controlada humidificada de manera que se logra el crecimiento óptimo para la línea celular particular Las células se mantienen en la fase de crecimiento durante un periodo entre uno y cuatro días usualmente entre dos a tres días La "fase de transición" del cultivo celular se refiere al período durante el cual se acoplan las condiciones de cultivo para la fase de producción. Durante la fase de transición, los factores ambientales tales como temperatura del cultivo celular, osmolalidad del medio y similares, se cambian de condiciones de crecimiento a condiciones de producción. La "fase de producción" del cultivo celular se refiere al período durante el cual el crecimiento celular se ha sembrado en cajas. Durante la fase de producción, el crecimiento celular logarítmico ha terminado y ia producción de proteínas es primaria Durante este período, el medio generalmente se suplementa para soportar producción de proteínas continua y para lograr el producto de ghcoproteína deseado El término "expresión" o "expresiones" se usan en la presente para referirse a la transcripción y traslación que se presentan dentro de una célula huésped El nivel de expresión de un gen de producto en una célula huésped se puede determinar sobre la base de la cantidad de ARNm correspondiente que está presente en la célula o la cantidad de la proteína codificada por el gen del producto que se produce por la célula Por ejemplo, el ARNm transcrito de un gen del producto convenientemente se cuantifica por hibpdización de Northern Sambrook y otros, Molecular Cloning A laboratory Manual, págs 73-757 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). La proteína codificada por un gen de producto se pude cuantificar ya sea mediante el análisis de la actividad biológica de la proteína o empleando análisis que son independientes de dicha actividad, tales como gráfica Western o radioinmunoanalisis usando anticuerpos que son capaces de reaccionar con la proteína. Sambrook y otros, Molecular Cloning: A laboratory Manual, págs. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989). Por ácido alcalino o sa! del mismo se entiende un ácido alcanóico, saturado o insaturado, de cadena recta o ramificada o sal del mismo. El ácido alcanóico generalmente es de uno a diez átomos de carbón y preferiblemente es de tres a seis átomos de carbón. Un ácido alcanóico ilustrativo es ácido butírico y la sal correspondiente es butirato de sodio. II. Procedimientos de Cultivo Celular Los inventores presentes han descubierto que los factores que incrementan la productividad celular específica durante la producción de una glicoproteína producida por cultivo celular de mamíferos, tiene un efecto inverso en el contenido de ácido siálico de la glicoproteína producida. Dado que las proteínas que expresan uno o más residuos de ácido siálico por estructura de oligosacárido complejo tienen regímenes de eliminación más largos in vivo, el régimen de eliminación de la glicoproteína producida puede manipularse dentro de límites amplios por el grado global de sialilación de la preparación. La presente invención provee procesos para controlar el grado de sialilación de una glicoproteína producida por cultivo celular de mamíferos. Siguiendo la metodología establecida en la presente, uno es capaz de determinar los parámetros precisos del proceso que proveen el contenido de ácido siálico deseado de una glicoproteína producida por cultivo celular de mamíferos. De acuerdo con la presente invención, se cultiva una célula huésped de mamífero para producir un producto de glicoproteína recuperable. El contenido global de ácido siálico en la glicoproteína se controla mediante el control de parámetros de cultivo celular los cuales afectan la productividad específica de las células. Los factores que afectan la productividad específica de las células son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no están limitados a, factores que afectan el número de copias de ADN/ARN. factores que afectan el ARN, tales como factores que estabilizan ARN, nutrientes del medio y otro suplementos, la concentración de incrementadores de transcripción, la osmolalidad del ambiente de cultivo, la temperatura y pH del cultivo celular, y similares. De acuerdo con la presente invención, el ajuste de estos factores, solos o en combinación, para incrementar la productividad específica, genera una proteína con un contenido de ácido siálico disminuido. El ajuste de estos factores, solo o en combinación, para disminuir la productividad específica para células, genera una glicoproteína madura con un contenido de ácido siálico incrementado La invención ahora será descrita con referencia a varias técnicas y principios de cultivo celular, incluyendo aquellos bien conocidos. De acuerdo con la presente invención, se cultivan las células de mamíferos para producir un producto de glicoproteína deseado. Eligiendo una célula huésped para la producción de la glicoproteína dentro del contexto de la presente invención es importante reconocer que las células huésped diferentes tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento traslacional y postraslacional y modificación (v gr , glicosilación, separación) de las proteínas expresadas Se deben elegir líneas celulares apropiadas para asegurar que sean posibles las modificaciones post-traslacionales deseadas Alternativamente, las células huésped pueden modificarse para expresar un producto de genes deseado requerido para la modificación post-traslacional específica En particular, las células de mamíferos que expresan la proteína deseada deberán expresar o ser manipuladas para expresar las enzimas particulares de manera que bajo las condiciones apropiadas, descritas en la presente se presente ijn vivo la modificación post-traslacional apropiada Las enzimas incluyen aquellas enzimas necesarias para la adición y acompletamiento de carbohidratos N- y O-l?gados tales como aquellos descritos en Hubbard y Ivan supra para ohgosacápdos N-ligados Las enzimas incluyen opcionalmente ohgosacapltransferasa, alfa-glucosidasa I alfa-glucosidasa II. ER alfa(1 2)manos?dasa. Alfa-manosidasa I de Golgí, N-acetiIglucosaminiltransferasa I, alfa- anosidasa II de Golgí N-acetiIglucosaminiltransfrasa II, alfa(1 6)fucos?ltransferasa y ß(1 4)galactos?ltransferasa Adicionalmente, la célula huésped expresa para unir el ácido siálico terminal en la posición y ligadura específicas como parte del genoma de células huésped Opcionalmente la célula huésped puede hacerse para expresar las transferasas de sialilo apropiadas por ejemplo, mediante transfección de la célula huésped con el ADN que codifica la sialiltransferasa. Se podría esperar que las sialiltransferasas descritas antes adicionen el residuo de ácido siálico terminal a la estructura de matriz de oligosacárido apropiada tal como Galß1-4GlcNAc. Las sialiltransferasas apropiadas dentro del contexto de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, aquellas sialiltransferasas que catalizan la sialilación compleja y ramificación de los oligosacáridos N- y O-ligados. Para el cultivo de las células de mamíferos que expresan la proteína deseada y capaces de adicionar los carbohidratos deseados en la posición específica y ligadura, se pueden usar numerosas condiciones de cultivo prestando atención particular a la célula huésped que se esta cultivando. Las condiciones de cultivo adecuadas para las células de mamíferos son bien conocidas en la técnica (J. Immunol. Methods (1983) 56:221-234) o se pueden determinar fácilmente por el experto (ver, por ejemplo. Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. y Hames, B.D., eds. Oxford University Press, New York (1992)) y varían de acuerdo con la célula huésped particular seleccionada. El cultivo de células de mamíferos de la presente invención se preparó en un medio adecuado para la célula particular que se está cultivando. El medio comercialmente disponible tal como Ham's f 10 (sigma). Medio Esencial Mínimo ([MEM], Sigma). RPMI-1640 y Medio Eagle Modificado de Dulbecco ([DMEM], Sigma) son soluciones nutrientes ilustrativas. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y Wallace, (1979) Meth. Enz.. 58:44: Barnes y Sato. (1980) Anal. Biochem., 102:255; Patentes de E.U.A. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 5,122,469 o 4,560,655; Publicaciones Internacionales Nos. WO 90/03430; y WO 87/00195; las descripciones de las cuales se incorporan aquí por referencia, se pueden usar como medio de cultivo. Cualquiera de estos medios puede ser suplementado según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), soluciones reguladoras de pH (tales como HEPES). nucleosidos (tales como adenosina y timidina). antibióticos (tales como el fármaco Gentamycin™). elementos traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en la escala micromolar) lípidos (tales como ácido linoleico u otros ácidos grasos) y sus vehículos adecuados y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquiera de los otros suplementos necesarios también pueden incluirse a concentraciones apropiadas que podrían conocerse por los expertos en la materia. En una modalidad particular, la célula huésped de mamíferos es una célula de OHC. preferiblemente una célula de dp12.0HC y un medio adecuado contiene un componente de medio basal tal como una formulación basada en DMEM/HAM F-12 para la composición de medio de DMEM y HAM F12. ver las formulaciones del medio de cultivo en American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomes. Sexta Edición, 1988, páginas 346-349) (la formulación del medio como se describe en la patente de E.U.A. ,122,469, son particularmente apropiadas) con concentraciones modificadas de algunos componentes tales como aminoácidos, sales, azúcar y vitaminas, y opcionalmente conteniendo glicina, hipoxantina y timidina; insulina humana recombinante, peptona hidrolizada, tal como Primatona HS o Primatona RL (Sheffield, Inglaterra) o el equivalente, un agente protector celular, tal como Pluronic F68 o el poliol plurónico equivalente, Gentamicina y elementos traza. Las glicoproteínas de la presente invención se pueden producir por células en desarrollo que expresan la proteína deseada bajo una variedad de condiciones de cultivos celulares. Por ejemplo, los procedimientos del cultivo celular para la producción a gran escala o pequeña escala de proteínas son potencialmente útiles dentro del contexto de la presente invención. Los procedimientos que incluyen, pero no están limitados a, un bioreactor de lecho fluidizado, bioreactor de fibra hueca, cultivo de botella de rodillo o sistema de bioreactor de tanque agitado, se pueden usar en los dos últimos sistemas, con o sin microvehículos y se pueden operar alternativamente en un lote, lote de alimentación, o modo continuo.

En una modalidad preferida, el cultivo celular de la presente invención se realiza en un sistema de bioreactor de tanque agitado y se emplea un procedimiento de cultivo en lote de alimentación. En el cultivo de lote de alimentación preferido, las células huésped de mamíferos y medio de cultivo se suministran a un recipiente de cultivo inicialmente y se alimentan nutrientes de cultivo adicionales. continuamente o en incrementos discretos, al cultivo durante el cultivo, recogiendo o no periódicamente la célula y/o producto antes de terminar el cultivo El cultivo del lote de alimentación puede incluir, por ejemplo, un cultivo de lote de alimentación semicontínuo, en donde todo el cultivo se remueve y reemplaza periódicamente (incluyendo células y medio) por medio fresco El cultivo de lote de alimentación se distingue de cultivo de lote sencillo en el cual todos los componentes para cultivo celular (incluyendo las células y todos los nutrientes del cultivo) se suministran al recipiente de cultivo al inicio del proceso de cultivo El cultivo de lote de alimentación además puede distinguirse del cultivo de perfusión en cuanto a que el sobrenadante no se remueve del vaso de cultivo durante el proceso (en el cultivo de perfusión, las células se restringen el cultivo por, v gr , filtración, encapsulacion, unión a los microvehicuos, etc y el medio de cultivo se introduce y se remueve continua o intermitentemente del recipiente de cultivo) Además, las células del cultivo se pueden propagar de acuerdo con cualquier esquema o rutina que puede ser adecuado para la célula huésped particular y el plan de producción particular contemplado Por lo tanto la presente invención contempla un procedimiento de cultivo de un solo paso o de múltiples pasos En un cultivo de un solo paso, las células huésped se inoculan en un ambiente de cultivo y los procesos de la presente invención se emplean durante una sola fase de producción del cultivo celular Alternativamente, se prevé un cultivo de múltiples etapas En los cultivos de múltiples etapas se pueden cultivar células en un numero de pasos o fases Por ejemplo las células pueden crecer en un cultivo en un primer paso o fase de crecimiento en donde las células, removidas posiblemente del almacenamiento, se inoculan en un medio adecuado para promover el crecimiento y alta viabilidad. Las células se pueden mantener en la fase de crecimiento durante un período adecuado por la adición de medio fresco al cultivo de células huésped. De acuerdo con un aspecto preferido de la invención, las condiciones de cultivo celular en lote de alimentación o continuo se proveen para aumentar el crecimiento de las células de mamíferos en la fase de crecimiento del cultivo celular. En la fase de crecimiento se desarrollan células bajo condiciones y durante un período que se aumentan al máximo para el crecimiento. Las condicione de cultivo, tales como temperatura, pH, oxígeno disuelto (dO2) y similares, son aquellos usados con el huésped particular y serán evidentes para el experto común. Generalmente, el pH se ajusta a un nivel entre aproximadamente 6.6 y 7.5 usando tanto un ácido (v.gr., CO2), o una base (v.gr., Na2CO2 o NaOH). Una escala de temperatura adecuada para cultivar células de mamíferos tales como células de CHO está entre aproximadamente 30 a 38°C y un dO2 adecuado está entre 5-90% de saturación de aire. En una etapa particular, las células se pueden usar para inocular una fase o paso de producción del cultivo celular. Alternativamente, como se describió antes, la fase o paso de producción puede ser continuo con la fase o paso de inoculación o crecimiento. De acuerdo con la presente invención, se controla el ambiente de cultivo celular durante la fase de producción del cultivo celular.

De acuerdo con el proceso de la presente invención, los factores que afectan la productividad específica de la célula de la célula huésped de mamíferos se manipulan de manera que el contenido de ácido siálico deseado se logra en la glicoproteína resultante. En particular, los factores que incrementan la productividad específica de la célula se controlan durante la fase producción del proceso del cultivo celular de manera que el producto de glicoproteína resultante contiene el contenido de ácido siálico deseado. En un aspecto preferido, la fase de producción de los procesos de cultivo celular es precedido por una fase de transición del cultivo celular en el cual se acoplan los parámetros de la fase de producción del cultivo celular. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la concentración de un incrementador de transcripción tal como un ácido alcanóico, se manipula para afectar la productividad específica de la célula y por lo tanto el contenido de ácido siálico resultante del producto de glicoproteína de células de mamíferos. El ácido alcanóico puede ser cualquiera de un número de ácidos alcanóicos de cadena sencilla o ramificada que aumentan la transcripción de proteínas de mamíferos. En una modalidad preferida, el ácido alcanóico es ácido butírico y especialmente la sal del mismo, butirato. De acuerdo con la presente invención, la concentración de butirato de sodio se controla con el fin de controlar la productividad específica de la células. Se usan concentraciones de butirato de sodio de entre 0.1 y 20 mM y se modifican de acuerdo con la célula huésped particular que se está cultivando y el contenido de ácido siálico deseado de la glicoproteína producida. Con el fin de generar una proteína con el contenido de ácido siálico deseado, se elige una concentración de butirato de sodio la cual provee la productividad especifica de célula más alta con el perfil de ácido siálico más aceptable. Por lo tanto, de acuerdo con las concentraciones de la presente invención de un incrementador de transcripción tal como butirato de sodio se eligen para obtener el contenido de ácido siálico deseado. Con el fin de incrementar el contenido de ácido siálico de la glicoproteína madura, generalmente se usan concentraciones inferiores del incrementador de transcripción. La concentración inferior provee transcripción aumentada pero mantiene productividad específica para célula inferior mientras que mantiene la viabilidad del cultivo de células huésped. Generalmente, se usan las concentraciones del incrementador de transcripción tal como butirato de sodio entre aproximadamente 0.1 mM y aproximadamente 8 mM. Más preferiblemente, se usan concentraciones preferiblemente entre aproximadamente 1.0 y 6.0 mM. En una modalidad particular. aproximadamente se usa butirato de sodio 6 mM. En otra modalidad, se usan aproximadamente 1 mM de butirato de sodio. En otra modalidad, se produce una glicoproteína con un nivel disminuido de ácido siálico. De acuerdo con este aspecto de la presente invención, se cultivan las células de mamíferos bajo condiciones tales que se incrementa la productividad específica de células. De acuerdo con este aspecto de la presente invención, una concentración de ácido alcanóico u otro incrementador de transcripción apropiado se elige de manera que la productividad específica de célula incrementada genera una proteína con el perfil de ácido siálico deseado. En una modalidad preferida, la concentración del ácido alcanoico o sal del mismo es entre aproximadamente 5 a 20 mM y más preferiblemente entre aproximadamente 6 mM y 12 mM. En una modalidad particular, la concentración de butirato de sodio es de aproximadamente 12 mM. Para determinar la concentración apropiada del incrementador de transcripción tal como un ácido alcanóico o sal del mismo, se puede hacer referencia a la Figura 2, así como la Tabla I infra en el Ejemplo I. De acuerdo con la presente invención, la concentraciones de butirato inferior dan como resultado generalmente una productividad inferior específica de célula. De acuerdo con la invención, se eligen las concentraciones de butirato de sodio, se eligen teniendo en mente otros parámetros del proceso tales como la osmolalidad del la fase de producción. Como se trata después, la osmolalidad puede afectar la productividad específica de células. Las concentraciones de butirato se eligen teniendo en mente la osmolalidad particular que será mantenida durante la fase de producción. Alternativamente, para otras células huésped de mamíferos y otras glicoproteínas. pueden prepararse cultivos de prueba pequeños y el régimen de producción del producto de glicoproteína. es decir, la productividad específica de células puede determinarse y se puede usar el contenido de ácido siálico resultante para preparar una tabla similar y figura apropiadas para la célula huésped particular que se está cultivando, teniendo en mente que las disminuciones en productividad específica de célula conduce a incrementos en el contenido de ácido siálico de la glicoproteína producida El ácido alcanóico o sal del mismo, tal como butirato de sodio y otro incrementador de transcripción apropiado se adiciona al cultivo de células huésped en, o aproximadamente, en el tiempo en que se inicia la fase de producción del cultivo de célula Convenientemente una fase de transición se emplea durante el proceso del cultivo de la célula precediendo la fase de producción en la cual se acoplan las condiciones del cultivo celular como se trato en la presente para la productividad especifica de célula desead ay por lo tanto el perfil de glicoformas deseado El ácido alcanóico o sal del mismo se adiciona por cualquier medio conocido en la técnica En una modalidad preferida se adiciona el butirato de sodio en lote al sistema de cultivo de lote de alimentación con o sin otros nutrientes apropiados como se describió en la presente o conocido para los expertos en la materia del cultivo celular de mamíferos De acuerdo con la presente invención la osmolahdad del ambiente de cultivo celular se controla además de los factores observados antes para regular el grado de sialilación de la glicoproteina madura En una modalidad, la osmolalidad se controla con el fin de controlar el contenido de ácido siálico de la proteína madura independiente de otros factores que afectan la productividad especifica de células En otra modalidad la osmolahdad se controla además de controlar otros factores que afectan la productividad específica para células. En una modalidad preferida, se controlan tanto la osmolalidad como la concentración de ácido alcanóico. La osmolalidad del ambiente de cultivo celular se controla con el fin de producir el balance deseado entre la productividad específica para células y el perfil de ácido siálico de la glicoproteína resultante. Generalmente, la productividad específica para células se incrementa cuando se incrementa la osmolalidad. Una osmolalidad que produce una proteína con el ácido siálico deseado se elige teniendo en mente que los incrementos en la osmolalidad generalmente conducen a incrementar el régimen de producción de la proteína particular. Con el fin de disminuir el régimen de producción e incrementar el contenido de ácido siálico de la osmolalidad de glicoproteína madura generalmente se mantiene a un nivel inferior para el tipo de célula particular que se está cultivando.

Para cultivo de células de mamíferos, la osmolalidad del medio de cultivo generalmente es de aproximadamente 290-330 mOsm. Sin embargo, los incrementos en la osmolalidad conduce generalmente a incrementar el régimen de producción de proteínas. Una osmolalidad se elige de manera que el régimen de producción corresponde al perfil de producto deseado. Con el fin de incrementar el contenido de ácido siálico, se disminuye el régimen de producción y la osmolalidad generalmente se mantiene dentro de un margen inferior teniendo en mente la célula huésped particular que se está cultivando. La osmolalidad en la escala de aproximadamente 250 mOsm a alrededor de 450 mOsm es apropiada para un contenido incrementado de ácido siálico Más preferiblemente, la osmolalidad se mantiene a alrededor de entre 300 y 450 mOsm, de acuerdo con este aspecto de la invención y más preferiblemente entre aproximadamente 350 y 400 mOsm y aún más preferiblemente de aproximadamente 400 mOsm. Para un contenido de ácido siálico inferior, se elige una osmolalidad que provee un régimen de producción incrementado. De acuerdo con este aspecto de la invención, se mantiene la osmolalidad a aproximadamente entre 350-600 mOsm y preferiblemente está entre aproximadamente 450-550 mOsm, de acuerdo con este aspecto de la invención El practicante experto reconocerá que la osmolalidad media depende de la concentración de partículas osmóticamente activas en el fluido de cultivo y que un número de variables que forman un medio de cultivo de células de mamíferos impactan la osmolahdad La osmolalidad inicial del medio de cultivo se determina por la composición del medio de cultivo La osmolalidad puede medirse usando un osmometro tal como el vendido por Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania bajo el nombre comercial OSMETTE para el modelo Osmette 2007. disponible de Precisión Systems, Inc Natick MA), por ejemplo Con el fin de lograr una osmolahdad en la escala deseada, se puede ajustar la concentración de varios constituyentes en el medio de cultivo Los solutos que se pueden adicionar al medio de cultivo de manera que se incremente la osmolalidad del mismo incluyen proteínas, péptidos aminoácido, proteínas animales hidrolizadas tales como peptonas, polímeros no metabolizados, vitaminas, iones, sales, azúcares, metabolitos, ácidos orgánicos, líquidos y similares. En una modalidad, la osmolalidad se controla por la adición de una peptona al cultivo celular junto con otros componentes del medio de cultivo durante un procedimiento de cultivo de lote de alimentación. De acuerdo con la presente invención, la osmolalidad se mantiene o ajusta a la escala deseada vía la adición de, por ejemplo, una formulación de medio basal incluyendo aminoácidos, varias sales (v.gr., NaCI) además de una peptona. En una modalidad preferida, el medio de cultivo se suplementa con, por ejemplo, un medio de cultivo basal conteniendo aminoácidos en exceso (ver, v.gr., el medio "Super" de la Patente de E.U.A. No. 5,122,469), glucosa y una peptona. Sin embargo, se apreciará que la(s) concentración(es) de otros constituyentes en el medio de cultivo pueden modificarse con el fin de lograr una escala de osmolalidad como se estableció antes. Controlando ya sea intermitente o continuamente la concentración de glucosa (la fuente de energía primaria) por ejemplo, en el medio de cultivo mediante el cultivo, la osmolalidad del medio puede mantenerse aproximadamente a la escala deseable especificada. El control de la concentración de glucosa sirve para proveer fuente de carbón adecuada a las células y controlar simultáneamente la producción de ácido láctico por las células huésped. Esto es ventajoso dado que limita la disminución de pH en el medio de cultivo el cual necesita la adición de un neutralizador (v.gr., una base tal como Na2CO3 o NaOH) que ocasiona que se eleve la osmolalidad. El medio se puede suplementar para mantener la osmolalidad dentro de los márgenes apropiados de acuerdo con el esquema que se esté usando para mantener el cultivo de células. En una modalidad preferida, el sistema de cultivo es un sistema de cultivo en lote de alimentación y el medio se suplementa en lote en una alimentación durante la fase de producción del cultivo celular. Adicionalmente, se puede suplementar el medio durante la fase de producción como se describió antes. Alternativamente, se puede llevar a cabo el muestreo fuera de línea intermitente del medio de cultivo. La osmolalidad del medio de cultivo se puede modificar por la modulación de una solución de alimentación según se requiere. Se entenderá por el experto que los procedimientos de cultivo celular de la presente invención se seleccionan para lograr el nivel deseado de sialilación de la proteína producida. Los parámetros del proceso además de aquellos descritos en la presente que influencian el grado de sialilación, incluyen el nivel de oxígeno y nivel de glucosa. La densidad el cultivo, tiempo y condiciones de almacenamiento tales como temperatura, también influencian la sialilación. Se entiende que la presente invención incluye aquellos parámetros de proceso que además son más adecuados para la sialilación incrementada. lll. Recuperación de la Glicoproteína Siguiendo la fase de producción del polipéptido, el polipéptido de interés se recupera del medio de cultivo usando técnicas que están bien establecidas en la materia. El polipéptido de interés, preferiblemente se recupera del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse de los lisatos de células huésped. Como un primer paso, el medio de cultivo o lisato se centrifuga para remover desechos de células en partículas. Por lo tanto, el polipéptido se purifica de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, los siguientes procedimientos siendo ilustrativos de los procedimientos de purificación adecuados por la fraccionación en inmunoafinidad o columnas de intercambio iónico; precipitación de etanol, CLAR de fase inversa, cromatografía sobre sílice o en una resina de intercambio catódico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amonio; filtración de gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75; y columnas de proteína A Sepharose para remover los contaminantes tales como IgG. Un inhibidor de proteasa tal como fluoruro de fenil metil sulfonilo (FFMS) también puede ser útil para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación. Un experto en la materia apreciará que los métodos de purificación adecuados para el polipéptido de interés pueden requerir modificación para contar los cambios en el carácter del polipéptido al expresarse en el cultivo celular recombinante. Especialmente dentro del contexto de la presente invención se prefieren las técnicas y procesos de purificación que seleccionan los carbohidratos de la invención Las glicoformas deseadas de la presente invención pueden ser enriquecidas para moléculas que contiene ácidos por ejemplo, cromatografía de gel blando de intercambio iónico o CLAR usando resinas de intercambio catiónico o aniónico, en donde se recoge la fracción más acida IV Análisis de la Glicoproteína La porción compleja de carbohidratos de la ghcoproteína producida por el proceso de la presente invención se puede analizar fácilmente, si se desea, por técnicas convencionales de análisis de carbohidratos Por lo tanto, por ejemplo, las técnicas tales como aglutinación de lectina, bien conocidas en la técnica, revelan proporciones de mañosa terminal u otros azúcares tales como galactosa. La terminación de oligosacárido mono, bi, tp o tetra-antenapo por ácidos siálicos pueden confirmarse por la liberación de azúcares de la proteína usando hidrazina anhídrida o métodos enzimáticos y fraccionación de ohgosacápdos por intercambio iónico o cromatografía de exclusión de tamaño y otros métodos bien conocidos en la materia El pf de la glicoproteína también se puede medir, antes o después del tratamiento con neuraminudasa para remover ácidos siálicos Un incremento en pl después del tratamiento de neuraminidasa indica la presencia de ácidos siálicos en la glicoproteína Las estructuras de carbohidratos de la presente invención ocurren sobre ia proteína expresada como carbohidratos N-ligados u O-l?gados Los carbohidratos N-ligados u O-l?gados difieren principalmente en sus estructuras de núcleo La glicosilacion N- ligada se refiere a la unión de la porción de carbohidratos vía GIcNAc a un residuo de asparagina en la cadena de péptidos. Los carbohidratos N-ligados contienen una estructura de núcleo Man1-6(Man1-3)Manß1-4GlcNAcß1-4GlcNAcß-R. Por lo tanto, en la estructura de núcleo descrita, R representa un residuo de asparagina de la proteína producida. La secuencia de péptidos de la proteína producida contendrá una asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina y asparagina-X-cisteína, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina. Los carbohidratos O-ligados, en contraste, se caracterizan por una estructura de núcleo común, la cual es el GalNAc unida al grupo hidroxilo de una treonina o serina. De los carbohidratos N-ligados y O-ligados, los más importantes son los carbohidratos complejos N- y O-ligados. Dichos carbohidratos complejos contendrán varias estructuras antenarias. Las estructuras mono-, bi-, tri- y tetra-exteriores, son importantes para la adición de ácidos siálicos terminales. Dichas estructuras en cadena provee sitios adicionales para los azúcares específicos y ligaduras que comprenden los carbohidratos de la presente invención. Los carbohidratos resultantes pueden analizarse por cualquier método conocidos en la técnica incluyendo aquellos métodos descritos en la presente. Se conocen varios métodos en la técnica para análisis de glicosilación y son útiles en el contexto de la presente invención, Dichos métodos proveen información con respecto a la identidad y la composición del oligosacárido unido al péptido. Los métodos para análisis de carbohidratos útiles en la presente invención incluyen pero no están limitados a cromatografía de lectina. HPAEC-DAP, que usa cromatografía de intercambio aniónico de pH alto para separar los oligosacáridos basado en la carga; RMN; espectrometría de masa; CLAR; CFG; análisis de composición de monosacáridos; digestión enzimática secuencial. Adicionalmente, se conocen los métodos para liberar los oligosacáridos. Estos métodos incluyen 1) enzimáticos, que comúnmente se llevan a cabo usando péptido-N-glicosidasa F/endo-ß-galactosidasa; 2) ß eliminación usando ambiente alcalino desagradable para liberar estructuras principalmente O-ligadas y 3) métodos químicos usando hidrazina anhídrida para liberar oligosacáridos tanto N- como O-ligados. El análisis se puede llevar a cabo usando los siguientes pasos: 1. Diálisis de la muestra contra agua desionizada, para remover todas las sales reguladoras, seguido por liofilización. 2. Liberar las cadenas intactas de oligosacáricos con hidrazina anhídrida. 3. Tratamiento de las cadenas de oligosacáridos intactas con HCl metanóico anhidrido para liberar monosacáridos individuales como derivados O-metílicos. 4. N-acetilación de cualesquiera grupos amino primarios. 5. Derivatización para dar glicosidos per-O- trimetilsililmetílicos 6. Separación de este derivado, por CGL capilar (cromatografía de gas-líquido) sobre una columna de CP- SIL. 7. Identificación de derivados de glicosido individual por tiempo de retención de la CGL y espectroscopia de masa, comparado con normales conocidas. 8. Cuantificación de derivados individuales por FID con una norma interna (13-O-metil-D-glucosa). Se pueden determinar los azúcares neutros y amino mediante cromatografía de intercambio aniónico de lato rendimiento combinada con detección amperométrica pulsada (Sistema de Carbohidratos IAAR-DAP, Dionex Corp.). Por ejemplo, los azúcares pueden liberarse mediante hidrólisis en 20% (v/v) de ácido trifluoroacético a 100°C durante 6 h. Los hidrolisatos se secan entonces por liofilización o con un Speed-Vac (Savant Instruments). Los residuos se disuelven entonces en solución de trihidrato de acetato de sodio 1% y se analizaron en una columna de CLAR-AS6 como se describe por Anumula y otros (Anal. Biochem, 195:269-280 (1991). El ácido siálico puede determinarse por separado mediante el método colorimétrico directo de Yao y otros (Anal. Biochem. 179;2332-335 (1989)) en muestras por triplicado. En una modalidad preferida, se usa el ácido tiobarbiturico (ATB) de Warren, L.J. Biol. Chem. 238:(8) (1959). Alternativamente, se puede llevar a cabo el análisis de carbohidrato inmunográfico. De acuerdo con este procedimiento, se detectan carbohidratos unidos a proteína usando un sistema de detección de glicano comercial (Boehringer) que se basa en el procedimiento de inmunográfica oxidativo descrito por Haselbeck y Hosel [Haselbeck y otros, Glycoconjugate J., 7:63 (1990)]. Se sigue el protocolo de tinción recomendado por el fabricante en cuanto a que la proteína se transfiere a una membrana de difluoruro de polivinilideno en lugar de una membrana de nitrocelulosa y las soluciones reguladoras de bloqueo que contuvieron 5% de albúmina de suero de bovinos en solución reguladora de pH tris 10 mM, pH 7.4 con cloruro de sodio al 0.9%. Se realizó la detección con anticuerpos anti-digoxigenina ligados con un conjugado de fosfato alcalino (Boehringer), dilución al 1:1000 en solución salina tris con pH regulado usando los substratos de fosfatasa, cloruro de 4-nitroazul de tetrazolio, 0.03% (p/v) y 5-bromo-4-cloro-3-indoil-fosfato 0.03% (p/v) en solución reguladora de pH tris 100 mM , pH 9.5, conteniendo cloruro de sodio 100 mM y cloruro de magnesio 50 mM. Las bandas de proteína que contiene carbohidrato usualmente se visualizan en aproximadamente 10 a 15 min. El carbohidrato también puede analizarse por digestión con peptido-N-glicosidasa F. De acuerdo con este procedimiento, se suspende el residuo en 14 µl de una solución reguladora de pH conteniendo 0.18% de SDS, beta-mercaptoetanol 18 mM, fosfato 90 mM, EDTA 3.6 mM a pH 8.6 y se calienta a 100°C durante 3 minutos. Después de enfriar a temperatura ambiente, la muestra se divide en dos partes iguales. Una alícuota no se trata adicionalmente y sirve como un control. La segunda fracción se ajusta aproximadamente a 1% de detergente NP-40 seguido por 0.2 unidades de peptido-N-glicosidasa F (Boehringer). Ambas muestras se calientan a 37°C durante 2 horas y después se analizan por electroforesis de gel de poiacrilamida-SDS. V. Quimeras de Receptor de Factor de Necrosis Tumoral-Inmunoglobulina En una modalidad preferida, los proceso de la presente invención se usan para producir quimeras de receptor de factor de necrosis tumoral (RFNT)-lnmunoglobulina (Ig). Especialmente entre esta clase de proteínas quiméricas se prefiere el RFNT-lgGi de tipo 1. Las quimeras de RFNT1-lgd producidas son útiles en el tratamiento o diagnóstico de muchas enfermedades y trastornos mediados por FNT o relacionados con FNT. El término "tratamiento" en este contexto, incluye tanto profiláctico (prevención), supresión (v.gr., de un síntoma) y tratamiento de una condición existente. Las condiciones patológicas asociadas con FNT incluyen, pero no están limitadas a bacteremia gran negativa y gram positiva, choque endotóxico, fenómeno de rechazo de injerto, artritis reumatoide, lupus sistémico, enfermedad de Crohn y otras enfermedades autoinmune e inflamatorias asociadas con FNT. Las preparaciones de RFNT1-lgG» de la presente invención, son útiles generalmente en aquellas indicaciones en donde los anticuerpos monoclonales para FNT se han encontrado útiles. Por ejemplo, en modelos animales, se encontró que los anticuerpos monoclonales para FNT-alfa tienen efecto protector cuando se emplean profilácticamente (Tracey, K.JK. y otros (1987) Nature 330:662). En un estudio clínico de fase I reportado por Exley, A.R., y otros (1990) Lancet 335:1275, un anticuerpo monoclonal de murinos para FNT-alfa humano recombinante se encontró seguro cuando se administra a pacientes humanos con choque séptico severo. RFNT1-lgG1 se usa adecuadamente en el tratamiento de artritis reumatoide así como choque séptico. En un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con FNT, se administra una cantidad terapéuticamente activa de preparación de RFNT1-lgG? a un sujeto que necesita dicho tratamiento. El sujeto preferido es un ser humano. Una cantidad efectiva de una preparación de glicoforma de RFNT1-lgd de la presente invención para el tratamiento de una enfermedad o trastorno está en la escala de dosis de 0.01-100 mg/paciente, preferiblemente 1 mg-75 mg/paciente y más preferiblemente entre aproximadamente 10 y alrededor de 50 mg/paciente. Para la administración, la preparación de RFNTI-lgGi debe formularse en una composición farmacéutica o terapéutica apropiada. Dicha composición normalmente contiene una cantidad terapéuticamente activa de la preparación de RFNT1-lgd y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable tal como solución salina, solución salina con pH regulado, dextrosa o agua. Las composiciones también pueden comprender agentes estabilizantes específicos tales como azúcares, incluyendo mañosa y manitol y anestésicos locales para composiciones inyectables, incluyendo, por ejemplo, lidocaina. La presente invención provee composiciones que además comprenden una cantidad terapéuticamente activa de un ingrediente activo adicional tal como anticuerpos monoclonales, (v.gr., anticuerpos anti-FNT, anticuerpos para Mac 1 o LFA 1) u otros receptores asociados con la producción de FNT, v.gr., receptores IL-1 o IL-2, etc. Una composición terapéutica preferida para terapia sencilla o combinada, como antes, comprende una preparación de RFNT1-lgd de esta invención, la cual exhibe eliminación prolongada de la sangre mientras retiene actividad funcional significativa. Dicha vida media funcional prolongada, permite la administración de dosis de bolo simplificada y contribuye a la potencia in vivo. Las quimeras de RFNT1-lgG? preferidas en la composición terapéutica incluye RFNT1-lgd y preparaciones descritas en la presente, por ejemplo: (1) Preparaciones de RFNT1-lgd que comprenden un oligosacárido complejo terminado por uno o más residuos de un ácido siálico; (2) Preparaciones de RFNT1-lgG? en donde la escala de punto isoeléctrico, pl de la preparación está entre 5.5 y 7.5 determinado por cromatoenfoque, en el cual el pl es sensible al tratamiento de neuraminidasa; (3) Preparaciones de RFNT1-lgd que tienen aproximadamente 1-2 moles de residuos de N- acetilglucosamina por mol de proteína. (4) Preparaciones de RFNT1-lgd que tienen una relación molar de ácido siálico a proteína de aproximadamente 4- 7, especialmente de aproximadamente 5-6. (5) Preparaciones de RFNTI-lgd que tienen una relación molar de ácido siálico a N-acetilglucosamina de aproximadamente 035 a alrededor de 05 y más preferiblemente de aproximadamente 04 a alrededor de 045 Las rutas de administración para las composiciones terapéuticas individuales o combinadas de la presente invención incluyen rutas normales, tales como, por ejemplo, infusión intravenosa o inyección de bolo También se provee el uso de una preparación de RFNT1-lgd de esta invención en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de un ser humano o animal Habiéndose descrito generalmente la invención, la misma será más fácilmente entendida a través de la referencia a los siguientes ejemplos que se proveen a manera de ilustración y no se pretende que limiten la presente invención, a menos que se especifique Ejemplos Los efectos biológicos de FNT-alfa y FNT-beta se median a través de receptores específicos (Dembic y otros (1990) Cytokines, 2231) La clonación molecular ha demostrado la existencia de dos tipos distintos de receptores de FNT (RFNT) con masas moleculares evidentes de 55 kD (tipo 1) (Schall y otros (1990) Cell 61 361 ) y 75 kD (tipo 2) (Smith y otros (1990) Science 248 1019), cada uno de los cuales se une naturalmente tanto a FNT-alfa como FNT-beta (Loetscher y otros (1990) Cell, 61 351, Shall y otros (1990) Cell, 61 361, Kohno y otros (1990) Proc Nati Acad Sci EUA 878331) Las porciones extracelulares de ambos receptores se encuentran naturalmente como proteínas de unión de FNT (Kohno y otros, supra). Se han creado agonistas de FNT, los cuales bloquean el efecto perjudicial de FNT en varios eventos inmunes e inflamatorios (Peppel y otros (1991) J. Exp. Med., 174:1483-1489. Ulich (1993) Am. J. Path., 142:1335-1338; Howard, O.M.Z. (1993) Proc. NMtl. Acad. Sci. USA 90:2335-2339: Wooley. P.H., (1993) J. Immunol. 151:6602-6607). Uno de dichos agonistas (Werner y otros (1991) J. Cell. Biochem. Abstracts, 20th annual meeting, p. 115) combina el dominio extracelular de RFNT tipo 1 55 kD humano con una porción de la articulación y regiones de Fe de cadena gruesa G1 de inmunoglobulina humana. En este Ejemplo, se cultivaron las células de mamíferos .transfectadas con un vector que contiene el ADNc que codifica la quimera de RFNT1-lgd. Métodos A. Línea Celular La línea celular de ovario de hámster Chino (OHC) usadas como la línea de células huésped de mamíferos, se derivó de OHC-K1 (ATCC No. CCL61 OHC-K1). Una línea celular deficiente dihidroftlatoreductasa (DHFR) mutante de OHC-K1 nombrada (DHFR) OHC-K1. DUX-B11 (obtenida de Dr. L. Chasin de Columbia University; Simonsen, C.C., y Levinson, A.D., (1983) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 80:2495-2499; Uriaub G. Y Chasin. L. (1980= Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216-4220) se usó después para obtener una línea celular con un requisito reducido para insulina por transfección con el vector que contiene el ADNc para la proinsulina (Sures y otros (1980) Science, 108:57-59). El clon seleccionado designado dp12.OHC requiere glicina, hipoxantina y timidina para el crecimiento, verificando así su genotipo de DHFR). B. Construcción de Quimera de RFNT-lgG! Tipo 1 Soluble Una quimera de RFNT-lgGi tipo 1 soluble se construyó por fusión de genes del dominio extracelular del RFNT tipo 1 humano con la región de articulación y dominios de CH2 y CH3 de cadena gruesa de Igd (denominada además como RFNTI-lgd). El RFNT tipo 1 humano que codifica secuencia de ADN (ver Loetscher y otros, Supra) se obtuvo del plásmido pRK-FNT-R (Schall y otros, Cell 61 :361 (1990)]. Para construir este plasmido de partida, se insertó un clon de ADNc placental de 2.1 kb en el vector de expresión de mamíferos pRK5, la construcción de la cual se describe en EP Pub. NO. 307,247, publicada el 15 de marzo de 1989. Este ADNc empieza en una posición 64 del nucleótido de la frecuencia reportada por Loetscher y otros, con la metionina de inicio de 118 pb corriente abajo. La fuente de la secuencia que codifica Igd fue el plásmido de expresión de CD4-lgG pRKCD42Fc1 [Capón, D. J. Y otros, Nature 337, 525 (1989); Byrn y otros, Nature 344. 667 (1990)], conteniendo una secuencia de ADNc que codifica un polipéptido híbrido que consiste de residuos 1-180 de la proteína de CD4 humana madura (dos dominios variables N-terminales CD4) fusionados con secuencia de IgG 1 humanas empezando en un ácido aspartico 216 (tomando el aminoácido 114 como el primer residuo de región constante de cadena gruesa [Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest 4a Edición (1987)] que es el primer residuo de la articulación de Igd después del residuo de cisteína implicado en la unión de cadena gruesa-ligera) y terminando con el residuo 441 para incluir los dominios de CH2 y CH3 Fe de Igd. Se construyó RFNT1-lgG? generando fragmentos de restricción de plásmidos pRK-FNT-R y pRKCD42Fc1 y ligándolos, usando mutagénesis de supresión, de manera que el residuo 171 de treonina de FRNT madura se yuxtapone al residuo de ácido aspártico 216 de cadena pesada de IgGi [Kabat y otros, supral. El plásmido resultante de pRKTNFR-lgG contuvo la longitud completa codificando la secuencia para RFNT! Igd. C. Cultivo Celular El gen que codifica el RFNT-lgd tipo 1 soluble, se introdujo en las células dp12.OHC por transfección. Esto se logró usando la técnica de fosfato de calcio para introducir ADN en células de mamíferos. Dos días después de la transfección de células se tripsinizó y se volvió a sembrar en placas en medio selectivo (glicina-hipoxantina y timidina libre de Ham's F-12 DMEM, 1:1 v/v con 2% de suero dializado). Los aislados subsecuentes se tamizaron para secreción de RFNTI-lgGt. Los clones expresando RFNT1-lgd se amplificaron en metotrexato produciendo clones de alta expresión y subsecuentemente adaptado a medio libre de suero. Estas células estuvieron bajo una presión selectiva continua hasta que se transfirieron a medio no selectivo para crecimiento y expansión del inoculo. Para proveer células para los cultivos de producción de RFNTI-lgd, la población de células descrita antes se expandió desde el medio que contiene metotrexato por subcultivos en ERIE en recipientes para incrementar los volúmenes de medio de crecimiento que no contienen metotrexato. Para estos pasos del proceso, el medio de crecimiento no selectivo fue la formulación basada en DMEM/HAM F-12 (ver Patente de E.U.A. 5:122,469, por ejemplo) con concentraciones modificadas de algunos componentes, tales como glucosa, aminoácidos, sales, azúcar, vitaminas, glicina, hipoxantina y timidina; insulina humana recombinante, peptona hidrolizada (Primatona HS o Primatona RL) un agente protector celular tal como Pluronic F68 (poliol plurónico) o el equivalente; Gentamicina; Lípidos y elementos traza. Los cultivos se controlaron a pH 7.2 + /-0.4 por el uso de gas CO2 (ácido) y/o Na2CO3 (base). La temperatura se controló cerca de 37°C durante el período de crecimiento. El oxígeno disuelto se mantuvo por arriba de 5% de saturación de aire por rocío directo con aire y/o gas oxígeno. La osmolalidad durante la fase de expansión de inoculo se mantuvo entre aproximadamente 250 mOsm y 350 mOsm. La fase de crecimiento para cada cultivo se siguió por una segunda fase o fase de transición en donde se cambiaron los parámetros del cultivo de crecimiento óptimo a condiciones de producción. Durante esta fase de transición, disminuyó la temperatura del sistema del cultivo, generalmente a aproximadamente entre 30 y 35°C. Se adicionó butirato y se acopló cierta escala de osmolalidad. El producto acumulado durante esta fase de producción se analizó para contenido de ácido siálico.

En una forma de producción normal aproximadamente 1.2x106 células derivadas de la expansión de inoculo de la etapa selectiva se desarrollaron en una fase de crecimiento con una osmolalidad de partida de 300 mOsm. El medio de crecimiento se suplemento con elementos traza, insulina humana recombinante y peptona hidrolizada. Las células se desarrollaron bajo estas condiciones durante 2 días. Al inicio del tercer día, disminuyó la temperatura del cultivo celular. Simultáneo a o después del cambio de temperatura, se adicionó butirato de sodio al cultivo celular y se acopló la osmolalidad de producción deseada por la adición de varios componentes del medio. Las células se desarrollaron bajo estas condiciones con alimentación durante 9-10 días. Las células se alimentaron con varios componentes del medio. La Tabla I describe las condiciones de producción para varios procesos de producción.

Tabla I Productividad Contenido de Osmolalidad especifica de Acido Siálico de Versión del Conc. de en fase de célula día 5 y RFNT1-lgG? en Proceso Butirato producción día 10 día 10 (mml/1) (mOsmol/kg) (pg/ ) (mol/mol) A 1 360-420 0.6-1.5 6.4-7.2 N = 4 B 1 480-510 1.7-2.2 6.0-6.3 N = 3 C 6 460 4.8 4.7 N = 1 D 6 370-420 2.4-2.8 5.5-5.6 N = 3 E 6 350-370 1.4-2.3 5.4-6.3 N = 3 F 12 390 4.0 5.3 N = 1 G 12 490-510 2.9-5.2 4.0-5.2 N = 4 H 12 400-430 2.0-2.8 5.8-6.0 N = 3 I 12 370-380 2.0-2.2 5.5-5.9 N = 3 D. Recuperación del RFNT-lgG La quimera de RFNT1-lgG? se purificó a más de 95% de homogeneidad por cromatografía de afinidad en la Proteína A de Staphylococcus aureus inmovilizado como se describió por Capón y otros, supra. E. Análisis de Carbohidratos El contenido de ácido siálico se analizó por el método de Warren, L. (1959) J. Biol. Chem. 234:1971-1975. Resultados La productividad específica de células para cada uno de los cultivos de producción descritos en la Tabla I, se gráfico contra el contenido de ácido siálico del producto cultivado Los resultados se presentan en la Figura 1 El contenido de ácido siálico superior se observó cuando los parámetros del proceso se mantuvieron a una osmolahdad de producción entre aproximadamente 360 y 420 mOsm y una concentración de butirato de aproximadamente 1 mM El contenido de ácido siálico podría controlarse sobre una amplia escala de valores ajustando los parámetros del proceso Ejemplo II Se determinaron los regímenes de vida media farmacocinética de plasma y/o eliminación de diferentes preparaciones Las preparaciones que tienen un contenido de ácido siálico superior en los regímenes de vida media de plasma incrementada y/o eliminación total inferior comparado con las preparaciones que tienen un contenido de ácido siálico disminuido Métodos Se asignaron aleatoriamente diecisiete ratas macho derivadas de Sprague-Sawly pesando 272-315 g para uno de tres grupos de tratamientos de proteína de fusión de RFNT1-lgd (N = 5 o 6 por grupo) Los animales se inyectaron intravenosamente con una dosis nominal de 5 mg/kg de material de prueba vía una cánula de vena femoral Los materiales de prueba elegidos incluyeron dos preparaciones de RFNT1-lgG? de un proceso en el cual la concentración de butirato durante la fase de producción fue de 6 mM y la osmolahdad durante la fase de producción se mantuvo a aproximadamente 400 mOsm El proceso I y una tercera preparación de RFNT1-lgd de un proceso en el cual la concentración de butirato fue de 12 mM y la osmolalidad durante la fase de producción fue de 12 mM y la osmolalidad durante la fase de producción fue de aproximadamente 500 mOsm, Proceso II. Se recogieron muestras de sangre de dos ml en EDTA (8.5%) antes de la dosis y a 5 minutos y 2, 6, 10, 24, 34, 48, 56, 72, 96 y 120 horas después de la dosis. Las muestras de sangre se centrifugaron, se recogió el plasma y las muestras se analizaron para concentraciones de proteína de fusión Se usó un análisis de unión inmunológica y biológica unida a enzima (AIBUE) para cuantificar RFNT1-lgd en plasma de rata. Este análisis se basa en la capacidad de FNT-alfa acoplado a peroxidasa de rábano (FNT-alfa-HRP) para unirse a la porción del receptor de la proteína de fusión de RFNT1-lgG?. En este análisis, los fragmentos de Fab de IgGFc antihumano de cabra revertido en los pozos de placas de microtitulación se usaron para capturar RFNT1-lgG? por interacción con la porción de Fe de la molécula. Se adicionó FNT-alfa-HRP a los pozos y se dejó unir a la porción del receptor del RFNT1-lgG? capturado. La cuantificación se determinó midiendo un color producido por la reacción de peroxidasa con peróxido y un substrato de orto-fenilendiamina (OFD). La escala del análisis es de 0.003 a 0.02 mg/ml. Se mostró que la presencia de EDTA en las muestras de plasma no tiene efecto sobre el rendimiento del análisis. La dosis se normalizó para contar las diferencias de concentración de solución de dosis. Todos los cálculos se basaron en los datos de concentración contra tiempo a través del punto de tiempo de 120 hr. El área truncada bajo la curva (AUC0-?2o) se calculó usando la regla trapezoidal y la eliminación truncada normalizada por peso (CL0-?2o/P) se calculó como dosis/AUC0-?2o- Resultado Los regímenes de eliminación variaron dependiendo de la versión del proceso usada (Proceso I comparado con Proceso II) y la cantidad de ácido siálico presente en el producto. Los regímenes de eliminación para animales individuales y la media resultante y desviaciones normales de este estudio se presentaron en la siguiente Tabla II. El Proceso I exhibe un régimen de eliminación más lento y favorable. Tabla II ELIMINACIÓN 1-120 (mL/hr/kg) Proceso I Proceso I Proceso II 2.12 2.08 2.144 2.03 2.31 2.99 1.63 2.20 2.61 1.89 2.22 3.27 1.85 1.99 2.81 1.66 3.42 STDEV 1.91 2.08 2.88 media 0.02 0.23 0.45 Ejemplo lll COMPOSICIÓN DE MONOSACÁRIDO DE RFNT1-laG? La determinación de composición y estructura de carbohidrato de oligosacárido de RFNT1-lgG? preparado como se describió en el Ejemplo I, mostró que varió el contenido de ácido siálico de las diferentes versiones del proceso. Se asoció la eliminación rápida del plasma con GIcNAc altamente expuesto, ácido siálico inferior en las cadenas de oligosacárido y (por inferencia) capacidad de acceso de la proteína a receptores de mañosa o galactosa. La eliminación lenta del plasma se asoció con residuos de ácido siálico más terminales. A. Métodos Se produjo RFNT1-lgd de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1 anterior. El material del Proceso I se obtuvo de cultivo de células usando butirato 6mM y una osmolalidad de aproximadamente 400 mOsm durante la fase de producción. El material del proceso II se obtuvo del cultivo celular usando butirato 12 mM y una osmolalidad de aproximadamente 500 mOsm durante la fase de producción. B. Métodos La liberación de azúcares neutros y de amino intactos se determinó por cromatografía de intercambio aniónico de pH alto combinado con detección amperométrico pulsada. El análisis se realizó usando los siguientes pasos: 1. El intercambio de solución reguladora de pH se realizó con RFNT1-lgd (aproximadamente 50 µg/ml) y las muestras de referencia apropiadas de manera que la muestra final estuvieron contenida en el ácido acético al 1%. 2. Aproximadamente 90 µg de RFNT1-lgd así como las muestras de los materiales de referencia se congelaron en un baño de hielo seco y alcohol y la muestra congelada se liofilizó durante la noche. 3. Las muestras secas congeladas se reconstituyeron en 500 µl de ácido trifluoroacético y se incubó a 120°C durante 1 hora. 4. Después de la hidrólisis de ácido, el RFNT1 -lgd y las muestras de referencia se enfriaron y se evaporaron a sequedad . 5. Las muestras se reconsituyeron con agua a una concentración final de aproximadamente 0.6 mg/ml . 6. La separación de los monosacáridos se l levó a cabo a temperatura ambiente por cromatografía de intercambio aniónico a pH alto con detección amperométrica pulsada usando una columna Dionex CarboPac PA l (4x250 mm) (Dionex Corp . , Sunnyvale, CA) . 7. La cuantificación de monosacáridos individuales fue por comparación a los monosacáridos de referencia . C . Resultados El contenido molar relativo de cada monosacárido en las dos preparaciones se muestra en la siguiente Tabla l l l : Tabla lll CONTENIDO MOLAR RELATIVO DE MONOSACÁRIDOS EN DOS PREPARACIONES DE RFNT1-lgd Monosacárido Proceso I Proceso II Fucosa 43±02 44 Galactosa 6 5+00 4 7 Mañosa -| 2 2+06 12 5 N-acetiIglucosamina 14 1+Q 143 Acido Siálico 3 7±03 49+0 3 N-acetilgalactosamina 0 3 0 5+0 1 Relación Acido Sia co/GIcNAc 026 035 Los resultados anteriores demuestran que los parámetros del proceso seleccionados para la fase de producción de la g coproteína afecta la composición de carbohidratos de la glicoproteína madura Las preparaciones que tienen un contenido de ácido siálico superior generalmente exhibieron vida media de suero prolongada Las Tablas IV y V presentadas enseguida demuestran la composición de carbohidrato de las cadenas laterales de oligosacápdos de las preparaciones de quimera de RFNTI-lgd producidas bajo las condiciones del tipo del proceso I y el proceso II La Tabla V presenta datos de carbohidratos en la porción receptora de la molécula quimérica, substrayendo el sitio de glicosilacion Tabla IV P-i E-L £i El Pll Pll Acido Siálico 5.8 5.8 5.7 5.8 3.7 3.5 Fucosa 4.0 4.0 3.6 4.1 4.4 4.3 Gal NAc 0.3 0.2 0.2 0.4 0.3 0.4 Glc NAc 12.9 15.0 14.8 14.3 14.3 14.4 Gal 7.4 7.6 7.1 7.0 4.7 4.1 Man 12.0 12.0 10.0 12.0 12.5 11.9 Reí. SA/G1cNAc 0.45 0.39 0.39 0.41 0.26 0.24 Tabla V Pll Pll P--L P-I Moles expuestas de 3.18 3.2 1.11 1.32 GIcNAc por mol Moles expuestas de Gal 0.97 0.08 1.45 -0.26 por mol Antena de Gal 4.47 4.72 6.45 6.24 Acido siálico por mol 3.5 4.8 5.00 6.5 Los resultados presentados en las Tablas IV y V demuestran que la composición de RFNT1-lgd es normal de oligosacáricos complejos de ácido siálico terminado en mono-, bi-, y triantenas. Se puede concluir que el RFNT1-lgG? preparado por el Proceso I contiene una proporción significativamente superior de ácido siálico y una proporción significativamente inferior de GIcNAc expuesto. El ácido siálico por mol de proteína índica que este material podría tener un punto isoeléctrico inferior que el material producido por el Proceso II. Comparando con los resultados en la Tabla II, estos resultados también indican que la eliminación de plasma más lenta del material del Proceso I se correlaciona con GIcNAc inferiores expuestos y generalmente con un contenido de ácido siálico superior. Las Tablas IV y V demuestran que las preparaciones de RFNT1-lgG? que comprenden un oligosacárido complejo terminado por uno o más residuos de ácido siálico. Las preparaciones de RFNTI-lgG! preferidas comprenden moléculas de RFNT1-lgd que tienen aproximadamente 1-2 moles de residuos de N- acetilglucosamina expuestos por mol de proteína. La relación molar de ácido siálico a proteína es de aproximadamente 4-7. Las preparaciones de RFNT1-lgd tienen una relación molar de ácido siálico a N-acetilglucosamina de aproximadamente 0.4 a alrededor de 0.45. Ejemplo IV El pl de la preparación altamente sialilisada es inferior al pl de la preparación ligeramente sialilisada. Métodos El enfoque isoeléctrico se levó a cabo por las diversas preparaciones descritas en el Ejemplo II. Los geles de enfoque isoeléctrico separan las glicoproteínas de la preparación de acuerdo con su punto isoeléctrico, pl, usando un gradiente de pH creado con anfolitos de diferente pH. En este estudio, el análisis de las preparaciones se llevó a cabo usando un gradiente de pH de 10 a 4. Resultados Las preparaciones de RFNT1-lgd exhiben una escala de punto isoeléctrico de aproximadamente 5.5 a alrededor de 7.5 determinado por cromatoenfoque en el cual el pl es sensible al tratamiento de neuroaminídasa. Las referencias citadas antes se incorporan aquí por referencia, ya sea que se incorpore o no específicamente. Mientras que esta invención se ha descrito en relación con modalidades específicas de la misma se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales. Se pretende que esta solicitud cubre cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de las siguientes invenciones, en general , los principios de la invención e i ncluyendo dichas desviaciones de la descripción presente dado que entran dentro de la práctica conocida o común dentro de la técnica a la cual pertenece la invención y puede aplicarse a los aspectos esenciales exhibidos antes de la siguiente manera en el alcance de las reivindicaciones anexa.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un proceso para Controlar la cantidad de ácido siálico presente en una cadena lateral de oligosacárido de una glicoproteína producida por cultivo de células de mamíferos el cual comprende: i) adicionar un ácido alcanóico o una sal del mismo al cultivo celular a una concentración de aproximadamente 0.1 mM a alrededor de 20 M; y ii) mantener la osmolalidad del cultivo de células de aproximadamente 250 a alrededor de 600 mOsm.
2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cantidad de ácido siálico presente en la cadena lateral de oligosacárido de la glicoproteína se incrementa y en donde: la productividad específica de células del cultivo celular disminuye cultivando la célula huésped a una concentración de ácido alcanóico o sal del mismo de aproximadamente 0.1 a alrededor de 6 mM y mantener la osmolalidad a aproximadamente 300-450 mOsm.
3. El proceso de la reivindicación 2, en el cual la célula huésped es una célula de OHC.
4. El proceso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el ácido alcanoico o sal del mismo es butirato de sodio.
5. El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la glicoproteína producida es una glicoproteína de mamíferos.
6. El proceso de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la glicoproteína es una quimera de receptor de factor de necrosis tumoral-inmunoglobulina.
7. El proceso de la reivindicación 6, en el cual la célula huésped es una línea celular dp12.OHC transfectada con el vector que porta el ADNc que codifica una quimera de receptor de factor de necrosis tumoral-inmunoglobulina.
8. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde disminuye la cantidad de ácido siálico presente en la cadena lateral de oligosacárido de la glicoproteína y en donde: la productividad específica de células del cultivo celular se incrementa cultivando la célula huésped a una concentración de aproximadamente 6 mM a alrededor de 12 mM del ácido alcanoico o sal del mismo y mantiene la osmolalidad a aproximadamente 450-600 mOsm.
9. El proceso de la reivindicación 8, en el cual la célula huésped es una célula de OHC.
10. El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el ácido alcanoico o sal del mismo es butirato de sodio.
11. El proceso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la glicoproteína producida es una glicoproteína de mamíferos.
12. El proceso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la glicoproteína es una quimera de receptor de factor de necrosis tumoral-inmunoglobulina.
13. El proceso de la reivindicación 14, en el cual la célula huésped es una línea celular dp12.OHC transfectada con el vector que porta el ADNc para quimera de RFNT1-lgd.
14 Un proceso para producir una proteína quimérica de receptor de factor de necrosis tumoral-inmunoglobulina RFNT1-lgG? que comprende a) cultivar una célula huésped de mamífero que expresa una quimera de RFNT-IG en una fase de crecimiento bajo dichas condiciones y durante un período tal que el se logra el crecimiento máximo de la célula, b) cultivar la célula huésped en una fase de producción en presencia de butirato de sodio a una concentración de aproximadamente 6 mM a alrededor de 12 mM, c) mantener la osmola dad de la fase de producción de aproximadamente 450-600 mOsm
15 Un proceso para producir una proteína quimérica de receptor de factor de necrosis tumoral-inmunoglobulina RFNT1-lgd que comprende a) cultivar una célula huésped de mamífero que expresa una quimera de RFNT-IG en una fase de crecimiento bajo dichas condiciones y durante un período tal que el se logra el crecimiento máximo de la célula, b) cultivar la célula huésped en una fase de producción en presencia de butirato de sodio a una concentración de aproximadamente 1 mM a alrededor de 6 mM, c) mantener la osmola dad de la fase de producción de aproximadamente 300-450 mOsm
16 El proceso de la reivindicación 15, en el cual la célula huésped es una célula de OHC
17. El proceso de la reivindicación 16, en el cual la célula huésped es una línea de dp12.OHC.
18. Una preparación que comprende el RFNT1-lgG? producido mediante el proceso de la reivindicación 17.
19. Una composición terapéutica que comprende el RFNT1- Igd producido por el proceso de la reivindicación 15, y un excipiente farmacéuticamente aceptable del mismo.
20. Una preparación de RFNT1-lgG? que comprende moléculas de RFNT1-lgd en donde las moléculas de RFNTI-lgd tienen una relación molar de ácido siálico a proteína de aproximadamente 4-7.
21. Una preparación de RFNTI-lgG-, que comprende moléculas de RFNTI-lgd en donde las moléculas de RFNT1-lgd tienen aproximadamente 1-2 moles de residuos de N-acetilglucosamina por mol de proteína de RFNT1-lgG?.
22. Una preparación de RFNTI-lgG., que comprende moléculas de RFNT1-lgd en donde las moléculas de RFNT1-lgd tienen una relación molar de ácido siálico a N-acetilglucosamina de aproximadamente 0.35 a alrededor de 0.5.
23. La preparación de RFNT1-lgG» de la reivindicación 22, en donde la relación molar de ácido siálico a N-acetilglucosamina es de aproximadamente 0.39 a alrededor de 0.45.