MXPA97009390A - Cistatina e humana - Google Patents

Abstract

Se describe un polipéptido CysE humano y el ADN (ARN) que codifica para tal polipéptido. También se proporciona un procedimientopara producir tal polipéptido por técnicas recombinantes. También se describen los métodos para utilizar polipéptido para tratar la osteoporosis, metástasis tumoral, infecciones microbianas, infecciones virales, choque séptico, inflamación, irritación genital, caries, caquexia y debilitameiento muscular. También se describen los métodos de diagnóstico para detectar mutaciones en la secuencia codificadora y alteraciones en la concentración de los polipéptidos en una muestra derivada de un huésped.

Description

CISTATINA E HUMANA Esta invención se relaciona con polinucleótidos recientemente identificados, los polipéptidos codificados por tales polinucleótidos y el uso de tales polinucleótidos y polipéptidos, así como con la producción de tales polinucleótidos y polipéptidos. De manera más particular, el polipéptido de la presente invención ha sido identificado putativamente como cistatina E humana, algunas veces aquí refereida como "CysE". La invención también se relaciona con la inhibición de la acción de tales polipéptidos. La superfamilia de la cistatina comprende un grupo de inhibidores de la cisteína proteinasa, los cuales se encuentran ampliamente distribuidos en los tejidos y fluidos corporales humanos, y que forman complejos fuertes e irreversibles con la cisteína proteinasas tales como las catepsinas B, H, L y S. Las cistatinas están muy probablemente implicadas en la regulación de los procesos normales o patológicos en los cuales participan esas proteinasas. De este modo, las cistatinas pueden influenciar el catabolismo intra o extracelular de proteínas y péptidos Barret, A.J. y Kirch e, H., Methods Enzymol . , 80:535-561 (1981)), regulan los procesos proteolíticos de las prohormonas (Orlowski, M., Mol. Cell. Biochep , 52:49-74 (1983)) y proenzimas (Taugner, R., et al., Histochemistry, REF: 26204 83:103-108 (1985)), protegen contra la penetración de los tejidos normales por células malignas (Sloane, B. F., Semin. Cáncer Biol., 1:137-152 (1990)) o microorganismos (Bjorck, L., et al., Nature, 337:385-386 (1989) y Bjorck, L., et al., J. Virol., 64:941-943 (1990)) y modulan los procesos inflamatorios normales en la artritis reumatoide (Mort, J.S., et al., Arthritis Rheum., 27:509-515 (1984)) y la bronquiectasis purulenta (Buttle, D.J., et al., Scand. J. Clin. Lab. Invest., 50:509-516 (1990) ) La superfamilia de la cistatina ha sido subdividida en familias I, II y III (también llamadas familias de la estefina, cistatina y quininógeno, respectivamente) , cada una con miembros que difieren de los de las otras familias en organización estructural y distribución biológica (Barret, A.J., et al., Biochem. J., 236:312 (1986)). Las cistatinas A y B de la familia I son proteínas pequeñas que consisten de cadenas polipeptídicas únicas de aproximadamente 100 aminoácidos residuales sin puente disulfuro. Las cistatinas de la familia II consisten de cadenas polipeptídicas de aproximadamente 120 aminoácidos residuales con dos enlaces disulfuro intracadena. Finalmente, las cistatinas de la familia III, los quininógenos, presentan un mayor grado de complejidad estructural caracterizado por la presencia de tres dominios similares a los de las cistatinas de la familia II, cada uno con dos puentes disulfuro en posiciones homologas a aquellas en las cistatinas de la familia II (Muller-Esterl, W., et al., Transbiochem. Sci . , 11:336-339 (1986)). Las cistatinas de las familias I y II están principalmente presentes intracelularmente y en* fluidos secretorios (Abrahamson, M., et al., J. Biol. Chem., 261:11282-11289 (1986)), mientras que los quininógenos están altamente concentrados en el plasma sanguíneo (Adam, A. , et al., Clin. Chem., 31:423-426 (1985)). Al menos una cistatina del tipo II, designada como cistatina C, parece expresarse en todos los tejidos (Abrahamson, M., et al., Biochem. J., 268:287-294 (1990)). En contraste, las cistatinas del tipo S, se encuentran predominantemente en la saliva. (Abrahamson, M., et al., J. Biol. Chem., 261:11282-11289 (1986)). Las cistatinas y péptidos derivados poseen actividades antibacteriana y antiviral (Bjorck, et al. (1989, 1990)), consistentes con su presencia en secreciones que bañan las superficies epiteliales directamente expuestas al ambiente. Las cistatinas también pueden modular la respuesta inmune. Esto podría ocurrir directamente, por la inhibición de las cisteína proteasas liberadas por los macrófagos (Bieth, J., Cysteine Proteinases and Their Inhibitors, V. Turk, ed (Walter De Gruyter & Company, New York) pp. 693-703 (1986)), o indirectamente, por la inhibición de la respuesta quimiotáxica y las ráfagas respiratorias asociadas con la fagocitosis de las células (Leung-Tack, et al. Biol. Chem., 371:255-258 (1990)). Estos datos sugieren que las cistatinas del tipo II pueden efectuar una variedad de funciones protectoras en las superficies epiteliales. La familia del gen de la cistatina del tipo II humana, consiste de al menos siete miembros. La angiopatía amiloide relacionada con la cistatina C hereditaria (HCCAA) es una enfermedad asociada con una mutación Glu -» Leu en el gen que codifica para la cistatina C. Esta conduce a la deposición de fibrillas amiloides comprendidas de esta cistatina C mutante en las arterias cerebrales, la cual parece causar hemorragias fatales (Ghiso, J., et al., PNAS, EUA, 83:2974-2978 (1986)). El polipéptido de la presente invención ha sido putativamente identificado como una CysE como resultado de la homología de la secuencia de aminoácidos .con la cistatina C. Esta identificación se ha hecho como resultado de la homología de la secuencia de aminoácidos. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan un polipéptido maduro novedoso, así como fragmentos, análogos y derivados del mismo biológicamente activos y útiles en diagnóstico o terapéuticamente. El polipéptido de la presente invención es de origen humano. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para un polipéptido de la presente invención, incluyendo ARNm, ADN, ADNc, ADN genómico así como los análogos y fragmentos de los mismos biológicamente activos y útiles en diagnóstico o terapéuticamente. De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporcionan un proceso para producir tal polipéptido por técnicas recombinantes, que comprenden cultivar células huésped procarióticas y/o eucarióticas recombinantes, que contienen una secuencia de ácido nucleico humano que codifica para un polipéptido de la presente invención, bajo condiciones que promueven la expresión de la proteína y la recuperación subsecuente de tal proteína. De acuerdo con un aspecto más de la presente invención, se proporciona un procesos para utilizar tal polipéptido, o polinucleótido que codifican para tal polipéptido para propósitos terapéuticos por ejemplo, para inhibir las catepsinas y prevenir la osteoporosis, metástasis tumoral, reproducción viral, inflamación, bronquiectasis purulenta para proteger la retina, para prevenir la leucoencefalopatía, para reducir la caries, para tratar reacciones alérgicas, para tratar la caquexia y debilitamiento muscular, y para prevenir la amiloidosis, y como un agente antimicrobiano. De acuerdo con otro aspecto aún más de la presente invención, también se proporcionan sondas de ácido nucleico que comprenden moléculas de ácido nucleico de suficiente longitud para hibridarse específicamente a las secuencias de ácido nucleico que codifican para el polipéptido de la presente invención. De acuerdo con un aspecto aún más de la presente invención, se proporcionan anticuerpos contra tales polipéptidos. De acuerdo con otro aspecto aún más de la presente invención, se proporcionan ensayos de diagnóstico para detectar enfermedades o susceptibilidad a enfermedades relacionadas con mutaciones en las secuencias de ácido nucleico que codifican para un polipéptido de la presente invención. De acuerdo con otro aspecto aún más de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar tales polipéptidos, o polinucleótidos que codifican para tales polipéptidos, para propósitos in vitro relacionados con la investigación científica, por ejemplo, síntesis de ADN y manufactura de vectores de ADN. Esos y otros aspectos de la presente invención serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. Los siguientes dibujos son ilustrativos de las modalidades de la invención y por lo tanto no limitan el alcance de la invención que es abarcada por las reivindicaciones.

La Figura 1 ilustra la secuencia de ADNc y del aminoácido deducido correspondiente del polipéptido de la presente invención. Se usaron las abreviaciones estándar de una letra para los aminoácidos. El secuenciamiento se efectuó usando un secuenciador de ADN automatizado 373 (Applied Biosystems, Inc.). La Figura 2 ilustra la homología de la secuencia de aminoácidos entre el polipéptido de la presente invención (línea superior) y la cistatina C humana (línea inferior) . De acuerdo con un aspecto de la presente invención,, se proporciona un ácido nucleico (polinucleótido) aislado, el cual codifica para el polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ ID NO: 2) o para el polipéptido maduro codificado por el ADNc de la clona depositada con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, y el Depósito ATCC No. 97156 asignado el 22 de Mayo de 1995. El polinucleótido de esta invención fue descubierto en una biblioteca de ADNc derivada de células amnióticas del cultivo primario. Este está estructuralmente relacionado con la superfaptilia de la cistatina II. Contiene un marco de lectura abierta que codifica para una proteína de 149 aminoácidos residuales de localización cuales aproximadamente los primeros 28 aminoácidos residuales son la secuencia, líder putativa, de modo que la proteína madura comprende 121 aminoácidos. La proteína exhibe el más alto de homología con la cistatina C humana con un 34.228% de identidad y un 46.980% de similitud sobre una extensión de 149 aminoácidos. El polinucleótido de la presente invención puede estar en forma de ARN o en forma de ADN, ADN el cual incluye al ADNc, ADN genómico, y ADN sintético. El ADN puede ser de doble hebra o de una sola hebra, y si es de una sola hebra puede ser la hebra codificadora o la hebra no codificadora (antisentido) . La secuencia codificadora que codifica para el polipéptido maduro puede ser idéntica a la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 (SEQ. ID. NO:l) o a la de la clona depositada o puede ser una secuencia codificadora diferente, secuencia codificadora la cual, como resultado de la redundancia o degeneración del código- genético, codifique para el mismo polipéptido maduro que el ADN de la Figura 1 (SEQ. ID. NO:l) o el ADNc depositado. El polinucleótido que codifica para el polipéptido maduro de la Figura 1 (SEQ. ID. NO:2) o para el polipéptido maduro codificado por el ADNc depositado puede incluir, pero no se limita a: únicamente la secuencia codificadora para el polipéptido maduro; la secuencia codificadora para el polipéptido maduro y la secuencia codificadora adicional tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia de proproteína; la secuencia codificadora para el polipéptido maduro (y de manera opcional una secuencia codificadora adicional) y la secuencia no codificadora, tales como intrones o la secuencia no codificadora 5' y/o 3' de la secuencia codificadora para el polipéptido maduro. De este modo, el término "polinucleótido que codifica para un polipéptido" abarca un polinucleótido, el cual incluye únicamente la secuencia codificadora para el polipéptido así como un polinucleótido el cual incluye secuencias codificadora y/o no codificadora adicionales. La presente invención se relaciona además con las variantes de los polinucleótidos descritos aqui anteriormente, los cuales codifican para fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ. ID. NO:2) o el polipéptido codificado por el ADNc de la clona depositada. La variante del polinucleótido puede ser una variante alélica del polinucleótido que se encuentre en la naturaleza o una variante no natural de polinucleótido. De este modo, la presente invención incluye los polinucleótidos-- qµe codifican para el mismo polipéptido maduro como se muestra en la Figura 1 (SEQ. ID. NO:2) o el mismo polipéptido maduro codificado por el ADNc de la clona depositada así como las variantes de tales polinucleótidos cuyas variantes codifican para un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ. ID. N0:2) o el polipéptids codificado por el ADNc de la clona depositada. Tales variantes nucleotídicas incluyen variantes de supresión, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción. Como se indicó aquí anteriormente, el polinucleótido puede tener una secuencia codificadora la cual es una variante alélica natural de la secuencia codificadora mostrada en la Figura 1 (SEQ. ID. NO:l) o la secuencia codificadora de la clona depositada. Como se sabe en la técnica, una variante alélica es una forma alternativa de una secuencia polinucleotídica que puede tener una sustitución, supresión o adición de uno o más nucleótidos, los cuales no alteran sustancialmente la función del polipéptido codificado. La presente invención también incluye a los polinucleótidos, en donde la secuencia codificadora para el polipéptido maduro puede estar fusionada en el mismo marco de lectura a una secuencia polinucleotídica que ayuda a la expresión y secreción de un polipéptido de una célula huésped, por ejemplo, una secuencia líder la cual funciona como una secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia líder es una preproteína y puede tener la secuencia líder escindida por la célula huésped para formar la forma madura del polipéptido. Los polinucleótidos pueden también codificar para una proproteína la cual es la proteína madura más aminoácidos residuales 5' adicionales. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína y es una forma inactiva de la proteína. Una vez que la prosecuencia es escindida, permanece una proteína madura activa. De este modo, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar para una proteína madura, o para una proteína que tiene una prosecuencia o para una proteína que tiene tanto una prosecuencia como una presecuencia (secuencia líder) . Los polinucleótidos de la presente invención también puede tener la secuencia codificadora fusionada en el marco a una secuencia marcadora la cual permite la purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser una marca de hexahistidina suministrada por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación del polipéptido maduro fusionado al marcador en el caso de un huésped bacteriano, o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser una marca de hemaglutinina (HA) cuando se usa un huésped mamífero, por ejemplo, células COS-7. La marca HA corresponde a un epitopo derivado de la proteína de la hemaglutinina de la influenza (Wilson, I . , et al., Cell, 37:767 (1984)) . El término "gen" significa el segmento de ADN implicado en la producción de una cadena polipeptídica; este incluye las regiones que preceden y siguen a la región codificadora (líder y trasera) así como las secuencias interventoras (intrones) entre los segmentos codificadores individuales (exones) . Los fragmentos del gen de la CysE de longitud completa pueden ser usados como sonda de hibridación para una biblioteca de ADNc para aislar el gen de la CysE de longitud completa y para aislar otros genes que tienen una alta similitud de secuencia con el gen de la CysE o actividad biológica similar. Las sondas de este tipo preferiblemente tienen al menos 30 bases y pueden contener, por ejemplo, 50 o más bases. La sonda también puede ser usada para identificar una clona de ADNc que corresponde a una transcripto de longitud completa y una clona o clonas genómicas que contengan el gen de la CysE completo, incluyendo las regiones reguladora y promotora, exones, e intrones. Un ejemplo de una selección comprende aislar la región codificadora del gen de la CysE usando la secuencia de ADN conocida para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Los oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria a la del gen de la presente invención se usaron para seleccionar una biblioteca de ADNc humano, ADN genómico o ARNm para determinar cuáles miembros de la biblioteca se hibridan a la sonda.

La presente invención se relaciona además con los polinucleótidos que se hibridan a las secuencias descritas aquí anteriormente si existe al menos 70%, de manera preferible al menos 90%, y de manera más preferible al menos 95% de identidad entre las secuencias. La presente invención se relaciona particularmente con los polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones estrictas a los polinucleótidos descritos aquí anteriormente. Como se usa aquí, el término "condiciones estrictas" significa que la hibridación ocurrirá únicamente si existe al menos 95% y de manera preferible al menos 97% de identidad entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridan a los polinucleótidos descritos aquí anteriormente en una modalidad preferida codifican para polipéptidos los cuales retienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por los ADNc de la Figura 1 (SEQ. ID. NO:l) o los ADNc depositados. De manera alternativa, el polinucleótido puede tener al menos 20 bases. De manera preferible 30 bases, y de manera más preferible al menos 50 bases, el cual se hibrida a un polinucleótido de la presente invención y que tiene una identidad hasta ahora, como se describió aquí anteriormente, y que puede o no retener la actividad. Por ejemplo, tales polinucleótidos pueden ser empleados como sondas para el polinucleótido de la SEQ. ID. NO:l, por ejemplo, para recuperar el polinucleótido o como una sonda de diagnóstico o como un cebador de PCR. De este modo, la presente invención está dirigida a polinucleótidos que tiene al menos una identidad del 70%, de manera preferible al menos 90% y de manera más preferible al menos 95% de identidad con el polinucleótido que codifica para el polipéptido de la SEQ. ID. NO: 2, así como los fragmentos del mismo, fragmentos los cuales tienen al menos 30 bases y de manera preferible al menos 50 bases y con los? polipéptidos codificados por tales polinucleótidos. Los depósitos a los que se hace referencia aqui serán mantenidos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para propósitos de Procedimientos de Patentes. Esos depósitos se proporcionan únicamente por conveniencia para aquellos expertos en la técnica y no se admite que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C. § 112. La secuencia de los polinucleótidos contenidos en los materiales depositados, asi como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por estos, se incorporan aquí como referencia y están bajo control en el caso de cualquier conflicto con alguna descripción de las secuencias de la presente. Puede requerirse una licencia para hacer, usar o vender los materiales depositados, y tal licencia no es otorgada por la presente.

La presente invención se relaciona además con un polipéptido CysE el cual tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 (SEQ. ID. NO: 2) o que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el ADNc depositado, así como fragmentos, análogos y derivados de tal polipéptido. Los términos "fragmento", "derivado" y "análogo" cuando se refieren al polipéptido de la Figura 1 (SEQ. ID. NO: 2) o que son codificados por el ADN depositado, significan un polipéptido que retiene esencialmente la misma función o actividad biológica que tal polipéptido. De este modo, un análogo incluye una proproteína la cual puede ser activada mediante la escisión de una porción de la proproteína para producir un polipéptido maduro activo. El polipéptido de la presente invención puede ser un polipéptido recombinante, un polipéptido natural o un polipéptido sintético, de manera preferible un polipéptido recombinante. El fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la Figura 1 (SEQ. ID. NO: 2) o que es codificado por el ADNc depositado puede, ser (i) uno en el cual uno o más de los aminoácidos residuales estén sustituidos con un aminoácido residual conservado o no conservado (de manera preferible un aminoácido residual conservado) y tal aminoácido residual sustituido puede o no ser uno codificado por el código genético, o (ii) uno en el cual uno o más de los aminoácidos residuales incluye un grupo sustituyente, o (iii) uno en el cual el polipéptido maduro está fusionado con otro compuesto, tal compuesto incrementa la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilen glicol), o (iv) uno en el cual los aminoácidos adicionales están fusionados el polipéptido maduro, tal como una secuencia líder o secretora o una secuencia la cual se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proproteína. Se considera que tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan preferiblemente en una forma aislada, y de manera preferible se purifican hasta la homogeneidad. El término "aislado" significa que el material es removido de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si este se encuentra en la naturaleza) . Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido natural presente en un animal viviente no es aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, es aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición, y aún ser aislados dado que tal vector o composición no es parte de su ambiente natural. Los polipéptidos de la presente invención incluyen el polipéptido de la SEQ. ID. N0:2 (en particular el polipéptido maduro) así como los polipéptidos que tienen al menos 70% de similitud (de manera preferible al menos 70% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. NO: 2 y de manera más preferible al menos 90% de similitud (de manera más preferible al menos 90% de identidad) con el polipéptida de la SEQ. ID. NO:2 y de manera aún más preferible al menos 95% de similitud (de manera aún más preferible al menos 95% de identidad) con el polipéptido de la SEQ. ID. NO:2 y también incluyen las porciones de tales polipéptidos con tal porción del polipéptido conteniendo generalmente al menos 30 aminoácidos y de manera más preferible al menos 50 aminoácidos . Como se sabe en la técnica la "similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos sustitutos conservados de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido. Los fragmentos o porciones de los polipéptidos de la presente invención pueden emplearse para producir el polipéptido de longitud completa correspondiente por síntesis peptídica; por lo tanto, los fragmentos pueden emplearse como intermediarios para producir los polipéptidos de longitud completa. Los fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la presente invención pueden usarse para sintetizar los polinucleótidos de longitud completa de la presente invención. La presente invención también se relaciona con vectores los cuales incluyen los polinucleótidos de la presente invención, las células huésped diseñadas genéticamente con los vectores de la invención y la producción de los polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. Las células huésped se diseñan (transducen o transforman o transfectan) genéticamente con los vectores de esta invención los cuales pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una- partícula viral, un fago, etc. Las células huésped diseñadas pueden ser cultivadas en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar los promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes de la CysE. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son aquellas previamente usadas con las células huésped seleccionadas para la expresión, y serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. Los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para producir polipéptidos por técnicas recombinantes. De este modo, por ejemplo, el polinucleótido puede ser incluido en cualquiera de una variedad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Tales vectores incluyen secuencias de ADN cromosomal, no cromosomal y sintéticas, por ejemplo, derivadas de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tal como el de vaccinia, adenovirus, virus de la viruela, y pseudorabies. Sin embargo, puede usarse cualquier otro vector en tanto sea duplicable y viable en el huésped. La secuencia de ADN apropiada puede ser insertada en el vector por una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN es insertada en un sitio de endonucleasa de restricción apropiado por los procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que tales procedimientos y otros están dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica. La secuencia de ADN en el vector de expresión está ligado operativamente a una secuencia (promotora) de control de la expresión apropiada para dirigir la síntesis de ARNm. Como ejemplos representativos de tales promotores, pueden mencionarse: el promotor LTR o SV40, el lac o trp de E. coli, el promotor PL del fago lambda y otros promotores que se sabe controlan la expresión de los genes en células procarióticas o eucarióticas o sus virus. El vector de expresión también contienen un sitio de unión ribosomal para iniciar la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Además, los vectores de expresión preferiblemente contienen uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de las células huésped transformadas tales como la resistencia a dihidrofolato reductasa o neomicina para los cultivos de células eucarióticas, o tales como la resistencia a la tetraciclina o ampicilina en E. coli. El vector que contiene la secuencia de ADN apropiada como se mencionó aquí anteriormente, así como una secuencia promotora o de control apropiada, pueden emplearse para transformar un huésped apropiado para permitir que el huésped exprese la proteína. Como ejemplos representativos de los huéspedes apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, tales como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células de fungo, tales como levaduras; células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS o melanoma de Bowes; adenovirus; células de plantas, etc. Se considera que la selección de un huésped apropiado está dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. De manera más particular, la presente invención también incluye constructos recombinantes que comprenden una o más de las secuencias ampliamente descritas anteriormente. Los constructos comprenden un vector, tal como un plásmido o vector viral, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación hacia adelante o invertida. En un aspecto preferido de esta modalidad, el constructo comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor, ligado de manera operable a la secuencia. Un gran número de vectores y promotores adecuados son conocidos por aquellos expertos en la técnica, y se encuentran comercialmente disponibles. Los siguientes vectores se proporcionan a manera de ejemplo; Bacterianos: PQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen) , pBS, pDlO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene) ; ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); Eucarióticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia) . Sin embargo, pueden usarse cualesquier otros plásmidos o vectores en tanto sean duplicables y viables en el huésped. Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables.

Dos vectores apropiados son el pKK232-8 y el pCM7. Los promotores bacterianos particularmente nombrados incluyen al lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda PR, PL y trp. Los promotores eucarióticos incluyen al CMV primario inmediato, timidina cinasa de HSV, SV40 primario y tardío, el LTR de retrovirus, y metalotioneína I de ratón. La selección del vector y promotor apropiado también está dentro del nivel de un experto en la técnica. En una modalidad más, la presente invención se relaciona con células huésped que contienen los constructos descritos anteriormente. La célula huésped puede ser una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, u una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o la célula huésped puede ser una célula procariótica, tal como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula huésped puede efectuarse por transfección con fosfato de calcio, transfección medida por DEAE-Dextran, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Métodos Básicos en Biología Molecular, (1986)). Los constructos en las células huésped pueden usarse de manera convencional para producir el producto genético codificado por la secuencia recombinante. De manera alternativa, los polipéptidos de la invención pueden ser producidos sintéticamente por sintetizadores peptídicos convencionales.

Las proteínas maduras pueden ser expresadas en células de mamífero, levadura, bacteria u otras células bajo el control de los promotores apropiados. También pueden emplearse sistemas de traducción libres de células para producir tales proteínas usando ARN derivados de los constructos de ADN de la presente invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para usarse con los huéspedes procarióticos y eucarióticos se describen en Sambrook, et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), la descripción del cual se incorpora aquí como referencia. La transcripción del ADN que codifica para los polipéptidos de la presente invención por eucariotes superiores se incrementa insertando una secuencia amplificadora en el vector. Los amplificadores son elementos que actúan en la posición cis del ADN, usualmente alrededor de 10 a 300 pb que actúan sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los ejemplos incluyen el amplificador de SV40 en el lado final del origen de duplicación de 100 a 270 pb, un amplificador del promotor primario del citomegalovirus, el amplificador del polioma en el lado final del origen de duplicación, y amplificadores de adenovirus.

De manera general, los vectores de expresión recombinantes incluirán los orígenes de duplicación y marcadores seleccionables que permitan la transformación de la célula huésped, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción de una secuencia estructural corriente abajo. Tales promotores pueden derivarse de operones que codifican para enzimas glicolíticas tales como la 3-fosfoglicerato cinasa (PGK) , factor a, fosfatasa acida, o proteínas de choque térmico, entre otras. Las secuencias estructurales heterólogas se montan en la fase apropiada con secuencias de inicio y terminación de la traducción, y de manera preferible, una secuencia líder capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida en el espacio periplásmico o medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión incluyendo un péptido de identificación N-terminal que imparte las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada del producto recombinante expresado. Los vectores de expresión útiles para uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de ADN estructural que codifica para una proteína deseada junto con señales de inicio y terminación de la traducción adecuadas en la fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables, fenotípicos, y un origen de duplicación para asegurar el mantenimiento del vector y para, si es deseable, proporcionar amplificación dentro de huésped. Las células procarióticas adecuadas para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y varias especies dentro del género Pseudomonas, Streptomyces, y Straphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como materia de elección. Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de duplicación bacteriano derivado de plásmidos comercialmente disponibles que comprende elementos del vector de clonación pBR322 (ATCC 37017) bien conocido. Tales Vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suiza) y GEMÍ (Promega Biotec, Madison, Wl, USA) . Esas secciones del "esqueleto" del pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural a ser expresada. Después de la transformación de una cepa huésped adecuada y el crecimiento de la cepa huésped a una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado es inducido por medios apropiados (por ejemplo, desviación de la temperatura o inducción química) y las células se cultivan durante un periodo adicional. Las células se cosechan típicamente por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para purificación adicional. Las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas pueden ser rotas por cualquier método conveniente, incluyendo el ciclo de congelamiento-descongelamiento, sonicación, rompimiento mecánico, o el uso de agentes Usantes de células, tales métodos son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. También pueden emplearse varios sistemas de cultivo de células de mamífero para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen los linajes COS-7 de los fibroblastos de riñon de mono, descritos por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otros linajes celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, los linajes celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de duplicación, un promotor y amplificador adecuados, y también cualesquier sitios de unión riboso al necesarios, un sitio de poliadenilación, sitios donadores y receptores de empalmes, secuencias de terminación transcripcional, y secuencias no transcriptas flanqueantes 5' . Las secuencias de ADN derivadas del empalme de SV 0, y los sitios de poliadenilación pueden usarse para proporcionar los elementos genéticos no transcriptos requeridos. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser recuperados y purificados de los cultivos celulares recombinantes por métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción acida, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía sobre fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de afinidad, cromatografía sobre hidroxilapatita y cromatografía sobre lectina. Pueden usarse pasos de replegamiento de proteína, según sea necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse cromatografía líquida de alta resolución (CLAP) para los pasos de purificación finales. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser un producto purificado naturalmente, o un producto de procedimientos sintéticos químicos, o producido por técnicas recombinantes a partir de un huésped procariótico o eucariótico, (por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, plantas superiores, insecto y mamífero en cultivo) . Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden no estar glicosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir un aminoácido residual metionina inicial. El polipéptido CysE de la presente invención puede emplearse para inhibir las enzimas catepsinas humanas y las patologías resultantes relacionadas con la acción de esas catepsinas. Por ejemplo, el CysE puede emplearse para tratar la osteoporosis, enfermedad de behcet, hipercalcemia, osteomalicia, enfermedades alérgicas de la piel, rinitis alérgica y púrpura alérgica. También se piensa que las catepsinas juegan un papel vital en la metástasis de tumores y, en consecuencia, el CysE puede emplearse para prevenir las metástasis tumorales. El polipéptido CysE puede ser empleado como un agente antimicrobiano para detener el crecimiento de ciertos agentes microbianos, por ejemplo, estreptococos y para reducir la caries dental al reducir la producción de los ácidos que contribuyen a la caries. El polipéptido CysE también puede ser empleado como un agente antiviral para tratar la infección causada por virus, por ejemplo, para prevenir la reproducción del virus del herpes simple (HSV) . El polipéptido CysE también puede ser empleado para proteger la retina contra el ataque posición las cisteína proteinasas.

El polipéptido CysE de la presente invención también puede ser empleado para tratar la caquexia y debilitamiento muscular mediante la prevención de la acción de las cisteína proteinasas. El polipéptido CysE también puede ser empleado para modificar la inflamación, por ejemplo, que se asocia con la artritis reumatoide, y para tratar el choque séptico. El polipéptido CysE también puede ser empleado para tratar la bronquiectasis purulenta. El polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención pueden emplearse como reactivos y materiales de investigación para descubrir tratamientos y diagnóstico» para enfermedades humanas. Esta invención proporciona métodos para la identificación del receptor del polipéptido de la cistatina E. El gen que codifica para el receptor puede ser identificado por numerosos métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, selección del ligando y clasificación por FACS (Coligan, et al., Current Protocols in Immun., 1(2), Capítulo 5, (1991)). De manera preferible, se emplea la clonación de expresión en donde se prepara ARN poliadenilado a partir de una célula que responde al polipéptido de la cistatina E, y una biblioteca de ADNc creada para este ARN se divide en porciones y se usa para transfectar células COS u otras células que no responden al polipéptido de la cistatina E. Las células transfectadas que crecen sobre placas de vidrio se exponen al polipéptido de la cistatina E marcado. El polipéptido de la cistatina E puede ser marcado por una variedad de medios incluyendo yodación o inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína cinasa específica del sitio. Después de la fijación e incubación, las placas se someten a análisis autorradiográfico. Las porciones positivas se identifican y se preparan subporciones y se transfectan usando un subporción iterativa y proceso de reselección, produciendo eventualmente una sola clona que codifica para el receptor putativo. Como un método alternativo para la identificación del receptor, el ligando marcado puede ser ligado por fotoafinidad con membrana celular o preparaciones de extracto que expresen la molécula receptora. El material reticulado se resolvió por PAGE y se expuso a una película de rayos X. El complejo marcado que contenía el ligando-receptor pudo ser escindido, se resolvió en fragmentos peptídicos, y se sometió a microsecuenciamiento de proteína. La secuencia de aminoácidos obtenida del microsecuenciamiento podría usarse para diseñar un conjunto de sondas oligonucleotídicas degeneradas para seleccionar una biblioteca de ADNc para identificar el gen que codifica para el receptor putativo. Esta invención proporciona un método para seleccionar compuestos para identificar aquellos que se unen al receptor de la cistatina E e inducen la respuesta de un segundo mensajero del mismo. Como un ejemplo, se incuba una célula de mamífero o preparación de membrana que expresa el receptor de la cistatina E en presencia del compuesto a ser seleccionado. Se mide y compara la respuesta de un sistema de un segundo mensajero conocido después de la interacción del compuesto y el receptor con la respuesta del segundo mensajero inducida por la cistatina E. Tales sistemas de segundo mensajero incluyen pero no se limitan a, AMPc guanilato ciclasa, canales iónicos o hidrólisis de fosfoinositida. El polipéptido de la presente invención y los compuestos agonistas pueden ensayarse por su capacidad para inhibir la actividad de cisteína proteinasa, ensayos los cuales comprenden determinar las constantes de equilibrio para la disociación (KA) de los complejos de cistatina E con papaína y catepsina B, por ensayos de velocidad continuos con Z-Phe-Arg-NHMec 10 µM como sustrato en amortiguador de fosfato de sodio 100 M (Nicklin, M. J. H., y Barret, A. J., Biochem, J., 223:245-253 (1984)). El amortiguador contiene ditiotreitol 1 mM y EDTA 2 mM y se ajustó a pH 6.5 para el ensayo de papaína y a pH 6.0 para los ensayos de catepsina B. La catepsina B se preincubó durante 20 minutos en amortiguador de ensayo a temperatura ambiente antes de su uso. Las concentraciones de enzima en los ensayos son de 0.05-0.25 nM. La concentración de cistatina E más alta ensayada en los ensayos de catepsina B es de 100 nM. Las concentraciones de inhibidor que dan inhibición informativa, es decir, que dan como resultado una nueva velocidad en estado estacionario 1 hora después de la adición de inhibidor, fueron 20-50 nM en los ensayos de papaína. La hidrólisis del sustrato a 37°C se verificó en un fluorómetro Perkin-Elmer Cetus LS50 a longitudes de onda de excitación y emisión de 360 a 460 nm, respectivamente. Los valores de Ka para la hidrólisis de Z-Phe-Arg-NHMec bajo el ensayo se usaron para compensar los valores de K± aparente obtenidos para la disociación del inhibidor inducida por el sustrato, por la relación: K± Aparente = K±(l + [S] /W,) . Los polipéptidos de la presente invención y los compuestos agonistas pueden emplearse en combinación con un portador farmacéuticamente adecuado. Tales composiciones incluyen una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido o agonista y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal portador incluye pero no se limita a solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. La formulación deberá diseñarse de acuerdo al modo de administración. La invención también proporciona un paquete o equipo farmacéutico que comprende uno o más recipientes llenados con uno o más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la invención. Asociada con tales recipientes puede estar una nota de la forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la manufactura, uso o venta de fármacos o productos biológicos, nota la cual refleja la aprobación por la agencia de la manufactura, uso o venta para la administración en humanos.

Además, los polipéptidos o agonistas de la presente invención pueden ser empleados en conjunto con otros compuestos terapéuticos. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse de manera conveniente tal como por las rutas oral, tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratumoral, subcutánea, intranasal o intradér ica. Las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad que es efectiva para tratar y/o la profilaxis de indicación específica. En general, las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad de al menos aproximadamente 10 µg/kg de peso corporal y en la mayoría de los casos se administrarán en una cantidad que no exceda de aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal por día. En la mayoría de los casos la dosis es de aproximadamente 10 µg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal diariamente, tomando en cuenta las rutas ele administración, síntomas, etc.

Los polipéptidos del CysE, y los compuestos agonistas, los cuales son polipéptidos, también pueden emplearse de acuerdo con la presente invención mediante la expresión de tales polipéptidos in vivo, lo cual con frecuencia se llama "terapia genética". De este modo, por ejemplo, pueden diseñarse o alterarse las células de un paciente con un polinucleótido (ADN o ARN) que codifique para el polipéptido ex vivo, las células diseñadas o modificadas son entonces proporcionadas* a un paciente a ser tratado con el polipéptido. Tales métodos-son bien conocidos en la técnica y serán evidentes a partir de las enseñanzas de aquí. Por ejemplo, las células pueden ser diseñadas o modificadas mediante el uso de una partícula retroviral que contenga el ARN que codifica para el polipéptido de la presente invención. De manera similar, pueden diseñarse o modificarse células in vivo para la expresión de un polipéptido in vivo por, por ejemplo, los procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede transducirse una célula empaquetada con un vector plasmídico retroviral que contenga ARN que codifica para un polipéptido de la presente invención de modo que la célula empaquetada produzca ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen de interés. Las células productoras pueden ser administradas a un paciente para modificar células in vivo y expresar el polipéptido in vivo.

Esos y otros métodos para administrar un polipéptido de la presente invención, por tal método serán evidentes a aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente invención. Los retrovirus a partir de los cuales los vectores plasmídicos retrovirales mencionados aquí anteriormente pueden derivarse incluyen, pero no se limitan a, Virus de la Leucemia Murina de Moloney, Virus de la Necrosis del Bazo, retrovirus tales como el Virus del Sarcoma de Rous, Virus del Sarcoma de Harvey, virus de la leucosis de las aves, virus de la leucemia del simio gibón, virus de la inmunodeficiencia humana, adenovirus, Virus del Sarcoma Mieloproliferativo, y virus del tumor de mama. En una modalidad, el vector plasmídico retroviral se deriva del Virus de la Leucemia urina de Moloney. El vector incluye uno o más promotores. Los promotores adecuados que pueden ser empleados incluyen, pero no se limitan a, el LTR retroviral; el promotor de SV40; y el promotor del citomegalovirus (CMV) humano descrito en Miller, et al., Biotechni ues, Vol. 7, No. 9, 980-990 (1989), o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales como los promotores de células eucarióticas, incluyendo, pero sin limitarse a, la histona, pol III, y promotores de ß-actina) . Otros promotores virales que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, promotores de adenovirus, promotores de timidina cinasa (TK) , y promotores del parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será evidente para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas contenidas en la presente. La secuencia de ácido nucleico que codifica para los polipéptidos de la presente invención está bajo el control de un promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, promotores adenovirales, tales como el promotor tardío mayor adenoviral; o promotores heterólogos, tales como el promotor del citomegalovirus (CMV) ; el promotor del virus sincitial respiratorio (RSV) ; promotores inducibles, tales como el promotor MMT, el promotor de la metalotioneína; promotores del. choque térmico; promotores de albúmina; el promotor ApoAI; promotores de globina humana; promotores de timidina cinasa viral, tales como el promotor de la timidina cinasa del Herpes Simplex; LTR retrovirales (incluyendo los LTR retrovirales modificados descritos aquí anteriormente) ; el promotor de ß-actina; y promotores de la hormona del crecimiento humano. El promotor también pueden ser el promotor nativo que controla al gen que codifica para el polipéptido. El vector plasmídico retroviral se emplea para transducir los linajes celulares empacados para formar linajes celulares productores. Los ejemplos de células empacadas que pueden ser transfectadas incluyen, pero no se limitan a, el PE501, PA317, ?-2, ?-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, ?CRE, ?CRIP, GP+E-86, GP+envAml2, y linajes celulares DAN como se describe en Miller, Human Gene Therapy, Vol 1, páginas 5-14 (1990), la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. El vector puede transducir las células empacadas a través de cualesquier medios conocidos en la técnica. Tales medios incluye, pero no se limitan a, electroporación, el uso de liposomas, y precipitación con CaP0. En una alternativa, el vector plasmídico retroviral puede ser encapsulado en un liposoma, o acoplado a un lípido y a continuación administrado a un huésped. El linaje celular productor genera partículas de vector retroviral infecciosas, las cuales incluyen las secuencias de ácido nucleico que codifican para los polipéptidos. Tales partículas de vector retroviral pueden entonces ser empleadas, para transducir células eucarióticas, ya sea in vi tro o in vivo. Las células eucarióticas transducidas expresaran la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido. Las células eucarióticas que pueden ser transducidas incluyen, pero no se limitan a, células no diferenciadas embriónicas, células de carcinoma embriónico, así como células no diferenciadas hematopoyéticas, hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células endoteliales, y células de epitelio bronquial.

La angiopatía a aloide relacionada con la cistatina C hereditaria es una enfermedad que causa hemorragias fatales, y puede asociarse con la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, enfermedad de Parkinson, demencia, y podría conducir a la muerte antes de una edad de 40 años. Esta invención, por lo tanto, se relaciona con el uso del gen de la CysE como diagnóstico. La detección de una forma mutante de la CysE permitirá un diagnóstico de una enfermedad similar a la HCCAA, que resulta de una mutación en el gen de la CysE. Los individuos que contienen mutaciones en el gen de la CysE pueden ser detectados a nivel de ADN por una variedad de técnicas. Los ácidos nucleicos para diagnóstico pueden obtenerse de células de un paciente, incluyendo pero sin limitarse a la sangre, orina, saliva, material de biopsia y autopsia. El ACN genómico puede usarse directamente para la detección o puede amplificarse enzi áticamente usando PCR (Saiki et al., Nature, 324:163-166 (1986)) antes del análisis. El ARN o ADNc también pueden ser usados para el mismo propósito. Como un ejemplo, los cebadores de PCR complementarios al ácido nucleico que codifican para la CysE pueden usarse para identificar y analizar mutaciones de la CysE. Por ejemplo, las supresiones e inserciones pueden ser detectadas por un cambio en el tamaño del producto amplificado en comparación con el genotipo normal. Las mutaciones puntuales pueden ser identificadas hibridando el ADN amplificado a ARN de la CysE marcado radioactivamente o de manera alternativa, secuencias de ADN antisentido de la CysE marcadas radioactivamente. Las secuencias perfectamente equiparadas pueden ser distinguidas de los dúplex no equiparables por digestión con RNasa A o por diferencias en la temperaturas de fusión. Las diferencias de secuencia entre el gen de referencia y el gen que tiene mutaciones pueden ser reveladas' por el método de secuenciamiento de ADN directo. Además, los segmentos de ADN clonados pueden ser empleados como sondas para detectar segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este método aumenta en gran medida cuando se combina con PCR. Por ejemplo, se usa un cebador de secuenciamiento con el producto de la PCR de doble hebra o una molécula patrón de una sola hebra generada por una PCR modificada. La determinación de la secuencia se efectúa por los procedimientos convencionales con nucleótido marcado radioactivamente o por los procedimientos de secuenciamiento automáticos con marcas fluorescentes. Las pruebas genéticas basadas en las diferencias de secuencia de ADN pueden lograrse mediante la detección de la alteración de la movilidad electroforética de fragmentos de ADN en geles con o sin agentes desnaturalizantes. Las supresiones e inserciones de secuencias pequeñas pueden visualizarse por electroforesis en gel de alta resolución. con una localización particular sobre un cromosoma humano individual. Además existe la necesidad actual de identificar sitios particulares sobre el cromosoma. Pocos reactivos que marquen cromosomas basados en los datos de secuencia actuales (polimorfismos repetidos) están actualmente disponibles para marcar lugares cromosómicos. La elaboración del mapa de los ADN para los cromosomas de acuerdo a la presente invención es un primer paso importante para correlacionar aquellas secuencias con los genes asociados con la enfermedad. De manera breve, las secuencias pueden trazarse en cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de 15-25 pb) del ADNc. El análisis por computadora de la región no traducida 3' del gen se usó para seleccionar rápidamente los cebadores que no abarcan más de un exón en el ADN geómico, complicando de este modo el proceso de amplificación. Esos cebadores se usan entonces para seleccionar por PCR híbridos de células somáticas que contienen crcp-osopias humanos individuales. Únicamente aquellos híbridos que contiene el gen humano que corresponde al cebador producirán un fragmento amplificado. El trazado por PCR de los híbridos de células somáticas es u-a procedimiento rápido para asignar un ADN particular a un cromosoma particular. Usando la presente invención con los mismos cebadores oligonucleotídicos, puede lograrse las subclonación con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o grupos grandes de clonas genómicas Los fragmentos de ADN de diferentes secuencias pueden ser distinguidos en geles de gradiente de formamida desnaturalizantes, en los cuales las movilidades de los diferentes fragmentos de ADN son retardadas en el gel en diferentes posiciones de acuerdo a sus temperaturas de fusión o fusión parcial específicas (véase, por ejemplo, Myers et al . , Science. 230:1242 (1985)). Los cambios de secuencia en lugares específicos también pueden ser revelados por ensayos de protección con nucleasa, tales como la protección con RNasa y SI y el método de escisión química (por ejemplo, Cotton et al . , PNAS, EUA, 85:4397-4401 (1985)). De este modo, la detección de una secuencia de ADN específica puede lograrse por métodos tales como la hibridación, protección con RNasa, escisión química, secuenciamiento de ADN directo o el uso de enzimas de restricción, (por ejemplo, Polimorfismo de la Longitud del Fragmento de Restricción (RFLP) ) y manchado Southern del ADN genómico. Además de la electroforesis en gel más convencional y el secuenciamiento del ADN, las mutaciones también pueden ser detectadas por análisis in si tu. Las secuencias de la presente invención son también valiosas para la identificación de cromosomas. La secuencia está dirigida al blanco específicamente y puede hibridarse en una forma análoga. Otras estrategias de trazado que pueden emplearse de igual modo para trazar el mapa para su cromosoma incluyen la hibridación in si tu, preselección con cromosomas clasificados por flujo, marcados, y preselección por hibridación de bibliotecas de ADNc específicas para construir cromosomas. La hibridación in si tu, por fluorescencia (FISH) de una clona de ADNc a una metafase cromosomal difusa puede usarse para proporcionar la localización cromosomal precisa en un paso. Esta técnica puede usarse con . ADNc tan cortos como de 50 ó 60 bases. Para una revisión de esta técnica, véase Verma et al., Cromosomas Humanos: un Manual de las Técnicas Básicas, Pergamon Press, New York (1988). Una vez que se ha trazado el mapa de la secuencia para un lugar cromosomal preciso, la posición física de la secuencia sobre el cromosoma puede correlacionarse con los datos del mapa genético. (Tales datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick, Mendelian Inhetritance in Man (disponible en línea a través de la Biblioteca Médica Welch de la Universidad Johns Hopkins) . La relación entre los genes y las enfermedades que han sido trazados en la misma región cromosomal se identifica entonces a través de análisis de enlaces (herencia de genes físicamente adyacentes) .

A continuación, es necesario determinar las diferencias en el ADNc o la secuencia genómica entre los individuos afectados y no afectados. Si se observa una mutación en algunos o todos los individuos afectados pero no en ningún individuo normal, entonces la mutación probablemente sea el agente causal de la enfermedad. Con la resolución actual y las técnicas de mapeo fisiológicamente y mapeo genético, un ADNc localizado de manera precisa en la región cromosomal asociada con la enfermedad podría ser uno de entre 50 y 500 genes causales potenciales. (Esto presupone una resolución del trazado del mapa de 1 megabase y de un gen por 20 kb) . Los polipéptidos, sus fragmentos u otros derivados, o análogos de los mismos, o células que los expresan pueden usarse como inmunógeno para producir anticuerpos para estos. Esos anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente invención también incluye anticuerpos quiméricos, de una sola cadena y humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una biblioteca de expresión de Fab. Pueden usarse varios procedimientos conocidos en la técnica para la producción de tales anticuerpos y fragmentos. Los anticuerpos generados contra los polipéptidos que corresponden a una secuencia de la presente invención pueden obtenerse por inyección directa de los polipéptidos en un animal o mediante la administración de los polipéptidos a un animal, preferiblemente no humano. El anticuerpo así obtenido se unirá entonces a los polipéptidos en sí. De esta manera, puede usarse aún una secuencia que codifica únicamente para un fragmento de los polipéptidos para generar anticuerpos que se unen a los polipéptidos nativos completos. Tales anticuerpos pueden usarse entonces para aislar el polipéptido del tejido que expresa tal polipéptido. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos continuos de linajes celulares. Los ejemplos incluyen la técnica del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al . , 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé, et al . , 1985, en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (Patente Estadounidense No. 4,946,778) pueden adaptarse para producir anticuerpos de una sola cadena para los productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención. También, pueden usarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos humanizados para los productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención. La presente invención se describirá mejor con referencia a los siguientes ejemplos; sin embargo, debe comprenderse que la presente invención no se limita a tales ejemplos. Todas las partes o cantidades, a menos que se especifique otra cosa, están en peso. Para facilitar la comprensión de los siguiente ejemplos se describirán ciertos métodos y/o términos que ocurren con frecuencia. Los "plásmidos" se designan con una p minúscula precedida y/o seguida por letras mayúsculas y/o números. Los plásmidos de partida de la presente están comercialmente disponibles, públicamente disponibles en una base no restringida, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles de acuerdo a los procedimientos publicados. Además, los plásmidos equivalentes a aquellos descritos son conocidos en la técnica y serán evidentes a aquellos expertos en la técnica. La "digestión" del ADN se refiere a la escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa únicamente en ciertas secuencias en el ADN. Las diferentes enzimas de restricción usadas aquí se encuentran comercialmente disponibles y sus condiciones de reacción, cofactores y otros requerimientos se usaron como es sabido por un experto en la técnica. Para propósitos analíticos, se usó típicamente 1 µg de plásmido o fragmentos de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente 20 µl de solución amortiguadora. Para el propósito de aislar los fragmentos de ADN para la construcción del plásmido, se digirieron típicamente de 5 a 50 µg de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen más grande. Las cantidades de amortiguadores y sustrato apropiadas para las enzimas de restricción particulares fueron las especificadas por el fabricante. De manera ordinaria se usaron tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37°C, pero pueden variar de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la digestión la reacción se sometió a electroforesis directamente sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado. La separación por tamaño de los fragmentos escindidos se efectuó usando el gel de poliacrilamida al 8 por ciento descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980) . Por "oligonucleótidos" se refiere ya sea a un polidesoxinucleótido de una sola hebra o dos hebras de polidesoxinucleótido complementarias las cuales pueden ser sintetizadas químicamente. Tales oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato 5' y de este modo no se ligarán a otro oligonucleótido sin agregar un fosfato . como un ATP en presencia de una cinasa. Un oligonucleótido sintético se ligará a un fragmento que no ha sido desfosforilado. La "ligación" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiester entre los fragmentos de ácido nucleico de dos hebras (Maniatis, T., et al., Id., p. 146). A menos que se establezca otra cosa, la ligación puede efectuarse usando los amortiguadores y condiciones conocidas con 10 unidades de ADN ligasa T4 ("ligasa") por 0.5 µg de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN a ser ligados. A menos que se establezca otra cosa, la transformación se efectuó como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973) .

Ejemplo 1 Expresión Bacteriana y Purificación de la Forma Soluble de la CysE La secuencia de ADN que codifica para la CysE, ATCC No. 97156, se amplificó inicialmente usando cebadores oligonucleotídicos de la PCR que corresponden a las secuencias 5' de la proteína CysE procesada (menos la secuencia peptídica de señal) y las secuencias del vector 3' al gen de la CysE. Se agregaron los nucleótidos adicionales que corresponden a la CysE a las secuencias 5' y 3' respectivamente. El cebador oligonucleotídico 5' ' tiene la secuencia 5' CGCCCATGGCGGCCGCAGGAG 3' (SEQ ID NO: 3) que contiene un sitio de enzimas de restricción Ncol seguido por la secuencia que codifica para la CysE comenzando desde el aminoácido terminal presumido de la proteína procesada. La secuencia 3' 5' CGCAAGCTTTCACATCTGCAAAAAGTTGGC 3' (SEQ ID NO: 4) contiene secuencias complementarias para un sitio HindIII y está seguida por la secuencia que codifica para la CysE. Los sitios de la enzima de restricción corresponden a los sitios de la enzima de restricción en el vector de expresión bacteriano pQE-9 (Qiagen, Inc. Chatsworth, CA, 91311) . El pQE-9 codifica para la resistencia a antibióticos (Ampr) , un origen de duplicación bacteriano (ori), un operador del promotor regulable por IPTG (P/O) , un sitio de unión ribosomal (RBS) , una marca de 6-His y sitios de la enzima de restricción. El pQE-9 se digirió entonces con Ncol y HindIII. Las secuencias amplificadas se ligaron al pQE-9 y se insertaron en el marco con la secuencia que codifica para la marca de histidina y el RBS. La mezcla de ligación se usó entonces para transformar la cepa de E. coli M15/rep 4 (Qiagen, Inc.) por el procedimiento descrito en Sambrook, J. et al., Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Laboratory Press, (1989) . La M15/rep4 contiene copias múltiples del plásmido pREP4, el cual expresa el represor lacl y también confiere resistencia a la kanamicina (Kanr) . Los transformantes fueron identificados por su capacidad para crecer sobre placas de LB y se seleccionaron las colonias resistentes a la ampicilina/kanamicina. El plásmido de ADN fue aislado y confirmado por análisis de restricción. Las clonas que contenían los constructos deseados se hicieron crecer durante la noche (0/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 ug/ml) y Kan (25 ug/ml) . Los cultivos O/N se usaron para inocular un cultivo grande a una relación de 1:100 a 1:250. Las células se hicieron crecer hasta una densidad óptica de 600 (D.O.600) de entre 0.4 y 0.6. A continuación se agregó IPTG ("Isopropil-B-D-tiogalacto piranósido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce por inactivación al represor lacl,' que elimina el P/O que conduce a la expresión incrementada del gen. Las células se hicieron crecer durante 3 a 4 horas extra. Las células se cosecharon a continuación por centrifugación. El sedimento celular se solubilizó en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar. Después de la clarificación, la CysE solubilizada fue purificada de esta solución por cromatografía sobre una columna de quelato de níquel, bajo condiciones que permiten una fuerte unión por las proteínas que contienen la marca 6-His (Hochuli, E. et al., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). La CysE fue eluida de la columna en guanidina HCl 6 molar, pH 5.0 y para los propósitos de renaturalización se ajustó a guanidina HCl 3 molar, fosfato de sodio lOOmM, glutatión 10 molar (reducido) y glutatión 2 molar (oxidado) . Después de la incubación en esta solución por 12 horas la proteína se dializó en fosfato de sodio 10 molar.

Ejemplo 2 Clonación y expresión de la CysE usando el sistema, de--expresión de baculovirus La secuencia de ADN que codifica para la proteina CysE de longitud completa, ATCC No. 97156, se amplificó usando cebadores oligonucleotídicos de PCR que corresponden a las secuencias 5' y 3' del gen: El cebador 5' tiene la secuencia CGCGGATCCGCCATCATGGCGCGTTCGAACCTC 3' (SEQ ID NO: 5) y que contiene un sitio de enzima de restricción BamHl (en negrillas) seguido por una señal eficiente para el inicio de la traducción en células eucarióticas (Kozak, M., J. Mol. Biol., 196:947-950 (1987) y 18 nucleótidos del gen de la CysE (el codón de inicio de la traducción "ATG" está subrayado) . El cebador 3" tiene la secuencia CGCGGATCCTCACATCTGCAAAñAGTTGGCTT (SEQ ID NO: 6) y contiene el sitio de escisión para la endonucleasa de restricción Ba-mHI y los nucleótidos complementarios a la secuencia 3' no traducida del gen de la CysE. Las secuencias amplificadas fueron aisladas de un gen de agarosa el 1% usando un equipo comercialmente disponible ("Geneclean", BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El fragmento fue digerido entonces con la endonucleasa BamHI y a continuación purificada nuevamente sobre un gel de agarosa al 1%. Este fragmento se designó como F2. Se usó el vector pA2 (modificación del vector ?VL941, discutido más adelante) para la expresión de la proteína CysE usando el sistema de expresión de baculovirust (para una revisión véase; Summers, M. D. y Smith, G. E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555) . Este vector de expresión contiene el promotor de polihedrina fuerte del virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido por los sitios de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamHI. Se usó el sitio de poliadenilación del virus de simio (SV)40 para la poliadenilación eficiente. Para una selección fácil del virus recombinante se insertó el gen de la beta-galactosidasa de E.coli en la misma orientación que el promotor de la polihedrina seguido por la señal de poliadenilación del gen de la polihedrina. Las secuencias de la polihedrina fueron flanqueadas en ambos lados por secuencias virales para la recombinación homologa mediada por la célula de ADN viral del tipo natural cotransfectado. Podrían usarse muchos otros baculovirus en lugar del pA2 tales como el pRGl pAc373, pVL941 y pAcIMl (Luckow, V. A. y Sumers, M. D., Virology, 170:31-39). El plásmido fue digerido con las enzimas de restricción BamHI y a continuación se fosforiló usando fosfatasa intestinal de carnero por los procedimientos conocidos en la técnica. A continuación se aisló el ADN de un gel de agarosa al 1% usando el equipo comercialmente disponible ("Geneclean" BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). El ADN del vector se designó como V2. El fragmento F2 y el plásmido desfosforilado V2 se ligaron con ADN ligasa T4. A continuación se transformaron células de E.coli HB101 y bacterias' identificadas que contenían el plásmido (pBacCysE) con el gen de la CysE usando las enzima de restricción BamHI. La secuencia del fragmento clonado se identificó por secuenciamiento del ADN. Se cotransfectaron 5 µg de plásmido pBacCysE con 1.0 µg de un baculovirus linealizado comercialmente disponible ("ADN de baculovirus "BaculoGoldMR", Pharmingen, San Diego, CA. ) usando el método de lipofección (Felgner et al. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 84:7413-7417 (1987)). lµg de ADN de virus BaculoGold" y 5µg del plásmido pBacCysE se mezclaron en un pozo estéril de una placa microtituladora que contenía 50 µl de medio de Grace libre de suero (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD) . Posteriormente se agregaron 10 µl de Lipofectina más 90 µl de medio de Grace, se mezcló e incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación se agregó la mezcla de transfección gota a gota a células de insecto Sf9 (ATCC CRL 1711) sembradas en una placa de cultivo tisular de 35 mm con 1 ml de medio de Grace sin suero. La placa se agitó hacia atrás y hacia adelante para mezclar la solución nuevamente agregada. La placa se incubó a continuación durante 5 horas a 27°C. 5 horas después se removió la solución de transfección de la placa y se agregó 1 ml de medio de insecto de Grace suplementado con 1% de suero de carnero fetal al 10%. La placa se colocó nuevamente en un incubador y se continuó cultivando a 27°C durante cuatro días. Cuatro días después se efectuó el ensayo de la placa de manera similar a lo descrito por Summers y Smith (supra) . Como una modificación se usó un gel de agarosa con "Azul Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg), la cual permitió un aislamiento fácil de las placas teñidas de azul. (Una descripción detallada de un "ensayo de placa" también puede encontrarse en la guía del usuario para el cultivo de células de insecto y baculovirología distribuido por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10).

Cuatro días después de la dilución en serie, se agregó el virus a las células y las placas reñidas de azul se extrajeron con la punta de una pipeta de Eppendorf. El agar que contenía los virus recombinantes fue suspendida entonces en un tubo de Eppendorf que contenía 200 µl de medio de Grace. El agar fue removido mediante una breve centrifugación y el sobrenadante que contenía el baculovirus recombinante se usó para infectar células Sf9 sembradas en discos de 35 mm. Cuatro días más tarde se cosecharon los sobrenadantes de esos discos de cultivo y a continuación se almacenaron a 4°C. Las células Sf9 se hicieron crecer en medio de Grace suplementado con 10% de FBS inactivado por calor. Las células fueron infectadas con el baculovirus recombinante V-CysE a una multiplicidad de infección (MOI) de 2. Seis horas más tarde se removió el medio y se colocó nuevamente con medio SF900 II menos metionina y cisteína (Life Technologies Inc., Gaithersburg). 42 horas después se agregaron 5 µCi de 3S-metionina y 5 µCi de 35S cisteína (Amersham) . Las células se incubaron adicionalmente durante 16 horas antes de ser cosechadas por centrifugación y las proteínas marcadas se visualizaron por SDS-PAGE y autorradiografía.

Ejepplo 3 Expresión de la CysE Recambinante en células COS La expresión del plásmido, CysE HA se derivó de un vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contenía: 1) el origen de duplicación del SV40, 2) el gen de resistencia a la ampicilina, 3) el origen de duplicación de E.coli, 4) el promotor CMV seguido por una región polienlazante, un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. Se clonó un fragmento de ADN que codifica para el precursor de la CysE completo y una marca de HA fusionada en el marco en su extremo 3* en una región polienlazante del vector, por lo tanto, la expresión de la proteína recombinante fue dirigida bajo el promotor de CMV. La marca de HA corresponde a un epitopo derivado de la proteína hemaglutinina de la influenza como se describió anteriormente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly, y R. Lerner, 1984, Cell 37:767, (1984)). La infusión de la marca de HA a la proteína objetivo permite la fácil detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epitopo HA. La estrategia de construcción del plásmido se describe como sigue: La secuencia de ADN que codifica para la CysE, ATCC No. 97156, se construyó por PCR sobre el EST original clonado usando dos cebadores: el cebador 5' 5' GCGCGGATCCACCATGGCGCGTTCG 3' (SEQ ID NO: 7) que contiene un sitio BamHI seguido por 12 nucleótidos de la secuencia que codifica para la CysE comenzando desde el codón de inicio; la secuencia 3' 5' GCGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTACAT CTGCACAAA 3' (SEQ ID NO: 8) que contiene las secuencias complementarias para un sitio Xbal, el codón de alto de traducción, la marca de HA y la secuencia que codifica para los nucleótidos de la CysE (no incluye el codón de alto) . Por lo tanto, el producto de la PCR contiene un sitio BamHI, que codifica para la secuencia seguida de la CysE por la marca de HA fusionada en el marco, un codón de alto de terminación de la traducción después de la marca de HA, y un sitio Xbal. El fragmento de ADN amplificado por PCR y el vector, pcDNAI/Ap, se digirieron con enzima de restricción- BamHI y Xbal y se ligaron. La mezcla de ligación se transformó en la cepa de E. coli SURE (disponible de Stratagene Cloning Systems, 1109 North Torrey Pines Roaul, La Jolla, CA 92037) se colocaron aproximadamente diez piezas en cada matraz. El cultivo transformado del matraz se cultivó en placas de medios con ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. El ADN del plásmido se aisló de los transformantes y se examinó por análisis de restricción para la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de la CysE recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el método de DEAE-DEXTRAN (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína CysE HA fue detectada por el método de marcado radioactivo e inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lañe, Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con 35S-cisteína dos días después de la transfección. Se recolectaron los medios de cultivo y las células se lisaron con detergente (amortiguador RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0.1%, NP-40 al 1%, DOC al 0.5%, Tris 50mM, pH 7.5) (Wilson, I. et al., Id. 37:767 (1984)). Ambos lisados celular y medio de cultivo se precipitaron con anticuerpo monoclonal específico para HA. Las proteínas precipitadas se analizaron sobre geles de PAGE con 15% de SDS.

Ejemplo 4 Expresión Via Terapia Genética Se obtuvieron fibroblastos de un sujeto por biopsia cutánea. El tejido resultante se colocó en medio de cultivo tisular y se separó en pequeñas piezas. Los pequeños trozos de cultivo se colocaron sobre una superficie húmeda de una matraz de cultivo tisular, se volteó hacia abajo, se cerró herméticamente y se dejó a temperatura ambiente durante la noche. 24 horas después a temperatura ambiente, el matraz se invirtió y los trozos de tejido permanecieron fijos al fondo del matraz y se agregó medio fresco (por ejemplo, medio F12 de Ham, con 10% de FBS, penicilina y estreptomicina. Este se incubó a continuación a 37°C durante aproximadamente una semana. En ese momento, se agregó medio fresco y posteriormente se cambió diariamente. Después de dos semanas adicionales en cultivo, emergió una monocapa de fibroblastos:. La monocapa se tripsinizó y se escaló a matraces más grandes . El pMV-7 (Kischmeier, P. T. et al, ADN, 5:219-25 (1988)) flanqueado por las repeticiones terminales largas del virus del sarcoma murino de Moloney, se digirió con EcoRI y HindIII y posteriormente se trató con fosfatase intestinal de carnero. El vector lineal se fraccionó sobre gel de agarosa y se purificó, usando perlas de vidrio. El ADNc que codifica para un polipéptido de la presente invención se amplificó usando cebadores de PCR que corresponden a las secuencias del extremo 5' y 3' respectivamente. El cebador 5* que contiene un sitio EcoRI y el cebador 3» incluyen además un sitio HindIII. Se agregaron cantidades iguales del esqueleto lineal del virus del sarcoma murino de Moloney y el fragmento de EcoRI y HindIII juntos, • en presencia de ADN ligasa T4. La mezcla resultante se mantuvo bajo condiciones apropiadas para la ligación de los dos fragmentos. La mezcla de ligación se usó para transformar bacterias HB101, las cuales se cultivaron entonces en agar que contenía kanamicina con el propósito de confirmar que el vector tenía el gen de interés insertado apropiadamente. El pA317 amórfico o las células empacadas GP+aml2 se hicieron crecer en cultivo tisular hasta una densidad confluente en Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) con 10% de suero de carnero (CS), penicilina y estreptomicina. El vector MSV que contiene el gen se agregó entonces al medio y las células empacadas se transdujeron con el vector. Las células empacadas producen ahora partículas virales infecciosas que contienen el gen (las células empacadas son ahora referidas como células productoras) . Se agregaron medios frescos a las células productoras transducidas, y posteriormente se cosecharon los medios de una placa de 10 cm de células productoras confluentes. Los medios usados, que contenían las partículas virales infecciosas, se filtraron a través de un filtro de millipore para remover las células productoras desprendidas y estos medios se usaron entonces para infectar células de fibroblasto. Se removieron los medios de una placa subconfluente de fibroblastos y se reemplazaron inmediatamente con los medios de las células productoras.

Estos medios se removieron y reemplazaron con medios frescos. Si el título de virus es alto, entonces virtualmente todos los fibroblastos serán infectados y no se requerirá selección. Si el título es muy bajo, entonces será necesario usar un vector retroviral que tenga un marcador seleccionable, tal como el neo o his. Los fibroblastos alterados o diseñados se inyectaron entonces en el huésped, ya sea solos o después de haber crecido hasta la confluencia sobre células microportadoras citodex 3. Los fibroblastos producen ahora el producto proteico. Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención en el uso y las enseñanzas anteriores y, por lo tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención puede practicarse de otro modo al particularmente descrito.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: Hl, JIAN YU, GUO-LIANG GENTZ, REINER ROSEN, CRAIG (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: CISTATINA E HUMANA (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 9 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DIRECCIÓN: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART & OLSTEIN (B) CALLE: 6 BECKER FARM ROAD (C) CIUDAD: ROSELAND (D) ESTADO: NJ (E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 07068 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco Flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: US 08/461,030 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 05 de Junio de 1995 (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL MANDATARI0/AGENTE : (A) NOMBRE: FERRARO, GREGORY D. (B) NUMERO DE REGISTRO: 36,134 (C) REFERENCIA/NUMERO DE DOCUMENTO: 325800-459 (ix) INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: (201) 994-1700 • (B) TELEFAX: (201) 994-1744 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 588 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 19..465 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sig_peptide (B) LOCALIZACION: 19..100 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACION: 103..465 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: CCGACGGCAC TGACGGCC ATG GCG CGT TCG AAC CTC CCG CTG GCG CTG GGC 51 Met Ala Arg Ser Asn Leu Pro Leu Ala Leu Gly -28 -25 -20 CTG GCC CTG GTC GCA TTC TGC CTC CTG GCG CTG CCA CGC GAT GCC CGG 99 Leu Ala Leu Val Ala Phe Cys Leu Leu Ala Leu Pro Arg Asp Ala Arg -15 -10 -5 GCC CGG CCG CAG GAG CGC ATG GTC GGA GAA CTC CGG GAC CTG TCG CCC 147 Ala Arg Pro Gln Glu Arg Met Val Gly Glu Leu Arg Asp Leu Ser Pro 1 • 5 10 15 GAC GAC CCG CAG GTG CAG AAG GCG GCG CAG GCG GCC GTG GCC AGC TAC 195 Asp Asp Pro Gln Val Gln Lys Ala Ala Gln Ala Ala Val Ala Ser Tyr 20 25 30 AAC ATG GGC AGC AAC AGC ATC TAC TAC TTC CGA GAC ACG CAC ATC ATC 243 Asn Met Gly Ser Asn Ser He Tyr Tyr Phe Arg Asp Thr His He He 35 40 45 AAG GCG CAG AGC CAG CTG GTG GCC GGC ATC AAG TAC TTC CTG ACG ATG 291 Lys Ala Gln Ser Gln Leu Val Ala Gly He Lys Tyr Phe Leu Thr Met 50 55 60 G 3 ATG GGG AGC ACA GAC TGC CGC AAG ACC AGG GTC ACT GGA GAC CAC 339 Glu Met Gly Ser Thr Asp Cys Arg Lys Thr Arg Val Thr Gly Asp His 65 70 75 GTC GAC CTC ACC ACT TGC CCC CTG GCA GCA GGG GCG CAG CAG GAG AAG 387 Val Asp Leu Thr Thr Cys Pro Leu Ala Ala Gly Ala Gln Gln Glu Lys 80 85 90 95 CTG CGC TGT GAC TTT GAG GTC CTT GTG GTT CCC TGG CAG AAC TCC TCT 435 Leu Arg Cys Asp Phe Glu Val Leu Val Val Pro Trp Gln Asn Ser Ser 100 105 110 CAG CTC CTA AAG CAC AAC TGT GTG CAG ATG TGAIAAGTCC CCGAGGGCGA 485 Gln Leu Leu Lys His Asn Cys Val Gln Met 115 120 AGGCCATTGG GTTTGGGGCC ATGGTGGAGG GCACTTCACG TCCGTGGGCC GTATCTGTCA 545 CAA1AAATGG CCAGTGCTGC TTCTTGCAAA AAAAAAAAAA AAA 588 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 149 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: Met Ala Arg Ser Asn Leu Pro Leu Ala Leu Gly Leu Ala Leu Val Ala -28 -25 -20 -15 Phe Cys Leu Leu Ala Leu Pro Arg Asp Ala Arg Ala Arg Pro Gln Glu -10 -5 1 Arg Met Val Gly Glu Leu Arg Asp Leu Ser Pro Asp Asp Pro Gln Val 10 15 20 Gln Lys Ala Ala Gln Ala Ala Val Ala Ser Tyr Asn Met Gly Ser Asn 25 30 35 Ser He Tyr Tyr Phe Arg Asp Thr His He He Lys Ala Gln Ser Gln 40. 45 50 Leu Val Ala Gly He Lys Tyr Phe Leu Thr Met Glu Met Gly Ser Thr 55 60 65 Asp Cys Arg Lys Thr Arg Val Thr Gly Asp His Val Asp Leu Thr Thr 70 75 80 Cys Pro Leu Ala Ala Gly Ala Gln Gln Glu Lys Leu Arg Cys Asp Phe 85 90 95 100 Glu Val Leu Val Val Pro Trp Gln Asn Ser Ser Gln Leu Leu Lys His 105 110 115 Asn Cys Val Gln Met 120 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CGCCCATGGC GGCCGCAGGA G 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: : CGCAAGCTTT CACATCTGCA AAAAGTTGGC 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: CGCGGATCCG CCATCATGGC GCGTTCGAAC CTC 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: CGCGGATCCT CACATCGCA AAAAGTTGGC TT 32 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: GCGCGGATCC ACCATGGCGC GTTCG 25 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 52 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: GCGCTCTAGA TCAAGCGTAG TCTGGGACGT CGTATGGGTA CATCTGCACA AA 52 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 146 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: Met Ala Gly Pro Leu Arg Ala Pro Leu Leu Leu Leu Ala He Leu Ala 1 5 10 15 Val Ala Leu Ala Val Ser Pro Ala Thr Gly Ser Ser Pro Gly Lys Pro 20 25 30 Pro Arg Leu Val Gly Gly Pro Met Asp Ala Ser Val Glu Glu Glu Gly 35 40 45 Val Arg Arg Ala Leu Asp Phe Ala Val Gly Glu Tyr Asn Lys Ala Ser 50 55 60 Asn Asp Met Tyr His Ser Arg Ala Leu Gln Val Val Arg Ala Arg Lys 65 70 75 80 Gln He Val Ala Gly Val Asn Tyr Phe Leu Asp Val Glu Leu Gly Arg 85 90 95 Thr Thr Cys Thr Lys Thr Gln Pro Asn Leu Asp Asn Cys Pro Phe His 100 105 110 Asp Gln Pro His Leu Lys Arg Lys Ala Phe Cys Ser Pro Gln He Tyr 115 120 125 Ala Val Pro Trp- Gln Gly Thr Met Thr Leu Ser Lys Ser Thr Cys Gln 130 135 140 Asp Ala 145 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido que codifica para el polipéptido que comprende del aminoácido -28 al aminoácido 121 como se expone en la Figura 1; (b) un polinucleótido que codifica para el polipéptido que comprende del aminoácido 1 al aminoácido 121 como se expone en la Figura 1; (c) un polinucleótido capaz de hibridarse a y que es al menos 70% idéntico al polinucleótido de (a) o (b) ; y (d) un fragmento polinucleotídico del polinucleótido de (a), (b) o (c) .

2. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido es ADN.

3. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque codifica para el polipéptido que comprende del aminoácido -28 al 121 de la Figura 1.

4. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque codifica para el polipéptido que comprende del aminoácido 1 al 121 de la Figura 1.

5. Un polinucleótido aislado, caracterizado porque comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido el cual codifica para un polipéptido maduro que tiene la secuencia de aminoácidos expresada por el ADN contenido en el Depósito ATCC No. 97156; (b) un polinucleótido el cual codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expresada por el ADN contenido en el Depósito ATCC No. 97156; (c) un polinucleótido capaz de hibridarse a y que es al menos 70% idéntico al polinucleótido de (a) ; y (d) un fragmento polinucleotídico del polinucleótido de (a), (b) o (c) .

6. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia expuesta en la Figura 1 del nucleótido 1 al nucleótido 588.

7. El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la secuencia expuesta en la Figura 1 del nucleótido 103 al nucleótido 465.

8. Un vector, caracterizado porque contiene el ADN de conformidad con al reivindicación 2.

9. Una célula huésped diseñada o modificada genéticamente con el vector de conformidad con la reivindicación 10.

10. Un proceso para producir un polipéptido, caracterizado porque comprende: expresar de la célula huésped de conformidad con al reivindicación 11 el polipéptido codificado por tal ADN.

11. Un proceso para producir células capaces de expresar un polipéptido, caracterizado porque comprende diseñar o modificar genéticamente células con el vector de conformidad con la reivindicación 10.

12. Un polipéptido, caracterizado porque comprende un miembro seleccionado del grupo que consiste de (i) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la Figura 1 y fragmentos, análogos y derivados del mismo; y (ii) un polipéptido codificado por el ADNc del Depósito ATCC No. 97156 y fragmentos, análogos y derivados de tal polipéptido.

13. Un compuesto, caracterizado porque activa al receptor para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 12.

14. Un compuesto, caracterizado porque inhibe al receptor para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 12.

15. Un método para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de CysE, caracterizado porque comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de conformidad con la reivindicación 12.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido se administra proporcionando al paciente el ADN que codifica para tal polipéptido y expresando tal polipéptido in vivo.

17. Un método para el tratamiento de un paciente que tiene necesidad de inhibir un polipéptido CysE, caracterizado porque comprende: administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de conformidad con la reivindicación 14.

18. Un proceso para diagnosticar una enfermedad o una susceptibilidad a una enfermedad relacionada con una subexpresión del polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende: determinar una mutación en la secuencia de ácido nucleico que codifica para tal polipéptido.

19. Un proceso de diagnóstico, caracterizado porque comprende: analizar la presencia del polipéptido de conformidad con la reivindicación 12 en una muestra derivada de un huésped.

20. Un método para identificar los compuestos que se unen a y activan a un receptor para el polipéptido de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende: poner en contacto una célula que expresa sobre la superficie de la misma un receptor para el polipéptido, el receptor está asociado con un segundo componente capaz de proporcionar una señal detectable en respuesta a la unión de un compuesto al receptor, con un compuesto a ser seleccionado bajo condiciones para permitir la unión al receptor; y determinar si el compuesto se une a y activa al receptor detectando la presencia de una señal generada a partir de la interacción del compuesto con el receptor.