MXPA97009244A - Metodos para incrementar celulas hematopoyeticas - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para incrementar células hematopoyéticas, que incluyen plaquetas y eritrocitos, en pacientes que reciben trasplantes de médulaósea o células germinales de sangre periférica. Los métodos comprenden administrar a un donador una cantidad suficiente de trombopoyetina para estimular la proliferación de células del linaje mieloide, recolectar células del donador, y administrar las células recolectadas a un paciente receptor. El paciente receptor puede ser tratado con trombopoyetina adicional. Los métodos sonútiles dentro de los procedimientos de trasplantes alogénicos y autólogos.

Description

MÉTODOS PARA INCREMENTAR CÉLULAS HEMATOPOYETICAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La hematopoyesis es el proceso por el cual se desarrollan células sanguíneas y diferencian de células germinales pluripotentes en la médula ósea. Este proceso implica una interacción compleja de factores de crecimiento de polipéptido (citocinas) que actúan vía receptores de enlace de membrana sobre sus células objetivo. La acción de la citocina resulta en una proliferación celular y diferenciación, con una respuesta a una citocina particular con frecuencia que es específica a linage y/o específica en período. El desarrollo de un tipo de célula individual, tal como una plaqueta, a partir de una célula germinal puede requerir la acción coordinada de una pluralidad de citocinas que actúan en la secuencia apropiada. Se ha hipotetizado por muchos años que la producción de plaquetas puede ser regulada por factores humorales específicos. Los experimentos iniciales han demostrado que el plasma u orina de animales trombocitopénicos contiene una actividad que promueve la formación de colonias megacariocíticas e incrementa el tamaño de megacariocitos de la médula. Esta actividad se refiere a, en la literatura como "trombopoyetina" (revisada REF: 25900 recientemente por McDonald, Exp. Hematol. 16:201-205, 1988 y McDonald, A . J. Ped. Hematol. Oncol. 14:8-21, 1992) . La baja concentración de esta actividad y la carencia de bioensayos adecuados obstaculiza grandemente la purificación y caracterización de la proteína. La trombopoyetina ha sido ahora producida utilizando células cultivadas en ingeniería genética. Véase, de Sauvage et al., Nature 369 :533-538. 1994; Lok et al., Nature 369:565-568, 1994; Kaushansky et al., Nature 369:568-571, 1994; y Bartley et al., Cell 77:1117-1124, 1994. La trombopoyetina ha mostrado incrementar los números de plaquetas a lo normal (Lok et al., ibid.), y animales trombocitopénicos (Sprugel et al., Blood 84 (10 Suppl . 1) :242a, 1994), y para estimular la producción de eritrocitos (Kaushansky et al., J. Clin. Invest . , in Press) .

In vi tro la TPO mejora la sobrevivencia y proliferación de las células CD34+ destinadas para llegar a ser megacariocitos (Papayannopoulou et al., Blood 84 (10 Suppl. 1) :324a, 1994). Aunque la clonación y caracterización de TPO actualmente permite la investigación de su uso en la estimulación de trombopoyesis, permanecen como problemas significantes médicos la trombocitopenia y la anemia, tales como junto con la terapia de radiación y quimioterapia de pacientes con cáncer. Permanece una necesidad particular para métodos para estimular la producción de plaquetas en pacientes que reciben trasplantes de médula ósea y trasplantes de células germinales sanguíneas periféricas, incluyendo trasplantes autólogos . Permanece también una necesidad para estimular la producción de eritrocitos. La presente invención proporciona métodos terapéuticos que se dirigen a estas necesidades, y proporcionan otras ventajas relacionadas .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos para incrementar células hematopoyéticas en un paciente receptor en la necesidad de tal incremento. Los métodos comprenden las etapas de (a) administrar a un donador una cantidad de trombopoyetina (TPO) suficiente para estimular la proliferación de células de linage mieloide en el donador; (b) recolectar las células del donador, en donde las células son células de médula ósea o células germinales de sangre periférica; y (c) administrar las células de médula ósea o células germinales de sangre periférica a un paciente receptor. El donador y el receptor pueden ser individuos diferentes o el mismo individuo. Dentro de una modalidad de la invención, el paciente receptor ha sido tratado con quimioterapia o terapia de radiación. Dentro de otra modalidad, después o en forma conjunta con la administración de células de médula ósea o células germinales de sangre periférica, se administra una cantidad de TPO suficiente para elevar la recuperación de plaquetas o recuperación de eritrocitos al paciente receptor. Dentro de otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para preparar células para trasplante que comprende administrar a un donador una cantidad suficiente de TPO para estimular la proliferación de células de linage mieloide en el donador, y recolectar células del donador, en donde las células son células de médula ósea o células germinales de sangre periférica. Dentro de un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para estimular la recuperación de plaquetas o recuperación de eritrocitos en un paciente que recibe quimioterapia o terapia de radiación que comprende (a) administrar al paciente una cantidad de TPO suficiente para estimular la proliferación de células de linage mieloide en el paciente; (b) recolectar las células de médula ósea o células germinales de sangre periférica del paciente antes de la quimioterapia o terapia de radiación; y (c) regresar las células recolectadas al paciente después de la quimioterapia o terapia de radiación. Dentro de una modalidad, este método comprende adicionalmente administrar al paciente, después o junto con el regreso de las células recolectadas, una cantidad de TPO suficiente para mejorar la recuperación de plaquetas o recuperación de eritrocitos. Estos y otros aspectos de la invención llegarán a ser evidentes de la referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos anexos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra el efecto de trasplante de células de médula ósea a partir de ratones donadores tratados con vehículo o TPO sobre cuentas de plaquetas en animales receptores. En un experimento los receptores de médula tratada con TPO son también tratados con TPO (20 kU/día i.p.) . Los datos son presentados como medias de 10-20 ratones en dos experimentos. *, p<0.05; **, p<0.01. La Figura 2 ilustra el efecto de trasplante células de médula ósea a partir de ratones donadores tratados con vehículo o TPO sobre cuentas de eritrocitos en animales receptores. Los datos se expresan como la media de 20 ratones en dos experimentos. *, p<0.05; **, p<0.005. La Figura 3 ilustra la recuperación de plaquetas en ratones que recibieron trasplantes de médula a partir de donadores tratados con TPO o vehículo, con o sin un tratamiento de TPO post-trasplante .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "célula germinal" se utiliza aquí para denotar las células germinales hematopoyéticas pluripotentes y células progenitoras mieloides. El término "trasplante" se utiliza aquí para denotar el proceso de remover células a partir de un donador y subsecuentemente administrar las células a un receptor. El término abarca tanto el trasplante alogénico, en donde el donador y el receptor son individuos diferentes de las mismas especies; y un trasplante autólogo, en donde el donador y el receptor son el mismo individuo. El término "células hematopoyéticas incrementadas" se utiliza aquí para denotar el restablecimiento o la recuperación mejorada de niveles de células hematopoyéticas después de su ablación, tal como la ablación que resul*a r3 -la enfermedad o la intervención terapéutica. El término "trombopoyetina" abarca las proteínas caracterizadas por su capacidad para enlazar específicamente al receptor MPL de las mismas especies y para estimular la producción de plaquetas in vivo . En animales para pruebas normales, la TPO es capaz de incrementar los niveles de plaquetas por 100% o más dentro de los 10 días después de comenzar la administración diaria. Se muestra una secuencia de ADNc de la TPO humana representativa en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1, y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2. La evidencia analítica y experimental indica que la proteína madura comienza en el residuo Ser-22. Aquellos con habilidad en la técnica reconocerán que las secuencias ilustradas corresponden a alelos individuales del gen de TPO humano, y que se espera que la variación alélica exista. Las variantes alélicas incluyen aquellas que contienen mutaciones silentes y aquellas en las cuales las mutaciones resultan en los cambios de secuencias de aminoácidos. Será también evidente que una persona con habilidad en la técnica podrá crear variantes adicionales, tales como por sitios de ingeniería que pueden facilitar la manipulación de secuencias de nucleótidos utilizando codones alternativos, por sustitución de codones para producir cambios conservadores en la secuencia de aminoácidos, etc. Se contempla el uso de variantes alélicas y de ingeniería de TPO por la presente invención. Además, los polipéptidos de TPO aminoterminales de aproximadamente 150 aminoácidos o más en longitud son conocidos para ser activos (de Sauvage et al., ibid. ; Bartley et al., ibid.; la solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 08/346,999, co-pendiente, asignada comúnmente), y el uso de tales formas truncadas de TPO están dentro del alcance de la presente invención. Han sido descritas las trombopoyetinas de especies no humanas en la literatura científica (Lok et al., ibid.; de Sauvage et al., ibid; Bartley et al., ibid.). La presente invención proporciona métodos para incrementar células hematopoyéticas en pacientes, particularmente pacientes que sufren de terapia de radiación y/o quimioterapia, tales como en el tratamiento de cáncer. Tales terapias eliminan células progenituras de división en la médula y sangre periférica, limitando la terapia y con frecuencia requiriendo transfusiones para restablecer los niveles de circulación de plaquetas y otras células sanguíneas. Son de particular interés aquellos pacientes que reciben trasplantes de médula ósea y/o células germinales de sangre periférica después de la terapia de radiación y pacientes que sufren de defectos metabólicos congénitos que necesitan trasplante de médula ósea. Entre estas indicaciones están los trasplantes de médula ósea asociados con el tratamiento de cáncer de mama, leucemia, linfoma, mielo a múltiple y defectos congénitos tales como deficiencia inmune combinada severa, talasemia, y anemia falciforme. El trasplante de células germinales de sangre periférica puede ser preferido en condiciones donde no está presente el riesgo de células tumorales en la sangre. Los métodos para llevar a cabo los trasplantes de médula ósea y células germinales sanguíneas periféricas se conocen en la técnica. Para revisión, véase Snyder et al., "Transfusión Medicine" en Benz y McArthur, eds., Hematoloqy 1994 , American Society of Hematology, 96-106, 1994. Las células germinales de sangre periférica son recolectadas por leucaféresis de acuerdo a procedimientos clínicos aceptados. Las células progenitoras hematopoyéticas pueden ser seleccionadas sobre la base de marcadores de superficie celular (por ejemplo, CD34) , permitiendo el enriquecimient de las células deseadas y la deplexión de células tumorales contaminantes. Las células recolectadas son almacenadas congeladas en un crioprotector adecuado (por ejemplo, sulfóxido de dímetilo, almidón de hidroxietilo) hasta lo necesario. Las células de médula son recolectadas de donadores por una punción de hueso bajo anestesia. Para reducir el volumen, la médula recolectada es procesada usualmente para separar plasma de los componentes celulares. La remoción de plasma puede también eliminar las incompatibilidades de células rojas en el trasplante alogénico. La fracción celular puede ser enriquecida por células mononucleares que utilizan técnicas de gradiente de densidad o métodos de separación automatizada y reducción de células T utilizando varios agentes citotóxicos. Las células de médula recolectadas son crioconservadas de acuerdo a procedimientos establecidos que incluyen congelamiento de velocidad controlada y el uso de crioprotectores . Las células germinales son descongeladas en un baño de agua caliente inmediatamente antes del uso para minimizar las pérdidas asociadas con el descongelado. En el caso de trasplantes alogénicos, los donadores y receptores son igualados en tejido para minimizar el riesgo de la enfermedad de injerto contra huésped. Un incremento en las células hematopoyéticas resulta de trasplante en un paciente receptor de células germinales, particularmente células de linage mieloide, incluyendo las células germinales CD34+ y células derivadas de las células germinales CD34+. Son de particular interés las células en los linages de megacariocitos y eritrocitos, las cuales reconstituyen las poblaciones de plaquetas y eritrocitos del receptor, respectivamente. Dentro de la presente invención se trata un donador, antes de la donación de médula o células sanguíneas periféricas, con TPO en una cantidad suficiente para estimular la proliferación de células de linage mieloide. Tal cantidad estará generalmente en el rango de 0.5 lg/kg/día a 40 lg/kg/día, de preferencia l lg/kg/día a 20 lg/kg/día. El tratamiento del donador se llevará a cabo por un periodo de una semana a varios días, de preferencia aproximadamente 2-5 días, durante un periodo de 3 días a 2 semanas antes del cosechado de médula ósea o células germinales de sangre periférica. Se prefiere tratar al donador durante un periodo de cinco a diez días antes del cosechado de las células. El incremento en las células germinales CD34+ y otras células de linage mieloide en el donador se manifestarán por una recuperación mejorada de niveles de plaquetas y/o eritrocitos en el receptor del trasplante. Dentro de una modalidad de la invención, es tratado el receptor con TPO después del trasplante para mejorar adicionalmente la recuperación de plaquetas. Se ha encontrado que el tratamiento post-trasplante con TPO mejora la sobrevivencia de animales de prueba irradiados letalmente que tienen médula ósea de donadores tratados con TPO. "Una cantidad de trombopoyetina suficiente para mejorar la recuperación de plaquetas" es aquella cantidad que produce una reducción estadísticamente significante en tiempo para recuperación de niveles de plaquetas normales o un incremento estadísticamente significante en cuenta de plaquetas comparada con pacientes no tratados. Las dosis de T?'~> utilizadas en el tratamiento post-trasplante estarán generalmente en el rango de 0.5 lg/kg/día a 40 Ig/kg/día administradas por aproximadamente 3 a aproximadamente 20 días. En general, los pacientes que reciben trasplantes de médula ósea requerirán un tratamiento más largo post-trasplante que aquellos que reciben trasplantes de células germinales de sangre periférica. Para uso dentro de la presente invención, la TPO puede ser preparada utilizando células cultivadas por ingeniería genética, de acuerdo a métodos generalmente conocidos en la técnica. Para resumir estos métodos, se une una molécula de ADN que codifica TPO a otras secuencias de ADN las cuales se proporcionan para su mantenimiento y transcripción en una célula huésped. Se inserta el vector de expresión resultante en la célula huésped, y las células resultantes "transformadas" o "transfectadas" son cultivadas en un medio nutritivo adecuado. Las células de riñon de hámster bebé (BHK) son un huésped preferido. Se prefiere maquinar las células para segregar la TPO en el medio, aunque puede ser recuperada la TPO de lisatos celulares y procesada in vi tro para dar la proteína activa. Véase, en general, Sauvage et al., ibid.; Lok et al., ibid.; Kaushansky et al., Nature 369:568-571, 1994; Wendling et al, Nature 369:571-574, 1994; Bartley et al., ibid.; y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. de Serie 08/366,859 copendiente, asignada comúnmente y la No. de Serie 08/347,029, las cuales se incorporan aquí para referencia en su totalidad. La TPO puede ser purificada a partir de medios de cultivo acondicionados en células por una combinación de técnicas de cromatografía y otras, incluyendo la captura directa sobre una matriz de afinidad de ligandos en colorantes y cromatografía de intercambio iónico. Las proteínas contaminantes pueden ser eliminadas por adsorción con la hidroxiapatita.

Para uso farmacéutico, se formula la TPO para suministro parenteral, particularmente intravenoso o subcutáneo, de acuerdo a métodos convencionales. La administración intravenosa será por inyección de bolo o infusión sobre un periodo típico de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína hematopoyética en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tales como solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa al 5% en agua o similares. Las formulaciones pueden incluir adicionalmente uno o más excipientes, conservadores, solubilizantes, agentes amortiguantes (por ejemplo, amortiguador de fosfato) , albúmina o un detergente no iónico para evitar las pérdidas de proteínas sobre las superficies de frascos, etc. Además, la TPO puede estar combinada con otras citocinas, particularmente citocinas que actúan en forma temprana tales como el factor de células germinales IL-3, IL-6, IL-11 o GM-CSF. Cuando se utiliza tal terapia de combinación, las citocinas pueden ser combinadas en una formulación individual o pueden ser administradas en formulaciones separadas. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Reminaton ' s Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 1990, la cual se incorpora aquí para referencia.

La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Se prepara la trombopoyetina de ratón utilizando células de riñon de hámster bebé transfectado (células 570 de BHK, ATCC CRL 10314) . El medio libre de suero contiene 145 kU/ml de actividad de TPO, en donde 10 unidades o-definen como la cantidad de TPO que da la estimulación media máxima en un ensayo de mitogénesis (incorporación de 3H-timidina) utilizando las células BaF3 transfectadas con un vector de expresión que codifica el receptor MPL humano (Vigon et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:5640-5644. 1992) como células objetivo. BaF3 es una interleucina-3 dependiente de la línea celular pre-linfoide derivada de médula ósea de murinos (Palacios y Steinmetz, Cell 41.: 747-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). Las células son expuestas a muestras de prueba en la presencia de 3H-timidina. Se cuantifica la cantidad de 3H-timidina incorporada en el ADN celular por comparación con una curva estándar de TPO humana. Las muestras de TPO de ratón son efectivas en los ensayos de formación de colonias en un rango de aproximadamente 100-400 U/ml. Las actividades in vivo se observan en el rango de 20-40 kU/día en ratones. Para los experimentos in vivo, se diluye la TPO a la concentración deseada en una solución amortiguada con fosfato libre de endotoxina (PBS) y se administra como inyecciones intraperitoniales o subcutáneas. Los ratones Balb-C hembra (en el rango de edad de 8-12 semanas) son obtenidos de Broekman B.V. (Someren, The Netherlands) y alimentados con comida para roedores comercialmente disponible y provistos de agua acidificada ad libi tum. Los receptores de trasplante son mantenidos en un ambiente libre de patógenos y proporcionados con agua que contiene ciprofloxacin en una concentración de 1 mg/ml, polymyxine-B a 70 lg/ml, y sacarosa en 2 g/100 ml . Los ratones receptores son colocados en una caja de polimetilmeta-acetato e irradiados letalmente (8.5 Gy) utilizando un acelerador lineal de Philips SL 75-5/6 mV (Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) . La irradiación se divide en dos partes en una posición posterior-anterior y anterior-posterior, en una velocidad de dosis de 4 Gy/minuto. Se trasplanta a los ratones con 105 células de médula ósea a partir de ratones donadores en estado listo. El trasplante se lleva a cabo dentro de las cuatro horas del cosechado de la médula. Se tratan grupos de 5 ratones receptores con TPO en una dosis de 20 kU/día intraperitonialmente (i.p.) en los días 1-5, 3-8 o 3-12 después del trasplante. Se trasplanta a los animales de control con una cantidad igual de células de médula y solución salina dada en intervalos de tiempos similares después del trasplante. En comparación con los receptores de control tratados con solución salina, la administración de TPO no resulta en una reconstitución acelerada de plaquetas. Una dosis de 30 kU/día administrada subcutáneamente (s.c.) en los días 1-14 es también inefectiva en la aceleración de recuperación de plaquetas. Ningún efecto se observa en la reconstitución de células sanguíneas blancas o células sanguíneas roj as . En un segundo conjunto de experimentos, los ratones donadores son tratados con TPO durante cinco días consecutivos en una dosis de 20 kU/día i.p. por ratón. En el día 5 los ratones son sacrificados, y sangrados, se cosecha la médula ósea y los bazos. Las células sanguíneas rojas, las células sanguíneas blancas y las plaquetas son contadas en un contador Sysmex 800 (TOA Medical Electronics Company, Kobe, Japan) . El tratamiento con TPO induce un incremento de 2.5 veces el número de plaquetas, pero no tiene un efecto sobre el número de células sanguíneas blancas o células sanguíneas rojas. Los niveles de células progenituras también se determinan en los ratones donadores tratados con TPO. Las células de médula ósea son cosechadas haciendo fluir los fémures bajo condiciones estériles con RPMI 1640 que contiene 450 lg/ml de penicilina, 250 lg/ml de estreptomicina, y 2% de suero de bovino fetal (FBS) (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) . Las suspensiones de células individuales de los bazos se preparan macerando los órganos y lavándolos una vez con RPMI 1640 que contiene 2% de FBS. Para determinar las unidades formadoras de colonias, se cultivan CFU-GM de acuerdo a los procedimientos publicados (Fibbe et al., J. Immunol . 148 :417, 1992) . En breve, se cultivan las células de médula ósea en placas de microtítulo que contienen 104 células/pozo en un medio semi-sólido en la presencia de GM-CSF murino (1.25 ng/ml). Las células mononucleares de sangre periférica y las células de bazo se cultivan en cajas de 3.5 cm que contienen 5xl05 células/ml y 106 células/ml, respectivamente. Las células son cultivadas en una atmósfera totalmente húmeda a 37°C que contiene 5% de C02 • Después de 6 días de cultivo se cuenta el número de colonias (definidas como agregados de >20 células) utilizando un microscopio invertido. Se realiza el ensayo de mezcla de CFU en un modo idéntico en cajas de 3.5 cm en la presencia de una combinación de 1.25 ng/ml de GM-CSF murino recombinante, 2 U/ml de EPO humano recombinante, 25 ng/ml de IL-3 murino recombinante, 5% de transferina, 5% de albúmina de suero de bovino, 5% de 10 "3 b-mercaptoetanol, y 7.5% de medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) . Después de 6 a 7 días de cultivo a 37°C en una atmósfera totalmente húmeda al 5% de C02 , se cuenta el número de células formadoras de colonias utilizando un microscopio invertido. El tratamiento con TPO resulta en un número incrementado de unidades formadoras de colonias (CFU) y BFU-Es en la médula ósea o bazo en comparación con los controles tratados con solución salina (Tabla) .

Tabla Tratamiento del donador TPO Solución salina Fémur Células nucleadas (xlO6) 18.4 ± 4.7 19.9 ± 4.3 CFU (XlO3) 55.3 ± 12.5* 38.6 ± 5.2 BFU-E (XlO3) 24.0 ± 4.9* 16.4 ± 5.3 Bazo Células nucleadas (xlO6) 71.8 ± 35.0 78.4 ± 42.5 CFU (XlO3) 27.3 ± 16.9 16.3 ± 11.4 BFU-E (xlO3) 10.2 ± 2.3 1.9 ± 0.7 Los resultados se expresan como números celulares absolutos (media ± S.D., n=7) por órgano (fémur o bazo). CFU representa el número total de colonias cultivadas en el ensayo de mezcla de CFU. *p<0.05.

Se trasplanta a los animales receptores irradiados letalmente con 105 células de médula ósea a partir de donadores que han sido tratados con TPO en una dosis de 20 kU/día i.p. durante cinco días consecutivos, o de donadores de control tratados con solución salina. Las muestras de sangre se toman después del trasplante de los receptores individuales cada 3 días por sangrado de la vena de la cola. No se observa ninguna diferencia visible en la tendencia de sangrado entre receptores de células de médula ósea modificadas con TPO o no modificadas. Las cuentas celulares se analizan utilizando las pruebas T de student. En el análisis de MANOVA, se comparan los grupos con respecto a su curso sobre el tiempo. Se realizan los análisis sobre los valores del logaritmo de los datos. Los valores de <0.05 se consideran estadísticamente significantes. Se comparan las curvas utilizando la prueba de MANOVA. Los resultados muestran que la reconstitución plaquetas en receptores de médula tratada con TPO se altera significativamente en comparación con los animales de control con trasplante con un número igual de células de médula ósea a partir de donadores de control tratados con solución salina (Figura 1) . Además, las cuentas nadir de plaquetas son más altas en animales que reciben médula tratada con TPO que aquellas que reciben médulas de control (88 x 109 contra 30 x 109 el día 12 después del trasplante, media de 20 ratones) .

Como se muestra en la Figura 1, el tratamiento posttrasplante con 20 kU/día TPO i.p. en los días 1-5 no resulta en una aceleración adicional de la reconstitución de plaquetas en ratones que reciben médulas de donadores tratados con TPO. Además, para acelerar la reconstitución de las plaquetas, los receptores de células de médula ósea modificada con TPO exhiben también reconstitución acelerada de eritrocitos (Figura 2) . Las cuentas nadir de eritrocitos son también significativamente más altas en estos animales que en los controles con trasplante con un número igual _ _ células de médula ósea no modificadas. Se realizan experimentos para comprobar adicionalmente que este efecto es debido a una actividad directa de TPO sobre la eritropoyesis y no relacionada a diferencias en las cuentas de plaquetas y tendencia de sangrado. En este experimento, los animales receptores no son sangrados hasta el día 12 después del trasplante, tiempo en el cual los ratones receptores son sacrificados, y se evalúan los números de médulas óseas y células progenitoras derivadas de la sangre. Los receptores de células de médula ósea modificada con TPO tienen un número mayor de colonias de BFU-E/fémur (770 ± 386 contra 422 ± 320, media ± SD, n=5) y mayores reticulocitos en la sangre (44% contra 8%, media de 5 ratones) que los controles trasplantados con un número igual de células de médula ósea no modificadas, aunque estas diferencias no alcanzan una significancia estadística. El tratamiento post-trasplante con TPO no resulta en una aceleración adicional de la reconstitución de eritrocitos en las dosis probadas.

Ejemplo 2 Se lleva a cabo un segundo experimento para comparar cuentas de plaquetas en ratones irradiados letalmente que reciben médulas de donadores no tratac'-tratados con TPO, y para determinar el efecto de tratamier... con TPO post-trasplante de los animales receptores. Los ratones Fl B6D2 obtenidos de Taconic (Germantown, NY) y alojados bajo condiciones específicas libres de patógenos. Los ratones son alojados cinco por jaula y reciben agua acida y alimento ad libi tum . Se utilizan cuarenta ratones hembra como receptores, y se utilizan cinco ratones macho como donadores. Se prepara la TPO de humano recombinante utilizando células BHK 570 transfectadas. Las especies moleculares principales tienen una banda de 70 kD. La preparación tiene una actividad específica de 5641 U/lg. Se elabora la proteína en amortiguador de fosfato de potasio al 29 mM, pH 6.0, que contiene polisorbato 80 al 0.05% y NaCl al 0.13 M y se almacena y congela en alícuotas de 20 kU. Se descongelan las soluciones de TPO y vehículo directamente antes de su uso y se inyectan en ratones una vez al día, • subcutáneamente. Dos ratones donadores son tratados cada uno con 20 kU de TPO por día durante cuatro días, después son sacrificados por dislocación cervical en el quinto día. Se trata a los donadores de control con vehículo solamente. Se extraen asépticamente las partes femorales, y se extrae la médula ósea con F2 de Ham (Fred Hutchinson Cáncer Research Center, Seatle, WA) que contiene 2% de suero de bovino fetal insertando una aguja de 25 g conectada a una jeringa. Se hace fluir la suspensión celular dos veces a través de una aguja de 18 g, una aguja de 20 g, y una aguja de 22 g para producir una suspensión de células individuales. Las células nucleadas son contadas en un hemocitómetro. En el día -2, los ratones receptores se exponen a 1200 cGy de irradiación corporal total desde una fuente 137Cs (Gammacell 40 Irradiator, Atomic Energy of Canadá Radiochemical Company, Kanata, Canadá) . Se realizan los trasplantes de médula ósea en las horas dos a cuatro después de la irradiación. Veinte ratones reciben la médula ósea (lxlO5 células) de donadores tratados con TPO, y veinte ratones reciben lxlO5 células de donadores tratados con vehículo. Se trata a los receptores con TPO (20 kU/día) comenzando en el día 1 (2 días después del trasplante) y continuando durante 14 días.

Los ratones son sangrados desde la retroorbital sinusoidal bajo anestesia con éter. Se recolectan cincuenta muestras sanguíneas 11 en micropipetas heparinizadas (VWR Scientific, Seatle, WA) y se agregan en forma de gotas en los tubos microtainer con EDTA (Becton Dickinson, San José, CA) . Se colocan gotas de sangre en portaobjetos, y se preparan los frotis. Se analiza la sangre en un analizador de hematología Cell Dyn 3500 (Abbott, Santa Clara, CA) . Se determinan los hematocritos, las cuentas de RBC, cuentas de WBC y cuentas de plaquetas. En los ratones que reciben médula de donadores de control, las cuentas de plaquetas caen en el día 8 a niveles bajos (abajo de 6% del normal) y se inicia la recuperación en los animales tratados con TPO o de control en el día 12 (Figura 3) . No hay una diferencia entre los dos grupos en la recuperación de plaquetas. Sin embargo, en los controles tratados con vehículo solamente 3 de 10 animales ientras que en los grupos tratados con TPO 7 de 9 a" sobreviven. La muerte se relaciona a la hemorragia. Las desviaciones estándar son más grandes dentro del grupo tratado con TPO ya que algunos animales con cuentas muy bajas de plaquetas son capaces de sobrevivir. Los ratones que reciben médula de donadores tratados con TPO tienen también números de plaquetas que están abajo de 6% del normal en el día 8. Los animales que son tratados con TPO durante 14 días tienen, en general, una recuperación más rápida en las cuentas de plaquetas. Ocho de nueve animales tratados con TPO sobreviven, mientras que solamente cuatro de nueve ratones tratados con vehículo sobreviven. Los RBC se recuperan más rápido en ratones que reciben médula ósea pretratada con TPO y son tratados con TPO comparados con los controles. No hay una influencia del tratamiento de TPO sobre recuperación de células sanguíneas blancas . De lo mencionado anteriormente, se apreciará que, aunque las modalidades específicas de la invención han sica descritas en la presente para propósitos de ilustración, diversas modificaciones pueden ser realizadas sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Por consiguiente, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones anexas .

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: ZymoGenetics , Inc. 1201 Eastlake Avenue East Seattle WA USA 98102 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: MÉTODOS PARA INCREMENTAR CÉLULAS HEMATOPOYETICAS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 2 (iv) DIRIGIR LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: ZymoGenetics, Inc. (B) CALLE: 1201 Eastlake Avenue East (C) CIUDAD: Seattle (D) ESTADO: WA (E) PAÍS: ESTADOS UNIDOS DE AMERICA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : 98102 (v) FORMA DE LECTURA EN LA COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco blando (B) COMPUTADORA: Compatible con una PC IBM (C) SISTEMA DE OPERACIÓN: PC-DOS/MS -DOS (D) SOFTWARE: Patent In Reléase #1.0, Versión #1.25 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DEL APODERADO/AGENTE : (A) NOMBRE: Parker, Gary E (B) NUMERO DE REGISTRO: 31-648 (C) REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: 95-04 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 206-442-6600 ext . 6673 (B) TELEFAX: 206-442-6678 (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1062 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..1059 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 1 ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA 48 Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala 1 5 10 15 AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC 96 Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val 20 25 30 CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC 144 Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser 35 40 45 CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACÁ CCT GTC CTG CTG CCT GCT 192 Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala 50 55 60 GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG 240 Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys 65 70 75 80 GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG 288 Ala Gln Asp lie Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 85 90 95 GCA GCA CGG GGA CAÁ CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG 336 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 100 105 lio CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC 384 Gln Leu Ser Oly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu 115 120 125 CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACÁ GCT CAC AAG GAT 432 Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp 130 135 140 CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAÁ CAC CTG CTC CGA GGA AAß GTG 480 Pro Asn Ala lie Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val 145 150 155 160 CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC 528 Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala 165 170 175 CCA CCC ACC ACÁ GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACÁ CTG 576 Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu „ 180 185 190 AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACÁ AAC TTC ACT 624 Aßn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr 195 200 205 GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA 672 Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly 210 215 220 TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAÁ ACC TCC AGG TCC CTG 720 Phe Arg Ala Lys lie Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu 225 230 235 240 GAC CAÁ ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA 768 Asp Gln lie Pro Gly Tyr Leu Asn Arg lie His Glu Leu Leu Asn Gly 245 250 255 ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA 3GA GCC CCG 816 Thr Arg Gly Leu Phß Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro 260 265 270 GAC ATT TCC TCA GGA ACÁ TCA GAC ACÁ GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC 864 Asp lie Ser Ser Gly Thr Ser Aßp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu 275 280 285 CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT 912 Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr 290 295 300 ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC 9S0 Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu 305 310 315 320 CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC 1008 His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser 325 330 335 CCT CTT CTA AAC ACÁ TCC TAC ACC CAC TCC CAO AAT CTG TCT CAG GAA 1056 Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His SS Gln Asn Leu Ser Gln Glu 340 345 350 GGG TAA 1062 Gly (2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 353 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. DE IDENT. NO: 2 Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala 1 5 10 15 Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Ars Val 20 25 30 Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser 35 40 45 Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala 50 55 60 Val Asp Phe Sex Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys 65 70 75 80 Ala Gln Asp He Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met 85 90 95 Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly 100 105 no Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu 115 120 125 Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp 130 135 140 Pro Asn Ala He Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val 145 150 155 160 Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val. Arg Arg Ala 165 170 175 Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu 180 185 190 Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr 195 200 205 Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly 210 215 220 Phe Arg Ala Lys He Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu 225 230 235 240 Asp Gln He Pro Gly Tyr Leu Asn Arg lie His Glu Leu Leu Asn Gly 245 250 255 Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro 260 265 270 Asp He Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu 275 280 285 Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr 290 295 300 Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu 305 310 315 320 His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser 325 330 335 Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln siu 340 345 350 Gly Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (4)

REIVINDICACIONES 1. El uso de células de médula ósea o de células pluripotenciales o germinales de sangre periférica en la fabricación de un medicamento para incrementar células hematopoyéticas en un paciente receptor en necesidad de tal incremento, por ejemplo, para estimular la recuperación de plaquetas o eritrocitos en un paciente que recibe quimioterapia o terapia de radiación, en el que las células se han recolectado de un donador al cual se le ha administrado trombopoyetina (TPO) , por ejemplo TPO humana para estimular la proliferación de células de la línea mieloide. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medicamento es para uso con un paciente receptor tratado con quimioterapia o terapia de radiación. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el donador y el paciente receptor son el mismo individuo, opcionalmente en el que el paciente receptor es tratado con quimioterapia o radiación entre las etapas de recolección y la segunda administración. 4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 , caracterizado porque comprende de manera adicional que el medicamento permite la administración de tales células de manera concurrente con o ante la administración de trombopoyetina suficiente para mejorar la recuperación de plaquetas o la recuperación de eritrocitos. 5. Un método para preparar células para trasplante, caracterizado porque comprende: administrar a un donador una cantidad de trombopoyetina (TPO) , por ejemplo TPO humana, suficiente para estimular la proliferación de células de la línea mieloide en el donador; recolectar células del donador, en el que las células son células de médula ósea o células pluripotenciales de sangre periférica. 6. El uso de trombopoyetina (TPO) , por ejemplo TPO humana en una cantidad para estimular la proliferación de células de la línea mieloide, en la preparación de células de médula ósea o de células pluripotenciales de sangre periférica. 7. El uso de trombopoyetina (TPO) , por ejemplo TPO humana, en la fabricación de un medicamento para la estimulación de proliferación de células de la línea mieloide en un donador de células de médula ósea o células de sangre periférica . RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se describen métodos para incrementar células hematopoyéticas, que incluyen plaquetas y eritrocitos, en pacientes que reciben trasplantes de médula ósea o células germinales de sangre periférica. Los métodos comprenden administrar a un donador una cantidad suficiente de trombopoyetina para estimular la proliferación de células del linaje mieloide, recolectar células del donador, y administrar las células recolectadas a un paciente receptor. El paciente receptor puede ser tratado con trombopoyetina adicional. Los métodos son útiles dentro de los procedimientos de trasplantes alogénicos y autólogos. 33

1. El uso de células de médula ósea o de células pluripotenciales o germinales de sangre periférica en la fabricación de un medicamento para incrementar células hematopoyéticas en un paciente receptor en necesidad de tal incremento, por ejemplo, para estimular la recuperación de plaquetas o eritrocitos en un paciente que recibe quimioterapia o terapia de radiación, en el que las células se han recolectado de un donador al cual se le ha administrado trombopoyetina (TPO) , por ejemplo TPO humana para estimular la proliferación de células de la línea mieloide.

2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medicamento es para uso con un paciente receptor tratado con quimioterapia o terapia de radiación.

3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el donador y el paciente receptor son el mismo individuo, opcionalmente en el que el paciente receptor es tratado con quimioterapia o radiación entre las etapas de recolección y la segunda administración.

4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 , caracterizado porque comprende de manera adicional que el medicamento permite la administración de tales células de manera concurrente con o ante la