MXPA97009074A - Metodo para reducir los inhibidores de hibridizacion del acido nucleico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para reducir la cantidad de substancias inhibitorias a la hibridización delácido nucleico en las muestras. El método es práctico antes de la liberación delácido nucleico blanco desde las células de interés e involucra poner en contacto la muestra con un agente que solubiliza las substancias inhibitorias y no efectúa la liberación de losácidos nucleicos desde las células en la muestra, y luego las células desde el agente.

Description

"MÉTODO PARA REDUCIR LOS INHIBIDORES DE HIBRIDIZACION DEL ACIDO NUCLEICO" ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El campo de la presente invención se relaciona ampliamente con la hibridización del ácido nucleico. De manera más específica, la presente invención se relaciona con la reducción de substancias en muestras que inhiben los eventos de hidridización del ácido nucleico. Estos eventos incluyen la hibridización de sonda de ácido nucleico para determinar la presencia y/o la cantidad de un ácido nucleico de blanco y la hibridización del cebador del ácido nucleico para la iniciación de un proceso de amplificación del ácido nucleico. Los procesos de amplificación del ácido nucleico tales como la amplificación de desplazamiento en cadena (SDA) , reacción de cadena de poli erasa (PCR) , reacción de cadena de ligasa (LCR) , amplificación a base de secuencia del ácido nucleico (NASBA) , amplificación mediada por transcripción (TMA) y otras, se usan para crear copias múltiples de una secuencia (s) de ácido nucleico específica de interés (secuencia de blanco) que está presente en un número menor de copias en una muestra. Sin embargo, un número de substancias encontradas comúnmente en estas muestras ocasiona la inhibición de los procesos de amplificación del ácido nucleico debido a la inhibición de la hibridazación de cebadores para iniciar el proceso de amplificación. De manera semejante, estas substancias inhiben las reacciones de hibridización de sonda de ácido nucleico directas usadas para la dirección de ácidos nucleicos de blanco no amplificados. Un ejemplo de estas substancias inhibitorias de hibridización del ácido nucleico son los compuestos de porfirina derivados de heme y hematina que se encuentran ambos comúnmente en muestras de sangre e inhiben la PCR.

(PCR Technology, Stockton Press, Henry A. Erlich, Editores páginas 33-34, 1989) . Los protocolos usando la lisis osmótica y granulación de la basura de la celda nucleica se han usado para reducir la cantidad de estos inhibidores. Las muestras de saliva también se han dado a conocer que contienen substancias inhibitorias de la PCR. Orchet y otros, PCR Methods and Applications 3 , 365-368 (1994) . Aún cuando las substancias inhibitorias no se identificaron, se encontró que el tratamiento prolongado de microondas o ebullición de la muestra de saliva removió totalmente la inhibición de la PCR. Frickhofen y Young, J. Virol. Methods 35, 65-72 (1991), dan a conocer que el calentamiento de las muestras de suero durante 45 segundos a 70°C mejora la amplificación de la PCR de las secuencias del ácido nucleico viral. Esta mejora se debe según se tiene la teoría a la inactivación térmica de las enzimas de suero tales como aprotinina, leupeptina PMSF y pepstatina que se cree que son inhibitorias a los procesos de PCR. Otro enfoque para remover la substancias inhibitorias de la PCR del suero antes de amplificación de la secuencia del ácido nucleico viral se da a conocer por Zeldis y otros, J. Clin. Invest. 84, 1503-1508 (1989) . Este enfoque involucra adsorber el virus en las micropartículas revestidas con el anticuerpo, lavando las micropartículas y luego destruyendo las proteínas restantes que pueden ser inhibitorias a la PCR sin la proteinasa K. Al tratar de detectar Treponema pallid?m en el fluido amniótico, los sueros fetal y neonatal y el fluido cerebroespinal por la PCR, se intentaron cuatro procesos diferentes para remover los compuestos inhibitorios de PCR. Gri pel y otros, J. Clin. Microbiol. 29, 1711-1718 (1991) . Abreviando, los cuatro procesos para la remoción de los compuestos inhibitorios de PCR fueron: (1) un método de ebullición en donde una muestra en un tubo se colocó en una baño de agua en ebullición durante 10 minutos, se enfrió en hielo y luego se centrifugó; (2) un método de separación de baja centrifugación en donde se añadió la muestra a una solución salina estabilizada con fosfato estéril y se sometió a una serie de centrifugaciones, luego el granulo se volvió a suspender e hirvió durante 10 minutos después de lo cual se enfrió en hielo; (3) un método de extracción de lisis alcalina en donde la muestra se hirvió durante 1.5 minutos en 1 M de NaCl, 1N de NaOH y 0.1 por ciento de SDS, luego se neutralizó con 0.5 M de Tris-HCl (pH de 8.0) y luego se sometió a una serie de extracciones con fenol y alcohol de cloroformo-isoamilo y se precipitó con alcohol isopropílico; y (4) un método de extracción de centrifugación en donde la muestra se sometió a separación de baja centrifugación como se describe en (2) anterior, seguido por 10 minutos de ebullición y una extracción con fenol-cloroformo antes de la precipitación en etanol absoluto frío. Los autores dieron a conocer el éxito variable de estos métodos dependiendo del tipo de muestras usadas . Con muestras de materias fecales, se encontró que la precipitación con polietilenglicol removía una cantidad significativa de partículas pequeñas y substancias solubles que podrían se inhibitorias para un proceso de transcriptasa-PCR inverso. Jiang y otros, J. Clin. Microbiol. 30, 2529-2534 (1992) . Después de la precipitación, se llevó a cabo un proceso de extracción usando el detergente catiónico, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) en una alta concentración de sal junto con la extracción de fenol-cloroformo. Un enfoque diferente para la remoción de las substacias inhibitorias de PCR de las muestras de materias fecales se dio a conocer por Wide y otros, J. Clin. Microbiol. 28, 1300-1307 (1990) . Antes de usar la PCR para detectar el ácido nucleico de rotavirus de las muestras de materias fecales, el proceso de extracción se modificó con un paso adicional que utilizó polvo de fibra de celulosa cromatográfico (polvo de CFll) para purificar el ARN de rotavirus durante una serie de pasos de lavado y elución rápidos . Cuando se llevó a cabo un estudio para detectar el citomegalovirus (CMV) en orina usando la PCR, se encontró que la urea es inhibitoria para la PCR. Khan y otros, J. Clin. Pathol. 44, 360-365 (1991) . Esta referencia da a conocer que los efectos inhibitorios de la PCR de la urea en la orina se remueven de manera efectiva mediante diálisis simple o ultracentrifugación. Otro proceso para remover las substancias inhibitorias de PCR de la orina antes de la detección del ácido nucleico CMV se dio a conocer por Buffone y otros, Clin. Chem. 37, 1945-1949 (1991) . Este proceso ocurre subsecuentemente a la liberación del ácido nucleico de los organismos de CMV y usa cuentas de vidrio finas para adsorber el ácido nucleico de tal manera que la proteína y las otras substancias pueden eluirse selectivamente antes de la recuperación del ácido nucleico para amplificación. Como se evidencia mediante las referencias anteriormente descritas, la mayoría de la publicación respecto a la inhibición de amplificación del ácido nucleico se ha relacionado con la PCR. Sin embargo, estas misms substancias que son inhibitorias para la PCR, así como un número de substancias encontradas comúnmente en las muestras clínicas tales como las substancias proteicas, EDTA, ADN humano y hierro se ha encontrado que son inhibitorias para SDA, y otros procesos de amplificación del ácido nucleico asimismo. También, la mayoría de estos métodos para reducir o remover las substancias inhibitorias de la hibridización del ácido nucleico involucran pasos complicados más bien retardados que deben añadirse a la metodología de procesamiento de muestra. Otro problema con los métodos que utilizan pasos o condiciones de procesamiento relativamente serisos y/o requieren la separación del ácido nucleico de blanco de otras substancias, es la pérdida de una cierta secuencia del ácido nucleico de blanco. A pesar de la capacidad de los procesos de amplificación del ácido nucleico para hacer copias múltiples de la secuencia de blanco (amplicons) de muy pocos blancos originales, la eficiencia de amplificación y la capacidad de detección se mejoran si hay grandes números de blancos originales en la muestra. La mayor capacidad de detección puede ser muy importante cuando se procesan muestras particularmente difíciles de detectar tales como muestras de Bacill us resistente al ácido (AFB) Mycobacteri um tuberculosis negativo de frote.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN A fin de enfocar los problemas asociados con la presencia de substancias inhibitorias a la hibridización del ácido nucleico en muestras y de esta manera lograr los beneficios de amplificación más eficiente y detección mejorada de las secuencias del ácido nucleico de blanco, la presente invención proporciona un método para reducir la cantidad de estas substancias en las muestras mediante antes de la lisis de las células en la muestra que contienen el ácido nucleico que va a amplificarse, poner en contacto la muestra con un agente que no lleva a cabo la liberación del ácido nucleico de las células y luego separar las células del agente. Los ejemplos de algunos agentes útiles para usarse en la presente invención incluyen caotropos tales como tiocianato de guanidina, perclorato de sodio y tiocianato de sodio. Asimismo, la separación de las células del agente por lo general se logra mediante un paso de lavado y centrifugación con una solución en donde es soluble el agente.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los distintos objetos, ventajas y particularidades novedosas de la invención se apreciarán más fácilmente de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con las figuras anexas en las cuales : La Figura 1 es una representación gráfica de los resultados de un experimento llevado a cabo para determinar si el método de la presente invención reduce la cantidad de inhibición de la amplificación del ácido nucleico de una muestra clínica en comparación con un método de procesamiento de muestra normal de control. La Figura 2 es una representación gráfica de los resultados de un experimento llevado a cabo para determinar el pH óptimo y los valores de concentración para un agente específico usado en el método de la presente invención. La Figura 3 es una representación gráfica de los resultados de un experimento que muestra la eficacia del método de la presente invención para reducir la cantidad de inhibidores de la hibridización del ácido nucleico de las muestras clínicas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se manifiesta en lo que antecede, la presente invención se relaciona con un método para reducir la cantidad de substancias que son inhibitorias para los procesos de hibridización del ácido nucleico, a partir de muestras que contienen células con ácido nucleico que se someterán a un proceso de hibridización. En el método, un agente que solubiliza estas . substancias y no efectúa la liberación del ácido nucleico de las células, se pone en contacto con una muestra antes de someter a lisis las células en la muestra de tal manera que las células que contienen el ácido nucleico permanecerán en la muestra. Luego, estas células se separan del agente. Los resultados de este método eran particularmente inesperados debido a la complejidad de algunos de los procesos ensayados por otros para remover las substanacias inhibitorias como se evidencia mediante sección de antecedentes de la invención anteriormente citada. Asimismo, los agentes usados en el método de la presente invención se creía generalmente por aquellas personas expertas en la técnica que eran útiles para efectuar la liberación del ácido nucleico de las células mediante lisis de pared de la célula o solubilización, como se evidencia mediante varias referencias tales como la Patente Norteamericana Número 5,482,834, en donde se da a conocer que las sales caotrópicas son útiles de manera específica para la solubilización o lisis de las células. Por lo general, estos agentes se usaron en combinación con calentamiento para Usar o solubilizar las células. Las propiedades lisogénicas de la pared de la célula de caotropos tales como tiocianato de guanidinio (GuSCN) también se han dado a conocer en referencias tales como de Hubbard y otros, Experimental & Applied Acarology 19, 473-478 (1995), Boom y otros, J. Clin. Microbiol . 28 495-503 (1990), Reek y otros, BioTechniques 19, 282-285 (1995), Chunge y otros, J. Med. Virol. 40, 142-145 (1993) y Shah y otros, J. Clin. Microbiol. 33, 322-328 (1995) . De manera semejante, los caótropos y detergentes tales como GuSCN se han utilizado extensamente en la extracción del ácido nucleico de células como se da conocer en las referencias tales como la de Delacourt y otros, J. Pediatrics 126 703-710 (1995), Lee y Choi, J. Microbiol. & Biotechnol. 5, 181-187 (1995), Cano y otros, J. Food Protection 58, 614-620 (1995), Bartolomé y otros, J. Hepatol. 17, s90-s93 (1993), Rajagopaian y otros, Lett.

Applied. Microbiol. 21, 14-17 (1995) y Shieh y otros, J^ Virol. Methods 54, 51-66 (1995) . Por lo tanto, el método rápido y sencillo de la presente invención en donde las células en una muestra se ponen en contacto (lavan) con este agente antes de la lisis de la célula para remover las substancias inhibitorias de la hibridización del ácido nucleico fue inesperado en vista de los otros procesos que están siendo usados en la técnica. Asimismo, una de las ventajas del método de la presente invención es la capacidad para aumentar el rendimiento inicial de ácido nucleico de blanco de las células en una muestra. Aún cuando los procesos de amplificación del ácido nucleico son capaces de crear muchas copias de una secuencia de blanco (amplicons) de unos cuantos blancos iniciales, es benéfico iniciar el proceso de amplificación con tantos blancos iniciales como sea posible. Otros procesos para remover las substancias inhibitorias de la hibridización del ácido nucleico subsecuentemente a la lisis de las células son notablemente ineficientes debido a que se basan en la separación del ácido nucleico de otras substancias en el lisado y, por lo tanto, no se recuperan muchos de los blancos iniciales. En el método presente, en donde las substancias inhibitorias se removieron antes de la lisis de la célula, esta separación subsecuente no es necesaria y se logran rendimientos mejores del blanco inicial. Las muestras que se pueden someter al método de la presente invención incluyen virtualmente todas las muestras clínicas humanas y veterinarias tales como muestras de esputo, muestras de sangre, muestras de orina, muestras de fluido cerebroespinal ("CSF") y otras, muestras ambientales tales como muestras de agua, aire y tierra, y muestras de alimentos. Las muestras que se pueden someter al método de la presente invención se sospecha que contienen células con una secuencia de ácido nucleico de blanco que va someterse a un proceso de hibridización tal como hibridización de sonda directa o hibridización del cebador para la iniciación de un proceso de amplificación. Las substancias que son inhibitorias a los procesos de hibridización del ácido nucleico y que se encuentran típicamente en estas muestras incluyen materiales proteicos y el ADN humano en muestras humanas y ADN animal en muestras veterinarias. Como se discute en la sección de antecedentes anteriormente citada, esas substancias se conoce que son inhibitorias de los procesos de amplificación del ácido nucleico tales como SDA, PCR, LCR, NASBA, TMA y otras.

El primer paso del método de la presente invención es poner en contacto la muestra con un agente en donde es soluble la substancia inhibitoria y que no efectuará la liberación del ácido nucleico a partir de las células. Este contacto puede ocurrir en cualquier momento antes de someterse a lisis las células para liberar el ácido nucleico de blanco. Sin embargo, un tiempo preferido para poner en contacto las células con este agente es después de cierta manipulación de la muestra para concentrar la ubicación de las células o granular las células. Típicamente, esta concentración es un resultado de la centrifugación, pero también puede ser el resultado de filtración o absorción selectiva. Esta concentración de las células proporciona una mayor seguridad de que el agente se pondrá en contacto con las células y permite el uso más eficiente del agente debido a una ubicación definida de las células. El contacto de las células con el agente de preferencia es un lavado relativamente breve de las células. Típicamente, el contacto de las células y el agente es hasta de aproximadamente 5 minutos. Muchos agentes son útiles en el método de la presente invención. Los ejemplos de estos agentes útiles incluyen caótropos y detergentes que son bien conocidos por aquellas personas expertas en la técnica tales como Tritón X-100, Tritón X-114, NP-40, Brik 35, Brij 58, Tween 20, Tween 80, glucósido de octilo, tioglucósido de octilo, Chaps, yoduro de sodio, perclorato de sodio, yoduro de potasio, tiocianato de sodio, tiocianato de potasio, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina, tricloroacetato de sodio, trifluoroacetato de sodio y urea. Otros agentes útiles en el método de la presente invención pueden identificarse mediante una persona conocedora de la técnica con un grado razonable de éxito llevando a cabo los ensayos de selección rutinarios dirigidos hacia las dos características primarias de estos agentes, el grado de solubilización de las substancias inhibitorias de la hibridización del ácido nucleico y la falta de llevar a cabo la liberación del ácido nucleico desde las células. Abreviando, un agente se pone en contacto con las células, las células se centrifugan y la reacción de amplificación para la secuencia del ácido nucleico de blanco común a las células se lleva a cabo en el líquido sobrenadante en un ensayo de selección rutinario. Si se amplifica la secuencia del blanco, entonces el agente no llena los requisitos para usarse en el método de la presente invención debido a que ha efectuado la liberación del ácido nucleico desde las células, mientras que la falta de amplificación de la secuencia de blanco y la amplificación de una secuencia de control interna indicarían que el agente puede ser útil en el método de la presente invención. Luego, el agente que no ha efectuado la liberación del ácido nucleico desdelas células se coloca en contacto con las substancias inhibitorias de la hibridización del ácido nucleico conocidas y el grado de solubilización de la substancia inhibitoria se determina rápidamente en un ensayo de selección rutinario. Aquellos agentes que solubilizan la substancia inhibitoria son útiles en el método de la presente invención. La concentración y cantidad del agente usadas en el método de la presente invención depende del tipo de muestra que está siendo sometido al método. Los ejemplos de concentraciones apropiadas de caótropos y detergentes para usarse en el método de la presente invención se presentarán a continuación en el Cuadro I.

CUADRO I Concentraciones de Caótropo/Detergente Caótropo/Detergente Concentraciones Tritón X-100 0.024 mM, 0.24 mM, 2.4 mM Tritón X-114 0.021 mM, 0.21 M, 2.1 mM NP-40 0.029 mM, 0.29 mM, 2.9 mM Brij 35 0.009 mM, 0.09 mM, 0.9 mM Brij 58 0.0077 mM, 0.077 mM, 0.77 mM Tween 20 0.006 mM, 0.06 mM, 0.6 mM Tween 80 0.0012 mM, 0.012 mM, 0.12 mM Glucósido de octilo 2.4 mM, 24 mM Tioglucósido de octilo 0.9 mM, 9.0 mM Chaps 0.9 mM, 9.0 mM Nal 2M, 3M, 4M, 5M, 6M NaCl?4 2M, 3M, 4M, 5M, 6M KI 2M, 3M, 4M, 5M, 6M NaSCN 2M, 3M, 4M, 5M, 6M KSCN 2M, 3M, 4M, 5M, 6M Isotiocianato de guanidina 2M, 3M, 4M, 5M, 6M Tricloroacetato de sodio 2M, 3M, 4M, 5M, 6M Trifluoroacetato de sodio 2M, 3M, 4M, 5M, 6M Urea 2M, 3M, 4M, 5M, 6M Por lo general, el volumen del agente usado en el método de la presente invención es por lo menos igual al volumen de la muestra. De manera más específica, la relación de volumen-volumen del agente a la muestra es de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 5:1. Asimismo, por lo general se prefiere que el agente se prepare como una solución básica, con mayor preferencia siendo determinado los valores de pH para estos agentes específicos mediante un ensayo de selección rutinario que se basa por ejemplo en los experimentos presentados en el Ejemplo 3 de la presente, en donde 6.0 M de una solución de isotiocianato de guanidina pH de 9.0 se encontró que era particularmente benéfico para reducir la cantidad de las substancias inhibiotorias de la hibridización del ácido nucleico. La concentración óptima (molaridad) de un agente específico también se puede determinar usando el mismo tipo de ensayo de selección rutinario basándose en los experimentos presentados en el Ejemplo 3 de la presente. Asimismo, por lo general, el agente se pone en contacto con la muestra a temperatura ambiente. Cuando el agente se pone en contacto con las células de la muestra, las substancias inhibitorias de la hibridización del ácido nucleico se solubilizan mediante el agente lavando de esta manera estas substancias de las paredes de las células. Debido a que los agentes apropiados no efectúan la liberación del ácido nucleico desde las células, la pérdida del ácido nucleico de blanco cuando se separa el agente desde la células no es un problema. Sin embargo, los agentes usados en el método de la presente invención pueden también efectuar perjudicialmente los procesos de hibridización del ácido nucleico y por lo tanto, estos agentes son separados subsecuentemente desde las células. Esta separación puede lograrse mediante cualquier medio apropiado tal como filtración o lavado y centrifugación, con o sin un agente de estabilización en donde el agente soluble. De preferencia, este agente estabilizador se usa a fin de asegurar la remoción de las substancias inhibitorias así como el agente antes de la lisis de la célula. Por lo tanto, cuando estas células se someten a lisado, el ácido nucleico de blanco se presenta en un medio ambiente con cantidades mínimas de substancias que son inhibitorias para el proceso de hibridización al cual se someterá el ácido nucleico de blanco. Se usan en la actualidad una variedad de procesos para preparar ácidos nucleicos de blanco en muestras para la hibridización o amplificación. Por ejemplo, las muestras de esputo que se procesan para amplificar las secuencias de ácido nucleico icrobacterianas se someten típicamente a un proceso de NALC/NaOH. El método de la presente invención puede ser particularmente útil con muestras microbacterianas sometidas a este proceso de NALC/NaOH debido a su solubilización selectiva de los granulos de NALC/NaOH para reducir la aglomeración de estas muestras. De manera semejante, otros tipos de muestras clínicas se someten a otros procesos normales bien conocidos, por ejemplo, la centrifugación para muestras de gran volumen tales como de sangre y orina. El método de la presente invención puede usarse antes como parte de o después de aquellos procesos normales siempre y cuando el método se lleve a la práctica antes de la lisis de las células que contienen el ácido nucleico de blanco. El método de la presente invención no requiere la ligazón cuantitativa y liberación del ácido nucleico de blanco desde una superficie de ligazón y por lo tanto permite el uso de una mayor cantidad de la muestra de la que se utiliza convencionalmente en la hibridización a base del ácido nucleico o ensayos de amplificación. Esta capacidad de usar mayor cantidad de la muestra confiere mayor sensibilidad de estos ensayos y hay más ácido nucleico de blanco presente en las etapas iniciales del ensayo. La selectividad de los agentes en las substancias inhibitorias de solubilización pero no concomitantemente el ácido nucleico de blanco de solubilización o las paredes de la célula, es una de las características de los agentes que contribuyen a los resultados del método de la presente invención como se demuestra mediante los Ejemplos que se señalarán a continuación. Los siguientes ejemplos ilustran las modalidades específicas de la invención descritas en la presente. Como se hará evidente para los artesanos expertos, varios cambios y modificaciones son posibles si se proponen dentro del alcance de la invención descrita.

EJEMPLO 1 Comparación del Método de la Presente Invención Con el Método de Procesamiento de Muestra de Control El objeto de este Ejemplo fue determinar si un método de la presente invención reduce la cantidad de inhibición de la amplificación del ácido nucleico de una muestra clínica y por lo tanto rinde mejores valores de detección de blanco en comparación con un método de procesamiento de muestra normal de control.

MATERIALES REACTIVOS DE PROCESAMIENTO DE MUESTRA Perclorato de Sodio (Sigma) Tiocianato de Sodio (Sigma) Tiocianato de Guanidina (Sigma) H2O Destilada de Osmosis Inversa ("RODI") MycoPrep (BBL) Diluyente de Muestra de MAC/TB Solución de Estabilizador de Fosfato (BBL) Cápsulas que Contienen Cuentas de Zirconio (Becton Dickinson) • Muestras de Esputo Clínicas; Muestra ID 785, 657, 634, 8594, 8894, 13883, 8396, 13867, 13088, 146 • Células Micobacterinas del Complejo de M. a iorna ("MAC") REACTIVOS DE AMPLIFICION H20 RODI 500 mM de KPO4 50X PBA • 50X dCAG 5 miligramos por mililitro de BSA 100 mM de DTT 50 por ciento de trehalosa IU/microlitro de UDG • 192 mM de magnesio 50X dU 5U/microlitro de UDI Bst 120U/microlitro Bso BI 160U/microlitro • Control de Amplificación Interna ("IAC") 103 55 por ciento de glicerol DMSO ADN de la placenta humana Anti-espumante • Diluyente de blanco REACTIVOS DE DETECCIÓN Mezcla de hibridización M. tb. Sondas de MAC Diluyente de hibridización Mezcla de hibridización de IAC Fluido del sistema Fluido de la lavada Dispositivo de ensayo ("AD") LUMIPHOS 530 Tubos Labcraft® de 2.0 mililitros Calibradores de ensayo MAC Calibradores de ensayo PROCEDIMIENTO Se preparó el NaCl?4 a 2M en agua destilada. Se preparó el NaSCN en 3M en agua destilada. Se preparó el GuSCN a 4M en agua destilada. Cada una de estas soluciones de caótropo se distribuyó hacia diez tubos LabCraft® de capacidad de 2.0 mililitros a razón de 1.0 mililitro por tubo. Una alícuota de 1.0 mililitro del agente estabilizador de la muestra de MAC/TB se distribuyó hacia diez tubos de LabCraft® de capacidad de 2.0 mililitros. Se descongelaron a temperatura ambiente diez muestras de esputo clínicas. El agente estabilizador de MycoPrep se añadió a un volumen igual a los volúmenes de la muestra de esputo y las muestras se sometieron a vórtice y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadió luego el estabilizador de fosfato a cada muestra para ajustar el volumen total de cada muestra hasta 50 mililitros. Las muestras se sometieron a vórtice y se centrifugaron a 3,000 de fuerza centrífuga relativa (RCF) durante 20 minutos. El líquido sobrenadante se decantó y se añadieron 2.0 mililitros del estabilizador de fosfato a cada muestra y las muestras se sometieron a vórtice. Las células de MAC a 75 partículas por mililitro se colocaron el la muestra resultante. Una alícuota de 500 microlitros de cada muestra luego se distribuyó hacia todos los cuatro tipos de estabilizador de lavada descritos (muestra del agente estabilizador, 2M de NaC10 , 3M de NaSCN y 4M de GuSCN a 1.0 mililitro de los anteriores). Las muestras se sometieron a vórtice y se centrifugaron a 12,200 RCF durante 3.0 minutos. El líquido sobrenadante se decantó y el granulo se volvió a suspender con 1.0 mililitro del estabilizador de muestra de MAC/TB y luego se centrifugó a 12,220 RCF durante 3.0 minutos. De nuevo, el líquido sobrenadante se decantó, el granulo se volvió a suspender con 1.0 mililitro del estabilizador de muestra de MAC/TB y se centrifugó a 12,200 RCF durante 3.0 minutos. Se insertó dentro de cada tubo una cápsula que contiene cuentas de zirconio y cada granulo se volvió a suspender con 400 microlitros del estabilizador de muestra de MAC/TB. Las muestras se calentaron durante 30 minutos a 105°C en un horno de aire caliente forzado para lisar las células micobacterianas y convertir en no infecciosos cualesquiera de los organismos micobacterianos . Los tubos de las muestras luego se cargaron en un instrumento Savant CellPrep™ que se hizo funcionar a graduación de 5.0 m/s durante 45 segundos para separar los ácidos nucleicos de los otros componentes celulares. Las muestras luego se procesaron adicionalmente en un sistema de amplificación y de detección de MAC/TB de la siguiente manera. Se llevó a cabo el SDA termofílico como se describe en la Solicitud de Patente Europea publicada Número 0 684 315 en una mezcla de reacción que comprende 25 mM de fosfato de potasio de pH de 7.6, 100 microgramos por mililitro de albúmina de suero bovino acetilado (BSA) , 0.5 mM de dUTP, 0.2 mM de cada uno de dATP y dGTP, y 1.4 mM de 2 ' -deoxicitidina, 5 ' -O- (1-tiotrifosfato) (alfa-tio dCTP) , 12 por ciento de glicerol, 6.5 mM de acetato de magnesio, 0.5 mM de cebadores de amplificación, 0.05 micrómetros de cebadores de tope, 50 ng del ADN de placenta humana, 12.5 unidades de polimerasa de Bst, 160 unidades de BsoBI, 1 unidad de uracil-N-glicosilasa (UNG) y 2 unidades del inhibidor de uracil-N-glicosidasa (Ugi) . Antes de la adición de las enzimas y la iniciación de la reacción de amplificación, las muestras se hirvieron durante 2 minutos. Las muestras luego se incubaron a 41°C durante 2 minutos y se añadió UNG para degradar cualesquiera de los amplicons contaminantes. Después de una incubación de 30 minutos con UNG, las muestras se transfirieron a temperatura de 52°C durante 5 minutos. La mezcla de enzima (polimersa de Bst, BsoBI, Ugi y glicerol) se añadió y se dejó proseguir la amplificación durante 30 minutos a 52°C. La reacción se detuvo mediante ebullición durante 5 minutos. Los productos de amplificación se detectaron en un ensayo quimioluminiscente esencialmente como se describe por C.A. Spargo y otros, (1993, Mol ec . Cell . Probes 7, 395-404) . Las sondas detectoras irradiadas con fosfatasa alcalina para M. tb., MAC e IAC, las sondas de captura biotiniladas para M. tb., MAC e IAC, y las muestras se añadieron al pozo de una placa de microvaloración revestida con estreptavidina y se incubaron durante 50 minutos a 37°C. Los pozos luego se lavaron tres veces con un estabilizador. Se añadió LUMIPHOS (Lumigen, Inc.) y la reacción se incubó durante 30 minutos a 37°C. Se detectó la luminiscencia en un lumino-medidor (Dynatech) y se registraron las unidades de luz relativas (RLUs) .

RESULTADOS Se proporcionan los resultados en el cuadro que se presenta a continuación como valores medios de M. tb., MAC e IAC para las diez muestras y en forma gráfica en la Figura 1. CAOTROPO TB(RLU) MAC (RLU) IAC(RLU) 2M NaC104 0.42 189.1 157.4 3M NaSCN 0.42 166.6 122.5 4M GuSCN 0.5, 11.91* 196.1 87.7 CONTROL 0.6, 2.33* 36.2 54.1 * Ambos métodos de lavar tenían la misma muestra con valores positivos de M. tb., indicando un diagnóstico erróneo posible en el sitio clínico.

CONCLUSIONES Los datos de este Ejemplo indican que, estadísticamente no hay diferencia en los valores de IAC para ningunas de las condiciones de lavar, sin embargo es interesante que los valores medios para todas las condiciones del agente son más elevadas que el procedimiento de lavar de control. Los datos también muestran estadísticamente la condición de 4M de GuSCN produjo valores específicos más elevados de MAC RLU que ninguna de las otras tres condiciones. Esto indica que el método de la presente invención como se práctica en la presente no daña el microbacterio y de hecho en el caso de 4M de GuSCN mejora la recuperación del organismo de MAC y subsecuentemente el ADN de blanco.

EJEMPLO 2 Selección de Muestras Clínicas para la Inhibición de la Amplificación del Acido Nucleico El objeto de este Ejemplo era seleccionar las muestras clínicas para inhibición de la amplificación del ácido nucleico.

MATERIALES REACTIVOS DE PROCESAMIENTO DE MUESTRA • Reactivo MycoPrep • Estabilizador de fosfato BBL, pH de 6.8 • Diluyente de muestra de TB/MAC • Esputo negativo de cultivo frote negativo de N. Carolina Public Health, Muestra ID 8207, 1514, 13472, 14199, 13847, 3675, 6401, 4691, 13545, 13711, 9939, 12227, 12228, 12161, 8406, 782, 13547, 13448, 13506, 13319, 13420, 243, 103. • Cápsulas que contienen una cuenta de zirconio. REACTIVOS DE AMPLIFICACIÓN Igual que para el Ejemplo 1, y un Control de Plásmido IN2. REACTIVOS DE ENSAYO Igual que para el Ejemplo 1.

PROCEDIMIENTO Se descongelaron a temperatura ambiente 23 muestras de esputo clínico. Cualquier esputo con más de 12 mililitros de esputo se dividió en un tubo separado de tal manera que la escala de volúmenes para cualquier muestra de esputo procesada era de 7.5 a 12 mililitros. El reactivo MycoPrep se añadió a las muestras de esputos a un volumen igual al volumen del esputo. Las muestras se sometieron a vórtice y se mantuvieron a temperatura ambiente durante 15 minutos. El volumen de cada solución de esputo se ajustó a 50 mililitros con el agente estabilizador de fosfato. Las soluciones se centrifugaron a 3,000 RCF durante 20 minutos. El líquido sobrenadante se decantó de cada granulo de muestra y se añadieron a cada tubo 2.0 mililitros del agente estabilizador de fosfato. Las muestras se dividieron en alícuotas en alícuotas de 500 microlitros en tubos LabCraft® de capacidad de 2.0 mililitros. Una muestra de cada tipo se mantuvo a temperatura ambiente y las muestras restantes se almacenaron a -70°C. Un mililitro del estabilizador de la muestra de MAC/TB se añadió a cada muestra mantenida a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 12,200 RCF durante 3.0 minutos. El líquido sobrenadante se decantó, se añadió 1.0 mililitro del estabilizador de muestra de MAC/TB a cada tubo y los tubos se centrifugraon a 12,200 RCF durante 3.0 minutos. El líquido sobrenadante se decantó, se añadió una cápsula que contiene una cuenta de zirconio a cada tubo y se distribuyó hacia cada tubo 400 microlitros del estabilizador de muestra de MAC/TB. Los tubos se calentaron en un horno de aire caliente forzado a 105°C durante 30 minutos para lisar las células micobacterianas a fin de convertir en no infecciosos cualesquiera de los organismos micobacterianos . Los tubos se agitaron en un instrumento Savant CellPrep™ usando una graduación de 5.0 m/s durante 45 segundos. Usando el desplazamiento en cadena termofílico (tSDA) se usaron un ensayo triple líquido de MAC/TB y procedimientos de detección como se describe en el Ejemplo 1, a fin de generar los resultados de este experimento en Unidades de Luz Relativas (RLUs) .

RESULTADOS Los resultados se presentan en el cuadro que se da a continuación MUESTRA DE ID M TB(RLU) MAC (RLU) IAC(RLU) 8207 0.3 5.3 0.3 13506 0.3 3.8 0.7 13472 0.3 3.9 12 14199 0.3 2.1 44 13847 0.3 2.9 116 3675 0.3 2.4 24 6401 0.4 0.9 0.7 4691 0.4 1.3 2 13545 0.4 4.0 16 13711 0.3 2.3 69 9939 0.3 2.0 10 1514 0.3 2.7 50 12228 0.3 0.7 7 12161 0.2 3.5 6 8406 0.4 1.6 8 782 0.3 1.5 0.4 13547 0.6 2.4 41 13319 0.9 3.0 10 243 0.5 0.7 106 13448 0.4 1.1 0.8 13420 0.4 1.2 54 103 0.8 0.5 123 12227 0.5 1.4 66 CONCLUSIÓN De las ventitres muestras clínicas ensayadas en el sistema de MAC/TB, nueve produjeron valores de IAC de menos de 10 RLUs indicando inhibición seria de la reacción de amplificación/detección mediante la muestra clínica. Estos especímenes inhibitorios producidos bajo condiciones de lavado de muestra "normales" se procesaron además como se muestra en los Ejemplos que se presentan a continuación.

EJEMPLO 3 Ajustes de pH y Molaridad a la Solución de Caótropo El objeto de este Ejemplo fue determinar si el pH y la molaridad del lavado de GuSCN se puede ajustar para remover más inhibidores de las muestras clínicas.

MATERIALES REACTIVOS DE PROCESAMIENTO DE MUESTRA • Muestra de granulo de NALC negativo Números 6401, 8406, 782, 13448, 13506 del Ejemplo 2. • Isotiocianato de guanidina (GuSCN) Gibco BRL • Estabilizador de muestra de MAC/TB • Cápsulas que contienen una cuenta de zirconio • 500 mM de fosfato de potasio (KP0 ) • 5N de NaOH Ricca • Células micobacterianas de M. tb. REACTIVOS DE AMPLIFICACIÓN Igual que para el Ejemplo 1. REACTIVOS DE ENSAYO Igual que para el Ejemplo 1.

PROCEDIMIENTO Se preparó un depósito o charco inhibitorio de NALC negativo distribuyendo 1.0 mililitro de la muestra 782 y 500 microlitros de las muestras 6401, 8406, 13448 y 13506 en un tubo de polipropileno de 2 mililitros. Los organismos de M. tb. se colocaron en el depósito inhibitorio a razón de 200 partículas por mililitro (7.5 partículas/reacción final de tSDA) . Las soluciones de GuSCN preparadas se compendian en el cuadro que se presenta a continuación. Las soluciones de pH de 7.0 y 9.0 se ajustaron al pH indicado con 5N de NaOH.

SOLUCIONES DE CAOTROPOS 6.0 M GuSCN, pH 4.9 4.0 M GuSCN, pH 5.6 6.0 M GuSCN, pH 7.0 4.0 M GuSCN, pH 7.0 6.0 M GuSCN, pH 9.0 4.0 M GuSCN, pH 9.0 Cada solución de GuSCN se distribuyó hacia un tubo LabCraft® de capacidad de 2.0 mililitros a razón de 1.0 mililitro por tubo. El depósito inhibitorio de NALC negativo se distribuyó hacia cada tubo que contiene GuSCN a 500 microlitros por tubo. Los tubos se sometieron a vórtice brevemente y los tubos se centrifugaron a 12,200 RCF durante 3.0 minutos. El líquido sobrenadante se decantó y se distribuyó 1.0 mililitro del estabilizador de la muestra de MAC/TB hacia cada tubo y los tubos se centrifugaron a 12,200 RCF durante 3.0 minutos. El líquido sobrenadante se decantó y se distribuyó hacia cada tubo 1.0 mililitro del estabilizador de muestra de MAC/TB. Los tubos se centrifugaron a 12,200 RCF durante 3.0 minutos. El líquido sobrenadante se decantó y una cápsula que contiene una cuenta de zirconio se insertó en cada tubo. El estabilizador de muestra de MAC/TB se decantó en cada tubo a 400 microlitros por tubo. Los tubos se calentaron en un horno de aire caliente forzado durante 30 minutos. Los tubos se agitaron en un instrumento Savant CellPrep™ usando una graduación de 5.0 m/s durante 45 segundos. El tSDA usando el ensayo triple líquido de MAC/TB y los procedimientos de detección como se describen en el Ejemplo 1, se usaron para generar los resultados de este experimento en Unidades de Luz Relativas (RLUs) .

RESULTADOS Se presentan los resultados en el cuadro que se da a continuación y en forma gráfica en la Figura 2.

GuSCN (M) pH M TB RLUs MAC RLUs IAC RLUs .7 2.4 0.3 1.9 4.9 1.5 0.4 0.7 2.4 0.4 1.3 6 7 32.8 0.4 6 . 6 2.6 0.4 5.3 1022.7 0.4 320.4 Nota: Los valores de M. tb., MAC e IAC eran los medios de cinco muestras duplicadas de amplificación/ detección.

CONCLUSIÓN La condición de GuSCN de 6.0 M, de pH de 9.0 produjo estadísticamente mejores valores de M. tb., e IAC RLU que las otras condiciones sin producir valores de MAC no específicos. Esto indica que se remueven una cantidad mayor de los inhibidores de hibridización del ácido nucleico usando la solución de GuSCN de 6.0 M, de pH de 9.0 sin liberar el ácido nucleico de blanco del micobacterio.

EJEMPLO 4 Lavado de GuSCN (a 6 M y pH de 9.0) Usando Muestras Clínicas Negativas con M. tb.

El objeto de este Ejemplo fue determinar si las muestras clínicas reforzadas con M. tb. y lavadas con la solución de 6 M de GuSCN de pH de 9.0 removerán los inhibidores de hibridización del ácido nucleico indeseados y permitirán la amplificación y detección del blanco del ADN de M. tb. específico.

MATERIALES REACTIVOS DE PROCESAMIENTO DE MUESTRA • Muestras de granulo de NALC negativo Números 8207, 1514, 13472, 14199, 13847, 3675, 6401, 4691, 13545, 13711, 9939, 12227, 12228, 12161, 8406, 782, 13547, 13448, 13506, 13319, 13420, 243, 103. • Isotiocianato de guanidina (GuSCN) Gibco BRL • Estabilizador de muestra de NAC/TB • Cápsulas que contienen una cuenta de zirconio. • 500 mM de fosfato de potasio (KPO4) • 5N de NaOH Ricca REACTIVOS DE AMPLIFICACIÓN Igual que para el Ejemplo 1. REACTIVOS DE ENSAYO Igual que para el Ejemplo 1 PROCEDIMIENTO Se preparó una solución de GuSCN a 6 M con 200 mM de KPO4 y se ajustó a un pH de 9.0 con 5 N de NaOH como en el Ejemplo 3. Los organismos de M. Tb. se reforzaron en 500 microlitros de cada muestra clínica de la sección de materiales del Ejemplo 2 a 200 partículas/mililitros (7.5 partículas/reacción de amplificación) . Algunas de estas muestras del Ejemplo 2 eran inhibitorias para la hibridización del ácido nucleico. M. tb. se reforzó en 500 microlitros del estabilizador de MAC/TB a 200 partículas/ mililitro y se marcó como "control de procesamiento de muestra" . La solución de GuSCN se distribuyó hacia un tubo LabCraft® de capacidad de 2.0 mililitros a 1.0 mililitro y el tubo se marcó como "control negativo de GuSCN". Un mililitro de la solución de GuSCN de 6 M, pH de 9.0 se distribuyó hacia cada tubo de muestra clínica. Los tubos se sometieron a vórtice y se centrifugaron a 12,200 RCF durante 3.0 minutos. El líquido sobrenadante se decantó y se distribuyó 1.0 mililitro del estabilizador de MAC/TB hacia cada tubo y los tubos se centrifugaron a 12,200 RCF durante 3.0 minutos. El líquido sobrenadante se decantó y se distribuyó 1.0 mililitro del estabilizador de muestra de MAC/TB hacia cada tubo y los tubos se centrifugaron a 12,200 RCF durante 3.0 minutos. El líquido sobrenadante se decantó y se añadió de la cápsula se zirconio a cada tubo. Se añadió el estabilizador de muestra de MAC/TB a cada tubo a razón de 400 microlitros por tubo. Los tubos se calentaron y agitaron como se describe en los Ejemplos anteriores. El tSDA usando el ensayo triple líquido de MAC/TB y los procedimientos de detección descritos en el Ejemplo 1 se usaron para generar los resultados de este experimento en Unidades de Luz Relativas (RLUs) .

RESULTADOS Los resultados se presentan en un cuadro que se da a continuación como el medio de tres duplicados de amplificación de cada muestra procesada y en forma gráfica en la Figura 3.

MUESTRA CLÍNICA ID M TB (RLUs) IAC (RLUs) 8207 1515.7 298.9 1514 1290.5 200.8 13472 223.5 79.6 14199 1004.8 263.4 13847 1342.1 154.3 3675 294.7 20.2 6401 279.5 71.6 13545 396.5 43.6 13711 275.5 32.8 9939 335 134.6 12227 1144.1 185.4 12228 297.7 43.6 12161 778.1 66.6 8406 478.6 90.9 4691 344.6 15.3 13547 1271.9 188 13448 358.5 16.3 13506 1470.4 101.8 13319 993.7 88 13420 1490.5 305 243 1406.2 117.9 103 1052.2 132.5 782 158.9 171.3 GuSCN NEG. CTRL. 1.8 91.7 M. tb. y control estabilizador 568.5 37.9 CONCLUSIÓN Ventitres valores de IAC proporcionaron valores de tSDA aceptables de más de 10 RLUs indicando que no se inhibió la reacción de amplificación. Además, se detectó M. tb. a 7.5 partículas/reacción de amplificación en cada muestra reforzada como se evidencia de las relaciones de RLU específica a de fondo de menos de 88.2:1 para cada muestra. En el Ejemplo 2, se demostró que 5 de las muestras clínicas no usando lavado de GuSCN tenían valores de IAC inhibitorios de menos de 10 RLUs. Las mejoras en casi todas las muestras (aún aquéllas en que se demostró que eran inhibitorias mediante generación de señal baja en el Ejemplo 2) se lograron con el método de la presente invención como se practica en este Ejemplo. Aún cuando la invención se ha descrito con cierta especificidad, pueden hacerse las modificaciones evidentes para aquellos conocedores de la técnica sin desviarse del alcande de la invención. Se señalan en las siguientes reivindicaciones distintas particularidades de la invención.

Claims (10)

R E I V I N D I C A C I O N E S

1. Un método para reducir la cantidad de substancias que son inhibitorias a los procesos de hibridización del ácido nucleico de una muestra que contiene células que comprende los pasos de: (a) antes de la lisis de las células, poner en contacto las células con un agente que (i) solubiliza las substancias, y (ii) no efectúa la liberación del ácido nucleico desde las células; y (b) separar las células del agente.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el agente se selecciona del grupo que consiste de Trito X-100, Tritón X-114, NP-40, Brij 35, Brij 58, Tween 20, Tween 80, glucósido de octilo, tioglucósido de octilo, Chaps, Nal, NaC104, KI, NaSCN, KSCN, isotiocianato de guanidina, tricloroacetato de sodio, trifluoroacetato de sodio y urea.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el agente es un caótropo.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el caótropo es isotiocianato de guanidina.

5. El método de la reivindicación 4, en donde el isotiocianato de guanidina está presente en una solución con un pH básico.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el pH es de aproximadamente 9.0.

7. El método de la reivindicación 5, en donde la concentración del isotiocianato de guanidina es de aproximadamente 6 M.

8. El método de la reivindicación 1, en donde la separación se lleva a cabo mediante lavado y centrifugación.

9. El método de la reivindicación 1, en donde el agente es un detergente.

10. El método de la reivindicación 1, en donde antes del paso (a) las células se granulan.