MXPA97006263A - Metodos para mantener esterilidad en plantas - Google Patents

Abstract

Se describe un método para mantener esterilidad en plantas. El método comprende la transformación genética de líneas de plantas paternales con un gen de esterilidad que estágenéticamente enlazado a un gen de resistencia, el cual confiere resistencia a un agente selectivo, incrementar la línea paternal transgénica y revestir la semilla de la línea paternal transgénica incrementada con una composición que comprende el agente selectivo al cual el gen de resistencia confiere resistencia. El gen de resistencia puede estar bajo el control de un gen inducible, o, alternativamente, bajo el control de promotores específicos constitutivos o de tejido, incluyendo promotores específicos de semilla.

Description

MÉTODOS PARA MANTENER ESTERILIDAD EN PLANTAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para mantener genes de esterilidad en plantas, y a plantas producidas utilizando el método. El objetivo de la reproducción de plantas, es combinar, una variedad individual, o varias características deseables de híbrido de las líneas paternales. Para granos de campo, estas características pueden incluir resistencia a enfermedades e insectos, tolerancia al calor y sequedad, reducción del tiempo para la madurez del grano, mayor producción y mejorar calidad agrícola. Con la cosecha mecánica de muchos granos, la uniformidad de característica de plantas tales como germinación y establecimiento, velocidad de crecimiento, madurez, y tamaño del fruto, es importante . Los granos de campo son reproducidos a través de técnicas que presentan la ventaja del método de polinización de planta. Una planta es autopolinizada si el polen de una flor es transferido a la misma, u otras flores de la rt-is:r;a planta. Una planta es polinizada por cruce si el polen viene de una flor de una planta diferente. En Brassica, la planta es normalmente autoestéril y sólo puede ser polinizada en cruce. En especies de autopolinización, tales como soya y algodón, los órganos masculinos y femeninos están anatómicamente yuxtapuestos. Durante la polinización natural, los órganos reproductores masculinos de una flor dada, polinizan los órganos reproductivos femeninos de la misma flor. Las plantas de maíz (Zea mays L. ) presentan una única situación en que puedan ser reproducidos a través de técnicas tanto de autopolinización como de polinización de cruce. El maíz tiene flores masculinas, ubicadas sobre la espiga y flores femeninas, ubicadas sobre la mazorca, sobre la misma planta. Puede autopolinizarse o polinizarse en cruce. La polinización natural ocurre en el maíz cuando el viento sopla el polen de las espigas hacia los estigmas que salen de las partes superiores de las mazorcas incipientes. Un método confiable para controlar la fertilidad en plantas podría ofrecer la oportunidad de reproducción de plantas mejoradas y producción de híbridos. En particular, el control de la fertilidad masculina es significativo con relación a la producción comercial de híbridos. Esto es especialmente verdadero para el desarrollo de especies de grano vendidas solamente como híbridos, por ejemplo, sorgo y maíz, ambos de los cuales se basan históricamente en alguna clasificación de sistema de esterilidad masculina. Además, tal método podría ser útil en granos tales como soya, girasol, cánola, trigo y otros, los cuales en el pasado, no han sido receptivos a la hibridación.

La producción de híbridos de maíz requiere del desarrollo de líneas innatas esencialmente homocigotas, ^1 cruce de estas líneas, y la evaluación de los cruces. La reproducción y la selección recurrente son dos de los métodos de reproducción utilizados para desarrollar líneas innatas de poblaciones. Los programas de reproducción combinan características deseables de dos o más de las líneas innatas o varias fuentes de base amplia en grupos de reproducción, a partir de los cuales se desarrollan nuevas líneas innatas mediante fecundación y selección de fenotipos deseados. Una variedad de maíz de híbrido es el cruce de dos líneas innatas, cada una de las cuales puede tener una o más características deseables que carecen de la otra o las cuales complementan a la otra. Las nuevas líneas innatas son cruzadas con otras líneas innatas y los híbridos de estos cruces son evaluados para determinar cuales tienen potencial comercial. La progenie de la primera generación se designa F . En el desarrollo de híbridos solamente se buscan plantas de híbrido F^ . El híbrido F1 es más vigoroso que sus parentescos innatos. Este vigor de híbrido, o heterosis, puede ser manifestado en varias formas, incluyendo el crecimiento vegetativo incrementado y rendimiento incrementado. Estas manifestaciones de heterosis son particularmente significativas desde un punto de vista comercial; el rendimiento incrementado es particularmente importante, tanto para compañías de siembra de maíz, como para granjeros, y las líneas de maíz híbrido de alto rendimiento se han convertido en los productos comerciales de elección en la industria de semilla de maíz. La semilla de maíz híbrida es típicamente producida por un sistema de esterilidad macho incorporando despendonación manual. Las tiras alternantes de dos variedades innatas de maíz son plantadas en un campo, y se remueven las espigas que llevan el polen de una de las innatas (hembra) . Con aislamiento suficiente de las fuentes de polen de maíz extraño, las mazorcas de las líneas innatas despendonadas serán fertilizadas solamente con polen de la otra línea innata (macho) , y la semilla resultante es, por lo tanto híbrida, y formará plantas híbridas. Desafortunadamente, aunque el procedimiento de despendonación manual es muy confiable, también es un procedimiento muy laborioso, el cual debe ser realizado dentro de una ventana específica de tiempo crítico, y si existe una reducción o no disponibilidad de mano de obra, la ventana típica para la despendonación puede ser perdida. Además, una planta hembra ocasionalmente será soplada por una tormenta y escapará a la despendonación. Además, los factores ambientales, pueden ocasionar que las plantas produzcan espigas secundarias después de que se completa la despendonación manual. O, el que realiza la despendonación completamente no eliminará la espiga de la planta, o se pueden formar retoños sóbrenlas plantas hembra, o las espigas pueden desprenderse mientras siguen en el verticilo. En tal caso, tales plantas hembra exitosamente desprenderán el polen y algunas plantas hembra se autopolinizarán . Esto dará como resultado una semilla de la línea innata hembra que es cosechada junto con la semilla híbrida, la cual pretende ser producida. Esta es una desventaja significativa, ya que las líneas innatas generalmente no pretender ser utilizadas para la venta comercial, ya que no tienen el rendimiento comercial de híbridos, y las líneas innatas típicamente, no se hacen públicamente disponibles a menos que sean legalmente protegidas. Alternativamente, las líneas innatas hembra pueden ser mecánicamente despendonadas. La despendonación mecánica es aproximadamente tan confiable como la despendonación manual, pero es más rápida y menos costosa. Sin embargo, la mayoría de las máquinas despendonadoras producen más daño a las plantas que la despendonación manual, y una limpieza final después de la despendonación mecánica siempre requiere una despendonación manual en cualquier caso. De esta manera, ninguna forma de despendonación es en la actualidad completamente satisfactoria, y continúa la necesidad de que existan alternativas, las cuales reduzcan más los costos de producción y eliminan la autopolinización en la producción de semillas híbridas. El procedimiento de despendonación laborioso puede evitarse utilizando líneas intactas estériles macho citoplástnicas (CMS) . Las plantas de una línea intacta CMS son machos estériles, como resultado de factores que resultan del geno a citoplásmico, opuesto al nuclear. Así, esta característica es heredada a través de los parientes hembra en plantas de maíz, ya que solamente las hembras proporcionan citoplasma a la semilla fertilizada. Las plantas CMS son fertilizadas con polen de otra línea intacta que no es macho estéril. El polen de la segunda línea intacta puede o no puede contribuir con genes que hagan machos fértiles a las plantas híbridas. Usualmente, la semilla de maíz normal despendonada y la semilla producida por CMS del mismo híbrido deben ser mezclados para asegurar que estén disponibles cargas adecuadas de polen para la fertilización cuando crezcan las plantas híbridas. También pueden existir otras desventajas para CMS. Una es una asociación históricamente observada de una variante específica de CMS con susceptibilidad a ciertas enfermedades del grano. Este problema ha conducido al abandono virtual del uso de aquella variante particular de CMS para producir maíz híbrido, aunque otros sistemas de CMS siguen estando en uso.

Otra forma de esterilidad, un tipo de esterilidad macho genética, conocida como esterilidad macho nuclear, se describe en las Patentes de los Estados Unidos 4,654,465 y 4,727,219 de Brar, et al. Sin embargo, esta forma de esterilidad macho genética, requiere el mantenimiento de genes mutantes múltiples en ubicaciones separadas dentro del genoma y requiere un sistema marcador complejo para rastrear los genes y hacer uso conveniente del sistema. Patterson también describe un sistema de esterilidad macho nuclear que incorpora translocaciones cromosomales, las cuales son efectivas, pero complicadas. Ver Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,861,709 y 3,710,511. Se han hecho muchos otros intentos para mejorar estas desventajas. Por ejemplo, Fabijanski, et al., desarrollaron varios métodos para provocar esterilidad macho en plantas (véase EPO 89/3010153.8, publicación no. 329,308, y solicitud PCT PCT/CA90/00037, publicada como WO 90/08828) . Un método incluye suministrar a la planta un gen que codifica una sustancia citotóxica asociada con un promotor específico para el tejido macho. Otro método implica un sistema antisentido en el cual un gen crítico a la fertilidad es identificado y un gen, el cual es antisentido al gen de fertilidad, es insertado en la planta. Mariani et al., también describen varias secuencias de gen de codificación de citotoxina, junto con promotores específicos de tejido macho y menciones de un sistema antisentido. Véase EP 89/401,194. Aún otros sistemas utilizan- genes "represores" los cuales inhiben la expresión de otro gen crítico de la fertilidad macho. PCT/GB90/00102, publicada como WO 90/08829. Otros aspectos del trabajo con sistemas de esterilidad macho se relacionan con la identificación de genes que impactan la fertilidad macho. Tal gen puede ser utilizado en una variedad de sistemas para controlar la fertilidad macho. Previamente, se ha identificado un gen de fertilidad macho en Arabidopis thaliana a través de mutantes estériles macho inducido por transposon, y el gen fue clonado después. Aarts, et al., "Transposon Tagging of a Male Sterility Gene in Arabidopsis" , Nature, 363:715-717 (junio 24, 1993). Otro gen de fertilidad macho importante se describe en la solicitud de los Estados Unidos pendiente No. de serie 08/013,739, la cual es una continuación en parte de la solicitud de los Estados Unidos pendiente No. de serie 07/537,183. Véase también Albertsen et al . , Am. J. Botany 80 : 16 (1983) . Sin considerar el sistema esterilizado para lograr la esterilidad macho, como se observó anteriormente, la esterilidad macho es de importancia crítica en la producción de híbridos comerciales. La presencia de machos no esterilizados en un campo de producción comercial, puede tener consecuencias desastrosas, ya que se presentarán cruces indirectos y/o semillas autopolinizadas, y consecuentemente "contaminantes" (en este contexto, semilla que tiene un desarrollo genético diferente a aquel del híbrido el cual pretende ser producido), estarán presentes. Una vez que las líneas paternales estériles macho, transgénicas han sido producidas, se vuelve crucial para desarrollar una estrategia para mantener genes de esterilidad macho y eliminar fertilidades macho en la progenie de endógamos de maíz. Esto es esencial para la utilización en la producción de semilla comercial. Por ejemplo, una estrategia podría ser la unión del gen de esterilidad macho con el gen de resistencia al herbicida de Bar y mantener su característica como un heterocigoto a través de cruce. La progenie cruzada de esto debe segregar 1 estéril: 1 fértil. De esta manera, las plantas fértiles pueden ser eliminadas a través de aplicación por aspersión de un herbicida apropiado: BastaMR por ejemplo. Varias limitaciones están asociadas con este aspecto. La aspersión de herbicidas es por sí misma una práctica potencialmente peligrosa, y el costo del equipo especializado requerido para las aspersión por lo regular es prohibitivo. También, algunos herbicidas pueden tener efectos particularmente devastadores en la salud de plantas sobrevivientes, y en algunos casos puede tener efectos potenciales a largo plazo. Por ejemplo, se sabe que el glifosato puede ser trasladado y almacenado en el tejido meristemático, y esto puede afectar negativamente la fertilidad. Sin embargo, una limitación significativa de este aspecto es el desaplazamiento del herbicida, el cual aniquila al padre macho no transgénico en la producción de semilla híbrida. Sin embargo, se reconocerá que estos eon problemas de aspersión o de aplicación, o problemas de tratamiento de la planta completa, de los mismos problemas herbicidas. Un método alternativo para la aplicación de herbicida que evita el desplazamiento, debe solucionar este problema. El revestimiento de la semilla para protección contra hongos y para el mantenimiento de integridad mecánica, ha sido descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4,438,593 expedida a McNew et al. El revestimiento de la semilla con CaptanMR o derivados de fosfinotricina, utilizando agentes adhesivos, también ha sido descrito en McNew, et al., así como en la Patente de los Estados Unidos No. 5,145,777 (Goodman, et al.) y la Patente Canadiense No. 1,251,653A. La transformación genética de plantas para producir resistencia herbicida es bien conocida en la ciencia de granos (ver por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,975,374). Además, la Patente de los Estados Unidos No. 5,369,022 describe un método para mejorar la protección de granos del daño herbicida incorporando resistencia genéticamente impartida al herbicida en combinación con una semilla de tratamiento del grano con una cantidad de antídoto de un asegurador químico para el herbicida. Sin embargo, la combinación novedosa de revestimiento de semilla, resistencia genéticamente inducida, y transformación genética para mantener plantas estériles, proporciona un método único para mantener genes de esterilidad en la progenie los cuales dirigen muchos de los problemas antes subrayados . La presente invención proporciona un método para mantener esterilidad en plantas. El método implica la generación de una línea de planta paternal transgénica, la cual comprende un gen de esterilidad genéticamente unido a un gen que confiere resistencia a un agente selectivo, por ejemplo, un herbicida, un antibiótico, un sustrato tal como 4-metiltriptofan (4-mT) o similares. La línea de planta paternal transgénica es incrementada a través de métodos de reproducción de planta tradicionales, y la semilla de las líneas de planta paternal transgénica incrementadas son revestidas con una composición que comprende el agente selectivo al cual el gen de resistencia confiere resistencia. Los genes de esterilidad útiles en la práctica de la invención incluyen, por ejemplo, el gen pAN::Tox, el gen dam etilasa, el gen ACC sintasa y similares. La invención visualiza que el gen de esterilidad está genéticamente ligado a un gen que confiere resistencia a un agente selectivo, por ejemplo un herbicida o un antibiótico, o algún otro agente adecuado, por ejemplo, un sustrato tóxico, tal como 4-mT. El gen de resistencia puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o alternativamente puede estar bajo el control de un promotor específico de semilla, o alternativamente puede estar bajo el control de un gen inducible,- por ejemplo, uno inducido por una hormona, o por otra sustancia química sin hormona, por ejemplo, una proteína sin hormona o "asegurador" químico, o alguna otra forma de ligando químico. De acuerdo con esta modalidad del método de la invención, las semillas de la línea paternal son revestidas con una mezcla que comprende una cantidad efectiva, tanto del agente selectivo al cual se le ha conferido resistencia en forma genética, así como el producto químico que induce resistencia. En una modalidad alternativa adicional, el gen de resistencia puede estar bajo el control de un promotor específico de semilla. Una ventaja particular de estas modalidades se refiere al hecho de que la expresión del gen de resistencia puede ser limitada a las etapas de desarrollo de las semillas. Estas modalidades, por lo tanto, tienen ventajas particulares para limitar o restringir la expresión de genes, los cuales son sometidos a reglamentos gubernamentales. Específicamente, estas modalidades de la invención, en particular la modalidad que se refiere al uso de un promotor específico de semilla, presentan la ventaja de restringir la expresión del gen de resistencia a la semilla y evitar emisiones reguladoras potenciales, asociadas con la resistencia en granos, tales como girasol, sorgo y cánola, granos en donde la resistencia puede ser cruzada a especies silvestres. Estas modalidades proporcionan la ventaja adicional de evitar la necesidad de vender semillas, las cuales darán surgimiento a plantas que pueden expresar putativamente genes de resistencia en la planta completa a través de la vida de las plantas. Un objeto del método de la invención es proporcionar a un sistema mediante el cual se presente la aplicación de un agente selectivo, un herbicida, por ejemplo, a las semillas de las plantas que dará como resultado la muerte de una planta de tipo silvestre y sobrevivencia de plantas resistentes, de manera que se evita la aspersión u otras formas de aplicación ambiental general de la planta total, y de esta manera, la muerte de la planta fértil macho de tipo silvestre y la sobrevivencia de plantas resistentes pueden lograrse en forma temprana, y en ciertas modalidades seleccionadas, etapas de desarrollo. Una ventaja general del método de la invención es evitar la necesidad de aplicar productos químicos potencialmente peligrosos sobre las plantas en el campo, reduciendo así la cantidad de tales productos químicos, utilizados en e introducidos en el ambiente. Una ventaja adicional de la invención es que el método fomentará el desarrollo de híbridos en la especie de autopolinización, tales como soya, y en especies que no han sido susceptibles a la despendonación manual, tal como sorgo. Además, la presente invención, además visualiza la semilla transgénica revestida en plantas, el crecimiento de la misma de plantas estériles macho, transgénicas, maduras, la fertilización de plantas estériles macho maduras, y la cosecha de la semilla fertilizada de aquellas plantas. La presente invención además se refiere a la semilla producida de acuerdo con el método de la invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIGURA 1 es un mapa de plásmido del plásmido pPHP610 Las líneas de planta paternales transgénicas pueden ser generadas utilizando un número de métodos reconocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, bombardeo de icropoyectiles, microinyección, métodos mediados por Agrobacterium, electroporación, y similares. Véase en general, Glic, and Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Perss, 1993. Como aquellos expertos en la técnica, reconocerán que la elección del método de transformación y condiciones variará dependiendo de la especie de planta que será sometida al método de la invención.

Cualquier construcción de gen que confiere esterilidad, puede ser aplicada en el método de la invención. Por ejemplo, en una modalidad preferida del método de la invención, la construcción que confiere esterilidad es la construcción pAN::tox. Otros genes útiles para conferir esterilidad han sido descritos en la técnica (véase las referencias citadas anteriormente), e incluye, por ejemplo dam metilasa y ACC sintasa. Como se utiliza en la presente, el término "gen de esterilidad" se refiere a un gen, el cual activamente promueve o confiere esterilidad, y puede incluir genes heterólogos, tales como el gen Barnase, y el gen dam metilasa, y similares, o puede constituir un gen que esté en antisentido al gen de fertilidad. La presente invención también implica el uso de un gen de resistencia, el cual confiere resistencia a un agente selectivo genéticamente enlazado al gen de esterilidad. "Genéticamente enlazados" se utiliza en la presente para referirse a una asociación, ya sea directa o indirecta entre los dos genes, tal que durante la transformación, estos son liberados hacia la célula de la planta, en el mismo caso de transformación, y son incorporados al material genético de la planta recipiente, de tal manera que durante el incremento de la semilla paternal, los genes mantienen su asociación funcional .

El método de la invención se refiere a enlazar genéticamente el gen de esterilidad a un gen de resistencia, por ejemplo, un gen para resistencia herbicida, o para resistencia a antibiótico, o genes que alteran el metabolismo con el fin de permitir el metabolismo de toxinas u otros sustratos selectivos. El gen de resistencia confiere resistencia a un agente selectivo correspondiente: los genes de resistencia de herbicida a herbicida; genes de resistencia de antibióticos a antibióticos, y otros genes de resistencia de productos químicos a sus agentes químicos respectivos, por ejemplo, el gen para triptófano descarboxilasa, el cual confiere resistencia a 4-mT. En una modalidad del método de la invención, el gen de esterilidad está genéticamente enlazado a un gen, el cual confiere resistencia herbicida. La resistencia puede ser conferida a herbicidas de varios grupos, incluyendo inhibidores de síntesis de aminoácido, inhibidores de fotosíntesis, inhibidores de lípido, reguladores de crecimiento, interruptores de membrana de célula, inhibidores de pigmento, inhibidores de crecimiento de semilla, y similares, y ejemplos herbicidas específicos aplicables al método de la invención incluyen: imidazolinonas, sulfonilureas, triazolopirimidinas, glifosato, setoxidim, fenoxaprop, glufosinato (por ejemplo, bialafos) , las triazinas, bromoxinilo, y similares. Véase por ejemplo, Holt, J.S., Mechanisms and Agronomic Aspects of Herbicide Resistance, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44:203-29, 1993; Wilmink et al.. , Selective Agents and Marker Genes for Transforma tion of Monocotyledonous Plan te, Plant Mol. Biol. Rept . 11, 1993; Gunsolus, Chart Your Chemical ' s Family Tree', Soybean Digest abril, 1993. En una modalidad específica de la presente invención, se utiliza el herbicida comercial BastaMR. Los genes apropiados para utilizarse en esta modalidad del método de la invención incluyen, por ejemplo, Bar, PAT, aroA, Epsps, corl-1, bxn, y psbA. En una modalidad alternativa de la presente invención, el gen de esterilidad está genéticamente enlazado a un gen que confiere resistencia antibiótica. Los antibióticos útiles en la práctica de la invención incluyen, por ejemplo, los antibióticos de aminoglicosida, por ejemplo, kanamicina, gentamicina, G418, neomicina, paromisina, e higromicina, y los genes útiles en la práctica de esta modalidad de la invención, incluyen, por ejemplo NPT II, el gen aphA2 de Tn5 de E. coli , y el gen pht-aphlV de E. col i . Véase Wilmink et al., op. cit. Véase también, Bowen, B.A., ?far-ícers for Plant Gene Transfer, Transgenic Plant. Vol. 1, Engineering and Utilization, 1993; Everett et al., Genetic Engineering of Sun f lower (Helianthus annus L.) .

Bio/Technology 5:1201-1204 (1987); Bidney et al., Plant Mol. Biol. 18:301-313 (1992).

En una modalidad alternativa adicional de la invención, el gen de esterilidad está enlazado a un gen de resistencia que confiere resistencia a un producto químico particular, por ejemplo, uno que sea tóxico a la planta. Un ejemplo podría ser el gen para triptófano descarboxilasa, el cual confiere resistencia 4-mT. • Véase Goodijn et al., A Chimeric Tryptophan Decarboxylase Gene as a Novel Selectable Marker in Plant Cells, Plant Mol. Biol. 22:907-912, 1993. Véase también Bowen, op. cit. En una modalidad de la invención, el gen de resistencia está bajo el control de un promotor de construcción. En una modalidad alternativa de la invención, el gen de resistencia está bajo el control de un promotor inducido por un químico particular (un promotor inducible) . Por ejemplo, el gen de resistencia puede ser inducido por una hormona, por ejemplo, una hormona de proteína o una hormona esteroide, o a través de un "asegurador" químico. Ejemplos de hormonas esteroides efectivas en la práctica de la invención, podrían ser los estrógenos, los glucocorticidas y similares. Véase, por ejemplo, Gronemeyer, Transcription Activa tion by Estrogen and Progesterone Receptors, Ann. Rev. Genet . 35:89- 123, 1991. Véase también Glick and Thompson (citado anteriormente) , en particular Graber and Crosby, Vectors for Plant Trans forma tion, a pp. 89-119, para una discusión de los promotores inducibles. Para una discusión de otros agentes químicos, véase Hershey and Stoner, Isola tion and Characteriza tion of a cDNA Clones for RNA Species Induced by Substi tuted Benzene-Sulfonamides in Corn . Plant Mol. Biol. 17:679-690. Véase también la Patente de los Estados Unidos No. 5,364,780 para la discusión de los "aseguradores". En estas últimas modalidades alternativas, será obvio para aquellos expertos en la técnica que las semillas pueden ser revestidas con mezclas que comprenden el agente químico específico al cual responde al gen inducible, junto con el agente selectivo particular. Alternativamente, tejido específico, o más particularmente expresión específica de semilla, puede ser genéticamente proporcionado. Glick, and Thompson, op . cit. Una vez que las líneas paternales transgénicas adecuadas, han sido producidas, el método de la presente invención implica el incremento de las líneas paternales, utilizando métodos bien conocidos en la técnica de reproducción de plantas. Una vez que las líneas paternales han sido incrementadas suficientemente, la semilla de la línea incrementada puede ser recolectadas por medios familiares, y reconocidos por aquellos expertos en la técnica de reproducción de plantas . La semilla recolectada de lae líneas paternales transgénicas incrementadas puede ser revestida de cualquier forma adecuada. Por ejemplo, en una modalidad específica de la invención, un volumen igual de una solución de trabajo de ingrediente activo al 10% de CaptanMR -(N-triclorometiltio-4-ciclohexen-1, 2-dicarboximida [ingrediente activo], dipropilenglicol [adhesivo] , y poliox (WSRN10) [adhesivo] (concentraciones finales de 42.5% de CaptanMR, 54.5% de dipropilenglicol, y 3% de poliox) se mezclan con una formulación comercial de BastaMR (20% de fosfinotricina [ácido DL-homoalanin-4-il (metil) -fosfínico; véase Droge et al., Planta 187:142-151, 1992], ingrediente activo) a una relación de 1:1 (vol-vol) . La mezcla puede ser aplicada a las semillas en cualquier forma conveniente. El revestimiento puede proseguir en un tratamiento secuencial (CaptanMR seguido por agente selectivo y, si es aplicable, el inductor) o un tratamiento simultáneo, aunque las etapas de tratamiento secuenciales son actualmente preferidas. Las formulaciones alternativas serán fácilmente evidentes para aquellos expertos en la técnica; por ejemplo una mezcla de 1:1 (vol:vol) de una solución de trabajo de CaptanMR y metionina sulfoximina (MSO) pueden ser utilizadas. Las formulaciones alternativas de varios aglutinantes y agentes selectivos alternativos, pueden ser tamizadas por rutina para eficacia, tamizando la germinación de semillas revestidas con mezclas de revestimiento conteniendo concentraciones de incremento del aglutinante y/o agente selectivo, y se pueden realizar convenientemente procedimientos de tamización similares para revestimientos que contienen ligandos químicos alternativos adicionales para practicar la invención utilizando un sistema inducible . Después de que las semillas revestidas se han secado, son plantadas como es apropiado al tipo de planta, y la semilla estéril resistente germinará y crecerá. Después, la producción de planta híbrida, puede proseguir de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica de reproducción de plantas. Los siguientes ejemplos pretenden ilustran la invención, pero no limitar su alcance. EJEMPLO 1 Efecto del Revestimiento de Semilla en la Sobrevivencia de Siembra Este ejemplo establece los resultados de experimentos realizados para determinar el efecto de revestimiento de semilla en la sobrevivencia de siembra en semillas de tipo silvestre y transgénicas. Materiales y Métodos Se obtuvo una semilla de la variedad de plantas TO transgénicas y Hi-II de tipo salvaje. A menos que se mencione lo contrario, se desmenuzaron granos para análisis PCR para indicar que progenie TO autofecundada contuvo o no contuvo el gen de Bar. Después, los granos se sumergieron en una mezcla de 1 : 1 de Captan^R (solución de trabajo de ingrediente activo normal 10% utilizada en la producción de semilla) y la formulación comercial BastaMR (ingrediente activo 20%) . Se realizó el revestimiento de grano similar, utilizando una mezcla de 1:1 de CaptanMR y metionina sulfoximina (solución acuosa 20%) . Después, se dejó que la semilla se secara al aire a un color rosa característica de CaptanMR. Los granos positivos de Bar fueron plantados en un recipiente por separado de invernadero de aquellos que fueron negativos a Bar. En un experimento subsecuente, los granos no se desmenuzaron para PCR, sino que más bien se revistieron con BastaMR-CaptanMR, se plantaron en recipientes de invernadero y se recogió el material de follaje de las plantas sobrevivientes para al análisis de PCR. Los granos de maíz de tipo silvestre fueron ya sea revestidos con BastaMR-CaptanMR o dejados sin tratamiento y plantados en recipientes separados. De 13 granos, todos los no tratados germinaron y produjeron siembras. Sin embargo, ninguno de los granos tratados con BastaMR fueron capaces de germinar y desarrollarse en siembras. Estos resultados sugirieron que la aplicación de BastaMR a la superficie de la semilla fue un método exitoso para aplicar un dosis letal de este herbicida. Este método de aplicación de herbicidas se repitió después con la semilla transgénica. Antes del tratamiento con BastaMR o MSO, los granos TI transgénicos fueron desmenuzados mediante PCR para determinar cuales fueron Bar negativos y Bar positivos. Los resultados del segundo experimento de revestimiento de semilla se enlistan en la Tabla 1. Ninguno de los granos que fueron Bar negativos sobrevivieron para formar una siembra, mientras que el 80% y el 53% de aquellos granos Bar positivos se revistieron con BastaMR o MSO, respectivamente, y se desarrollaron a plantas. Los granos Bar negativos fueron viables y germinaron para formar raíces, pero fallaron para formar retoños. Lo mismo fue evidente para los granos Bar negativos tratados con MSO. Las desventajas de revestimiento de los granos con Basta^ o MSO son como sigue: En primer lugar, es un método rápido, mediante el cual miles de granos pueden ser tratados en cuestión de minutos. En segundo lugar, esta tecnología se fija perfectamente con el uso actual de CaptanMR como un tratamiento de semillas. En tercer lugar, mitiga los problemas asociados con la aspersión, tales como la necesidad de experimentos costos, desplazamiento de herbicidas, y otros mencionados anteriormente. En cuarto lugar, es una solución elegante y novedosa a un problema significativo. Como se puede ver en la Tabla 1, sólo aproximadamente la mitad de los granos Bar positivos fueron capaces de sobrevivir al tratamiento MSO comparado con el 85% a aquellos tratados con Basta1^. La razón exacta para esto no ha sido resuelta; sin pretender que esté limitado por teoría, puede ser que demasiado MSO fuera aplicado a la superficie de los granos y que niveles más bajos podrían resultar en una sobrevivencia mejor de progenie transformada Bar positiva. TABLA 1 EFECTO DE REVESTIMIENTO DE LA SEMILLA CON BASTA Y MSO EN LA SOBREVIVENCIA DE SIEMBRA 10 DÍAS DESPUÉS DE LA PLANTACIÓN EN INVERNADERO Producto Químico Bar Negativo Bar Positivo Basta 0/15* 12/15 MSO 0/15 8/15 *E1 numerador se refiere al número de siembras sobrevivientes. El denominador se refiere al número de semillas que fueron plantadas. EJEMPLO 2 Prueba de Cámara de Crecimiento de Revestimiento de Herbicida y Ensayo de Campo Se condujo un examen preliminar en la cámara de crecimiento para probar la expresión de la característica de resistencia de herbicida en cuatro antecesores puros por separado. La segunda porción de este estudio, fue una característica de campo que se condujo en dos ubicaciones (Sysart, IA y Johnston, IA) durante la temporada de crecimiento de 1994. El ensayo de campo fue cubierto bajo el Permiso de Liberación Ambiental USDA #94-056-05N.

Materiales y Métodos 1) Prueba de Cámara de Crecimiento Preliminar Los tratamientos para esta prueba preliminar fueron una combinación factorial de cuatro fenotipos y tres regímenes de revestimiento herbicida. Las semillas fueron obtenidas de dos poblaciones transgénicas (35S::BAR) TI y cruzando con varios parientes innatos hembra: Líneas Innatas A, B, C y D. El 6 de mayo, se trataron lotes individuales (30 semillas por lote), con 0.08 mi de CaptanMR. Inmediatamente después de la aspersión del CaptanMR, cada lote se trató ya sea con 0. 0.12 o 0.60 mi ("cero", "bajo" y "alto") de una solución del herbicida que contiene glufosinato conocido como BastaMR (Hoechst) a una concentración de 20% de ingrediente activo. Un tratador giratorio fabricado por Hans-Ulrich Hege ("HEGE 11") se utilizó para aplicar los tratamientos CaptanMR y BastaMR. Cada una de las tres cajas de plástico se llenaron con 2 kg del suelo seco al aire. El 6 de mayo, tres filas (15 gramos por fila) de un genotipo individual de plantaron en cada caja. Las filas representaron los regímenes ya sea de cero, bajo o alto de BastaMR. El suelo seco se cubrió con toallas de papel y después se vaciaron 500 mi de agua corriente sobre las toallas. Las toallas se removieron una vez que el agua penetró en el suelo. Se sellaron cajas con tapas y después se colocaron en una cámara con temperatura controlada, en la oscuridad, fijada a 22°C. El 17 de mayo, se registraron las cuentas de emergencia. -Se clasificaron las siembras decoloradas, ya sea como, normales o anormales basándose en la apariencia relativa a los controles no tratados. El tejido de las siembras emergidas se cosechó y se utilizó para generar datos de perfil Southern (Véase Ejemplo 3 siguiente) . II. Análisis de Campo Los tratamientos para el experimento fueron una combinación factorial de cuatro genotipos y seis regímenes de revestimiento de herbicida. Cada genotipo fue una gráfica completa, y una sola pila (longitud 5.33 metros) de cada régimen de revestimiento de herbicida fue una subgráfica. Todo el experimento se dispuso como un diseño de bloque completo aleatorio con tres réplicas en cada ubicación. Se obtuvieron semillas de dos poblaciones transgénicas TI (35S::BAR) cruzando con los padres innatos hembra selectos del Ejemplo 1: Líneas Innatas A, B, C y D. El 18 de mayo se trataron pequeños lotes (325 semillas por lote) con 0.86 mi de lodo de CaptanMR. Al día siguiente, los lotes individuales de semillas se trataron ya sea con 0., 1.30, 2.60, 3.90, 5.20, o 6.50 mi de BastaMR. Se utilizó HEGE 11 para aplicar los tratamientos de CaptanMR y BastaMR. Un día después de la aplicación de BastaMR, todas las semillas fueron revestidas con polvo de talco para evitar que los granos se adhirieran durante la plantación. Se utilizó cultivo convencional para preparar un lecho de semilla fino en cada ubicación. Se incorporó doble herbicida para el control de semilla de preplanta a Dysart. Se plantaron semillas manualmente (28 granos por pila) a una profundidad de 2 a 5 cm utilizando un plantador de empuje tradicional. Las fechas de las plantaciones fueron 27 de mayo para Johnston y 1 de junio para Dysart. Se aplicó PounceMR para el control de orugas el 3 de junio en Johnston. La mala hierba que surgió durante el experimento se removió a mano. Los datos de emergencia fueron registrados para cada subgráfica el 7 de junio en Johnston y el 17 de junio en Dysart. Durante el 21 al 24 de junio en Johnston, y 27 a 28 de junio en Dysart, cada planta en experimento se le asignó un número de identificación que se registró en un palo de plástico pequeño colocado en el suelo inmediatamente adyacente a la planta. Al mismo tiempo, se eliminaron pequeñas hojas de una hoja superior de la planta, y después se colocaron en un frasco de plástico marcado. La etiqueta sobre el plástico se correspondió al número de identificación de la planta en el campo. Las hojas se almacenaron en un congelador para un futuro análisis de PCR. El 6 de julio, todos los recipientes en ambas ubicaciones fueron rociados con BastaMR, utilizando un aspersor de bomba de mochila cargado con C02. La velocidad de aplicación de BastaMR fue de 6.4 pintas por acre con un volumen de vehículo de 9.14 litros de agua por acre. Tres boquillas dirigieron el herbicida hacia la parte superior y ambos lados de las plantas. La cobertura fue excelente, y las condiciones climatológicas fueron caliente y seco. Los números de identificación de aquellas plantas que fueron sensibles a BastaMR se registraron el 11 de julio en Johnston y el 12 de julio a Dysart. La sensibilidad a BastaMR fue obvia; las plantas fueron amarillas y tuvieron áreas de tejido necrótico. Las plantas resistentes parecieron normales, excepto para un grado limitado de pequeñas manchas en algunas hojas. Sin pretender que esté limitado por teoría, este efecto, probablemente fue causado por algún ingrediente no activo en el herbicida, y fue marcadamente menos severo que la declinación general observada en las plantas sensibles. En seguida se recolectaron los datos, las plantas fueron trituradas en la superficie del suelo y después los residuos fueron escarificados en el suelo. Las gráficas fueron verificadas para asegurar que ninguna de las plantas fueran capaces de recuperar o desprender polen. Resultados y Discusión En el estudio preliminar de la cámara de crecimiento, la emergencia fue casi de 100% para los granos que no fueron revestidos con BastaMR; estas siembras parecieron normales (Tabla 2) . La aplicación de BastaMR redujo el régimen de emergencia. Al bajo régimen de BastaMR, algunas de las siembras emergidas fueron muy retrasadas y parecieron anormales con relación a los controles. Se postula que esas plantas anormales fueron segregadas no transformadas que mostraron daño herbicida. Las siembras anormales menores, ocurrieron al régimen alto, indebidamente ya que los segregados no transformados fueron exitosamente aniquilados por el herbicida. En retrospectiva, esta prueba debió haber sido conducida en la luz én lugar de la oscuridad, ya que el herbicida debe mostrar mayor fitotoxicidad en la luz. Para resumir los resultados del análisis de campo, se observó que el tratamiento de granos con BastaMR completamente eliminó la emergencia con BastaMR sensibles (Tabla 3) . El control de los segregados sensibles a BastaMR fue obtenido aun al régimen más bajo de BastaMR aplicado a los granos. Esta conclusión se basó en el hecho de que solamente las plantas que mostraron susceptibilidad al herbicida aplicado a las hojas, fueron en las gráficas de control que no tuvieron BastaMR en los granos (Tabla 4) . El porcentaje de reducción que resultó del tratamiento de los granos, fue consistente con la relación de segregación esperada para la característica de resistencia al herbicida. Basado en los resultados de corte claro, se decidió que no es necesario realizar ningún análisis PCR en los discos de las hojas que fueron recolectadas durante el experimento. TABLA 2 Resultados de la Prueba de Cámara de Crecimiento Preliminar, Emergencias de Siembras Afectadas por el Revestimiento de Granos por BastaMR Genotipo Cero Bajo Alto (por medio de hembra) # Emergido Intacta A 15 (todo normal) 5 (normal) 7 (normal) 8 (anormal) 4 (anormal) Intacta B 14 (todo normal) 4 (normal) 7 (normal) 1 (anormal) 1 (anormal) Intacta C 15 (todo normal) 8 (normal) 8 (todo 2 (anormal) normal) Intacta D 15 (todo normal) 5 (normal) 7 (todo 5 (anormal) normal) TABLA 3 Porcentaje de Emergencia de Plantas de Semillas Revestidas con BastaMR y Captan*41* éqimen de Dosis de Basta MR Hembra Ubicación Intacta ox 1X 2X 3X 4X 6X Johpßton A 905 10.9* NO 46.4 * 12.4 33.3*4.1 35.7 12.9 41.7114.4 B 97.6*2.1 35.7*4.1 31.0*4.1 31.0*2.1 36.1*4.1 31.0*7.4 C 92.9*62 35.7112.9 47.6*11.1 51.2162 42.9*15.6 381 11.5 D 92.9192 405 ±12.5 54.9111.5 47.61 .1 9.2192 47.6 11.5 Daart A 92.9*92 NO 383136 32.116.2 38115.5 39.3*9.4 B 96.4*0.0 27.4 * 7.4 42.9*36 32.1*62 35.7*17.9 33315.6 C 90.5*7.4 512*2.1 39.3*7.1 54.6* 13 J 46.417.1 41.7 14 J 0 95.2*2.1 42.9 12.9 «unos 4661115 54.8*20.6 452 5.5 *Los valores representan medios para tres aplicaciones ± S.D. TABLA 4 Porcentajes de Plantas que fueron Sensibles a una Aplicación Foliar de Basta141 Réaimen de Dosis de Basta MR Hembra Intacta Ubicación ox 1X 2X 3X 4X «X Jonnajtui A 50.0*9.4* 0.0 0.0 00 00 0.0 B 58.3*13.5 OJO 0.0 ao 0.0 OJO C 44.0154 0.0 0.0 0.0 0.0 0? O 42-9*9.4 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 Oyaart A 486*9.0 ao 0.0 0.0 0.0 ?? B 69.0*7.4 ao 0.0 0.0 0.0 0.0 C 63**94 Ofi 0.0 00 0.0 00 O «2.4*4.1 ao 0.0 0.0 0.0 0.0 * Los valores representan medios para tres réplicas ± S.D. EJEMPLO 3 Análisis Southern del Crecimiento de la Cámara de Crecimiento Para poblaciones de maíz a través de bombardeo con micropartículas, con el plásmido pPHP610 (Pioneer Hi-Bred International, Inc.) conteniendo el gen Bar. La semilla se revistió con sólo el revestimiento de CaptanMR (no se agregó BastaMR) , o CaptanMR más 0.12 mi de BastaMR o CaptanMR más 0.60 mi de BastaMR. Las plantas germinaron y se extrajo el ADN de las plantas sobrevivientes y se sometió a análisis Southern. En una forma del análisis Southern, el ADN transformado putativo fue digerido con una enzima de restricción, la cual se predijo que se cortó una vez dentro del plásmido. Esto se denominó "análisis de integración" y para el plásmido pPHP610 se eligió EcoRl . En una forma alternativa del análisis Southern EcoRl/Notl, se eligió con el fin de proporcionar una digestión, en donde el ADN del plásmido liberado podría ser cortado dos veces, y en donde la digestión hará caer un fragmento de un tamaño conocido que contendrá tanto como la unidad de transmisión de planta ("PTU") de la que sea posible. El "análisis de integración" está diseñado para dar teóricamente una marca de hibridación dimensionada en forma diferente, para cada sitio de integración diferente en el genoma de planta. El análisis "PTU" debe dar una hibridación a un tamaño de fragmento específico. La presencia de fragmentos de hibridación de tamaño diferente, podría indicar un caso de integración compleja (por ejempio, revolvimiento, eliminación o inserción en la región de PTU) . Los resultados de los análisis' Southerns fueron analizados para la presencia de o ausencia del gen Bar. La región de codificación de Bar se utilizó en todos los análisis, y la plantilla para las sondas fue el fragmento de 567pb Bam Hl/Hpal de pPHP610. Se utilizó un control negativo, 10 µg de Hill (F2 de B73 x A188) ADN no transformado. Como un control positivo, se agregaron ADN de plásmido de pPHP610 HI-II igual a 1 copia/genoma y 5 copias/genoma a 10 g de ADN Hi-II no transformado. El análisis de integración mostró casos de transformación individuales a través de las líneas mejoradas, con un poco de integraciones más complejas en ciertas líneas. Estas líneas parecieron tener tres sitios de integración separados conteniendo 3 PTU, uno de los cuales pareció estar intacto. Solamente una planta la cual no contuvo el gen Bar germinó de una semilla revestida con Basta^R, y ésta no fue sorprendentemente ya que esta planta fue de un grano revestido con BastaMR más CaptanMR, la que germinó y se desarrolló bajo condiciones subóptimas (en la oscuridad) .

EJEMPLO 4 Inducción del Ligando del Gen de Reporte Vía el Revestimiento de Semilla La semilla derivada del cruce de plantas de maíz TO transgénica contienen un receptor dependiente de hormona adecuado y un elemento de respuesta de hormona impulsando al gen de Bar con polen del tipo silvestre, se utilizaron como el material de fuente. La semilla resultante se revistió con la siguiente combinación de productos químicos. 1) Control no revestido 2) Revestida solamente con BastaMR 3) Revestida solamente con hormona 4) Revestida con BastaMR y hormona La semilla revestida se plantó en el invernadero y se cuantifico la emergencia. Los resultados anticipados parecieron estar casi a un 100 por ciento de emergencia de la semilla de control no revestida y de la semilla revestida solamente con hormona. No se esperó ninguna emergencia de la semilla revestida solamente con BastaMR y se espero un 50% de emergencia de la semilla revestida con BastaMR y hormona. EJEMPLO 5 Inducción Segura del Gen de Reporte Via el Revestimiento de Semilla La semilla derivada mediante el cruce de plantas del maíz contienen una secuencia promotora de ADN de IN2-1 o IN2-2 que impulsa al gen Bar con polen de tipo silvestre, se utilizaron como material de fuente. La semilla heterocigota resultante se revistió con la siguiente combinación de productos químicos. 1) Control sin revestir 2) Revestido con BastaMR solamente 3) Revestido solamente con el asegurador 2-CBSU 4) Revestido tanto con BastaMR como con 2-CBSU Se aplicó BastaMR como se describió en el Ejemplo 2, mientras que el 2-CBSU se aplicó a velocidades de un equivalente de 7568 litros/hectárea. La semilla revestida se plantó en el invernadero y se cuantifico la emergencia. Los resultados anticipados pueden estar casi a un 100 por ciento de emergencia de la semilla de control sin revestir y de la semilla revestida solamente con el asegurador 2-CBSU. No se esperó ninguna emergencia de la semilla revestida solamente con BastaMR, mientras que se esperó un 50% de la semilla revestida tanto con BastaMR como con el asegurador 2-CBSU. EJEMPLO 6 Expresión Específica de Semilla de Resistencia Existirán casos en donde puede ser deseable utilizar el sistema de revestimiento de semilla sobre semillas que producen plantas que no expresan más de la resistencia más allá de la etapa de siembra. Por ejemplo, algunas especies de plantas de grano pueden ser elecciones deficientes para la introducción de resistencia, ya que se cruzan con especies de maleza. Aunque el tratamiento de revestimiento de semilla requerirá que un gen de resistencia sea expresado en la semilla y posiblemente en la siembra y/o raíces, no requiere que el gen de resistencia sea expresado en la planta en otras etapas de desarrollo' en otros tejidos, tales como en las hojas de plantas jóvenes o adultas. Existen promotores que podrían limitar la expresión de la semilla y/o siembra. Estos incluyen promotores de genes que son expresados en el aleurón bajo germinación, tales como el gen a-amilasa amy32b de la cebada (Whittier, R.F., Dean, D.A., and Rogers, J.C. 1987, Nucleic Acid Res. 6: 2515-2535); genes que son expresados en el desarrollo de embrión de la semilla hasta muy tarde en la maduración de la semilla, tal como el gen de globulina glbl del maíz, (Belanger, F.C. y Kriz, A.L. 1991, Genetics 129: 863-872); y genes que son expresados tanto en el embrión durante la maduración de la semilla y en la siembra durante la germinación, tal como el gen de sintasa de malato MS-a de Brassica napus (Comai, L., Matsudaira, K.L., Heupel, R.C., Dietrich, R.A. , y Harada, J.J. 1992, Plant Physiol, 98: 53-61), o el gen Em, del trigo, el cual es activo en embriones de semillas maduras y ABA inducible en siembras. (Marcotte, W.R., Jr., Russell, S.H., y Quantrano, R.S. 1989, Plant Cell 1: 969-976).

Un promotor activo en el aleurón de semillas de germinación podría proporcionar la expresión necesaria para inactivar el revestimiento de semilla químico a medida que entra la semilla. En el caso de que algún agente selectivo químico sea capaz de penetrar la semilla sin ser inactivado por el producto de gen de resistencia en el aleurón, un promotor de expresión tardía en el desarrollo de embrión durante la maduración de la semilla podría proporcionar una fuente de producto de gen de resistencia en el embrión antes de la germinación, de manera que no puede ocurrir ninguna atrofia del embrión por la exposición al agente selectivo antes de que pueda producir el producto de gen de resistencia. La expresión del gen de resistencia para germinar siembras, puede ser necesario para protección contra el agente selectivo residual en el suelo, así como cualquier agente selectivo que no sea inactivado por el gen de resistencia producido en el aleurón. Otra opción para proteger siembras de cualquier agente selectivo residual en el suelo podría ser un gen de resistencia activado por un promotor específico de raíz, tal como el gen de peroxidasa P0X1 del trigo (Hertig, C, Rebmann, G. , Bull, Jr., Mauch, F., and Dudler, R. 1991, Plant Molec . Biol. 16: 171-174). Ya que la estrategia subrayada anteriormente puede ser razonablemente lograda a través de un patrón individual de expresión o una combinación de patrones diferentes de expresión de transgenes de resistencia separados, también es posible que un transgen de resistencia individual con un promotor o promotores que confieren todos los caracteres específicos del tejido necesario puedan ser desarrollados. Este puede ser un promotor que tenga una o más de las características específicas descritas anteriormente, una combinación de promotores con diferentes patrones de expresión, o un promotor híbrido .derivado de dos o más promotores que tengan diferentes caracteres específicos individuales como se discutió anteriormente. Sin considerar el aspecto particular, el sistema de revestimiento de semilla puede ser utilizado en semillas que germinan y sobreviven, pero producen plantas las cuales no expresan mayor resistencia más allá de la etapa de siembra. EJEMPLO 7 Uso del Gen NPT II La semilla se obtiene de varias plantas transgénicas y de tipo silvestre, por ejemplo, maíz, sorgo, soya, cánola, girasol, trigo y otras plantas cereales o dicotiledóneas, que expresan el gen NPT II. Las plantas transgénicas son identificadas con base en la enzima o análisis elisa para la expresión del gen NPT II, análisis PCR del gen estructural para NPT II, y/o análisis Southern de NPT II. Las plantas transgénicas y de tipo silvestre individuales son autofe?undadas para producir la semilla TO para análisis. Típicamente, la presencia o ausencia del gen NPTII se confirma a través de PCR de trozos de semilla de plantas individuales. Las semillas son sumergidas en una combinación de una solución de Captan (10% de solución activa) y niveles variables de kanamicina en una solución acuosa que varían en concentración de 25 mg/1 á 1000 mg/1 con los niveles preferidos de 100 y 400. Tanto la infiltración al vacío como el simple revestimiento de la semilla se realizan con semillas de cada planta. La semilla identificada como NPT II positivo y aquellas identificadas como NPT II negativo (tipo silvestre) son plantadas y subsiguientemente se intenta la germinación en una mezcla de suelo bajo condiciones de invernadero. Una prueba similar se realizó en donde la planta de tipo salvaje y las plantas transgénicas conocidas que expresan NPT II, se polinizaron con plantas de tipo silvestre. Las semillas de cada una de las plantas fueron revestidas como se mencionó anteriormente, y la semilla se plantó bajo condiciones de invernadero. Las plantas de tipo silvestre se esperó que mostraran ya sea ninguna germinación, o crecimiento de plantas albinas. Las semillas de las plantas transgénicas polinizadas a través de plantas de tipo silvestre, se esperó que tuvieran relaciones de segregación consistentes con una relación de 1:1 en donde normalmente se germinó la mitad, y la otra mitad ya sea que no se germinó o que fueron albinas. El análisis de PCR de las plantas verdes resultantes esperó ser positivo para la^presencia de gen en todos los casos. En otra prueba, se rocío kanamicina sobre las siembras con una identidad conocida a niveles que varían de 25 mg/l a 1000 mg/l . Aquellas siembras que contienen el gen NPT II permanecen verdes, mientras que las plantas de tipo silvestre no demostraron ninguna germinación o fueron ya sea un fenotipo albino o perdieron clorofila con las hojas presentes en el momento de la aspersión. La descripción de todas las patentes y otras publicaciones citadas en la presente se incorporan en la presente para referencia. Aunque la invención anterior ha sido descrita en detalle para propósitos de claridad y entendimiento, será evidente para aquellos expertos en la técnica, que se pueden hacer ciertas modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (30)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para mantener esterilidad en plantas, el método está caracterizado porque comprende generar una línea de planta paternal transgénica, la línea de planta paternal transgénica comprende un gen de esterilidad genéticamente enlazado a un gen de resistencia, el cual confiere resistencia a un agente selectivo, incrementando la línea de planta paternal transgénica, y el revestimiento de la semilla de la línea de planta paternal transgénica incrementada con una composición que comprende el agente selectivo al cual el gen de resistencia confiere resistencia.
2. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen de esterilidad se selecciona del grupo que consiste de p.AN::Tox, dam metilasa, o Barnasa.
3. 3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen de resistencia confiere resistencia a un herbicida.
4. 4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el gen de resistencia al herbicida confiere resistencia a un agente selectivo, que comprende un herbicida seleccionado del grupo que consiste de inhibidores de síntesis de aminoácido, inhibidores de fotosíntesis, inhibidores de lípido, reguladores de crecimiento, interruptores de membrana de célula, inhibidores de pigmento e inhibidores de crecimiento de siembra.
5. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el gen de resistencia al herbicida confiere resistencia a un agente selectivo, que comprende un herbicida seleccionado del grupo que consiste de imidazolinonas, sulfonilureas, triazolopirimidinas, glifosato, setoxidima, fenoxaprop, glufosinato, las triazinas y bromoxinilo.
6. 6. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el gen de resistencia al herbicida se selecciona del grupo que consiste de Bar, PAT, aroA, Epsps, Corl-1, bxn, y psbA.
7. 7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen de resistencia confiere resistencia a un antibiótico.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el gen de resistencia al antibiótico confiere resistencia a un agente selectivo que comprende un antibiótico de aminoglicosida.
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el gen de resistencia al antibiótico confiere resistencia a un agente selectivo que comprende un antibiótico aminoglicosida seleccionado del grupo que consiste de kanamicina, gentamicina, G418, neomicina, paromicina, e higromicina.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el gen de resistencia al antibiótico se selecciona del grupo que consiste del gen NPT II, el gen aphA2, y el gen hpt-aphlV. 11. El método de conformidad con la reivindicación
11. I, caracterizado porque el gen de resistencia confiere resistencia a un agente selectivo que comprende un producto químico, tóxico diferente a un herbicida o a un antibiótico.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el producto químico tóxico comprende un metabolito tóxico.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el metabolito tóxico es 4-metiltriptófano.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque el gen de resistencia es el gen de descarboxilasa de triptófano.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la línea de planta paternal transgénica además comprende un promotor constitutivo enlazado al gen de resistencia.
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el promotor constitutivo se selecciona del grupo que consiste de CaMV 19S, CaMV 35S, CaMV doble 35S, ALS, MAS, y ubiquitina.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la línea de -planta paternal transgénica, además comprende un gen químicamente inducible que controla la expresión del gen de resistencia.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el gen químicamente inducible es inducido por una hormona.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la hormona es una hormona esteroidal .
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el gen químicamente inducible es inducido a través de un químico sin hormona.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el químico sin hormona es un asegurador.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la línea de planta paternal transgénica además comprende por lo menos un promotor específico de tejido.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el promotor específico de tejido es un promotor específico en semilla.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la semilla de la línea de planta paternal transgénica, incrementada es revestida con una composición que comprende una cantidad efectiva del producto químico que induce al gen químicamente inducible.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el agente químico que induce al gen químicamente inducible se selecciona del grupo que consiste de hormonas y de aseguradores.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 24, caracterizado además porque comprende plantar la semilla revestida, hacer crecer plantas maduras, fertilizar plantas maduras, y cosechar las semillas de las plantas maduras.
27. 27. Plantas maduras producidas a través del método de conformidad con la reivindicación 26.
28. 28. Semillas de plantas producidas a través de las plantas maduras, de conformidad con la reivindicación 27.
29. 29. Un método para mantener esterilidad macho en plantas, el método está caracterizado porque comprende generar una línea de planta paternal transgénica, la línea de planta paternal transgénica comprende un gen de esterilidad macho, genéticamente enlazado a un gen de resistencia, el cual confiere resistencia a un agente selectivo, el gen de resistencia está bajo el control de un gen químicamente inducible; incrementar la línea de planta paternal transgénica; y revestir la semilla de la línea de planta paternal transgénica incrementada con una composición que comprende -cantidades efectivas del agente selectivo al cual el gen de resistencia confiere resistencia y del agente químico al cual responde el gen químicamente inducible.
30. 30. Un método para mantener esterilidad macho en plantas, el método está caracterizado porque comprende generar una línea de planta paternal transgénica, la línea de planta paternal transgénica comprende un gen de esterilidad macho, genéticamente enlazado a un gen de resistencia, el cual confiere resistencia a un agente selectivo, el gen de resistencia está bajo el control de un promotor específico de semilla; incrementar la línea de planta paternal transgénica; y revestir la semilla de la línea de planta paternal transgénica incrementada con una composición que comprende una cantidad efectiva del agente selectivo al cual el agente de resistencia confiere resistencia.