MXPA97002920A - Composiciones para el cuidado de la piel que contienen amidas de acido graso, azoles y retinol o ester retinilico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a amidas deácido graso en combinación con azoles y ya sea retinol oéster retinílico que dan como resultado una mejora sinergística en la proliferación de queratinocito e inhibición sinergística de diferenciación de queratinocito. Los efectos del retinol oésteres retinílicos en combinación con amidas deácido graso y azoles fueron análogos al tratamiento conácido retinoico.

Description

COMPOSICIONES PARA EL CUIDADO DE LA PIEL QUE CONTIENEN AMIDAS DE ACIDO GRASO, AZOLES Y RETINOL O ESTER RETINILICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con composiciones para el cuidado de la piel que contienen amidas de ácido graso, azoles y retinol o éster retinílico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El retinol (vitamina A) es un compuesto endógeno, el cual ocurre naturalmente en el cuerpo humano y es esencial para la diferenciación normal de células epiteliales. Se han utilizado extensivamente derivados de vitamina A naturales y sintéticos en el tratamiento de una variedad de enfermedades de la piel y han sido utilizados como agentes de reparación o renovadores de la piel. Se ha empleado el ácido retinoico para tratar una variedad de condiciones de la piel, por ejemplo, acné, arrugas, psoriasis, manchas por la edad y decoloración. Véase, por ejemplo, Vahlquist. A. et al., ".

Jnvest. Der atol . , Vol. 94, Holland D.B. and Cunliffe, W.J. (1990), pp. 496-498; Ellis, C.N. et al., "Pharmacology of Retinols in Skin", Vasel, Karger, Vol. 3, (1989), pp 249,252; Lowe, N.J. et al., "Pharmacology of Retinols in Skin", Vol. 3, (1989) pp. 240-248; Solicitud de Patente PCT No. - WO 93/19743. El retinol y los esteres retinílicos, tales como acetato de retinilo y palmitato de retinilo, son más fáciles de formular/estabilizar que el ácido retinoico. Desafortunadamente, el retinol y los esteres retinílicos son menos efectivos que el ácido retinoico para proporcionar beneficios para la piel. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que ciertas combinaciones de retinol o de esteres retinílicos con amidas de ácido graso y azoles da como resultado una mejora sinergística en la proliferación de queratinocito y represión de diferenciación. Los efectos de la combinación de una amida de ácido graso con azol y ya sea retinol o un éster retinílico fueron análogos a los efectos del ácido retinoico. Este efecto fue no solamente mayor que el efecto de ya sea retinol/éster retinílico con una amida de ácido graso o de retinol/éster retinílico con azol, sino que los tres ingredientes actuaron en sinergia entre ellos para promover una respuesta de ácido retinoico. De esta manera, una mezcla de amidas de ácido graso con retinol o esteres retinílicos se parece al ácido retinoico, aún es más fácil de utilizarse que el ácido retinoico. Thornfeldt (Patente de los Estados Unidos No. 5,057,501) describe un método para el tratamiento de enfermedades papuloescamosas y eczematosas con una composición que contiene un compuesto sesquiterpeno y de aproximadamente 0.025% a aproximadamente 35% de un ácido graso monocarboxílico, éster o amida. Las composiciones también pueden incluir un retinoide; Thornfeldt enseña que ciertos retinoides, principalmente isotretinoina, tretinoina, etretina (todos de los cuales son estereoformas de ácido retinoico) y etretinato (un éster de ácido trimetoxifenil retinoico) han probado eficacia contra enfermedades papuloescamosas. La Solicitud PCT WO/9325177 (Procter and Gamble) describe composiciones para aplicación tópica a la piel, las cuales contienen un tipo específico de enfriador de carboxamida acíclica y pueden incluir retinoides tales como ácido retinoico y sus derivados (por ejemplo cis y trans) . La Solicitud PCT WO/9403156 (Rhone Poulenc) describe una composición tópica que contiene ácido linoléico o un derivado como un ingrediente activo para el tratamiento y profilaxis de piel impura (por ejemplo, piel afectada por barros, pústulas o espinillas) ; la composición puede contener también 0.025-0.1 % en peso de tretinoina. La Solicitud de Patente Europea No. 0 388 275 (Pierre Fabre Cosmetique) describe composiciones para tratar seborrea que contienen alquil carboxamida y una sal de zinc la cual puede ser retinoato de zinc . Klaus et al. (Patente de los Estados Unidos No. 5,216,148) describe el uso de carboxamidas complejas específicas para tratar y evitar neoplasmas, dermatosis y envejecimiento de la piel. Van Scott et al. (Patente de los Estados Unidos No. 4,380,549) y Yu et al., (Patente de los Estados Unidos No. 4,363,815) describen el tratamiento de acné, piel seca, escamosa, laminosa, con un hidroxiácido o la amida del mismo. La EP 582,548 describe el uso de N,N-(alquilo de Cl,4) lauramida, la EP 559,304 describe el uso de una amida que contiene una cadena hidrocarbilo de por lo menos 25 átomos de carbono como un agente suavizador de la piel. Beauquey et al. (Patente de las Estados Unidos No. 5,308,551) describen una composición para lavar y acondicionar la piel que contiene, entre otros ingredientes, una alcanolamida de 1-4 átomos de carbono de un ácido graso de 8-16 átomos de carbono. La Especificación de Patente de Gran Bretaña No. 1,126,289 (Hoffman-La Roche) describe una preparación de vitamina de abastecimiento que contiene alcohol de vitamina A o un éster de vitamina A, un emulsificante y un solvente, el cual se selecciona de un alcohol o una dialquila ida de un ácido monocarboxílico (por ejemplo, N,N-dietil-acetamida, N,N-dimetil acetamida o N,N-dimetil formamida) . Una Solicitud de Patente Europea antiguamente presentada EP 0 742 005 (Unilever; fecha de prioridad: 8 de mayo de 1995) , publicada el 13 de noviembre de 1996 (después de la fecha de prioridad de la solicitud presente) , describe combinaciones de amidas de ácido graso con retinol o esteres retinílicos. Ninguno de los documentos antes citados, sin embargo, menciona los azoles. Han sido descritas las composiciones que contienen retinoides y azoles. Véase, por ejemplo, Yusuf et al., CA 2,101,101, Cauwenbergh, Patente de los Estados Unidos ,476,852 y Keyhani, Solicitud de Patente PCT WO 9505852.

Estos documentos, sin embargo, no mencionan las amidas de ácido graso. También son conocidas las composiciones que contienen azoles y amidas de ácido graso. Estas composiciones, sin embargo, no incluyen ningún retinoide.

Véase, por ejemplo, WO 95/17175; EP 0 347,199; Patente de los Estados Unidos No. 4,867,971; y Patente de los Estados Unidos No. 5,348,736. La técnica citada en lo anterior no describe composiciones acondicionadoras para la piel a base de combinaciones sinergísticas de tres ingredientes: una amida de ácido graso, un azol y un retinol o un éster retinílico.

Ninguna de las referencias antes citadas se dirige a la necesidad de una alternativa efectiva para el ácido retinoico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye, en parte, una composición acondicionadora de la piel que contiene: (a) de 0.001% a aproximadamente 10% de retinol o de un éster retinílico; (b) de 0.001% a aproximadamente 50% de un azol; (c) de 0.0001% a aproximadamente 50% de una amida de ácido graso, en donde el ácido graso contiene por lo menos 6 átomos de carbono; y (d) un vehículo cosméticamente aceptable.

El término "acondicionadora" como se utiliza en la presente, significa la prevención y el tratamiento de la piel seca, piel fotodañada, aparición de arrugas, manchas por la edad, piel envejecida, incremento de la flexibilidad del estrato córneo, e incremento general de la calidad de la piel. La composición puede ser utilizada en un método cosmético para mejorar la desescamación de la piel y la proliferación y diferenciación epidérmica. La presente invención también incluye el uso de la composición inventiva para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de piel arrugada, seca, escamosa, envejecida, fotodañada y tratar trastornos de la piel (por ejemplo, acné o psoriasis) .

La invención además proporciona un método cosmético para mejorar la proliferación de queratinocito y - la diferenciación en la piel, el método comprende aplicar a la piel la composición de la invención como se describió en lo anterior. La presencia de la amida de ácido graso y de un azol en el producto de la invención, sustancialmente mejora el rendimiento del retinol o de un éster retinílico, es decir, una amida de ácido graso en combinación con el azol, sustancialmente incrementa la capacidad del retinol o de un éster retinílico para efectuar la proliferación celular y diferenciación. La amida de ácido graso o el azol tiene muy poco o ningún efecto para mejorar el beneficio de la piel, cuando se utiliza solo; se puede observar solamente un incremento sustancial en el beneficio de la piel cuando la amida y el azol se combinan con retinol o un éster retinílico. En resumen, la presente invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento de la interacción sinergística entre el retinol o un éster retinílico, amidas de ácido graso y azoles. En una modalidad preferida de la invención, la amida es una amida de ácido graso de C8~c24' *^e m^yor preferencia una mono o di-alcanolamida de un ácido graso de Cg-C2 y el azol es climbazol.

De acuerdo con la presente invención, en virtud de incluir una cantidad efectiva de una amida de ácido graso y un azol a las composiciones que contienen retinol o un éster retinílico, el rendimiento de las composiciones se mejora sustancialmente. Alternativamente, se pueden incluir niveles más bajos de retinol o de un éster retinílico en la composición que contiene la amida de ácido graso y el azol para igualar el rendimiento de una formulación similar sin la amida y el azol .

DESCRIPCIÓN DE LA MODALIDAD PREFERIDA Todos los porcentajes son en peso de la composición final, a menos que se indique otra cosa. Las composiciones de la invención contienen, como un primer ingrediente esencial, un compuesto seleccionado del grupo que consiste de retinol o un éster retinílico. El término "retinol" incluye los siguientes isómeros de retinol: all-trans-retinol, 13-cis-retinol, 11-cis-retinol, 9-cis-retinol, 3 -4-didehidro-retinol . Los isómeros preferidos son all-trans-retinol, 13-cis-retinol, 3-4-didehidro-retinol, 9-cis-retinol. De mayor preferencia es all-trans-retinol, debido a su amplia disponibilidad comercial. El éster retinílico es un éster de retinol. El término "retinol" ha sido definido en lo anterior. Los esteres retinílicos adecuados para utilizarse en la presente invención- son esteres de retinol de c? ~ c 0 ' **^e Preferencia esteres de C2-C2o Y de mayor preferencia esteres de C2~C3 y c16' ^a *3ue son ^"os rn*^s com?nmente disponibles. Ejemplos de esteres retinílicos incluyen, pero no se limitan a: palmitato de retinilo, formiato de retinilo, acetato de retinilo, propionato de retinilo, butirato de retinilo, valerato de retinilo, isovalerato de retinilo, hexanoato de retinilo, heptanoato de retinilo, octanoato de retinilo, nonanoato de retinilo, decanoato de retinilo, undecanoato de retinilo, laurato de retinilo, tridecanoato de retinilo, miristato de retinilo, pentadecanoato de retinilo, heptadecanoato de retinilo, estearato de retinilo, isoestearato de retinilo, nonadecanoato de retinilo, araquidonato de retinilo, behenato de retinilo, linoleato de retinilo, oleato de retinilo, lactato de retinilo, glicolato de retinilo, hidroxi caprilato de retinilo, hidroxi laurato de retinilo, tartarato de retinilo. El éster preferido para utilizarse en la presente invención se selecciona de palmitato de retinilo, acetato de retinilo y propinato de retinilo, ya que éstos son los más comúnmente disponibles, y por lo tanto, los menos costosos. El linoleato de retinilo también es preferido debido a su eficacia superior.

El retinol o éster retinílico se emplea en la composición de la invención en una cantidad de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 10%, de preferencia en una cantidad de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 1%, de mayor preferencia en una cantidad de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.5%. El segundo ingrediente esencial de la composición de la invención es una amida de ácido graso. De preferencia, la amida de ácido graso contiene por lo menos 6 átomos de carbono. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácidos grasos saturados e insaturados, de cadena recta o ramificada. Los ácidos grasos adecuados de preferencia contienen de 8 a 24 átomos de carbono, de preferencia 12 a 20 átomos de carbono y de mayor preferencia de 12 a 18 átomos de carbono, ya que las amidas de ácido graso de cadena más larga son más benéficas para acondicionar la piel. En la modalidad más preferida de la invención, se emplean amidas de ácidos grasos esenciales, ya que los ácidos grasos esenciales proporcionan nutrición a la piel. Ejemplos de ácidos grasos esenciales incluyen, pero no se limitan a, linoléico, linolénico, araquidónico, gamma-linolénico, homo-gamma-linolénico y mezclas de los mismos. El ácido linoléico es el más preferido ya que también es un precursor para ceramida.

Las amidas adecuadas para utilizarse en la presente invención pueden ser amidas simples (es decir, aquellas que contienen un grupo -CONH2) , N-alquilamidas, N,N-dialquilamidas, mono-alcanolamidas y di-alcanolamidas . Los grupos alquilo o alcanol adecuados contienen de 1 a 30 átomos de carbono, de preferencia de 1 a 20 átomos de carbono y de mayor preferencia de 1 a 8 átomos de carbono. Las amidas preferidas incluidas en la presente invención son mono y di-alcanolamidas, particularmente de ácidos grasos esenciales. Las alcanolamidas son más comúnmente disponibles que las alquilamidas . Las amidas de ácido graso preferidas se seleccionan de mono y di-etanolamidas de ácido linoléico, ácido palmítico y aceite de coco. La amida es incluida en las composiciones de la invención en una cantidad que varía de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 50%, de preferencia de 0.01% a aproximadamente 10%, de mayor preferencia de aproximadamente de 0.1% a aproximadamente 5%. El tercer ingrediente esencial de las composiciones de la invención es un azol. Los azoles empleados en la presente invención tienen la fórmula I : en donde R-^, R2 y R3 se seleccionan independientemente de hidrógeno; grupo sulfhidrilo (SH) , tiol o un alquilo que contiene 1-12 átomos de carbono; un grupo arilo; un grupo arilo sustituido con 1-5 átomos de halógeno; un grupo heterocíclico que contiene átomos de nitrógeno y/u oxígeno; y mezclas de los mismos. Los de mayor preferencia son climbazol, miconazol, bifonazol, econazol, clotrimazol. También adecuados para utilizarse en la presente invención son 1, 2, 4-triazol, octil-triazol, ketoconazol, itraconazol, fluconazol, terconazol, sulconazol, liarazol, butoconazol y mezclas de los mismos. El azol es incluido en la composición de la invención en una cantidad de aproximadamente 0.0001% a 50%, de preferencia de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 10%, de mayor preferencia de 0.1% a 5%, aproximadamente.

Vehículo Cosmeticcúnente Aceptable La composición de acuerdo con la invención también comprende un vehículo cosméticamente aceptable para actuar como un diluyente, dispersante o vehículo para los componentes activos en la composición, con el fin de facilitar su distribución cuando la composición es aplicada a la piel. Los vehículos diferentes o además del agua, pueden incluir emolientes líquidos o sólidos, solventes, humectantes, espesantes y polvos. Un vehículo no acuoso especialmente preferido es un polidimetilsiloxano y/o polidimetilfenilsiloxano. Las siliconas de esta invención pueden ser aquellas con viscosidades que varían de aproximadamente 10 a 10,000,000 mm2/s (centistokes) a 25°C. Especialmente deseables son las mezclas de siliconas con una baja y alta viscosidad. Estas siliconas están disponibles de General Electric Company bajo las marcas comerciales de Vicasil, SE y SF y de Dow Corning Company bajo las series 200 y 550. Las cantidades de silicona que pueden ser utilizadas en las composiciones de esta invención varían de 5% a 95%, de preferencia de 25% a 90% en peso de la composición. El vehículo cosméticamente aceptable usualmente formará de 5% a 99.9%, de preferencia de 25% a 80% en peso de la composición, y pueden, en ausencia de otros auxiliares cosméticos, formar el resto de la composición. De preferencia, el vehículo es por lo menos 80% en peso de agua, por peso del vehículo. De preferencia, el agua comprende por lo menos 50% por peso de la composición de la invención, de mayor preferencia de 60 a 80% por peso de la composición.

Materiales Opcionales de Beneficio para la Piel y Auxiliares Cosméticos Puede estar presente un aceite o un material oleoso, junto con un emulsificante para proporcionar ya sea una emulsión de agua en aceite o una emulsión de aceite en agua, dependiendo enormemente del equilibrio promedio hidrofílico-lipofílico (HLB) del emulsificante empleado. Las composiciones de la invención de preferencia incluyen filtros solares. Los filtros solares incluyen aquellos materiales comúnmente empleados para bloquear la luz ultravioleta. Los compuestos ilustrativos son los derivados de PABA, cinamato y salicilato. Por ejemplo, se puede utilizar metoxicinamato de octilo y 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona (también conocida como oxibenzona) . El metoxicinamato de octilo y la 2-hidroxi-4-metoxi-benzofenona están comercialmente disponibles bajo los nombres comerciales de Parsol MCX y Benzophenone-3 , respectivamente. La cantidad exacta de filtro solar empleado en las emulsiones puede variar dependiendo del grado de protección deseado de la radiación UV del sol.

Otro ingrediente opcional preferido se selecciona de ácidos grasos esenciales (EFA) , es decir, aquellos ácidos grasos que son esenciales para la formación de membrana de plasma de todas las células, en deficiencia de EFA de queratocitos que hacen a las células hiperproliferativas . La suplementación de EFA corrige esto. Los EFA también mejoran la biosíntesis de lípidos de la epidermis y proporcionan lípidos para la formación de barrera de la epidermis. Los ácidos grasos esenciales de preferencia se eligen de ácido linoléico, ácido y-linolénico, ácido homo-7-linolénico, ácido columbínico, ácido eicosa- (n-6, 9-13) -trienoico, ácido araquidónico, ácido Y-linolénico, ácido timnodónico, ácido hexaenoico y mezclas de los mismos. Por lo regular se incorporan emolientes a las composiciones cosméticas de la presente invención. Los niveles de tales emolientes pueden variar de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 50%, de preferencia de entre aproximadamente 5% y 30% en peso de la composición total. Los emolientes pueden ser clasificados bajo categorías químicas generales como esteres, ácidos grasos y alcoholes, polioles e hidrocarburos . Los esteres pueden ser mono o di-ésteres. Los ejemplos aceptables de di-ésteres grasos incluyen adipato de dibutilo, sebacato de dietilo, dimerato de diisopropilo y succinato de dioctilo. Los esteres grasos de cadena ramificada aceptables incluyen miristato de 2-etil-hexilo, estearato de isopropilo y palmitato de isoestearilo. Los esteres ácido tribásicos aceptables incluyen trilinoleato de triisopropilo y citrato de trialurilo. Los esteres grasos de cadena recta aceptables incluyen palmitato de laurilo, lactato de miristilo, eurcato de oleilo y oleato de estearilo. Los esteres preferidos incluyen caprilato/caprato de coco (una mezcla de caprilato de coco y caprato de coco) , acetato de éter miristílico de propilenglicol, adipato de diisopropilo y octanoato de cetilo. Los alcoholes grasos adecuados y ácidos incluyen aquellos compuestos que tienen de 10 a 20 átomos de carbono. Especialmente preferidos son los compuestos tales como alcoholes cetílico, miristílico, palmítico y estearílico, y ácidos. Entre los polioles que pueden servir como emolientes se encuentran los compuestos alquil polihidroxilo de cadena lineal y ramificada. Por ejemplo, se prefieren el propilenglicol, sorbitol y glicerina. También útiles pueden ser los polioles poliméricos tales como polipropilenglicol y polietilenglicol. Especialmente preferidos como mejoradores de penetración son el butilen y propilenglicol. Los hidrocarburos ilustrativos que pueden servir como emolientes, son aquellos que tienen cadenas de hidrocarburo de 12 a 30 átomos de carbono. Los ejemplos específicos incluyen cualquiera de aceite mineral, jalea de petróleo; escualeno e isoparafinas . Otra categoría de ingredientes funcionales dentro de las composiciones cosméticas de la presente invención son los espesantes. Un espesante usualmente estará presente en cantidades de 0.1 a 20% en peso, de preferencia de aproximadamente 0.5% a 10% en peso de la composición. Los espesantes ilustrativos son materiales de poliacrilato entrelazados, disponibles bajo el nombre comercial de Carbopol de B.F. Goodrich Company. Se pueden emplear gomas tales como de xantano, carragenano, gelatina, karaya, pectina y goma de algarroba. Bajo ciertas condiciones, la función espesante puede lograrse a través de un material que también sirve como una silicona o emoliente. Por ejemplo, gomas de silicona en un exceso de 10 centistokes y esteres tales como estearato de glicerol tienen una doble funcionalidad. Se pueden introducir polvos a las composiciones cosméticas de la invención. Estos polvos incluyen greda, talco, tierra de Fuller, caolín, almidón, arcillas de esmectita, silicato de aluminio-magnesio químicamente modificado, arcilla de montmorillonita orgánicamente modificada, silicato de aluminio hidratado, sílice ahumada, succinato de octenilo de almidón de aluminio y mezclas de los mismas .

También se pueden incorporar a las composiciones cosméticas -otros componentes menores auxiliares. Estos ingredientes pueden incluir agentes colorantes, opacadores y perfumes. Las cantidades de estos otros componentes menores auxiliares pueden variar de 0.001% hasta 20% en peso de la composición.

Uso de la Composición La composición de acuerdo con la invención pretende principalmente ser un producto para aplicación tópica a la piel del ser humano, especialmente como un agente para acondicionar y suavizar la piel, y evitar o reducir la apariencia de piel arrugada o envejecida. Durante el uso, una cantidad pequeña de la composición, por ejemplo de 1 a 100 ml, se aplica a las áreas expuestas de la piel, a partir de un recipiente o aplicador adecuado y, si es necesario, después se extiende sobre y/o frota en la piel utilizando la mano o los dedos o un dispositivo adecuado.

Forma y Empaque del Producto La composición para el tratamiento de la piel tópica de la invención puede ser formulada como una loción, una crema o un gel. La composición puede ser empacada en un recipiente adecuado para adecuar su viscosidad y uso pretendido por el consumidor. Por ejemplo, una loción o crema puede ser empacada en una botella o un aplicador de bola giratoria, o un dispositivo en aerosol impulsado por un propulsor o un recipiente equipado con una bomba adecuada para la operación con el dedo. Cuando la composición es una crema, simplemente puede ser almacenada en una botella no deformable o recipiente comprimible, tal como un tubo o un recipiente con tapa. La composición también puede ser incluida en cápsulas tales como aquellas descritas en la Patente de los Estados Unidos 5,063,507, incorporada aquí para referencia. La invención por consiguiente también proporciona un recipiente cerrado que contiene una composición cosméticamente aceptable como se define aquí. Los siguientes ejemplos específicos ilustran más la invención.

MATERIALES Y MÉTODOS Cultivo de Célula; Se desarrollaron queratinocitos humanos, aislados de prepucio neonatal mediante el tratamiento con tripsina en un medio de Dulbecco Modification Eagle (DME) Hams F12 (1:1)/10% de suero de bovino fetal en presencia de fibroblastos de ratón 3T3 irradiados para establecer la división de colonias de queratinocito. Se desarrollaron células bajo las condiciones anteriores hasta su segundo pasaje y se mantuvieron congeladas para un uso futuro. Los queratinocitos congelados de segundo pasaje se descongelaron y se colocaron en placas en el medio anterior y se desarrollaron durante 5 días antes de que fueran conmutados a un medio a base de MCDB 153 libre de suero, medio de crecimiento de queratinocito (KGM) de Clonetics Corporation, San Diego, CA, conteniendo 0.15 mM de Ca, o medio libre de suero de queratinocito (KSFM) de GIBCO conteniendo 0.09 mM de Ca) . En el séptimo día; cuando las células fueron 80-90% confluentes, se triptinizaron y se colocaron en placas en el medio libre de suero para varios experimentos.

Ensayo de Timidina Incorporación de -3.H-Timidina y Proliferación de Queratinocito La incorporación de 3H-Timidina mediante queratinocitos cultivados se utilizó como un ensayo para la proliferación de queratinocito. La timidina es uno de los cuatro desoxinucleósidos, los cuales son las unidades monoméricas de ADN, la biblioteca universal de la información genética en el reino animal. Antes de la división celular de una célula somática tal como un queratinocito, el genoma completo de la célula que sufre la división de célula se replicó. Esto implica la síntesis a gran escala de ADN mediante la célula y permite que las células hijas reciban copias idénticas del material genético. Cuando se incluye 3H-timidina en el medio de cultivo de queratinocitos, los cuales son sintetizados mediante ADN en la preparación para la división de célula, entonces el nucleósido marcado es incorporado en el ADN recientemente sintetizado. El grado de incorporación de 3H-timidina a una población de células es proporcional al régimen de síntesis de ADN mediante esta población de células y por lo tanto una indicación de su proliferación celular. Los queratinocitos (que fueron cultivados como se describió en lo anterior) fueron colocados en placas de 24 pozos a una densidad de 40,000 células por pozo en un medio de 1 ml . Después de la incubación durante cuatro días o hasta que las células fueron 60-70% confluentes, el medio se cambió. Se añadieron compuestos de prueba (por triplicado) a los pozos 24 horas después del cambio del medio, y cuatro horas después, se añadió, por pozo lµCi3H-Timidina en 50 µl del medio. Las células se incubaron durante 24 horas adicionales. El medio se removió de las células, se añadió 10% de ácido tricloroacético enfriado con hielo (TCA) y las placas se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. Las células se lavaron cinco veces con 5% de TCA y se dejaron disolver en 500 µl de 0. ÍM de NaOH durante por lo menos una hora (usualmente durante la noche) . Las preparaciones se neutralizaron con 0. ÍM de HCl; se utilizaron 50 µl de la preparación de célula para determinar el contenido total de proteína. Se determinaron las desintegraciones por minuto (DPM) a partir de la marcación de 3H de ADN mediante cintilación de líquido representando 900 µl de la preparación de célula. Los resultados de incorporación de timidina se expresaron como proteína DPM/µg.

Ensayo de Transqlutaminasa Ensayo de Transqlutaminasa y Diferenciación de Queratinocito Durante el procedimiento de la diferenciación terminal en la epidermis, se formó una capa gruesa de 15nm de proteína, conocida como la envoltura cornificada (CE) sobre la superficie interna de la periferia celular. La CE está compuesta de numerosas distintas proteínas, las cuales han sido entrelazadas conjuntamente mediante la formación de enlaces de isodipéptido de N e- (7-glutam.il) lisina mediante la acción de por lo menos dos transglutaminasas diferentes (TGases) expresadas en la epidermis. TGase I se expresa en abundancia en las capas diferenciadas de la epidermis, especialmente la capa granulada, pero está ausente en la epidermis basal no diferenciada. De esta manera, TGase I es un marcador útil de la diferenciación de queratinocito de la epidermis con altos niveles de TGase I indicando un estado más diferenciado. Se utilizó un análisis de TGase I a base de ELISA, utilizando un anticuerpo TGase I, para analizar el estado de diferenciación de los queratinocitos cultivados en los ejemplos que siguen. Se colocaron en placa queratinocitos (cultivados como se describió en lo anterior) en placas con 96 pozos a una densidad de 3,000 células por pozo en un medio de 200 µl . Después de la incubación durante cuatro días, el medio se cambió a un medio conteniendo compuestos de prueba (seis réplicas por prueba) . Las células se cultivaron durante 72 horas adicionales, después de lo cual el medio fue aspirado y las placas se almacenaron a -70°C. Las placas se removieron del congelador, y las células se lavaron con PBS. Se añadieron 100 µl de agua estéril y las células se congelaron fracturadas mediante congelación a -70°C, después se descongelaron. Las células se incubaron durante una hora a temperatura ambiente (R/T) con PBS/3% BSA (regulador de pH de lavado, albúmina de suero de bovino) , entonces se enjuaga con una alícuota recién preparada de un regulador de pH de lavado. Las células se incubaron con 50 µl de transglutaminasa anti-humana monoclonal de anticuerpos primarios (IgG) obtenida de Amersham (ratón) diluida con 1:300 en un regulador de pH de lavado durante una hora, a 37°C, después se enjuagaron dos veces con un regulador de pH de lavado. Después, las células se incubaron con 50 µl de anticuerpo secundario (fragmento Feb, IgG anti-ratón conjugado con peroxidasa obtenido de Amersham) diluido 1:200 en regulador de pH de lavado durante una hora a 37°C, después se enjuagaron dos veces con regulador de pH de lavado. Las células se incubaron con solución de sustrato (4 mg de o-fenilendiamina y 3.3 µl de 30% de H202 en 10 ml de 0. ÍM de regulador de pH de citrato pH 5.0) durante cinco minutos, R/T, en la oscuridad (bajo una hoja de aluminio) . La reacción se detuvo mediante la adición de 50 µl de 4N de H2S04. Se leyó la absorbancia de las muestras a 492nm en un lector de placa. Fuera de las seis réplicas, cuatro fueron tratadas con ambos anticuerpos, dos fueron tratadas solamente con el anticuerpo secundario (es decir, para determinar la unión antecedente del Ab conjugado con enzima) . Se determinaron los niveles de TGase sustrayendo el antecedente de las lecturas de cada tratamiento y determinando ± s.d. medio para réplicas expuestas a ambos Ab.

Ensayo de ADN El nivel de TGase-1 detectado después del tratamiento de la células puede ser influenciado por el número de células, es decir, entre más grande sea el número de células mayor es el nivel de TGase-1 detectado. El nivel de TGase-1 se normalizó a un contenido de ADN de las células en el mismo pozo eliminando así la variación debida a las diferencias en el número de células. La cuantificación de ADN es un indicador particularmente útil del número de células, incluyendo el número de células de queratinocito, ya que cada una de las células tiene todos los intentos y propósitos de un genoma idéntico y por lo tanto una cantidad idéntica de ADN. El contenido total de ADN de un pozo de células por lo tanto, es directamente proporcional al número de células en aquel pozo. Se utilizó la cuantificación de ADN para normalizar los datos de TGase para el número de células. Se colocaron en placas los queratinocitos en placas de 96 pozos a una densidad de 3,000 células por pozo en un medio de 200 µl. Después de la incubación durante cuatro días, el medio se cambió por un medio que contiene compuestos de prueba (seis réplicas por prueba) . Las células se cultivaron durante 72 horas adicionales, después de lo cual el medio se aspiró y las placas se almacenaron durante por lo menos 1.5 horas a -70°C. Las placas se removieron del congelador y las células se fijaron con una solución fría de etanol/acetona 1:1 durante 30 minutos. Se añadieron 100 µl/pozo de colorante Hoechst (concentración final de 10 µg/ml) y esto se incubó durante 15 minutos, se cubrió y después se leyó en un fluorímetro (ex. 360 nm y em. 460 nm) . La solución colorante se removió y los pozos se enjuagaron con PBS en una preparación para el ensayo de TGase.

EJEMPLO 1 Acido retinoico es más efectivo que el retinol para alteral el estado de diferenciación de queratinocito A. Se examinó el efecto de la incorporación de proteína soluble de µg de 3H-timidina 24 horas después de la adición de ácido retinoico o retinol a varias concentraciones. Los resultados que se obtuvieron se resumen en la Tabla ÍA.

TABLA ÍA EFECTO DE ACIDO RETINOICO (RA) Y RETINOL (ROH) EN LA INCORPORACIÓN DE TIMIDINA DE QUERATINOCITO n = 3 Todas las concentraciones de ácido retinoico probadas, es decir, 2.5 x 10~7 M, 2.5 x 10"8 y 2.5 x 10"9M, incrementaron significativamente la proliferación de queratinocito sobre el control de etanol y cada uno de los tratamientos de retinol 2.5 x 10"7 M, 2.5 x 10_8M y 2.5 x 10~9M y lo realizaron en una forma de dosis dependiente. Esto es consistente con el ácido retinoico que tiene un efecto de estimulación mayor sobre la proliferación epitelial que el retinol .

B. Se examinó el efecto sobre niveles de Transglutaminasa después de la adición de ácido retinoico y retinol. Los resultados que se obtuvieron se resumen en la Tabla IB.

TABLA IB EFECTO DE ACIDO RETINOICO (RA) Y RETINOL (ROH) SOBRE UN NIVEL DE TRANSGLUTANIMASA DE OUERATINOCITO n = 3 Todas las concentraciones de ácido retinoico probadas, es decir, 2.5 x 10"7 M, 2.5 x 10"8M y 2.5 x 10"9M, redujeron la diferenciación de queratinocito sobre el control de etanol y cada uno de los tratamientos de retinol y lo hicieron a un grado significativamente mayor que cada uno de los tratamientos de retinol de 2.5 x 10"7 M, 2.5 x 10""8M y 2.5 x 10" 9M correspondientes. La reducción en el nivel de transglutaminasa fue dependiente de la dosis tanto para el ácido retinoico como para el retinol. Esto es consistente con el ácido retinoico que tiene un efecto inhibidor mayor sobre la diferenciación epitelial que el retinol.

EJEMPLO 2 LINOLEOIL-DIETANOLAMINA (LINOEOIL-DEA) . BIFONAZOL Y RETINOL ACTUANDO SINEROISTICAMENTE PARA MEJORAR LA PROLIFERACIÓN DE OUERATINOCITO Y PARA INHIBIR LA DIFERENCIACIÓN A. Se analizó el efecto de la incorporación de 3H-timidina/proteína soluble µg 24 horas después de la adición de los compuestos de prueba, y los resultados combinados de los tres experimentos independientes fueron normalizados a sus controles respectivos de etanol. Los resultados que se obtuvieron se resumen en la Tabla 2A.

TABLA 2A EFECTO DE RETINOL. BIFONAZOL Y LINOLEOIL-DEA SOBRE LA INCORPORACIÓN DE TIMIDINA DE QUERATINOCITO Incorporación media valor p valor p valor p valor p Tratamiento de tirnidina/µg de s vs vs vs. (*,@ proteína ± s.d. control 2.5x10 * 2.5x10 "* (control) ROH RA Control 4368 ±250 (100%) 0.105 0.008 •= 0.103 @=0.039 2?cis? RA 55691248 1127%) 0.008 0.002 •= 0.158 F=0.0B5 2.5x1 * R?tinol 4856 * 217 (11 1%) 0.105 0.038 •= 0.600 ®=0.403 2.5x1 s'M ROH + 10*lM tADEA 50271 3W (1 15%) 0.103 0.600 0.158 @=0.936 2.5x10?M ROH + iO^ 5052 ± 202 (116%) 0.039 0.403 0.085 •= 0.936 Kfonazol 2.5xl0"'M ROH + I0»M LADEA 56701 68 (130%) 0.011 0.029 0.142 •=0.153 + lO'M Bitonazoi 0=0.048 n = 3 * = valor p vs 2.5xlO?M ROH + ÍO^M LADEA @ = valor p vs 2.5x10"'M ROH + I0'M Bifonazol 2.5 x 10" 9M de ácido retinoico significativamente redujo la incorporación de timidina de queratinocito a un 27% con respecto al control de etanol y a un 16% con respecto al tratamiento de retinol de 2.5 x 10"9M. Tanto 2.5 x 10~9M de retinol + 10"8M de linoleoil-DEA y 2.5 x 10"9M de retinol + ~9M de bifonazol tuvieron un efecto estimulador marginal sobre la proliferación de queratinocito ;on respecto al retinol por sí mismo. Sin embargo, la combinación de 2.5 x 10~9M de retinol + 10"8M de linoleoil-DEA + 10"9M de bifonazol incrementaron significativamente la proliferación de queratinocito con respecto a los tratamientos con etanol y 2.5 x 10"8M de retinol a un 30% y 19%, respectivamente. La combinación de 2.5 x 10~9M de retinol + 10~8M de linoleoil-DEA + 10"9M de bifonazol también incrementó la proliferación de queratinocito con respecto al tratamiento con 2.5 x 10"9M de retinol + 10"8M de linoleoil-DEA y 2.5 x 10"9M de retinol + 10"9M de bifonazol. Por lo tanto, las amidas de ácido graso, bifonazol y retinol actúan sinergísticamente para incrementar la proliferación de queratinocito a niveles que se asemejan estrechamente al efecto estimulador del ácido retinoico. B. Se examinó el efecto de los niveles de transglutaminasa 1 (TG1) normalizada a un contenido de ADN de las células en respuesta a un tratamiento de 72 horas con compuestos de prueba y se muestra en la Tabla 2B .

TABLA 2B EFECTO DE RETINOL, BIFONAZOL Y LINOLEOIL-MEA EN TGASE DE OUERATINOCITO n = 6 2.5 x 10"8M de ácido retinoico fue muy efectivo para reprimir los niveles de queratinocito TGl, es decir, a 13% del nivel de control. Ni el 2.5 x 10"8M de retinol ni el 10~8M de LAMEA + 10~8M de bifonazol tuvieron un efecto inhibidor sobre el nivel de queratinocito de TGl. Sin embargo, 2.5 x 10~8M de retinol + 10"8M de LAMEA + 10"8M de bifonazol reprimieron la TGl de queratinocito a 42% de niveles de control. El retinol, amidas de ácido graso y el bifonazol, por lo tanto, actúan sinergísticamente para reprimir la diferenciación de queratinocito en una forma análoga al efecto del ácido retinoico.

EJEMPLO 3 LINOLEOIL-DEA, CLIMBAZOL Y RETINOL SINERGISTICAMENTE MEJORANDO LA PROLIFERACIÓN DE QUERATINOCITO Y LA DIFERENCIACIÓN INHIBIDA A. Se examinó el efecto de linoleoil-DEA-climbazol y retinol en la incorporación de 3H-timidina. Los resultados que se obtuvieron se resumen en la Tabla 3A TABLA 3A EFECTO DE RETINOL. CLIMBAZOL Y LINOEOIL-DEA EN LA INCORPORACIÓN DE TIMIDINA DE OUERATINOCITO n = 3 * = valor p vs 2.5 x 10 *M ROH + 1Q M LADEA @ = valor p vs 2.5 x lO^M ROH + 10 'M Clímbazol 2.5 x 10"7M de ácido retinoico significativamente incrementaron la incorporación de timidina de queratinocito a un 30% con respecto al control de etanol y a un 28% con respecto al tratamiento 2.5 x 10"8M de retinol. Tanto 2.5 x ~8M de retinol + 10"8M de linoleoil-DEA como 2.5 x 10~8M de retinol + 10" 9M de climbazol tuvieron un efecto estimulador significativo sobre la proliferación de queratinocito con respecto al control y al retinol. Sin embargo, la combinación de 2.5 x 10"8M de retinol + 10"8M de linoleoil-DEA + 10~9M de climbazol incrementó significativamente la proliferación de queratinocito sobre el control como sobre 2.5 x 10~8M de retinol, tratamientos, a un 29% y 27%, respectivamente. Más significativamente, la combinación de 2.5 x 10"8M de retinol + 10~8M de linoleoil-DEA + 10"9M de climbazol también incrementó enormemente la proliferación de queratinocito tanto en 2.5 x 10"8M de retinol + 10"8M de linoleoil-DEA como 2.5 x 10~8M de retinol + 10"9M de climbazol a un 17% y 20%, respectivamente. Por lo tanto, el retinol, linoleoil-DEA y climbazol actúan sinergísticamente para incrementar la proliferación de queratinocito a niveles que se asemejan estrechamente al efecto estimulante del ácido retinoico. B. Se analizó el efecto de los niveles de transglutaminasa 1 (TGl) normalizada a un contenido de ADN de las células en respuesta a un tratamiento de 72 horas con compuestos de prueba y se muestra en la Tabla 3B.

TABLA 3B EFECTO DE RETINOL. CLIMBAZOL Y LINOLEOIL-DEA SOBRE NIVELES DE TGASE DE OUERATINOCITO n = 6 2.5 x 10"7M de ácido retinoico fue muy efectivo para reprimir los niveles de queratinocito TGl, (a 29%) de nivel de control, mientras que la dilución de 2.5 x 10_9M de ácido retinoico no fue tan afectiva pero siguió inhibiendo los niveles de TGl a un 55%. 2.5 x 10"9M de retinol, 2.5 x ~9M de retinol + 10~8M de LADEA y 2.5 x 10 "" 9M de retinol + 10"8M de climbazol no tuvieron ningún efecto inhibidor sobre el nivel de TGl de queratinocito. Sin embargo, 2.5 x 10"9M de retinol + 10"8M de LADEA + 10~8M de climbazol significativamente reprimieron la TGl de queratinocito a 83% de niveles de control. Esta inhibición fue significativamente mayor que el control, ROH solo, ROH + LADEA y ROH + climbazol indicando que los tres ingredientes, es decir, ROH, LADEA y climbazol actúan sinergísticamente para inhibir los niveles de TGl de queratinocito. Este efecto fue aún mayor cuando la concentración de climbazol se incrementó a lOx, es decir, 2.5 x 10 "9M + 10"8M de LADEA + 10"7M de climbazol, lo cual dio como resultado en esta combinación inhibiendo niveles de TGl a 72% de control. El retinol, las amidas de ácido graso y el climbazol, por lo tanto, actúan sinergísticamente para reprimir la diferenciación de queratinocito en una forma análoga al efecto del ácido retinoico.

EJEMPLO 4 CLOTRIMAZOL, LINOLEOIL-MEA ("LAMEA") Y RETINOL QUE MEJORAN SINERGISTICAMENTE LA PROLIFERACIÓN DE OUERATINOCITO Se examinó el efecto de la incorporación de 3H-timidina/proteína soluble µg 24 horas después de la adición de los compuestos de prueba y los resultados se muestran normalizados para el control en la Tabla 4 TABLA 4 EFECTO DE RETINOL, Linoleoil-MEA Y CLOTRIMAZOL SOBRE LA INCORPORACIÓN DE TIMIDINA DE QUERATINOCITO n = 3 * = valor p vs 2.5 x ÍO ^M ROH + 10 ""M LAMEA @ = valor p vs 2.5 x 10 ""M ROH + ÍO ^M Clotrimazol 2.5 x 10~9M de ácido retinoico significativamente incrementó la incorporación de timidina de queratinocito a un 28%, sobre el control de etanol y a un 15% sobre el tratamiento 2.5 x 10"9M de retinol. Tanto 2.5 x 10_9M de retinol + 10"8M de linoleoil-MEA como 2.5 x 10~9M de retinol + 10~8M de clotrimazol tuvieron un efecto estimulante sobre la proliferación de queratinocito en el control, pero este efecto no fue mayor que el retinol por sí mismo. Sin embargo, la combinación de 2.5 x 10~9M de retinol + 10"8M de linoleoil-MEA + 10~8M de clotrimazol incrementó significativamente la proliferación de queratinocito tanto en el control de etanol como en el tratamiento de 2.5 x 10"8M de retinol, a un 29% y 16%, respectivamente. Más inesperadamente, la combinación de 2.5 x 10" 9M de retinol + 10"8M de linoleoil-MEA + 10"8M de clotrimazol también incrementó significativamente la proliferación de queratinocito sobre tanto 2.5 x 10~9M de retinol + 10"8M de linoleoil-MEA como 2.5 x 10~9M de retinol + 10"8M de clotrimazol a un 21% y 17%, respectivamente. El retinol, linoleoil-MEA y clotrimazol por lo tanto, actúan sinergísticamente para incrementar la proliferación de queratinocito a niveles que se asemejan estrechamente al efecto estimulante del ácido retinoico. Los ejemplos 1-4 demuestran que el ácido retinoico, en una forma dependiente de dosis, incrementó la incorporación de timidina y redujo los niveles de transglutamina I en los queratinocitos de la piel. En otras palabras, el ácido retinoico incrementó la proliferación de queratinocito y redujo la diferenciación de queratinocitos. En los Ejemplos 1-4, el ácido retinoico se utilizó como un control positivo y el compuesto de referencia contra el cual los otros compuestos bajo análisis, fueron comparados. El retinol fue significativamente menos efectivo que el ácido retinoico para inhibir la diferenciación de queratinocito y completamente inefectivo para incrementar la proliferación de queratinocito. Los resultados inesperados de los Ejemplos 1-4, sin embargo, fueron que el efecto del retinol sobre queratinocitos cultivados puede ser mejorado a niveles que alcanzan aquellos del ácido retinoico combinando el retinol o éster retinílico con una amida de ácido graso y un azol, aunque un azol y una amida de ácido graso cada uno ejerce muy poco o ningún beneficio. Los resultados documentados anteriormente demuestran que las amidas de ácido graso en combinación con los azoles actúan sinergísticamente con el retinol o éster retinílico, tanto para incrementar la proliferación de queratinocito como para reducir la diferenciación de queratinocito, asemejándose al efecto del ácido retinoico.

El resultado inesperado de este estudio fue que el efecto del retinol sobre queratinocitos cultivados puede ser mejorado a niveles que se acercan a aquellos del ácido retinoico combinando el retinol con una amida del ácido graso y un azol. Este efecto fue no solamente mayor que el efecto de ya sea retinol + aminoácido graso o de retinol + azol sino que los tres ingredientes actúan en forma sinergista entre sí para promover una respuesta de tipo ácido retinoico. Los ejemplos 6-11 ilustran composiciones tópicas de acuerdo con la presente invención. Las composiciones pueden ser procesadas en una forma convencional. Son adecuadas para uso cosmético. En particular, las composiciones son adecuadas para aplicación a piel arrugada, áspera, seca, escamosa, envejecida y/o dañada por UV para mejorar la apariencia y tacto de la misma así como también para la aplicación para la salud de la piel para evitar o retardar su deterioro.

EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra una fase interna elevada de una emulsión agua-en-aceite que incorpora la composición inventiva.

* Brij 92 es polioxietilen (2) oleiléter EJEMPLO 7 Este ejemplo ilustra una crema agua-en-aceite que incorpora la composición inventiva.

*Brij 56 es acohol cetílico POE (10) Alfol 16RD es alcohol cetílico EJEMPLO 8 Este ejemplo ilustra una loción de alcohol que incorpora la composición de acuerdo a la invención.

EJEMPLO 9 Este ejemplo ilustra otra loción de alcohol que contiene la composición inventiva, ¡r fí-ll' -í " .jí|!»« M!i ? Retinol 0.15 Palmitoilmonoetanolam Ja 0.1 Climbazol Etanol 40 Antioxidarrte 0.1 Perfume CS Agua para 100 EJEMPLO 10 Este ejemplo ilustra una crema bronceadora que incorpora la composición de la invención.

EJEMPLO 11 Este ejemplo ilustra una composición para el cuidado de la piel no acuosa que incorpora la combinación inventiva. 1 Un polímero de dimetilsilicona que tiene peso molecular de por lo menos 50,000 y una viscosidad de por lo menos 10,000 centistokes a 25°C, disponible de GEC. 2 Pentámero de dimetilsiloxano cíclico, disponible de Dow Corning Corp. 3 Tetrámero de dimetilsiloxano, disponible de Dow Corning Corp.

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de acondicionamiento de la piel caracterizada porque comprende (a) de 0.001% a aproximadamente 10% de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de retinol y un éster retinílico; (b) de 0.0001% a aproximadamente 50% de un azol (c) de 0.0001% a aproximadamente 50% de una amida de ácido graso; y (d) un vehículo cosméticamente aceptable.

2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido graso comprende de 12 a 18 átomos de carbono.

3. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la amida se selecciona del grupo que consiste de N-alcanolamidas, N,N-dialcanoilamidas, y mezclas de las mismas.

4. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque el éster retinílico se selecciona del grupo que consiste de linoleato de retinilo, palmitato de retinilo, acetato de retinilo, propionato de retinilo y mezclas de los mismos. -

5. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque el ingrediente (a) es retinol.

6. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el azol se selecciona del grupo que consiste de climbazol, miconazol, bifonazol, clotrimazol, econazol.

7. Un método cosmético para acondicionar la piel, el método está caracterizado porque comprende aplicar tópicamente a la piel, la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Un método cosmético para tratar la apariencia de piel arrugada, seca, áspera, escamosa, envejecida o fotodañada, caracterizada porque comprende aplicar a la piel una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Un método cosmético para asemejar el efecto sobre la piel del ácido retinoico, el método está caracterizado porque comprende aplicar a la piel la composición de conformidad con las reivindicaciones 1-6.