MXPA97001111A - Oligomeros especificos de union de secuencia paraacidos nucleicos y su uso en estrategias antisentido - Google Patents

Abstract

Esta invención se relaciona con oligómeros que consisten completa o parcialmente de análogos nucleosidicos de 1,5-anhidrohexitol representados por la fórmula general (I), en la cual B es un anillo heterocíclico, el cual se derivóde una base pirimídica o púrica, tal como la citosina, 5-metilcitosina, uracilo y timina, o derivados desaza de las mismas o adenina, guanina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina y xantina, o derivados desaza de las mismas.

Description

OLIGOMEROS ESPECÍFICOS DE UNION DE SECUENCIA PARA ÁCIDOS NUCLEICOS Y SU USO EN ESTRATEGIAS ANTISENTIDO La presente invención se relaciona con los oligómeros que tienen propiedades de unión de ácido nucleico, oligómeros los cuales consisten completa o parcialmente de análogos nucleosidicos de 1, 5-anhidrohexitol como unidades monoméricas. Esta invención se relaciona además con el uso de los oligómeros en técnicas antisentido y con un método de preparación de los oligómeros. Las técnicas antisentido se basan en el principio de que la función de una hebra sentido codificadora de una molécula de ADN o ARN puede ser bloqueada por una hebra antisentido complementaria. Las técnicas antisentido pueden usarse para varias aplicaciones, tales como el diagnóstico, terapia, modificación y aislamiento del ADN, etc. En esas técnicas, además de la estabilidad de la hebra antisentido en si, la estabilidad del doblete o triplete formado por las hebras sentido y antisentido, asi como la afinidad de unión de la hebra antisentido por la hebra sentido son de importancia. Al igual que la sensibilidad del oligómero, el doblete o triplete para degradar enzimas, tal como las nucleasas, es un factor relevante para la efectividad. Los oligonucleótidos son oligómeros en los cuales los monómeros son nucleótidos. Los nucleótidos son esteres de REF: 24034 fosfato de nucleósidos, los cuales están constituidos de una base púrica o pirimidica y un azúcar. El esqueleto de cada nucleótido consiste de grupos azúcar y fosfato alternados. La estabilidad y afinidad de unión de los nucleótidos puede, por ejemplo, ser influenciada por la modificación de la base. La investigación en esa dirección (1-5) mostró que tales modificaciones únicamente conducen a un doblete menos estable. Las alteraciones en el esqueleto o la incorporación de nuevas estructuras en él condujeron a una mayor estabilidad de la nucleasa pero tuvieron únicamente un efecto adverso sobre su afinidad de unión por las hebras •complementarias. La modificación de los azúcares condujo a un incremento muy limitado en la afinidad por la molécula objetivo (6-8) . Un objeto de la presente invención es proporcionar oligómeros novedosos, los cuales tienen una estabilidad y afinidad de unión mejorada en comparación con los oligómeros conocidos. Ahora se ha encontrado que los oligómeros, que consisten completa o parcialmente de análogos nucleosídicos de 1, 5-anhidro-2, 3-didesoxi-D-arabino-hexitol, en donde el hexitol está acoplado vía su posición 2 al anillo heterocíclico de una base pirimídica o púrica, son capaces de unirse a los oligonucleótidos que se encuentran en la naturaleza. Los monómeros de los cuales los oligómeros están al menos parcialmente compuestos son los representados por la fórmula I : (D en la cual B es un anillo heterocíclico, el cual se derivó de «:0 una base pirimídica o púrica. Los monómeros están conectados entre sí a través de un puente fosfodiéster en la fórmula II representando la estructura de esos oligómeros, en la cual B es un anillo heterocíclico, el cual se derivó de una base pirimídica o púrica y, en donde 1 es un número entero de 0 a 15, y m son cada una números enteros de 1 a 15 pero si k > 1, entonces puede ser 0 y si m > 1, k puede 5 ser 0; y, en donde X representa oxígeno o azufre. Todas las sales posibles del compuesto de fórmula II están incluidas en 1- nvención. Los monómeros de fórmula I son el objeto de la solicitud de patente Europea No. 92201803.1. Los oligómeros de fórmula II son compuestos novedosos. Ellos presentan una cierta similitud con los oligonucleótidos que consisten de los 2' -desoxinucleósidos que se encuentran en la naturaleza, pero los azúcares de los monómeros están alargados debido a que se incorporó un grupo metilo entre el óxido y un carbón del anillo, el cual se acopló a la base. 15 De acuerdo a la invención se ha encontrado que los oligómeros de fórmula II y sus sales exhiben unión específica de secuencia a los oligómeros naturales representados por la fórmula III en la cual k es un entero y en donde B tiene la misma designación que en las fórmulas I y II. Por lo tanto se ha encontrado una clase novedosa de híbridos o polímeros de unión específicos de secuencia. El hecho de que los oligómeros de acuerdo a la invención, consistan al menos parcialmente de nucleósidos de piranosa, que tienen una alta afinidad de unión es muy sorprendente. El estudio de la construcción de oligonucleótidos a partir de nucleótidos de piranosa monoméricos fue emprendido hace años inter alia por el grupo de A. Eschenmoser et al. Eschenmoser investigó la selección natural de las furanosas como bloques de construcción de azúcares para ácidos nucleicos (9) . Sin embargo, el no indicó los requerimientos que una molécula antisentido adecuada deberá satisfacer para lograr una buena unión a furanosa-ADN que se encuentra en la naturaleza. Los presentes inventores sin embargo investigaron cuales oligonucleótidos similares a la piranosa podrían ser capaces de formar dos bloques estables con la furanosa-ADN natural (10, 11) . Teóricamente, un oligonucleótido de piranosa tiene una energía libre ventajosa sobre un oligómero de furanosa debido al menor número de cambios de entropía durante la formación del doblete. Sin embargo, los oligonucleótidos similares a la piranosa estudiados por los presentes inventores anteriormente no fueron capaces o no fueron suficientemente capaces de .nirse a las hebras complementarias de la furanosa-ADN natural. Esos oligonucleótidos similares a la piranosa consistieron de nucleósidos de 2, 3-didesoxi-B-D-eritro-hexopiranosilo (fórmula V), nucleósidos de 2,4-didesoxi-ß-D-eritro-hexopiranosilo (fórmula VI) y/o nucleósidos de 3, 4-didesoxi-ß-D-eritro-hexopiranosilo (fórmula VII), respectivamente.

El hecho de que se encuentre unión específica de secuencia para los oligómeros de fórmula II, que comprenden piranósidos como bloques de construcción de azúcar es por lo tanto aún más sorprendente. Alargando el anillo de furano de los compuestos de furanosa a un anillo de pirano no se producen oligómeros capaces de unirse a oligonucleótidos naturales. De este modo, no podría anticiparse el efecto de alargar el anillo de pentofuranosilo a un anillo de 1, 5-anhidrohexitol. Los compuestos de acuerdo a la invención son por lo tanto oligómeros de análogos nucleosídicos, en donde un 1,5-anhidro-2, 3-didesoxi-D-hexitol se acopló vía su posición 2 de acuerdo a una configuración arabino al anillo heterocíclico de una base pirimídica o púrica. Los oligómeros consisten de los análogos nucleosídicos anteriores conectados entre sí como diésteres de fosfato o diésteres de tiofosfato. Los oligómeros pueden ser representados por la fórmula II en la cual k, 1, m, B y X tienen las designaciones establecidas anteriormente. Los oligómeros pueden estar compuestos exclusivamente de análogos nucleosídicos de hexitol de fórmula I (con 1 en la fórmula II igual a cero) o puede tener 2' -desoxinucleósidos naturales entremezclados o en el extremo de la molécula (con 1 en la fórmula II siendo igual a uno o mayor) . El hexitol tiene la configuración (D) y la estequiometría de los sustituyentes es de acuerdo a una configuración arabino. Cuando el grupo B se deriva de una base pirimídica esta puede ser, ya sea citosina, 5-metil citosina, uracilo o o ti ina. Cuando B se deriva de una base púrica este puede ser una adenina, guanina, 2, 6-diaminopurina, hipoxantina o anillo de xantina, o un derivado desaza de uno de esos. Los análogos nucleosídicos, componentes monoméricos de la presente invención, pueden prepararse de diferentes maneras y uno de los métodos de preparación es el objeto de la solicitud de patente europea No. 92.201803.1. Esas síntesis has sido descritas igualmente en Verheggen et al. (12) . El montaje de los monómeros en un oligómero sigue los esquemas clásicos y puede efectuarse ya sea por la química de la fosforamidita estándar (compárese la referencia 13) o por la química de la H-fosforato (compárese la referencia 14) . Todos los procedimientos se llevaron a cabo de manera conveniente en un sintetizador de ADN automático para síntesis oligonucleotídica estándar. Para esas condiciones estándar se hace referencia a los Métodos en Biología Molecular (15) . El método preferido es el método de la fosforamidita, el cual hace uso de las fosforamiditas de análogos nucleosídicos de hexitol como bloques de construcción entrantes para el montaje en la "dirección 6'". Las fosforamiditas son representadas por la fórmula VIII en donde B* es una porción básica protegida adecuada para la síntesis oligonucleotídica (por ejemplo, timina, N4-benzoil-citosina, N6-benzoiladenina en N2-isobutirilguanina, representadas por las fórmulas IX, X, XI y XII, respectivamente) .

Los productos de fórmula VIII pueden prepararse de acuerdo a los procedimientos estándar. La protección de las porciones básicas de citosina, adenina o guanina se logra siguiendo una estrategia de protección transitoria para las porciones hidroxilo de los compuestos de fórmula I (16) . De manera preferible, sin embargo, la protección básica se lleva a cabo mediante la acilación de los análogos nucleosídicos protegidos con 4, 6-bencilideno la-d, los cuales son intermediarios en la síntesis de los monómeros de la fórmula I establecida anteriormente. Después de la acilación de la funcionalidad amino exocíclica, la porción de bencilideno se remueve con ácido acético al 80% para obtener 3a-d. Para obtener el compuesto 3c puede removerse el grupo p-nitro-feniletilo con DBU.

La función hidroxilo primario de los análogos 1,5-anhidrohexitol 3a-d puede protegerse con un grupo dimetoxi-tritilo para producir 4a-d. La conversión a los bloques de construcción de fosforamidita 5a-d, adecuados para la incorporación en una cadena oligonucleotídica puede efectuarse con 2-cianoetil N,N-diisopropilclorofosfor-amidita. Pueden prepararse soportes que contengan un análogo de 1, 5-anhidrohexitol mediante la acilación de los compuestos 4a-d produciendo 6a-d, los cuales pueden ser acoplados a la función amino de cualquier vidrio de poro controlado de alquilamino de cadena larga (CCAA-CPG) o un poliestireno con funcionalidades amino adecuadas (por ejemplo Tentagel®-RAPP Poly ere) haciendo uso de una carbodiimida, y produciendo 7a-d (para la funcionalización de soportes viz. ref. 17) . Después del montaje, los oligonucleótidos obtenidos se separan del soporte y se desprotegen mediante el tratamiento con amoniaco durante 16 horas a 55°C. La purificación de los oligómeros obtenidos de la fórmula II establecida anteriormente puede efectuarse de varias formas (18). El método _ preferido es la purificación por FPLC de intercambio aniónico a un pH básico de 12 para romper todas las estructuras secundarias posibles (10) . La desalación puede efectuarse por las técnicas de filtración en gel sencillas seguidas por liofilización. Todas las sales aceptables pueden prepararse de manera convencional. la- 2a-d a:B=timin-l-ilo a:B*=timin-l- b:B=adenin-9-ilo b:B*=N6-benzoiladenin-9-ilo 7a-b :R2 - J— CH2CH2CONH — CPG O c:B=N2-ísobutiril-06- (2- (p-nitro- c:B*=N2-isobutirilguanin-9-ilo fenil) etil) guanin-9-ilo d:B*=N4-benzoilcitosin-l-ilo d:B=citosin-l-ilo CPG=vidrio de poro controlado (soporte sólido) (i) HOAc al 80%; (ii) cloruro de dimetoxitritilo, piridina; (iii) N, N-diisopropiletilamina, 2-ciano-N,N-«diisopropilclorofosforamidita, CH2C12; (iv) DMAP, anhídrido succílico, piridina; (v) LCAA-CPG preactivado, DMAP, Et3N, 1- (3-<±Letilap nopropil)-3-etilcarboaliimi'da. HCl, piridina, Como se estableció anteriormente, los oligómeros presentan unión específica de secuencia por oligonucleótidos naturales. Ellos muestran una unión más fuerte a un oligodesoxiaucleótido natural complementario que las secuencias no modificadas y están rotados con mucha mayor estabilidad bioquímica. De esta manera pueden usarse de manera ventajosa para las estrategias antisentido que comprenden el diagnóstico, hibridación, aislamiento de ácidos nucleicos, modificación de ADN específica de un sitio y las estrategias terapéuticas y antisentido que actualmente continúan con oligodesoxinucleótidos naturales.

E.JEMPLOS Los compuestos de acuerdo a la invención así como su síntesis química y la preparación de los materiales de partida se ilustran de manera adicional en los siguientes ejemplos, los cuales sin embargo no pretenden limitar la invención. Se usaron las siguientes abreviaciones: FABMS = espectrometría de masas de bombardeo atómico rápido Thgly = tioglicerol NBA = alcohol nitrobencílico La síntesis de los análogos nucleosídicos de 1,5-anhidro-2, 3-didesoxi-2-sustituidos-D-arabino-hexitol y de sus derivados protegidos con 4, 6-O-bencilideno ha sido descrita por Verheggfjn et al. (12) .

E.JEMPLO 1 Análogos nucleosídicos protegidos por bases 1.1. 1 , 5-anhidro-2- (N6-benzoiladenin-9-il) -2 , 3-didesoxi-D- arabinohexitol (3b) A una solución de 2.3 g (6.51 mmol) de 1,5-anhidro-4, 6-0-benciliden-2- (adenin-9-il) -2, 3-didesoxi-D-arabino-hexitol en 20 ml de piridina seca, se adicionaron 0.9 ml (7.8 mmol) de cloruro de benzoilo a 0°C. Después de agitar durante 4 horas a temperatura ambiente, la mezcla se enfrió sobre un baño de hielo y se le adicionaron 2 ml de H20. Después de la adición de 1.5 ml de una solución de NH3 concentrado (33% g/v) y agitar durante 45 minutos adicionales a temperatura ambiente, la mezcla se evaporó. El residuo se purificó por cromatografía en columna (CH2-Cl2-MeOH, 98:2) produciendo 1.92 g (4.19 mmol, rendimiento del 64%) de 1,5-anhidro-4, 6-0-benciliden-2- (N6-benzoiladenin-9-il) -2, 3-didesoxi-D-arabinohexitol . Este se trató adicionalmente con 100 ml de ácido acético al 80% a 60°C durante 5 horas para remover la porción bencilideno. La evaporación, coevaporación con tolueno y purificación por cromatografía en columna (CH2-Cl2-MeOH, 95:5 tot 90:10) produjo 1.10 g (2.98 mmol, rendimiento del 71%) del compuesto mencionado en el titulo de este ejemplo. UV (MeOH) ^«298nm (e=20200) FABMS (Thgly, NaOAc) m/e: 392 (M+Na) + .240 (B+2H) + lE RMN (DMSO-dßd 1.94 (m, 1H, H-3'ax), 2.32 (m, 1H. H-3'eq), 3.21 (m, 1H, H-5'), 3.42-3.76 (m, 3H, H-4' , H-6' , H-6") , 3.90 (dd, 2J=131iz, 1H, H-l'ax), 4.27 (dd, 2J=12.2Hz, 1H, H-l'eq), 4.67 (t, J=5.7Hz, 1H, 6'=OH), 4.88-5.00 (m, 2H, H-2' , 4' -OH), 7.47-7.68 ( , 3H, H aromático), 8.00-8.07 (m, 2H, H aromático) 8.60 (s, 1H) , 8.73 (s, 1H) (H-2, H-8) ppm. 13C RMN (DMSO-dß) d 635.8 (C-3' ) , 50.7 (C-2'), 60.5 60.7 (C-4', C-.6'), 67.9 (C-1'), 83.1 (C-5'), 125.1 (C-5), 128.5 (Co, Cm) , 132.5 (Cp) , 133.6 (Cx) , 143.5 (C-8), 150.3 (C-4), 151.4 (C-2), 152.4 (C-6) ppm. 1.2. l,5-Anhidro-2,3-didesoxi-2- (N2-isobutirilguanin-9-il- arabinohexitol (3c) La alquilación de la N2-isobutiril-06- [2- (p-nitrofenil) etil] guanina (1.85 g, 7.5 mmol) con 1,5-anhidro- 4, 6-0-benciliden-3-didesoxi-D-glucitol (1.18 g, 5 mmol) produjo 1.35 g de 1, 5-anhidro-4, 6-0-benciliden-2, 3-didesoxi- 2- (N2isobuti?:il-guanin-9-il) -D-arabinohexitol crudo después - de la remoción del grupo p-nitrofeniletilo con 1.5 ml (10 mmol) de D3U en piridina anhidra durante 16 horas y purificación por cromatografía instantánea en columna (CH2C12- MeOH, 99:1 a 97:3). La hidrólisis de la porción bencilideno con 100 ml de HOAc al 80% (5 horas a 60°C) dió el compuesto deseado 3c (610 mg, 1.74 mmol, rendimiento total del 34%) después de la cromatografía en columna (CH2Cl2-MeOH, 90:10).

UV(MeOH)?mc?273nm FABMS (Thgly, NaOAc) m/e: 352 (M+H)+ *H RMN d 1.11 (d, J = 6.7 Hz, 6H, CH3) , 1.93 (m, 1H, H-3'ax), 2.11-2.38 (m, 1H, H-3'eq), 2.80 (q, 1H, CHMe-2) , 3.25 (m, 1H, H-5'), 3.42-3.78 (m, 3H, H-4' , H-6' , H-6") , 3.89 (dd, 2J=13Hz, 1H, H-l'), 4.21 (dd, 2J=13Hz, 1H, H-l"), 4.69 13C RMN d 19.4 (CH3), 34.5 (CHMe2) , 35.8, (C-3' ) , 50.5 (C-2'), 60.5, 60.7 (C-4', C-6'), 67.9 (C-1'), 83.1 (C-5'), 116.7 (C-5), 141 7 (C-8), 152.0 (C-4), 153.0 (C-2), 159.8 (C-6), 175.2 (C=0) ppm.

E¿TEMPLO 2 Dimetoxitri ilación de análogos nucleosídicos 2.1. l,5-Anhidro-6-0-dimetoxitritil-2- (timin-1-il) -2,3- didesoxi-D-arabinohexitol (4a) El 1, 5-Anhidro-2- (timin-2-il) -2, 3-didesoxi-D-arabinohexit:ol (3a) (330 mg, 1.29 mmol) se disolvió en 20 ml de piridina anhidra, y se le adicionaron 480 mg (1.42 mmol) de cloruro de dimetoxitritilo. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente, se diluyó con 100 ml de CH2C12 y se lavó dos veces con 100 ml de solución NaHC03 saturada. La capa orgánica se secó, se evaporó y se coevaporó con tolueno. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columna (con un gradiente de MeOH del 0 al 3% en CHC13 que contenía 1% de trietilamina) para producir 373 mg (0.67 mmol, 52%) del compuesto del título como una espuma. FABMS (Thgly, NaOAc) m/e: 581 (M+Na) \ 127 (B+2H) + lK RMN (CDC13) : d 1.60-2.50 (m, 2H, H-3' , H-3") . 1.91 (s, 3H, CH3) , 3.12-3.62 (m, 2H, H-5' , H-4'), 3.77 (s, 6H, 2x OCH3) , 3.65-4.17 (m, 4H, H-6' . H-6", H-l', H-l"), 4.53 (s, 1H, H-2'), 4.88 (d, 1H, J=5.1, Hz 4'-OH), 6.81 (d, J=8.7, 4H, H aromático), 7.09-7.53 (m, 9H, H aromático), 8.09 (s, 1H, H-6), 9.10 (s amplio 1H, NH) ppm 13C RMN (CDCI3) d 12.5 (CH3) , 35.5 (C-3' ) , 50.7 (C-2'), 54.9 (OCH3), 62.4, 63.1 (C-4', C-6'), 68.2 (C-1'), 81.1 (C-5'), 86.0 (Ph3C), 110.0 (C-5), 138.4 (C-6), 151.0 (C-2), 163.8 (C- 4), 112.9, 126.6, 127.5, 127.8, 129.7, 135.6, 144.6, 158.3 (C 5 aromático) ppm. 2.2. l,5-Anhidro-6-0-dimetoxitritil-2- (N6-benzoiladßnin-9- il) -2 , 3-didesoxi-D-arabinohexitol (4b) Í0 Una solución de 370 mg (1 mmol) del nucleósido 3b y 400 mg (1.2 mmol) de cloruro de dimetoxitritil en 25 ml de piridina seca se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla se diluyó con 100 ml de CH2C12 y se lavó dos i5 veces con veces con solución de NaHC03 saturada. La capa orgánica se secó, se evaporó y coevaporó con tolueno. El residuo se purificó por cromatografía en columna (0 a 3% de MeOH en CH2C12 con 0.2% de piridina) para obtener 400 mg (0.6 mmol, rendimiento del 63%) del compuesto 4b como una espuma.

FABMS (Thgly, NaOAc) m/e: 694(m+Na)\ 240 (B+2H)\ 2.3. 1 , 5-Anhidro-6-0-dimetoxitritil-2- (N2-isobutirilguanin-9- il) -2,3-didesoxi-D-arabinohexitol (4c) A una solución de 580 mg (1.65 mmol) del nucleósido 3c y 670 mg (2.0 mmol) de cloruro de dimetoxitritilo en 25 ml de piridina seca se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla se diluyó con 100 ml de CH2C12 y se lavó dos veces con veces con 100 ml de solución de NaHC03 saturada. La capa orgánica se secó, se evaporó y coevaporó con tolueno. El residuo se purificó por cromatografía en columna con un gradiente de 0 a 3% de MeOH en CH2C12 con un contenido de 0.2% de piridina para obtener 770 mg (1.18 mmol, rendimiento del 71%) del compuesto 4c como una espuma. FABMS (NBA) m/e: 654 (M+H)\ 2.4. Preparación de los bloques de construcción de la amidita (5a-c) Una mezcla del nucleósido protegido en 6' -O (0.5 mmol), 3 equivalentes de N,N-diisopropiletilamina seca y 1.5 equivalentes de 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforami-dita en 2.5 ml de CH2C12 seco se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Después de la adición de 0.5 ml de EtOH y una agitación adicional por 25 minutos, la mezcla se lavó con solución de NaHC03 al 5% (15 ml) y solución de NaCl saturada, se secó y evaporó. La cromatografía instantánea en columna con Et3N dió la amidita como una espuma blanca, la cual se disolvió en una pequeña cantidad de CH2C12 seco y se adicionó por goteo a 100 ml de n-hexano frío (-50°C) . El precipitado se aisló, se lavó con n-hexano, se secó y usó como tal para la síntesis del ADN. La siguiente tabla da el solvente de elución y el rendimiento después de la precipitación para las diferentes amiditas: compuesto solvente relación rendimi-anto FABMS (NBA) de m/e solvente 5a n-hexano/acetato 23:75:2 62% 759 (M+H)* de etilo/trietilamina 5b n-hexano/acetato 50:48:2 65% 872 (M+H)* de etilo/trietilamina 5c n-hexano/acetona/ 55:43:2 56% 854 (M+H)* trietilamina E«TEMPLO 3 Succinilación de los análogos nucleosídicos protegidos 6-0 3.1. l,5-Anhidro-6-0-dimetoxitritil-4-0-succinil-2- (timin-1-il) -2,3-did«_¡soxi-D-arabinohexitol (ßa) Una mezcla de 80 mg (0.14 mmol) 4a, 9 mg (0.07 mmol) de DMAP y 43 mg (0.14 mmol) de anhídrido succínico en 5 ml de pirida anhidra se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Puesto que la reacción no se completó, se agregó una cantidad adicional de 43 mg (0.43 mmol) y la mezcla se agitó durante otras 24 horas. La solución se evaporó y coevaporó con tolueno. El residuo se disolvió en CH2C12, la capa orgánica se lavó con solución de NaCl saturada y agua, se secó y evaporó para dar 78 mg (0.12 mmol, rendimiento del 86%) de 6a como una espuma blanca. 3.2 l,5-Anhidrido-6-0-dimetoxitritil-4-0-succinil-2-(Nß-benzoiladenin-9-il) -2,3-didesoxi-D-arabinohexitol (6b) Se usó el mismo procedimiento que se describió para 6a para la síntesis de 6b. Una cantidad de 260 mg (0.39 mmol) de 4b produjo 256mg (0.33 mmol, rendimiento del 85%) del compuesto del título como un espuma.

E«EMPLO 4 Producción de oligonucleótidos 4.1 Preparación del soporte sólido Una mezcla de 80 µmol de succinatos (6a, b) , 400 mg de LCAA-CPG preactivado (17), 5 mg (40 mmol) de DMAP, 35 µl de Et3N y 153 mg de (800 µmol) 1- (3-dimetilaminopropil) -3-etilcarbodii ida.HCl en 4 ml de piridina anhidra se sónico primero durante 5 minutos y a continuación se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de agitar, el soporte sólido de CPG se filtró y se lavó sucesivamente son piridina, metanol y CH2C12 seguido por secado bajo vacío. Los sitios' sin reaccionar sobre la superficie del soporte se coronaron usando 1.5 ml de 1-metilimidazol en THF (Applied Biosystems) y 1.5 ml de anhídrido acético-lutidina-THF 1:1:8 (Applied Biosystems) . Después de agitar durante 4 horas a temperatura ambiente, el soporte sólido se filtró, se lavó con CH2C12 y se secó bajo vacío. El análisis colorimétrico con dimetoxitritilo indicó una carga de 18.5 µmol/g para 7a y 21.5 µmol/g para 7b. -_ 4.2 Síntesis del ADN La síntesis oligonucleotídica se efectuó en un sintetizador de ADN ABI 381A (Applied Biosystems) usando el 5 método de la fosforamidita (dimetoxitritilo final) . Las secuencias obtenidas se desprotegieron y escindieron del soporte sólido mediante el tratamiento con amoniaco concentrado (55°C, 16 horas) . Después de la purificación sobre una columna de NAP-10® (Sephadex G25-grado ADN, O Pharmacia) , eluida con amortiguador A (véase más adelante) , la purificación se efectuó sobre una columna de intercambio aniónico mono-Q® HR 10/10 (Pharmacia) con el siguiente sistema de gradiente [A= NaOH 10 mM, pH 12.0, NaCl 0.1 M; B= NaOH 1.0 mM, pH 12.0, NaCl 0.9 M; el gradiente usado depende 5 del oligonucleótido, velocidad de flujo 2 ml/min]. El sistema de cromatografía líquida de baja presión consistió de una Bomba Inteligente Merck-Hitachi L6200 A, una columna Mono Q® HR 10/10 (Pharmacia), un detector de UV Uvicord SJI 2138 (Pharmacia-LKB) y un dispositivo de registro. La fracción que 0 contenía el producto se desaló sobre una columna NAP-10® y se liofilizó.

E¿TEMPLO 5 Temperaturas de fusión Los oligómeros se disolvieron en el siguiente amortiguador: NaCl 0.1 M, fosfato de potasio 0.02 M pH=7.5, EDTA 0.1 mM. La concentración se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm a 80°C y asumiendo que los análogos nucleosídicos del 1, 5-anhidrohexitol tienen los mismos coeficientes de extinción en el estado desnaturalizado que los núcleosidos naturales. Para los monómeros de adenina e = 15000 Para los monómeros de timina e = 8500 Para los monómeros de guanina e = 12500 Para los monómeros de citosina e = 7500 La concentración en todos los experimentos fue de aproximadamente 4 µM de cada hebra. Las curvas de fusión se determinaron con un Espectrofotómetro Uvikon 940. Las cubetas se termoestabilizaron con agua circulante a través del portacubeta y la temperatura de la solución se midió con una termorresistencia directamente sumergida en la cubeta. El control de la temperatura y la recolección de datos se efectuaron automáticamente con una computadora compatible IBM/Pc AT. Las muestras se calentaron y enfriaron a una velocidad de 0.2°C/min y no se observaron diferencias entre las curvas de fusión en caliente y en frío, las curvas de fusión se evaluaron tomando en cuenta la primer derivada de la curva de absobancia contra la curva de temperatura. Los ejemplos de los oligonucleótidos sintetizados junto con sus puntos de fusión se dan en las tablas 1 hasta 4.

Tabla 1 Puntos de fusión de los oligonusleótidos con un solo nucleósido de anhidrohexitol (A*, T*) incorporados (medidos a una concentración de NaCl de 0.1 M) a la mitad de un doblete A13/T?3.

A partir de la Tabla 1 está claro que la incorporación de 1, 5-anhidro-2- (adenina-9-il) -2, 3-didesoxi-D- arabinohexitol en un oligodesoxiadenilato da transiciones helicoidales casi idénticas a la inserción de una 2'- b desoxiadenosina natural. Deberá mencionarse, sin embargo, que un mal emparejamiento en un doblete de oligodesoxiadenilato/oligotimidina tiene un gran efecto sobre la estabilidad del doblete. Por el contrario, en la sustitución de la timidina por 1, 5-anhidro-2, 3-didesoxi-2- : o (timin-l-il) -D-arabinohexitol en un oligotimidilato da una disminución sustancial en la temperatura de fusión. En contraste a las observaciones anteriores de nuestro laboratorio con nucleósido de 2, 4-didesoxi-ß-D-eritro- hexopiranosilo en donde un mal acoplamiento A*.G [A*:9-2,4-15 didesoxi-ß-D-eritrohexopiranosil) adenina] da una hibridación más estable que un apareamiento de bases A*.T [A* : 9-2,4- didesoxi-ß-D-eritrohexopiranosil) adenina] (11) en donde no existe alteración en base a la especificidad de apareamiento con los nucleósidos de 1, 5-anhidrohexitol cuando 20 se usa el doblete de oligodesoxiadenilato/oligotimidina como modelo.

Tabla 2 Temperatura de fusión de oligonusleótidos completamente modificados y de oligonusleótidos modificados en ambos extremos, determinada a NaCl 0.1 M. (1) medida a 284 nm El oligoA* y el oligoT* de un sola hebra muestran ambos una estructura ordenada pero, en contraste con los resultados a alta concentración de sal (no se muestran los resultados) el poliT* no muestra la misma tendencia para la formación de homodobletes. Esto se demostró por el mayor incremento más o menos lineal de la absorción de UV con la temperatura, tanto para el oligoA* como para el oligoT*. Una mezcla equimolar de oligoT* y oligodesoxiadenilato muestra una temperatura de fusión de 45°C con una hipocromicidad del 49% cuando se midió a 284 nm. Se sabe que, cambiando la concentración de sal, ocurren transiciones estructurales en el ADN y este es claramente el caso. La asociación oligoT*: oligodesoxiadenilato se favoreció a concentraciones de sal más bajas mientras que la formación de homodobletes de oligoT* se favoreció a altas concentraciones de sal. El comportamiento térmico del complejo a 260 nm sin embargo, indica que la asociación oligoT*: oligodesoxiadenilato no es una transición helicoidal clásica. A 260 nm, la hipocromicidad disminuye primero, mostrando un mínimo a 46°C (el punto de fusión observado a 484 nm) y a continuación se incrementa. De igual modo se evaluaron las secuencias mezcladas completamente modificadas (dos hexámeros y un dodecámero) que contienen análogos nucleosídicos de adenina (A*) y guanina (G*) .

Tabla 3 Temperaturas de Fusión de hexámeros completamente modificados Secuencia (mezcla equimolar con complemento) Tm (°C) (16) 6'-A*G*G*A*G*A* 31.2 (17) 5'-AGGAGA 10.0 (18) 6'-G*A*G*A*G*A* 14.7 (19) 5'-GAGAGA 9.5 determinada a NaCl 1M, KH2P04 20 mM pH 7.5, EDTA 0.1 mM Los dobletes se formaron con las secuencias complementarias 5'-TCTCCT(20) para 16 y 17, y 5'-TCTCTC (21) para 18 y 19 respectivamente. Aunque algunos de esos puntos de fusión de la secuencia podrían determinarse para los hexámeros, la desnaturalización térmica de esos oligonucleótidos se estudió en NaCl 1 M (con un contenido de K:HP04 20 mM pH 7.5 y EDTA 0.1 mM) . El fenómeno más importante es la clara formación de un doblete entre los oligonucleótidos similares a la piranosa y sus contrapartes naturales. Además, esos dobletes modificados son más estables que los dobletes control que consisten de pares de bases de Watson-Crick exclusivamente.

. De manera sorprendente, sin embargo la diferencia es grande en la temperatura de fusión para las secuencias 16 (Tm = 31.2°C) y 17 (Tm = 14.7°C) con sus oligonucleótidos complementarios antiparalelos. En donde ambos oligonucleótidos modificados contienen 3 G*' y 3A* difiriendo únicamente én su orden de secuencia, la temperatura de fusión para 16 dobla al de 18. Este efecto dependiente de la secuencia, solamente es reflejado marginalmente por los oligonucleótidos control 17 y 19.

Tabla 4 Temperaturas de Fusión para dodecámeros completamente modificados que contienen A* y G* Secuencia (mezcla equimolar con complemento) Tm con 24 (°C) (22) 6'-A*G*G* G*A*G* A*G*G* A*G*A* 64.8 (23) 5' -AGG GAG AGG AGA 49.0 determinada a NaCl^O.l M (24) 5' -TCT CCT CTC CCT Observando los dodecámetros puede notarse nuevamente un incremento en la estabilidad de los oligonucleótidos completamente modificados comparados con su secuencia control 23 con un incremento en la temperatura de fusión de 16°C, cuando se evalúan ambas secuencias con sus secuencia antiparalela complementaria 24.

REFERENCIAS I. Beaucage, S.L. & Iyer, R.P., Tetrahedron 49, 6123-6194 (1993) 2. Sanghvi et al., Nucleosides and Nucleotides 10, 345-346 (1991) 3. Chollet et al., Chemica Scripta 26, 37-40 (1986) 4. Seela, F. & Kehne, A., Biochemistry 24, 7556-7561 (1985) . Wagner et al., Science 260, 1510-1513 (1993) 6. Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15, 6131-6148 (1987) 7. Perbost et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165, 742- 747 (1989) 8. Gagnor et al., Nucleic Acids Res. 15, 10419-10436 (1987) 9. Esche iaoser, A., Puré & Appl. Chem. 65, 1179-1188 (1993) 10. Augustyns et al., Nucleic Acid Res. 20, 4711-4716, (1992) II. Augustyns et al., Nucleic acids Res. 21, 4670-4676, (1993) 12. Verheggen et al., J. Med. Chem..36, 2033-2040 (1993) 13. Matteucci en Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103, 3185-3191 (1981) 14. Froehler et al., Nucí. Acids Res. 14, 5399-5407 (1986) . Métodos en Biología Molecular, vol. 20, Protocolos para oligonucleótidos y análogos, S. Agrawal ed., Humana Press, Toto a, New Jersey, U.S.A. 16. Ti et al., J. Am. Chem. Soc. 104, 1316-1319 (1982) 17. Pon et al., Biotechniques 6, 768-775 (1988) 18. Métodos en Biología Molecular vol. 26, hoofdstuk 9 "Análisis y Purificación de oligonucleótidos sintéticos por CLAP"; S. Agrawel ed., Humana Press, Totowa, New Jersey, USA Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de La presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Los oligómeros, caracterizados porque comprenden completa o parcialmente de análogos nucleosídicos 1, 5-anhidrohexitol representados por la fórmula general I en la cual B es un anillo heterocíclico, el cual se derivó de una base pirimídica o púrica.

2. Los oligómeros de conformidad con la reivindicación 1, caracterizados por la fórmula general II - .. en la cual B es un anillo heterocíclico, el cual se derivó de una base pirimídica o púrica, y en la cual k, 1, y m son cada una números enteros de 0 a 15, con la condición de que k y m son al menos uno; pero si k > 5 1, entonces m puede ser 0; y si m > 1, k puede ser 0; y, en la cual X representa oxígeno o azufre, y las sales de los mismos.

3. Los oligómeros de conformidad con la 0 reivindicación 1 ó 2, caracterizados porque el anillo heterocíclico se selecciona del grupo que consiste de citosina, 5-metilcitosina, uracilo y timina, o derivados desaza de los mismos. 5 4.

Los oligómeros de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizados porque el anillo heterocíclico se selecciona del grupo que consiste de adenina, guanina, 2, 6-diaminopurina, hipoxantina y xantina, o derivados desaza de los mismos. 0 5.

Los oligómeros de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizados porque el compuesto de fórmula I tiene la configuración (D) y los sustituyentes se localizan en la configuración arabino. 5 ß.

Los oligómeros de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizados porque se usan en técnicas antisentido.

7. Los oligómeros para usarse de conformidad con la reivindicación 6, caracterizados porque las técnicas antisentido comprenden el diagnóstico, hibridación, aislamiento de ácidos nucleicos, modificación de ADN dirigida a un sitio y terapia.

8. Un método para preparar los oligómeros de fórmula II, caracterizado porque comprende acoplar una cantidad adecuada de monómeros de fórmula I .

9. Las fosforamiditas de la fórmula general VIII caracterizadas porque B* es una base protegida, para usarse en la preparación de los oligómeros de la reivindicación 1.