MXPA96001655A - Proteinas (ob) obesas recombinantes - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas que modulan el peso corporal de animales y humanos para el tratamiento, prevención y control de obesidad y enfermedades o condiciones asociadas, y la expresión recombinante de estas proteínas biológicamente activas en formas purificada y homogénea.

Description

PROTEÍNAS (ob) OBESAS RECOMBINADAS DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La obesidad se considera, en las sociedades occidentales, como el trastorno nutricional mas común [Zhang, Y. et al., Nature 372, 425-432 (1994%]. Mas de tres de 10 adultos americanos pesan por lo menos 20% en exceso de su peso ideal [Zhang, Y. et al., supra]. El peso coporal aumentado es un problema de salud pública debido a que está asociado con importantes morbideces medicas tal como la diabetes mellitus tipo II (o sea diabetes mellitus no dependiente de insulina), hipertensión e hiperlipidemia [Grundy, S.M. and Barnett, Disease-a-Mouth 36, 645-696 (1990)]. Existe evidencia de que el peso corporal se regula fisiológicamente y la obesidad (y sus condiciones o enfermedades relacionadas) se deben en parte a desarreglos de esta regulación [Zhang, Y. et al., supra]. En los roedores se describen siete mutaciones genéticas simples que resultan en un fenotipo obeso; cinco de las cuales están presentes en los ratones. De estos siete modelos de roedores, uno de los estudiados mas intensivamente es la mutación genética obesa (ob) en ratones, identificado en 1950 [Ingalls, A.M. et al., J. Hered. 41, 317-318 (1950)]. Ratones homozigóticos para esta mutación de gen ob son profundamente obesos, desarrollan diabetes mellitus tipo II, y son hiperfágicos e hipometabólicos, como parte de un sindrome que se asemaja a la obesidad mórbida en el hombre [Friedman J.M. et al., Genomics 11, 1054-1062 (1991)]. Este gen ob se mapea en el cromosoma 6 próximo de ratón y codifica una proteina (o sea, proteina ob) expresado en tejido adiposo [Zhang, Y. et al., supra] . Ratones homozigóticos para la mutación genética ob tienen de poca a ninguna producción de esta proteina ob, y por consiguiente tienen regulación defectuosa del peso corporal conduciendo a la obesidad. Las proteinas ob murinas o humanas pueden administrarse a pacientes que sufran de defectos o mutaciones en su gen ojeso (ob) correspondiente, cuyos defectos o mutaciones previenen o interfieren con la producción y/o función de las proteinas ob en modular el peso corporal. Estas proteinas pueden utilizarse, por consiguiente, como una sustancia hormonal para controlar, prevenir o tratar la obesidad y sus enfermedades y condiciones relacionadas en el hombre y animales. Para utilizar de este modo las proteinas ob murinas o humanas estas proteinas pueden administrarse a través de inyección mediante una variedad de vias, tal como intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o subcutánea, en dosis frecuentes. Debido a que se administra frecuentemente mediante inyección es importante que las proteinas murinas o humanas sean purificadas, de preferencia hasta homogeneidad, estén libres de materiales proteinicos contaminantes, y que se expresen de modo recombinante en una forma soluble y biológicamente activa. Se conoce generalmente por los expertos en el campo que los contaminantes presentes en la medicación inyectable puede conducir con frecuencia a efectos secundarios tóxicos o respuestas inmunológicas adversas. Si bien la secuencia genética ob murina se describe en Zhang, Y. et al, supra, no se han expuesto métodos de expresar la proteina ob murina o su contraparte humana, mucho menos producir estas proteinas en un estado biológicamente activo y soluble del que las proteinas puedan purificarse hasta homogeneidad. Por consiguiente es importante, y constituye un objeto de este invento, expresar y producir las proteinas ob murinas o humanas en un estado homogéneo, soluble y biológicamente activo. Se ha descubierto que las proteinas humana y murina recombinantes pueden expresarse en un estado biológicamente activo y soluble, y por consiguiente purificarse hasta homogeneidad apropiada para inyección a pacientes para tratar, prevenir o controlar la obesidad y sus condiciones y enfermedades relacionadas, tal como diabetes mellitus tipo II, hipertensión, hiperlipidemia y similares. De conformidad con este invento las proteinas ob humana y murina pueden producirse de modo recombinánte en una forma biológicamente activa y purificarse hasta homogeneidad construyendo primero nuevos vectores de expresión para Escherichia coli (E. coli) . Estos vectores de expresión contienen un promotor y una secuencia de ADN, cuya secuencia de ADN codifica una proteina de fusión que comprende dos partes: el péptido de señal de la proteina de membrana externa A de E. coli (o sea., sOpA) y la proteina ob humana o murina. De conformidad con este invento la etapa siguiente para producir la forma recombinane biológicamente activa de las proteinas ob murina y humana es insertar este vector de expresión en un huésped E. coli con lo que se obtiene expresión y translocación eficiente de la proteina de fusión en el espacio periplásmico (o sea, entre las membranas de célula interna y externa del microorganismo E. coli), en cuyo punto se escinde el péptido de señal de la proteina ob que abandona la proteina ob en una forma soluble y biológicamente activa. A continuación las proteinas ob se secretan de modo eficiente en forma soluble y biológicamente activa en medio libre de células siguiente al tratamiento de las células E. coli huespedes para enfriar el shock osmótico, en cuyo punto las proteinas ob se purifican hasta homogenedidad mediante el uso secuencial de la cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de columna de interacción hidrofóbica y filtración de gel, llevado a cabo en este orden. El presente invento se dirige también a 1) un vector de expresión que contiene el ADN que codifica una proteina de fusión que comprende un péptido de señal sOmpA y una proteina ob humana o murina; 2) un organismo huésped transfectado o transformado por este vector de expresión; 3) la secuencia de ADN que codifica la proteina ob humana; y 4) polietilen o polipropilen glicol que conjuga la proteina ob. El presente invento se dirige también a métodos para expresar proteinas ob humana y murina recombiantes en un estado biológicamente activo y soluble, y para producir estas proteinas en una forma homogénea purificada apropiada para administración a animales y humanos. El método para expresar y producir la proteina ob murina de conformidad con este invento se obtiene utilizando el gen ob murino como expone Zhang, Y. et al., supra, la secuencia por la que el gen es una secuencia nucleótida de 702 pares de bases (bp) aqui identificada como SEQ ID NO. 1. Esta secuencia genética ob murina comprende una secuencia que codifica 501 bp o marco de lectura abierto (ORF) a partir de un codón de iniciación en el nucleótido 36 y que termina con un codón de finalización en el nucleótido 537, y teniendo secuencias no traducidas en ambos extremos 3' y 5'. El ORF contiene una secuencia de señal de 63 bp a partir del núcleotido 36 a 98. Esta secuencia genética ob murina (SEQ ID NO: 1) codifica la proteina ob murina (mas su secuencia de señal) cuya secuencia de amino ácido es de 167 aminoácidos de longitud y se identifica como SEQ ID NO: 2. En esta proteina de SEQ ID NO: 2, los primeros 21 aminoácidos representan la secuencia de señal de la proteina ob murina. La proteina ob murina madura (sin su secuencia de señales) se extiende desde el aminoácido 22 (Val) al aminoácido 167 (Cys) y se representa mediante SEQ ID NO: 3. El método para expresar y producir la proteina ob humana de conformidad con este invento se obtiene utilizando el gen ob humano, la secuencia por la que el gen es una secuencia nucleótida de 690 bp identificada aqui como SEQ ID NO: 4. Zhang Y. et al., supra, revela el gen ob humano como altamente homólogo al gen ob murino, y describe un método convencional que utiliza sondas oligonucleótidas dirigidas al gen ob murino que puede utilizarse para 1) tamizar una genoteca de ADNc de clones derivada de tejido adiposo humano, 2) identificar aquellos clones que tienen el gen ob humano, y 3) aislar y secuenciar la secuencia de gen ob humano. Esta secuencia de gen ob humano cuando se secuencia con medios convencionales se determina que tiene la secuencia 'nucleótida SEQ ID NO: 4. Como con el gen ob murino, el gen ob humano comprende una secuencia que codifica 501 bp o marco de lectura abierto (ORF) a partir de un codon de inicio en el nucleótido 37 y que termina con un codon de finalización en el nucleótido 538, y que tiene una secuencia sin traducir en ambos extremos 3' y 5'. El ORF contiene una secuencia de señal de 63 bp del nucleótido 37 a 99. Esta secuencia de gen ob humano (SEQ ID NO: 4) codifica una proteina ob humana mas su secuencia de señal cuya secuencia de aminoácidos de 167 aminoácidos de longitud se identifica como SEQ ID NO: 5. Los primeros 21 aminoácidos de esta proteina de 167 aminoácidos de longitud representan la secuencia de señal. La proteina ob humana madura (sin su secuencia de señal) se extiende desde el aminoácido 22 (Val) al aminoácido 167 (Cys) y se representa mediante SEQ ID NO: 6. Zhang, Y. et al., supra, expone el 84% de identidad entre las proteinas ob murina y humana. Zhang Y. et al., supra, también expone que existen variantes de las proteinas murina y humana, caracterizándose una de estas variantes en ambas especies por una supresión de glutamina 49. Aproximadamente al 30% de clones de ADNc en las bibliotecas derivadas de tejido adiposo de ratón y tejido adiposo humano les falta el codon 49 [Zhang, Y. et al., supra]. Los términos que siguen tienen las definiciones expuestas a continuación: Proteina ob murina (mob) se reifere a la proteina de SEQ ID NO: 3 cuyas propiedades biológicas se refieren al tratamiento, control o prevención de obesidad o sus condiciones y enfermedades asociadas. Específicamente una proteina ob murina se define de modo que incluye cualquier proteina o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homóloga a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, y que tiene adicionalmente las actividades biológicas siguientes: 1) Cuando la proteina o polipéptido se administra mediante inyección intracerebroventricular (ICV) a ratones ob/ob obesos y maduros con ayuno de 16-18 horas que tienen un peso corporal de por lo menos 30 gramos a una dosis de 20 µg o menos utilizando los métodos de Haley and McCormick, Brit. J. Pharmacol. 12, 12-15 (1957), la proteina o polipéptido: (a) reduce la ingesta de alimentos durante una prueba de alimentación de 5 horas en el 50% en comparación a ratones de control inyectados con vehículo (DE50 para reducir la ingesta de alimentos) ; y (b) reduce la ganancia de peso corporal durante las 24 horas después de la inyección de ICV en por lo menos el 50% comparado con los ratones de control con inyección de vehículo (DE50 para reducir la ganancia de peso corporal) ; 2) Cuando la proteina o polipéptido se administra intraperitoneal (IP) a ratones ob/ob maduros sin ayuno con un peso corporal de por lo menos 30 gramos dos veces al dia al inicio de la luz del dia y de nuevo en el punto de las 3 horas de la fase oscura, durante una semana, en una dosis diaria total de 20 µg o menos, la proteina o polipéptido: (a) reduce la ingesta de alimento en 5 y 24 horas en por lo menos el 20% comparado con ratones de control inyectados con vehículo (DE20 para reducir la ingesta de alimentos) ; y (b) reduce la ganancia de peso corporal durante las 24 horas siguientes a la primera inyección IP en por lo menos el 20% comparado con los ratones de control inyectados con vehículo (DE20 para reducir la ganancia de peso corporal) . Como aqui se utiliza el termino proteina ob murina incluye tales proteinas deliberadamente modificadas, como por ejemplo, mediante mutagenesis dirigida al sitio o accidentalmente a través de mutaciones. Proteina ob humana (hob) se refiere a la proteina de SEQ ID NO: 6 cuyas propiedades biológicas se refieren al tratamiento, control o prevención de la obesidad o de sus condiciones y enfermedades asociadas. Específicamente una proteina ob humana se define de modo que incluya cualquier proteina o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente homologa a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6, y que tiene además las actividades biológicas siguientes: 1) Cuando la proteina o polipéptido se administra ICV a ratones ob/ob obesos maduros, con ayuno de 16-18 horas, que tienen un peso corporal de por lo menos 30 gramos a una dosis de 20 µg o menos utilizando los métodos de Haley and McCormick, supra, la proteina o polipéptido: (a) reduce la ingesta de alimentos durante una prueba de alimentación de 5 horas en el 50% comparado a ratones de control inyectados con vehículo (DE50 para reducir la ingesta de alimentos) ; y (b) reduce la ganancia de peso corporal durante las 24 horas después de inyección de ICV en por lo menos el 50% comparado con ratones de control inyectados con vehículo (DE50 para reducir la ganancia de peso corporal) ; o 2) Cuando la proteina o polipéptido se administra IP a rato- nes ob/ob maduros sin ayunar que tienen un peso corporal de por lo menos 30 gramos dos veces al dia al inicio de la luz del dia y de nuevo en el punto de 3 horas de la fase oscura, durante una semana, en una dosis diaria total de 20 µg o menos, la proteina o polipéptido: (a) reduce la ingesta de alimentos en 5 y 24 horas en por lo menos el 20% comparado con ratones de control inyectados con vehículo (DE20 para reducir la ingesta de alimentos) ; y (b) reduce la ganancia de peso corporal durante las 24 horas después de la primera inyección IP en por lo menos el 20% comparado con ratones de control inyectados con vehículo (DE20 para reducir la ganancia de peso corporal) . Como aqui se utiliza el término proteina ob humana incluye estas proteinas deliberadamente modificadas, como por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio o accidentamente a través de mutaciones. Sustancialmente homólogo que puede referirse tanto a secuencias de ácido nucleico como de aminoácido, significa que una secuencia objeto particular, por ejemplo, una secuencia mutante, varia de una secuencia de referencia en una o mas sustituciones, supresiones, o adiciones, cuyo efecto neto no resulta en una disimilaridad funcional adversa entre las secuencia de referencia y objeto. Para los fines del presente invento secuencias que tienen mas del 95 porciento de homología, propiedades biológicas equivalentes, y características de expresión equivalentes se consideran sustancialmente homologas. Para los fines de determinar homología debe descartarse el truncado de la secuencia madura. Las secuencias que tienen grados menores de homología, comparable bioactividad, y características de expresión equivalentes, se consideran equivalentes sustanciales. En general secuencidas de ADN homologas pueden identificarse mediante hibridización cruzada bajo condiciones de hibridización corrientes de estringencia moderada. Fragmento de la proteina ob murina o humana significa cualquier proteina o polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de una porción o fragmento de una proteina ob murina o humana, y que tiene la actividad biológica de la proteina ob murina o humana, respectivamente. Los fragmentos incluyen proteinas o polipéptidos producidos mediante degradación roteolitica de las proteinas ob murina o humana o producidas mediante sintesis química con métodos rutinarios en el arte. Una proteina ob o fragmento respectivo es biológicamente activo cuando la administración de la proteina o fragmento a un mamífero, incluyendo el hombre, reduce la ingesta de alimentos y reduce la proporción de ganancia de peso en el mamífero. La determinación de esta actividad biológica de la proteina ob humana o murina puede llevarse a cabo con pruebas convencionales bien conocidas, utilizadas para estos fines sobre una o mas especies de mamíferos, particularmente el ratón ob/ob obeso. Aqui se describen varias de estas pruebas que pueden utilizarse para demostrar esta actividad biológica. En la determinación de actividad biológica de conformidad con la prueba ICV en ratones ob/ob como aqui se describe, la proteina ob humana o murina tiene, de preferencia, una DE50 para reducir la ingesta de alimentos de 20 µg o menos y una DE50 para reducir la ganancia de peso corporal de 20 µg o menos. Alter-nativamente, en la determinación de actividad biológica de la proteina humana o murina de conformidad con la prueba IP en ratones ob/ob como aqui se describe, la proteina ob humana o murina tiene de preferencia una DE20 para reducir la ingesta de alimento de 20 µ g o menos y una DE20 para redacir la ganancia de peso corporal de 20 µg o menos. En gen ral se prefieren fragmentos que exhiben la actividad biológica antes citada, Replicón es cualquier elemento genético (por ejemplo, plásmido, cromosoma, virus) que funció:la como una unidad autónoma de réplica de ADN in vivo, o seaj capaz de réplica bajo su propio control . Vector de expresión es un repllicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ADN de modo que proporcione la réplica del segáento unido. Comprende una unidad transcripcional que comprende un conjunto de (1) un elemento o elementos genético (s) que tiene (n) una regla reguladora en expresión genética, por ejemplo, promotores o mejoradores, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en mRNA y traduce en proteina, y (3) secuencias apropiadas de iniciación y terminación de transcripción. Clon es un grupo de moléculas de ADN derivadas de una longitud original de secuencias de ADN y producido por una bacteria o virus que utiliza técnicas de ingeniería genética, implicando con frecuencia plásmidos. Secuencia de señal es la secuencia de ácido nucleico situada al inicio (extremo 5') de la secuencia codificadora de una proteina que ha de expresarse. Esta secuencia de señal codifica un péptido de señal, N-terminal a la proteina nuevamente sintetizada, que dirige la célula huésped para translocar la proteina hacia o a través de la membrana de célula huésped, y cuyo péptido de señal se escinde usualmente durante esta translocación. Codón de inicio es un codón usualmente situado en ATG en la secuencia codificadora de una proteina, y usualmente en el extremo 5', y señala el primer aminoácido en una secuencia proteinica. Codón de finalización es un codon sin sentido situado en una secuencia codificadora de una proteina y usualmente en el extremo 3', y señala el extremo de una cadena polipeptidica en crecimiento. Marco de lectura abierta (ORF) es una disposición lineal de tripletes de codon en DNA doble filamentado que codifica una secuencia de aminoácidos en una célula in vitro o in vivo cuando se dispone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los limites del ORF se determinan mediante un codón de inicio en el termino 5' y un codon de finalización en el termino 3'. Puede denominarse también como una "secuencia codificadora". Secuencia promotora es una región reguladora de ADN capaz de ligar una polimerasa de RNA en una célula e iniciar la transcripción de un marco de lectura abierto corriente abajo (dirección 3') de uno o mas genes estructurales. La secuencia promotora se sitúa usualmente en el extremo 5' de la secuencia de señal o marco de lectura abierto y se extiende corriente arriba en la dirección 5' para incluir el número minimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción del polipéptido a un nivel detectable sobre la base. Una secuencia codificadora de ORF está bajo el control de una secuencia promotora cuando la polimerasa de RNA transcribe la secuencia codificadora en mRNA. Una composición que comprende A (en donde A es un polipéptido simple) es homogénea para A cuando no existe cantidad detectable de proteinas contaminantes u otros materiales endógenos, como se detecta con medios convencionales, por ejemplo, manchado de geles de poliacrilamida. Para los fines de este invento el término homogéneo debe referirse a una composición que comprende una proteina o polipéptido simple cuando por lo menos el 95% en peso de la composición es dicha proteina o polipéptido simple. Las etapas que siguen exponen los métodos para expresión recombinante de proteinas ob humanas y murinas en un estado libre de células biológicamente activo y soluble, exento de otras proteinas de mamífero, de las que pueden purificarse las proteinas ob hasta homogeneidad. Estas etapas se ejemplifican con detalle en los ejemplos. 1) Obtención de los genes ob de ratón y_ humanos . El ADNc (SEG ID NO 1) que codifica la proteina ob murina mas su secuencia de señal natural se publica en Zhang, Y. et al., supra. Este ADNc murino se ha aislado y amplificado mediante técnica PCR -Inutilizando cebadores de ADN oligodeoxinucleótidos con técnicas conven-cionales. Estos cebadores de DNA y los métodos para su obtención se describen en Zhang, Y. et al., supra. El ADNc (SEQ ID NO. 4) que codifica la proteina ob humana mas su secuencia de señal natural se obtiene utilizando los mismos cebadores de DNA oligodeoxinucleótidos que se utilizan en Zhang, Y. et al., supra para obtener el gen ob murino. Con el empleo de la técnica convencional este ADNc humano se ha aislado de una biblioteca de ADNc lambda fago obtenido de RNA derivado de tejido adipocito humano. El ADNc ob humano o de ratón puede obtenerse no solo a partir de bibliotecas de ADNc, sino con otros medios convencionales, por ejemplo, mediante sintesis química, o clonando ADN genómico, o sus fragmentos, purificado a partir de la célula deseada. Estos procedimientos se describen por Sambrook et al., en "DNA Cloning: A Practical Approach", Vol. I y II, D.N. Glover, ed., 1985, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K.; Benton and Davis, Science 196, 180-182 (1977) ; y Grunstein and Hogness, Proc. Nat. Acad. Sci. 72, 3961-3965 (1975). Para obtener el ADNc ob de humano o ratón a partir de bibliotecas de ADNc, se tamizan las bibliotecas con técnicas de hibridización de ADN convencionales con los métodos de Benton and Davis, supra, o Grunstein and Hogness, supra, utilizando cebadores preparados mediante trans-cripción inversa de RNA poliadenilado aislado a partir de céulas adiposas murinas conteniendo el gen ob murino. Clones que hibridizan a los cebadores se analizan mediante disociación de endonucleasa de restricción, electroforesis de gel de agarosa, y experimentos de hibridización adicionales ( "Southern blots") implicando los cebadores electroforizados. Después de aislar diversos ciónos que hibridizan a las sondas de ADNc murinas, se subclona el segmento de hibridización de un clon y secuencia con técnicas convencionales. Los ciónos derivados de ADN genómico pueden contener regiones de ADN reguladoras e intrón en adición a regiones codificadoras: los clones derivados de ADNc no contendrán secuencias intrón. En el clonado molecular del gen, a partir de ADN genómico se generan fragmentos de ADN, algunos de los cuales codificarán el gen deseado. El ADN puede disociarse en sitios específicos utilizando diversas enzimas de restricción. Alternativamente, puede utilizarse DNAse en presencia de manganeso para fragmentar el ADN, o el ADN puede dividirse físicamente, como por ejemplo, mediante sonicación. Los fragmentos de ADN lineal pueden separarse luego según tamaño mediante técnicas corrientes, incluyendo, pero sin limitación, electroforesis de agarosa y poliacrilamida y cromatografía de columna. Cualquiera que sea la fuente el gen ob humano o murino puede ser clonado molecularmente en un vector apropiado para propagación del gen con métodos conocidos en el arte. Puede utilizarse cualquier vector que se encuentre en el comercio. Por ejemplo el ADNc de ratón puede isnertarse en un vector pCDNa3 y el ADNc humano puede insertarse en un vector pBluescriptSK- . Vectores apropiados para uso con huespedes de bacterias se describen por Pouwels et al., en "Cloning Vectors: A Laboratory Manual", 1985, Elsevier, N.Y. Como ejemplo representativo, pero no limitativo, vectores de clonación útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador selecciona-ble y origen bacteriano de réplica derivado de plásmidos que se encuentran en el comercio que se derivan a su vez del vector de clonación pBR322 (ATCC 37017) bien conocido. Estos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wisc, USA) . Las secuencias nucleótidas del gen ob humano o murino insertado en estos vectores que se encuentran en el comercio pueden verificarse con métodos conocidos en el arte mediante técnicas de secuenciación de nuclótidos corrientes. Aqui pueden utilizarse otros ácidos nucleicos que codifican proteinas ob de especies diferentes de humano o murinas. Asi pues, si bien el ADN específico se ha clonado y secuenciado en relación con el gen ob humano y de ratón, puede utilizarse potencialmente cualquier adipocito animal como la fuente de ácido nucleico de la proteina ob. 2) Construcción de un vector de expresión para la proteina ob humana y murina. El gen ob humano o murino clonado de conformidad con los métodos antes descritos se utilizan para construir los vectores de expresión para las proteínas ob humanas y murinas, respectivamente. Para la expresión de la proteina ob humana y murina biológicamente activa mediante una célula de huésped E. coli transfectada o transformada y para secreción de la proteina ob en el periplasma puede utilizarse un nuevo vector de expresión. Este vector de expresión incluye un promotor y una secuencia de DNA que codifica una proteina de fusión. La proteina de fusión está constituida por dos partes: siendo la primera parte un péptido de señal para la proteina de membrana externa A de E. coli (sOmpA) y siendo la segunda parte de la proteina de fusión la proteina ob humana o murina (menos sus propias secuencias de señal naturales) . La secuencia de ADN que codifica esta proteina de fusión está constituida también por dos parte: una primera parte que codifica el péptido sOmpA y una segunda parte que codifica la proteina ob murina o humana (menos sus secuencias de señal naturales) . La primera parte de la secuencia de ADN que codifica el péptido sOmpA es la secuencia de señal descrita por De Sutter, K. et al., Gene 141, 163-170 (1994) y tiene la secuencia nucleótida de SEQ ID NO: 7. La segunda parte de la secuencia de ADN de dos partes codifica las proteinas ob murinas o humanas y tiene la secuencia nucleótida de SEQ ID NO: l o SEQ ID NO: 4, respectivamente menos la porción de la secuencia nucleótida que codifica las secuencias de señal naturales respectivas. El péptido de señal codificado por la secuencia de señal sOmpA de SEQ ID NO: tiene la secuencia de aminoácido SEQ ID NO: 8 como expone De Sutter, K. et al., supra. El nuevo vector de expresión de este invento se obtiene insertando el promotor y secuencia de ADN que codifica la proteina de fusión en un vector de expresión convencional apropiado para la expresión de proteinas recombinantes en células huésped de E. coli. En la construcción de ese nuevo vector de expresión de conformidad con este invento puede utilizarse cualquier promotor tan largo como sea capaz de controlar la transcripción de la proteina de fusión que comprende el péptido sOmpA y la proteina ob en la célula huésped de E. coli. Cuando se utiliza el sOmpA como el péptido de señal es preferible utilizar tanto el lac-operador promotor (POjac) como el promotor de lipoproteina (Pjpp) F Otros promotores útiles para esta expresión en E. coli incluyen e? promotor de polimerasa de RNA T7 descrito por Studier et al., J. Mol. Biol. 189, 113-130 (1986), el promotor lacz descrito por Lauer, J. Mol. Appl. Genet. 1, 139-147 (1981) y disponible a partir de la American Type Culture Collection (ATCC) como ATCC 37121, el promotor tac descrito por Maniatis, en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor 1982, y disponible como ATCC 37138, el promotor de fosfatasa alcalina (phaA) , y el promotor trp descrito por Goeddel et al., Nucleic Acids Research 8, 4057-4075 (1980) . Otros promotores se han descrito y utilizado en E. coli y se han publicado (Sienbenlist et al< Cell 20, 269-281 (1980) detalles relativos a sus secuencias nucleótidas, que facilitan al experto en el arte ligarlos funcionalmente dentro del vector de expresión de este invento. Específicamente un vector de expresión comprende: a) una secuencia promotora, y b) una secuencia de ADN que codifica una proteina de fusión, cuya proteina de fusión comprende la proteina ob murina de SEQ ID NO: 3 o la proteina ob humana de SEQ ID NO: 6, y el péptido de señal para la proteina de membrana externa A de E. coli. A continuación se describe el método para construir este nuevo vector de expresión. Este método se detalla adicionalmente en los ejemplos y se ilustra en las figuras 2 y 3'. En primer lugar se incorpora la secuencia codificadora del gen ob humano o de ratón (menos su secuencia de señal natural) en un plásmido que contiene la secuencia de señal sOmpA, tal como el plásmido pTlOsOmpArPDI. Este plásmido pTlOsOmpArPDI y su construcción y preparación se describe por De Sutter, K. et al., supra. Una vez incorporado en este plásmido el gen ob humano o de ratón se funde a este gen sOmpA para crear una "secuencia de gen híbrida" en este plásmido. El gen sOmpA debe estar corriente arriba de la región 5' de la secuencia que codifica el gen ob. Luego promotores como se han enumerado antes, y de preferencia el promotor de lipoproteina (P]_pp) y el promotor-operador lac (PO?ac) , se incorporan en este plásmido conteniendo la secuencia genética híbrida para crear los vectores de expresión de este invento. Dos modalidades de estos vectores de expresión se identifican como pLPPsOmpA mob y pLPPsOmpA hobl y se represetan en las figuras 2 y 3, respectivamente. Puede utilizarse cualquier método o procedimiento conocido en el arte para construir un plásmido de esta índole. Además, no es crítico el orden con el que se funden las secuencias genéticas sQmpaA y ob, incorporan las secuencias genéticas en un plásmido apropiado, e incorpora el promotor para llegar al vector de expresión de este invento. Por ejemplo, la secuencia genética sOmpA puede fusionarse inicialmente a la secuencia de gen ob murino o humano directamente para crear una secuencia de gen híbrida, y luego esta secuencia híbrida insertase en un plásmido que tiene ya incorporado los promotores apropiados. Sin embargo, es necesario que la secuencia genética sOmpA esté corriente arriba en el extremo 5' de la secuencia de gen ob murino o humano. Se ha descubierto que con el empleo de este nuevo vector de expresión, y en particular, utilizando la secunda de señal que codifica el sOmpA, las proteinas ob murinas o humanas pueden translocarse al espacio periplásmico, en donde el péptido de señal se disocia apropiadamente dejando intactas las proteínas ob humanas o murinas en una forma soluble y biológicamente activa. Una vez en este espacio periplásmico, las proteinas ob se secretan eficientemente al ambiente exento de células libre de otras proteinas de mamífero después de someter las células huésped a shock osmótico frió, en cuyo momento las proteinas ob puede purificarse hasta homogeneidad en una forma biológicamente activa. 3_^ Expresión de las proteinas ob humanas o murinas en células E. coli transformadas . A continuación los vectores de expresión construidos de conformidad con los procedimientos antes descritos se insertan en una célula de E. coli huésped para transformar la célula E. coli. Puede utilizarse cualquier cepa de E. coli, tal como cepa E. coli K-12 294 como se describe en la Publicación de patente británica n° 2055382 A (ATCC N° 31446) . Otras cepas útiles de conformidad con este invento incluyen E. coli MC1061 [Casadaban and Cohén, J. Mol. Biol. 138, 179-207 (1980)], E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC N° 31537), y E. coli W 3110 (ATCC N° 27325) u otras cepas muchas de las cuales se han depositado y se encuentran disponibles a partir de instuticiones depositarlas de microorganismos reconocidas.

Las células de E. coli transformadas se desarrollan hasta una densidad de célula apropiada y se cultivan con métodos corrientes. Procediendo asi al crecimiento y cultivo de los huéspedes de E. coli transformados los vectores de expresión de este invento permiten de modo eficiente y efectivo la expresión de las proteínas ob murinas o humanas y la translocación de estas mismas proteinas en el periplasma de las células de E. coli huéspedes en una forma soluble y biológicamente activa. El péptido de señal sOmpA (o sea, la parte 1 de la proteina de fusión) se disocia durante la translocación de la proteina de fusión en el periplasma dando la proteina ob biológicamente activa libre de otras proteinas de mamífero o polipeptidos. Específicamente, el método de producir la proteina obesa humana o murina recombinante y biológicamente activa libre de otras proteinas de mamífero comprende las etapas de: a) construir un vector de expresión que tiene una secuencia promotora, y una secuencia de ADN que codifica una proteina de fusión, cuya proteina de fusión comprende SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO 6, y el péptido de señal para la proteina de membrana externa A de E. coli; b) insertar el vector de expresión en una célula huésped de E. coli para transformar la célula huésped de E. coli; c) expresar la proteina de fusión en la célula huésped de E. coli; y d) tratar la célula huésped de E. coli con tampón de shock osmótico frió para liberar la proteina ob murina o humana de otras proteínas de mamífero y exenta del péptido de señal.

Las proteinas ob humanas o murinas producidas de modo recombinante en un estado soluble y biológicamente activo en el periplasma de células E. coli transformadas se purifican luego hasta homogeneidad. Las proteinas ob humanas y murinas recombinantes translocadas al periplasma de célula de conformidad con los procedimientos aquí descritos pueden secretarse de modo efectivo fuera de la célula sometiendo las células huésped a shock osmótico frió con métodos conocidos en el arte y descritos por Koshland, D. and Botstein, D., Cell 20, 749-760 (1980). El empleo de shock osmótico frió libera de la E. coli las proteinas ob en su estado biológicamente activo libres de proteinas o polipéptidos de mamífero. Las proteinas ob humanas o murinas situadas en el fluido osmótico después de shock osmótico frió de células de E. coli transformadas, de conformidad con el procedimiento antes descrito, son biológicamente activas y pueden purificarse hasta homogeneidad utilizando una combinación de cromatografía de columna de intercambio de aniones, cromatografía de columna de interacción hidrofóbica y filtración de gel. La cromatografía de intercambio de aniones e interacción hidrofóbica puede llevarse a cabo en cualquier orden, sin embargo, el empleo de uno u otro debe estar precedido de filtración de gel. La etapa de intercambio de aniones puede llevarse a cabo con medios convencionales. La columna preferida para cromatografía de intercambio de aniones es una columna Q Sepharose Fast Flow. Los medios de cromatografía de intercambio de aniones apropiados incluyen diversas matrices insolubles que comprenden grupos dietilaminoetilo (DEAE) o dietil- (2-hidroxipropil) -aminoetilo (QAE) . Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comunmente utilizados en la purificación de proteinas. Un material particularmente útil para cromatografía de intercambio de aniones es DEAE-Sephacel (Pharmacia, Uppsala, Suecia) . Cuando se utilizan medios conteniendo grupos DEAE se aplican extractos conteniendo proteinas ob murinas o humanas a un pH débilmente básico, por ejemplo, pH 8,1. Las proteinas ob murinas o humanas vinculadas pueden eluirse en forma mas altamente purificada mediante aplicación de un gradiente de sal en un tampón apropiado tal como Tris-HCl. En general las características del gradiente pueden determinarse mediante experimentos de elución preliminar que implican una pequeña cantidad de proteina recombinante. El material que contiene la proteina ob humana o murina obtenido con el empleo de cromatografía de intercambio de aniones, cuando se utiliza la cromatografía de intercambio de aniones como la primera etapa de purificación, se somete a continuación a cromatografía de interacción hidrofóbica. La cromatografía de interacción hidrofóbica es una técnica de separación en donde las sustancias se separan sobre la base de diferentes potencias de interacción hidrofóbica con un material de lecho sin carga conteniendo grupos hidrofóbicos. Típicamente la columna de interacción hidrofóbica se equilibra primero bajo condiciones favorables a ligazón hidrofóbica, por ejemplo alta potencia iónica. Puede utilizarse un gradiente de sal descendente para eluir la muestra.

Puede utilizarse cualquier columna de interacción hidrofóbica. La columna hidrofóbica preferida es fenil Sepharose, sin embargo, puede utilizarse también butil Sepharose. De conformidad con el invento el material que con-tiene la proteina ob murina o humana recombinante que se ha eluido a partir de la columna aniónica se carga sobre una columna conteniendo un gel hidrofóbico relativamente fuerte tal como fenil sepharose. Para promover la interacción hidrofóbica con el gel hidrofóbico se utiliza un disolvente que contiene, por ejemplo, mas de, o igual a, 0,4 M de sulfato amónico, prefiriéndose 0,4 M. Asi pues la columna y la muestra se ajustan a 0,4 M de sulfato amónico en 50 mM de tampón Tris y la muestra se aplica a la columna . Se lava la columna con 0,4 M de tampón de sulfato amónico. La proteina ob se eluye luego con disolventes que atenúan las interacciones hidrofóbicas tal como, por ejemplo, disminuyendo los gradientes de sal, etilen o propilen glicol, o urea. Una modalidad preferida implica lavar la columna secuencialmente con el tampón Tris y el tampón Tris conteniendo 20% de etilenglicol. La proteina ob se eluye subsi-guientemente de la columna con un gradiente de concentración de sulfato amónico decreciente y concentración en aumento de etilenglicol en el tampón Tris. El empleo colectivo y secuencial de la cromatografía de intercambio de aniones y cromatografía de columna de interacción hidrofóbica, en cualquier orden, proporciona proteina ob humana o murina de modo rutinario con una pureza estimada del 90%. La etapa de cromatografía de filtración de gel sigue a la cromatografía de intercambio de aniones y etapas de cromatografía de columna de interacción hidrofóbica antes expuestas, y puede llevarse a cabo con cualquier procedimiento de filtración de gel convencional. La proteina ob eluida de la columna de interacción hidrofóbica, o la columna de intercambio de aniones, cualquiera que sea la columna utilizada finalmente, puede concentrarse y dializarse hasta un pequeño volumen utilizando una membrana con un corte de peso molecular de 10.000 (membrana AMICON-YM10) . El material concentrado puede cargarse luego sobre una columna conteniendo medio de filtración de gel tal como GlOO-Sephadex (Pharmacia, Uppsala, Suecia) . La proteina ob puede separarse luego de otros contaminantes sobre la base de su peso molecular mediante técnicas corrientes utilizando SDS-PAGE. El empleo colectivo y secuencial de cromatografía de intercambio de aniones, cromatografía de columna de interacción hidrofóbica y filtración de gel proporciona de modo rutinario proteina ob humana o murina con pureza del 95% . La secuenciación de aminoácido N-terminal de la proteina ob murina o humana purificada puede llevarse a cabo con métodos conocidos en el arte, por ejemplo, mediante electrotransferencia de conformidad con los métodos de Laemli, U.K., Nature 227, 680- 685 (1970) o con los procedimientos descritos por Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262, 10035-10038 (1987). La secuenciación interna puede llevarse a cabo también con métodos conocidos en el arte. Por ejemplo pueden generarse fragmentos de péptidos mediante digestión de la banda M (sobre nitrocelulosa) con Lisina C de endoproteinasa y luego separarse mediante un sistema de HPLC.

La actividad biológica de las proteinas ob humanas y murinas purificadas de este invento es tal que la administración frecuente de la proteina ob mediante inyección a pacientes humanos o ratones resulta en la disminución de ingesta de alimentos y disminución de la tasa de ganancia de peso comparado con grupos de sujetos no inyectados o de control. La actividad biológica de las proteinas ob humanas y murinas, o sus fragmentos, obtenidos y purificados de conformidad con este invento pueden probarse con métodos rutinarios, por ejemplo mediante inyección intracerebro-ventricular repetida o simple (ICV) en ratones ob/ob siguiendo los procedimientos de Haley, T.J. et al., supra, como se describe con detalle en los ejemplos 13 y 16. Basado en esta prueba ICV, puede determinarse la DE50 para reducir la ingesta de alimentos y la DE50 para reducir la ganancia de peso corporal. En adición, la actividad biológica de las proteinas ob humanas y murinas purificadas o sus fragmentos pueden determinarse mediante inyección IP repetida en ratones ob/ob como se detalla en el ejemplo 15. En base a la prueba IP, puede determianrse la DE20 para reducir la ingesta de alimentos y la DE20 para reducir el peso corporal. La actividad biológica de las proteinas ob humanas y murinas, o sus fragmentos, obtenidos y purificados de conformidad con este invento pueden determinarse también en humanos con métodos conocidos en el arte, por ejemplo midiendo la reducción de la ingesta de comida después de administración IV de la proteina ob a los sujetos de prueba humanos obesos comparado con administración IV de control salino, de conformidad con los métodos de Muurahainen, N.E. et al., Am. J. Physiol 260, 672-680 (1991), y como se describe en detalle en los ejemplos 14 y 17. Alternativamente, la capacidad de las proteinas ob murinas y humanas purificadas de este invento para reducir la proporción de ganancia de peso (por ejemplo inducir pérdida de peso) puede determinarse mediante repetida administración IV a sujetos de prueba humanos obesos de conformidad con los métodos de Drent, M.L. et al., Int. Obesity 19, 221-2265 (1995), como se describe con detalle en el ejemplo 18. Las proteinas ob murinas y humanas de este invento, cuando se purifican de conformidad con este invento, tienen actividad biológica por cuanto que: 1) Cuando se administran mediante inyección intrace- rebroventricular (ICV) a ratones ob/ob obesos maduros con ayuno de 16-18 horas que tienen un peso corporal de por lo menos 30 gramos a una dosis de 20 µg o menos utilizando los métodos de Haley and McCormick, supra, la proteina o polipéptido: (a) reduce la ingesta de alimentos durante una prueba de alimentación de 5 horas en el 50% comparado con ratones de control inyectados con vehículo (DE50 para reducir la ingesta de alimentos) ; y (b) reduce la ganancia de peso corporal durante las 24 horas después de la inyección ICV en por lo menos el 50% comparado con ratones de control inyectados con vehículo (DE50 para reducir la ganancia de peso corporal) ; 2) Cuando se administran intraperitonealmente (IP) a ratones ob/ob maduros sin ayuno que tienen un peso corporal de por lo menos 30 gramos dos veces al dia al inicio de la luz del dia y de nuevo en el punto de las 3 horas de la fase oscura, durante una semana, en una dosis diaria total de 20 µg o menos, la proteina o polipéptido: (a) reduce la ingesta de alimentos en 5 y 24 horas en por lo menos el 20% comparado con los ratones de control inyectados con vehículo (DE20 para reducir la ingesta de alimentos); y (b) reduce la ganancia de peso corporal durante las 24 horas después de la primera inyección IP en por lo menos el 20% comparado con ratones de control inyectados con vehículo (DE20 para reducir la ganan- cia de peso corporal) . En adición esta reducción de peso corporal y de ingesta de alimentos aún tiene lugar a dosis por debajo de 20 µg o menos, aún a un nivel de dosis administrado ICV de 1 µg o menos especialmente cuando estas proteinas se purifican hasta homogeneidad. Los ensayos biológicos antes descritos y detallados en los ejemplos para determinar la actividad biológica de proteinas humanas y/o murinas pueden utilizarse para determinar la actividad biológica de fragmentos de estas proteinas, ya sea produciéndose estos fragmentos mediante degradación proteolitica de las proteinas ob, mediante sintesis química mediante expresión proteínica recombinante de una secuencia de ADN parcial para las protinas ob o con cualquier otro medio conocido por el experto en el arte. De conformidad con otra modalidad de este invento la proteina ob murina y humana de este invento puede conjugarse con homopolimeros de polietilen o polipropilen glicol que pueden estar insustituidos o sustitudios mediante eterificación de uno de los grupos hidroxi en uno de sus extremos por un grupo de alquilo inferior. Estos conjugados proporcionan la proteina ob en forma estable y mejoran la vida media de estas proteinas. En adición el empleo de estos conjugados formados a partir de homopolimeros de polietilenglicol o polipropilenglicol proporcionan medios para aumentar la vida media de la actividad de la proteina ob en el cuerpo. Ademas, estos conjugados se ha encontrado que proporcionan ventajas adicionales tal como aumento de la estabilidad y tiempo de circulación de la proteina ob terapéutica en el cuerpo mientras que también disminuyen la inmunogenicidad de la proteina ob. Estas proteinas ob pegiladas pueden adsorberse también fácilmente en el cuerpo humano y proporcionar absorción aumentada en el sistema sanguíneo. Los homopolímeros de polietilen o polipropilen glicol preferidos que se conjugan con la proteina ob tienen pesos moleculares de aproximadamente 15 a 60 kDa, para producir una proteina que puede ser mono- o poli-peguilada con moléculas de polietilen o polipropilen glicol. En el caso preferido, la proteina ob es mono- o di- peguilada para formar un conjugado con unidades de polietilen o polipropilen glicol, cuyas unidades en el conjugado tienen un peso molecular total de 15 a 60 kDa, mas preferentemente de 35 a 45 kDa. En general los conjugados se producen como mezcla (composición) de conjugados de polietilen y polipropilen glicol puesto que los materiales de partida de polietilen y polipropilen glicol se venden como una mezcla de homopolímeros diferentes que tienen diferentes pesos moleculares. El peso molecular antes expuesto es el peso molecular medio de la mezcla de los conjugados ob asi producidos. Estas mezclas pueden separarse en los conjugados individuales, si se desea, con medios convencionales tal como mediante cromatografía de columna que incluye HPLC. Sin embargo, para el tratamiento, este conjugado se utiliza generalmente como una mezcla. Los polímeros de polietilenglicol o polipropilenglicol [PEG] pueden unirse a la proteina ob vía el aminoácido N-terminal libre de la proteina para formar el conjugado con cualquier medio convencional. Métodos para unir el polietilen o polipropilen glicol para formar los conjugados con la proteina ob pueden ser cualquiera de muchos métodos conocidos disponibles. El polietilen o polipropilen glicol pueden enlazarse covalentemente a través del aminoácido N-terminal de la proteina, así como también a través de los diversos radicales de lisina sobre la proteina ob. Adicionalmente, los homopolímeros de polietilen o polipropilen glicol pueden conjugarse a la proteina ob mediante grupos de enlace bi- o poli funcionales. En la producción de conjugados de homopolímero de mono-polietilen o polipropilen glicol se utilizan enlazadores di-funcionales y el homopolímero se conjuga a un grupo funcional de este enlazador mientras que el aminoácido N-terminal, así como el grupo de lisina de la proteina ob pueden conjugarse al otro grupo funcional de este enlazador. Los polímeros tri- o poli- [polietilen o polipropilen glicol] conjugados con la proteina ob se forman utilizando un enlazador tri-funcional o poli-funcional. El homopolimero puede conjugarse a dos o mas de estos grupos funcionales, uniéndose un grupo funcional restante del enlazador a la proteina ob. Entre estos enlazadores se encuentran los enlazadores poli-funcionales que tienen grupos funcionales amino y carboxi. Los grupos amino pueden conjugarse con el grupo hidroxi funcionalizado del polietilen o polipropilen glicol para formar un enlace amídico. Los grupos carboxi pueden conjugarse con los grupos amina sobre la proteina ob para formar un enlace amidico y con el grupo hidroxi funcionalizado sobre el glicol para formar un éster. Entre los muchos tipos de grupos de enlace que pueden utilizarse para formar el conjugado entre la proteina ob y el PEG se encuentran los descritos en las patentes estadounidenses núms. 4.902.502, 5.034.514, 4.609.546, 5.122.614 y 4.847.325. De conformidad con una modalidad especialmente preferida de este invento se encuentran los conjugados de las fórmulas ROCH2CH2(OCH2CH2)í—o C- -NH (CH2)4 I-A CH ROCH2CH2(OCH2CH2)n O C NH :c -NH- O O RO(CH2CH2O)nCH2 CH2 -NH- I-B en donde P es la proteina murina o humana aqui descrita; y n y n' son números enteros cuya suma es de 300 a 1200 de modo que el peso molecular medio de todas las unidades PEG es de 15 a 60 kDa y el peso molecular total del conjugado es de 30 kDa a 80 kDa; y R y Rt son alquilo inferior. Los compuestos de fórmula I-A y I-B pueden prepararse a partir de los materiales poliméricos conocidos o ROCH2CH2(OCH2CH2); -NH (CH^ ROCH2CH2(OCH2CH2)„ O C II-A RO(CH2CH2O)nCH2CH2 ?-B condensándolos con la proteina ob murina o humana de este invento. Puede utilizarse cualquier método vonencional de reacción de un éster activado con una amina para formar una amida. En la reacción ilustrada antes el éster de succinimidilo ejemplificado es un grupo partiente que produce la formación de amida. Cuando se utiliza el compuesto de fórmula II-B para producir el compuesto de fórmula I-B, la reacción con la proteina ob murina o humana de este invento se lleva a cabo de igual modo que se ha descrito en conexión con la conversión del compuesto de fórmula II-A al compuesto de fórmula I-A. Estos esteres de succinimidilo tal como el compuesto de fórmula II-A para producir conjugados con proteinas se describe en Monfardini et al. Bioconjugate Chem., 6, 62-69 (1995). En el caso del compuesto de la fórmula I-A, la suma de n y n' son de 300 a 1500 de modo a producir un conjugado que tiene un peso molecular medio total de unidades PEG de 15 a 60 kDa y de preferencia de 35 a 45 kDa. En la modalidad preferida de la fórmula I-A la suma de n y n' es de alrededor de 800 a 1200 siendo la suma media de n y n' de 850 a 1000. En general la relación preferida de n a n' en los compuestos de fórmula I-A y II-A es de 0,5 a 1,5, prefiriéndose de 0,8 a 1,2. En el caso del compuesto de fórmula I-B, n tiene un valor de preferencia entre 300 a 1500 para producir un compuesto que tiene de 300 a 1500 unidades PEG con un peso molecular total de 15 a 60 kDa y de preferencia de 35 a 45 kDa. En la modalidad preferida n es de alrededor de 850 a 1000. Las proteinas ob humanas o murinas preparadas de conformidad con este invento pueden prepararse en composiciones farmacéuticas apropiadas para inyección con un portador o vehículo farmacéuticamente aceptable compatible con métodos conocidos en el arte. Puede utilizarse cualquier material de vehículo convencional. El material de vehículo puede ser orgánico o inorgánico apto para administración enteral, percutánea o parenteral. Los vehículos apropiados incluyen agua, gelatina, goma arábiga, lactosa, almidón, estearato de magnesio, talco, aceites vegetales, polialquilen-glicoles, vaselina y similares. Además, los preparados farmacéuticos pueden contener otros agentes farmacéuticamente activos. Pueden adicionarse, de conformidad con prácticas aceptadas de composiciones farmacéuticas, aditivos adicionales tales como agentes saborizantes, conservantes, estabilizantes, agentes emulgentes, tampones y similares. Entre los vehículos preferidos para la formulación de proteinas ob homogéneas del invento se encuentran albúmina de suero humano, proteinas de plasma humano, etc. La administración de proteina ob homogénea recombinante, ya sea humana o murina o una combinación respectiva, resulta en la disminución de ingesta de alimentos y peso corporal en humanos y animales obesos. Por consiguiente la administración de la proteina ob restituye esta proteina que es importante en la regulación del peso corporal. Las compo-siciones farmacéuticas que contienen las proteinas ob humanas o murinas pueden formularse con una potencia efectiva para administración por varios medios a pacientes humanos o animales que experimenten fluctuaciones anormales de peso corporal, solo o como parte de una condición médica adversa o enfermedad, tal como diabetes mellitus tipo II. Puede utilizarse una variedad de técnicas administrativas mediante inyección, entre éstas inyecciones subcutáneas, intravenosas e intraperitoneales. Las cantidades medias de la proteina ob pueden variar y en particular deberán basarse en las recomendaciones y prescripción de un facultativo o veterinario cualificado. Las proteinas humanas o murinas, preparadas de conformidad con este invento pueden utilizarse también en métodos de tamizado para identificar receptor (es) de proteina (s) ob. Los ejemplos que se ofrecen a continuación no pretenden limitar en modo alguno el invento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 es una representación esquemática de los dos clones para proteina ob humana; o sea, ob cll y hob cl2, que ilustra de modo esquemático la posición y tipos de sitios de restricción situados en los extremos 5' y 3' de la secuencia de ADNc ob humana. Figura 2 es una representación esquemática de la contrucción del vector de expresión mob pLPPsOmpA. Figura 3 es una representación esquemática de la construcción del vector de expresión hobl pLPPsOmpA.

EJEMPLO 1 Obtención del ADNc de la ob humana. El ADNc de la ob humana se obtuvo por rastreo de una genoteca de ADNc del fago lambda ("Clontech") , adquirible comercialmente, obtenida a partir del ARN derivado del tejido adipocito humano. A partir de esta genoteca se obtuvieron dos fagos lambda conteniendo cada uno aproximadamente un fragmento de 2,5 kilobases correspondientes a la secuencia del ADNc de la ob humana, mediante la hibridación de genotecas del fago lambda. Mediante esta técnica, se identificaron dos clones, a saber, hobl ADNc y hob2 ADNc. El gen de la ob humana se subclonó en el ADN del vector plásmido pBluescriptSk" comercialmente adquirible en Stratagene. Los vectores resultantes que contienen estas secuencias génicas de la ob humana recibieron el nombre de pBluescriptSk" hobl y pBluescriptSk" hob2. La secuencia del gen de la ob humana en este pBluescriptSk" hobl y pBluescriptSk" hob2 se comprobó mediante el secuenciado de los nucleótidos. Las secuencias de aminoácidos de la proteína deducida de la secuencia de nucleótidos correspondió a la proteína ob humana codificada por SEQ ID. NO. 4, como ha sido publicado por Zhang, Y. y col., ver más arriba. El pBluescriptSk" hobl tuvo una mutación T-C después del codon de terminación del hobl ADNc. Esta mutación dio como resultado la pérdida del sitio de restricción Stul, que por otra parte se había pronosticado estaría presente en la secuencia de nucleótidos del hob l como sigue: hob 1 ...GGG.TGC. GA GGCCT TGA. Gly Cys stop pBluscriotSk—hobl ...GGG.TGC.TGA GGCCC TGA. Gly Cys stop pBluescriptSk—hob2 ...GGG. TGC .TGA GGCCT TGA Gly Cys stop Puesto que esta mutación en el pBluescriptSk" hobl está situada después del codon de terminación de la secuencia del ADNc de la ob humana, no conduce a ningún cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína ob humana, como ha sido publicado por Zhang, Y. y col., ver más arriba. Por lo que se refiere a la secuencia de nucleótidos del ADNc presente en el pBluescriptSk" hob2, se demostró mediante análisis con enzimas de restricción, que este plásmido tiene el sitio de restricción Stul situado después del codon de terminación de la secuencia del ADNc de la ob humana. Además del hecho de que el pBluescriptSk" hobl tiene una mutación en el sitio de restricción Stul después del codon de terminación, el pBluescriptSk" hobl tiene también un sitio de restricción EcoRI después de ORF en el ADNc de hobl que no figura en el ADNc del hob2 (ver figura 1.) .

EJEMPLO 2 Construcción del plásmido para la proteína ob de ratón (mob) El ADNc de la ob de ratón de SEQ ID NO. 1 se obtuvo mediante el procedimiento de Zhang, Y. y col., y a continuación se insertó en el vector pCDNA3, comercialmente adquirible en Invitrogen (San Diego, California, USA) . El gen de la ob de ratón así obtenido se empleó para la construcción del vector de expresión pLPPsOmpA-mob para la expresión de la proteína ob de ratón (mob) . Este vector de expresión y su construcción están detallados en la figura 2. La primera etapa de la construcción fué la de lograr la fusión de la secuencia de codificación de la señal a partir del gen sOmpA para la región madura de codificación del gen de la ob de ratón, esto es, sin su secuencia-señal natural. El fragmento de ADN de 501 bp que codifica la proteína madura ob de ratón insertada en el vector pCDNA3 se amplificó a partir del vector mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) empleando la Vent ADN polimerasa (New England Biolabs) , un cebador delantero (cebador 1) a partir del primer nucleótido del codon que codifica la valina (la cual es el primer aminoácido de la mob madura) (Zhang, Y. y col., ver más arriba) , y un cebador invertido (cebador 2) correspondiente a la región de la mob que contiene el codon de terminación de la mob. El cebador 2 contiene también una secuencia que corresponde al sitio de restricción Hind III.

Cebador 1 : 5 ' GTG CCT ATC CAG AAA GTC 3 ' Val Pro He Glu Lys Val Cebador 2 : 5 ' TCCCAAGCTT T£AGCATTCAGGGCTAAC 3 • HindIII terminación El fragmento amplificado de ADN de 501 bp se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se fosforiló empleando la T4 polinucleótido kinasa (de Boehringer) y a continuación se digirió con el enzima de restricción HindIII para crear un extremo agudo 5' en la posición del cebador 2. El fragmento obtenido tiene un extremo romo que corresponde al primer nucleótido del ADNc que codifica la mob madura, y un extremo 5' agudo que corresponde a un sitio HindIII escindido.

A continuación, el sOmpA plásmido pTlOsOmpArPDI obtenido mediante los métodos de De Sutter, K. y col., ver más arriba, se fusionó con el gen mob para crear un plásmido pTlOsOmpAmob. Para lograr esto, el fragmento mob se clonó por ligación empleando la T4 ligasa ("New England-Biolabs") en el ADN del vector pTlOsOmpArPDI que previamente se había digerido con los enzimas de restricción Nael y HindIII con métodos conocidos en la especialidad [Sambrook, J. y col., en "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] . Este plásmido pTlOsOmpArPDI se derivó del plásmido p7l4 [Parker and Wiley, Gene 83, 117-134 (1989)]. Este plásmido contenía el ADNc que codificaba la proteína de rata disulfuro isomerasa (rPDI) madura, fusionado con el ADNc de la secuencia sOmpA. Esta fusión del último codon de la sOmpA (alanina) con el primer codon del ADNc de la rPDI madura (glicina) creó un sitio de restricción Nael que después de la escisión con Nael liberó el último codon de la secuencia sOmpA y el primer codon de la secuencia de ADNc que codifica la rPDI, como extremos romos . Nael 5 ' GCC / GGC 3 ' Ala Gly sOmpA cDNA / rPDI cDNA madura Existe un sitio HindIII en el extremo del ADNc que codifica la rPDI . Por lo tanto, la posterior digestión de este plásmido con HindIII liberó la parte principal del ADNc de la rPDI y creó un extremo agudo 5' compatible con uno de los extremos del fragmento PCR. El plásmido resultante en donde el ADNc que codifica la rPDI fué substituido por el ADNc que codifica la ob madura de ratón, fué llamado pTlOsOmpAmob, y está representado en la figura 2. El ADN ligado se introdujo en la cepa MC1061 de E. coli empleando la electroporación estándar y las colonias obtenidas se rastrearon para detectar la presencia del fragmento de ADN de la ob de ratón, mediante el análisis con enzimas de restricción. El clon pTlOsOmpAmob tenía la secuencia que codifica la proteína ob madura de ratón fusionada con la secuencia que codifica el sOmpA. A continuación la expresión del mob en la E. coli en este pTlOsOmpAmob se colocó bajo el control del promotor lipoproteína (P?pp) y el promotor-operador lac (P0lac) . Para lograr esto, la secuencia sOmpA-mob del gen híbrido se transfirió del plásmido pTlOsOmpAmob al plásmido vector pLPPsOmpArPDI mediante procedimientos estándar descritos en De Sutter y col., ver más arriba. El plásmido pLPPsOmpArPDI se derivó como ya se ha mencionado anteriormente, del plásmido p7l4 [Parker and Wiley, Gene 83, 117-134 (1989)]. Para este paso, el ADN del plásmido pTlOsOmpAmob se escindió con los enzimas de restricción Xbal y HindIII. El fragmento que contenía el sOmpA-mob que codifica el ADN se ligó a continuación al plásmido pLPPsOmpArPDI del cual se había eliminado previamente el sOmpA-rPDI que codifica el ADN mediante escisión con los enzimas de restricción Xbal y HindIII. El plásmido resultante recibió el nombre de pLPPsOmpAmob . EJEMPLO 3 Expresión de la proteína ob de ratón en E. coli (MC1061) La expresión de la proteína ob de ratón en la E. coli se logró como sigue. El plásmido pLPPsOmpAmob construido de acuerdo con el ejemplo 2 se insertó por electroporación en una cepa MC1061 de E. coli. Las células de E. coli (MC1061) que hospedaban el plásmido pLPPsOmpAmob se hicieron crecer durante la noche a 28°C en medio Luria-Bertania ("Difco Laboratories") suplementado con el antibiótico carbenicilina (100 µg/ml, "Beecham") . Este cultivo se empleó a continuación como inoculo (dilución 100 veces) para un cultivo de 30 ml durante la noche a 28°C en el mismo medio. Este cultivo se diluyó a continuación 100 veces en 3 litros (p. ej , 6 x 0,5 litros en matraces Erlenmeyer de 1 litro) en el medio anterior y se agitó a 28°C en un agitador neumático New Brunswick (300 rpm) durante aproximadamente 4 horas hasta alcanzar una densidad de Aß00 0,3 a 0,5. En este momento el promotor lac fué inducido mediante la adición de una concentración final 2 mM de isopropil-jß-D-tiogalactopiranosido (IPTG, de Boehringer) , como está descrito en Sutter y col., ver más arriba. A continuación las células se incubaron a 28°C durante aproximadamente 5 horas hasta que la densidad celular fué de A600 1,3 a 1,5. A continuación se recogieron las células por centrifugación en un rotor JA10 (centrífuga Beckman modelos J2-21 ó J2-21M) durante 6 minutos a 6750 rpm (8000 x g) a 4°C. El sobrenadante se separó y el sedimento de células se resuspendió rápidamente en 250 ml de tampón de choque osmótico enfriado con hielo (Tris-HCl 100 mM, pH 7,4 conteniendo sacarosa 20% y EDTA 10 mM) y se incubó con hielo durante 10 a 20 minutos como ha sido descrito por Koshland y Botstein, ver más arriba. A continuación se transfirió la suspensión a tubos de centrífuga de plástico y las células se separaron por centrifugación a 8200 rpm (8000 x g) durante 5 minutos a 4°C en un rotor JA20. Se separó el sobrenadante, y el sedimento de células se resuspendió rápidamente en 120 ml de agua enfriada con hielo, agitando vigorosamente y se incubó en hielo durante 10 minutos adicionales. A continuación se centrifugó la suspensión en el rotor JA20 durante 6 minutos a 4°C a 11.500 rpm (16.000 x g) y se recogió el sobrenadante correspondiente a la fracción periplásmica (fluido de choque osmótico) (aproximadamente 120 ml) . Se añadieron azida de sodio y Tris-HCl (pH 7,5) a una concentración final de 0,05% y 50 mM respectivamente. El fluido de choque osmótico que contenía la proteína ob de ratón se guardó a -20°C hasta su uso posterior.

EJEMPLO 4 Expresión de la proteína ob de ratón en E. coli (MC1061) La expresión de la proteína ob de ratón se efectuó de acuerdo con el procedimiento descrito en el ejemplo 3, excepto que se empleó la triacilina (100 µg/ml) como antibiótico para suplementar el medio de Luria-Bertaria (en lugar de la carbenicilina) . EJEMPLO 5 Purificación de la proteína ob de ratón a partir del fluido osmótico de E. coli La proteína ob de ratón localizada en el fluido de choque osmótico congelado de 120 ml, de acuerdo con el ejemplo 4, se purificó como sigue. El fluido de choque osmótico de 120 ml conteniendo la proteína ob de ratón se descongeló y se centrifugó a 4°C durante 20 minutos a 16.000 rpm en un rotor JA20 para eliminar los residuos insolubles. A continuación, se cargó el sobrenadante directamente en una columna conteniendo un volumen de lecho de 30 ml de de Sepharose Q de ai a fluidez ("Pharmacia") preequilibrada con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), Después de lavar con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), la proteína mob se eluyó con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) conteniendo NaCl 0,1 M. A continuación, se añadió (NH4)2S04 al material eluído de la columna que contenía la Sepharose Q de alta fluidez, a una concentración final de 1,0 M y la mezcla se cargó en una columna conteniendo un volumen de lecho de 7,5 ml de butil- Sepharose de alta fluidez ("Pharmacia") preequilibrada con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) conteniendo (NH4)2S04 1,0 M.

Después de lavar con tampón Tris-HCl (pH 7,5) conteniendo (NH4)2S04 1,0 M, se eluyó la proteína mob aplicando un gradiente de (NH4)2S04 1,0 M en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) a etilenglicol 20% en agua. La proteína mob eluyó de la columna de butil-Sepharose de alta fluidez, muy al final del gradiente, mientras que la mayoría de impurezas eluyeron mucho antes . La pureza de la proteína mob en esta etapa fué del 90% como se verificó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con plata (PAGE) . La proteína mob en el material eluído de la columna conteniendo la butil-Sepharose de alta fluidez, fué a continuación purificada mediante cromatografía de filtración sobre gel. Para lograr esto, se concentró la proteína ob de ratón a 4°C hasta un volumen de 1 ml sobre una membrana YM10 ("Amicon") empleando una unidad de concentración 8MC ("Amicon"), y se aplicó a una columna (1,0 cm x 50 cm) conteniendo 39 ml de Sephadex G-100 ("Pharmacia") preequilibrada en solución salina tamponada con fosfato. Las fracciones conteniendo la proteína mob se juntaron a continuación y la proteína se concentró en una membrana YM10. En esta etapa, la proteína mob dio una pureza mayor del 95% según se comprobó mediante PAGE y tinción con plata. El SDS-PAGE reveló una banda única de proteína a Mr 15.000. EJEMPLO 6 Análisis de la secuencia de la proteína ob de ratón La secuencia de aminoácidos N-terminales de la proteína ob de ratón obtenida y purificada por los procedimientos de los ejemplos 2, 3, 4 y 5 descritos más arriba, se determinó de acuerdo con el procedimiento de Laemli, U.K., ver más arriba. Después de la electrotransferencia de las proteínas sometidas a electroforesis a una lámina de fibra de vidrio recubierta de poli (yoduro de 4-vinil N-metilpiridinio) , como se ha descrito por Bauw, G. y col., J. Biol. Chem. 7, 194-196 (1988), la banda de proteína con Mr 15.000 se recortó de la membrana y la secuencia de aminoácidos N-terminales se determinó mediante degradación Edman en un secuenciador en fase gaseosa 470A, equipado en línea con un analizador de aminoácidos 120A de feniltiohidantoína ("Applied Biosystems"). La secuencia de aminoácidos N-terminales de la proteína ob de ratón obtenida mediante los procedimientos más arriba descritos fué Val-Pro-Ile-Gln, que corresponde a la proteína ob de ratón madura de SEQ ID NO: 3. EJEMPLO 7 Construcción del vector de expresión para la proteína ob humana (hob) El gen de la ob humana obtenido de acuerdo con los procedimientos del ejemplo l se utilizó para construir un vector de expresión pLPPsOmpAhobl para la expresión de la proteína ob humana. Esta construcción fué similar a la construcción del pLPPsOmpAmob descrita en el ejemplo 2 y está detallada en la figura 3. Fué necesaria una ligación de tree segmentos para completar el fragmento de ADN que contiene la secuencia que codifica la ob humana madura completa. En la primera etapa de la construcción, se fusionó una secuencia de nucleótidos de hob empezando con el primer nucleótido del codon que codifica el primer aminoácido de la proteína ob humana madura (valina) , con la secuencia que codifica la señal "del OmpA (sOmpA) , de forma que la secuencia sOmpA está más arriba del extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la hob. Este fragmento de ADN se obtuvo por amplificación en una mezcla de PCR que contenía el plásmido pBluescriptSK'hobl, la Vent ADN polimerasa, y dos cebadores. El cebador delantero (cebador 1) empezó con el primer nucleótido del codon que codifica el primer aminoácido de la proteína ob humana madura, y el cebador opuesto (cebador 2) contenía la secuencia del ADNc humano que contenía el codon de terminación. La reacción de amplificación proporcionó un fragmento de ADN de 501 bp que contenía la secuencia que codifica la proteína ob humana madura. A continuación se fosforiló el extremo 5' de este fragmento de ADN con la T4 polinucleótido kinasa y se digirió con el enzima de restricción HindIII, proporcionando un fragmento de ADN de 353 bp que tiene un extremo romo correspondiente al primer nucleótido del ADNc que codifica la hob madura (posición correspondiente al cebador 1) , y un extremo agudo 5' que corresponde a un sitio escindido HindIII. Este fragmento de ADN de 353 bp se purificó mediante electroforesis en gel de agarosa y se clonó en el plásmido pTlOsOmpArPDI que ha sido previamente digerido con los enzimas de restricción Nae I y HindIII. El plásmido resultante pTlOsOmpAhobl (parcial) tiene el fragmento de ADN que codifica una parte de la proteína ob humana madura (parte amino-terminal) fusionada con la secuencia que codifica el sOmpA.

Cebador 1 : 5 ' GTGCCCATCCAAAAAGTC 3 ' Cebador 2 : 5 ' TCCCAAGCTTTCAGCACCCAGGGCTGAG 3 ' terminación En una segunda etapa, la secuencia de ADN que codifica la parte del carboxilo terminal de la proteína ob humana, esto es, el fragmento 2, se ligó al fragmento de ADN que codifica la parte amino- erminal de la hob madura, y el fragmento resultante que codifica la secuencia entera de la hob madura fusionada con el sOmpA, se transfirió al plásmido pLPPsOmpArPDI para conducir la expresión de la proteína ob humana madura en la E. coli bajo el control del promotor lipoproteína y el promotor-operador lac. Para lograr esto, se digirió el plásmido pTlOsOmpAhobl (parcial) con Xbal y HindIII y el fragmento 1 de ADN de 400 bp de hob se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa (fragmento 1) . A continuación, se escindió el plásmido pBluescriptSK'hobl con HindIII y EcoRI, y el 450 bp se aisló mediante electroforesis en gel de agarosa (fragmento 2) . Finalmente, se escindió el plásmido pLPPsOmpArPDI con Xbal y EcoRI y el fragmento del vector se aisló mediante la electroforesis en gel de agarosa (fragmento 3) . Los fragmentos de ADN 1, 2 y 3 se ligaron a continuación entre sí y la mezcla de la ligación se introdujo en la cepa MC1061 de E. coli. La colonia que contenía la construcción del plásmido final pLPPsOmpAhobl se utilizó para la expresión y secreción de la proteína ob humana madura. EJEMPLO 8 Expresión de la proteína ob humana en E. coli (MC1061) El pLPPsOmpAhobl construido de acuerdo con el ejemplo 7 se utilizó para la transformación de la cepa MC1061 de E. coli para la expresión de la proteína ob humana en forma soluble biológicamente activa en el periplasma de las células hospedadoras E. coli. La inserción del plásmido en estas células hospedadoras E. coli se efectuó por electroporación. Las células E. coli (MC1061) que hospedaban el plásmido pLPPsOmpAhobl se cultivaron a 28°C en el medio Luria-Bertania ("Difco Laboratories") suplementado con el antibiótico carbencilina (100 µg/ml, "Beecham") hasta alcanzar la densidad apropiada, después de lo cual el promotor lac fué inducido mediante la adición de isopropil-3-D-tiogalactopiranosido a la concentración final de 2 mM (IPTG de Boehringer) como está descrito en De Sutter y col., ver más arriba. Las células se hicieron crecer a continuación hasta que la densidad celular fué de 1,3 A600. A continuación las células fueron recogidas por centrifugación (8000 x g a 4°C) y el sedimento de células se resuspendió rápidamente en tampón de choque osmótico enfriado con hielo (Tris-HCl 100 M, pH 7,4 con sacarosa 20% y EDTA 10 mM) y se incubó en hielo durante 10 minutos como ha sido descrito por Koshland y Botstein, ver más arriba. A continuación, se recogieron de nuevo las células por centrifugación como se ha expuesto más arriba y el sedimento de células se resuspendió en agua enfriada con hielo y se incubó en hielo durante 10 minutos . A continuación se centrifugó la suspensión durante 5 minutos a 16.000 x g y se recogió el sobrenadante (fluido de choque osmótico) . Se añadió azida de sodio y Tris-HCl (pH 7,5) a la concentración final de 0,05% y 50 mM respectivamente. El fluido de choque osmótico que contenía la proteína ob humana se guardó a -20°C hasta que se utilizó.

EJEMPLO 9 Expresión de la proteína ob humana en E. coli (Mcl061) La expresión de la proteína ob humana se logró empleando el mismo procedimiento del ejemplo 8, excepto que se empleó la triacilina (100 µg/ml) como antibiótico para suplementar el medio de Luria-Bertaria en lugar de la carbenicilina. EJEMPLO 10 Purificación de la proteína ob humana del fluido osmótico de E. coli Para purificar la proteína ob humana en el fluido de choque osmótico del ejemplo 9, se añadió NaCl al fluido a una concentración final de 0,1 M y a continuación el fluido se cargó directamente en una columna conteniendo un volumen de lecho de 30 ml de Sepharose Q de alta fluidez ("Pharmacia") preequilibrada con tampón de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). A continuación, se añadió (NH4)2S04 sólido al material eluído a través de la columna conteniendo Sepharose Q de alta fluidez, hasta una concentración final de 1,0 M y la mezcla se cargó en una columna conteniendo un volumen de lecho de 7,5 ml de butil-Sepharose de alta fluidez ("Pharmacia") preequilibrada con tampón Tris-HCl 50 M (pH 7,5) conteniendo (NH4)2S04 1,0 M. Después de lavar con tampón Tris-HCl (pH 7,5) conteniendo (NH4)2S041,0 M, se eluyó la proteína hob aplicando un gradiente de (NH4)2S04 1,0 M en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) a etilenglicol 20% en agua. La proteína hob eluyó de la columna de butil-Sepharose de alta fluidez muy al final del gradiente, mientras la mayor parte de impurezas eluyeron mucho más pronto. La pureza de la proteína hob en esta etapa fué del 90% según se comprobó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida y tinción con plata (PAGE) . La proteína hob en el material eluído de la columna conteniendo butil-Sepharose de alta fluidez se purificó a continuación mediante cromatografía por filtración sobre gel. Para lograr esto, se concentró la proteína ob humana a 4°C a un volumen de 1 ml en una membrana YM10 ("Amicon") empleando una unidad de concentración 8MC ("Amicon"), y se aplicó a una columna (1,0 cm x 50 cm) que contenía 39 ml de GlOO-Sephadex ("Pharmacia") preequilibrada en solución salina tamponada con fosfato. A continuación, las fracciones que contenían la proteína hob se juntaron y la proteína se concentró en una membrana YM10. En esta etapa, la pureza encontrada fué superior al 95% como se comprobó mediante PAGE y tinción con plata. El análisis SDS PAGE del eluato demostró la presencia de una única banda de proteína a Mr 15.000. EJEMPLO 11 Purificación de la proteína ob humana del fluido osmótico de E. coli Para purificar la proteína humana del fluido de choque osmótico del ejemplo 9 se utilizó el procedimiento del ejemplo 10 con la siguiente excepción: Antes de añadir el (NH4)2S04 sólido al material eluído, se efectuaron los siguientes pasos con respecto al fluido de choque osmótico del ejemplo 9. La proteína ob humana del fluido de choque osmótico del ejemplo 9 se cargó directamente en una columna que contenía un volumen de lecho de 30 ml de Sepharose Q de alta fluidez ("Pharmacia") preequilibrada con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) . Después de lavar con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), se eluyó la proteína hob con tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) conteniendo NaCl 0,1 M. Ejemplo 12 Análisis de la secuencia de la proteína ob humana La secuencia de aminoácidos N-terminales de la proteína ob humana purificada y obtenida mediante los procedimientos de los ejemplos 7-11 descritos más arriba, se efectuó de acuerdo con el procedimiento de Laemli, U.K., ver más arriba. Después de la electrotransferencia de las proteínas sometidas a electroforesis, a una lámina de fibra de vidrio recubierta de poli (yoduro de 4-vinil N-metilpiridinio) , como se ha descrito por Bauw y col., ver más arriba, la banda de proteína con Mr 15.000 se recortó de la membrana y a continuación se determinó la secuencia de aminoácidos N-terminales mediante la degradación de Edman en un secuenciador en fase gaseosa 470A equipado con un analizador de aminoácidos 120A en línea con feniltiohidantoína ("Applied Biosystems") . La secuencia de aminoácidos N-terminales de la proteína hob obtenida mediante los procedimientos descritos más arriba fué Val-Pro-Ile-Gln que corresponden a la proteína ob humana madura de SEQ ID NO: 6. EJEMPLO 13 Actividad biológica de la proteína ob de ratón: Inyección intracerebroventricular (ICV) en el ratón ob/ob . La actividad biológica de la proteína madura ob del ratón, purificada de acuerdo con el ejemplo 5, se determinó empleando el método ICV como sigue. Se implantaron cánulas de infusión en el ventrículo lateral de cerebros de ratones obesos ob/ob hembras anestesiados (edad 6-13 semanas) empleando las siguientes coordenadas (2 mm lateralmente a la línea mediana; 0,6 mm con respecto al bregma,- 2 mm debajo) basado en el método de Haley y Me Cormick, ver más arriba. El extremo de la cánula se montó en el cráneo empleando un tornillo de joyero y cemento dental. Los ratones se alojaron individualmente en jaulas de plástico con libre acceso para la comida (excepto en la noche previa a la inyección ICV) y agua. Una vez recuperados de la intervención quirúrgica como se comprueba por la ingesta diaria de alimento y la ganancia de peso, los ratones fueron estudiados en varias ocasiones después de la inyección intracerebroventricular (ICV) de 1 µl de una de las soluciones de ensayo siguientes: 1) CSF artificial; 2) solución de control bacteriano; 3) proteí?a ob (0,6 a 1 µg/ratón) ,- ó 4) ninguna infusión. La inyección de una de las soluciones ICV de ensayo anteriores en cada ratón fué seguida por 1 µl de CSF artificial para limpiar la cánula. Para la finalidad de este experimento, la solución de control bacteriano fué una muestra elaborada y preparada idénticamente de acuerdo con los procedimientos descritos en los ejemplos 2-4, excepto que el plásmido insertado en la bacteria E. coli no estaba presente el gen ob de ratón. Los ratones fueron sometidos a ayuno durante 18 horas (durante la noche) antes de la inyección ICV. Los ratones fueron ligeramente inmovilizados y se empleó una jeringuilla Hamilton de 10 µl provista de una pieza de tubo de polietileno (PE) precalibrado (PE20) , para inyectar 1 µl de la solución de ensayo en la cánula colocada en el ventrículo lateral . Inmediatamente los ratones fueron colocados en una jaula de ensayo con un plato de alimento conteniendo una cantidad previamente pesada de comida para ratones en pildoras y un frasco de agua. Los ratones fueron observados visualmente y la ingesta de comida se midió durante las próximas siete horas. Las mediciones de ingesta de comida se obtuvieron a las 0,5, l, 2, 3, 4, 6 y 7 horas después de la inyección ICV. El peso corporal de cada animal se midió antes de la inyección de ICV y 24 horas más tarde. El correcto emplazamiento de la cánula se comprobó por un aumento a las 2 horas de la ingesta de alimento después de la inyección ICV de 10 µg del neuropéptido Y en ratones sometidos a 2 horas de ayuno según Morley, J.E. y col., American J. Physiol. 253, 516-522 (1987). Los resultados del ensayo ICV descrito más arriba fueron como sigue: A. Reducción de la ingesta de alimento Durante los primeros 30 minutos después de la inyección ICV casi todos los ratones comieron con breves intervalos y consumieron aproximadamente 0,5 g. Los ratones que no recibieron ninguna inyección o CSF artificial continuaron comiendo durante las próximas 6,5 horas y alcanzaron una ingesta acumulada en 7 horas de 3,2 gramos (tabla 1) . Por el contrario, los ratones tratados con ICV de proteína ob interrumpieron la ingesta después de los primeros 30 minutos y ya no volvieron a comer. De esta forma, su ingesta de alimento acumulada permaneció anulada durante las próximas 6,5 horas a aproximadamente 0,5 gramos (tabla 1) . Los ratones que recibieron la solución ICV de control del vehículo interrumpieron también la comida después de 30 minutos, y solamente empezaron a comer de nuevo entre las 6 y 7 horas .

B. Reducción de la ganancia de peso corporal El cambio en 24 horas del peso corporal de los ratones inyectados con control del vehículo fué ligeramente inferior al de los ratones inyectados o no inyectados con CSF artificial (tabla 1) . Sin embargo, el cambio en tanto por ciento del peso corporal de los ratones inyectados con proteína ob fué casi cero y se redujo significativamente en comparación con los ratones inyectados con control del vehículo (tabla 1) . C. Conclusión El efecto observado de la administración directa de la proteína ob recombinante de ratón (1,1 µg/ratón en 1 µl al cerebro) fué una continua y significativa reducción en la ingesta de alimento y ganancia de peso corporal de los ratones ob/oJ hembra. Esto demuestra que la proteína ob puede actuar directamente sobre el cerebro y es consecuente con el efecto de la proteína ob cuando se inyecta intraperitonealmente. Este ejemplo confirma también la actividad biológica de la proteína ob recombinante de ratón expresada bacterialmente en ratones ob/ob obesos hembras .

TABLA 1 * indica significativas diferencias entre los grupos con proteína ob y los grupos con líquido cefalorraquídeo (CSF) artificial con p<0,05. ** indica tanto por ciento de control EJEMPLO 14 Actividad biológica de la proteína ob de ratón intravenosa (IV) en ratones ob/ob La actividad biológica de la proteína ob de ratón obtenida y purificada de acuerdo con los ejemplos 2, 3, 4 y 5 se ensayó mediante inyección intravenosa (IV) en ratones ob/ob obesos como sigue: A ratones ob/ob obesos machos y hembras (de 6-13 semanas de edad) se les implantaron cánulas yugulares crónicas con anestesia de pentobarbital (80 mg/kg de peso corporal) de acuerdo con el método de Mokhtarian A., y col., Physiol. Behav. 54, 895-898 (1993) . Los ratones fueron alojados individualmente en jaulas de plástico en condiciones ambientales constantes, con un ciclo de 12 horas de oscuridad/12 horas de luz. Los pesos corporales se midieron diariamente y la lim-pieza de las cánulas se verificó y se mantuvo un día si y otro no, por infusión de = 0,1 ml de una solución estéril heparina/ solución salina (50 U/ml en solución salina 0,9%) . Después de la completa recuperación de la intervención quirúrgica, confirmada por la ganancia en peso corporal, los ratones se sometieron a un ayuno de 16-18 horas (durante la noche) . La mañana siguiente, se pesaron los ratones y se colocaron en jaulas de ensayo durante 45 minutos para su aclimatación antes del experimento. El agua estuvo continuamente disponible. La proteína ob de ratón (3µg en 0,1 ml) o un volumen igual de control del vehículo o solución salina (0,9%) se inyectó por vía intravenosa. Los ratones despiertos fueron ligeramente inmovilizados y se utilizaron jeringuillas de insulina de 0,5 ml para inyectar 0,1 ml de la solución de ensayo seguida de 0,05 ml de heparina/solución salina. Las pruebas se espaciaron entre sí como mínimo 3 días. A continuación los ratones se volvieron a colocar inmediatamente en la jaula de ensayo con una cápsula de petri previamente pesada, conteniendo pildoras de comida para ratones . Los ratones fueron observados visualmente y se midió la ingesta de alimento durante las próximas siete horas a 0,5, 1, 2, 3, 4, 6 y 7 horas después de la inyección intravenosa. El peso corporal se midió antes de la inyección IV y de nuevo pasadas 24 horas. Se utilizaron dos grupos separados de ratones canulados (11 ob/ob y 12 flacos) en cinco pruebas individuales. La mayor parte de ratones recibieron la proteína ob de ratón y uno o ambos grupos, inyecciones de control en un orden equilibrado. Se utilizaron dos preparaciones distintas de proteína ob de ratón en este experimento. Los datos que aquí se exponen son una combinación de los resultados de las repeticiones individuales. A. Resultados Los resultados del experimento anterior son como sigue: Durante los primeros 30 minutos siguientes a la inyección IV la mayor parte de los ratones obesos y flacos comieron con breves intervalos y consumieron aproximadamente 0,3-0,5 gramos. La ingesta de alimento en ratones obesos inyectados con solución salina y control del vehículo, aumentó a lo largo del experimento. La ingesta de alimento acumulada de los ratones ob/ob obesos inyectados con control del vehículo no fué distinta de la ingesta de alimento de los ratones obesos de forma análoga en ayunas, que fueron inyectados con solución salina. En contraste, la ingesta de alimento de los ratones ob/ob obesos inyectados con proteína ob recombinante se * redujo significativamente y permaneció suprimida en el 57% del control (tabla 2) . No se observaron otros efectos del comportamiento en el control del vehículo y los grupos de proteína ob durante las 7 horas del período de observación. Como se esperaba, la ganancia en peso corporal después de la inyección a las 24 horas no fué diferente en los grupos de tratamiento (tabla 2) debido a la duración limitada de la acción de un único bolo por vía IV de la proteína ob de ratón.

B. Conclusiones Estos resultados demuestran que la proteína ob de ratón recombinante reduce significativamente la ingesta de alimento acumulada durante 7 horas después de la administración IV (3 µg/ratón) en ratones ob/ob obesos. La capacidad de la proteína ob de ratón recombinante, de reducir la ingesta de alimento en los ratones ob/ob obesos es consecuente con los resultados de ingesta de alimento obtenidos después de inyección IP repetida de la proteína ob en ratones ob/ob obesos. Este ejemplo confirma también la actividad biológica de la proteína ob de ratón recombinante en ratones ob/ob obesos hembra. TABLA 2 Tabla 2 : Administración de la proteína ob de ratón en ratones ob/ob Los datos son la media ± sem. n = indica el número de ratones individuales, sem significa "error estándar de la media", * indica diferencias significativas entre los grupos con proteína ob y los grupos con CSF artificial con p<0,05. ** indica el tanto por ciento de control. EJEMPLO 15 Actividad biológica de la proteína ob de ratón: Inyección IP repetida en ratones ob/ob. La actividad biológica de la proteína ob de ratón obtenida y purificada de acuerdo con los ejemplos 2-5 se ensayó mediante inyección intraperitoneal (IP) repetida en ratones ob/ob obesos, como sigue: Se estudiaron tres grupos de ratones ob/ob obesos hembra. Los ratones fueron alojados en jaulas de plástico (tres por jaula) en condiciones ambientales constantes, con un ciclo de 12 horas de oscuridad/12 horas de luz. Se midieron cada día la ingesta de alimento en veinticuatro (24) horas y el peso corporal . Después de un período de adaptación a las condiciones ambientales, a la manipulación diaria y a las inyecciones, los ratones fueron repartidos en tres grupos de tratamiento. Cada ratón recibió dos inyecciones intrape-ritoneales (IP) en cada día de tratamiento (poco tiempo antes del principio de la fase de oscuridad del ciclo oscuridad/luz y a las tres horas en la fase de oscuridad) de 0,1 ml de las siguientes soluciones de ensayo: 1) solución salina (0,9%); 2) solución de control bacteriano: ó 3) proteína ob de ratón (3 µg/0,1 ml) . La solución de control bacteriano fué una muestra elaborada y preparada idénticamente de acuerdo con los procedimientos descritos en los ejemplos 2-4 para obtener y purificar la proteína ob de ratón, excepto que el plásmido insertado en la bacteria E. coli estuvo ausente del gen de la ob de ratón. Los ratones fueron tratados dos veces diariamente durante cinco días y a continuación no recibieron ningún tratamiento durante dos días. Se midió la ingesta de alimento de cada jaula a las 2, 3, 5 y 24 horas después de la primera inyección IP de cada día de tratamiento. A. Resultados Reducción de la ingesta de alimento La ingesta de alimento no fué distinta en los ratones inyectados con solución salina y control bacteriano en los días de tratamiento y no tratamiento durante el experimento de una semana (tabla 3) . Sin embargo, la ingesta de alimento se redujo en los seis ratones inyectados con 6 µg de proteína ob en los días de tratamiento durante el experimento. La reducción en la ingesta de alimento se observó a las 2, 3, 5 y 24 horas después de la primera inyección en los días de tratamiento en los ratones del grupo que habían recibido la proteína ob, en comparación con los grupos de control bacteriano y control salino. Reducción de la ganancia de peso corporal La ganancia de peso corporal acumulado durante los cinco días de tratamiento del grupo de proteína ob, fué de -3,3 +/- 0,7 gramos en comparación a los -0,9 +/- 0,2 gramos en el grupo de la solución salina y de -0,7 +/- 0,4 gramos en el grupo de control bacteriano (ver tabla 3) . Conclusión Este ejemplo demuestra que dos inyecciones IP diarias de la proteína ob de ratón recombinante expresada bacterialmente (6 µg/ratón/día) dieron como resultado una reducción significativa y sostenida de la ingesta de alimento y una disminución significativa de la proporción de ganancia de peso de los ratones ob/ob hembra tratados en comparación con los ratones ob/ob tratados con control salino y bacteriano. Estos resultados demuestran que la proteína ob de ratón expresada bacterialmente es biológicamente activa y tiene los efectos esperados de anti-obesidad en ratones ob/ob genéticamente obesos, de acuerdo con la presente invención. En la tabla 3, los resultados de la hora 2 y 5 son la media de la ingesta diaria de alimento, mientras que los resultados a las 24 horas muestran la ingesta de alimento acumulada en 5 días. TABLA 3 Tabla 3 : Administración IP repetida de la proteína ob de ratón, en ratones ob/ob Los datos son la media ± sem para seis ratones ob/ob en cada grupo. La ingesta de alimento es la media de la ingesta acumulada para jaulas de tres ratones durante los cinco días de tratamiento a las 2, 5 y 24 horas después de la primera inyección IP. La ganancia de peso corporal es el cambio acumulado del peso corporal durante los cinco días de tratamiento. * indica diferencias significativas entre la proteína ob y los grupos del vehículo con p<0,05. EJEMPLO 16 Actividad biológica de la proteína ob humana: inyección intracerebroventricular (ICV) en ratones ob/ob El método empleado para determinar la actividad biológica de la proteína ob humana mediante inyección intracerebroventricular ICV en ratones ob/ob fué el mismo del ejemplo 13 excepto que las soluciones de ensayo fueron: - proteína ob humana recombinante obtenida en el ejemplo 11 (0,05 µg) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) conteniendo 0,1% de albúmina de suero de ratón; y - PBS conteniendo 0,1% (p/v) de albúmina de suero de ratón (control de albúmina) como solución control del vehículo. A. Reducción de la ingesta de alimento Durante los primeros 30 minutos después de la inyección ICV casi todos los ratones comieron con breves intervalos y consumieron aproximadamente 0, 5 gramos . Los ratones que no recibieron ninguna inyección continuaron comiendo durante las siguientes 6,5 horas y alcanzaron una ingesta acumulada en 7 horas de 1,8 gramos (tabla 4). Los ratones que recibieron la solución ICV de control de albúmina pararon de comer después de 30 minutos y solamente empezaron a comer de nuevo entre las 3 y 7 horas. En contraste, los ratones tratados ICV con proteína ob humana comieron significativamente menos en los primeros 30 minutos (0,2 gramos) y comieron muy pocas cantidades durante las siguientes 6,5 horas. De esta forma, su ingesta acumulada de alimento permaneció paralizada durante las siguientes 6,5 horas a aproximadamente 0,4 gramos (tabla 4) . B. Reducción de la ganancia de peso corporal El cambio en 24 horas del peso corporal de los ratones inyectados con control del vehículo fué ligeramente inferior al de los ratones inyectados o no inyectados con CSF artificial (tabla 4) . Sin embargo, el tanto por ciento de cambio en el peso corporal de los ratones inyectados con proteína ob humana fué próximo a cero (tabla 4) . C. Conclusión El efecto observado de la directa administración de la proteína ob humana recombinante (0,05 µg/ratón en 1 µl en el cerebro, para conseguir una sostenida y significativa reducción de la ingesta de alimento y de la ganancia de peso corporal de los ratones ob/ob hembras demuestra que la proteína ob puede actuar directamente sobre el cerebro y es consecuente con el efecto de la proteína ob cuando se inyecta vía IP. Este ejemplo confirma también la actividad biológica de la proteína ob humana recombinante expresada bacterialmente en ratones ob/ob obesos hembra. TABLA 4 Tabla 4 : Administración ICV de la proteína ob humana en ratones ob/ob Los datos son la media ± sem. N = indica el número de ratones individuales. * indica diferencias significativas entre los grupos con proteína ob humana y los grupos con CSF artificial con p<0, 05. ** indica el tanto por ciento de control EJEMPLO 17 Actividad biológica de la proteína ob en sujetos humanos obesos: Reducción de la ingesta de alimento de ensayo después de la administración vía IV. La actividad biológica de las proteínas ob de ratón y humana obtenidas y purificadas de acuerdo con los ejemplos 7-11 respectivamente, se determina midiendo la ingesta de alimento de ensayo después de la administración vía IV a seres humanos como sigue: Voluntarios humanos flacos y obesos se preparan con comidas de ensayo de un contenido calórico prefijado en un laboratorio de comidas en dos ocasiones empleando el método de Muurahainen, N.E. y col., ver más arriba. Por lo menos una hora antes a la administración de la comida se coloca un catéter IV permanente en la vena antecubital o vena del antebrazo y se mantiene abierto con un tapón de heparina. Se determina la valoración analógica visual del apetito, 15 minutos antes y 15 minutos después de la presentación de la comida, y a la finalización de la comida de ensayo. A continuación se infunde vía IV la proteína ob de ratón o humana, o la solución salina, durante 20 minutos antes de la presentación de la comida. Cada individuo es informado de que puede comer lo que desee de la comida de ensayo hasta quedar satisfecho. Se mide la cantidad de comida de ensayo ingerida por cada individuo. Cada individuo recibe a continuación infusiones de proteína ob humana (0,5 mg/kg de peso corporal) o bien de proteína ob de ratón (0,5 mg/kg de peso corporal) o o bien de solución salina, y se calcula la diferencia de la cantidad de comida de ensayo ingerida en estas condiciones. En el grupo de la proteína ob humana o de ratón se ha reducido la cantidad de comida consumida en por lo menos un 20%. EJEMPLO 18 Actividad biológica de la proteína ob en individuos humanos obesos : Inducción de la pérdida de peso mediante la administración repetida vía IV Se determinó la actividad biológica de las proteínas ob de ratón y humana obtenidas y purificadas de acuerdo con los ejemplos 7-11, respectivamente, midiendo la pérdida de peso después de la administración repetida vía IV de la proteína ob, de acuerdo con el siguiente método. Se efectuó un estudio de pérdida de peso, doble ciego, controlado con placebo, empleando los métodos de Drent, M.L. y col., ver más arriba. Individuos obesos con un índice de masa corporal (BMI) mayor de 27 se pesaron y a continuación se sometieron a una dieta de 1500 Kcalorías durante un período de rodaje de 2-4 semanas. Al final del período de rodaje, todos los individuos obesos que perdieron por lo menos 1 kg de peso corporal se distribuyeron al azar en dos grupos de tratamiento emparejados por la pérdida de peso durante la fase de rodaje. Los individuos recibieron diariamente la administración vía IV de proteína ob humana, o bien de ratón (0,5 mg/kg/día) o bien de placebo (solución salina) durante por lo menos 6 semanas. El peso corporal se midió semanalmente . Los individuos que recibieron la proteína ob humana o de ratón experimentaron una reducción significativa en el peso corporal respecto al grupo placebo después de 6 semanas de tratamiento. EJEMPLO 19 A. Preparación de la proteína ob de células de E. coli conjugada con polietilenglicol 50 g del sedimento de células de E. coli preparado como se ha descrito en el ejemplo 8, antes de la resuspensión, se suspendieron con l litro de Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) conteniendo EDTA 5 mM. La suspensión se incubó durante 15 minutos a 37°C, se diluyó con 1 litro adicional de Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) conteniendo EDTA 5 mM. A continuación, se homogeneizó la suspensión empleando un homogeneizador durante 15 minutos ajustado al 50% de su potencia. La suspensión se clarificó mediante centrifugación a 8.000 rpm, 4°C, durante una hora. El sedimento se deshecho. El sobrenadante se diluyó con agua hasta una conductividad de 1,8 mS y se aplicó directamente a una columna rellena con 200 ml de Sepharose Q de alta fluidez (resina de intercambio iónico fuertemente aniónica) , preequilibrada con Tris-HCl 50 M (pH 8,5) . Después de lavar con el tampón de equilibrado, la proteína ob adsorbida se eluyó de la columna con el mismo tampón de equilibrado conteniendo adicionalmente NaCl 100 mM. El eluato obtenido después de tratar la columna con el tampón de equilibrado conteniendo cloruro de sodio, se llamó eluato de Sepharose Q. Se añadió NaCl sólido al eluato de Sepharose Q hasta alcanzar la conductividad final de 82 mS . Después de esto, el eluato se aplicó a una columna de interacción hidrofóbica (HIC) rellena con 200 ml de butil-Sepharose de alta fluidez, preequilibrada con Tris-HCl 50 mM (pH 8,5) conteniendo NaCl ÍM. Los materiales no adsorbidos se eliminaron por lavado con tampón de equilibrado y la proteína ob adsorbida se eluyó con acetato de amonio 50 mM (pH 6,9) para obtener el eluato de HIC. La proteína ob del eluato de HIC se analizó mediante HPLC de fase inversa dando un resultado del 95 % de pureza. La proteína ob purificada se concentró a 3,7 mg/ml empleando una membrana de tamizado molecular (YM-10) . La membrana de tamizado molecular fué una membrana que retenía moléculas de 10.000 daltons o mayores. Después de este paso de concentración, mediante el empleo de una membrana de tamizado molecular, la proteína ob se diafiltró en tampón de borato 100 mM (pH 8,0), la cual se utilizó como solución stock de ob. B. Peguilación de la proteína ob humana Para efectuar esta reacción de Peguilación se utilizó el reactivo PEG2-NHS de fórmula 11-A en donde R es CH3, la suma de n y n' oscila de 820 a 1040 siendo la suma media alrededor de 930 y teniendo un peso molecular medio de 40 kDa, pudiéndose adquirir en Shearwater Polymers, Huntsville, Alabama. Este es una mezcla de reactivos PEG2-NHS de fórmula 11-A en donde la relación de n a n' es aproximadamente de 1,0 y la suma de n y n' en esta mezcla osciló de 820 a 1040 unidades con el peso molecular medio de la cadena de PEG en esta mezcla siendo aproximadamente 20kDa de forma que el peso molecular medio del reactivo es aproximadamente 40 kDA con la suma media de n y n' en esta mezcla siendo alrededor de 930. A 2 mg ó 0, 54 ml de la solución en stock de 3,7 mg/ml de ob humana purificada preparada más arriba en la parte A [125 nmoles de proteína ob] , se añadieron 250 nmoles de la antes mencionada solución de reactivo PEG2-NHS. Esta solución consistió en 10 mg ó 0,1 ml de la solución de 100 mg/ml de reactivo PEG2-NHS en HCl l mM. La mezcla total de reacción se completó hasta 0,67 ml con adición de borato 100 mM pH 5,0. La relación molar final de proteína respecto al reactivo fue 1:2. Esta mezcla se agitó a 4°C durante 4 horas y la reacción se interrumpió mediante la adición de l µl de ácido acético glacial hasta obtener un pH final de 4,5. La mezcla de reacción resultante (0,67 mL) se diluyó con agua para formar una solución de 27 ml que se cargó en una columna conteniendo 1,7 ml de resina de intercambio catiónico carboxi metilada (Perspectives, Framingham, Massachusetts) . La columna se equilibró con tampón HEPES 3,3 µM/MES/acetato de sodio, pH 5,0. La mezcla de reacción diluida se aplicó a la columna y el reactivo PEG2-NHS sin adsorber se eliminó por lavado de la columna. Las proteínas ob peguiladas y sin modificar adsorbidas, se eluyeron con un paso de gradientes de sal [15 volúmenes de columna cada vez] de NaCl 80, 150 y 500 mM) . Se recogieron separadamente en sucesión 2 ml de estos eluatos y las muestras de cada fracción se sometieron al análisis SDS-PAGE. De este análisis los eluídos se clasificaron como conjugados altamente peguilados, la deseada proteína mono-PEG-ob ramificada (PEG2-ob) y la proteína ob sin modificar. Cada una de estas fracciones se juntó con las clasificaciones mencionadas más arriba y con el segundo grupo que contenía la proteína mono-PEG2-ob ramificada. Esta proteína deseada tenía la estructura del compuesto de fórmula I-A en donde la suma de n y n' era aproximadamente 820-1040, con la suma promedio alrededor de 930, R y R' son CH3 y el peso molecular medio de cada cadena de PEG era de alrededor de 20 kilodaltons. El producto peguilado tenía un peso molecular medio alrededor de 56 kDA. El grupo que contenía el PEG2-ob se concentró a 3,7 mg/ml empleando una membrana YM 10. La YM 10 es una membrana de tamizado molecular que retiene las moléculas con un peso molecular de 10.000 daltons o mayores. Después de un paso de tamizado, el material concentrado se diafiltró en un tampón de PBS (pH 7,3) y se guardó congelado a -20°C. Este producto almacenado fué la proteína ob peguilada de fórmula I-A en donde la suma de n y n' fué aproximadamente 820 a 1040 y el peso molecular medio de cada cadena de ob fué aproximadamente 20 kDA. El peso molecular medio de la proteína PEG en esta mezcla de conjugado de proteína ob fué de 56 kDA. EJEMPLO 20 Ensayo biológico de la proteína ob humana peguilada: Inyección IP única en ratones ob/ob Métodos Se estudiaron dos grupos de ratones ob/ob obesos hembra. Los ratones fueron alojados en jaulas de plástico (tres por jaula) en condiciones ambientales constantes con un ciclo de 12 horas de oscuridad/12 horas de luz. Cada día se midió la ingesta de alimento en 24 horas y el peso corporal. Después de un período de adaptación a las condiciones ambientales, manipulación diaria e inyecciones, los ratones fueron repartidos en dos grupos de tratamiento. Cada ratón recibió una inyección intraperitoneal (IP) el día 1 del experimento (justo antes del principio de la fase oscura del ciclo de oscuridad/luz) de 0,1 ml de las siguientes soluciones: solución salina (0,9%); solución de stock de proteína ob humana preparada en la parte A del ejemplo 19 (30 µg 0,1 ml) ,-solución de control peguilada (una muestra idénticamente elaborada y purificada sin proteína ob humana) o proteína ob peguilada (30 µg/0,1 ml) preparada como se ha descrito en el ejemplo 19. Los ratones fueron inyectados solamente una vez el día 1. Se midió la ingesta de alimento de la jaula y el peso corporal de cada ratón durante los siguientes tres días y de nuevo el día 6. Resultados A) Reducción de la ingesta de alimento La ingesta de alimento diaria no fué distinta en los ratones inyectados con solución salina y con control de peguilación en el tratamiento único y los dos días siguientes (tabla 5) . Sin embargo, la ingesta diaria se redujo en los seis ratones inyectados con 30 µg de proteína ob humana y proteína ob humana peguilada en el día de tratamiento (5,2, 8,2 frente a 11,9, 11,4) comparado con los ratones inyectados con solución salina y con control peguilado. La ingesta de alimento de los ratones inyectados con proteína ob humana volvió a los niveles de control, mientras que la ingesta de alimento de los ratones inyectados con proteína ob humana peguilada permaneció reducida los días subsiguientes del experimento. La reducción de la ingesta de alimento fué observada 48 horas después de la inyección única en el grupo de la proteína ob humana peguilada. La ingesta de alimento acumulada en 24 horas durante los tres días del experimento se redujo significativamente al 49% del control en la proteína ob humana peguilada en comparación con el grupo de solución salina y control de Peguilación. B) Reducción de la ganancia de peso corporal El cambio de peso corporal no fué diferente en los ratones inyectados con solución salina y con control de peguilación en el tratamiento único y dos días siguientes (tabla 6) . Sin embargo, el peso corporal se redujo en seis ratones inyectados con 30 µg de proteína ob humana y proteína ob humana peguilada en el día de tratamiento (-0,9, -0,7 frente a 0,1, 0,3 g) en comparación con los ratones inyectados con solución salina y control peguilado. El peso corporal de los ratones inyectados con proteína ob humana volvieron a los niveles de control, mientras que el peso corporal de los ratones inyectados con la proteína ob humana peguilada continuaron disminuyendo en los días siguientes del experimento. La continuada reducción del peso corporal se observó 48 horas después de la inyección única en el grupo de la proteína ob humana peguilada. El cambio acumulado de peso corporal durante los seis días del experimento fué de -1,6 gramos en comparación con 0,4 gramos en el grupo de la proteína ob, 0,7 gramos en la solución salina y 1,1 + 0,2 gramos en los grupos de control de peguilación (tabla 6) . Conclusión Este ejemplo demuestra que la inyección IP única de proteína ob humana peguilada (30 µg/ratón) dio como resultado una reducción significativa, sostenida, de la ingesta de alimento y un significativo descenso del peso corporal de los ratones ob/ob hembras tratados durante tres días en comparación con ratones ob/ob tratados con solución salina y control de peguilación. Estos resultados demuestran que la proteína ob humana peguilada se ha mantenido potente biológicamente activa y tiene los efectos esperados de antiobesidad sobre ratones ob/ob genéticamente obesos. Tabla 5: Ingesta diaria de alimento de una única administración IP de proteína ob humana peguilada en ratones ob/ob. Tratamiento Ingesta de alimento (3 ratones/día) día 1 día 2 día 3 g % de g % de g % de control control control Sol. salina 11,9 100 13,7 100 13,6 100 proteína ob 5,2 43,7 11,7 85,4 12,5 92 Control peguilado 11,4 95,8 4,5 106 13,4 99 proteína ob peguilada 8,2 68,9 6,0 43,8 4,9 36 Los datos son la media para seis ratones ob/ob en cada grupo. La ingesta de alimento es la media de la ingesta diaria de alimento para jaulas de tres ratones en cada día del experimento después de la inyección IP única en el día 1. Nótese la persistente reducción en la ingesta diaria de alimento solamente en el grupo de la proteína ob peguilada. Tabla 6 : Cambio del peso corporal de ratones ob/ob con la administración IP única de la proteína ob humana peguilada Tratamiento Cambio de peso corporal (gramos) día 1 día 2 día 3 día 4 Sol . salina 0,1 0,6 0,01 -0,01 proteína ob -0,9 1,1 0,2 ND Control peguilado 0,3 0,4 0,6 -0,2 proteína ob peguilada -0,7 -0,6 -0,9 0,6 Los datos son la media para seis ratones ob/ob. Los ratones recibieron una inyección IP única el día 1. El cambio en el peso corporal es el cambio en el peso corporal de cada uno de los días del experimento. Nótese la persistente pérdida de peso solamente en el grupo de la proteína ob peguilada. ND en la tabla significa no determinado.

RELACION DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG (B) CALLE: Grenzacherstrasse 124 (C) CIUDAD: Basilea (D) ESTADO: BS (E) PAÍS: Suiza (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : CH-4070 (G) TELEFONO: 061 - 688 42 56 (H) TELEFAX: 061 - 688 13 95 (I) TELEX: 962292/965542 hlr ch (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: proteínas de la obesidad (ob) recombinantes (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 8 (iv) FORMA LEGIBLE DEL COMPUTADOR: (A) TIPO MEDIO: Disco flexible (B) ORDENADOR: Apple Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: Sistema 7.1 (Macintosh) (D) PROGRAMA: Word 5.0 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:l: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 702 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) INSENSIBILIZANTE: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:l: CAAGGTGCAA GAAGAAGAAG ATCCCAGGGA GGAAAATGTG CTGGAGACCC CTGTGTCGGT 60 TCCTGTGGCT TTGGTCCTAT CTGTCTTATG TTCAAGCAGT GCCTATCCAG AAAGTCCAGG 120 ATGACACCAA AACCCTCATC AAGACCATTG TCACCAGGAT CAATGACATT TCACACACGC 180 AGTCGGTATC CGCCAAGCAG AGGGTCACTG GCTTGGACTT CATTCCTGGG CTTCACCCCA 240 TTCTGAGTTT GTCCAAGATG GACCAGACTC TGGCAGTCTA TCAACAGGTC CTCACCAGCC 300 TGCCTTCCCA AAATGTGCTG CAGATAGCCA ATGACCTGGA GAATCTCCGA GACCTCCTCC 360 ATCTGCTGGC CTTCTCCAAG AGCTGCTCCC TGCCTCAGAC CAGTGGCCTG CAGAAGCCAG 420 AGAGCCTGGA TGGCGTCCTG GAAGCCTCAC TCTACTCCAC AGAGGTGGTG GCTTTGAGCA 480 GGCTGCAGGG CTCTCTGCAG GACATTCTTC AACAGTTGGA TGTTAGCCCT GAATGCTGAA 540 GTTTCAAAGG CCACCAGGCT CCCAAGAATC ATGTAGAGGG AAGAAACCTT GGCTTCCAGG 600 GGTCTTCAGG AGAAGAGAGC CATGTGCACA CATCCATCAT TCATTTCTCT CCCTCCTGTA 660 GACCACCCAT CCAAAGGCAT GACTCCACAA TGCTTGACTC AA 702 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 167 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADENA: no (D) TOPOLOGÍA: desconocida ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : péptido ( iii ) HIPOTÉTICA : NO ( iv) INSENSIBILIZANTE : NO (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 2 : Met Cys Trp Arg Pro Leu Cys Arg Phe Leu Trp Leu Trp Ser Tyr Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Gln Ala Val Pro lie Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu lie Lys Thr lie Val Thr Arg lie Asn Asp lie Ser His Thr 35 40 45 Gln Ser Val Ser Ala Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe l e Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro lie Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln Val Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln 85 90 95 lie Ala Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro 115 120 125 Glu Ser Leu Asp Gly Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu G n Gly Ser Leu Gln Asp lie Leu Gln G n 145 150 155 160 Leu Asp Val Ser Pro Glu Cys 165 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 146 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADENA: no (D) TOPOLOGÍA: desconocida ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : péptido ( iii ) HIPOTÉTICA : NO ( iv) INSENSIBILIZANTE : NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 3 : Val Pro lie Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu lie Lys Thr 1 5 10 15 lie Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ala 20 25 30 Lys Gln Arg Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro lie 35 40 45 Leu Ser Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln Val 50 55 60 Leu Thr Ser Leu Pro Ser Gln Asn Val Leu Gln He Ala Asn Asp Leu 65 70 75 80 Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95 Ser Leu Pro Gln Thr Ser Gly Leu Gln Lys Pro Glu Ser Leu Asp Gly 100 105 110 Val Leu Glu Ala Ser Leu Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125 Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp He Leu Gln Gln Leu Asp Val Ser Pro 130 135 140 Glu Cys 145 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 690 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) INSENSIBILIZANTE: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4: GTTGCAAGGC 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HIPOTÉTICA: NO (iv) INSENSIBILIZANTE: NO (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEQ ID NO : 5 : Met His Trp Gly Thr Leu Cys Gly Phe Leu Trp Leu Trp Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Phe Tyr Val Gln Ala Val Pro He Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys 20 25 30 Thr Leu He Lys Thr He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr 35 40 45 Gln Ser Val Ser Ser Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro 50 55 60 Gly Leu His Pro He Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala 65 70 75 80 Val Tyr Gln Gln He Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gln 85 90 95 He Ser Asn Asp Leu Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala 100 105 110 Phe Ser Lys Ser Cys His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu 115 120 125 Asp Ser Leu Gly Gly Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val 130 135 140 Val Ala Leu Ser Arg Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln 145 150 155 160 Leu Asp Leu Ser Pro Gly Cys 165 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO : 6 : ( i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 146 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (C) CADENA : no (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) INSENSIBILIZANTE: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 6 : Val Pro He Gln Lys Val Gln Asp Asp Thr Lys Thr Leu He Lys Thr 1 5 10 15 He Val Thr Arg He Asn Asp He Ser His Thr Gln Ser Val Ser Ser 20 25 30 Lys Gln Lys Val Thr Gly Leu Asp Phe He Pro Gly Leu His Pro He 35 40 45 Leu Thr Leu Ser Lys Met Asp Gln Thr Leu Ala Val Tyr Gln Gln He 50 55 60 Leu Thr Ser Met Pro Ser Arg Asn Val He Gln He Ser Asn Asp Leu 65 70 75 80 Glu Asn Leu Arg Asp Leu Leu His Val Leu Ala Phe Ser Lys Ser Cys 85 90 95 His Leu Pro Trp Ala Ser Gly Leu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Gly Gly 100 105 110 Val Leu Glu Ala Ser Gly Tyr Ser Thr Glu Val Val Ala Leu Ser Arg 115 120 125 Leu Gln Gly Ser Leu Gln Asp Met Leu Trp Gln Leu Asp Leu Ser Pro 130 135 140 Gly Cys 145 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 63 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADENA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) INSENSIBILIZANTE: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: ATGAAAAAGA CAGCTATCGC GATTGCAGTG GCACTGGCTG GTTTCGCTAC CGTAGCGCAG 60 GCC 63 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADENA: no (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (iii) HIPOTÉTICA: NO (iv) INSENSIBILIZANTE: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 8 : Met Lys Lys Thr Ala He Ala He Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala 20 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (38)

REIVINDICACIONES

1. Proteína obesa humana homogénea y biológicamente activa o su fragmento, caracterizada porque el fragmento tiene la actividad biológica de dicha proteína .

2. La proteína o fragmento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la actividad biológica de dicha proteína o fragmento se caracteriza por reducir la ingesta de alimentos en mamíferos y reducir la proporción de ganancia de peso en mamíferos .

3. La proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende la SEQ ID NO: 6.

4. Proteína obesa humana recombinante y biológicamente activa exenta de otras proteínas de mamífero o su fragmento, caracterizada porque el fragmento tiene la actividad biológica de dicha proteína.

5. La proteína o fragmento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque la actividad biológica de dicha proteína se caracteriza por reducir la ingesta de alimentos en mamíferos y reducir la proporción de ganancia de peso en mamíferos.

6. La proteína de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque comprende la SEQ ID NO: 6.

7. Proteína obesa murina homogénea y biológicamente activa o su fragmento, caracterizada porque el fragmento tiene la actividad biológica de dicha proteína.

8. La proteína o fragmento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la actividad biológica de dicha proteína o fragmento se caracteriza por reducir la ingesta de alimentos en mamíferos y reducir la proporción de ganancia de peso en mamíferos.

9. La proteína de conformidad con la reivindicación 7,' caracterizada porque comprende la SEQ ID NO: 3.

10. Proteína obesa murina recombinante y biológicamente activa exenta de otras proteínas de mamífero o sus fragmentos, caracterizada porque el fragmento tiene la actividad biológica de dicha proteína.

11. La proteína de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la actividad biológica de dicha proteína se caracteriza por reducir la ingesta de alimentos en mamíferos y reducir la proporción de ganancia de peso en mamíferos.

12. La proteína de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende la SEQ ID NO : 3.

13. Un vector de expresión, caracterizado porque comprende : a) una secuencia promotora, y b) una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión, cuya proteína de fusión comprende la proteína ob murina de la SEQ ID NO: 3 o la proteína ob humana de la SEQ ID NO: 6, y el péptido de señal para la proteína de membrana externa A de E. coli , cuyo vector de expresión es capaz de expresar la proteína de fusión en células huésped de Escherichia coli .

14. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia promotora está constituida por un lac-promotor operador y un promotor de lipoproteína .

15. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende la proteína obesa murina o la proteína obesa humana, y el péptido de señal para la proteína de membrana externa A de Escherichia coli .

16. Una proteína de fusión de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque la proteína obesa murina comprende la SEQ ID NO: 3 y en donde la proteína obesa humana comprende la SEQ ID NO : 6.

17. Una secuencia de ADN, caracterizada porque comprende una primera y segunda parte, en donde: (a) la primera parte es la secuencia genética sOmpA de la SEQ ID NO: 7 que codifica el péptido sOmpA; y (b) la segunda parte es la secuencia nucleótida que codifica la proteína ob murina o la secuencia nucleótida que codifica la proteína ob humana.

18. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la proteína ob murina comprende la SEQ ID NO : 3.

19. La secuencia de ADN de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la proteína ob humana comprende la SEQ ID NO: 6.

20. Un organismo huésped de Escherichia coli transformado con el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 13.

21. Un método para producir proteína obesa humana o murina recombinante y biológicamente activa exenta de otras proteínas de mamífero, caracterizado porque comprende las etapas de: a) construir un vector de expresión que tiene una secuencia promotora, y una secuencia de ADN que codifica una proteína de fusión, cuya proteína de fusión comprende la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 6, y el péptido de señal para la proteína de membrana externa A de E . col i ; b) insertar el vector de expresión en una célula huésped de E. coli para transformar la célula huésped de E . col i ; c) expresar la proteína de fusión en la célula huésped de E. coli ; y d) tratar la célula huésped de E. col i con tampón de shock osmótico frío para liberar la proteína ob murina o humana de otras proteínas de mamífero y exenta del péptido de señal .

22. La secuencia de gen ob humana, caracterizada porque comprende la SEQ ID NO: 4.

23. Un método para producir proteína obesa humana o murina recombinante, homogénea y biológicamente activa, caracterizado porque comprende someter el fluido osmótico que contiene la proteína obesa humana o murina a una combinación de cromatografía de columna de intercambio de aniones, cromatografía de columna de interacción hidrofóbica y filtración de gel.

24. Una composición, caracterizada porque comprende uno o más conjugados de polietilenglicol y/o polipropilenglicol enlazado (s) a una proteína ob humana o murina, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, estando la proporción de peso molecular de las unidades de polietilen o polipropilenglicol en dichos conjugados dentro de dicha composición entre 15 kDa y 60 kDa.

25. Una composición, caracterizada porque comprende uno o más conjugados de la fórmula ROCH2CH2(OCH2CH2)? O C- -NH (CH2)4 I-A en donde P es una proteína ob humana o murina de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, n y n' son números enteros que tienen una suma de 300 a 1500,- estando comprendida la relación de peso molecular de las unidades de polietilenglicol en dichos conjugados dentro de dicha composición entre 15 kDa y 60 kDa, y R y R' son alquilo inferior.

26. Una composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la suma de n y n' es de alrededor de 800 a 1200 y estando comprendido el peso molecular medio de las unidades de polietilenglicol en dicho conjugado dentro de dicha composición entre 35 y 45 kDa.

27. Una composición, caracterizada porque comprende uno o más conjugados de la fórmula: O RO(CH2CH2O)nCH2 CH2 •NH- I-B en donde P es una proteína ob humana o murina de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, n es un número entero que tiene una suma de 300 a 1500, estando comprendido el peso molecular medio de las unidades de polietilenglicol en dichos conjugados dentro de dicha composición entre 15 kDa y 60 kDa, y R es alquilo inferior.

28. Una composición de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque n tiene un valor entre alrededor de 850 a 1000 y estando comprendido el peso molecular medio de las unidades de polietilenglicol en dichos conjugados dentro de dicha 'composición entre 35 y 45 kDa.

29. La proteína humana o murina, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12 o una composición de conformidad con las reivindicaciones 24-28 en calidad de agentes terapéuticamente activos.

30. La proteína ob humana o murina, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12 o una composición de conformidad con las reivindicaciones 24-28 como agentes terapéuticamente activos para el tratamiento, prevención y control de obesidad y enfermedades asociadas.

31. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una proteína humana o murina, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12 o una composición de conformidad con las reivindicaciones 24-28 y un material de vehículo farmacéuticamente aceptable compatible.

32. El empleo de una proteína ob humana o murina, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12 o una composición de conformidad con las reivindicaciones 24-28 para la preparación de composiciones farmacéuticas.

33. El empleo de proteína ob humana o murina, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12 o una composición de conformidad con las reivindicaciones 24-28 para la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento, prevención y control de obesidad y enfermedades asociadas .

34. El empleo de proteína ob humana o murina, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12 para identificar receptor (es) de proteínas ob.

35. El empleo de un vector de expresión de conformidad con las reivindicaciones 13 y 14 para producir proteína ob humana o murina de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12.

36. El empleo de una secuencia de ADN de conformidad con las reivindicaciones 17 a 19 para producir proteína ob humana o murina, de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12.

37. El empleo del organismo huésped de Escherichia col i para producir proteína ob humana o murina de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12.

38. Proteína ob humana o murina recombinante, homogénea y biológicamente activa, siempre que se prepare con un procedimiento de conformidad con la reivindicación 21 ó 23.