MXPA94005661A

MXPA94005661A - Inhibidores de triptasa

Info

Publication number: MXPA94005661A
Application number: MXPA/A/1994/005661A
Authority: MX
Inventors: Fritz Hans; P Sommerhoff Christian
Original assignee: Fritz Hans; P Sommerhoff Christian; Ucp Genpharma Ag
Priority date: 1993-07-26
Filing date: 1994-07-25
Publication date: 2000-07-01

Abstract

La presente invención se refiere a novedosos inhibidores de triptasa humana, a su aislamiento a partir de sanguijuelas, a secuencias de nucleótido que codifican las novedosas moléculas inhibidoras o fragmentos de las mismas, a vectores que contienen la secuencia codificadora para las mismas, a células huéspedes transformadas con estos vectores, a la producción recombinante de los inhibidores, a composiciones farmacéuticas que contienen las novedosas moléculas inhibidoras, y a su uso en el diagnóstico y la terapia.

Description

INHIBIDORES DE TRIPTASA INVENTORES: HAMS FRITZ y CH SSTIAN P. SOMMÜ-RHOFF. ciudadanos Alemanes, con domicilio ßn Am Bucket 33, D-82057 Icking, Alemania* y Dßnníngßr Str. 146, D-81927 Münchßn, Al emania .

CAUSAHABIENTE: UCP G1N-PHA1MA AT, una sociedad Suiza, con domicilio en Kraftstraße 6, CH - 8044 Zürich, EXTRACTO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a novedosos inhibidores de triptasa humana, a su aislamiento a partir de sanguijuelas, a secuencias de nucleótido que codifican las novedosas moléculas inhibidoras o fragmentos de las m -.sirias, a vectores que contienen la secuencia codificadora para las mismas, a células huéspedes transformadas con estos vectores, a la producción recoinbinante de los inhibidores, a composiciones farmacéuticas que contienen las novedosas moléculas inhibidoras, y a su uso en el diagnóstico y la terapia.

* * * * * La presente invención se refiere a novedosos inhibidores de triptasa humana, a su aislamiento a partir de sanguijuelas, a secuencias de nucleótido que codifican las novedosas moléculas inhibidoras o fragmentos de las mismas, a vectores que contienen la secuencia codificadora para las mismas, a células huéspedes transformadas con estos vectores, a la producción recombinante de los inhibidores, a composiciones farmacéuticas que contienen las novedosas moléculas inhibidoras, y a su uso en el diagnóstico y la terapia. La triptasa es un miembro tetramérico de la familia de las proteinasas de serina en forma de tripsina. La triptasa se expresa virtualmente exclusivamente por las células sebadas [Castells Irani, 1987] y se almacena en grandes cantidades en sus granulos secretorios, que constituyen aproximadamente el 23 por ciento de la proteína celular total [Schwartz Lewis A-usten, 1981]. Enseguida de la activación de las células sebadas, la triptasa se libera rápidamente hacia el espacio extracelular, junto con otros mediadores preformados (por ejemplo, histamina, quimasa, y proteoglicanos) [Schwartz Lewis Seldin, 1981; Caughey Lazarus, 1988]. Se han descubierto niveles elevados: ° en el plasma de los pacientes con mastocitosis, después de anafilaxis sistémica [Schwartz Metcalfe, 1987; Schwartz Yunginger, 1989], y durante la respuesta sistémica después de la agresión con aspirina de pacientes con asma sensible a la aspirina [Bosso Schwartz, 1991], 0 en el fluido de lavado broncoalveolar de pacientes con asma [Broide Gleich, 1991; Bousquet Chanez, 1991; enzel Fowler, 1988], en las enfermedades intersticiales del pulmón [Walls Bennett, 1991] , y después de la agresión con antígeno de pacientes alérgicos [Castells, 1988; Butrus, 1990], ° en el fluido de ampollas de la piel después de agresión con antlgeno cutáneo en pacientes con enfermedad de la piel atópica y alérgica [Shalit Schwartz, 1990; Atkins Schwartz, 1990], 0 en el fluido de lavado nasal después de una agresión con antígeno local de pacientes con rinitis alérgica de temporada [Juliusson Holmberg, 1991], ° en el fluido crevicular de pacientes con gingivitis y periodontitis [Cox Eley, 1989, J. Period Res; Eley Cox, 1992, J Dent] , y 0 en la piel lesional de pacientes con psoriasis [Harvima Nauk arinen, 1989]. Los estudios in vitro han proporcionado una evidencia considerable de que la triptasa está directamente involucrada en la patogénesis de desórdenes relacionados con las células sebadas. Por ejemplo, se ha sugerido la triptasa como un mediador patsgenético de asma, ya que incrementa la contractilidad del músculo liso de las vías aéreas [Sekizawa, 1989], e inactiva el péptido intestinal vasoactivo, destruyendo de esta manera su potente acción broncodilatadora [Tam Caughey, 1990; Tam Franconi, 1990; Franconi, 1989]. En adición, se ha demostrado que la triptasa es un potente mitógeno para fibroblastos, sugiriendo su involucración en la fibrosis pulmonar en asma y enfermedades intersticiales del pulmón [Ruoss Hartmann, 1991; Hartmann Ruoss, 1992]. La triptasa también se ha implicado en la patogénesis de artritis y enfermedades periodontales, ya que activa la prostomelisina (= MMP-3) , que a su vez activa la colagenasa, iniciando de esta manera la destrucción del cartílago y del tejido conectivo periodontal, respectivamente [Gruber Márchese, 1989; Gruber Schwartz, 1990;] Cox Eley, 1989, J Period Res; Eley Cox, 1992, J Dent] . La triptasa también puede promover desórdenes de la coagulación sanguínea, mediante la inactivación de la función procoagulante de quininógeno de alto peso molecular [Maier Spragg, 1983] y mediante la disociación del fibrinógeno [Schwartz Bradford Litt an, 1985]. La triptasa humana es virtualmente única entre las proteinasas de serina, ya que es completamente activa catalíticamente en el plasma y en el espacio extracelular [Schwartz Bradford, 1986; Goldtein Leong, 1992]. La triptasa no es inhibida por las antiproteinasas que se presentan naturalmente que regulan la actividad de otras proteinasas de serina en forma de tripsina, tales como el inhibidor de proteinasa de moco (=antileucoproteasa ó HUSI-I) , antitrombina III, inhibidor de alfa1-proteinasa, al inhibidor de alfa2-macroglobulina, ó inhibidor de ^-esterasa [Alter Kra ps, 1990; Smith Hougland, 1984; Schwartz Bradford, 1986; Harvima Schechter, 1988; Cromlish Seidah, 1987], Además, aunque se ha conocido la triptasa durante más de 10 años, todavía no se han descrito inhibidores derivados a partir de especies no humanas, o producidos mediante tecnologías de síntesis de péptidos o recombinantes. Por consiguiente, la triptasa no es afectada por la hirudina [Alter Kramps, 1990], aprotinina, inhibidor ovomucoide, inhibidor de tripsina de frijol de soya y frijol de lima [Butterfield Weiler, 1990; Cromlish Seidah, 1987; Harvima Schechter, 1988], ecotina [Chung Ivés, 1983], y el dominio de Kunitz-recombinante de la proteína precursora de beta-a iloide de Alzheimer [Sinha Dovey, 1990]. Aunque la triptasa es inhibida por los inhibidores generales de las proteinasas en forma de tripsina, tales como fluorofosfato de diisopropilo, fluoruro de fenilmetilsulfonilo, y clorometilcetona de tosil-L-lisina [Smitch Hougland, 1984; Harvima Shechter, 1988], estos compuestos son inadecuados para las aplicaciones en vivo, e inclusive para la mayoría de las aplicaciones in vitro, debido a su alta toxicicidad y/o baja estabilidad. Además, los únicos inhibidores diferentes que se sabe que afectan a la triptasa, los aldehidos de péptido-arginina, leupeptina y antipaína [Cromlisch Seidah, 1987], y ciertos derivados de benzamidina [Stürzebecher Prasa, 1992; Caughey, 1993] son de una utilidad limitada, ya que son relativamente no específicos, y/o inhiben la triptasa solamente con afinidades moderadas (valores K? para los complejos en la escala micromolar) . El problema de la presente invención, por consiguiente, es proporcionar un inhibidor potente y eficiente de la triptasa de proteinasa humana. Como se ilustra con mayor detalle más adelante, el presente problema se puede resolver proporcionando un polipéptido inhibidor que se puede obtener a partir de la sanguijuela médica Hirudo medicinalis . Breve descripción de las figuras: Figura 1: aislamiento de los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela, mediante cromatografía de intercambio de cationes utilizando SP-Sephadex. Se aplicó el extracto de sanguijuela dializado, y la columna se lavó hasta que la absorción del efluyente regresó a la línea base. La desorción se logró con 20 mM de NaP, 500 mM de NaCl (pH de 8.0). Se agruparon las fracciones que contenían el material activo inhibidor (marcado con una barra) . Figura 2: Cromatografía de afinidad de los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela utilizando anhidrotripsina-Sepharose. Se aplicó el eluato agrupado de la cromatografía de SP-Sephadex, la columna se lavó extensamente y se eluyó con 100 mM de KC1/HC1 (pH de 2.1). Las fracciones que contenían el material activo inhibidor (marcadas con una barra) , se recolectaron y se neutralizaron inmediatamente mediante la adición de 1 M de Tris. Figura 3: Cromatografía de intercambio de cationes de los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela, utilizando una columna Mono S FPLC. Después de la diálisis contra 20 M de NaP (pH de 8.0), se aplicó el eluato agrupado desde la cromatografía de afinidad de anhidrotripsina, se lavó la columna, y se eluyó utilizando un gradiente lineal de 60 a 240 M de NaCl. Se agruparon las fracciones que contenían el material activo inhibidor (marcado con una barra) . Figura 4: SDS-PAGE de los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela aislada bajo condiciones reductoras. Pista 1 = extracto de sanguijuela dializado; pista 2 =: eluato de la columna de SP-Sephadex; pista 3 = eluato de la cromatografía de afinidad de anhidrotripsina; pista 4 = eluato de la cromatografía de intercambio de cationes Mono S. Los marcadores de peso molecular (pista 5) son de arriba hacia abajo: ovalbúmina (43 kD) , anhidrasa carbónica (29 kD) , ß-lactoglobulina (18.4 kD) , lisozima (14.3 kD) , inhibidor de tripsina bovina (6200 D) , y ß-cadena de insulina (3400 D) . Figura 5: HPLC de fase inversa de los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela aislada. El tiempo de elución y la absorción del efluyente en 206 nanómetros, se dan sobre la abscisa y la ordenada, respectivamente. Los dos picos demuestran la presencia de cuando menos dos formas. Figura 6: fragmentación tríptica de las dos especies de inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela, separadas mediante HPLC de fase inversa (ver la Fiqura 5) . Trazo inferior: trazo de HPLC de la digestión tríptica del pico que se eluye a los 25 minutos en la Figura 5; Trazo superior: trazo de HPLC de la digestión tríptica del pico que se eluye a los 29 minutos. Los perfiles de elución difieren solamente en los picos que representan los péptidos de terminal C (marcados por las flechas) . Figura 7: Espectroscopia de masa de las dos especies de inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela, separadas mediante HPLC (ver la Figura 5) . a) el espectro de masa del pico de HPLC que se eluye a los 25 minutos, demuestra la presencia de dos formas con una masa de 4340 (forma A; picos izquierdos) , y 4396 (forma B; picos derechos) , respectivamente. b) el espectro de masa del pico de HPLC que se eluye a los 29 minutos, muestra una tercera forma (forma C) , con una masa de 4738. Figura 1: Determinación de secuencia de los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela. Las barras representan los fragmentos traslapados utilizados para deducir la secuencia de aminoácidos. Las barras sólidas denotan la secuencia obtenida a partir del tipo de HPLC que se eluye a los 25 minutos (ver la Fiqura 5) , y la barra cruzada denota la secuencia adicional obtenida a partir del pico de HPLC que se eluye a los 29 minutos. N-terminal = secuencia obtenida a partir del inhibidor nativo; Red/T = secuencia obtenida después de la reducción y la fragmentación tríptica; Ox/T/ChT = secuencia obtenida después de la oxidación y la fragmentación tríptica/quimotríptica . Figura 9: Inhibición de triptasa humana mediante los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela. La triptasa (0.59 nM) se preincubó con concentraciones crecientes de los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela (0-40 nM) a 37 °C durante 25 minutos, y la reacción se inició mediante la adición del sustrato tos-Gly-Pro-Arg-pNa. Las velocidades de estado continuo resultantes se midieron durante 3.5 minutos. Los valores dados son el cociente de la velocidad en la presencia del inhibidor, dividido entre la velocidad en ausencia del inhibidor.

Figura 10: Efecto de los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela sobre la disociación inducida por triptasa del péptido intestinal vasoactivo (VIP) . El VIP se incubó con triptasa en la presencia de concentraciones crecientes de los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela. Posteriormente, la cantidad de VIP disociada se cuantifico mediante HPLC de fase inversa. Los valores dados son el cociente de la velocidad en la presencia del inhibidor dividido entre la velocidad en ausencia del inhibidor. Figura 11: Diseño, DNA y secuencia de aminoácidos del gen de forma C rLDTI sintético. (a) Diseño del gen maestro de forma C rLDTI sintético. Se muestran los sitios de restricción introducidos. (b) Nucleótido y secuencia de aminoácidos correspondiente del gen maestro de forma C rLDTI . Los corchetes y los números indican los oligonucleótidos sintéticos utilizados para ensamblar el gen. (c) Modificación del gen maestro de forma C rLDTI mediante mutagénesis de cartucho. Figura 12: (a) Mapa de plásmido de pRM 5.1.5. (b) Vector de expresión pRM 9.1.4. Se ligó un gen sintético para rLDTI-for a C en un vector de secreción de levadura purificado pVT102U/a, se disoció con Xbal y HindIII. Las flechas indican la dirección de la transcripción; ADH-p, el promotor del gen ADH1; mat, el gen líder de factor de acoplamiento a; ADH-t, la región 31 del gen ADH1, incluyendo una señal terminadora de transcripción; Ura-3, el gen Ura; amp-R, el gen de resistencia a la ampicilina; el E.coli ori, levadura ori (2µ-ori) , y la región intergénica del fago fl (fl-ori) . Figura 13: Análisis SDS/PAGE del sobrenadante de fermentación y forma C rLDTI purificada pista 1 - marcadores de baja masa molecular; pista 2 = sobrenadante de fermentación de la cepa de levadura H005 después de 96 horas de cultivo (80 µl) ; pista 3 = rLDTI forma C purificada (2 µg) . Figura 14: Análisis de HPLC de rLDTI-for a C purificada. HPLC de fase inversa sobre una columna RP 18, que se realizó con 7.4 nanomoles (35 microgramos) de inhibidor purificado. Se formó un gradiente lineal del 0 al 60 por ciento (por volumen) de acetonitrilo, desde el 0.1 por ciento (por volumen) de ácido trifluoroacético en acetonitrilo, y se utilizó el 0.1 por ciento (por volumen) de ácido trifluoroacético. La velocidad de flujo se ajustó a 1.0 mililitros/minuto, y la absorbencia en el efluyente se supervisó en 206 nanómetros. Figura 15: Mapa de plásmido del vector de expresión pRM 3.1.10. Figura 16: Mapa de plásmido del vector de expresión pRM 4.1.4. Figura 17: Mapa de plásmido del vector de expresión pRM 11.1.4. De conformidad con una primera modalidad, la presente invención se refiere a moléculas inhibidoras purificadas de triptasa humana. Los inhibidores novedosos son polipéptidos que se pueden obtener a partir de extractos de sanguijuelas, como por ejemplo, la sanguijuela médica Hirudo medicinalis . La presente invención también se refiere a los equivalentes funcionales de las moléculas inhibidoras que muestran actividad inhibidora de triptasa, y a las sales farmacéuticamente aceptables de los inhibidores. Las moléculas inhibidoras de la presente invención se caracterizan por su capacidad para inhibir la triptasa humana con un valor K¿ en la escala de aproximadamente 0.1 a 10 nM, dejando a las proteasas involucradas en la cascada de coagulación sanguínea humana, eustancialmente sin afectarse. De preferencia, se proporcionan inhibidores de triptasa que se caracterizan por la siguiente secuencia de aminoácidos (posición 1: aminoácido N-terrainal Lys) : Lys-Lys-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Lys-Ile-Leu 10 Lys-Pro-Val-Cys-Gly-Ser-Asp-Gly-Arg-Thr 20 Tyr-Ala-Asn-Ser-Cys-Ile-Ala-Arg-Cys-Asn 30 Donde X = H (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1) , Gly (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA:2) ó Gly-Ile-Leu-Asn (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3 ) . La presente invención también abarca variantes genéticas, alelos ó equivalentes funcionales de la secuencia anteriormente mencionada, de la cual se sustituyen uno ó más de los aminoácidos (conservadora ó no conservadora) , o se suprimen, ó a la cual se le agregan uno ó más aminoácidos sin afectar sustancialmente la actividad inhibidora de la triptasa. Las sustituciones conservadoras abarcan, por ejemplo, sustituciones dentro de los siguientes grupos de aminoácidos (código de una letra): G,A; V,I,L; D,E; N,Q; K,R; y S,Y,N. De preferencia, la adición o supresión de aminoácidos se realiza en el extremo N- y/o C-terminal de la secuencia anteriormente mencionada. Los equivalentes funcionales con una especificad alterada y/o mejorada, y/o una eficiencia inhibidora, pueden ser preparados fácilmente por una persona de una experiencia ordinaria, aplicando los métodos usuales de síntesis de péptidos, o aplicando métodos bien conocidos en el campo de la biología molecular, como por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, o mutagénesis no dirigida (por ejemplo, utilizando un sistema de despliegue visual de fago) . Los equivalentes funcionales del inhibidor de la presente invención son, por ejemplo, los que comprenden la secuencia de aminoácidos: R1-Cys-Pro-Lys-Ile-Leu Lys-Pro-Val-Z-Gly-Ser-Asp-Gly-Arg-Thr Tyr-Ala-Asn-Ser-Cys-Ile-Ala-R2 en donde: el residuo N-terminal R1 representa Ala- ó Cys-Ala-; el residuo N-terminal R2 representa -Arg ó -Arg-Cys; Z define cualquier, de preferencia cualquier aminoácido que se presente naturalmente. Más aún, basándose en la descripción de la presente invención, una persona de una experiencia ordinaria podrá preparar fragmentos de las formas naturales del inhibidor, mostrando todavía la actividad inhibidora de triptasa deseada. Las formas que se presentan naturalmente de las moléculas inhibidoras reivindicadas, pueden aislarse a partir de sanguijuela, de preferencia la sanguijuela médica Hirudo medicinalis , o se pueden preparar mediante síntesis de péptidos ó tecnología de DNA recombinante. De conformidad con un aspecto adicional de la presente invención, se diseñó, se clonó, y se expresó un gen sintético que codifica para la forma C (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3) del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela (LDTI-C) , en Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae . El fragmento codificador se ensambló por medio de 6 oligonucleótidos, contiene secuencias enlazadoras, codones de detención, y sitios de reconocimiento seleccionados para otras modificaciones, por ejemplo, mediante mutagénesis de cartucho. La fuerte expresión del inhibidor de forma C recombinante (rLDTI-C) se encontró utilizando el vector de secreción de Saccharomyces cerevisiae pVT102U/alfa, y la cepa S-78. El material secretado se aisló mediante centrifugación y filtración de flujo cruzado, y se purificó adicionalmente mediante cromatografía de intercambio de cationes, es inhibitoriamente activo, y aproximadamente 85 por ciento puro. El secuenciamiento de aminoácidos mostró que el rLDTI-C se procesa de una manera predominantemente correcta en la unión entre el péptido líder del factor de acoplamiento alfa y los primeros aminoácidos de LDTI-C; solamente se detectaron cantidades menores de formas truncadas. El espectro lejano UV-CD de la molécula recombinante es típico para una proteína doblada que contiene elementos estructurales secundarios. La masa molecular del material purificado mediante HPLC es de 4738 + 4 Da, determinada mediante espectrometría de masa de ionización de electropulverización. El rLDTI-C exhibe constantes de disociación en equilibrio con la tripsina bovina y la triptasa humana, que son casi idénticas a las naturales. Los productos de expresión esperados codificados adentro del vector de expresión también se identificaron in vitro, utilizando un sistema de traslado de transcripción S30. Las proteínas presentadas en la presente invención son los primeros compuestos que son inhibidores eficientes de triptasa. Por consiguiente, los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela reducen la actividad catalítica de la triptasa, estando el valor K del complejo inhibidor de la enzima en la escala nanomolar. Más aún, los inhibidores afectan no solamente la disociación inducida por triptasa del sustrato de nitroanilida del péptido utilizado co o una herramienta para determinar la actividad de la proteinasa in vitro. También afectan la disociación del péptido intestinal vasoactivo (VIP) y del quininógeno, representativos de loe péptidos y las proteínas que se cree que son sustratos biológicamente relevantes de la triptasa. En adición, los inhibidores disminuyen de una manera eficiente el crecimiento inducido por triptasa de los queratinocitos humanos - un ejemplo de los efectos celulares directos de la triptasa - sin causar efectos citotóxicos u otros efectos secundarios aparentes. Además de tener una alta afinidad para la triptasa, los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuelas son altamente efectivos. Por consiguiente, con la excepción de las proteinasas pancreáticas tripsina y químotripsina, otras proteinasas de serina no inhiben o solamente se inhiben marginalmente, siendo los valores Kj^ para los complejos de enzima-inhibidor cuando menos 200 veces más altos que para el complejo con triptasa. Su especificad se ilustra por el efecto de carestía sobre la coagulación sanguínea ex vivo , verificando que no se afectan las proteinasas involucradas en la cascada de coagulación. Por consiguiente, los inhibidores de triptasa derivados de sanguijuela de la presente invención permitirán por primera vez la inhibición de triptasa con una alta afinidad y especificidad. En consecuencia, los inhibidores proporcionan la perspectiva de bloquear efectivamente los eventos patofisiológicos que involucran la disociación de proteínas y péptidos y/o la activación de células por triptasa. Por consiguiente, es un objeto de la presente invención, aplicar los inhibidores como sondas en el diagnóstico, así como fármacos en la terapia de enfermedades relacionadas con triptasa y con células sebadas. De conformidad con una modalidad preferida adicional de la presente invención, se proporcionan secuencias de nucleótido, como por ejemplo, secuencias de DNA y RNA, que codifican un polipéptido con actividad inhibidora de triptasa ó fragmentos del mismo. De preferencia, se proporcionan moléculas de polinucleótido que comprenden la siguiente secuencia de nucleótido general (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4) : 5' 1 AARAARGTNTGYGCNTGYCCNAARATHYTNAARCCNGTNTGYGGNWSNGA 51 YGGNMGNACNTAYGCNAAYWSNTGYATHGCNMGNTGYAAYGGNGTNWSNA 101 THAARWSNGARGGN SNTGYCCNACNX 3' en donde R denota A ó G; M denota A ó C; W denota A ó T; S denota C ó G; Y denota C ó T; H denota A, C, ó T; N denota cualquier nucleótido; y X denota -OH (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4 ) , GGN (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5) , ó GGN ATH YTN AAY (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6) . La presente invención también se refiere al cordón complementario de los mismos; y las secuencias de DNA que se hibridizan, de preferencia bajo condiciones estrictas, en la secuencia de DNA anteriormente mencionada. De preferencia, los polinucleótidos de la presente invención comprenden una secuencia de nucleótido que corresponde sustancialmente a los residuos de nucleótido 1 a 149, o más preferiblemente 7 a 144 del NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 7; o fragmentos de los mismos que comprenden cuando menos de 15 a 21 nucleótidos consecutivos del NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 7. Dentro del alcance de la presente invención, también están los polinucleótidos complementarios que comprenden una secuencia de nucleótido que corresponde sustancialmente a los residuos de nucleótido 1 a 149, o de preferencia de 10 a 147 del NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8; o fragmentos de los mismos que comprenden cuando menos de 15 a 21 nucleótidos consecutivos del NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8. De preferencia, estos fragmentos son derivados específicos o funcionales de inhibidor de triptasa de estas secuencias de nucleótido. De conformidad con una modalidad adicional, la presente invención se refiere a un oligonucleótido que se hibridiza, de preferencia bajo condiciones estrictas, en una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido con una actividad inhibidora de triptasa. De preferencia, este oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótido que es sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleótido del residuo 22 al residuo 87 del NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 7. Otra modalidad de la presente invención se refiere a polinucleótidos que codifican un polipéptido con actividad inhibidora de triptasa, cuyos polinucleótidos se pueden obtener mediante hibridización, de preferencia bajo condiciones estrictas, con un oligonucleótido como se específico anteriormente; así como a polipéptidos codificados por estos polinucleótidos. Las condiciones estrictas adecuadas pueden ser fácilmente determinadas por un experto en este campo. También dentro del alcance de la presente invención está la secuencia de polinucleótido del NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 9, y sus equivalentes funcionales. La presente invención también abarca moléculas de vector para la transformación de huéspedes eucarióticos ó procarióticos, que comprenden una molécula de DNA como se definió anteriormente. Por ejemplo, el vector puede ser un virus ó un plásmido que contenga la secuencia de DNA codificadora del inhibidor en una relación funcional con secuencias regulatorias de transcripción y de traslación adecuadas bien conocidas en la técnica. La secuencia de codificación también se puede enlazar con secuencias de réplica autónoma adecuadas (ARSS) . Las células huéspedes adecuadas se pueden transformar con un vector que contenga a la secuencia codificadora del inhibidor de triptasa, y el inhibidor producido por las células huéspedes se puede expresar y aislar de una manera adecuada a partir del cultivo celular. Una modalidad adicional de la presente invención es un cartucho de expresión de polipéptido que comprende un promotor operablemente enlazado con una secuencia de DNA que codifica para el polipéptido, y con una secuencia de DNA que contiene señales de terminación de transcripción. En los huéspedes capaces de secretar los polipéptidos expresados, el cartucho de expresión de preferencia comprende un promotor operablemente enlazado con una primera secuencia de DNA que codifica un péptido de señal enlazado en el marco de lectura apropiado con una segunda secuencia de DNA que codifica para el polipéptido de la invención, y una secuencia de DNA que contienen señales de terminación de transcripción. En una modalidad preferida, el promotor, la secuencia de señal, y el terminador, son reconocidos por el sistema de expresión de la levadura. Los promotores adecuados para la expresión en cierto huésped son bien conocidos. Los ejemplos son el promotor del gen TRP1, el gen ADHI ó ADHII, el gen de fosfatasa acida (PH05) , el gen CUP1, el gen isocitocromo c, ó un promotor de los genes que codifican para enzimas glicolíticas, tales como TDH3, deshidrogenase de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH), una versión acortada de GAPDH (GAPFL) , quinasa de 3-fosfoglicerato (PFK) , hexoquinasa, descarboxilasa de piruvato, fosfofructoquinasa, isomerasa de glucosa-6-fosfato, mutasa de 3-fosfoglicerato, quinasa de piruvato, isomerasa de triosefosfato, isomerasa de fosfoglucosa, genes de invertasa y glucoquinasa, ó un promotor de los genes de feromona de acoplamiento con levadura que codifican para el factor a ó a, se pueden utilizar. Los vectores preferidos de la presente invención contienen, por ejemplo, promotores con un control de transcripción que se pueden activar o desactivar mediante la variación de las condiciones de crecimiento, por ejemplo, el promotor del gen PH05 ó CUPl. Por ejemplo, el promotor PH05 se puede reprimir ó desrreprimir a placer, exclusivamente incrementando ó disminuyendo la concentración de fosfato inorgánico en el medio, y el promotor CUPl se puede activar mediante la adición de iones de Cu2+ al medio, por ejemplo, en la forma de una sal de cobre. Se prefieren especialmente el GAPDH y el promotor CUP1 de levadura. La secuencia de DNA que codifica un péptido de señal ("secuencia de señal") , por ejemplo, un péptido de señal de levadura, de preferencia se deriva a partir de un gen, por ejemplo, un gen de levadura, que codifique para un polipéptido que se secrete ordinariamente. Las secuencias de señal de levadura son, por ejemplo, las secuencias de señal y prepro de la levadura invertasa (SUC2), factor , peptidasa de feromona (KEX1) , "toxina aniquiladora" y fosfatasa acida reprimible (PH05) , y la secuencia de señal de glucoamilasa a partir de Aspergilluss awamori. También se pueden incluir secuencias adicionales, tales como secuencias pro ó espaciadoras, que pueden llevar señales de procesamiento específicas, en las construcciones, para facilitar un procesamiento preciso de las moléculas precursoras. Por ejemplo, las señales de procesamiento contienen un residuo Lys-Arg, que es reconocido por una endopeptidasa de levadura localizada en las membranas de Golgi. Las secuencias de señal preferidas de conformidad con la presente invención, son aquellas del gen PH05 de levadura, el factor , y del gen de invertasa de levadura (SUC2) . Una secuencia de DNA que contiene señales de terminación de transcripción, por ejemplo, señales de terminación de transcripción de levadura, de preferencia es la secuencia del flanco 3' de un gen, por ejemplo, un gen de levadura, que contiene señales apropiadas para la terminación de transcripción y la poliadenilación. La secuencia de flanqueo preferida es la de la levadura PHOS y el gen del factor a. El DNA que codifica para el polipéptido de conformidad con la presente invención, se puede aislar a partir de un banco genético del huésped natural (la sanguijuela médica Hirudo medicinalis ) , mediante métodos conocidos en este campo, o se puede sintetizar mediante PCR utilizado, por ejemplo, el uso de codón preferido del huésped. El promotor, la secuencia de DNA que codifica para el péptido de señal, la secuencia de DNA que codifica para el polipéptido, y la secuencia de DNA que contiene las señales de terminación de transcripción, se enlazan operablemente unas con otras, es decir, se yuxtaponen de tal manera que se mantienen sus funciones normales. El arreglo es tal que el promotor efectúa una expresión apropiada del complejo de secuencia de señal - gen de polipéptido, y las señales de terminación de transcripción efectúan una terminación apropiada de la transcripción y poliadenilación. La secuencia de señal se enlaza en el marco de lectura apropiado con el gen del polipéptido, de tal manera que el último codón de la secuencia de señal se enlaza directamente con el primer codón del gen para el polipéptido. El promotor de levadura de preferencia se une a la secuencia de señal entre el inicio principal de mRNA, y el ATG enlazado naturalmente con el gen promotor. La secuencia de señal tiene su propio ATG para la iniciación del traslado. La unión de estas secuencias, por ejemplo, se puede efectuar por medio de enlazadores de oligodesoxinucleótido sintéticos que lleven la secuencia de reconocimiento de una endonucleasa. Los ejemplos para los cartuchos de expresión relacionados se describen, por ejemplo, en la EP-A-341215. Los cartuchos de expresión preferidos incluyen el promotor de CUP1 ó de GAPDH, el factor , o la secuencia líder de invertasa de levadura, el gen inhibidor de triptasa, y el terminador de factor a. El cartucho de expresión especialmente preferido incluye una molécula de DNA recombinante, como se describe en el Ejemplo 9 , ó un fragmento ó derivado funcional de la misma. Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a un plásmido recombinante que comprende un cartucho de expresión de polipéptido como se describió anteriormente. Aparte del cartucho de expresión de polipéptido, los plásmidos de expresión de conformidad con la presente invención pueden incluir un segmento de DNA que se origine desde DNA de dos mieras que contenga el origen de réplica, o si se utiliza una cepa de levadura libre de DNA de dos mieras, DNA de dos mieras en total. El último tipo de plásmido es el preferido. Por ejemplo, los plásmidos de conformidad con la presente invención pueden contener el DNA de dos mieras completa en una forma ininterrumpida, es decir, el DNA de dos mieras se disocia una vez con una endonucleasa de restricción, el DNA linealizado se enlaza con los otros componentes del vector antes de la recirculación. El sitio de restricción se selecciona de tal manera que se mantenga una función normal de los genes REP1, REP2 y FLLP, y de los sitios ORÍ, STB, IR1 e IR2 de DNA de dos mieras, así como los sitios pequeños de "objetivo de reconocimiento de FLP" (FRT) , localizados cerca del centro de cada repetición invertida (IR) en donde actúe la recombinasa de FLP. Opcionalmente, el sitio de restricción se selecciona de tal manera que el gen D del DNA de dos mieras se mantenga intacto también. Los sitios de restricción adecuados son, por ejemplo, el sitio único PstI localizado adentro del gen D, y los sitios únicos HpaJ y SnaBI localizados afuera de todos los genes y sitios. Sin embargo, de la misma manera es posible insertar el cartucho de expresión y otros componentes (cf . más adelante) en diferentes (tales como dos) sitios de restricción, especialmente los mencionados anteriormente, adentro del DNA de dos mieras. De preferencia, los plásmidos de expresión de conformidad con la presente invención incluyen uno ó más, especialmente uno ó dos, marcadores genéticos selectivos, por ejemplo, un marcador para levadura y un marcador y (excepto por los vectores híbridos en forma de dos mieras simétricas) un origen de réplica para un huésped bacteriano, especialmente Escherichia coli . Con respecto a los marcadores genéticos selectivos, se puede utilizar cualquier gen marcador que facilite la selección para los transformantes, debido a la expresión fenotípica del gen marcador. Los marcadores adecuados son, por ejemplo, los que expresan resistencia al antibiótico, ó en el caso de los mutantes de levadura auxotrópicos, los genes que complementan las lesiones del huésped. Los genes correspondientes confieren, por ejemplo, resistencia a los antibióticos G418, higromicina, ó bleomicina, o proporcionan una prototrofia en el mutante de levadura auxotrófico, por ejemplo, el gen de URA3 , LEU2 , LYS2 , HIS3 ó TRP1. Ya que la amplificación de los plásmidos de expresión convenientemente se realiza en un procariote, tal como E . coli , convenientemente se incluyen en el origen de réplica un procariote, por ejemplo, E . coli , ó un marcador genético y un procariote, por ejemplo, E . coli . Estos se pueden obtener de los plásmidos procarióticos correspondientes, por ejemplo, plásmidos de E. coli , tales como plásmido de pBR322 ó un plásmido de pUC, por ejemplo, pUC18 ó pUC19, que contienen ambos un origen de réplica procariótico, por ejemplo, JE-, coli , y un marcador genético que confiere resistencia a los antibióticos, tales como ampicilina. Un vector adecuado para transformar células de levadura es el plásmido pRM 9.1.4, como está depositado con el lbSM, y que tienen un número de acceso DSM 9271. Otras moléculas de vector preferidas son: pRMll.1.4, como está depositada con el DSM, y que tienen el número de acceso DSM 9272; pRM5.1.5 como está depositada con el DSM, y que tienen el número de acceso DSM 9270; pRM4.1.4 como está depositada con el DSM, y que tienen el número de acceso DSM 9269; pRM3.1.10 co o está depositada con el DSM, y que tienen el número de acceso DSM 9268; El vector también se puede seleccionar a partir de pHE175, pHE175R, pHE177 y pHE177R, como se describe en la parte experimental que está mas adelante. De conformidad con una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona un método para preparar un inhibidor de triptasa, el cual incluye los pasos de: a) obtener un extracto de una sanguijuela, de preferencia de la sanguijuela medicinal Hirudo medicinalis , y b) purificar el extracto mediante diálisis y cromatografía en columna. De preferencia, el extracto crudo se dializa contra un regulador de una baja concentración iónica. Subsecuentemente, el extracto dializado se purifica mediante cromatografía de intercambio de cationes, cromatografía bioespecífica, como por ejemplo, cromatografía de afinidad de anhidrotripsina-sefarosa y otra etapa de cromatografía de intercambio de cationes. Otros detalles experimentales se ilustran en la parte experimental que está más adelante. Las modificaciones del proceso reivindicado pueden ser fácilmente diseñadas por una persona de una experiencia ordinaria, las cuales todavía son abarcadas por el alcance de la presente invención. La presente invención también se refiere a métodos para preparar un inhibidor de triptasa recombinante, y a inhibidores de triptasa recombinante que se pueden obtener mediante estos métodos. De conformidad con una modalidad preferida, este método incluye: a) transformar un huésped procariótico ó eucariótico con un vector como se definió anteriormente; b) inducir la expresión de la secuencia de codificación del inhibidor de triptasa; c) recuperar el producto de expresión; y opcionalmente d) remover del producto obtenido fragmentos de péptido no requeridos para la actividad del inhibidor de triptasa y/u opcionalmente renaturalizar el producto. La secuencia de codificación también se puede expresar mediante la aplicación de un sistema de trae-lado de transcripción adecuado, como por ejemplo, el sistema de traslado de transcripción S30. De conformidad con otra modalidad de la presente invención, se proporcionan huéspedes procarióticos y eucarióticos transformados con un vector que codifica un inhibidor de triptasa, y variantes y mutantes de los mismos. Los huéspedes adecuados son de origen procariótico ó eucariótico. Los ejemplos son células bacterianas, fúngales, de plantas, o de insectos. Los huéspedes preferidos son células bacterianas y fúngales, talles como E . coli , u hongos, Saccharomyces cerevisiae , Aspergillus niger, Aspergillus nidulans ó Neurospora crassa . Las cepas de levadura preferidas son las mencionadas anteriormente, por ejemplo, S . cerevisiae , que se han curado del plásmido de dos mieras endógeno ("cepas cir0") , y especialmente cepas que son sencillamente ó múltiplemente deficientes en proteasas de levadura; y/o, en el caso de que se utilice el promotor de CUP1, cepas de levadura que contengan de 1 a 3 copias adicionales del gen de CUP1 cromosomal. Se han caracterizado una amplia variedad de proteinasas, como las mencionadas, en la levadura Saccheiromyces cerevisiae , [Aschstetter y colaboradores (1985)]. Los mutantes que carecen de actividad de la mayoría de estas proteasas se han aislado y estudiado bioquímicamente. Se elucidaron las consecuencias de la ausencia de ciertas proteasas, y algunas propiedades probaron ser útiles para la producción de proteínas heterogéneas. Las proteasas que faltan en las cepas de levadura de conformidad con la presente invención, no realizan funciones indispensables en el metabolismo celular; por consiguiente, las mutaciones que destruyen completamente la actividad de estas proteínas no son letales. Por ejemplo, la cepa de levadura carece de una ó más proteasas seleccionadas a partir del grupo de carboxipeptidasas ysca-, yscB, yscA, yscY y yscS. Los métodos para la producción de estas cepas de levadura se describen, por ejemplo, en la EP-A-40170 y en la EP-A-341215. La transformación del huésped con los plásmidos híbridos de conformidad con la presente invención, se puede realizar de conformidad con los métodos conocidos C I lu técnica. Una modalidad preferida se refiere a un huésped eucariótico derivado a partir de S . cerevisiae S-78, como está depositado con el DSM, y que tiene el número de acceso DSM 9273, y a variantes y mutantes del mismo, capaces de producir una molécula inhibidora de triptasa. De conformidad con otra modalidad preferida de la presente invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas, que incluyen una cantidad inhibidora de triptasa de un polipéptido como se definió anteriormente, preparada a partir de extractos de sanguijuela, u obtenida, por ejemplo, mediante la expresión de un gen codificador de inhibidor de triptasa recombinante, opcionalmente en combinación con un vehículo ó diluyente farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones se pueden utilizar en particular en el caso de las indicaciones mencionadas en la presente, si se administran, por ejemplo, parenteralmente (tal como intravenosamente, intracutáneamente, intramuscularmente, o subcutáneamente) , oralmente, mediante inhalación, o localmente. La dosificación depende esencialmente del método específico de administración y del propósito del tratamiento ó profilaxis.

El tamaño de las dosis individuales y el programa de administración se pueden determinar mejor basándose en una evaluación individual del caso relevante. Los métodos requeridos para determinar los factores relevantes son familiares para el experto. Normalmente, en el caso de inyección, la cantidad terapéuticamente activa de los compuestos de conformidad con la presente invención, está en la escala de dosificación de aproximadamente 0..005 a aproximadamente 1 miligramo/kilogramo de peso del cuerpo. Se prefiere la escala de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.05 miligramos/kilogramo de peso del cuerpo. La administración es mediante inyección intravenosa, intramuscular, o subcutánea. En consecuencia, dependiendo del método de aplicación, las preparaciones farmacéuticas para administración parenteral contienen aproximadamente de 0.05 a aproximadamente 10 miligramos del compuesto de conformidad con la presente invención por dosis individual. En adición al ingrediente activo, estas composiciones farmacéuticas normalmente contienen también un regulador, por ejemplo, un regulador de fosfato, pretendido para mantener el valor del pH entre aproximadamente 3.5 y 7, y además, cloruro de sodio, manitol, o sorbitol, con el objeto de ajustar la isotonicidad. Pueden estar en una forma secada por congelación o disuelta, en donde las soluciones convenientemente pueden contener un agente conservador antibacteriano, por ejemplo, del 0.2 al 0.3 por ciento de éster metílico ó éster etilico de ácido 4-hidroxibenzoico. Una preparación para aplicación local puede estar en la forma de una solución acuosa, loción o jalea, una solución o suspensión aceitosa, o un ungüento graso, o particularmente en emulsión. Se obtiene una preparación en la forma de una solución acuosa, por ejemplo, disolviendo la sustancia de conformidad con la presente invención, o una sal terapéuticamente útil de la misma, en una solución reguladora acuosa de un pH de 4 a 6.5, y si se desea, se agrega una ó más sustancias adicionales a la misma. La concentración del ingrediente activo es de aproximadamente 0.08 a aproximadamente 1.5 miligramos, de preferencia de 0.25 a l.O miligramos, en aproximadamente 10 mililitros de una solución, ó 10 gramos de una jalea. Se obtiene una forma aceitosa de aplicación para administración local, por ejemplo, suspendiendo la sustancia de conformidad con la presente invención, o una sal terapéuticamente útil de la misma en un aceite, opcionalmente con la adición de agentes de hinchamiento, tales como estearato de aluminio, y/o agentes de actividad superficial (tensoactivos) , cuyo valor de HLB (balance hidrofílico-lipofílico) sea menor de 10, tales como monoésteres de ácido graso de alcoholes polihídricos, por ejemplo, monoestearato de glicerol, monolaurato de sorbitan, monoestearato de sorbitán, o monooleato de sorbitán. Se obtiene un ungüento grasoso, por ejemplo, mediante la suspensión de la sustancia de conformidad con la presente invención, ó las sales, en una base grasosa extensible, opcionalmente con la adición de un tensoactivo que tenga un valor de HLB menor de 10. Se obtiene un ungüento de emulsión mediante trituración de una solución acuosa de la sustancia de conformidad con la presente invención, ó las sales, en una base grasosa blanda extensible, con la adición de un tensoactivo, cuyo valor de HLB sea menor de 10. Todas estas formas de aplicación local también pueden contener un agente conservador. La concentración del ingrediente activo es de aproximadamente 0.08 a aproximadamente 1.5 miligramos, de preferencia de 0.25 a 1.9 miligramos en aproximadamente 10 gramos de la matriz. La presente invención también se refiere al uso bioanalítico de los compuestos de conformidad con la presente invención y las sales de los mismos, para la determinación analítica de triptasa, y las preparaciones que sirvan para este fin, que contengan las sustancias de conformidad con la presente invención, por ejemplo, mezclas sólidas y todas las soluciones anteriores, en particular, soluciones acuosas. En adición a la cantidad específica ó concentración de las sustancias de conformidad con la presente invención (también en la forma de una sal) , éstas también pueden contener adyuvantes inertes, por ejemplo, los mencionados anteriormente con referencia a las preparaciones para inyección, que tengan, por ejemplo, una función estabilizante y/o conservadora. De conformidad con una modalidad adicional, la presente invención se refiere al uso de un inhibidor de triptasa como se definió anteriormente, en el diagnóstico de desórdenes relacionados con triptasa funcional y células sebadas. Se prefiere especialmente el uso para la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de asma, enfermedad intersticial del pulmón, artritis, enfermedad periodontal, desórdenes alérgicos, desórdenes de la coagulación sanguínea, desórdenes de la piel, y psoriasis.

PARTE EXPERIMENTAL 1. MATERIALES a) Extractos de sanguijuela: los extractos de la sanguijuela Hirudo medicinalis , fueron un regalo de Plantorgan, Alemania. Los extractos de sanguijuela también se pueden preparar en base a la descripción de la EP-A-0 207 956, y a las referencias citadas en la misma. b) Enzimas y sustratos: las proteasas se obtuvieron como sigue: tripsina bovina, calicreína pancreática porcina, y elastasa pancreática porcina, (Sigma; Deisenhofen, Alemania) ; factor Xa humano (Boeringer; Mannheim, Alemania) ; elastasa de neutrófilo humano, trombina humana, uroquinasa humana, y quimotripsina bovina (Medor; Hersching, Alemania) ; plasmina humana, y calicreína de plasma humano (Kabi; Essen, Alemania) ; catepsina humana G (Calbiochem; Bad Soden, Alemania) . La triptasa se purificó a partir de tejido de pulmón humano hasta una homogeneidad aparente utilizando una modificación de los métodos descritos [Smith Hougland, 1984; Schwartz Lewis Austen, 1981; Harvima Schechter, 1988]. Se adquirieron los siguientes sustratos: Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA (Novabiochem; Bad Soden, Alemania) ; Suc-Ala-Ala-Ala-pNA (Bachem; Heidelberg, Alemania) ; D-Pro-Phe-Arg-pNA, y D-Val-Leu-Arg-pNA (Kabi; Essen, Alemania) ; Suc-Val-Pro-Phe-pNA, y Pyr-Gly-Arg-pNA (Medor; Herrsching, Alemania) ; MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA (Sigma; Munich, Alemania) . El Tos-Gly-Pro-Arg-pNA se obtuvo en Boehringer, Mannheim, Medor, y Sigma. (Tos = Tosilo; Suc = succinilo; "pNA" = p-nitroanilida) . El péptido intestinal vasoactivo (VIP) se adquirió en Calbiochem (Bad Soden, Alemania) , y la heparina de pulmón bovino de Sigma. El Bdellin B fue un regalo de E. Fink (kllinische Chemie und Klinische Biochemie, Chirurgische Klinik, LMU; Munich, Alemania) . c) Materiales de columna: SP-SephadexR, SepharoseR 4B activada con bromuro de cianógeno, y Mono S R HR 5/5 se obtuvieron en Pharmacia (Freiburg, Alemania) . La anhidrotripsina se preparó a partir de tripsina, se purificó por afinidad mediante una modificación de los métodos descritos por Ako [Ako Foster Ryan, 1972] y se inmovilizó sobre Sepharose 4B activada con bromuro de cianógeno de conformidad con los lineamientos de Pharmacia. d) Cultivo celular: El medio, el suero de becerro fetal, y los antibióticos, se obtuvieron en Biochrom (Berlín, Alemania) . La línea celular de queratinocito humano HaCaT [Boukamp Petrussevska, 1988] se obtuvo en N. Fusenig, Germán Cáncer Research Center (DKFZ; Heidelberg, Alemania) . La [Aíetil-3H] tímida se adquirió en Amersham Buchler (Braunschweig, Alemania) . 2. MÉTODOS 2.1 Purificación del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela a) Cromatografía sobre SP-SephadexR: El extracto de sanguijuela (aproximadamente 3.5 gramos) se disolvió en agua desionizada (77 mililitros) , y se dializó contra 20 nM de NaP (pH de 8.0) durante la noche a 4°C. El material dializado se aplicó sobre una columna de SP-SephadexR (1.6 x 20 centímetros) equilibrada con el mismo regulador. La columna se lavó a una velocidad de flujo de un mililitro/minuto, hasta que la densidad óptica (280 nanómetros) del efluyente, alcanzó la línea base, y se eluyó con 20 mM de NaP, 500 mM de NaCL (pH de 8.0). Se recolectaron y se agruparon las fracciones que contenían el material activo inhibidor. b) Cromatografía de afinidad sobre anhidrotripsina-SepharoseR: El material agrupado a partir de la cromatografía de intercambio de cationes (aproximadamente 20 mililitros) , se aplicó sobre una columna de anhidrotripsina-Sepharose (1.6 s 3.6 centímetros) equilibrada con 20 mM de NaP (pH de 8.0). Se enlazaron aproximadamente el 90 por ciento del material activo inhibidor; el resto del flujo se recolectó para la recromatografía. Después de un lavado extenso de la columna (aproximadamente 10 volúmenes de columna) , se inició la elución mediante la adición de 100 mM de KC1/HC1 (pH de 2.1) , a una velocidad de flujo de 0.3 mililitros/minuto. Las fracciones se recolectaron y se neutralizaron inmediatamente mediante la adición de 1 M de Tris. El eluato agrupado se dializó contra 20 mM de NaP (pH de 8.0) durante la noche a 4°C. c) Cromatografía sobre Mono SR: El eluato dializado a partir de la cromatografía de afinidad, se enlazó sobre una columna de intercambio de cationes Mono SR (0.5 x 5 centímetros) equilibrada con 20 mM de NaP (pH de 8.0). La columna se lavó con el mismo regulador (aproximadamente 20 mililitros) , y se eluyó utilizando un gradiente de 60 a 240 mM de NaCl en 50 volúmenes de columna a una velocidad de flujo de 1 mililitro/minuto. Se agruparon las fracciones que contenían el material activo inhibidor (aproximadamente 5 mililitros) , se formaron alícuotas, y se almacenaron a -20°C. 2.2. Métodos Analíticos Estándares a) Ensayo de proteína: Se determinaron las concentraciones de proteína utilizando el procedimiento de ácido biciconínico [Smith Krohn, 1985], con albúmina de suero bovino como estándar. b) Electroforesis: El análisis electroforético de la proteína reducida y desnaturalizada, se realizó utilizando del 10 al 20 por ciento de SDS-geles de gradiente de poliacrilamida, como es descrito por Laemmii [Laemmii, 1970]. Las proteínas se detectaron después del manchado con plata [Huekeshoven, 1985]. c) HPLC: Se cargaron muestras (aproximadamente 1 nanomol) sobre una columna de fase inversa Lichrospher RP 8 (120 x 4 milímetros; Merck), y se eluyeron utilizando un gradiente lineal del 0 por ciento al 30 por ciento de acetonitrilo en el 0.1 por ciento de TFA, a una velocidad de flujo de 1 mililitro/minuto. d) Análisis de secuencia: Reducción y S-ß-piridiletilación: la S-ß-piridiletilación se realizó esencialmente como es descrito por Friedman y colaboradores [Friedman Krull, 1970]. El inhibidor (1-2 nanomoles) se disolvió en 100 microlitros de regulador (6 M de HCl de guanidinio, 0.25 M de Tris-HCl, 1 mM de EDTA, 5 por ciento (volumen/volumen) de ß-mercaptoetanol; pH de 8.5), y se incubó durante la noche a la temperatura ambiente. Después de la adición de 5 microlitros de 4-vinilpiridina, y de la incubación durante 90 minutos, la reacción se detuvo mediante acidificación con ácido fórmico. El inhibidor S-piridinetilado se desalificó mediante cromatografía de fase inversa sobre una columna Aquapore RP 300 (2.1 x 30 milímetros; Applied Biosystems, Pfungstadt, Alemania) . Oxidación del inhibidor: Una mezcla de ácido fórmico (45 microlitros) y peróxido ácido (30 por ciento; 5 microlitros) , se preincubó durante una hora a la temperatura ambiente. Posteriormente, el inhibidor (1-2 nanomoles) se disolvió en esta mezcla. Después de la incubación durante 1 hora a 4°C, la reacción se detuvo mediante dilución con un mililitro de agua desionizada y liofilización. Fraccionación : El inhibidor (1 nanomol) se incubó con tripsina y/o quimotripsina (ambas de grado de secuenciamiento; Boeringer, Mannheim) en 100 microlitros de regulador de 1 M de carbonato ácido de amonio (pH de 8.0) durante 14 horas a 37 °C. Se utilizó una proporción de enzima/inhibidor de 1:40. La reacción se terminó mediante acidificación con ácido fórmico, y los fragmentos se separaron mediante HPLC. Análisis de secuencia de aminoácidos : El secuenciamiento de aminoácido automatizado se realizó utilizando un secuenciador en fase de gas 473A (Applied, Biosystems, Weiterstadt, Alemania) . e) Comparación de secuencia: Se investigó la base de datos MIPSX (Martinsrieder Institut für Proteinsequenzen am Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried, Alemania) utilizando el algoritmo de búsqueda rápida de proteína Lipman & Pearson, FASTP [Lipman Pearson, 1985] . Las alineaciones se optimizaron utilizando CLUSTAL [Higgins Sharp, 1988]. f) Análisis de aminoácidos: Las muestras del inhibidor oxidado se hidrolizaron al vacío en 5.7 M de ácido clorhídrico a 110°C durante 20 horas, y se analizaron sobre un sistema analizador de alto rendimiento Biotronik LC 5000 (Puchheim, Alemania) . g) Determinación de la masa molecular: La masa molecular del inhibidor purificado con HPLC (50 µM) se determinó utilizando un instrumento de cuadrupolo en hilera API III (Sciex, Thornhill, Ontario, Canadá) . El instrumento se calibró con los iones de aducto de amonio de glicol de polipropileno. h) Actividad inhibidora: Durante el procedimiento de purificación, el inhibidor fue seguido por mediciones de su efecto sobre la actividad a idolítica de triptasa. Por consiguiente, las muestras se incubaron con triptasa (0.59 nM) en 50 mM de Tris/HCl (pH de 7.6), 150 mM de NaCl, 50 microgramos/mililitros de heparina de pulmón bovino, y 0.1 por ciento (peso/volumen) de albúmina de suero bovino, durante 25 minutos a 37 °C. El ensayo se inició mediante la adición del sustrato tos-Gly-Pro-Arg-pNa, a una concentración final de 0.1 mM. La nitroanilina liberada se supervisó espectrométricamente a 405 nanómetros durante 3.5 minutos utilizando un fotómetro UVIKON 930 (Kontron; Eching, Alemania) . Se definió una unidad de inhibición (IU) como la cantidad de inhibidor que reduce la hidrólisis del sustrato por el 30 por ciento. i) Titulación del inhibidor: La concentración del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela activo inhibidor se determinó mediante titulación con tripsina. Por consiguiente, la tripsina pancreática bovina se estandarizó mediante titulación de sitio activo utilizando p'-guanidinobenzoato de p-Nitrofenilo [Chase Shaw, 1970) . La concentración del inhibidor activo se calculó asumiendo una interacción de 1:1 entre el inhibidor y la tripsina. k) Determinación de constantes de equilibrio: Para determinar la especificidad del inhibidor, se determinó su efecto sobre la actividad amidolítica de diferentes proteinasas de serina (ver la Tabla 5) . Por consiguiente, las proteinasas se incubaron con el inhibidor (0.2 µM) durante 15 y 30 minutos, bajo las condiciones indicadas en la Tabla 5. La actividad enzimática residual se midió después de la adición de un sustrato adecuado. Las constantes de disociación de equilibrio ( KL ) para los complejos del inhibidor con proteasas individuales, se determinaron esencialmente como es descrito por Bieth [Bieth, 1980]. Dicho brevemente, se incubaron concentraciones crecientes del inhibidor con una concentración constante de la enzima; se determinó el tiempo necesario para alcanzar el equilibrio del complejo de enzima-inhibidor para cada proteasa en los experimentos preliminares. Luego se agregó el sustrato, y se midió la actividad enzimática residual. Se calcularon los valores K¡_ mediante ajuste de las velocidades de estado continuo a la ecuación para inhibidores de enlace apretado [Morrison, 1969] utilizando análisis de regresión no lineal. 1) Ensayo de coagulación: Se midieron el tiempo de protrombina de acuerdo con Quick y el tiempo de tromboplastina parcial, utilizando un coagulómetro Amelung KC 10 (Lemgo, Alemania) , y las series de reactivo de Behringwerke AG (Marburg, Alemania) , de conformidad con los lineamientos de los fabricantes. ) Disociación del péptido intestinal vasoactivo (VIP): Se preincubó triptasa (4.8 nM) con diferentes concentraciones del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela, en 100 mM de Tris (pH de 7.4), 140 mM de NaCl, 50 microgramos/mililitro de heparina a 37 °C durante 25 minutos. Entonces se agregó el péptido intestinal vasoactivo (VIP; 24 µM, concentración final) . Después de la incubación durante 1 a 10 minutos adicionales, la reacción se detuvo mediante acidificación con ácido acético. El VIP restante y los fragmentos generados se cuantificaron utilizando HPLC. n) Crecimiento de queratinocitos humanos; Para estudios del crecimiento, se utilizó la línea celular de queratinocito humano HaCaT, una línea celular espontáneamente transformada que mantiene las características de los queratinocitos diferenciados [Boukamp Petrussevska, 1988], Las células de HaCaT se recubrieron en placas de cultivo de tejido de 24 pozos (Falcon; Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania) , en una densidad de 104 células/centímetro cuadrado, en un medio que contenía el 90 por ciento de medio de Eagle modificado con Dulbecco, suero de becerro fetal al 10 por ciento, y 50 microgramos/mililitro de gentamicina. Las células se incubaron a 37 °C en el 5 por ciento de C02. Después de 24 horas, las células se lavaron dos veces con medio de Eagles modificado con Dulbecco exento de suero, y se agregó medio exento de suero fresco conteniendo 7.8 microgramos/mililitro de heparina solamente, o medio conteniendo los agonistas y/o el inhibidor. Después de 48 horas, las células se lavaron dos veces nuevamente, y se agregó medio exento de suero fresco conteniendo 1 µCi/ml de 3H-timidina. Después de dos horas adicionales, las células se lavaron tres veces con PBS de Dulbecco helado, y la 3H-timidina incorporada se precipitó mediante ácido tricloroacético al 10 por ciento. Después de la solubilización del precipitado en 0.1 N de NaOH, 1 por ciento de SDS, se determinó la radiactividad incorporada mediante cuenta de cintilación de líquido (modelo de contador beta LS 1800, Beckman Instruments, Munich, Alemania) . Para los estudios de crecimiento, también se pueden aplicar otras líneas celulares que no sean de queratinocito.

Ejemplo l: Aislamiento del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela Se disolvieron 3.5 gramos de extracto de sanguijuela liofilizado en agua, se dializaron contra 20 mM de NaP (pH de 8.0), y se aplicaron sobre una columna de intercambio de cationes SP-SephadexR (ver la Sección de Método) . El volumen de la proteína (aproximadamente el 98 por ciento) , y la actividad inhibidora de tripsina, se encontraron en el flujo atravesado, mientras que el inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela se enlazó con la columna. Después de la elución de la columna con 500 mM de NaCl (Figura 1) , se separó el inhibidor de las proteínas no inhibidoras de tripsina mediante cromatografía de afinidad subsecuente sobre anhidrotripsina-sepharose (Fiqura 2 ) . La purificación final se logró mediante cromatografía de intercambio de cationes Mono SR (Fiqura 3) . Los datos del procedimiento de aislamiento se resumen en la Tabla 1.

Tabla 1: Purificación del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela Se utilizaron 3.5 gramos del extracto de sanguijuela liofilizado como material de partida. Una unidad inhibidora (IU) se definió como la cantidad de inhibidor que reduce la actividad amidolítica de triptasa por el 30 por ciento (ver Métodos) . El inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela aislado fue homogéneo de acuerdo con SDS-PAGE y análisis de secuencia N-terminal (Figuras 4 y 8) . Sin embargo, se separaron dos especies mediante HPLC de fase inversa (Figura 5) . El secuenciamiento de aminoácidos subsecuente después de la fragmentación tríptica, el análisis de aminoácidos y la espectroscopia de masa (Tabla 2, Figuras 6 y 7), demostraron que las dos especies comprenden tres formas que difieren solamente en su secuencia C-terminal. Por consiguiente, las formas B (43 aa) y C (46 aa) difieren de la forma A más corta (42 aa) por una extensión C-terminal de -GLY y -GLY-ILE-LEU-ASN, respectivamente. Los resultados obtenidos para las tres formas se comparan en la Tabla 3.

Tabla 2: Análisis de aminoácidos de las dos especies del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela separado mediante HPLC (ver la Fiqura 5) Los valores dados entre paréntesis, son los valores calculados a partir de la secuencia de aminoácidos. -1) las formas A y B no se han separado; 2) La secuencia de las formas A y B contienen 4 y 5 glicinas, respectivamente; n.d. = no determinado.

Tabla 3: Resumen de la caracterización de las tres formas del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela -1) Asumiendo tres enlaces de disulfuro 2) Las formas A y B no se han separado Se determinaron los 35 residuos de aminoácido N-ter inales del inhibidor derivado de sanguijuela, secuenciando el inhibidor nativo. La estructura primaria se completó y se verificó utilizando péptidos traslapados generados después de la modificación y la fragmentación tríptica y/o quimotríptica (Figura 8) . Las comparaciones de la secuencia demuestran que el inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela es un inhibidor de proteinasa de serina de tipo Kazal no clásico. El más alto grado de similitud se encontró en Bdellin B [Frink Rehm, 1986]; en la sección de secuencia común para ambos inhibidores (aminoácidos 1-40), 19 de 40 (47.5 por ciento) aminoácidos son idénticos (Tabla 4) . A pesar de la alta identidad de secuencia para el inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela, el Bdellin B, un inhibidor también aislado a partir de la sanguijuela médica, no afecta a la triptasa (observaciones no publicadas) .

Tabla 4: Comparación de las secuencias de aminoácidos del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela y Bdellin B-3 [Fink Rehm, 1986].

Inhibidor de trip- 1 5 10 5 20 5 30 5 4) tasa Bdellin 3 KKVCACPKILKPVCGSDGRTYANSCIARCNGVSIKSEGSC DTECVCTKELHRVCGSDGVTYDNECLATCHGASVAHDHAC .. *.*.* *..****** **.*.*.* *.*.*. . .* Inhibidor de trip- PT tasa Bdellin 3 EGHEEHHVDEHGEDHD (* = residuos idénticos; . = aminoácidos homólogos) Ejemplo 2: Especificidad del inhibidor derivado de sanguijuela El inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela inhibe la triptasa humana en una forma que depende de la concentración. Utilizando el tripéptido-nitroanilida de Tos-Gly-Pro-Arg-pNa como un sustrato, se observó una inhibición máxima del 50 por ciento (Fiqura 9) . Por consiguiente, más posiblemente debido al impedimento estérico, el inhibidor bloquea solamente dos de las cuatro subunidades catalíticas del tetrámero de triptasa, dejando las otras dos subunidades accesibles para el sustrato pequeño. La interacción del inhibidor con las primeras dos subunidades de triptasa, se puede describir matemáticamente como una inhibición de enlace apretado con un K1 de aproximadamente 1.4 nM para el complejo. El inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela es altamente específico, e inhibe solamente la tripsina y la quimotripsina con afinidades similares a aquellas para la triptasa (Tabla 5) . En contraste, los valores K¿ para los complejos con otras proteinasas, son cuando menos 200 veces más altos.

Tabla 5: Especificidad del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela, f1) en 0.2 µM; 2.) Ki para la inhibición de dos de las cuatro subunidades del tetrámero de triptasa; ni, ninguna inhibición en 0.2 µM; nd, no determinado) Tabla 5 (continuación) Tabla 5 (continuación) Ejemplo 3: Caracterización biológica Para determinar si el inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela afecta la disociación de un sustrato biológicamente relevante mediante triptasa, se midió su efecto sobre la descomposición del péptido intestinal vaeoactivo (VIP) . En una concentración de 4 x 10~7M, el inhibidor redujo la descomposición de VIP por el 66 por ciento (Fiqura 10) . Por consiguiente, el inhibidor bloquea no solamente la disociación inducida por triptasa del sustrato de nitroanilida del péptido tos-Gly-Pro-Arg-pNA (ver el Ejemplo 2) , sino que también el del sustrato biológicamente relevante. La triptasa no solamente disocia las proteínas solubles, sino que también interactúa directamente con las células que activan las funciones celulares, tales como el crecimiento de fibroblastos y queratinocitos. Para determinar si el inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela bloquea estos efectos celulares de la triptasa, se estudió su efecto sobre el crecimiento inducido por triptasa de queratinocitos humanos cultivados. En ausencia del inhibidor, la triptasa (10~9 M) estimuló notablemente el crecimiento de los queratinocitos, incrementando su incorporación de 3H-timidina hasta 182+ 6 por ciento del control. El inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela no afectó de una manera significativa el crecimiento de la línea base, sugiriendo una falta de efectos citotóxicos (Tabla 6) .

Tabla 6: Efecto del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela sobre la proliferación de la línea celular de queratinocito humano HaCaT Los índices de crecimiento se calcularon como la incorporación de 3H-timidina en la presencia del agonista y/o inhibidor expresado como un porcentaje de la incorporación en medio solamente. Los datos se dan como el promedio + EM, n > 2. El inhibidor reduce mucho el crecimiento celular inducido por triptasa (10-9 M) sin un efecto significativo sobre la proliferación bajo condiciones de la línea base. Por consiguiente, el inhibidor bloquea casi completamente el efecto biológico de la triptasa sin ningún efecto secundario citotóxico. Sin embargo, el inhibidor redujo significativamente la proliferación inducida por triptasa, reduciendo la incorporación de 3H-timidina hasta 115+5 por ciento y 120+2% del control, en una concentración de 10~7 M y 10~8 M, respectivamente. Ya que esta incorporación de 3H-timidina es similar a la causada por 10-11M triptasa (118+4%) , los datos sugieren que el inhibidor bloquea el efecto celular de la triptasa por aproximadamente el 99 por ciento. Finalmente, se midió la influencia del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela sobre el tiempo de protrombina (de acuerdo con Quick), y el tiempo de tromboplastina parcial, para determinar si interfiere con la coagulación sanguínea. En una concentración de 10~7M, el inhibidor no tuvo ningún efecto significativo sobre ambos parámetros (Tabla 7) . Por consiguiente, el inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela no inhibe de una manera significativa a cualquiera de las proteasas involucradas en la cascada de la coagulación sanguínea.

Tabla 7: Efecto del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela sobre la coagulación sanguínea El inhibidor (100 nM) no afecta al tiempo de protrombina de acuerdo con Quick, y al tiempo de tromboplastina parcial, demostrando que las enzimas involucradas en la cascada de coagulación no son inhibidas.

Ejemplo 4: Preparación farmacéutica que contiene al inhibidor de triptasa para administración parenteral Una solución preparada de conformidad con el Ejemplo 1, se dializa contra una solución de NaCl de una concentración del 0.9 por ciento. La concentración de la solución se ajusta entonces hasta 1 miligramo/mililitro ó 10 miligramos/mililitro, mediante concentración o mediante dilución con la misma solución de NaCl. Estas soluciones se esterilizan mediante ultrafiltración (teniendo las membranas poros de 0.22 mieras). Las soluciones esterilizadas se pueden utilizar para administración intravenosa.

Ejemplo 5: Preparación de inhibidor de triptasa recombinante 5.1. Materiales Todos los productos utilizados se obtuvieron en Sigma, St. Louis, EUA; Merck, Darmstadt, FRG; Serva, Heidelberg, FRG; Biomol, Hamburgo, FRG; Roth, Karlsruhe, FRG, Braun, Melsungen, FRG; Dianova, Hamburgo, FRG; Promega, Madison, EUA. Las endonucleasas de restricción y las enzimas modificadoras del DNA, se adquirieron en Boehringer, Mannheim, FRG; New England Biolabs, Beverly, EUA, y Pharmacia-Biotech, Freiburg, FRG. La [35S]-tiotrifosfato de adenosina-5 ' -a , se obtuvo en Amersham Buchler, Braunschweig, FRG. La Bacto-triptona, Bacto-peptona, base de nitrógeno de levadura Bacto (sin aminoácidos, W/O) , el extracto de levadura Bacto y el Bacto-ágar fueron de disco, Augsburg, FRG. Como el medio de cultivo utilizamos 2xYT [Sambrook y colaboradores, 1989]; YPD (10 gramos de extracto de levadura Bacto, 20 gramos de Bacto-pectona, 20 gramos de glucosa, pH de 6.0); YED (20 gramos de extracto de levadura Bacto, 20 gramos de glucosa, 6.7 gramos de NaH2P04, pH de 6.0) , y SD+ (6.7 gramos de base de nitrógeno Bacto (w/o) , 20 gramos de glucosa, 6.7 gramos de NaH2P04, 19 miligramos de L-leucina, pH de 6.0). Los oligonucleótidos se adquirieron en MWG-Biotech, München, FRG, ó fueron sintetizados por el Dr. S. Modrow, München, FRG.

Vectores y cepas: El vector de clonación E . coli pUC, fue de Pharmacia Biotech Europe GmbH, Freiburg. El vector de lanzamiento y de expresión de E . coli - S . cerevisiae , pVT102U/ , y la cepa de levadura S-78, fueron proporcionados amablemente por T. Vernet, Montreal, CAN, y por C. -W. Chi y Y. -S. Zhang, ambos de Shanghai, China [Lit. Vernet y colaboradores, Chen y colaboradores) . E . coli TG1 ( (lac-pro) , supE, thi, hsdD5/F*traD36, proA+B+, laclq, lacZmld) fue de Amersham Buchler, Braunschweig, FRG; E . coli JM105 (thi, rspL, endA, sbcB15, hspR4, (lac-proAB) F'traAB proAB, laclq, lacZM15) ; y E . coli HB101 (F", pro", leu", trhi" lacY, Smr, endon", recA", rk~, mk~) fueron de Deutsche Stam sammlung Braunschweig, FRG. Las técnicas estándares de clonación molecular se realizaron de acuerdo con Sambrook y colaboradores [Sambrook y colaboradores, 1989], y con M.D. Rose y colaboradores [Rose y colaboradores, 1990]. 5.2. Métodos analíticos estándares a) SDS PAGE y enfoque isoeléctrico (IEF) Se realizaron SDS-PAGE de las proteínas con el 15 al 25 por ciento de geles de poliacrilamida, siguiendo el procedimiento de Laemmii [Laemmii, 1970]. Los geles se auto-prepararon y se ejecutaron en un aparato convencional, ó en el PhastSystem (Pharmacia, Solentuna, Suecia) . El enfoque isoeléctrico también se hizo con el PhastSystem, utilizando el estuche de calibración de enfoque isoeléctrico, pH de 3 a 10. b) Análisis de HPLC, secuenciamiento de aminoácidos Normalmente se analizaron de 2 a 3 nanomoles de proteína mediante HPLC de fase inversa, como se detalló anteriormente [Auerswald y colaboradores, 1991] . Los términos N se secuenciaron con un secuenciador en fase de gas 473A (Applied Biosystems GmbH, Witerstadt, FRG) , siguiendo las instrucciones del fabricante. c) Determinación de las concentraciones de proteína Para determinar la concentración de proteína, se utilizó el Pierce BCA* Protein Assay, con BSA como la proteína estándar [Smith y colaboradores, 1985]. Se calculó el A280nm (1 %) para el LDTI-C recombinante, utilizando los valores de A280 para los residuos aromáticos y las cistinas de Mach y colaboradores [1992]: A280 (1 %) = 3.46, y para las mezclas de proteína, A28o (i%) = 1« d) Ensayo de inhibición de tripsina La concentración del material inhibitoriamente activo y la actividad inhibidora específica de rLDTI-C, se determinó indirectamente midiendo la actividad de tripsina residual utilizando las siguientes condiciones descritas por Chase y Shaw, 1970. Regulador de prueba: 0.05M de Tris-HCl, pH de 7.6, 150 mM de NaCl. 0.1 por ciento (volumen/volumen) de Tritón X-100, 600 pM de tripsina; lOOµM de Tos-Gly-Pro-Arg-p-NA. e) Determinación de valores Ki Se determinaron las constantes de disociación de equilibrio (K^) para los complejos de rLDTI-C con tripsina y triptasa, esencialmente como se describió anteriormente [Bieth, 1980] . 5.3.3. Construcción del gen LDTI-C sintético Se diseñó y se construyó un gen sintético que codifica para un homólogo recombinante de LDTI forma C, como se ilustra en la Figura 11. La secuencia de DNA se seleccionó en base a la secuencia de aminoácidos del inhibidor de triptasa natural mediante asistencia del software de análisis de secuencia GCG [UWGCG, Devereux y colaboradores, 1984], con los usos de codones de E . coli y S . cerevisiae para los genes fuertemente expresados [Bennetzen y Hall, 1982]. Los extremos 5 ' -OH de los oligonucleótidos internos se fosforilaron utilizando quinasa de polinucleótido T4 , antes de la hibridización. Los seis oligonucleótidos, de 200 picomoles cada uno, se calentaron durante 5 minutos a 95°C. La hibridización se logró durante el enfriamiento hasta la temperatura ambiente dentro de 8 horas. Después de la extracción con fenol y la precipitación con etanol, se ligaron muescas internas mediante ligasa T-4 (Boehringer) , de conformidad con el protocolo de los fabricantes. El material se separó mediante electroforesis de gel sobre un agarosa de bajo punto de fusión (5 por ciento) , y se purificó un fragmento de 149 bp de largo utilizando el estuche de aislamiento MERMAID de Dianova, Hamburgo. 5.4. Construcción del vector de clonación pRM3.l.l? El fragmento de DNA obtenido de acuerdo con 5.3, se ligó en el vector pUCld cortado con EcoRI/HindIII (proporción molar del vector: fragmento, 1: 20) . Las células E . coli TG1 competentes s'e transformaron con la mezcla de ligación, y se seleccionaron clones recombinantes. El secuenciamiento del DNA se realizó utilizando el preparador de secuenciamiento M13/pUC (-40) , un 17 mer, y el preparador de secuenciamientos inversos (-48), un 24 mer. El vector pRM3.1.10 (Figura 15) que contenía las secuencias diseñadas de rLDTI-C, se utilizó para otros experimentos. 5.5. Producción in vitro y expresión citoplásmica en E.coli a) El gen LDTI-C sintético y el vector de expresión pASK 40 [Skerra y colaboradores, 1991] se disociaron por separado con EcoRI y Hindlll , se purificaron, y se ligaron. El pASK 40 modificado se designó como pRM4.1.4 (Figura 16). El DNA de pRM4.1.4 se analizó mediante un sistema de traslado de transcripción in vitro acoplado con E . coli S-30, de Promega, con cisteína S-35, siguiendo las instrucciones de los fabricantes. El traslado de transcripción in vitro del vector pRM4.1.4 con un lisato de E . coli S-30, comercialmente disponible, mostró dos bandas de proteína etiquetadas radioactivas principales con un peso molecular aproximado de 7 kDA y 5 kDA (no se muestran los datos) . La otra banda fuerte detectada parece ser ß-lactamasa (peso molecular aproximado de 31 kDA) . La banda de proteína de 7 kDA se interpreta como la proteína de fusión no disociada que contiene la secuencia de señal ompA y LDTI-C (peso molecular teórico 7038 Da) , mientras que la banda de proteína de 5 kDA (peso molecular teórico de 5015 Da) parece ser el LDTI-C disociado y esperado [ANS] , que se prolonga por tres residuos de aminoácidos. b) Para la expresión citoplásmica, el gen LDTI-C sintético se ligó después de una reacción de relleno en pGEX-3X (Pharmacia) disociado con Smal. El vector resultante se llamó pRM 11.1.4 (Figura 17), y la cepa huésped resultante es E . coli 1314. Se encontraron proteínas de fusión citoplásmica de glutationa-S-transferasa-LDTI-C como cuerpos de inclusión insolubles, con E . coli 1314 (HB 101 con pRMll.1.4, no se muestran los datos) . 5.6. Construcción del vector de expresión pRM 9.1.4 Para los experimentos de expresión con levadura, se seleccionó el sistema de secreción de acoplamiento alfa modificado pVT102U/a [Vernet y colaboradores, 1987], en donde se expresó con éxito el inhibidor de tripsina Trichosan thes , un pequeño inhibidor de proteinasa de serina de la familia macerada [Chen y colaboradores, 1992]. Dentro de este sistema, el inhibidor recombinante se dobló correctamente, se disoció de la secuencia de señal, se protegió de la degradación proteolítica, y se pudo purificar en dos ó tres etapas a partir del caldo de fermentación de levadura. Con el objeto de utilizar el vector de lanzamiento pVT102U/a, primero se tuvo que modificar el gen rLDTI-C. El gen LDTI-C (Figura 11) se utó sustituyendo el cartucho -Eco-RJ/Sphl con un cartucho enlazador Sbal/Sphl . La secuencia de este enlazador Sbal/Sphl es CTAGATTAAAAGAAAGAAGGTTTGCGCATGV. Codifica para el extremo C-terminal (Figura 11 c) de la secuencia de señal de tipo de acoplamiento alfa que contiene un sitio de disociación para la peptidasa de señal KEX2 (Lys Arg) y término N de LDTI. El gen LDTI-C modificado se ensambló por medio de una ligación de tres fragmentos utilizando el cartucho enlazador Xbal /Sphl , el fragmento de LDTI-C Sphl/HindIII , y el vector pUCld disociado Xbal/HindIII (proporción molar, 10:5:1) . Después de la transformación de TG1 E . coli , los clones recombinantes se clasificaron mediante análisis de restricción y secuenciamiento de DNA utilizando el preparador M13/pUC (-40) (Biolabs) y el preparador inverso M13/pUC/-48 (Biolabs) (CGCAGTAGCGGTAAACG) . El nuevo vector pRM 5.1.5 (Figura 12a) llevaba la secuencia esperada y el fragmento Xbal /HindIII , incluyendo el gen rLDTI-C se ligó en el pVT102U/ disociado con Xbal/HindIII . El vector de expresión resultante pRM 9.1.4 (Figura 12b) se aisló y se utilizó para transformar S . cerevisiae cepa S-78, de conformidad con el método de Becker y Guárante [Becker y Guárante, 1991]. 5.7. Expresión en Saccharomyces cerevisiae Se realizaron experimentos de expresión analíticos rLDTI-C utilizando cepa de levadura H005 (S-78 con pRM9.1.4 ) , con matraces Fernbach (180 - 220 rpm, 28°C; precultivo durante 3 días con 100 mililitros de medio SD(+) , y cultivos principales durante 4 días con 900 mililitros de medio YED fresco) . En cada día, se determinó la densidad celular (OD700) , se ajustó el pH a 6.0 con 1M de NaOH, y se agregaron 10 mililitros de una solución de material de extracto de levadura al 50 por ciento, y 30 mililitros de glucosa al 50 por ciento (peso/volumen), y se determinó la inhibición de tripsina. Después de la transformación de las cepas S-78 competentes con pRM9.1.4, se detectó la expresión de rLDTI. El caldo de las células de levadura recombinantes cultivadas mostró una inhibición notable de tripsina. El sobrenadante concentrado dio un patrón de proteína con la banda más fuerte emigrando en aproximadamente un peso molecular de 5000 Da después de SDS-PAGE (ver la Figura 13, pista 2). El material recombinante se aisló en preparación a partir del caldo de cultivo de S . cerevisiae cultivado en matraces agitadores de un litro durante 96 horas. Después de este tiempo, la curva de cultivo de las células de levadura alcanzó un OD700 de 22.0. La actividad inhibidora de tripsina se detectó después de dos días, y se incrementó paralela a la biomasa. El caldo de levadura se cosechó (6000 gramos, 20 minutos, 4°C) después de 96 horas de cultivo, y el sobrenadante se filtró, primero a través de una membrana de 0.16 mieras, y luego a través de una membrana de flujo cruzado con un corte de 3 kDa (Filtron Omega Minisette, Filtron, Karlstein, FRG) . El regulador se intercambió mediante diafiltración con 20 mM de NaH2P04, pH de 8.2. El material se purificó mediante cromatografía de intercambio de cationes (Fractogel EMD S03~ 65o (S) columna 150-10; Merk) , velocidad de flujo de 3 mililitros/ minuto, regulador de elución de 20 mM de NaH2P04, pH de 8.2, 500 mM de NaCl. Los datos de una purificación representativa se resumen en la Tabla 8.

Tabla 8: Resultados de una purificación típica de rLDTI forma C, de sobrenadante de cultivo de Saccharomyces cerevisiae La proteína total se estimó aplicando el ensayo de Pierce (albúmina de suero bovino como estándar) ; el material activo se calculó a partir de ensayos inhibidores de tripsina; el rendimiento se da como un porcentaje del material aislado. A partir de un litro de caldo de fermentación, se obtuvieron 3 miligramos de rLDTI-C. El SDS-PAGE de este material mostró una banda homogénea pero relativamente amplia emigrando en un peso molecular aproximado de 5000 Da (Figura 13, pista 3). Se eluyó aproximadamente el 85 por ciento de rLDTI-C como un pico agudo en el 28 por ciento de acetonitrilo, cuando se analizó mediante HPLC RP18. El secuenciamiento de aminoácidos del pico 1 (Figura 14) reveló el término N esperado KKVCACPK. Pero se observaron pequeñas heterogeneidades después de la HPLC de RP, y se identificó un término N diferente (pico 2) , empezando con 11 aminoácidos adicionales de la parte C-terminal del péptido de señal de factor alfa (Figura 14). Eso demuestra que la proteasa KEX 2 endógena de la levadura se disoció con una alta precisión después de LysArg, el sitio de reconocimiento de la peptidasa de señal KEX2 , y todavía enfrente de los dos residuos de aminoácido N-terminales Lys Lys de LDTI . El enfoque isoeléctrico con el PhastSystem demostró que el punto isoeléctrico de rLDTI estaba arriba de un pH de 10. Las constantes de inhibición determinadas de los complejos de triptasa-LDTI-C y tripsina LDTI-C, son similares a las de LDTI natural. La actividad inhibidora de tripsina específica medida del 60 por ciento, es comparable con otros inhibidores recombinantes. El rLDTI-C inhibe la triptasa humana de una manera similar al inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela que se presenta naturalmente: utilizando el tripéptido-nitroanilida de tos-Gly-Pro-Arg-pNa, como un sustrato, se observó una máxima inhibición de aproximadamente 50 por ciento, y un Ki de 1.9 nM que se calculó para el complejo entre triptasa y rLDTI-C.

Ejemplo 6: Construcción de pFBYl66 El pFBY166 es un plásmido derivado de pUC18 que contiene un fragmento BamHI de 1085bp. Este fragmento contiene el promotor CUP1 fundido con ARG del líder del factor a, un fragmento de embutido, y el terminador de factor a . La manera precisa en que se diseñaron las fusiones, hace posible la inserción de ORF (marco de lectura abierta) que contiene fragmentos bien sea en ATG mediante la utilización del sitio EcoRI , después de la secuencia de señal mediante la utilización de un sitio PsTI , o deepués de la secuencia líder del factor a, mediante la inserción después del sitio BglII . El ORF que se va a expresar debe tener idealmente un sitio Salí en su extremo 3' para facilitar la fusión con el terminador, que está precedido por un sitio Salí , y no debe tener sitios Ba HI adentro de su secuencia, ya que la disociación de este plásmido en los dos eitioe BamHI eepara todo el cartucho de expresión, de modo que se puede clonar fácilmente en un vector de lanzamiento de levadura. El pFBY166 contiene un fragmento Ba Hl/EcoRI de 425 bp del promotor CUP1, que corresponde a los nucleótidos 1080 a 1505 del EMBL GENBANK número de acceso K02204. El promotor de CUP1 permite la expresión de una manera regulada con cobre. El ATG se proporciona como parte de la secuencia y líder de señal de feromona de factor a-1, nucleótidos 293 a 527 del EMBL GENBANK número de acceso K01581, seguido por la secuencia, AGATCTTGC, que posiciona un sitio BglII , que es único en el pFBY139, justo antes de la posición normal para el sitio de disociación KEX2 de LysArg. Si ee requieren fusiones para solamente una secuencia de señal, esto se puede lograr mediante la utilización del sitio PstJ único que está presente adentro de la región que codifica la secuencia de señal. El sitio BslII es seguido por una secuencia sin importancia, ya que siempre se remueve cuando se clona el ORF de entrada en el plásmido, entre cualquiera de los sitios EcoRI , PstJ, ó BglII , y el sitio Salí , que marca el final del fragmento de embutido, y el principio de lae eecuenciae ter inadoras de feromona de factor a-1, nucleótidos 825 a 1100 de EMBL GENBANK número de acceso X01581. Esto es seguido inmediatamente por la secuencia AATTCGGATCC, que codifica el eitio BamHI que limita eete final del cartucho de expreeión. Este plásmido ee puede construir utilizando fragmentos de reacción de cadena de polimerasa (PCR) del DNA genómico de la levadura. Todos los oligonucléotidos utilizados en la reacción de PCR se sintetizan utilizando un sintetizador de DNA automático. Las reacciones de PCR se realizan en una unidad de PCR de Perkin Elmer, bajo las siguientes condiciones: 20 mM de los oligonucleótidos en cuestión se incuban en 0.1 mililitros de regulador (10 mM de Tris-HCl, pH de 8.3, 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCl2) con 2.5 unidades de Taq DNA-polimerasa, y 0.2 mM de dATP, dCTP, dTTP, y dGTP. Las reacciones se incuban durante 30 ciclos: 30 segundos a 92 °C, durante 1 minuto a 42 °C y a 72 °C durante 1 minuto. El fragmento que comprende la mayor parte de la señal de factor a y lae eecuencias líderes, ee genera a partir del DNA de levadura genómico utilizando loe fragmentos de PCR 1 y 2: 1. 5 ' GTGCGAATTCAAAATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAG 3 • 2. 5 ' CAAAGTCGACTTTATCCAGCAAGATCTCTTCTTCTTTAGCAGCAATGC 3 ' El fragmento que comprende el terminador de factor a se genera a partir de DNA de levadura genómico utilizando los fragmentoe de PCR 3 y 4 : 3. 5 ' GAAGAGATCTTGCTGGATAAAGTCGACTTTGTTCCCACTGTACTTTTAGC 3 ' 4. 5 ' CCGGGGATCCGAATTAATTCTCTTAGGATTCG 3 ' El fragmento que comprende el promotor de CUP1 se genera a partir de DNA de levadura genómico utilizando los fragmentos de PCR 5 y 6: 5. 5 ' TAGAGGATCCCCATTACCGACATTTGGGCGCTATACGTGC 3 » 6. 5 ' CGACGAATTCACAGTTTGTTTTTCTTAATATCTATTTCG 3 ' y la disociación subeecuente con BamHI y ecoRI . El fragmento que comprende la mayor parte de la señal de factor a y las secuencias líderes, y el fragmento que comprende al terminador de factor a, se mezclan y se reamplifican en una reacción de PCR con el oligonucleótido 1 y el oligonucleótido 3 , y se cortan con ecoRI y BamHI . El último fragmento amplificado y el fragmento que comprende el promotor de CUP1, se clonan en pTZ18R cortado con BamHI , y tratado con fosfataea alcalina bacteriana, para crear pFBY139.

Ejemplo 7: Construcción de pHE 174 Expresión de inhibidor de triptasa bajo en control del promotor de CUP1 regulado Se ensambla un gen eintético que codifica al inhibidor de triptasa en el uso del codón de levadura preferido, a partir de 3 oligonucleótidos sintéticos en una reacción de PCR. En adición, el gen se extiende en su extremo 51 para proporcionar una fusión adentro del marco conveniente con el líder de factor alfa en el plásmido pFBY 166. Se sintetizan los siguientes 3 oligonucleótidos utilizando un sintetizador de DNA automático: 1. 5 • -AAAGATCTTG CTGGATAAAA GAAAGAAGGT TTGCGCCTGT CCAAAAGATTT TGAAGCCAGT TTGTGGTTCT GACGGTCGTA CC-3 ' 2. 5'-ACAAGAACT TCAGACTTAA TAGAAACACC GTTACAACGG GCAATACAAG ACTTGGCGTA GGTACGACCG TCAGAACCAC-3 ' 3. 5 • -TTGTCGACTC AGTTCAAAAT ACCGGTTGGA CAAGAACCTT CAGACTTAA 3' de estos 3 oligonucleótidos, se ensambla un fragmento de 170bp en la siguiente reacción de cadena de polimerasa (PCR) , utilizando la unidad de PCR de Perkin Elmer, y lae eiguientee condicionee: 20 mM de oligonucleótidos 1 y 3, y 20 mM del oligonucléotido 2, se incuban en incuban en 0.1 mililitros de regulador (10 mM de Tris-HCl, pH de 8.3, 50 mM de KCl, 1.5 mM de MgCl2) con 2.5 unidades de Taq DNA-polimerasa, y 0.2 M de dATP, dCTP, dTTP, y dGTP. La reacción se incuba durante 30 ciclos: 30 segundoe a 92°C, durante 1 minuto a 42°C y a 72°C durante 1 minuto. El fragmento de PCR de 170 bp se aisla eobre un gel de agarosa al 2 por ciento, se restringe con BglII y Scill y se liga en pFBY 166 (supra) , cortado en BglII y Salí . La E . coli HB101 se transforma con el plásmido resultante pHE174. La cepa de E . coli transformada se designa como E . col i/pHE174. La fusión correcta del fragmento de PCR con el líder del factor a y la secuencia correcta del ORF del inhibidor de triptasa, se confirma mediante secuenciamiento.

Ejemplo 8: Construcción de pHE 175 y 175R Vectores de 2 mieras, con el cartucho de expresión del inhibidor de triptasa Para la expresión en levadura, se utiliza pDP34 como vector. El pDP34 (EP-A-340 170, Figura 3 de la misma) es un vector de lanzamiento de levadura-E. coli , con el marcador de resistencia a la ampicilina para E . coli y los marcadores selectivos de levadura de URA3 y dLEU2. Contiene las secuencias de 2 mieras completas en la forma A, y es eficiente en REP1, REP2 y FLP. El pláemido pDP34 ee digiere con BamHI , y los extremos pegajosos se desfoeforilan mediante tratamiento con fosfatasa alcalina. El pHE174 se digiere con BamHI , y el fragmento de 1119bp que contiene al cartucho de expresión del inhibidor de triptasa completo ligado en pDP 34 cortado en BamHI . El E . coli HB 101 se transforma con los plásmidoe resultantes pHE 175 y 175R. La orientación del inserto se prueba mediante digestión con Salí . El pHE 175 contiene el cartucho de expresión del inhibidor de triptasa en una orientación en la dirección de las manecillas del reloj con respecto a dLEU2 ; el pHE 175R en la orientación contraria a la dirección de las manecillas del reloj con respecto al marcador dLEU2.

Ejemplo 9 Construcción de pHE 176 El ORF del inhibidor de triptasa fundido con la secuencia de señal de invertasa (SUC2) Para proporcionar un sietema de secreción alternativo, el ORF del inhibidor de triptaea ee funde con la secuencia de señal del gen de invertasa de levadura SUC2. Se hacen los siguientee 2 oligonucleótidoe: 1. 5 ' -TTGTCGACTC AGTTCAAAAT A-3 ' 2. 5 ' -AAGAATTCAT GCTTTTGCAA GCTTTCCTTT TCCTTTTGGC TGGTTTTGCA GCCAAAATAT CTGCAAAGAA GGTTTGCGCC TGTC-3 ' El pHE 174 se utiliza como el DNA de plantilla para una reacción de cadena de polimerasa como se describió en el Ejemplo 7. Se incuban 20 nanogramos del pHE 174 de plantilla con 20 mM de los preparadoree de oligonucleótido bajo las condiciones experimentales como en el Ejemplo 7. El fragmento de PCR amplificado de 214bp, se aíela sobre un gel de agarosa al 2 por ciento, se restringe con EcoRI y Salí, y se liga en el vector pFBY 166 cortado en EcoRI y Salí . El E . coli HB 101 se transforma con el plásmido resultante pHE 176. La secuencia correcta de la fusión del inhibidor de triptasa de la eecuencia de eeñal SUC2 , se confirma mediante secuenciamiento.

Ejemplo 10: Construcción de pHE 177 y pHE 177R Vectores de 2 mieras con el cartucho de expresión del inhibidor de triptasa con la secuencia de señal de SUC2 En analogía al Ejemplo 8, el fragmento de BamHI de 918 bp que contiene al cartucho de expresión del inhibidor de triptasa, se separa del pHE 176 mediante digestión con BamHI , y se inserta en pDP 34 cortado en BamHI . El E . coli HB 101 se transforma con los plásmidos resultantes pHE 177 y pHE 177R.

La orientación del inserto se prueba mediante digestión con Salí. El pHE 177 contiene el cartucho de expresión del inhibidor de triptasa en una orientación en la dirección de las manecillas del reloj con respecto a dLEU2 , y el pHE 177R en una orientación contraria a la dirección de las manecillas del reloj .

Ejemplo 11: Construcción de Saccharomyces cerevisiae cepa TR 1456 El Saccharomyces cerevisiae cepa TR1456 se construye como se deecribe en la EP-A-341 215. Empezando con Saccharomyces cerevisiae cepa H449 (DMS 4413, MATa , leu23, 112, ura3, prbl [cir°]), en doe series subsecuentes de experimento, se remueven las dos carboxipeptidaeae yeca e yscY, a partir de la cepa H449, mediante alteración de sus genes codificadores KEX1 y PRC1, respectivamente. Primero se altera el gen que codifica ysca, KEX1. Para este propósito, la cepa H449 se transforma con un fragmento de DNA que codifica el gen de KEXl, con el gen de URA3 completo insertado a la mitad de la región codificadora de KEX1. Se seleccionan transformantes prototrópicos de uracilo y se prueban por la ausencia de actividad de ysca. Enseguida, el gen de URA3 insertado en el lugar de KEXl, se altera mediante transformación con un plásmido que contiene una versión alterada del gen, URA3?5 (ver la EP-A-341 215) . Los transformantes que son autotróficos de uracilo se seleccionan, y en el eiguiente paso se alteran en su gen PRC1 endógeno que codifica para el yscY. de la carboxipeptidasa. El experimento se lleva a cabo de una manera totalmente análoga, como se describió para la alteración de KEX1. El derivado isogénico finalmente reeultante de la cepa H449 se llama TR1456, y tiene el siguiente genotipo: TR1456 = MATa, leu2-3, 112, ura-3, prbl, kexl::ura3, prcl::ura3, [cir°] Ejemplo 12: Transformación de la cepa TR 1456 con los plásmidos pHE 175, 175R, 177 y 177R Los plásmidos pHE 175, 175R, 177 y 177R se introducen en las cepas huéspedee H449 y TR1456, reepectivamente, utilizando el protocolo de traneformación deecrito por Hinnen y colaboradoree (Proc. Natll. Acad. Sci. USA (1978), 75, 1929).

Otros detalles del procedimiento son como ee deecriben en la EP-A-341 215. Lae células de levadura traneformadas se seleccionan sobre medio mínimo de levadura, complementado con leucina, y careciendo de uracilo. Los clones de levadura transformados sencillos se aislan y son referidos como: Saccharo ycee cerevisiae TR 1456 / pHE 175 Saccharomyces cerevisiae TR 1456 / pHE 175R Saccharomyces cerevieiae TR 1456 / pHE 177 Saccharomyces cerevisiae TR 1456 / pHE 177R Saccharomyces cerevieiae H449 / pHE 175 Saccharomycee cerevieiae H449 / pHE 175R Saccharomycee cerevieiae H449 / pHE 177 Saccharomycee cerevisiae H449 / pHE 177R Ejemplo 13: Secreción de inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela mediante TR 1456 transformado con el plásmido pHE 177 Las células de Saccharomyces cerevisiae TR 1456 / pHE 177, se cultivan en dos precultivos subsecuentee de 20 mililitros cada uno. El medio sintético se compone de: 6.7 gramos/litro de base de nitrógeno de levadura Difco (sin aminoácidos) 10 gramos/litro de L-aeparagina 1 gramoe/litro de L-hietidina 20 gramos/ litro glucosa 0.02 gramos/litro L-leucina El pH del medio se ajusta a 5.8. El primer precultivo se cultiva durante 60 horas a 28°C y 180 r.p.m. El segundo precultivo se inocula con el 2 por ciento (volumen/ volumen) del primer precultivo, y se incuba durante 24 horas a 28°C y 180 r.p.m. El medio del cultivo principal se compone de: 5 gramos/litro de peptona 10 gramos/ litro de extracto de levadura 20 gramos/litro de glucosa 40 gramos/litro de sacarosa 3 gramos/litro de sulfato de amonio 2 gramos/litro de dihidrogenfosfato de potaeio 0.5 gramos/litro de etahidrato de sulfato de magnesio 0.1 gramos/litro de cloruro de sodio 0.1 gramos/litro de cloruro de calcio 10~5 gramos/litro de biotina El cultivo principal (100 mililitros de medio) se inocula con aproximadamente 106 células/mililitro, y se incuba durante 72 horas a 28°C y 180 r.p.m. Inmediatamente enseguida de la inoculación, se agrega sulfato de cobre estéril a una concentración de 1 mM, al cultivo. Al final de la fermentación, se toman alícuotas del cultivo, las células se remueven mediante centrifugación, y el sobrenadante del cultivo se analiza por la actividad del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela, mediante titulación del inhibidor con tripsina, como se describe en el 2.2. i) .

Ejemplo 14: Análisis del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela a partir de cultivos de fermentación de Saccharomyces cerevisiae cepa TR 1456 / pHE177, utilizando HPLC de fase inversa Las muestras de los sobrenadantes de cultivo de la cepa TR 1456 / pHE177, se sujetan a análisis de HPLC bajo las siguientes condiciones: Se utiliza una columna Merck Lichrospher 1000 RP-8 (4 x 250 milímetros, 10 mieras) . Se hace la fase móvil A a partir de agua (NanopurR, Barnstead) conteniendo el 0.1 por ciento (volumen/volumen) de ácido trifluoroacético. Se hace la faee móvil B a partir del 20 por ciento de agua (NanopurR, Barnstead) y el 80 por ciento de acetonitrilo (grado de HPLC, Fluka), conteniendo 0.09 por ciento (volumen/volumen) de ácido trifluoroacético. Las separaciones cromatográficas ee realizan a una velocidad de flujo de 1.5 mililitros/minuto, ejecutándose el siguiente gradiente (Tabla 9) . Los eluyentes ee eupervisan mediante absorbencia en 214 nanómetros.

Tabla 9 Se observa un p co mayor con un t empo de retención de 19.5 minutos sobre el cromatograma que eetá presente en las cepas que llevan el plásmido de expresión del inhibidor, pero ausente en las cepas no transformadas. Otro análisie reveló que este pico contiene una especie del inhibidor de triptasa derivado de sanguijuela con un Mr aparente de 4738.8, como fue detectado mediante espectroscopia de masa. Este valor está de acuerdo con el valor Mr calculado de 4738, señalando la molécula inhibidora de toda la longitud que lleva tanto al término N como al término C correctos. El peso molecular químico del inhibidor se determina mediante espectrometría de masa de ionización de desorción de láser asistida por matriz (MALDI-MS) utilizando un instrumento hecho en casa (Boernsen y colaboradores, Chimica (1990) 44, 412-416) .

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LISTADO DE SECUENCIA (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: UCP Gen-Pharma AG (B) CALLE: Kraftstr. 6 (C) CIUDAD: Zuerich (E) PAÍS: Suiza (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP) : CH-8044 (G) TELEFONO: 01 251 10 60 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Inhibidor de Triptasa (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 9 (iv) FORMA LEGIBLLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Paentln Rellease #1.0, Versión #1.2 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: No (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Hirudo medicinalis (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NUMERO DE IDENTIFICACIÓN D SECUENCIA: 1: Lys Lys Val Cys Ala Cys Pro Lye lie Leu Lys Pro Val Cys Gly Ser 1 5 10 15 Asp Gly Arg Thr Tyr Ala Asn Ser Cys lie Ala Arg Cys Asn Gly Val 20 25 30 Ser lie Lys Ser Glu Gly Ser Cys Pro Thr 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 43 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Hirudo medicinalis (iii) HIPOTÉTICO: No (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NUMERO DE IDENTIFICACIÓN D SECUENCIA: 2: Lys Lys Val Cys Ala Cys Pro Lys lie Leu Lys Pro Val Cys Gly Ser 1 5 10 15 Asp Gly Arg Thr Tyr Ala Asn Ser Cys lie Ala Arg Cys Asn Gly Val 20 25 30 Ser lie Lys Ser Glu Gly Ser Cys Pro Thr Gly 35 40 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 46 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (iii) HIPOTÉTICO: No (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NUMERO DE IDENTIFICACIÓN D SECUENCIA: 3: Lys Lys Val Cys Ala Cys Pro Lys lie Leu Lys Pro Val Cys Gly Ser 1 5 10 15 Asp Gly Arg Thr Tyr Ala Aen Ser Cye lie Ala Arg Cye Asn Gly Val 20 25 30 Ser lie Lys Ser Glu Gly Ser Cys Pro Thr Gly lie Leu Asn 35 40 45 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 126 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICO: SI (iii) CONTRA-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Hirudo medicinalis (Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NUMERO DE IDENTIFICACIÓN SECUENCIA: 4: AARAARGTNT GYGCNTGYCC NAARATHYTN AARCCNGTNT GYGGNWSNGA YGGNMGNACN TAYGCNAAYW SNTGYATHGC NMGNTGYAAY GGNGTNWSNA THAARWSNGA RGGNWSNTGY CCNACN (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 129 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (Üi) HIPOTÉTICO: SI (iii) CONTRA-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Hirudo medicinalis (Xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NUMERO DE IDENTIFICACIÓN SECUENCIA: 5: AARAARGTNT GYGCNTGYCC NAARATHYTN AARCCNGTNT GYGGNWSNGA YGGNMGNACN TAYGCNAAYW SNTGYATHGC NMGNTGYAAY GGNGTNWSNA THAARWSNGA RGGNWSNTGY CCNACNGGN (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 138 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (Üi) HIPOTÉTICO: SI (iii) CONTRA-SENTÍDO: NO (Vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Hirudo medicinalis (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NUMERO DE IDENTIFICACIÓN SECUENCIA: 6: AARAARGTNT GYGCNTGYCC NAARATHYTN AARCCNGTNT GYGGNWSNGA YGGNMGNACN TAYGCNAAYW SNTGYATHGC NMGNTGYAAY GGNGTNWSNA THAARWSNGA RGGNWSNTGY CCNACNGGNA THYTNAAY (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 7 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 149 paree de baee (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICO: SI (iii) CONTRA-SENTIDO: NO (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Hirudo medicinalis (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NUMERO DE IDENTIFICACIÓN SECUENCIA: 7: ATTTCGAAGA AGGTTTGCGC ATGCCAAAG ATCTTGAAGC CAGTCTGTGG TTCTGACGGT 6 CGTACATATG CTAACTCATG CATCGCTCGT TGTAACGGTG TATCGATCAA GTCTAAGGT 12 TCTTGTCCAA CCGGTATTTT AAACTAATA 14 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 149 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICO: SI (iii) CONTRA-SENTIDO: SI (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Hirudo medicinalis (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NUMERO DE IDENTIFICACIÓN SECUENCIA: 8: AGCTTATTAG TTTAAGTTAC CGGTTGGACA AGAACCTTCA GACTTGATCG ATACACCGTT 6 ACAACGAGCG ATGCATGAGT TAGCATATGT ACGACCGTCA GAACCACAGA CTGGCTTCAA 12 GATCTTTGGG CATGCGCAAA CCTTCTTCG 14 (2) INFORMACIÓN PARA EL NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 929 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) CORDONES: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 435..440 (D) OTRA INFORMACIÓN: /función= "sitio EcoRI" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: miec_feature (B) LOCALIZACION: 642..647 (D) OTRA INFORMACIÓN: /función= "eitio Salí" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: promotor (B) LOCALIZACION: 1..443 (D) OTRA INFORMACIÓN: /fenotipo= "promotor CUP1" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: sig_peptide (B) LOCALIZACION: 444..500 (D) OTRA INFORMACIÓN: /función= "eecuencia de señ de invertasa SUC2" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: matjpeptide (B) LOCALIZACION: 501..641 (D) OTRA INFORMACIÓN: /producto= "inhibidor triptasa" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: terminador (B) LOCALIZACION: 648.-923 (D) OTRA INFORMACIÓN: /nombre_estándar= "terminad de factor alfa" (ix) CARACTERÍSTICAS: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) LOCALIZACION: 924..929 (D) OTRA INFORMACIÓN: /función= "sitio BamHI" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: NUMERO DE IDENTIFICACIÓN SECUENCIA: 9: GATCCCCATT ACCGACATTT GGGCGCTATA CGTGCATATG TTCATGTATG TATCTGTATT TAAAACACTT TTGTATTATT TTTCCTCATA TATGTGTATA GGTTTATACG G-ATGATTTAA 1 TTATTACTTC ACCACCCTTT ATTTCAGGCT CATATCTTAG CCTTGTTACT AGTTAGAAAA 1 AGACATTTTT GCTGTCAGTC ACTGTCAAGA CATTCTTTTG CTGGCATTTC TTCTAGAAGC 2 AAAAAGAGCG ATGCGTCTTT TCCGCTGAAC CGTTCCAGCA AAAAAGACTA CCAACGCAAT 3 ATGGATTGTC AGAATCATAT AAAAGAGAAG CAAATAACTC CTTGTCTTGT ATCAATTGCA 3 TTATAATATC TTCTTGTTAG TGCAATATCA TATAGAAGTC ATCGAAATAG ATATTAAGAA 4 AAACAAACTG TAACGAATTC AAAATGCTTT TGCAAGCTTT CCTTTTCCTT TTGGCTGGTT 4 TTGCAGCCAA AATATCTGCA AAGAAGGTTT GCGCCTGTCC AAAGATTTTG AAGCCAGTTT 5 GTGGTTCTGA CGGTCGTACC TACGCCAACT CTTGTATTGC CCGTTGTAAC GGTGTTTCTA 6 TTAAGTCTGA AGGTTCTTGT CCAACCGGTA TTTTGAACTG AGTCGACTTT GTTCCCACTG 6 TACTTTTAGC TCGTACAAAA TACAATATAC TTTTCATTTC TCCGTAAACA ACATGTTTTC 7 CCATGTAATA TCCTTTTCTA TTTTTCGTTC CGTTACCAAC TTTACACATA CTTTATATAG 7 CTATTCACTT CTATACACTA AAAAACTAAG ACAATTTTAA TTTTGCTGCC TGCCATATTT 8 CAATTTGTTA TAAATTCCTA TAATTTATCC TATTAGTAGC TAAAAAAAGA TGAATGTGAA 9 TCGAATCCTA AGAGAATTAA TTCGATCC 9

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se considera como una novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una molécula inhibidora purificada de triptasa humana, que es un polipéptido; o los equivalentes funcionales de la misma que muestran una actividad inhibidora de triptaea.

2. El inhibidor de triptasa de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, que se puede obtener a partir de extractos de sanguijuelas.

3. El inhibidor de triptasa de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por: a) inhibir la triptasa humana con un valor K¿ en la escala de aproximadamente 0.1 a 10 nM; y b) dejar las proteinasas involucradas en la cascada de coagulación sanguínea humana sustancialmente sin afectarse.

4. El inhibidor de triptasa de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicacionee 1 a 3, caracterizado esencialmente por la secuencia de aminoácidos: Lys-Lys-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Lys-Ile-Leu 10 Lys-Pro-Val-Cys-Gly-Ser-Asp-Gly-Arg-Thr 20 Tyr-Ala-Asn-Ser-Cys-Ile-Ala-Arg-Cys-Asn 30 Gly-Val-Ser-Ile-Lys-Ser-Glu-Gly-Ser-Cys 40 Pro-Thr-X 42 en donde el residuo C-terminal X representa H (NU?ERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 1) , -Gly (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 2 ) , o -Gly-Ile-Leu-Asn (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 3) ; o los equivalentes funcionales del mismo, que tengan uno o más de los aminoácidos de la secuencia anterior suetituidos o suprimidos, o que tengan uno o más aminoácidos agregadoe, sin afectar sustancialmente su actividad inhibidora de triptasa.

5. Un equivalente funcional del inhibidor de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicaciones 1 a 4, el cual comprende la secuencia de aminoácidos: R1 -Cye-Pro-Lye-Ile-Leu Lys-Pro-Val-Z-Gly-Ser-Asp-Gly-Arg-Thr Tyr-Ala-Asn-Ser-Cys-Ile-Ala-R2 en donde: el residuo N-terminal R1 representa Ala- o Cys-Ala-; el residuo C-terminal R2 representa -Arg o -Arg-Cys; y Z define cualquier aminoácido.

6. Un inhibidor de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se puede obtener mediante síntesis de péptido o tecnología de DNA recombinante.

7. Un polinucleótido que codifica un polipéptido con una actividad inhibidora de triptasa, de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones l a 6; o el polinucleótido complementario del mismo.

8. El polinucleótido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 7, caracterizado porque incluye la secuencia de nucleótido (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4) : 1 AARAARGTNTGYGCNTGYCCNAARATHYTNAARCCNGTNTGYGGNWSNGA 51 YGGNMGNACNTAYGCNAAYWSNTGYATHGCNMGNTGYAAYGGNGTNWSNA 101 THAARWSNGARGGNWSNTGYCCNACNX en donde: R denota A ó G; M denota A ó C; W denota A ó T; S denota C ó G; Y denota C ó T; H denota A, C, ó T; N denota cualquier nucleótido; X denota 3' -OH (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 4) GGN (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5) ó GGN ATH YTN AAY (NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 6) ó el cordón complementario del mismo; y las secuencias de nucleótido que se hibridizan en la secuencia de DNA anteriormente mencionada.

9. El polinucleótido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 7, caracterizado porque-, incluye una secuencia de nucleótido que corresponde sustancialmente a los residuos de nucleótido 1 a 149, o de preferencia 7 a 144, del NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 7; o un fragmento del mismo.

10. El polinucleótido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 7, caracterizado porque incluye una secuencia de nucleótido que corresponde suetancialmente a los residuos de nucleótido 1 a 149, o de preferencia 10 a 147 del NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 8; o un fragmento del mismo.

11. Un oligonucleótido que se hibridiza en una secuencia de nucleótido que codifica un polipéptido con una actividad inhibidora de triptasa.

12. El oligonucleótido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 11, caracterizado porque incluye una secuencia de nucleótido que es sustancialmente complementaria a la secuencia de nucleótido de los residuos 22 a 87 del NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 5.

13. Un polinucleótido que codifica un polipéptido con una actividad inhibidora de triptasa, y que se puede obtener mediante hibridización con un oligonucleótido de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicaciones 11 y 12.

14. Un cartucho de expresión de polipéptido que comprende un promotor operablemente enlazado con una secuencia de DNA que codifica el polipéptido de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicaciones 7 a 10 y 13, y con una secuencia de DNA que contiene señales de terminación de transcripción.

15. El cartucho de expresión de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14, caracterizado porque incluye un promotor operablemente enlazado con una primera secuencia de DNA que codifica un péptido de señal enlazado en el marco de lectura apropiado, con un segundo polipéptido que codifica una secuencia de DNA de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicaciones 7 a 10 y 13, y una secuencia de DNA que contiene señalee de terminación de tranecripción.

16. El cartucho de expresión de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 15, caracterizado porque el promotor se selecciona a partir del grupo que consiste en CUPlp, y GAPDHp.

17. El cartucho de expresión de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 14 ó 15, caracterizado porque la secuencia de señal se selecciona a partir del grupo que consiste en el líder de factor a, PH05, y SUC2.

18. El cartucho de expresión de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque el terminador se selecciona a partir del grupo que consiste en el terminador de factor a y el terminador de PH05.

19. El cartucho de expresión de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizado porque incluye la secuencia del DNA del NUMERO DE IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIA: 9, o un equivalente funcional del miemo.

20. Un polipéptido codificado por un polinucleótido de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 13.

21. Un vector para la transformación de huéspedes eucarióticos o procarióticos, el cual comprende un polinucleótido de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicaciones 7 a 10 ó 13.

22. Un vector para la transformación de huéepedes eucarióticos o procarióticos, el cual comprende un cartucho de expresión de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicaciones 14 a 19.

23. El vector de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 21 ó 22, caracterizado porque es un vector de levadura basado en dos mieras.

24. EL vector de conformidad con lo reclamado en una las reivindicaciones 21 a 23, seleccionado a partir de: a) pRM9.1.4, como se depositó con el DSM, y que tiene el número de acceso DSM 9271; b) pRMll.1.4 como se depositó con el DSM, y que tiene el número de acceso DSM 9272; c) pRM5.1.5 como se depositó con el DSM, y que tiene el número de acceso DSM 9270; d) pRM4.1.4 como se depositó con el DSM, y que tiene el número de acceso DSM 9269; y e) pRM3.1.10 como se depositó con el DSM, y que tiene el número de acceso DSM 9268.

25. El vector de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicaciones 21 a 23, seleccionado a partir del grupo que consiste en pHE175, pHE175R, pHE177, y pHE177R.

26. Un método para la preparación de un inhibidor de triptasa humana, mediante: a) obtener un extracto de sanguijuela, y b) purificar el extracto mediante diálisie y cromatografía en columna.

27. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 26, caracterizado porque: a) el extracto ee dializa contra un regulador adecuado; b) el extracto dializado ee purifica mediante cromatografía de intercambio de cationes; cromatografía de afinidad bioespecífica, y una etapa adicional de cromatografía de intercambio de cationes.

28. Un método para la preparación de un inhibidor de triptasa recombinante, cuyo método incluye: a) transformar un huésped procariótico o eucariótico con un vector de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicaciones 21 a 25; b) inducir la expresión de la secuencia de codificación del inhibidor de triptasa; c) recuperar el producto de expresión; y opcionalmente d) remover del producto obtenido, los fragmentos del péptido no requeridos para la actividad inhibidora de triptasa, y/u opcionalmente renaturalizar el producto.

29. Un inhibidor de triptasa que se puede obtener mediante un método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 28.

30. Una composición farmacéutica que incluye una cantidad inhibidora de triptasa de un polipéptido de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicacionee 1 a 6, 20 y 29, opcionalmente en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

31. El uso de un inhibidor de triptasa de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 20 y 29, en el diagnóstico de desórdenes funcionales.

32. El uso de un polipéptido de conformidad con lo reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, 20 y 29, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de desórdenes relacionados con células cebadas.

33. El uso de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 31, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de asma, enfermedad intersticial del pulmón, artritis, enfermedad periodontal, desórdenes alérgicos, desórdenes de la piel, psoriaeie, o desórdenes de la coagulación sanguínea.

34. Un huésped procariótico o eucariótico transformado con un vector de conformidad con lo reclamado en una de las reivindicaciones 21 a 25, y variantes y mutantes del mismo.

35. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 34, caracterizado porque es Saccharomyces cerevisiae o E. Coli.

36. Un huésped eucariótico de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 35, depositado con el DSM, y que tiene el número de acceso DSM 9273, y variantes y -nutantes del mismo capaces de producir un polipéptido inhibidor de triptasa.

37. Un huésped de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 35, el cual se selecciona a partir del grupo que consiste en: Saccharomyces cerevisiae TR 1456 / pHE 175 Saccharomyces cerevisiae TR 1456 / pHE 175R Saccharomyces cerevisiae TR 1456 / pHE 177 Saccharomyces cerevisiae TR 1456 / pHE 177R Saccharomyces cerevisiae H449 / pHE 175 Saccharomyces cerevisiae H449 / pHE 175R Saccharomyces cerevisiae H449 / pHE 177 Saccharomyces cerevisiae H449 / pHE 177R, y variantes y mutantes de los mismos, capaces de producir un polipéptido inhibidor de triptasa. En testimonio de lo cual, firmo lo anterior en esta Ciudad de México, D. F. , a los 25 días del mes de julio de 1994. POR UCP GEN-PHARMA AG APODERADO Ing. Javier Saucedo C.