MXPA94003509A - Procedimiento para la produccion de compuestos demacrolida, producto obtenido y composicioninsecticida o acaricida - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un cultivo biológicamente purificado de Saccharopolyspora Spinosa seleccionada de entre NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538óNRRL 18539óun mutante de la misma productor de A85343.

Description

" PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS DE MACROLIDA, PRODUCTO OBTENIDO Y COMPOSICIÓN INSECTICIDA O ACARICIDA " Inventores: LAVERNE DWAINE BOECK, norteamericano, domiciliado en 741 Chapel Hill West Drive, Indianapolis , Indiana 46214, E.U.A.; HANG CHIO, norteamericano, domiciliado en 128 Lakeview Court South, Greenfield, Indiana 46140, E.U.A; TOM EDWARD EATON, norteamericano, domiciliado en 3991 Santa Clara Drive, Greenwood, Indiana 46142, E.U.A.; OTIS WEBSTER GODFREY, JR. , norteamericano, domiciliado en 222 Serenity Way, Greenwood, Indiana 46142, E.U.A.; KARL HEINZ MICHEL, alemán, domiciliado en 225 East North Street, Apt. 2205 Indianapolis, Indiana 46204, E.U.A.; WALTER MITSUO NAKATSUKASA, norteamericano, domiciliado en 1517 Iron Liege Road, Indianapolis, Indiana 46217, E.U.A. y RAYMOND CHE-FONG YAO, norteamericano, domiciliado en 1189 Woodgate Drive, Carmel, Indiana 46032, E.U.A.

Causahabiente: ELI LILLY AND COMPANY, corporación del Estado de Indiana, E.U.A., domiciliada en Lilly Corporate Center, Indianapolis, Indiana, E.U.A.

.•EXTRACTO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un nuevo grupo de compuestos de macrolida que ejercen actividad insecticida y acaricida. Existe una fuerte necesidad de nuevos insecticidas y acaricidas porque los organismos diana están desarrollando rápidamente resistencia a los insecticidas y acaricidas de uso corriente. La resistencia a los insecticidas en los artrópodos está muy extendida, siendo resistentes a uno o más insecticidas por lo menos 400 especies. El desarrollo de resistencia a los insecticidas más antiguos, como DDT, los carbamatos y los organofosfatos, es muy conocido. No obstante, se ha desarrollado resistencia incluso contra algunos de los más modernos insecticidas y acaricidas piretroides. Por lo tanto, exis te la necesidad de nuevos insecticidas y acaricidas.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El control de ectoparásitos, tales como moscas, garrapatas, moscas ordedoras y similares, se ha considerado desde hace mucho tiempo un problema importante en la cria de animales. Los tratamientos tradicionales de los animales domésticos consisten en aplicar insecticidas tópicamente, como los famosos baños de las ovejas. De hecho, todavía estos tratamientos se utilizan ampliamente. En la actualidad, sin embargo, el motivo de las investigaciones ha sido tratar de hallar compuestos gue puedan ser administrados a los animales, especialmente por vía oral, y que controlen los ectoparásitos envenenando al parásito cuando ingiere la sangre del animal tratado. Esta invención se refiere a un nuevo producto de fermentación denominado "A83543", que está constituido por los componentes individuales A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H y A83543J. El A83543 y sus componentes individuales son útiles para el control de insectos, especialmente lepidópteros, tales como el gusano soldado del sur, y dípteros, tales como la mosca de los establos y el mosquito, proporcionando así composiciones y métodos insecticidas útiles para reducir la población de insectos o ácaros empleando compuestos de A83543. Los compuestos de A83543 de esta invención son compuestos de fórmula 1: donde R es H o un grupo seleccionado entre es RO s?_ -, 1 3 R 6 R , R , R y R son hidrógeno o metilo y 4 R es metilo o etilo; o una sal de adición de ácido de los compuestos cuando R es distinto de hidrógeno. Los compuestos preferidos de esta invención, desde el punto de vista de su facilidad de preparación, son aquéllos donde R, R , R , R y R se encuentran en una de las siguientes combinaciones: R R1 R3 R4 R5 R6 (a) Me H Et Me Me (b) Me H Et Me Me (O Me H Et Me Me (a) Me Me Et Me Me (a) Me H Me Me Me (a) H H Et Me Me (d) Me H Et Me Me (a) Me H Et H Me (a) Me H Et Me H H Me H Et Me Me H Me Me Et Me Me H Me H Me Me Me H H H Et Me Me H Me H Et H Me H Me H Et Me H o una sal de adición de los compuestos cuando R es distinto de hidrógeno. Se ha demostrado que el aminoázucar de A83543A es la ß-D-forosamina y el azúcar neutro en A83543A es a-2, 3,4-tri-O-metilramnosa. Se han caracterizado 9 componentes de A83543. Estos componentes son los compuestos de fórmula 1 donde R es distinto de H. Tienen las siguientes estructuras: Componente R R1 R3 R4 R5 R6 A (a) Me H Et Me Me B (b) Me H Et Me Me C (c) Me H Et Me Me D (a) Me Me Et Me Me E (a) Me H Me Me Me F (a) H H Et Me Me G (d) Me H Et Me Me H (a) Me H Et H Me J (a) Me H Et Me H El aminoazúcar puede ser eliminado de los componentes A83543 para formar pseudoagliconas (compuestos de fórmula 1 donde R = H) . Los componentes A, B, C y G tienen una pseudoaglicona común (la pseudoaglicona A83543A o pseudo-A) . Más adelante se halló que la pseudoaglicona A83543A es producida naturalmente como un componente de A83543. Los componentes D, E, F, H y J contienen cada uno una pseudoaglicona única. Las pseudoagliconas A83543 tienen las siguientes estructuras: Pseudoaglicona R1 R3 R4 R5 R6 A83543A Me H Et Me Me A83543D Me Me Et Me Me A83543E Me H Me Me Me A83543F H H Et Me Me A83543H Me H Et H Me A83543J Me H Et Me H aR = H.

- - Las pseudoagliconas son útiles como intermedios, por ejemplo, para los componentes A83543. En los siguientes párrafos se resumen las propiedades físicas y espectrales de los componentes y pseudoagliconas A83543. En las discusiones que siguen, se utilizan las siguientes abreviaturas: EM-IE: espectrometría de masas por impacto electro nico EM-BAR: espectrometría de masas por bombardeo atómico rápido EM-DC: espectrometría de masas por desorción en campo HPLC : cromatografía de líquidos de alto rendimiento IR : infrarrojo RMN : resonancia magnética nuclear UV : ultravioleta. Características de A83543A Peso molecular: 731 Fórmula empírica: C41Hg5NO10 EM-DC: Véase la Figura 4 EM-BAR (M + 1): Encontrado: 732,4706; Calculado para 41Hg6 O10=: 732,4687 (véase la Figura 8) EM-IE: Encontrado: 731,4612; Calculado: 731,4608 (véase la Figura 10) UV(EtOH) ?max: 243 nm (e 8920) - - IR (CHC13) : v (.lactona) 1713; (cetona conjugada) 1657; multipletes para vibraciones C-H alrededor de 2940 y para vibraciones C-0 alrededor de 1060 cm" (véase la Figura 1) 529 fa}D -121,8° (c = 1,03, CHC13) í }365: +6,8° (c = 1,03, CHClg) . En la Tabla I se resumen los datos de los espectros de RMN 1H y 13C observados con A83543A (en acetona-dg) . TABLA I Datos de RMN H y - i1J3Cc ddee AA8l3543A en acetona-dg Posición 13c V 1 172, ,02 2 33, ,83 3,r07/2, ,45 3 48, ,13 2, ,94 4 1, ,65 3, ,48 5 129, ,12 5,r86 6 129, ,66 5,r89 7 41, ,46 2,rl5 9 76, ,31+ 4, ,31 10 37, ,65 2, ,36/1, ,36 11 46, ,42 0| ,93 12 49, ,74 2,r87 13 147, ,78 l l ,01 TABLA I (cont.) 13 lfía Posic :ión iJC 14 144,27 15 202,46 16 47,74 3,30 17 80,41 3,53 18 30,33 1,51 19 21,85 1,78/1,17 34,45 1,50 21 76,24+ 4,66 22 28,51 1,48 23 8,97 0,81 24 15,71 1,12 1' 96,34 4,81 2' 77,61 3,51 3' 81,87 3,37 4' 82,43 3,00 » 68,03 3,48 6' 17,64 1,18 3'-•0CH3 58,39* 3,41 4'--0CH3 60,12 3,45 1" 103,45 4,45 2" 31,24 1,92/1,37 3" 18,14 1,84/1,52 TABLA I (cont.) Posici n 13C 4" 65,34 2,12 5" 73,35 3,56 6" 18,87 1,21 N(CH3 40,38 2,22 >2 a Se tomaron algunas medidas de la correlación 1H/13C.

'* Las resonancias con el mismo supraíndice pueden ser intercambiadas . Características de A83543B Peso molecular: 717 Fórmula empírica: C4QH63N010 EM-BAR: (véase la Figura 9) Características de A83543C Peso molecular: 703 Fórmula empírica: C3gH61NO10 EM-DC: (véase la Figura 5) . Características de A83543D Peso molecular: 745 Fórmula empírica: C.2Hg_N01Q UV (EtOH) ?max: 244 nm (e 9.910) IR (CHC13) : (lactona) 1708; (cetona conjugada) 1658; multipletes para vibraciones C-H alrededor de 2940 y para vibraciones C-0 alrededor de -i 1070 cm (véase la Figura 2) ía} 389: -142,9° (c = 1,02, CHC13) ía}365: -29,9° (c = 1,02, CHC13) EM-DC: véase la Figura 6. En la Tabla II se resumen los datos de RMN H y 13C observados con A83543D (en acetona-dg) . TABLA II Datos de RMN XH y 13C de A83543D en acetona-d6,.

P 'osicidn 13C 1 172,68 - 2 34,38 3,08/2,43 3 49,01 2,90 4 42,83 3,47 5 123,27 5,54 6 137,26 - 6-CH3 20,81 1,74 7 44,41 2,18 8 35,61 2,01/1,45 9 76,72 4,32 10 38,64 2,37/1,37 11 47,04 1,02 12 50,05 2,78 13 148,47 7,04 14 145,19 - 15 203,16 - 16 48,47 3,30 TABLA II (cont.) Posición 13c lHa 17 81,03 3,53 18 30,99 1,49 19 22,51 1,78/1,19 35,12 1,49 21 76,84 4,65 22 29,16 1,48 23 9,55 0,81 24 16,32 1,12 1' 97,11 4,85 2' 78,33 3,54 3' 82,58 3,40 4' 83,15 3,03 ' 68,71 3,50 6' 18,26 1,18 2'-OCH3 57,31* 3,40 3'-OCH3 59,02* 3,43 4'-OCH3 60,71 3,47 1" 104,14 4,47 2" 31,96 1,94/1,39 3" 18,83 1,81/1,49 4" 66,06 2,12 •5" 74,12 3,55 6" 19,42 1,20 N(CH •j) 40,99 2,21 a i 1 "*? Se tomaron algunas medidas de la correlación H/ C.

* Las resonancias pueden ser intercambiadas. Características de A83543E Peso molecular: 717 Fórmula empírica: C.0Hg3 O10 EM-BAR CM + 1) : Encontrado: 718,4526; Calculado para C40H64NO1(): 718,4530 UV (EtOH) ? ItlaX: 2 24444 nnmm ((ee 88..66000? ) IR (KBr) Cvéase la Figura 13) . En la Tabla III se resumen los datos de RMN H y 13 C observados con A83543E (en acetona-do.-) . TABLA III Datos de RMN H.y 13C de A83543E en acetona-d6-.

Posición 13c V 1 172,46 — 2 34,95 3,06/2,40 3 48,88 2,95 4 42,11 3,43 5 129,78 5,86 6 130,39 5,90 7 42,11 2,14 8 37,18 1,96/1,39 9 77,06 4,33 10 38,31 2,36/1,36 TABLA III (cont.) Posicidn 13c 1H3 11 47,18 0,93 12 50,40 2,86 13 148,37 7,06 14 144,84 15 203,09 16 48,05 3,34 17 81,35 3,55 18 34,98 1,62/1,48 19 22,25 1,77/1,13 33,73 1,50 21 72,97 4,68 22 21,61 1,12 23 - 24 16,52 1,13 1' 97,11 4,83 2» 78,36 3,55 3' 82,55 3,37 4' 83,13 3,02 ' 68,72 3,50 6' 18,26 1,18 2'--0CH3 59,01 3,43 3'--OCH, 57,30 3,40 TABLA III (cont.) Posición 13c 1Ha 4 ' -OCH3 60,69 3,46 1" 104,24 4,47 2" 32,00 1,93/1,39 3" 18,86 1,82/1,50 4" 66,06 2,12 5" 74,13 3,57 6" 19,42 1,21 N(CH3)2 40,99 2,21 a Se tomaron algunas medidas de la correlación 1H/13C.

Características de A83543F Peso molecular: 717 Fórmula empírica: C4QHg,NO.,0 EM-BAR (M + 1): Encontrado: 718,4534; Calculado para 40H64NO10= 718'4530 UV (EtOH) ? ?mUCL.X: 243 nm (e 10.500) y 282 nm ( e 109) IR (KBr) : (véase la Figura 14) . En la Tabla IV se resumen los datos de RMN 1H y 13C observados con A83543F (en acetona-dg) .

TABLA IV Datos de RMN ^ y {C de A83543F en acetona-d 0,.

Posición 13c lHa 1 172,60 - 2 34,50 3,06/2,42 3 48,82 2,95 4 42,46 3,45 129,56 5,87 6 130,39 5,92 7 42,19 2,16 8 37,18 1,97/1,35 9 77,15 4,65 38,30 2,33/1,34 11 46,89 0,94 12 50,34 2,84 13 148,86 7,03 14 145,73 - 15 198,68 - 16 45,49 3,22/2,50 17 74,17 3,58 18 30,74 1,52 19 22,41 1,70/1,17 34,45 1,51 21 77,09 4,32 22 29,05 1,48 TABLA IV (cont.) Posición 13C 23 9,56 0,81 1' 97,19 4,83 2' 78,38 3,53 3' 82,58 3,38 4' 83,15 3,00 5' 68,74 3,48 6' 18,25 1,18 2'--OCH3 59,02 3,43 3'--OCH3 57,31 3,40 4'--OCH3 60,69 3,47 1" 100,19 4,53 2" 32,41 1,80/1,38 3" 18,86 1,83/1,53 4" 66,16 * 2,13 5" 74,01 4,01 6" 19,46 1,22 N(CH3)2 41,01 2,22 Se tomaron algunas medidas de la correlación 1H/13C. Características de A83543G Peso molecular: 731 Fórmula empírica: C iH65N0?n EM-BAR (M + 1): Encontrado: 732,4661; Calculado para c ?H66NOl?= 732*-4687 UV (EtOH) ?_ : 243 nm (e 8.970) IR (KBr) : (véase la Figura 15) . En la Tabla V se resumen los datos de RMN H y 13C observados con A83543G (en acetona-d-) . TABLA V Posic.ion 13c 1 172,59 - 2 34,67 3,04/2,46 3 48,72 2,94 4 42,25 3,50 5 129,85 5,84 6 130,26 5,89 7 42,02 2,14 8 37,12 1,95/1,34 9 76,99 4,32 10 38,28 2,36/1,36 11 47,23 0,91 12 50,43 2,87 13 148,28 7,04 14 144,61 - 15 203,20 - 16 47,94 3,30 17 81,73 3,57 18 35,20 1,55 TABLA V (cont.) Posición 13c lHa 19 21,68 1,64/1,16 31,41 1,64/1,36 21 76,47 4,64 22 28,84 1,48 23 9,61 0,80 24 15,29 1,18 1' 96,98 4,81 2 ' 78,23 3,52 3 ' 82,46 3,37 4' 83,05 2,29 5' 68,64 3,49 6' 17,18 1,12 2'--0CH3 58,97 3,42 3'--OCH3 57,25 3,39 4*--OCH3 60,70 3,46 1" 99,51 4,80 2" 29,62 1,87/1,48 3" 19,31 1,73 4" 62,13 2,29 5" 69,93 4,20 6" 18,22 1,17 N(CH3)2 43,47 2,24 1 13 Se tomaron algunas medidas de la correlación H/ C Características de A83543H Peso molecular: 717 Fórmula empírica: C . -Hg-NO., - UV (EtOH) ?max: 243 nm (e 10.100)* IR (KBr): véase la Figura 16*. * determinado en una mezcla de A83543H:J (58:42) Características de A83543J Peso molecular: 717 Fórmula empírica: C nH63N^?n UV (EtOH) ? max: 243 nm (e 10.100)* IR(CHC13) : véase la Figura 16* * determinado en una mezcla de A83543H:J (58:42) Los componentes A83543H y J se separaron de A83543 como mezcla (relación H:J = 58:42) que puede ser separada por cromatografía analítica de líquidos de alto rendimiento (HPLC) , como se describe más adelante. Las estruc turas atribuidas a A83543H y J se basan en los estudios-' de RMN 1H y 13C de la mezcla de A83543 H:J en acetona-dg .

Los espectros de RMN se parecen a y fueron comparados con los de A83543A. Las principales variaciones en los espectros de H y J se centran alrededor del azúcar ramnosa. Los componentes H y J tienen solamente dos grupos OCH3 en ese azúcar. En el componente H, H-l' se desplaza aproximadamente 0,1 <5 en el espectro de RMN H y 3 { en el .es-pectro de RMN 13C (4,81 y 99,68, respectivamente). Estos desplazamientos son debidos a la ausencia de metilo en el metoxi de la posición 2 ' . Los desplazamientos en el componente J corresponden a una ausencia similar del metilo en el metoxi de la posicidn 3'. Características de la pseudoaglicona A83543A Peso molecular: 590 Fórmula empírica: C,3H50Og: UV (EtOH) ? ?UclX: 243 nm (e 10.300) IR (CHC1,) : (lactona) 1724; (cetona conjugada) 1652; multipletes para vibraciones C-H alrededor de 3017; multipletes para vibraciones C-0 alrededor de 1140 cm" (véase la Figura 3) . EM-DC: véase la Figura 7. EM-IE: véase la Figura 11. Características de la psudoaglicona A83543D Peso molecular: 604 Fórmula empírica: C34H5_0.. Los componentes A83543 pueden separarse unos de otros empleando uno de los siguientes sistemas de HPLC analítica: SISTEMA I Columna: ODS, 3 y, 4,5 x 50 mm (IBM) Disolvente: CH30H:CH3CN:H20 (2:2:1) Velocidad de flujo: 1,0 ml/min.

Detección: UV a 245 n Temperatura: temperatura ambiente Componertte Tiempo de retención (min. ) A 8,50 B 6,15 C 3,92 D 11,47 SISTEMA II Columna: 4,6 x 100 mm, ODS (~ (AQ-301, S-5; YMC, I»C. , Mt. Freedom, NJ) Disolventes: CH30H:CH3CN: H40Ac 0,05 % (H20) (A) 35:35:30 - pH 7,8 CB) 45:45:10 - pH 6,7 Velocidad de flujo: 2,0 ml/min. Tiempo de recorrido: 35 min. Detección: UV, 250 nm Gradiente: 10 % B a 25 % B en 20 minutos, hasta 50 % B en 30 minutos. Tiempo de retención Componente (minutos) A 22,62 Pseudo-A 7,27. B 12,65 C 10,62 D 25,47 Tiempo de reten¬ Compo:nente ción (minutos) E 19,22 F 16,30 G 18,92 H 16,30 J 17,50 SISTEMA III Columna: 4,6 x 100 mm, ODS (AQ-301, S-5; YMC, Inc., Mt. Freedom, NJ) Disolventes: CH3OH:CH3C :NH40Ac 0,05 % (H20) 35:35:30 - pH 6,0 Velocidad de flujo: 2,0 ml/min. Tiempo de recorrido: 10 min. Detección: UV, 250 nm. Tiempo de reten- Componente cidn (min.) F 4,32 H 3,42 J 3,42 Los componentes A83543 no son solubles en agua pero sí lo son en disolventes como metanol, etanol, dimetilformamida, dimetilsulfdxido, acetonitrilo, acetona y similares. A83543 y sus componentes individuales, es decir A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H y A83543J, pueden reaccionar para formar diversas sales. Todas estas formas de estos compuestos constituyen parte de la invención. Las sales de A83543 son útiles, por ejemplo, para separar y purificar A83543. Además, algunas sales presentan mayor solubilidad en agua. Las sales de A83543 se preparan empleando los procedimientos habituales para la preparación de sales. Por ejemplo, el A83543 puede ser neutralizado con un ácido apropiado para formar una sal de adición de ácido. Las sales de adición de ácidos son especialmente útiles. Sales adecuadas representativas son las formadas mediante las reacciones conocidas con ácidos orgánicos e inorgánicos como, por ejemplo, sulfúrico, clorhídrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, maleico, fumárico, cólico, pamoico, úcico, glutámico, canfdrico, glutárico, glicólico, ftálico, tartárico, fórmico, láurico, esteárico, salicílico, metanosulfónico, bencenosulfdnico, sdrbico, pícrico, benzoico, cinámico y ácidos similares. En las discusiones de utilidad, el término "compuesto de A83543" denota preferiblemente un miembro seleccionado entre el grupo formado por A83543, los componentes individuales A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G,= A83543H y A83543J y sus sales de adición de ácidos.

El producto de fermentación A83543 es producido cultivando una cepa del nuevo microorganismo Saccharopolyspora spinosa seleccionada entre NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 y NRRL 18539 o mutantes de las mismas productoras de A83543, en condiciones aerobias sumergidas en un medio de cultivo adecuado hasta que se ha producido una cantidad recuperable de A83543. Como advertirán los expertos en los procesos de fermentación, la relacidn de los componentes en A83543 variará con las condiciones de fermentación utilizadas para producirlo. En general, el A83543 contiene alrededor de 85-90 % de A83543A, alrededor del 10-15 % de A83543D y pequeñas cantidades de A83543B, C, E, F, G, H y J y de pseudoaglicona A83543A. Los componentes individuales, es decir, A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H y A83543J y pseudoaglicona A83543A pueden ser separados y aislados como se describe más adelante. Por lo tanto, otro aspecto de esta invención es un procedimiento para la producción de un compuesto de A83543 gue consiste en cultivar una cepa de Saccharopolyspora spinosa seleccionada entre NRRL 18395, NRRL 18357, NRRL 18538 o NRRL 18539 o un mutante de las mismas productor de A83543, en un medio de cultivo que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y sales inorgánicas, bajo condiciones de fermentación aerobia sumergida, hasta que se produce una cantidad recuperable de A83543. Los componentes individuales pueden ser aislados después por técnicas cono- - - cidas per se. Esta invención también se refiere a un cultivo biológicamente purificado del microorganismo Saccharopolyspora spinosa seleccionado entre NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 o NRRL 18539 o un mutante de las mismas productor de A83543. Estos microorganismos son útiles porgue producen A83543. Por comodidad en las discusiones que siguen, las cepas han recibido las siguientes designaciones: A83543.1, A83543.3, A83543.4 y A83543.5. El cultivo A83543.1 se obtuvo por mutación química de un cultivo (A83543) aislado de una muestra de tierra recogida en las Istas Vírgenes. Los cultivos A83143.3, A83543.4 y A83543.5 se obtuvieron a partir de derivados del cultivo A83543.1 mediante mutaciones químicas. Los cultivos A83543.1, A83543.3, A83543.4 y A83543.5 han sido depositados y forman parte de la colección de cultivos de reserva del Midwest Área Northern Regional Research Center, Servicio de Investigaciones Agrícolas, Ministerio de Agricultura de Estados Unidos, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604, donde pueden solicitarse bajo los siguientes números de accesión: NRRL n° Cepa nß 18395 A83543,l 18537 A83543.3 18538 A83543.4 18539 A83543.5. Frederick P. Mertz, de los Lilly Research Laboratories, realizó los estudios taxonómicos del cultivo A83543.1. Basándose en estos estudios, los microorganismos A83543.1, A83543.3, A83543.4 y A83543.5 han sido clasificados como miembros de una nueva especie del género Saccharopolyspora, que es denominada Saccharopolyspora spinosa sp. nov. Esta clasificación se basa en comparaciones directas en laboratorio y estudio de las descripciones publicadas de especies similares. Métodos empleados Los métodos seguidos son los recomendados por el International Streptomyces Pro ect (ISP) para la caracterización de la especie Streptomyces [E . B. Shirling y D. Gottlieb, "Methods fór Characterization of Streptomyces Species", Int. J. Syst. Bacteriol. 16:313-340 (1966)1 y los recomendados para la caracterización de la especie Nocardia por R. E. Gordon, D. A. Barnett, J. E. Hander-han y C. H. Pang, "Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophi-ca y Nocardia Strain", Int. J. Syst. Bacteriol. 24(1), 54-63 (1974) . Para atribuir los nombres de los colores al reverso y a las hifas aéreas se utilizaron los gráficos ISCC-NBS Centroid Color Charts, muestra patrón n° 2106 (National Bureau of Standards, 1958, Ministerio de Comercio de Estados Unidos, Washington, D.C.). La morfología se estudió empleando un microscopio dptico y un microscopio electrónico de barrido (MEB) . El isómero del ácido diaminopimélico (DAP) y los hidratos de carbono en los hidrolizados de células completas se establecieron por los métodos cromatográficos de Becker y col. [B. Becker, M. P. Lechevalier, R. E. Gordon y H.E. Lechevalier, "Rapid Differentiation between Nocardia y Streptomyces by Paper Chromatography of Whole-cell Hydro-lysates", Appl. Microbiol. 1¿, 421-423 (1964)] y de Lechevalier y Lechevalier M. P. Lechevalier y H. Lechevalier, "Chemical Composition as a Criterion in the Classification of Aerobic Actinomycetes", Int. J. Syst. Bacteriol. 20, 435-443 (1970)]. Los fosfolípidos se determinaron por el procedimiento de M. P. Lechevalier y H. Lechevalier [_ en A University Laboratory Approach, Dietz and Thayer (directores de edicidn) , Society for Industrial Microbiology Special Publication n° 6, Arlington, VA, págs. 227-233 (1980)1. La composicidn menaquindnica se determinó siguiendo los métodos de R. M. Kroppenstedt en Chemical Methods in Bacterial Systematics, M. Goodfellow y D. E. Minnikin (directores de edición), 1985, págs. 173-196] y M. D. Collins (ibid., págs. 267-285). La resistencia a los antibióticos se midió aplicando discos de sensibilidad a los antibióticos sobre la superficie de placas de agar ISP n° 2 sembradas. La hidrólisis del almidón se determinó estudiando la presencia de almidón con yodo en placas de agar ISP n° 4 (sales inorgánicas-almidón) . El análisis de ácidos grasos se realizó empleando el Sistema de Identificación Microbiana HP 5898A [Véase L. Miller y T. Berger, "Bacterial Identification by Gas Chropa- tography of Whole Cell Fatty Acids", Hewlett-Packard Application Note 228-241, 8 págs. (1985)]. Los esteres metílicos de ácidos grasos se prepararon a partir de células completas liofilizadas crecidas bajo condiciones idénticas. El análisis de los componentes principales fué bidimensional y generado por ordenador. Las unidades de medida en el gráfico de componentes principales (mostrado en la Figura 12) son desviaciones típicas. Los ácidos micólicos se determinaron por los métodos propuestos por Minnikin [D. E. Minnikin, I. G. Hutchinson y A. B. Caldicott, "Thin-Layer Chromatography of Methanoly-sates of Mycolic Acid-Containing Bacteria", J. Chromatography 188, 221-233 (1980)]. Características de cultivo El cultivo A83543.1 crecid bien tanto en medios complejos como definidos. El cultivo produjo micelios aéreos en todos los medios empleados. El color de la masa de esporas aéreas fué predominantemente rosa amarillento pálido pero era blanco en algunos de los medios. El reverso era de amarillo a castaño amarillento. No se observd pigmentación distintiva. En algunos medios se liberó al medio un pigmento pardo soluble. Las características de cultivo se encuentran resumidas en la Tabla VI .

TABLA VI Características de cultivo de A83543.1 Color del Micelio aéreo Pigmento so- Medio Crecimiento reverso Crecimiento Color luble Medio ISP 2 Abundante 76. 1. yBr. Abundante 92.yWhite Ninguno Medio ISP 3 Bueno 264. 1. Gray Bueno 263. White Ninguno Medio ISP 4 Bueno 92. yWhite Bueno 263. White Ninguno Medio ISP 5 Abundante 73. p. OY Abundante 31. p. yPink 1. Brown Medio ISP 7 Abundante 77. m. yBr Abundante 31. p. yPink 1. Brown i Agar AIA Abundante 89. p. Y Abundante 31. p. yPink Brown ATCC n° 172 Abundante 92. yWhite Abundante 31. p. yPink Ninguno Bennett Abundante 92. yWhite Abundante 31. p. yPink 1. Brown Malato c lcico Bueno 73. p. OY Mediano 9. p. k. White Brown Citina Mediano 92. yWhite Mediano 263. White Ninguno Czapek Bueno 92. yWhite Bueno 263. White Ninguno Emerson Abundante 76. 1. yBr Abundante 31. p. yPink Brown Glucosa-aspa Bueno 90. gy. Y Mediano 31. p. yPink 1. Brown ragina Glicerol-glicina Abundante 78. d. yBr Abundante 80. gy. yBr d. Brown TABLA VI (cont.) Características de cultivo de A83543.1' Color del Micelio aéreo Pigmento so¬ Medio Crecimiento reverso * Crecimiento Color luble Nutriente Abundante 90. gy. Y Abundante 31. p. yPink 1. Brown TPOC Abundante 90. gy. Y Abundante 31. p. yPink Ninguno TWAd Mediano 93. yGray Pobre 263. White Ninguno YDAe Abundante 77. m. yBr Mediano 9. pk. White d. Brown Incubado a 30°C durante 21 días Agar de aislamiento de Actinomice os, Difco Agar pasta de tomate-harina de avena. En The Actinomycetes, Vol. 2, S. A. Waksman, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, 1961) Agar agua corriente (Gordon, Barnett, Handerhan y Pang, supra) Agar levadura dextrosa (Gordon, Barnett, Handerhan y Pang, supra) Características morfológicas El cultivo A83543.1 produjo un extenso micelio substrato que se fragmentó en fermentación líquida. No se observó fragmentación cuando el cultivo se creció sobre medios de agar. Cuando el cultivo se depositó sobre medio ISP 1, se observaron colonias circulares blancas, de 8-10 mm de diámetro con parte central protuberante y reverso de color castaño amarillento. En la mayoría de los medios se encontraban hifas aéreas bien formadas. Las hifas aéreas se segmentaron en largas cadenas de esporas dispuestas como ganchos y bucles abiertos. También se observaron espirales pero eran cortas e incompletas. La morfología general era Rectus-flexibilis (RA) .

Las hifas aéreas presentaban un distintivo aspecto moniliforme con muchos espacios vacíos en la cadena de esporas. Esta característica indicaba que la cadena de esporas estaba embutida en una vaina esporal. Esta vaina espo-ral estaba cubierta con espinas muy evidentes. Las espinas tenían aproximadamente 1 um de longitud y eran redondeadas en los extremos . La forma de las esporas era oblonga, con un tamaño medio de 1,1 x 1,5 y m aproximadamente. La longitud de la cadena de esporas era muy superior a 50 esporas. No se ob-servaron ningunas características en zig-zag, esclero-cios, esporangios o células mótiles. Caracteristicas fisiológicas El cultivo A83543.1 produjo ácido a partir de los siguientes hidratos de carbono: adonitol, D-arabinosa, eritritol, fructosa, glucosa, glicerol, manitol, mañosa, ribosa y trehalosa. El cultivo no produjo ácido a partir de L-arabino-sa, celobiosa, celulosa, dextrina, dulcitol, etanol, galactosa, glicógeno, inositol, inulina, lactosa, maltosa, me-licitosa, melebiosa, a-metil-D-glucdsido, rafinosa, L-ram-nosa, salicina, sorbitol, L-sorbosa, sacarosa, xilitol o xilosa. Se observó crecimiento con galactosa, maltosa y melicitosa pero no se produjo ácido a partir de estos hidratos de carbono. El cultivo A83543.1 utilizó los siguientes ácidos orgánicos como sales sódicas: acetato, butirato, citrato, formiato, lactato, malato, propionato, piruvato y succinato. El cultivo no utilizó benzoato, ucato, oxalato o tartrato. El A83543.1 descompuso la alantoína, el maleato calcico, caseína, elastina, hipurato, hipoxantina, testosterona, L-tirosina y urea. Fué incapaz de descomponer adenina, esculina, guanina, almiddn o xantina.

El A83543.1 produjo catalasa, fosfatasa, ureasa y H2S. Licud la gelatina y redujo los nitratos. No era resistente a la lisozima y no produjo pigmentos melanoi<|es. No peptonizd ni hidrolizd la leche descremada. El A83543.1 toleró niveles de NaCl hasta del 11 %. Fué incapaz de so brevivir a 50 °C durante 8 horas pero creció a temperaturas entre 15 y 37°C. El A83543.1 era resistente a la cefalotina (30 yg) , penicilina G (10 unidades) y rifa pina (5 yg) . Era sensible a bacitracina (.10 unidades), gentamicina (10 yg) , linco icina (2 yg) , neomicina (30 yg) , oleandomicina (15 yg) estreptomicina (10 yg) , tetraciclina (30 yg) , tobramici-na (10 yg) y vancomicina (30 yg) .

Análisis de la pared celular Las células completas hidrolizadas de A83543.1 contenían ácido meso-diaminopimélico. Los azúcares de diagnóstico en los extractos de células completas fueron galactosa y arabinosa. Por lo tanto, A83543.1 presenta un perfil de la pared celular del Tipo IV y un perfil de azúcares del Tipo A (Lechevalier y Lechevalier, supra) . Las células no contienen ácidos micdlicos . Las determinaciones de fosfolípidos en las células completas implicaron la presencia de fosfatidilcolina y cardiolipina. No se detectó fosfatidiletanolamina. Por lo tanto, el A83543.1 presenta un perfil de fosfolípidos del Tipo PXIl M. P. Lechevalier, A. E. Stern y H. A. Lechevalier, "Phospholipids in the Taxonomy of Actinomycetes" , en Actinomycetes , Zbl. Bakt. Suppl. 11, K. P. Schaal y G. Pulverer (directores de edición) , Gustav Fischer Verlag, New York, 198l]. La meilaquinona principal detectada fué MK-9 (H.) . Se observó una pequeña cantidad de MK-9 (Hß) . Plaqueo de fagos Se plaquearon sobre A83543.1 varios fagos de Streptomycete, Saccharopolyspora y Amycolatopsis . No se observó ninguna placa. Identidad de A83543.1 Como se ha indicado anteriormente, el cultivo A83543.1 presenta un perfil de la pared celular del Tipo IV y un perfil de azúcares de la célula completa del Tipo A. Los 13 géneros siguientes presentan este perfil de química celular: Nocardia, Rhodococcus , Corynebacterium, Caseobacter, Mycobacterium, Faenia (Micropolyspora) , Pseu-donocardia, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Actinopo-lyspora, Amycolata, Amycolatopsis y Kibdelosporangium. Estos géneros se distinguen por la presencia o ausencia de ácidos micólicos, por la composicidn de los ácidos grasos y por los tipos de fosfolípidos y menaquinonas . Faenia, Pseudonocardia y Saccharopolyspora presentan características quemotaxondmicas idénticas a las de A83543.1 pero estos géneros difieren de A83543.1 en las propiedades morfológicas y de cultivo. El género Faenia CMicropolyspora) presenta esporas lisas y cortas cadenas de esporas que se encuentran sobre las hifas aéreas las del substrato. Sus hifas aéreas son escasas y de color blanco. Es un termdfilo que crece a 60°C. A83543.1 no presenta ninguna de estas propiedades y, por lo tanto, difiere de Faenia. El género Pseudonocardia presenta esporas en las hifas aéreas y en las de substrato. Se distingue por yemas acropetálicas y blastosporas. Presenta una morfología en zig zag característica de' las hifas. Las hifas han sido descritas como articuladas pero no septadas [.véase A. Henssen y D. Schafer, "Amended Description of the Genus Pseudonocardia Henssen and Descripción of a New Species Pseudonocardia spinosa Schafer", Int. J. Syst. Bacteriol. 21: 29-34 (1971)]. Crece muy lentamente. No hay fragmentación o se observa raras veces. A83543.1 no presenta ninguna de estas propiedades. El género Saccharopolyspora se caracteriza por una vaina esporal y un aspecto moniliforme distintivo de la cadena de esporas. Esta característica es muy prominente en A83543.1. También se ha observado fragmentacidn en el género Saccharopolyspora. La especie típica, S. hirsuta se aisló de bagazo de azúcar. El aultivo parental del que se obtuvo A83543.1 se aisló de un molino de azúcar. Puesto que el A83543.1 presenta muchas propiedades de ese género, se considera por lo tanto una cepa de Saccharopolyspora. Las únicas especies válidamente publicadas en el género Saccharopolyspora son S. erythraea y S. hirsuta. Subespecies conocidas son S_. hirsuta subsp. taberi y S. hirsuta subsp. kobensis . El A83543.1 difiere de estas cepas en el color aéreo y del reverso o en la producción de pigmentos solubles. Se midió la similitud bioquímica construyendo una tabla de coeficientes de similitud basada sobre el mayor número posible de medidas bioquímicas. Se emplearon el coeficiente de Jaccard Sj y el coeficiente de coincidencia simple S [véase W. Kurylowicz, A. Paszkiewicz, W. Woznicka, W. Kurzatkowski y T. Szulga, "Numerical Taxo-nomy of Streptomycetes", Editores Médicos Polacos, Var-sovia, 1975, pág. 37]. En la Tabla VII se resumen estos coeficientes de similitud.

TABLA VII Coeficientes de similitud entre A83543.1 y especies de Saccharopolyspora Cultivo Scs Sj A83543.1 100 100 S. hirsuta subsp. taberi 68 57 S_. hirsuta subsp. kobensis 6 677 60 S_. erythraea 63 54 S. hirsuta 55 50 El análisis de ácidos grasos de A83543.1 y de las especies conocidas de Saccharopolyspora mostró que todos ellos contenían ácidos grasos a la vez saturados y de cadena ramificada. La composicidn de ácidos grasos de A83543.1 es similar, pero no idéntica, a la de las otras especies. En la Tabla VIII se comparan las composiciones de ácidos grasos de A83543.1 y las especies conocidas de Saccharopolyspora.

TABLA VIII Composicidn porcentual dé ácidos grasos de A83543.1 y cepas de Saccharopolyspora S. hirsuta Acido graso A83543.1* S. erythraea S. hirsuta subsp. kobensis :0 Iso 11,80 17,86 15,44 17,94 15:0 Anteiso 0,64 1,33 1,38 1,25 16:0 Iso 22,47 25,70 15,61 19,05 16:1 Trans 9 1,15 4,14 2,63 o. 17:1 Iso F 7,22 7,97 17:1 Iso G 3,75 6,82 17:0 Iso 17,59 13, ,37 26,26 19,41 17:0 Anteiso 15,30 12, ,46 14,19 12,72 17:1 C 1,65 2,70 1,81 17:0 2,74 1, ,01 1,43 0,94 16:1 20H 1,27 2,07 4,74 4,85 18:1 Iso F 7,57 11, ,31 6,83 7,47 TBSA lOMe 1,15 1, ,34 1,77 1,00 18:0a TBSA = ácido tuberculosteárico.

El análisis de los componentes principales de las composiciones de ácidos grasos mostradas en la Tabla VIII presenta una dispersión suficiente para sugerir que todos los cultivos son especies distintas dentro del mismo género. El perfil de los componentes principales de los datos de la Tabla VIII está presentado en la Figura 12.

En la Tabla IX se comparan las características fisiológicas de A83543.1 con las de las especies y subespecies existentes de Saccharopolyspora.

TABLA IX Características fisiológicas diferenciales de A83543.1 y especies de Saccharopolyspora S. hirsuta S. hirsuta subsp. subsp. Característica A83543.1 S. erythraea S. hirsuta taberi kobensis Descomposición de: adenina + + + + esculina + + + + almidón + + .o + + t xantina + + + + alantoína + — - - ND Reducción de nitratos + + - + + Fosfatasa + + -Utilización de: " ND benzoato - + - mucato ND — + - oxalato ND — + - ND Intervalo de temperaturas (°C) 15-37 20-42 25-50 20-42 Tolerancia al NaCl (%) n 20-42 ND* 15 ND 12 Producción de ácido a partir de: arabinosa + + + celobiosa + + + + dextrina + + + TABLA IX Características fisiológicas diferenciales de A83543.1 y especies de Saccharopolyspora S. hirsuta S. hirsuta subsp. subsp. Característica A83543.1 S. erythraea S. hirsuta taberi kobensis galactosa + + + inositol + + + maltosa + + + + melecitosa + + ND 1 Producción de ácido a partir de: melibiosa + ND ND rafinosa + + + + raninosa + + + salicina + ND sacarosa + + + xilosa + + lactosa + ND a_Me-D-glucdsido + ND sorbitol + inulina ND + ND * ND = no determinado.

Las comparaciones realizadas indican que A83543.1 difiere suficientemente de las especies anteriormente descritas de Saccharopolyspora para considerarlo una nueva especie de Saccharopolyspora para la que se ha escogido el nombre de Saccharopolyspora spinosa. El adjetivo spino sa refleja la ornamentación de esporas espinosas de esta espe cié. Las cepas A83543.3, A83543.4 y A83543.5 son macroscópicamente suficientemente similares a la cepa A83543.1 para ser clasificadas como cepas de Saccharopolyspora spinosa. Las cuatro cepas difieren en la cantidad de A83543 que producen. La cepa A83543.3 produce aproximadamente cuatro veces más deA83543 que la cepa A83543.1 y las cepas A83543.4 y A83543.5 producen aproximadamente de ocho a nueve veces más que la cepa 83543.1. Como ocurre con otros organismos, las características de los cultivos productores de A83543 de esta invención, Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 y NRRL 18539, continúan estando sujetas a variaciones. Así, pueden obtenerse mutantes de estas cepas por métodos físicos y químicos conocidos en este campo. Por ejemplo, pueden obtenerse otras cepas por tratamiento con productos químicos tales como N-metil-N1 -nitro-N-nitroso-guanidina. Forman parte de esta invención mutantes naturales e ±nciucidos de Saccharopolyspora spinosa NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 y NRRL 18539 que conserven las características de producir una cantidad recuperable de A83543. El medio de cultivo utilizado para crecer los cultivos de Saccharopolyspora spinosa puede ser uno cualquiera de numerosos medios. Por razones de economía de producción, rendimiento óptimo y facilidad de aislamiento del producto se prefieren sin embargo ciertos medios de cultivo. Así, por ejemplo, las fuentes de carbono preferidas en la fermentación a gran escala son glucosa y maltosa aunque también pueden utilizarse ribosa, xilosa, fructosa, galactosa, mañosa, manitol, almidón soluble, dextrina de patata, oleato de metilo, aceites como aceite de soja y similares. Las fuentes de nitrógeno preferidas son harina de semilla de algodón, leche peptonizada y harina de soja digerida, aunque también pueden utilizarse harina de pescado, infusión de maíz, extracto de levadura, caseína hidrolizada con enzimas, extracto de buey y similares. Entre las sales inorgánicas nutrientes que pueden incorporarse a los medios de cultivo se encuentran las sales solubles habituales capaces de dar iones cinc, sodio, magnesio, calcio, amonio, cloruro, carbonato, sulfato, nitrato y similares. Los elementos traza esenciales necesarios para el crecimiento y desarrollo del organismo también deben ser incluidos en el medio de cultivo. Estos elementos traza se encuentran habitualmente como impurezas en los otros constituyentes del medio, en cantidades suficientes para responder a las necesidades de crecimiento del organismo. Habitualmente, si la formación de espuma constituye un problema, pueden agregarse a los medios de fermentación a gran escala pequeñas cantidades (v.g. 0,2 ml/1) de un agente antiespumante tal como polipropilenglicol. Sin embargo, en el caso del cultivo productor de A83543, los antiespumantes convencionales inhiben la producción de A83543. La formación de espuma puede controlarse incluyendo en el medio harina de soja o Pluronic L-101 (BASF) (1-3 %). Puede agregarse aceite adicional si se forma espuma. El porcentaje de un componente A83543 particular puede ser modificado mediante cambios en el medio. Por ejemplo, agregando valina o ácidos isobutírico o propiónico aumenta el porcentaje de A83543D producido. Para la producción de cantidades sustanciales de A83543, se prefiere la fermentación aerobia sumergida en biorreactores agitados. Pueden obtenerse pequeñas cantidades de A83543 mediante cultivo en matraces agitados. Debido al retraso observado corrientemente en la produc-cidn mediante inoculación de grandes biorreactores con la forma esporulada del organismo, es preferible emplear un inoculo vegetativo. El inoculo vegetativo se prepara inoculando un pequeño volumen de medio de cultivo con la forma esporulada o con fragmentos miceliales del organismo para obtener un cultivo nuevo de crecimiento activo del organismo. Después el inoculo vegetativo se transfiere a un biorreactor mayor. El medio del inoculo vegetativo puede ser igual al utilizado para las fermentaciones de mayor volumen, pero también son adecuados otros medios. El A83543 es producido por los organismos productores de A83543 cuando se cultivan a temperaturas comprendidas aproximadamente entre 24° y 33°C. Al parecer las temperaturas ófeimas para la producción de A83543 son alrededor de 28-30 °C. Como es costumbre en los procesos de cultivo aerobio sumergido, se hace pasar aire estéril a través de la vasija desde el fondo mientras el medio es agitado con impulsores de turbina convencionales. En general, la velocidad de aireación y la velocidad de agitación deben ser suficientes para mantener el nivel de oxígeno disuelto en el 35 % o más alto y preferiblemente en el 50 % o más alto del valor de saturación con aire, con una presidn interna de la vasija de 0,34 atmósferas.

La producción de los componentes A83543 puede ser seguida durante la fermentación mediante pruebas en extractos del caldo. Para este fin es un ensayo útil la HPLC, empleando un sistema como los descritos en el Ejemplo 1. Después de su producción bajo condiciones de fermentación aerobia sumergida, los componentes A83543 pueden ser recuperados del medio de fermentación por los métodos empleados en este campo. El A83543 producido durante la fermentación de un organismo productor de A83543 se encuentra tanto en el micelio como en el caldo. El A83543 parece ser lipófilo. Así, si se utiliza una cantidad sustancial de aceite en la fermentacidn, la extracción del caldo completo resulta más eficaz. Si sólo se emplean pequeñas cantidades de aceite, la mayor parte del A83543 se encuentra en el micelio. En ese caso, se consigue una recuperación más eficaz del A83543 filtrando inicialmente el medio para separar el caldo de la masa ice-lial (la biomasa) . El A83543 puede ser recuperado de la biomasa por diversas técnicas. Una técnica preferida consiste en lavar la biomasa separada con agua para eliminar el caldo residual, mezclar la biomasa con un disolvente polar en el que sea soluble el A83543, por ejemplo metanol o acetona, separar y ooncentrar el disolvente, extraer el con-centrado con un disolvente no polar y/o adsorberlo en un adsorbente de gel de sílice de fase inversa tal como RP-C8 o RP-C18 o un polímero muy poroso como HP-20 y similares. El material activo se eluye del adsorbente con un disolvente adecuado como, por ejemplo, mezclas de acetonitrilo :metanol conteniendo pequeñas cantidades . de THF. El A83543 puede separarse en los componentes individuales A83543A, A83543B, A83543C, A83543D, A83543E, A83543F, A83543G, A83543H y A83543J y peeudoaglicona A83543A por procedimientos similares. Un método de separación preferido implica la cromatografía en gel de sílice en fase inversa (Clg o Cft) . Alternativamente, pueden utilizarse como fuente de A83543 los sólidos del cultivo, que incluyen los constituyentes del medio y del micelio, sin extraerlos o separarlos pero preferiblemente después de eliminar el agua. Por ejemplo, después de la producción del A83543, el caldo de fermentación completo puede ser secado por liofilización, por secado en tambor o por destilación azeotrdpica y secado. El caldo seco puede ser entonces utilizado directamente, por ejemplo mezclándolo directamente con una premezcla para pienso.

Actividad insecticida y acaricida Los compuestos de esta invención son útiles para el control de insectos y ácaros. Por lo tanto, esta invención también se refiere a métodos de inhibición de un insecto o acaro, que consisten en aplicar al habitat del insecto o acaro una cantidad inhibidora del insecto o acaro de un compuesto de A83543. Los compuestos de A83543 presentan actividad contra numerosos insectos y ácaros. Más concretamente, los compuestos presentan actividad contra el gusano soldado del sur, que es un miembro del orden de los lepidópteros. Otros miembros típicos de este orden son el eucdsmido, gusanos cortadores, polillas de la ropa, polilla india de la harina, arrolladores de hojas, gusano de la mazorca, gusano de la cápsula del algodón, barrenillo europeo del maíz, gusano importado de la col, rizador de la col, gusano rosa de la cápsula del algodón, gusano de zurrón, oruga oriental constructora de tiendas, tejedor del césped y gusano soldado de otoño. Los compuestos también presentan actividad contra el áfido del algodón, que es un miembro del orden de los homópteros. Otros miembros de los homdpteros son los saltadores de hojas, saltadores de plantas, piojo del peral, chupador del manzano, pulgones, moscas blancas y chinches escupidoras, así como otras varias especies de áfidos es-pecíficas del huésped. Además, los compuestos de A83543 presentan actividad contra las moscas de los establos, las moscardas y los mosquitos, que son miembros del orden de los dípteros. Otro miembro típico de este orden es la mosca doméstica común. Los compuestos de A83543 son útiles para reducir las poblaciones de insectos y ácaros y se emplean en métodos de inhibición de una población de insectos o ácaros que consisten en aplicar al habitat del insecto o acaro una cantidad efectiva inactivante de los mismos de un compuesto de A83543. El "habitat" de los insectos o ácaros se refiere al entorno en el que viven o donde se encuentran sus huevos, incluido el aire que los circunda, el alimento que comen o los objetos con los que entran en contacto. Por ejemplo, los insectos o ácaros que ingieren plantas pueden ser controlados aplicando el compuesto activo a las partes de la planta que comen o habitan los insectos o ácaros, especialmente el follaje. Se considera en esta invención que los compuestos también pueden ser útiles para proteger a los artículos textiles, papel, cereales almacenados o semillas, mediante la aplicación de un compuesto activo a dichas sustancias.

La expresión "inhibición de un insecto o acaro" se refiere a una disminución en el número de insectos o ácaros vivos o a una disminución en el número de huevos viables de insectos o ácaros. El grado de reducción conseguido por un compuesto depende, naturalmente, de la proporción de aplicación del compuesto, del compuesto particular empleado y de la especie de insecto 0 acaro diana. Debe utilizarse por lo menos una cantidad inactivante de insectos o inactivante de ácaros. Las expresiones "cantidad inactivante de insectos" y "cantidad inactivante de ácaros" se utilizan para describir la cantidad que es suficiente para producir una reducción mensurable de la población de insectos o ácaros tratada. Generalmente se emplea una cantidad comprendida aproximadamente entre 1 y 1000 ppm (o 0,01 y 1 kg/Ha) de compuesto activo. En una realización preferida, esta invención se refiere a un método de inhibición de un insecto susceptible del orden de los lepidópteros, que consiste en aplicar a una planta una cantidad efectiva inactivante de insectos de un compuesto de A83543 de acuerdo con esta invención. Otra realización preferida de la invención se refiere a un método de inhibición de las moscas mordedoras del orden de los dípteros en animales, que consiste en administrar una cantidad efectiva inhibidora de pestes de un compuesto de A83543 por vía oral o parenteral al animal. ESCRUTINIO CON ACAROS/INSECTOS Se determinó la actividad acaricida e insecticida de los compuestos de A83543 en el siguiente escrutinio con ácaros/insectos . Cada compuesto a ensayar se formuló disolviéndolo en una mezcla de acetona/alcohol (1:1) que contenía 23 g de "Toximul R" (mezcla de sulfonato/emulgente no iónico) y 13 g de "Toximul S" (mezcla de sulfonato/emulgente no iónico) por litro. Después estas mezclas se diluyeron con agua para dar las concentraciones indicadas. Se introdujeron en los cotiledones de una calaba-z a arañuelas bimaculadas (Tetranychus urticae Koch) y áfidos del algodón o del melón (Aphis gossypii Glover) y se dejaron que se establecieran en ambas superficies de las hojas. Otras plantas en la misma parcela de tratamiento se dejaron sin infestar. Después las hojas se pulverizaron con 5 ml de la solución a ensayar, empleando una atomizadora DeVilbiss a 0,07 MPa (10 psi). Las dos superficies de las hojas se cubrieron hasta chorrear y después se dejaron secar durante una hora. A continuación se cortaron dos hojas no infestadas y se colocaron en una placa Petri que contenía gusano soldado del sur (Spodoptera eridania Cramer) . Se evaluaron otros insectos empleando formulados y procedimientos de evaluación similares, con las excepciones indicadas. Después de unos periodos de exposición establecidos, se evaluó el porcentaje de mortalidad. Los resultados se encuentran en las tablas siguientes. Se emplearon las siguientes abreviaturas: Nombre cientí¬ Término Insecto/ácaro fico GA gorgojo del algodón Anthonomus grandis AA Afido del algodón Aphis gossypii GCA Gusano de la cápsula Heliothis zea del algodón SHM Saltahojas del maíz Dalbulus maidis GRMS Gusano de la raíz Diabrotica undecimpunc- del maíz del sur tata howardi GSS Gusano soldado del sur Spodoptera eridania AB Arañuela bimaculada Tetranychus urticae TABLA X. Actividad del A83543A contra larvas de GCA recién nacidas Tratamiento Díasa Proporción (ppm) Inhibicidnb, % Tópico 1,00 20,00 5,00 100,00 10,00 100,00 50,00 100,00 100,00 100,00 TABLA X (cont.) ProporInhibi¬ Tratamiento Días ción (ppm) ción13, % Dietad . 4 1,00 30,00 5,00 100,00 10,00 100,00 50,00 100,00 100,00 100,00 Huevos 6 10,00 0,00 50,00 0,00 100,00 30,00 Tdpicoc 1 0,50 10,00 1,00 40,00 5,00 80,00 10,00 100,00 50,00 100,00 100,00 70,00 Dieta 3 0,50 15,00 1,00 45,00 5,00 100,00 10,00 100,00 50,00 100,00 a Número de días entre el tratamiento y la observación Media de dos replicados ensayados c Tratado con 1 ml de A83543A formulado La dieta se trata superficialmente con A83543A, se deja secar y se infesta Huevos tópicamente tratados con A83543A y conservados hasta que los huevos se abren por completo. TABLA XI Porcentaje de control de larvas de GCA recién nacidas por los componentes de A83543 Partes por mi lldn Compnente2 0,E 1 5 10 A 55 (d) 100 (a) 100 (a) 100 (a) B 35 (e) 80 (c) 100 (a) 100 (a) C 5 (g) 85 (be) 93 (be) 100 (a) D 58 (d) 90 (ac) 100 (a) 100 (a) E 28 (ef) 58 (d) 100 (a) 100 (a) F 0 (g) 0 (g) 0 (g) 95 (ab) G 0 (g) 0 (g) 20 (f) 80 (c) 1) Los tratamientos con la misma letra entre paréntesis son similares al nivel de 0,05 2) Método tópico con pipeta empleando 20 larvas/replicado y 4 replicados; un día entre el tratamiento y la observación.

TABLA XII Actividad del A83543A contra larvas de GSS Propor- Inhiji Fase Tratamiento Días cidn (ppm) cidn Neonata Foliar/fri- 3 1,00 10,00 jolc 5,00 40,00 10,00 100,00 50,00 100,00 100,00 100,00 Neonata Tópica 1,00 0,00 5,00 60,00 10,00 100,00 50,00 100,00 100,00 100,00 Neonata Foliar/fri- 0,50 0,00 jole 1,00 66,67 5,00 100,00 10,00 100,00 50,00 100,00 Segunda edad Tópico 1,00 0,00 5,00 0,00 10,00 0,00 50,00 80,00 100,00 100,00 TABLA XII (cont.) Proporción Inhibi- Fase Tratamiento Dias (ppm) cidnp, S ' Segunda edad Foliar/fri 4 1,00 0,00 jold 5,00 0,00 10,00 80,00 50,00 80,00 100,00 100,00 Tercera edad Tópico 1,00 0,00 5,00 0,00 10,00 13,33 50,00 73,33 Tercera edad Foliar/fri- 0,50 0,00 jole 1,00 0,00 5,00 40,00 10,00 100,00 50,00 100,00 Quinta edad Tdpicoe 10,00 0,00 50,00 0,00 Quinta edad Foliar/fri10,00 0,00 jol6 50,00 0,00 a Días entre el tratamiento y la observación Media de los replicados ensayados c Un replicado Dos replicados Tres replicados Tratadas tópicamente con 1 ml de A83543A formulado. TABLA XIII Actividad de A83543A contra GA adulto Tratamient :oo Proporción (ppm) Inhibición , % Tópicob 1,00 0,00 5,00 20,00 10,00 20,00 50,00 100,00 100,00 100,00 a Un replicado; observado 3 días después del tratamiento A83543A formulado (1 ml) vertido sobre insectos adultos en una placa Petri. TABLA XIV Actividad del A83543A en pruebas en invernadero contra di- versas pestes de cultivos Cultivo Peste Proporción (ppm) Inhibición Maíz GRMS 30 100 15 50 7,5 10 3,75 0 - TABLA XIV (cont.) Cultivo Peste Proporción (ppm) Inhibición5 Calabaza GSS 250 100 125 100 62,5 100 31,25 55 15,63 40 7,8 20 3,9 20 1,9 0 Calabaza AB 250 70 125 40 62,5 20 31,25 0 Calabaza AA 100 0 50 0 Maíz SHM 200 90 100 30 50 0 Frijol GSC 100 100 50 80 25 40 12,5 0 en macetas a la intemperie TABLA XIV (cont.) Cultivo Peste Proporción (ppm) Inhibición' Frijol AB 100 100 50 80 25 30 12,5 10 6,25 0 Calabaza AA 100 80 50 40 25 0 Maíz GRMS 6 30 3 0 En la Tabla XV se compara la eficacia y la persistencia del tratamiento con A83543A con las del metomilo en ensayos en macetas a la intemperie contra el gusano soldado del sur. TABLA XV Eficacia del A83543 contra Spodoptera eridanlia en ensayos en macetas a la intemperie Díasi después del . tratamiento3 Proporción Tratamiento (ppm) 1 5 7 14 A83543A 63 100 88 90 5 A83543A 125 100 88 95 90 A83543A 250 100 95 100 100 A83543A 500 100 100 100 100 TABLA XV (cont.) Días después del tratamiento3. Proporción Tratamiento (ppm) 1 5 7 14 metomilo 63 100 20 15 0 metomilo 125 100 35 40 20 metomilo 250 100 85 45 40 metomilo 500 100 90 85 60 Ninguno 0 0 0 0 0 Ninguno 0 0 0 0 0 En la Tabla XVI se resumen los valores de la CL.-», las concentraciones letales a las cuales el com-puesto ensayado inhibe al 50 % de los insectos o ácaros probados, presentada por el compuesto A83543A en comparación con la presentada por el conocido insecticida metomilo. TABLA XVI CL5Q para A83543a <ppxÚ CL50 Objetivo A83543 M< =tomilo GRMS 15 6 Acido de los cereales >250 5,4 AB 150 71,4 GSS/foliar 1,3 11,4 GCA/Contacto 0,6 14,5 En el gusano de la raíz del maíz , proporción en peso en la tierra; en todos los otros casos es la concentración de la pulverización. Los componentes de A83543 resultaron activos contra las larvas del mosquito de la fiebre amarilla (Aedes aegyp i) en ensayos homologados larvicidas de mosquitos in vitro. En las Tablas XVII y XVIII se resume la actividad de los componentes en estos ensayos. TABLA XVII Actividad in vitro del A83543B y A83543C contra larvas de mosquitos en la primera edad Componente Concentración mínima inhibí- A83543 toria (mcg/ml) a A 0,016, 0,031b B 0,016 C 0,031 a Concentración mínima que produce una inhibición del 100 % al cabo de 24 horas (sobre placas de microensayo) Ensayos en dos lotes.

TABLA XVIII Actividad de los componentes de A83543 frente a larvas de mosquito en la cuarta edad Componente Cont„rol , A 60, 70b B 60 C 60 D 30 E 80 F 0 G 0 A las 24 horas cuando se tratan con 0,312 ppm Resultados de dos ensayos. Pruebas en campo El A83543A se evaluó en pruebas en campo. En estas pruebas, el A83543A presentaba actividad contra el gusano importado de la col y el saltador de la col y en brácoli en brotacidn y contra una mezcla de saltadores de las hojas (75 %) y gusano soldado de otoño (25 %) sobre soja. Composiciones insecticidas Los compuestos de esta invención se aplican en forma de composiciones, que también forman parte de la invención. Estas composiciones comprenden una cantidad inactivante de insectos o ácaros de un compuesto de A83543 y un vehículo inerte fitoldgicamente aceptable. El componente activo, es decir, el compuesto de A83543, puede encontrarse como 1) un solo componente de A83543, 2) una mezcla de dos o más componentes, 3) la mezcla de A83543 separada o 4) A83543 junto con la fracción seca del medio de fermentación en el que se produce, es decir, el caldo de fermentación crudo seco. Las composiciones son formulados concentrados que se dispersan en agua para su aplicación o son formulados en polvo o granulados que se aplican sin ningún otro tratamiento. Las composiciones se preparan siguiendo los procedimientos y las fórmulas convencionales en química agrícola pero que son nuevos e importantes debido a la presencia de uno o más de los compuestos de esta invención. Las dispersiones en las que se aplican los compuestos o material desecado crudo son en la mayoría de los casos suspensiones o emulsiones acuosas preparadas a partir de formulados concentrados de los compuestos o del material crudo. Estos formulados solubles en agua, suspendibles o emulsionables en agua son o bien sólidos (conocidos habitual mente como polvos mojables) o líquidos (conocidos habitualmente como concentrados emulsionables o suspensiones acuosa Los polvos mojables, que pueden ser compactados pa ra formar granulos dispersables en agua, están constituí-dos por una mezcla íntima del compuesto activo, un vehículo inerte y surfactantes. La concentración del compuesto activo está comprendida habitualmente entre alrededor del 1 %, preferiblemente del 10 %, y alrededor del 90 % en peso. El vehículo inerte se escoge habitualmente entre las arcillas atapulgíticas, las arcillas montmorilloníticas, las tierras de diatomeas o los silicatos purificados. Se encuentran surfactantes eficaces, que constituyen alrededor de 0,5 al 10 % del polvo mojable, entre las ligninas sulfonadas, los naftalensulfonatos condensados, los naftalensulfonatos, los alquilbencenosulfonatos, los alquilsulfatos y los surfactantes no iónicos como aductos de óxido de etileno con alquilfenoles. Los concentrados emulsionables de los compuestos comprenden una concentración conveniente de un compuesto, por ejemplo alrededor de 50 a 500 gramos por litro de líquido, equivalente al 10-50 % aproximadamente, disueltos en un vehículo inerte que o bien es un disolvente miscible con agua o es una mezcla de un disolvente orgánico no miscible con agua y e ulgentes. Los disolventes orgánicos útiles incluyen compuestos aromáticos, especialmente los xilenos, y las fracciones del petróleo, especialmente las fracciones naftalénica y olefínica de elevado punto de ebullición, tal como la - nafta aromática pesada. También pueden utilizarse otros disolventes orgánicos como los disolventes terpénicos, que incluyen derivados de colofonia, cetonas alifáticas como ciclohexanona y alcoholes complejos como 2-etoxi-etanol. Los emulgentes adecuados para los concentrados emulsionables se escogen entre los surfactantes no iónicos convencionales, como los mencionados antes. Las suspensiones acuosas están constituidas por suspensiones de compuestos insolubles en agua de esta invención, dispersados en un vehículo acuoso a una concentración comprendida aproximadamente entre 5 y 50 % en peso. Las suspensiones se preparan moliendo finamente el compuesto y mezclándolo fuertemente con un vehículo constituido por agua y un surfactante seleccionado entre los mismos tipos descritos antes. También pueden agregarse ingredientes inertes, tales como sales inorgánicas en gomas naturales o sintéticas, para aumentar la densidad y la visco-sidad del vehículo acuoso. Con frecuencia lo más eficaz es moler y mezclar el compuesto al mismo tiempo mediante la preparación de la mezcla acuosa y su homogeneizacidn en un dispositivo tal como un molino de arena, un molino de bolas o un homogeneizador del tipo de pistdn. Los compuestos también pueden ser aplicados como composiciones granuladas, que son especialmente útiles para aplicaciones al terreno. Las composiciones granuladas habitualmente sontienen alrededor de 0,5 al 10 % en peso del compuesto, dispersado en un vehículo inerte que está constituido por completo o en gran parte por arcilla o por una sustancia barata similar. Estas composiciones se preparan habitualmente disolviendo el compuesto en un disolvente adecuado y apl¿ candólo a un vehículo granulado que ha sido pre-formado al tamaño de partícula apropiado, comprendido entre 9*5 y 3 mm aproximadamente. Estas composiciones también pueden ser formuladas preparando una masa o pasta del vehículo del compuesto y triturándolo y secándolo para obtener el tamaño de partícula granular deseado. Los polvos finos que contienen los compuestos se preparan simplemente mezclando íntimamente el compuesto en forma pulverizada con un vehículo agrícola polvoriento adecuado, tal como caolín, roca volcánica molida y similares. Los polvos finos pueden contener adecuadamente alrededor de 1 a 10 % del compuesto. Cuando convenga por cualquier razón, es igualmente práctico aplicar el compuesto en forma de solución en un disolvente orgánico apropiado, habitualmente un aceite de petróleo blando, tales como los aceites de pulverización, que son ampliamente utilizados en química agrícola.

Los insecticidas y acaricidas se aplican generalmente en forma de dispersión del ingrediente activo o de un vehículo líquido. Es corriente referirse a las proporciones de aplicación expresándolas como la concentración del ingrediente activo en el vehículo. El vehículo más utilizado es el agua. Los compuestos de esta invención también pueden ser aplicados en forma de composición en aerosol. En estas composiciones, el compuesto activo se disuelve o dispersa en un vehículo inerte, que es una mezcla propelente generadora de presión. La composición en aerosol se envasa en una vasija de la que se dispersa la mezcla a través de una válvula atomizadora. Las mezclas propelentes están constituidas por hidrocarburos de bajo punto de ebullición, que pueden mezclarse con disolventes orgánicos, o por suspensiones acuosas presionizadas con gases inertes o con hidrocarburos gaseosos. La cantidad efectiva de compuesto que ha de aplicarse al habitat de los insectos y ácaros no es crítica y puede ser determinada fácilmente por los expertos en este campo a la vista de los ejemplos presentados. En general, se espera que unas concentraciones del orden de 10 a 5000 ppm de compuesto ejerzan un buen control. Con muchos de los compuestos, son suficientes concentraciones del orden de 100 a 1000 ppm. Para los cultivos en campo, co o la soja ael algodón, una proporción de aplicación adecuada de estos compuestos es alrededor de 0,01 a 1 kg/Ha, aplicada típicamente a razón de 46,7-467 litros/Ha (5-50 galoes/acre) de formulado pulverizado. El habitat al que se aplica el compuesto puede ser cualquier sitio habitado por un insecto o acaro, por ejemplo cultivos vegetales, árboles frutales y de nueces, viñas y plantas ornamentales. Debido a la singular habilidad de los huevos de los ácaros para resistir a la acción de los tóxicos, puede ser conveniente realizar aplicaciones repetidas para controlar las larvas recién salidas, como ocurre con otros acaricidas conocidos. Actividad ectoparasiticida Los compuestos de A83543 también son activos contra miembros del orden de los dípteros. En las Tablas XIX a XXI se resumen los estudios in vitro con A83543A y A83543D. TABLA XIX Ificacia in vitro del A83543A contra las larv; carda. negra Dosis (ppm) Actividad 100 100 50 100 25 100 TABLA XIX (cont. ) Dosis (ppm) Actividad 10 100 5 100 2 100 1 95 0, .5 60 . o, 25 25 Actividad = % de mortalidad. TABLA XX Eficacia in vitro del A83543A contra la mosca de loi tablos adulta Dosis Actividad a las Actividad a las (ppm) 24 horasl 48 horasl 100 100 100 50 100 100 25 100 100 10 100 90 5 80 100 2 70 90 1 10 60 0,5 0 10 1 A,ct.i.„vi•dad = % de mortalidad.

TABLA XXI Eficacia in vitro de A83543A y A83543D1'2 MEA LM MEA LM ppm 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 24 h 48 h 10 80 100 100 100 50 100 100 100 5 50 100 100 100 20 90 90 100 2,5 30 100 100 100 20 100 90 100 to 1,25 20 100 100 100 10 90 80 90 0,625 0 70 60 90 0 60 50 75 0,312 0 50 25 50 0 0 25 25 Porcentaje de mortalidad de los insectos al cabo de 24 a 48 horas de exposición in vitro tras de suero con aditivo químico 2 MEA = mosca de los establos adulta LM = larvas de moscarda ppm = partes por millón.

En ensayos in vivo, los compuestos de A83543 presentaron actividad insecticida sistémica en cobayas y ovejas contra larvas de moscarda y moscas adultas de los establos, sin síntomas evidentes de toxicidad. Se han ensayado los compuestos representativos A83543A y A83543D en laboratorio y en aminales diana para determinar el alcance de la actividad. Los siguientes ensayos son ilustrativos. Ensayo sistémico en cobayas En este sistema experimental se utilizan cobayas adultos. Los compuestos a ensayar se disuelven en solucidn acuosa de polivinilpirrolidona o en polietilenglicol 2000 y se administra una cantidad apropiada de la solucidn por vía oral o por inyección intraperitoneal. Se emplean varias dosis del compuesto, como se indica en las tablas siguientes. Se extrae sangre de los cobayas a los 30 minutos, salvo indicación en contrario, y se centrifugan las muestras de sangre. Unas torundas dentales se saturan con el suero sanguíneo y después se exponen en placas Petri a las moscas de los establos adultas; las larvas de moscarda se exponen en tubos de ensayo. Al cabo de 24 y 48 horas se examinan los insectos y se cuenta el número de muertes. Los resultados de los ensayos están registrados como porcentaje de los insectos que han muerto.

Ensayo sistémico en ovejas Los ensayos se realizan con ovejas siguiendo el método experimental descrito antes al tratar de los cobayas. El compuesto a ensayar se administra por inyección intraperitoneal o intravenosa o intrarruminalmente; las muestras de sangre se extraen a las 24 horas en estos ensayos. Los resultados de los ensayos sistémicos en cobayas y ovejas empleando A83543A y A83543D están resumidos en las Tablas XXII a XXV. El A83543A no presentó actividad antihelmíntica en ovejas tratadas con una sola dosis intraperiotoneal o intrarruminal de 50 mg/kg de peso corporal © en ratones infectados experimentalemente con el nematodo intestinal Nematospiroides dubius, cuando se administró oralmente mediante una sola toma a 500 mg/kg.

TABLA XXII Actividad insecticida in vivo de A83543A Sistémico en cobayas Sistémico en o mg/kg LM MEA Tox mg/kg LM MEA (ip) 0 0 N 1 100 ( (iipp)) 0 0 0 0 (ip) 0 0 N 1 100 ( (iirr)) 0 0 0 0 (ip) 90 50 N 3 300 ( (iipp)) 8 800 0 0 50 (ip) 100 100 N 3300 ((iirr)) 110000 3300 50 (os) 100 60* N 5500 ((iipp)) 2200 3300 50 (ir) 100 70 2 x 25 (ir) 100 90 1,0 (iv) 25 100 * muestra de sangre a las 5 horas; no se tomó ninguna muestra a los 30 minutos a Actividad medida como % de mortalidad ip - intraperitoneal MEA = mosca de los establos adulta ir = intrarruminal LM = larvas de moscarda iv - intravenosa Tox = toxicidad para el animal huésped os = oral (N = ninguna) TABLA XXIII Actividad insecticida sistémica de A83543A y A83543D en cobayas A83543A A83543D Dosis T Tiieemmppoo ddee A Accttiivviiddaadd,, % % Actividad, , % (mg/kg) Vía ssaannggrraaddoo L LMM M MEEAA LM MEA 10 ip 3 300 mmiinn.. 0 0 0 0 0 0 5 h 0 0 0 0 24 h 0 0 10 20 ?p 30 min. 0 0 -j 5 h 0 0 24 h 0 0 30 ip 3300 mmiinn.. 9 900 5 500 0 0 5 h 50 0 0 0 24 h 30 0 0 0 50 ip 3300 mmiinn.. 1 10000 1 10000 75 0 5 h 95 40 0 0 24 h 25 30 25 0 50 oral 5 h 100 60 24 h 0 0 LM = larvas de moscarda MEA = moscas de los establos adultas ip = intraperitoneal TABLA XXIV Ensayo insecticida de A83543A en la sangre de ovejas atacadas con Haemonchus contortus - 24 horas a de exposición in vitro de los insectos a muestras de suero recogidas de las ovejas Porcentaj e de mortalidad insecticida Peso ini Día 0 35 min. 5 h t. Día 1 Día 2 Día 3 Día ? Día 5 Tratamiento cial (kg) L A L A L A L A L A L A L A L A 50x1 (ip) 38,6 0 0 0 0 10 0 10 0 20 10 20 0 10 10 10 0 50x1 í^)' 31,8 0 0 0 10 40 10 90 0 90 20 80 0 40 0 20 0 25x2 (ir) 34,1 0 0 0 20 25 10 100 10 90 20 90 0 60 0 50 0 lxl (iv) 25,9 0 0 25 10 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Control con ^J vehículo 44,5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -J No tratadas 30,9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 L = larvas de moscarda Cantidad (mgkg) multiplicado por el número de dosis adminis= tradas A = mosca de los establos adulta Tiempos de extracción de la sangre después de la administraip = intraperitoneal ción ir = intrarruminal iv = intravenosa TABLA XXV Ensayo insecticida de A83543A en la sangre de ovejas atacadas con Haemonchus contortus - 48 horas de exposición in vitro de los insectos a muestras de suero recogidas de las ovejas Porcentaje de mortalidad insecticida Peso ino Día 0 35 in. 5 h. Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Tratamiento cial (kg) L A L A L A L A L A L A L A L A 50x1 (ip) 38,6 0 20 10 0 10 10 10 0 20 30 20 10 20 20 25 0 50 xl (ir) 31,8 0 0 0 10 75 3010060 100 70100 20 40 20 25 0 25x2 (ir) 34,1 0 10 0 30 50 1010090 100 90100 70 90 30 75 30 -J lxl (iv) 25,9 0 0 25 10 10 20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 03 Control con ve hículo 44,5 0 10 0 0 0 20 010 0 0 0 20 0 0 0 0 No tratadas 30,9 0 40 0 0 0 0 0 0 0 10 0 0 0 0 0 0 ^L = larvas de moscarda cantidad (mg/kg) multiplicado por el número de dosis A = moscas adultas de los establos administradas ip = intraperitoneal ''tiempos de extracción de la sangre después de la administración. ir = intrarruminal iv - intravenosa En los ensayos in vitro contra el nematodo intestinal de las ovejas Haemonchus contortus, el A83543A matd al 30 % de los gusanos a una concentración de 100 ppm. Métodos ectoparasiticidas Por lo tanto, esta invención también se refiere a un método de control de una población de insectos ectopa-rásitos aue consumen sangre de un animal huésped, cuyo método consiste en administrar al animal huésped una cantidad efectiva de un compuesto de A83543. Los insectos ecto-parásitos incluyen los parásitos insectos y acáridos. La administración al animal puede ser por vía dérmica, oral o parenteral. Los insectos y acáridos parásitos incluyen especies que son chupadoras de la sangre así como comedoras de la carne y son parásitas durante todo su ciclo vital o solamente durante parte de su ciclo vital, por ejemplo solamente la edad larvaria o solamente la edad adulta. Especies representativas son las siguientes: tábano Tabanus sp. mosca de los establos Stomoxys calcitrans mosca negra Simulium sp. piojo chupador del ca- Haematopinus asini bailo acaro de la sarna Sarcoptes scabiei acaro de la roña Psoroptes equi mosca de los cuernos Haematobia irritans piojo mordedor del Bovicola bovis ganado piojo del ganado de naHae atopinus eurysternus riz corta piojo del ganado de naLinognathus vituli riz larga mosca setse Glossina spp. acaro del folículo del Demodex bovis ganado garrapata del ganado Boophilus microplus y B. decoloratus garrapata de la Costa Amblyomma maculatum del Golfo garrapata Estrella SoAmblyomma americanum litaria garrapata de las ovejas Otobius megnini garrapata de la madera Dermacentor andersoni de las Montañas Rocosas mosca de gusano enrosCochliomyia hominivorax cado chinche asesino Reduvius spp. mosquito Culiseta inornata garrapata parda de las Rhipicephalus appendiculatus ovejas garrapata roja africana Rhipicephalus ever si garrapata del antílope Amblyomma sp. africano garrapata con patas del Hyalomma sp. antílope africano piojo del cerdo Haema opinus suis chigoe Tunga penetrans piojo del cuerpo Haematopinus ovillus piojo de las patas Linognathus pedalis ked de la oveja Melophagus ovinus acaro de la roña de la Psoroptes ovis ove a mosca de las botellas Phaenicia sericata verdes moscarda negra Phormia regina gusano rosado secundario Cochliomyia macellaria moscarda de las ovejas Phaenicia cuprina chinche de las camas Cimex lectularius chinche del pollo del Sur Echidnophaga gallinácea garrapata de las aves Argas persicus acaro de los pollos Dermanyssus gallinae acaro de las patas esca- Knemidokoptes mutans mosas acaro desplumante Knemidokoptes gallinae acaro del folículo del Demodex canis perro pulga del perro Ctenosephalis canis garrapata americana del Dermacentor variabilis perro garrapata parda del perro Rhipicephalus sanguineus El método de la invención puede ser utilizado papara proteger a los animales económicos y de compañía contra los ectoparásitos. Por ejemplo, los compuestos pueden - - ser beneficiosamente administrados a caballos, ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, perros, gatos y similares, así como animales exóticos tales como camellos, llamas, ciervos y otras especies que son corrientemente denominadas animales salvajes. Los compuestos también pueden ser beneficiosamente administrados a las aves de corral y otras, tales como pavos, pollos, patos y similares. Preferiblemente, el método se aplica a los animales de interés económico y todavía mejor al ganado vacuno y ovino. La proporción, la periodicidad y la forma de aplicación efectiva variarán ampliamente con la identidad del parásito, el grado de ataque parasitario y otros factores. Las aplicaciones pueden realizarse periódicamente durante toda la vida del huésped o solamente durante una temporada de máximo ataque parasitario. En general, el control de este parásito se consigue con la aplicación tópica de formulados líquidos que contienen alrededor de 0,00005 a 95,0 % de compuesto, preferiblemente hasta un 5 % y todavía mejor hasta alrededor de un 1 % del compuesto. Se consigue un control efectivo de los parásitos a proporciones de administración comprendidas entre 5 y 100 mg/kg aproximadamente. Los compuestos se aplican a los animales huéspedes mediante las prácticas veterinarias convencionales. Habi-tulamente, los compuestos se formulan como composiciones ectoparasiticidas que contienen un compuesto y un vehículo fisiológicamente aseptable. Por ejemplo, las composiciones líquidas pueden ser simplemente pulverizadas sobre los animales en los que se desea controlar los ectoparásitos. Los animales también pueden ser tratados con dispositivos tales como raspadores, que pueden contener el sompuesto tóxiso en un paño, por ejemplo, sontra el que puede caminar el animal y ponerse en contasto. También se emplean tanques de inmersión para administrar el agente astivo al animal huésped. Estos sompuestos presentan actividad ectoparasi-ticida sistémica. Los compuestos son capases de penetrar en los tejidos de un animal huésped al que se ha administrado uno de ellos. Los insestos parásitos que después consumen la sangre u otro tejido vivo del animal huésped mueren. Los compuestos se administran por vía dérmica, oral o percutánea. Esta invención también se refiere a composiciones ectoparasiticidas que contienen un vehículo inerte fisiológicamente aceptable y un compuesto de A83543. Estas composisiones pueden ser preparadas por métodos conocidos, por ejemplo disolviendo el compuesto en uno de los numerosos adyuvantes o diluyentes fisiológicamente aceptables conosidos. La administración oral puede realizarse mezclando el compuesto con el pienso o el agua de bebida de los animales o administrando composisiones tales somprimidos, cápsulas, bolos o implantes. La administración percutánea se realiza convenientemente por inyección subcutánea, intraperitoneal e intravenosa de un formulado inyectable. Los compuestos pueden ser formulados por administración oral en las formas habituales, tales como purgas, comprimidos o sápsulas. Naturalmente, estas somposisiones requieren vehísulos inertes oralmente aseptables. Los sompuestos también pueden ser formulados como solución o suspensión inyectable para administración subcutánea, dérmica, intrarruminal, intraperitoneal, intramuscular o intravenosa. En algunas aplicaciones, los compuestos se formulan convenientemente como uno de los componentes del pienso del animal. En esta realización, es habitual primero formular el compuesto en forma de premezcla en la que el compuesto está dispersado en un vehículo líquido o sólido en partículas. La premezcla puede contener alrededor de 4,4 a 551 g de compuesto por kilogramo (2 a 250 g/libra) . La premezcla se formula a su vez en el pienso final mediante mezclado convencional. Como el ataque ectoparasitario generalmente tiene lugar durante una parte importante de la vida del animal huésped, es preferible administrar los sompuestos de esta invensidn en una forma que produzsa la liberasión sos-tenida durante un sierto periodo de tiempc Los métodos convencionales comprenden el uso de una matriz que inhibe físicamente la disolución, cuya matriz es un semisólido céreo, por ejemplo ceras vegetales o polivinilgli-sol de alto peso molecular. Una buena forma para administrar los compuestos consiste en utilizar un bolo de acsión sostenida, somo los dessritos por Laby en la Patente Norteamericana 4.251.506 y Simpson en la Patente Británica 2.059.767. En estos bolos, el compuesto debe estar encapsulado en una matriz polimérica como la de la Patente Norteamericana 4.273.920 de Nevin. También puede conseguirse la liberación sostenida de los compuestos de esta invención mediante el uso de un implante, por ejemplo de goma conteniendo silicona. Para ilustrar con más detalle la puesta en práctica de esta invensión, se incluyen los siguientes ejemplos: EJEMPLO 1 Método de ensayo del A83543 por HPLC El siguiente método analítico de HPLC es útil para seguir la fermentación de producsidn de A83543. Centrifugar una muestra de saldo sompleto, decantar y separar el líquido que sobrenada. Agregar a la biomasa metanol suficiente para devolver la muestra al volumen original, mezclar y dejar la mezcla en reposo durante 15 minutos como mínimo. Centrifugar y filtrar el líquido que sobrenada a través de un filtro de. ,45 y . Alternativamente, el caldo completo puede ser extraído con acetonitrilo (caldo: disolvente 1:4) o acetona. Sistema HPLC: Soporte de la columna: solumna de 8 x 100 mm, gel de sílise C.g esférico 4 (Nova C18 , Waters) Fase móvil: CH3CN/MeOH/H20 (45/45/10) conteniendo 0,05 % de acetato amónico Velosidad de flujo: 4 ml/min. Detessión: UV a 250 nm Tiempos de retensión: A83543A - 3,6-3,7 min. A83543D - 4,4-4,5 min. EJEMPLO 2 Preparasión de A83543 con el cultivo A83543.1 A. Fermentación en matraz agitado Se emplea el cultivo Sacsharopolyspora spinosa NRRL 18395, como sedimento liofilizado o como suspensión mantenida en nitrógeno líquido, para inocular un medio vegetativo con la somposisidn A o B (se prefiere el medio B para la producción a gran escala) : MEDIO VEGETATIVO A Ingredientes Cantidad (%) Caldo de soja tripticasa* 3,0 Extraato de levadura 0,3 MgS04.7H20 0,2 Glucosa 0,5 Maltosa 0,4 Agua desionizada, c.s. hasta 1 litro No se ajusta el pH. *Baltimore Biological Laboratories MEDIO VEGETATIVO B Ingredientes Cantidad (%) Caseína hidrolizada enzimáticamente* 3 , , 0 Extracto de levadura 0 . , 3 MgS04.7H20 0 , , 2 Glucosa 1 , , 0 Agua desionizada, c.s. hasta 1 litro pH 6,2, ajustar a 6,5 con NaOH *NZ Amine A, Sheffield Products, P.O. Box 638, Norwich, NY 13815. Pueden prepararse tubos inclinados o placas agregando 2,5 % de agar al medio de siembra vegetativo A o B. El tublo inclinado inoculado se incuba a 30 °C durante 10 a 14 días aproximadamente. El cultivo inclinado maduro se arranca con una herramienta estéril para aflojar las esporas y separar y maserar la sapa miselial. Se emplea alrededor de la suarta parte de las esporas sueltas y del crecimiento de cultivo así obtenidos para inocular 50 ml de un medio de siembra vegetativo de primera fase. Alternativamente, el medio de primera fase puede ser inoculado mediante una ampolla de nitrógeno líquido. Cuando el cultivo se mantiene en nitrógeno líquido, se preparan ampollas empleando volúmenes iguales de cultivo vegetativo (48-72 horas de incubasión, 30°C) y medio suspensor. El medio suspensor contiene lactosa (100 g) , glicerol (200 ml) y agua desionizada (c.s. hasta 1 litro) . Se emplea una ampolla de nitrógeno líquido para inocular 100 ml de medio vegetativo en matraces " Erlen-meyer de 500 ml (o 50 ml de medio en matraces de 250 ml) . Los cultivos se incuban a 30 °C durante 48 horas en un agitador que describe un círsulo de 2" (5,08 sm) a 250 rpm. El sultivo incubado (inoculo al 5 % en volumen) se emplea para inocular 100 ml de un medio de producción con la siguiente composición: MEDIO DE PRODUCCIÓN I Ingredientes Cantidad (%) Glucosa 4 Proteína vegetal, parsialmente hidrolizada enzimátisamente* 1,5-3 Ingredientes Cantidad (%) Harina de semilla de algodón** 1,0 CaC03 (calidad reactivo o tésnisa) 0,3 Aceite de soja 1,0 Agua corriente, c.s. hasta 1 litro (pH antes de la esterilización ajustado a 7,0 con NaOH) *Sheftone H, Sheffield Produsts **Proflo, Traders Protein, P.O. Box 8407, Memphis, TN 38108. El medio de produssión inosulado se incuba en Erlenmeyers de 500 ml a 28-30 °C durante 6 a 8 días en un agitador que describe círsulos de 5,08 sm (2") de 250 rpm. B. Fermentación en biorreactor agitado Para conseguir un volumen mayor de inoculo, se emplean 10 ml del medio incubado de primera fase, preparado como se ha descrito en la Secsidn A, para inosu-lar 400 ml de un medio vegetativo de segunda fase son la misma composición que el medio vegetativo de la primera fase. Este medio de segunda fase se incuba en Erlen-meyers de boca ancha de 2 litros durante unas 48 horas a 30 °C, en un agitador que describe círculos de 5,08 cm a 250 rpm. El medio vegetativo de segunda fase incubado (2 1) así preparado se emplea para inocular 80 a 115 li-tros de medio de produsción estéril, preparado como se ha descrito en la Sección A. Se agrega aceite de soja adicional para controlar la formación de espuma, si es necesario. El medio de producción inoculado se deja fermentar en un biorreactor agitado de 165 litros durante 5 a 8 días a una temperatura de 28°C. El caudal de aire y la velocidad del agitador en la vasija agitada se controlan mediante ordenador para mantener un nivel de oxígeno disuelto igual o superior al 50 % de la saturación con aire. E.JEMPL0 3 Aislamiento de A83543A, B, C y D Se filtran 225 litros del caldo de fermentación, preparado somo se ha dessrito en el Ejemplo 2, empleando un auxiliar de filtración Cl % de Hyflo) y la biomasa separada se lava con agua (unos 50 litros) . Después la biomasa se agita con unos 100 litros de metanol durante una hora aproximadamente y se filtra. El filtrado metanólico se concentra a un volumen de 1 litro aproximadamente. El concentrado se extrae tres veces con 1 litro cada vez de éter dietílico. Los extractos etéreos reunidos se sonsen ran a un volumen de 200 ml aproximadamente .

Se cromatografían 8 ml del concentrado en una columna de gel de sílice (JRP-8 Lobar, tamaño B, E. M. Science, División of E. M. Industries, Inc.). Este proceso se repite por un total de 12 ve-ses (sislos) . El instrumental y el método de realiza-sidn de la sromatografía preparativa por el sistema "Autoprep" es el siguiente: Un sistema de HPLC "Autoprep" completo está formad por tres bombas Rainin Rabbit HPX, un módulo de presión, un colector de fracciones Gilson modelo 20 IB 4 HPLC, un detector de absorbancia ISCO-V y un ordenador Apple Macintosh Plus. El sistema completo se dispone de acuerdo con las instrucciones dadas en el manual Dynamax HPLC Method Manager de Rainin Ins- trument Company, Inc. La configuración HPLC "Autoprep" aprovecha la automatización del sistema para permitir la realización de separaciones preparativas repetitivamente bajo condiciones prácticamente idénticas con resultados prácticamente idénticos. La recogida y reunión de las frassiones correspondientes procedentes de múltiples operaciones proporciona capacidad cromatográfisa sin necesidad de una columna de gran tamaño. Se emplean dos mezslas disolventes (A) y (B) en el modo isosrático a una velocidad de flujo de 8,0 ml/min Sistemas disolventes Cantidad (ml) Disolvente A B CH3OH 95 100 CH3C 95 100 H20 10 - La mezcla isocrática empleada contiene 60 % de disolvente B. El tiempo de duracidn de cada cislo es 28,0 minutos. Los eluídos de los 16 primeros minutos de cada operación se desprecian. Se recogen los siguien tes eluídos en 6 fracsiones temporales, de 2 minutos (16 ml) cada una. Las fracciones automáticamente reunidas procedentes de cada uno de los 12 cislos dan lugar a 6 frassiones finales (frassiones sromatográfisas) . La presensia de los compuestos de A83543 activos se determina analizando la actividad de cada fracsión final sobre larvas de mosquito y también por HPLC analítisa. Después se reúnen las fracciones activas de acuerdo con su actividad y perfiles de HPLC y a continuación se purifisan, empleando la misma HPLC "Autoprep" y el mismo sistema disolvente pero son alta resolusión, una solumña preparativa de 21,4 mm x 25 sm (Rainin-Dyna-max) , previamente rellena son gel de sílise de fase inversa C-18 de 8 µ , para dar los somponentes A, B, C y D de A83543. Los factores A y D cristalizan en CTóOR/H-O. En la Figura 5 se presenta el EM-DC de A83543C y el EM-BAR de A83543B se encuentra 'en la Figura 9 de los dibujos. EJEMPLO 4 Purificación de A83543A y D Se preparan 10 litros de caldo de fermentación somo se ha descrito en el Ejemplo 2, Secsión A, a excep-sión de que 1) se emplean 200 ml de medio de produssidn en matraces de 1 litro; 2) se omite el aceite de soja del medio de producsidn y 3) la insubasidn se realiza a 30° durante 4-6 días. El saldo se filtra. El filtrado, que sontiene 4 msg de A83543A/ml y santidades no de-testables de A83543B, C o D/ml, se despresia. La biomasa se lava con agua y se extrae durante 1 hora con metanol. El extracto (7 litros) contiene 72 mcg de A83543A/ml y 7 mcg de A83543D/ml. El extracto metandlico se consentra hasta un volumen de 5 litros y se vierte sobre resina HP-20 (150 ml, Mitsubishi Chemisal Industries, Ltd., Japón) en 2 litros de agua. Esta mezsla se agita durante 1 hora. Después la mezcla con resina HP-20 se introduce en una columna de vidrio. El efluente inicial y el eluído empleando metanol:'agua (1:1,-1 litro) no son activos. El segundo eluído empleando metanol: agua (7:3, 1 litro) contiene cantidades traza de A83543A. El siguiente eluído empleando metanol (1 litro) contiene la actividad de A83543A y A83543D. El eluído metandlico se concentra y reúne con dos fracciones similares procedentes de otras operaciones y se consentra a sequedad. El residuo se disuelve en 75 ml de metanol: HF (4:1) y se presipita por adisión sobre 10 volúmenes de asetonitrilo. Se filtra la mezsla y el filtrado se sonsentra a sequedad. El residuo se disuelve en 25 ml de metanol y se aplisa a una solumna de 5,5 x 90 cm de LH-20 Sephadex (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., U.S.A.), preparada en metanol, recogiendo y analizando 125 fracsiones de 25 ml, empleando el prosedimiento HPLC dessrito en el Ejemplo 1. Se reúnen y sonsentran las frasciones que contienen los sompuestos deseados. El residuo se disuelve en 10 ml de metanol y se aplisa a una solumna preparativa de 41,1 mm x 25 sm, pre-preparada son gel de sílise de fase inversa C-18 de 8 µ (Rainin Dynamax) . La solumna se acondiciona en metanol :acetoni-trilo:agua (37,5:37,5:25). Después de la aplicasión de la muestra, la solumna se revela empleando un gradiente lineal de 180 min. de los siguientes disolventes; Sistema disolvente Cantidad (ml) Disolvente A B CH3OH 37,5 45 CH3CN 37,5 45 H20 25 10 El gradiente varía desde 100 % A hasta 100 % B, recogiéndose fracsiones de 25 ml. Las frasciones que contienen A8543A se re nen, se concentran a sequedad, se disuelven en 5 ml de t-butanol y se liofilizan para dar 778 mg de A83543A puro. El espectro de IR de A83543A en CHC13 está mostrado en la Figura 1. El espectro de EM-DC de A83543A está mostrado en la Figura 4; el espectro • EM—BAR de A83543A está mostrado en la Figura 8 [dispersante BAR -ditiotreitol:ditioeritritol (5:1)] y el espectro de EM-IE de A83543A está mostrado en la Figura 10. Las fracciones que contienen A83543D se reúnen con las fracsines que sontienen el mismo componente procedentes de 6 separaciones similares y se sonsentran y sromatografían somo se ha dessrito antes, empleando la misma solumna pero disolventes diferentes. La solumna se asondiciona en metanol: acetonitrilo: agua (40:40:20). Los sistemas disolventes empleados para revelar la columna en una operación de gradiente lineal de 180 minutos son: Sistema disolvente Cantidad (ml) Disolvente A B CH3OH 40 95 CH3CN 40 95 H20 20 10 Se reúnen y consentran las frassiones que sontienen A83543D. El residuo se disuelve en 5 ml de t-butanol y se liofiliza para dar 212 mg de A83543D. El espestro de IR de A83543D en CHC13 está mostrado en la Figura 2 y el espectro de EM-D.C de A83543D está mostrado en la Figura 6. EJEMPLO 5 Aislamiento de los componentes E, F, G, H y J de A83543 y de la Pseudoaglicona de A Se tratan 8 litros de caldo de fermentación, preparado siguiendo procedimientos similares a los descritos en el Ejemplo 2, en la forma descrita en el Ejemplo 4. Las fracciones de la columna de Sephadex LH-20 conteniendo los compuestos deseados se reúnen con las correspondientes fracciones procedentes de fermentaciones similares. Como los componentes E, F, G, H, J y la pseudoaglicona de A se producen en cantidades muy pequeñas, son necesarias numerosas fermentaciones para conseguir cantidades sufisientes para su posterior purificación. Una mezcla de los factores menores, preparada de esta manera y conteniendo aproximadamente 1,6 g de materia sólida, se aplica a una columna de HPLC (Rainin Dynamax) previamente preparada con gel de sílice de fase inversa C-18 de 8 mieras (ODS) , somo se ha descrito en el Ejemplo 4. La columna se acondiciona en CH3OH:CH3CN: H20 (75:75:50) y el gradiente varía desde 100 % de disolvente (A) hasta 50 % de disolvente (B) , con los siguientes sistemas disolventes: Sistemas disolventes Cantidad (%) Disolvente A B CH30H 75 95 CH3CN 75 95 H20 50 10 recogiéndose fracciones de 25 ml. Se reúnen las siguientes frassiones: Mezsla Frassiones 1 31 - 44 2 45 - 63 3 64 - 69 4 70 - 80 5 81 - 130 6 131 - 160 Se concentran 100 ml de la mezcla 5 hasta obtener un residuo que se disuelve en 1 ml de metanol y se aplica a una columna de HPLC de 21,4 mm x 250 mm (Rainin Dynamax), como se ha descrito en el Ejemplo 3. La columna se acondiciona empleando el sistema disolvente (A) de los siguientes sistemas disolventes: Sistemas disolventes Cantidad (%) Disolvente A B CH30H 30 95 CH3CN 30 95 H20 (NH40Ac, ÍN, pH 5,0) 40 H20 - 10 y se revela empleando un gradiente lineal de 120 minutos desde 100 % de disolvente (A) hasta 50 % de disolvente (B) , recogiéndose fracciones de 15 mm a razón de 7,5 ml/min. La elución se prosigue a 50 % de (B) durante 60 minutos más. Se reúnen las siguientes fracciones: Mezcla Fracción Componente 1 37 F 2 38 - 48 E 3 52 - 63 B, G 4 65 - 70 H, J Estas mezclas se reúnen con las procedentes de otras operaciones cromatográficas empleando materias pri-mas similares. Las mezclas reunidas se purifican de nuevo por cromatografía en columna como se ha descrito antes, se desalan en resina HP-20 empleando las técni-sas habituales y se soncentran y liofilizan para dar los siguientes componentes: Peso moleComponente Cantidad (mg) cular* IR** E 249 717 Figura 13 F 4 717 Figura 14 G 104 731 Figura 15 H, J 87 717 Figura 16 Pseudo A 288 590 Figura 3 * Por espectrometría de masas ** Disco de KBr. Los espectros de EM-DC y EM-IE de pseud?agli-cona A83543A están mostrados en las Figuras 7 y 11 respectivamente . EJEMPLO 6 Preparación de A83543 con el cultivo A83543.3 A. Fermentación en matraz agitado Siguiendo procedimientos similares a los del Ejemplo 2, Sección A, el cultivo Sassharopyspora spinosa NRRL 18537 se cultiva en matraces agitados pero empleando el medio vegetativo C siguiente: MEDIO VEGETATIVO C Ingredientes Cantidad Caseína hidrolizada enzimátisamente* 30,0 g Extrasto de levadura 3 , 0 g MgS04.7H20 0,2 g Glusosa 10,0 g Gliserol 20 ml Agua desionizada c.s. hasta 1 litro pH 6,6, ajustado a 7,0 con NaOH *NZ, Amine A B. Fermentación en biorreactor agitado Se preparan ampollas de nitrógeno líquido del cultivo como se ha descrito en el Ejemplo 2, empleando los procedimientos generales de la Secsión B. Se emplea una ampolla para inosular un cultivo vegetativo de primera fase (50 ml de medio C en matraces de 250 ml) , que se incuba durante 48-72 horas aproximadamente. El cultivo de primera fsse incubado se utiliza para inocular (inóculos de 10 ml) un sultivo de segunda fase (400 ml de medio C en matrases de 2 litros) , que se insuba durante 48 horas aproximadamente. El sultivo de segunda fase insubado (5 litros) se utiliza para inosular un medio de produssión (115 litros) son la siguiente somposisión: MEDIO DE PRODUCCIÓN II Ingredientes Cantidad (g/1) Glucosa 80 Leche peptonizada* 20 Harina de semilla de algodón** 20 CaC03 5 Oleato de metilo 30 ml/1 Agua corriente, s.s. hasta 1 litro * Nutriente de Leche Peptonizada, Sheffield Products; puede utilizarse una alimentación continua adicional, comenzando el cuarto día, a razón de 5 mg/ml/día. ** Proflo (pH previo a la esterilización ajustado a 7,0 con NaOH) . El medio de producsión inoculado se deja fermentar en un biorreactor agitado de 165 litros durante 8 a 10 días aproximadamente, o más, a una temperatura de 30 °C. Los niveles de oxígeno disuelto (OD) se regulan G por sistemas computerizados fijados para mantener el nivel de OD por encima del 50 % de la saturación con aire, como se ha descrito en el Ejemplo 2, Sección B. EJEMPLO 7 Preparación de A83543 con el cultivo A83543.5 A. Fermentación en matraz agitado Siguiendo prosedimientos similares a los del Ejemplo 2, Sescidn A, el cultivo Saccharopolyspora spinosa NRRL 18539 se cultiva en matrases agitados, empleando el medio vegetativo B. B. Fermentasión en biorreactor agitado Se preparan ampollas del cultivo en nitrógeno líquido como se ha descrito en el Ejemplo 1, empleando los procedimientos generales de la Seccidn B. Se emplea una ampolla para inocular un cultivo vegetativo de primera fase (50 ml de medio B en matraces de 250 ml) que se incuba durante 48 a 72 horas. El cultivo de primera fase incubado se emplea para inocular Cindculo de 10 ml) un cultivo de segunda fase C400 ml de medio B en matraces de 2 litros) , que se incuba durante 48 horas aproximadamente. El cultivo de segunda fase incubado (2 litros) se utiliza para inocular un medio de producción (115 litros) con una de las siguientes composiciones: MEDIO DE PRODUCCIÓN III Ingredientes Cantidad (g/1) Glucosa 80 Proteína vegetal, parcialmente hidroliza da enzimáticamente* 20 Harina de semilla de algodón** 10 CaC03 5 Oleato de metilo 30 ml/1 Agua corriente, c.s. hasta 1 litro *Sheftone H **Proflo (pH previo a la esterilización ajustado a 7,0 con NH.OH). MEDIO DE PRODUCCIÓN IV Ingredientes Cantidad (%) Glucosa 8 Harina de semilla de algodón* 3 Leche peptonizada** 2 Caldo de infusión de maíz 1 CaC03 (calidad técnica) 0, .5 Oleato de metilo 3, .0 Agua corriente, c.s. hasta 1 litro *Proflo **Nutriente de leche peptonizada (pH previo a la esterilización ajustado a 7,0 son NaOH) El medio de produssidn inosulado se deja fermentar en un biorreactor agitado de 165 litros durante unos 8 a 10 días, o más, a una temperatura de 30°C. Los niveles de OD se regulan como se ha descrito en el Ejemplo 6. EJEMPLO 8 Preparación de A83543 con el cultivo A83543.4 Siguiendo procedimientos similares a los de los Ejemplos 2 y 7, se cultiva Saccharopolyspora spinosa NRRL 18538 pero empleando el medio vegetativo B y el medio de producción III.

EJEMPLO 9 Se prepara caldo de fermentación como se ha descrito en el Ejemplo 8. Se separa A83543 del caldo como sigue: 1. Agregar un volumen igual de acetona al caldo y filtrar, empleando Un filtro de cerámisa o un auxiliar de filtración con un filtro prensa. 2. Ajustar el saldo filtrado a pH 10. 3. Agregar asetato de etilo (0,25-0,5 veses el volumen del saldo) . 4. Recuperar el extracto en acetato de etilo por decantasión de la frassidn asuosa no miscible y consentrar el extracto en acetato de etilo hasta la mitad de su volumen a vacío. 5. Extraer la solución de acetato de etilo concentrada con solución acuosa 0,1 M de ácido tartárico (0,5 volúmenes) y separar las fases. 6. Separar el acetato de etilo soluble de la fase acuosa por evaporación a vacío (alrededor del 5 %) . Concentrar la solución acuosa mediante una operación de osmosis inversa. 7. Ajustar la solución acuosa concentrada a pH 10-11 con hidróxido sódico. 8. Separar el precipitado por filtración, lavar con agua y secar a vacío para dar A83543.

EJEMPLO 10 Pseudoaglisona . A83543A Una muestra de A83543 que sontiene fundamentalmente somponente A (unos 100 mg) se disuelve en 50 ml de metanol, 2 ml de agua y 3 ml de HCl soncentrado. Esta solución se concentra a sequedad a 50°C. El residuo se trata dos veces con 200 ml cada vez de éter dietílico y la materia insoluble se desprecia. Las soluciones etéreas reunidas que contienen la pseudoaglicona cruda se concentran a sequedad. El residuo se disuelve en 20 ml de metanol y se purifica, empleando el sistema AUTOPREP-HPLC descrito en el Ejemplo 3, para dar 20 mg de pseudoaglicona . A83543A pura. EJEMPLO 11 Se prepara pseudoaglicona A83543D a partir de A83543D, empleando un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 10. EJEMPLO 12 Los siguientes formulados son típisos de las somposisiones insestisidas útiles en esta invención. A. Suspensión acuosa A-83543A 12,5 % "Tergitol TMN-6" (surfactante no iónico) 1,0 % "Zeosyl 200" (sílice) 1,0 % "AF-100" (agente antiespumante a base de silisona) 0,2 % Solusidn de xantano (2 %) 10,0 % "Makon 10" (surfastante de nonilfenol son 10 moles de óxido de etileno) 9,0 % Agua sorriente 66,3 % B. Concentrado emulsionable A83543D 12,4 % "Exxon 200" (disolvente naftalénico) 83,6 % "Toximul H" (mezcla de surfactante no ióni co/anidniso) 2,0 % "Toximul D" (mezcla de surfactante no idni^ co/anidnico) 2,0 % EJEMPLO 13 Las siguientes composiciones ilustran el tipo de formulados empleados para poner en práctica el método de esta invención. A. Premezcla para piensos A83543A 10 % Cascarillas de arroz 85 Aceite mineral ligero 5 B. Premezcla para piensos A83543E 25 % Harina de alfalfa 60 Arcilla pulverizada 5 Melazas 10 C. Suspensión A83543A 30 % Sal de naftalensulfonato 5 Surfactante no iónico 5 Sílice pirolizada 1 Agua 59 D. Solución para gotear A83543A 20 % Surfactante no iónico 0,8 Propilenglicol 16 Agua 64, ,2 E. Suspensión para gotear A83543B 10 Surfactante no iónico 1 Aceite mineral ligero 89 F. "Solución inyectable A83543A 15 % Propilenglicol 85 G. Suspensión inyectable A83543C 25 % Propilenglicol 15 Agua 60 H. Suspensión inyectable A83543D 30 % Polivinilpirrolidona 2 Agua 68

Claims (1)

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en la siguiente R E I V I N D I C A C I Ó N

1. Un cultivo biológicamente purificado de Saccharopo lvspora spinosa seleccionada de entre NRRL 18395, NRRL 18537, NRRL 18538 ó NRRL 18539 ó un mutante de la misma productor de A85343. En testimonio de lo cual, firmo la presente en esta Ciudad de México, D.F. el 18 de diciembre de 1989. Por: ELI LILLY AND COMPANY Apoderado . FA*h??.