MX2015005622A - Metodos de cultivo de microorganismos en condiciones mixotroficas no axenicas. - Google Patents

Abstract

Se describen métodos para cultivar microorganismos en condiciones mixotróficas no axénicas. Se describe específicamente un método para cultivar microalgas mixotróficamente y controlar la contaminación bacteriana con un sistema auxostat-pH con ácido acético. También se describen métodos para cultivar microalgas mixotróficamente con un aumento en la productividad a través de un incremento en la transferencia de oxígeno al cultivo, y para controlar la contaminación bacteriana con un agente oxidante.

Description

MÉTODOS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS EN CONDICIONES MIXOTRÓFICAS NO AXÉNICAS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los microorganismos, tales como, pero no limitados a microalgas y cianobacterias, han llamado la atención como una fuente viable de alimento, combustible, fertilizantes, cosméticos, productos químicos y farmacéuticos, debido a la capacidad de crecer rápidamente y en una variedad de condiciones, tales como un medio de aguas residuales. Cada especie de microalgas y cianobacterias tienen un perfil de proteínas, minerales y ácidos grasos diferente que hace a algunas especies mejores fuentes para determinados productos que otras especies. Diferentes especies de microalgas y cianobacterias pueden usar diferentes fuentes de energía y carbono. Los microorganismos fototróficos usan energía de la luz, así como carbono inorgánico (por ejemplo, dióxido de carbono), para llevar a cabo la actividad metabólica. Los microorganismos heterótrofos no usan la luz como fuente de energía y en su lugar usan una fuente de carbono orgánico para la energía y el carbono para llevar a cabo la actividad metabólica. Los microorganismos mixótrofos pueden usar una combinación de fuentes de energía y de carbono, incluyendo la luz, el carbono inorgánico (por ejemplo, el dióxido de carbono) y carbono orgánico. La versatilidad de los Ref . 256146 microorganismos mixótrofos, que son capaces de usar una variedad de fuentes de energía y de carbono, ofrece el potencial para prosperar en condiciones desafiantes para fotótrofos o heterótrofos obligados, y reducir los efectos de la pérdida de biomasa a través de la respiración de los materiales de las células. Además, el crecimiento de los microorganismos mixótrofos atribuibles a la relación de los metabolismos fotótrofos y heterótrofos da por resultado diferentes nutrientes que limitan el crecimiento de los microorganismos que en un cultivo puro de fotótrofos o heterótrofos.

A pesar de la versatilidad de microorganismos mixótrofos para usar diferentes fuentes de energía y de carbono, los cultivos mixotróficos enfrentan a su propio conjunto de desafíos. Los cultivos heterotróficos que usan una fuente de carbono orgánico se mantienen en condiciones axénicas o estériles para evitar la contaminación con bacterias, hongos u otras especies contaminantes no deseadas que usan la fuente de carbono orgánico como fuente de alimentación. Estos cultivos de microorganismos heterótrofos habitualmente comprenden sistemas de biorreactores cerrados, sellados y esterilizables en autoclave, lo que da por resultado un mayor costo y complejidad que los sistemas de biorreactores abiertos simples. Los cultivos de microorganismos fototróficos pueden cultivarse fuera en condiciones no axénicas para la exposición a la luz natural a un costo menor que el sistema de biorreactor de heterótrofos cerrado, y no usan una fuente de carbono orgánico (que puede proveer una fuente de alimentación para las bacterias contaminantes).

Un cultivo de microorganismos mixótrofos que utiliza la luz puede ser cultivado al aire libre en un sistema de biorreactor abierto para acceso a la luz natural, pero también incluye una fuente de carbono orgánico, que crea el mayor potencial de contaminación por bacterias y otros organismos contaminantes en el cultivo debido a la capacidad de las bacterias y hongos para usar la fuente de carbono orgánico para crecer a un ritmo más rápido que las microalgas o cianobacterias mixótrofas. Alternativamente, un cultivo de microorganismos mixótrofos puede realizarse en interiores, en la presencia de luz ambiente o la luz aumentada de fuentes de luz artificiales, tales como diodos emisores de luz (LED) y lámparas fluorescentes, pero sin embargo puede experimentar un potencial similar para la contaminación debido a la presencia de una fuente de carbono orgánico.

Además, las bacterias contaminantes pueden afectar la formación de productos (por ejemplo, lípidos, pigmentos, proteínas) y el crecimiento del microorganismo. La fracción de crecimiento de microorganismos atribuida al metabolismo heterotrófico también puede ser determinada por los microorganismos presentes en el cultivo. La proliferación de contaminación de bacterias y otros organismos de contaminación en un cultivo de microorganismos mixótrofos ha demostrado ser perjudicial para la producción de microalgas y cianobacterias si la población de bacterias contaminantes no se controla y se le permite consumir recursos necesarios por las microalgas y cianobacterias. Por lo tanto, existe una necesidad en la téenica de un método de cultivo de microalgas y cianobacterias de manera eficiente en condiciones mixotróficas no axénicas que controle la contaminación y mantenga los nutrientes de cultivo a niveles para aumentar al máximo el crecimiento de las microalgas y cianobacterias.

En una modalidad, la presente invención describe un método para el crecimiento mixotrófico de microorganismos en condiciones no axénicas que usan un auxostat-pH con ácido acético para suministrar una fuente de carbono orgánico y controlar el nivel de pH del cultivo. Otras modalidades describen métodos alternativos con diferentes fuentes de carbono y también operan en condiciones no axénicas. La invención describe los detalles que no son enseñados en la técnica anterior que permiten que este método sea ejecutado en condiciones no axénicas, tales como estanques abiertos, mientras se mantiene el control sobre contaminantes bacterianos .

En la técnica anterior, el sistema de cultivo auxostat-pH fue reportado por primera vez por dos grupos de investigación diferentes en la década de 1960 (Bungay, 1972; Watson 1969) y un desarrollo detallado fue presentado por Martin y Hempfling (1976). Aunque esta investigación se refiere a cultivos de bacterias y levaduras, Ratledge y colaboradores (2001) reportaron un auxostat-pH con ácido acético basado en algas en condiciones heterótrofas . Crypthecodinium cohnii cultivadas heterotróficamente por Ratledge usando ácido acético como la fuente de carbono orgánico mostró una mejora en el crecimiento de heterótrofos y la acumulación de lípidos con un método de cultivo auxostat-pH con ácido acético. Aunque Ratledge usó el auxostat-pH con ácido acético para cultivar microalgas, el sistema estaba limitado a las especies heterótrofas en un sistema de fermentación cerrado, que no enfrenta los mismos desafíos en relación con el control de la contaminación como un sistema mixotrófico abierto. Los cultivos mixotróficos de microalgas en estanques abiertos han sido reportados con fuentes de carbono orgánico distintas del ácido acético, pero la población bacteriana del cultivo no fue controlada o dirigida. El documento WO 2012/109375 A2 describe la utilización de la glucosa como fuente de carbono orgánico en un cultivo de Chlorella que crece mixotróficamente en un estanque abierto a una densidad baja antes de recoger la biomasa para la producción de lípidos en un sistema de heterótrofos. Debido al corto tiempo en la etapa mixotrófica, el cultivo no experimenta los mismos problemas de contaminación que un cultivo puramente mixotrófico que produce bio asa de alta densidad y lípidos durante un periodo de tiempo más largo.

También, el papel del ácido acético como un bactericida se conoce en la téenica (Huang et al, 2011; Roe et al, 2002), pero hasta ahora no se ha aplicado para controlar las poblaciones bacterianas en cultivos mixotróficos de microalgas a gran escala. La utilización de ácido acético en cultivos mixotróficos de microalgas ha sido en general en experimentos a escala de laboratorio, en donde las condiciones estándares de laboratorio suponen operación axénica y la población bacteriana del cultivo no se había tratado (Yeh et al. 2011). En el documento US 3,444,647 Takashi describe cultivos mixotróficos de Chlorella en cultivos en matraces que contienen diferentes fuentes de carbono y los niveles bacterianos más bajos observados asociados con el cultivo que comprendía ácido acético, pero CO2 se usó para controlar el nivel de pH dentro de los cultivos en matraces y no el ácido acético. De manera más importante, el documento US 3,444,647 no describe métodos para el control de bacterias contaminantes en cultivos de microalgas a pequeña o gran escala, o métodos para aumentar al máximo la producción de biomasa de las microalgas en condiciones de crecimiento mixotróficas no axénicas. El método de la invención que se describe aquí innova en la téenica anterior mediante la creación de un proceso estable que controla la contaminación heterotrófica mientras aumenta las productividades de microalgas a niveles más altos (por ejemplo, 3 g/L d) que se han descrito previamente para un cultivo iluminado.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Las modalidades descritas en este documento se refieren en general a sistemas y métodos para cultivar microorganismos mixotróficamente en condiciones no axénicas. En particular, las modalidades descritas en el presente documento optimizan el crecimiento y controlan la contaminación en un cultivo con una fuente de carbono orgánico, agentes oxidantes, y la transferencia de gas.

En algunas modalidades de la invención, un método de cultivo de microorganismos en condiciones mixotróficas no axénicas, comprende: inocular un medio de cultivo acuoso con un cultivo de microorganismos que comprenden por lo menos algunas bacterias contaminantes en un recipiente de cultivo; suministrar el cultivo de microorganismos con por lo menos algo de luz; suministrar el cultivo de microorganismos con una fuente de carbono orgánico que comprende un ácido orgánico; y en donde el cultivo de microorganismos mantiene un nivel de bacterias contaminantes por debajo de 25% de un recuento total de células del cultivo y un rendimiento de microorganismos de por lo menos 50 g/m2 día.

En algunas modalidades, el microorganismo comprende por lo menos un microorganismo del género seleccionado del grupo que consiste de: Chlorella, Anacystis, Synechococcus , Synechocystis , Neospongiococcum, Chlorococcum, Phaeodactylum, Spirulina, Micractinium, Haematococcus , Nannochloropsis y Brachiomonas. En algunas modalidades, las bacterias contaminantes comprenden por lo menos una seleccionada del grupo que consiste de: Achromobac ter sp., Acidovorax sp., Aeromonas sp., Agrobacterium sp., Alteromonas sp ., Aquaspirillum sp., Azospírillum sp., Azotobacter sp ., Bergeyella sp., Brochothrix sp., Brumimicrobium sp ., Burkholderia sp., Caulobacter sp., Cellulomonas sp ., Chryseobacterium sp., Curtobacterium sp ., Delftia sp ., Empedobacter sp., Enterobacter sp., Escherichia sp ., Flavobacterium sp., Marinobacter sp., Microbacterium sp., Myroides sp., Paracoccus sp., Pedobacter sp., Phaeobacter sp., Pseudoal teromonas sp., Pseudomonas sp., Rahnella sp., Ralstonia sp., Rhizobium sp., Rhodococcus sp., Roseomonas sp., Staphylococcus sp., Stenotrophomonas sp., Vibrio sp., y Zobelliae sp.

En algunas modalidades, el ácido orgánico de la fuente de carbono orgánico comprende 0.5-50% de ácido acético. En algunas modalidades, el cultivo de microorganismos mantiene un nivel de contaminación de bacterias por debajo de 20%, 10% o 5% de un recuento total de células del cultivo. En algunas modalidades, el ácido orgánico se combina con por lo menos un otro nutriente y se suministra al medio de cultivo en combinación, el otro por lo menos un nutriente comprende por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de: nitratos, fosfatos, hierro, cobalto, cobre, sodio, molibdeno, manganeso, zinc, sales y sílice. En algunas modalidades, el método comprende además el suministro de por lo menos un agente oxidante al cultivo de microorganismo, el por lo menos un agente oxidante comprende por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de: ozono, peróxido de hidrógeno, cloro, clorito, clorato, hipoclorito, ácido nítrico, cromo, permanganato, óxido de plata y bromo.

En algunas modalidades, la fuente de carbono orgánico es suministrada al cultivo por un sistema auxostat-pH cuando un nivel de pH medido del cultivo alcanza un nivel de umbral. En algunas modalidades, el nivel umbral de pH es 7.5. En algunas modalidades, el sistema auxostat-pH mantiene un nivel de pH sustancialmente constante en el cultivo de microorganismos. En algunas modalidades, el auxostat-pH mantiene un nivel de pH dentro de un intervalo de histéresis definido que inhibe la proliferación de bacterias contaminantes en el cultivo de microorganismos. En algunas modalidades, la fuente de carbono orgánico se suministra al cultivo hasta que un nivel de oxígeno disuelto medido del cultivo alcanza un nivel crítico por debajo de 2 mg de O2/L.

En algunas modalidades, el medio de cultivo acuoso comprende una concentración inicial de acetato de sodio, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio entre 0.1 y 6 g/L. En algunas modalidades, por lo menos algo de luz se suministra a la cultivo de microorganismos para un fotoperiodo de 10-16, menos de 15, o más de 15 horas por día. En algunas modalidades, por lo menos algo de luz es luz natural, luz artificial o una combinación de las mismas. En algunas modalidades, por lo menos algo de luz comprende por lo menos un espectro de longitud de onda específica del grupo que consiste de: violeta (aproximadamente 380-450 nm), azul (alrededor de 450 a 495 nm), verde (aproximadamente 495 a 570 nm), amarillo (570- 590 nm), anaranjado (aproximadamente 590 a 620 nm), rojo (aproximadamente 620 a 750 nm) y rojo lejano (aproximadamente 700 a 800 nm). En algunas modalidades, el recipiente de cultivo es un recipiente abierto dispuesto al aire libre.

En algunas modalidades de la invención, un método para controlar la contaminación bacteriana en un cultivo mixotrófico de microorganismos en condiciones no axénicas, comprende: inocular un medio de cultivo acuoso con un cultivo de microorganismos que comprenden por lo menos algunas bacterias contaminantes en un recipiente de cultivo; suministrar el cultivo de microorganismos con por lo menos algo de luz; suministrar el cultivo de microorganismos con una fuente de carbono orgánico; suministrar el cultivo de microorganismos con un agente oxidante; y en donde el cultivo de microorganismos mantiene un nivel de bacterias contaminantes por debajo del 25% del recuento total de células del cultivo de microorganismos. En algunas modalidades, el agente oxidante comprende por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de: ozono, peróxido de hidrógeno, cloro, clorito, clorato, hipoclorito, ácido nítrico, cromo, permanganato, óxido de plata y bromo.

En algunas modalidades, el ozono se suministra en concentraciones entre 0.1 y 2.0 mg/L. En algunas modalidades, el agente oxidante se suministra al cultivo de microorganismos a través de por lo menos uno de un rociador y un inyector venturi. En algunas modalidades, el microorganismo comprende por lo menos un microorganismo de un género seleccionado del grupo que consiste de: Agmenellum, Amphora, Anabaena, Anacystis, Api st onema, Arthrospira (Spirulina) , Botryococcus , Brachiomonas , Chlamydomonas , Chlorella, Chloroccum, Cruciplacolithus , Cylindrotheca, Coenochloris, Cyanophora, Cyclotella, Dunaliella, Emiliania, Euglena, Extubocellulus , Fragilaria, Galdieria, Goniotrichium, Haematococcus , Halochlorella, Isochyrsis , Leptocylindrus, Micractini um, Melosira, Monodus, Nostoc, Nannochloris , Nannochloropsis , Navícula, Neospongiococcum, Nitzschia . , Odontella, Ochromonas, Ochrosphaera, Pavlova, Picochlorum, Phaeodactylum, Pleurochyrsis, Porphyridium, Poteriochromonas , Prymnesium, Rhodomonas, Scenedesmus , Skeletonema, Spumella, Stauroneis , Stichococcus, Auxenochlorella, Cheatoceros , Neochloris , Ocromonas , Porphiridium, Synechococcus , Synechocystis , Tetraselmis Thraustochytridos y Thalassiosira .

En algunas modalidades, la fuente de carbono orgánico comprende por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de: etilo, ácido acético, linoleato de amonio, arabinosa, arginina, ácido aspártico, ácido butírico, celulosa, ácido cítrico, etanol, fructosa, ácidos grasos, galactosa, glucosa, glicerol, glicina, ácido láctico, lactosa, ácido maleico, maltosa, mañosa, metanol, melaza, peptona, hidrolizado a base de plantas, prolina, ácido propiónico, ribosa, sacarosa, hidrolizados parciales o completos de almidón, sacarosa, tartárico, ácidos orgánicos del ciclo del TCA, residuos de destilería delgados, urea, soluciones de residuos industriales, y extracto de levadura.

En algunas modalidades de la invención, un método de cultivo de microorganismos en condiciones mixotróficas no axénicas, comprende: inocular un medio de cultivo acuoso con un cultivo de microorganismos que comprende por lo menos algunas bacterias contaminantes en un recipiente de cultivo; suministrar el cultivo de microorganismos con por lo menos algo de luz; suministrar el cultivo de microorganismos con una fuente de carbono orgánico; suministrar el cultivo con un gas que comprende oxígeno; y en donde el gas se suministra al cultivo a una kLa de por lo menos 2.40 X 103 s-1, y los resultados en una tasa de productividad para el microorganismo de por lo menos 0.4 g/L d. En alguna modalidad, la kLa es entre 2.70 X 103 S1 y 21 s-1. En algunas modalidades, la tasa de productividad de los microorganismos es entre 0.5 g/L d y 50 g/L d.

En algunas modalidades, el gas se suministra al cultivo de los microorganismos por lo menos por uno seleccionado del grupo que consiste de un inyector de gas, difusor poroso, difusor de microporos, membrana permeable a gas, generador de microburbujas, inyección venturi y oscilador fluídico de microburbujas. En alguna modalidad, la fuente de carbono orgánico comprende ácido acético y el medio de cultivo acuoso comprende una concentración inicial y el suministro para los primeros 1-5 días de acetato de sodio, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio.

En algunas modalidades de la invención, un método de microorganismos que crecen mixotróficamente comprende: proveer un cultivo de microorganismos en un medio de cultivo acuoso en un recipiente de cultivo, los microorganismos pueden utilizar la luz y el carbono orgánico como fuentes de energía; suministrar por lo menos algo de luz al cultivo de microorganismos; y suministrar de una fuente de carbono orgánico que comprende ácido acético y un promotor de oxaloacetato al cultivo de microorganismos. En algunas modalidades, el ácido orgánico comprende por lo menos una forma del grupo que consiste de ácido acético, acetato y anhídrido acético. En algunas modalidades, el promotor de oxaloacetato comprende por lo menos uno del grupo que consiste de ácido propiónico, valina, isoleucina, treonina y metionina. En algunas modalidades, la relación de ácido orgánico a promotor de oxalacetato varía de 10:0.01 a 10:2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una gráfica comparativa que muestra la productividad en peso seco de células y lípidos como un porcentaje del peso seco de células entre cultivos fotoautotróficos y mixotróficos.

La figura 2 es una gráfica comparativa que muestra la productividad en peso seco de células y lípidos como un porcentaje del peso seco de células entre cultivos fotoautotróficos y mixotróficos.

La figura 3 es una gráfica comparativa que muestra la absorción de NaNCh entre cultivos fotoautotróficos y mixotróficos, y la absorción de etilo durante un cultivo mixotrófico .

La figura 4 es una gráfica comparativa que muestra la absorción de NaNC entre cultivos fotoautotróficos y mixotróficos, y la absorción de etilo durante un cultivo mixotrófico.

La figura 5 es una gráfica comparativa que muestra el acetato residual para dos cultivos mixotróficos.

La figura 6 es una gráfica comparativa que muestra la productividad en peso seco de células para cultivos fotoautotróficos y mixotróficos con fotoperiodos de 24 y 14 horas.

La figura 7 es una gráfica comparativa que muestra el consumo de nitrato de cultivos fotoautotróficos y mixotróficos con fotoperiodos de 24 y 14 horas.

La figura 8 es una gráfica comparativa que muestra la absorción de acetato para cultivos mixotróficos con fotoperiodos de 24 y 14 horas.

La figura 9 es una gráfica comparativa que muestra el nivel de oxígeno disuelto para cultivos fotoautotróficos y mixotróficos con fotoperiodos de 24 y 14 horas.

La figura 10 es una gráfica comparativa de la productividad en peso seco de células libre de ceniza para cultivos fotoautotróficos y mixotróficos con fotoperiodos de 24 y 0 horas, y la concentración de oxígeno disuelto.

La figura 11 es una gráfica comparativa que muestra la adición de ácido acético para cultivos mixotróficos y heterótrofos.

La figura 12 es una gráfica comparativa que muestra la absorción de NaN03 para cultivos fotoautotróficos y mixotróficos con fotoperiodos de 24 y 0 horas.

La figura 13 es una gráfica comparativa que muestra la productividad en peso seco de células por dos cultivos mixotróficos.

La figura 14 es una gráfica comparativa que muestra el nivel de oxígeno disuelto y temperatura máxima de dos cultivos mixotróficos.

La figura 15 es una gráfica comparativa que muestra la productividad en peso seco de células, NaN03 residual y nivel de oxígeno disuelto para un cultivo mixotrófico.

La figura 16 es una gráfica comparativa que muestra la productividad en peso seco celular, NaN03 residual y el nivel de oxígeno disuelto para un cultivo mixotrófico.

La figura 17 es una gráfica comparativa que muestra los recuentos de bacterias y la temperatura para dos cultivos mixotróficos.

La figura 18 es una gráfica comparativa de la productividad en peso seco de células libre de ceniza de un cultivo que pasó de condiciones mixotróficas a fotoautótrofas.

La figura 19 es una gráfica comparativa de la productividad en peso seco de células libre de ceniza para cultivos mixotróficos y autótrofos de concentraciones de acetato de sodio iniciales de 2 y 0 g/L.

La figura 20 es una gráfica comparativa que muestra la adición de ácido acético para cultivos mixotróficos de concentraciones de acetato de sodio iniciales de 2 y 0 g/L.

La figura 21 es una gráfica comparativa que muestra los efectos de las aplicaciones de H2O2 a medios que contienen glucosa y acetato.

La figura 22 es una gráfica comparativa que muestra los efectos de las aplicaciones de H2O2 a medios que contienen glucosa y acetato.

La figura 23 es una gráfica comparativa de la productividad el peso seco libre de ceniza para dos cultivos mixotróficos.

La figura 24 es una gráfica comparativa que muestra el rendimiento en g/m2 día para dos cultivos mixotróficos.

La figura 25 es una gráfica comparativa que muestra la tasa de crecimiento volumétrico para dos cultivos mixotróficos.

La figura 26 es una gráfica comparativa que muestra la productividad en g/m2 día y el consumo de ácido acético para dos cultivos mixotróficos.

La figura 27 es una gráfica comparativa que muestra el consumo de nitratos para dos cultivos mixotróficos.

La figura 28 es una gráfica comparativa que muestra el porcentaje de bacterias a Chlorella para dos cultivos mixotróficos.

La figura 29 es una gráfica comparativa que muestra la concentración de oxígeno para dos cultivos mixotróficos.

La figura 30 es una gráfica comparativa que muestra la concentración de oxígeno para un cultivo mixotrófico.

La figura 31 es una gráfica comparativa que muestra la concentración de bacterias y células de microalgas vivas de un cultivo de microalgas tratado con sonicación.

La figura 32 es una gráfica que muestra una concentración de cultivo mixotrófico de microalgas y tasa de crecimiento volumétrico (g/L) con el tiempo.

La figura 33 es una gráfica que muestra una tasa de crecimiento de área (g/m2) de un cultivo mixotrófico de microalgas con el tiempo.

La figura 34 es una gráfica que muestra una tasa de crecimiento volumétrico de cultivo mixotrófico de microalgas (g/L/día) correlacionada con la concentración.

La figura 35 es una gráfica que muestra una tasa de crecimiento de área de cultivo mixotrófico de microalgas (g/m2) correlacionada con la concentración.

La figura 36 es una gráfica que muestra una temperatura del cultivo mixotrófico de microalgas con el tiempo.

La figura 37 es una gráfica que muestra un pH del cultivo mixotrófico de microalgas con el tiempo.

La figura 38 es una gráfica que muestra una concentración de oxígeno disuelto del cultivo mixotrófico de microalgas en el tiempo.

La figura 39 es una gráfica que muestra una radiación activa fotosintética suministrada al cultivo mixotrófico de microalgas con el tiempo.

La figura 40 es una gráfica que muestra la concentración de nitrato del cultivo mixotrófico de microalgas con el tiempo.

La figura 41 es una gráfica que muestra la productividad en peso seco de células de cultivos mixotróficos de microalgas suministrados con diferentes fuentes de carbono orgánico en el tiempo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Introducción El término "microorganismo" se refiere a los organismos microscópicos, tales como las microalgas y cianobacterias. Las microalgas incluyen plantas multicelulares microscópicas (por ejemplo, la lenteja de agua), microorganismos fotosintéticos, microorganismos heterótrofos, diatomeas, dinoflagelados y algas unicelulares.

Los microorganismos que pueden crecer en condiciones de cultivo mixotróficas comprenden microalgas y cianobacterias. Ejemplos no limitantes de microorganismos mixótrofos pueden comprender organismos de los géneros: Agmenellum, Amphora, Anabaena, Anacystis , Apistonema, Art hrospira (Spirulina) , Botryococcus , Brachiomonas , Chlamydomonas , Chlorella, Chloroccum, Cruciplacolithus , Cylindrotheca , Coenochloris , Cyanophora, Cyclotella, Dunaliella, Emiliania, Euglena, Extubocellulus , Fragilaria, Galdieria, Goniotrichium, Haematococcus , Halochlorella , Isochyrsis , Leptocylindrus , Micractinium, Melosira, Monodus, Nostoc, Nannochloris , Nannochloropsis , Navícula, Neospongiococcum, Nitzschia . , Odontella, Ochromonas, Ochrosphaera , Pavlova, Picochlorum, Phaeodactylum, Pleurochyrsis , Porphyridium, Poteriochromonas , Prymnesium, Rhodomonas, Scenedesmus, Skeletonema, Spumella, Stauroneis , Stichococcus, Auxenochlorella, Cheatoceros , Neochloris , Ocromonas, Porphiridium, Synechococcus , Synechocystis , Tetraselmis, Thraustochytridos, Thalassiosira , y especies de los mismos.

Ejemplos no limitantes de especies de microorganismos adecuados para el crecimiento mixotrófico con el uso de ácido acético como una fuente de carbono orgánico puede comprender organismos de los géneros: Chlorella, Anacystis , Synechococcus, Synechocystis, Neospongiococcum, Chlorococcum, Phaeodactylum, Spirulina, Micractinium, Haematococcus, Nannochloropsis, Brachiomonas, y especies de los mismos.

Las fuentes de carbono orgánico adecuadas para el cultivo de un microorganismo mixotróf icamente o heterotrófreamente pueden comprender: acetato, ácido acético, linoleato de amonio, arabinosa, arginina, ácido aspártico, ácido butírico, celulosa, ácido cítrico, etanol, fructosa, ácidos grasos, galactosa, glucosa, glicerol, glicina, ácido láctico, lactosa, ácido maleico, maltosa, mañosa, metanol, melaza, peptona, hidrolizado a base de plantas, prolina, ácido propiónico, ribosa, sacarosa, hidrolizados parciales o completos de almidón, sacarosa, tartárico, ácidos orgánicos del ciclo del TCA, residuos de destilación delgados, urea, soluciones residuales industriales, extracto de levadura, y combinaciones de los mismos. La fuente de carbono orgánico puede comprender cualquier fuente única, combinación de fuentes y diluciones de las fuentes individuales o combinaciones de fuentes.

Aunque los microorganismos capaces de crecimiento mixotrófico también pueden crecer en condiciones 100% fototróficas o condiciones 100% heterotróficas, se ha encontrado que la combinación de luz y una fuente de carbono orgánico puede superar las condiciones fototróficas en un biorreactor, que incluyen sistemas abiertos. Los microorganismos capaces de crecimiento mixotrófico también pueden crecer en una combinación de condiciones, tales como la transición entre las condiciones fototróficas, mixotróficos y heterótrofas. El cultivo de métodos con transiciones entre las condiciones tróficas puede regular la fuente de alimentación para las bacterias, lo que permite al mismo tiempo que los microorganismos mixótrofos sigan creciendo en condiciones variadas.

Por ejemplo, el crecimiento de las microalgas puede frenarse en condiciones fototróficas en comparación con las condiciones mixotróficas o heterótrofas, pero el crecimiento de las bacterias puede desacelerarse también, y no crecer fototróficamente si las bacterias carecen de un metabolismo fotosintético. La capacidad para crecer mixotróficamente en condiciones no axénicas también provee un método más simple que la fermentación tradicional y más cerca de la simplicidad de los métodos fototróficos. La optimización de la productividad de un microorganismo mixótrofo en condiciones no axénicas, por lo tanto, comprende la selección de una fuente de carbono orgánico, el sistema y métodos para la administración de la fuente de carbono orgánico, los sistemas y métodos para aplicar el tipo óptimo de la luz y la cantidad de luz, los sistemas y métodos para la administración de nutrientes, los sistemas y métodos para controlar el nivel de pH, y los sistemas y métodos para controlar la población de organismos contaminantes (por ejemplo, bacterias, hongos). El uso de un sistema auxostat-pH con ácido acético provee un método eficiente para el crecimiento de un cultivo mixotrófico de microorganismos en condiciones no axénicas mediante el mantenimiento de la fuente de carbono orgánico a un nivel constante o sustancialmente constante en el cultivo mientras ayuda a mantener las condiciones de cultivo que inhiben el crecimiento de contaminación bacteriana.

Las abreviaturas en una fórmula como g/m2 d; g/L d; h/día; L/d; Watts h/g; o mg/L d se usan a lo largo de este texto, g/m2 d significa gramo por metro cuadrado por día o gramos por metro cuadrado por día. g/L d significa gramo por litro por día o gramos por litro por día; L/d significa litro por día o litros por día; h/día y h/d significan horas por día; Wh/g significa vatios hora por gramo o vatios hora por gramo.

El término "productividad" se refiere a la medida de la tasa de crecimiento de microalgas o cianobacterias.

El término "productividad de área" o "tasa de crecimiento de área" significa la masa de microalgas o cianobacterias producida por unidad de tierra por día. Un ejemplo de la tasa es gramos por metro cuadrado por día (g/m2 d) que es los gramos de microalgas o cianobacterias producidos por m2 del área de reactor por día.

El término "productividad en volumen" o "tasa de crecimiento volumétrico" significa la masa de microalgas o cianobacterias producida por volumen de cultivo unitario por día. Un ejemplo de esa unidad es g/L d (gramos por litro por día), que es los gramos de microalgas o cianobacterias producidos en cada litro de cultivo por día. El ejemplo 4 se refiere a un estanque con 10 cm de profundidad, por lo tanto la productividad de aérea en g/m2/día es 1/100 veces la de la productividad volumétrica en g/L/día.

Un auxostat es un dispositivo que usa la tasa de alimentación para controlar una variable de estado en un cultivo continuo. Los organismos en el cultivo establecen su propia tasa de dilución. Un auxostat tiende a ser mucho más estable a altas tasas de dilución que un quimiostato comúnmente conocido en la téenica. Las presiones de selección de población en un auxostat conducen a cultivos que crecen rápidamente. Aplicaciones prácticas incluyen la propagación de tasa alta, la destrucción de desechos con control a una concentración de tasa máxima, el cultivo abierto porque los organismos contaminantes potenciales no pueden adaptarse antes del lavado, y la operación de los procesos que se benefician de cuidadoso equilibrio de las relaciones de las concentraciones de nutrientes.

El término "auxostat-pH" se refiere a la técnica de cultivo microbiano que empareja la adición de medio fresco (por ejemplo, medio que contiene carbono orgánico o ácido acético) para el control del pH. A medida que el pH se desplaza desde un punto de ajuste determinado, se añade medio fresco para llevar el pH de nuevo al punto de ajuste. La tasa de cambio de pH es a menudo una indicación excelente del crecimiento y satisface los requerimientos como un parámetro de crecimiento dependiente. La alimentación mantendrá la concentración de nutrientes residuales en equilibrio con la capacidad de amortiguación del medio. El punto de ajuste del pH se puede cambiar según los microorganismos presentes en el cultivo en el momento. Los microorganismos presentes pueden ser impulsados por la ubicación y la temporada en la que se opera el biorreactor y lo cerca que los cultivos están en condiciones de otras fuentes de contaminación (por ejemplo, otras granjas, agricultura, océano, lago, río, agua de vertido). La velocidad de adición se determina por medio de la capacidad de amortiguación y la concentración de alimentación del nutriente limitante y no directamente por el punto de ajuste (pH) como en un auxostat tradicional. El auxostat-pH es robusto pero controla la concentración de nutrientes indirectamente. El nivel de pH representa la suma de la producción de diferentes especies iónicas y liberación de iones durante la absorción de carbono y nutrientes. Por lo tanto, el nivel de pH se puede mover ya sea hacia arriba o hacia abajo como una función de crecimiento de los microorganismos. La situación más común es la depresión de pH causada por la producción de ácido orgánico y la absorción de amonio. Sin embargo, para los microorganismos que crecen en medios ricos en proteínas o aminoácidos, el nivel de pH se elevará con el crecimiento debido a la liberación del exceso de amoníaco.

El término "cultivo microbiológico", "cultivo microbiano" o "cultivo de microorganismos" se refieren a un método o sistema para multiplicar los microorganismos a través de la reproducción en un medio de cultivo predeterminado, incluso bajo condiciones de laboratorio controladas. Los cultivos microbiológicos, cultivos microbianos y cultivos de microorganismos se usan para multiplicar el organismo, para determinar el tipo de organismo, o la abundancia del organismo en la muestra que se prueba. En un medio de cultivo líquido, el término cultivo microbiológico, microbiano o de microorganismos generalmente se refiere a todo el medio líquido y los microorganismos en el medio líquido, independientemente del recipiente en el que reside el cultivo. Un medio líquido se refiere a menudo como "medios", "medio de cultivo" o "medios de cultivo". El acto de cultivar se conoce generalmente como "cultivar microorganismos" cuando se hace hincapié en una pluralidad de microorganismos. El acto de cultivar se conoce generalmente como "cultivar un microorganismo" cuando se da importancia a una especie o género de microorganismo. Cultivo de microorganismos se usa como sinónimo de cultivar microorganismos.

Los términos "monoalgal" y "unialgal" se refieren a un cultivo de microalgas o cianobacterias que es operado bajo condiciones no axénicas pero dominado por un solo género o especie de microalgas o cianobacterias. A pesar de la presencia de otros microorganismos heterótrofos (es decir, condiciones no axénicas), el cultivo se mantiene estable debido al medio de cultivo mineral inorgánico usado en los cultivos. Los cultivos monoalgales podrían utilizarse para cultivos heterótrofos pero la combinación de un medio orgánico con la presencia de bacterias heterótrofas y hongos no garantiza la estabilidad del cultivo monoalgal encontrado en condiciones fototróficas "como tal" y, por lo tanto, el término es menos apropiado. El cultivo monoalgal también se puede usar para definir un cultivo de microorganismos axénicos no dominado por un solo género o especie.

El término "inocular" se refiere a la implantación o la introducción de microorganismos en un medio de cultivo. Inocular o inoculación de un cultivo de microorganismos en las condiciones de cultivo descritas en toda la especificación se refiere a iniciar un cultivo de microorganismos en las condiciones de cultivo, como se usa comúnmente en la téenica de cultivo de microorganismos. Los microorganismos que se introducen en un medio de cultivo pueden referirse como semilla o inoculo.

El término "ozono" significa una forma de oxígeno, O3, con un olor peculiar que sugiere que el del cloro débil, que se produce cuando una chispa eléctrica o luz ultravioleta se hace pasar a través del aire o el oxígeno. El ozono es un gas tóxico incoloro inestable con potentes propiedades oxidantes, formado a partir de oxígeno por descargas eléctricas.

El término "coagular" significa causar la transformación de una suspensión líquida en una masa espesada viscosa o blanda, semisólida, o sólida. Coagular significa deshidratar, como para eliminar el agua suficiente para hacer que una suspensión líquida se convierta a una masa blanda espesada viscosa semisólida o sólida. Los métodos de deshidratación se pueden usar junto con cultivos de microorganismos que hacen que los microorganismos se coagulen y formen una masa más densa que puede ser más adecuada para la recolección y el procesamiento corriente abajo.

Los términos "mixotrófico" y "mixotrofía" se refieren a las condiciones de cultivo en las cuales la luz, el carbono orgánico y el carbono inorgánico (por ejemplo, dióxido de carbono, carbonato, bi-carbonato) se pueden aplicar a un cultivo de microorganismos. Los microorganismos capaces de crecer en condiciones mixotróficas tienen el perfil metabólico tanto de microorganismos fototróficos como heterótrofos, y puede usar tanto la luz como el carbono orgánico como fuentes de energía, así como tanto el carbono inorgánico como el carbono orgánico como fuentes de carbono.

Un microorganismo mixótrofo puede usar luz, carbono inorgánico y carbono orgánico a través de los metabolismos fotótrofos y heterótrofos simultáneamente o puede cambiar entre la utilización de cada metabolismo. Un microorganismo en condiciones de cultivo mixotróficas puede ser un productor neto de oxígeno o dióxido de carbono según la fuente de carbono y fuente de energía utilizadas por el microorganismo. Los microorganismos capaces de crecimiento mixotrófico comprenden microorganismos con el metabolismo natural y capacidad de crecer en condiciones mixotróficas, así como microorganismos que obtienen el metabolismo y la capacidad mediante la modificación de las células por medio de métodos tales como mutagénesis o ingeniería genética.

Los términos "fototrófico", "fototrofía", "fotoautotrofía", "fotoautótrofo", y "autótrofo" se refieren a las condiciones de cultivo en las que la luz y el carbono inorgánico (por ejemplo, dióxido de carbono, carbonato, bi carbonato) se pueden aplicar a un cultivo de microorganismos. Los microorganismos capaces de crecer en condiciones fototróficas pueden utilizar la luz como fuente de energía y carbono inorgánico (por ejemplo, dióxido de carbono) como fuente de carbono. Un microorganismo en condiciones fototróficas puede producir oxígeno.

Los términos "heterotrófico" y "heterotrofía" se refieren a las condiciones de cultivo en las que el carbono orgánico se puede aplicar a un cultivo de microorganismos en ausencia de luz. Los microorganismos capaces de crecer en condiciones heterotróficas pueden utilizar carbono orgánico tanto como una fuente de energía como fuente de carbono. Un microorganismo en condiciones heterotróficas puede producir dióxido de carbono.

El término "axénico" describe un cultivo de un organismo que es totalmente libre de todos los otros organismos "contaminantes" (es decir, organismos que son perjudiciales para la salud de los cultivo de microalgas o cianobacterias). A lo largo de la especificación, axénico refiere a un cultivo que cuando se inocula en una placa de agar con medio basal bacteriano, no forma ninguna colonia que no sea el microorganismo de interés. Axénico describe cultivos no contaminados por o asociados con otros organismos vivos tales como, pero no limitados a bacterias, cianobacterias, microalgas y/u hongos. Axénico se usa generalmente en referencia a cultivos puros de microorganismos que son completamente libres de la presencia de otros organismos diferentes. Una cultivo axénico de microalgas o cianobacterias está completamente libre de otros organismos diferentes.

El término "cosecha" se refiere a la eliminación del cultivo de microorganismos del recipiente de cultivo y/o la separación de microorganismos del medio de cultivo. La cosecha de los microorganismos puede ser realizada por cualquier método conocido en la téenica, tal como, pero no limitado a, desnatado, drenado, flotación de gas disuelto, fraccionamiento de espuma, centrifugación, filtración, sedimentación, floculación química y electro-deshidratación.

Métodos de cultivo mixotrófico Un método de cultivo de microorganismos en condiciones mixotróficas no axénicas comprende: inocular un medio de cultivo acuoso con un cultivo de microorganismos que comprenden por lo menos algunas bacterias contaminantes en un recipiente de cultivo; suministrar el cultivo de microorganismos con por lo menos algo de luz; y suministrar una fuente de carbono orgánico para el cultivo de microorganismos. La selección de un ácido orgánico como fuente de carbono orgánico puede contribuir a mantener un nivel de bacterias contaminantes por debajo de un umbral aceptable para lograr altas tasas de crecimiento. Se reconoce que en la práctica, un cultivo que comprende microorganismos en condiciones no axénicas como un cultivo iluminado de microalgas o cianobacterias con una fuente de carbono orgánico tendrá por lo menos algunas bacterias de contaminación, ya que la capacidad práctica para reducir la población de bacterias cerca de cero (por ejemplo, mediante la esterilización por vapor u otros procedimientos conocidos) puede tener un costo prohibitivo para los cultivos de gran volumen iluminados con una densidad de cultivo de 0.05 a 10 g/L. Además, puede no ser deseable eliminar por completo la población de bacterias de un cultivo, ya que ciertas bacterias pueden estar involucradas en la producción de nutrientes esenciales para las microalgas o cianobacterias, tales como cianocobalamina, u otros productos valiosos. Por lo tanto, en algunas modalidades se puede mantener el nivel de bacterias contaminantes por debajo de 25%, 20%, 10% o 5% de los recuentos de células totales del cultivo.

Como se ha descrito anteriormente, el mantenimiento de un cierto nivel de tipos específicos de bacterias puede ser beneficioso para un cultivo de microalgas o cianobacterias. Las bacterias que pueden estar presentes en cultivos de microalgas y cianobacterias comprenden, pero no se limitan a: Achromobacter sp., Acidovorax sp ., Acinetobacter sp., Aeromonas sp., Agrobacterium sp ., Alteromonas sp., Ancylobacter sp., Aquaspirillum sp., Azospirillum sp., Azotobacter sp., Bacillus sp., Bergeyella sp., Brevundimonas sp., Brochothrix sp., Brumimicrobium sp., Burkholderia sp., Caulobacter sp., Cellulomonas sp., Chryseobacterium sp., Curtobacterium sp., Delftia sp., Empedobacter sp., Enterobacter sp., Escherichia sp., Flavobacterium sp., Gemmatimonas sp., Halomonas sp., Hydrogenophaga sp., Janthinobacterium sp., Lactobacillus sp., Marinobacter sp., Massilia sp., Microbacterium sp., Myroides sp., Pantoea sp., Paracoccus sp. Pedobacter sp., Phaeobacter sp., Phyllobacterium sp., Pseudoalteromonas sp., Pseudomonas sp., Rahnella sp., Ralstonia sp., Rhizobium sp., Rhodococcus sp., Roseomonas sp., Sphingobacterium sp., Sphingomoas sp., Staphylococcus sp., Stenotrophomonas sp., Vibrio sp., y Zobelliae sp.

Las bacterias que tienen un efecto negativo o perjudicial sobre las microalgas y cianobacterias pueden ser designadas como bacterias contaminantes. Las bacterias que pueden tener un efecto negativo o perjudicial sobre microalgas o cianobacterias en un cultivo comprenden, pero no se limitan a: Achromobacter sp., Acidovorax sp., Aeromonas sp., Agrobacterium sp., Alteromonas sp., Aquaspirillum sp., Azospirillum sp., Azotobacter sp., Bergeyella sp ., Brochothrix sp., Brumimicrobium sp., Burkholderia sp ., Caulobacter sp., Cellulomonas sp., Chryseobacterium sp., Curtobacterium sp ., Delftia sp., Empedobacter sp ., Enterobacter sp., Escherichia sp., Flavobacterium sp., Marinobacter sp ., Microbacterium sp ., Myroides sp ., Paracoccus sp., Pedobacter sp., Phaeobacter sp., Pseudoalteromonas sp., Pseudomonas sp., Rahnella sp., Ralstonia s ., Rhizobium sp., Rhodococcus sp., Roseomonas sp., Staphylococcus sp., Stenotrophomonas sp., Vibrio sp., Zobelliae sp. y otras bacterias que comparten características similares .

Las bacterias que pueden tener un efecto neutro o beneficioso sobre microalgas o cianobacterias en un cultivo comprenden, pero no se limitan a: Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Aeromonas sp., Agrobacterium sp ., Alteromonas sp., Ancylobacter sp., Azospirillum sp ., Azotobacter sp., Bacillus sp ., Brevundimonas sp., Brumimicrobium sp., Burkholderia sp ., Caulobacter sp ., Cellulomonas sp., Delftia sp., Empedobac ter sp., Gemmatimonas sp., Halomonas sp., Hydrogenophaga sp., Janthinobacterium sp., Lactobacillus sp., Marinobac ter sp., Pantoea sp., Paracoccus sp., Phaeobac ter sp., Phyllobacterium sp ., Pseudoalteromonas sp., Pseudomonas sp., Rhizobium sp., Sphingomoas sp., Zobelliae sp. y otras bacterias que comparten características similares. Aunque las bacterias en un género particular generalmente tienen las mismas características, se reconoce que un género de bacterias con la mayoría de las especies identificadas generalmente como perjudiciales para microalgas o cianobacterias también puede incluir una especie en particular dentro del género que es neutro o beneficioso para un cultivo específico de microalgas o cianobacterias, y viceversa. Por ejemplo, muchas especies de Pseudomonas se han observado que son perjudiciales para las microalgas, sin embargo la literatura ha descrito ciertas especies de Pseudomonas con funcionalidad anti-hongos que pueden ser beneficiosas para un cultivo de microalgas o cianobacterias.

Las bacterias que proveen un efecto neutro o beneficioso pueden añadirse a un cultivo de microalgas o cianobacterias en un papel probiótico para ayudar a controlar el nivel de bacterias contaminantes, aumentar el rendimiento de crecimiento de las microalgas o cianobacterias, o aumentar el cultivo de la longevidad. En un ejemplo no limitante, los datos recientes han demostrado al inocular cultivos de Chlorella mixotróficos con Bacillus sp., Rhizobium sp., y Sphingomonas sp., que Chlorella creció bien a 35° C y superó los cultivos de control que no fueron inoculados con bacterias. Otros aditivos pueden ser aplicados a los medios que inhiben bacterias grampositivo y/o gramnegativopara reducir el crecimiento de todas las bacterias y/o bacterias específicas presentes en el cultivo.

Algunas especies de bacterias que se ha observado que tienen un efecto neutro o beneficioso sobre microalgas o cianobacterias y pueden ser añadidas al cultivo en un papel probiótico para proveer funciones tales como: cielar nutrientes orgánicos e inorgánicos; producir productos industriales y farmacéuticos valiosos tales como sustancias extracelulares de polímero, nutrientes, vitaminas y minerales quelados; producir agentes ant ifúngicos; producir potenciadores del crecimiento; producir antibióticos; producir biocompuestos; fijar nitrógeno; transformar nutrientes; descomponer materia orgánica; ayudar a mantener un equilibrio de equilibrio biológico en el cultivo de microorganismos; y ayudar en la nitrificación y desnitrificación. Algunas bacterias pueden tener fotopigmentos que reaccionan a la luz de manera similar a las microalgas o cianobacterias. Como un ejemplo no limitante, Azospirillum sp. crecido en un cultivo con Chlorella puede aumentar el contenido de pigmentos, el contenido de lípidos, la variedad de lípidos, y el crecimiento. Se sabe en la literatura que Sphingomonas sp. está asociado con plantas y es capaz de fijar el nitrógeno. Las bacterias con fotopigmentos también pueden ser manipulados con intensidad de luz y/o longitudes de onda de luz específicas para influir en un cultivo.

Los microorganismos se inoculan en un medio de cultivo acuoso contenido en cualquier recipiente adecuado para el crecimiento. En algunas modalidades, el medio de cultivo puede ser cualquier medio de cultivo líquido adecuado para el cultivo de microorganismos, tales como, pero no limitados a un medio de cultivo BG-11, un medio de cultivo BG-11 modificado, un medio de cultivo f/2, y un medio de cultivo f/2 modificado. En algunas modalidades, el medio de cultivo comprende uno o más de: agua de mar, agua de lago, el agua de río, aguas residuales, o de otras fuentes de agua disponibles; fuentes de agua disponibles limpiadas por filtración o esterilización antes de la inoculación con un cultivo de microorganismos; y un medio acuoso inoculado con microorganismos benéficos (por ejemplo, bacterias) para impulsar el cultivo de microorganismos. En algunas modalidades, los parámetros de un cultivo pueden ser manipuladas, y microbios beneficiosos (por ejemplo, bacterias) se pueden añadir al medio de cultivo según sea necesario de acuerdo con los microorganismos presentes en el cultivo y la salud del cultivo. En algunas modalidades, el recipiente de cultivo puede comprender un tanque, biorreactor, fotobiorreactor, estanque, estanques de flujo abierto, reactor tubular, reactor de panel plano, comedero, biorreactor de columna, bolsa de biorreactor, o cualquier otro biorreactor conocido en la téenica. En algunas modalidades, el buque podrá ser abierto. En algunas modalidades, el recipiente puede ser cerrado. En algunas modalidades, el recipiente puede estar situado en el interior. En algunas modalidades, el recipiente puede estar situado al aire libre. En algunas modalidades, el recipiente puede estar situado en el exterior pero dispuesto dentro de un invernadero, estructura, o cubierta que encierra sustancialmente el reactor para reducir al mínimo la entrada de elementos no deseados y materiales extraños del medio ambiente, y bloquear por lo menos algo de luz o longitudes de onda de la luz.

El cultivo de microorganismos se puede mantener a un nivel de pH y temperaturas constantes o sustancialmente constantes. En otras modalidades, el cultivo de microorganismos se puede operar entre una gama de niveles de pH o un intervalo de histéresis de temperaturas, incluidas temperaturas que siguen un ciclo diurno, o un intervalo de niveles de pH y temperaturas. En algunas modalidades, el nivel de pH varía de aproximadamente 6 a 9 y la temperatura varía de aproximadamente 10°C a 30°C. En otras modalidades, el nivel de pH varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 y la temperatura oscila entre 30°C y 50°C. En algunas modalidades, el nivel de pH y la temperatura pueden mantenerse con los intervalos identificados para por lo menos una parte del ciclo de crecimiento que pueden correlacionarse con las horas de luz del día u horas después de la puesta del sol. En otras modalidades, el nivel de pH es de aproximadamente 7.5 y la temperatura es de aproximadamente 25-28°C.

En algunas modalidades, la temperatura del cultivo se puede controlar con un intercambiador de calor, tal como, pero no limitado a, serpentines de refrigeración o calentamiento. En algunas modalidades, el punto de ajuste de pH se puede cambiar dentro del intervalo adecuado para el crecimiento de microalgas durante el cultivo de acuerdo con la composición de microorganismos presentes. Un cambio en el pH puede usarse para impactar (es decir, estrés) bacterias y reducir la proliferación de bacterias contaminantes en el cultivo perjudiciales para las microalgas o cianobacterias primarias. Un cambio en el pH se puede combinar con un cese del suministro de fuente de carbono durante un periodo de tiempo (por ejemplo, 4 horas - 48 horas), manipulación de los niveles de oxígeno disuelto (OD), modificación de la temperatura, adición de agentes bactericidas, adición de aminoácidos o de otras fuentes de alimentación, y combinaciones de los mismos que pueden reducir la proliferación de bacterias que pueden ser perjudiciales para las microalgas o cianobacterias y/o promover la proliferación de bacterias que pueden ser bacterias beneficiosas/no nocivas.

Una fuente de iluminación que comprende la radiación fotosintéticamente activa (PAR) suministra el cultivo con por lo menos un poco de luz para la actividad fotosintética. La fuente de luz puede ser natural, artificial, o cualquier combinación de las mismas. El periodo de exposición a la luz (es decir, fotoperiodo) puede variar de aproximadamente 0 a 24 hr/día. En otras modalidades, el periodo de exposición a la luz (es decir, fotoperiodo) puede variar de aproximadamente 10 a 16 hr/día. En algunas modalidades, el suministro de la luz puede ser discontinuo (por ejemplo, parpadeando), continuo, intensidad constante o intensidad variable. En algunas modalidades, la fuente de luz natural puede comprender radiación solar. En modalidades alternativas, el cultivo puede ser expuesto a la luz de forma intermitente, al final de la vida del cultivo, durante unos pocos minutos por dia, o durante un día y similares. En algunas modalidades, la fuente de luz artificial puede comprender diodos emisores de luz (LED), micro-LED, luces fluorescentes, luces incandescentes, lámparas de gas o lámparas de halógeno.

En otras modalidades, la fuente de luz natural puede ser filtrada o la fuente de luz artificial puede ser sintonizada para limitar la luz suministrada a un espectro de longitud de onda específico o combinación de espectros específicos de longitud de onda tales como, pero no limitados, a los espectros de luz violeta (aproximadamente 380-450 nm), azul (aproximadamente 450 a 495 nm), verde (aproximadamente 495 a 570 nm), amarillo (570-590 nm), anaranjado (aproximadamente 590-620 nm), rojo (aproximadamente 620 a 750 nm) , y rojo lejano (aproximadamente 700-800 nm). Los LED sintonizados en un espectro de longitud de onda o longitudes de onda específicas de luz filtrados por películas específicas de efecto invernadero se pueden usar para manipular el crecimiento y la producción de productos de los microorganismos en el cultivo. Los pasos de acabado con LED de una longitud de onda específica pueden usarse antes, durante o después de la cosecha para influir en el perfil del producto en los microorganismos. Diferentes intensidades y/o longitudes de onda de luz se pueden aplicar a los microorganismos en momentos concretos para: mejorar el crecimiento, mejorar la formación del producto, manipular la formación de pigmento, o "naturalmente esterilizar" el cultivo con luz ultravioleta (UV). Por ejemplo, el aumento de la intensidad de la luz UV en un cultivo Haematococcus puede producir quiste y formación de pigmento.

El cultivo se puede mezclar mediante mezcla hidráulica (por ejemplo, bombas), mezcla mecánica (por ejemplo, agitadores oscilantes, agitadores giratorios, propulsores), o ruedas de paletas. En algunas modalidades, el cultivo puede ser aireado con aire, dióxido de carbono, oxígeno o cualquier otro gas adecuado. En algunas modalidades, la aireación se puede proveer mediante un inyector de gas, difusor poroso, difusor de microporos, membranas permeables al gas, generador de microburbujas, inyección venturi, o un oscilador fluídico de microburbujas. El mezclado, agitación y/o aireación del cultivo permite la circulación de los microorganismos en el cultivo para una distribución uniforme de los nutrientes, gases y la fuente de carbono orgánico, así como el acceso a la luz.

En algunas modalidades, un ácido orgánico tal como ácido acético puede ser usado como una fuente de carbono orgánico y se suministra al cultivo de microorganismos a partir de un tanque de alimentación a través de un sistema auxostat-pH. En algunas modalidades, el sistema auxostat-pH puede comprender una válvula de solenoide, una bomba peristáltica, una sonda de pH y un controlador de pH. En algunas modalidades, el sistema auxostat-pH puede comprender un dispositivo de aplicación por goteo controlado mediante una válvula de aguja, una bomba dosificadora o una bomba peristáltica, y un controlador de pH. La absorción de carbono y nitrógeno (es decir, acetato de sodio, nitrato de sodio) y la actividad fotosintética (es decir, la absorción de bicarbonato de sodio) hacen que el nivel de pH del cultivo se eleve. El controlador de pH puede fijarse a un nivel de umbral (es decir, el punto de ajuste) y activar el sistema auxostat para suministrar ácido acético al cultivo cuando el nivel de pH medido esté por encima del umbral establecido. La frecuencia de las mediciones de pH, la administración de ácido acético por el sistema auxostat, y el mezclado del cultivo son controlados en combinación para mantener el valor pH sustancialmente constante. En algunas modalidades, la alimentación de ácido acético se puede diluir en agua hasta una concentración por debajo de 100% y tan bajo como 0.5%, con una concentración preferible entre 15% y 50%. En otras modalidades, el ácido acético puede estar en concentraciones por debajo de 10% con el fin de diluir continuamente el cultivo de microorganismos. En otras modalidades, el ácido acético se puede mezclar junto con otros medios o fuentes de carbono orgánico.

En otras modalidades, la fuente de carbono orgánico, tal como ácido acético, pueden ser combinadas o mezcladas junto con otros componentes nutrientes tales como fuentes de nitrógeno o de fósforo. En otras modalidades, los otros nutrientes pueden añadirse directamente a la fuente de carbono orgánico, tal como ácido acético, y una sola solución (o soluciones múltiples) se puede añadir al cultivo a través del suministro de ácido acético controlado por el auxostat-pH. En una modalidad, los nutrientes pueden añadirse directamente al ácido acético o fuente de carbono orgánico alternativa antes de suministrar la solución al cultivo. En aquellas modalidades que usan un ácido orgánico, la necesidad de filtración de los medios nutrientes se puede reducir porque el ácido orgánico, tal como ácido acético, mantiene los medios de nutrientes estériles. La cantidad de fuente de carbono orgánico, tal como ácido acético, el consumo se puede monitorizar al medir el nivel del carbono orgánico (por ejemplo, ácido acético) en el tanque de alimentación, que puede estar correlacionada con el crecimiento celular de los microorganismos. Los nitratos (por ejemplo, NO3), fosfatos, y otro nutriente que se sabe que son usados por las plantas (por ejemplo, un conjunto no limitante de nutrientes sería hierro, cobalto, cobre, sodio, manganeso, zinc, molibdeno, sílice, sales y combinaciones de los mismos) también se pueden añadir al cultivo para mantener el nitrato y nutrientes en un nivel deseado. En algunas modalidades, la fuente de carbono orgánico y por lo menos otro nutriente pueden estar en forma concentrada. En algunas modalidades, la fuente de carbono orgánico y por lo menos otro nutriente pueden estar en forma diluida.

En algunas modalidades, el nivel de contaminación en el cultivo de microorganismos mixótrofos (v.gr., microalgas o cianobacterias) se puede manejar para limitar las fuentes de alimentación residuales o de flotación libre disponibles a los microorganismos contaminantes (v.gr., bacterias, hongos). En algunas modalidades, la alimentación de carbono orgánico y por lo menos una alimentación de otro nutriente se pueden mezclar y suministrar juntos para introducir el carbono orgánico y por lo menos otro nutriente juntos en una cantidad que será sustancialmente consumida por los microorganismos mixótrofos y para reducir al mínimo la cantidad de carbono orgánico residual o de flotación libre y por lo menos otro nutriente disponible para microorganismos contaminantes. Estas modalidades pueden mantener de manera eficaz la concentración del cultivo a casi cero para el carbono orgánico y por lo menos otro nutriente. En algunas modalidades, la relación de carbono orgánico a por lo menos otro nutriente se puede seleccionar de modo que el consumo por el microorganismo mixótrofo del carbono orgánico iguala el consumo de por lo menos otro nutriente. Las tasas de consumo de carbono orgánico y de nutrientes para varios microorganismos por separado se pueden determinar a través de experimentación y revisión de la literatura disponible.

En algunas modalidades, la fuente de carbono orgánico comprende ácido acético. En algunas modalidades, el ácido acético puede ser diluido a una concentración de aproximadamente 30% o menos. En algunas modalidades, el por lo menos otro nutriente comprende NO3. En algunas modalidades, la relación de NO3:ácido acético puede variar de 0.5:10 a 2:10, preferiblemente aproximadamente 1:10. En algunas modalidades, el ácido acético puede comprender ácido acético y sus precursores, tales como acetato y anhídrido acético.

En algunas modalidades, la relación de carbono orgánico a por lo menos otro nutriente se puede seleccionar de modo que la dosis de por lo menos el otro nutriente anula la concentración en el medio de cultivo para mantener un nivel de línea basal. Una aplicación no limitante para esa modalidad puede estar en el cultivo de un microorganismo de tratamiento de aguas residuales tal como, pero sin limitarse a bacterias, para propósitos de remedio de desechos en un medio de cultivo de aguas residuales. El carbono orgánico se puede mezclar y administrar con otro nutriente limitante del crecimiento, tal como nitratos, para mantener de manera eficaz la concentración de nitratos en el cultivo a un nivel mínimo o línea basal tal como, pero sin limitarse a, 100 ppm.

El crecimiento de microorganismos mixótrofos consume y produce oxígeno, lo que altera la concentración de oxígeno disuelto (DO) (mg/L) en el medio de cultivo. La concentración de oxígeno disuelto puede ser controlada para aumentar el crecimiento de microorganismos mixótrofos y mantener una población de bacterias contaminantes controlada. La respiración celular en microalgas y cianobacterias parece ser menos eficaz que en bacterias, lo que puede depurar el oxígeno a una concentración baja o incluso crecer anaeróbicamente mejor que las microalgas y cianobacterias. Por lo tanto, el oxígeno disuelto puede ser utilizado como un parámetro variable para manejar las poblaciones de bacterias contaminantes en cultivos mixotróficos con poco o ningún efecto sobre la productividad y viabilidad de microalgas y cianobacterias. La transferencia de oxígeno puede ser reducida o incrementada para manejar las poblaciones de bacterias contaminantes dentro de los cultivos mixotróficos para incrementar la longevidad del cultivo y reducir la contaminación bacteriana.

Las concentraciones de oxígeno disuelto en la solución de cultivo pueden ser controladas mecánicamente, químicamente o biológicamente. El control mecánico puede comprender inyección de aire puro; aire mezclado con concentraciones de oxígeno incrementadas mediante el uso de un concentrador de oxígeno o inyección de oxígeno comprimido; o aire mezclado con nitrógeno que reduce las concentraciones de oxígeno disuelto. El control mecánico también puede comprender el diseño y dimensionamiento del reactor, profundidad de la unidad de cultivo, tasas de mezclado y área de superficie del reactor que determina intercambio de gases aire/agua. El control químico puede comprender sulfito de sodio que reduce concentraciones de oxígeno disuelto, u otros compuestos químicos que incrementarían el oxígeno disuelto, tales como ozono. El sulfito de sodio puede actuar como un depurador de oxígeno, por ejemplo dos moléculas de sulfito de sodio reaccionarán con dos átomos de oxígeno cuando se disuelven en agua. Por lo tanto, para remover 1 ppm de oxígeno, se pueden utilizar 7.8 ppm de sulfito de sodio (2Na + 2S03 + 20 = 2Na + 2SO4).

Una lista no limitante de depuradores de oxígeno incluye sulfito de sodio e hidrazina (Sigma-Aldrich St. Louis, MO), carbohidrazida Eliminox® y eritrobato SurGard® (Nalco Chemical Co. Naperville, IL), metiletilcetoxima Mekor® (Drew Chemical Corporation, Boonton, NJ), hidroquinona Magni-Form® (Betz Laboratories, Trevose, PA), dietilhidroxilamina Steamate® (Dearborn Chemical Co. Lago Zurick, IL). El oxígeno disuelto también puede ser controlado biológicamente al poner en transición el cultivo entre condiciones mixotróficas y fototróficas. Cuando las concentraciones de oxígeno disuelto alcanzan las concentraciones objetivo y las poblaciones de bacterias contaminantes han sido reducidas, el sistema puede ser puesto en transición de condiciones fototróficas de nuevo a condiciones mixotróficas lo que crea un patrón cíclico que reduce las bacterias contaminantes e incrementa la longevidad del cultivo de microalgas o cianobacterias.

Los niveles de umbral (es decir, puntos de ajuste) para oxígeno disuelto en un cultivo de microorganismos mixotrófico pueden variar de aproximadamente 0.1 mg 02/L a aproximadamente 30 mg 02/L según la población y especie de bacterias, así como población y especies de microalgas o cianobacterias. Los intervalos de oxígeno disuelto pueden ser mantenidos a concentraciones objetivo durante un periodo sostenido. Cuando las poblaciones de bacterias contaminantes alcanzan concentraciones no adecuadas para longevidad y viabilidad del cultivo de microorganismos mixótrofos, el oxígeno disuelto puede ser incrementado a concentraciones objetivo que reducen las poblaciones de bacterias contaminantes sin afectar la viabilidad del cultivo de microalgas o cianobacterias. Las concentraciones objetivo de oxígeno disuelto pueden ser entre 1-6 mg O2/L, o por arriba de las concentraciones de saturación atmosféricas tales como 100 a 300% de saturación. En algunas modalidades, la fuente de carbono orgánico puede ser suministrada a cultivo hasta que un nivel de oxígeno disuelto medido del cultivo alcanza un nivel crítico por debajo de 2 mg O2/L.

En una modalidad ilustrativa no limitante, un factor que contribuye a la eficacia del sistema auxostat-pH para suministrar ácido acético (es decir, carbono orgánico) al cultivo incluye la capacidad para activar inicialmente el sistema auxostat e iniciar el suministro de acético ácido para controlar el nivel de pH. En algunas modalidades, el sistema auxostat-pH con ácido acético puede ser activada inicialmente por la actividad fotosintética de los microorganismos que aumentan el pH del cultivo. En algunas modalidades, acetato de sodio, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio se pueden añadir al medio de cultivo inicial para incrementar la concentración de ácido acético residual y activar automáticamente el sistema auxostat-pH con ácido acético antes del inicio de la actividad fotosintética por los microorganismos. En algunas modalidades, 0.05-10 g/L de acetato de sodio pueden ser añadidas inicialmente al medio de cultivo. En otras modalidades, 0.1-6 g/L de acetato de sodio puede ser añadida inicialmente al medio de cultivo para ayudar con la transición de condiciones fototróficas a mixotróficas. En algunas modalidades, la concentración de acetato de sodio puede estar por arriba de 1.6 g/L a fin de inhibir el crecimiento de microorganismos contaminantes (v.gr., bacterias, hongos). En algunas modalidades, la concentración de acetato de sodio puede ser suministrada por lo menos durante el primer día de crecimiento de microorganismos. En otras modalidades, el acetato de sodio puede ser suministrado los primeros 1-5 días de crecimiento de microorganismos y preferiblemente los primeros dos días de crecimiento de microorganismos.

En una modalidad alternativa, el acetato de sodio puede ser añadido a la formulación de nutrientes del medio de cultivo para asegurar que la concentración inicial de acetato de sodio esté presente. El medio de cultivo con la formulación de nutrientes que comprende acetato de sodio también se puede añadir continuamente al cultivo a medida que tiene lugar la cosecha. En otra modalidad, la fuente de carbono orgánico puede ser añadida en bajos niveles al agua complementaria para rellenar el cultivo y el agua usada para lavar el sistema de cultivo como una alternativa a un sistema que hace el cultivo con una fuente de carbono orgánico.

Una vez que el cultivo de microorganismos alcanza la concentración o madurez deseada, por lo menos una porción del cultivo de microorganismos puede ser desechada para procesamiento posterior. Los microrganismos pueden ser cosechados por cualquier método conocido en la téenica tal como, pero sin limitarse a, flotación de gas disuelto, fraccionamiento de espuma, centrifugación, filtración, sedimentación, floculación química y electro-deshidratación. La cosecha puede tener lugar continuamente o en un método intermitente que ocurre múltiples veces en un día, diariamente, después de un cierto número de días, o cada semana.

En otras modalidades, también se pueden usar un auxostat con amoniaco u otro medio cambiante de pH. En otras modalidades, la adición del carbono orgánico puede ser balanceada con dióxido de carbono para cielar la materia orgánica dentro del cultivo y permitir que las bacterias contaminantes sean controladas o mantenidas en observación sin dominar un cultivo (como se define por más de 50% de células vivas en el cultivo que comprende bacterias contaminantes). En otras modalidades, la manipulación del suministro de fuete de carbono (v. gr., ácido acético o CO2) puede permitir el control del nivel de pH, pero las oscilaciones en el nivel de pH pueden hacerse intencionalmente más grandes para mantener el equilibrio entre dominación de microalgas o cianobacterias sobre las bacterias contaminantes en el cultivo (v. gr., el nivel de pH varía de 7.5 a 8.5, o de 6.5 a 9 o cualquier intervalo con por lo menos una diferencia de pH de 0.5 dentro del cultivo). Esas manipulaciones del nivel de pH pueden afectar las bacterias contaminantes a un mayor grado que las microalgas o cianobacterias debido a que los niveles de pH están dentro del intervalo de crecimiento de microalgas o cianobacterias. En algunas modalidades, el nivel de pH se mantiene en un intervalo de histéresis definido que inhibe la proliferación de organismos contaminantes en el cultivo de microorganismos.

Métodos de control de contaminación El uso de una fuente de carbono orgánico en el medio de cultivo introduce un riesgo más alto de contaminación bacteriana del cultivo de microorganismos que en un medio de cultivo fototrófico sin una fuente de carbón orgánica. Con algunas especies de bacterias capaces de crecer más rápido que las microalgas o cianobacterias, las bacterias pueden rebasar los recursos de cultivo de microalgas o cianobacterias y las microalgas o cianobacterias mismas. Por lo tanto, la capacidad para controlar la contaminación bacteriana es un factor que contribuye a la eficiencia de un cultivo mixotrófico. Un ácido orgánico tal como ácido acético se ha encontrado que inhibe el crecimiento bacteriano en ciertas condiciones, que pueden estar asociadas con la desnaturalización de las enzimas responsables de la síntesis de metionina (o-succiniltransferasa). Se ha encontrado que la proliferación bacteriana es más rápida en un medio de cultivo que contiene glucosa que en un medio de cultivo que contiene ácido acético, lo que demuestra el beneficio de seleccionar ácido acético como la fuente de carbono orgánico. Además, se encontró que el ácido acético reduce además la resistencia bacteriana al estrés oxidativo (es decir, ozono, peróxido de hidrogeno) que es observado con cultivos alimentados con glucosa.

En algunas modalidades, al mantener el pH por arriba de 7.5 y la temperatura por debajo de 30°C en un medio definido de minerales mínimos especifico para un género de microalgas o cianobacterias son condiciones que se ha mostrado que son condiciones subóptimas para la proliferación de organismos contaminantes tales como bacterias. En algunas modalidades, el nivel de pH puede estar por debajo de 5 y la temperatura entre 30°C a 50°C. A través de los métodos de control de contaminación descritos en este documento, que incluyen la utilización del sistema auxostat-pH con ácido acético para administrar ácido acético al cultivo no axénico, los recuentos de células bacterianas contaminantes de cultivo pueden mantenerse por debajo de 25% del total, por debajo de 20% del total de células, por debajo del 10% del total de células y preferiblemente por debajo del 25% del total de células del cultivo (<0.05% de la biomasa total) a través de un método de cultivo que puede comprender una combinación de ácido acético residual en el medio de cultivo, el mantenimiento de un nivel de pH constante, o el uso de un agente oxidante. Un intercambiador de calor que mantiene la temperatura constante, tal como serpentinas de enfriamiento o calentamiento, también mejora el control sobre la población de bacterias contaminantes cuando se usa en combinación con otros métodos de control de contaminación, tales como pero sin limitarse al sistema auxostat-pH con ácido acético de agentes oxidantes.

Métodos adicionales de control de bacterias y organismos contaminantes en un cultivo mixotrófico pueden comprender la aplicación de peróxido de hidrogeno, ozono, antibióticos, radiación ultravioleta (UV)/esterilización, u otros agentes oxidantes (v. gr., cloro, clorito, clorato, hipoclorito, ácido nítrico, cromo, permanganato, óxido de plata, bromo). Los métodos de control de contaminación en el cultivo mixotrófico se pueden usar individualmente o en combinación. La adición de peróxido de hidrogeno a un medio de cultivo que comprende bacterias contaminantes se ha mostrado que inhibe el crecimiento de las bacterias contaminantes en aplicaciones entre 2.5 y 30 mM de H2O2. El crecimiento de bacterias en medios de cultivo mixotrófico que comprenden ácido acético se ha mostrado que son más susceptibles a estrés oxidativo que en medios de cultivo mixotrófico que comprenden glucosa. El ozono se puede aplicar a un cultivo a través de cualquier método de inyección de gas tal como, pero sin limitarse a aspersión e inyección de Venturi. Los tratamientos con ozono se puede aplicar al cultivo de microorganismos a concentraciones de 0.01-2.0 mg/L, y preferiblemente a concentraciones de 0.01-0.50 mg/L. Los tratamientos con antibióticos pueden comprender, pero no se limitan a, penicilina (100-500 mg/L), tetracielina (10-100 mg/L), cloranfenicol (1-20 mg/L), y aureomicina (1-20 mg/L).

El uso de electrocoagulación para concentración periódica y purga de un cultivo provee un ejemplo para un método que comprende la cosecha diaria o continua de un cultivo para contribuir al control de la contaminación a través de la concentración regular y remoción de las microalgas o cianobacterias de medios contaminados, y el remplazo del cultivo en el medio tratado o nuevo. Un método de cosecha y purga de un cultivo para control de contaminación también se puede realizar a través de métodos conocidos de cosecha o separación de microalgas de un cultivo tal como, pero sin limitarse a flotación de gas disuelto, fraccionamiento de espuma, centrifugación y floculación. Cuando se muestra un método de cosecha y purga, la adición de la fuente de carbono orgánico puede necesitar ser ajustada de acuerdo a ello. La cosecha de purga pueden promover la salud de la población de microalgas o cianobacterias y por lo tanto su resistencia hacia la contaminación. En algunas modalidades, el medio de cultivo separado puede ser procesado para convertir la materia orgánica en descomposición (mineralización) en una fuente de carbono disponible para los microorganismos mixótrofos.

En una modalidad alternativa, la sonicación se puede usar para controlar la contaminación en un cultivo mixotrófico. El cultivo puede ser sometido a energía sónica a varias intensidades para reducir la contaminación. La sonicación puede reducir la contaminación dentro del cultivo al crear burbujas de gas del mismo tamaño que las vacuolas de gas dentro de las bacterias contaminantes. A medida que las burbujas estallan, las burbujas del mismo tamaño en las bacterias resonarán y estallarán también. La sonicación también puede reducir la contaminación dentro del cultivo al alterar las paredes celulares de las bacterias contaminantes, que son más débiles en relación con las paredes celulares de microalgas, cianobacterias o diatomeas. En algunas modalidades, la energía sónica se puede proveer a aproximadamente 40-99% de intensidad de una bocina de 30 kHz. En algunas modalidades, el cultivo que es tratado con sonicación puede ser enfriado para mantener la temperatura del cultivo dentro de un intervalo deseado. En algunas modalidades, el tratamiento de sonicación se puede usar con un cultivo para aumentar la temperatura y tratar la contaminación de manera simultanea. En algunas modalidades, la sonicación se puede usar como un pre-tratamiento de un cultivo en combinación con un compuesto químico o enzima debilitante de la pared celular. En algunas modalidades, la bocina de sonicación puede estar en línea con una trayectoria de flujo de cultivo. En algunas modalidades, las células rotas por sonicación pueden ser removidas del cultivo usando cualquier dispositivo conocido en la téenica tal como, pero sin limitarse a un dispositivo de flotación de gas disuelto, un dispositivo de fraccionamiento de espuma o un desnatador de proteína.

En una modalidad alternativa, la adición de extractos vegetales al cultivo puede controlar las bacterias contaminantes al desacelerar el crecimiento de las bacterias para permitir que las microalgas o cianobacterias compitan con las bacterias contaminantes dentro del cultivo. En algunas modalidades, los cultivos con bacterias contaminantes pueden tener poblaciones reducidas con 1, 2 o 3 o más reducción logarítmica en la población con un medio descrito anteriormente.

Niveles de oxígeno disuelto Se ha mostrado que los niveles de oxígeno disuelto (DO) son un nutriente limitante para el crecimiento mixotrófico óptimo. Por lo tanto, la capacidad para transferir gases, tales como oxígeno al cultivo a una alta velocidad es un factor que contribuye a la eficiencia del cultivo mixotrófico. En estado estable, la tasa de transferencia de oxígeno es igual a la tasa de consumo de oxígeno por las células de microalgas o cianobacterias. La transferencia de masa interfacial gas-líquido se puede calcular mediante la siguiente fórmula: kLa . (C* - CL) = OUR Por lo tanto, kLa= tasa de utilización de oxígeno/(gradiente de concentración); k÷L es el coeficiente de transferencia de masa para transferencia de oxígeno en el medio líquido; a es el área de superficie interfacial de gas por volumen de líquido; kL es una métrica de la transferencia de masa interfacial gas-líquido medida en Hz o (s-1), en donde grandes volúmenes de ki,a son un equivalente para mejor transferencia de masa y rendimiento de reactor más alto como se determina por la tasa de crecimiento volumétrico de microalgas.

Al incrementar la kLa en un recipiente, las limitaciones sobre el crecimiento de los microorganismos debido a suministro insuficiente de oxígeno pueden ser superadas. En modalidades en las que se cultivan microalgas o cianobacterias con ácido acético como fuente de carbono, la kLa puede variar de 2.00 x 103 s1 a 2.10 x 104 s-1. En algunas modalidades, la kLa puede ser por lo menos 2.40 x 103 s1. Los métodos para incrementar la kLa en un recipiente incluyen disminuir el tamaño de las burbujas de gas e implementar el tiempo de residencia, y se pueden lograr al: incrementar el esfuerzo cortante del mezclado mecánico, disminuir el tamaño de los puntos de inyección y/o incrementar el número de puntos de inyección para disolver más gas en la solución de cultivo de microorganismos, o incrementar la presión del gas. El incremento en ^a se puede lograr a través de cualquier sistema conocido para inyección de microcorriente de gas o microburbujas de gas en un líquido tal como, pero sin limitarse a, un inyector de gas, un difusor poroso, un difusor de microporo, una membrana permeable a gas, un generador de microburbujas, inyección de venturi y un oscilador fluídico de microburbujas. Un incremento en la presión del gas se puede lograr por cualquier método conocido tal como, pero sin limitarse al incremento de la altura de la columna del líquido. La transferencia de oxígeno también se puede mejorar al romper las burbujas con esfuerzo cortante mecánico y al incrementar el tiempo de residencia de las burbujas a través de mezclado horizontal, vertical o angular. El incremento en la contribución fotosintética a la mixotrofía mejorará la transferencia de oxígeno a través de una trayectoria de transferencia química.

En algunas modalidades, el suministro de ácido acético al cultivo mixotrófico puede ser controlado por estabilización de pH, lo que da por resultado que los siguientes reactivos limitantes para el proceso de cultivo de microorganismos sean oxígeno seguido por nitratos y otros nutrientes. En algunas modalidades, el nitrato, así como sus nutrientes, pueden ser en un régimen de alimentación automático basado en controles de retroalimentación mediante el uso de sensores en el cultivo de microalgas. En una modalidad alternativa, se pueden alimentar nutrientes, carbono orgánico o aire mediante el uso de retroalimentación desde un sensor de nitrato, lecturas de conductividad eléctrica en sistemas de agua dulce, o sensor de oxígeno disuelto. Además, la relación entre la alimentación de oxígeno y el diseño mecánico permite cambios en el diseño mecánico para alterar de manera correspondiente las condiciones de oxígeno disuelto del cultivo. La demanda de oxígeno basada en estequiometria se calcula en el ejemplo 11. En algunas modalidades, el cultivo puede ejecutarse a una kLa mucho más alta que en el mínimo estequiométrico (calculado en el ejemplo 11 como la relación de tasa de utilización de oxígeno a la concentración de equilibrio (C*)) para asegurar que la reacción sea limitada metabólicamente y no limitada por transferencia de masa.

Varios métodos conocidos en la téenica para mejorar la kLa del cultivo y condiciones de oxígeno disuelto se pueden usar con un proceso de cultivo de microorganismos mixótrofos. Los métodos conocidos en la técnica pueden ser categorizados en métodos mecánicos y métodos químicos. En algunas modalidades, el método para incrementar la kLa del cultivo y condiciones de oxígeno pueden ser un método mecánico o una combinación de métodos mecánicos. Los métodos mecánicos pueden incluir, pero no se limitan a, la adición de aire rico en oxígeno, inyección de venturi, eductores, vertederos, y a reducir la temperatura del cultivo. En algunas modalidades, el método para incrementar la kLa del cultivo y condiciones de oxígeno puede ser un método químico, o una combinación de métodos químicos. Los métodos químicos pueden incluir la adición de burbujas de área de superficie alta con productos compatibles con el cultivo tales como ozono, burbujas de hidrocarburo nanodimensionadas, aceite vegetal, aceite mineral y portadores de oxígeno metálico nanodimensionados. Cualquiera de los métodos anteriores se puede usar individualmente o en combinación para incrementar la kLa del cultivo y condiciones de oxígeno, incluyendo combinaciones de métodos mecánicos y químicos. De estos métodos, los métodos mecánicos pueden ser los menos invasivos al crecimiento del cultivo y potencialmente moldear para implementar .

Además, la concentración de oxígeno disuelto también puede ser monitoreada para manejar la población de bacterias contaminantes. Las bacterias contaminantes que crecen aeróbicamente pueden usar el exceso de oxígeno en el cultivo; por lo tanto, si el oxígeno disponible a las bacterias contaminantes es limitado, entonces el crecimiento de las bacterias contaminantes puede ser limitado.

Ejemplo 1 Chlorella sp. SNL 333 (una cepa local aislada por la Universidad Estatal de Arizona e inicialmente reportada como Chlorella sp. en el tiempo de prueba; un análisis adicional fue realizado por Dr. Barbara Melkonian en la Universidad de Colonia, Zülpicher Strasse 47 b, 50674 Kóln, Alemania, que confirma que la cepa de microalgas comparte características de identificación con otras especies de Chlorella conocidas) se cultivó bajo condiciones mixotróficas no axenicas por medio de un sistema de alimentación auxostat-pH con ácido acético en condiciones no axénicas durante 8 días. El experimento se condujo como un solo lote si cosechar durante el periodo de 8 días. El ensayo se realizó en fotobiorreactores rociados con aire de panel plano de 0.6 m por 0.6 m con un volumen de corrimiento de 14 litros (L). El volumen se incrementó hasta 15 L debido a la adición de solución de ácido acético. Un tratamiento de control también se realizó en un sistema auxostat-/pH con CO2 para un cultivo fotoautotrófico (fototrofía). Los reactores se aislaron a 0.1 g/L con 3 L de un cultivo de monoalgas en crecimiento exponencial de Chlorella sp. SNL 333. El inoculo se obtuvo a partir de un estanque de flujo abierto exterior con corrimiento a aproximadamente 0.5 g/L en un medio de cultivo BG-11. Los cultivos después se acondicionaron a los fotobiorreactores de panel plano de 0.6 m por 0.6 m hasta que lograron una densidad de 1 a 2.5 g/L. Los cultivos se alimentaron en forma intermitente con una solución de nitrato-fosfato para mantener el nivel de nitrato entre 400 y 1500 ppm. El cultivo se mantuvo a un pH casi constante de aproximadamente 7.5, y una temperatura de aproximadamente 25°C. Los cultivos fueron expuestos a la luz de paneles de 8 focos FT5-H0 en cada lado del reactor (un foco = 259.6 pmol/m2s) en periodos de luz de 24 horas (luz constante) y aireación (0.7 litros de aire/litro de medio por minuto) en el tratamiento. Para empezar, los cultivos se iniciaron con una intensidad de 25% de luz y control de CO2/pH hasta que los cultivos alcanzaron 0.5 g/L. y después con una intensidad de luz de 50% hasta que el cultivo alcanzó 2 g/L. después de que los cultivos alcanzaron 2 g/L, el tratamiento de controlar el pH con adiciones de ácido acético empezaron. El tratamiento de C02 comprendió inyección de CO2en la corriente de aire a una relación de 1 a 10 y fue controlada por un solenoide y un controlador de pH fijado a 7.5 El sistema de tratamiento de ácido acético comprendía un solenoide, bomba peristáltica y conjunto de controlador de pH a 7.5 para controlar la alimentación de ácido acético bombeada al reactor desde el tanque de alimentación de ácido acético. La alimentación de ácido acético se diluyó entre 10% y 50% de concentración con agua. Una sonda se fijó al tubo de alimentación para asegurar que el bombeo fuera constante y estuviera dentro de un intervalo de control y fluctuación de pH. Se tomaron muestras cada 24 s, el peso seco y el peso seco libre de ceniza por triplicado se tomaron una vez al día. Se tomaron imágenes de contaminación diariamente. Cada 2-3 días una muestra de peso seco no destructiva (centrifugación 200 mi) para secado por congelamiento, análisis de ácido graso se tomó. El sobrenadante de la centrifugación se congeló para análisis de ácido acético mediante cromatografía de gases. El consumo de ácido acético se midió al monitorear el nivel en el tanque de alimentación de ácido acético.

Con referencia a las figuras 1-2 y tabla 1, los resultados mostraron que el cultivo mixotrófico fue más productivo que el cultivo fotoautotrófico (autótrofo) estándar con respecto al peso seco de células (g/1). La tabla 1 de una lista de las productividades volumétricas y productividades de área para un cultivo mixotrófico y fotoautotrófico de Chlorella sp . SNL 333. Los resultados también mostraron que el consumo mixotrófico tuvo contenido de lípidos más alto (% de peso seco) que el cultivo fotoautotrófico. Para los valores listados en la tabla 1, la relación de superficie (iluminada) a volumen del reactor de 0.6 m por 0.6 m es 19 L/m2. La productividad de área del experimento de reactor de panel plano se calculó al multiplicar la productividad volumétrica con el volumen (19 L) que puede estar contenido en 1 m2. Las productividades de área extrapoladas, gramos por metro cuadrado por día (g/m2 d), supuso 300 L/m2 en mixotrofía. Además, la mixotrofía y no la fototrofía, se mostró que impulsa el crecimiento mixotrófico de Chlorella . Estos resultados condujeron a la conclusión de que la relación de superficie (iluminada) a volumen es menos crítica para el crecimiento, y el límite para la cantidad de litros que pueden ser colocados en un metro cuadrado depende de la transferencia de oxígeno del sistema.

Tabla 1 Intervalo de productividad Fase de crecimiento (2 d) Lote entero (8 d) Productividadesvolumétricas (g/L d) Tratamiento Fotoautotrofía 0.5 0.4 Mixotrofía 2.6 1.6 Productividades de área (g/m2 d) Fotoautotrofía 9.5 7.6 Mixotrofía 49.4 30.4 Productividades de área extrapoladas (g/m2 d) Fotoautotrofí 9.5 7.6 Mixotrofía 780 480 Con referencia a las figuras 3-4, los resultados mostraron que la absorción de NaNC>3 fue más alta en el cultivo mixotrófico que en el cultivo fotoautotrófico (autótrofo). Con referencia a la figura 5, los resultados mostraron que las concentraciones de ácido acético residual fueron relativamente bajas (8 veces menores que el vinagre de mesa) en el cultivo mixotrófico mediante el uso del sistema auxostat-pH con ácido acético con un nivel de pH fijado a 7.5, y llevaría un riesgo bajo de problemas ambientales (derrames, emisiones de carbono orgánico volátiles), peligros de trabajo o desecho de sustrato. El ácido acético residual incrementó a medida que los nitratos y otros nutrientes eran consumidos.

Ejemplo 2 Chlorella sp. SNL 333 se cultivó bajo condiciones mixotróficas no axénicas mediante el uso de un sistema de alimentación auxostat-pH con ácido acético en condiciones no axénicas durante 10 días. El ensayo se realizó con los mismos reactores y procedimiento que se usaron en el ejemplo 1, con la excepción del periodo de exposición a la luz (fotoperiodo), sistema de alimentación de ácido acético y adición de nitratos sólo durante el crecimiento (sin fosfatos o nutrientes traza). Los ensayos también se realizaron como un lote individual sin cosechar en el periodo de 10 días, consistente con el procedimiento del ejemplo 1. Los ensayos se realizaron con periodos de exposición a la luz de 24 horas en luz artificial por día y con periodos de exposición a la luz de 14 horas (10 de oscuridad por día), también en luz artificial. El ácido acético fue alimentado a través de un sistema de goteo controlado por una válvula de aguja en respuesta al controlador de nivel de pH. Los niveles de oxígeno disuelto también se midieron continuamente y se actualizaron en un registrador de datos. Cada cuatro días se tomaron fotografías microscópicas a 20X y 100X (inmersión en aceite), así como una medición de recuentos de células, tamaños de célula, recuento de clorofila, y proporción de partículas sin clorofila.

Con referencia a la figura 6 y tabla 2, los resultados mostraron que los cultivos mixotróficos sobrepasaron los cultivos fotoautótrofos (autótrofos) con respecto al peso seco de las células (g/L), y que el peso seco de las células del cultivo mixotrófico fue menos afectado por la reducción en la exposición a la luz que el cultivo fotoautotróf ico. La tabla 2 da una lista de las productividades volumétricas y productividades de área para un cultivo mixotrófico y fotoautótrof o de Chlorella sp . SNL 333 que creció en un fotoperiodo de 24 hr y 14 hr. Para los valores de la tabla 2, la relación de superficie (iluminada) a volumen del reactor de 0.6 m x 0.6 m es 19 L/m2 . La productividad de área del experimento de panel plano se calculó al multiplicar las productividades volumétricas con el volumen (19 L) que puede estar contenido en 1 m2. Las productividades de área extrapoladas (g/m2 d) supusieron 300 L/m2 en mixotrofía. Además, la mixotrofía, y no la fototrofía, impulsó el crecimiento mixotrófico de Chlorella con base en los resultados.

Tabla 2 Fase de crecimiento Lote entero Rango de productividad (2 d) (8 d) Productividades volumétricas (g/L d) Tratamiento Fotoperiodo 24 hr 1.06 0.70 Fotoautotrofía 14 hr 0.66 0.47 24 hr 2.74 1.21 Mixotrof í a 14 hr 2.76 1.30 Productividades de área reales (g/m2 d) 24 hr 20.1 13.3 Fotoautotrofía 14 hr 12.5 8.9 24 hr 52.1 23.0 Mixotrofía 14 hr 46.7 24.7 Productividades de área extrapoladas (g/m2 d) 24 hr 20.1 13.3 Fotoautotrofía 14 hr 12.5 8.9 24 hr 822 363 Mixotrofía 14 hr 828 390 Con referencia a la figura 7, los resultados mostraron que la absorción de NaNC se vio afectada más por la reducción en el periodo de exposición a la luz para el cultivo fotoautotrofico (autótrofo) que para el cultivo mixotrófico. Con referencia a la figura 8, los resultados mostraron que la absorción de ácido acético en los cultivos mixotróficos fue menor para la exposición a la luz durante 14 hr que la exposición a la luz durante 24 horas. Con referencia a la figura 9, los resultados también mostraron que el nivel de oxígeno disuelto estuvo bajo una saturación de punto crítico posible (20%), lo que sugiere que la transferencia de gas pobre de oxígeno en el fotobiorreactor de panel plano de 0.6 m por 0.6 m fue más crítico para limitar el crecimiento de los cultivos mixotróficos que la energía lumínica.

Con referencia a la tabla 3, los resultados mostraron que los niveles de bacterias en el cultivo mixotrófico se mantuvieron bajos a pesar de las condiciones no axénicas e introducción de una fuente de carbono orgánico. La tabla 3 da una lista de la incidencia de poblaciones bacterianas en un cultivo de Chlorella sp. SNL 333 operado bajo un régimen mixotrófico o fotoautotrofo. Para los valores listados en la tabla 3, las células algales fueron identificadas por auto-fluorescencia de clorofila y las células bacterianas fueron identificadas por colorante verde BacLight. Los valores de la tabla 3 también supusieron un peso de Chlorella de 27 x 1012 g/células y el peso de las células bacterianas de 0.2 x 1012 g/célula.

Tabla 3 de biomasa células totales*! total*2 Tratamiento Fotoperiodo 24 hr 4.9 0.04 Mixotrofía 14 hr 3.9 0.03 24 hr 1.6 0.01 Fotoautotrofía 14 hr 1.6 0.01 Ej emplo 3 Chlorella sp. SNL 333 se hizo crecer bajo condiciones mixotróficas no axénicas mediante el uso de un sistema de alimentación auxostat-pH con ácido acético en condiciones no axénicas durante 4 días. El ensayo se realizó con el mismo equipo y procedimiento que se describió anteriormente en el ejemplo 2, con la excepción del periodo de exposición a la luz (fotoperiodo) y la alimentación de ácido acético. Los ensayos uno y dos se realizaron con exposición a la luz de 24 hr y los ensayos tres y cuatro se realizaron con exposición a la luz de 0 hr (heterótrofo). El ácido acético se alimentó a 200 g/L, y 1 g/L de acetato de sodio inicial para densidades de cultivo de 0.5 a 5-6 g/L; y alimentación de ácido acético de 10 g/L a densidades de cultivo por arriba de 5-6 g/L. El ácido acético se alimentó al auxostat en respuesta al cambio de pH. El reactor se ajustó con un tubo de sobreflujo para permitir que el volumen de cultivo que excedía el volumen de operación de los biorreactores de 0.6 x 0.6 (14 L) drenara (cosecha) en matraces de 4 L para mediciones y análisis.

Con referencia a la figura 10, los resultados mostraron que los cultivos de Chlorella alimentados con ácido acético crecieron mejor en la exposición a la luz de 24 hr que la exposición a la luz de 0 hr. También se encontró que la actividad fotosintética ayuda a mejorar los valores de oxígeno disuelto de 4.9 mg/L para el tratamiento heterótrofo cercano (exposición a la luz de 0 horas con ingreso de luz ambiente mínimo) a 6.5 mg/L para el tratamiento mixotrófico (exposición a la luz de 24 hr). Con referencia a la figura 11, los resultados mostraron que el consumo de ácido acético para el tratamiento mixotrófico (exposición a la luz de 24 hr) fue más alto que en el tratamiento heterótrofo (exposición a la luz de 0 hr). Con referencia a la figura 12, los resultados mostraron que la concentración de NaNC>3 residual fue menor para el cultivo mixotrófico (exposición a la luz de 24 hr) que para el cultivo heterótrofo cercano (exposición a la luz de 0 hr) o los cultivos fotoautótrofos (autótrofos).

Ejemplo 4 Chlorella sp. SNL 333 se hizo crecer bajo condiciones mixotróficas no axénicas mediante el uso de un sistema de alimentación auxostat-pH con ácido acético durante 10 días. El ensayo se realizó con dos fotobiorreactores de estanque de flujo abierto hechos de PVC, con un área cultivable de 5.6 m2 y una trayectoria de luz de 10 cm (es decir, profundidad de cultivo). Ambos fotobiorreactores contenían cultivos mixotróficos, aireados con dos difusores porosos de 50 cm a 10 litros por minuto (LPM), y estaban ubicados en exteriores. El primer fotobiorreactor (Reactor 1) se mezcló hidráulicamente (bomba). El segundo fotobiorreactor (Reactor 2) se mezcló con una rueda de paletas. Chlorella sp. SNL 333 se inoculó a una densidad de 0.3 g/L en los reactores 1 y 2. La Chlorella se adaptó a las condiciones de exteriores bajo control de CC^/pH hasta que logró una densidad de 0.3-0.4 g/L para los ensayos experimentales. Las adiciones de ácido acético ocurrieron mediante el uso del sistema de goteo anteriormente descrito en el ejemplo 2.

Los cultivos se cosecharon según fuera necesario cuando la densidad del cultivo alcanzó 1.5 g/L. El medio inicial fue un medio BG-11 con acetato de sodio (1 g/L) complementado en el medio inicial. La luz solar natural se aplicó al cultivo, con el fotoperiodo promedio en mayo de 2012 para Gilbert, AZ siendo de aproximadamente 14.5 hr. La temperatura fue controlada mediante serpentinas de enfriamiento a 28°C. El controlador de pH del sistema auxostat-pH, como se describió anteriormente, se fijó a 7.5. La temperatura, pH y oxígeno disuelto se midieron continuamente. El consumo de ácido acético fue monitoreado por el nivel del tanque de alimentación de ácido acético diariamente. Los pesos secos se tomaron tres veces (n=3) diariamente y los niveles de nitrato se tomaron diariamente. Se realizó centrifugación para medir el acetato residual (200 mi) y la biomasa cada dos días.

La observación de contaminación (micrografía de contraste de fases a 400X, 1000X con aceite de inmersión y la citometría de células con tinción bacteriana) se realizó cada 2 días, incluso una medición de contaminación bacteriana por citometría de flujo. Para medición de contaminación bacteriana, a cada muestra de 1 mi, 1 ml de tinción bacteriana con BacLight™ Green (Invitrogen, Eugene, OR, E.U.A.) se añadió, y las muestras se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 a 60 minutos. Después de la incubación, las muestras se analizaron en un aparato BD FACSAria™ (BD Biosciences, San José, CA, E.U.A.) y las poblaciones de bacterias y algas se fijaron con base en fluorescencia de BacLight™ y autofluoresencia de clorofila.

Con referencia a la figura 13, los resultados mostraron una productividad diaria máxima de 97 g/m2 d (0.97 g/L d) para el reactor 1 (es decir, SP3) y 127 g/m2 d (1.27 g/L d) para el reactor 2 (es decir, SP4). La productividad diaria promedio (arriba de 9 días) fue de 56 g/m2 d (0.56 g/L d) para el reactor 1 y 76 g/m2 d (0.76 g/L d) para el reactor 2. La productividad de los cultivos mixotróficos en los reactores de exteriores fue aproximadamente seis veces la productividad de los cultivos fotoautótrofos previamente obtenidos en los reactores de exteriores. Con referencia a las figuras 14-16, los resultados mostraron que el reactor 1, que tenía la productividad más baja que el reactor 2 (R2), también tenía el nivel de oxígeno disuelto más bajo, que corresponde a los hallazgos anteriores que relacionan los niveles de oxígeno disuelto bajos con limitación del crecimiento. Con referencia a la figura 17, los resultados mostraron que los niveles de bacterias estaban por debajo de 5% de los recuentos de células totales (<0.05% de la biomasa total) en las condiciones mixotróficas no axénicas de exteriores cuando la temperatura se mantuvo por abajo de 30°C.

Ejemplo 5 Chlorella sp. SNL 333 se cultivó mixotróficamente en condiciones no axénicas en fotobiorreactores de estanque abierto, de exteriores, mediante el uso de un sistema auxostat-pH con ácido acético durante 10 días antes de ser transferido a los fotobiorreactores de panel plano para crecimiento fotoautótrofo (fototrófico). Los reactores de exteriores se operaron como se describió antes en el ejemplo 4. Los fotobiorreactores de panel plano fueron inoculados con un cultivo de Chlorella de los reactores de exteriores a una densidad de 0.5 g/L, y se operaron a una temperatura promedio de 25°C, pH de 7.5 controlado por CO2, aireación a 10 LPM, pulsos de C02 a 2 LPM, exposición a la luz (fotoperiodo), de 14 hr de paneles de 8 focos FTS-HO (un foco = 259.6 pmol/m2 s) en cada lado del fotobiorreactor. Los datos recopilados una vez al día incluyeron: densidad óptica a 750 y 680 nm y pH. Las mediciones de peso seco, mediciones de nitrato y análisis de clorofila se realizaron al principio, a la mitad y al final del ensayo. Con referencia a la figura 18, los resultados mostraron que el inoculo mixotróficamente en crecimiento de los reactores de exteriores igualó las tasas de crecimiento fotoautotróficas (autótrofas) típicas después de la transferencia a los fotobiorreactores de panel plano para crecimiento fotoautótrofo, y que la conversión trófica fue instantánea.

Ejemplo 6 Chlorella sp. SNL 333 se cultivó mixotróficamente en condiciones no axénicas mediante el uso de un sistema auxostat-pH con ácido acético y la adición inicial de acetato de sodio al medio de cultivo. El equipo y procedimiento que se describieron anteriormente en el ejemplo 2 se usaron para cultivar Chlorella mixotróficamente con una exposición a la luz de 14 hr (fotoperiodo). El primer y cuarto ensayos recibieron 2 g/L de acetato de sodio inicialmente, y el segundo y tercer ensayo no recibieron acetato de sodio inicialmente. Se alimentó ácido acético a 200 g/L. El peso seco, peso seco libre de ceniza, oxígeno disuelto, ácido acético, contaminación bacteriana y nitratos se monitorearon como se describe en los experimentos anteriores. Con referencia a las figuras 19-20, los resultados mostraron que el ácido acético residual refleja el requerimiento de amortiguación del medio de cultivo, que se determinaron por el consumo de las sales minerales (nutrientes), el consumo de CO2 por procesos fotosintéticos, así como la excreción de ácidos orgánicos por la célula. Por lo tanto el sistema no es puramente un auxostat (concentración constante), sino que varía la concentración ±0.5 g de ácido acético/L dentro del lote. Los resultados también mostraron que el acetato de sodio inicial aseguró la presencia de acetato todo el tiempo y una activación exitosa del control de pH independientemente del proceso fotosintético.

Ejemplo 7 Chlorella. sp. SNL 333 se cultivó en reactores de estanque abierto, en condiciones no axénicas mediante el uso de un sistema auxostat-pH con ácido acético. El equipo R1 y el procedimiento como se describió anteriormente en el ejemplo 4 se usaron con la excepción de que el acetato de sodio no se añadió inicialmente al medio de cultivo. Los resultados mostraron una falla en la activación del sistema auxostat-pH con ácido acético y productividades equivalentes a aquellas obtenidas en el sistema fotoautótrofo.

Ejemplo 8 Se aplicó peróxido de hidrógeno a un cultivo de E. coli para determinar los efectos inhibidores sobre la bacteria. 200 mi de inoculo de bacterias de un fotobiorreactor contaminado con bacterias se añadió a 200 mi de medio de cultivo BG-11. La solución se dividió a la mitad, en donde la primera recepción recibió 6.84 g de glucosa y la segunda solución recibió 5 g de acetato de sodio. El pH y la densidad óptica de ambas soluciones se tomaron. Las dos soluciones se dividieron cada una en tres grupos de tres volúmenes separados de 100 mi, para tratamientos de control, MH2O2 10 m y H2O2 20 mM. Cada volumen tenía 2.092 g de regulador de pH MOPS (Sigma Chemical St. Louis, MO), y después se colocó en una incubadora fijada a 27°C, 96 rpm, y 100 pmol/m2 s de luz de LED. Los volúmenes se incubaron durante la noche, después se llevaron a un pH de 7.5 mediante el uso de NaOH 10 M y la densidad óptica se midió. Los tratamientos de H2O210 mM y H20220 mM se añadieron después y se incubaron durante 24 hr. La densidad óptica y el pH se midieron después y la metionina se añadió a un volumen de cada tratamiento. La densidad óptica y el pH se midieron nuevamente el tercer día y el sexto día antes del análisis con microscopio el sexto día. Los resultados mostraron que la adición de H202 tuvo poco efecto sobre el pH del cultivo. Con referencia a la figura 21, los resultados también mostraron que la adición de H202 afectó negativamente el crecimiento de cultivos bacterianos tanto en medios con glucosa como de acetato, con el tratamiento de H20220 mM que tuvo un mayor efecto que el tratamiento con H20210 mM.

Ejemplo 9 Se aislaron bacterias contaminantes de cultivos de microalgas y se identificaron como Escherichia coli . Diferentes concentraciones de peróxido de hidrógeno se aplicaron a cultivos de E. coli para determinar los efectos inhibidores sobre las bacterias mediante el uso del mismo equipo y procedimientos que se usaron en el ejemplo 8. Los cultivos de bacterias en glucosa y acetato de sodio se trataron con H2O20 mM (control), H2O21 mM, H2O22.5 mM y H2O2 5 mM. Con referencia a la figura 22, los resultados mostraron que a medida que la concentración de H2O2 incrementó, el efecto inhibidor sobre el crecimiento de las bacterias aumentó. Los resultados también mostraron que el crecimiento de cultivo de bacterias se recuperaría finalmente a partir del tratamiento de una vez, lo que indica que el tratamiento continuo sería necesario para controlar la población de bacterias. Debido a la recuperación de las bacterias, la dosificación periódica ayudaría a controlar la población de bacterias. Para cultivos que contienen glucosa: un tratamiento de H2O22.5 mM debía ser dosificado cada 2 días, o cada 6 días si se usara un tratamiento de H2O25 mM. Para cultivos que contenían acetato de sodio, un tratamiento de H2O2 2.5 mM sería dosificado cada 3 días, lo que sugiere la sensibilidad más alta de bacterias alimentadas con acetato para estrés oxidativo que las algas alimentadas con glucosa.

Ejemplo 10 Chlorella sp. SNL333 se cultivó en un sistema mixotrófico en los sistemas de estanque de flujo abierto descritos anteriormente en el ejemplo 4. El área del fotobiorreactor de canal fue 5.6 m2 con un volumen de operación de 568 L a una profundidad de 15 cm. Una unidad se mezcló con una bomba (Reactor 1), y la otra a través de una rueda de paletas (Reactor 2). El aire se suministró al sistema de rueda de paletas por medio de una piedra de aire. El aire se suministró al reactor bombeado a través de un sistema de inyección venturi. Se usaron eductores en el reactor bombeado para incrementar la velocidad del agua y mejorar la transferencia de oxígeno del medio líquido. La tasa de crecimiento es proporcional a la cantidad de oxígeno disponible. El oxígeno requerido para la productividad estimada de 20 - 200 g/m2 d sería de aproximadamente 34 - 100 g/m2 d. El reactor 1 y Reactor 2 se inocularon con Chlorella a 0.48 g/L. Se añadió acetato de sodio al medio de cultivo del cultivo de inicio el día 0 a una concentración de 0.3 g/L. La alimentación de nutrientes al sistema consistió de ácido acético al 20% y una solución de nutrientes BG-11 con niveles de nitrato modificados (350 mg/L). El nivel de nitratos en la receta de BG-11 modificada consistió de 400 mg/L, y se determinó a través de las tasas de consumo de nitrato a partir de ensayos anteriores.

Durante el ensayo, el nitrato residual en ambos sistemas alcanzó 0 a unos cuantos días a través del ensayo. Los niveles de nitrato se ajustaron hacia el final del ensayo para mantener el nitrato residual en el sistema (400 mg/L). Las cosechas se produjeron diariamente a lo largo de los ensayos. La cosecha consistió de 50% del volumen de cultivo diariamente, con una cosecha de 80% que ocurrió el día 7.. El ensayo total duró 12 días para el reactor 1 y 10 días para el reactor 2.

Con referencia a la figura 23, los resultados mostraron que la concentración más alta de biomasa alcanzada en el reactor 1 fue 1.47 g/L (120 hr) y en el reactor 2 fue 1.34 g/L (120 hr). La concentración de biomasa se despliega como peso seco libre de ceniza (AFDW) en g/L. El sistema se cosechó cuando las concentraciones alcanzaron 1.0 g/L o más. Las cosechas consistieron de 50% del volumen de cultivo total por día, con una cosecha de 80% que ocurrió el día 8 para ambos sistemas.

Con referencia a la figura 24, los resultados mostraron el rendimiento en g/m2 d para los sistemas mixotróficos de canal. El reactor 1 superó al reactor 2 sobre una base de longitud de cultivo total y rendimiento diario promedio total. El cultivo del reactor 1 se realizó en un total de 12 días, y el cultivo del reactor 2 se realizó en un total de 10 días. El rendimiento diario promedio para el reactor 1 durante el periodo de 12 días fue 87 g/m2 d (incluye los últimos dos días cuando la viabilidad del cultivo disminuyó debido a contaminación bacteriana). El rendimiento diario promedio en el reactor 1 para los primeros 10 días fue 101 g/m2 d. El rendimiento diario promedio para el reactor 1 sobre el periodo de 10 días fue 76 g/m2 d (incluye los últimos dos días cuando la viabilidad del cultivo disminuyó debido a contaminación bacteriana). El rendimiento diario promedio en el reactor 2 durante los primeros 8 días fue 74 g/m2 d.

Con referencia a la figura 25, los resultados de la tasa de crecimiento volumétrico del reactor 1 y el reactor 2 se muestran. La productividad volumétrica promedio en el reactor 1 fue 1 g/L d para el ensayo de 12 días y 0.66 g/L d para los primeros 10 días del ensayo. La productividad volumétrica máxima lograda en el reactor 1 durante el ensayo fue 0.92 g/L d. La productividad volumétrica promedio en el reactor 2 fue 0.49 g/L d para el ensayo de 10 días y 0.50 g/L d para los primeros 8 días del ensayo. La productividad volumétrica máxima lograda en el reactor 2 durante el ensayo fue 0.81 g/L d.

La figura 26 muestra el rendimiento de los resultados y el consumo de ácido acético durante los ensayos. El reactor 1 consumió en promedio 2.31 L/d de ácido acético durante los primeros siete días. El reactor 2 consumió en promedio 1.83 L/d de ácido acético durante los primeros seis días de los ensayos. La figura 27 muestra el consumo de nitrato bajo condiciones mixotróficas. El reactor 1 consumió un máximo de 447 mg/L d de nitrato. El reactor 2 consumió un máximo de 350 mg/L d.

Con referencia a la figura 28, el porcentaje de bacterias a Chlorella en cultivos mixotróficos se cuantificó mediante el uso del procedimiento descrito en los ejemplos anteriores. Los tratamientos para controlar la población bacteriana ocurrieron en el tiempo indicado por la línea discontinua vertical. El reactor 1 recibió un tratamiento de ozono, y el reactor 2 recibió un tratamiento de antibiótico. A 190 horas el agua de complemento para rellenar el sistema fue esterilizada por cloración antes de ser añadida al cultivo. En el reactor 1, el porcentaje de bacterias a Chlorella en el cultivo había alcanzado 10% a 240 hr. En el reactor 2, el porcentaje de bacterias a Chlorella en el cultivo había alcanzado 18% a 240 hr. A 168 hr, los niveles de bacterias tanto en el reactor 1 como en el reactor 2 empezaron a aumentar y ambos sistemas fueron tratados. El reactor 1 fue tratado con ozono aplicado a niveles promedio que variaban de 0.10 - 0.20 mg/L durante 17 hr. El ozono fue inyectado en un aspersor de aire y mezclado con aire a PSI de 5. El reactor 2 fue tratado con una mezcla de antibióticos como se lista en la tabla 4. El porcentaje de bacterias a Chlorella se redujo de 6.5% a 1.4% en el reactor 1 mediante el tratamiento de ozono. El por ciento de bacterias en el reactor 2 después del tratamiento con antibiótico se redujo de 65% a 19%. El rendimiento promedio en el reactor 1 para los tres días después del tratamiento de ozono fue 105 g/m2 d. El rendimiento promedio en el reactor 2 para los tres días después del tratamiento de antibiótico fue 71 g/m2 d. El tratamiento de antibiótico redujo las bacterias en el sistema pero también redujo la productividad. El tratamiento de ozono redujo las bacterias en el sistema y mantuvo un rendimiento por arriba de 100 g/m2 d.

Tabla 4 Ejemplo 11 La demanda de oxígeno para cultivo mixotrófico de microalgas se calculó para los reactores de estanque de flujo abierto, de exteriores, anteriormente descrito en el ejemplo 4. La tasa de crecimiento calculada del ejemplo 10 se midió como 0.6 g/L d en un promedio durante 9 días de operación continua. Aproximadamente 33% de ácido acético en masa se convierte a biomasa que iguala a 3.33 g de ácido acético/g de biomasa producida. El consumo estequiométrico teórico de oxígeno para consumir ácido acético es como sigue: CH3COOH + 202 - --> 2CO2 + 2H2O 1 mol de ácido acético requiere 1.5 moles de oxígeno o 60 g de ácido acético requiere 64 g de 02 o 1.07 g de 02/g de ácido acético.

Intermediarios alternativos distintos de C02 son posibles para conversión a biomasa y no se indican explícitamente aquí. Las fuentes de carbono distintas del ácido acético, tales como pero sin limitarse a glucosa, también son posibles en un cultivo mixotrófico. La tasa de consumo de oxígeno calculada es como sigue: (0.6 g de biomasa/L d x 3.33 g de ácido acético/g de biomasa x 1.07 g de 02/g de ácido acético) = 2.14 g O2/L d, que calcula para una tasa de consumo de 1.48 ppm 02/min.

La concentración de oxígeno en equilibrio a 25°C es de 8.5 ppm, por lo tanto la kLa calculada a partir del experimento descrito en el ejemplo 9 es 0.17 min-1 o 2.90 x 103 s1.

Ejemplo 12 Un experimento adicional se condujo en una muestra pequeña removida de los reactores de exteriores abiertos como se describe en el ejemplo 4. El cultivo en el estanque abierto estuvo en equilibrio a un nivel de oxígeno disuelto por debajo de la saturación, lo que sugiere que el oxígeno consumido fue igual al oxígeno transferido. Dos diferentes pruebas se realizaron sobre muestras de reactores de exteriores abiertos. Muestras de 1L se llevaron a laboratorio y se cubrieron con tela para bloquear la luz. La tasa de uso de oxígeno se midió con una sonda de oxígeno disuelto (medidor de oxígeno disuelto polarográfico DOH-SD1™, OMEGA Engineering Ltd Manchester RU), y los datos se muestra en la figura 29. El cultivo de los tanques se usó para llenar un matraz Erlenmcyer de 250 mi, y para reducir la transferencia de oxígeno. La caída del nivel de DO se gráfico contra el tiempo para calcular la demanda de oxígeno (a un nivel de DO por arriba del nivel crítico).

A partir de la figura 29, se mostró que la tasa de consumo de O2 era la pendiente de la curva 0.54 ppm/min para el reactor 1 y 0.57 ppm/min para la muestra del reactor 2. La concentración inicial fue 5 ppm de O2 y por lo tanto el gradiente de concentración para la prueba sería 8.5 a 3.5 ppm. La kLa en este caso para el reactor 1 sería entre 3.5 s-1 y 2.75103 s1.

Ejemplo 13 Una prueba como se describe en el ejemplo 12 se realizó en un día diferente del reactor 1 y los resultados se muestran en la figura 30. La gráfica en la figura 30 gráfica la tasa de consumo de oxígeno como se mide en el reactor 1 durante el periodo de crecimiento con una tasa de crecimiento volumétrico promedio de 0.6 g/L d o 100 g/m2 para el reactor de 15 cm de profundidad. La tasa de consumo de oxígeno de la muestra fue 0.5413 ppm/min. La concentración inicial fue 4.8 ppm, y por lo tanto el gradiente de concentración para la prueba sería 8.5-4.8- 3,7 ppm. La kLa en este caso para el reactor 1 sería 0.107 min1 o 2.44 x 103 s1. La ki,a promedio para el experimento fue 2.7 x 103. Los resultados para los cálculos de kLa se resumen en la tabla 5.

Tabla 5 C* es la concentración de saturación, C es la concentración de oxígeno.

Ejemplo 14 En un ejemplo de pronóstico, la tasa de crecimiento de área de biomasa de microalgas o cianobacterias para una reacción mixotrófica puede variar de 100 a 10,000 g/m2 d, con un intervalo más esperado de 100 a 4,000 g/m2 d. La tasa de crecimiento volumétrico puede variar de 0.6 g/L d a 600 g/L d, con un intervalo más esperado de 0.6 a 6 g/L d. Los reactores de crecimiento de microorganismos de pronóstico pueden ser cerrados o abiertos y operar en exteriores o interiores. Los reactores de interiores pueden ser operados con luz externa alrededor del reactor o un tubo de luz u otro medio de insertar luz dentro de un volumen de un reactor de crecimiento de microalgas.

La reacción de ácido acético con oxígeno y microalgas es de naturaleza volumétrica y limitada por transferencia de masa interfacial. Como se describe en el ejemplo 2, la tasa de crecimiento volumétrica de interiores fue 2.7 g/L d. Este experimento fue limitado por transferencia de masa de oxígeno en el líquido como se ve por el valor bajo de oxígeno disuelto. Para el ejemplo 2, el oxígeno se alimentó en forma de aire a través de un rociador simple hecho de un tubo con agujeros distribuidos espacialmente de aproximadamente 0.079375 cm de diámetro separados cada 1.905 cm y escalonados entre dos hilera (aproximadamente 32 agujeros en total).

Con puntos de inyección de aire más pequeños, un número incrementado de puntos de inyección, y/o un incremento en el rompimiento de burbujas más grandes, más oxígeno puede disolverse en la solución de cultivo de microalgas. Con más oxígeno disuelto en la solución de cultivo de microorganismos, se puede lograr una tasa de crecimiento mixotrófica volumétrica más alta de microalgas o cianobacterias. Con un diámetro de inyección de aire menor que 0.1 mm y muy preferiblemente entre lxlO-7 m y lx404 m, la tasa de crecimiento volumétrica correspondiente excederá 2.7 g/L d y variará de 0.6 g/L d a 600 g/L d.

Además, la solubilidad o absorción de oxígeno incrementada en el medio de reacción líquido también se puede lograr con un aumento en presión. Un medio para incrementar la presión es el uso de una altura de columna de líquido. En un ejemplo de pronóstico, se puede usar un reactor que varía de 0.2 m a 40 m de altura, con un intervalo preferido de 0.2 m a 10 m de altura. Este reactor puede ser de naturaleza tubular y tener aire, aire con oxígeno incrementado a partir de un generador de absorción por oscilación de presión (PSA) u otra operación unitaria, tal como pero sin limitarse a separación por membrana, que suministra un gas con una composición de oxígeno que varía de 25% a aproximadamente 98%, u oxígeno de alta pureza alimentado en o cerca del fondo del recipiente de reacción. Los niveles de oxígeno pueden ser controlados para incrementar el crecimiento de microalgas o cianobacterias y para controlar los organismos contaminantes. Una granja de microalgas o cianobacterias de la invención puede estar compuesta de bancos de reactores tubulares de 0.2 m a 40 m de altura con aire alimentado en el fondo y que incluyen opcionalmente un centro de tubo de luz espacialmente distribuido. El tubo de luz preferencialmente puede estar hecho de LEDs específicos de longitud de onda compuestos de cualquier longitud de onda que pueda incrementar el crecimiento y/o la formación de producto de fotopigmento, y alternativamente puede estar dispuesto alrededor del exterior del tubo. El diámetro del tubo puede variar de 0.1 m a 10 m. La granja de algas de la invención puede ser alojada en exteriores o dentro de un alojamiento para evitar cambios de las condiciones de la intemperie, que incluyen radiación solar inconsistente, degradación por UV, insectos, animales, contaminación, tormentas de viento, tormentas de lluvia, tormentas de arena, huracanes y similares.

En una modalidad alternativa, una columna de agua o medio de cultivo puede ser adyacente a un reactor (v.gr., reactor tubular, de panel plano o sustancialmente plano), por lo que el oxígeno disuelto más alto se puede añadir al medio en la columna alta ya sea antes de la adición al reactor de la invención o cielarse y del reactor para incrementar la cantidad de oxígeno disuelto para ayudar a la reacción.

En una modalidad alternativa, un reactor sustancialmente plano y sustancialmente tubular se usan juntos, en donde un reactor tubular de primera etapa se usa para crecimiento alto y un segundo reactor sustancialmente plano se usa para producción de lípidos o pigmento para una cepa de microalgas que puede comprender especies de los géneros tales como: Agmenellum, Amphora, Anabaena, Anacystis , Apistonema, Pleurochyrsis , Arthrospira ( Spirulina), Botryococcus , Brachiomonas , Chl mydomonas , Chlorella , Chloroccum, Cruciplacolithus , Cylindrotheca, Coenochloris, Cyanophora, Cyclotella , Dunaliella , Emiliania, Euglena, Extubocellulus, Fragilaria, Galdieria, Goniotrichium, Haematococcus , Halochlorella, Isochyrsis , Leptocylindrus , Micractinium, Melosira, Monodus, Nostoc, Nannochloris , Nannochloropsis , Navícula, Neospongiococcum, Nitzschia . , Odontella, Ochromonas , Ochrosphaera , Pavlova, Picochlorum, Phaeodactylum, Pleurochyrsis, Porphyridium, Poteriochromonas, Prymnesium, Rhodomonas, Scenedesmus , Skeletonema, Spumella, Stauroneis, Stichococcus , Auxenochlorella, Cheatoceros, Neochloris, Ocromonas, Porphiridium, Synechococcus , Synechocystis , Tetraselmis Thraustochytrids y Thalassiosira . En un ejemplo, un reactor tubular de primer paso de crecimiento alto se puede usar para un cultivo de Haematococcus para producir astaxantina. El segundo reactor sustancialmente plano se puede ser usar en un paso final para incrementar la producción de astaxantina ya que luz adicional se puede usar para inducir un color rojo intenso. Un reactor sustancialmente plano puede adoptar la forma de un estanque de flujo abierto de cualquier anchura, longitud o profundidad de hasta aproximadamente 1 m.

Como lo describe Yue et al, Chemical Engineering Science 62 (2007) 2096-2108, una kLa de gas líquido de 21 s1 para CO2 en agua se ha descrito en la literatura mediante el uso de téenicas de intensificación de proceso. Un factor de transferencia de masa 10,000 veces más alta de gas en un líquido es posible que el valor calculado a partir de los ejemplos mixotróficos descritos. A medida que la tasa de transferencia de masa de oxígeno se incrementa, otro fenómeno de reacción o tasas de conversión de microalgas inherentes pueden hacerse limitantes, y como tales 6,000 g/L d (o tasas 10,000 veces más altas que las descritas aquí) pueden no ser posibles. Se teoriza que puede ser posible lograr 600 g/L d en un cultivo mixotrófico continuo con el uso de transferencia de masa de gas-líquido mejorada en un cultivo de crecimiento de microalgas.

A partir del experimento descrito en el ejemplo 10, una productividad de área de 101 g/m2d se midió con una tasa de crecimiento volumétrico correspondiente de 0.66 g/L d. Con transferencia de masa mejorada de 100 veces, que sin embargo está muy por debajo de la posibilidad teórica de 10,000 veces, y con un incremento en la posibilidad del reactor de 15 cm a 150 cm (o un incremento de 10 veces en el volumen del reactor para la misma área de superficie desplazada expuesta al sol) mientras aún se mantiene un régimen de mezclado para permitir por lo menos algo de exceso a la luz para el cultivo en su totalidad, entonces el crecimiento de área resultante seria tres órdenes de magnitud mayores que los experimentos actualmente reportados o hasta 10,000 g/m2 d. con una profundidad de cultivo más baja o transferencia de masa gas o líquido menos optimizada, entonces el intervalo de productividad de área de un cultivo mixotrófico puede variar de 100 g/m2 d a 1,000 g/m2 d.

Ejemplo 15 Se condujo un experimento en un biorreactor de estanque de flujo abierto con un volumen total de 6600 L, y una profundidad total de 15 cm y una longitud de aproximadamente de 23.4 m. dos de los reactores fueron alojados dentro de un invernadero para limitar el ingreso de tierra y contaminantes, así como para mitigar el efecto los eventos inducidos por la intemperie. El reactor fue inoculado con Chlorella sp. SNL 333 a una densidad inicial de 0.2 g/L. El pH fue controlado con ácido acético (solución 20% en agua) de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente para dosificación de ácido acético. Los reactores se mezclaron hidráulicamente y se airearon con mangueras porosas. El sistema fue operado semi-continuamente con 50% de los cultivos cosechados diariamente para mantener la densidad de células entre 0.5 y 1.5 g/L de peso seco. El peso seco de las células de los cultivos se midió antes y después de cada cosecha. Los reactores se operaron por duplicado durante 6 días consecutivos antes de cosechar totalmente los cultivos. Los recuentos bacterianos se mantuvieron por debajo de 5% de los recuentos comparables durante el periodo de cultivo. Las productividades del sistema excedieron 100 g/m2 d lo que muestra resultados comparables con los biorreactores de volumen más pequeño descritos en el ejemplo 10.

Ejemplo 16 Se condujo un experimento para determinar el efecto de microalgas que crecen mixotróficamente ( Chlorella sp . SNL 333) en cultivos con bacterias contaminantes. Un sonicador UID 400 de Hielscher Ultrasonics GmbH (Teltow, Alemania) se usó para aplicar energía sónica a 600 mi de cultivo de microalgas y bacterias mixotróf icamente cultivadas. El cultivo fue sonicado a una intensidad de 95% usando una bocina con frecuencia de 30 kHz durante incrementos de 1.5 minutos y se enfrió para mantener la temperatura del cultivo en un intervalo de 25-35°C. El cultivo se volvió a inocular en el sistema de prueba pequeña después de 15 minutos de tratamiento de sonicación y la tasa de crecimiento de las microalgas tratadas y no tratadas se encontró que estaba dentro de 10%. Con referencia a la figura 31, las columnas representan la concentración bacteriana y la línea representa el porciento de células de algas vivas (es decir, células de microalgas). Los resultados mostraron una reducción logarítmica en la concentración bacteriana que se logró después de 15 minutos de tratamiento de sonicación sin una pérdida significativa de células microalgas vivas.

Ejemplo 17 Un sistema de biorreactor mixotrófico que comprendía un estanque de flujo abierto que proveía la porción del sistema de biorreactor que recibió por lo menos algo de luz, y un desnatador de proteína (es decir, un aparato de columna que usaba inyección de gas para conducir fraccionamiento de espuma) que provee una porción del sistema de biorreactor que no recibió luz, se uso para cultivar Chlorella en condiciones de cultivo mixotróficas en un medio de cultivo acuoso. El estanque de flujo abierto mantuvo un volumen de 500 L a una profundidad de cultivo operacional de 30 cm y estuvo en comunicación de fluido con un desnatador de proteína RK2RK75 bombeado por venturi de flujo alto con un volumen de operación ajustable de 408-466 L, lo que dio por resultado un volumen de sistema de biorreactor total de 908-966 L. El cultivo de microorganismos fue circulado por bombas en el estanque de flujo abierto, y salió del estanque de flujo abierto a través de una salida en comunicación de fluido con el desnatador de proteína. La inyección de aire para manipulación de la concentración de oxígeno disuelto y el cultivo se realizó por la bomba de venturi del desnatador de proteína. El ácido acético fue dosificado al cultivo de microorganismos a una concentración de 20% por una bomba de medición omega en la línea de descarga del desnatador de proteína, que regresó el cultivo de microrganismos al estanque de flujo abierto y completó la trayectoria de circulación de cultivo entre el desnatador de proteína y las porciones de estanque de flujo abierto del sistema de biorreactor .

El nivel de pH fue detectado por sondas de pH Hannah en el estanque de flujo abierto en la salida del desnatador de proteína y en la entrada del desnatador de proteína. Sondas de oxígeno disuelto Eutech se montaron en la entrada del desnatador de proteína y tubos de descarga para detectar la concentración de oxígeno disuelto. Una sonda de temperatura Redfish estaba dispuesta en el estanque de flujo abierto cerca de la salida para detectar la temperatura del cultivo de microorganismos. La iluminación al cultivo de microorganismos se proveyó mediante el uso natural (es decir, radiación solar). Una cubierta de invernadero de perfil bajo con una tela de sombra con 30% de aluminet cubrió el estanque de flujo abierto y bloqueó por lo menos la luz solar mientras también exponía el volumen de cultivo en el estanque de flujo abierto a por lo menos algo de luz solar. Un ventilador montado en la cubierta del invernadero forzó la circulación de aire a través de la superficie del cultivo de microorganismos acuoso y el espacio superior por arriba de la superficie del cultivo de microorganismos acuoso. La circulación del cultivo entre la porción del estanque de flujo abierto y la porción del desnatador de proteína dio por resultado un ciclo de trabajo de 5% (es decir, una cantidad de tiempo de cultivo de microorganismos estuvo expuesta a luz durante el tiempo de circulación total). El nivel de pH se mantuvo entre aproximadamente 7.5 y aproximadamente 8.5 durante la operación de la prueba, con el punto de ajuste de los controles a 7.5.

El biorreactor se limpió y se esterilizó con blanqueador para los procedimientos de operación estándares Heliae antes del experimento. El biorreactor fue inoculado a una concentración inicial de 0.08 g/L. El medio de cultivo se hizo mediante el uso de agua tratada con UV y materiales de abastecimiento BG-11 de laboratorio. El medio se hizo a BG-11 una vez con nitratos y fosfatos reducidos para factores externos. El medio fue rociado con nitrógeno para disminuir la concentración de oxígeno disuelto (DO) a 3 mg de O2/L (sólo en la inoculación inicial y no posteriormente). Durante la inoculación, boyas que contenían los cultivos de semilla de Chlorella fueron operados y la semilla fue vaciada directamente en el medio de cultivo circulante. Se notó que inmediatamente después de la inoculación, la concentración de DO había alcanzado ~9 mg de O2/L. Todas las muestras usuales para nutrientes y bacterias se recogieron como se describió anteriormente en los otros ejemplos.

Las muestras para concentración y los niveles de nitrato fueron enviadas al laboratorio diariamente. Las muestras fueron presentadas diariamente para FACs, petrifilm, y microscopía cuando asociados entrenados para hacer las pruebas antes mencionadas estuvieron disponibles. Las muestras se recogieron del lado sur del sistema de biorreactor en donde el puerto de muestra en la cubierta fue colocada. Un libro de registros se completo tres veces al día. El libro de registro tenía los siguientes campos: fecha, hora, pH, temperatura, concentración de DO; PAR, relleno de ACID, toma de muestras, volumen unitario, cosecha, inicial y notas. Para mantener la concentración de DO, la tasa de flujo de aire en el desnatador de proteínas se incrementó a medida que la concentración de células de cultivo se incrementó la unidad de desnatador de proteína produjo espuma húmeda a medida que avanzaba, y la válvula de descarga del desnatador de proteína se abrió completamente para permitir que la espuma blanca seca fuera desnatada constantemente y el volumen de la unidad del desnatador de proteína disminuyera de 946L anterior a 908L. El desnatador de proteína lavado se fijó durante 25 segundos aproximadamente cada 4 horas, con el barril de recolección basado diariamente. El nivel de nitrato dirigido para el reactor para la mayor parte de la operación fue 700 ppm con alimentaciones diarias de nitrato de sodio y la relación apropiada de fosfato de potasio. El objetivo parta cosecha fue esperar hasta que el cultivo alcanzara una densidad de 5 g/L o mayor y después cosechar del cultivo para reducir la densidad a 2.25 g/L.

La cosecha de la biomasa de Chlorella se realizó al bombear un volumen del cultivo del estanque de flujo abierto equivalente a una cosecha de 55% del volumen del sistema de biorreactor total. Los periodos de cosecha se anotaron en las figuras que se verán más adelante mediante las líneas discontinuas verticales. El agua tratada con UV se añadió después para remplazar el cultivo desechado así como de abastecimiento de BG-11 una vez (Nitrato 700 ppm) para el volumen del reactor total. La concentración en el cultivo se mantuvo entre 2-5 g/L para la mayor parte de la operación de prueba en donde la concentración alcanzo 7-8 g/L brevemente en dos días Los resultados para la concentración, tasa de crecimiento volumétrico y tasa de crecimiento de área con el tiempo se muestran en las figuras 32-33 para la operación de prueba. Las líneas de cosecha discontinuas en las figuras corresponden a una cosecha de 55% (-500L). Antes de la primera cosecha, el incremento en concentración muestra una curva de crecimiento de algas clásica (retraso-exponencial-estacionaria).

Las figuras 34-35 muestran la correlación de la concentración (g/L) a tasa de crecimiento volumétrica y tasa de crecimiento de área para la operación de prueba, y pueden sugerir, para el sistema de biorreactor, que 3 g/L deben ser el umbral más bajo cuando se cosecha y operar el reactor. Los dos puntos de cada crecimiento alto ocurren por arriba de una concentración de 5 g/L, lo que sugiere que la optimización posterior de productividad puede ser posible con concentraciones de operación más altas.

Las figuras 36-40 muestran los parámetros ambientales durante la operación del cultivo del sistema de biorreactor mixotrófico, incluyendo la temperatura, nivel de pH, concentración de oxígeno disuelto, iluminación (es decir, radiación activa fotosintética), y concentración de nitrato.

En la figura que despliega temperatura, los resultados despliegan la estabilidad térmica del volumen del cultivo a través de los pequeños cambios en temperatura sobre una base diaria.

Durante la operación, se llevaron a cabo observaciones con microscopio diariamente. Las observaciones mostraron el cultivo después de la misma progresión que la mayoría de los cultivos externos, el incremento en densidad de células así como contaminación que comprendía residuos celulares y bacterias. Sin embargo, el cultivo de Chlorella en el cultivo de sistema de biorreactor mixotrófico difirió de las operaciones de reactor previas como los signos de advertencia (v. gr., olor pútrido, depredadores o bacterias que atacan a algas) que pronostican un decaimiento de cultivo (es decir, dominancia por organismos contaminantes) no se observó. Se usó ácido acético como la fuente de carbono orgánico, pero no se uso anti-espuma, antibióticos, ozono o UV en la operación de la prueba. El sistema de biorreactor mixotrófico no se selló y se operó en condiciones no axénicas. El cultivo continuó en crecimiento durante 34 días, con una tasa de crecimiento promedio durante los 34 días de 302 g/m2 d.

Combinaciones de carbono orgánico Aunque los cultivos mixotróficos pueden operar mediante un suministro de una fuente de carbono orgánico única, algunos cultivos de microrganismos pueden experimentar un beneficio del uso de una combinación de fuentes de carbono orgánico. En algunas modalidades, el suministro de carbono orgánico comprende por lo menos una fuente de carbono orgánico. En algunas modalidades, la fuente de carbono orgánico comprende por lo menos dos fuentes de carbono orgánico. En una modalidad no limitante, un cultivo de microrganismos mixotróficos puede usar un suministro de carbono orgánico que comprende ácido acético y por lo menos una fuente de carbono orgánico adicional.

Cuando se cultivan microrganismos en condiciones mixotróficas mediante el uso de ácido acético como la principal fuente de carbono orgánico, la excreción de pequeñas cantidades de ácido succínico al medio de cultivo puede ocurrir debido a sobreflujo metabólico. La excreción de ácido succínico puede disminuir la alcalinidad del medio y desplazar el ácido acético residual presente al medio de cultivo. En una modalidad que usa un sistema auxostat-pH para dosificar ácido acético a un cultivo mixotrófico de Chlorella , se observó que el ácido succínico fue excretado al medio de cultivo pero el ácido acético fue sin embargo suministrado y consumido por los microorganismos, con constituciones residuales por arriba de 0.5 g de acetato/L.

Debido a que el ácido succínico es un intermediario del ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) que es responsable de metabolizar acido acético, la acumulación de ácido succínico en el medio de cultivo puede sugerir la utilización sub-óptima de la fuente de carbono orgánico en los microorganismos debido a algún tipo de estrés o alteración metabólica. La energía de ácido acético es producida a través del TCA, que es un ciclo no catalítico. Puesto que el PCA es un ciclo no catalítico, la cantidad de oxaloacetato suministrada depende del material de partida y no de cuánta acetil-coA entra al ciclo. En un cultivo de microorganismos alimentado con glucosa, el oxaloacetato puede ser producido a partir de piruvato a través de la piruvato carboxilasa; pero en el cultivo de microorganismos suministrado con ácido acético, el piruvato puede ser suministrado a través de fotosíntesis-glucolisis . La excreción de ácido succínico (un intermediario de TCA) indica que la fotosíntesis puede no ser capaz de satisfacer la demanda metabólica para oxaloacetato.

En la téenica se sabe que el ácido propiónico pude ayudar a reciclar el oxaloacetato en un cultivo de dinof lagelados alimentado con acetato (v. gr., Crypthecodinium cohnii ) . También en la técnica se sabe que en hongos, el ácido propiónico entra al TCA después de convertirse a succinil-coA o a través de citramalato.

La entrada del TCA después de la conversión a succinil-coA o por citramalato puede incrementar el suministro de oxaloacetato requerido para activar el TCA, y por lo tanto produce suficiente energía para crecimiento y biosíntesis. El piruvato también puede ser convertido a oxaloacetato a través de la enzima piruvato carboxilasa que cataliza la carboxilación irreversible de piruvato. Al aplicar este conocimiento en el contexto de un cultivo alimentado con ácido acético de microorganismos mixótrofos, se puede crear un método para mejorar la metabolización de ácido acético en microorganismos mixótrofos .

En algunas modalidades, una pequeña cantidad de promotor de oxaloacetato se puede combinar con el ácido acético suministrado a un cultivo de microorganismos mixotrófico en un recipiente de cultivo para ayudar a recielar el oxaloacetato al TCA, mejorar el crecimiento, mejorar la productividad de biomasa y reducir el efecto inhibidor de uno o más inhibidores sobre el TCA. El promotor de oxaloacetato puede comprender piruvato; precursores de azúcar hexosa de piruvato; ácido propiónico; y precursores de ácido propiónico tales como ácidos grasos de cadena non, valina, isoleucina, treonina y metionina. En algunas modalidades, la relación de ácido acético a promotor de oxaloacetato puede variar de 10:0.01 a 10:2. En algunas modalidades, el ácido acético puede comprender ácido acético y sus precursores, tales como acetato y anhídrido acético.

Ejemplo 18 Una especie de Chlorella se cultivó en un sistema de biorreactor mixotrófico que comprendía un sistema auxostat-pH con 100 g/1 de ácido acético y 10 g/1 de ácido propiónico (una relación de ácido acético: ácido propiónico de 10:1) en el contenedor de suministro de fuente de carbono orgánico. Para el recipiente de cultivo, un reactor de columna burbujeante con 800 mi de volumen circulante se utilizó. Se cultivó Chlorella en un modo semi-continuo en el cual 80% del cultivo fue cosechado cada dos días durante el crecimiento mixotrófico. Las cosechas de cultivo se muestran en la figura 41 en donde las líneas de tendencia en la gráfica del peso seco de células adquirieron una declinación aguda. El medio del cultivo fresco (BG-11) se añadió al cultivo para remplazar el medio de cultivo perdido con cada cosecha.

Los cultivos se mantuvieron a 25°C y una aireación constante de 50 volúmenes de aire/volumen de cultivo por minuto (VVM). Se proveyó luz fluorescente a un lado de los recipientes de cultivo a 200 mmo? fotón/m2 s en un fotoperiodo continuo de 24 horas. La trayectoria de luz en los recipientes de cultivo fue 4 cm. Los niveles de bacterias se mantuvieron por debajo de 25% de los recuentos de células totales a lo largo del experimento .

Cuatro días después de la inoculación, y después de la primera cosecha semi -continua , el cultivo que recibió el carbono orgánico más tratamiento de promotor de ácido acético :ácido propiónico (10:1) iniciado para realizar el cultivo que recibió únicamente tratamiento de ácido acético en términos de densidad de células y productividad de biomasa. Para el final del experimento, el cultivo que recibió el carbono orgánico más el tratamiento con promotor de ácido acético :ácido propiónico (10:1) mostró un incremento en productividad de 25% sobre el cultivo que recibió ácido acético únicamente. Como se usa en la figura 41 y la tabla 6, la mezcla de ácido acético y ácido propiónico tuvo un rendimiento igual de bueno o mejor que el ácido acético sobre una base diaria.

Tabla 6 Los expertos en la téenica reconocerán, o podrán confirmar, al usar nada más que experimentación de rutina, numerosos equivalentes a las modalidades específicas descritas específicamente aquí. Se pretende que estos equivalentes sean abarcados en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (12)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

1. Un método de cultivo de Chlorella en condiciones de cultivo mixotróficas no axénicas, caracterizado porque comprende inocular un medio de cultivo acuoso con un cultivo que comprende Chlorella en un recipiente de cultivo abierto en presencia de: a. luz que comprende radiación fotosintéticamente activa (PAR); b. una fuente de carbono orgánico que comprende por lo menos uno seleccionado de ácido acético, acetato y anhídrido acético, a una concentración en el intervalo de 15-50% (v/v); c. un pH en el intervalo de 6-9; d. una concentración inicial de acetato de sodio, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio en el intervalo de 0.05-10 g/L; y e. una concentración de oxígeno disuelto (DO) en el intervalo de 1-6 mg de 02/Litro de cultivo.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende controlar la temperatura del cultivo con calentamiento y enfriamiento para mantener la temperatura dentro del intervalo del intervalo de 10-30°C.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de carbono orgánico comprende ácido acético y además comprende un segundo componente de carbono orgánico que comprende ácido propiónico.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la fuente de carbono orgánico comprende ácido acético y ácido propiónico en una relación de ácido acético:ácido propiónico en el intervalo de 10:0.01 a 10:2.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de carbono orgánico comprende además la fuente de carbono orgánico comprende en combinación con por lo menos un nutriente adicional que comprende por lo menos uno seleccionado del grupo que consiste de nitratos y fosfatos.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la fuente de carbono orgánico en combinación con por lo menos un nutriente adicional comprende ácido acético y NO3 en una relación de ácido acético:NÜ3 de 10:0.5 a 10:2.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la densidad de inoculación de Chlorella en el cultivo comprende 0.3-0.5 g/L.

8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el volumen del cultivo es por lo menos 500 litros.

9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además cosechar Chlorella del cultivo sobre una base periódica una vez que la densidad de Chlorella en el cultivo alcanza una densidad de umbral de 5 g/1.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración inicial de acetato de sodio, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio está en el intervalo de 1-6 g/1.

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el carbono orgánico es suministrado por un sistema auxostat-pH con un punto de ajuste en el intervalo de 6-9.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración inicial de acetato de sodio, hidróxido de sodio o hidróxido de potasio es suministrada durante los primeros 1-5 días después de que el cultivo es inoculado.