MX2015003386A

MX2015003386A - Metodo para la deteccion de mutaciones de braf y pi3k.

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Publication number: MX2015003386A
Application number: MX2015003386A
Authority: MX
Inventors: Juan Moscoso Del Prado; María Luisa Villahermosa
Original assignee: Genomica Sau
Priority date: 2012-09-21
Filing date: 2013-09-20
Publication date: 2015-06-05
Also published as: ES2712941T3; CN104685070A; EP2711432A1; CN104685070B; EP2898093A1; CA2884869A1; MX362212B; WO2014044828A1; EP2898093B1

Abstract

La presente invención se basa un método de detección de las mutaciones de BRAF, V600E y V600K, y de las mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R en una muestra susceptible de contener una o más de dichas mutaciones, basado en la amplificación de la muestra con los cebadores desarrollados en la presente invención. Asimismo, la presente invención está relacionada con (i) un kit que comprende entre sus componentes, reactivos de amplificación que incluyen uno o más de los cebadores de la invención; (ii) los cebadores en sí; así como (iii) el uso del método, el kit y los cebadores arriba mencionados, para el diagnóstico/pronóstico de una condición patológica en un paciente, particularmente, de cáncer.

Description

MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE MUTACIONES DE BRAF Y PI3K.

Antecedentes de la invención.

B-raf (o BRAF) forma parte de la ruta de transducción de señal de Ras/Raf/MEK/MAP y juega un papel fundamental en la regulación de la ruta de señalización de MAP Kinasa/ERK. Mutaciones en este gen se han asociado con varios tipos de cáncer como cáncer colorrectal (CRC), cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), melanomas malignos y adenocarcinomas.

En cáncer de colon se han detectado mutaciones oncogénicas de BRAF, tratándose en la mayoría de los casos de la mutación V600E (Davies H, et al., 2002, Nature 417:949-54; Rajagopalan H, et al., 2002, Nature 418:934). La mutación V600E está localizada en el exón 15 del gen BRAF: En la posición 1799 de la secuencia codificante del gen BRAF, hay un cambio de T a A, lo cual se traduce en un cambio de valina (V), presente en la proteina BRAF tipo nativo, a glutamina (E) en la proteina correspondiente al gen mutado. La mutación V600K (1798— 1799 GT>AA), menos abundante, también se ha detectado, y constituye la segunda mutación más abundante en patologías como melanoma (Rubinstein et al., 2010, Journal of Translational Medicine 8, No pp. proporcionada). Otras mutaciones identificadas en el gen BRAF son V600D, V600M y V600A.

La ruta de señalización de la PI3K (fosfatidilinositol 3-cinasa) juega un papel importante en muchos procesos celulares entre los que se encuentran proliferación celular, adhesión, supervivencia y motilidad. La desregulación de esta ruta se ha observado en muchos tipos de enfermedades humanas, y se ha asociado a menudo a alteraciones genéticas en componentes de esta via. Entre estas alteraciones genéticas se incluyen mutaciones activantes en la subunidad pllOa de PI3K, PIK3CA (Hurst et al., 2009, BMC Research Notes 2:66). La mayoría de las mutaciones de PI3K tienen lugar, bien en el exón 9 de PIK3CA, el cual codifica por el dominio helicoidal, o bien en el exón 20 de PIK3CA, el cual codifica por el dominio quinasa (Engelman, 2009, Nat. Rev. Cáncer 9: 550-562). Cuatro mutaciones frecuentes de PI3K en los exones mencionados más arriba son E542K, E545D, E545K (las tres localizadas en el exón 9) y H1047R (exón 20).

Publicaciones recientes sugieren que mutaciones en BRAF y PI3K pueden conferir resistencia frente a la terapia anti-EGFR (Lurkin et al., 2010, PLoS ONE, 5, (1); De Roock et al., 2010, Lancet Oncol.11:753-62; De Roock et al., 2011, Lancet Oncol.12: 594-603; Bardelli & Sienna, 2010, J Clin Oncol; 28(7): 1254-1261). En particular, se ha demostrado que mutaciones en BRAF perjudican la respuesta a panitumumab o cetuximab en pacientes con mCRC (Di Nicolantonio F et al., 2008, J. Olin. Oncol.26:5705-5712), y que la presencia de BRAF mutado representa un factor de pronóstico negativo para los pacientes con mCRCs. Datos actuales también sugieren que la evaluación de alteraciones de BRAF y PI3K, podría ser útil en la selección de pacientes con mCRC, que es probable que no vayan a responder a anticuerpos dirigidos frente a EGFR (Bardelli & Sienna, 2010, J Olin Oncol; 28(7): 1254- 1261).

Existe una gran demanda de métodos para la detección de mutaciones en los genes PI3K y BRAF. Recientemente, se ha hecho público un método para la detección simultánea de mutaciones genéticas que son relevantes para la respuesta al tratamiento anti-EGFR (Lurkin et al., 2010, PLoS ONE, 5, (1)). El método incluye el análisis de las mutaciones de PI3K en los exones 9 y 20, así como el análisis de las mutaciones de BRAF en el exón 15. Básicamente, se diseñaron dos PCRs Multiplex; la primera comprende un par de cebadores o primers para la amplificación del exón 15 de BRAF; y la segunda comprende dos pares de cebadores para la amplificación de los exones 9 y 20 de PI3K. Seguidamente, se purifican los productos de PCR obtenidos, se desnaturalizan, y se incuban con sondas que hibridan con una de las cadenas del producto de amplificación correspondiente en una posición adyacente al sitio de la mutación. A continuación se llevan a cabo reacciones de extensión en un termocielador, donde sólo el ddNTP complementario a la mutación que está presente en la muestra se va a incorporar al producto de extensión, y se detecta con un secuenciador automático.

Otros métodos de detección de mutaciones en estos genes incluyen ensayos de Real-Time ARMS (del inglés amplification refractory mutation system), como los que se muestran en Ellison et al., 2010, Journal of Experimental & Clinical Cáncer Research 29: 132.

ARMS es un método de detección de mutaciones puntuales, basado en el principio de "primado" alelo-especifico de la amplificación PCR (EP0332435; Newton et al., 1989, Nucleic Acid Research 17, 2503-251 6). Este sistema se basa en una estrategia donde cada cebador oligonucleotidico o cebador se diseña de tal manera, que sólo puede funcionar como cebador de la PCR cuando tiene como molde para la PCR a su correspondiente secuencia especifica de DNA diana. Esta téenica requiere que el nucleótido terminal en posición 3' del cebador para la PCR, "especifico del alelo". Esto implica que el nucleótido terminal en posición 3' sea el que corresponde con el de la mutación puntual. Asi, el cebador se diseña en dos formas: La forma "normal", que es refractaria a la amplificación por PCR del DNA de la forma "mutante" modelo; y la forma "mutante", que es refractaria a la amplificación por PCR del DNA "normal".

En algunas ocasiones, una única base mal apareada en posición 3' del cebador, no consigue evitar completamente la extensión inespecifica del primer oligonucleotidico cuando tiene como molde al DNA correspondiente a otra mutación puntual, y la amplificación tiene lugar. En esos casos, la introducción deliberada de un "mismatch o mal apareamiento" en una posición próxima al extremo 3' del cebador alelo-específico (en la posición correspondiente al segundo, tercer o cuarto nucleótido adyacente al extremo 3' del cebador), permite aumentar la especificidad del cebador.

La técnica ARMS implica que puedan tener lugar al menos dos reacciones de PCR en una sola mezcla de reacción, cada una de ellas correspondiente a la amplificación con uno de los cebadores AR S. Todo cebador ARMS requiere, además, de un segundo cebador (a menudo llamado "cebador común" y que en lo sucesivo llamaremos "cebador de amplificación"), para generar el producto especifico de alelo.

La presencia de una secuencia diana especifica en una muestra, se detecta mediante visualización del producto tras electroforesis en gel de agarosa y tinción con bromuro de etidio. Alternativamente, los resultados pueden analizarse en un formato de tubo cerrado entiempo real, mediante incorporación de sondas fluorescentes como Taqman, Scorpions, Molecular beacons o tinciones fluorescentes intercalantes como Yo-Pro o Sybr green.

El estado de la téenica aborda a menudo el aspecto de la detección de las mutaciones de BRAF, V600E y V600K, y de las mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R. No obstante, hasta donde alcanza nuestro conocimiento, ninguno de los métodos de detección del estado de la técnica, permite la detección de productos de amplificación obtenidos a partir de estas mutaciones mediante hibridación de dichos productos con sondas especificas. Esto se debe al hecho de que cualquier sonda que se diseñe para hibridar con cualquier producto de amplificación correspondiente a una de las mutaciones de uno de estos genes, también se uniría de manera inespecífica a los productos de amplificación de mutaciones próximas del mismo gen, debido a la similitud de secuencia entre ellos. Por ese motivo, los métodos de detección de mutaciones de BRAF y PI3K del estado de la téenica, tienen el inconveniente de que la detección de cualesquiera productos de amplificación obtenidos no puede ser llevada a cabo mediante la hibridación de los mismos con sondas específicas de mutación, y, en particular, con micromatrices que contengan dichas sondas.

Este inconveniente afectaría tanto a la aproximación de amplificación ARMS Multiplex, coma a la aproximación de amplificación ARMS individual, donde se obtienen los productos de amplificación específicos de cada mutación en tubas de reacción independientes.

Otro problema asociado es que las mutaciones de BRAF y PI3K que se presentan coma factores pronósticos de estadio tumoral, metástasis, evolución, heterogeneidad celular, o heterogeneidad alélica, a menudo se encuentran presentes en las muestras en cantidades poco abundantes respecto a la forma tipo nativo. Y, aunque hay muchos metodos de diagnóstico disponibles para detección de mutaciones, la mayoría no son capaces de detectar con exactitud mutaciones poco abundantes. La secuenciación de Sanger es el "patrón de referencia" para la identificación de mutaciones, aunque sólo puede detectar mutaciones cuya abundancia sea superior, aproximadamente, al 20% (Ogino et al., 2005, J. Mol. Diagn.7:413-421; Li et al., 2008, Nat. Med.14: 579-584).

Sería, por tanto, de enorme interés disponer de un método que, a diferencia de los métodos del estado de la téenica, permitiera detectar especí ficamente cualquier producto de amplificación, obtenido a partir de cualquiera de las mutaciones de BRAF, V600E y V600K, o de las mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R presentes en una muestra, mediante hibridación de dichos productos con sondas específicas. También sería conveniente que el método permitiera la detección de mutaciones presentes en bajo porcentaje en la muestra. La invención que aquí se describe tiene como finalidad proporcionar un método robusto y sólido para la detección de mutaciones de BRAF y PI3K, y así mitigar las limitaciones del estado de la técnica.

Breve descripción de la invención.

El problema a resolver con la presente invención es proporcionar un método de detección de cualquiera de las 2 mutaciones de BRAF, V600E y V600K, o de cualquiera de las 4 mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R presentes en una muestra, mediante la hibridación de cualquier producto de amplificación que se obtenga a partir de un ácido nucleico que tenga cualquiera de estas mutaciones, con sondas especificas de la diana.

La solución, se basa en la amplificación de una o más de las 2 mutaciones de BRAF, V600E y V600K o de una o más de las 4 mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R, presentes en una muestra, con uno o más cebadores de la téenica ARMS de la presente invención.

Los cebadores ARMS de la presente invención se caracterizan en que cada cebador tiene una longitud total de entre 36 y 50 nucleótidos, estando su extremo 3' diseñado de acuerdo con el método de amplificación ARMS (del inglés "amplification refractory mutation system", método de detección de mutaciones puntuales basado en el principio de "primado" especifico del alelo de la amplificación por PCR), y constituyendo dicho extremo 3' una secuencia especifica de la diana seleccionada de entre ID SEC NO: 1 e ID SEC NO: 2, respectivamente, en el caso de las mutaciones V600E y V600K de BRAF, e ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, respectivamente, en el caso de las mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R, comprendiendo, además, cada cebador en la posición 5' una secuencia "tag" o marcadora diferente, no especifica de la diana, de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud. Asi, el cebador ARMS que se usa según el método de la presente invención comprende una secuencia especifica de la diana en el extremo 3', la cual es capaz de hibridar con el ácido nucleico diana que tiene una mutación como la antes descrita de un modo especifico de alelo. Este cebador también comprende una secuencia en 5' que no es especifica de la diana, y por tanto no es complementaria con el ácido nucleico diana. Esta secuencia es una secuencia marcadora que es útil para la detección del producto de amplificación mediante la posterior hibridación de éste con una sonda diseñada específicamente para hibridar con la región del producto de amplificación complementaria a la secuencia marcadora. Esto permite la detección específica del producto de amplificación mediante los métodos que aquí se describen.

El método de la presente invención permite la detección específica de cualquier producto de amplificación que se obtenga de cualquiera de las 2 mutaciones de BRAF, V600E y V600K, y/o de las mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R, presentes en una muestra, mediante hibridación de dicho producto con una o más sondas que hibriden de manera especifica con dicho producto en la región correspondiente al marcador aportado por el cebador especifico.

Las secuencias marcadoras en posición 5' de los distintos cebadores, son todas diferentes entre si. Esta diferencia es la que hace posible la unión especifica de los distintos productos de amplificación a sus sondas correspondientes, dado que cualquier sonda especifica para uno de los productos de amplificación debe tener una secuencia nucleotidica capaz de hibridar al menos con la región del producto correspondiente al marcador correspondiente.

A lo largo de la presente descripción, estos cebadores específicos de la mutación, diseñados en su extremo 3' de acuerdo con el método de amplificación ARMS, se denominarán "cebadores ARMS". Adicionalmente, el o los cebadores que se combinan con los "cebadores ARMS" para la amplificación del DNA diana, y que habitualmente se denominan cebadores comunes, se denominarán de ahora en adelante "cebadores de amplificación". Los "cebadores ARMS" de la presente invención, específicos para las mutaciones de BRAF y PI3K de la presente invención, se pueden representar como se indica en la Tabla 1.

Marcadorl, marcador2, marcador3, marcador4, marcador5 y marcador6, son secuencias nucleotidicas de entre 15 y 20 nucleótidos, y más preferiblemente de entre 17 y 19 nucleótidos de longitud, siendo todas diferentes entre si. En otras palabras no existe homología sustancial entre las secuencias marcadoras. Por ausencia de homología sustancial se entiende menos del 50% (es decir, dos secuencias marcadoras no deben compartir más del 50% de sus nucleótidos).

En una modalidad preferida, el contenido GC de cada "fragmento" es de 11-71%, más preferiblemente de 40-60%. En otra modalidad preferida, la Tm de cada "fragmento" es de 39-70°C. Preferiblemente, la longitud total de los cebadores ARMS oscila entre los 39 y los 47 nucleótidos.

Entre los cebadores ARMS especialmente preferidos se encuentran los de ID SEC NO: 3 y ID SEC NO: 4, correspondientes a las mutaciones de BRAF, V600E y V600K, respectivamente, y los de ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 y ID SEC NO: 19, correspondientes a las mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R, respectivamente.

Además de los cebadores ARMS, la mezcla de amplificación de la presente invención comprende uno o más cebadores de amplificación que se combinan con los cebadores ARMS para generar los productos de amplificación.

El método de la presente invención consiste por tanto en poner en contacto una muestra a ensayar que contenga ácidos nucleicos, con uno o más cebadores ARMS diagnósticos, específicos, correspondientes a una o más de las mutaciones de BRAF o PI3K indicadas más arriba, en presencia de uno o más cebadores de amplificación, los nucleótidos trifosfato adecuados y un agente de polimerización, y en las condiciones apropiadas, de manera que la extensión a partir de cada cebador ARMS diagnóstico sólo tenga lugar en caso de que su mutación correspondiente esté presente en la muestra; La presencia o ausencia en la muestra de cada mutación se determinará en función de la presencia o ausencia del producto de extensión del cebador diagnóstico correspondiente. Preferiblemente, dicha presencia o ausencia de tal producto se determinará mediante hibridación de cualquier producto de amplificación obtenido, con sondas especificas del marcador.

Los métodos de amplificación y detección de las mutaciones de BRAF y PI3K de la presente invención difieren de los del estado de la téenica en el uso de los cebadores ARMS aquí descritos. La amplificación con estos cebadores permite la posterior hibridación especifica de los productos de amplificación con sondas especificas de la secuencia.

En particular, la amplificación de una o más de las 2 mutaciones de BRAF, V600E y V600K, o de una o más de las 4 mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R, con uno o más de los correspondientes cebadores ARMS de la presente invención que se muestran en la Tabla 1, permite, a diferencia de los métodos del estado de la técnica, detectar cualquier producto resultante de dicha amplificación, mediante hibridación con sondas especificas de la secuencia. Preferiblemente, las sondas especificas de la secuencia diana pueden encontrarse formando parte de una micromatriz.

El factor clave que hace posible la unión especifica entre los productos de amplificación y sus sondas correspondientes, es que las sondas de detección hibridan específicamente con su producto de amplificación correspondiente, en la región correspondiente al marcadorl, marcador2, marcadoró, marcador4, marcadoró o marcador6, proporcionados por el correspondiente cebador AR S. Esta región marcadora no presenta homología sustancial entre los distintos cebadores. De este modo, se consigue especificidad de la hibridación entre cualquier producto de la amplificación, y su(s) sonda(s) correspondiente(s).

Para una mejor comprensión del método de la presente invención, en la Figura 1 se muestra un esquema de éste. Como ejemplo, se ha seleccionado la detección de la mutación V600E de BRAF.

El método de la presente invención constituye una ventaja relevante frente a los métodos del estado de la téenica, siendo la razón que la hibridación específica de los productos de amplificación con sondas específicas da lugar a un método de detección de un solo paso, mucho más sencillo que los métodos del estado de la téenica para la detección de mutaciones de BRAF y PI3K.

El método de detección de la presente invención muestra valores de sensibilidad en donde 1% de los mutantes de BRAF y PI3K pueden detectarse en un fondo tipo nativo.

Lurkin et al., 2010, PLoS ONE, 5, (1), muestran un método de detección basado en la amplificación de DNA seguida de hibridación con sondas. En particular, se diseñaron dos técnicas PCR Multiplex, la primera para la detección del exón 15 de BRAF, y la segunda que permite la detección de los exones 9 y 20 de PI3K. Los productos de amplificación que se obtienen para cada gen hibridan de manera no específica con una sonda, la cual híbrida con dichos productos en una posición adyacente al sitio de la mutación de interés. La detección específica sólo se produce cuando tiene lugar la extensión del híbrido formado entre la sonda y el producto de amplificación. Los productos obtenidos se procesan y posteriormente se analizan en un secuencíador automático, donde el mareaje fluorescente del ddNTP incorporado indica la presencia o ausencia de mutación. Por tanto, en Lurkin et al., los productos de amplificación que se obtienen se unen de manera no especifica a la sonda proporcionada, y la detección especifica sólo se produce cuando tiene lugar la extensión del híbrido formado entre la sonda y el producto de amplificación. Por tanto, se requiere como mínimo una reacción adicional a la de la amplificación para que pueda llevarse a cabo la detección. A diferencia de Lurkin et al., de acuerdo con el método de la presente invención, la detección tiene lugar mediante hibridación directa de cualquier producto de amplificación que se obtenga, con su sonda específica de la secuencia.

El método de la presente invención, también hace posible la amplificación por PCR Multiplex con dos o más cebadores ARMS de la presente invención. Adicionalmente, el método de la presente invención hace posible la detección de mutaciones que estén presentes en la muestra en porcentaje bajo.

Uno de los aspectos de la presente invención, corresponde a un método de detección de una o más mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, o de una o más mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, donde el método comprende las etapas de: someter una muestra que contiene ácidos nucleicos a amplificación con una mezcla de amplificación que comprende uno o más cebadores ARMS, que se caracterizan en que cada cebador ARMS tiene una longitud total de entre 36 y 50 nucleótidos, y comprende en posición 3' una secuencia específica de la diana seleccionada de entre ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 2, ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, respectivamente, comprendiendo además cada cebador ARMS en posición 5' una secuencia marcadora no especifica de la diana, diferente, que tiene entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, donde la mezcla de amplificación comprende además uno o más cebadores de amplificación; y - detectar cualquier producto de amplificación que se obtenga, mediante hibridación de dicho producto con una o más sondas, donde cada sonda híbrida específicamente con la región del producto de amplificación correspondiente a la secuencia marcadora en 5' del cebador ARMS correspondiente.

Otro aspecto de la presente invención está relacionado con un kit para la detección de una o más mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, o de una o más mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, en una muestra experimental que contenga ácidos nucleicos, donde el kit comprende una o más mezclas de reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo cada mezcla: - uno o más cebadores ARMS caracterizados en que cada cebador tiene una longitud de entre 36 y 50 nucleótidos, conteniendo en posición 3' una secuencia especifica de la diana seleccionada de entre ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 2, ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, conteniendo en posición 5' una secuencia marcadora no especifica de la diana de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, y - uno o más cebadores de amplificación, donde el kit comprende además una micromatriz con una o más sondas inmovilizadas, donde cada sonda híbrida específicamente con la región del producto ARMS correspondiente, complementaria a la secuencia marcadora en 5' del cebador ARMS correspondiente.

Otro aspecto de la presente invención corresponde a un método de amplificación de un ácido nucleico que tiene una o más mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, o a una o más mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, donde el método consiste en poner en contacto una muestra que contiene ácidos nucleicos con una mezcla de amplificación que contenga uno o más cebadores ARMS, que se caracterizan en que cada cebador ARMS tiene una longitud total de entre 36 y 50 nucleótidos, y comprende en posición 3' una secuencia especifica de la diana seleccionada de entre ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 2, ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, respectivamente, comprendiendo cada cebador ARMS en posición 5' una secuencia marcadora no especifica de la diana, de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, donde la mezcla de amplificación comprende además uno o más cebadores de amplificación.

Además de los cebadores ARMS y de amplificación, la mezcla de amplificación también comprende reactivos adicionales para la amplificación de ácidos nucleicos, como una DNA polimerasa y dNTPs.

Preferiblemente, el marcador en 5' puede ser seleccionado de entre las siguientes secuencias: ID SEC NO: 6, ID SEC NO: 7, ID SEC NO: 22, ID SEC NO: 23, ID SEC NO: 24 e ID SEC NO: 25. Las sondas de la presente invención pueden, pues, comprender una secuencia seleccionada de entre ID SEC NO: 6, ID SEC NO: 7, ID SEC NO: 22, ID SEC NO: 23, ID SEC NO: 24 e ID SEC NO: 25, pudiendo contener nucleótidos adicionales a los específicos de la región marcadora.

Preferiblemente, una o más de las sondas con las que se ponen en contacto los productos de amplificación tienen una longitud de entre 15 y 45 nucleótidos, siendo la región de la sonda que híbrida específicamente con la región del producto correspondiente a la secuencia marcadora en 5' del cebador ARMS, de una longitud de entre 15 y 20 nucleótidos. Aun más preferiblemente, una o más sondas comprenden secuencias seleccionadas de entre ID SEC NO: 6, ID SEC NO: 7, ID SEC NO: 22, ID SEC NO: 23, ID SEC NO: 24 e ID SEC NO: 25.

Preferiblemente, las sondas de la presente invención se seleccionan de entre ID SEC NO: 8 (V600E de BRAF), ID SEC NO: 9, ID SEC NO: 10, ID SEC NO: 11 (V600K de BRAF), ID SEC NO: 26 (E542K de PI3K), ID SEC NO: 27 (E545D de PI3K), ID SEC NO: 28 (E545K de PI3K) y ID SEC NO: 29 (H1047R de PI3K).

Las sondas pueden estar inmovilizadas en un soporte sólido. El juego de sondas de la micromatriz y soporte sólido puede además comprender una o más sondas testigo.

Otro aspecto de la presente invención corresponde a un cebador ARMS de entre 36 y 50 nucleótidos, que se caracteriza por comprender, en posición 3', una secuencia específica de la diana de BRAF seleccionada de entre ID SEC NO: 1 y ID SEC NO: 2, o una secuencia específica de la diana PI3K seleccionada de entre ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, y una secuencia marcadora no específica de la diana en posición 5', de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, la secuencia marcadora en posición 5' tiene una longitud de entre 17 y 19 nucleótidos. En un aspecto preferido de la invención, uno o más cebadores ARMS se seleccionan del grupo que comprende ID SEC NO: 3, ID SEC NO: 4, ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 e ID SEC NO: 19.

Otro aspecto más de la presente invención corresponde al uso de los métodos de detección y amplificación, del kit, o de los cebadores ARMS aquí descritos, para el diagnóstico y/o el pronóstico de una condición patológica en un paciente.

Preferiblemente, la condición patológica es cáncer. Más preferiblemente, cáncer colorrectal.

Otro aspecto tiene que ver con un método para detectar/diagnosticar cáncer en un paciente, que comprende un método de detección o amplificación como el aquí descrito. Adicionalmente, otro aspecto más de la presente invención corresponde a la predicción de la respuesta de un paciente a terapia con anticuerpos anti-EGFR, mediante la puesta en práctica de los métodos y kit de la presente invención.

Breve descripción de las figuras.

Figura 1.

La Figura 1 es un esquema que muestra la hibridación especifica del producto de amplificación obtenido con un cebador ARMS de la presente invención, correspondiente a la mutación V600E de BRAF, y la sonda especifica correspondiente. Como se indica en la figura, solo el producto ARMS de la mutación V600E de BRAF se une específicamente a la sonda correspondiente a V600E, mientras que el producto ARMS de V600K no lo hace. De manera similar, sólo el producto de amplificación de V600K se une específicamente a la sonda correspondiente a V600K, mientras que el producto ARMS de V600E no lo hace (no mostrado).

Figura2.

La Figura 2 muestra la visualización, en un gel de agarosa al 2%, de los productos de la amplificación ARMS Multiplex de las mutaciones V600E y V600K de BRAF, llevada a cabo con los cebadores ARMS y de amplificación de la presente invención, de acuerdo con el Ejemplo 1 (Multiplex 1), a partir de las muestras/lineas celulares/clones, correspondientes a las mutaciones V600E o V600K de BRAF, que se indican.

Figura 3.

La Figura 3 muestra la visualización de la hibridación, con una micromatriz que comprende las sondas de la presente invención, de los productos que resultan de la amplificación ARMS Multiplex llevada a cabo según el Ejemplo 1 de la presente invención. (a) Muestra que contiene la mutación de V600E de BRAF. P: marcador de posición; circuios: productos de la amplificación del IC/EC; cuadros: manchas correspondientes a la hibridación del producto de la amplificación ARMS Multiplex correspondiente a la mutación V600E de BRAF y su sonda especifica. (b) clon de 10e3 copias/5ul de la mutación V600K de BRAF. P: marcador de posición; circuios: los productos de la amplificación del IC/EC; rectángulos: manchas correspondientes a la hibridación del producto de la amplificación ARMS Multiplex correspondiente a la mutación V600K de BRAF, y su sonda especifica. Las manchas que llevan el nombre "P" corresponden al Marcador de posición; llaass mmaanncchhaass rodeadas por circuios corresponden a cualquiera de los productos de la amplificación de IC ó EC; las manchas rodeadas por cuadros (en (a)), corresponden a la unión especifica del producto de la amplificación ARMS de V600E de BRAF con sus sondas especificas; las manchas rodeadas por rectángulos (en (b)), corresponden a la unión especifica del producto de la amplificación ARMS de V600K de BRAF con sus sondas especificas. IC: testigo interno; EC: testigo de la extracción.

Figura4.

La Figura 4 muestra la visualización de la hibridación, con una micromatriz que comprende las sondas de la presente invención, de los productos que resultan de la amplificación ARMS Multiplex llevada a cabo según el Ejemplo 2 de la presente invención. (a) Linea celular HTC 116 que contiene la mutación H1047R de PI3K; (b) Muestra clínica que comprende la mutación de E542K de PI3K.

Las manchas marcadas como "P", corresponden al Marcador de posición; las manchas dentro de círculos corresponden a los productos de amplificación del IC o del EC; las manchas rodeadas de cuadros corresponden a la unión específica del producto de amplificación ARMS de H1047R de PI3K con sus sondas específicas (en (a)), o a la unión específica del producto de amplificación ARMS de E542K de PI3K con sus sondas específicas (en (b)).

Descripción detallada de la invención.

En los párrafos que se muestran a continuación, se definen en más detalle diferentes aspectos de la presente invención. Cada aspecto puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos, a no ser que claramente se indique lo contrario. En particular, cualquier aspecto catalogado como preferido o especialmente ventajoso puede combinarse con cualquier otro aspecto o aspectos preferidos o ventajosos.

Un primer aspecto de la presente invención es un método de detección de una o más mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, o de una o más mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, en una muestra que comprende ácidos nucleicos, donde el método consiste en: - someter a la muestra a una amplificación con una mezcla de amplificación que comprende uno o más cebadores ARMS, que se caracteriza en que cada cebador tiene una longitud de entre 36 y 50 nucleótidos, y comprende, en la posición 3' una secuencia específica de la diana seleccionada de entre ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 2, o ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, respectivamente, donde cada cebador comprende además, en posición 5', una secuencia marcadora diferente, no especifica de la diana, de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, donde la mezcla de amplificación comprende además uno o más cebadores de amplificación, y - detectar cualquier producto de amplificación que se obtenga, mediante hibridación de dicho producto con una o más sondas específicas, donde la sonda específica para cualquiera de las mutaciones de BRAF o PI3K híbrida específicamente con el producto, al menos en la región del producto correspondiente a la secuencia marcadora en la posición 5' , proporcionada por el cebador ARMS específico, correspondiente.

Un segundo aspecto de la presente invención corresponde a un kit para la detección de una o más de las mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, o de una o más de las mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, presentes en una muestra.

Específicamente, la invención se refiere a un kit para la detección de cualesquiera de esas mutaciones en una muestra a ensayar que comprende ácidos nucleicos, donde el kit comprende una o más mezclas de reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo cada mezcla: - uno o más cebadores ARMS caracterizados en que cada cebador tiene una longitud de entre 36 y 50 nucleótidos, comprendiendo una secuencia especifica de la diana en la posición 3' seleccionada de entre ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 2, ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, respectivamente, comprendiendo, además, cada cebador en la posición 5' una secuencia marcadora diferente, no especifica de la diana, de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, y - uno o más cebadores de amplificación, donde el kit incluye además una micromatriz con una o más sondas especificas inmovilizadas. Cada sonda especifica híbrida específicamente con la región del producto ARMS correspondiente, complementaria a la secuencia marcadora en 5' del cebador ARMS correspondiente.

Un tercer aspecto de la presente invención está relacionado con un método para amplificar un ácido nucleico en una muestra a ensayar, donde dicho ácido nucleico comprende una o más mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, o una o más mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, donde dicho método comprende poner en contacto dicha muestra con uno o más cebadores ARMS caracterizados en que cada cebador tiene una longitud total de entre 36 y 50 nucleótidos, y comprende una secuencia especifica de la diana en posición 3' seleccionada de entre la ID SEC NO: ?, ID SEC NO: 2, ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, respectivamente, comprendiendo, además, cada cebador, en posición 5', una secuencia marcadora diferente no especifica de la diana, de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, donde la mezcla de amplificación comprende además uno o más cebadores de amplificación.

Preferiblemente: cada cebador ARMS tiene una longitud total de entre 39 y 47 nucleótidos; la secuencia especifica de diana en posición 3' tiene una longitud de entre 21 y 30 nucleótidos; la secuencia marcadora en la posición 5' tiene una longitud de entre 17 y 19 nucleótidos; la sonda de detección una longitud de entre 18 y 38 nucleótidos.

En una modalidad de los métodos o kits antes descritos, el método o kit se refiere a la detección o amplificación de una o más mutaciones de BRAF, seleccionadas de V600E y V600K. En otra modalidad, el método o kit se relaciona con la detección o amplificación de una o más mutaciones de PI3K seleccionadas de E542K, E545D, E545K y H1047R, por ejemplo, es posible detectar o amplificar una sola mutación seleccionada de E542K, E545D, E545K y H1047R, o se puede detectar o amplificar cualquier combinación de dos o más mutaciones seleccionadas de E542K, E545D, E545K y H1047R, o se pueden detectar o amplificar todas las mutaciones E542K, E545D, E545K y H1047R. En otra modalidad, es posible detectar o amplificar una o más mutaciones de BRAF seleccionadas de V600E y V600K, y una o más mutaciones de PI3K seleccionadas de E542K, E545D, E545K y H1047R. Las mutaciones V600E y/o V600K pueden ser combinadas con una o más de las mutaciones E542K, E545D, E545K y H1047R. En una modalidad, se detectan o amplifican todas las mutaciones V600E, V600K, E542K, E545D, E545K y H1047R.

De acuerdo con los métodos y kit de la presente invención, además de los cebadores ARMS y de amplificación, cualesquiera otros componentes adicionales conocidos por la persona experta en la materia como necesarios para la amplificación de ácidos nucleicos, y en particular, para la amplificación PCR, podrán estar también presentes en la mezcla de amplificación. Asi, una DNA polimerasa y dNTPs, podrán estar también presentes en la mezcla de amplificación.

Preferiblemente, el producto de amplificación se transforma en DNA de cadena sencilla, previamente a la hibridación con la sonda correspondiente. Más preferiblemente, el DNA de cadena sencilla se obtiene mediante desnaturalización del producto de amplificación, más preferiblemente, mediante desnaturalización por calor. La sonda híbrida específicamente con la región del producto complementaria a la secuencia marcadora en 5' del cebador ARMS específico. Preferiblemente, las sondas están comprendidas en una micromatriz, y más preferiblemente, se encuentran inmovilizadas en un soporte sólido.

Definiciones: "Cebador" significa cebador de una reacción de amplificación de ácidos nucleicos.

A lo largo de la presente descripción, a no ser que se indique lo contrario, el término "cebadores ARMS" se refiere a los cebadores de amplificación específicos de la mutación de BRAF y PI3K, diseñados en su extremo 3' de acuerdo con el método de amplificación ARMS, y comprendiendo en 5' una secuencia no especifica de la diana; y el término "cebadores de amplificación" se refiere a los cebadores que se combinan con los cebadores ARMS para la amplificación del DNA diana.

Los cebadores ARMS que se usan en los distintos aspectos de la presente invención, se pueden representar como se muestra en la Tabla 1 de más arriba, donde también se indican las características de la secuencia marcadora en 5' o marcador.

El marcador confiere al producto de amplificación la especificidad.

Preferiblemente, el marcador en 5' se puede seleccionar de entre una de las siguientes secuencias: ID SEC NO: 6, ID SEC NO: 7, ID SEC NO: 22, ID SEC NO: 23, ID SEC NO: 24 e ID SEC NO: 25.

Una modalidad particular de estos aspectos de la invención consiste en la amplificación de una o más mutaciones de BRAF y/o de PI3K, con uno o más cebadores ARMS del grupo compuesto por ID SEC NO: 3, ID SEC NO: 4, ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 e ID SEC NO: 19: GATTAGCGCAGTGCACTACGGTGATTTTGGTCTAGCTTCAGA (ID SEC NO: 3) (V600E de BRAF) AGATCGTTATCAATCGCATGGTGATTTTGGTCTAGCTACTAA (ID SEC NO: 4) (V600K de BRAF) AGACCTTAGCATAGCTTAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTGTCTA (ID SEC NO: 16) (E542K de PI3K) ACTATAGCCGAGTACGGCCCTCTCTCTGAAATCAGTGAT (ID SEC NO: 17) (E545D de PI3K) TAACTGGCTATCCGGAGGATCCTCTCTCTGAAATCAGTA (ID SEC NO: 18) (E545K de PI3K) CGATATGATATGCTAGTTGAAACAAATGAATGATGCTCGT (ID SEC NO: 19) (H1047R de PI3K).

Los nucleótidos en negritas corresponden al marcador en 5'.

Como cebador de amplificación, puede usarse cualquier cebador que, al combinarse con uno o más de los cebadores ARMS de más arriba para llevar a cabo la amplificación, genere productos de amplificación de 1000 pb de longitud o más cortos. En una modalidad particular, el cebador de amplificación que se combina con los cebadores ARMS de más arriba, genera productos de amplificación de 500 pb o más cortos; en otra modalidad preferida, de alrededor de 200 pb, y más preferiblemente, de entre 200 y 100 pb. De manera preferente, el cebador de amplificación tendrá una longitud de entre 18 y 24 nucleótidos, y más preferentemente, de entre 21 y 22 nucleótidos.

Preferiblemente, un cebador de amplificación que comprende ID SEC NO: 5, y más preferiblemente, un cebador de amplificación que consiste en ID SEC NO: 5, se usa en combinación de uno o más de los cebadores ARMS siguientes: - Un cebador de entre 36 y 50 nucleótidos, que comprende en posición 3' una secuencia especifica de la diana seleccionada de entre ID SEC NO: 1 e ID SEC NO: 2, donde el cebador comprende, además, en el extremo 5' una secuencia marcadora no especifica de la diana de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud; asi como - cebadores de ID SEC NO: 3 e ID SEC NO: 4.

También, preferiblemente, un cebador de amplificación que comprende ID SEC NO: 20, y más preferiblemente, un cebador de amplificación que consiste en ID SEC NO: 20, se usa en combinación con uno o más de los cebadores ARMS siguientes: - Un cebador de entre 36 y 50 nucleótidos, que comprende en posición 3' una secuencia especifica de la diana seleccionada de entre ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13 e ID SEC NO: 14, donde el cebador comprende, además, en el extremo 5' una secuencia marcadora no especifica de la diana de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud; así como - cebadores de ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17 e ID SEC NO: 18.

También, preferiblemente, un cebador de amplificación que comprende ID SEC NO: 21, y más preferiblemente, un cebador de amplificación que consiste en ID SEC NO: 21, se usa en combinación con uno o más de los cebadores ARMS siguientes: - Un cebador de entre 36 y 50 nucleótidos, que comprende en posición 3' una secuencia específica de diana ID SEC NO: 15, donde el cebador comprende, además, en el extremo 5', una secuencia marcadora no específica de la diana de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud; así como - un cebador de ID SEC NO: 19.

En un aspecto preferido, toda sonda de detección específica tendrá una longitud de entre 15 y 45 nucleótidos, siendo la región que híbrida específicamente con el producto ARMS correspondiente en la región correspondiente al marcador en 5', de entre 15 y 20 nucleótidos. Cada sonda puede comprender además nucleótidos adicionales, tanto en el extremo 5' y/o en el 3', hasta una longitud total de sonda de entre 15 y 45 nucleótidos.

Preferiblemente, las sondas especificas para la detección de las mutaciones de BRAF, V600E y V600K, o de cualquiera de las mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R, comprenden, respectivamente, las secuencias nucleotidicas ID SEC NO: 6, ID SEC NO: 7, ID SEC NO: 22, ID SEC NO: 23, ID SEC NO: 24 e ID SEC NO: 25.

Para detectar cada mutación de BRAF o PI3K se pueden emplear una o más sondas diferentes.

Las sondas más preferidas para cada una de las mutaciones se muestran en la Tabla 2: En particular, las sondas se encuentran inmovilizadas en una micromatriz. Una micromatriz es un conjunto de manchas microscópicas de oligonucleótidos. Una micromatriz de DNA (también llamado comúnmente "chip" genético, "chip" de DNA o "biochip") es una colección de manchas microscópicas de DNA unidas a una superficie sólida. Las sondas se sintetizan y luego se fijan a una superficie sólida mediante ingeniería de superficie, mediante unión covalente a una matriz química (vía epoxi-silano, amino-silano, lisina, poliacrilamida u otros). Las superficies sólidas son conocidas en el estado de la téenica, e incluyen palas microscópicas, así como soportes sólidos.

En particular, las sondas de la presente invención se pueden inmovilizar sobre un soporte sólido.

Así, además de la mezcla de reactivos para la amplificación, el kit de la presente invención comprende una micromatriz donde se encuentran inmovilizadas una o más sondas que hibridan específicamente a uno o más productos obtenidos a partir de las mutaciones de BRAF o PI3K.

En los métodos y kit de la presente invención se pueden incluir uno o más controles o testigos.

Preferiblemente, en la mezcla de amplificación se puede incluir un par de cebadores de amplificación, correspondientes a cualquier gen humano constitutivo y ubicuo conocido para el experto en la materia. De manera preferente, se utilizan cebadores correspondientes al gen de b-actina. La amplificación con tal par de cebadores permite confirmar la correcta extracción de los ácidos nucleicos presentes en la muestra a ensayar, y constituye el "Testigo endógeno" o "Testigo de Extracción". De manera adicional, en la mezcla de amplificación preferiblemente se incluyen además, un plásmido de DNA y un par de cebadores con capacidad para amplificarlo, los cuales constituyen el "Testigo de amplificación" o "Testigo Interno". Preferiblemente, la micromatriz puede incluir una o más sondas testigo con capacidad para hibridar con cualquier secuencia de DNA testigo, en particular con los productos de los testigos de extracción y amplificación. Preferiblemente, el kit de la presente invención comprende además reactivos para la visualización de la hibridación entre cualquier producto de amplificación, y la micromatriz de sondas.

Otro aspecto de la presente invención, corresponde a uno o más cebadores ARMS, de longitud entre 36 y 50 nucleótidos, el cual se caracteriza por que cada cebador comprende, en su extremo 3', una secuencia especifica de la diana de BRAF seleccionada de entre ID SEC NO: 1 e ID SEC NO: 2, o una secuencia especifica de la diana de PI3K seleccionada de entre ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, comprendiendo, además, cada cebador, una secuencia marcadora no especifica de la diana, en su extremo 5', de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud. Preferiblemente, los marcadores en posición 5' de los cebadores ARMS contienen 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 nucleótidos. Especialmente preferidos son los cebadores ARMS seleccionados del grupo que comprende ID SEC NO: [lacuna] ID SEC NO: 3, ID SEC NO: 4, ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 e ID SEC NO: 19.

También otro aspecto más de la presente invención corresponde al uso de los métodos aquí descritos, o del kit aquí descrito, o de los cebadores aquí descritos, para el diagnóstico y/o pronóstico de una condición patológica en un paciente, en particular, de cáncer, asi como para la predicción de la respuesta de un paciente a la terapia con anticuerpos anti-EGFR.

La invención también se refiere a un método in vitro para diagnosticar a un individuo o valorar a un individuo para una quimioterapia apropiada, el método consiste en: i) proporcionar una muestra de tumor del individuo ii) determinar si está presente en la muestra una mutación de BRAF y/o PI3K empleando los métodos que se describen en la presente.

El paso (ii) anterior, por tanto, consiste en detectar una o más mutaciones de BRAF seleccionadas de V600E y V600K, o una o más mutaciones de PI3K, seleccionadas de E542K, E545D, E545K y H1047R, en donde el método comprende los pasos de: someter dicha muestra de tumor que contiene ácidos nucleicos a la amplificación con una mezcla de amplificación que contenga uno o más cebadores ARMS, caracterizada porque cada cebador ARMS tiene una longitud total de entre 36 y 50 nucleótidos, y contiene una secuencia especifica de la diana en la posición 3' seleccionada de la ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 2, ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, respectivamente. Cada cebador ARMS contiene en el extremo 5' una secuencia marcadora, no especifica de la diana, diferente, de entre 15 y 20 nucleótidos.

La mezcla de amplificación además contiene uno o más cebadores de amplificación; y - detectar cualquier producto de la amplificación que se obtenga, mediante la hibridación de cualquiera de estos productos con una o más sondas, en donde cada sonda híbrida específicamente con la región del producto de la amplificación correspondiente a la secuencia marcadora del extremo 5' del cebador ARMS correspondiente.

Las modalidades preferidas de los cebadores que pueden utilizarse se mencionan en otra parte de la presente.

En una modalidad, otro paso consiste en la selección de un tratamiento adecuado correlacionado con la presencia o ausencia de una mutación de BRAF o PI3K.

En una modalidad particular, los tipos de muestra que se pueden procesar en el marco de la presente invención, son hisopos, biopsias incrustadas en parafina, sangre, esputo, lavado de colon, lavado bronquial, así como fluidos salinos, plasma y líquido cerebroespinal, así como cualquier otro fluido corporal, o tejido, que se pueda obtener de un individuo. El individuo es un humano. La muestra a ensayar puede ser, asimismo, una secuencia de ácido nucleico correspondiente a la secuencia presente en la muestra a ensayar. Toda o parte de la región de interés presente en la muestra de ácido nucleico puede ser amplificada previamente a su uso en el método de la presente invención, mediante cualquier téenica apropiada para ello, como por ejemplo, la PCR.

En otra modalidad preferida, se puede llevar a cabo la extracción del material genético de la muestra, mediante técnicas de extracción tanto automáticas como manuales, conocidas en el estado de la técnica.

Un método de extracción de DNA especialmente preferido a partir de tejidos y otras muestras, es EZ1® DNA Tissue Kit de QIAGEN. También se prefiere especialmente el producto de QIAGEN AllPrep® DNA/RNA FFPE, que tiene como finalidad la purificación simultánea de DNA genómico y RNA total, a partir de secciones de tejido incrustadas en parafina y fijadas en formalina.

Igualmente se pueden usar cualesquiera otras técnicas y métodos de procesamiento manual o automático de muestras, para la extracción de DNA y otros ácidos nucleicos, conocidos por el experto en la materia.

En una modalidad particular de la presente invención, el recipiente donde tiene lugar el método de la presente invención comprende, además de uno o más cebadores ARMS y el cebador o cebadores de amplificación, otros componentes para la amplificación del DNA presente en la muestra. En particular, se incluyen también en la mezcla de reactivos de amplificación, los trifosfatos de nucleótidos apropiados, como dATP, dCTP, dGTP, dTTP, y una enzima adecuada para la polimerización.

Se puede emplear cualquier enzima adecuada para la polimerización. En particular, cualquier DNA polimerasa con capacidad para discriminar en cierta medida, entre secuencias molde normales y mutantes. Entre los ejemplos de enzimas adecuadas se incluyen las enzimas termoestables sin actividad exonucleasa 3'-5' significativa, y con velocidades de polimerización de alrededor de 10 nucleótidos/segundo, lo cual permite obtener fragmentos de amplificación de 600-1000pb en etapas de extensión normales. Preferentemente, se puede usar la DNA Polimerasa HotStarTaq de QIAGEN. Asimismo, se puede usar cualquier otra enzima de estas características que se conozca en el estado de la téenica. Por ejemplo, la DNA polimerasa "Ampli Taq Gold" de PE Applied Biosystems.

La amplificación ARMS de las diferentes mutaciones de la presente invención, puede ser llevada a cabo tanto de manera individual, como en una reacción de amplificación Multiplex de dos o más mutaciones. En ambos casos, para la amplificación ARMS asociada a los métodos y kits de la presente invención, se utiliza de manera preferente el kit "Multiplex PCR Kit" de QIAGEN.

El método de la presente invención puede llevarse a cabo en uno o más recipientes de reacción, cada uno de los cuales comprende al menos un cebador ARMS y un cebador de amplificación, junto con otros reactivos necesarios para la amplificación.

El agente y condiciones de polimerización adecuados podrán ser seleccionados por el experto en la materia. Para la amplificación de las mutaciones de acuerdo con la presente invención, se pueden emplear condiciones estándar de termocielado.

Unas condiciones de termociclado que han demostrado funcionar particularmente bien con muestras, y que pueden utilizarse de acuerdo con las diferentes modalidades de la invención, son las siguientes: Cualquier combinación posible de los cebadores ARMS de la presente invención, puede ser usada para la amplificación y detección Multiplex de una o más de las mutaciones de BRAF y PI3K presentes en una muestra.

Asi, el recipiente de reacción donde tiene lugar el método de la presente invención, puede contener 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 de los cebadores ARMS de la Tabla 1, o de los cebadores seleccionados de entre ID SEC NO: 3, ID SEC NO: 4, ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 e ID SEC NO: 19, asi como uno o más cebadores de amplificación que puedan combinarse con dichos cebadores, para la amplificación de una o más mutaciones de BRAF y PI3K presentes en una muestra.

En la mezcla de amplificación se pueden incluir también pares de cebadores adicionales, preferiblemente los correspondientes a los testigos de extracción y/o internos y/o pares de cebadores para la amplificación de otras mutaciones.

Algunas combinaciones de cebadores ARMS especialmente preferidas son mezclas de cebadores que comprenden: - cebadores ARMS de ID SEC NO: 3 (V600E de BRAF) e ID SEC NO: 4 (V600K de BRAF) (Componentes de la Mezcla de Amplificación 1); - cebadores ARMS de ID SEC NO: 16 (E542K de PI3K) e ID SEC NO: 19 (H1047R de PI3K) (Componentes de la Mezcla de Amplificación 2); - cebadores ARMS de ID SEC NO: 17 (E545D de PI3K) e ID SEC NO: 18 (E545K de PI3K) (Componentes de la Mezcla de Amplificación 3); - cebadores ARMS de ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 e ID SEC NO: 19 (E542K de PI3K, E545D de PI3K, E545K de PI3K y H1047R de PI3K, respectivamente) (Componentes de la Mezcla de Amplificación 4).

Algunas combinaciones de cebadores ARMS y de amplificación, especialmente preferidas comprenden: - cebador ARMS de ID SEC NO: 3 (V600E de BRAF), el cebador ARMS de ID SEC NO: 4 (V600K de BRAF), el cebador de amplificación de ID SEC NO: 5 (cebador de Amplificación común para los cebadores ARMS de ID SEC NO: 3 e ID SEC NO: 4) (Componentes de la Mezcla de Amplificación 1); - cebadores ARMS de ID SEC NO: 16 (E542K de PI3K) e ID SEC NO: 19 (H1047R de PI3K), los cebadores de amplificación de ID SEC NO: 20 e ID SEC NO: 21 (cebadores de amplificación correspondientes a cebadores ARMS de ID SEC NO: 16 e ID SEC NO: 19, respectivamente) (Componentes de la Mezcla de Amplificación 2); - cebadores ARMS de ID SEC NO: 17 (E545D de PI3K) e ID SEC NO: 18 (E545K de PI3K) y el cebador de amplificación de ID SEC NO: 20 (cebador de amplificación común a los cebadores ARMS de ID SEC NO: 17 e ID SEC NO: 18) (Componentes de la Mezcla de Amplificación 3); - cebadores ARMS de ID SEC NO: 16 (E542K de PI3K), ID SEC NO: 17 (E545D de PI3K), ID SEC NO: 18 (E545K de PI3K) e ID SEC NO: 19 (H1047R de PI3K), los cebadores de amplificación de ID SEC NO: 20 (cebador de amplificación común a los cebadores ARMS de ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17 e ID SEC NO: 18) e ID SEC NO: 21 (cebador de amplificación para el cebador ARMS de ID SEC NO: 19) (Componentes de la Mezcla de Amplificación 4).

El resto de componentes de las distintas mezclas de amplificación incluyen una DNA polimerasa, dNTPs y cualquier otro componente necesario para que tenga lugar la amplificación. Asimismo, las distintas mezclas de amplificación pueden contener adicionalmente cebadores de avance y retroceso para la amplificación de los testigos interno y de extracción, asi como pares de cebadores para la amplificación de otras mutaciones.

El método de la presente invención permite detectar fácilmente cantidades de DNA con mutación de BRAF y PI3K de entre 1 ng y 1 pg. En particular, el método de la presente invención ha demostrado que permite detectar sin problema 5 mL de una linea celular con 200 ng/mL de DNA con mutación de BRAF o PI3K, asi como diluciones seriadas del mismo de hasta 0.2 ng/pL. El limite de detección del kit de la presente invención es de 1,000 copias de BRAF o PI3K mutado en 5 pL de muestra. El valor de la sensibilidad de detección del kit para las distintas mutaciones de BRAF o PI3K es de 1%. En cuanto a los parámetros diagnósticos, el valor de Sensibilidad Diagnostica del kit de la presente invención para las mutaciones de BRAF y PI3K es superior al 98%.

Durante la amplificación ARMS se puede introducir un etiquetado en el producto de la amplificación del DNA, que permita su posterior detección; en particular, una etiqueta que genere una señal que pueda ser detectada por métodos colorimétricos, por métodos fluorescentes, o bien cualquier otra forma de mareaje conocida en el estado de la téenica. La etiqueta puede ser un agente radiactivo, quimioluminiscente, luminiscente y fluorescente. Preferiblemente, la etiqueta empleada es biotina. Sin embargo, también se puede usar cualquier otro tipo de etiqueta conocido en el estado de la téenica (p. ej., digoxigenina). En una modalidad preferida, al menos uno de los cebadores que se usan estará marcado en posición 5' con biotina. Preferiblemente, se etiqueta el cebador de amplificación. Además, el etiquetado del DNA amplificado se puede conseguir alternativamente mediante adición a la mezcla de PCR de nucleótidos modificados portadores de la etiqueta (p. ej., derivados de dUTP biotilinados o etiquetados con digoxigenina). En algunas modalidades se podrán usar etiquetas radiactivas, asi como fluoróforos.

También se pueden usar métodos alternativos conocidos por el experto en la materia, que permitan la detección de la interacción entre cualquier producto de amplificación y su sonda correspondiente, incluyendo métodos que impliquen el etiquetado de la sonda. En una modalidad preferida de la presente invención, los productos de amplificación, previamente desnaturalizados, se incuban con sondas especificas de la diana que hibridan con dichos productos, al menos, en la región correspondiente al marcador de los nucleótidos en posición 5' proporcionado por el cebador especifico.

Preferiblemente, la desnaturalización del DNA amplificado se lleva a cabo mediante calentamiento. También se pueden usar otros métodos de obtención de DNA de cadena sencilla después de la amplificación; por ejemplo, métodos químicos.

En un aspecto preferido, la muestra a analizar que comprende ácidos nucleicos, se divide en dos o más alícuotas, donde: - una de las alícuotas se somete a amplificación con una mezcla que comprende los cebadores de ID SEC NO: 3, ID SEC NO: 4 e ID SEC NO: 5 (Mezcla de Amplificación 1); - otra alícuota se somete a amplificación con una mezcla que comprende los cebadores de ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 19, ID SEC NO: 20 e ID SEC NO: 21 (Mezcla de Amplificación 2); y - otra alícuota se somete a amplificación con una mezcla que comprende los cebadores de ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 e ID SEC NO: 20 (Mezcla de Amplificación 3), o bien - una de las alícuotas se somete a amplificación con la Mezcla 1 indicada más arriba; y - otra alícuota se somete a amplificación con una mezcla que comprende los cebadores de ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18, ID SEC NO: 19, ID SEC NO: 20 e ID SEC NO: 21 (Mezcla de Amplificación 4).

El método también comprende la desnaturalización de cualquier producto de amplificación que se obtenga, y su posterior hibridación con una micromatriz que comprende una o más de las sondas seleccionadas de entre ID SEC NO: 8, ID SEC NO: 9, ID SEC NO: 10, ID SEC NO: 11, ID SEC NO: 26, ID SEC NO: 27, ID SEC NO: 28 e ID SEC NO: 29.

En una modalidad preferida de la presente invención, las sondas de detección de los productos de amplificación, forman parte de una micromatriz. La teenología de micromatrices hace posible la detección simultánea de diferentes productos de amplificación, correspondientes a una o más de las mutaciones presentes en una muestra, en presencia de los testigos necesarios para garantizar la fiabilidad de los resultados.

En una modalidad preferida de la presente invención, el DNA de cadena sencilla que se obtiene a partir de uno o más productos de amplificación, se incuba con un conjunto de sondas especificas de la diana dispuestas en una micromatriz. Al menos una, pero preferiblemente más de una sonda con capacidad para hibridar con cada secuencia diana, están presentes en la micromatriz. En ciertas modalidades de la presente invención, el DNA de cadena sencilla puede incubarse con sondas específicas de la diana en solución No obstante, preferiblemente sondas estarán dispuestas en una micromatriz.

En la presente invención, se describen sondas contenidas en una micromatriz, el cual puede encontrarse formando parte de un portaobjetos, o bien de un recipiente de reacción, el cual entonces recibe el nombre de "recipiente de la matriz". Los "recipientes de la matriz" pueden tener distintos formatos de presentación, los cuales incluyen "recipientes de la matriz" individuales, como pocilios o tubos, o bien conjuntos de "recipientes de la matriz" dispuestos en tiras de pocilios o tubos, o bien en forma de placas. Normalmente, las placas están formadas por conjuntos de tiras de "recipientes de la matriz". Asi, la micromatriz de la presente invención puede encontrarse contenido en un "recipiente de la matriz" individual. Alternativamente, dos o más micromatrices pueden encontrarse contenidos en una tira de "recipientes de la matriz". Preferiblemente, la tira de "recipientes de la matriz" está formada por 8 "recipientes de la matriz". Además, tres o más "recipientes de la matriz" pueden disponerse a modo de conjunto de tiras de recipientes. En otra modalidad preferida, dicho conjunto es una placa de microtitulación . En otra modalidad preferida más, la placa de microtitulación está compuesta por 96 "recipientes de la matriz".

En modalidades preferidas de la presente invención, las sondas de la micromatriz pueden estar inmovilizadas en un soporte sólido, el cual puede ser el mismo fondo del "recipiente de la matriz", o bien un soporte sólido diferente del fondo del "recipiente de la matriz", fijado al mismo. Esto significa que la superficie de la micromatriz puede ser el fondo liso del "recipiente de la matriz". 0, alternativamente, que la superficie de la micromatriz pueda ser un soporte sólido unido al fondo del "recipiente de la matriz".

En una modalidad de la presente invención, el recipiente de reacción tiene el tamaño típico de los recipientes de reacción de laboratorio. Los volúmenes típicos de dichos recipientes están en el rango de 100 ml a 2.5 mL, pero también pueden ser menores o mayores en modalidades concretas. El recipiente de reacción puede tener el volumen normal de llenado para un tubo Eppendorf estándar de hasta 1.5 mL. Otros volúmenes también preferidos pueden ser de hasta 0.4 mL, hasta 0.5 mL, hasta 0.7 mL, hasta 1.0 mL o hasta 2.0 mL.

Debido a que el DNA amplificado está etiquetado en el lugar en que las moléculas a analizar interaccionen con moléculas de la sonda en la superficie de la micromatriz, un reactivo "indicador" se unirá a la etiqueta, y generará señales visibles que podrán ser detectadas por un dispositivo de detección.

Las moléculas de la sonda y de la muestra que interaccionen serán identificadas gracias a la localización de la señal correspondiente en la superficie de la micromatriz. En el caso particular de que los productos de amplificación de la muestra estén etiquetados con biotina, el agente indicador podrá ser "peroxidasa de rábano" unida covalentemente a estreptavidina. Esta última se une específicamente a la biotina, y, a su vez, la peroxidasa promueve la precipitación de sustratos como tetrametilbencidina (TMB).

De igual forma, se puede hacer uso de cualquier otra reacción que conduzca a la formación de un precipitado en los elementos del arreglo, y que pueda emplearse para detectar la interacción entre moléculas diana y sonda correspondientes, de acuerdo con la presente invención. Asimismo, cualquier otro método de detección conocido en el estado de la teenica, como por ejemplo, fluorescencia, puede ser usado para la detección de la interacción entre los productos de amplificación y las sondas correspondientes. El método concreto dependerá del etiquetado exacto que se haya empleado para los productos de la amplificación.

Las sondas de la presente invención pueden obtenerse mediante distintos métodos, tales como sintesis química (por ejemplo, mediante el método convencional del "fosfotriester"); o técnicas de ingeniería genética como por ejemplo, el clonaje molecular de plásmidos recombinantes que llevan insertas las secuencias nucleotídicas de interés, las cuales se pueden obtener posteriormente mediante digestión con nucleasas.

Sondas individuales, o mezclas de sondas específicas para cada mutación, pueden inmovilizarse en una sola posición del soporte sólido, en dos posiciones diferentes de dicho soporte, así como en tres o más posiciones diferentes del mismo.

Además, puede haber una o más sondas testigo en distintas posiciones.

De manera preferida, la visualización de la interacción entre los productos de amplificación y sus correspondientes sondas especificas o sondas testigo, consistirá en los siguientes pasos: - Primero, se captura la imagen del arreglo, por medio del uso de un dispositivo óptico; - A continuación, se analiza la imagen; Finalmente, se genera un informe que contiene la interpretación del resultado.

Preferiblemente, la imagen se analiza mediante el uso de un software apropiado. Para ello se podrá emplear cualquier dispositivo adecuado para el procesamiento.

La detección de las mutaciones de BRAF y PI3K con el método de la presente invención es compatible con la detección de otras mutaciones en esos mismos genes, asi como de mutaciones en otros genes relevantes en cáncer.

De hecho, el método de la presente invención puede combinarse con otros métodos de detección de mutaciones, ya sean en los genes BRAF y PI3K y/o en otros genes relevantes en cáncer, para llevar a cabo un completo diagnostico y/o pronóstico del cáncer.

El método de detección de las 2 mutaciones de BRAF, V600E y V600K, o de las 4 mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R de la presente invención, puede también ser aplicado a cualquier patología y muestra, sospechosas de correlacionarse con mutaciones de BRAF o PI3K.

Los ejemplos que se muestran a continuación simplemente sirven para ilustrar la presente invención, y en ningún modo limitan el ámbito de protección de las reivindicaciones de la misma.

Ejemplos.

Ejemplo 1: Se preparó la siguiente mezcla de reactivos, para la amplificación ARMS Multiplex de las mutaciones de BRAF, V600E y V600K, en muestras/líneas celulares/clones: Se adicionaron seguidamente, 5 mL de un total de 30 pL de eluido obtenido a partir de muestras de tejido incrustado en parafina (muestra), o bien de diferentes líneas celulares o clones, hasta un volumen final de reacción de 50 pL.

Las condiciones de termocielado empleadas para la PCR fueron: Los resultados de la amplificación ARMS Multiplex correspondiente a BRAF se muestran en la Figura 2 y Figura 3.

Los diferentes productos ARMS de las muestras/clones o líneas celulares que se indican en la Tabla 3 de la Figura 2, se visualizaron en un gel de agarosa al 2%, en el cual se analizaron los productos de las diferentes reacciones de amplificación.

La longitud de los diferentes productos de amplificación es la siguiente: Longitud de la banda especifica de la mutación correspondiente a las mutaciones V600E y V600K: 144pb; Longitud de la banda de IC: lOlpb (producto de amplificación del gen de la beta-actina); Longitud de la banda de EC: 112pb (producto de amplificación del plásmido ppg25).

A pesar del hecho de gue la longitud de los diferentes productos de amplificación es similar, se pueden apreciar diferencias entre los pocilios que contienen alguna banda especifica de la mutación junto con las bandas testigo, y los pocilios que únicamente contienen las bandas testigo. Esta diferencia es debida al producto de amplificación especifico de la mutación.

En estos experimentos se ha comprobado que la amplificación ARMS sólo tiene lugar cuando la muestra que se somete a amplificación es la de una muestra/clon/linea celular, correspondiente a una de las mutaciones para las que se han incluido cebadores ARMS en la mezcla de reactivos para la amplificación Multiplex .

Se ha confirmado por secuenciación de DNA, que los productos ARMS que se obtienen en cada pocilio resultan efectivamente de la amplificación especifica de cada muestra/clon/linea celular con el primer ARMS correspondiente. La amplificación ARMS en cada Multiplex es especifica.

Se ha podido confirmar que pequeñas variaciones en el número de ciclos de amplificación (2-3 ciclos de amplificación adicionales, o menos) no modifican los resultados que se obtienen.

Los diferentes productos de amplificación ARMS Multiplex se desnaturalizaron e hibridaron con micromatrices de sondas. La visualización de los resultados correspondientes se muestra en la Figura 3.

Ejemplo 2.

A continuación se muestra la composición de las Mezclas de Amplificación 2 y 3 para PI3K. El resto de condiciones de reacción son las mismas que las mostradas en el Ejemplo 1 para BRAF.

Los resultados obtenidos a partir de 5 de la linea celular HTC 116 (0.2 ng/pL) que contiene la mutación de PI3K, H1047R (a), o de 5 mL de una muestra clínica que contiene DNA a una concentración de 20 ng/pL (b), tras las respectivas amplificaciones con los reactivos de la Mezcla de Amplificación 2, y posterior hibridación de los productos obtenidos con una micromatriz de sondas, y posterior visualización, se muestran en las Figuras 4a) y 4b), respectivamente.

Ejemplo 3: La inclusión en las Mezclas de Amplificación, de los cebadores de avance y retroceso necesarios para la amplificación del Testigo interno y del Testigo de Extracción, asi como de un plásmido como el pBSK con inserto, también necesario para la amplificación del Testigo Interno, en las concentraciones que se muestran más abajo, no altera los resultados que se obtienen: IC: Testigo Interno; EC: Testigo de Extracción.

Listado de secuencias ID SEC NO: 1 Secuencia del extremo 3' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de BRAF, V600E, siendo la secuencia especifica de la diana ggtgatfflggtctagcttcaga ID SEC NO: 2 Secuencia del extremo 3' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de BRAF, V600K, siendo la secuencia especifica de la diana ggtgattttggtctagctactaa ID SEC NO: 3 Cebador ARMS para la amplificación de la mutación de ID SEC NO: 4 Cebador ARMS para la amplificación de la mutación de BRAF, V600K agatcgttat caatcgcatg gigattítgg tctagctact aa ID SEC NO: 5 Cebador de amplificación que se utiliza en combinación con cualesquiera de los siguientes: Cebadores ARMS que comprenden la ID SEC NO: 1 y 2, ó Cebadores ARMS que consisten en la ID SEC NO: 3 y 4. ggccaaaaatttaatcagigga ID SEC NO: 6 Secuencia del extremo 5' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de BRAF, V600E, siendo la secuencia no especifica de la diana. Esta secuencia también está presente en la sonda de detección de la mutación de BRAF, V600E. gattagcgcagtgeactae ID SEC NO: 7 Secuencia del extremo 5' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de BRAF, V600K, siendo la secuencia no especifica de la diana. Esta secuencia también está presente en la sonda de detección de la mutación de BRAF, V600K. agategttatcaatcgeat ID SEC NO: 8 Sonda para la detección del producto de la amplificación ARMS de la mutación de BRAF, V600E cggg lací;cqí3ípcjl :c}4ttaí|cyC icjt dactac ID SEC NO : 9 Sonda para la detección del producto de la amplificación ARMS de la mutación de BRAF, V600K aggtegiíaftaaicgcatggtga! ID SEC NO: 10 Sonda para la detección del producto de la amplificación ARMS de la mutación de BRAF, V600K cgggttacccgggagaicgttatcaatcgcai ID SEC NO : 11 Sonda para la detección del producto de la amplificación ARMS de la mutación de BRAF, V600K cgggttacccgggagteicagatcgttatcaatcgcat ID SEC NO : 12 Secuencia del extremo 3' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, E542K, siendo la secuencia especifica de la diana aagcaatttctacacgagatcctctgt a ID SEC NO: 13 Secuencia del extremo 3' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, E545D, siendo la secuencia especifica de la diana cctctctctgaaatcagtgat ID SEC NO: 14 Secuencia del extremo 3' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, E545K, siendo la secuencia especifica de la diana gaícctctctcigaaaicagta ID SEC NO: 15 Secuencia del extremo 3' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, H1047R, siendo la secuencia especifica de la diana gaaacaaatgaatgatgctcgt ID SEC NO: 16 Cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, E542K agaocttagcatagcttaagcaatttctacacgagalcctctglcla ID SEC NO: 17 Cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, E545D actatagccgagtacggceetctctctgaaalcagtgat ID SEC NO: 18 Cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, E545K taactggctateeggaggatcetctctctgaaatcagta ID SEC NO: 19 Cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, H1047R cgatatgatatgctagtlgaaacaaatgaaígatgctcgt ID SEC NO: 20 Cebador de amplificación que se utiliza en combinación con cualquiera de los cebadores ARMS que comprende la ID SEC NO: 12, 13 y 14, o los cebadores ARMS consistentes en la ID SEC NO: 16, 17 y 18.

ACrilyctgHycitCrjyctariat ID SEC NO: 21 Cebador de amplificación que se utiliza en combinación con cualquiera de los cebadores ARMS que comprende la ID SEC NO: 15, o el cebador ARMS consistente en la ID SEC NO: 19. tggaatccagagtgagctttc ID SEC NO: 22 Secuencia del extremo 5' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación PIK3CA, E542K; siendo la secuencia no especifica de la diana. Esta secuencia también está presente en la sonda de detección de la mutación de PIK3CA, E542K agaccttagcatagctt ID SEC NO: 23 Secuencia del extremo 5' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, E545D; siendo la secuencia no especifica de la diana. Esta secuencia también está presente en la sonda de detección de la mutación de PIK3CA, E545D actatagccgagtacggc ID SEC NO: 24 Secuencia del extremo 5' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, E545K; siendo la secuencia no especifica de la diana. Esta secuencia también está presente en la sonda de detección de la mutación de PIK3CA, E545K taactggctatccgga g ID SEC NO : 25 Secuencia del extremo 5' del cebador ARMS para la amplificación de la mutación de PIK3CA, H1047R; siendo la secuencia no específica de la diana. Esta secuencia también está presente en la sonda de detección de la mutación de PIK3CA, H1047R cgalatgata!gctagU ID SEC NO: 26 Sonda para la detección del producto de la amplificación ARMS de la mutación de PIK3CA, E542K cgggttacccgggagtctcagaccttagcatagctt ID SEC NO: 27 Sonda para la detección del producto de la amplificación ARMS de la mutación de PIK3CA, E545D cygttneonggaetatagetgagíaegge ID SEC NO: 28 Sonda para la detección del producto de la amplificación ARMS de la mutación de PIK3CA, E545K cgggttacccgggagtcfclaactggctaíccggag ID SEC NO: 29 Sonda para la detección del producto de la amplificación ARMS de la mutación de PIK3CA, H1047R cgatatgatatgctagtt ID SEC NO: 30 Sonda para la detección del producto de la amplificación ARMS de la mutación de PIK3CA, H1047R CGGGTT ACCCGGGCGAT ATGAJAIGCTAGTT

Claims

REIVINDICACIONES 1 Un método de detección de una o más mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, y/o de una o más mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, donde el método comprende las etapas de: - someter una muestra que contiene ácidos nucleicos a amplificación con una mezcla de amplificación que comprende uno o más cebadores ARMS, que se caracterizan en que cada cebador ARMS tiene una longitud total de entre 36 y 50 nucleótidos, y comprende en posición 3' una secuencia especifica de la diana seleccionada de entre ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 2, ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, respectivamente , donde cada cebador ARMS comprende además en posición 5' una secuencia marcadora no especifica de la diana, diferente de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, donde la mezcla de amplificación comprende además uno o más cebadores de amplificación; y - la detección de cualquier producto de amplificación que se obtenga, mediante hibridación de dicho producto con una o más sondas, donde cada sonda híbrida específicamente con la región del producto de amplificación correspondiente a la secuencia marcadora en 5' del cebador ARMS correspondiente. 2. El método de la reivindicación 1 donde uno o más cebadores ARMS se seleccionan de entre ID SEC NO: 3, ID SEC NO: 4, ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 e ID SEC NO: 19. 3. El método de las reivindicaciones 1 y 2 donde el cebador o cebadores de amplificación que se combinan con uno o más de los cebadores ARMS comprenden entre 18 y 24 nucleótidos de longitud, y son tales que, al combinarse con uno o más de los cebadores ARMS, la amplificación da lugar a uno o más productos de 1000 pb de longitud, o más cortos. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el cebador de amplificación es: - un cebador que comprende o consiste en la secuencia ID SEC NO: 5, para la amplificación con uno o más de los cebadores ARMS siguientes: cebadores de entre 36 y 50 nucleótidos, que comprenden una secuencia específica de la diana en posición 3', seleccionada de entre ID SEC NO: 1 e ID SEC NO: 2, donde los cebadores además comprenden una secuencia marcadora no especifica de la diana en posición 5', de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, y - cebadores de ID SEC NO: 3 e ID SEC NO: 4 - un cebador que comprende o consiste en la secuencia ID SEC NO: 20, para la amplificación con uno o más de los cebadores ARMS siguientes: cebadores de entre 36 y 50 nucleótidos, que comprenden una secuencia especifica de la diana en posición 3', seleccionada de entre ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13 e ID SEC NO: 14, donde los cebadores además comprenden una secuencia marcadora no especifica de la diana en posición 5', de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, y - cebadores de ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17 e ID SEC NO: 18 - un cebador que comprende o consiste en la secuencia ID SEC NO: 21, para la amplificación con uno o más de los cebadores ARMS siguientes: cebadores de entre 36 y 50 nucleótidos, que comprenden una secuencia especifica de la diana ID SEC NO: 15 en posición 3', donde los cebadores además comprenden una secuencia marcadora no especifica de la diana en posición 5', de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, y un cebador de ID SEC NO: 19. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la mezcla de amplificación comprende una DNA polimerasa y dNTPs. 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde se emplean una, dos, tres o cuatro de las siguientes combinaciones de cebadores: - ID SEC NO: 3, ID SEC NO: 4 e ID SEC NO: 5; - ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 19, ID SEC NO: 20 e ID SEC NO: 21; - ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 e ID SEC NO: 20; - ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18, ID SEC NO: 19, ID SEC NO: 20 e ID SEC NO: 21. 7. El método de las reivindicaciones 1 a 6 donde una o más sondas con las que se hibridan los productos de amplificación tienen una longitud de entre 15 y 45 nucleótidos, y comprenden una secuencia seleccionada del grupo formado por ID SEC NO: 6, ID SEC NO: 7, ID SEC NO: 22, ID SEC NO: 23, ID SEC NO: 24 e ID SEC NO: 25. El método de las reivindicaciones 1 a 7 donde una o más sondas se seleccionan de entre ID SEC NO: 8 ID SEC NO: 9, ID SEC NO: 10, ID SEC NO: 11, ID SEC NO: 26, ID SEC NO: 27, ID SEC NO: 28, ID SEC NO: 29 e ID SEC NO: 30. 9. Un kit para la detección de una o más mutaciones de BRAF seleccionadas entre V600E y V600K, y/o de una o más mutaciones de PI3K seleccionadas entre E542K, E545D, E545K y H1047R en una muestra que comprende ácidos nucleicos, donde el kit comprende una o más mezclas de reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo cada mezcla: - uno o más cebadores ARMS caracterizados en que cada cebador tiene una longitud de entre 36 y 50 nucleótidos, comprendiendo una secuencia especifica de la diana en posición 3' seleccionada de entre ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 2, ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, respectivamente, comprendiendo además cada cebador en posición 5' una secuencia marcadora no específica de la diana, diferente entre los distintos cebadores, de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, y - uno o más cebadores de amplificación, donde el kit comprende además una micromatriz con una o más sondas inmovilizadas, donde cada sonda híbrida específicamente con la región del producto ARMS correspondiente, complementaria a la secuencia marcadora en 5' del cebador ARMS correspondiente. 10. El kit de la reivindicación 9 donde una o más sondas tienen una longitud de entre 15 y 45 nucleótidos, y comprenden una secuencia seleccionada de entre ID SEC NO: 6, ID SEC NO: 7, ID SEC NO: 22, ID SEC NO: 23, ID SEC NO: 24 e ID SEC NO: 25. 11. El kit de las reivindicaciones 9 y 10, el cual comprende una o más de las siguientes mezclas de amplificación: - Mezcla de amplificación que comprende los cebadores de ID SEC NO: 3, ID SEC NO: 4 e ID SEC NO: 5; - Mezcla de amplificación que comprende los cebadores de ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 19, ID SEC NO: 20 e ID SEC NO: 21; - Mezcla de amplificación que comprende los cebadores de ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 e ID SEC NO: 20; y - Mezcla de amplificación que comprende los cebadores de ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18, ID SEC NO: 19, ID SEC NO: 20 e ID SEC NO: 21; donde el kit además comprende - una micromatriz que comprende una o más de las sondas seleccionadas de entre ID SEC NO: 8, ID SEC NO: 9, ID SEC NO: 10, ID SEC NO: 11, ID SEC NO: 26, ID SEC NO: 27, ID SEC NO: 28 e ID SEC NO: 29. 12. Un método de amplificación de un ácido nucleico correspondiente a una o más mutaciones de BRAF seleccionadas de entre V600E y V600K, o a una o más mutaciones de PI3K seleccionadas de entre E542K, E545D, E545K y H1047R, donde el método comprende poner en contacto una muestra que contiene ácidos nucleicos con una mezcla de amplificación que comprende uno o más cebadores ARMS, que se caracterizan en que cada cebador ARMS tiene una longitud total de entre 36 y 50 nucleótidos, y comprende en posición 3' una secuencia especifica de la diana seleccionada de entre ID SEC NO: 1, ID SEC NO: 2, ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, respectivamente, comprendiendo cada cebador ARMS en posición 5' una secuencia marcadora no especifica de la diana, diferente entre los distintos cebadores, de entre 15 y 20 nucleótidos de longitud, donde la mezcla de amplificación comprende además uno o más cebadores de amplificación. 13. Un cebador ARMS de entre 36 y 50 nucleótidos de longitud, caracterizado por comprender, en posición 3', una secuencia especifica de la diana de BRAF seleccionada de entre ID SEC NO: 1 e ID SEC NO: 2, o una secuencia especifica de la diana de PI3K seleccionada de entre ID SEC NO: 12, ID SEC NO: 13, ID SEC NO: 14 e ID SEC NO: 15, y una secuencia marcadora no especifica de la diana, en posición 5', de entre 15 y 20 nucleótidos. 14. El cebador de la reivindicación 13, seleccionado del grupo que comprende ID SEC NO: 3, ID SEC NO: 4, ID SEC NO: 16, ID SEC NO: 17, ID SEC NO: 18 e ID SEC NO: 19. 15. El uso del método de detección de mutaciones de BRAF y PI3K de las reivindicaciones 1 a 8, o del kit de las reivindicaciones 9 a 11, o del método de amplificación de la reivindicación 12, o de los cebadores de las reivindicaciones 13 y 14, para el diagnostico y/o pronóstico de una condición patológica de un paciente, o para predecir la respuesta de un paciente a la terapia con anticuerpos anti-EGFR. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa un método de detección de las mutaciones de BRAF, V600E y V600K, y de las mutaciones de PI3K, E542K, E545D, E545K y H1047R en una muestra susceptible de contener una o más de dichas mutaciones, basado en la amplificación de la muestra con los cebadores desarrollados en la presente invención. Asimismo, la presente invención está relacionada con (i) un kit que comprende entre sus componentes, reactivos de amplificación que incluyen uno o más de los cebadores de la invención; (ii) los cebadores en si; asi como (iii) el uso del método, el kit y los cebadores arriba mencionados, para el diagnóstico/pronóstico de una condición patológica en un paciente, particularmente, de cáncer