MX2015002639A

MX2015002639A - Metodo para aumentar la resistencia al estres abiotico de una planta.

Info

Publication number: MX2015002639A
Application number: MX2015002639A
Authority: MX
Inventors: Magalie Guilhabert-Goya; Hong Zhu
Original assignee: Bayer Cropscience Lp
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2015-06-24
Also published as: KR20150050578A; CA2918610A1; AU2013308476B2; US20170088479A1; AR092418A1; UY35011A; WO2014036474A1; AP2015008329A0; AU2013308476A1; PH12015500617A1; TW201433264A; RU2015111500A; WO2014036474A4; US20140066302A1; CN105263328A; JP2015528296A; EP2890241A1; BR112015004278A2

Abstract

Un método para aumentar la resistencia al estrés abiótico de una planta y mejorar la nutrición de los suelos que comprende aplicar una composición que comprende Bacillus pumilus o Bacillus subtiis, o un mutante de los mismos, a la planta, a una parte de la planta y/o a un área alrededor de la planta o de la parte de planta. La invención también está dirigida a un método para mejorar la nutrición del suelo que comprende aplicar una composición que comprende Bacillus subtiiis o un mutante del mismo al suelo.

Description

MÉTODO PARA AUMENTAR LA RESISTENCIA AL ESTRÉS ABIÓTICO DE UNA PLANTA REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud invoca la prioridad de la Solicitud Provisional de Patente de los EE.UU. N°: 61/696.046 presentada el 31 de agosto, 2012, la Solicitud Provisional de Patente de los EE.UU. N°: 61/715,780 presentada el 18 de octubre, 2012, y la Solicitud Provisional de Patente de los EE.UU. N°: 61/792.355 presentada el 15 de marzo, 2013. Cada una de las solicitudes precedentes se incorporan por completo en la presente a modo de referencia.

CAMPO TÉCNICO Esta invención se relaciona con el campo téenico de aumentar la resistencia al estrés abiótico de una planta y con la mejora de los niveles nutricionales en el suelo.

ANTECEDENTES En todo el mundo se emplean fertilizantes, basados en sustancias inorgánicas y orgánicas, con el fin de promover el crecimiento, el desarrollo y el rendimiento de las plantas. Otro factor limitante importante del crecimiento y la productividad de las plantas es el estrés abiótico, tal como el estrés por sequía, el estrés por salinidad, la deficiencia de nutrientes, la contaminación con metales pesados, las temperaturas extremas o las inundaciones. Por ejemplo, la exposición al estrés salino, condiciones de sequía o deficiencia de nutrientes generalmente causa una disminución en los rendimientos del material vegetal, de semillas, de frutos y de otros productos comestibles. Las pérdidas de los cultivos y las pérdidas en el rendimiento de los principales cultivos, tales como arroz, maíz y trigo, así como de árboles forestales, causadas por estos tipos de estrés representan un factor económico y político significativo y contribuyen en la escasez de alimentos en muchos países en desarrollo. El desarrollo de métodos que vuelven a las plantas tolerantes y/o resistentes, por ejemplo al estrés salino, constituye una estrategia que tiene el potencial de resolver o intervenir en por lo menos algunos de estos problemas. Aún más, los métodos para mejorar la nutrición del suelo y para liberar nutrientes par alas plantas del material orgánico podría aumentar el crecimiento de las plantas y aliviar el estrés ambiental para las plantas.

Por consiguiente existe una necesidad continua de proveer maneras para volver a las plantas tolerantes y/o resistentes al estrés abiótico y para aumentar en el suelo los nutrientes disponibles para las plantas. Un objeto de la presente invención comprende proveer un método para conferir o aumentar la tolerancia al estrés abiótico y/o la resistencia de las plantas y para aumentar la disponibilidad de los nutrientes para las plantas en el suelo.

SÍNTESIS La presente invención provee un método para aumentar la resistencia al estrés abiótico de una planta. El método incluye aplicar una composición a por lo menos una entre una planta, una parte de la planta, un área alrededor de la planta y un área alrededor de la parte de planta. Típicamente el método incluye suministrar la composición. La composición incluye Bacillus subtilis o Bacillus pumilus. En algunas formas de realización, el Bacillus subtilis o el Bacillus pumilus incluidos en la composición es un mutante de una cepa conocida de Bacillus subtilis o de Bacillus pumilus.

En determinadas formas de realización, la invención provee un método para aumentar la resistencia al estrés abiótico de una planta, donde dicho método comprende aplicar una composición que comprende Bacillus subtilis a la planta, a una parte de la planta y/o a un área alrededor de la planta o de la parte de planta en una cantidad suficiente como para aumentar la resistencia al estrés abiótico de la planta.

De acuerdo con algunas formas de realización particulares, el Bacillus subtilis es B. subtilis QST713, depositado en NRRL, N° Acceso B-21661, o un muíante de la misma. En algunas formas de realización, el Bacillus subtilis es la cepa QST30002 de B. subtilis o la cepa QST30004 de B. subtilis, depositadas con los N° de Acceso NRRL B-50421 y NRRL B-50455, respectivamente, o un muíante de las mismas. En otras formas de realización, la cepa de Bacillus pumilus es B. pumilus 2808 que fue depositada con el N° Acceso NRRL B-30087 y se describe en la Publicación de Patente Internacional N°: WO 2000/058442. De acuerdo con algunas otras formas de realización particulares, el estrés abiótico puede ser estrés salino o deficiencia de nutrientes. El estrés salino puede incluir una mayor concentración de sales o sequía. La deficiencia de nutrientes puede ser la falta de un nutriente del suelo, tal como potasio, fosfato o hierro en un área del suelo alrededor de la planta. El aumento de la resistencia al estrés contra una deficiencia de nutrientes (suelo), tal como fosfato, se puede suministrar por medio de una mayor solubilización de los nutrientes que son deficientes en el suelo. El área alrededor de una planta o parte de planta, que también puede ser alrededor de un fruto, puede ser o puede incluir el locus donde está creciendo la planta, o una parte de dicho locus. El área respectiva alrededor de una planta o parte de planta puede ser o puede incluir, por ejemplo, material tal como el suelo localizado en la proximidad de la planta o parte de planta. El área respectiva alrededor de un fruto puede ser o puede incluir, por ejemplo, una porción de la planta sobre la cual está creciendo el fruto, o puede ser o puede incluir material tal como la tierra ubicada cerca de la planta o de la parte de la planta que lleva al fruto. En algunas formas de realización, el método incluye aplicar la composición al suelo. La composición y el suelo pueden tomar contacto con la planta de manera independiente. En algunas formas de realización, el suelo toma contacto con la planta o la parte de planta antes de aplicar la composición. En algunas formas de realización, la composición se aplica antes que la planta o la parte de planta tome contacto con el suelo. En algunas formas de realización, la composición se aplica mientras que la planta o la parte de planta toma contacto con el suelo.

Después de la exposición a la composición, el aumento de la resistencia al estrés abiótico. tal como la resistencia al estrés salino o la resistencia a la deficiencia de nutrientes, es efectivo durante por lo menos aproximadamente 2 semanas. En algunas formas de realización, la resistencia al estrés salino aumenta durante por lo menos un mes aproximadamente. La resistencia al estrés salino de una planta expuesta a la composición aumenta, en algunas formas de realización, durante por lo menos aproximadamente 2 meses, incluyendo durante por lo menos aproximadamente 3 meses, durante por lo menos aproximadamente 4 meses, durante por lo menos aproximadamente 5 meses, durante por lo menos aproximadamente 6 meses, durante por lo menos aproximadamente 7 meses, durante por lo menos aproximadamente 8 meses, por lo menos aproximadamente 9 meses, por lo menos aproximadamente 10 meses o durante por lo menos aproximadamente 11 meses. En algunas formas de realización, la resistencia al estrés salino de una planta respectiva aumento durante por lo menos aproximadamente un año, incluyendo durante por lo menos aproximadamente 1½ años después de la aplicación o por más tiempo.

El método de la presente invención incluye la aplicación de la composición en cualquier momento durante el ciclo de vida de una planta, durante una o más etapas del ciclo de vida de una planta o a intervalos regulares del ciclo de vida de una planta o de forma continua durante toda la vida de la planta. Por ende la composición se puede aplicar según necesidad. La composición se puede aplicar, por ejemplo, a una planta durante el crecimiento, antes y/o durante la floración y/o antes y/o durante la aparición de semillas. A modo de ejemplo ilustrativo, la composición se puede aplicar antes, durante y/o al poco tiempo después de transplantar las plantas de una ubicación a otra, tal como de un invernadero o de un semillero al campo. En otro ejemplo, la composición se puede aplicar al poco tiempo después que las plántulas emergen del suelo o de otro medio de crecimiento (por ejemplo, vermiculita). Como aún otro ejemplo, la composición se puede aplicar en cualquier momento a las plantas que crecen hidropónicamente. Un método de acuerdo con la invención puede incluir la aplicación de la composición sobre una planta, sobre una parte de planta, sobre un área alrededor de una planta, incluyendo las proximidades de una planta, sobre un fruto y/o sobre un área alrededor de un fruto, inclusive próximo al mismo, muchas veces, por ejemplo una cantidad preseleccionada de veces durante un período de tiempo deseado. En algunas formas de realización, una composición respectiva se puede aplicar sobre las plantas múltiples veces con un período de intervalo deseado.

En un método de acuerdo con la invención la composición se aplica a una planta, a una parte de planta, a un área alrededor de una planta o de una parte de planta, a los frutos, a una planta que lleva los frutos y/o a un área alrededor de un fruto. El área alrededor de un fruto, una planta o una parte de planta puede ser, por ejemplo, un área dentro de aproximadamente 2 metros, dentro de aproximadamente un metro, dentro de aproximadamente 70 cm, dentro de aproximadamente 50 cm, dentro de aproximadamente 25 cm, dentro de aproximadamente 10 cm o dentro de aproximadamente 5 cm alrededor de la planta, la parte de planta o del fruto.

En un aspecto relacionado, la presente invención se relaciona con el uso de Bacillus subtilis o Bacillus pumilus para aumentar la resistencia al estrés salino de una planta. El uso incluye aplicar una composición a por lo menos una entre una planta, una parte de la planta, un área alrededor de la planta y un área alrededor de la parte de planta. En algunas formas de realización, se incluye Bacillus subtilis o Bacillus pumilus en la composición.

De acuerdo con otra forma de realización, la presente invención se relaciona con un método para mejorar la nutrición del suelo, que comprende aplicar una composición que comprende Bacillus subtilis al suelo. La composición puede facilitar la biodegradación de materiales orgánicos con una enzima hidrolítica seleccionada entre una proteinasa, una celulasa y una xilanasa. En una forma de realización, la invención provee un método para mejorar la nutrición del suelo que comprende aplicar una composición que comprende Bacillus subtilis al suelo en una cantidad suficiente como para mejorar dicha nutrición del suelo.

En un aspecto relacionado, la presente invención se relaciona con un método para facilitar la biodegradación de material orgánico, donde dicho método comprende aplicar Bacillus subtilis al material orgánico en una cantidad suficiente como para facilitar la biodegradación del material orgánico con una enzima hidrolítica.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS En la Figura 1 se muestran plantas de arroz tratadas con agua o con SERENADE SOIL® e irrigadas con sales 60 mM durante 14 días.

En la Figura 2 se muestran las raíces de plantas de arroz tratadas con agua o con SERENADE SOIL® e irrigadas con sales a 60 mM durante 14 días (64 oz/aere es igual a 0,448 g/m2).

En la Figura 3 se muestran plantas de arroz tratadas con agua o con SONATA® e irrigadas con sales a 60 mM durante 14 semanas.

En la Figura 4 se muestran las raíces de plantas de arroz tratadas con agua o con SERENADE SOIL® o SONATA® e irrigadas con sales a 60 mM durante 14 días (64 oz/acre es igual a 0,448 g/m2).

En la Figura 5 se muestran los pesos secos de raíces y brotes en mg de plantas tratadas con SERENADE ASO® y de plantas tratadas con agua.

En las Figuras 6A y 6B se muestran los niveles de fosfato soluble resultantes del cultivo de las cepas AQ30002 (Figura 6A) y AQ713 (Figura 6B) de Bacillus subtilis cultivadas en medio NBRIY en comparación con el medio blanco.

En la Figura 7 se muestra la alineación de diversos ADN genómicos swrA que abarcan al transcripto swrA predicho. Bsub_168 = B. subtilis, cepa 168; Bsub_3610 = B. subtilis, cepa 3610; QST713 = QST713, de tipo salvaje; AQ30002 y AQ30004 = cepas representativas de la presente invención; Bamy_FZB42 = B. amyloliquefaciens, cepa FZB42; Bpum_SAFR-032 = B. pumilus, cepa SAFR-032; y Blic_14580 = B. licheniformis, cepa 14580.

En la Figura 8 se muestra la alineación de diversos ADN genómicos swrA que abarcan al transcripto swrA predicho. Las abreviaturas tienen los mismos significados de swrA que en la Figura 5A, y Batr_1942 = B. atrophaeus, cepa 1942 y Bpum_2808 = B. pumilus, cepa 2808.

En la Figura 9 se muestra la alineación de diversas proteínas obtenidas de sus transcriptos swrA predichos. Las abreviaturas tienen el mismo significado que en las Figuras 7 y 8, y Bpum_7061 = B. pumilus 7061. DESCRIPCIÓN DETALLADA A menos que se los defina de otro modo, todos los términos científicos y téenicos usados en la presente tienen el mismo significado que le dan los especialistas en la técnica a los que concierne esta invención.

Según se usa en la presente, el término “planta” se refiere a cualquier organismo vivo que pertenece al reino Plantae (es decir, cualquier género/especie del reino de las plantas). Incluye organismos familiares tales como, pero en un sentido no taxativo, árboles, hierbas, arbustos, pastos, enredaderas, heléchos, musgos y algas verdes. El término se refiere a plantas monocotiledóneas, también denominadas monocots, y a plantas dicotiledóneas, también denominadas dicots. En algunas formas de realización, la planta es de importancia económica. En algunas formas de realización, la planta es una planta cultivada por el hombre, por ejemplo una planta cultivada, que puede ser una planta agronómica, de silvicultura o de horticultura. Los ejemplos de plantas particulares incluyen, pero en un sentido no taxativo, maíz, papas, rosas, manzaneros, girasoles, trigo, arroz, bananas, tomates, opio, zapallos, calabaza, lechuga, col, robles, guzmania, geranios, hibisco, clematis, poinsetias, caña de azúcar, taro, lenteja de agua, pinos, pasto de Kentucky, pasto zoysia, cocoteros, vegetales de hojas de brassica (por ejemplo brócoli, brócoli nabo, repollitos de Bruselas, col, col chino (Bok Choy y Napa), coliflor, cola de caballo, repollos, col forrajera, colinabo, hojas de mostaza, hojas de colza y otros cultivos de vegetales de hoja de brassica), vegetales de bulbos (por ejemplo, ajo, puerro, cebolla (bulbo seco, de verdeo y Welch), echalotes y otros cultivos de vegetales de bulbo), frutos cítricos (por ejemplo, pomelo, limón, lime, naranja, mandarina, híbridos de cítricos, toronjas y otros cultivos de frutos cítricos), vegetales curcubitáceas (por ejemplo, pepino, sandía blanca, calabazas comestibles, pepinillos, melones amarillos (incluyendo híbridos y/o cultivares de melones comunes), sandía, cantalupa y otro cultivos de vegetales curcubitáceas), verduras de frutos (incluyendo berenjena, tomatitos cherry, pepino, pimiento, tomate, tomatillos y otros cultivos de verduras de frutos), uvas, verduras de hojas (por ejemplo, lechuga romaine), verduras de raíces/tubérculos y bulbos (por ejemplo, papas) y frutos secos (almendras, pacanas, pistachos y nueces), bayas (por ejemplo, tomates, agracejos, grosellas, bayas del saúco, grosellas espinosas, madreselvas, podofilos, bayas nanny, uvas Oregon, espinos amarillos del mar, almecinas, gayubas, arándanos rojos, frutillas, uvas de playa, zarzamoras, frambuesas amarillas, moras de logan, frambuesas, zarzamoras americanas, silva falsa y frambuesas japonesas), cultivos de cereales (por ejemplo, maíz, arroz, trigo, cebada, sorgo, mijo, avena, centeno, triticales, trigo sarraceno, formio y quinoa), frutos carnosos (por ejemplo, manzanas, peras), drupas (por ejemplo, cafés, yuyubas, mangos, olivos, cocos, palmeras oleaginosas, pistachos, almendras, damascos, cerezas, ciruela damson, nectarinas, duraznos y ciruelas), vides (por ejemplo, uvas de mesa, uvas de vino), cultivos de vegetales fibrosos (por ejemplo, cáñamo, algodón), ornamentales, por nombrar unos pocos. La planta puede ser, en algunas formas de realización, una planta casera/doméstica, una planta de invernadero, una planta de agricultura o una planta de horticultura. Como ya se indicó previamente, en algunas formas de realización, la planta puede ser un árbol de madera dura, tal como una planta de de acacia, de eucalipto, un carpe, nogal americano, caoba, nogal, roble, fresno, sauce, pacana, abedul, castaño, álamo, aliso, arce, sicómoro, gingo, palmera y gomero dulce. En algunas formas de realización, la planta puede ser una conifera tal como un ciprés, un abeto Douglas, un abeto, una secuoya, una tsuga, un cedro, un enebro, un alerce, un pino, una secuoya, abeto y tejo. En algunas formas de realización, la planta puede ser una planta leñosa frutal tal como una planta de manzana, ciruela, pera, banana, naranja, kiwi, limón, cereza, uva, papaya, maní e higo. En algunas formas de realización, la planta puede ser una planta leñosa, tal como algodón, bambú y una gomera. La planta puede ser, en algunas formas de realización, una planta de agricultura, una planta de silvicultura y/o una planta ornamental, es decir, una planta que se usa comúnmente en la jardinería, por ejemplo, en parques, jardines y en balcones. Los ejemplos comprenden pasto, geranio, geranio, petunia, begonia y fucsia, para nombrar unos pocos entre la amplia variedad de ornamentales. El término “planta” también pretende incluir cualquier propágulo de planta.

El término “planta” generalmente incluye una planta que ha sido modificada mediante uno o más entre cría, mutagénesis y manipulación genética. La manipulación genética se refiere al uso de téenicas de ADN recombinante. Las técnicas de ADN recombinante permiten efectuar modificaciones que no se pueden obtener fácilmente por entrecruzamiento bajo circunstancias naturales, mutaciones o recombinación natural. En algunas formas de realización, la planta obtenida mediante manipulación genética puede ser una planta transgénica.

Según se usa en la presente, el término “parte de planta” se refiere a cualquier parte de una planta incluyendo, pero en un sentido no taxativo, brotes, raíces, tallos, semillas, estípulas, hojas, pétalos, flores, óvulos, brácteas, ramas, pecíolos, internodos, corteza, madera, tubérculos, pubescencias, retoños, rizomas, frondas, briznas, polen, estambres, microsporas, frutos y semillas. Las dos partes de plantas principales cultivadas en los medios típicos empleados en el arte, tal como el suelo, a menudo se conocen como partes “aéreas”, a veces también llamados “brotes”, y la parte “subterránea”, también a menudo conocida como “raíces”.

En un método de acuerdo con la invención, la composición se puede aplicar a cualquier planta o a cualquier parte de cualquier planta cultivada en cualquier tipo de medio usado para tal fin (por ejemplo, tierra, vermiculita, cartón desmenuzado y agua) o se pueden aplicar a plantas o las partas de plantas que crecen en el aire, tales como orquídeas o heléchos Staghorn. La composición se puede aplicar, por ejemplo, por rociado, atomización, vaporización, dispersión, pulverización, riego, riego a chorros, riego suave o riego copioso. Como ya se indicó previamente, la aplicación se puede llevar a cabo en cualquier ubicación deseada donde pudiera encontrarse la planta de interés, tal como en ambientes agronómicos, de horticultura, forestales, de una plantación, de huerto, vivero, cultivos orgánicos, de céspedes y urbanos.

La presente invención provee un método para usar una composición que incluye Bacillus subtilis y/o Bacillus pumilus, un producto de fermentación de Bacillus subtilis y/o Bacillus pumilus o un extracto sin células de Bacillus subtilis y/o Bacillus pumilus para aumentar la resistencia al estrés salino de una planta. Tanto Bacillus subtilis como Bacillus pumilus son bacterias del suelo Gram-positivas, que a menudo se encuentran en la rizosfera de las plantas. B. subtilis, al igual que muchas especies de bacterias, puede presentar dos modos de crecimiento diferentes, un modo de crecimiento planctónico que nada libremente y un modo de biopelícula sésil en el cual un agregado de células secreta una matriz extracelular para adherirse entre sí y/o a una superficie. Las vías utilizadas por bacterias tales como B. subtilis para construir biopelículas son extremadamente diversas, que varían enormemente dentro y entre diferentes especies y bajo diferentes condiciones ambientales. Recientemente se ha reconocido que la formación de biopelículas por cepas específicas de B. subtilis y especies relacionadas puede ayudar a controlar una infección causada por patógenos de plantas.

La composición que incluye Bacillus subtilis y/o Bacillus pumilus puede ser un líquido, una lechada, un polvo humectable, gránulos, un material que fluye, ya sean seco o acuoso, o microencapsulamientos en un medio adecuado.

Ambos Bacillus subtilis y Bacillus pumilus pueden estar presentes en las composiciones usadas en la presente invención como esporas (que son latentes), como células vegetativas (que están en crecimiento), como células en estado de transición (que están en transición de la fase de crecimiento a la fase de esporulación) o como una combinación de todos de estos tipos de células. En algunas formas de realización, una composición respectiva incluye, incluye esencialmente, consiste en y consiste principalmente en esporas. En otras formas de realización, la composición incluye esporas y metabolitos producidos por las células durante la fermentación antes de su esporulación.

En algunas formas de realización, Bacillus subtilis es la cepa QST713 de Bacillus subtilis. La cepa QST713 de Bacillus subtilis es una bacteria natural ampliamente distribuida que se puede usar para controlar las enfermedades en plantas incluyendo tizón, fusariosis, moho gris y diversos tipos de mildiú. Las autoridades reguladoras de los EE.UU. y Europa han clasificado a la cepa QST713 de Bacillus subtilis como sin efectos adversos para seres humanos o el medio ambiente. La bacteria, Bacillus subtilis, es prevalente en suelos y se ha encontrado en una variedad de hábitats en todo el mundo. Se sabe que la cepa QST713 de Bacillus subtilis es antagonista de muchos patógenos fúngicos de las plantas.

La cepa QST713 de Bacillus subtilis de tipo salvaje, sus mutantes, sus sobrenadantes, y sus metabolitos de lipopéptidos, y los métodos para su uso en el control de patógenos de plantas e insectos se describen con detalle en las Patentes de los EE.UU. N°: 6.060.051; 6.103.228; 6.291.426; 6.417.163; y 6.638.910; cada de las cuales se incorpora específicamente y por completo en la presente a modo de referencia por todo cuanto enseña. En estas Patentes de los EE.UU., la cepa se denomina AQ713, que es sinónimo de QST713. Toda referencia en esta memoria descriptiva a QST713 se refiere a la cepa QST713 de Bacillus subtilis (también conocida como AQ713) presente en el producto SERENADE®, depositado en NRRL, N° Acceso B21661, o preparada en biorreactores bajo condiciones que simulan la producción del producto SERENADE®.

En el momento de la presentación de la Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 09/074.870 en 1998, que corresponde a las patentes anteriores, la cepa se designó Bacillus subtilis en base a métodos clásicos, fisiológicos, bioquímicos y morfológicos. Desde entonces, ha evolucionado la taxonomía de las especies de Bacillus, en especial a la luz de los avances de la genética y de las teenologías de secuenciación, de modo tal que la designación de especies se basa en gran medida en la secuencia de ADN en lugar de los métodos usados en 1998. Después de alinear las secuencias de proteína de FZB42 de B. amyloliquefaciens, 168 y QST713 de B. subtilis, aproximadamente un 95% de las proteínas halladas en FZB42 de B. amyloliquefaciens son un 85% o más idénticas a las proteínas halladas en QST713; en tanto solamente un 35% de las proteínas en 168 de B. subtilis son un 85% o más idénticas a las proteínas de QST713. Sin embargo, aún con la mayor confianza en la genética, aún persisten ambigüedades taxonómicas en la literatura científica relevante y los documentos reguladores, que reflejan la comprensión en desarrollo de la taxonomía de Bacillus durante los últimos 15 años. Por ejemplo, un producto plaguicida basado en la cepa FZB24 de B. subtilis, que está tan estrechamente relacionada con QST713 como FZB42, se clasifica en los documentos de U.S. EPA como B. subtilis var. amyloliquefaciens. Dadas estas complejidades en la nomenclatura, esta especie particular de Bacillus se designa de diversas maneras, dependiendo del documento, como B. subtilis, B. amyloliquefaciens y B. subtilis var. amyloliquefaciens. Por ello, se ha retenido la designación de B. subtilis de QST713 en lugar de cambiarlo por B. amyloliquefaciens, según lo esperado actualmente basado solamente en comparación de secuencias y taxonomía inferida.

La cepa QST713 de Bacillus subtilis fue depositada en NRRL el 7 de mayo, 1997 bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimientos de Patentes con el N° de Acceso B21661. NRRL es la abreviatura de Agricultural Research Service Culture Collection, una autoridad de depósito internacional dedicado al propósito de depositar cepas de microorganismos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Propósito de Procedimientos de Patentes, cuyo domicilio es National Center for Agricultural Utilization Research, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, 1815 North University Street, Peoría, Illinois 61604, EE.UU. Las formulaciones adecuadas de la cepa QST713 de Bacillus subtilis se encuentran disponibles comercial mente bajo los nombres comerciales SERENADE®, SERENADE® ASO, SERENADE SOIL® y SERENADE® MAX de Bayer CropScience LP, North Carolina, EE.UU.

El producto SERENADE® (N° registro de U.S. EPA 69592-12) contiene una cepa patentada de Bacillus subtilis (cepa QST713) y muchos lipopéptidos diferentes que funcionan sinérgicamente destruyendo los patógenos de la enfermedad y proveen una actividad antimicrobiana superior. El producto SERENADE® se usa para proteger a plantas tales como verduras, frutas, frutos secos y cultivos de vid contra enfermedades tales como tizón del fuego, Botrytis, podredumbre ácida, roya, Sclerotinla, mildiú pulverulento, manchado bacteriano y moho blanco. El producto SERENADE® se encuentra disponible como formulaciones líquidas o secas que se pueden aplicar como un tratamiento foliar y/o en tierra. Las copias de las etiquetas maestras de U.S. EPA para los productos SERENADE®, incluyendo SERENADE® ASO, SERENADE® MAX y SERENADE® SOIL®, se encuentran disponibles al público en National Pesticide Information Retrieval System (NPIRSv) USEPA/OPP Pesticide Product Label System (PPLS).

SERENADE® ASO (suspensión orgánica acuosa) contiene 1,34% de QST713 seco como ingrediente activo y 98,66% de otros ingredientes. SERENADE® ASO está formulado para contener un mínimo de 1 x 109 UFC/g de QST713 en tanto se ha determinado que la cantidad máxima de QST713 es de 3,3 x 1010 UFC/g. Los nombres comerciales alternativos para SERENADE® ASO incluyen SERENADE® BIOFUNGICIDE, SERENADE SOIL® y SERENADE GARDEN® DISEASE. Por información adicional, veanse las etiquetas maestros de U.S. EPA para SERENADE® ASO del 4 de enero, 2010, y SERENADE SOIL®, cada una de las cuales se incorpora por completo en la presente a modo de referencia.

SERENADE® MAX contiene 14,6% de QST713 seco como ingrediente activo y 85,4% de otros ingredientes. SERENADE® MAX está formulado para contener un mínimo de 7,3 x 109 UFC/g de QST713 en tanto se ha determinado que la cantidad máxima de QST713 es de 7,9 x 101° UFC/g. Por información adicional, véase la etiqueta maestra U.S. EPA para SERENADE® MAX, que se incorpora por completo en la presente a modo de referencia.

Según se explicó con detalle en la Solicitud de Patente Internacional N°: WO2012/087980, los cultivos de la cepa QST713 de B. subtilis son en realidad una mezcla de células tipo salvaje y un porcentaje relativamente pequeño de variantes de tipos celulares que fueron designados como “células tipo papel de lija”, basado en la morfología de sus colonias. Por consiguiente, las células QST713 tal como se encuentran en el producto SERENADE® o las células QST713 cultivadas en un biorreactor consisten en una población mixta de células de tipo salvaje y estas células tipo papel de lija a la misma relación o a relaciones similares a las halladas en el producto SERENADE® (véase, por ejemplo, la Figura 4). Estas células tipo papel de lija forman colonias sobre un agar nutritivo que morfológicamente y fisiológicamente parecen altamente compactadas, hidrofóbicas, planas, secas y muy “crujientes” y son muy difíciles de retirar del agar. La adherencia celular se puede observar cualitativamente o se puede medir mediante la tinción con violeta cristal. Además de esta morfología de colonias distinta sobre un agar nutriente, las células tipo papel de lija forman biopelículas densas, compactas (o biopelículas más robustas) sobre superficies tales como raíces. De acuerdo con la divulgación anterior, la cepa AQ30002 de B. subtilis (también conocida como QST30002) o AQ30004 (también conocida como QST30004), depositada con los N° de Acceso NRRL B-50421 y NRRL B-50455 que se describen en la Publicación de Patente Internacional No. WO2012/087980, o los mutantes de estas cepas de B. subtilis, tienen todas las características fisiológicas y morfológicas de la cepa AQ30002 de B. subtilis (también conocida como QST30002) o AQ30004 (también conocida como QST30004) también se pueden usar en el método de la invención, ya sea solas o en una mezcla con otras cepas de Bacillus subtilis, tal como QST713 de B. subtilis.

El término “tipo salvaje” se refiere al fenotipo de la forma típica de una especie tal como aparece en la naturaleza y/o como aparece en una forma aislada conocida que se ha designado previamente como de “tipo salvaje”. Los sinónimos de “tipo salvaje” reconocidos en la presente incluyen “tipo salvaje”, “de tipo salvaje”, “+” y “wt”. El tipo salvaje generalmente se define como un producto del alelo estándar, “normal” de uno o más genes específicos en uno o más loci, a diferencia del producido por un alelo no estándar, “mutante” o “variante”. En general, y según se usa en la presente, el alelo más prevalente (es decir, el que tiene la frecuencia genética más alta) de una cepa o forma aislada particular de Bacillus es considerado como el de tipo salvaje. Según se usa en la presente, “QST713 de tipo salvaje” o “QST713 swrA+ de tipo salvaje” y sinónimos de los mismos (por ejemplo, “QST713 swrA+, “QST tipo salvaje”, “QST713 wt”, etc.) se refieren a QST713 de B. subtilis con un gen swrA funcional (es decir, swrA+) capaz de expresar la proteína swrA codificada. Por lo tanto, estos términos se refieren a células clónales QST713 de tipo salvaje que son 100% swrA+.

Según se mencionó previamente, en algunas formas de realización, la cepa de Bacillus subtilis es la cepa AQ30002 de B. subtilis o AQ30004 de B. subtilis. En otras formas de realización, la cepa de Bacillus subtilis es la cepa 3610 de B. subtilis. En algunas formas de realización, la cepa de Bacillus pumilus es la cepa SAFR-032 de B. pumilus. En algunas formas de realización, la cepa de Bacillus pumilus es la cepa 2808 de B. pumilus que fue depositada con el N° Acceso NRRL B-30087 y se describe en las Patentes de los EE.UU. N°: 6.245.551 y 6.586.231 y en la Publicación de Patente Internacional No. W02000/058442. Las formulaciones adecuadas de la cepa 2808 de Bacillus pumilis se encuentran disponibles bajo el nombre comercial SONATA® de Bayer CropScience LP, Carolina del Norte, EE.UU.

En términos generales, la composición usada en la presente invención puede ser cualquier caldo de fermentación de Bacillus subtilis, Bacillus pumilus o de un muíante de los mismos. El término “caldo de fermentación” (que también se puede denominar “cultivo en caldo completo” o “caldo completo”), según se usa en la presente, se refiere al medio de cultivo que resulta después de la fermentación de un microorganismo y abarca al microorganismo usado en la presente (es decir, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus o un mutante de los mismos) y sus partes componentes, sustratos de partida sin usar y los metabolitos producidos por el microorganismo durante fermentación, entre otros. Ambos Bacillus subtilis y Bacillus pumilus son bacterias formadoras de esporas. En un aspecto, estos caldos de fermentación incluyen entonces células bacterianas formadoras de esporas, sus metabolitos y el caldo de fermentación residual. En otros aspectos, las células bacterianas formadoras de esporas del caldo de fermentación son mayormente esporas. En otro aspecto, las composiciones que comprenden los caldos de fermentación comprenden además ingredientes de formulación inertes e ingredientes de formulación. En algunas formas de realización, el caldo de fermentación se lava, por ejemplo, mediante un proceso de diafiltración, para eliminar el caldo de fermentación residual y los metabolitos de modo tal que el producto de fermentación comprende mayormente esporas. Las células, esporas y metabolitos bacterianos del medio de cultivo que resultan de la fermentación se pueden usar directamente o se pueden concentrar usando métodos industriales convencionales, tales como centrifugación, filtración por flujo tangencial, filtración profunda y evaporación. En otra forma de realización, el caldo de fermentación o el caldo de fermentación concentrado se seca usando procesos o métodos de secado convencionales tales como secado por aspersión, secado por congelamiento, secado en bandeja, secado en lecho fluido, secado en tambor o evaporación para crear un sólido de fermentación. El término “producto de fermentación,” según se usa en la presente, se refiere al caldo completo, a un concentrado del caldo y/o a sólidos de fermentación.

En algunas formas de realización, la composición incluye un mutante de una cepa particular de Bacillus subtilis o Bacillus pumilus, tal como la cepa QST713 de Bacillus subtilis o la cepa QST2808 de Bacillus pumilus. El término “mutante” se refiere a una variante genética derivada de QST713 o QST2808. En una forma de realización, el mutante presenta una o más o todas las características de identificación (funcionales) de una cepa parental, tal como QST713 o QST2808. En otra forma de realización, el mutante o un producto de fermentación del mismo aumenta por lo menos la resistencia al estrés abiótico de una planta (como una característica funcional de identificación), al igual que la cepa parental. Dichos mutantes pueden ser variantes genéticas que tienen una secuencia genómica que presenta más que aproximadamente un 85%, más que aproximadamente un 90%, más que aproximadamente un 95%, más que aproximadamente un 98% o más que aproximadamente un 99% de identidad de secuencia con la cepa parental. Los mutantes se pueden obtener mediante tratamiento de células de la cepa parental con sustancias químicas o irradiación o mediante selección de los mutantes espontáneos de una población de células de la cepa parental (tales como mutantes resistentes a fagos o resistentes a antibióticos) o mediante otros medios bien conocidos por los especialistas en el arte.

En algunas formas de realización, la composición incluye células de Bacillus con una mutación en el gen swrA (es decir, células swrA) tales como las que se describen en la Publicación de Patente Internacional N°. WO2012/087980. En la Publicación de Patente Internacional N°: WO2012/087980 también se describen diversos métodos para generar células swrA en células de Bacillus. En una forma de realización, la mutación en el gen swrA es en una posición correspondiente a una o más de las posiciones 26-34 del gen swrA que se muestra en la SEQ ID N°: 1 o en una posición correspondiente a una o más de las posiciones 1-3 del gen swrA como se muestra en la SEQ ID N°: 1.En una variación, la mutación es una inserción o una supresión.

El listado de secuencias provisto con esta Solicitud provee secuencias del gen swrA de diversas especies y cepas de Bacillus, como también se muestra en las Figuras 7, 8 y 9. En la siguiente Tabla 1 se correlacionan las SEQ ID N° con las cepas. Todas las secuencias son secuencias de nucleótidos, excepto la SEQ ID N°: 2, que es una secuencia de aminoácidos.

Tabla 1 En algunas formas de realización, se ha reducido la actividad swrA por un medio distinto de una mutación del gen swrA. La actividad swrA se pueden reducir usando diversos agentes, incluyendo moléculas pequeñas, drogas, sustancias químicas, compuestos, ARNsi, ribozimas, oligonucleótidos antisentido, anticuerpos inhibidores de swrA, péptidos inhibidores de swrA, aptámeros o aptámeros especulares. En una forma de realización, la mutación del gen swrA en las células swrA- es en una posición correspondiente a una o más de las posiciones 26-34 del gen swrA que se muestra en la SEQ ID N°: 1 o en una posición correspondiente a una o más de las posiciones 1-3 del gen swrA que se muestra en la SEQ ID N°: 1.En una variación, la mutación es una inserción o una supresión. En otro aspecto, las células swrA- son el resultado de un noqueo del gen swrA.

En una forma de realización, las células bacterianas formadoras de esporas de la presente invención son células bacterianas Bacillus subtilis QST713 que tienen una mutación en el gen swrA y composiciones con las mismas. En un aspecto, las células bacterianas de la cepa QST713 de Bacillus subtilis comprenden por lo menos un cambio de un par de bases de ácido nucleico en un codón de inicio y/o por lo menos una inserción o una supresión de un par de bases de ácido nucleico en un gen swrA. En otros aspectos, la inserción o supresión en el gen swrA tiene lugar en uno o más de los pares de bases en las posiciones 26-34 de la SEQ ID N°: 1.En aún otro aspecto, las células swrA- de Bacillus subtilis QST713 se seleccionan del grupo que consiste en la cepa AQ30002 (también conocida como QST30002) y la cepa AQ30004 (también conocida como QST30004), depositada con los N° de Acceso NRRL B-50421 y NRRL B-50455, respectivamente. En aún otro aspecto de la invención, la cepa QST713 de Bacillus subtilis que tiene la mutación en el gen swrA es de tipo salvaje para epsC, sfp y degQ. En otro aspecto, la Bacillus subtilis QST713 que tiene la mutación es isogénica de otra manera con Bacillus subtilis QST713.

En determinadas formas de realización, las células swrA-comprenden por lo menos aproximadamente un 3,5% de las células totales en la composición y por lo menos un 70% de las células swrA- son esporas. La presente invención provee además composiciones tales en donde las células swrA- comprenden por lo menos un 10% de las células totales en la composición o comprenden por lo menos un 50% de las células totales en la composición o comprenden un 100% de las células totales en la composición. La presente invención provee además aquellas composiciones en donde por lo menos aproximadamente un 80%, por lo menos aproximadamente un 85% o por lo menos aproximadamente un 90% de las células swrA- y/o de las células totales en la composición son esporas.

En algunas formas de realización, el porcentaje de células swrA- en las células totales en las composiciones y en los métodos de la presente invención será de por lo menos un 3,5% o por lo menos un 3,6% o por lo menos un 3,7% o por lo menos un 3,8% o por lo menos un 3,9% o por lo menos un 4% o por lo menos un 5% o por lo menos un 6% o por lo menos un 7% o por lo menos un 8% o por lo menos un 9% o por lo menos un 10%, o por lo menos un 15% o por lo menos un 20% o por lo menos un 25% o por lo menos un 30% o por lo menos un 35% o por lo menos un 40% o por lo menos un 45% o por lo menos un 50% o por lo menos un 55% o por lo menos un 60% o por lo menos un 65% o por lo menos un 70% o por lo menos un 75% o por lo menos un 80% o por lo menos un 85% o por lo menos un 90% o por lo menos un 95% o por lo menos un 98% o por lo menos un 99% o un 100%. En algunas formas de realización de la presente invención, todas las células presentes en una composición particular o usadas en un método particular son células swrA- (es decir, un 100% de células swrA-).

En algunas formas de realización, el porcentaje de células swrA- en las células totales en la composición y en los métodos de la presente invención serán de entre aproximadamente un 3,5% y aproximadamente un 99,9%. En otra forma de realización, el porcentaje será de entre aproximadamente un 5% y aproximadamente un 99%. En otra forma de realización, el porcentaje será de entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 99%.

En algunas formas de realización, la cantidad de unidades formadoras de colonias (“UFC”) por gramo (“g”) de células swrA- en las composiciones y en los métodos de la presente invención será de al menos 1 x 107 UFC/g o al menos 1 x 108 UFC/g o al menos 1 x 109 UFC/g o al menos 2 x 109 UFC/g, o al menos 3 x 109 UFC/g o al menos 4 x 109 UFC/g o al menos 5 x 109 UFCbg o al menos 6 x 109 UFC/g o al menos 7 x 109 UFC/g, o al menos 8 x 101° UFC/g, o al menos 8,5 x 101° UFC/g, o al menos 9 x 101° UFC/g, o al menos 9,5 x 101° UFC/g, o al menos 1 x 1011 UFC/g, o al menos 2 x 1011 UFC/g, o al menos 3 x 1011 UFC/g, o al menos 4 x 1011 UFC/g, o al menos 5 x 1011 UFC/g, o al menos 6 x 1011 UFC/g, o al menos 7 x 1011 UFC/g, o al menos 8 x 1011 UFC/g, o al menos 9 x 1011 UFC/g, o al menos 1 x 1012 UFC/g, o al menos 1 x 1013 UFC/g, o al menos 1 x 1014 UFC/g.

En otras formas de realización, la cantidad total de células swrA- en las composiciones y en los métodos de la presente invención se basa en el peso seco relativo o real de las células swrA- en las composiciones totales. En algunas formas de realización, la cantidad total de células swrA- en las composiciones y los métodos de la presente invención se basa en las UFC/g de las células swrA-en las composiciones.

En algunas formas de realización, la resistencia al estrés abiótico que es aumentada mediante el tratamiento de una planta con una composición que comprende Bacillus subtilis, Bacillus pumilus o un muíante de los mismos, es una deficiencia de nutrientes. Un ejemplo de deficiencia de nutrientes es la deficiencia de un nutriente del suelo tal como potasio, fosfato o hierro.

El término “estrés abiótico” se usa en la presente con su significado común, como el impacto negativo de factores no vivos sobre los organismos vivos en un ambiente específico y por consiguiente con referencia a plantas se refiere al impacto negativo de los factores no vivos sobre una planta en un ambiente específico. El factor no vivo (variable) afectar el entorno más allá de su rango de variación normal para afectar adversamente al desempeño de una población de plantas o a la fisiología individual de una planta de una manera significativa. Aunque el estrés biótico incluye perturbaciones vivas, tales como hongos o insectos perjudiciales, los factores del estrés abiótlco pueden ser naturales o hechas por el hombre, e incluyen temperatura, suelo seco, estrés osmótico, sequía, deficiencia de sales o de nutrientes, todos los cuales pueden causar daño en las plantas en el área afectada (véase, por ejemplo, la Tabla 2 en Bianco Carmen y Defez Roberto (2011 ); Soil Bacteria Support and Protect Plants Against Abiotic Stresses, Abiotic Stress in Plants - Mechanisms and Adaptations, Prof. Arun Shanker (Ed.), ISBN: 978-953-307-394-1, InTech, disponible de: http:bwww.intechopen.com/books/abiotic-stress-in-plants-mechanisms-andadaptations/soil-bacteria-support-and-protect-plants-against-abiotic-stresses.

En este contexto, en algunas formas de realización, se excluye la toxicidad por metales pesados de los factores de estrés que causan estrés abiótico.

El término “deficiencia de nutrientes”, según se usa en la presente, se refiere a la deficiencia de nutrientes que resulta en la deprivación de nutrientes para una planta cuando se cultiva bajo condiciones deficientes en nutrientes. Por consiguiente, el término “aumentar la resistencia a una deficiencia de nutrientes” se refiere a la capacidad de las bacterias contempladas en la presente (o composiciones que contienen a estas bacterias) para suministrar nutrientes a la planta con el fin de reducir o eliminar la falta de un nutriente, reduciendo o eliminando así el estrés abiótico (véase Lunde et al, Climate Change: Global Risks, Challenges and Decisions, IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science 6 (2009) 372029, doi: 10,1088/1755-1307/6/7/372029, IOP Publishing). La mayor resistencia al estrés causado por la deficiencia de nutrientes es causada por la capacidad de las bacterias para solubilizar los nutrientes del suelo tales como potasio, fosfato o hierro, volviéndolas disponibles para su captación por la planta. En el caso de una mayor disponibilidad de hierro, se cree que la mejora en su disponibilidad es causada por la producción de sideróforos por parte de las bacterias usadas en la invención, lo cual a su vez puede complejar el hierro y por consiguiente volverlo disponible para su captación por las plantas. Dicha disponibilidad para la captación por la planta también se conoce como “biodisponibilidad” en la presente. De acuerdo con la presente invención, una “biodisponibilidad mejorada” significa que la captación de uno o más nutrientes del suelo aumentan o mejoran en una cantidad mensurable o notable con respecto a la misma captación de nutrientes de una planta producida bajo las mismas condiciones, pero sin la aplicación de la composición de la presente invención. La captación se puede medir cosechando y analizando el tejido vegetal. De acuerdo con la presente invención, se prefiere que la biodisponibilidad aumente en por lo menos un 0,5%, o en por lo menos un 1%, o en por lo menos un 2%, o en por lo menos un 4%, o en por lo menos un 5% o en por lo menos un 10% cuando se compara con los controles apropiados.

En algunas formas de realización, las cepas y las composiciones usadas en la presente invención se aplican antes de la siembra y se pueden denominar inoculantes del suelo. La aplicación de presiembra mejora la biodisponibilidad de nutrientes en el suelo y/o mejora el rendimiento y/o el crecimiento y/o el vigor de plantas que se plantan en un suelo pretratado. En formas de realización específicas, la cepa y las composiciones se aplican al suelo o al medio para macetas por lo menos aproximadamente un día antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente dos días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente tres días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente cuatro días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente cinco días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente seis días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente siete días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente ocho días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente nueve días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente diez días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente 11 días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente 12 días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente 13 días antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente 14 días antes de la siembra , o por lo menos aproximadamente 2,5 semanas antes de la siembra, o por lo menos aproximadamente tres semanas antes de la siembra.

En algunas formas de realización, las cepas y las composiciones usadas en la presente invención mejoran la nutrición del suelo. El término “nutrición del suelo” según se usa en la presente se refiere a la condición del suelo en términos de los niveles de nutrientes de plantas disponibles contenidos en el mismo. Al mejorar la nutrición del suelo, la presente invención aumenta la disponibilidad de estos nutrientes para las plantas. Los nutrientes de las plantas incluyen nitrógeno (N), fósforo (P), potasio (K), calcio (Ca), azufre (S), magnesio (Mg), silicio (Si), boro (B), cloro (Cl), manganeso (Mn), hierro (Fe), zinc (Zn), cobre (Cu), molibdeno (Mo), níquel (Ni), selenio (Se) y sodio (Na).

Cuando los materiales orgánicos son devueltos al suelo proveen nutrición del suelo y de carbono orgánico. Este carbono orgánico mejora la salud del suelo y de las plantas de cultivo. Para utilizar los nutrientes de las plantas presentes en los materiales orgánicos es necesaria una biodegradación para reducirlos a compuestos más simples. En una forma de realización, el proceso de degradación es facilitado por las cepas y las composiciones de la presente invención cuando se las aplica al suelo. Este proceso de biodegradación de los materiales orgánicos y de enriquecimiento en carbono orgánico en el suelo también le provee al suelo la estabilidad de retención de agua.

En una forma de realización, las cepas y las composiciones de la presente invención facilitan la biodegradación de los materiales orgánicos con enzimas hidrolíticas. Las enzimas hidrolíticas pueden ser proteinasas, celulasas o xilanasas, que catalizan la hidrólisis de proteínas, celulosa y xilano, respectivamente. En algunas formas de realización, la celulasa es una endoglucanasa y la xilanasa es una endoxilanasa. Las endoglucanasas y las endoxilanasas diván los enlaces internos en los polisacáridos de celulosa y xilano, respectivamente, en tanto las exoglucanasas y las exoxilanasas clivan los enlaces próximos a los extremos expuestos (por ejemplo, entre 2 y 4 unidades desde el extremo) de los polisacáridos.

En determinadas formas de realización, el método para mejorar la nutrición del suelo comprende además aplicar un material orgánico al suelo. El material orgánico se puede encontrar en la forma de compost, desechos de animales o cualquier otra fuente de carbono orgánico.

En algunas otras formas de realización, la resistencia al estrés abiótico que aumenta con el tratamiento de una planta con una composición que comprende Bacillus subtilis, Bacillus pumilus o un mutante de los mismos es resistencia al estrés salino. Los ejemplos de estrés salino comprenden la tolerancia a sales o la resistencia a sequía.

El término “tolerancia a sales” se usa en la presente con su significado común para hacer referencia a la resistencia de las plantas a concentraciones de sales. Por consiguiente, “aumentar la resistencia o tolerancia a sales de una planta” se refiere al aumento/mejora de la capacidad de la planta para resistir o tolerar una concentración de sales (en su entorno, es decir, en el suelo o en el agua) cuando la planta es expuesta a una concentración de sales que es mayor que la concentración de sales que habitualmente es fisiológicamente aceptable para la planta.

El término “tolerancia a la sequía” también se usa en la presente con su significado común como la capacidad de una planta para mantener un equilibrio de agua y turgencia favorables, aún cuando se la expone a condiciones de sequía, evitando de esa manera el estrés y sus consecuencias. Por consiguiente, “aumentar la resistencia a sequía” de una planta se refiere a un aumento/mejora de la capacidad de la planta para mantener un equilibrio de agua y turgencia favorables con respecto a cuando la planta es expuesta a condiciones de sequía durante la cual la planta no recibe la cantidad de agua que necesita comúnmente para mantener su equilibrio de agua y turgencia.

El término “estrés salino” se refiere a la exposición de una planta a una fuerza iónica diferente de la fuerza iónica óptima para la planta respectiva. Típicamente, la fuerza iónica difiere de la fuerza iónica óptima en que es aproximadamente 1,2 veces o más mayor o menor que la fuerza iónica óptima para la planta respectiva. En algunas formas de realización, la fuerza iónica difiere de la fuerza iónica óptima para la planta respectiva en que es aproximadamente 1,5 veces o más mayor o menor que la fuerza iónica óptima para la planta respectiva. En algunas formas de realización, la fuerza iónica difiere de la fuerza iónica óptima en un factor de 2, incluyendo un factor de 2,5. En algunas formas de realización, la fuerza iónica es aproximadamente tres veces o más mayor o menor que la fuerza iónica óptima para la planta respectiva. En algunas formas de realización, la fuerza iónica difiere de la fuerza iónica óptima en un factor de 3,5, incluyendo un factor de 4. En algunas formas de realización, la fuerza iónica es aproximadamente cinco veces o más mayor o menor que la fuerza iónica óptima para la planta respectiva. El estres salino puede deberse a la concentración de uno o más entre NaCI, KCI, LiCI, MgCI2 y CaCI2, que difiere de las concentraciones óptimas de la sal respectiva en un factor de aproximadamente 1,5 o más.

En algunas formas de realización, la concentración de NaCI, KCI, LiCI, MgCI2 y/o CaC difiere de la concentración óptima de la planta respectiva para la sal respectiva en un factor de aproximadamente 1,5 veces o más. En algunas formas de realización, la concentración de NaCI, KCI, LiCI, MgCI2 y/o CaCI2 difiere de la concentración óptima de la planta respectiva para la sal respectiva en un factor de aproximadamente dos veces o más, incluyendo un factor de 2,5 o un factor de 3. En algunas formas de realización, la concentración de NaCI, KCI, LiCI, MgCI2 y/o CaCI2 difiere de la concentración óptima de la planta respectiva para la sal respectiva en un factor de aproximadamente 4 veces o más.

En algunas formas de realización, la fuerza iónica óptima está definida por un rango conocido de fuerza iónica, a la cual la planta dada presenta un vigor, un crecimiento, una producción de biomasa o cualquier otro parámetro adecuado óptimos como se ilustra más adelante. Asimismo, es sabido que la concentración óptima de uno o más entre NaCI, KCI, LiCI, MgCI2 y CaCI2 puede definirse por un rango determinado, en el cual la planta dada presenta un vigor, un crecimiento, una producción de biomasa o cualquier otro parámetro adecuado óptimos como se lustra más adelante. El estrés salino puede definirse, en dicha forma de realización, por una fuerza iónica que excede el límite superior de dicho rango o que cae por debajo del límite inferior de un rango respectivo en un factor de aproximadamente 1,2 veces o más. Lo mencionado con respecto a una fuerza iónica o concentración de sales óptimas se aplica por lo demás mutatis mutandis. La resistencia a sales se puede verificar, en algunas formas de realización, por exposición de una planta de interés a agua con una concentración salina elevada (véase también la Sección de Ejemplos). La concentración salina del agua que irriga al suelo se puede expresar convenientemente como partes por millón de las sales disueltas p/p en el agua. El agua dulce típicamente contiene menos que 1.000 ppm de sales; el agua ligeramente salina típicamente contiene entre 1.000 ppm y 3.000 ppm; el agua moderadamente salina típicamente contiene entre 3.000 ppm y 10.000 ppm; el agua altamente salina típicamente contiene entre 10.000 ppm y 35.000 ppm; en tanto el agua de mar típicamente contiene 35.000 ppm de sales.

La mayor resistencia al estrés salino (es decir, tolerancia a sales o resistencia a sequía) de una planta se puede analizar mediante cualquier método deseado disponible en el arte. Típicamente, se compara una característica de la planta de interés con una referencia. Dicha referencia puede ser una planta correspondiente mantenida bajo las mismas condiciones o condiciones comparables con la excepción que la planta no es expuesta a una composición que incluye Bacillus subtilis o Bacillus pumilus. En algunas formas de realización, se puede usar una referencia adicional para dar cuenta del efecto del estrés salino. Dicha referencia adicional puede ser una planta que corresponde a la planta de interés por cuanto se mantiene bajo las mismas condiciones o condiciones comparables con la excepción que la planta no es expuesta a las condiciones que inducen estrés salino. Por consiguiente una planta que sirve como dicha referencia adicional típicamente se mantiene a condiciones bajo las cuales la planta es expuesta a niveles de sales que se sabe son bien toleradas por la respectiva especie de planta.

El estrés salino típicamente se manifiesta como un estrés osmótico, que da como resultado la interrupción de la homeostasis y la distribución de iones en las células de una planta. Dicho estrés por salinidad o por sequía puede causar desnaturalización de proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, se pueden activar las vías de señalización del estrés celular y las respuestas de celular estrés, tal como la producción de proteínas de estrés, la sobrerregulación de anti-oxidantes, la acumulación de solutos compatibles y el arresto del crecimiento.

Un ejemplo de un indicador de resistencia al estrés salino u otra resistencia al estrés abiótico (tal como resistencia a la deficiencia de nutrientes) de una planta es el índice de crecimiento de la planta. El índice de crecimiento de la planta se puede evaluar, por ejemplo, monitoreando la altura de la planta, la longitud de las raíces o la longitud de los brotes de la planta sobre un período de tiempo. Un ejemplo adicional de un indicador de resistencia al estrés abiótico de una planta es el desarrollo de la planta. En este sentido, se puede evaluar, por ejemplo, cuanto demora una planta para alcanzar las diversas etapas del desarrollo. En términos generales en este sentido, un ejemplo de un indicador de resistencia al estrés abiótico de una planta es el vigor de la planta. El vigor de la planta también se puede manifestar según diversos aspectos, algunos de los cuales comprenden el aspecto visual, por ejemplo, color de la hoja, color y aspecto de los frutos, cantidad de hojas básales muertas y/o extensión de las laminas foliares, el peso de las plantas, la altura de las plantas, la extensión de las plantas (vuelco), número, fuerza y productividad de retoños, longitud del panículo, extensión del sistema radicular, fuerza de las raíces, extensión de nodulación, en particular de nodulación de rizobios, momento de la germinación, emergencia, floración, madurez de los granos y/o senescencia, contenido de proteínas, contenido de azúcares, peso de mil granos, porcentaje de germinación, porcentaje de emergencia, crecimiento de las plántulas, altura de las plántulas, longitud de las raíces o biomasa de raíces y brotes, por nombrar unos pocos ejemplos (véase también la Sección de Ejemplos en donde se usaron el tamaño y el peso de las raíces o de los brotes para evaluar la resistencia al estrés salino de las plantas de arroz). El término “biomasa”, según se usa en la presente, se refiere al peso total de una planta. En la definición de biomasa, se puede distinguir entre la biomasa de una o más partes de una planta, que puede incluir cualquiera entre una o más de las siguientes partes: partes aéreas tales como, pero en un sentido no taxativo, biomasa de los brotes, biomasa de las semillas y biomasa de las hojas; partes aéreas cosechables tales como, pero en un sentido no taxativo, biomasa de los brotes, biomasa de las semillas y biomasa de las hojas; partes subterráneas tales como, pero en un sentido no taxativo, biomasa de raíces; la biomasa vegetativa tal como la biomasa de raíces o la biomasa de los brotes; órganos reproductores; y propágulos tales como semillas.

Otro ejemplo de un indicador de resistencia al estrés abiótico de una planta es el rendimiento del cultivo. Los términos “cultivo” y “fruto” se interpretarán como cualquier producto de una plantas que se utiliza luego después de la cosecha, por ejemplo frutas en el sentido real, verduras, frutos secos, granos, semillas, madera (por ejemplo, en el caso de plantas de silvicultura) o flores (por ejemplo, en el caso de las plantas de jardinería, ornamentales). Sobre una base general, el cultivo y los frutos puede ser cualquiera de valor económico que es producido por la planta. Aún otro ejemplo de un indicador de resistencia al estrés ablótlco de una planta es la tolerancia o la resistencia de la planta a los factores de estrés biótico. En algunas formas de realización, la supervivencia de la plántula puede servir como un ejemplo adicional de un indicador de resistencia al estrés abiótico de una planta. Se puede analizar cualquier indicador tal de resistencia al estrés abiótico de una planta cuando se desea, ya sea solo o varios indicadores combinados entre sí.

En este sentido, un “mayor rendimiento” de una planta, en particular de una planta para agricultura, silvicultura y/u ornamental, significa que el rendimiento de un producto de la respectiva planta aumenta en una cantidad mensurable con respecto al rendimiento del mismo producto de la planta producida bajo la misma exposición a estrés abiótico, incluyendo sequía o deficiencia de nutrientes, pero sin la aplicación de la composición de la invención. En algunas formas de realización, el rendimiento de una planta con mayor resistencia al estrés abiótico aumenta en aproximadamente un 0,5% o más, cuando se compara con una planta no tratada correspondiente bajo condiciones similares o iguales de estrés abiótico. En algunas formas de realización, el rendimiento de una planta con mayor resistencia al estrés abiótico aumenta en por lo menos aproximadamente un 1% bajo condiciones de estrés abiótico. En algunas formas de realización, el rendimiento aumenta en por lo menos aproximadamente un 2%, tal como en por lo menos aproximadamente un 4% bajo condiciones de estrés abiótico. En algunas formas de realización, el rendimiento aumenta en por lo menos aproximadamente un 5% bajo condiciones de estrés abiótico. En algunas formas de realización, el rendimiento aumenta en por lo menos aproximadamente un 10% cuando se compara con un control adecuado bajo condiciones de estres abiótico.

La resistencia a la sequía de una planta de interés (y por consiguiente el aumento en su resistencia a la sequía con relación a una planta control cultivada bajo condiciones idénticas) también se puede determinar mediante tratamiento de la planta con una composición de Bacillus subtilis o Bacillus pumilus por un período de tiempo adecuado y luego se puede detener o reducir el riego y después determinar cual es la planta que colapsa primero, si la planta tratada con una composición de Bacillus subtilis o Bacillus pumilus o la planta control. Como alternativa, la resistencia a la sequía se puede determinar haciendo pasar a las plantas por ciclos repetidos de estrés por agua (es decir, sin irrigación de las plantas) y suministro adecuado de agua y evaluar cuál será la última planta en colapsar.

Como se explicó previamente, en un método de la presente invención la composición que incluye Bacillus subtilis y/o Bacillus pumilus se puede aplicar a una amplia variedad de cultivos agronómicos y/o de horticultura, incluyendo aquellos cultivados por semillas, producción, paisajismo y aquellos cultivados por la producción de semillas. Las plantas representativas a las cuales se puede aplicar la composición incluyen, pero en un sentido no taxativo, los siguientes plantas: Brassica, verduras de bulbo, granos de cereales, cítricos, algodón, curcurbitáceas, verduras de frutos, verduras de hoja, legumbres, cultivos de semillas oleaginosas, maní, frutas carnosas, verduras de raíz, verduras de tubérculos, verduras de bulbo, frutas con carozo, tabaco, frutillas y otras bayas, y diversas ornamentales.

La composición usada en el contexto de la invención se puede usar y/o proveer en cualquier forma que mantenga al Bacillus subtilis y/o al Bacillus pumilus, respectivamente, en una forma por lo menos esencialmente viable. La composición se puede aplicar a la superficie de una planta, a la superficie de una porción de una planta, a un fruto, a la proximidad de una planta, a la proximidad de un fruto, a un área que abarca a la planta o a los frutos o a un área que abarca a la parte de planta.

La composición se puede administrar como un rociado foliar, como un tratamiento de semillas/raíces/tubérculos/rizomas/bulbos/tallo bulboso/gajo y/o como un tratamiento de la tierra. La composición se puede aplicar a semillas/raíces/tubérculos/rizomas/bulbos/tallos bulbosos/gajos antes de la siembra, durante la siembra o después de la siembra. Cuando se usa como un tratamiento de semillas, las composiciones de la presente invención se aplican a una dosis de entre aproximadamente 1 x 102 y aproximadamente 1 x 1010 unidades formadoras de colonias (“UFC”)/semilla, dependiendo del tamaño de la semilla. En algunas formas de realización, las composiciones de la presente invención se aplican a una dosis de entre aproximadamente 1 x 102 y aproximadamente 1 x 109 UFC/semilla, dependiendo del tamaño de la semilla. En algunas formas de realización, las composiciones de la presente invención se aplican a una dosis de entre aproximadamente 1 x 102 y aproximadamente 1 x 108 UFC/semilla, dependiendo del tamaño de la semilla. En algunas formas de realización, las composiciones de la presente invención se aplican a una dosis de entre aproximadamente 1 x 102 y aproximadamente 1 x 107 UFC/semilla, dependiendo del tamaño de la semilla. En algunas formas de realización, la dosis de aplicación es de entre aproximadamente 1 x 103 y aproximadamente 1 x 108 UFC por semilla, dependiendo del tamaño de la semilla. En algunas formas de realización, la dosis de aplicación es de entre aproximadamente 1 x 103 y aproximadamente 1 x 107 UFC por semilla, dependiendo del tamaño de la semilla. En algunas formas de realización, la dosis de aplicación es de entre aproximadamente 1 x 103 y aproximadamente 1 x 106 UFC por semilla, dependiendo del tamaño de la semilla. En algunas formas de realización, la dosis de aplicación es de entre aproximadamente 1 x 104 y aproximadamente 1 x 107 UFC por semilla, dependiendo del tamaño de la semilla. Cuando se usa como un tratamiento de tierra, las composiciones de la presente invención se pueden aplicar como un riego de la superficie de la tierra, por introducción con una caña, inyección y/o aplicación en surcos o mezclados con el agua de irrigación. La dosis de aplicación para los tratamientos mediante riego de superficie de la tierra, que se puede aplica en el momento de la siembra, durante o después de la siembra, o después del transplante y en cualquier etapa del crecimiento vegetal, es de entre aproximadamente 4 x 107 y aproximadamente 8 x 1014 UFC por aere o de entre aproximadamente 4 x 109 y aproximadamente 8 x 1013 UFC por acre o de entre aproximadamente 4 x 1011 y aproximadamente 8 x 1012 UFC por acre o de entre aproximadamente 2 x 1012 y aproximadamente 6 x 1013 UFC por acre o de entre aproximadamente 2 x 1012 y aproximadamente 3 x 1013 UFC por acre. En algunas formas de realización, la dosis de aplicación es de entre aproximadamente 1 x 1012 y aproximadamente 6 x 1012 UFC por acre o de entre aproximadamente 1 x 1013 y aproximadamente 6 x 1013 UFC por acre. En algunas formas de realización, la dosis de aplicación para los tratamientos mediante riego de superficie de la tierra, que se puede aplicar en el momento de la siembra, durante o después de la siembra, o después del transplante y en cualquier etapa del crecimiento vegetal, es de entre aproximadamente 4 x 1011 y aproximadamente 8 x 1012 UFC por acre. En otras formas de realización, la dosis de aplicación es de entre aproximadamente 6 x 1012 y aproximadamente 8 x 1012 UFC por acre. En aún otras formas de realización, la dosis de aplicación es de entre aproximadamente 6 x 1012 y aproximadamente 8 x 1012 UFC por acre. En otras formas de realización, la dosis de aplicación es de por lo menos aproximadamente 1 x 108 UFC por acre, por lo menos aproximadamente 1 x 109 UFC por acre, por lo menos aproximadamente 1 x 101° UFC por acre, por lo menos aproximadamente 1 x 1011 UFC por acre, por lo menos aproximadamente 1 x 1012 UFC por aere o por lo menos aproximadamente 1 x 1013 UFC por acre. La dosis de aplicación para los tratamientos en surcos, aplicada en el momento de la siembra, es de entre aproximadamente 2,5 x 101° y aproximadamente 5 x 1011 UFC por 1000 pies de fila. En algunas formas de realización, la dosis de aplicación es de entre aproximadamente 6 x 101° y aproximadamente 4 x 1011 UFC por 1000 pies de fila. En otras formas de realización, la dosis de aplicación es de entre aproximadamente 3,5 x 1011 UFC por 1000 pies de fila y aproximadamente 5 x 1011 UFC por 1000 pies de fila. En aún otras formas de realización, la dosis de aplicación para los tratamientos en surcos, aplicada en el momento de la siembra, es de por lo menos aproximadamente 1 x 109 UFC por cada 1000 pies de fila, por lo menos aproximadamente 1 x 101° UFC por cada 1000 pies de fila, por lo menos aproximadamente 1 x 1011 UFC por cada 1000 pies de fila o por lo menos aproximadamente 1 x 1012 UFC por cada 1000 pies de fila.

La composición también se puede preparar para su aplicación como un fumigante para su aplicación tanto en exteriores como en interiores, por ejemplo en ambientes cerrados, tales como invernaderos, galpones o invernaderos para animales, domicilios humanos y otros edificios. Los especialistas en el arte conocerán los diversos métodos para preparar tales fumigantes, por ejemplo, como concentrados de neblina y generadores de humo. Un concentrado de neblina generalmente es una formulación líquida para su aplicación por medio de una máquina de neblina con el fin de crear una niebla fina que se pueda distribuir por todo un ambiente cerrado y/o abierto. Dichos concentrados de neblina se pueden preparar usando téenicas conocidas para permitir la aplicación mediante una máquina de neblina. Los generadores de humo, que generalmente son una formulación en polvo que se quema para crear un fumigante de humo. Dichos generadores de humo también se pueden preparar usando técnicas conocidas.

En un método de acuerdo con la invención, la composición se puede aplicar de numerosas maneras diferentes. Para una aplicación a pequeña escala, se pueden utilizar tanques de mochila, pulverizadores telescópicos manuales, botellas pulverizadoras o latas de aerosol. Para una aplicación a una escala algo mayor, se pueden emplear equipos tirados por tractores con plumas, sopladores de niebla tirados por tractores, avionetas o helicópteros equipados para rociado o pulverizadores de neblinas. La aplicación a escala pequeña de las formulaciones sólidas se puede llevar a cabo de numerosas maneras diferentes, como por ejemplo: agitación directa del producto desde el contenedor o mediante aplicación por gravedad utilizando un aplicador de fertilizante accionado por humanos. La aplicación a gran escala de formulaciones sólidas se puede llevar a cabo por medio de aplicadores tirados por tractores alimentados por gravedad o dispositivos similares.

En algunas formas de realización, la composición que contiene Bacillus subtilis y/o Bacillus pumilus se puede aplicar antes, durante y/o al poco tiempo después de transplantar las plantas de una ubicación a otra, tal como de un invernadero o de un semillero al campo. En otro ejemplo, las composiciones se pueden aplicar al poco tiempo después que las plántulas emergen del suelo o de otro medio de crecimiento (por ejemplo, vermiculita). En aún otro ejemplo, las composiciones se pueden aplicar en cualquier momento a las plantas que crecen hidropónicamente. Por ende, de acuerdo con los métodos de la presente invención las composiciones se pueden aplicar en cualquier momento deseable durante el ciclo de vida de una planta. En algunas otras formas de realización, las composiciones de la presente invención se aplican a una planta y/o parte de planta dos veces, durante cualquier etapa del desarrollo deseada, a un intervalo de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente dos días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 10 días, aproximadamente dos semanas, aproximadamente tres semanas, aproximadamente 1 mes o más. En algunas formas de realización, las composiciones de la presente invención se aplican a una planta y/o parte de planta más de dos veces, por ejemplo, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces o más, durante cualquier etapa del desarrollo deseada, a un intervalo de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 10 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente dos días, aproximadamente 3 días, aproximadamente 4 días, aproximadamente 5 días, aproximadamente 1 semana, aproximadamente 10 días, aproximadamente dos semanas, aproximadamente tres semanas, aproximadamente 1 mes o más. Los intervalos entre cada aplicación pueden variar si se desea.

La presente invención provee además cualquiera de las composiciones de la presente invención que además comprenden al menos un ingrediente o agente activo adicional además de las células swrA- Dichos otros ingredientes o agentes activos pueden ser una sustancia química u otra cepa bacteriana. Los ejemplos de ingredientes o agentes activos adecuados incluyen, pero en un sentido no taxativo, un herbicida, un fungicida, un bactericida, un insecticida, un nematocida, un miticida, un regulador del crecimiento vegetal, un estimulante del crecimiento vegetal, un fertilizante y combinaciones de los mismos.

La presente invención provee además cualquiera de las bacterias formadoras de esporas, tal como Bacillus subtilis, o composiciones de la presente invención que además comprenden una formulación inerte u otro ingrediente de formulación, tales como polisacáridos (almidones, maltodextrinas, metilcelulosas, proteínas, tal como proteína del suero, péptidos, gomas), azúcares (lactosa, trehalosa, sacarosa), lípidos (lecitina, aceites vegetales, aceites minerales), sales (cloruro de sodio, carbonato de calcio, citrato de sodio) y silicatos (arcillas, sílice amorfa, sílices de humo/precipitadas, sales de silicato). En algunas formas de realización, tales como aquellas en las cuales las composiciones se aplican a la tierra, las composiciones de la presente invención comprenden un vehículo, tal como agua o un material mineral u orgánico, tal como turba, que facilita la incorporación de las composiciones en la tierra. En algunas formas de realización, tales como aquellas en donde se usa la composición para el tratamiento de semillas o como una inmersión radicular, el vehículo es un aglutinante o adhesivo que facilita la adherencia de la composición a la semilla o raíz. En otra forma de realización en donde las composiciones se usan como un tratamiento de semillas, el ingrediente de formulación es un colorante. En otras composiciones, el ingrediente de formulación es un conservante.

Las composiciones de la presente invención pueden incluir ingredientes de formulación inertes que se agregan a las composiciones que comprenden células, preparaciones sin células o metabolitos para mejorar la eficacia, la estabilidad y utilidad y/o para facilitar el procesamiento, el envasado y la aplicación de uso final. Dichos ingredientes de formulación inertes pueden incluir vehículos, agentes de estabilización, nutrientes o agentes modificadores de las propiedades físicas, que se pueden agregar individualmente o combinados. En algunas formas de realización, los vehículos pueden incluir materiales líquidos tales como agua, aceite y otros solventes orgánicos o inorgánicos y materiales sólidos tales como minerales, polímeros o complejos de polímeros derivados biológicamente o mediante síntesis química. En algunas formas de realización, el vehículo es un aglutinante o un adhesivo que facilita la adherencia de la composición a una parte de planta, tal como una semilla o raíz. Véase, por ejemplo, Taylor, A.G., et al., “Concepts and Technologies of Selected Seed Treatments” Annu. Rev. Phytopathol. 28: 321-339 (1990). Los agentes de estabilización pueden incluir agentes anti-aglutinantes, agentes anti-oxidantes, desecantes, protectores o conservantes. Los nutrientes pueden incluir fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo, tales como azúcares, polisacáridos, aceite, proteínas, aminoácidos, ácidos grasos y fosfatos. Los modificadores de las propiedades físicas pueden incluir agentes de carga, agentes humectantes, espesantes, modificadores del pH, modificadores de la reología, dispersantes, adyuvantes, agentes tensioactivos, agentes anticongelantes o colorantes. En algunas formas de realización, la composición que comprende células, una preparación sin células o metabolitos producidos por fermentación se pueden usar directamente con o sin agua como diluyente sin ninguna otra preparación de formulación. En algunas formas de realización, los ingredientes de formulación inertes se agregan después de concentrar el caldo de fermentación y durante y/o después del secado.

La lista o mención de un documento publicado anterior en esta memoria descriptiva no se debería entender necesariamente como un reconocimiento de que el documento es parte del estado actual de la teenología o es conocimiento general común.

La invención descrita ilustradamente en la presente puede ser practicada convenientemente en ausencia de cualquier elemento o elementos o limitación o limitaciones que no se revelan específicamente en la presente. Así, por ejemplo, los términos “que comprende”, “que incluye”, “que contiene”, etc., se considerarán en un sentido amplio y sin limitaciones. Las formas en singular tales como “un”, “una”, “el” y “la” abarcan las referencias en plural, a menos que del contexto surja lo contrario. A menos que se indique de otra manera, se interpreta que el término “por lo menos” cuando precede a una serie de elementos hará referencia a cada elemento en la serie. Los términos “por lo menos uno” y “por lo menos uno entre” incluyen por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro o cinco o más elementos. Se pueden usar ligeras variaciones por encima y por debajo de los rangos definidos para obtener sustancialmente los mismos resultados que los valores comprendidos en los rangos. Además, a menos que se indique de otra manera, se pretende que la divulgación de los rangos sea como un rango continuo, incluyendo cada valor entre los valores mínimos y máximos.

Además, los términos y las expresiones empleados en la presente se usan como términos descriptivos y no limitativo, y no hay ninguna intención que el uso de tales términos y expresiones excluya cualquier equivalente de las características que se muestran y describen, o porciones de las mismas, pero se reconoce que es posible efectuar diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Por lo tanto, se comprenderá que aunque la presente invención se ha divulgado específicamente mediante formas de realización específicas y características opcionales, el especialista en el arte podrá recurrir a modificaciones y/o variaciones de las formas de realización descritas en la presente, y que tales modificaciones y variaciones se considerarán dentro del alcance de esta invención.

En la presente se ha descrito la invención de manera amplia y genérica. Cada una de las especies más estrechas y las agrupaciones subgenéricas que caen dentro de la divulgación genérica también forman parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa que remueve a cualquier objeto del género, independientemente de si el material eliminado se menciona específicamente, o no, en la presente.

Otras formas de realización se encuentran dentro de las reivindicaciones adjuntas. Además, cuando se describen características o aspectos de la invención en términos de grupos Markush, los especialistas en la téenica comprenderán que la invención también se describirá así en términos de cualquier miembro o subgrupo individual del grupo Markush.

Para poder comprender la invención con mayor facilidad y ponerla en práctica, a continuación se describirán formas de realización particulares por medio de los siguientes ejemplos no taxativos, que solamente se ofrecen a efectos ilustrativos.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : Aumento de la resistencia al estrés salino por Bacillus subtilis Se condujo un primer estudio para analizar si la promoción del crecimiento vegetal es visible en las plántulas de arroz remojadas con SERENADE® cuando se irrigan con sales.

Procedimiento Se sembraron tres semillas de arroz, variedad RM401 , en macetas de 2,5” llenas de Profile Greens Grade. A cada semilla se le aplicaron (como un ejemplo de un producto/composición de fermentación usado en la presente) 2 mi del producto comercial SERENADE® a razón de 64 oz / aere (11 ,2% de los 100 mi de volumen total) o de agua. Las macetas se colocaron en bandejas sin orificios por grupo de tratamiento de remojo y se dejaron crecer en un invernadero. Las plantas fueron irrigadas con fertilizante 20-20-20 a 100 ppm de N por toda la duración del experimento y los niveles de irrigación se mantuvieron aproximadamente por la mitad de la altura de las macetas. Catorce días después de la siembra, a diez macetas de cada grupo de tratamiento de remojo (H2O o SERENADE® 64 oz/acre) se aplicaron concentraciones de sales de 60 mM de sales con la irrigación. El agua en las bandejas se reemplazó dos veces por semana y las plantas se calificaron 14 días después de comenzar los tratamientos con sales. Las plantas se cosecharon y se dejaron secar. Se registraron los pesos de raíces y brotes.

Resultados: Las plantas de arroz tratadas con SERENADE SOIL® e irrigadas con sales a 60 mM durante 14 días parecían más altas que las plantas tratadas con agua bajo estrés salino (Figura 1). Las raíces de las plantas de arroz con SERENADE SOIL® e irrigadas con sales a 60 mM durante 14 días parecían más largas que las plantas tratadas con agua bajo estrés salino (Figura 2). En un experimento separado que se condujo de la misma manera que se describió precedentemente, los pesos de las raíces y los brotes de las plantas tratadas con SERENADE ASO® e irrigadas con sales a 60 mM durante 14 días eran significativamente mayores que los pesos de las plantas tratadas con agua. Véase la Figura 5. Por consiguiente, este resultado muestra que una composición/producto de fermentación de la cepa QST713 de B. subtilis aumenta la resistencia al estrés salino (tolerancia al estrés salino) de plantas.

Ejemplo 2: Aumento de la resistencia al estrés salino por Bacillus pumilus Se condujo un segundo estudio para analizar si la promoción del crecimiento vegetal es visible en las plántulas de arroz remojadas con SONATA® cuando se irrigan con sales. En este estudio, también se comparó la eficacia del tratamiento con SONATA® con el tratamiento de las plantas con SERENADE®. Procedimiento Se sembraron tres semillas de arroz, variedad RM401, en macetas de 2,5” llenas de Profile Greens Grade. A cada semilla se le aplicaron (como un ejemplo de un producto/composición de fermentación usado en la presente) 2 mi del producto comercial SONATA® o SERENADE® a razón de 64 oz / aere (11,2% de los 100 mi de volumen total normalizado por UFC/planta) o de agua. Las macetas se colocaron en bandejas sin orificios por grupo de tratamiento de remojo y se dejaron crecer en un invernadero. Las plantas fueron irrigadas con fertilizante 20-20-20 a 100 ppm de N por toda la duración del experimento y los niveles de irrigación se mantuvieron aproximadamente por la mitad de la altura de las macetas. Catorce días después de la siembra, a diez macetas de cada grupo de tratamiento de remojo (H2O o SERENADE® 64 oz/acre) se aplicaron concentraciones de sales de 60 mM de sales con la irrigación. El agua en las bandejas se reemplazó dos veces por semana y las plantas se calificaron 14 días después de comenzar los tratamientos con sales. Las plantas se cosecharon y se dejaron secar. Se registraron los pesos de raíces y brotes.

Resultados: Las plantas de arroz tratadas con SONATA® e irrigadas con sales a 60 mM durante 14 días parecían más altas que las plantas tratadas con agua bajo estrés salino (Figura 3). Las raíces de plantas de arroz tratadas con SONATA® y SERENADE SOIL®, respectivamente, e irrigadas con sales a 60 mM durante 14 días parecían más largas que las plantas tratadas con agua bajo estrés salino (Figura 4). En la Figura 5 se muestran los pesos secos de raíces y brotes en mg de plantas tratadas con SERENADE ASO® y de plantas tratadas con agua. Los pesos secos de brotes y raíces son significativamente más altos en las plantas tratadas con SERENADE ASO® que las plantas tratadas con agua. Por consiguiente, este resultado muestra que una composición/producto de fermentación de la cepa QST2808 de B. pumilis aumenta la resistencia al estrés salino (tolerancia al estrés salino) de plantas.

Ejemplo 3: Aumento de la resistencia al estrés por sequía Generalmente se acepta que la tolerancia a sales imita la tolerancia a la sequía, de modo que se puede concluir que las plantas que presentan tolerancia a sales también serán tolerantes a la sequía. Por consiguiente, los experimentos que se describieron precedentemente también indican que la cepa QST713 de B. subtilis y la cepa QST2808 de B. pumilis también aumentan la resistencia a sequía en las plantas.

La resistencia a la sequía también se puede determinar como se explica a continuación.

Se sembraron plantas, tal como semillas de arroz, variedad RM401, en macetas de 2,5” llenas de Profile Greens Grade. A cada semilla se le aplicaron 2 mi de producto comercial SONATA® o SERENADE® a razón de 64 oz/acre (11,2% de los 100 mi de volumen total) o de agua. Las macetas se colocan en bandejas sin orificios por grupo de tratamiento de remojo y se dejaron crecer en un invernadero. Las plantas se irrigan con fertilizante 20-20-20 a 100 ppm de N por toda la duración del experimento y los niveles de irrigación se mantienen aproximadamente por la mitad de la altura de las macetas. Catorce días después de la siembra, se detiene o reduce el riego de las diez macetas de cada grupo de tratamiento de remojo (H2O o SERENADE® 64 oz/acre) y se determinará cuál es la última planta en colapsar. Sobre la base de los resultados anteriores, se espera que las plantas tratadas con SONATA® o SERENADE® colapsarán después de las plantas que solamente recibieron agua.

Otro protocolo típico que se puede usar para determinar la tolerancia a la sequía comprende hacer pasar las plantas por ciclos repetidos de estrés por agua (es decir, sin irrigación de las plantas) y suministro adecuado de agua y evaluar cuál será la última planta en colapsar. Por ejemplo, se detuvo el suministro de agua hasta que las plantas tratadas con SONATA® y SERENADE® presentan signos de sufrimiento en cuyo momento las plantas se vuelven a regar. Se realizará una evaluación para determinar las últimas plantas en colapsar o que ofrecen un aspecto más saludable al final del experimento. Sobre la base de los resultados precedentes, también se espera que las plantas tratadas con SONATA® o SERENADE® colapsarán después de las plantas que solamente recibieron agua o que tendrán un aspecto más saludable al final del experimento cuando se comparan con las plantas tratadas con agua solamente.

Ejemplo 4: Ensayos para determinar las propiedades de solubilización de nutrientes para la solubilización de fosfato por el Bacillus subtilis Se cultivaron cultivos frescos de la cepa bacteriana (AQ30002 y AQ713) en un frasco de agitación que contiene medio NBRIY (glucosa 10 g/l, Ca3(P04)25 g/l (NH4)2SO40,1 g/l, NaCI 0,2 g/l, MgS04 x 7 H2O 0,25 g/l, KCI 0,2 g/l, MgCI2 x 6 H20 5 g/l, FeS04 x 7 H200,002 g/l. Los frascos se incubaron a 30 °C con agitación a 200 rpm por hasta 14 días. Las concentraciones de potasio soluble en el sobrenadante de caldo de cultivo se midieron después de 7 y 14 días mediante un ensayo colorimétrico usando un espectrofotómetro a 660 nm, usando un blanco de medio como control. Como se puede observar en la Figura 6, ambas cepas proporcionaron niveles significativamente más altos de fosfato soluble en medio NBRIY en comparación con el blanco de medio (Figura 6A, solubilización de fosfato por AQ713, Figura 6B, solubilización de fosfato por AQ30002).

Ejemplo 5: Ensayos para determinar las propiedades de solubilización de nutrientes por Bacillus subtilis A: Producción de sideróforos para mejorar las disponibilidad de hierro Se inocularon cultivos frescos de una cepa bacteriana (AQ30002 y AQ713) sobre placas de agar con cromo azurol S (CAS) usando el método de recubrimiento de agar CAS de acuerdo con Pérez-Miranda et al., O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection, J. Microbiol. Methods, 70: 127-131, 2007. Las placas se incubaron a 30°C por hasta 7 días. Se examinó visualmente el cambio de color de las placas de azul a anaranjado, que era indicativo de la producción de sideróforos. Las colonias AQ30002 y AQ713 causaron un cambio de color lo que indicaba que ambas cepas eran de utilidad como inoculantes de suelos para proveer una producción suficiente de sideróforos y así proporcionar una disponibilidad mejorada de hierro.

Ejemplo 6: Ensayos para determinar las actividades de endoglucanasa, endoxilanasa y proteinasa con el fin de mejorar los niveles nutricionales del suelo La actividad endoglucanasa, endoxilanasa y proteolítica se midieron usando agar con nutrientes suplementado con 1% de carboximetilcelulosa sódica (CMC-Na), 1% de xilano y 1% de AZO-caseína, respectivamente. Las cepas bacterianas AQ30002 y AQ713 se cultivaron primero sobre placas de agar con nutrientes de Hardy Diagnostics incubadas durante la noche a 30 °C. Luego se transfirió una sola colonia a la mitad de las placas suplementadas con sustrato (CMC-Na, xilano, AZO-caseína). Las placas se incubaron luego a 30 °C durante 2-7 días. Si al final del período de incubación se visualizaba una zona de aclaramiento entonces se consideró a la actividad enzimática como positiva.

La incubación de las colonias AQ30002 y AQ713 sobre las placas suplementadas con sustrato produjo una zona de aclaramiento con cada sustrato. La endoglucanasa y la endoxilanasa hidrolizan la celulosa y el xilano, respectivamente, siendo ambas polisacáridos que están presentes en las paredes de las células vegetales. Estas actividades hidrolíticas junto con la actividad proteinasa permiten que las cepas AQ713 y AQ30002 faciliten la conversión del material orgánico presente en el suelo en los nutrientes que podrán ser utilizados por las plantas en crecimiento.

Las raíces de las plantas también extruyen muchos materiales orgánicos sobre la superficie de las raíces. Sin limitaciones por ninguna teoría, los colonizadores de raíces tales como las cepas AQ713 y AQ30002 pueden emplear los extrudados como una fuente de energía para el crecimiento a lo largo de las raíces y, al mismo tiempo, liberan minerales de los materiales orgánicos por acción enzimática para que sean captados por la planta.

Claims

REIVINDICACIONES:

1. Un método para aumentar la resistencia al estrés abiótico de una planta, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende aplicar una composición que comprende Bacillus pumilus y/o Bacillus subtilis a la planta, a una parte de la planta y/o a un área alrededor de la planta o de la parte de planta, en donde el Bacillus pumilus se selecciona del grupo que consiste en la cepa QST 2808 de B. pumilus, un mutante de la cepa QST 2808 de B. pumilus, y combinaciones de los mismos, y el Bacillus subtilis se selecciona del grupo que consiste en la cepa QST713 de B. subtilis, la cepa QST30002 de B. subtilis, la cepa QST30004 de B. subtilis, un mutante de la cepa QST713 de B. subtilis, un mutante de la cepa QST30002 de B. subtilis, un mutante de la cepa QST30004 de B. subtilis, y combinaciones de los mismos.

2. El método de la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE la resistencia al estrés abiótico es resistencia al estrés salino o resistencia a una deficiencia de nutrientes.

3. El método de la reivindicación 2, CARACTERIZADO PORQUE la resistencia al estrés salino es tolerancia a sales o resistencia a sequía.

4. El método de la reivindicación 2, CARACTERIZADO PORQUE la resistencia a una deficiencia de nutrientes se aumenta mediante solubilización de los nutrientes o por estimulación de la producción de sideróforos de la planta en el suelo en un área alrededor de la planta o de la parte de planta.

5. El método de la reivindicación 4, CARACTERIZADO PORQUE la solubilización de nutrientes mejora la biodisponibilidad de nutrientes en por lo menos aproximadamente un 5%.

6. El método de la reivindicación 4, CARACTERIZADO PORQUE la solubilización de nutrientes se selecciona del grupo que consiste en solubilización de potasio, solubilización de fosfato, solubilización de hierro causada por unión de sideróforos, y combinaciones de las mismas.

7. El método de la reivindicación 6, CARACTERIZADO PORQUE la aplicación es precedida por identificación de bajas concentraciones en el suelo de uno o más nutrientes del suelo seleccionados del grupo que consiste en potasio, fosfato y hierro.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, CARACTERIZADO PORQUE la composición comprende células QST713 de Bacillus subtilis que tienen una mutación en el gen swrA y las células que contienen la mutación comprenden por lo menos un 3,5% de las células bacterianas totales en la composición.

9. El método de la reivindicación 8, CARACTERIZADO PORQUE las células que contienen la mutación comprenden por lo menos un cambio de un par de bases de ácido nucleico en un codón de inicio y/o por lo menos una inserción o supresión de un par de bases de ácido nucleico en el gen swrA.

10. El método de la reivindicación 9, CARACTERIZADO PORQUE la inserción o supresión en el gen swrA tiene lugar en uno o más de los pares de bases en las posiciones 26-34 de la SEQ ID N°: 1.

11. El método de la reivindicación 8, CARACTERIZADO PORQUE las células que contienen la mutación se seleccionan del grupo que consiste en la cepa QST30002 y la cepa QST30004, depositada como los N° de Acceso NRRL B-50421 y NRRL B-50455, respectivamente.

12. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADO PORQUE la composición además comprende por lo menos un vehículo.

13. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADO PORQUE además comprende aplicar por lo menos un ingrediente activo adicional a la composición.

14. El método de la reivindicación 13, CARACTERIZADO PORQUE el ingrediente activo es una sustancia química u otra cepa bacteriana.

15. El método de la reivindicación 13, CARACTERIZADO PORQUE el ingrediente activo se selecciona del grupo que consiste en un regulador del crecimiento vegetal, un estimulante del crecimiento vegetal, un fertilizante y combinaciones de los mismos.

16. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADO PORQUE la parte de planta se selecciona del grupo que consiste en una semilla, frutos, raíces, tallos bulbosos, tubérculos, bulbos y rizoma.

17. El método de la reivindicación 16, CARACTERIZADO PORQUE la composición se aplica a las semillas a una dosis de por lo menos aproximadamente 1 x 106UFC por semilla.

18. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADO PORQUE el método comprende aplicar la composición al suelo.

19. El método de la reivindicación 18, CARACTERIZADO PORQUE la composición se aplica a una dosis de entre aproximadamente 4 x 107 y aproximadamente 8 x 1014 UFC por acre.

20. El método de la reivindicación 18, CARACTERIZADO PORQUE la composición se puede aplicar antes, durante o después que la planta o parte de planta toma contacto con el suelo.

21. El metodo de la reivindicación 20, CARACTERIZADO PORQUE la composición se aplica por lo menos cinco días antes de la siembra aproximadamente.

22. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADO PORQUE la composición es una seleccionada del grupo que consiste en un líquido, un polvo humectable, gránulos, un material que fluye y microencapsulamientos.

23. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, CARACTERIZADO PORQUE la planta se selecciona del grupo que consiste en un árbol, una hierba, un arbusto, un pasto, una enredadera, un helécho, musgos y algas verdes, una planta monocotiledónea y una planta dicotiledónea.