MX2015002151A - Produccion de dienos volatiles por deshidratacion enzimatica de alquenoles ligeros. - Google Patents
Produccion de dienos volatiles por deshidratacion enzimatica de alquenoles ligeros.Info
- Publication number
- MX2015002151A MX2015002151A MX2015002151A MX2015002151A MX2015002151A MX 2015002151 A MX2015002151 A MX 2015002151A MX 2015002151 A MX2015002151 A MX 2015002151A MX 2015002151 A MX2015002151 A MX 2015002151A MX 2015002151 A MX2015002151 A MX 2015002151A
- Authority
- MX
- Mexico
- Prior art keywords
- dehydratase
- compound
- butadiene
- general formula
- formula
- Prior art date
Links
- 150000001993 dienes Chemical class 0.000 title claims abstract description 38
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 45
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 title abstract description 14
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 title abstract description 8
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N Butadiene Chemical compound C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 126
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 111
- RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N Isoprene Chemical compound CC(=C)C=C RRHGJUQNOFWUDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 82
- 108090001042 Hydro-Lyases Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 102000004867 Hydro-Lyases Human genes 0.000 claims abstract description 52
- SDJHPPZKZZWAKF-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbuta-1,3-diene Chemical compound CC(=C)C(C)=C SDJHPPZKZZWAKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- CJSBUWDGPXGFGA-UHFFFAOYSA-N dimethyl-butadiene Natural products CC(C)=CC=C CJSBUWDGPXGFGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 66
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 59
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 57
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 108030005936 Linalool dehydratases Proteins 0.000 claims description 17
- -1 diene compound Chemical class 0.000 claims description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- XXROGKLTLUQVRX-UHFFFAOYSA-N allyl alcohol Chemical compound OCC=C XXROGKLTLUQVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 73
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 73
- 101001051109 Castellaniella defragrans Linalool dehydratase/isomerase Proteins 0.000 description 60
- MKUWVMRNQOOSAT-UHFFFAOYSA-N methylvinylmethanol Natural products CC(O)C=C MKUWVMRNQOOSAT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 32
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 32
- WCASXYBKJHWFMY-UHFFFAOYSA-N gamma-methylallyl alcohol Natural products CC=CCO WCASXYBKJHWFMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 26
- CPJRRXSHAYUTGL-UHFFFAOYSA-N isopentenyl alcohol Chemical compound CC(=C)CCO CPJRRXSHAYUTGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- JEYLKNVLTAPJAF-UHFFFAOYSA-N xi-3-Methyl-3-buten-2-ol Chemical compound CC(O)C(C)=C JEYLKNVLTAPJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- HNVRRHSXBLFLIG-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-3-methylbut-1-ene Chemical compound CC(C)(O)C=C HNVRRHSXBLFLIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- ASUAYTHWZCLXAN-UHFFFAOYSA-N prenol Chemical compound CC(C)=CCO ASUAYTHWZCLXAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 21
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 20
- CDOSHBSSFJOMGT-UHFFFAOYSA-N linalool Chemical group CC(C)=CCCC(C)(O)C=C CDOSHBSSFJOMGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 19
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- GLZPCOQZEFWAFX-UHFFFAOYSA-N Geraniol Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCO GLZPCOQZEFWAFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 15
- WCASXYBKJHWFMY-NSCUHMNNSA-N 2-Buten-1-ol Chemical compound C\C=C\CO WCASXYBKJHWFMY-NSCUHMNNSA-N 0.000 description 14
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 14
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 13
- UAHWPYUMFXYFJY-UHFFFAOYSA-N beta-myrcene Chemical compound CC(C)=CCCC(=C)C=C UAHWPYUMFXYFJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 239000001490 (3R)-3,7-dimethylocta-1,6-dien-3-ol Substances 0.000 description 10
- CDOSHBSSFJOMGT-JTQLQIEISA-N (R)-linalool Natural products CC(C)=CCC[C@@](C)(O)C=C CDOSHBSSFJOMGT-JTQLQIEISA-N 0.000 description 10
- 238000000769 gas chromatography-flame ionisation detection Methods 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 10
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 10
- 229930007744 linalool Natural products 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 125000001844 prenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 10
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 9
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 9
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 241001277508 Castellaniella defragrans Species 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 8
- GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N Geraniol Natural products CC(C)=CCC\C(C)=C/CO GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N 0.000 description 8
- 239000005792 Geraniol Substances 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 229940113087 geraniol Drugs 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- NEJDKFPXHQRVMV-UHFFFAOYSA-N (E)-2-Methyl-2-buten-1-ol Natural products CC=C(C)CO NEJDKFPXHQRVMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OSUIFWPTEFZCMB-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbut-3-en-1-ol Chemical compound OCC(C)C(C)=C OSUIFWPTEFZCMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NEJDKFPXHQRVMV-HWKANZROSA-N 2-Methyl-2-buten-1-ol Chemical compound C\C=C(/C)CO NEJDKFPXHQRVMV-HWKANZROSA-N 0.000 description 6
- NVGOATMUHKIQQG-UHFFFAOYSA-N 2-Methyl-3-buten-1-ol Chemical compound OCC(C)C=C NVGOATMUHKIQQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZSPTYLOMNJNZNG-UHFFFAOYSA-N 3-Buten-1-ol Chemical compound OCCC=C ZSPTYLOMNJNZNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KJQMOGOKAYDMOR-UHFFFAOYSA-N CC(=C)C=C.CC(=C)C=C Chemical compound CC(=C)C=C.CC(=C)C=C KJQMOGOKAYDMOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 150000004808 allyl alcohols Chemical class 0.000 description 6
- VYBREYKSZAROCT-UHFFFAOYSA-N alpha-myrcene Natural products CC(=C)CCCC(=C)C=C VYBREYKSZAROCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 101150003532 CSH gene Proteins 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 5
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-M (R)-mevalonate Chemical compound OCC[C@](O)(C)CC([O-])=O KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-M 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiothreitol Chemical compound SCC(O)C(O)CS VHJLVAABSRFDPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N DL-mevalonic acid Natural products OCCC(O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- AWDLBZUXUNIODN-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbut-3-en-2-ol Chemical compound CC(=C)C(C)(C)O AWDLBZUXUNIODN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BZAZNULYLRVMSW-UHFFFAOYSA-N 2-Methyl-2-buten-3-ol Natural products CC(C)=C(C)O BZAZNULYLRVMSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 3
- CKWZHPCVVYXYEZ-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylbut-2-en-1-ol Chemical compound CC(C)=C(C)CO CKWZHPCVVYXYEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WCASXYBKJHWFMY-IHWYPQMZSA-N 2-buten-1-ol Chemical compound C\C=C/CO WCASXYBKJHWFMY-IHWYPQMZSA-N 0.000 description 2
- NSPPRYXGGYQMPY-UHFFFAOYSA-N 3-Methylbuten-2-ol-1 Natural products CC(C)C(O)=C NSPPRYXGGYQMPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- VZHHNDCSESIXJW-UHFFFAOYSA-N C(=CC(C)=C)OP(=O)(O)OP(=O)(O)O Chemical compound C(=CC(C)=C)OP(=O)(O)OP(=O)(O)O VZHHNDCSESIXJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 2
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical compound CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 2
- 241000588901 Zymomonas Species 0.000 description 2
- 241000588902 Zymomonas mobilis Species 0.000 description 2
- XECAHXYUAAWDEL-UHFFFAOYSA-N acrylonitrile butadiene styrene Chemical compound C=CC=C.C=CC#N.C=CC1=CC=CC=C1 XECAHXYUAAWDEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004676 acrylonitrile butadiene styrene Substances 0.000 description 2
- 229920000122 acrylonitrile butadiene styrene Polymers 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000006317 isomerization reaction Methods 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 101150006006 nudF gene Proteins 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N prenyl diphosphate Chemical compound CC(C)=CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O CBIDRCWHNCKSTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 2
- XTHUGLFFHZPVGL-XQHVRGAUSA-N (E)-but-2-en-1-ol Chemical compound C(\C=C\C)O.C(\C=C\C)O XTHUGLFFHZPVGL-XQHVRGAUSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VHVMXWZXFBOANQ-UHFFFAOYSA-N 1-Penten-3-ol Chemical compound CCC(O)C=C VHVMXWZXFBOANQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LLVWLCAZSOLOTF-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-[1,4,4-tris(4-methylphenyl)buta-1,3-dienyl]benzene Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(C=1C=CC(C)=CC=1)=CC=C(C=1C=CC(C)=CC=1)C1=CC=C(C)C=C1 LLVWLCAZSOLOTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BKOOMYPCSUNDGP-UHFFFAOYSA-N 2-methylbut-2-ene Chemical group CC=C(C)C BKOOMYPCSUNDGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241001133594 Castellaniella Species 0.000 description 1
- 240000002319 Citrus sinensis Species 0.000 description 1
- 235000005976 Citrus sinensis Nutrition 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 235000014663 Kluyveromyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108030004845 Linalool isomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241000589350 Methylobacter Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000253911 Saccharomyces fragilis Species 0.000 description 1
- 235000018368 Saccharomyces fragilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- 241000499912 Trichoderma reesei Species 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- RMBGGQZGADTQLW-UHFFFAOYSA-N acetylene prop-1-ene Chemical group C#C.CC=C RMBGGQZGADTQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002015 acyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229930003651 acyclic monoterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000002841 acyclic monoterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000009603 aerobic growth Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229920000704 biodegradable plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- WPOPOPFNZYPKAV-UHFFFAOYSA-N cyclobutylmethanol Chemical compound OCC1CCC1 WPOPOPFNZYPKAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 125000002897 diene group Chemical group 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001177 diphosphate Substances 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000000895 extractive distillation Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000003317 industrial substance Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- QVDTXNVYSHVCGW-ONEGZZNKSA-N isopentenol Chemical compound CC(C)\C=C\O QVDTXNVYSHVCGW-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 1
- NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N isopentenyl diphosphate Chemical compound CC(=C)CCO[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O NUHSROFQTUXZQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229940031154 kluyveromyces marxianus Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 229930003658 monoterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000002773 monoterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000002577 monoterpenes Nutrition 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001558 permutation test Methods 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000003880 polar aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003138 primary alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N sec-butylidene Natural products CCCC IJDNQMDRQITEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000004230 steam cracking Methods 0.000 description 1
- 229920003051 synthetic elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000005061 synthetic rubber Substances 0.000 description 1
- 229910052715 tantalum Inorganic materials 0.000 description 1
- GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N tantalum atom Chemical compound [Ta] GUVRBAGPIYLISA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003718 tetrahydrofuranyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000383 tetramethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
- C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
- C12P5/007—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons containing one or more isoprene units, i.e. terpenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
- C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
- C12Y402/01127—Linalool dehydratase (4.2.1.127)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Se describe un procedimiento para la generación de dienos conjugados por medio de un procedimiento biológico. Más específicamente, la solicitud describe un procedimiento para la producción de dienos conjugados (por ejemplo butadieno, isopreno o dimetilbutadieno) a partir de alquenoles ligeros a través de la deshidratación enzimática, en particular, mediante el uso de un alquenol deshidratasa.
Description
PRODUCCIÓN DE PIENOS VOLÁTILES POR DESHIDRATACIÓN
ENZIMÁTICA DE ALQUENOLES LIGEROS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento para la generación de dienos conjugados, en particular dienos volátiles, a traves de un procedimiento biológico. Más específicamente, la invención se refiere a un procedimiento para producir butadieno, isopreno o dimetilbutadieno de alquenoles ligeros a través de la deshidratación enzimática, en particular, mediante el uso de un alquenol deshidratasa, tal como una linalool deshidratasa (EC 4.2.1.127).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los dienos conjugados, por ejemplo, 1,3-dienos tales como butadieno o isopreno, son moléculas importantes para la industria. El isopreno (2-metil-1,3-butadieno) es un dieno conjugado con la fórmula CsHs. Es un compuesto clave para el sector de los neumáticos, y también tiene muchas aplicaciones en los adhesivos. Se produce químicamente usando varias vías:
- Destilación extractiva a partir de aceite (corte C5)
- Deshidrogenación de iso-amileno
- Doble deshidrogenación de isopentano
- Reacción de isobuteno y formaldehído
- Reacción de acetona y acetileno
- Dimerización de propileno
El documento WO 2009/076676 reseña una vía metabólica para isopreno. La vía está basada en la desfosforilación - deshidratación de intermedios cadena abajo en la vía del mevalonato, es decir, isoprenil-pirofosfato o prenil-pirofosfato. Este procedimiento tiene el inconveniente de que requiere ir a través de toda la vía del mevalonato: doble fosforilación del mevalonato, seguido por una descarboxilación -deshidratación en isoprenil-pirofosfato, isomerizado adicionalmente en prenil-pirofosfato, y finalmente doble desfosforilación / deshidratación en isopreno.
El butadieno (1,3-butadieno) es un dieno conjugado con la fórmula C4H6. Es un producto químico industrial importante usado como monómero en la producción de caucho sintetico, nylon, ABS (acrilonitrilo-butadieno-estireno), plásticos, látex. Existen diferentes posibilidades para producir butadieno. El butadieno se produce, por ejemplo, en forma de un subproducto del procedimiento de craqueo a vapor usado para producir etileno y otras olefinas. En este procedimiento el butadieno se produce en la corriente C4 y normalmente se aísla de otros subproductos por extracción en un disolvente aprótico polar, tal como acetonitrilo, del que se elimina después. El butadieno también se puede producir por la deshidrogenación catalítica de butano normal o se puede producir a partir de etanol. En este último caso, se usan dos procedimientos diferentes. En un procedimiento de una sola etapa, el etanol se convierte en butadieno, hidrógeno y agua a 400 °C - 450 °C sobre un catalizador de óxido de metal (Kirshenbaum, I. (1978), Butadiene. En M. Grayson (Ed.), Encyclopaedia of Chemical Technology, 3a ed, vol 4, págs. 313 - 337 Nueva York: John Wilcy & Sons). En un procedimiento de dos etapas, el etanol se oxida a acetaldehído que reacciona con etanol adicional sobre un catalizador de sílice porosa promovido por tantalio a 325 °C - 350 °C para producir butadieno (Kirshenbaum, I. (1978), loe cit.). El butadieno también se puede producir por deshidrogenación catalítica de butenos normales.
Durante las últimas dos décadas, las teenologías de modificación de ingeniería genética han hecho posible la modificación del metabolismo de microorganismos, y por lo tanto su uso para producir sustancias clave que producirían de otra forma a un rendimiento bajo. Mediante la potenciación de las vías metabólicas de origen natural, estas tecnologías abren nuevas formas de bío-producir numerosos compuestos de interés para la industria. De forma habitual se producen varios compuestos industriales tales como aminoácidos para la alimentación animal, plásticos biodegradables o fibras textiles usando organismos modificados genéticamente.
Todavía existe una necesidad de proporcionar procedimientos sencillos, rentables y respetuosos con el medio ambiente, para la producción de los compuestos anteriormente mencionados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención está basada en el diseño de un biocatalizador nuevo para la síntesis de compuestos dieno volátiles, en particular dienos conjugados tales como 1 ,3-dienos, basados en la conversión de alquenoles ligeros, en particular por medio de la deshidratación enzimática de alquenoles ligeros. La invención está basada en la demostración de que dicha conversión se puede llevar a cabo biológicamente mediante el uso de una enzima que cataliza una reacción de deshidratación. La invención se puede implementar in vitro, en sistemas libres de celulas, o mediante el uso de organismos, en particular microorganismos. La invención también se refiere a la producción de dienos conjugados tales como 1 ,3-dienos de una fuente de carbono, y particularmente un hidrato de carbono (en particular glucosa), un poliol (en particular, glicerol), un polímero biodegradable (en particular, almidón, celulosa, poli-3-hidroxialquenoato), convirtiéndose la fuente de carbono en un alquenol ligero por un microorganismo, que luego se convierte en un dieno conjugado tal como 1,3-dieno.
Más específicamente, la invención se refiere a un procedimiento para producir un dieno conjugado caracterizado porque comprende una etapa de convertir enzimáticamente un compuesto que responde a la fórmula general CnhbnO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7, mediante el uso de un alquenol deshidratasa. La conversión es una deshidratación.
Un compuesto que responde a la fórmula CnFfenO, con 3 < n < 7, se denomina alquenol ligero en el contexto de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
En cuanto a las realizaciones preferidas de los diferentes componentes, se aplica lo mismo tal y como se ha establecido en relación con el procedimiento de acuerdo con la invención.
La figura 1 muestra esquemáticamente los alcoholes alílicos primarios (PRA) que responden a la fórmula general CnhbnO, con 3 < n < 7. En particular se muestran:
Sustrato / Denominación sistemática / Fórmula / Categoría / R1 / R2 / Producto
La Figura 2 muestra esquemáticamente los alcoholes alílicos secundarios y terciarios (STA) que responden a la fórmula general CnFbnO, con 3 < n < 7.
Sustrato / Denominación sistemática / Fórmula / Categoría / R1 / R2 / Producto
La Figura 3 muestra esquemáticamente los alcoholes primarios homoalílicos (PHA) que responden a la fórmula general CnhtenO, con 3 < n < 7.
Sustrato / Denominación sistemática / Fórmula / Categoría / R1 / R2 / Producto
La figura 4 muestra una vista general esquemática sobre la conversión de los compuestos DRP, PHA y STA mencionados antriormente, en un dieno conjugado de acuerdo con el procedimiento de la presente invención.
La Figura 5 muestra una visión general de las reacciones catalizadas por linalool deshidratase - isomerasa.
La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos del linalool deshidratasa -isomerasa de Castellaniella defragrans (anteriormente Alcaligenes defragrans).
La Figura 7 muestra los cromatogramas GC / FID obtenidos para ensayos enzimáticos (negro) y libres de enzimas (rojo) con alcohol trans crotílico 80 mM despues de 22 horas de incubación.
La Figura 8 muestra los cromatogramas GC / FID obtenidos para ensayos enzimáticos (negro) y libres de enzimas (rojo) con 3-buten-2-ol 80 mM después de 22 horas de incubación.
La figura 9 muestra los cromatogramas GC / FID obtenidos para ensayos enzimáticos (negro) y libres de enzimas (azul) con isoprenol 80 mM después de 22 horas de incubación.
La Figura 10 muestra los cromatogramas de GC / FID obtenidos para ensayos enzimáticos (negro) y libres de enzimas (negro) con 2-metil-3-buten-2-ol 80 mM después de 22 horas de incubación.
La Figura 11 muestra la cinética de la producción de 1 ,3-butadieno para un intervalo de concentraciones de alcohol trans crotílico, como se describe en el Ejemplo 7.
La Figura 12 muestra la cinética de la producción de 1,3-butadieno para un intervalo de concentraciones de but-3-en-2-ol, como se describe en el Ejemplo 8.
La figura 13 muestra los cromatogramas de GC / FID obtenidos de ensayos enzimáticos (rojo) y libres de enzimas (negro) con but-3-en-1-ol 50 mM después de 18 horas de incubación.
La figura 14 muestra los cromatogramas de GC / FID típicos obtenidos de ensayos enzimáticos (rojo) y libres de enzimas (negro) con 2-metilbut-3-en-2-ol 160 mM despues de 6 horas de incubación.
La figura 15 muestra los cromatogramas de GC / FID típicos obtenidos de ensayos enzimáticos (rojo) y libres de enzimas (negro) con 3-metilbut-3-en-2-ol 50 mM después de 1 hora de incubación.
La Figura 16 muestra la actividad de las versiones truncadas de linalool deshidratasa para la reacción global de conversión de alcohol crotílico en 1,3 butadieno y para la reacción de deshidratación de but-3-en-2-ol en 1,3 butadieno, respectivamente.
La Figura 17 muestra que el linalool deshidratasa - isomerasa recombinante es capaz de catalizar la conversión de cualquiera de alcohol cis- o trans- crotílico en 1 ,3-butadieno.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En una realización preferida n es 4. En este caso, el alquenol ligero que se va a usar en forma de sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención responde a la fórmula C4H8O. Los compuestos que responden a esta fórmula son but-2-en-1-ol (alcohol de crotilo), but-3-en-2-ol y but-3-en-1-ol (alcohol de isocrotilo). El dieno que resulta de la conversión de estos compuestos de acuerdo con el procedimiento de la presente invención es butadieno. En una realización particularmente preferida, el alquenol ligero usado como sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención es but-2-en-1-ol (alcohol de crotilo) o but-3-en-2-ol y el dieno producido es butadieno.
En otra realización preferida n es 5. En este caso, el alquenol ligero que se va a usar en forma de sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención responde a la fórmula C5H10O. Los compuestos que responden a esta fórmula son 2-metilbut-2-en-1-ol, 3-metilbut-2-en-1-ol (prenol), 3-metilbut-3-en-2-ol, 2-metilbut-3-en-2-ol, 2-metilbut-3-en-1-ol y 3-metilbut-3-en-1-ol (isoprenol). El dieno que resulta de la conversión de estos compuestos de acuerdo con el procedimiento de la presente invención es isopreno. En una realización más preferida, el alquenol ligero usado en
forma de sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención es 2-metilbut-2-en- 1-ol, 3-metilbut-2-en-1-ol (prenol), 3- metilbut-3-en-2-ol, 2-metilbut-3-en-2-ol, o 3-metilbut-3-en-1-ol (isoprenol) y el dieno producido es isopreno. En una realización más preferida, el alquenol ligero usada como sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención es 3-metilbut-2-en-1-ol (prenol), 3-metilbut-3-en-2-ol, 2- metilbut-3-en-2-ol, o 3-metilbut-3-en-1-ol (isoprenol) y el dieno producido es isopreno. En una realización particularmente preferida, el alquenol ligero usado como sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención es 3-metilbut-2-en-1-ol (prenol) o 2-metilbut-3-en-2-ol y el dieno producido es isopreno.
En otra realización preferida n es 6. En este caso, el alquenol ligero que se va a usar en forma de sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención responde a la fórmula C6H12O. Los compuestos que responden a esta fórmula son 2,3-dimetilbut- 2-en-1-ol, 2,3-dimetilbut-3-en-2-ol y 2,3-dimetilbut-3-en-1-ol. El dieno que resulta de la conversión de estos compuestos de acuerdo con el procedimiento de la presente invención es dimetil-butadieno. En una realización particularmente preferida, el alquenol ligero usado como sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención es 2,3-dimetilbut-2-en-1-ol o 2,3-dimetilbut-3-en-2-ol y el dieno producido es dimetil-butadieno.
Los compuestos que responden a la fórmula general CnhbnO, con 3 < n < 7, se pueden subdividir en tres grupos, a saber, en
(i) alcoholes alílicos primarios (abreviadamente en ingles PRA) de la fórmula I:
H3C-OH
Fórmula I
(ii) alcoholes alílicos secundarios o terciarios (abreviadamente en inglés STA) de la fórmula II:
Fórmula II
y
(iii) alcoholes homoalílicos primarios (abreviadamente en ingles PHA) de la fórmula III:
Fórmula II
en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H y CH3.
En una realización preferida, el compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO, con 3 < n < 7, es un alcohol alílico primario (PRA) de la fórmula I:
Fórmula I
En la que R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H y CH3. Los compuestos que responden a esta fórmula son but-2-en-1-ol (alcohol crotílico), 2-metilbut-2-en-1-ol, 3-metilbut-2-en-1-ol (prenol) y 2,3 -dimetilbut-2-en-1-ol (véase la Figura 1). En una realización preferida, el alcohol alílico primario es but-2-en-1-ol (alcohol crotílico) y el dieno producido es butadieno. En otra realización preferida, el alcohol alílico primario es 3-metilbut-2-en-1-ol (prenol) y el dieno producido es isopreno.
En otra realización preferida, el compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO, con 3 < n < 7, es un alcohol alílico secundario o terciario (STA) de la fórmula II:
Fórmula II
En la que R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H y CH3. Los compuestos que responden a esta fórmula son but-3-en-2-ol, 3-metilbut-3-en-2-ol, 2-metilbut-3-en-2-ol y 2,3-dimetilbut-3-en-2-ol (véase la Figura 2).
En una realización preferida, el STA es but-3-en-2-ol y el dieno producido es butadieno. En otra realización preferida, el STA es 2-metilbut-3-en-2-ol y el dieno producido es isopreno.
En una realización preferida adicional, el compuesto que responde a la fórmula general CnFfenO, con 3 < n < 7, es un alcohol homoalílico primario (PHA) de la fórmula III:
Fórmula III
En la que R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H y CH3. Los compuestos que responden a esta fórmula son but-3-en-1-ol (alcohol de isocrotilo), 2-metilbut-3-en-1-ol, 3-metilbut-3-en-1-ol (isoprenol) y 2,3 -dimetilbut-3-en-1-ol (véase la Figura 3).
En una realización preferida, el alcohol homoalílico es 3-metilbut-3-en-1-ol (isoprenol) y el dieno producido es isopreno.
La Figura 4 ofrece una visión esquemática sobre la conversión de los compuestos de PRA, PHA y STA antes mencionados en un dieno conjugado de acuerdo con el procedimiento de la presente invención.
Si en el contexto de la presente invención se hace referencia a un compuesto del que existen estereoisómeros, por ejemplo, por inversiones Z / E en los dobles enlaces sp2 C = C o por inversiones R / S en los centros quirales C sp3, todos estos estereoisómeros están abarcados por referencia en dicho compuesto. Por ejemplo, la mención de but-2-en-1-ol (alcohol crotílico) se refiere al estereoisómero cis (Z) así como al estereoisómero trans (E). Del mismo modo, la mención de 2-metilbut-2-en-1-ol se refiere al estereoisómero cis (Z), así como al estereoisómero trans (E). Además, la mención de but-3-en-2-ol, de 3-metilbut-3-en-2-ol, de 2-metilbut-3-en-1-ol o de 2,3-
dimetilbut-3- en-1-ol se refiere tanto al isómero R como al S.
En una realización preferida, la mención de but-2-en-1-ol (alcohol crotílico) se refiere al estereoisómero cis (Z). En otra realización preferida, la mención de but-2-en-1-ol (alcohol crotílico) se refiere al estereoisómero trans (E). En otra realización, la mención de but-2-en-1-ol (alcohol crotílico) se refiere a una mezcla que comprende ambos estereoisómeros. Si alguno de estos se usa en forma de sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención, el producto es el butadieno.
En una realización preferida, la mención de 2-metilbut-2-en-1-ol se refiere al estereoisómero cis (Z). En otra realización preferida, la mención de 2-metilbut-2-en-1-ol se refiere al estereoisómero trans (E). En otra realización, la mención de but-2-metilbut-2-en-1-ol se refiere a una mezcla que comprende ambos estereoisómeros. Si alguno de estos se usa en forma de sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención, el producto es isopreno.
En una realización preferida, la mención de but-3-en-2-ol se refiere al isómero R. En otra realización preferida, la mención de but-3-en-2-ol se refiere al isómero S. En otra realización, la mención de but-3-en-2-ol se refiere a una mezcla que comprende ambos isómeros. Si alguno de estos se usa en forma de sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención, el producto es el butadieno.
En una realización preferida, la mención de 3-metilbut-3-en-2-ol se refiere al isómero R. En otra realización preferida, la mención de 3-metilbut-3-en-2-ol se refiere al isómero S. En otra realización, la mención de 3-metilbut-3-en-2-ol se refiere a una mezcla que comprende ambos isómeros. Si alguno de estos se usa en forma de sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención, el producto es isopreno.
En una realización preferida, la mención de 2-metilbut-3-en-1-ol se refiere al isómero R. En otra realización preferida, la mención de 2-metilbut-3-en-1-ol se refiere al isómero S. En otra realización, la mención de 2-metilbut-3-en-1-ol se refiere a una mezcla que comprende ambos isómeros. Si alguno de estos se usa en forma de sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención, el producto es isopreno.
En una realización preferida, la mención de 2,3-dimetilbut-3-en-1-ol se refiere al isómero R. En otra realización preferida, la mención de 2,3-dimetilbut-3-en-1-ol se refiere al isómero S. En otra realización, la mención de 2,3-dimetilbut-3-en-1-ol se
refiere a una mezcla que comprende ambos isómeros. Si alguno de estos se usa en forma de sustrato en el procedimiento de acuerdo con la invención, el producto es dimetil-butadieno.
Como se describe anteriormente, el procedimiento de acuerdo con la presente invención se caracteriza en que la conversión del compuesto que responde a la fórmula general CnFhnO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7, se logra mediante el uso de un alquenol deshidratasa. Un alquenol deshidratasa es una enzima que puede deshidratar un alquenol, preferiblemente, es una enzima que puede deshidratar al menos un compuesto que responde a la fórmula general CnFtenO, con 3 < n < 7, y en el que el producto de la reacción es CnH2n-2 + H2O. Esta actividad se puede medir en ensayos tal como se describe en los ejemplos adjuntos. Un ejemplo de un alquenol deshidratasa para ser empleado en un procedimiento de acuerdo con la presente invención es el alquenol deshidratasa que se ha denominado "linalool deshidratasa -isomerasa" (EC 4.2.1.127) y que ha sido identificado en Castellaniella defragrans (anteriormente Alcaligenes defragrans) cepa 65Phen (Brodkorb et al., J. Biol. Chem. 285 (2010), 30436 - 30442). El linalool deshidratasa - isomerasa es una enzima bifuncional que está implicada en la degradación anaeróbica de los monoterpenos. Se ha descubierto que la enzima nativa tiene una masa molecular de 160 kDa y se supone que es un homotetrámero con subunidades de 40 kDa. La enzima cataliza dos reacciones in vitro en ambas direcciones dependiendo de las fuerzas impulsoras termodinámicas. Por un lado, la enzima cataliza la isomerización del geraniol alcohol alílico primario en su linalool estereoisómero que lleva un motivo de alcohol alílico terciario. Por otro lado, la enzima cataliza la secesión de agua (deshidratación) del linalool alcohol terciario al beta-mirceno monoterpeno acíclico correspondiente, una molecula que lleva un motivo dieno conjugado. La Figura 5 ofrece una visión general de las reacciones catalizadas por linalool deshidratasa - isomerasa in vitro en condiciones anaeróbicas. En Castellaniella defragrans la proteína se expresa como una proteína precursora con una señal peptídica para una ubicación periplasmática que se escinde después del transporte a través de la membrana. La enzima se clasifica como EC 4.2.1.127. Un linalool deshidratasa - isomerasa tiene la capacidad de catalizar la siguiente reacción bajo condiciones anaeróbicas:
Linalool <=> mirceno + H2O
Esta actividad se puede medir, por ejemplo, con un ensayo como se describe en Brodkorb et al. (loe. cit.). En un ensayo como tal, los viales se precalientan a 35 °C, la solución de proteína anóxica se transfiere a los viales y se añade DTT a 2 mM. Las mezclas de reacción se sellan con un tapón de butilo y el espacio de cabeza se lava con CO2 / N2 (10/90 (v / v)). La reacción se inicia mediante la adición de una concentración distinta de linalool y se incuba a 35 °C. La conversión de linalool en mirceno se evalúa mediante la investigación de la producción de mirceno, por ejemplo, mediante cromatografía de gases.
En una realización preferida, un linalool deshidratasa - isomerasa tambien tiene la capacidad de catalizar la isomerización de geraniol en linalool bajo condiciones anaeróbicas:
Geraniol <=> linalool
Esta actividad se puede medir, por ejemplo, con un ensayo como se describe en Brodkorb et al. (loe. cit.). En un ensayo como tal, los viales se precalientan a 35 °C, la solución de proteína anóxica se transfiere a los viales y se añade DTT a 2 mM. Las mezclas de reacción se sellan con un tapón de butilo y el espacio de cabeza se lava con CO2 / N2 (10/90 (v / v)). La reacción se inicia mediante la adición de una concentración distinta de geraniol y se incuba a 35 °C. La conversión de geraniol en linalool se evalúa mediante la investigación de la producción de mirceno, es decir, el producto de la segunda reacción catalizada por la enzima, por ejemplo, mediante cromatografía de gases.
El geraniol, linalool y mirceno son Cio-terpenoides acíclicos producidos por plantas, que pertenecen a la clase de los alialcoholes e hidrocarburos, respectivamente. Lüddecke y Harder (Z. Naturforsch.66c (2011), 409 - 412) reseñaron una alta especificidad del sustrato de linalool deshidratasa - isomerasa. Los inventores han descubierto deforma sorprendente que el linalool deshidratasa - isomerasa puede actuar sobre los compuestos de la fórmula CnhtenO, con 3 < n < 7, y los puede convertir en dienos conjugados. En los ejemplos adjuntos esto se muestra para la conversión de but-2-en-1 -ol (alcohol crotílico) en butadieno, de but-3-en-2-ol en butadieno, de 3-metilbut-2-en-1 -ol (prenol) en isopreno, de 3-metilbut-3-en-1-ol (isoprenol) en isopreno
y de 2-metilbut-3-en-2-ol en isopreno. Por lo tanto, los presentes inventores pudieron demostrar que el linalool deshidratase - isomerasa tambien puede convertir inesperadamente alquenoles que son mucho más cortos que sus sustratos naturales a pesar de la alta especificidad reseñada del sustrato. Así pues, en una realización, el alquenol deshidratase empleado en el procedimiento de acuerdo con la presente invención es una linalool deshidratasa (EC 4.2.1.127).
Un ejemplo de una secuencia de un alquenol deshidratasa que se puede emplear en el procedimiento de acuerdo con la presente invención se da en la SEC ID N°: 1 (Figura 6). Una secuencia de un alquenol deshidratasa también está accesible en la base de datos UniProtKB / TrEMBL con el número de acceso E1XUJ2. Estas secuencias representan un alquenol deshidratasa que se clasifica como linalool deshidratasa - isomerasa. En una realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invención hace uso de un alquenol deshidratasa que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 1 o una secuencia que es al menos x % idéntica a la SEC ID N°: 1 y que es capaz de catalizar la conversión de un compuesto que responde a la fórmula general CnhtaiO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7, siendo x un número entero entre 30 y 100, preferiblemente 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 , 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99.
El término "alquenol deshidratasa" como se usa en la presente invención, por tanto, se refiere a una enzima que muestra el grado de identidad de secuencia indicado anteriormente con la SEC ID N°: 1 y que puede catalizar la conversión de un compuesto que responde a la fórmula general CnFtenO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7. Mediante el uso de la secuencia de SEC ID N°: 1 o las secuencias que codifican nucleótidos correspondientes, posibilita al experto en la materia identificar alquenoles deshidratasas adicionales que pueden catalizar la conversión anteriormente indicada.
Tales variantes de alquenol deshidratasa, por ejemplo, de linalool deshidratasa (EC 4.2.1.127), también abarcan versiones más cortas que muestran deleciones en el extremo N- o C-terminal, preferentemente en el extremo C-terminal, como se describe más adelante. Los ejemplos adjuntos muestran que tales versiones truncadas mantienen la capacidad de catalizar las conversiones descritas anteriormente.
Preferiblemente, el grado de identidad se determina mediante la comparación de la secuencia respectiva con la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 1. Cuando las secuencias que se comparan no tienen la misma longitud, el grado de identidad preferiblemente se refiere o bien al porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia más corta que son identicos a los residuos de aminoácidos en la secuencia más larga o bien al porcentaje de residuos de aminoácidos en la secuencia más larga que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia más corta. El grado de identidad de secuencia puede determinarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la téenica usando preferentemente algoritmos informáticos adecuados, tales como CLUSTAL.
Cuando se usa el procedimiento de análisis de Clustal para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, idéntica al 80 % a una secuencia de referencia, se pueden usar ajustes predeterminados o los ajustes son preferiblemente como sigue: Matriz: blosum 30; Penalización por abertura de hueco: 10,0; Penalización por extensión de hueco: 0,05; retraso divergente: 40; Distancia de separación de hueco: 8, para las comparaciones de secuencias de aminoácidos. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, la penalización por extensión de hueco se ajusta preferiblemente a 5,0.
Preferiblemente, el grado de identidad se calcula sobre la longitud completa de la secuencia.
Además, si el término "homología" se usa en el contexto de la presente invención, este término significa preferentemente "identidad de secuencia".
Como se describe anteriormente, el alquenol deshidratasa al que se refiere como un "linalool deshidratasa - isomerasa" identificado en defragrans Castellaniella (anteriormente Alcaligenes defragrans) tiene un péptido señal que garantiza el transporte en el espacio periplasmático. En una realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la presente invención emplea una enzima que no muestra una secuencia señal como tal. En los ejemplos se muestra que la interrupción del péptido señal mediante la inserción de un his-tag no obstaculiza la expresión de la enzima en E. coli y lleva a la producción intracelular de una proteína activa.
El alquenol deshidratasa, tal como un linalool deshidratasa - isomerasa, empleado en el procedimiento de acuerdo con la invención puede ser un alquenol deshidratasa de origen natural o puede ser un alquenol deshidratasa que se deriva de un alquenol deshidratasa de origen natural, tal como un linalool deshidratasa -isomerasa, por ejemplo, por medio de la introducción de mutaciones u otras alteraciones que, por ejemplo, alteran o mejoran la actividad enzimática, la estabilidad, en particular, la estabilidad termica, etc.
Los ejemplos adjuntos muestran que las versiones truncadas de un linalool deshidratasa (EC 4.2.1.127) también pueden catalizar de manera eficiente las conversiones descritas anteriormente, preferiblemente versiones truncadas que muestran deleciones en el extremo C-terminal. Por lo tanto, el término "alquenol deshidratasa" también abarca enzimas que se derivan de un alquenol deshidratasa, tales como un linalool deshidratasa (EC 4.2.1.127) por deleciones, en particular deleciones en el extremo C-terminal. Más preferiblemente, es una enzima que se deriva de una enzima que muestra la secuencia de aminoácidos como se representa en la SEC ID N°: 1 pordeleción de al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 , 11, 12, 13, 14 o 15 residuos de aminoácidos del extremo C-terminal.
El término "linalool deshidratasa - isomerasa" o "una proteína / enzima que tiene la actividad de un linalool-isomerasa deshidratasa" en el contexto de la presente solicitud también abarca enzimas que se derivan de un linalool deshidratasa -isomerasa, que son capaces de catalizar la conversión de un compuesto que responde a la fórmula general CnhhnO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7, pero que sólo tienen una afinidad baja a sus sustratos naturales, es decir, geraniol, linalool y / o mirceno, o que ya no aceptan sus sustratos naturales. Dicha modificación del sustrato preferido permite mejorar la conversión de un compuesto que responde a la fórmula general CnhfenO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7, y reducir la producción de subproductos posiblemente de origen no deseado. Los procedimientos para modificar y / o mejorar las actividades enzimáticas deseadas de las proteínas son bien conocidas para la persona experta en la técnica e incluyen, por ejemplo, mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida al sitio y selección subsiguiente de enzimas que tienen propiedades o enfoques deseados de la denominada "evolución dirigida", mezcla de
ADN o evolución in vivo.
Por ejemplo, para la modificación por ingeniería genetica en células procarióticas, una molécula de ácido nucleico que codifica un linalool deshidratasa -isomerasa se puede introducir en plásmidos que permiten la mutagénesis o modificación de la secuencia por recombinación de secuencias de ADN. Los procedimientos convencionales (véase Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Coid Spring Harbor, NY, EE.UU.) permiten que se lleve a cabo el intercambio de bases o que se añadan secuencias naturales o sintéticas. Los fragmentos de ADN se pueden conectar entre sí mediante la aplicación de adaptadores y enlaces a los fragmentos. Además, se pueden usar medidas de modificación por ingeniería genética que proporcionan sitios de restricción adecuados o eliminan sitios de restricción o excedentes de ADN. En aquellos casos, en los que son posibles las inserciones, deleciones o sustituciones, se puede usar mutagénesis in vitro, "reparación con cebadores", restricción o ligación. En general, se llevan a cabo como procedimientos de análisis, el análisis de secuencias, análisis de restricción y otros procedimientos de bioquímica y biología molecular. Las variantes de linalool deshidratasa - isomerasa resultantes se ensayan después para determinar su actividad enzimática y, en particular, para determinar su capacidad para preferir un compuesto que responde a la fórmula general CnhbnO, con 3 < n < 7, en forma de sustrato en lugar de, por ejemplo, geraniol, linalool y / o mirceno.
Tales procedimientos para la identificación de variantes con propiedades enzimáticas mejoradas en cuanto a la producción de un compuesto dieno conjugado también se pueden llevar a cabo en presencia de un cofactor que permite una complementación estérica y / o electrónica en el sitio catalítico de la enzima debido al hecho que un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO, con 3 < n < 7, es más corto que los sustratos naturales.
En una realización preferida, el alquenol deshidratasa empleado en un procedimiento de acuerdo con la invención muestra una elevada estabilidad térmica. Una enzima como tal se puede obtener por medio de procedimientos habituales que implican, por ejemplo, mutación aleatoria de una secuencia de ácido nucleico que codifica un alquenol deshidratasa y cribado de los mutantes obtenidos para una mayor
estabilidad termica. Preferiblemente, el alquenol deshidratase es estable y enzimáticamente activo a temperaturas de 68 °C o superiores. Como el punto de ebullición del dimetilbutadieno es 68 °C a presión atmosférica, usar una enzima como tal y llevar a cabo el procedimiento de acuerdo con la invención a una temperatura de 68 °C o más elevada, tiene la ventaja de que el dimetilbutadieno desgasifica fuera de la reacción y puede ser recuperado fácilmente de la fase gaseosa.
La versión modificada del alquenol deshidratasa, por ejemplo, una variante que acepta o prefiere un compuesto que responde a la fórmula general CnhknO, con 3 < n < 7, en forma de sustrato, pero que tiene una afinidad baja a sus sustratos naturales o que ya no aceptan sus sustratos naturales o una variante con una mayor estabilidad térmica, se puede derivar de un alquenol deshidratasa de origen natural, tal como un linalool deshidratasa - isomerasa, o de un alquenol deshidratasa ya modificado, optimizado o preparado sintéticamente.
El procedimiento de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo in vitro, por ejemplo, en presencia de una enzima aislada o de Usados de células que comprenden preparaciones de enzimas o enzimas parcialmente purificadas. In vitro significa preferiblemente en un sistema libre de células.
En una realización, la enzima empleada en el procedimiento se usa en forma purificada para convertir un compuesto que responde a la fórmula general CnhfenO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7. Sin embargo, un procedimiento como tal puede ser costoso, ya que los costes de producción y purificación de enzimas y sustratos son elevados.
Por lo tanto, en otra realización preferida, las enzimas empleadas en el procedimiento están presentes en la reacción en forma de un extracto no purificado, o también en forma de bacterias no lisadas, de forma que se economiza en los costes de purificación de proteínas. Sin embargo, los costes asociados a un procedimiento como tal todavía pueden ser bastante elevados debido a los costes de producción y purificación de los sustratos.
En una reacción in vitro las enzimas, nativas o recombinantes, purificadas o no, se incuban en presencia del sustrato en condiciones fisicoquímicas que permiten que las enzimas sean activas, y se deja proceder la incubación durante un período de
tiempo suficiente que permita la producción del dieno. Al final de la incubación, se mide opcionalmente la presencia del compuesto dieno mediante el uso de cualquier sistema de detección conocido para un experto en la teenica tal como cromatografía de gases o ensayos colorimétricos para medir la formación de tales compuestos.
En una realización particularmente preferida de la invención, el procedimiento se lleva a cabo in vitro y la enzima se inmoviliza. Los medios y procedimientos para la inmovilización de enzimas sobre soportes diferentes son bien conocidos por la persona experta en la técnica.
En otra realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la invención se lleva a cabo en cultivo, en presencia de un organismo, preferentemente un microorganismo, que produce la enzima. Por lo tanto, en una realización de la invención como tal, se usa un organismo, preferentemente un microorganismo, que produce un alquenol deshidratasa, tal como un linalool deshidratase - isomerasa. En una realización preferida, el (micro) organismo es recombinante en que la enzima producida por el huésped es heteróloga con respecto al huésped de producción. El procedimiento, por lo tanto, se puede llevar a cabo directamente en el medio de cultivo, sin la necesidad de separar o purificar las enzimas. De una manera especialmente ventajosa, se usa un (micro) organismo que tiene la propiedad natural o artificial de producir endógenamente un compuesto que responde a la fórmula general CnhbnO, con 3 < n < 7, y también expresa o sobreexpresa un alquenol deshidratasa, tal como un linalool deshidratasa - isomerasa, natural o modificado, de tal forma que produce el compuesto dieno directamente de una fuente de carbono presente en la solución.
Por ejemplo, el procedimiento de acuerdo con la invención puede llevarse a cabo mediante el uso de microorganismos que producen un compuesto que responde a la fórmula general CnhfcnO, con 3 < n < 7. Por ejemplo, Pérez et al. (Phytochemistry 19 (1980), 183-187) describen enzimas de Citrus sinensis que son capaces de hidrolizar los fosfatos alílicos, por ejemplo, una prenil difosfatasa (EC 3.1.7.1) que puede convertir prenol difosfato en prenol y difosfato. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican tales enzimas se pueden introducir en los microorganismos que producen el sustrato correspondiente de tal forma que sea capaz de producir prenol. Por otra parte, Withers et al. (Appl. Environ. Microbiol.73 (2007), 6277 - 6283)
han descrito, por ejemplo, células de E. coli que se han modificado por ingeniería genética con la ruta biosintética de isopentenil pirofosfato basado en mevalonato y que también expresaron el gen nudF de la cepa 6051 Bacillus subtilis. La proteína codificada por el gen nudF actúa directamente sobre los precursores de prenil difosfato y lleva a la producción de isopentenol (isoprenol).
Así pues, en una realización del procedimiento de acuerdo con la presente invención, se prefiere usar un microorganismo que es capaz de producir un compuesto que responde a la fórmula general CnFfenO, con 3 < n < 7, y que se ha modificado por ingeniería genética de tal forma que (sobre) expresa un alquenol deshidratasa, originándose preferiblemente dicho alquenol deshidratasa de un organismo diferente del microorganismo hospedador. La modificación genética puede consistir, por ejemplo, en la integración del gen correspondiente que codifica el alquenol deshidratasa en el cromosoma, expresando la enzima a partir de un plásmido que contiene un promotor aguas arriba de la secuencia que codifica las enzimas, originándose preferiblemente el promotor y la secuencia codificadora de diferentes organismos, o cualquier otro procedimiento conocido para un experto en la téenica. De forma alternativa, se pueden usar otras bacterias o levaduras pueden tener ventajas específicas y pueden ser elegidas. Por ejemplo, una levadura tal como Saccharomyces cerevisiae, una bacteria extremófila tal como Thermus thermophilus, o bacterias anaeróbicas de la familia Clostridiae, microalgas, o bacterias fotosintéticas.
También es concebible aislar los genes que codifican las proteínas que son responsables de la síntesis de un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO, con 3 < n < 7, e introducir estos genes en otros organismos, en particular un microorganismo, tal como por ejemplo, E. coli, Saccharomyces o Pichia, una bacteria extremófila, tal como Thermus thermophilus, o bacterias anaeróbicas de la familia Clostridiae, microalgas, o bacterias fotosintéticas.
En una realización preferida, el (micro) organismo usado en el procedimiento de acuerdo con la invención es un (micro) organismo que está modificado genéticamente de modo que contenga una molécula de ácido nucleico que codifica un alquenol deshidratasa. Tal molécula de ácido nucleico que codifica un alquenol deshidratasa como se describe anteriormente se puede usar sola o como parte de un vector. Las
moleculas de ácido nucleico pueden comprender adicionalmente secuencias de control de expresión unidas operativamente al polinucleótido comprendido en la molécula de ácido nucleico. El término "operativamente unido" o "operablemente unido", como se usa en toda la presente descripción, se refiere a una unión entre una o más secuencias de control de expresión y la región codificante en el polinucleótido que se expresa de tal manera que la expresión se consigue en condiciones compatibles con la secuencia de control de expresión.
La expresión comprende la transcripción de la secuencia de ADN heterólogo, preferiblemente en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en hongos, así como en bacterias, son bien conocidos para los expertos en la téenica. Abarcan promotores, potenciadores, señales de terminación, señales de fijación de diana y similares. Más adelante se proporcionan ejemplos en relación con las explicaciones relativas a los vectores.
Los promotores para usar en relación con la molécula de ácido nucleico pueden ser homólogos o heterólogos con respecto a su origen y / o con respecto al gen que se va a expresar. Los promotores adecuados son por ejemplo promotores que se prestan a la expresión constitutiva. Sin embargo, también se pueden usar promotores que sólo se activan en un punto en el tiempo determinado por influencias externas. En este contexto, se pueden usar promotores artificial y / o químicamente inducibles.
Los vectores pueden comprender, además, secuencias de control de expresión operablemente unidas a dichos polinucleótidos contenidos en los vectores. Estas secuencias de control de la expresión pueden ser adecuadas para garantizar la transcripción y síntesis de un ARN traducible en bacterias u hongos.
Además, es posible insertar diferentes mutaciones en los polinucleótidos mediante procedimientos habituales en biología molecular (véase por ejemplo Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Coid Spring Harbor, NY, EE.UU.), que lleva a la síntesis de polipéptidos que posiblemente han modificado las propiedades biológicas. La introducción de mutaciones puntuales es concebible en posiciones en las que una modificación de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, influye en la actividad biológica o la regulación del polipéptido.
Además, se pueden preparar mutantes que poseen una especificidad modificada del sustrato o producto. Preferiblemente, dichos mutantes muestran un aumento de la actividad. Además, la introducción de mutaciones en los polinucleótidos que codifican una enzima como se define anteriormente permite que se optimice la velocidad de la expresión genica y / o la actividad de las enzimas codificadas por dichos polinucleótidos, por ejemplo, en lo que se refiere a la estabilidad térmica.
Para la modificación genética de bacterias u hongos, los polinucleótidos que codifican una enzima como se define anteriormente o partes de estas moléculas se pueden introducir en plásmidos que permiten la mutagénesis o la modificación de secuencias por recombinación de secuencias de ADN. Los procedimientos convencionales (véase Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Coid Spring Harbor, NY, EE.UU.) permiten que se realicen intercambios de bases para llevar a cabo o que se añadan secuencias naturales o sintéticas. Los fragmentos de ADN se pueden conectar entre sí mediante la aplicación de los adaptadores y enlazadores a los fragmentos.
Además, se pueden usar medidas de modificación por ingeniería genética que proporcionan sitios de restricción adecuados o eliminan sitios de restricción o excedentes de ADN. En aquellos casos, en los que son posibles las inserciones, deleciones o sustituciones, se puede usar mutagénesis in vitro, "reparación con cebadores", restricción o ligación. En general, se llevan a cabo como procedimientos de análisis, el análisis de secuencias, análisis de restricción y otros procedimientos de bioquímica y biología molecular.
El polinucleótido introducido en un (micro) organismo se expresa de tal forma que lleva a la producción de un polipéptido que tiene la actividad descrita anteriormente. Una visión general de los diferentes sistemas de expresión está contenido, por ejemplo, en Methods in Enzymology 153 (1987), 385 - 516, en Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516 - 544) y en Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1 - 9), Billman-Jacobé (Current Opinión in Biotechnology 7 (1996), 500 - 4), Hockncy (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456 -463), Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427 - 440). Una visión general de los sistemas de expresión de levadura, se proporciona, por ejemplo, por
Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261 - 279), Bussineau et al. (Deveopments in Biological Standard ization 83 (1994), 13 - 19), Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79 - 93, Fleer (Current Opinión in Biotechnology 3 (1992), 486 - 496), Vedvick (Current Opinión in Biotechnology 2 (1991), 742 - 745) y Buckholz (Bio / Technology 9 (1991), 1067 - 1072).
Los vectores de expresión se han descrito ampliamente en la bibliografía. Como norma, no sólo contienen un gen marcador de selección y un origen de replicación que asegura la replicación en el huesped seleccionado, sino también un promotor bacteriano o viral, y en la mayoría de los casos una señal de terminación para la transcripción. Entre el promotor y la señal de terminación hay, en general, al menos un sitio de restricción o un poliengarce que permite la inserción de una secuencia de ADN codificadora. La secuencia de ADN que controla naturalmente la transcripción del gen correspondiente se puede usar en forma de la secuencia del promotor, si está activo en el organismo del huésped seleccionado. Sin embargo, esta secuencia también se puede intercambiar por otras secuencias promotoras. Es posible usar promotores que aseguran la expresión constitutiva del gen y promotores inducibles que permiten un control deliberado de la expresión del gen. Las secuencias promotoras bacterianas y virales que poseen estas propiedades se describen en detalle en la bibliografía. Las secuencias reguladoras para la expresión en microorganismos (por ejemplo E. coli, S. cerevisiae) se describen de forma suficiente en la bibliografía. Los promotores que permiten una expresión particularmente alta de una secuencia aguas abajo son por ejemplo el promotor T7 (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60 - 89), lacUV5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., en Rodríguez y Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, Nueva York, (1982), 462 - 481; DeBoer et al, Proc Nati Acad Sci EE.UU. (1983), 21 -25), Ip1, rae (Boros et al., Gene 42 (1986), 97 - 100). Los promotores inducibles se usan preferiblemente para la síntesis de polipéptidos. Estos promotores a menudo llevan a rendimientos de polipéptidos mayores a los de los promotores constitutivos. Con el fin de obtener una cantidad óptima de polipéptido, se usa a menudo un procedimiento de dos etapas. En primer lugar, las células hospedadoras se cultivan en condiciones óptimas hasta una densidad celular relativamente alta. En la segunda etapa, se induce la transcripción dependiendo del
tipo de promotor usado. A este respecto, un promotor tac es particularmente adecuado, que puede ser inducido por lactosa o IPTG (= isopropil-R-D-tiogalactopiranósido) (deBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 80 (1983), 21 - 25). En la bibliografía también se describen señales de terminación para la transcripción.
La región codificadora que codifica el alquenol deshidratasa se puede modificar de maneras conocidas para el experto en la téenica. Por ejemplo, es posible insertar etiquetas que simplifican la purificación de la proteína, tal como una etiqueta his (véase el Ejemplo 1). Además, también es posible eliminar o interrumpir la secuencia señal de la enzima que asegura la localización en el periplasma, permitiendo de ese modo que la proteína se produzca intracelularmente. También es posible unir una señal de secreción a la región codificadora que permita la secreción de la proteína en el medio de cultivo.
También es posible expresar el alquenol deshidratasa como una proteína de fusión en la que el alquenol deshidratasa está fusionado a otro resto polipeptídico, por ejemplo, otra enzima.
La transformación de la célula hospedadora con un polinucleótido o vector de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo por procedimientos convencionales, como por ejemplo se describe en Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Coid Spring Harbor, NY, EE UU.; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 1990. La célula hospedadora se cultiva en medio nutritivo que reúne los requisitos de la célula hospedadora particular usada, en particular en lo que se refiere al valor de pH, temperatura, concentración de sal, aireación, antibióticos, vitaminas, oligoelementos, etc.
Los organismos usados en la invención pueden ser procariotas o eucariotas, preferiblemente, son microorganismos. El término "microorganismo" en el contexto de la presente invención se refiere a bacterias, así como a hongos, tales como levaduras, y también a algas y arqueas. El término "microorganismo" también incluye células vegetales o células animales. En una realización particular, los microorganismos son bacterias. Las bacterias preferidas para ser empleadas en el procedimiento de acuerdo con la invención son bacterias del género Bacillus, Clostridium, Corynebacterium,
Pseudomonas, Zymomonas, Methylobacter o Escherichia. En una realización particularmente preferida, la bacteria pertenece al genero Escherichia y aún más preferida a la especie Escherichia coli. En otra realización preferida, la bacteria pertenece a la especie Pseudomonas putida o a la especie Zymomonas mobilis o a la especie Corynebacterium glutamicum.
En otra realización preferida, los microorganismos son bacterias recombinantes, preferiblemente del género Escherichia, que se han modificado para producir endógenamente un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO, con 3 < n < 7, y que lo convierten en un compuesto dieno tal como se describe anteriormente en la presente memoria descriptiva.
El término "microorganismo" en el contexto de la presente invención se refiere a bacterias, así como a hongos, tales como levaduras, y también a algas y arqueas. En una realización preferida, el microorganismo es una bacteria. En principio, se puede usar cualquier bacteria. Las bacterias preferidas para ser empleadas en el procedimiento de acuerdo con la invención son bacterias del género Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Pseudomonas, Zymomonas o Escherichia. En una realización particularmente preferida, la bacteria pertenece al género Escherichia y aún más preferida a la especie Escherichia coli. En otra realización preferida, la bacteria pertenece a la especie Pseudomonas putida o a la especie Zymomonas mobilis o a la especie Corynebacterium glutamicum.
En otra realización preferida, el microorganismo es un hongo, más preferiblemente un hongo del género Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Aspergillus, Trichoderma, Kluyveromyces o Pichia y aún más preferiblemente de la especie Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis o Pichia pastoris.
En una realización particularmente preferida, el microorganismo es un hongo recombinante, preferiblemente una levadura que produce un compuesto que responde a la fórmula general CnhbnO, con 3 < n < 7, y que lo convierte en un compuesto dieno tal como se describe anteriormente en la presente memoria descriptiva.
En otra realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la invención hace uso de un microorganismo fotosintetico que expresa un alquenol deshidratasa. Preferiblemente, el microorganismo es una bacteria fotosintética, o una microalga. Incluso más preferiblemente un microorganismo como tal tiene la propiedad natural o artificial de producir endógenamente un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO, con 3 < n < 7. En este caso el microorganismo sería capaz de producir un dieno directamente a partir de CO2 presente en solución.
En otra realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la invención hace uso de un organismo multicelular que expresa un alquenol deshidratasa. Ejemplos de tales organismos son plantas o animales.
En una realización, el procedimiento implica el cultivo de microorganismos en condiciones de cultivo convencionales (30 °C - 37 °C a 1 atm, en un termentador que permite el crecimiento aeróbico de las bacterias). El butadieno y el isopreno tienen un punto de ebullición de -4 °C y 34 °C, respectivamente, y ya estarían en estado gaseoso si se elige una temperatura de 34 °C o superior para el cultivo. En una realización preferida, el procedimiento implica el cultivo de microorganismos en condiciones no convencionales, preferiblemente a una temperatura más elevada para corresponder a las condiciones de cultivo de organismos termófilos. Esta realización tiene la ventaja de que incluso los dienos que tienen un punto de ebullición más elevado, en particular, dimetilbutadieno (con un punto de ebullición de 68 °C) se desgasificarían fuera del cultivo y se podrían recoger fácilmente a partir de la fase gaseosa. Por lo tanto, en particular, en aquellas realizaciones del procedimiento de acuerdo con la invención en las que se produce dimetilbutadieno, el microorganismo es un microorganismo termófilo que puede ser cultivado a temperaturas de 68 °C o superior.
En una realización preferida adicional, el procedimiento de acuerdo con la invención, que hace uso de un microorganismo, se lleva a cabo de tal manera que el microorganismo está inmovilizado sobre un soporte.
En una realización preferida adicional, el procedimiento de la invención se lleva a cabo en condiciones microaerófilas. Esto significa que la cantidad de aire inyectado es limitante, de tal forma que reduce al mínimo las concentraciones de oxígeno residual en los efluentes gaseosos que contienen el compuesto dieno producido.
En otra realización preferida, el procedimiento de acuerdo con la invención se lleva a cabo en condiciones de tal forma que el dieno producido se desgasifica fuera de la reacción. Esto tiene la ventaja de que el equilibrio termodinámico de la reacción se desplaza hacia la producción del dieno conjugado. Se prefiere que el procedimiento comprenda además la etapa de recoger el dieno gaseoso. Por lo tanto, en una realización preferida, el procedimiento se lleva a cabo en presencia de un sistema para recoger el dieno producido en forma gaseosa durante la reacción.
En una realización particular, el procedimiento también comprende detectar el dieno producido (butadieno, isopreno o dimetilbutadieno), que está presente en la fase gaseosa. La presencia del dieno que se va a producir en un ambiente de aire u otro gas, incluso en pequeñas cantidades, puede ser detectada mediante el uso de diversas téenicas y, en particular, mediante el uso de sistemas de cromatografía de gases con detección de ionización de llama o de infrarrojos, o por acoplamiento con espectrometría de masas.
La presente invención también se refiere al uso de un organismo que produce un alquenol deshidratasa, tal como un linalool deshidratasa - isomerasa, para la conversión de un compuesto que responde a la fórmula general CnhhnO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7 , como se describe anteriormente en la presente memoria descriptiva en relación con el procedimiento de acuerdo con la invención. En una realización preferida tal organismo es un organismo recombinante en el sentido de que está modificado genéticamente debido a la introducción de al menos una molécula de ácido nucleico que codifica un alquenol deshidratasa, tal como un linalool deshidratasa - isomerasa. Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico como tal es heteróloga con respecto al organismo, lo que significa que no se produce de forma natural en dicho organismo.
En una realización preferida tal organismo es un organismo que produce un compuesto que responde a la fórmula general CnhbiO, con 3 < n < 7.
La presente invención también se refiere al uso de un alquenol deshidratasa, tal como un linalool deshidratasa - isomerasa, para la conversión de un compuesto que responde a la fórmula general CnhtenO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7, como se describe anteriormente en la presente memoria descriptiva, en relación con el
procedimiento de acuerdo con la invención.
Además, la presente invención tambien se refiere a una composición que comprende un organismo que produce un alquenol deshidratasa y un compuesto que responde a la fórmula general CnhtenO, con 3 < n < 7. La presente invención también se refiere a una composición que comprende un alquenol deshidratasa, tal como un linalool deshidratasa - isomerasa, y un compuesto que responde a la fórmula general CnhfenO, con 3 < n < 7.
Otros aspectos y ventajas de la invención se describirán en los siguientes ejemplos, que se proporcionan con fines ilustrativos y no a modo de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Clonación y expresión en E. coli del gen para linalool deshidratasa - isomerasa
Clonación y cultivo bacteriano
La secuencia de linalool deshidratasa - isomerasa inferida a partir del genoma de Castellaniella defragrans (anteriormente Alcaligenes defragrans) se generó mediante la concatenación del oligonucleótido para adaptar el uso del codón de E. coli. Se insertó un tramo de 6 codones de histidina después del codón de iniciación de metionina para proporcionar una etiqueta de afinidad para la purificación. El gen sintetizado de este modo se clonó en un vector de expresión pET25b (+) (el vector fue construido por GeneArt AG). Las células competentes de E. coli BL21 (DE3) (Novagen) fueron transformadas con este vector de acuerdo con el procedimiento de choque de calor. Como control negativo, la cepa de E. coli BL21 (DE3) se transformó con el vector vacío. Las células transformadas se cultivaron con agitación (160 rpm) en un medio de auto-inducción-ZYM 5052 (Studier FW, Prot. Exp. Pur.41 (2005), 207 - 234) durante 6 horas a 37 °C y la expresión de la proteína se continuó a 18 °C durante toda la noche (aproximadamente 12 horas). Las células se recogieron por centrifugación a 4 °C, 10.000 rpm durante 20 min y los sedimentos se congelaron a -80 °C.
Preparación de Usado celular
Los sedimentos de 100 mi de celulas de cultivo se descongelaron en hielo y se volvieron a suspender en 4 mi de T ris-HCI 50 mM, pH 7,5. A continuación se añadieron 10 ml de lisonasa (Novagen). Las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego volvieron a hielo durante 20 minutos. La concentración de proteínas se determinó usando el procedimiento de Bradford (BioRad).
Ejemplo 2: producción de 1,3-butadieno a partir de (2E) -2-buten-1 -ol (alcohol trans crotílico)
Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones:
Tris HCI 50 mM, pH 7,5
D, L-ditiotreitol 2 mM
(2E) -2-buten-1-ol 0-80 mM (alcohol trans crotílico)
El pH se ajustó a 7,5
Se añadió 0,25 mi de lisado celular que contiene linalool deshidratasa -isomerasa recombinante a 0,5 mi de mezcla de reacción. En paralelo, se llevó a cabo una reacción de control libre de enzimas que contiene el lisado de células de E. coli transformadas con el vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 °C durante 1 - 22 horas en un vial de vidrio sellado de 2 mi (Interchim) con agitación. A continuación se recogió 1 mi de la fase de espacio de cabeza y se inyectó en un cromatógrafo de gases Varían 450-GC equipado con un detector de ionización de llama (abreviadamente en inglés FID). Se usó nitrógeno como gas vehículo con una velocidad de flujo de 1,5 mi / min. Los compuestos volátiles se separaron por cromatografía en columna de enlace Rt-Alúmina / Na2SÜ4 (Restek) usando un modo isotérmico a 130 °C. El producto de la reacción enzimática fue identificado por comparación con el 1,3-butadieno convencional (Sigma). Bajo estas condiciones cromatográficas, el tiempo de retención del butadieno era de 7,6 min. Se observó una producción significativa de 1 ,3-butadieno en el ensayo enzimático con linalool deshidratasa - isomerasa. No se observó ninguna señal de butadieno en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 7). El número de recambio para esta conversión ascendió a aproximadamente 3x10-5 s_1 de la molécula de sustrato por el sitio activo de la enzima.
Ejemplo 3: Producción de 1 ,3-butadieno a partir de 3-buten-2-ol
Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones:
Tris HCI 50 mM pH 7,5
D, L-ditiotreitol 2 mM
3-buten-2-ol 0 mM - 80 mM
El pH se ajustó a 7,5
Se añadió 0,25 mi de lisado celular que contiene linalool deshidratasa -isomerasa recombinante a 0,5 mi de mezcla de reacción. En paralelo, se llevó a cabo una reacción de control libre de enzimas que contiene el lisado de células de E. coli transformadas con el vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 °C durante 1 - 22 horas en un vial de vidrio sellado de 2 mi (Interchim) con agitación. La producción de 1,3-butadieno se analizó por medio del procedimiento GC / FID, como se describe en el ejemplo 2. Se observó una producción significativa de 1 ,3-butadieno en el ensayo enzimático con linalool deshidratasa - isomerasa. No se observó ninguna señal de butadieno en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 8). El número de recambio para esta conversión ascendió a aproximadamente 10·4 s_1 de la molécula de sustrato por el sitio activo de la enzima.
También se realizaron experimentos similares usando but-3-en-2-ol enantiopuro R y S, y se observaron resultados similares.
Ejemplo 4: 2-metil-1 ,3-butadieno (isopreno) la producción de 3-metil-2-buten-1-ol (prenol)
Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones:
Tris HCI 50 mM, pH 7,5
D, L-ditiotreitol 2 Mm
3-metil-2-buten-1-ol (prenol) 0 mM - 80 mM
El pH se ajustó a 7,5
Se añadió 0,25 mi de lisado celular que contiene linalool deshidratasa -isomerasa recombinante a 0,5 mi de mezcla de reacción. En paralelo, se llevó a cabo una reacción de control libre de enzimas que contiene el lisado de células de E. coli
transformadas con el vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 °C durante 1 - 22 horas en un vial de vidrio sellado de 2 mi (Interchim) con agitación. Despues se recogieron 100 mI de la fase de espacio de cabeza y se inyectaron en un cromatógrafo de gases Varían 450-GC equipado con un detector de ionización de llama (FID). Los compuestos volátiles de la fase de espacio de cabeza se separaron en columna Rtx-1 (Restek) usando nitrógeno como gas vehículo con una velocidad de flujo de 1 ,5 mi / min. El ciclo de horno para cada muestra fue de 100 °C durante 4 minutos, aumentando la temperatura a 20 °C / minuto hasta una temperatura de 130 °C, y se mantuvo a 130 °C durante 1,5 minutos. El tiempo total de ejecución fue de 7 min. El producto de la reacción enzimática fue identificado por comparación con el isopreno convencional (Sigma). Bajo estas condiciones GC, el tiempo de retención del isopreno era de 3,08 min. Se observó una producción significativa de isopreno en el ensayo enzimático con linalool deshidratasa - isomerasa. Se observó una señal insignificante de isopreno correspondiente a la descomposición espontánea de prenol en el ensayo de control libre de enzimas (Tabla 1). El número de recambio para esta conversión ascendió a aproximadamente 3x10_4s·1 de la molécula de sustrato por el sitio activo de la enzima.
Tabla 1. Producción de isopreno después de 22 horas de incubación en ensayos con prenol 80 mM.
Ejemplo 5: Producción de 2-metil-1,3-butadieno (isopreno) a partir de 3-metil-3-buten-1-ol (isoprenol)
Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones: Tris HCI 50 mM, pH 7,5
D, L-ditiotreitol 2 Mm
3-metil-3-buten-1-ol (isoprenol) 0 mM - 80 mM
El pH se ajustó a 7,5
Se añadió 0,25 mi de lisado celular que contiene linalool deshidratase -isomerasa recombinante a 0,5 mi de mezcla de reacción. En paralelo, se llevó a cabo una reacción de control libre de enzimas que contiene el lisado de células de E. coli transformadas con el vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 °C durante 1 - 22 horas en un vial de vidrio sellado de 2 mi (Interchim) con agitación. La producción de isopreno se analizó por medio del procedimiento GC / FID, como se describe en el ejemplo 4. Se observó una producción significativa de isopreno en el ensayo enzimático con linalool deshidratasa - isomerasa. No se observó ninguna señal de isopreno en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 9). El número de recambio para esta conversión ascendió a aproximadamente 3x105s 1 de la molécula de sustrato por el sitio activo de la enzima.
Ejemplo 6: Producción de 2-metil-1,3-butadieno (isopreno) a partir de 2-metil-3-buten-2-ol
Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones:
Tris HCI 50 mM, pH 7,5
D, L-ditiotreitol 2 Mm
2-metil-3-buten-2-ol 0 mM - 80 mM
El pH se ajustó a 7,5
Se añadió 0,25 mi de Usado celular que contiene linalool deshidratasa -isomerasa recombinante a 0,5 mi de mezcla de reacción. En paralelo, se llevó a cabo una reacción de control libre de enzimas que contiene el lisado de células de E. coli transformadas con el vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 °C durante 1 - 22 horas en un vial de vidrio sellado de 2 mi (Interchim) con agitación. La producción de isopreno se analizó por medio del procedimiento GC / FID, como se describe en el ejemplo 4. Se observó una producción significativa de isopreno en el ensayo enzimático con linalool deshidratasa - isomerasa. No se observó ninguna señal de isopreno en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 10). El número de recambio para esta conversión ascendió a aproximadamente 103s_1 de la molécula de sustrato por el sitio activo de la enzima.
Ejemplo 7: Cinética de la producción de 1,3-butadieno a partir de (E)-but-2-en-1-ol (alcohol trans crotílico)
Lisis celular y preparación de sobrenadante
El lisado celular se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 con las siguientes modificaciones. El sedimento obtenido a partir de 200 mi de células cultivadas se descongeló en hielo y se volvió a suspender en 3 mi de Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, suplementado con D, L-d itiotreitol 4 mM, glutatión 20 mM, MgCla 25 mM y KCI 25 mM. A continuación, se añadió 10 ml de lisonasa (Merck). Las células se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se volvieron a hielo durante 20 minutos. El lisado celular se clarificó por centrifugación a 13.000 rpm, 4 °C durante 10 min. El sobrenadante recogido se concentró en unidad de filtro Amicon Ultra-4 10 kDa (Millipore). El nivel de expresión de linalool deshidratasa - isomerasa se estimó por análisis SDS-PAGE de sobrenadante. La concentración de la proteína total se determinó usando el procedimiento de Bradford (BioRad).
Ensayo enzimático
Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones:
Tris-HCI 50 mM, pH 7,5
Alcohol trans crotílico 0 mM - 160 mM (Alfa Aesar)
Se añadieron 0,2 mi - 0,4 mi del sobrenadante que contiene el linalool deshidratasa - isomerasa recombinante a 0,5 mi de la mezcla de reacción. La concentración de linalool deshidratasa - isomerasa en el ensayo era de aproximadamente 1,2 mg / mi. En paralelo, se llevaron a cabo reacciones de control libres de enzimas que contienen el sobrenadante de células de E. coli transformadas con un vector vacío. Las reacciones se incubaron a 37 °C en un vial de vidrio sellado de 2 mi (Interchim) con agitación. Las reacciones detuvieron por congelación de los tubos de ensayo a -80 °C. La producción de butadieno se midió mediante el análisis de alícuotas de la muestra durante un período de incubación de 5,5 horas. La cantidad de 1,3-butadieno producido se cuantificó por medio de análisis de cromatografía de gases (GC) de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. La Figura 11 muestra la cinética de la producción de 1,3-butadieno para un intervalo de
concentraciones de alcohol trans crotílico.
Ejemplo 8: Cinética de la producción de 1 ,3-butadieno a partir de but-3-en- 2-ol
El Usado celular aclarado que contiene el linalool deshidratasa - isomerasa recombinante se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 7.
Ensayo enzimático
Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones:
Tris-HCI 50 mM, pH 7,5
but-3-en-2-ol 0 mM - 160 mM (Sigma-Aldrich)
Se añadieron 0,2 mi - 0,4 mi del sobrenadante que contiene el linalool deshidratasa - isomerasa recombinante a 0,5 mi de la mezcla de reacción. La concentración de linalool deshidratasa - isomerasa en el ensayo era de aproximadamente 1,2 mg / mi. En paralelo, se llevaron a cabo reacciones de control libres de enzimas que contienen el sobrenadante de células de E. coli transformadas con un vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 °C en un vial de vidrio sellado de 2 mi (Interchim) con agitación. Las reacciones se detuvieron por congelación de los tubos de ensayo a -80 °C. La producción de butadieno se midió mediante el análisis de alícuotas de la muestra durante un período de incubación de 5,5 horas. La cantidad de 1,3-butadieno producido se cuantificó por medio de análisis de cromatografía de gases (GC) de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. La Figura 12 muestra la cinética de la producción de 1,3-butadieno para un intervalo de concentraciones de but-3-en -2-ol.
Ejemplo 9: Producción de 1,3-butadieno a partir de but-3-en-1-ol (alcohol isocrotílico)
Preparación de Usado celular
El lisado celular se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 con las siguientes modificaciones. El sedimento obtenido a partir de 200 mi de células cultivadas se descongeló en hielo y se volvió a suspender en 3 mi de Tris-HCI 50 pH 7,5, suplementado con D , L-d itiotreitol 4 mM, glutatión 20 mM, MgCL 25 mM
y KCI 25 mM. A continuación, se añadió 10 mI de lisonasa (Merck). Las celulas se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se volvieron a hielo durante 20 minutos.
Ensayo enzimático
Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones:
Tris-HCI 50 mM, pH 7,5
but-3-en-1-ol 50 mM (Sigma)
Se añadió 0,4 mi de Usado celular que contiene el linalool deshidratasa -isomerasa recombinante a 0,5 mi de la mezcla de reacción. En paralelo, se llevó a cabo una reacción de control libre de enzimas que contiene el lisado de células de E. coli transformadas con un vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 °C durante 18 horas en un vial de vidrio sellado de 2 mi (Interchim) con agitación. A continuación se recogió 1 mi de la fase de espacio de cabeza y se inyectó en un cromatógrafo de gases Varían 450-GC equipado con un detector de ionización de llama (FID). Se usó nitrógeno como gas vehículo con una velocidad de flujo de 6 mi / min. Los compuestos volátiles se separaron por cromatografía en columna J&W GS-Alúmina (30 m x 0,53 mm DI) (Restek) usando un modo isotérmico a 130 °C. El producto de la reacción enzimática fue identificado por comparación con el 1 ,3-butadieno convencional (Sigma - Aldrich). Bajo estas condiciones de GC, el tiempo de retención del butadieno era de 3,05 min. Se produjo 1,3-butadieno en el ensayo enzimático en presencia de linalool deshidratasa - isomerasa, no se observó ninguna señal de butadieno en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 13).
Ejemplo 10: Producción de 2 -metil-1 ,3-butadieno (isopreno) a partir de 2-metilbut-3-en-2-ol
Durante otra ronda de experimentos, se reprodujo la reacción ensayada en el Ejemplo 6 y se ha confirmado el resultado. Las condiciones de ensayo exactas fueron como sigue:
El lisado celular aclarado que contiene el linalool deshidratasa - isomerasa recombinante se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 7.
Ensayo enzimático
Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones:
Tris-HCI 50 mM, pH 7,5
2- metilbut-3-en-2-ol 160 mM (Sigma)
Se añadieron 0,2 mi - 0,4 mi del sobrenadante que contiene el linalool deshidratasa - isomerasa recombinante a 0,5 mi de la mezcla de reacción. La concentración de linalool deshidratasa - isomerasa en el ensayo era de aproximadamente 1 ,2 mg / mi. En paralelo, se llevaron a cabo reacciones de control libres de enzimas que contienen el sobrenadante de celulas de E. coli transformadas con un vector vacío. Los ensayos se incubaron durante 6 horas a 37 °C en un vial sellado de 2 mi (Interchim) con agitación. Las reacciones detuvieron después por congelación de los tubos de ensayo a -80 °C.
A continuación se recogió 1 mi de la fase de espacio de cabeza y se inyectó en un cromatógrafo de gases Varían 450-GC equipado con un detector de ionización de llama (FID). Se usó nitrógeno como gas vehículo con una velocidad de flujo de 1,5 mi / min. Los compuestos volátiles se separaron por cromatografía en columna de enlace Rt-Alúmina / Na2S04 (Restek) usando un modo isotérmico a 155 °C. El producto de la reacción enzimática fue identificado por comparación con el isopreno convencional (Sigma - Aldrich). Bajo estas condiciones de GC, el tiempo de retención del isopreno era de 7,5 min.
Se observó una producción significativa de isopreno en el ensayo enzimático creado en presencia de linalool deshidratasa - isomerasa. No se observó ninguna señal de isopreno en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 14).
Ejemplo 11: Producción de 2-metil-1,3-butadieno (isopreno) a partir de 3-metilbut-3-en-2-ol
Preparación de Usado celular
El lisado celular se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 con las siguientes modificaciones. El sedimento obtenido a partir de 200 mi de células cultivadas se descongeló en hielo y se volvió a suspender en 3 mi de Tris-HCI 50 pH 7,5, que contiene D, L-ditiotreitol 4 mM, glutatión 20 mM, MgC 25 mM y KCI 25 mM. A continuación, se añadió 10 ml de lisonasa (Merck). Las células se
incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego se volvieron a hielo durante 20 minutos.
Ensayo enzimático
Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo bajo las siguientes condiciones: Tris-HCI 50 mM pH 7,5
3-metilbut-3-en-2-ol 50 mM (Sigma-Aldrich)
Se añadió 0,45 mi de lisado celular que contiene el linalool deshidratase -isomerasa recombinante a 0,5 mi de la mezcla de reacción. En paralelo, se llevó a cabo una reacción de control libre de enzimas que contiene el lisado de celulas de E. coli transformadas con un vector vacío. Los ensayos se incubaron a 37 °C durante 1 hora en un vial de vidrio sellado de 2 mi (Interchim) con agitación. A continuación se recogió 1 mi de la fase de espacio de cabeza y se inyectó en un cromatógrafo de gases Varían 450-GC equipado con un detector de ionización de llama (FID). Se usó nitrógeno como gas vehículo con una velocidad de flujo de 6 mi / min. Los compuestos volátiles se separaron por cromatografía en columna J&W GS-Alúmina (30 m x 0,53 mm DI) (Restek) usando un modo isotérmico a 150 °C. El producto de la reacción enzimática fue identificado por comparación con un isopreno convencional (Sigma -Aldrich). Bajo estas condiciones de GC, el tiempo de retención del isopreno era de 3,85 min. Se produjo una cantidad significativa de isopreno en el ensayo enzimático en presencia de linalool deshidratase - isomerasa, se observó una señal insignificante de isopreno correspondiente a la descomposición espontánea de 3-metilbut-3-en-2-ol en el ensayo de control libre de enzimas (Figura 15, Tabla 2).
Tabla 2: Producción de isopreno después de 1 hora de incubación en ensayos con 3-metilbut-3-en-2-ol 50 mM.
Ejemplo 12: Variantes truncadas de linalool deshidratase: la actividad con respecto a la reacción global de conversión de alcohol crotílico en 1,3 butadieno y para la reacción de deshidratación de but-3-en-2-ol en 1,3 butadieno
Diversos rastreos en busca de la mejora en la actividad y la solubilidad del linalool deshidratasa - isomerasa han llevado a la identificación de una recopilación de 9 variantes de la enzima que se truncan después de la porción C-terminal. La enzima de tipo salvaje de longitud completa corresponde a M1-K397 como se muestra en la SEC ID N°: 1. Las versiones truncadas observadas son M1-L385, M1-R386, M1-P388, M1-P389, M1-A391, M1-K393, M1 -L394, M1-A395 y M1-G396 como se muestra en SEC ID N°: 1. En estas versiones truncadas de forma C-terminal, sólo se ha modificado la longitud de la proteína, el resto de la secuencia de la proteína permanece sin cambios. La variante más corta (M1-L385) tiene una identidad del 96,9 %.
La actividad se ensayó de acuerdo con el siguiente ensayo:
Este ensayo se estableció de la siguiente manera. La recogida de variantes truncadas de forma C-terminal de linalool-deshidratasa isomerasa clonadas en el vector de expresión pET25b + comercial se transformó en células competentes BL21 (DE3). Se usaron clones aislados para inocular 1 mi de medio de autoinducción (Studier FW, Prot.Exp.Pur.41, (2005), 207 - 234) y se cultivaron durante toda la noche a 30 °C durante 20 - 22 horas en una incubadora con agitación ajustada a 700 rpm y humedad al 85 %. Las células se sedimentaron y se almacenaron a -80 °C durante toda la noche. Estos sedimentos celulares que contienen las variantes de linalool deshidratasa - isomerasa recombinante expresado se volvieron a suspender en una mezcla de reacción que contiene Tris-HCI 50 mM, pH 7,5, KCI 25 mM, MgCh 25 mM, DTT 4 mM, glutatión 10 mM, ya sea con de alcohol trans crotílico 50 mM (Alfa Aesar) o but-3-en-2-ol 50 mM (Sigma Aldrich). Se establecieron las reacciones de control usando clones bacterianos que contienen el vector de expresión vacío pET25b + o el vector de expresión que expresa la enzima de tipo salvaje. Esta mezcla de reacción se incubó durante 16 horas a 37 °C y la reacción se detuvo por una incubación de 5 minutos a 80 °C. La cantidad de 1 ,3-butadieno producido se cuantificó a continuación por análisis de cromatografía de gases (GC). Para el análisis de espacio de cabeza
GC, se inyectó 300mI del gas del espacio de cabeza en un sistema Bruker GC450 equipado con una columna Restek RT-alúmina (5 m x 0,32 mm) y un sistema de detección de ionización de llama (FID). El procedimiento de análisis de GC usado para detectar 1,3 butadieno se caracteriza por una temperatura del horno constante a 140 °C, temperatura del puerto inyector a 200 °C, con una relación de división de 1:4 y la temperatura del detector de FID a 250 °C. Se usó nitrógeno como gas vehículo (flujo constante de 1,25 mi / min) y una mezcla de aire (flujo de aire de 300 mi / min), nitrógeno (flujo de 28 mi / min) y se usó hidrógeno (flujo de 30 mi / min) para suministrar el sistema de detección de FID.
La actividad de las versiones truncadas anteriores de linalool deshidratasa para la reacción global de conversión de alcohol crotílico en 1 ,3 butadieno y para la reacción de deshidratación de but-3-en-2-ol en 1,3 butadieno, respectivamente, se muestra en la la Figura 16.
Ejemplo 13: El linalool deshidratasa - isomerasa recombinante cataliza la conversión de estereoisómeros de alcohol cis- y trans- crotílico en 1 ,3-butadieno
El gen que codifica el linalool deshidratasa - isomerasa recombinante se subclonó en el vector de expresión bacteriana PET-25b+ comercial de Novagen, se transformó en celulas competentes BL21 (DE3) y se sembró en placas de agar LB suplementadas con el antibiótico apropiado. Las células competentes BL21 (DE3) también se transformaron con el vector PET-25b + para usarse como control negativo en los ensayos enzimáticos posteriores. Se usaron transformantes individuales para inocular 500 mi de medio de auto-inducción (Studier FW, 2005;. Loe cit.) y los cultivos se incubaron durante toda la noche a 30 °C en una incubadora con agitación. Los sedimentos celulares se almacenaron durante toda la noche a -80 °C antes de volver a suspenderse en 7,5 mi de tampón de lisis (Tris-CI 50 mM, pH 7,5, DTT 4 mM, MgCb 25 mM, KCI 25 mM) suplementado con 50 ml de Merck Novagen Lisonasa. Las suspensiones celulares se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente seguido por 20 minutos en hielo. Los lisados celulares fueron aclarados después por centrifugación y los sobrenadantes se concentraron 2 veces usando un concentrador de filtración (Amicon Ultra - Millipore). La cantidad de linalool deshidratasa - isomerasa recombinante presente en la fracción soluble concentrada se calculó en gel de SDS-
PAGE frente a una curva de calibración de albúmina de suero bovino usando densitometría gel. Las reacciones enzimáticas se establecieron en viales de vidrio de 2 mi (Interchim) con 225 mI del sobrenadante del lisado celular, un intervalo de alcohol trans- crotílico 0 a 100 mM (Alfa Aesar) o alcohol cis- crotílico (ChemSampCo), DTT 4 mM, MgC 25 mM, KCI 25 mM, glutatión 4 mM y Tris-CI 50 mM, pH 7,5 en un volumen de reacción final de 250pl. Las reacciones enzimáticas se establecieron usando el lisado celular que contiene el linalool deshidratasa - isomerasa recombinante o el lisado celular obtenido a partir de celulas transformadas con el vector de expresión vacío. Los viales se sellaron y se incubaron durante 4 horas a 37 °C. Las reacciones enzimáticas se detuvieron por medio de incubación durante 5 minutos a 80 °C y el 1 ,3-butadieno presente en el espado de cabeza de la reacción se cuantificó por cromatografía de gases (GC). Para el análisis del espacio de cabeza GC, se inyectó 300mI del gas del espacio de cabeza en un sistema Bruker GC450 equipado con una columna Restek RT-alúmina (5 m x 0,32 mm) y un sistema de detección de ionización de llama (FID). El procedimiento de análisis GC usado para detectar el 1,3-butadieno se caracteriza por una temperatura del horno constante a 140 °C (modo Isotérmico), temperatura del puerto inyector a 200 °C, con una relación de división de 1:4 y la temperatura del detector de FID a 250 °C. Se usó nitrógeno como gas vehículo (flujo constante de 1,25 mi / min) y una mezcla de aire (flujo de aire de 300 mi / min), nitrógeno (flujo de 28 mi / min) y se usó hidrógeno (flujo de 30 mi / min) para suministrar el sistema de detección de FID. El producto de la reacción enzimática se identificó por comparación con un 1,3-butadieno convencional (Sigma-Aldrich). Bajo estas condiciones GC, el tiempo de retención para el butadieno es 1,05 min. La Figura 17 muestra que el linalool deshidratasa - isomerasa recombinante es capaz de catalizar la conversión de cualquiera de alcohol cis- o trans- crotílico en 1,3-butadieno. No se observó ninguna señal significativa de 1 ,3-butadieno en las reacciones de control libres de enzimas.
Claims (15)
1. Un procedimiento para producir un dieno conjugado, caracterizado porque comprende una etapa de convertir enzimáticamente un compuesto que responde a la fórmula general CnHfenO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7, mediante el uso de un alquenol deshidratasa.
2. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto que responde a la fórmula general CnhbnO, con 3 < n < 7, es un alcohol alílico primario (PRA) de la fórmula I: Fórmula I en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H y CH3.
3. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto que responde a la fórmula general CnhtaiO, con 3 < n < 7, es un alcohol alílico secundario o terciario (STA) de la fórmula II: R HO-C-CH3 R,-< CH2 Fórmula II en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H y CH3.
4. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto que responde a la fórmula general CnhbnO, con 3 < n < 7, es un alcohol homoalílico primario (PHA) de la fórmula III: R2 C=CH2 R1— CH H2C-OH Fórmula III en la que R1 y R2 se seleccionan independientemente entre H y CH3.
5. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se lleva a cabo in vitro.
6. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el procedimiento se lleva a cabo mediante el uso de un microorganismo que produce un alquenol deshidratasa.
7. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el microorganismo es capaz de producir un compuesto que responde a la fórmula general CnhfenO, con 3 < n < 7.
8. El uso de un alquenol deshidratasa o de un microorganismo que produce un alquenol deshidratasa para convertir un compuesto que responde a la fórmula general CnhhnO en CnH2n-2 + H2O, con 3 < n < 7.
9. Una composición, caracterizada porque comprende un organismo que produce un alquenol deshidratasa y un compuesto que responde a la fórmula general CnH2nO, con 3 < n < 7.
10. Una composición, caracterizada porque comprende un alquenol deshidratasa y un compuesto que responde a la fórmula general CnHfenO, con 3 < n < 7.
11. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el uso de la reivindicación 8 o la composición de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que el alquenol deshidratasa es un linalool deshidratasa (EC 4.2.1.127).
12. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 u 11 , el uso de las reivindicaciones 8 u 11 o la composición de las reivindicaciones 9, 10 u 11, en el que el alquenol deshidratasa es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEC ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos idéntica al 30 % a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 1 y que muestra la actividad enzimática de la conversión de un compuesto que responde a la fórmula general CnhknO en CnH2n-2 + H2O , con 3 < n < 7.
13. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 ó 12 o el uso de las reivindicaciones 8, 11 ó 12 en donde n es 4 y el compuesto dieno producido es butadieno, o la composición de las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12 , en la que n es 4.
14. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 ó 12 o el uso de las reivindicaciones 8, 11 ó 12, en donde n es 5 y el compuesto dieno producido es isopreno, o la composición de las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12, en donde n es 5.
15. El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 11 ó 12 o el uso de las reivindicaciones 8, 11 ó 12, en donde n es 6 y el compuesto dieno producido es dimetil-butadieno, o la composición de las reivindicaciones 9, 10, 11 ó 12, en donde n es 6.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP12182270 | 2012-08-29 | ||
| PCT/EP2013/067727 WO2014033129A1 (en) | 2012-08-29 | 2013-08-27 | Production of volatile dienes by enzymatic dehydration of light alkenols |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MX2015002151A true MX2015002151A (es) | 2015-08-14 |
| MX360664B MX360664B (es) | 2018-11-13 |
Family
ID=46785274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MX2015002151A MX360664B (es) | 2012-08-29 | 2013-08-27 | Producción de dienos volátiles por deshidratación enzimática de alquenoles ligeros. |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US8703455B2 (es) |
| EP (1) | EP2890793B1 (es) |
| JP (1) | JP6513022B2 (es) |
| KR (1) | KR20150046320A (es) |
| CN (1) | CN104736713B (es) |
| AU (1) | AU2013307376B2 (es) |
| CA (1) | CA2880268A1 (es) |
| DK (1) | DK2890793T3 (es) |
| ES (1) | ES2643865T3 (es) |
| GT (1) | GT201500042A (es) |
| IL (1) | IL236964B (es) |
| IN (1) | IN2015DN02366A (es) |
| LT (1) | LT2890793T (es) |
| MX (1) | MX360664B (es) |
| MY (1) | MY166447A (es) |
| PE (1) | PE20150618A1 (es) |
| PH (1) | PH12015500448B1 (es) |
| PL (1) | PL2890793T3 (es) |
| RU (1) | RU2668403C2 (es) |
| SG (1) | SG2014012751A (es) |
| WO (1) | WO2014033129A1 (es) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013188546A2 (en) * | 2012-06-15 | 2013-12-19 | Invista Technologies S.À.R.L. | Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene |
| EP2721164A2 (en) | 2011-06-17 | 2014-04-23 | Invista Technologies S.à.r.l. | Methods of producing four carbon molecules |
| US9422578B2 (en) | 2011-06-17 | 2016-08-23 | Invista North America S.A.R.L. | Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene |
| US8703455B2 (en) * | 2012-08-29 | 2014-04-22 | Scientist of Fourtune, S.A. | Production of volatile dienes by enzymatic dehydration of light alkenols |
| EP2925871A1 (en) | 2012-11-28 | 2015-10-07 | Invista Technologies S.A R.L. | Methods for biosynthesis of isobutene |
| PL2997145T3 (pl) * | 2013-05-17 | 2021-09-06 | Global Bioenergies | Warianty dehydratazy alkenolowej |
| US10294496B2 (en) | 2013-07-19 | 2019-05-21 | Invista North America S.A.R.L. | Methods for biosynthesizing 1,3 butadiene |
| US9862973B2 (en) | 2013-08-05 | 2018-01-09 | Invista North America S.A.R.L. | Methods for biosynthesis of isoprene |
| EP3030668A1 (en) | 2013-08-05 | 2016-06-15 | Invista Technologies S.A R.L. | Methods for biosynthesis of isobutene |
| WO2015195710A1 (en) | 2014-06-16 | 2015-12-23 | Invista Technlogies S.A.R.L. | Process for producing glutarate and glutaric acid methyl ester |
| US10113186B2 (en) | 2014-11-13 | 2018-10-30 | Global Bioenergies | Alkenol dehydratase variants |
| US9220742B1 (en) | 2015-02-27 | 2015-12-29 | Invista North America S.A.R.L. | Mutant polypeptides and uses thereof |
| CN107750276A (zh) | 2015-04-09 | 2018-03-02 | 基因组股份公司 | 用于改进巴豆醇生产的工程化微生物和方法 |
| WO2016196233A1 (en) * | 2015-05-30 | 2016-12-08 | Genomatica, Inc. | Vinylisomerase-dehydratases, alkenol dehydratases, linalool dehydratases and/ crotyl alcohol dehydratases and methods for making and using them |
| KR20190004258A (ko) | 2016-03-09 | 2019-01-11 | 브라스켐 에세.아. | 에틸렌 글리콜 및 3-탄소 화합물의 동시-생산을 위한 미생물 및 방법 |
| US11286490B2 (en) | 2016-07-12 | 2022-03-29 | Braskem S.A. | Formation of alkenes through enzymatic dehydration of alkanols |
| IT201600105178A1 (it) | 2016-10-19 | 2018-04-19 | Versalis Spa | Procedimento per la produzione di dieni |
| US11162115B2 (en) | 2017-06-30 | 2021-11-02 | Inv Nylon Chemicals Americas, Llc | Methods, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons |
| US11634733B2 (en) | 2017-06-30 | 2023-04-25 | Inv Nylon Chemicals Americas, Llc | Methods, materials, synthetic hosts and reagents for the biosynthesis of hydrocarbons and derivatives thereof |
| US11505809B2 (en) | 2017-09-28 | 2022-11-22 | Inv Nylon Chemicals Americas Llc | Organisms and biosynthetic processes for hydrocarbon synthesis |
| JP7262189B2 (ja) * | 2018-08-03 | 2023-04-21 | 国立大学法人千葉大学 | 共役ジエン製造用触媒、前記触媒の製造方法、及び共役ジエンの製造方法 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5643758A (en) * | 1987-03-10 | 1997-07-01 | New England Biolabs, Inc. | Production and purification of a protein fused to a binding protein |
| WO2009076676A2 (en) | 2007-12-13 | 2009-06-18 | Danisco Us Inc. | Compositions and methods for producing isoprene |
| EP2336341A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-22 | Philippe Marliere | Method for producing an alkene comprising the step of converting an alcohol by an enzymatic dehydration step |
| EP2336340A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-22 | Philippe Marliere | Method for producing an alkene comprising the step of converting an alcohol by an enzymatic dehydration step |
| CN103025877A (zh) * | 2010-07-26 | 2013-04-03 | 基因组股份公司 | 用于生物合成芳族化合物、2,4-戊二烯酸和1,3-丁二烯的微生物和方法 |
| EP2721164A2 (en) * | 2011-06-17 | 2014-04-23 | Invista Technologies S.à.r.l. | Methods of producing four carbon molecules |
| US20120323166A1 (en) | 2011-06-20 | 2012-12-20 | Fitzgerald Matthew J | Phacoemulsification irrigation sleeve with an alignment mark |
| MX348612B (es) | 2011-08-19 | 2017-06-21 | Genomatica Inc | Microorganismos y metodos para producir 2,4 - pentadienoato, butadieno, propileno, 1,3 - butanodiol y alcoholes relacionados. |
| EP2785848A2 (en) | 2011-12-02 | 2014-10-08 | INVISTA Technologies S.à.r.l. | Methods for biosynthesizing 1,3butadiene |
| US8741613B2 (en) | 2012-05-16 | 2014-06-03 | Glycos Biotechnologies, Inc. | Microorganisms and processes for the production of isoprene |
| US8703455B2 (en) * | 2012-08-29 | 2014-04-22 | Scientist of Fourtune, S.A. | Production of volatile dienes by enzymatic dehydration of light alkenols |
-
2013
- 2013-08-02 US US13/957,482 patent/US8703455B2/en active Active
- 2013-08-27 EP EP13766909.9A patent/EP2890793B1/en active Active
- 2013-08-27 LT LTEP13766909.9T patent/LT2890793T/lt unknown
- 2013-08-27 ES ES13766909.9T patent/ES2643865T3/es active Active
- 2013-08-27 CA CA2880268A patent/CA2880268A1/en not_active Abandoned
- 2013-08-27 RU RU2015111090A patent/RU2668403C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-08-27 MY MYPI2015700258A patent/MY166447A/en unknown
- 2013-08-27 CN CN201380044914.1A patent/CN104736713B/zh active Active
- 2013-08-27 AU AU2013307376A patent/AU2013307376B2/en not_active Ceased
- 2013-08-27 KR KR1020157008025A patent/KR20150046320A/ko not_active Ceased
- 2013-08-27 PL PL13766909T patent/PL2890793T3/pl unknown
- 2013-08-27 JP JP2015528987A patent/JP6513022B2/ja active Active
- 2013-08-27 MX MX2015002151A patent/MX360664B/es active IP Right Grant
- 2013-08-27 DK DK13766909.9T patent/DK2890793T3/da active
- 2013-08-27 WO PCT/EP2013/067727 patent/WO2014033129A1/en not_active Ceased
- 2013-08-27 SG SG2014012751A patent/SG2014012751A/en unknown
- 2013-08-27 PE PE2015000241A patent/PE20150618A1/es not_active Application Discontinuation
-
2014
- 2014-03-03 US US14/195,738 patent/US8975050B2/en active Active
- 2014-04-09 US US14/249,022 patent/US8895278B2/en active Active
-
2015
- 2015-01-28 US US14/607,328 patent/US9617564B2/en active Active
- 2015-01-28 IL IL236964A patent/IL236964B/en active IP Right Grant
- 2015-02-25 GT GT201500042A patent/GT201500042A/es unknown
- 2015-02-27 PH PH12015500448A patent/PH12015500448B1/en unknown
- 2015-03-23 IN IN2366DEN2015 patent/IN2015DN02366A/en unknown
-
2017
- 2017-02-27 US US15/444,156 patent/US20170175147A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2013307376B2 (en) | Production of volatile dienes by enzymatic dehydration of light alkenols | |
| CN102083990B (zh) | 通过3-羟基烷酸的酶促脱羧制备烯 | |
| KR101883511B1 (ko) | 3-히드록시알카노산의 조합된 효소적 전환에 의한 알켄의 제조 | |
| AU2012324935B2 (en) | Process for the enzymatic production of butadiene from crotyl alcohol | |
| EP2336341A1 (en) | Method for producing an alkene comprising the step of converting an alcohol by an enzymatic dehydration step | |
| EP2336340A1 (en) | Method for producing an alkene comprising the step of converting an alcohol by an enzymatic dehydration step | |
| JP6231011B2 (ja) | ３−ヒドロキシアルク−４−エノエートおよび／または３−ホスホノキシアルク−４−エノエートの酵素変換による１，３−ジエンの産生 | |
| US10036003B2 (en) | Alkenol dehydratase variants of linalool dehydratase-isomerase | |
| EP3218476B1 (en) | Alkenol dehydratase variants | |
| BR112015003686B1 (pt) | Produção de dienos voláteis por desidratação enzimática de alcenóis leves |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Grant or registration |