MX2015001600A - Anticuerpos anti-virus del dengue y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona, entre otras cosas, agentes de anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos y/o fragmentos de los mismos que unen antígeno) que se unen a epítopos de DV, así como composiciones que los contienen y métodos de diseño, suministro, formulación, uso, identificación y/o caracterización de los mismos. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran unión significativa a una pluralidad de serotipos de DV. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran unión significativa a la totalidad de los cuatro serotipos de DV. Estos agentes de anticuerpo son útiles, por ejemplo, en la profilaxis, tratamiento, diagnóstico y/o estudio de DV.

Description

ANTICUERPOS ANTI-VIRUS DEL DENGUE Y USOS DE LOS MISMOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus del dengue (DV) es un miembro de la familia de virus Falviviridae y se transmite a las personas por varias especies de mosquitos dentro del género Aedes, principalmente Aedes aegypti . Más de 3.6 miles de millones de personas en todo el mundo se encuentran en riesgo de ser infectados con DV, y más de 200 millones de infecciones de DV se calcula que se producen cada año en todo el mundo (McBride et al., 2000 Microbes & Infection 2:1041-1050, Guzman et al., 2010 Nature Rev, Microbiol.8:S7-16). La fiebre del dengue es la enfermedad arboviral médicamente más relevante en humanos. Los incrementos significativos en incidencia, alcance geográfico y gravedad de los casos de enfermedad de dengue vuelven a DV un patógeno mayor en humanos. Desafortunadamente, los regímenes terapéuticos eficaces no están disponibles actualmente; las medidas de prevención actuales más eficaces se basan en control de los mosquitos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones para el tratamiento y/o prevención de infección por DV. Entre otras cosas, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que neutralizan la totalidad de los cuatro serotipos DV. En algunas modalidades, se proporcionan REF: 253760 agentes de anticuerpo que son variantes del anticuerpo de referencia 4E11; en algunas de estas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que tienen secuencias de aminoácidos que muestran una alta identidad de secuencia general con la de 4E11 o un fragmento relevante de la misma pero que aún incluyen variaciones de secuencia específicas en comparación con 4E11 y muestran una mejora significativa en la neutralización de por lo menos un serotipo de DV en comparación con el observado para 4E11.

La presente invención proporciona el avance de que el anticuerpo de referencia 4E11 tiene ciertos atributos deseables que incluyen unión a la totalidad de los cuatro serotipos de DV y que tienen potente capacidad neutralizante de tres de los cuatro serotipos de DV pero también carece de la capacidad de neutralizar eficazmente el cuarto serotipo de DV. La presente invención identifica la fuente del problema de la incapacidad de 4E11 para neutralizar eficazmente este cuarto serotipo de DV. En particular, la presente invención define modificaciones de rasgos estructurales que mejoran la capacidad de un agente de anticuerpo cuya secuencia contiene una o varias de las modificaciones para neutralizar el serotipo relevante de DV en comparación con la capacidad de 4E11, el cual carece de las modificaciones. La presente invención por lo tanto define y proporciona anticuerpos que tienen estructuras que incluyen las modificaciones del rasgo estructural relevante (pero que de otra manera son sustancialmente idénticos a los de 4E11) y que están caracterizados por una capacidad para neutralizar el serotipo 4 de DV (DV4). En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpos que muestran capacidades para neutralizar cada uno de los otros tres serotipos de DV que no se reducen de manera significativa en comparación con los de 4E11. En realidad, en algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que están caracterizados por un incremento sorprendente en la capacidad de neutralización con respecto a uno o más de los otros tres serotipos de DV (DV1 a 4) en comparación con los observados con 4E11.

La presente invención proporciona teenologías para definir modificaciones estructurales que imparten actividades biológicas de interés a polipéptidos mientras mantienen rasgos estructurales necesarios para conservar otras actividades.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a epítopos de DV así como composiciones que las contienen y métodos de diseño, suministro, formulación, uso, identificación y/o caracterización de las mismas. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran unión significativa a una pluralidad de serotipos de DV. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran unión significativa a la totalidad de los cuatro serotipos de DV. Se proporcionan agentes de anticuerpo que son útiles, por ejemplo, en la profilaxis, tratamiento, diagnóstico y/o estudio de DV.

En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que presentan competencia cruzada con uno o más anticuerpos anti-DV de referencia descritos previamente. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que se unen a un epítopo que es o que comprende una secuencia de aminoácidos dentro de la SEC ID NO: 17 (EDIII-DV1), SEC ID NO: 18 (EDIII-DV2), SEC ID NO: 19 (EDIII-DVE), SEC ID NO: 20 (EDIII-DV4) y/o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que no compiten de manera cruzada de modo significativo con uno o más anticuerpos anti-DV descritos previamente de modo más particular.

En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que neutralizan DV en sistemas de modelo establecidos con mayor potencia en comparación con uno o más anticuerpos anti-DV de referencia descritos previamente. La presente invención abarca, entre otras cosas, el reconocimiento de que los agentes de anticuerpo que se proporcionan pueden ofrecer un beneficio terapéutico y/o profiláctico superior en comparación con los anticuerpos anti-DV descritos previamente.

Se proporcionan agentes de anticuerpo que son útiles en una diversidad de contextos que incluyen, por ejemplo, en aplicaciones terapéuticas, profilácticas, de diagnóstico y/o de investigación. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que son útiles en el tratamiento de infección crónica y/o aguda por DV, por ejemplo, al administrar a un sujeto que padece o que es susceptible de esta infección una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más de los agentes de anticuerpos proporcionados de esta manera que se suministran. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad suficiente para obtener uno o más efectos biológicos particulares que incluyen, pero que no se limitan a: (i) reducir la gravedad o frecuencia de, y/o retrasar el inicio o resurgimiento de uno o más síntomas o características de infección por DV en un individuo susceptible de o que padece de infección por DV; y/o (ii) reducir el riesgo de infección y/o el desarrollo de uno o más síntomas o características de infección por DV en un individuo expuesto o en riesgo de exposición a infección por DV. En algunas modalidades, uno o más síntomas o características de infección por DV es o Comprende fiebre alta y por lo menos uno o más síntomas adicionales que se seleccionan, por ejemplo, de cefalea grave, dolor grave en ojos, dolor en articulaciones, dolor muscular, dolor en huesos, erupción cutánea, manifestación de hemorragia ligera (por ejemplo, sangrado de nariz o encías, petequias, moretones que se producen con facilidad), dolor abdominal, vómito, heces negras y alquitranadas, somnolencia o irritabilidad, piel pálida, fría o fría y pegajosa, dificultad en respirar, cuenta leucocítica baja, partículas virales circulantes en el individuo en uno o más tejidos (por ejemplo, sangre, médula ósea) u órganos (por ejemplo, hígado) de los mismos. En algunas modalidades un individuo que padece de infección por DV presenta fiebre alta y por lo menos dos de los síntomas adicionales.

En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que pueden ser utilizados para evitar, reducir la recurrencia de y/o retrasar el inicio de uno o más síntomas o características de infección por DV. En algunas modalidades se pueden utilizar agentes de anticuerpo proporcionados, por ejemplo, para inmunización pasiva de individuos expuestos recientemente a DV o en riesgo de estar expuestos a DV, bebés recién nacidos que nace de madres positivas DV y/o pacientes de transplante de hígado (por ejemplo, para evitar posibles infecciones DV recurrentes en estos pacientes).

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes imitadores virales cuya estructura incluye uno o más elementos conservados de ciertos antígenos de DV, por ejemplo, suficiente para permitir que el agente imitador viral imite una o más actividades biológicas del antígeno DV relevante . En algunas modalidades, los agentes imitadores virales incluyen elementos estructurales conservados de antígenos de DV, por ej emplo, como se define en la presente y la carencia de uno o más elementos estructurales adicionales de los antígenos de DV. En algunas modalidades se proporcionan agentes de imitación viral que son o que comprenden uno o más polipeptidos . En algunas modalidades se proporcionan polipéptidos de agente de imitación viral que tienen secuencias de aminoácidos que incluyen uno o más elementos de secuencia conservados a partir de un antígeno de DV; en algunas modalidades se proporcionan polipéptidos de agente imitador viral que carecen de una o más de elementos de secuencia adicionales a partir del antígeno de DV. Por ejemplo, en algunas modalidades, se proporcionan polipéptidos de agente imitador viral que son o que comprenden fragmentos de un antígeno de DV.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos terapéuticos de tratamiento, utilizados después del desarrollo de uno o más síntomas de infección por DV. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos terapéuticos de profilaxis utilizados antes del desarrollo de uno o más síntomas de infección por DV y/o antes de exposición a DV, infección por DV o riesgo de la misma. En algunas modalidades particulares, la presente invención proporciona teenologías de inmunización pasiva .

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos de diagnóstico para detectar DV en, y/o caracterizar de alguna otra manera muestras tales como muestras clínicas, ambientales y/o de investigación.

La presente invención proporciona sistemas para diseñar, identificar y/o caracterizar agentes útiles de anticuerpo anti-DV. Por ejemplo, en algunas modalidades, la presente invención proporciona enfoques computaciones empíricos que captan rasgos fisicoquímicos particulares comunes a interfases de proteínas. En algunas modalidades, estos enfoques permiten la predicción de interacciones proteína-proteína (por ejemplo, interacciones antígeno-anticuerpo) que incluyen, por ejemplo, predecir cuales secuencias de aminoácidos pueden mostrar afinidad de interacción particularmente alta. En algunas modalidades se proporcionan soluciones que se aplican exitosamente para diseñar, identificar y/o caracterizar secuencias que difieren de una secuencia de referencia y que muestran una o más características mejoradas (por ejemplo, afinidad mejorada) con respecto a sus interacciones proteína-proteína.

La presente invención proporciona sistemas para estratificar pacientes en base en su respuesta inmunológica a DV. La presente invención proporciona métodos para identificar aquellos pacientes que probablemente respondan bien a la inmunoterapia para DV. Por ejemplo, se puede utilizar el suero de un paciente para pruebas para la presencia de anticuerpos dirigidos contra un epítopo particular de DV (por ejemplo, epítopo al cual se unen específicamente agentes de anticuerpo proporcionados). Si el paciente no tiene los niveles de anticuerpos adecuados dirigidos a ese epítopo, uno o más agentes de anticuerpo de DV proporcionados se pueden administrar al paciente. La respuesta inmunitaria propia del paciente se puede suplementar con los agentes de anticuerpo DV proporcionados. En algunas modalidades la inmunoterapia ayuda a la depuración del virus de DV y/o resolución de infección por DV. En algunas modalidades, la inmunoterapia de acuerdo con la presente invención trata y/o evita infección crónica por DV.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos de diseño, identificación y/o caracterización de agentes de anticuerpos útiles. Por ejemplo, en algunas modalidades, estos métodos involucran determinar si un agente de anticuerpo de prueba compite por unión a antígeno con uno o más anticuerpos anti-DV de referencia y/u otros agentes de anticuerpo. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo de prueba se identifica como un agente de anticuerpo útil si compite de modo cruzado con uno o más anticuerpos DV de referencia.

En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que se combinan con una o más sustancias farmacéuticamente aceptables adicionales para proporcionar composiciones farmacéuticas. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para tratamiento, prevención, diagnóstico y/o caracterización de infección por DV.

En algunas modalidades las composiciones farmacéuticas comprenden agentes de anticuerpo que son o que comprenden, por ejemplo, anticuerpos humanos o fragmentos o variantes de los mismos que se unen a cualquier serotipo de DV y que neutralizan la infección por DV in vitro. En algunas modalidades las composiciones farmacéuticas comprenden agentes de anticuerpo que son o que comprenden, por ejemplo, anticuerpos humanos o fragmentos o variantes de los mismos que se unen a cualquier serotipo de DV y que neutralizan infección por DV in vivo. En algunas modalidades, la neutralización de DV por los agentes de anticuerpo proporcionados en sistemas in vitro es una correlación y/o predicción de neutralización de DV por agentes de anticuerpo proporcionados in vivo (por ejemplo, en humanos y/u otros mamíferos).

En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que pueden ser utilizados juntos con uno o más tratamientos adicionales para tratar, reducir la incidencia, frecuencia o gravedad de, y/o para retrasar el inicio de infección por DV o uno o más síntomas o características de los mismos. Por ejemplo, en algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que se utilizan junto con uno o más agentes antivirales, antiinflamatorios, sustancias para alivio del dolor, sustancias terapéuticas inmunomoduladoras y tratamientos combinados los cuales de manera preferible involucran otros objetivos de DV. Por ejemplo, en algunas modalidades, en ciertas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que se administran en combinación con uno o más interferones (por ejemplo, interferón a-2b, interferón-g, etc.), analgésicos (que preferiblemente contienen acetaminofeno y no aspirina y/o ibuprofeno), anticuerpos monoclonales anti-DV, anticuerpos policlonales anti-DV, inhibidores de ARN polimerasa, inhibidores de proteasa, análogos de nucleósido, inhibidores de helicasa, inmunomoduladores, compuestos antisentido, ARN de interferencia corta (ARNsi), ARN de horquilla corta (ARNsh), microARN (ARNmi), aptámeros de ARN, ribozimas y combinaciones de los mismos.

De esta manera, en algunas modalidades la invención proporciona de manera específica un agente de anticuerpo que se une a y neutraliza cada uno de los serotipos de virus de dengue DI, D2, D3 y D4. En algunas modalidades el agente de anticuerpo se une a un epítopo que es o que comprende una secuencia de aminoácidos dentro de: SEC ID NO: 17 (EDIII-DV1), SEC ID NO: 18 (EDIII-DV2), SEC ID NO: 19 (EDIII-DVE), SEC ID NO: 20 (EDIII-DV4) o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades el agente de anticuerpo se une a un epítopo en la región de la cadena A de glucoproteína de envoltura del virus de dengue.

En algunas modalidades el epítopo comprende uno o más residuos que corresponden a el que se encuentra en una posición que se selecciona del grupo que consiste de 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 323, 325, 327, 329, 360, 361, 362, 363, 364, 385, 387, 388, 389, 390, 391 y combinaciones de los mismos, de cualquiera de las SEC ID NOS: 17 a 20. En algunas modalidades el residuo correspondiente en la posición 305 se selecciona del grupo que consiste de: serina, lisina y treonina. En algunas modalidades, el residuo correspondiente en la posición 310 es lisina. En algunas modalidades el residuo correspondiente en la posición 311 es lisina. En algunas modalidades el residuo correspondiente en la posición 323 se selecciona del grupo que consiste de arginina, lisina y glutamina. En algunas modalidades, el residuo correspondiente en la posición 327 se selecciona del grupo que consiste de glicina y glutamato. En algunas modalidades, el residuo correspondiente en la posición 329 se selecciona del grupo que consiste de arginina, aspartato, glutamato y treonina.

En algunas modalidades, la invención proporciona un agente de anticuerpo cuya región variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera incluye por lo menos una región determinadora de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) que comparte por lo menos 80% de identidad de secuencia con una CDR de un anticuerpo de referencia 4E11 pero que difiere por sustitución de por lo menos un residuo aminoácido dentro de la CDR. En algunas modalidades, el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia del anticuerpo 4E11 en que es ya sea idéntica a la CDR de referencia o que incluye entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos dentro de la CDR de referencia. En algunas modalidades, la CDR de referencia se selecciona del grupo que consiste de uno encontrado entre los residuos 27 y 33 de la cadena pesada de 4E11 (SEC ID NO: 1), uno encontrado entre los residuos 53 y 58 de la cadena pesada 4E11 (SEC ID NO: 1), uno encontrado entre los residuos 100 y 106 de la cadena pesada de 4E11 (SEC ID NO: 1), uno encontrado entre los residuos 24 y 38 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2), uno encontrado entre los residuos 54 y 60 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2), uno encontrado entre los residuos 93 y 101 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2); y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia que se establece en lo siguiente y que es ya sea idéntica a la CDR de referencia o que incluye entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos dentro de las CDR de referencia, las CDR de referencia: GFNIKDT (SEC ID NO: 7), DPANGD (SEC ID NO: 8), GWEGFAY (SEC ID NO: 9), RASENVDKYGNSFMH (SEC ID NO: 14), RASNLES (SEC ID NO: 15) y/o QRSNEVPWT (SEC ID NO: 16).

En algunas modalidades, la referencia CDR es una CDR de cadena pesada. En algunas modalidades, la CDR de referencia es una CDR de cadena ligera. En algunas modalidades, el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR de cadena pesada que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia de cadena pesada y que también incluye por lo menos una CDR de cadena ligera que es idéntica a una CDR de referencia de cadena ligera. En algunas modalidades, cada una de las CDR en el agente de anticuerpo es sustancialmente idéntica a una de las CDR de referencia.

En algunas modalidades, la invención proporciona un agente de anticuerpo cuya región variable de cadena pesada incluye por lo menos una región determinadora de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) que comparte por lo menos 95% de identidad de secuencia con una CDR del anticuerpo de referencia 4E11 pero que difiere por sustitución de por lo menos un residuo aminoácido dentro de la CDR. En algunas modalidades, el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia del anticuerpo 4E11 y que es idéntica a la CDR de referencia o que incluye entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos dentro de la CDR de referencia. En algunas modalidades, la CDR de referencia se selecciona del grupo que consiste de una encontrada entre los residuos 27 y 33 de la cadena pesada de 4E11 (SEC ID NO: 1), una encontrada entre los residuos 53 y 58 de la cadena pesada 4E11 (SEC ID NO: 1), una encontrada entre los residuos 100 y 106 de la cadena pesada de 4E11 (SEC ID NO: 1), una encontrada entre los residuos 24 y 38 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2), una encontrada entre los residuos 54 y 60 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2), una encontrada entre los residuos 93 y 101 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2); y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia que se establece en lo siguiente, y que es ya sea idéntica a la CDR de referencia o que incluye entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos dentro de las CDR de referencia, las CDR de referencia: GFNIKDT (SEC ID NO: 7), DPANGD (SEC ID NO: 8), GWEGFAY (SEC ID NO: 9), RASENVDKYGNSFMH (SEC ID NO: 14), RASNLES (SEC ID NO: 15) y/o QRSNEVPWT (SEC ID NO: 16). En algunas modalidades, la CDR de referencia es una CDR de cadena pesada. En algunas modalidades, la CDR de referencia es una CDR de cadena ligera. En algunas modalidades, el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR de cadena pesada que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia de cadena pesada y también incluye por lo menos una CDR de cadena ligera que es idéntica a una CDR de referencia de cadena ligera. En algunas modalidades, cada una de las CDR en el agente de anticuerpo es sustancialmente idéntica a una de las CDR de referencia. En algunas modalidades, la CDR de región variable de cadena pesada tiene sustitución del residuo aminoácido en la posición 55. En algunas modalidades, el aminoácido de sustitución en la posición 55 se selecciona del grupo que consiste de glutamato y aspartato. En algunas modalidades, la CDR de la región variable de cadena ligera tiene sustitución del residuo aminoácido en las posiciones que se seleccionan del grupo que consiste de 31, 57, 59, 60 y combinaciones de las mismas.

En algunas modalidades, el residuo de aminoácido sustituto en la posición 31 es lisina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 57 se selecciona del grupo que consiste de glutamato y serina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 59 se selecciona del grupo que consiste de glutamina y asparagina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 60 se selecciona del grupo que consiste de triptofano, tirosina y arginina.

En algunas modalidades, la invención proporciona un agente de anticuerpo el cual es una IgG. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: un anticuerpo de ratón, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo purificado, un anticuerpo aislado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo policlonal y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, se proporciona un agente de anticuerpo en donde el fragmento que une antígeno se selecciona del grupo que consiste de: un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fd1, un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento scFv, una región CDR aislada, un diacuerpo dsFv, un anticuerpo de cadena sencilla y combinaciones de los mismos.

En algunas modalidades, la invención proporciona una línea de células que expresan un agente de anticuerpo específico para el virus del dengue, en donde el agente de anticuerpo se une y neutraliza cada uno de los virus del dengue serotipos DI, D2, D3 y D4. En algunas modalidades, la invención proporciona una composición farmacéutica que incluye uno o más agentes de anticuerpo en donde el agente de anticuerpo se une a y neutraliza cada uno de los virus del dengue serotipos DI, D2, D3 y D4 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades una composición farmacéutica incluye además por lo menos un agente antiviral adicional.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos para tratar a un sujeto en necesidad del mismo, que incluye la etapa de administrar un agente de anticuerpo en donde el agente de anticuerpo se une a, y neutraliza cada uno de los virus del dengue serotipos DI, D2, D3 y D4. En algunas modalidades, la invención proporciona kits que incluyen por lo menos un agente de anticuerpo en donde el agente de anticuerpo se une a, y neutraliza cada uno de los virus del dengue serotipos DI, D2, D3 y D4, una jeringa, aguja o aplicador para administración de por lo menos un anticuerpo o fragmento a un sujeto e instrucciones para uso.

En algunas modalidades, la invención proporciona métodos de manufactura de composiciones farmacéuticas, el método incluye las etapas de proporcionar un agente de anticuerpo en donde el agente de anticuerpo se une a, y neutraliza cada uno de los virus del dengue serotipos DI, D2, D3 y D4, y formula el agente de anticuerpo con por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable de manera que se genere una composición farmacéutica. En algunas modalidades, la composición farmacéutica es una composición líquida. En algunas modalidades, la composición farmacéutica se formula para administración parenteral. En algunas modalidades, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa. En algunas modalidades, la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa a un niño.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las figuras son únicamente con propósitos de ilustración y no como limitación.

La figura 1 muestra el efecto del tamaño de intervalo sobre la precisión de predicción. El tamaño de intervalo representa el número de resultados positivos predichos. La precisión de predicción se determina por el número de estructuras de caso de prueba (total, 37) predichos correctamente. Cuando el tamaño del intervalo es uno, (es decir, cuando una de 101 estructuras se predice como positiva) casi la mitad de las estructuras de rayos X (48% ~ 18 de 37) se identifican correctamente, la probabilidad binomial de la cual es 1.46E-26 (n = 37, p = 0.009, número de exito = 18) si las estructuras se seleccionarán aleatoriamente. La precisión de predicción del método de MLR se considera que es una función que se incrementa logarítmicamente del tamaño de intervalo con una precisión que alcanza 85% con un tamaño de intervalo 5 y 100% con un tamaño de intervalo 10. Por el contrario, ZRANK no predice 100% de las estructuras incluso cuando el tamaño del intervalo es 20.

La figura 2A a la figura 2C ilustra resultados de atraco de una investigación local. Para esta determinación las estructuras similares a las nativas se definen que tienen menos de 3 angstroms (Á) de RMSD desde el ligando en la estructura de rayos X, calculada para átomos de ligando que están dentro de 7 Á del receptor fijo. Las estructuras que presentan RMSD > 3 Á se denomina como estructuras no nativas, (fig. 2A) Cada punto en la gráfica de superficie representa un señuelo de atraco. El eje de las abscisas muestra la calificación ZRANK; el eje de las ordenadas representa RMSD (en Á) respecto a la estructura de rayos X; el eje Z representa probabilidades de predicción basadas en MLR. Las calificaciones ZRANK de estructuras similares a nativas varía entre -60 a -30 Kcal/mol. (fig. 2B) Correlación entre calificaciones ZRANK (eje de las abscisas) y RMSD (eje de las ordenadas). Los puntos de datos dentro de los círculos punteados son cercanos a la estructura nativa de rayos X. (fig. 2C) Correlación entre la probabilidad basada en MLR y RMSD. Existe una correlación significativa entre las probabilidades de predicción versus RMSD pero no existe esta correlación entre ZRANK y RMSD.

La figura 3 demuestra la afinidad y actividad in vitro del anticuerpo 4E11.

La figura 4 muestra un diagrama de flujo del enfoque de diseño de anticuerpo.

La figura 5 demuestra la superposición de 5 modelos de atraco principales sobre EDIII fijo. El dominio EDIII está representado como esferas; 4E11, mostrado como la superficie en cada modelo.

Laa figuraa 6A y 6B ilustran determinantes de secuencia y estructurales de unión pobre de DV4. (Figura 6A) Alineación de secuencia de la región de dominio EDIII de cuatro serotipos. Los residuos de unión mAb putativos están sombreados en gris. Los residuos en 307, 329, 361, 364, 385, 388 y 390 diferencian a DV4 del resto de las secuencias; estas están numeradas. Los contactos de residuo realizados por cinco mutaciones mAb están en rectángulos. De manera notable, 5 de los 6 contactos nuevos se forman contra residuos de epítopo conservados de las cadenas A y B. Esto explica porque las mutaciones nuevas no deterioran la unión a DVl a 3. (Figura 6B) Modelo estructural de la interacción 4E11/EDIII. Las posiciones de secuencia que discriminan DV4 de otras cepas están marcadas y las cadenas laterales de aminoácidos en la misma se representan como barras.

La figura 7 demuestra que las mutaciones que mejoran la afinidad se localizan en la periferia de la interfase 4E11:EDIII-DV4. Las posiciones positivas identificadas en el cribado de unión están resaltados y se muestran en un modelo estructural de interacción 4E11:EDIII-DV4. Todas las mutaciones positivas se localizan en la periferia de la interfase de unión. Los dos paneles representan vistas diferentes del mismo modelo. Las proteínas EDIII (arriba), VH (derecha) y VL (izquierda) están representadas respectivamente en cada panel.

Las figuras 8A - 8H muestra sensogra as de resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) de 4E11 WT y 4E5A con antígenos EDIII de DV1 a 4.

La figura 9 ilustra la actividad neutralizante in vitro de anticuerpos determinada por la prueba de neutralización de reducción de foco (FRNT, por sus siglas en inglés). Los análisis de neutralización se realizaron con DV1 a 4 y anticuerpos 4E11 WT, m4Ell WT, 4E5A y 4G2. Diluciones seriadas de anticuerpos se mezclaron con cantidades iguales de virus y se agregaron a monocapas de células Vero con una capa superior viscosa. Después de 4 a 6 días, las células se fijaron y los focos se inmunotiñeron y se contaron. Los puntos de datos representan promedios de duplicados con barras de error que representan desviación estándar. Un modelo logístico de cuatro parámetros estándar se ajustó a los datos utilizando regresión de mínimos cuadrados. 4E5A muestra actividad neutralizante similar a 4E11 y m4Ell para DV1 a 3 y un incremento sustancial en la actividad neutralizante para DV4.4G2 , un anticuerpo específico para bucle de fusión de flavivirus representativo demuestra actividad neutralizante menor para DV1 a 3 y solo una actividad ligeramente mayor para DV4 en relación a 4E5A.

La figura 10 muestra el modelo de exposición DV2 profiláctico in vivo. Los datos muestran virus en el suero de ratones AF129 en el día 3 después de la exposición a virus.

Los ratones tratados con AB1 o placebo 1 día antes de la exposición a virus. El ARN extraído del suero de los ratones se amplificó por QRT-PCR y un título aproximado LogioCCIDso se extrapoló en base en una curva a partir de un ARN control tomado de una muestra de un título conocido. La línea discontinua representa el límite de detección aproximado.

La figura 11 demuestra las frecuencias de aminoácidos en paratopo y epítopo. Datos generados a partir de 77 complejos de antígeno-anticuerpo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Con el fin de que la presente invención se entienda con mayor facilidad, ciertos terminos se definen primero en lo siguiente ; aquellos habitualmente expertos en el ámbito apreciarán y entenderán que el uso y alcance de estos términos como se define en lo siguiente y/o de otra manera utilizados en la presente .

Adulto : Como se utiliza en la presente, el término "adulto" se refiere a un humano de 18 años de edad o mayor. Los pesos corporales entre adultos pueden variar ampliamente con un intervalo típico entre 41 kg (90 libras) y 113 kg (250 libras) .

Afinidad: Como se conoce en el ámbito, "afinidad" es una medida de lo ajustado de un ligando particular (por ejemplo, un anticuerpo) que se une a su asociado (por ejemplo, un epítopo) . Las afinidades se pueden medir de diferentes maneras .

Aminoácido: Como se utiliza en la presente, el término "aminoácido" en su sentido más amplio se refiere a un compuesto y/o sustancia que se puede incorporar en una cadena polipeptídica. En algunas modalidades un aminoácido tiene la estructura general H2N-C(H)(R)-C00H. En algunas modalidades, un aminoácido es un aminoácido como se encuentra de modo natural. En algunas modalidades, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas modalidades un aminoácido es un d-aminoácido; en algunas modalidades un aminoácido es un 1-aminoácido. Un "aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte 1-aminoácidos estándar que se encuentran habitualmente en péptidos como se encuentran en la naturaleza. Un "aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido diferente de los aminoácidos estándar, sin importar si se prepara de modo sintético o si se obtiene de una fuente natural. Como se utiliza en la presente, el término "aminoácido sintético" abarca aminoácidos modificados químicamente que incluyen pero que no se limitan a sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, que incluyen aminoácidos de la parte carboxi- y/o amino-terminal en péptidos se pueden modificar por metilación, amidación, acetilación, grupos protectores y/o sustitución con otros grupos químicos que pueden cambiar la vida media circulante del péptido sin afectar de manera adversa su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. Los aminoácidos pueden comprender una o modificaciones post-traduccionales tales como asociación con una o más entidades químicas (por ejemplo, grupos metilo, grupos acetato, grupos acetilo, grupos fosfato, porciones formilo, grupos isoprenoide, grupos sulfato, porciones polietilenglicol, porciones lipídicas, porciones de carbohidratos, porciones de biotina, etc.). El término "aminoácido" se utiliza de modo intercambiable con "residuo aminoácido" y puede hacer referencia a un aminoácido libre y/o un residuo aminoácido de un péptido. Será evidente del contexto en el cual se utiliza el término si se refiere a un aminoácido libre o un residuo de un péptido.

Animal: Como se utiliza en la presente, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas modalidades "animal" se refiere a humanos, de cualquier sexo y de cualquier etapa de desarrollo.En algunas modalidades, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas modalidades, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, un borrego, ganado, un primate y/o un cerdo). En algunas modalidades, el animal incluye, pero no se limita a mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En ciertas modalidades, el animal es susceptible a infección por DV. En algunas modalidades un animal puede ser un animal transgénico, un animal manipulado genéticamente y/o un clon.

Agente de anticuerpo: Como se utiliza en la presente, el término "agente de anticuerpo" se refiere a un agente que se une específicamente a un antígeno particular. En algunas modalidades, el término abarca cualquier polipéptido con elementos estructurales de inmunoglobulina suficientes para conferir unión específica. Los agentes de anticuerpo adecuados incluyen, pero no se limitan a anticuerpos humanos, anticuerpos primatizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecí fíeos, anticuerpos humanizados, anticuerpos conjugados (es decir, anticuerpos conjugados o fusionados a otras proteínas, radiomarcas, citotoxinas), sustancias inmunofarmacéuticas modulares pequeñas (las "SMIPMR", por sus siglas en inglés), anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos cameloides y fragmentos de anticuerpos. Como se utiliza en la presente, el término "agente de anticuerpo" también incluye anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, anticuerpos de dominio único de tibhurón (por ejemplo, IgNAR o fragmentos de los mismos)), anticuerpos multiespecíf icos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpo en la medida en que presenten la actividad biológica deseada. En algunas modalidades, el término abarca péptidos recortados. En algunas modalidades, el término abarca uno o más peptidomiméticos de unión similares a anticuerpo. En algunas modalidades, el término abarca una o más proteínas de andamiaje de unión similares a anticuerpo. En algunas modalidades, el término abarca monocuerpos adnectinas. En muchas modalidades, un agente de anticuerpo es o comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye uno o más elementos estructurales reconocidos por los expertos en el ámbito como una región determinadora de complementariedad (CDR); en algunas modalidades, un agente de anticuerpo es o comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye por lo menos una CDR (por ejemplo, por lo menos una CDR de cadena pesada y/o por lo menos una CDR de cadena ligera) que es sustancialmente idéntica a una encontrada en un anticuerpo de referencia. En algunas modalidades, una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que es idéntica en secuencia o contiene entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos en comparación con la CDR de referencia. En algunas modalidades, una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que muestra por lo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la CDR de referencia. En algunas modalidades, una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que muestra por lo menos 96%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia con la CDR de referencia. En algunas modalidades, una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que por lo menos un aminoácido dentro de la CDR incluida está suprimido, agregado o sustituido en comparación con la CDR de referencia pero la CDR incluida tiene una secuencia de aminoácidos que de otra manera es idéntica con la de la CDR de referencia. En algunas modalidades, una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que 1 a 5 aminoácidos dentro de la CDR incluida se suprimen, agregan o sustituyen en comparación con la CDR de referencia pero la CDR incluida tiene una secuencia de aminoácidos que de otra manera es idéntica a la CDR de referencia. En algunas modalidades, una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que por lo menos un aminoácido dentro de la CDR incluida está sustituido en comparación con la CDR de referencia pero la CDR incluida tiene una secuencia de aminoácidos que de otra manera es idéntica con la de la CDR de referencia. En algunas modalidades, una CDR incluida es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia en que l a 5 aminoácidos dentro de la CDR incluida han sido suprimidos, agregados o sustituidos en comparación con la CDR de referencia pero la CDR incluida tiene una secuencia de aminoácidos que de otra manera es idéntica a la CDR de referencia. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo es o comprende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos incluye elementos estructurales reconocidos por aquellos expertos en el ámbito como un dominio variable de inmunoglobulina. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo es una proteína polipeptídica que tiene un dominio de unión el cual es homólogo o en gran medida homólogo a un dominio que une inmunoglobulina.

Anticuerpo: Como se conoce en el ámbito, un "anticuerpo" es una inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno particular. El término abarca inmunoglobulinas que se producen de modo natural en la medida en que son generadas por un organismo que reacciona a un antígeno y también aquellas que se producen o manipulan sintéticamente. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede ser un miembro de cualquier clase de inmunoglobulina que incluye cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA e IgD. Una unidad estructural de inmunoglobulina típica (anticuerpo), como se entiende en el ámbito, se conoce que está comprendida por un tetrámero. Cada tetrámero está constituido de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" de (aproximadamente 25 kD) y una cadena "pesada" (de aproximadamente 50 a 70 kD). La parte N terminal de cada cadena define una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principalmente del reconocimiento de antígeno. Los términos "cadena ligera variable" (VL, por sus siglas en inglés) y "cadena pesada variable" (VH, por sus siglas en inglés) se refieren a estas cadenas ligera y pesada, respectivamente. Cada región variable se subdivide adicionalmente en regiones hipervariable (HV, por sus siglas en inglés) y de infraestructura (FR). Las regiones hipervariables comprenden tres áreas de secuencia de hipervariabilidad denominadas regiones determinadoras de complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) separadas por cuatro regiones de infraestructura (FR1, FR2, FR3 y FR4) las cuales forman una estructura de lámina beta y sirven como un andamiaje para retener las regiones HV en posición. La parte C-terminal de cada cadena pesada y ligera define una región constante que consiste de un dominio para la cadena ligera (CL) y tres para la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). En algunas modalidades, el término "longitud completa" se utiliza con referencia a un anticuerpo para indicar que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, opcionalmente asociadas por enlaces disulfuro como se presentan con los anticuerpos producidos de manera natural. En algunas modalidades un anticuerpo es producido por una célula. En algunas modalidades un anticuerpo es producido por síntesis química. En algunas modalidades, un anticuerpo se deriva de un mamífero. En algunas modalidades, un anticuerpo se deriva de un animal tal como, pero sin limitarse a ratón, rata, caballo, cerdo o chivo. En algunas modalidades, se produce un anticuerpo utilizando un sistema de cultivo de células recombinantes. En algunas modalidades, un anticuerpo puede ser un anticuerpo purificado (por ejemplo, por cromatografía de afinidad inmunitaria). En algunas modalidades un anticuerpo puede ser un anticuerpo humano. En algunas modalidades un anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado (anticuerpo de especie no humana cuyas secuencias proteínicas han sido modificadas para incrementar su similitud con variantes de anticuerpo producidas naturalmente en humanos) . En algunas modalidades un anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico (anticuerpo elaborado al combinar material genético de una fuente no humana, por ejemplo, ratón, rata, caballo o cerdo, con material genético de humanos).

Fragmento de anticuerpo: Como se utiliza en la presente, un "fragmento de anticuerpo" incluye una porción de un anticuerpo intacto tal como, por ejemplo, la región que une antígeno o variable de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; triacuerpos; tetracuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados, fragmentos "Fv" que consisten de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas polipeptídicas de cadena única recombinante en las cuales las regiones variables de cadena ligera y pesada están conectadas por un enlazante peptídico ("proteínas scFv") y unidades de reconocimiento mínimas que consisten de los residuos aminoácidos que imitan la región hipervariable. En muchas modalidades, un fragmento de anticuerpo contiene suficiente secuencia del anticuerpo original del cual es un fragmento que se une al mismo antígeno al igual que el anticuerpo original; en algunas modalidades, un fragmento se une al antígeno con una afinidad comparable a la del anticuerpo original y/o compite con el anticuerpo original por unión al antígeno. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab')2, fragmento scFv, fragmento Fv, diacuerpo dsFv, fragmento dAb, fragmento Fd', fragmento Fd, y una región de la región determinadora de complementariedad (CDR) aislada. Un fragmento que une antígeno de un anticuerpo se puede producir por cualquier medio. Por ejemplo, un fragmento que une antígeno de un anticuerpo puede producirse enzimática o químicamente por fragmentación de un anticuerpo intacto y/o puede producirse de modo recombinante a partir de un gen que codifica para la secuencia de anticuerpo parcial. De manera alternativa o adicional, un fragmento de un anticuerpo que une antígeno puede producirse de manera sintética total o parcialmente.

Un fragmento de un anticuerpo que une antígeno opcionalmente puede comprender un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. De manera alternativa o adicional, un fragmento de un anticuerpo que une antígeno puede comprender múltiples cadenas las cuales están unidas juntas, por ejemplo, por enlaces disulfuro. Un fragmento de un anticuerpo que une antígeno opcionalmente puede comprender un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional habitualmente comprende de por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos y de manera más típica comprende por lo menos aproximadamente 200 aminoácidos.

Agente antiviral: Como se utiliza en la presente, el término "agente antiviral" se refiere a una clase de medicamento utilizada específicamente para tratar infecciones virales al inhibir, desactivar o destruir partículas de virus. En general, un agente antiviral puede ser o comprender un compuesto de cualquier clase química (por ejemplo, una molécula pequeña, metal, ácido nucleico, polipéptido, lípido y/o carbohidrato). En algunas modalidades, un agente antiviral es o comprende un anticuerpo o un imitador de anticuerpo. En algunas modalidades, un agente antiviral es o comprende un agente de ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido, un ARNsi, un ARNsh, etc.), o una imitación de los mismos. En algunas modalidades, un agente antiviral es o comprende una molécula pequeña. En algunas modalidades, un agente antiviral es o comprende un compuesto como se encuentra de modo natural (por ejemplo, una molécula pequeña). En algunas modalidades, un agente antiviral tiene una estructura química que es generada y/o modificada por la mano humana.

Aproximadamente: Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor", como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar al valor de referencia establecido. En ciertas modalidades, el término "aproximadamente" o "alrededor" se refiere a una gama de valores que se encuentran dentro de 25? 20Í 19? 185 I?: 16! 15' 14' 13! 12! 11! 10! 9%, 88%%,, 77%%,, 66%%,, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) el valor de referencia establecido a menos que se establezca en otro sentido o sea evidente de otra manera a partir del contexto (excepto en donde este número excede de 100% de un valor posible).

Bebé: Como se utiliza en la presente, el término "bebé" se refiere a un humano de menos de dos años de edad. Los pesos corporales típicos para un bebé varían de 1.4 kg (3 libras) hasta 9.1 kg (20 libras).

Biológicamente activo: Como se utiliza en la presente, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier sustancia que tiene actividad en un sistema biológico (por ejemplo, cultivo celular, organismo, etc.). Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo tiene un efecto biológico en ese organismo se considera que es biológicamente activa. En modalidades particulares, en donde una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparte por lo menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido típicamente se denomina como una porción "biológicamente activa".

Porción caracterizante: Como se utiliza en la presente, el término "porción caracterizante" se utiliza, en su sentido más amplio, para hacer referencia a una porción de una sustancia cuya presencia (o ausencia) se correlaciona con la presencia (o ausencia) de un rasgo, atributo o actividad particular de la sustancia. En algunas modalidades, una porción característica de una sustancia es una porción que se encuentra en la sustancia y en sustancias relacionadas que comparten el rasgo, atributo o actividad particular pero no en aquellas que no comparten el rasgo, atributo o actividad particular. En ciertas modalidades, una porción característica comparte por lo menos una característica funcional con la sustancia intacta. Por ejemplo, en algunas modalidades, una "porción característica" de una proteína o polipéptido es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos o una colección de tramos continuos de aminoácidos que juntos son característicos de una proteína o polipéptido. En algunas modalidades, cada uno de los tramos continuos generalmente contiene por lo menos 2, 5, 10, 15, 20, 50 o más aminoácidos. En general, una porción característica de una sustancia (por ejemplo, de una proteína, anticuerpo, etc.) es uno que, además de la identidad de secuencia y/o estructural específica de lo anterior, comparte por lo menos una característica funcional con la sustancia intacta relevante. En algunas modalidades, una porción característica puede ser biológicamente activa.

Niño: Como se utiliza en la presente, el término "niño" se refiere a un humano entre dos y 18 años de edad. El peso corporal puede variar ampliamente entre estas edades y los niños específicos, con un intervalo típico entre 14 kg (30 libras) y 68 kg (150 libras).

Tratamiento combinado: El término "tratamiento combinado", como se utiliza en la presente, se refiere a aquellas situaciones en las cuales dos o más agentes farmacéuticos diferentes son administrados en regímenes que se superponen de manera que el sujeto es expuesto simultáneamente a ambos agentes.

Comparable: El término "comparable" se utiliza en la presente para describir dos (o más) conjuntos de condiciones o circunstancias que son suficientemente similares entre sí para permitir comparación de los resultados obtenidos o fenómenos observados. En algunas modalidades, los conjuntos comparables de condiciones o circunstancias se caracterizan por una pluralidad de rasgos sustancialmente idénticos y uno o un número pequeño de rasgos que varían. Aquellos habitualmente expertos en el ámbito apreciarán que los conjuntos de condiciones son comparables entre si cuando se caracterizan por un número suficiente y tipo de rasgos sustancialmente idénticos para garantizar una conclusión razonable que diferencia en resultados obtenidos o fenómenos observados bajo los conjuntos de condiciones o circunstancias diferentes que son causadas por o indicativas de la variación en los rasgos que varían.

Correspondiente a: Como se utiliza en la presente, el término "correspondiente a" con frecuencia se utiliza para designar la posición/identidad de un residuo aminoácido en un polipéptido de interés. Aquellos con habilidad habitual apreciarán que, con propósitos de sencillez, los residuos en un polipéptido con frecuencia se denominan utilizando un sistema de numeración canónico basado en un polipéptido relacionado de referencia de manera que un aminoácido "correspondiente a" un residuo en la posición 190, por ejemplo, en realidad no necesita ser el aminoácido 190-ésimo en una cadena de aminoácidos particular sino más bien corresponde al residuo que se encuentra en 190 en el polipéptido de referencia; aquellos habitualmente expertos en el ámbito apreciarán fácilmente como identificar aminoácidos "correspondientes".

Forma de dosificación: Como se utiliza en la presente, los términos "forma de dosificación" y "forma de dosificación unitaria" se refiere a una unidad físicamente separada de una proteína terapéutica (por ejemplo, anticuerpo) para el paciente que va a ser tratado. Cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado. No obstante, se entenderá que la dosificación total de la composición se decidirá por el médico que atiende dentro del ámbito del buen juicio médico.

Régimen de dosificación: Un "régimen de dosificación" (o "régimen terapéutico") como se utiliza el término en la presente, es un conjunto de dosis unitarias (típicamente, más de una) que son administradas individualmente a un sujeto, típicamente separadas por períodos de tiempo. En algunas modalidades, un agente terapéutico dado tiene un régimen de dosificación recomendado el cual puede involucrar una o más dosis. En algunas modalidades, un Régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis, cada una de las cuales están separadas entre si por un período de tiempo de la misma longitud; en algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una pluralidad de dosis y por lo menos dos períodos de tiempos diferentes que separan a las dosis individuales. En algunas modalidades, todas las dosis dentro de un régimen de dosificación son de la misma cantidad de dosis unitaria. En algunas modalidades, dosis diferentes dentro de un régimen de dosificación son de cantidades diferentes. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguida por una o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis diferente de la primera cantidad de dosis. En algunas modalidades, un régimen de dosificación comprende una primera dosis en una primera cantidad de dosis, seguida por una o más dosis adicionales en una segunda cantidad de dosis igual a la primera cantidad de dosis.

Serotipo de DV: Como se utiliza en la presente, el término "serotipo" se refiere de manera general a distintas variaciones dentro de DV. Los cuatro serotipos de DV diferentes (DV1 a 4) que comprenden el grupo genético de DV difieren entre sí en aproximadamente 25% a 40% del nivel de aminoácidos. Los cuatro serotipos de DV varían en patogenicidades pero todos son prevalentes en áreas de Asia, África, América Central y del Sur. La infección con uno de estos serotipos proporciona inmunidad que dura toda la vida de manera que el serotipo, no obstante, también incrementa el riesgo de enfermedad grave ante una infección secundaria a partir de un serotipo de DV heterólogo.

Epítopo: Como se utiliza en la presente, el término "epítopo" tiene el significado como se entiende en el ámbito.

Se apreciará por aquellos habitualmente expertos en el ámbito que un epítopo también se conoce como un determinante antigénico, es una región molecular de un antígeno que es reconocida por el sistema inmunitario, específicamente por anticuerpos, linfocitos B o linfocitos T. Se apreciará adicionalmente que los epítopos pueden estar constituidos de azúcares, lípidos o aminoácidos. Los epítopos o antígenos proteínicos se dividen en dos categorías, epítopos conformacionales y epítopos lineales, en base en su estructura e interacción con un paratopo (parte de un anticuerpo que reconoce el epítopo). Un epítopo conformacional está compuesto de secciones discontinuas de la secuencia de aminoácidos del antígeno y estos epítopos interactúan con el paratopo en base en los rasgos de superficie tridimensional y la forma o estructura terciaria del antígeno. Los epítopos lineales interactúan con el paratopo en base en su estructura primaria y un epítopo lineal se forma por una secuencia continua de aminoácidos a partir del antígeno.

Expresión: Como se utiliza en la presente, la "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) producción de una plantilla de ARN a partir de una secuencia de ADN (por ejemplo, mediante transcripción); (2) procesamiento de un transcrito de ARN (por ejemplo, mediante empalme, edición, formación de remate 5' y/o formación de extremo 3'); (3) traducción de un ARN en un polipéptido o proteína; y/o (4) modificación post-traduccional de un polipéptido o proteína.

Funcional: Como se utiliza en la presente, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma en la cual muestra una propiedad y/o actividad mediante la cual es caracterizada.

Gen: Como se utiliza en la presente, el término "gen" tiene el significado como se entiende en el ámbito. Se apreciará por aquellos habitualmente expertos en el ámbito que el término "gen" puede incluir secuencias reguladoras de gen (por ejemplo, promotores, mejoradores, etc.), y/o secuencias de intrón. Se apreciará adicionalmente que las definiciones de gen incluyen referencias a ácidos nucleicos que no codifican para proteínas sino que más bien codifican para moléculas de ARN funcional tal como ARNt, agentes inductores de ARNi, etc. Con propósitos de claridad hacemos notar que, como se utiliza en la presente solicitud, el término "gen" generalmente se refiere a una porción de ácido nucleico que codifica para una proteína; el término opcionalmente abarca secuencias reguladoras, como será evidente a partir del contexto para aquellos habitualmente expertos en el ámbito. Esta definición no se pretende que excluya la aplicación del término "gen" a unidades de expresión codificantes no proteínicas sino más bien para aclarar que, en la mayor parte de los casos, el término como se utiliza en este documento se refiere a un ácido nucleico que codifica para una proteína.

Producto de gen o producto de expresión: Como se utiliza en la presente, el término "producto de gen" o "producto de expresión" se refiere de manera general a un ARN transcrito del gen (previo y/o posterior al procesamiento) o un polipéptido (previo y/o posterior a una modificación) codificado por un ARN transcrito a partir del gen.

Homología: Como se utiliza en la presente, el término "homología" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptídicas. En algunas modalidades, la moléculas poliméricas se considera que son "homologas" entre si sus secuencias son por lo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idénticas. En algunas modalidades, las moléculas poliméricas se considera que son "homologas " entre sí, si sus secuencias son por lo menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% similares.

Identidad: Como se utiliza en la presente, el término "identidad" se refiere a la relación general entre moléculas poliméricas, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de ADN y/o moléculas de ARN) y/o entre moléculas polipeptidicas. El cálculo del por ciento de identidad de dos secuencias de ácido nucleico, por ejemplo, se puede realizar al alinear las dos secuencias para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de ácido nucleico para alineación óptima y las secuencias que no son idénticas no se consideran para propósitos de comparación). En ciertas modalidades, la longitud de una secuencia alineada para propósitos de comparación es por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o sustancialmente 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Los nucleótidos en las porciones nucleotídicas correspondientes después se comparan. Cuando una posición en una primera secuencia es ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en consideración el número de espacios y la longitud de cada espacio, los cuales necesitan ser introducidos para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el por ciento de identidad entre dos secuencias nucleotídicas se puede determinar utilizando el algoritmo de Mcyers y Miller (CABIOS, 1989, 4: 11-17), el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) utilizando una tabla de residuo de ponderación PAM120, un castigo por longitud de espacio de 12 y un castigo por espacio de 4. El por ciento de identidad entre dos secuencias nucleotídicas, de manera alternativa, se puede determinar utilizando el programa GAP en el paquete de programa o software GCG utilizando una matriz NWSgapdna.CMP.

Aislado: Como se utiliza en la presente, el término "aislado" se refiere a una sustancia y/o entidad que ha sido: (1) separada de por lo menos uno de los componentes con los cuales estaba asociada cuando se produjo inicialmente (ya sea en un ámbito en la naturaleza o en uno experimental), y/o (2) ha sido producida, preparada y/o fabricada por la mano del hombre. Las sustancias y/o entidades aisladas se pueden separar desde aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de aproximadamente 99% de los otros componentes con los cuales inicialmente se asocian. En algunas modalidades, los agentes aislados son aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más de aproximadamente 99% puros. Como se utiliza en la presente, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes. Como se utiliza en la presente, el cálculo del por ciento de pureza de sustancias y/o entidades aisladas no debe incluir excipientes (por ejemplo, amortiguador, disolvente, agua, etc.).

Mimotopo: Como se utiliza en la presente, el término "mimotopo" se refiere a una macromolécula la cual imita la estructura de un epítopo. En algunas modalidades, un mimotopo induce una respuesta de anticuerpo idéntica o similar a la inducida por su epítopo correspondiente. En algunas modalidades, un anticuerpo que reconoce un epítopo también reconoce un mimotopo el cual imita a ese epítopo. En algunas modalidades, un mimotopo es un péptido. En algunas modalidades, un mimotopo es una molécula pequeña, carbohidrato, lípido o ácido nucleico. En algunas modalidades, los mimotopos son mimotopos peptídicos o no peptídicos de epítopos de DV conservados. En algunas modalidades, mediante imitación de la estructura de un epítopo viral definido, un mimotopo interfiere con la capacidad de las partículas de virus de DV para unirse a sus asociados de unión naturales (por ejemplo, receptor de objetivo de DV, Rab5, GRP78), por ejemplo, por unión al asociado de unión natural mismo.

Mutante: Como se utiliza en la presente, el término "mutante" se refiere a una entidad que muestra identidad estructural significativa con una entidad de referencia pero que difiere estructuralmente de la entidad de referencia en la presencia o nivel de una o más porciones químicas en comparación con la entidad de referencia. En muchas modalidades, un mutante también difiere funcionalmente de su entidad de referencia. En general, si una entidad particular se considera adecuadamente que es un "mutante" de una entidad de referencia que se basa en su grado de identidad estructural con la entidad de referencia. Como se apreciará por aquellos expertos en el ámbito, cualquier entidad de referencia biológica o química tiene ciertos elementos estructurales característicos. Un mutante, por definición, es una entidad química distinta que comparte uno o más de los elementos estructurales característicos. Para proporcionar algunos ejemplos, una molécula pequeña puede tener un elemento estructural de núcleo característico (por ejemplo, un núcleo de macrociclo) y/o una o más porciones pendientes características de manera que un mutante de la molécula pequeña es uno que comparte el elemento estructural del núcleo y las porciones pendientes características pero que difiere en otras porciones pendientes y/o en los tipos de enlaces presentes (por ejemplo, sencillos versus doble, E versus Z, etc.), dentro del núcleo, un polipéptido puede tener un elemento de secuencia característico comprendido de una pluralidad de aminoácidos que tienen posiciones designadas unos en relación a otros en el espacio lineal o tridimensional y/o que contribuyen a una función biológica particular, un ácido nucleico puede tener un elemento de secuencia característico comprendido de una pluralidad de residuos nucleotídicos que tienen posiciones designadas unos en relación a otros en un espacio lineal o tridimensional. Por ejemplo, un polipéptido mutante puede diferir de un polipéptido de referencia como un resultado de una o más diferencias en una secuencia de aminoácidos y/o una o más diferencias en porciones químicas (por ejemplo, carbohidratos, lípidos, etc.), unidos covalentemente a la estructura principal polipeptídica. En algunas modalidades, un péptido mutante muestra una identidad de secuencia general con un polipéptido de referencia que es de por lo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% o 99%. De manera alternativa o adicional, en algunas modalidades, un polipéptido mutante no comparte por lo menos un elemento de secuencia característico con un polipéptido de referencia. En algunas modalidades, el polipéptido de referencia tiene una o más actividades biológicas. En algunas modalidades, los polipéptidos mutantes comparten una o más actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas modalidades, un polipéptido mutante carece de una o más de las actividades biológicas del polipéptido de referencia. En algunas modalidades, un polipéptido mutante muestra un nivel reducido de una o más actividades biológicas en comparación con el polipéptido de referencia. Ácido nucleico: Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que es o que se puede incorporar en una cadena oligonucleotídica. En algunas modalidades, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que es o que se puede incorporar en una cadena oligonucleotídica por medio de un enlace fosfodiéster. En algunas modalidades, "ácido nucleico" se refiere a residuos individuales de ácido nucleico (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas modalidades, "ácido nucleico" se refiere a una cadena oligonucleotídica que comprende residuos de ácido nucleico individuales. Como se utiliza en la presente, los términos "oligonucleótidos" y "polinucleótidos " se pueden utilizar de manera intercambiable. En algunas modalidades, un "ácido nucleico" abarca ARN así como ADN de cadena sencilla y/o doble y/o ADNc . Además, los términos "ácido nucleico", "ADN", "ARN" y/o términos similares incluyen análogos de ácido nucleico, es decir, análogos que tienen otra estructura principal diferente a fosfodiéster. Por ejemplo, los denominados "ácidos peptidonucleicos" los cuales se conocen en el ámbito y tienen enlaces peptídicos en vez de enlaces fosfodiéster en la estructura principal, se consideran dentro del ámbito de la presente invención. El término "secuencia nucleotídica que codifica para una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias nucleotídicas que son versiones degeneradas de entre sí y/o que codifican para la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias nucleotídicas que codifican para proteínas y/o ARN pueden incluir intrones. Los ácidos nucleicos se pueden purificar de fuentes naturales, se pueden producir utilizando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente se pueden purificar, sintetizar químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas sintetizadas químicamente, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósido tales como análogos que tienen bases o azúcares modificadas químicamente, modificaciones en la estructura principal, etc. Una secuencia de ácido nucleico se presenta en la dirección 51 a 31, a menos que se indique en otro sentido. El término "segmento de ácido nucleico" se utiliza en la presente para referirse a una secuencia de ácido nucleico que es una porción de una secuencia de ácido nucleico más grande. En muchas modalidades, un segmento de ácido nucleico comprende por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 7, 8 ó l0 o más residuos. En algunas modalidades, un ácido nucleico es o comprende nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina); análogos nucleosídicos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metiladenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-etilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desazaadenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, 0(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases modificadas químicamente, bases modificadas biológicamente (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (por ejemplo, 21-fluororribosa, ribosa, 2'-desoxirribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y enlaces 51-N-fosforoamidita). En algunas modalidades, la presente invención se relaciona específicamente con "ácidos nucleicos no modificados" lo que significa ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótidos y residuos, que incluyen nucleótidos y/o nucleósidos) que no han sido modificados químicamente con el fin de facilitar u obtener suministro.

Paciente: Como se utiliza en la presente, el término "paciente" o "sujeto" se refiere a cualquier organismo al cual se puede administrar la composición que se proporciona, por ejemplo, para propósitos experimentales, de diagnóstico, profilácticos, cosméticos y/o terapéuticos. Los pacientes típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y/o humanos). En algunas modalidades, un paciente es un humano. Un humano incluye las formas pre y postnatales.

Farmacéuticamente aceptable: El término "farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en la presente, se refiere a sustancias que, dentro de alcance del buen juicio médico, son adecuadas para uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesivos, conmensurado con una relación razonable beneficio/riesgo.

Portador farmacéuticamente aceptable: Como se utiliza en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un material de relleno, diluyente, excipiente o material encapsulante disolvente líquido o sólido involucrado en el suministro o transporte del compuesto objeto desde un órgano, o porción del cuerpo a otro órgano u otra porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no dañino para el paciente. Algunos ejemplos de materiales los cuales sirven como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto pulverizado; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites tales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de frijol de soya; glicoles tales como propilenglicol; polioles tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes amortiguadores tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones amortiguadas en pH; poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos y/u otras sustancias compatibles no tóxicas utilizadas en formulaciones farmacéuticas.

Composición farmacéutica: Como se utiliza en la presente, el término "composición farmacéutica" se refiere a un agente activo, formulado junto con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, el agente activo está presente en una cantidad de dosis unitaria apropiada para administración en un régimen terapéutico que muestra una probabilidad estadísticamente significativa de obtener un efecto terapéutico predeterminado cuando se administra a una población relevante. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se pueden formular especialmente para administración en forma sólida o líquida que incluyen aquellas adaptadas para lo siguiente: administración oral, por ejemplo, pociones (soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas), tabletas, por ejemplo, aquellas dirigidas para absorción bucal, sublingual y sistémica, bolos, polvos, gránulos, pastas para aplicación a la lengua; administración parenteral, por ejemplo, por inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o epidural tal como, por ejemplo, una solución o suspensión estéril, o una formulación de liberación sostenida; aplicación tópica, por ejemplo, como una crema, ungüento o un parche de liberación controlada o aspersión aplicada a la piel, pulmones o cavidad oral; intravaginalmente o intrarrectalmente, por ejemplo, como un pesario, crema o espuma; sublingualmente; ocularmente; transdérmicamente; o nasalmente, pulmonarmente o a través de otras superficies mucosas.

Polipéptido: Como se utiliza en la presente, un "polipéptido", de manera general, es una cadena de por lo menos dos aminoácidos unidos entre sí por un enlace peptídico. En algunas modalidades, un polipéptido puede incluir por lo menos 3 a 5 aminoácidos, cada uno de los cuales está unido a otros por medio de por lo menos un enlace peptídico. Aquellos habitualmente expertos en el ámbito apreciará que los polipéptidos algunas veces incluyen aminoácidos "no naturales" u otras entidades que, no obstante, son capaces de integrarse en una cadena polipeptídica, opcionalmente.

Proteína: Como se utiliza en la presente, el término "proteína" se refiere a un polipéptido (es decir, una cadena de por lo menos dos aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos). Las proteínas pueden incluir porciones diferentes de aminoácidos (por ejemplo, pueden ser glucoproteínas, proteoglucanos, etc.), y/o de otra manera pueden ser procesados o modificados. Aquellos habitualmente expertos en el ámbito apreciarán que una "proteína" puede ser una cadena polipeptídica completa como es producida por una célula (con o sin una secuencia de señal) o puede ser una porción característica de la misma. Aquellos con habilidad habitual apreciarán que una proteína algunas veces puede incluir más de una cadena polipeptídica, por ejemplo, unida por uno o más enlaces disulfuro o asociados por otros medios.

Los polipéptidos pueden contener 1-aminoácidos, d-aminoácidos o ambos y pueden contener cualquiera de una diversidad de modificaciones de aminoácidos o análogos conocidos en el ámbito. Las modificaciones útiles incluyen, por ejemplo, acetilación terminal, amidación, metilación, etc. En algunas modalidades, las proteínas pueden comprender aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, aminoácidos sintéticos y combinaciones de los mismos. El término "péptido" se utiliza de manera general para referirse a un polipéptido que tiene una longitud de menos de aproximadamente 100 aminoácidos, menos de aproximadamente 50 aminoácidos, menos de 20 aminoácidos o menos de 10 aminoácidos. En algunas modalidades, las proteínas son anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, porciones biológicamente activas de los mismos y/o porciones características de los mismos.

Infección recurrente por DV: Como se utiliza en la presente, una "infección recurrente por DV" se refiere al resurgimiento de resultados de infección clínicos y/o de laboratorio, por ejemplo, uno o más síntomas de infección o la presencia de partículas circulantes de DV y/o partículas de DV en el hígado del sujeto.

Refractario: El término "refractario", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier sujeto que no responde con una eficacia clínica esperada posterior a la administración de las composiciones proporcionadas como se observan normalmente por el personal médico practicante.

Serotipo: En general, un "serotipo" o "serovariación" se refiere a variaciones distintas dentro de una especie de bacteria o virus de entre células inmunitarias de diferentes individuos. Estos microorganismos típicamente se clasifican juntos en base en sus antígenos de superficie celular, lo que permite la clasificación epidemiológica de organismos a nivel de subespecie.

Molécula pequeña: En general, una "molécula pequeña" es una molécula que tj.ene un tamaño menor de aproximadamente 5 kilodaltons (kD). En algunas modalidades, la molécula pequeña es de menos de aproximadamente 4 kD, 3 kD, aproximadamente 2 kD o aproximadamente 1 kD. En algunas modalidades, la molécula pequeña es menor de aproximadamente 800 daltons (D), aproximadamente 600 D, aproximadamente 500 D, aproximadamente 400 D, aproximadamente 300 D, aproximadamente 200 o aproximadamente 100 D. En algunas modalidades, una molécula pequeña es menor de aproximadamente 2000 g/mol, menor de aproximadamente 1500 g/mol, menor de aproximadamente 1000 g/mol, menor de aproximadamente 800 g/mol o menor de aproximadamente 500 g/mol. En algunas modalidades, las moléculas pequeñas son no poliméricas. En algunas modalidades, de acuerdo con la presente invención, las moléculas pequeñas no son proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, péptidos, polinucleótidos, oligonucleótidos, polisacáridos, glucoproteínas, proteoglucanos, etc.

Sustancialmente: Como se utiliza en la presente, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de presentar extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Una persona habitualmente experta en el ámbito biológico entenderá que los fenómenos biológicos y químicos raramente, en caso de que suceda, se completan y/o avanzan hasta su terminación o se obtienen o evitan un resultado absoluto. El término "sustancialmente" por lo tanto se utiliza en la presente para captar la carencia potencial de completado inherente en muchos fenómenos biológicos y químicos.

Homología de secuencia sustancial: La frase "homología sustancial" se utiliza en la presente para referirse a una comparación entre secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos. Como se apreciará por aquellos habitualmente expertos en el ámbito, dos secuencias generalmente se considera que son "sustancialmente homologas" si contienen residuos homólogos en posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. De manera alternativa, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos que serán apropiadamente estructurales similares y/o características funcionales. Por ejemplo, como es bien conocido por aquellos habitualmente expertos en el ámbito, ciertos aminoácidos típicamente se clasifican como aminoácidos "hidrofóbicos" o "hidrofílicos" y/o que tienen cadenas laterales "polares" o "no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo con frecuencia se puede considerar una sustitución "homologa". Las categorizaciones de aminoácidos típicas se resumen a continuación: Como es bien conocido en el ámbito, las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una diversidad de algoritmos, que incluyen aquellos disponibles en programas de computadora comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLASTP espaciado y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Estos programas ejemplares se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol . Biol ., 215(3):403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res . 25/3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to t he Analysis of Genes and Proteins, Wilcy, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999; la totalidad de los anteriores los cuales se incorporan en la presente como referencia. Además de identificar secuencias homologas, los programas mencionados en lo anterior típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. En algunas modalidades dos secuencias se considera que son sustancialmente homologas si por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o más de sus residuos correspondientes son homólogos con respecto al tramo relevante de residuos. En algunas modalidades, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo relevante es de por lo menos 10, por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 25, por lo menos 30, por lo menos 35, por lo menos 40, por lo menos 45, por lo menos 50, por lo menos 55, por lo menos 60, por lo menos 65, por lo menos 70, por lo menos 75, por lo menos 80, por lo menos 85, por lo menos 90, por lo menos 95; por lo menos 100, por lo menos 125, por lo menos 150, por lo menos 175, por lo menos 200, por lo menos 225, por lo menos 250, por lo menos 275, por lo menos 300, por lo menos 325, por lo menos 350, por lo menos 375, por lo menos 400, por lo menos 425, por lo menos 450, por lo menos 475, por lo menos 500 o más residuos.

Identidad sustancial: La frase "identidad sustancial" se utiliza en la presente para referirse a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como se apreciará por aquellos habitualmente expertos en el ámbito, dos secuencias generalmente se considera que son "sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en posiciones correspondientes. Como es bien sabido en este ámbito, las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos se pueden comparar utilizando cualquiera de una diversidad de algoritmos, que incluyen aquellos disponibles en programas de computadora comerciales tales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, BLAST espaciado y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Los ejemplos de estos programas se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol . Biol ., 215 (3):403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25;3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformati.es: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins , Wilcy, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados en lo anterior típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. En algunas modalidades, dos secuencias se considera que son sustancialmente idénticas si por lo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son idénticos sobre un tramo relevante de residuos. En algunas modalidades, el tramo relevante es una secuencia completa. En algunas modalidades, el tramo relevante es de por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 330, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos.

Que padece de: Un individuo quien "padece de" una enfermedad, trastorno o condición (por ejemplo, DV se le ha diagnosticado con y/o presenta uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno o condición. La infección por DV con frecuencia es asintomática. En algunas modalidades, un individuo quien padece de DV ha sido expuesto a y/o infectado con DV pero no presenta síntoma alguno de infección por DV y/o no se le ha diagnosticado con infección por DV. En algunas modalidades, un individuo quien padece de DV es un individuo quien tiene una o más partículas de DV en su sangre.

Susceptible a: Un individuo quien es "susceptible a" una enfermedad, trastorno o condición (por ejemplo, infección por DV) se encuentra en riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno o condición. En algunas modalidades, un individuo quien es susceptible de una enfermedad, trastorno o condición no presenta síntoma alguno de la enfermedad, trastorno o condición. En algunas modalidades, un individuo quien es susceptible de una enfermedad, trastorno o condición no se le ha diagnosticado con la enfermedad, trastorno y/o condición. En algunas modalidades, un individuo quien es susceptible de una enfermedad, trastorno o condición es un individuo quien ha sido expuesto a condiciones asociadas con el desarrollo de la enfermedad, trastorno o condición (por ejemplo, el individuo ha sido expuesto a DV). En algunas modalidades, un riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno y/o condición es un riesgo basado en una población (por ejemplo, usuarios de drogas intravenosas; receptores de sangre donada, productos sanguíneos y órganos antes de 1992 cuando estos productos comenzaron a ser cribados; persona relacionada con la salud quienes manejan agujas; bebés que nacieron de madres infectadas con DV; etc.).

Los síntomas están reducidos: De acuerdo con la presente invención, los "síntomas están reducidos" cuando uno o más síntomas de una enfermedad, trastorno o condición particular son de magnitud reducida (por ejemplo, intensidad, gravedad, etc.) o frecuencia. Para propósitos de claridad, un retraso en el inicio de un síntoma particular se considera una forma de reducción de la frecuencia de ese síntoma. Para proporcionar algunos ejemplos, los síntomas ejemplares de infección por DV incluyen pero no se limitan a inicio súbito de fiebre, fiebre alta (con frecuencia superior a 40°C), dolores musculares y en las articulaciones, cefalea, vómito, diarrea, presentación de una erupción cutánea o piel irritada o erupción cutánea similar a paperas, petequias (puntos rojos pequeños causados por capilares rotos que no desaparecen cuando se oprime la piel), hemorragia de las membranas mucosas, cuenta leucocítica baja, plaquetas bajas, acidosis metabólica, nivel elevado de aminotransferasa del hígado, fuga de plasma que resulta de hemoconcentración (indicada por un hematocrito aumentado) e hipoalbuminemia, acumulación de fluidos en el tórax y la cavidad abdominal (por ejemplo, en fusión pleural o ascitis), hemorragia gastrointestinal, choque y hemorragia, prueba positiva del torniquete, hipotensión, infección del cerebro o corazón, deterioro de los órganos vitales (por ejemplo, hígado), trastornos neurológicos tales como mielitis transversal y/o combinaciones de los mismos. No se pretende que la presente invención esté limitada únicamente a casos en donde se eliminen los síntomas. La presente invención específicamente contempla el tratamiento de manera que uno o más síntomas se reduzcan (y la condición del sujeto de esta manera "mejore"), aunque no se eliminen por completo.

Agente terapéutico: Como se utiliza en la presente, la frase "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que induce un efecto farmacológico deseado cuando se administra a un organismo. En algunas modalidades, un agente se considera que es un agente terapéutico si demuestra un efecto estadísticamente significativo a través de una población apropiada. En algunas modalidades, la población apropiada puede ser una población de organismos modelo. En algunas modalidades, una población apropiada se puede definir por diversos criterios tales como grupos de cierta edad, género, antecedentes genéticos, condiciones clínicas preexistentes, etc. En algunas modalidades, un agente terapéutico es cualquier sustancia que se puede utilizar para aliviar, disminuir, liberar, inhibir, evitar, retrasar el inicio de, reducir la gravedad de y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o rasgos de una enfermedad, trastorno y/o condición.

Cantidad terapéuticamente eficaz: Como se utiliza en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una proteína terapéutica la cual confiere un efecto terapéutico en el sujeto tratado, con una relación razonable beneficio/riesgo aplicable a cualquier tratamiento médico. El efecto terapéutico puede ser objetivo (es decir, mensurable por alguna prueba o marcador) o subjetivo (es decir, el sujeto proporciona una indicación de o siente un efecto). En particular, la "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una proteína o composición terapéutica eficaz para tratar, disminuir o evitar una enfermedad o condición deseada o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable, por ejemplo, al disminuir síntomas asociados con la enfermedad, evitar o retrasar el inicio de la enfermedad y/o también disminuir la gravedad o frecuencia de los síntomas de la enfermedad. Una cantidad terapéuticamente eficaz se administra comúnmente en un régimen de dosificación que puede comprender dosis unitarias múltiples. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad terapéuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la vía de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. Además, la cantidad terapéuticamente eficaz específica (y/o la dosis unitaria) para cualquier paciente particular puede depender de una diversidad de factores que incluyen el trastorno que es tratado y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico utilizado; la composición específica utilizada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; la hora de administración, la vía de administración y/o la velocidad de excreción o metabolismo de la proteína de fusión específica utilizada; la duración del tratamiento; y factores similares, como es bien sabido en el ámbito médico.

Tratamiento: Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento" (también "tratar" o "someter a tratamiento") se refiere a cualquier administración de una sustancia (por ejemplo, las composiciones que se proporcionan), que de manera parcial o completa alivia, aminora, libera, inhibe, retrasa el inicio de, reduce la gravedad de y/o reduce la incidencia de uno o más síntomas, rasgos y/o causas de una enfermedad, trastorno y/o condición particular (por ejemplo, infección por DV). El tratamiento puede ser de un sujeto quien no presenta signos de la enfermedad, trastorno y/o condición relevantes y/o de un sujeto quien presenta únicamente signos tempranos de la enfermedad, trastorno y/o condición. De manera alternativa o adicional, el tratamiento puede ser de un sujeto quien presenta uno o más signos establecidos de la enfermedad, trastorno y/o condición relevante. En algunas modalidades, el tratamiento puede ser de un sujeto en quien se ha diagnosticado que padece de la enfermedad, trastorno y/o condición relevante. En algunas modalidades, el tratamiento puede ser de un sujeto que se sabe que tiene uno o más factores de susceptibilidad que se correlacionan estadísticamente con riesgo aumentado de desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o condición relevante.

Dosis unitaria: La expresión "dosis unitaria", como se utiliza en la presente se refiere a una cantidad administrada como una dosis única y/o en una unidad físicamente discontinua de una composición farmacéutica. En muchas modalidades, una dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de un agente activo. En algunas modalidades, una dosis unitaria contiene una dosis única completa del agente. En algunas modalidades, se administran más de una dosis unitaria para obtener una dosis única total. En algunas modalidades se requiere o se espera que se requiera la administración de una dosis unitarias múltiples, con el fin de obtener un efecto deseado. Una dosis unitaria puede ser, por ejemplo, un volumen de líquido (por ejemplo, un portador aceptable) que contiene una cantidad predeterminada de uno o más agentes terapéuticos, una cantidad predeterminada de uno o más agentes terapéuticos en forma sólida, una formulación de liberación sostenida o dispositivo de suministro de fármaco que contenga una cantidad predeterminada de uno o más agentes terapéuticos, etc. Se apreciará que una dosis unitaria puede estar presente en una formulación que incluye cualquiera de una diversidad de componentes además de uno o varios de los agentes terapéuticos. Por ejemplo, se pueden incluir como se describe más adelante portadores aceptables (por ejemplo, portadores farmacéuticamente aceptables), diluyentes, estabilizantes, amortiguadores, conservadores, etc. Se apreciará por aquellos expertos en el ámbito que, en muchas modalidades, una dosificación diaria apropiada total de un agente terapéutico particular puede comprender una porción o una pluralidad de dosis unitarias que se pueden decidir, por ejemplo, por el médico que atiende dentro del ámbito del buen juicio médico. En algunas modalidades, el nivel de dosis eficaz específico para cualquier sujeto u organismo particular puede depender de una diversidad de factores que incluyen el trastorno que es tratado y la gravedad del trastorno; la actividad del compuesto activo específico utilizado; la composición específica utilizada; edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; hora de administración y velocidad de excreción del compuesto activo específico utilizado; duración del tratamiento; fármacos y/o tratamientos adicionales utilizados en combinación o de modo coincidente con uno o varios de los compuestos específicos utilizados y factores similares bien conocidos en el ámbito médico.

Vacunación: Como se utiliza en la presente, el término "vacunación" se refiere a la administración de una composición destinada para generar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, a un agente que provoca enfermedad. Para los propósitos de la presente invención, la vacunación se puede administrar antes, durante y/o después de la exposición a un agente causal de enfermedad y, en ciertas modalidades, antes, durante y/o poco después de la exposición al agente. En algunas modalidades, la vacunación incluye administraciones múltiples separadas apropiadamente en tiempo de una composición de vacunación.

Vector : Como se utiliza en la presente, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual está asociado. En alguna modalidad, los vectores son capaces de replicación y/o expresión extracromosómica de ácidos nucleicos a los cuales están unidos en una célula hospedadora tal como una célula eucariótica y/o procariótica. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denomina en la presente como "vectores de expresión".

Natural : Como se utiliza en la presente, el término "natural" tiene su significado entendido en el ámbito que se refiere a una entidad que tiene una estructura y/o actividad como se encuentra en la naturaleza en un estado o contexto "normal" (en contraste con mutante, enfermo, alterado, etc.). Aquellos habitualmente expertos en el ámbito apreciarán que los genes y polipéptidos naturales con frecuencia existen en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos). Nomenclatura de DV Es bien sabido por aquellos expertos en el ámbito que la nomenclatura de DV típicamente utiliza números romanos (por ejemplo, "I", "II", "III", "IV", etc.) que representan el genotipo de DV y una letra en minúsculas (por ejemplo, "a", "b", etc.) que representa el subtipo de DV. Aunque las reglas de nomenclatura generalmente se aceptan en el ámbito, aquellos habitualmente expertos en el tema reconocerán que las reglas de nomenclatura no siempre son seguidas de modo estricto en publicaciones, presentaciones, conversaciones, etc. De esta manera, los expertos en el ámbito reconocerán que, por ejemplo, está implícito que "DV la", "DV genotipo la", y "DV subtipo la" se pueden utilizar de modo intercambiable por una persona experta en el ámbito y que la totalidad de los tres términos se pretende que se refieran a DV genotipo I, subtipo a.

Como se utiliza en la presente, los números romanos (por ejemplo, "I", "II", "III", "IV", etc.) se utilizan para referirse al genotipo de DV y las letras en minúsculas (por ejemplo, "a", "b", etc.) se utilizan para referirse a los subtipos de DV. También se entenderá que, cuando se hace referencia en la presente a un DV de un genotipo particular, se quiere indicar que se abarcan todos los subtipos del genotipo mencionado. Para proporcionar un ejemplo, se utiliza genotipo I, en la presente para referirse a todos los subtipos de genotipo I (por ejemplo, genotipo I, subtipo a; genotipo I, subtipo b; etc.).

Como se utiliza en la presente, cualquier número romano (por ejemplo, "I", '?I", "III", "IV", etc.) que esté presente después del genotipo y designaciones del subtipo se entenderá que se refiere a la cepa de DV.

La presente invención proporciona agentes de anticuerpo anti-DV útiles con características estructurales y/o funcionales particulares así como composiciones y métodos en relación a estos agentes de anticuerpo.

Infección por virus de dengue (DV) La infección por DV representa una enfermedad viral transportada por artrópodos con más de 3.5 miles de millones de personas que viven en áreas de riesgo por la enfermedad y más de 200 millones de infecciones en todo el mundo lo que resulta en 21,000 muertes al año. De manera notable, el número promedio anual de infecciones reportadas por virus de dengue, la diseminación geográfica y la gravedad de la enfermedad se han incrementado de manera notable en años recientes. La epidemia por virus del dengue puede provocar morbilidad significativa lo que genera costos económicos sustanciales y que tiene impacto en el cuidado de la salud (Guzman et al, 2010 Nature Reviews Microbiol.8:S7-16).

La infección por DV es causada por cualquiera de los cuatro virus relacionados transmitidos principalmente por los mosquitos Aedes aegypti y que es endémica en regiones tropicales y subtropicales. La infección en un mamífero se inicia por inyección del DV durante la alimentación con sangre de un mosquito Aedes infectado, por lo que el DV se deposita principalmente en tejidos extravasculares. El período de incubación de DV después de la picadura de mosquito es de entre 3 y 14 días. Las células dendríticas, monocitos y macrófagos son entre los primeros objetivos del DV. Después de la replicación inicial en la piel y ganglios linfáticos, DV aparece en sangre en el curso de una etapa febril aguda, generalmente de 3 a 5 días.

El diagnóstico de laboratorio habitual de infección por virus de dengue se basa en el aislamiento de DV y/o detección de anticuerpos específicos para DV. La infección puede provocar diferentes síntomas diversos, alterados por la edad y/o estado inmunológico del individuo infectado. La infección primaria por DV puede ser asintomática o puede resultar en fiebre de dengue. La fiebre de dengue se caracteriza por una fiebre elevada que habitualmente tiene dos fases y por lo menos un síntoma adicional tal como cefalea (con frecuencia grave), dolor (el cual puede ser grave) en cualquiera de una diversidad de partes del cuerpo (por ejemplo, ojos, articulaciones, músculo, hueso, abdomen), erupciones cutáneas o eczantema, manifestación de hemorragias ligeras (por ejemplo, sangrado de nariz o encías, petequias, moretones que se producen con facilidad), linfadenopatía, vómito, heces con color diferente (negras), cambios de humor tal como postración, somnolencia o irritabilidad, la piel que se vuelve pálida, fría o pegajosa, dificultad en respirar, cuenta leucocítica baja, partículas virales circulantes en uno o más de los tejidos del organismo (por ejemplo, sangre, médula ósea, etc.) y/u órganos (por ejemplo, hígado) (véase, por ejemplo, la descripción del Center for Disease Control; véase también el documento US 2011/0189226). Con frecuencia se presentan números reducidos de leucocitos y plaquetas.

La fiebre hemorrágica del dengue (DHF, por sus siglas en inglés) es una complicación potencialmente mortal de infección por DV. La DHF se caracteriza por letargía y somnolencia graves, aunado con fiebre alta y otros síntomas asociados con la fiebre del dengue. La permeabilidad vascular aumentada y la homeostasis anormal pueden llevar a una disminución en el volumen sanguíneo, hipotensión y, en casos graves, choque hipovolémica y hemorragia interna. Dos factores que parecen jugar un papel principal en la presentación de fiebre de dengue hemorrágica son: replicación viral rápida con un alto nivel de viremia; y una respuesta inflamatoria mayor con liberación de niveles elevados de mediadores inflamatorios. Sin tratamiento, la tasa de mortalidad para la fiebre hemorrágica del dengue puede alcanzar 10%.

Los niños son particularmente susceptibles a los efectos de infección por DV, lo cual puede incrementar de manera notable con exposición repetida. Durante las infecciones iniciales por virus de dengue, la mayor parte de los niños experimentan infección subclínica o síndromes febriles no diferenciados ligeros. Durante las infecciones secundarias con el virus del dengue, la fisiopatología de la enfermedad con frecuencia cambia perceptiblemente. Infecciones secuenciales pueden resultar en síndrome de permeabilidad vascular aguda conocido como el síndrome de choque del dengue (DSS, por sus siglas en ingles). El DSS habitualmente es un progreso de DHF y con frecuencia es mortal. El DSS se caracteriza por un pulso de volumen rápido y pobre, hipotensión, extremidades frías e inquietud. Sin intervención médica, la tasa de mortalidad para DSS puede llegar a 40 a 50% (Thullier et al, 1999 Journal of Biotechnology 69:183-190). La gravedad de DSS depende con la edad, en donde la fuga vascular es más grave en niños jóvenes.

Las infecciones de DV en adulto con frecuencia están acompañadas por una tendencia a hemorragia que puede llevar a hemorragia grave. Las infecciones por DV pueden poner en peligro la vida cuando se presentan en individuos con asma, diabetes y/u otras enfermedades crónicas (Guzman et al, 2010 Nature Reviews Microbiol.8:S7-16).

La teoría líder propuesta para explicar el riesgo aumentado de enfermedad grave en casos secundarios de DV es el incremento dependiente de anticuerpo (ADE, por sus siglas en inglés). El virus del dengue (DV) presenta epítopos de anticuerpo que son únicos para cada serotipo así como epítopos que se comparten entre o a través de los serotipos. Una persona que ha experimentado (y que se ha recuperado de) una infección de DV primaria puede desarrollar respuestas de anticuerpo robustas que producen reacción cruzada con todos los serotipos de DV (DV1 a 4). No obstante, pese a la reactividad cruzada, los anticuerpos únicamente evitan la reinfección por el mismo serotipo (homólogo) y los individuos son susceptibles de infecciones subsecuentes con serotipos diferentes (heterólogos). Los individuos que experimentan una infección secundaria a dengue con un serotipo nuevo enfrentan un riesgo mucho mayor de desarrollar DHF, lo que indica que la inmunidad preexistente a DV puede exacerbar la enfermedad. La teoría de ADE de DV postula que los anticuerpos neutralizantes débilmente de la primera infección se unen al segundo serotipo e incrementan la infección de células mieloides que presentan FcyR tales como monocitos y macrófagos (Wahala et al., 2011 Viruses 3: 2374-2395).

Se han propuesto por lo menos tres tipos de mecanismos para explicar el desarrollo de las formas graves de infección por DV: (i) pueden ser causados por cepas de virus particularmente virulentas (ii) los anticuerpos subneutralizantes preexistentes pueden incrementar la captación mediada por anticuerpo de DV por monocitos o macrófagos, las cuales son designadas como células hospedadoras de DV (por ejemplo, ADE); y (iii) anticuerpos dirigidos contra una proteína no estructural del virus (NS1) pueden dar reacción cruzada con fibrinógeno, trombocitos y células endoteliales y de esta manera activan hemorragias.

Actualmente no hay tratamiento específico para la fiebre del dengue. Los tratamientos recomendados tratan con los síntomas e incluyen reposo en cama, control de la fiebre y dolor con antipiréticos y/o analgésicos e hidratación adecuada. Los esfuerzos se enfocan en equilibrar las pérdidas de líquido, sustitución de factores de coagulación y la infusión de heparina. La secuencia y variabilidad antigénica de los DV ha representado retos para el desarrollo de vacunas o tratamientos terapéuticos eficaces (Whitehead et al., 2007 Nature Reviews Microbiology 5:518-528). Desafortunadamente, la vacuna candidata líder recientemente demostró eficacia protectora en solo 30% en un estudio en fase II (Thomas et al., 2011 Curr Op Infectious Disease 24:442-450; Sabchareon et al., 2012 Lancet 380(9853):1559-1567). Por lo tanto, existe la necesidad por el desarrollo de tratamientos y vacunas para DV mejorados. Sería particularmente valioso el desarrollo de tratamientos aplicables a todos los serotipos de DV. Tal tratamiento, tendría un impacto sorprendente en la salud humana, especialmente en países en desarrollo.

Antígenos de DV Las infecciones por DV son causadas por cuatro virus (DV1 a 4) los cuales son de tipo serológico similar pero difieren antigénicaente. Los DV son ARN virus de cadena sencilla positivos que pertenecen al género flavivirus dentro de la familia Flaviviridae. El virión conprende una partícula esférica con un diámetro de 40 a 50 nm, con una envoltura de lipopolisacáridos. El genoma de ARN, el cual es de una longitud de aproximadamente 11 kb comprende un extremo 5' tipo I pero carece de la cola poli-A 3'. La organización del genoma comprende los siguientes elementos: una región no codificante (NCR, por sus siglas en inglés) 5', una región que no codifica para proteínas estructurales (cápside (C), premembrana/membrana (prM/M), envoltura (E)) y una región que codifica para proteínas no estructurales (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) y una NCR 3'.

El ARN genómico viral se asocia con las proteínas de cápside para formar una nucleocápside. Como es habitual en los flavivirus, el genoma viral de dengue codifica para una región codificante ininterrumpida la cual se traduce en una poliproteína única la cual es procesada postraduccionalmente. Las propiedades biológicas importantes de DV incluyen unión a receptor, hemaglutinación de eritrocitos, inducción de anticuerpos neutralizantes y la respuesta inmunitaria protectora, se asocia con la proteína E (Wahala et al., 2011 Viruses 3:2374-2395).

La proteína PrM, una glucoproteína de aproximadamente 19 kDa, contiene seis residuos cisteína altamente conservados que forman tres puentes disulfuro y que se escinden a proteínas Pr y M por furina o proteasa similar a furina durante la maduración.

La proteína NS1, también una glucoproteína de aproximadamente 40 kDa, contiene 12 residuos cisteína altamente conservados que forman seis puentes disulfuro y que están presentes intracelularmente, sobre la superficie celular, y exteriormente a las células (Lai et al. 2008 Journal of Virology 82(13):6631-43).

La proteína E, una glucoproteína de aproximadamente 55 kDa, contiene 12 residuos cisteína conservados estrictamente que forman seis fuentes disulfuro y que están presentes como un heterodímero con la proteína PrM antes de la maduración del virión. Los estudios cristalográficos de rayos X del ectodominio de la proteína E ha mostrado tres dominios barril beta distintos conectados por la membrana viral por un tallo helicoidal ancla y dos dominios transmembranales antiparalelos. El dominio III (EDIII) adopta un pliegue similar a inmunoglobulina y se ha sugerido que juega un papel crítico en interacciones con receptores. El dominio II (EDII) es un dominio alargado constituido de dos estructuras largas similares a dedos que contiene un bucle de fusión de tres aminoácidos altamente conservado (EDII-FL) en la punta y participa en la fusión de membrana y en la dimerización de la proteína E. El dominio central de E (dominio I; EDI) es un barril b de nueve cadenas que está conectado a EDIII y EDII por uno y cuatro enlazantes flexibles, respectivamente. Las proteínas E son importantes para ensamblado viral, unión a receptor, entrada, fusión viral y posible evasión inmunitaria durante el ciclo de vida del flavivirus y por lo tanto, son proteínas dinámicas que se requieren para adoptar varias conformaciones y distribuciones distintas en la partícula de virus. Además, la proteína E es el objetivo principal de los anticuerpos tanto neutralizantes como de mejoramiento (Lai et al., 2008 Journal of Virology 82:6631-6643; Pierson et al., 2008 Cell Host & Microbe 4:229-38).

Los DV se ensamblan sobre la membrana del retículo endoplástico (ER, por sus siglas en inglés) y el virus se reproduce por gemación en el lumen de ER como partícula de virus inmaduras. A diferencia de las partículas de virus maduras que tienen una superficie uniforme, las partículas de virus inmaduras que se reproducen por gemación en el ER tienen una superficie rugosa generada por trímeros de heterodímeros de E/prM que forman sesenta proyecciones en espiga con simetría icosahédrica sobre la envoltura viral (Perera et al., 2008 Antivir. Res.80 11-22). Las proteínas E de cada trímero se proyectan alejándose de la superficie del virión e interactúan con PrM vía el extremo distal de ED II incluyendo el bucle de fusión. La PrM en viriones inmaduros limita la capacidad de las proteínas E a experimentar rearreglo oligomérico en los compartimientos secretores derivados del aparato de Golgi con pH bajo durante la eclosión viral y de esta manera evitar la fusión prematura y adventicia (Guirakhoo et al., 1991 Journal of Virology 72:1323-1329; Heinz et al., 1994 Journal of Virology 198 (1):109-117). Conforme los viriones inmaduros se desplazan a través de los compartimientos ácidos a través de la red de Golgi (TGN, por sus siglas en inglés) cambian de orientación de proteínas prM y E desenmascarando un sitio para la serina proteasa celular furina. En este ambiente de pH bajo, las proteínas E de viriones inmaduros forman dímeros antiparalelos que se encuentran planos contra la superficie del virión y están distribuidos con una simetría casi icosahédrica T = 3 (Yu et al., 2009 Journal of Virology 83(23):12101-12107). La proteína prM continúa enmascarando el bucle de fusión de EDII hasta que es liberado después de escisión de furina y una transición a un pH neutro se produce en el espacio extracelular. Los virus maduros e infecciosos resultantes son partículas relativamente uniformes constituidas de 90 dímeros de proteína E y 180 copias de la proteína M de ~70 aminoácidos. En esta configuración, las proteínas E en la DV madura existe en tres ambientes distintos definidos por su proximidad a los ejes de simetría 2, 3 ó 5 (Kuhn et al., 2002 Cell 108:717-25). De esta manera, la totalidad de las subunidades de proteína E no están en ambientes idénticos sobre la superficie viral y las consideración esféricas y de otro tipo resultan en interacciones preferenciales de algunas subunidades E sobre otras con receptores y anticuerpos.

Los anticuerpos que reconocen el bucle de fusión altamente conservado en la proteína E demuestran reactividad amplia a la totalidad de los cuatro serotipos de DV; no obstante, su potencia de neutralización habitualmente es limitada debido probablemente a que este epítopo es principalmente inaccesible en DV maduro. Se ha demostrado que algunos anticuerpos los cuales reconocen la cadena b de "A" del dominio III de la proteína E (EDIII) neutralizan de manera potente las cepas DV particulares, pero no se sabe que sean eficaces contra la totalidad de los cuatro serotipos (Lok et al., Nature Structural & Molecular Biol.15:312-317). La cadena b "A" es parte de un subepítopo complejo centrado en las posiciones 305-308 (numeración de DV3) en EDIII.

Como se describe en la presente, la presente invención abarca el hallazgo de que el antígeno, y particularmente el dominio EDIII puede servir como un objetivo antigénico útil para agentes de anticuerpo anti-Dv de espectro amplio. La invención demuestra particularmente que los anticuerpos que se unen al antígeno E (por ejemplo, al dominio EDIII) , pero que no neutralizan todos los serotipos de DV se pueden manipular del modo razonado para producir variantes y/u otros agentes de anticuerpo que neutralizan la totalidad de los serotipos I a IV de DV (véase, por ejemplo, la figura 3. Además, la presente invención demuestra que los anticuerpos que se unen al antígeno E (por ejemplo, al dominio EDIII) y que neutralizan parte pero no la totalidad de los serotipos DV se pueden manipular de modo razonado para producir variantes y/u otros agentes de anticuerpo que tengan actividad de neutralización adquirida, en comparación con el anticuerpo original contra una o más cepas y/o serotipos particulares sin deteriorar de modo significativo su actividad, en comparación con el anticuerpo original, contra ciertas otras cepas y/o subtipos.

Anticuerpo 4E11 Los anticuerpos han demostrado ser una clase eficaz de sustancias terapéuticas antivirales, en parte debido a su alta especificidad bioquímica y su registro de seguridad establecido. Adicionalmente, los anticuerpos tienen una vida media en suero prolongada (~21 días) lo que permite usos profilácticos en personas, una aplicación de necesidad particular para enfermedades infecciosas las cuales muestran inicios rápidos, incluyendo la infección por virus de dengue.

Los anticuerpos que protegen contra infección de flavivirus se considera que actúan a través de mecanismos múltiples, que incluyen uno o más de (1) neutralización directa de la unión a receptor, (2) inhibición de fusión viral, (3) depuración viral dependiente del receptor Fc-g, (4) lisis mediada por complemento de virus o células infectadas, y (5) citotoxicidad dependiente de anticuerpo de células infectadas (Pierson et al., 2008 Cell Host & Microbe 4:229-38). Se considera que la neutralización de flavivirus requiere la unión por anticuerpos múltiples (Dowd et al., 2011 Virology 411:306-15). Los estudios con E16, un mAb que une EDIII que neutraliza al virus del Nilo occidental en una etapa posterior a la unión indica que ~30 anticuerpos necesitan unirse para neutralización eficaz. Los estudios han sugerido que tanto la afinidad de unión del anticuerpo y el número total de epítopos accesibles contribuyen a la potencia de neutralización de un anticuerpo. De esta manera, incluso para un anticuerpo que se une con alta afinidad, el anticuerpo fallará en neutralizar si el número de epítopos accesibles está por debajo de cierto nivel requerido para neutralización. Inversamente, un anticuerpo con afinidad menor puede neutralizar si muchos de los epítopos son accesibles para unión.

Como ya se ha indicado, el virus del dengue (DV) muestra epítopos de anticuerpos que son únicos para cada serotipo y epítopos que son compartidos entre serotipos. La mayor parte de los estudios para comprender cómo los anticuerpos neutralizan o incrementan DV se han realizado con anticuerpos monoclonales de ratón (mAb). Dado que la proteína E es el antígeno principal expuesto sobre la superficie del virión, los mAb de ratón que se unen a la proteína E han sido el foco de mucho análisis. Aunque los mAb de ratón neutralizantes se han mapeado para la totalidad de los tres dominios, los mAb neutralizantes más fuertes son específicos de serotipo y se unen a EDIII, el cual sobresale de la superficie del virión. Dos epítopos que se superponen parcialmente sobre EDIII designan la orilla lateral y los epítopos de la cadena E son los objetivos principales de los mAb de ratón que neutralizan DV.

El epítopo de la orilla lateral interactúa fuertemente con neutralizantes específicos para serotipo.

Por ejemplo, el mAb 3H5 mapea para EDIII-LR de DV serotipo 2, y el epítopo reconocido por estos mAb se localiza tanto en la cadena A (aminoácido 304) como el bucle FG (residuos 383 y 384) (Sukupolvi-Petty et al., 2007 Journal of Virology 81(23): 12816-12826).

No obstante, no todos los anticuerpos que unen EDIII presentan actividad neutralizante específica para el tipo. Los mAb que se unen al epítopo de la cadena A producen reacción cruzada con más de un serotipo de DV y se les denomina mAb neutralizantes subcomplejos de virus de dengue. Por ejemplo, los mAb subespecíficos de complejo 1A1D-2 reconocen un epítopo central de la cadena A de la superficie lateral de EDIII y pueden neutralizar la infección por DV serotipos 1 a 3 (DV1 a 3) pero no DV serotipo 4 (DV4) (Lok et al., 2008 Nature Struct Mol Biol 15(3):312-317; Roehrig et al., 1998 Virology 246(2):317-328; Sukupolvi-Petty et al., 2007 Journal of Virology 81(23): 12816-12826). Las bases moleculares para la especificidad de este mAb se han investigado; únicamente uno de los tres residuos en el centro del epítopo 1A1D-2 se conserva entre la totalidad de los cuatro serotipos DV (DV1 a 4). Un epítopo de cadena A similar también se reconoce por el mAb para DV de reacción cruzada neutralizante ampliamente, 4E11 (Thullier et al., 2001 Journal Gen Virol. 82(8):1885-1892). Los enfoques experimentales hasta ahora, no obstante, no han proporcionado anticuerpos capaces de neutralizar de manera potente la totalidad de los cuatro serotipos DV.

Un anticuerpo monoclonal murino particular, conocido como 4E11 que se une dentro de EDIII de la glucoproteína E muestra potente actividad neutralizante contra DV serotipos 1 a 4. 4E11 se une a un epítopo conformacional en DV EDIII de la glucoproteína E y da reacción cruzada con la totalidad de los cuatro serotipos. 4E11 neutraliza de manera potente a DV1 a 3 al interferir con la unión a la célula hospedadora. No obstante, tiene una afinidad pobre y por lo tanto una actividad neutralizante débil contra DV4.

Una línea de célula de hibridoma que secreta anticuerpo monoclonal de ratón 4E11 se ha depositado ante la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de acceso: HB-9259. Se conocen secuencias naturales ("wt", por sus siglas en inglés) de la cadena pesada (HC por sus siglas en inglés; SEC ID NO: 1) de 4E11 y de la cadena ligera (LC por sus siglas en inglés; SEC ID NO: 2). Las secuencias de la infraestructura (FR, por sus siglas en inglés) de 4E11 wt y las regiones determinadoras de complementariedad (CDR) se conocen (wt 4E11 HC FR1 es la SEC ID NO: 3, wt 4E11 HC FR2 es la SEC ID NO: 4, wt 4E11 HC FR3 es la SEC ID NO: 5, wt 4E11 HC FR4 es la SEC ID NO: 6, wt 4E11 HC CDR1 es la SEC ID NO: 7, wt 4E11 HC CDR2 es la SEC ID NO: 8, wt 4E11 HC CDR3 es la SEC ID NO: 9; wt 4E11 LC FR1 es la SEC ID NO: 10, wt 4E11 LC FR2 es la SEC ID NO: 11, wt 4E11 LC FR3 es la SEC ID NO: 12, wt 4E11 LC FR4 es la SEC ID NO: 13, wt 4E11 LC CDR1 es la SEC ID NO: 14, wt 4E11 LC CDR2 es la SEC ID NO: 15, wt 4E11 LC CDR3 es la SEC ID NO: 16).

SEC ID NO: 1: EVKLLEQSGAELVKPGASVRLSCTASGFNIKDTYMSWVKQRPEQGLEWIGRIDPANGDT KYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSGDTAVYYCSRGWEGFAYWGQGTLVTVSA SEC ID NO: 2: ELVMTQTPASLAVSLGQRATISCRASENVDRYGNSFMHWYQQKAGQPPKLLIYRASNL ESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQRSNEVPWTFGGGTKLEIKR SEC ID NO: 3: EVKLLEQSGAELVKPGASVRLSCTAS SEC ID NO: 4: YMSWVKQRPEQGLEWIGRI SEC ID NO: 5: TKYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSGDTAVYYCSR SEC ID NO: 6: WGQGTLVTVSA SEC ID NO: 7: GFNIKDT SEC ID NO: 8: DPANGD SEC ID NO: 9: GWEGFAY SEC ID NO: 10: ELVMTQTPASLAVSLGQRATISC SEC ID NO: 11: WYQQKAGQPPKLLIY SEC ID NO: 12: GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFC SEC ID NO: 13: FGGGTKLEIKR SEC ID NO: 14: RASENVDRYGNSFMH SEC ID NO: 15: RASNLES SEC ID NO: 16: QRSNEVPWT La presente invención abarca el reconocimiento de que sería deseable desarrollar anticuerpos (u otros agentes de anticuerpo) que sean variantes de wt 4E11. La presente invención proporciona particularmente estos anticuerpos y agentes de anticuerpo. Esto es, la presente invención proporciona diversos agentes de anticuerpo que muestran identidad estructural significativa con 4E11 y además muestran características funcionales mejoradas (por ejemplo, neutralización de DV4) en comparación con la que se observa con wt 4E11.

La presente descripción proporciona una métrica de calificación novedosa para atraco de interacción antígeno-anticuerpo. La infraestructura métrica de calificación clasifica las interfases proteína-proteína de acuerdo con rasgos fisicoquímicos y susceptibilidades de interacciones de aminoácidos pareados observadas en interfases intermoleculares. La presente descripción utiliza esta infraestructura para modificar propiedades de un anticuerpo existente. En algunas modalidades, la especificidad y afinidad de un anticuerpo por su antígeno se modifica. En algunas modalidades, el anticuerpo modificado es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, la infraestructura descrita en la presente invención se utiliza para manipular especificidad y afinidad más amplias a un mAb neutralizante anti-DV.

Utilizando el modelo atracado, se examinó el modo de unión de anticuerpos anti-DV a la totalidad de los cuatro serotipos de DV (DV1 a 4) y se identificó la base estructural de afinidad pobre de estos anticuerpos hacia DV4 . Las mutaciones se diseñaron cuidadosamente sobre el paratopo de estos anticuerpos para mejorar su afinidad y de esta manera su actividad neutralizante hacia DV4, mientras se mantiene afinidad y actividad neutralizante hacia DV1 a 3. Para el diseño de mutaciones, los residuos del bucle de CDR de los mAb se examinó cuidadosamente, uno a la vez. En una posición de CDR dada, el residuo "natural" se sustituyó sistemáticamente por los aminoácidos remanentes excluyendo glicina (Gly) y prolina (Pro), y la probabilidad de sustitución se evaluó en cada caso utilizando susceptibilidades pareadas estadísticas. Los residuos Gly y Pro no se modificaron para evitar alteración en la conformación de la estructura principal. Las mutaciones únicas con un alto potencial de sustitución se modelaron y se reevaluaron computacionalmente para encontrar mutaciones que: (1) no altere los valores phi-psi; (2) no entierren grupos polares; y (3) mejore los enlaces H, el puente salino, las fuerzas de van der Waals, contactos hidrofóbicos y empacado. Las mutaciones únicas promisorias identificadas por el enfoque computacional se activaron utilizando un método de análisis inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) indirecto de alto rendimiento para identificar mutaciones positivas que mejoran la afinidad hacia DV4 EDIII y al mismo tiempo mantienen la afinidad hacia DV1 a 3 EDIII. Finalmente, las mutaciones únicas positivas se combinaron para diseñar de modo razonado anticuerpos de alta afinidad. Los experimentos de ELISA de competencia se llevaron a cabo para determinar la afinidad, al equilibrio y en solución, entre los anticuerpos manipulados y EDIII de cada uno de los cuatro serotipos. Las mediciones de unión se verificaron utilizando análisis de resonancia de superficie (SPR, por sus siglas en inglés).

En algunas modalidades, los anticuerpos contra el epítopo de la cadena A se pueden manipular para encontrar la totalidad de los cuatro serotipos de DV. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-DV wt 4E11 se modificó para mejorar su afinidad y de esta manera la actividad neutralizante hacia DV4 mientras se mantiene la afinidad hacia DV1 a 3. En algunas modalidades, uno de los anticuerpos manipulados presenta una mejora de afinidad entre ~15 y -450 veces hacia EDIII de DV2 y DV4, respectivamente, mientras mantiene la afinidad original hacia EDIII de DV1 y DV3. En algunas modalidades, en comparación con wt mAb 4E11, el anticuerpo manipulado muestra un incremento >75 veces en el potencial neutralizante hacia DV4 y al mismo tiempo mantiene la actividad "natural" hacia otros serotipos. El anticuerpo 4E11 manipulado de acuerdo con la presente invención representa un candidato interesante para un anticuerpo terapéutico para tratar la enfermedad del dengue.

Variante proporcionada de agentes de anticuerpo DV Se apreciará que los agentes de anticuerpo proporcionados pueden ser manipulados, producidos y/o purificados de manera tal que mejoren las características y/o actividad de los agentes de anticuerpo. Por ejemplo, las características mejoradas de los agentes de anticuerpo proporcionados incluyen, pero no se limitan a estabilidad aumentada, afinidad y/o avidez de unión mejoradas, especificidad de unión aumentada, producción aumentada, agregación disminuida, unión inespecífica disminuida, entre otros.

En general, como se describe en la presente, se proporcionan agentes de anticuerpo que pueden ser o incluir, por ejemplo, un anticuerpo policlonal; un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que une antígeno; un anticuerpo modificado tal como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo reconformado, un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab', Fab, F(ab')2); o un anticuerpo biosintético, por ejemplo, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo de dominio único (DAB, por sus siglas en inglés), Fv, Fv de cadena sencilla (scFv) o similar.

Los métodos de elaboración y uso de anticuerpos policlonales y monoclonales se describen, por ejemplo, en Harlow et al., Using Antibodies: A Laboratory Manual: Portable Protocol I Coid Spring Harbor Laboratory (1 de diciembre de 1998). Los métodos para elaborar agentes de anticuerpo modificados tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos quiméricos, anticuerpos reconformados, anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos, por ejemplo, fragmentos Fab1, Fab, F(ab')2; o anticuerpos biosintéticos (por ejemplo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de dominio único (DAB), Fv, Fv de cadena sencilla (scFv) y similares), se conocen en el ámbito y se pueden encontrar, por ejemplo, en Zola, Monoclonal Antibodies: Preparation and Use of Monoclonal Antibodies and Engineered Antibody Derivatives, Springer Verlag (Dic.15, 2000; la edición).

La presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a la totalidad de los cuatro serotipos de DV (DV1 a 4). En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a DV1 con una afinidad mayor, en comparación con la afinidad de otro anticuerpo a DV1. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV2, en comparación con la afinidad de otro anticuerpo a DV2. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV3, en comparación con la afinidad de otro anticuerpo a DV3. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV4, en comparación con la afinidad de otro anticuerpo a DV4. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV1, DV2, DV3 y DV4 en comparación con la afinidad de otro anticuerpo a DV1, DV2, DV3 y DV4. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV4 y que retienen afinidad de unión hacia DV1, DV2 y DV3 en comparación con las afinidades de otro anticuerpo para estos serotipos de DV. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a DV1 y DV4 con afinidades mayores, en comparación con las afinidades de otro anticuerpo por estos serotipos de DV. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV1 y DV4 y que retienen su afinidad de unión hacia DV2 y DV3, en comparación con las afinidades de otro anticuerpo por estos serotipos de DV. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a DV2 y DV4 con afinidades mayores, en comparación con las afinidades de otro anticuerpo por estos serotipos de DV. En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV2 y DV4 y que retienen su afinidad de unión por DV1 y DV3, en comparación con las afinidades de otro anticuerpo por estos serotipos de DV. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen a DV3 y DV4 con afinidades mayores, en comparación con las afinidades de otro anticuerpo por estos serotipos de DV. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV3 y DV4 y que retienen su afinidad de unión por DV1 y DV2, en comparación con las afinidades de otro anticuerpo por estos serotipos de DV.

En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que se unen a uno o más de DV1 a 4 con una afinidad de por lo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o mayor que la afinidad de un anticuerpo diferente por uno o más de DV1 a 4. En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que se unen a uno o más de DV1 a 4 con una afinidad de por lo menos 2 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces, por lo menos 20 veces, por lo menos 30 veces, por lo menos 40 veces, por lo menos 50 veces, por lo menos 60 veces, por lo menos 70 veces, por lo menos 80 veces, por lo menos 90 veces, por lo menos 100 veces, por lo menos 200 veces, por lo menos 300 veces, por lo menos 400 veces, por lo menos 500 veces o una afinidad mayor que la de un anticuerpo diferente para uno o más de DV1 a 4. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran afinidades de unión por diferentes serotipos de DV que están dentro de 2, dentro de 5, dentro de 10, dentro de 25, dentro de 50, dentro de 100, dentro de 150, dentro de 200, dentro de 250, dentro de 300, dentro de 350 ó dentro de 400 veces afinidad entre sí.

En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran una neutralización CI50 (pg/ml) dentro de un intervalo como se describe y/o se ejemplifica en la presente. En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran una neutralización CI50 (pg/ml) cuya cota inferior es de aproximadamente 0.05 mg/ml y cuya cota superior es aproximadamente 10 pg/ml. En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran una neutralización CI5o (yg/ml) cuya cota inferior se selecciona del grupo que consiste de 0.05 mg/ml, 0.1 pg/ml, 0.2 pg/ml, 0.3 g/ml,0.4 pg/mi, 0.5 yg/ml, 0.6 g/ l, 0.7 pg/ml, 0.8 pg/ml, 0.9 g/ml, 1.0 pg/ml, 1.1 pg/ml, 1.2 pg/ml, 1.3 yg/ml, 1.4 mg/ml, 1.5 yg/ml, 1.6 mg/ml, 1.7 mg/tnlí 1.8 mg/ml, 1.9 mg/ml, 2.0 mg/ml, 2.5 mg/ml, 3.0 mg/ml, 3.5 mg/ml, 4.0 mg/ml, 4.5 mg/ml, 5.0 mg/ml o mayor y cuya cota superior es mayor que la cota inferior y se selecciona del grupo que consiste de 1.5 mg/ml, 1.6 pg/ml, 1.7 pg/ml, 1.8 mg/ml/ 1.9 pg/ml, 2.0 pg/ml, 2.5 mg/ml, 3.0 pg/ml, 3.5 mg/ml/ 4.0 mg/ml 4.5 mg/ml; 5.0 pg/ml, 5.5 mg/ml, 6.0 mg/ml, 6.5 mg/ml, 7.0 mg/ml, 7.5 pg/ml, 8.0 pg/ml, 8.5 mg/ml, 9.0 mg/ml, 9.5 pg/ml, 10.0 o mayor.

En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran unión por DV1 a 4 con una KD (nM) menor de 40000 nM, menor de 30000 nM, menor de 20000 nM, menor de 10000 nM, menor de 5000 nM, menor de 2000 nM, menor de 1500 nM, menor de 1000 nM, menor de 500 nM, menor de 250 nM, menor de 225 nM, menor de 200 nM, menor de 175 nM, menor de 150 nM, menor de 125 nM, menor de 100 nM, menor de 75 nM, menor de 50 nM, menor de 25 nM, menor de 15 nM, menor de 10 nM, menor de 5 nM, menor de 2.5 nM, menor de 1 nM, menor de 0.5 nM, menor de 0.25 nM o menor de 0.1 nM.

En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran unión a DV1 a 4 con una Kactivación (M^s1) ccuuyyaa ccoottaa iinnffeerriioorr es de aproximadamente 0.01 x 105 M1s1 y la cota superior es de aproximadamente 5.0 x 106 M^s-1. En algunas modalidades se proporcionan anticuerpos que muestran unión a DV1 a 4, con una Kactivación (M^s-1) cuya cota inferior se selecciona del grupo que consiste de 0.01 x 105 M^s-1, 0.05 x 105 M1s1, 0.1 x 105 M-1s-1, 0.5 x 105 M^s1, 1.0 x 105 M^s1, 2.0 x 105 M^s-1, 5.0 x 105 M1s1, 7.0 x 105 M^s-1 o mayor y cuya cota superior es mayor que la cota inferior y se selecciona del grupo que consiste de 1.0 x 106 M^-s1, 1.5 x 106 M_1s_1, 2.0 x 106 M^S1, 2.5 x 106 3 .0 x 106 1S 1 , 3 .5 x 106 M 1S 1, 4.0 x 106 M^s-1, 4 .5 x 106 M ^-s-1, 5.0 x 106 M^s-1, o mayor.

En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran unión a DV1 a 4 con una Kinactivación (s1) cuya cota inferior es de aproximadamente 5 x 10~4 s-1 y la cota superior es de aproximadamente 900 x 10-4 s_1.

En algunas modalidades, se proporcionan agentes de unión que muestran unión a DV1 a 4 con una Kinactivación (s-1) cuya cota inferior se selecciona del grupo que consiste de 5 x 104 s_1, 10 x 10-4 s-1, 12 x 10-4 s1, 13 x 104 S1, 14 x 104 S1, 15 x 104 s-1, 18 x 104 s-1, 20 x 10~4 s1, o mayor y cuya cota superior es mayor que la cota inferior y se selecciona del grupo que consiste de 50 x 104 s-1, 100 x 104 s_1, 120 x 10-4 s-1, 140 x 104 s1, 150 x 104 s1, 200 x 104 s1. 300 x 10-4 s_1, 400 x 10-4 s1, 500 x 104 s1, 600 x lO4 s1, 700 x 10-4 s1, 800 x 104 s-1, 900 x 104 s_1 o mayor.

En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que se unen a glucoproteína E de DV1 a 4. En ciertas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que se unen a EDIII de DV1 a 4 (SEC ID NOs: 17 a 20). En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que se unen a la cadena A de DV1 a 4. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con mayor afinidad a EDIII de DV4 (SEC ID NO: 20).

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a la cadena A de DV4.

SEC ID NO: 17: MCTGSFKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKIPFSSQDEKGVTQNGRLITANPIVT DKEKPVNIEAEPPFGESYIWGAGEKALKLSWFK SEC ID NO: 18: MCTGKFKW KEIAETQHGTMVIRVQYEGDDSPCKIPFEIMDLEKKHVLGRLITVNPIVIE KDSPINEAEPPFGDSYIIIGVEPGQLKLNWFK SEC ID NO: 19: MCTNTFVLKKEVSETQHGTILIKVEYKGEDAPCKIPFSTEDGQGKAHNGRLITANPW TK KEEPVNIEAEPPFGESNIVIGIGDNALKINWYK SEC ID NO: 20: MCSGKFSIDKEMAETQHGTTW KVKYEGAGAPCKVPIEIRDVNKEKW GRIISSTPLAEN TNSVTNIELEPPFGDSYIVIGVGNSALTLHWFR En algunas modalidades, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen a uno o más residuos aminoácidos en EDIII de DV1 a 4 (SEC ID NOs: 17 a 20) en las posiciones 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 323, 325, 327, 329, 360, 361, 362, 363, 364, 385, 387, 388, 389, 390, 391 y/o combinaciones de las mismas. En algunas modalidades, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que se unen a uno o más residuos aminoácidos en EDIII de DV1 a 4 (SEC ID NOs: 17 a 20) en las posiciones 305, 310, 311, 323, 327, 329 y/o combinaciones de las mismas. En algunas modalidades, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que unen residuos aminoácidos en EDIII de DV1 a 4 (SEC ID NOs: 17 a 20) en las posiciones 305, 310, 311, 323, 327 y 329. En algunas modalidades, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que unen un residuo aminoácido en EDIII de DV1 a 4 (SEC ID NOs: 17 a 20) en la posición 305. En algunas modalidades, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que unen un residuo aminoácido en EDIII de DV1 a 4 (SEC ID NOs: 17 a 20) en la posición 310. En ciertas modalidades, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que unen residuo aminoácido en EDIII de DV1 a 4 (SEC ID NOs: 17 a 20) en la posición 311. En algunas modalidades, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que unen residuos aminoácidos en EDIII de DV1 a 4 (SEC ID NOs: 17 a 20) en la posición 323. En algunas modalidades, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que unen residuo aminoácido en EDIII de DV1 a 4 (SEC ID NOs: 17 a 20) en la posición 327. En algunas modalidades, la presente invención identifica agentes de anticuerpo que unen residuo aminoácido en EDIII de DV1 a 4 (SEC ID NOs: 17 a 20) en la posición 329.

En algunas modalidades, un residuo serina, lisina y/o treonina en la posición 305 contribuye a la unión a los agentes de anticuerpo que se proporcionan. En algunas modalidades, un residuo lisina en la posición 310 contribuye a la unión a los agentes de anticuerpo que se proporcionan. En algunas modalidades, un residuo lisina en la posición 311 contribuye a la unión a los agentes de anticuerpo que se proporcionan. En algunas modalidades, un residuo arginina, lisina y/o glutamina en la posición 323 contribuye a la unión a los agentes de anticuerpo que se proporcionan. En algunas modalidades, un residuo serina y/o glutamato en la posición 327 contribuye a la unión a los agentes de anticuerpo que se proporcionan. En algunas modalidades, un residuo arginina, aspartato y/o glutamato en la posición 329 contribuye a la unión a los agentes de anticuerpo que se proporcionan.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV1, en comparación con el anticuerpo DV natural ("wt"). En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV2, en comparación con un anticuerpo DV wt o de referencia original. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV3 en comparación con un anticuerpo de referencia tal como un anticuerpo wt DV. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV4, en comparación con un anticuerpo DV de referencia. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV1, DV2, DV3 y DV4, en comparación con un anticuerpo DV de referencia. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV4 y que retienen la afinidad de unión a DV1, DV2 y DV3, en comparación con un anticuerpo DV de referencia. En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV2 y DV4, en comparación con un anticuerpo DV (wt) de referencia.

En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que se unen con una afinidad mayor a DV2 y DV4 y que retienen su afinidad de unión hacia DV1 y DV3, en comparación con un anticuerpo DV de referencia. En algunas modalidades, un anticuerpo wt DV es un anticuerpo wt 4E11.

Como se describe aquí, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran cierta relación estructural (es decir, secuencia) con 4E11 y/o que tienen atributos funcionales particulares que incluyen, por ejemplo, ciertos atributos funcionales mejorados en comparación con wt 4E11.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo cuyas secuencias de aminoácidos muestran niveles de homología y/o de identidad especificados con wt 4E11. En algunas modalidades se proporcionan agentes de anticuerpo que muestran por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% de identidad con wt 4E11 (es decir, con las SEC ID NOs: 1 a 2).

En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que tienen una CDR1 de cadena pesada (HC por sus siglas en inglés; SEC ID NO: 21) que comprende la secuencia GFNIKDT (SEC ID NO: 23), una CDR2 de HC que comprende la secuencia DPENGD (SEC ID NO: 24), una CDR3 de HC que comprende la secuencia GWEGFAY (SEC ID NO: 25), una CDR1 de cadena ligera (LC, por sus siglas en inglés; SEC ID NO: 29) que comprende la secuencia RASENVDKYGNSFMH (SEC ID NO: 26), una región CDR2 de LC que comprende la secuencia RASELQW (SEC ID NO: 27) y una región CDR3 de LC que comprende la secuencia QRSNEVPWT (SEC ID NO: 28).

SEC ID NO: 21: EVKLLEQSGAELVKPGASVRLSCTASGFNIKDTYMSWVKQRPEQGLEWIGRIDPENGDT KYDPKFQGKATITADTSSNTAYLHLSSLTSGDTAVYYCSRGWEGFAYWGQGTLVTVSA SEC ID NO: 22: ELVMTQTPASLAVSLGQRATISCRASENVDKYGNSFMHWYQQKAGQPPKLLIYRASEL QWGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEADDVATYFCQRSNEVPWTFGGGTKLEIKR En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que tienen una o más CDR y/o uno o más FR que son idénticos en secuencia a una CDR o FR correspondiente de wt 4E11 (es decir, a una o más de las SEC ID NOs: 7 a 9, 14 a 16 ó 3 a 6 y 10 a 13). En algunas modalidades, se proporcionan agentes de anticuerpo que tienen una o más CDR y/o FR que muestran un grado especificado de homología y/o identidad con las CDR y/o los FR correspondientes de wt 4E11, como se describe más adelante. En algunas modalidades, la totalidad de las CDR y los FR de los agentes de anticuerpo que se proporcionan muestran por lo menos el nivel de homología y/o identidad especificado. En algunas modalidades, los agentes de anticuerpo que se proporcionan tienen secuencias de CDR y FR que juntas contienen un máximo de 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1 sustituciones en comparación con wt 4E11.

En algunas modalidades, una región determinadora de complementariedad jCDR) 1 de un agente de anticuerpo de la presente invención muestra por lo menos 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95% o más de 99% de identidad con la wt 4E11 (SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 14). En algunas modalidades, una CDR1 proporcionada tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la de wt 4E11 y/o que no contiene sustitución de aminoácido alguna en comparación con CDR1 de wt 4E11 (SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 14). En algunas modalidades, una CDR1 proporcionada tiene una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 14). En algunas modalidades, una CDR1 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 14). En algunas modalidades, una CDR proporcionada tiene 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituciones y en algunas modalidades 1, 2 ó 3 sustituciones en comparación con wt 4E11.

En algunas modalidades, una CDR2 de un agente de anticuerpo de la presente invención muestra por lo menos 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95% o más de 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NO: 8 y SEC ID NO: 15). En algunas modalidades, una CDR2 proporcionada tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la de wt 4E11 y/o no contiene sustituciones de aminoácidos alguna en comparación con CDR2 de wt 4E11 (SEC ID NO: 8 y SEC ID NO: 15). En algunas modalidades, una CDR2 proporcionada tiene una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 8 y SEC ID NO: 15). En algunas modalidades, una CDR2 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 8 y SEC ID NO: 15). En algunas modalidades, una CDR proporcionada tiene 1, 2, 3, 4 ó 5 sus ituciones y en algunas modalidades, 1, 2 ó 3 sustituciones, en comparación con wt 4E11.

En algunas modalidades, una CDR3 de un agente de anticuerpo de la presente invención muestra por lo menos 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95% o más de 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 16). En algunas modalidades, una CDR3 proporcionada tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la de wt 4E11 y/o que no contiene sustituciones de aminoácidos alguna en comparación con CDR3 de wt 4E11 (SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 16). En algunas modalidades, una CDR3 proporcionada tiene una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 16). En algunas modalidades, una CDR3 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 16). En algunas modalidades, una CDR proporcionada tiene 1, 2, 3, 4 ó 5 sustituciones y en algunas modalidades, 1, 2 ó 3 sustituciones, en comparación con wt 4E11.

En algunas modalidades, una región 1 de infraestructura (FR1) proporcionada de un agente de anticuerpo de la presente invención compartirá más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95% o más de 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 10) . En algunas modalidades, una FR1 proporcionada tendrá una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 10). En algunas modalidades, una FR1 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 10).

En algunas modalidades, una región 2 de infraestructura (FR2) proporcionada de un agente de anticuerpo de la presente invención compartirá más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95% o más de 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 11) . En algunas modalidades, una FR2 proporcionada no tendrá una sustitución de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 11). En algunas modalidades, una FR2 proporcionada tendrá una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 11). En algunas modalidades, una FR2 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 11).

En algunas modalidades, una región 3 de infraestructura (FR3) proporcionada de un agente de anticuerpo de la presente invención compartirá más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95% o más de 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 12) . En algunas modalidades, una FR3 proporcionada no tendrá una sustitución de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 12).

En algunas modalidades, una FR3 proporcionada tendrá una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 12). En algunas modalidades, una FR3 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 12).

En algunas modalidades, una región 4 de infraestructura (FR4) proporcionada de un agente de anticuerpo de la presente invención compartirá más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95% o más de 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 13) . En algunas modalidades, una FR4 proporcionada no tendrá una sustitución de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 13).

En algunas modalidades, una FR4 proporcionada tendrá una o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 13). En algunas modalidades, una FR3 proporcionada tendrá dos o más sustituciones de aminoácidos en comparación con wt 4E11 (SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 13).

En algunas modalidades, la CDR de VH de los agentes de anticuerpo proporcionados mostrará por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NOs: 7 a 9). En algunas modalidades, la CDR de VH de los agentes de anticuerpo proporcionados muestra por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NOs: 7 a 9) pero difiere por sustitución de por lo menos una sustitución de aminoácido dentro de la CDR.

En algunas modalidades, la CDR de VH de los agentes de anticuerpo que se proporcionan tiene una sustitución del residuo aminoácido correspondiente en la posición 55 del anticuerpo wt 4E11. En algunas modalidades, un residuo aminoácido sustituto en la posición 55 se selecciona del grupo que consiste de glutamato y aspartato. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 55 es glutamato. En algunas modalidades, el residuo aminoácido en la CDR de VH de los anticuerpos que se proporcionan que corresponde al residuo aminoácido en la posición 55 de wt 4E11 no es alanina.

En algunas modalidades, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados mostrará por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NOs: 14 a 16). En algunas modalidades, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo proporcionados muestra por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NOs: 14 a 16) pero difiere por sustitución de por lo menos una sustitución de aminoácido dentro de la CDR. En algunas modalidades, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo que se proporcionan tiene una o más sustituciones del residuo aminoácido correspondiente en las posiciones 31, 57, 59, 60 y/o combinaciones de los mismos, del anticuerpo wt 4E11. En algunas modalidades, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo que se proporcionan tiene una sustitución del residuo aminoácido correspondiente en la posición 31 del anticuerpo wt 4E11. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 31 es lisina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido en la CDR de VL de los agentes de anticuerpo que se proporcionan corresponde al residuo aminoácido en la posición 55 de wt 4E11 no es arginina. En algunas modalidades, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo que se proporcionan tiene una sustitución del residuo aminoácido correspondiente en la posición 57 del anticuerpo wt 4E11. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 57 se selecciona del grupo que consiste de glutamato y serina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 57 es glutamato. En algunas modalidades, el residuo aminoácido en la CDR de VL de los agentes de anticuerpo que se proporcionan corresponde al residuo aminoácido en la posición 57 de wt 4E11 no es asparagina. En algunas modalidades, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo que se proporcionan tiene una sustitución del residuo aminoácido correspondiente en la posición 59 del anticuerpo wt 4E11.

En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 59 se selecciona del grupo que consiste de glutamina y asparagina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 59 es glutamina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido en la CDR de VL de los agentes de anticuerpo que se proporcionan corresponde al residuo aminoácido en la posición 59 de wt 4E11 no es glutamato. En algunas modalidades, la CDR de VL de los agentes de anticuerpo que se proporcionan tiene una sustitución del residuo aminoácido correspondiente en la posición 60 del anticuerpo wt 4E11. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 60 se selecciona del grupo que consiste de triptofano, tirosina y arginina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 60 es triptofano. En algunas modalidades, el residuo aminoácido en la CDR de VL de los agentes de anticuerpo que se proporcionan corresponde al residuo aminoácido en la posición 60 de wt 4E11 no es serina.

En algunas modalidades, la CDR de VH y VL de los agentes de anticuerpo proporcionados muestra por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NOs: 7 a 9 y 14 a 16, respectivamente). En algunas modalidades, las CDR de VH y VL de los agentes de anticuerpo proporcionados muestra por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 99% de identidad con wt 4E11 (SEC ID NOs: 7 a 9 y 14 a 16, respectivamente), pero difieren por sustitución de por lo menos una sustitución de aminoácido dentro de la CDR. En algunas modalidades, la CDR de VH de los agentes de anticuerpo que se proporcionan tiene sustitución del residuo aminoácido correspondiente en la posición 55 de la CDR de VL de los agentes de anticuerpo que se proporcionan que tiene sustitución del residuo aminoácido correspondiente en las posiciones 31, 57, 59 y 60 del anticuerpo wt 4E11. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 55 es glutamato. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 31 es lisina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 57 es glutamato. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 59 es glutamina. En algunas modalidades, el residuo aminoácido sustituto en la posición 60 es triptofano.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran unión a EDIII-DV4 (SEC ID NO: 20) con una KD (nM) menor de 40000 nM, menor de 30000 nM, menor de 20000 nM, menor de 15000 nM, menor de 10000 nM, menor de 8000 nM, menor de 5000 riM, menor de 4000 nM, menor de 3000 nM, menor de 2000 nM, menor de 1500 nM, menor de 1000 nM, menor de 500 nM, menor de 250 nM, menor de 225 nM, menor de 200 nM, menor de 175 nM, menor de 150 nM, menor de 125 nM, menor de 100 nM, menor de 75 nM o menor de 50 nM.

En algunas modalidades , la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran unión a EDIII -DV1 (SEC ID NO : 17) con una KD (nM) de menos de 3 nM, menos de 2 .5 nM, menos de 2 nM, menos de 1 . 5 nM, menos de 1. 0 nM, menos de 0.5 nM, menos de 0 .4 nM, menos de 0.3 nM, menos de 0 .2 nM, menos de 0 . 1 nM o menos de 0. 05 nM.

En algunas modalidades , la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran unión a EDIII -DV2 (SEC ID NO : 18) con una KD (nM) de menos de 15 nM, menos de 12 nM, menos de 10 nM, menos de 8 nM, menos de 7 nM, menos de 5 nM, menos de 2 .5 nM, menos de 2 nM, menos de 1 . 5 nM, menos de 1 nM, menos de 0. 5 nM, menos de 0.4 nM, menos de 0 .3 nM, menos de 0 .2 nM o menos de 0. 1 nM .

En algunas modalidades , la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran unión a EDIII-DV3 (SEC ID NO: 19) con una Kb (nM) de menos de 120 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 40 nM, menos de 35 nM, menos de 30 nM, menos de 25 nM, menos de 20 nM, menos de 15 nM, menos de 10 nM, menos de 5 nM, menos de 2 . 5 nM o menos de 1. 0 nM.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo con por lo menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces o mayor afinidad por unión a EDIII-DV4 en comparación con 4E11.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo con por lo menos 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces o mayor afinidad por unión a EDIII-DV2 en comparación con wt 4E11.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo con por lo menos 1 vez, 1.5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces o mayor afinidad por unión a EDIII-DV1 y/o EDIII-DV3 en comparación con wt 4E11.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agente de anticuerpo que muestran CIso de neutralización (pg/ml) EDIII-DV4 (SEC ID NO: 20) de 60 mg/ml o menos, 50 pg/ml o menos, 40 pg/ml o menos, 30 pg/ml, 20 pg/ml o menos, 10 pg/ml o menos, 5 pg/ml o menos, 4 pg/ml o menos, 3 pg/ml o menos, 2 yg/ml o menos.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran CI50 de neutralización (pg/ml) de EDIII-DV3 (SEC ID NO: 19) de 7.0 yg/ml o menos, 6.0 mg/ml o menos, 5.0 mg/ml o menos, 4.0 pg/ml o menos, 3.0 pg/ml o menos, 2.0 mg/tnl o menos, 1.5 mg/ml o menos, 1.0 mg/ml o menos, 0.90 mg/ml o menos, 0.80 mg/ml o menos, 0.70 mg/ml o menos, 0.60 mg/ml o menos, 0.50 mg/ml o menos.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran CI50 de neutralización (pg/ml) de EDIII-DV2 (SEC ID NO: 18) de 0.2 pg/ml o menos, 0.19 pg/ml o menos, 0.18 pg/ml o menos, 0.17 pg/ml o menos, 0.16 pg/ml o menos, 0.15 pg/ml o menos, 0.14 pg/ml o menos, 0.13 pg/ml o menos, 0.12 pg/ml o menos, 0.11 pg/ml o menos, 0.10 pg/ml o menos, 0.09 pg/ml o menos, 0.07 pg/ml o menos, 0.06 pg/ml o menos, 0.05 pg/ml o menos, 0.04 pg/ml o menos, 0.03 pg/ml o menos, 0.02 pg/ml o menos, o 0.01 pg/ml o menos.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que muestran CI50 de neutralización (pg/ml) de EDIII-DV1 (SEC ID NO: 17) de 5.0 pg/ml o menos 4.0 pg/ml o menos, 3.0 pg/ml o menos, 2.5 pg/ml o menos, 2.0 pg/ml o menos, 1.5 pg/ml o menos, 1.0 pg/ml o menos, 0.90 pg/ml o menos, 0.70 pg/ml o menos, 0.50 pg/ml o menos, 0.40 pg/ml o menos, 0.30 pg/ml o menos, 0.20 pg/ml o menos, 0.10 pg/ml o menos.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo con por lo menos 2 veces 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces, 500 veces o más reducción de CI50 para neutralización de EDIII-DV4 en comparación con wt 4E11.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo con por lo menos 1 vez, 1.5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, o más de reducción de CI50 para neutralización de EDIII-DV2 en comparación con wt 4E11.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo con por lo menos 1 vez, 1.5 veces, 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, o más de reducción de CI50 para neutralización de EDIII-DV1 y/o EDIII-DV3 en comparación con wt 4E11.

En algunas modalidades, una o más secuencias en los agentes de anticuerpo que se proporcionan han sido manipulados (por ejemplo, por maduración por afinidad u otro enfoque de optimización) para mejorar una o más características o actividades (por ejemplo, para incrementar estabilidad, disminuir agregación, disminuir inmunogenicidad, etc.), como se conoce en el ámbito.

En algunas modalidades, un agente de anticuerpo se modifica por PEGilación, metilación, sialilación, aminación o sulfatación. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo se conjuga a un núcleo/cubierta anfifílica para producir una micela polimérica. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo se conjuga a una macromolécula hiper-ramificada (es decir, un dendrímero). En algunas modalidades, un agente de anticuerpo se conjuga a un polímero natural que se selecciona del grupo que consiste de albúmina, quitosana, heparina, paclitaxel, poli-L-glutamato), N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA, por sus siglas en inglés), poli-(L-lactida) (PLA, por sus siglas en inglés), poli(amidoamina) (PAMAM, por sus siglas en inglés), folato y/o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo comprende una o más colas no estructuradas largas de aminoácidos hidrofílicos (rPEG). En algunas modalidades, se contempla la formación de derivados de inmunoglob linas al introducir selectivamente grupos sulfhidrilo en la región Fe de una inmunoglobulina utilizando condiciones de reacción que no alteren el sitio de combinación del anticuerpo. Los conjugados de anticuerpo producidos de acuerdo con esta metodología pueden presentar una longevidad, especificidad y sensibilidad mejoradas (patente U.S. No. 5,196,066, incorporada en la presente como referencia). La unión específica de sitio de moléculas efectoras o indicadoras, en donde la molécula indicadora o efectora está conjugada a un residuo carbohidrato en la región Fe también se han descrito en la literatura (O'Shannessy et al., 1987).

En algunas modalidades, un agente de anticuerpo DV proporcionado es o comprende un anticuerpo o fragmento del mismo. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo DV proporcionado es o comprende un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo DV proporcionado es o comprende un anticuerpo policlonal o fragmento del mismo. En algunas modalidades, el agente de anticuerpo de DV es o comprende un anticuerpo de "longitud completa" en la medida en que contiene dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, opcionalmente asociadas por enlaces disulfuro como sucede con anticuerpos producidos de manera natural. En algunas modalidades, el agente de anticuerpo DV es o comprende un fragmento de un anticuerpo de longitud completa en que contiene parte, pero no la totalidad de las secuencias encontradas en un anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, en algunas modalidades, un agente de anticuerpo de DV es o comprende fragmentos de anticuerpo los cuales incluyen, pero no se limitan a Fab, Fab1, F(ab')2, scFv, Fv, diacuerpo dsFv y fragmentos Fd. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo DV proporcionado es o comprende un anticuerpo que es un miembro de una clase de anticuerpo que se selecciona del grupo que consiste de IgG, IgM, IgA, IgD, IgE o un fragmento del mismo. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo DV que se proporciona es o comprende un anticuerpo producido por síntesis química. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo DV que se proporciona es o comprende un anticuerpo producido por una célula. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo DV que se proporciona es o comprende un anticuerpo producido utilizando un sistema de cultivo de células recombinante. En algunas modalidades, un agente de anticuerpo DV que se proporciona es o comprende un anticuerpo quimérico, por ejemplo, de ratón, rata, caballo, cerdo u otras especies, que presentan dominios de región constante y/o variable humanos.

En algunas modalidades, un agente de anticuerpo DV incluye uno o más fragmentos de anticuerpo, que incluyen, pero que no se limitan a Fab', Fab, F(ab')2, anticuerpos de dominio único (DAB, por sus siglas en inglés), Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), polipéptidos con CDR de anticuerpo, dominios de andamiaje que presentan las CDR (por ejemplo, anticalinas) o nanocuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo proporcionado puede ser un anticuerpo VHH (es decir, un VHH específico de antígeno) que comprende únicamente una cadena pesada. Estas moléculas de anticuerpo se pueden derivar de un anticuerpo de llama o de otro camélido (por ejemplo, una IgG2 o IgG3 de camélido o un marco que presenta CDR a partir de la Ig de camélido) o de un anticuerpo de tibhurón. En algunas modalidades, el agente de anticuerpo de DV es o comprende un avicuerpo (diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo). Las téenicas para preparación y uso de diversas construcciones y fragmentos basados en anticuerpo son bien conocidos en el ámbito. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos también son bien conocidos en el ámbito (véase, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory, 1988; incorporado en la presente como referencia).

En algunas modalidades, el agente de anticuerpo DV que se proporciona incluye uno o más de "Mini-anticuerpos" o "minicuerpos". Los minicuerpos son cadenas de polipéptido sFv las cuales incluyen dominios de oligomerización en sus partes C-terminal, separadas de scFv por una región de bisagra (Pack et al . , (1992) Biochem 31:1579-1584). El dominio de oligomerización comprende hélices alfa autoasociantes, por ejemplo, cremalleras de leucina que pueden ser estabilizadas adicionalmente por puentes disulfuro adicionales. El dominio de oligomerización se diseña para ser compatible con plegamiento vectorial a través de una membrana, un proceso que se considera facilita el plegado in vivo del polipéptido en una proteína de unión funcional. Generalmente, los minicuerpos se producen utilizando métodos recombinantes bien conocidos en el ámbito. Véase, por ejemplo, Pack et al., (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber et al. (1992) J Immunology 149B:120-126.

Conjugados de agente de anticuerpo En algunas modalidades, un agente de anticuerpo DV que se proporciona es o comprende un conjugado, en el cual, una porción de anticuerpo comprende o consiste del anticuerpo o una porción funcional del mismo con una porción conjugada. En algunas modalidades, particulares, el agente de anticuerpo DV como se describe en la presente se proporciona y/o utiliza en asociación con uno o más agentes activos o "cargas útiles" tales como un agente terapeutico o de detección. En estas modalidades, la asociación entre el agente de anticuerpo DV y el agente activo y/o la carga útil comprende por lo menos una interacción covalente de manera que se proporciona un conjugado de anticuerpo DV.

En algunas modalidades, un agente de anticuerpo es un agente de carga útil terapéutica que es una entidad efectora que tiene una actividad deseada, por ejemplo, actividad antiviral, actividad antiinflamatoria, actividad citotóxica, etc. Los agentes terapéuticos pueden ser o comprender cualquier clase de entidad química que incluye, por ejemplo, proteínas, carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos, moléculas orgánicas pequeñas, polímeros no biológicos, metales, iones, radioisótopos, etc. En algunas modalidades, los agentes terapéuticos para uso de acuerdo con la presente invención pueden tener una actividad biológica relevante con el tratamiento de uno o más síntomas o causas de infección por DV (así, por ejemplo, antiviral, alivio de dolor, antiinflamatorio, inmunomodulador, actividades que inducen el sueño, etc.). En algunas modalidades, los agentes terapéuticos para uso de acuerdo con la presente invención, tienen una o más actividades adicionales.

En algunas modalidades, un agente de anticuerpo es un agente de detección de carga útil que es o que comprende cualquier porción que puede ser detectada utilizando un análisis, por ejemplo, debido a sus propiedades funcionales específicas y/o características químicas. Los ejemplos no limitantes de estos agentes incluyen enzimas, radiomarcas, aptenos, marcas fluorescentes, moléculas fosforescentes, moléculas quimioluminiscentes, cromóforos, moléculas luminiscentes, moléculas de fotoafinidad, partículas con color o ligandos tales como biotina.

Muchos agentes de detección de carga útil apropiados se conocen en el ámbito así como sistemas para su unión a anticuerpos (véase, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 5,021,236; 4,938,948; y 4,472,509, cada una incorporada en la presente como referencia). Los ejemplos de los agentes de detección de carga útil incluyen iones paramagnéticos, isótopos radioactivos, fluorocromos, sustancias detectables por RMN, agentes generadores de imagen por rayos X, entre otros. Por ejemplo, en algunas modalidades, un ión paramagnético es uno o más de cromo (III), manganeso (II), hierro (III), hierro (II), cobalto (II), níquel (II), cobre (II), neodimio (II), samario (III), iterbio (III), gadolinio (III), vanadio (II), terbio (III), disprosio (III), holmio (III), erbio (III), lantano (III), oro (III), plomo (II) y/o bismuto (III).

En algunas modalidades, un isótopo radioactivo es uno o más de astatina211, 14carbono, 51cromo, 36cloro, 57cobalto, 58cobalto, cobre67, 152Eu, galio67, 3hidrógeno,yodol23, yodol25, yodol31, indiolll, 59hierro, 32fósforo, radio223, reniol86, reniol88, 75selenio, 35azufre, tenecio99m, torio227 y/o itrio 90.

Los agentes de anticuerpo marcados radioactivamente se pueden producir de acuerdo con métodos bien conocidos en el ámbito. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden yodar por contacto con yoduro de sodio y/o de potasio y un agente oxidante químico tal como hipoclorito de sodio o un agente oxidante enzimático tal como lactoperoxidasa. Se proporcionan agentes de anticuerpo que se pueden marcar con teenecio 99m, por proceso de intercambio de ligando, por ejemplo, al reducir pertecnato con una solución estanosa, quelar el tecnecio reducido en una columna de Sephadex y aplicar el anticuerpo a esta columna. En algunas modalidades, los agentes de anticuerpo DV que se proporcionan están marcados utilizando técnicas de marcado directo, por ejemplo, al incubar pertecnato, un agente reductor tal como SNCI2, una solución amortiguadora tal como una solución de ftalato de sodio y potasio, y el anticuerpo. Los grupos funcionales intermedios los cuales con frecuencia se utilizan para unir radioisótopos los cuales existen como iones metálicos para el anticuerpo son el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA, por sus siglas en inglés) o el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, por sus siglas en inglés).

En algunas modalidades, una etiqueta fluorescente es o comprende uno o más de Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, Cy3, Cy5,6-FAM, Fluorescein Isothiocyanate, HEX, 6-JOE, Oregon Green, 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin ROX, TAMRA, TET, Tetramethylrhodamine, y/o Texas Red, entre otros.

Se conocen en el ámbito diversos métodos para la unión o conjugación de un agente de anticuerpo a una carga útil. Algunos métodos de unión involucran el uso de un complejo de quelato de metal que utiliza, por ejemplo, un agente quelante orgánico tal como anhídrido de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA); ácido etilentriaminotetraacético; N-cloro-p-toluensulfonamida; y/o tetracloro-3a,6a-difenilglucourilo-3 unido al anticuerpo (patentes U.S. Nos. 4,472,509 y 4,938,948, cada una incorporada en la presente como referencia). Los agentes de anticuerpo DV que se proporcionan también se pueden hacer reaccionar con una enzima en presencia de un agente acoplado tal como glutaraldehído o peryodato. Los conjugados con marcadores de fluoresceína se preparan en presencia de estos agentes de acoplamiento por reacción con un isotiocianato. Producción de anticuerpos Los agentes de anticuerpo que se proporcionan incluyen anticuerpos y/o porciones características de los mismos o ácidos nucleicos que los codifican y se pueden producir por cualquier medio disponible. Son bien conocidos en el ámbito los métodos para generar anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y/o anticuerpos policlonales). Se apreciará que una amplia gama de especies de animales se pueden utilizar para la producción de antisueros que incluyen a conejos, ratones, ratas, hámsteres, cobayos o chivos. La elección del animal se decidirá en base en la facilidad de manipulación, costos de la cantidad de suero deseado, como es bien conocido por los expertos en el ámbito. Se apreciará que el agente de anticuerpo también se puede producir transgénicamente mediante la generación de un mamífero o una planta que sea transgénica para las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de interés y la producción del anticuerpo en una forma recuperable a partir de los mismos. En relación con la producción transgénica en mamíferos, se pueden producir anticuerpos y se pueden recuperar de leche de chivo, de vaca o de otros mamíferos. Véanse también, por ejemplo, las patentes U.S. Nos. 5,827,690; 5,756,687; 5,750,172 y 5,71,957.

Los agentes de anticuerpo que se proporcionan (que incluyen anticuerpos y/o porciones características) se pueden producir, por ejemplo, al utilizar un sistema de célula hospedadora manipulado para expresar un ácido nucleico que codifica para anticuerpo de la invención. De manera alternativa o adicional, los agentes de anticuerpo que se proporcionan pueden ser preparados parcial o completamente por síntesis quimérica (por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos automatizado).

Las fuentes ejemplares para preparaciones de agente de anticuerpo adecuadas para la invención incluyen, pero no se limitan a medio de cultivo acondicionado derivado de cultivo de una línea de células recombinantes que expresan una proteína de interés o a partir de extracto celular, por ejemplo, de células productoras de anticuerpo, bacterias, células de hongos, células de insecto, plantas transgénicas o células vegetales, animales transgénicos o células animales, o suero de animales, fluido ascítico, sobrenadantes de hibridoma o mieloma. Las células bacterianas adecuadas incluyen, pero no se limitan a células de Escherichia coli . Los ejemplos de cepas adecuadas de E. coli incluyen: HB101, DH5a, GM2929, JM109, KW251, N 538, NM539 y cualquier cepa de E. coli que no escinda ADN extraño. Las células hospedadoras de hongos adecuadas que se pueden utilizar incluyen, pero no se limitan a células de Saccharomices cerevisiae, Pichia pastoris y Aspergillus . Las células de insecto adecuadas incluyen pero no se limitan a células S2 Schneider, células D. Mel-2, SF9, SF21, High-5MR, MimicMR-SF9, células MG1 y KC1. Las líneas de células recombinantes ejemplares adecuadas incluyen, pero no se limitan a línea de mieloma de ratón BALB/c, retinoblastos humanos (PER.C6), células de riñón de mono, línea de riñón embriónico humano (293), células de riñón de hámster bebé (BHK, por sus siglas en inglés), células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés), células de sertoli de ratón, células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma cervical humano (HeLa), células de riñón de perro, células de hígado de rata búfalo, células de pulmón humano, células de hígado humano, células de tumor mamario de ratón, células TRI, células MRC 5, células FS4 y línea de hepatoma humano (Hep G2).

Los agentes de anticuerpo de interés se pueden expresar utilizando diversos vectores (por ejemplo, vectores virales) conocidos en el ámbito y células que se pueden cultivar bajo diversas condiciones conocidas en el ámbito (por ejemplo, alimentación por lotes). Se conocen bien en el ámbito diversos métodos de manipulación genética de células para producir anticuerpos. Véase, por ejemplo, Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wilcy, Nueva York).

Los agentes de anticuerpo que se proporcionan se pueden purificar, si se desea, utilizando filtración, centrifugación y/o diversos métodos cromatográficos tales como CLAR o cromatografía de afinidad. En algunas modalidades, los fragmentos de los agentes de anticuerpo que se proporcionan se pueden obtener por métodos los cuales incluyen digestión con enzimas, tal como pepsina o papaína y/o por escisión de enlaces disulfuro por reducción química. Ácidos nucleicos En ciertas modalidades, la presente invención proporciona ácidos nucleicos que codifican para un agente de anticuerpo. En algunas modalidades, la invención proporciona ácidos nucleicos los cuales son complementarios a ácidos nucleicos los cuales codifican para un agente de anticuerpo.

En algunas modalidades, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico las cuales hibridizan con ácidos nucleicos que codifican para un agente de anticuerpo. Estos ácidos nucleicos se pueden utilizar, por ejemplo, como cebadores o como sondas. Para proporcionar algunos ejemplos, los ácidos nucleicos se pueden utilizar como cebadores en reacción en cadena de polimerasa (PCR), como sondas para hibridación (que incluyen hibridación in si tu) y/o como cebadores para transcripción inversa-PCR (RT-PCR).

En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN y pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos pueden incluir uno o más nucleótidos no naturales. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos incluyen sólo nucleótidos naturales.

Caracterización y/o identificación de agentes relacionados con DV En algunas modalidades, la presente invención proporciona agentes de anticuerpo que se pueden utilizar para identificar y/o caracterizar uno o más agentes que imitan un epítopo de DV o un agente y/o que inducen una respuesta de anticuerpo fuerte a DV.

En algunas modalidades, estos agentes incluyen uno o más péptido miméticos de unión similares a anticuerpo. Liu et al . Cell Mol Biol (Noisy-le-grand).2003 Mar;49(2):209-16 describe "péptido mimético que se unen similares a anticuerpo" (ABiP) los cuales son péptidos que actúan como anticuerpos reducidos por comparación y que tienen ciertas ventajas sobre la vida media sérica más prolongada así como métodos de síntesis problemáticos. De igual manera, en algunos aspectos, las moléculas similares a anticuerpo son péptidos cíclicos o bicíclicos. Por ejemplo, los métodos para aislamiento de péptidos bicíclicos que unen antígeno (por ejemplo, por presentación de fago) y para uso de estos péptidos se proporcionan en la publicación de patente U.S. No. 20100317547, incorporado en la presente como referencia.

En algunas modalidades, estos agentes incluyen una o más proteínas de andamiaje que se unen, similares a anticuerpo. Por ejemplo, en algunas modalidades, una o más CDR que surgen de un anticuerpo se pueden injertar en un andamiaje proteínico. En general, los andamiajes de proteína pueden satisfacer un mayor número de los siguientes criterios: (Skerra A., J. Mol . Recogn. , 2000, 13:167-187): buena conservación filogenética; estructura tridimensional conocida (tal como, por ejemplo, mediante cristalografía, espectroscopia RMN o cualquier otra téenica conocida por una persona experta en el ámbito); tamaño pequeño; pocas o nulas modificaciones postrancripcionales; y/o facilidad de elaboración, expresión y purificación. El origen de estos andamiajes de proteína puede ser, pero no se limita a fibronectina (por ejemplo, el dominio 10 de fibronectina tipo III), lipocalina, anticalina (Skerra A., J. Biotechnol . , 2001, 74(4):257-75), proteína Z que surge del dominio B de la proteína A de Staphyilococcus aureus, tiorredoxina A o proteínas con un motivo repetido tal como la "secuencia repetida de ankirina" (Kohl et al . , PNAS, 2003, vol.100, No. 4, 1700-1705), la "secuencia repetida de armadillo", la "secuencia repetida rica en leucina" y la "secuencia repetida de tetratricopéptido". Por ejemplo, los derivados de anticalina o lipocalina se describen en las publicaciones de patentes US Nos. 20100285564, 20060058510, 20060088908, 20050106660 y en la publicación PCT No. W02006/056464 , incorporada en la presente como referencia. Los andamiajes derivados de toxinas tales como, por ejemplo, toxinas de escorpiones, insectos, plantas, moluscos, etc. y los inhibidores proteínicos de NO sintasa neuronal (PIN, por sus siglas en inglés) también se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención.

En algunas modalidades, estos agentes incluyen un mimotopo, el cual puede ser utilizado para interrumpir la interacción entre un virus de influenza y el receptor de polipéptido HA. En alguna modalidad, el mimotopo se utiliza para inducir una respuesta de anticuerpo idéntica o similar a la inducida por su epítopo objetivo correspondiente. En algunas modalidades, el epítopo objetivo es una secuencia que está conservada a través de más de un serotipo de DV. En alguna modalidad, el epítopo conservado es una secuencia que se conserva a través de DV, serotipos 1 a 4. En algunas modalidades, el epítopo es una secuencia conservada que se localiza dentro de la región de cadena A de la glucoproteína E. En algunas modalidades, un mimotopo es un péptido. En algunas modalidades, un mimotopo es una molécula pequeña, carbohidrato, lípido o ácido nucleico. En algunas modalidades, los mimotopos son mimotopos peptídicos o no peptídicos de epítopos de influenza conservados. En algunas modalidades, al imitar la estructura de un epítopo viral definido, un mimotopo interfiere con la capacidad de las partículas de DV para unirse a sus asociados de unión naturales, por ejemplo, mediante unión al asociado de unión natural mismo.

En algunas modalidades, un agente es un péptido recortado. En algunas modalidades, el péptido recortado comprende secuencias de aminoácidos que codifican para una o más CDR y/o FR que comprenden por lo menos más de 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% de homología y/o identidad con las CDR y/o los FR correspondientes de un anticuerpo anti-DV (por ejemplo, 4E11). En algunas modalidades, el péptido recortado comprende una secuencia de aminoácidos que codifica para una o más secuencias de cadena VH y/o VL que comprende por lo menos más de 65, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% de homología y/o identidad con las cadenas VH y VL correspondientes de un anticuerpo anti-DV (por ejemplo, 4E11).

En ciertas modalidades, el agente es o comprende un ácido nucleico tal como ADN o ARN. En ciertas modalidades, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN y pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos pueden incluir uno o más nucleótidos no naturales. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos incluyen únicamente nucleótidos naturales. En algunas modalidades, el ácido nucleico se diseña para imitar un epítopo dentro de un polipéptido DV. En algunas modalidades, el ácido nucleico se diseña para imitar un epítopo conservado dentro de uno o más serotipos de DV. En algunas modalidades, el agente es o comprende uno o más oligonucleótidos . En algunas modalidades, el agente es o comprende uno o más oligonucleótidos que comprenden una estructura secundaria tal como bucle, horquilla, pliegue o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el agente es o comprende uno o más oligonucleótidos que comprenden una estructura ordenada superior (terciaria o cuaternaria). En algunas modalidades, el agente es o comprende un aptámero.

En algunas modalidades, una vacuna se puede diseñar para inducir producción de anticuerpos que se ha encontrado que no se encuentran en el paciente. En algunas modalidades, es deseable que las composiciones de vacuna comprendan antíenos que tengan una conformación nativa, que medien una respuesta protectora (por ejemplo, activación de complemento, neutralización de virus, etc.) y/o que puedan inducir una respuesta fuerte de anticuerpo. En algunas modalidades, una vacuna contiene un epítopo o imotopo del mismo a anticuerpos los cuales no son producidos de manera natural en un individuo. Por ejemplo, los mimotopos peptídicos sintéticos aislados con anticuerpos DV (por ejemplo, anticuerpos DV que reconocen serotipos múltiples) tienen el potencial de inducir una respuesta inmunitaria potente similar a la del anticuerpo utilizado en el aislamiento original de mimotopo. La administración de esta vacuna puede inducir al sistema inmunitario del paciente para iniciar a producir un conjunto de anticuerpos dirigidos contra el epítopo administrado. Se apreciará que los mimotopos (o epítopos) de acuerdo con la invención se pueden utilizar solos o combinados con proteínas recombinantes, virus DV inactivados, virus DV muertos y/o como una combinación de varios mimotopos diferentes.

En algunas modalidades, las vacunas a DV se pueden utilizar para inmunización activa (es decir, inmunización en donde los microbios, proteínas, peptidos, epítopos, mimotopos, etc. se administran a un sujeto). En algunas modalidades, se pueden utilizar vacunas para DV que pueden comprender cualquier agente que imite por lo menos un epítopo conformacional de la región de la cadena de DV de la glucoproteína de envoltura de DV. Por ejemplo, el agente puede ser un péptido, proteína, glucopéptido, glucoproteína, molécula pequeña, mimotopo, compuesto orgánico, lípido, sacárido, compuesto organometálico, compuesto inorgánico, etc. En algunas modalidades, los epítopos representados en una vacuna incluyen aquellos contra los cuales se dirigen anticuerpos que se sabe evitan la infección. En algunas modalidades, los epítopos representados en una vacuna de acuerdo con la invención incluyen aquellos que se conservan entre diferentes genotipos y/o subtipos del virus o entre diferentes cepas de virus. En algunas modalidades, los péptidos o proteínas que contienen epítopos definidos conformacional ente de la región de cadena A de DV se utilizan en formulaciones de una vacuna para evitar, retrasar el inicio de, tratar, disminuir síntomas de y/o reducir la gravedad de infección por DV. En algunas modalidades, los epítopos de la región de la cadena A de DV pueden ser epítopos lineales. En algunas modalidades, los epítopos del régimen de cadena A pueden ser una mezcla de epítopos lineales y conformacionales. En algunas modalidades, los epítopos de la región de la cadena A pueden ser epítopos conformacionales. En algunas modalidades, los epítopos peptídicos son de una longitud menor de 100 aminoácidos. En ciertas modalidades, los epítopos peptídicos son de una longitud de menos de 50, menos de 40, menos de 30, menos de 20 o menos de 10 aminoácidos. En algunas modalidades los péptidos que van a utilizarse en la formulación de una vacuna son fragmentos peptídicos de proteína de la región de la cadena A de DV.

Típicamente, se utiliza un péptido que se pliega de una manera similar a su pliegue tridimensional en la proteína de la región de la cadena A nativa y de esta manera se conserva la estructura tridimensional del epítopo conformacional.

Sistemas para identificar y/o caracterizar agentes que unen DV La presente invención proporciona una diversidad de sistemas para probar, caracterizar y/o identificar agentes de anticuerpo de DV. En algunas modalidades, el agente de anticuerpo DV que se proporciona se utiliza para identificar y/o caracterizar otros agentes que unen DV (por ejemplo, anticuerpos, polipéptidos, moléculas pequeñas, etc.).

En algunas modalidades, los agentes que unen DV proporcionados se caracterizan por tales sistemas y métodos que involucran poner en contacto el agente que une DV con uno o más sustratos candidatos, tales como regiones de polipéptidos de DV, N-glucanos sobre polipéptidos de DV, receptores de DV, receptores de DV sialilados y/o glucanos sobre receptores de DV sialilados.

En algunas modalidades, los agentes que unen DV (es decir, anticuerpos de reacción cruzada) se pueden probar, caracterizar y/o identificar utilizando enfoques computacionales. En algunas modalidades, un enfoque computacional involucra utilizar características fisicoquímicas comunes a interacciones proteína-proteína (por ejemplo, anticuerpo-antígeno) para predecir interacción proteína-proteína y mutaciones que mejoren la afinidad. La potencia de los anticuerpos, por ejemplo, producidos utilizando este enfoque en neutralización de DV se puede entonces predecir por diversos análisis conocidos en el ámbito (por ejemplo, prueba de neutralización de reducción de placa, ELISA análisis de hemaglutinación y Western blot).

En algunas modalidades, un agente que une DV y/o un sustrato candidato pueden estar libres en solución, fijados a un soporte y/o expresarse dentro y/o sobre la superficie de una célula. El sustrato candidato y/o los agentes se pueden marcar para de esta manera permitir la detección de unión. Ya sea el agente que une DV o el sustrato candidato es la especie marcada. Los formatos de unión competitivos se pueden realizar en los cuales una de las sustancias está marcada y uno puede medir la cantidad de etiqueta libre versus etiqueta unida para determinar el efecto sobre la unión.

En algunas modalidades, los análisis de unión involucran, por ejemplo, exponer un sustrato candidato a un agente que DV y detectar la unión entre el sustrato candidato y el agente. Un análisis de unión se puede llevar a cabo in vitro (por ejemplo, en un tubo candidato, que comprende sustancialmente solo los componentes mencionados; en extractos libres de células y/o en componentes sustancialmente purificados). De manera alternativa o adicional, los análisis de unión se pueden llevar a cabo in si tu y/o in vivo (por ejemplo, dentro de una célula, tejido, órgano y/u organismo; descrito con mayor detalle en lo siguiente).

En ciertas modalidades, por lo menos un agente que une DV se pone en contacto con por lo menos un sustrato candidato y se detecta un efecto. En algunas modalidades, por ejemplo, un agente que une DV se pone en contacto con un sustrato candidato, y la unión entre las dos entidades es monitoreada. En algunas modalidades, un análisis puede involucrar poner en contacto un sustrato candidato con una porción característica de un agente. La unión del agente DV al sustrato candidato se detecta. Se apreciará que fragmentos, porciones, homólogos, variantes y/o derivados de agentes que unen DV se pueden utilizar con la condición de que comprendan la capacidad de unir uno o más sustratos candidatos.

La unión de un agente DV al sustrato candidato se puede determinar por una diversidad de métodos bien conocidos en el ámbito. En algunas modalidades, las mediciones de unión se pueden llevar a cabo utilizando análisis SPR. En algunas modalidades, el análisis SPR se puede utilizar para medir parámetros de afinidad y cinética de unión de un agente que une DV. En algunas modalidades, los análisis que involucran agentes de DV unidos en fase sólida y la detección de sus interacciones con uno o más sustratos candidatos se pueden utilizar. De esta manera, un agente que une DV puede comprender un marcador detectable, tal como una marca radioactiva, fluorescente y/o luminiscente. Además, un sustrato candidato se puede acoplar a sustancias las cuales permiten la detección indirecta (por ejemplo, por medio de la utilización de una enzima la cual utiliza un sustrato cromogénico y/o por medio de unión de un anticuerpo detectable). Los cambios en la conformación de los agentes que unen DV como resultados de una interacción con un sustrato candidato se puede detectar, por ejemplo, por el cambio en la emisión del marcador detectable. De manera alternativa o adicional, los complejos de proteína unidos en fase sólida se pueden analizar por medio de espectrometría de masas.

En algunas modalidades, el agente que une DV puede estar no inmovilizado. En algunas modalidades, el componente no inmovilizado puede ser marcado (con, por ejemplo, una marca radioactiva, una etiqueta de epítopo, un conjugado enzima-anticuerpo, etc.). De manera alternativa o adicional, la unión se puede determinar por téenicas de detección inmunológicas. Por ejemplo, la mezcla de reacción se puede someter a Western blot y la mancha se sondea con un anticuerpo que detecta el componente no inmovilizado. De manera alternativa o adicional se puede utilizar la prueba de ELISA para analizar en búsqueda de unión. En algunas modalidades, la afinidad de unión de un agente DV a un sustrato candidato se puede determinar mediante la utilización de un análisis de ELISA indirecto de alto rendimiento.

En algunas modalidades, el análisis de la prueba de neutralización de reducción de foco (FRNT, por sus siglas en inglés) se puede utilizar para medir la actividad o potencia neutralizante de un agente que une DV. En algunas modalidades, se puede utilizar un hospedador animal para medir actividad anti-DV in vivo.

En ciertas modalidades, las células pueden ser analizadas directamente para determinar unión entre agentes de DV y sustratos candidatos. Las téenicas inmunohistoquímicas, técnicas con focales y/u otras técnicas para determinar unión son bien conocidas por aquellos expertos en el ámbito. Se pueden utilizar diversas líneas de células para estos análisis de cribado que incluyen células manipuladas específicamente para este propósito. Los ejemplos de células utilizadas en los análisis de cribado incluyen células de mamífero, células micóticas, células bacterianas o células virales. Una célula puede ser una célula estimulada tal como una célula estimulada con un factor de crecimiento. Una persona experta en el ámbito entenderá que la invención que aquí se describe contempla una amplia variedad de análisis in si tu para medir la disponibilidad de agentes que se unen a DV para unirse a sustratos candidatos.

En base en el análisis, se puede requerir célula y/o cultivo de tejido. Se puede examinar una célula utilizando cualquiera de diversos análisis fisiológicos diferentes. De modo alternativo o adicional, se puede realizar análisis molecular que incluye, pero que no se limita a Western blot para monitorear expresión de proteínas y/o para probar interacciones proteína/proteína; espectrometría de masas para monitorear otras modificaciones químicas; etc.

En algunas modalidades, los análisis de unión que aquí se describen se pueden realizar utilizando una gama de concentraciones de agentes que unen DV y/o sustratos candidatos. En algunas modalidades, los análisis de unión que aquí se describen se utilizan para determinar la capacidad de un sustrato candidato para unirse a un agente de DV sobre una gama de concentraciones de anticuerpo (por ejemplo, mayor que aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 100 pg/ml, aproximadamente 50 pg/ml, aproximadamente 40 pg/ml, aproximadamente 30 pg/ml, aproximadamente 20 pg/ml, aproximadamente 10 pg/ml, aproximadamente 5 m9/p\1, aproximadamente 4 m9/p»1, aproximadamente 3 m9/th1, aproximadamente 2 m9/th1, aproximadamente 1.75 pg/ml, aproximadamente 1.5 m9/pi1, aproximadamente 1.25 pg/ml, aproximadamente 1.0 pg/ml, aproximadamente 0.9 pg/ml, aproximadamente 0.8 pg/ml, aproximadamente 0.7 pg/ml, aproximadamente 0.6 pg/ml, aproximadamente 0.5 pg/ml, aproximadamente 0.4 pg/ml, aproximadamente 0.3 pg/ml, aproximadamente 0.2 m9/ih1, aproximadamente 0.1 pg/ml, aproximadamente 0.05 m9/ih1, aproximadamente 0.01 g/ml y/o menos de aproximadamente 0.01 g/ml).

En algunas modalidades, cualquiera de los estudios de unión descritos en la presente se puede ejecutar en una manera de alto rendimiento. Utilizando análisis de alto rendimiento, es posible cribar hasta varios miles de agentes en un solo día. En algunas modalidades, cada pozo de una placa de microtitulación se puede utilizar para correr un análisis separado contra un sustrato candidato seleccionado o, si la concentración y/o los efectos de tiempo de incubación van a ser observados, cada 5 a 10 pozos pueden probar un sustrato candidato único. De esta manera, una placa de microtitulación estándar única puede analizar hasta 96 interacciones de unión entre agentes y sustratos candidatos; si se utilizan placas de 1536 pozos, entonces una placa única puede analizar hasta 1536 interacciones de unión entre agentes y sustratos candidatos; y así, sucesivamente. Es posible analizar muchas placas al día. Por ejemplo, hasta aproximadamente 6,000, aproximadamente 20,000, aproximadamente 50,000 o más de aproximadamente 100,000 análisis de cribado se pueden realizar sobre interacciones de unión entre anticuerpos y sustratos candidatos utilizando sistemas de alto rendimiento de acuerdo con la presente invención.

En algunas modalidades, estos métodos utilizan un hospedador animal. Como se utiliza en la presente, un "hospedador animal" incluye cualquier modelo animal adecuado para investigación de influenza. Por ejemplo, los hospedadores animales adecuados para la invención pueden ser hospedadores de mamíferos que incluyen primates, hurones, gatos, perros, vacas, caballos, roedores tales como ratones, hámster, conejos y ratas. En ciertas modalidades, un hospedador animal utilizado para la invención es un hurón. En particular, en algunas modalidades, un hospedador animal previamente no ha sido expuesto a exposición viral o infección antes de la administración de un agente (opcionalmente, en una composición de la invención). En algunas modalidades, el hospedador animal se inocula, se infecta o se expone de alguna otra manera a virus antes de o de modo concurrente con la administración de un agente. Un hospedador animal utilizado en la práctica de la presente invención se puede inocular con, infectar con o exponer de alguna otra manera a virus por cualquier método conocido en el ámbito. En algunas modalidades, un hospedador animal puede ser inoculado, infectado con, o expuesto a virus intranasalmente.

Los animales previamente no expuestos y/o inoculados se pueden utilizar para cualquiera de una diversidad de estudios. Por ejemplo, estos modelos de animales se pueden utilizar para estudios de transmisión de virus como se conoce en el ámbito. Se contempla que el uso de hurones en estudios de transmisión de virus puede servir como un elemento de pronóstico confiable para transmisión de virus en humanos. Los estudios de transmisión de virus se pueden utilizar para probar agentes. Por ejemplo, los agentes que unen DV se pueden administrar a un hospedador animal adecuado, antes, durante o después de los estudios de transmisión de virus con el fin de determinar la eficacia del agente en bloquear la unión del virus y/o la infectividad en un hospedador animal. Utilizando información recopilada de los estudios de transmisión de virus en un hospedador animal, uno puede predecir la eficacia de un agente para bloquear la unión de virus y/o infectividad en un hospedador humano. Composiciones farmacéuticas La presente invención proporciona composiciones que comprenden uno o más agentes de anticuerpo que se proporcionan. En algunas modalidades, la presente invención proporciona por lo menos un anticuerpo y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas opcionalmente pueden comprender y/o ser administradas en combinación con una o más sustancias adicionalmente terapéuticamente activas. En algunas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas que son útiles en medicina. En algunas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas que son útiles como agentes profilácticos (es decir, vacunas) en el tratamiento o prevención de infección por DV o de ramificaciones negativas asociadas o correlacionadas con infección por DV. En algunas modalidades se proporcionan composiciones farmacéuticas que son útiles en aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, en individuos que padecen de o que son susceptibles a infección por DV. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se formulan para administración a humanos.

Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que aquí se proporcionan se pueden suministrar en una forma inyectable estéril (por ejemplo, una forma que es adecuada para inyección subcutánea o infusión intravenosa) . Por ejemplo, en algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se proporcionan en una forma de dosificación líquida que es adecuada para inyección. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se proporcionan como polvos (por ejemplo, liofilizadas y/o esterilizadas) opcionalmente bajo vacío, las cuales se reconstituyen con un diluyente acuoso (por ejemplo, agua, amortiguador, solución salina, etc.) antes de su inyección. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas se diluyen y/o reconstituyen en agua, solución de cloruro de sodio, solución de acetato de sodio, solución de alcohol bencílico, solución salina amortiguada con fosfato, etc. En algunas modalidades, el polvo se debe mezclar ligeramente con el diluyente acuoso (por ejemplo, sin agitación).

En algunas modalidades se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, conservadores, diluyente inerte, agente de dispersión, agente tensioactivo y/o emulsificante, agente amortiguador, etc.). En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más conservadores. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas no comprenden conservadores.

En algunas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas en forma que pueden ser refrigeradas y/o congeladas. En algunas modalidades, se proporcionan composiciones farmacéuticas en una forma que no pueden ser refrigeradas y/o congeladas. En algunas modalidades, las soluciones y/o las formas de dosificación líquida reconstituidas se pueden almacenar durante cierto período de tiempo después de la reconstitución (por ejemplo, 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 días, 5 días, 7 días, 10 días, 2 semanas, un mes, dos meses o por períodos más prolongados).

Las formas de dosificación líquidas y/o las soluciones reconstituidas pueden comprender materia particulada y/o pueden cambiar de color antes de su administración. En algunas modalidades, no se debe utilizar una solución si presenta cambio de coloración o si presenta turbidez y/o si permanece material particulado después de la filtración.

Las formulaciones de las composiciones farmacéuticas que aquí se describen se pueden preparar por cualquier método conocido o desarrollado en lo siguiente en el ámbito de farmacología. En algunas modalidades, los métodos de preparación incluyen una etapa de asociar el ingrediente activo con uno o más excipientes y/o uno o más ingredientes accesorios adicionales, y después, si es necesario y/o deseable, conformar y/o empacar el producto en una unidad de dosis única o múltiple deseada.

Una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede preparar, empacar y/o vender a granel, en una dosis unitaria única y/o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Como se utiliza en la presente, una "dosis unitaria" es una cantidad definida de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo generalmente es igual a una dosis la cual se podría administrar a un sujeto y/o una fracción conveniente de esta dosis tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de esta dosis.

Las cantidades relativas de ingrediente activo, excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden variar en base en la identidad, tamaño y/o condición del sujeto tratado y/o dependiendo de la vía mediante la cual se va a administrar la composición . A modo de ej emplo, la composición puede comprender entre 0 . 1% y 100% (p/p) de ingrediente activo .

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención adicionalmente pueden comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable el cual , como se utiliza en la presente , puede ser o conprender disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsif icantes, conservadores, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada . Remington ' s The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, (Lippincott , Williams & Wilkins , Baltimore, MD, 2006 ) describe diversos excipientes utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y téenicas conocidas para la preparación de los mismos . Excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados , por ejemplo, al producir cualquier efecto biológico indeseable o al interactuar de alguna otra manera de un modo perjudicial con cualquier otro componente de la composición farmacéutica, su uso se contempla para que se encuentre dentro del alcance de esta invención.

Vacunas En algunas modalidades, la presente invención proporciona composiciones de vacuna para uso y/o para examen en inmunización pasiva (es decir, inmunización en donde los anticuerpos se administran a un sujeto) de un sujeto quien padece de, o es susceptible-de infección por DV. En algunas modalidades, la inmunización pasiva se produce cuando los anticuerpos se transfieren de la madre al feto durante el embarazo. En algunas modalidades, la inmunización pasiva incluye la administración de agentes de anticuerpo directamente a un individuo (por ejemplo, mediante inyección, por vía oral, nasal, etc.).

En algunas modalidades, las aplicaciones profilácticas pueden incluir administración de vacunas. En algunas modalidades, la vacunación se personaliza al paciente individual. Por ejemplo, como se describe más adelante, se puede recolectar suero de un paciente y se puede probar para determinar la presencia de DV y en algunas modalidades para uno o más serotipos particulares de DV. En algunas modalidades, los receptores apropiados de las vacunas que se proporcionan son individuos que padecen de o que son susceptibles de infección con uno o más serotipos de DV unidos y/o neutralizados por un anticuerpo que se proporciona.

En algunas modalidades, se administra una vacuna por vía oral, intranasal, subcutánea, intramuscular, intradérmica o por medio de cualquier otra vía de administración apropiada médicamente. Se apreciará que cada día de administración puede requerir formulaciones o mecanismos de suministro distintos y que estos parámetros variables están contemplados como dentro del alcance de la presente invención. En algunas modalidades, la vía de administración y/o la formulación se puede determinar, en parte, por la edad y/o condición del sujeto. Por ejemplo, la administración de una vacuna a un bebé se puede realizar por medio de inyección en la cara anterolateral del muslo, debido a la gran masa muscular. En algunas modalidades, cuando el sujeto es un niño o un adulto, la administración de una vacuna al músculo deltoide se puede preferir. Se entiende que el buen juicio médico debe utilizarse para determinar la vía y/o la formulación apropiados para administración a un sujeto particular.

En algunas modalidades, una composición de vacuna comprende por lo menos un adyuvante. Se puede utilizar cualquier adyuvante de acuerdo con la presente invención. Se conocen una gran cantidad de adyuvantes; un compendio útil de muchos de estos compuestos se ha preparado por el National Institutes of Health y se puede encontrar en www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf; véase también Allison (1998, Dev. Biol. Stand., 92:3-11; incorporado en la presente como referencia), Unkeless et al . (1998, Annu. Rev. Immunol., 6:251-281; incorporado en la presente como referencia), y Phillips et al . (1992, Vaccine, 10:151-158; incorporado en la presente como referencia).

Cientos de adyuvantes diferentes se conocen en el ámbito y se pueden utilizar en la práctica de la presente invención. Los adyuvantes ejemplares que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a citocinas, adyuvantes de tipo de gel (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, etc.); adyuvantes microbianos (por ejemplo, secuencias de ADN inmunomoduladoras que incluyen motivos de CPG; endotoxinas tales como monofosforilo lípido A; exotoxinas tales como toxina de cólera; toxina termolábil de E. coli y toxina de pertussis; dipéptido de muramilo; etc.); adyuvantes de emulsión de aceite y basados en emulsificante (por ejemplo, adyuvante de Freund, MF59 [Novartis], SAF, etc.); adyuvantes particulados (por ejemplo, liposomas, microesferas biodegradables, saponinas, etc.); adyuvantes sintéticos (por ejemplo, copolímeros de bloque no iónicos, análogos de péptido de muramilo, polifosfazeno, polinucleótidos sintéticos, etc.); y/o combinaciones de los mismos. Otros adyuvantes ejemplares incluyen algunos polímeros (por ejemplo, polifosfazenos; descritos en la patente U.S. 5,500,161, el cual se incorpora en la presente como referencia), Q57, QS21, escualeno, tetraclorodecaóxido, etc. Los excipientes farmacéuticament aceptables han sido descritos previamente con detalle adicional en la sección anterior intitulada "Composiciones farmacéuticas".

Tratamiento combinado Se apreciará que los agentes de anticuerpo para DV de acuerdo con la presente invención y/o las composiciones farmacéuticas de los mismos se pueden utilizar en tratamientos combinados. Mediante la frase "en combinación con" no se pretende implicar que los agentes deban ser administrados al mismo tiempo y/o formulados para suministro juntos, aunque estos métodos de suministro están dentro del alcance de la invención. Las composiciones se pueden administrar de modo concurrente con, antes de o subsecuente a uno o más procedimientos terapéuticos o médicos deseados adicionales. Se apreciará que los agentes terapéuticamente activos en combinación se pueden administrar juntos en una composición única o se pueden administrar por separado en composiciones diferentes. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o durante un protocolo de tiempo determinado para ése agente.

La combinación particular de tratamientos (por ejemplo, sustancias terapéuticas o procedimientos) para utilizar en un régimen de combinación tomará en consideración la compatibilidad de las sustancias terapéuticas deseadas y/o los procedimientos y el efecto terapéutico deseado que se va a obtener. También se apreciará que las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden utilizar en tratamientos combinados (por ejemplo, tratamientos de vacuna en combinación), esto es, las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de manera concurrente con, antes de o subsecuente a uno o más procedimientos terapéuticos y/o de vacunación deseados adicionales.

Las cantidades terapéuticamente eficaces de agentes de anticuerpo de acuerdo con la invención combinados con para uso en combinación con una composición farmacéutica proporcionada y por lo menos otro ingrediente activo adicional. En algunas modalidades, un ingrediente activo es un agente antiviral tal como, pero sin limitarse a interferones (por ejemplo, interferón a-2b, interferón-g, etc.), anticuerpos monoclanales anti-DV, anticuerpos policlonales anti-DV, inhibidores de ARN polimerasa, inhibidores de proteasa, inhibidores de helicasa, inmunomoduladores, compuestos antisentido, ARN de interferencia cortos, ARN de horquilla cortos, micro ARN, aptámeros de ARN, ribozimas y combinaciones de los mismos. La combinación particular de tratamientos para utilizar en un régimen de combinación generalmente tomará en consideración la compatibilidad de las sustancias terapéuticas y/o procedimientos deseados y el efecto terapéutico deseado que se va a obtener. También se apreciará que los tratamientos y/o vacunas utilizados pueden alcanzar un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un antígeno de la invención se puede administrar de modo concurrente con otra vacuna de DV) o pueden alcanzar efectos diferentes.

Se apreciará que los tratamientos utilizados pueden alcanzar un efecto deseado para el mismo propósito (por ejemplo, anticuerpos contra DV útiles para tratar, evitar y/o retrasar el inicio de infección por DV se pueden administrar de modo concurrente con otro agente útil para tratamiento, para evitar y/o retrasar el inicio de infección por DV) o pueden obtener efectos diferentes (por ejemplo, control de cualquiera de estos efectos adversos). La invención abarca el suministro de composiciones farmacéuticas en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir y/o modificar su metabolismo, inhibir su excreción y/o modificar su distribución dentro del cuerpo.

En algunas modalidades, los agentes utilizados en combinación se utilizarán en niveles que no excedan los niveles en los cuales son utilizados individualmente. En algunas modalidades, los niveles utilizados en combinación serán menores que aquellos utilizados individualmente.

En algunas modalidades, los anticuerpos contra DV de acuerdo con la invención se pueden administrar con interferón, con inhibidores de ARN polimerasa o con ambos, con interferón e inhibidores de ARN polimerasa.

En algunas modalidades, el tratamiento combinado puede involucrar las administraciones de una pluralidad de agentes de anticuerpo dirigidos a un epítopo único (por ejemplo, un epítopo conformacional único). En algunas modalidades, el tratamiento combinado puede comprender una pluralidad de agentes de anticuerpo que reconocen epítopos distintos (por ejemplo, en la misma proteína de envoltura viral o sobre proteína de envoltura viral diferentes, en donde los epítopos pueden ser o no conformacionales), por ejemplo, para interferir simultáneamente con mecanismos múltiples en el proceso infeccioso.

En ciertas modalidades, las composiciones de acuerdo con la invención comprenden exactamente un agente de anticuerpo para la región de la cadena A. En ciertas modalidades, las composiciones incluyen y/o utilizan tratamiento combinado exactamente de dos agentes de anticuerpo de la región de cadena A de DV.

Se apreciará por una persona experta en el ámbito que cualquier permutación o combinación de agentes de anticuerpo de acuerdo con la presente invención se pueden combinar con cualquier otro agente de anticuerpo diferente para formular composiciones y/o regímenes de tratamiento combinados que comprenden una pluralidad de agentes de anticuerpo diferentes.

Metodos de administración Los agentes de anticuerpo para DV de acuerdo con la invención y las composiciones farmacéuticas de los mismos de acuerdo con la presente invención se pueden administrar de acuerdo con cualquier vía y régimen apropiado. En algunas modalidades, una vía o régimen es uno que se ha correlacionado con un beneficio terapéutico positivo. En algunas modalidades, una vía o régimen es uno que ha sido aprobado por la FDA y/o la EP.

En algunas modalidades, la cantidad exacta administrada puede variar de un sujeto a otro, dependiendo de uno o más factores como es bien conocido en el ámbito médico. Estos factores pueden incluir, por ejemplo, una o más de especie, edad, condición general del sujeto, gravedad de la infección, composición particular, su modo de administración, su modo de actividad, el trastorno que está siendo tratado y la gravedad del trastorno; la actividad del agente de anticuerpo DV específico utilizado; la composición farmacéutica específica administrada; la vida media de la composición después de la administración; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; la hora de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del compuesto específico utilizado; la duración del tratamiento; fármacos utilizados en combinación o de modo coincidente con el compuesto específico utilizado y similares. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. No obstante, se entenderá que el uso diario total de las composiciones de la presente invención se decidirá por el médico que atienda dentro del alcance del buen juicio médico.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por cualquier vía, como se apreciará por aquellos expertos en el ámbito. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran por vía oral (PO), intravenosa (IV), intramuscular (IM), intraarterial, intramedular, intratecal, subcutánea (SQ), intraventricular, transdérmica, intradérmica, intradérmica, rectal (PR), vaginal, intraperitoneal (IP), intragástrica (IG), tópica (por ejemplo, por polvos, ungüentos, cremas, geles, lociones y/o gotas), por mucosa, intranasal, bucal, enteral, vitrea, sublingual; por instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o por inhalación y/o como aspersión oral, aspersión nasal y/o aerosol y/o a través de un catéter en la vena porta.

En modalidades específicas, los agentes de anticuerpo para DV de acuerdo con la presente invención y/o las composiciones farmacéuticas de los mismos se pueden administrar por vía intravenosa, por ejemplo, mediante infusión intravenosa. En modalidades, específicas, los agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la presente invención y/o las composiciones farmacéuticas de los mismos se pueden administrar por inyección intramuscular.

En modalidades específicas, los agentes de anticuerpo para DV de acuerdo con la presente invención y/o las composiciones farmacéuticas de los mismos se pueden administrar por inyección subcutánea. En modalidades específicas, los agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la presente invención y/o las composiciones farmacéuticas de los mismos se pueden administrar por medio de un catéter en la vena porta. No obstante, la invención abarca el suministro de agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la presente invención y/o composiciones farmacéuticas de los mismos por cualquier vía apropiada tomando en consideración los avances probables en la ciencia del suministro de fármacos.

En ciertas modalidades, los agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la presente invención y/o las composiciones farmacéuticas de los mismos de acuerdo con la invención se pueden administrar a niveles de dosificación suficientes para suministrar desde aproximadamente 0.001 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, desde aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, desde aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 40 mg/kg, desde aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, desde aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o desde aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg del peso corporal del sujeto al día para obtener el efecto terapéutico deseado. La dosificación deseada se puede suministrar más de tres veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, en días alternados, cada tercer día, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas, cada dos meses, cada seis meses o incluso cada doce meses. En ciertas modalidades, la dosificación deseada se puede suministrar utilizando administraciones múltiples (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones).

Aplicaciones profilácticas En algunas modalidades, los agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la invención se pueden utilizar para aplicaciones profilácticas. En algunas modalidades, las aplicaciones profilácticas involucran sistemas y métodos para evitar, inhibir el progreso de y/o retrasar el inicio de infección por DV y/o cualquier otra condición asociada a DV adicional, en individuos susceptibles de y/o que presenten síntomas de infección por DV. En algunas modalidades, las aplicaciones profilácticas involucran sistemas y métodos para evitar, inhibir el progreso de y/o retrasar el inicio de infección del cerebro. En algunas modalidades, las aplicaciones profilácticas involucran sistemas y métodos para evitar, inhibir el progreso de y/o retrasar el deterioro de órganos vitales (por ejemplo, hígado).

Aplicaciones de Diagnóstico En algunas modalidades, los agentes de anticuerpo DV de acuerdo con la invención se utilizan para aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, en virtud de la variedad de perfiles de unión de agentes de anticuerpo de DV, los análisis de diagnóstico se pueden utilizar los cuales detectarán una pluralidad de serotipos de DV, de manera que proporcionen un agente de anticuerpo de DV amplio mientras que al mismo tiempo es capaz de diseccionar serotipos individuales mediante análisis de sustracción.

Para propósitos de diagnóstico, los agentes de anticuerpo se pueden utilizar en una amplia variedad de formatos para detectar la región de cadena A de la glucoproteína de envoltura, discernir serotipos de DV, detectar viriones y anticuerpos (véase, por ejemplo, la patente U.S. Número 5,695,390; incorporada en la presente como referencia). Los agentes de anticuerpos se pueden utilizar individualmente en o en combinación con otros anticuerpos del grupo objeto u otros anticuerpos o con lectinas las cuales se unen a los grupos glucosilo presentes en las proteínas de envoltura de DV Para propósitos de diagnóstico se pueden utilizar una amplia variedad de marcas las cuales para la mayor parte han sido mencionadas previamente. Estas incluyen, pero no se limitan a fluoróforos, porciones quimioluminiscentes, radioisótopos, enzimas, partículas (por ejemplo, partículas de carbón coloidal, partículas de oro, partículas de látex, etc.), ligandos para los cuales existen receptores de alta afinidad y proetiquetas las cuales pueden ser activadas para proporcionar una señal detectable.

En algunas modalidades, una superficie es recubierta con una proteína la cual puede unirse a antígenos de DV como proteína libre (por ejemplo, proteínas circulantes) o como parte de un virión intacto o parcialmente intacto. Uno puede utilizar anticuerpos de la presente invención los cuales se unen a múltiples serotipos de DV o a lectinas (por ejemplo, la lectina de Galanthus nivalis; "GNA", por sus siglas en inglés).

En algunas modalidades, los análisis pueden involucrar poner en contacto una superficie con un medio, el cual puede contener una o varias proteínas libres o asociadas a DV, en donde el medio puede ser la muestra o una solución de la región de la cadena A conocida de uno o más serotipos. Después de incubación y lavado para eliminar proteína unida de manera no específica, el análisis puede llevarse a cabo de diversas maneras dependiendo de lo que se está analizando. Cuando una muestra de sangre sospechosa de seropositiva es lo que se analiza, la muestra se puede aplicar a la capa de la proteína de la región de la cadena A, se puede incubar y lavar y se puede determinar la presencia de anticuerpos humanos unidos a la capa de proteína. Uno puede utilizar anticuerpos humanos a marcados (diferentes de aquellos contra el isotipo de los anticuerpos objetivo, en donde los anticuerpos objetivo han sido utilizados inicialmente). En análisis por anticuerpos en sujetos seropositivos, los anticuerpos objeto se pueden utilizar como controles con el mismo reactivo utilizado para detectar anticuerpos anti-DV humanos en los sueros de estos sujetos. La especificidad de los anticuerpos en la muestra se puede confirmar mediante la utilización de los anticuerpos objeto, los cuales están marcados de modo diferencial de los anticuerpos anti-humanos y determinar si están bloqueados por los anticuerpos en la muestra.

Cuando la muestra se analiza para la proteína de la región de la cadena A de DV, la detección utiliza anticuerpos del objeto marcados, la selección depende de si uno está interesado en determinación del genotipo o detección de la proteína de la región de la cadena A. Después de eliminar por lavado anticuerpo unido de manera no específica, la presencia de los anticuerpos marcados se determina al detectar la presencia de la marca de acuerdo con téenicas conocidas. De manera alternativa o adicional, cuando los anticuerpos objeto se unen a una superficie, se puede utilizar una lectina marcada para la región de la cadena A para detectar la presencia de la proteína de la región de la cadena A.

Los agentes de anticuerpo de acuerdo con la invención se pueden utilizar para medir la reactividad de otros anticuerpos, que incluye anticuerpos en sueros, anticuerpos monoclonales, anticuerpos expresados como resultado de manipulación genética, etc. En algunas modalidades, se utilizan viriones intactos. En algunas modalidades, se utilizan proteínas de envoltura conservadas conformacionalmente. Para captura de virión véase, por ejemplo, Kimura et al., 1998, J. Med. Virology, 56: 25-32; Morita et al., 1996, Hapato-Gastroenterology, 43: 582-585; Sata et al., 1993, Virology, 196: 354-357; e Hijikata et al., 1993, J. Virol., 67: 1953-1958; la totalidad de las cuales se incorporan en la presente como referencia. Un protocolo involucra etapas de recubrimiento de un soporte sólido con una lectina (por ejemplo, GNA) y después poner en contacto la superficie con un medio (por ejemplo, suero de un paciente seropositivo) que comprende viriones intactos de DV. Habitualmente se evitan aditivos los cuales pueden destruir los viriones (por ejemplo, detergentes). Después de incubar el medio y lavar para eliminar los componentes unidos de manera no específica del medio, los viriones se pueden poner en contacto con anticuerpos de acuerdo con la invención y anticuerpos de la muestra. Esto se puede llevar a cabo de manera concurrente o consecutiva, en donde la muestra se agrega primero. Se utiliza una cantidad del anticuerpo del sujeto la cual es sensible al desplazamiento por otro anticuerpo. Tal cantidad se puede determinar empíricamente, y uno puede desear utilizar cantidades diferentes del anticuerpo del sujeto en una serie de pruebas. Al conocer la señal la cual se obtiene en ausencia y presencia de la muestra, uno puede determinar la reactividad o afinidad de unión de los anticuerpos en la muestra. Se pueden utilizar diversas téenicas para determinar la cantidad de un anticuerpo objeto unido a los viriones. Cuando los anticuerpos objeto se enmarcan, por ejemplo, con biotina o digoxigenina, estreptavidina o anti-digoxigenina marcada con un fluoróforo o enzima cuyo sustrato produce una señal detectable puede servir para determinar la cantidad de anticuerpos objeto.

Los agentes de anticuerpo objeto marcados se pueden utilizar en el análisis para la presencia de DV a partir del material de biopsia. El anticuerpo marcado se puede incubar con material de biopsia inmovilizado, tal como un corte de hígado, con una solución de uno o más de los anticuerpos marcados objeto. Después de eliminar por lavado anticuerpos unidos de manera no específica, la presencia de los anticuerpos unidos a la célula del tejido sometido a biopsia se puede detectar de acuerdo con la naturaleza de la marca.

En algunas modalidades, los agentes de anticuerpo de DV de acuerdo con la invención se pueden utilizar para identificar receptores de DV. Los expertos en el ámbito apreciarán que existen una multitud de maneras en las que se puede llevar a cabo esto (Sambrook J., Fritsch E. and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Coid Spring Harbor Press, Coid Spring Harbor, NY, 1989; y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, 1987; ambos los cuales se incorporan en la presente como referencia). Típicamente, la proteína y los receptores peptídicos se pueden identificar al determinar si un anticuerpo para la región de la cadena A de la glucoproteína de envoltura DV puede inhibir la unión de viriones DV a una célula susceptible de infección por DV. De esta manera, los receptores para las proteínas y péptidos de la región de la cadena A de DV se pueden identificar de esta manera. Una célula susceptible se puede incubar en presencia de DV y anticuerpo anti-región de cadena A de DV, y se puede utilizar un análisis de unión de célula para determinar si la unión disminuye en presencia del anticuerpo.

Las células que expresan receptores putativos para DV y/o bibliotecas de receptores putativos para DV se pueden cribar para determinar sus capacidades para unir DV. Por ejemplo, células que expresan un receptor DV putativo (por ejemplo, un receptor para la región de la cadena A de DV) se pueden poner en contacto con una proteína o péptido de DV en presencia de un anticuerpo durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la unión de la proteína o péptido de DV a un receptor putativo sobre la superficie de la célula. De manera alternativa o adicional, las proteínas de DV, los péptidos o viriones se pueden preincubar con anticuerpo antes de poner en contacto el receptor putativo sobre la superficie de la célula. La unión se puede detectar por cualquier medio conocido en el ámbito, por ejemplo, citometría de flujo, etc. (véase Ausubel et al. o Sambrook et al., supra). Una disminución a la unión a la superficie de la célula en presencia del anticuerpo en comparación con la unión en ausencia de la célula, en ausencia del anticuerpo, indica la identificación de un receptor de DV.

En algunas modalidades, los métodos de identificación de receptores de DV incluyen el uso de soportes sólidos tales como esferas, columnas y similares. Por ejemplo, los receptores para proteínas y péptidos de DV (por ejemplo, proteínas de la región de la cadena A y/o fragmentos de las mismas) y/o los viriones de DV se pueden identificar al unir un anticuerpo de DV a un soporte sólido y después poner en contacto el anticuerpo con una proteína o péptido de DV durante un tiempo suficiente para que la proteína o péptido de DV se una al anticuerpo. Esto proporciona un ligando de proteína de DV para los receptores putativos de DV que se pueden poner en contacto con el complejo anticuerpo: ligando sobre el soporte sólido durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para permitir la unión de un receptor a la proteína o péptido de DV. Las proteínas se pueden expresar a partir de una biblioteca o se pueden proporcionar como un extracto celular de preparación de proteína purificada a partir de células naturales o recombinantes. Una vez que se han formado los complejos de unión específicos entre el péptido de proteína DV, las proteínas o péptidos de DV no unidos, por ejemplo, proteínas o péptidos de biblioteca que no se unen de modo específico a las proteínas o péptidos de DV, son removidos, por ejemplo, por etapas de lavado estándar. Las proteínas unidas después se eluyen e identifican, por ejemplo, por electroforesis en gel.

Kits La invención proporciona una diversidad de kits para llevar de cabo de manera conveniente y/o eficaz los métodos de acuerdo con la presente invención. Los kits típicamente comprenden uno o más agentes de anticuerpos de Dv de acuerdo con la invención. En algunas modalidades los kits comprenden una colección de diferentes agentes de anticuerpo de DV para ser utilizados para diferentes propósitos (por ejemplo, diagnóstico, tratamiento y/o profilaxis). Típicamente los kits comprenderán cantidades suficientes de agentes de anticuerpo de DV para permitir a un usuario realizar administraciones múltiples a uno o varios sujetos y/o para realizar experimentos múltiples. En algunas modalidades, se proporcionan kits con, o que incluyen uno o más agentes de anticuerpo de DV que han sido especificados por el comprador.

En ciertas modalidades, los kits para uso de acuerdo con la presente invención pueden incluir una o más muestras de referencia; instrucciones (por ejemplo, para procesamiento de muestras, para realizar pruebas, para interpretar resultados, para solubilizar agentes de anticuerpo de DV, para almacenamiento de agentes de anticuerpo de DV, etc.); amortiguadores y/u otros reactivos necesarios para realizar pruebas. En ciertas modalidades los kits pueden comprender conjuntos de anticuerpos. Otros componentes de los kits pueden incluir célula, medio de cultivo celular, tejido y/o medio de cultivo de tejido.

Los kits pueden comprender instrucciones para uso. Por ejemplo, las instrucciones pueden informar al usuario del procedimiento apropiado por el cual preparar una composición farmacéutica que comprende agentes de anticuerpo de DV y/o el procedimiento adecuado para administrar composiciones farmacéuticas o un sujeto.

En algunas modalidades, los kits incluyen varias dosificaciones unitarias de una coaposición farmacéutica que conprende agentes de anticuerpo de DV. Se puede proporcionar un auxiliar de memoria, por ejenplo, en forma de números, letras y/u otras marcas y/o con un inserto de calendario, que designe los días/horas en el protocolo de tratamiento en los cuales se puede administrar las dosificaciones. Las dosificaciones placebo y/o los suplementos de calcio en la dieta, ya sea en una forma similar o distinta de las dosificaciones de las composiciones farmacéuticas se pueden incluir para proporcionar un kit en el cual una dosificación es injerida cada día.

Los kits pueden comprender uno o más depósitos o recipientes de manera que algunos de los componentes o reactivos individuales pueden ser alojados por separado. Los kits pueden comprender un medio para guardar los recipientes individuales en un confinamiento relativamente cerrado para venta comercial, por ejemplo, una caja de plástico, en la cual se pueden incluir instrucciones, materiales de empacado tales como espuma de estireno, etc.

En algunas modalidades, los kits se utilizan en el tratamiento, diagnóstico y/o profilaxis de un sujeto que padece de y/o que es susceptible a infección por DV. En algunas modalidades, estos kits comprenden: (i) por lo menos un agente de anticuerpos de DV; (ii) una jeringa, aguja, aplicador, etc. para administración de por lo menos un agente de anticuerpo de DV a un sujeto; y (iii) instrucciones para uso.

En algunas modalidades, los kits se utilizan en el tratamiento, diagnóstico y/o profilaxis de un sujeto que padece de y/o que es susceptible de infección por DV. En algunas modalidades, los kits comprenden: (i) por lo menos un agente de anticuerpo de DV que se proporciona como un polvo liofilizado; y (ii) un diluyente para reconstituir el polvo liofilizado. Estos kits opcionalmente pueden comprender una jeringa, aguja, aplicador, etc. para administración de por lo menos un agente de anticuerpo de DV a un sujeto; y/o instrucciones para uso.

La presente invención proporciona kits que contienen reactivos para la generación de vacunas que comprenden por lo menos un agente de anticuerpo de DV. En algunas modalidades, estos kits pueden incluir células que expresan anticuerpos de DV, porciones características de los mismos y/o porciones biológicamente activa de los mismos; (ii) medio para hacer crecer las células; y (iii) columnas, resinas, amortiguadores, tubos u otras herramientas útiles para purificación de anticuerpo. En algunas modalidades, estos kits pueden incluir: (i) plásmidos que contienen nucleótidos que codifican para anticuerpos de DV, porciones características de los mismos y/o porciones biológicamente activas de los mismos; (ii) células capaces de ser transformadas con los plásmidos, tales como líneas de células de mamífero que incluyen pero que no se limitan a líneas de células Vero y MDCK; (iii) medios para hacer crecer las células; (iv) plásmidos de expresión que no contienen nucleótidos que codifiquen para anticuerpos de DV, como controles negativos; (v) columnas, resinas, amortiguadores, tubos y otras herramientas útiles para purificación de anticuerpos; y (vi) instrucciones para uso.

En algunas modalidades se utilizan kits para detectar la presencia de Dv en una o más muestras. Estas muestras pueden ser muestras patológicas que incluyen pero que no se limitan a sangre, suero/plasma, células mononucleares de sangre periférica/linfocitos de sangre periférica (PBMC/OBL, por sus siglas en inglés), esputo, orina, heces, isopos frotados en la garganta, isopos protados en lesiones dérmicas, líquido cefalorraquídeo, frotis cervicales, muestras de pus, matrices de alimentos y tejidos de diversas partes del cuerpo tal como cerebro, bazo e hígado. Estas muestras pueden ser muestras ambientales que incluyen pero que no se limitan a suelo, agua y flora. Otras muestras que no se han enumerado también son aplicables. En algunas modalidades, estos kits comprenden: (i) por lo menos un anticuerpo de DV; (ii) una muestra que se sabe contiene DV, como un control positivo; y (iii) una muestra que se sabe que no contiene DV, como un control negativo; y (iv) instrucciones para uso.

En algunas modalidades, los kits se utilizan para neutralizar DV en una o más muestras. Estos kits pueden proporcionar materiales necesarios para tratamiento de una muestra que contiene DV con por lo menos un agente de anticuerpo de DV para probar la capacidad de la muestra tratada para infectar células cultivadas en relación a una muestra no tratada. Los kits pueden incluir (i) por lo menos un agente de anticuerpo de DV; (ii) células capaces de ser cultivadas e infectadas con DV; (iii) un anticuerpo que es incapaz de unirse a y neutralizar DV, como un control negativo; (iv) un anticuerpo que es capaz de unirse a y neutralizar DV, como un control positivo; (v) una muestra que se sabe que no contiene DV, como un control negativo; (vi) una muestra que se sabe que contiene Dv, como un control positivo; y (vii) instrucciones para uso.

EJEMPLOS La presente invención se comprenderá mejor en relación con los siguientes ejemplos. No obstante, debe entenderse que estos ejemplos son propósitos ilustrativos únicamente y que no significan limitar el alcance de la invención. Diversos cambios y modificaciones a las modalidades que se describen serán evidentes para aquellos expertos en el ámbito y estos cambios y modificaciones incluyen, sin limitación, aquellas que se relacionan con las formulaciones y/o métodos de la invención que pueden realizarse sin por esto apartarse del espíritu de la invención y el alcance de las reivindicaciones anexas.

EJEMPLO 1 Predicción de la estructura complejo proteína-proteína mediante análisis de los rasgos fisicoquímicos de la interacción Los estudios en este ejemplo ilustran el desarrollo y el uso de rasgos fisicoquímicos clave para elaborar un modelo de interacción proteína-proteína (por ejemplo, antígeno-anticuerpo). El análisis en este ejemplo ayuda a diferenciar estructuras similares a nativas de un interacción antígeno-anticuerpo de estructuras imprecisas y por lo tanto ayuda a superar las limitaciones y a utilizar únicamente funciones energéticas para clasificar posiciones, como se realiza en la elaboración de modelos de interacción proteína-proteína utilizando modelos de atraco computacional. Además, la falla en identificar la posición nativa de nueve casos de prueba analizados en este ejemplo resalta las limitaciones del algoritmo de búsqueda actual y los retos asociados con diseñar mutaciones mejoradoras de afinidad para complejos antígeno-anticuerpo.

Para captar muchas propiedades geométricas y químicas que forman la base de un reconocimiento molecular, se utilizaron trece rasgos de nivel atómico: siete químicos y seis físicos (tabla 1) para describir una interfase antígeno-anticuerpo. Además se ensambló un conjunto de datos que comprenden 77 estructuras tridimensionales no redundantes de complejos antígeno-anticuerpo (véase sección de métodos) y se dividieron en dos partes, un conjunto de entrenamiento que consiste de 40 estructuras y un conjunto de prueba que consiste de las 37 estructuras restantes. Correspondiente con cada estructura se construyeron 100 modelos de anzuelo utilizando atraco computacional (véase sección de métodos) lo que proporciona un total de 7,777 estructuras (7,700 de anzuelo + 77 de rayos X). En la fase de entrenamiento se utilizó el análisis de regresión logístico multivariado (MLR, por sus siglas en inglés) para determinar la relación entre cada rasgo (variable explicativa) y el grado con el cual puede diferenciar con éxito posiciones de anzuelo versus rayos X (variable de resultado). Este análisis ayudó a obtener un subconjunto de todas las variables explicativas que se pueden combinar para predecir el valor de la variable de resultado. Los rasgos intriducidos generados para cada archivo PDB (y sus anzuelos) se representaron como calificaciones Z estandarizadas para evitar aprendizaje no uniforme lo cual puede llevar a una estimación por exceso (o insuficiencia) de significancia. Para la fase se predicción, los rasgos significativos calculados previamente se utilizaron para predecir la probabilidad de que una estructura en el conjunto de datos de prueba sea similar a la nativa.

Los resultados a partir del análisis de MLR sugieren que la dominancia relativa de los rasgos individuales que afectan la probabilidad de estructuras nativas discriminantes con precisión versus de anzuelo es del orden de ZEPII > enlaces H cadena principal-cadena principal > densidad de enlaces H > porcentaje de grupos cargados > densidad de interacciones catión-pi > área de superficie enterrada > porcentaje de grupos polares neutros > densidad de enlaces iónicos. Cada uno de los rasgos anteriores se encontró que es significativo en un nivel alfa de 0.05. En base en los coeficientes de regresión logística, la densidad del enlace H y el enlace iónico, los enlaces H cadena principal-cadena principal y el área de superficie enterrada parecen estar estimados en exceso en los modelos de atracado. Esto se anticipa puesto que el incremento de los valores de los rasgos anteriores tiende a maximizar la función de calificación. Por el contrario, ZEPII, interacciones catión-pi, porcentaje de grupos polares cargados y neutros parecen estar representados de manera insuficiente en los modelos de atracado. Las interacciones catión-pi, el porcentaje de grupos polares cargados y neutros no contribuyen de modo significativo a la función de calificación de energía; y por lo tanto estos rasgos no se optimizaron en las interfases de atracado. Además, la determinación de los modelos atracados muestran que el procedimiento de atracado no recapitula de manera fiel las interacciones pareadas comunes a complejos antígeno-anticuerpo disociables; y por lo tanto se encontraron interconexiones en falso que tienen valores bajos de ZEPII.

Posteriormente se utilizó MLR para predecir estructuras de rayos X de 37 interacciones antígeno-anticuerpo en el conjunto de datos de prueba utilizando rasgos significativos calculados previamente y después la sensibilidad de la predicción basada en MLR se comparó con la de la función de energía de ZRANK, utilizada en modelos de atracado (véase sección de métodos). En general, se demostró que MLR es mejor en la predicción de estructuras de rayos X en comparación con la función de energía ZRANK (figura 1) lo que sugiere que el enfoque de MLR proporciona mejoras sobre ZRANK en predecir posiciones de unión similares a nativas. Un examen más cercano de los modelos de anzuelo, sus calificaciones ZRANK y las probabilidades de predicción basadas en MLR muestran avances interesantes (figuras 2A-2C). Estructuras similares a nativas identificadas por ZDOCK para 29 de las 37 estructuras indica que los algoritmos de búsqueda computacionales son muy precisos. No obstante: (1) la calificación ZRANK varía de modo significativo incluso entre posiciones estructuralmente similares (figura 2A); (2) estructuras muy diferentes pueden recibir aproximadamente la misma calificación lo que vuelve difícil discriminar con precisión de soluciones imprecisas (figura 2A); (3) las soluciones imprecisas peores con frecuencia reciben una mejor calificación que las estructuras similares a las nativas (figura 2A); (4) aunque la probabilidad de predicción basada en MLR también varía entre posiciones estructuralmente similares, las posiciones no nativas rara vez reciben alta probabilidad de predicción lo que indica que la probabilidad de una predicción de estructura positiva falsa es menor cuando las posiciones se clasifican de acuerdo con la probabilidad de predicción. En consecuencia, la probabilidad de predicción se consideró que se correlaciona mejor con RMSD cuando se compara con la calificación ZRANK (figuras 2B y 2C).

EJEMPLO 2 Utilización de rasgos fisicoquímicos para predicción de mutaciones mejoradoras de afinidad Los estudios en este ejemplo muestran el desarrollo de un esquema de clasificación para diseñar mutaciones mejoradoras de afinidad para interacciones proteína-proteína (por ejemplo, antígeno-anticuerpo).

Específicamente, este ejemplo describe un modelo matemático desarrollado para cuantificar las susceptibilidades de interacciones pareadas de aminoácidos (véase la sección de métodos). Estas susceptibilidades estadísticas se formulan como una matriz de interacción que asigna un peso a cada par posible de aminoácidos. El ajuste de un residuo en una posición de CDR, también denominado ajuste de interfase de aminoácido (AIF, por sus siglas en inglés) es la susceptibilidad combinada de todos los contactos pareados interproteína (definidos como dos aminoácidos dentro de una cierta distancia entre sí) que involucran a ese residuo. Las sustituciones que llevan a una mejora en el valor de AIF sin consecuencia estructural alguna se consideran como candidatos para mejoramiento de afinidad. Las susceptibilidades se determinaron utilizando estadísticas sobre contactos de aminoácidos en una base de datos de estructuras de proteína conocidas (véase la sección de métodos). Evitar cortes de distancia múltiples y etapas de minimización de energía eliminan las dependencias pesadas sobre las coordenadas atómicas.

Concordante con las observaciones realizadas por investigaciones previas, los datos de susceptibilidad muestran la dominancia de tirosina, triptofano, serina y fenilalanina sobre otros residuos en el paratopo (tabla 2). La métrica de AIF después se utiliza para predecir las mutaciones mejoradoras de afinidad de anticuerpos a través de tres sistemas diferentes para los cuales los datos publicados validan las predicciones. Uno de los casos de prueba es el fármaco anticuerpo anti-EGFR, cetuximab (Erbitux), en donde una mejora de afinidad de 10 veces a 50 p es manipulada por tres mutaciones en la cadena ligera. Dos de estas mutaciones predichas, S26D y T31E se ha demostrado que mejora la afinidad de unión como mutaciones únicas en cetuximab y una inspección más meticulosa de la tercera mutación (N93A) mostró que Ala está entre un conjunto de residuos con susceptibilidad general de contacto débil. Otro caso de prueba es el anticuerpo de modelo anti-lisozima D44.1, en donde dieciocho mutaciones se predicen como adecuadas para mejoramiento de afinidad. Cuatro de las mutaciones predichas sobre la cadena pesada, T28D, T58D, E35S, G99D son parte de una variante de alta afinidad publicada de D44.1. Otro caso de prueba es el anticuerpo E2 que dirige serina proteasa asociada con cáncer, MT-SP1. La métrica de AIF predice ocho mutaciones las cuales incluyen T98R, confirmando un estudio de mejoramiento de afinidad en silico previo el cual ha identificado una mutación única T98R para mejoramiento de la afinidad de anticuerpo en 14 veces, a 340 pM.

EJEMPLO 3 Diseño de mutaciones de me oramiento de afinidad en anticuerpo de dengue El anticuerpo en este ejemplo ilustra que el anticuerpo anti-Dv que se une solo a ciertos serotipos de DV se puede modificar a través de manipulación de manera que se genere una variante que neutraliza de modo potente la actividad de la totalidad de los cuatro serotipos de DV.

De manera específica, investigaciones en este ejemplo muestran que las mutaciones diseñadas de modo razonado en mAb 4E11 de dengue aumenta su afinidad por el serotipo 4 de DV (DV4) sin afectar de manera perjudicial de modo significativo su unión a DV serotipos 1 a 3 (DV1 a 3).

Los perfiles de unión y actividad neutralizante de mAb 4E11 muestran alta afinidad y potencia inhibidora a DV1 a 3, pero una baja afinidad y actividad neutralizante hacia DV4 (figura 3). Para manipular 4E11 para una potente actividad de neutralización para todos los cuatro serotipos, el enfoque de diseño (figura 4) se basa en tres factores importantes: (1) generar un modelo preciso de interacción 4E11-EDIII, (2) entender los elementos estructurales específicos de serotipo y recapturar los determinantes de afinidad y especificidad, y (3) el diseño de sustituciones que confieran interacción favorable y por lo tanto afinidad mejorada con DV4.

En ausencia de la estructura de cristal de anticuerpo, se construye un modelo estructural de la región Fv y la Fv modelada se atraca contra EDIII de DV1 utilizando el programa ZDOCK, y los datos funcionales publicados previamente respecto al epítopo y el paratopo H3 de CDR (Watanabe et al., 2012 Trends in Microbiology 20: 11-20) se incluyeron como residuos específicos en la interfase de unión para asegurar que las posiciones atracadas no se desvíen de modo significativo del complejo nativo (véase sección de métodos). El programa ZDOCK se corrió cinco veces con diferentes combinaciones de residuos de interconexión de entrada y el modelo con la mejor calificación de cada corrida (figura 5) se volvió a clasificar utilizando las probabilidades de MLR (tabla 3). El modelo superior predicho por el enfoque MLR no coincide con la predicción del método ZRANK.

El modelo superior predicho por el enfoque MLR es validado por comparación realizada entre puntos calientes de paratopo predichos computacionalmente por el servidor de red ANCHOR [Dosztanyi et al., 2009 Bioinformatics 25: 2745-2746] y los puntos calientes determinados experimentalmente por exploración con Ala de cada posición en la totalidad de los bucles de CDR de 4E11 con determinación de unión mediante prueba indirecta de ELISA para ED-III (DV1). La predicción de los puntos calientes del modelo seleccionado identificó correctamente 61% de los puntos calientes determinados experimentalmente mientras que las posiciones restantes presentan precisiones de predicción de puntos calientes de < 45% (intervalo, 28 a 44%) indicando de esta manera que la posición seleccionada es probable que refleje la verdadera configuración de unión de 4E11/ED-III.

El modelo superior 4E11-ED-III (DV1) se utiliza para guiar el modelado de la interacción entre 4E11 y la cepa EDIII representativa a partir de cada uno de los otros tres serotipos (véase sección de métodos). Utilizando los cuatro modelos estructurales, el modo de unión de anticuerpo a cada uno de los serotipos se examinó y la base molecular de afinidad pobre hacia el serotipo DV4 se identificó utilizando una combinación de análisis de secuencia y estructural a nivel de dominio ED-III. El análisis reveló múltiples diferencias de aminoácidos dentro y alrededor de la interfase de unión 4E11 entre DV4 y otros serotipos. De manera notable, la orientación de la cadena A (residuos 305 a 308) en relación a las cadenas b aledañas es diferente en DV4 debido a una diferencia localizada en la posición 307 (figuras 6A y 6B). Concordante con la baja afinidad y la potencia neutralizante para DV4, la interfase 4E11-EDIII (DV4) posee la BSA más pequeña, algunos enlaces H y contactos de puente salino.

Después se aplicó el índice AIF para diseñar mutaciones las cuales mejoran la afinidad a unión a DV4. Esto resultó en un conjunto de 87 mutaciones que abarcan 23 posiciones de CDR. Las mutaciones predichas incluyen aminoácidos de todo tipo. La elección de las sustituciones de aminoácidos no siempre fueron intuitivas (por ejemplo, si la región de epítopo que rodea a una posición de CDR de paratopo es cargada negativamente, Arg y Lys no siempre fueron favorecidas estadísticamente en esa posición de CDR). Aunque los residuos que mejoran la energética fueron favorecidos, la ganancia de afinidad pudo suceder a través de mejoras en la complementariedad electrostática, empacado y área de superficie hidrofóbica. Se realizó un esfuerzo consiente para diseñar mutaciones mejoradoras de afinidad en posiciones de CDR próximas a residuos específicos por el serotipo DV4 (figura 6). Las mutaciones que tuvieron potencial para mejorar la afinidad de DV4 mientras no fueran dañinas para otros serotipos se les proporcionó una preferencia superior. En un esfuerzo por aprender acerca de los efectos de las mutaciones puntuales sobre la afinidad de unión, los mutantes no se restringieron a residuos con las más altas probabilidades de éxito.

EJEMPLO 4 Caracterización experimental del anticuerpo de dengue manipulado Los experimentos en este ejemplo dilucidan que las mutaciones dirigidas a sitio manipuladas específicas en un anticuerpo aumentan su afinidad y/o potencia para EDIII de DV4 sin, o con solo una reducción mínima en la afinidad de unión y/o la potencia a EDIII de DV1 a 3. Los experimentos en este ejemplo también demuestran que las propiedades de unión de los anticuerpos manipulados también se pueden cuantificar con precisión. Los experimentos en este estudio además muestran que el anticuerpo de dengue manipulado diseñado por combinación de mutaciones únicas exitosas específicas resulta en un incremento máximo en la afinidad del anticuerpo. Además, los experimentos en este ejemplo confirman que los anticuerpos manipulados y diseñados en este estudio no solo presentan fuerte actividad inhibidora para la totalidad de los cuatro serotipos de DV sino que también tienen una potente actividad antiviral in vivo.

Un total de 87 mutaciones se seleccionaron para pruebas experimentales mediante prueba indirecta de ELISA utilizando las formas recombinantes purificadas de EDIII de DV1 a 4 como el antígeno recubierto. Los mutantes se generaron mediante mutagénesis dirigida a sitio, confirmada por secuencia y expresada a partir de células 293 mediante transfección transitoria. Se identificaron diez mutaciones con afinidad aumentada para EDIII-DV4 sin o con reducción mínima en la unión a EDIII de DV1 a 3 (tabla 3). Estas 10 mutaciones abarcan cinco posiciones de CDR con cuatro en VL (R31, N57, E59 y S60) y una en VH (A55). Ocho de las 10 mutaciones están en VL, en donde 7 están en L2 únicamente. Las mutaciones exitosas estaban principalmente cargadas o eran de naturaleza polar, y se encontró que residen en la periferia del área de interfase anticuerpo-antígeno (figura 7). El análisis estructural mostró que las cadenas laterales mutantes crearon contactos con residuos de epítopo altamente conservados, lo que sugiere el motivo por el que no hay-deterioro en la unión a DV1 a 3 (figura 6 y tabla 5).

Para una cuantificación precisa adicional de las propiedades de unión de estos 10 mutantes únicos descritos antes, se realizaron experimentos de ELISA de competencia para determinar afinidades al equilibrio y en solución. La tabla 6 indica los resultados de afinidad de cinco anticuerpos mutantes únicos, que representan aquellas mutaciones las cuales muestran el mayor mejoramiento de afinidad por EDIII-DV4 y al mismo tiempo mantienen afinidad hacia EDIII de EV1 a 3. El grado de mejoramiento de afinidad por DV4 varía de 1.1 veces (VL-R31K) a 9.2 veces (VH-A55E). De manera sorprendente, dos mutaciones confirieron afinidad aumentada a otros serotipos; VH-A55E resultó en un incremento de afinidad de 16 y 7 veces para ED-III-DV2 y ED-III-DV3, respectivamente mientras que VL-N57E demostró un incremento de afinidad de 3 veces hacia ED-III-DV2. Únicamente tres de las 15 afinidades medidas para los serotipos 1 a 3 (con los cinco anticuerpos mutantes únicos) mostraron una disminución mayor de 2 veces y únicamente una afinidad por anticuerpo-EDIII (VL-E59Q para EDIII-DV3) resultó en una disminución mayor de 3 veces en la afinidad.

Estructuralmente, las cinco posiciones mejoradoras de afinidad mapean hacia regiones especialmente distintas del paratopo (figura 7) lo que sugiere que se puede obtener una mejoría adicional al combinar mutaciones únicas con éxito. Se probaron múltiples combinaciones de tres, cuatro y cinco mutantes, y un anticuerpo mutante quíntuple, denominado 4E5A, que mostró el mayor incremento en la afinidad. De manera sorprendente, 4E5A estaba constituido de cinco sustituciones que representan el cambio de aminoácido en cada posición la cual confiere la más alta mejora en afinidad a EDIII-DV4 como un mutante único. En comparación con el mAb original, 4E5A mostró 450 veces mejora en afinidad hacia EDIII-DV4 (KD = 91 nM) mientras mantenía la afinidad a EDIII de DV1 y DV3 y un incremento de afinidad de 15 veces hacia DV2 /tabla 7 y tabla 8). De manera significativa, estos resultados ilustran que la afinidad de un anticuerpo se puede incrementar a partir de afinidad micromolar o casi nanomolar. La resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) se utilizó para verificar mediciones de afinidad así como para obtener parámetros de unión cinética (tabla 9 y figuras 8A-8H). Los valores de afinidad a partir de SPR están en buena concordancia cuantitativa con los obtenidos por la prueba de ELISA de competencia, con la excepción de que la unión específica de 4E11 WT a EDIII-DV4 no se puede detectar, lo que indica una afinidad muy baja, lo cual concuerda de modo general con los resultados de la prueba de ELISA de competencia (KD = 41 mM).

Para determinar si la afinidad aumentada de 4E5A hacia EDIII-DV4 se traduce en actividad aumentada, se utilizó un análisis de prueba de neutralización de reducción de foco (FRNT). En comparación con WT 4E11, 4E5A mostró un > 75 veces de incremento en la potencia neutralizante hacia DV4, y mantuvo la potencia hacia DV1 a 3 (figura 9). 4E5A mostró fuerte actividad inhibidora para la totalidad de los cuatro serotipos, con valores de FRNT50 de 0.19, 0.028, 0.77 y 4.0 m9/p\1 para DV1 a 4, respectivamente. Para dilucidar adicionalmente la actividad de 4E5A, el anticuerpo se probó en un modelo de ratón AG129 de exposición a DV2, el cual muestra viremia pico en el día 3 posterior a la infección. Tanto a 1 mg/kg como a 5 mg/kg, 4E5A demostró una reducción significativa en la viremia, en donde el tratamiento de 5 mg/kg resultó en niveles de título de virus por debajo del límite de detección (figura 10). De manera colectiva, estos resultados muestran que el mAb 4E5A manipulado muestra una fuerte actividad inhibidora para la totalidad de los cuatro serotipos de DV y que tiene una potente actividad antiviral in vivo.

Los anticuerpos manipulados que pueden ser diseñados en base en este estudio (por ejemplo, 4E5A) representan importantes candidatos de fármacos y adicionalmente pueden ser captados para rondas adicionales de maduración por afinidad y humanización, como se conoce en el ámbito. La estructura cristalina del complejo 4E11/ED-III se publicó antes del envío de la presente solicitud de patente, lo cual permitió una comparación del modelo estructural descrito en esta investigación con la estructura compleja publicada y en realidad se observó una excelente correspondencia entre las dos estructuras con valor RMSD de C-alfa de 1.4 ángstrom, lo que confirma de modo adicional la significancia de esta investigación.

DISCUSIÓN Los enfoques tradicionales para descubrir anticuerpos de interés terapéutico se basan en métodos experimentales tales como téenicas de presentación de fagos. No obstante, estos enfoques son costosos, técnicamente son demandantes y consumen tiempo. Por ejemplo, el mAb F16 de influenza, el cual neutraliza los virus de cubierta 1 y 2 se identificó al cribar 104,000 linfocitos B. Una estrategia alternativa sería modificar las propiedades de un anticuerpo existente por medio de manipulación razonada. En esta investigación se presentaron métodos computacionales para elaboración de modelo a initio y re-diseño de anticuerpo. En las corridas de prueba, la sensibilidad del método de predicción por MLR en la toma de estructuras de rayos X (de los diversos modelos de anzuelo) parecen superiores a ZRANK. Además, se demostró que la métrica de AIF puede captar mutaciones mejoradoras de afinidad conocidas a través de sistemas múltiples. Esta infraestructura se aplicó después a manipulación de especificidad más amplia y afinidad hacia un mAb neutralizante anti-dengue. Los resultados obtenidos en esta investigación son importantes en la medida en que: (1) solo algunos estudios han intentado mejorar la reactividad cruzada de un anticuerpo, (2) en esta primera investigación que ha utilizado un enfoque empírico hacia el re-diseño de un anticuerpo y mejoramiento de afinidad; y (3) se predicen mutaciones mejoradoras de afinidad sin la estructura cristalina del complejo anticuerpo-antígeno (denominada también predicción a ciegas). Este estudio muestra por primera vez que la aplicación de un enfoque computacional genera una mejoría mayor de ~ 400 veces en afinidad de un anticuerpo (tabla 10). Dada la sencillez de los métodos computacionales, pueden ser utilizados ampliamente para manipulación de anticuerpos y, a diferencia de los enfoques energéticos basados en física, no son afectados por la ubicación precisa de las coordenadas de átomos de la estructura inicial.

La solución de atracado superior a partir de ZRANK es estructuralmente muy diferente de la estructura nativa, lo que indica que cualquier esfuerzo de mejoramiento de afinidad después del modelo ZRANK superior no habría llevado a resultados fructíferos. Las mutaciones mejoradoras de afinidad también se predicen utilizando la estructura de rayos X por enfoque energético y los resultados resaltan los retos en discriminar mutaciones estabilizantes y neutras (tabla 11). De manera significativa, las mutaciones mejoradoras de afinidad N57E, N57S y E59N se clasificaron como desestabilizantes (tabla 11). Puesto que ZRANK se utiliza ampliamente se ha mostrado éxito considerable en los experimentos CAPRI, el método presentado en este estudio puede funcionar comparativamente bien cuando se confronta contra otros algoritmos de atraco. El hecho de que ZEPII aparezca de modo significativo indica que la composición de aminoácidos y los contactos inter-residuo contienen potencia discriminatoria. De modo interesante, algunos rasgos geométricos también tienen potencia de predicción para discriminar interfases nativas de los anzuelos. Esto se correlaciona con la observación realizada por estudios previos de que las interfases antígeno-anticuerpo son más planas y significativamente bien ordenadas o empacadas. Entre las diferentes combinaciones de residuos de interfase que se utilizaron para generar los cinco modelos diferentes, el modelo preciso se produjo mediante la utilización de la totalidad de los residuos de interfase de epítopo y paratopo conocidos al agregar más contexto estrechando el espacio de búsqueda y por lo tanto incrementando las probabilidades de encontrar una estructura compleja casi nativa.

La presentación de fago y los métodos de evolución dirigida aleatorizan bucles de CDR seleccionados, especialmente bucles VH-CDR dado que constituyen la mayor parte de los contactos estabilizantes. Los resultados sobre 4E11 muestran que las estrategias de diversificación deben utilizar un enfoque razonado e involucrar los bucles VL para diversificación dirigida. La observación de que las mutaciones mejoradoras de afinidad son de naturaleza principalmente polar y están presentes en la periferia de la interfase de unión es concordante con los datos conocidos. Es probable que estas mutaciones aumenten la tasa de asociación al incrementar la eficiencia de colisión. La tasa de éxito al predecir mutaciones con actividades dirigidas es 12% (10/87). Estos resultados son alentadores dada la complejidad del problema de diseño (es decir, el involucramiento de antígenos múltiples) y considerando las mutaciones aleatorias que podrían presentarse en promedio de un efecto perjudicial sobre la afinidad de unión.

Los estudios han demostrado que la línea germinal murina alberga segmentos de genes con una capacidad inherente por unión de alta afinidad hacia el dominio EDIII (Ref 24, 32). Pese al efecto benéfico de las 5 mutaciones, estas mutaciones no han co-evolucinado ín vivo. El análisis a nivel de codón muestra que las sustituciones de aminoácidos en N57E y en S60W requieren por lo menos dos cambios de base que resalten las limitaciones a nivel genómico. Investigaciones previas han demostrado que los epítopos reconocidos por anticuerpos anti-DV se encuentran dentro de tres regiones diferentes: (1) epítopo de orilla lateral en ED-III (neutralizantes potentes específicos de serotipo); (2) cadena A de DI11 (neutralizadores específicos de subcomplejo); y (3) otros epítopos DII y DIII (específicos de complejo o neutralizadores moderamente potentes de reacción cruzada con flavivirus). En esta investigación se demostró por primera vez que el anticuerpo contra el epítopo de la cadena A puede ser manipulado para unirse a la totalidad de los cuatro serotipos con buena potencia in vitro. De modo colectivo, 4E5A presentó un perfil de neutralización de espectro amplio interesante y puede ser un anticuerpo de interés para el desarrollo terapéutico potencial para el tratamiento de la enfermedad del dengue. Las sustancias terapéuticas de mAb contra DV en humanos deben enfrentarse a impedimentos reguladores debido a el mejoramiento dependiente de anticuerpo. No obstante, investigaciones recientes han demostrado que las modificaciones a la región Fe de anticuerpos anti-DV recombinantes evita ADE in vivo y de esta manera presentan oportunidades para estos nuevos enfoques complementarios. El grado de conservación del epítopo mAb puede ser un factor significativo en determinar el espectro neutralizante y la protección in vivo. El análisis filogenético de los virus DV4 ha mostrado la existencia de cuatro genotipos distintos: I (Sudeste de Asia), II (Indonesia), III y IV (Selvático o Malayo). Dentro del genotipo II, los virus se agrupan en dos grupos distintos definidos previamente como lía y Ilb. El análisis de secuencia de la región de epítopo 4E11-5A mostró un alto grado de conservación en los genotipos lia, Ilb y 4, mientras que una conservación relativamente menor en el genotipo I, sugiriendo a los presentes inventores que el anticuerpo manipulado probablemente sea eficaz contra la mayor parte de los virus DV4.

TABLA 1 Descripción de los rasgos fisicoquímicos - TABLA 2 Matriz de susceptibilidad de aminoácidos 20 X 20. Los aminoácidos paratopo están indicados en el lado izquierdo y los aminoácidos epítopo están indicados en el lado superior.

Los datos de susceptibilidad se generaron utilizando 77 complejos antígeno-anticuerpo no redundantes TABLA 3 Propiedades fisicoquímicas de los cinco modelos estructurales atracados principales. Las columnas 2 a 9 proporcionan valores de los rasgos significativos calculados previamente para los modelos atracados. El valor p y la relación de probabilidades (OR) se enumeran en los encabezados de columna. El coeficiente de regresión de MLR de los rasgos se enumera en la última hilera de la tabla. Las columnas 10 y 11 proporcionan probabilidad de predicción basada en MLR y calificación de ZRANK, respectivamente TABLA 4 Mutaciones que llevan a incremento en la afinidad de EDIII-DV4 mientras se mantiene la afinidad original hacia EDIII-DV1 a 3 TABLA 5 Contactos realizados por mutaciones mejoradoras de afinidad TABLA 6 Afinidades de anticuerpos imitantes únicos con afinidad aumentada hacia EDIII-DV4 y afinidades similares hacia EDIII-DV1 a 3 en relación a 4E11 WT. Las mutaciones incluyen aquellas las cuales, para cada posición identificada, demuestran la mayor afinidad EDIII-DV4 mientras que mantienen aproximadamente la afinidad de EDIII-DV1 a 3.Los valores Kb representan el promedio de por lo menos dos experimentos independientes ! !- i Afinidad de mutante de combinación 4E11-5A TABLA 8 Cálculos energéticos de 4E5A que muestran mutaciones que tienen efecto aditivo sobre la energía de unión a Energía libre calculada por AG = Rtln (KD) a 25°C 13 AAG = AGmutante - AGWT TABLA 9 Cinética de parámetros de unión para 4E11 y 4E5A medidos por SPR a Los valores de kactivación se expresa como (x 106 M^s-1) b Los valores de kinactivación se expresan como (x 10-4 s_1) c N . B . sin unión TABLA 10 Comparación de los resultados de diversos estudios de mejoramiento de afinidad de anticuerpo in silico TABLA 11 Mutaciones de anticuerpos predichas utilizando enfoque energético. Las mutaciones que incrementaron la afinidad de 4E11 están sombreadas MÉTODOS Un modelo matemático para calcular las susceptibilidades de contacto de aminoácidos en la interfase an tígeno -anti cuerpo Brevemente, en una interfase antígeno-anticuerpo, un par de residuos probablemente interactúen si presentan energética de interacción favorable o por presentación de probabilidad. La susceptibilidad de interacción de aminoácidos se calcula al computar el número de interacciones esperadas entre la probabilidad, es decir, la frecuencia esperada, y al dividir la frecuencia observada entre este número.

Si dos aminoácidos, uno desde cada lado de la interfase antígeno-anticuerpo están dentro de 4.5 Á (es decir, la distancia más corta de un átomo diferente de H es menos de 4.5 Á) entre sí, se definen como residuos pareados . Si el número total de interacciones pareadas entre los residuos x (antígeno) e y (anticuerpo) en la interfase es N (x, y), entonces su frecuencia de concurrencia, F (x, y) se define como sigue. _ _ El denominador de la ecuación anterior indica la sumatoria de interacciones pareadas de todos los pares de residuos en la interfase.

La frecuencia de presentación de cada aminoácido en el paratopo y epítopo se debe calcular. La frecuencia de un aminoácido particular x en el epítopo, FePítoP° (x) se define como sigue : En la ecuación anterior, N(x) indica la cuenta de aminoácido x en el epítopo. El denominador representa el número total de todos los aminoácidos en los epítopos.

De modo similar, la frecuencia de presentación del aminoácido y en el paratopo, FParat°p° (y) se define como sigue: En la ecuación anterior, N(y) indica el número de aminoácido y en el paratopo. El denominador indica el número total de todos los aminoácidos en los paratopos.

Los parámetros F (x, y), FePítoP° (x) y FParat°P° (y) se determinan utilizando la totalidad de setenta y siete estructuras antígeno-anticuerpo marcadas en el conjunto de datos. De modo concordante con las observaciones realizadas por investigaciones previas, la tirosina, serina, glicina y asparagina son los residuos paratopo más abundantes mientras que lisina, arginina, leucina y glicina son los residuos epitópicos más abundantes (figura 11). Las presentaciones de los aminoácidos x e y son independientes, EFePítoP°ParatoP° (x, y) definido en la ecuación siguiente es una tasa de frecuencia esperada de que los aminoácidos x e y aparezcan de modo concurrente.

EF (X , Y) = FePItoP° (x) FParatopo (y) Si la tasa de concurrencia de los aminoácidos x e y en la interfase para el antígeno es mayor que la tasa esperada, la siguiente relación RA (x, y) se vuelve mayor de 1.

F{x,y) RA(x, y) = EF(x, y) RA (x, y) es una matriz de 20 X 20. Las aplicaciones ej emplares de RAS (x, y) se sugieren a continuación .

Utilizando RA (x, y) para determinar el AIF de un residuo CDR. El AIF de un residuo CDR en la interfase se define como la sumatoria de RA (x, y) con sus vecinos . Los vecinos se definen por un criterio de distancia (4 .5 Á) .

La determinación de la elección óptima de aminoácido en una posición de interfase (remanipulación de paratopo) . Dado el complejo antígeno-anticuerpo, las preferencias de aminoácidos en una posición de CDR se calculan utilizando la calificación potencial de contacto. Específicamente, en una posición CDR dada, el residuo de tipo silvestre (WT) se sustituye sistemáticamente por los aminoácidos remanentes excluyendo glicina y prolina (para evitar alteraciones en la conformación de la estructura principal) y se evalúa la probabilidad de sustitución en cada instancia utilizando la metrica AIF. Las mutaciones solas con potencial de sustitución mayor que el residuo tipo silvestre se reevalúan computacionalmente para encontrar mutaciones que : (a) no entierra en grupo polares , y (b) no provoquen impedimento esterico .

Utilizando RA (x, y) para cuantificar la fuerza de interacción de la interfase antígeno-anticuerpo (el índice de interfase epítopo-paratopo) . La interacción entre un antígeno y anticuerpo resulta de la formación de numerosos enlaces no covalentes . Por lo tanto, la afinidad de interacción se relaciona directamente con la sumatoria de las fuerzas de atracción y repulsión ( interacciones de van der Waals, enlaces de hidrógeno, puentes salinos y fuerza hidrofóbica) . En la presente , la fuerza de interacción de una interfase anticuerpo-antígeno se investiga cuantitativamente por una combinación lineal de los RA para todas las combinaciones de pares de aminoácidos. Un índice que expresa la fuerza de una interfase antígeno-anticuerpo, "i" (denominado índice de interfase epítopo-paratopo (EPII, por sus siglas en inglés) ) se define por: En la ecuación anterior, F- (x, y) indica la frecuencia de presentación de los aminoácidos x (x pertenece a los grupos estructurales secundarios) e y en la interfase i.

Utilización de EPII para discriminar una interacción verdadera antígeno-anticuerpo de anzuelos de atracado. Con el fin de distinguir una interfase con el mayor potencial de otras interfases de anzuelo generadas por atracado computacional, los valores EPII deben ser normalizados para todas las interfases en la proteína. Se utiliza EPII Z-calificado para este propósito. Si las interfases M se encuentran en una proteína, la EPII Z-calificado para la interfase i se calcula como sigue: _ en donde - - La calificación ZEPIIÍ es un indicador de la probabilidad de unión de anticuerpo a una interfase dada. La interfase con la calificación ZEPIIÍ más alta (con ZEPIIÍ por encima del valor consenso establecido para la interacción antígeno-anticuerpo (descrita antes)) en una proteína es el sitio más probable para unión de anticuerpo.

Conjunto de datos de complejos estructurales antígeno-anticuerpo no redundantes y atracado computacional para generar modelos de anzuelo Se analizaron un total de 568 complejos antígeno-anticuerpo a partir de Protein Data Bank. Con el fin de asegurar una enumeración adecuada de los rasgos de interfase geométrica (planaridad, área de superficie enterrada, etc . ) , se excluyeron estructuras en donde la longitud de antígeno es menor de 20 aminoácidos . Adicionalmente , muchas estructuras que contienen antígeno igual o similar, las cuales pueden sesgar los estudios , proporcionaron una ponderación mayor para factores derivados de antígeno proteínico representado de manera múltiple. Para remover las estructuras redundantes del conjunto de datos, las estructuras que tienen antígeno homólogo (definido por valor P BLAST_ENEEF_40 10e27) y que comparten 50% de residuos epitópicos se clasificaran bajo el mismo grupo y la estructura con la resolución más alta se seleccionó co o la representativa. Esto llevó a setenta y siete estructuras de complejo antígeno-anticuerpo no redundantes.

Se utilizó ZDOCK para generar modelos cornputacionales de anzuelo de interacción antígeno-anticuerpo. El protocolo para generar los modelos de anzuelo son los mismos para la totalidad de los setenta y siete complejos estructurales tínicamente el dominio variable del anticuerpo se utilizó para atracado. La más grande de las dos moleculas se consideró al receptor mientras que la menor de las moléculas se consideró el ligando . La orientación del ligando se hace girar 6 grados en cada etapa para muestrear las diversas configuraciones . A partir de esto, el procedimiento de atracado inicial explora un área relativamente grande , las limitaciones de distancia entre residuos de punto caliente putativos en el epítopo o paratopo se ajustaron para asegurar que los modelos generados no se desplazaran de manera significativa de la posición nativa. Se seleccionaron dos residuos de punto caliente en cualquiera de los lados para asegurar que los retos enfrentados con la predicción de estructura fueran equivalentes al escenario de 4E11. En la totalidad de los modelos de anzuelo, los puntos calientes putativos de epítopo y paratopo están dentro de 10 ángstrom entre sí. Los puntos calientes se identificaron utilizando un servidor de red, ANCHOR. El procedimiento de atracado inicial generó 2,000 posiciones las cuales después se agruparon en base una matriz RMSD de todos contra todos, descrita previamente. La RMSD entre dos posiciones atracadas se calculó en base en los residuos de ligando dentro de 7 ángstroms de interfase de unión. Las posiciones de proteína atracada representan los centros de agrupamiento y se consideraron como modelos de anzuelo. ZDOCK utiliza complementariedad de forma junto con desolvatación y términos de energía electrostática ("ZRANK") para clasificar las posiciones atracadas. Cada uno de estos anzuelos se refina adicionalmente utilizando minimización CHARMm.

Las estructuras de rayos X se combinaron con los modelos de anzuelo para evaluar la sensibilidad de los métodos de predicción.

Elaboración de modelos de homología de Fv de 4E11 El modelo estructural de Fv de 4E11 se construyó utilizando un servidor de elaboración de modelos de homología SIWW-MODEL. Los estudios indicaron que la precisión general de elaboración de modelos, la CDR hipervariable es apropiada cuando: (1) el grado de similitud de secuencia entre el objetivo y la plantilla es alto, (2) las conformaciones de cadena principal de los bucles de CDR Ll, L2, L3 Hl, H2 siguen la "estructura canónica" y (3) la CDR3 (H3) de cadena pesada no es habitualmente larga.

Atracado computacional para generar posiciones 4E11-EDIII (DV 1-4) El Fv modelado es atracado contra EDIII de una cepa seleccionada DV1 utilizando ZDOCK. Se utilizó el antígeno DV1 debido a que el mAb 4E11 originalmente está aislado de un ratón infectado con un virus DV1. La estructura del antígeno DV1 se modela utilizando el servidor de elaboración de modelo de homología SWISS MODEL manteniendo la estructura de cristal resuelta de DV1 EDIII (PDB: 3IRC) como la plantilla. ZDOCK utiliza complementariedad de forma junto con desolvatación y términos de energía electrostática ("ZRANK") para clasificar las posiciones atracadas. Con el fin de asegurar que las posiciones atracadas no se desvíen significativamente del complejo nativo, los residuos mapeados de epítopo y paratopo encontrados en la literatura fueron forzados para ser incluidos en la interfase de unión. Los residuos incluidos en la interfase fueron 307K, 389L y 391W (epítopo; numeración DV1 como en 3IRC) y 101W, 102E (paratopo; numeración basada en la posición de secuencia).

Las estructuras de 4E11 en complejo con DV 2, 3, 4 (EDIII) se modelaron utilizando el modelo estructural 4E11-DV1 EDIII como la plantilla.

EQUIVALENTES Y ALCANCE Los expertos en el ámbito reconocerán como serán capaces de determinar utilizando no más que la experimentación habitual, muchos equivalentes para las modalidades específicas de la invención, que aquí se describen. El alcance de la presente invención no se pretende que esté limitado a la descripción anterior, más bien, se establecerá por las reivindicaciones anexas.

En las reivindicaciones, los artículos tales como "un", "uno" y "el" pueden significar uno o más de uno, a menos que se indique lo contrario o sea evidente en otro sentido a partir del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno o la totalidad de los miembros del grupo están presentes en, se utilizan en o de alguna otra manera son relevantes para un producto o proceso dado a menos que se indique en sentido contrario o sea evidente en otro sentido a partir del contexto. La invención incluye modalidades en las cuales exactamente un miembro del grupo está presente en, es utilizado en o de alguna otra manera es relevante para un producto o proceso dado. La invención incluye modalidades en las cuales más de uno o la totalidad de los miembros de un grupo presentes en, utilizados en o relevantes de alguna otra manera para un producto o proceso dado. Además, debe entenderse que la invención abarca todas las variaciones, combinaciones y permutaciones en las cuales uno o más de las limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc. de una o más de las reivindicaciones enumeradas se introduce en otra reivindicación. Por ejemplo, cualquier reivindicación que depende de otra reivindicación se puede modificar para incluir una o más limitaciones encontradas en cualquier otra reivindicación que sean dependientes de la misma reivindicación base. Además, cuando las reivindicaciones mencionan una composición, debe entenderse que los métodos de uso de la composición para cualquiera de los propósitos que aquí se describen están incluidos y los métodos de elaboración de la composición de acuerdo con cualquiera de los métodos de elaboración descritos en la presente u otros métodos conocidos en el ámbito están incluidos, a menos que se indique en otro sentido o a menos que sea evidente para una persona habitualmente experta en el ámbito que pueda surgir una contradicción o una inconsistencia.

Cuando los elementos se presentan como listas, por ejemplo, en el formato de grupo de Markush, debe entenderse que cada subgrupo de los elementos también se describe, y que cualquiera de uno o varios de los elementos se pueden remover del grupo. Debe entenderse que, en general, cuando la invención o los aspectos de la invención se hace referencia o que comprenden elementos particulares, rasgos, etc. que contienen ciertas modalidades de la invención o aspectos de la invención que consisten, o que consisten esencialmente de tales elementos, rasgos, etc. Para propósitos de sencillez, en las modalidades que no han sido establecidas específicamente in haec verba en la presente. Se hace notar que el término "que comprende" se pretende que sea abierto y permite la inclusión de elementos o etapas adicionales.

Cuando se proporcionan intervalos, se incluyen los puntos de extremo. Además, debe entenderse que, a menos que se indique en otro sentido o sea evidente de otra manera a partir del contexto y la comprensión de una persona habitualmente experta en el ámbito, los valores que se expresan como intervalos pueden asumir cualquier valor o subintervalo específico dentro de los intervalos establecidos en diferentes modalidades de la invención, hasta un décimo de unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto claramente lo determine en otro sentido.

Además, debe entenderse que cualquier modalidad particular de la presente invención que se encuentre dentro de la téenica anterior puede ser excluida explícitamente de cualquier otra de una o más de las reivindicaciones. Puesto que estas modalidades se consideran como conocidas para una persona habitualmente experta en el ámbito, pueden ser excluidas incluso si la exclusión no se establece de modo explícito en la presente.

Las publicaciones descritas en lo anterior y a través del texto se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en las mismas debe considerarse como admisión de que los inventores no están capacitados para antefechar la descripción en virtud de la descripción previa.

Los expertos en el ámbito reconocerán o serán capaces de determinar, utilizando únicamente la experimentación sistemática, muchos equivalentes para las modalidades específicas de la invención que aquí se describe. El alcance de la presente invención no se pretende que esté limitado a la descripción anterior, más bien, como se establece en las siguientes reivindicaciones: Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (64)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un agente de anticuerpo específico para el virus del dengue, caracterizado porque el agente de anticuerpo se une a, y neutraliza cada uno de los serotipos de virus de dengue DI, D2, D3 y D4.

2. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de anticuerpo se une a un epítopo que es o que comprende una secuencia de aminoácidos dentro de: SEQ ID NO: 17 (EDIII-DV1), SEC ID NO: 18 (EDIII-DV2), SEC ID NO: 19 (EDIII-DV3), SEC ID NO: 20 (EDIII-DV4), o combinaciones de las mismas.

3. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente se une a un epítopo en la región de cadena A de la glucoproteína de envoltura del virus del dengue.

4. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el epítopo comprende uno o más residuos que corresponden a aquel en una posición que se selecciona del grupo que consiste de: 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 323, 325, 327, 329, 360, 361, 362, 363, 364, 385, 387, 388, 389, 390, 391, y combinaciones de los mismos, de cualquiera de las SEC ID NOS: 17 a 20.

5. El agente de anticuerpo de conformidad can la reivindicación 4, caracterizado porque el epítopo comprende uno o más residuos que corresponden a aquel en una posición que se selecciona del grupo que consiste de: 305, 310, 311, 323, 327, 329 y combinaciones de los mismos, de cualquiera de las SEC ID NOS: 17 a 20.

6. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el epítopo comprende un residuo que comprende a aquel en la posición 305 de cualquiera de las SEC ID NOS: 17 a 20.

7. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el epítopo comprende un residuo que corresponde a aquel en la posición 310 de cualquiera de las SEC ID NOS: 17 a 20.

8. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el epítopo comprende un residuo que comprende a aquel en la posición 311 de cualquiera de las SEC ID NOS: 17 a 20.

9. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el epítopo comprende un residuo que corresponde a aquel en la posición 323 de cualquiera de las SEC ID NOS: 17 a 20.

10. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el epítopo comprende un residuo que comprende a aquel en la posición 327 de cualquiera de las SEC ID NOS: 17 a 20.

11. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el epítopo comprende un residuo que comprende a aquel en la posición 329 de cualquiera de las SEC ID NOS: 17 a 20.

12. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el residuo correspondiente se selecciona del grupo que consiste de: serina, lisina y treonina.

13. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el residuo correspondiente es lisina.

14. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el residuo correspondiente es lisina.

15. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el residuo correspondiente se selecciona del grupo que consiste de: arginina, lisina y glutamina.

16. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el residuo correspondiente se selecciona del grupo que consiste de: lisina y glutamato.

17. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el residuo correspondiente se selecciona del grupo que consiste de: arginina, aspartato, glutamato y treonina.

18. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera incluye por lo menos una región determinadora de complementariedad (CDR) que comparte por lo menos 80% de identidad de secuencia con una CDR de referencia del anticuerpo 4E11, pero difiere por sustitución de por lo menos un residuo aminoácido dentro de la CDR de manera que el agente de anticuerpo neutraliza de modo potente la totalidad de los cuatro serotipos de DV.

19. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia del anticuerpo 4E11 en que es ya sea idéntica a la CDR de referencia o incluye entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos dentro de la CDR de referencia.

20. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la CDR de referencia se selecciona del grupo que consiste de: una encontrada entre los residuos 27 y 33 de la cadena pesada de 4E11 (SEC ID NO: 1); una encontrada entre los residuos 53 y 58 de la cadena pesada de 4E11 (SEC ID NO: 1); una encontrada entre los residuos 100 y 106 de la cadena pesada de 4E11 (SEC ID NO: 1); una encontrado entre los residuos 24 y 38 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2); una encontrado entre los residuos 54 y 60 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2); una encontrado entre los residuos 93 y 101 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2); y combinaciones de los mismos.

21. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque incluso por lo menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia que se establece en lo siguiente, en donde es ya sea idéntica a la CDR de referencia o incluye entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos dentro de la CDR de referencia: las CDR de referencia son: GFNIKDT (SEC ID NO: 7), DPANGD (SEC ID NO: 8), GWEGFAY (SEC ID NO: 9), RASENVDRYG SFMH (SEC ID NO: 14), RASNLES (SEC ID NO: 15) y/o QRSNEVPWT (SEC ID NO: 16).

22. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la CDR de referencia es una CDR de cadena pesada.

23. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la CDR de referencia es una CDR de cadena ligera.

2 . El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR de cadena pesada que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia de cadena pesada y también incluye por lo menos una CDR de cadena ligera que es idéntica a una CDR de referencia de cadena ligera.

25. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque cada una de las CDR en el agente de anticuerpo es sustancialmente idéntica a una de las CDR de referencia.

26. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera incluye por lo menos una región determinadora de complementariedad (CDR) que comparte por lo menos 95% de identidad de secuencia con una CDR de referencia del anticuerpo 4E11, pero difiere por sustitución de por lo menos un residuo aminoácido dentro de la CDR, de manera que el agente de anticuerpo neutraliza de manera potente la totalidad de los cuatro serotipos de DV.

27. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia del anticuerpo 4E11 en que es idéntica a la CDR de referencia o incluye entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos dentro de la CDR de referencia.

28. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la CDR de referencia se selecciona del grupo que consiste de: una encontrada entre los residuos 27 y 33 de la cadena pesada de 4E11 (SEC ID NO: 1); una encontrada entre los residuos 53 y 58 de la cadena pesada de 4E11 (SEC ID NO: 1); una encontrada entre los residuos 100 y 106 de la cadena pesada de 4E11 (SEC ID NO: 1); una encontrada entre los residuos 24 y 38 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2); una encontrada entre los residuos 54 y 60 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2); una encontrada entre los residuos 93 y 101 de la cadena ligera de 4E11 (SEC ID NO: 2); y combinaciones de los mismos.

29. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia que se establece en lo siguiente, en que es ya sea idéntica a la CDR de referencia o incluye entre 1 y 5 sustituciones de aminoácidos dentro de la CDR de referencia: las CDR de referencia son: GFNIKDT (SEC ID NO: 7), DPANGD (SEC ID NO: 8), GWEGFAY (SEC ID NO: 9), RASENVDRYGNSFMH (SEC ID NO: 14), RASNLES (SEC ID NO: 15) y/o QRSNEVPWT (SEC ID NO: 16).

30. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la CDR de referencia es una CDR de cadena pesada.

31. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la CDR de referencia es una CDR de cadena ligera.

32. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el agente de anticuerpo incluye por lo menos una CDR de cadena pesada que es sustancialmente idéntica a una CDR de referencia de cadena pesada y también incluye por lo menos una CDR de cadena ligera que es idéntica a una CDR de referencia de cadena ligera.

33. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las CDR en el agente de anticuerpo son sustancialmente idénticas a una de las CDR de referencia.

34. El agente de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 26, caracterizado porque la CDR de región variable de cadena pesada tiene sustitución del residuo aminoácido en la posición 55.

35. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el residuo aminoácido sustituto en la posición 55 se selecciona del grupo que consiste de: glutamato y aspartato.

36. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el residuo aminoácido sustituto en la posición 55 es glutamato.

37. El agente de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 ó 26, caracterizado porque la CDR de región variable de cadena ligera tiene sustitución del residuo aminoácido en las posiciones que se seleccionan del grupo que consiste de: 31, 57, 59, 60 y combinaciones de los mismos.

38. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la CDR de región variable de cadena ligera tiene sustitución del residuo aminoácido en la posición 31.

39. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el residuo aminoácido sustituto en la posición 31 es lisina.

40. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la CDR de región variable de cadena ligera tiene sustitución del residuo aminoácido en la posición 57.

41. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el residuo aminoácido sustituto en la posición 57 se selecciona del grupo que consiste de: glutamato y serina.

42. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el residuo aminoácido sustituto en la posición 57 es glutamato.

43. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la CDR de región variable de cadena ligera tiene sustitución del residuo aminoácido en la posición 59.

44. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el residuo aminoácido sustituto en la posición 59 se selecciona del grupo que consiste de: glutamato y asparagina.

45. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el residuo aminoácido sustituto en la posición 59 es glutamina.

46. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la CDR de región variable de cadena ligera tiene sustitución del residuo aminoácido en la posición 60.

47. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el residuo aminoácido sustituto en la posición 60 se selecciona del grupo que consiste de: triptofano, tirosina y arginina.

48. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el residuo aminoácido sustituto en la posición 60 es triptofano.

49. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es una IgG.

50. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.

51. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: un anticuerpo de ratón, anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo purificado, un anticuerpo aislado, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo policlonal y combinaciones de los mismos.

52. El agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el agente de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de: un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fd, un fragmento Fd', un fragmento Fv, un fragmento dAb, un fragmento scFv, una región CDR aislada, un diacuerpo dsFv, un anticuerpo de cadena sencilla y combinaciones de los mismos.

53. Una línea de células caracterizadas porque expresan un agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.

54. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende: uno o más agentes de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1; y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.

55. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque comprende además por lo menos un agente antiviral adicional.

56. Un método para tratar un sujeto en necesidad del mismo, caracterizado porque comprende administrar un agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1.

57. Un kit, caracterizado porque comprende: por lo menos un agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1; una jeringa, aguja o aplicador para administración de por lo menos un anticuerpo o fragmento a un sujeto; e instrucciones para uso.

58. Un método de manufactura de una composición farmacéutica, caracterizado porque comprende las etapas de: proporcionar un agente de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1; y formular el agente de anticuerpo con por lo menos un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, de manera que se genere una composición farmacéutica.

59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la composición farmacéutica es una composición líquida.

60. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la composición farmacéutica se formula para administración parenteral.

61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa.

62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la composición farmacéutica se formula para administración intravenosa a un niño.

63. Un agente de anticuerpo caracterizado porque su cadena pesada es o comprende una secuencia de aminoácidos dentro de la SEC ID NO: 21 y cuya cadena ligera es o comprende una secuencia de aminoácidos dentro de la SEC ID NO: 22.

64. Un agente de anticuerpo con por lo menos una CDR caracterizado porque tiene la secuencia que se selecciona del grupo que consiste de: SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, SEC ID NO: 26, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28.