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MX2014014890A - Variantes de oxm pegilada. - Google Patents

Variantes de oxm pegilada.

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MX2014014890A
MX2014014890A MX2014014890A MX2014014890A MX2014014890A MX 2014014890 A MX2014014890 A MX 2014014890A MX 2014014890 A MX2014014890 A MX 2014014890A MX 2014014890 A MX2014014890 A MX 2014014890A MX 2014014890 A MX2014014890 A MX 2014014890A
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MX
Mexico
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oxm
fms
another embodiment
peg
fmoc
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MX2014014890A
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English (en)
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MX362432B (es
Inventor
Udi Eyal Fima
Oren Hershkovitz
Original Assignee
Opko Biolog Ltd
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Publication date
Application filed by Opko Biolog Ltd filed Critical Opko Biolog Ltd
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Abstract

Se describe una composición la cual incluye oxintomodulina y polímero de polietilenglicol (polímero PEG) enlazados vía un enlazador reversible, tal como 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden la oxintomodulina pegilada y métodos para usar las mismas.

Description

VARIANTES DE OXM PEGILADA Campo de la invención Se describe una composición que incluye oxintomodulina y polímero de polietilenglicol (polímero PEG) unidos a traves de un enlazador reversible como 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden la oxintomodulina pegilada inversa y métodos de uso de las mismas.
Antecedentes de la invención El tracto gastromtestinal es responsable de sintetizar y liberar muchas hormonas peptídicas que regulan la conducta alimentaria incluyendo la proteína pancreática (PP), péptido 1 similar al glucagón (GLP-1 ), péptido YY (PYY) y oxintomodulina (OXM). OXM surge de un procesamiento pos-transicional específico de tejidos de proglucagón en el intestino y el CNS. Contiene 37 aminoácidos, incluyendo la secuencia completa de glucagón con una extensión básica de octapéptido C-terminal que demostró que contribuye a las propiedades de OXM tanto ¡n vitro como in vivo pero no bastaba solo para los efectos del péptido. En respuesta a la ingestión de alimentos, OXM es secretada por las células intestinales L en el torrente sanguíneo proporcional al contenido calórico de la comida.
OXM mejora la remoción de glucosa mediante la estimulación de la secreción de insulina tras la administración oral e intraperitoneal. También regula el control de la ingesta de alimentos. La inyección intracerebroventricular (ICV) y la inyección intranuclear de OXM en los núcleos paraventriculares y arcuato (ARC) del hipotálamo, inhibe la realimentación en ratas en ayunas. Esta inhibición también se ha demostrado en ratas alimentadas libremente al comienzo de la fase oscura. Por otra parte, la administración periférica de OXM inhibe de forma dependiente a la dosis la toma de comida inducida rápida y en la fase oscura.
La farmacocinética desfavorable, como una vida media corta del suero, puede prevenir el desarrollo farmacéutico de muchos fármacos prometedores posibles diferentes. La vida media del suero es una característica empírica de una molécula y debe ser determinada experimentalmente para cada nuevo fármaco potencial. Por ejemplo, con fármacos de proteína de peso molecular inferior, mecanismos fisiológicos de evacuación tal como la filtración renal pueden hacer que el mantenimiento de los niveles terapéuticos de fármacos sea inviable debido al costo o la frecuencia del régimen de dosificación requerido.
Las proteínas y péptidos especialmente cortos son susceptibles a la desnaturalización o degradación enzimática en la sangre, hígado o riñón. En consecuencia, las proteínas suelen tener corta vida media circulatoria de varias horas. Debido a su baja estabilidad, los fármacos de péptido se entregan generalmente en una frecuencia sostenida para mantener una concentración plasmática efectiva del péptido activo. Además, puesto que los fármacos de péptido generalmente son administrados por infusión, inyección frecuente de fármacos de péptido causan molestia considerable a un sujeto. Por lo tanto, hay una necesidad de teenologías que prolonguen la vida media de péptidos y proteínas terapéuticas manteniendo una alta eficacia farmacológica de las mismas. Tales fármacos de péptido deseados también deben cumplir los requisitos de estabilidad mejorada del suero, alta actividad y una baja probabilidad de inducir una respuesta inmunitaria no deseada cuando se inyecta en un sujeto.
La presente invención se refiere a un derivado de OXM en la cual se prolonga la vida media del péptido utilizando una tecnología de pegilación reversible.
Breve descripción de la invención En una modalidad, la invención se refiere a una composición que consta de una oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde dicho polímero PEG se une al amino terminal de dicha oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
En una modalidad, la invención se refiere a una composición que consta de una oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde dicho polímero PEG se une a un residuo de lisina en el número de posición doce (Lys12) de dicha secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
En otra modalidad, la invención se refiere a una composición que consta de una oxintomodulina, un polímero de pol ietileng I icol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde dicho polímero PEG se une a un residuo de lisina en el número de posición treinta (Lys30) de dicha secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
En una modalidad, la invención se refiere a un metodo para mejorar el área bajo la curva (AUC) de oxintomodulina, consiste del paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al residuo de lisina en el número de posición 12 o a los residuos de lisina en el número de posición 30 o al amino terminal de dicha secuencia de ácidoaminos de oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la invención se refiere a un método para reducir la frecuencia de dosificación de oxintomodulina, consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) a los residuos de lisina en el número de posición 12 o a los residuos de lisina en el número de posición 30 o al amino terminal de dicha secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la invención se refiere a un método para extender la vida media biológica de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una proporción molar de 1 : 1 : 1 , en donde dicho polímero PEG es conjugado a un residuo de lisina en el número de la posición 12 o a un residuo de lisina en el número de posición 30 o al amino terminal de dicha secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
Otras características y ventajas de la presente invención serán aparentes de los siguientes ejemplos de la descripción detallada y dibujos. Debe ser entendido, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos mientras que indican modalidades preferidas de la invención se dan a modo de ejemplo solamente, puesto que varios cambios y modificaciones en el espíritu y el alcance de la invención serán aparentes para aquellos especializados en la teenica de esta descripción detallada.
Breve descripción de los dibujos La figura 1 muestra diversas variantes del conjugado PEG-FMS-OXM producido.
La figura 2 es un gráfico que muestra la actividad in vitro (cuantificación de cAMP) del PEG30-FMS-OXM heterogéneo y las tres variantes de PEG30-FMS-OXM (amino, Lys12 y Lys30) cuando se incubaron con células CHO-K1 con sobreexpresión del receptor de GLP-1.
La figura 3 es un gráfico que muestra la actividad in vivo del PEG30-FMS-OXM heterogéneo y las tres variantes de PEG30-FMS-OXM (amino, Lys12 y Lys30) en el modelo IPGTT. Todos los compuestos indujeron tolerancia a la glucosa en comparación con el grupo de vehículos.
La figura 4 muestra el efecto de PEG3o-FMS-OXM heterogéneo y las tres variantes de PEG30-FMS-OXM (amino, Lys12 y Lys30) en el peso corporal en ratones macho ob/ob.
La figura 5 muestra el efecto de PEG30-FMS-OXM heterogéneo y las tres variantes de PEG30-FMS-OXM (amino, Lys12 y Lys30) en la ingesta de alimentos en ratones macho ob/ob.
Las figuras 6A-B muestran el efecto de PEG30-FMS-OXM heterogéneo y las tres variantes de PEG30-FMS-OXM (amino, Lys12 y Lys30) sobre la glucosa en ayunas y con alimentos en ratones macho ob/ob.
La figura 7 muestra el efecto de MOD-6031 , OXM y liraglutida sobre la ingesta de alimentos acumulada en ratones macho ob/ob.
La figura 8 muestra el efecto de MOD-6031 , OXM y liraglutida en el peso corporal en ratones macho ob/ob.
Las figuras 9A-B muestran el efecto de MOD-6031 , OXM y liraglutida en la alimentación libremente y glucosa plasmática en ayunas en ratones macho ob/ob.
La figura 10 muestra el efecto de MOD-6031 y el grupo de alimentación en par de tolerancia a la glucosa (2 g/kg po) en el día 2 del estudio en ratones macho ob/ob.
La figura 11 muestra el efecto de MOD-6031 y el grupo de alimentación en par de tolerancia a la glucosa (2 g/kg po) el día 30 del estudio en ratones macho ob/ob.
La figura 12 muestra el efecto de MOD-6031 , OXM y liraglutida en colesterol del plasma terminal en ratones macho ob/ob.
Descripción detallada de la invención En el presente documento se proporciona una oxintomodulina de acción prolongada y los metodos de producción y uso de la misma. En un aspecto, la invención proporciona una composición que comprende o consiste en un GLP-1 dual/agonista del receptor de glucagón, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluoren¡lmetoxicarbon¡lo (FMS). En otra modalidad, la invención proporciona una composición que comprende o que consta de una oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, el polímero PEG se une a un residuo de sina en el número de posición doce (Lys12) de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía Fmoc o FMS. En una modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o que consta de polímero de oxintomodulina y polietilenglicol (polímero PEG) unido a un residuo de lisina en número de posición doce (Lys12) de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
En otro aspecto, en el presente documento se proporciona un novedoso método para extender la vida media sérica de los péptidos. Este método se basa en la unión reversible de una cadena de polietilenglicol (PEG) al péptido a través de un enlazador químico (llamado FMS o Fmoc) resultando en la liberación lenta del péptido nativo en el torrente sanguíneo. El peptido liberado entonces también puede cruzar la barrera hematoencefálica para entrar en el sistema nervioso central (CNS) o cualquier otro órgano objetivo. En una modalidad, la única estructura química del enlazador FMS conduce a una tasa específica de la liberación de péptidos.
Por lo tanto, en otra modalidad, en el presente documento se proporciona un método para extender la vida media biológica de un péptido OXM. En otra modalidad, en el presente documento se facilita un método para extender el tiempo de circulación en un fluido biológico de OXM, en donde dicho tiempo circulante se extiende por la lenta liberación del péptido de OXM intacto. En otra modalidad, ampliar dicha vida media biológica o dicho tiempo circulante de dicho péptido OXM permite que dicha OXM cruce la barrera hematoencefálica y dirigir el CNS. Será bien apreciado por la persona con experiencia que el fluido biológico puede ser sangre, suero, fluido cefalorraquídeo (CSF) y similares.
En una modalidad, en la administración de la composición oxintomodulina pegilada de la presente invención en un sujeto, la oxintomodulina es liberada en un fluido biológico en el sujeto como resultado de la hidrólisis química de dicho FMS o dicho enlazador Fmoc de dicha composición. En otra modalidad, la oxintomodulina liberada está intacta y recupera el GLP-1 completa y la actividad de enlace del receptor de glucagón. En otra modalidad, la hidrolización químicamente de dicho FMS o dicho Fmoc extiende el tiempo de circulación de dicho péptido OXM en dicho fluido biológico. En otra modalidad, extendiendo el tiempo de circulación de dicha OXM permite que dicha OXM cruce la barrera hematoencefálica y dirija el CNS. En otra modalidad, extendiendo el tiempo de circulación de dicha OXM permite que dicha OXM cruce la barrera hematoencefálica y se dirija al hipotálamo. En otra modalidad, extendiendo el tiempo de circulación de dicha OXM permite que dicha OXM cruce la barrera hematoencefálica y se dirija al núcleo arqueado.
En un aspecto, la variante de amino de PEG30-FMS-OXM (señalado MOD-6031 ) es un conjugado dirigido al sitio que comprende OXM y mPEG (30)-SH enlazados a traves de un enlazador bifuncional (FMS o Fmoc). En otra modalidad, el péptido OXM está conectado a través de su amina terminal del lado N-terminal que reacciona con el grupo éster (NHS) N-succinimida en el enlazador de un lado mientras mPEG (30)-SH está conectado ai radical de maleimida del enlazador FMS por su grupo tiol (ver ejemplos en este documento). Las variantes Lys12 y Lys30 se conjugan al enlazador FMS a través de su grupo amino de los residuos Lys. En una modalidad, se utiliza el método de pegilación reversible aquí para generar los péptidos de oxintomodulina (OXM) de larga duración se proporciona (por ejemplo, PEG30-FMS-OXM).
En una modalidad, los términos "GLP-1/ agonista del receptor glucagón" dual y "agonista" se usa indistintamente en este documento. En otra modalidad, los términos también incluyen a cualquier agonista del receptor de GLP-1/glucagón conocido en la téenica. En otra modalidad, el agonista preferido es oxintomodulina u OXM o una variante funcional de éstos.
En una modalidad, el término "funcional" se refiere a la capacidad del agonista u OXM proporcionado en este documento para tener la actividad biológica, que incluye pero no se limita a, reducción de peso, aumento de sensibilidad a la insulina, reducción de la resistencia a la insulina, aumento de gasto energético que induce tolerancia a la glucosa, inducción del control glucémico, mejorar los niveles de colesterol, etc. , como se dispone en el presente.
En una modalidad, la invención proporciona una composición que comprende una oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde el polímero PEG se une a un residuo de lisína en el número de posición treinta (Lys30) de dicha secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía Fmoc o FMS. En una modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o que consta de oxintomodulina y polímero de polietilenglicol (polímero PEG) unido a un residuo de lisina en el número de posición doce (Lys30) de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
En una modalidad, la invención proporciona una composición que consta de una oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde el polímero PEG se une a un residuo de lisina en el número de posición treinta (Lys30) de dicha secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía Fmoc o FMS. En una modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o que consta de oxintomodulina y polímero de polietilenglicol (polímero PEG) unido a un residuo de lisina en el número de posición doce (Lys30) de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
En una modalidad, la invención proporciona una composición que comprende una oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y un 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde el polímero de PEG está conectado al amino terminal de dicha oxintomodulina vía Fmoc o FMS. En una modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o consta de polímero oxintomodulina y polietilenglicol (polímero PEG) conectado al amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
En una modalidad, la invención proporciona una composición que consiste en una oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde el polímero PEG está unido al amino terminal de dicha oxintomodulina vía Fmoc o FMS. En una modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o consta de oxintomodulina y polímero de polietilenglicol (polímero PEG) unido al amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un péptido de oxintomodulina y un polímero de polietilenglicol (PEG) conjugado al aminoácido lisina del péptido oxintomodulina en la posición 12 (Lys12) o 30 (Lys30) o en el amino terminal dél péptido oxintomodulina vía un 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o enlazador 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, la presente invención proporciona un péptido oxintomodulina modificado que consta de un péptido oxintomodulina, y un polímero de polietilenglicol (PEG) conjugado en el aminoácido de lisina del péptido oxintomodulina en la posición doce (Lys12) o 30 (Lys30) o en el amino terminal del péptido oxintomodulina vía un enlazador 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, las composiciones donde PEG se une a oxintomodulina en Lys12, Lys30 o en el amino terminal respectivamente se denominan como la "variante Lys12, la "variante Lys30" o la "variante amino", de oxintomodulina. En una modalidad, el término "variante de amino" es sinónimo de la "variante N-terminal", "N" variante " o "variante N-terminal". Debe entenderse que un artesano puede guiarse por la presente invención para insertar fácilmente los residuos de lisina de manera específica del sitio o al azar a lo largo de la secuencia de OXM para unir un enlazador (Fmoc o FMS)/ conjugado PEG proporcionado aquí en estos residuos de lisina. En una modalidad, las variantes donde se encuentran uno o más residuos de lisina en diversas posiciones a lo largo de la secuencia de OXM y se utilizan para conjugar OXM a PEG y enlazador divisible (FMS o Fmoc), también se engloban en la presente invención.
En una modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un péptido oxintomodulina y un polímero de polietilenglicol (PEG) conjugado con el aminoácido de Usina del péptido oxintomodulina en la posición doce (Lys12) y 30 (Lys30) vía un 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o enlazador 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un péptido oxintomodulina y un polímero de polietilenglicol (PEG) conjugado con el aminoácido de Usina del péptido oxintomodulina en la posición 12 (Lys12) y en el amino terminal vía 9-fluorenilmetoxicarbon¡lo (Fmoc) o enlazador 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, la presente invención proporciona una composición que comprende un péptido oxintomodulina y un polímero de polietilenglicol (PEG) conjugado con el aminoácido de Usina del péptido oxintomodulina en la posición treinta (Lys30) y en el amino terminal vía un 9-fluorenilmetoxícarbonilo (Fmoc) o enlazador 2 -sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una oxintomodulina pegilada. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una oxintomodulina pegilada inversa. En otra modalidad, las frases “oxintomodulina de acción prolongada", "oxintomodulina pegilada inversa," "OXM PEGilada reversible," o "una composición que comprende o consta de oxintomodulina, polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS)" se usan indistintamente. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es OXM unida a PEG vía Fmoc o FMS. En otra modalidad, la OXM de acción prolongada es unida a Fmoc o FMS vía su residuo Lys12, o su residuo Lys30 o su amino (N') terminal.
En una modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada de la invención comprende un polímero de PEG. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada de la invención comprende un polímero PEG conjugado con el amino terminal de un peptido oxintomodulina vía Fmoc o FMS. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada de la invención comprende un polímero PEG conjugado a los residuos de Usina 12 ó 30 del péptido oxintomodulina vía Fmoc o FMS. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada de la invención comprende un polímero PEG conjugado vía Fmoc o FMS para ambos el amino terminal de un péptido oxintomodulina y a los residuos de Usina 12 y 30 de oxintomodulina.
En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o consta de oxintomodulina, polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una proporción molar de 1 :0.2-10:0.2-10. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o consta de oxintomodulina, polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una proporción molar de 1 :0.5-2:0.5-2. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es una composición que comprende o consta de oxintomodulina, polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2- sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una proporción molar de 1 : 1 : 1. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada incluye un polímero PEG conjugado con el amino terminal de oxintomodulina vía Fmoc o FMS. En otra modalidad, la relación molar de enlazador OXM-PEG-y es 1 : 1 : 1 - 1 : 1 :3.5. En otra modalidad, es la relación molar de 1 : 1 :1 -1 : 1 :10.0. En otra modalidad, la proporción más alta del enlazador permite un rendimiento optimizado de la composición.
En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada es unida a PEG vía un enlazador reversible tal como, pero no limitado a, Fmoc y FMS. En otra modalidad, Fmoc y FMS son sensibles a las bases y son removibles bajo condiciones fisiológicas. En otra modalidad, un enlazador reversible es un enlazador que es sensible a las bases y es removible bajo condiciones fisiológicas. En otra modalidad, un enlazador reversible es un enlazador que es sensible a las bases y es removible en condiciones fisiológicas en la sangre, plasma o linfa. En otra modalidad, un enlazador reversible es un enlazador que es sensible a las bases y es removible en condiciones fisiológicas en un fluido corporal. En otra modalidad, un enlazador reversible es un enlazador que es removible en un fluido corporal teniendo un pH básico. En otra modalidad, un enlazador que es sensible a las bases es dividido sobre la exposición a un ambiente básico liberando así OXM del enlazador y PEG. En otra modalidad, un enlazador que es sensible a la temperatura es dividido sobre la exposición a la temperatura específica que permite tal división tenga lugar. En otra modalidad, la temperatura que permite la división del enlazador está dentro del intervalo fisiológico.
En otra modalidad, una oxintomodulina inversa pegilada es una composición en donde OXM es unida a PEG vía un enlazador reversible. En otra modalidad, una oxintomodulina inversa pegilada libera OXM libre durante la exposición a un ambiente básico. En otra modalidad, una oxintomodulina inversa pegilada libera OXM libre durante la exposición a sangre o plasma. En otra modalidad, una oxintomodulina de acción prolongada comprende PEG y oxintomodulina que no están unidas directamente entre sí, como en los procedimientos de pegilación estándar, pero más bien ambos residuos están unidos a diferentes posiciones de Fmoc o FMS que son altamente sensibles a las bases y son removibles bajo condiciones fisiológicas normales. En otra modalidad, las condiciones fisiológicas normales incluyen un entorno fisiológico como la sangre o plasma.
En otra modalidad, se describen las estructuras y los procesos de fabricación de Fmoc y FMS en la patente de Estados Unidos No. 7585837. La descripción de la patente de los Estados Unidos No. 7585837 es por la presente incorporada mediante referencia en su totalidad.
En otra modalidad, la pegilación inversa hace de una OXM una OXM de acción prolongada. En otra modalidad, la oxintomodulina de acción prolongada es una oxintomodulina con una vida media biológica extendida. En otra modalidad, la pegilación inversa proporciona protección contra la degradación de OXM. En otra modalidad, la pegilación inversa efectúa la Cmax de OXM y reduce los efectos secundarios asociados con la administración de la composición proporcionada aquí. En otra modalidad, la pegilación inversa extiende la Tmax de OXM. En otra modalidad, la pegilación inversa extiende la vida media circulatoria de OXM. En otra modalidad, la OXM pegilada inversa ha mejorado la biodisponibilidad en comparación con OXM no modificada. En otra modalidad, OXM pegilada inversa ha mejorado la actividad biológica en comparación con OXM no modificada. En otra modalidad, la pegilación inversa aumenta la potencia de OXM.
En otras modalidades, una OXM pegilada inversa es al menos equivalente a la OXM no modificada, en cuanto a medidas bioquímicas. En otras modalidades, una OXM pegilada inversa es al menos equivalente a la OXM no modificada, en cuanto a las medidas farmacológicas. En otras modalidades, una OXM pegilada inversa es al menos equivalente a la OXM sin modificar, en terminos de capacidad de unión (Kd). En otras modalidades, una OXM pegilada inversa es al menos equivalente a la OXM sin modificar, en términos de absorción a través del sistema digestivo. En otras modalidades, una OXM pegilada inversa es más estable durante la absorción a través del sistema digestivo de OXM no modificada.
En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe niveles del área bajo la curva (AUC) de sangre mejorada en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe actividad biológica mejorada y los niveles del área bajo la curva (AUC) de sangre en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe tiempo de retención de sangre mejorada (ti/2) en comparación con OXM libre. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe mayor actividad biológica y tiempo de retención de sangre (t1/2) en comparación con OXM libre. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe niveles de Cmax mejorados en comparación con OXM libre, donde en otra modalidad resulta en un lento proceso de liberación que reduce los efectos secundarios asociados con la administración de las composiciones pegiladas inversas proporcionadas aquí. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa exhibe mayor actividad biológica y niveles de Cmax de sangre comparados con OXM libre. En otra modalidad, proporcionado en este documento es un metodo de mejora de AUC de OXM, Cmax, ti/2, actividad biológica o cualquier combinación que comprende o consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al amino terminal de OXM libre vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la mejora de AUC de OXM, Cmáx, t1/2, actividad biológica o cualquier combinación de éstos por conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al amino terminal de OXM libre vía 9-fluorenílmetoxicarbonMo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) permite la reducción en la frecuencia de dosificación de OXM. En otra modalidad, se proporciona un método para reducir una frecuencia de dosificación de OXM, que comprende o consta del paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al amino terminal o residuos de Usina de OXM vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS). En otra modalidad, la pegilación inversa de OXM es ventajosa en permitir que dosis más bajas sean utilizadas.
En otra modalidad, OXM comprende la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, OXM consiste en la secuencia del aminoácido de SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, SEQ ID NO: 1 comprende o consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos (AA): HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (SEQ ID NO: 1 ). En otra modalidad, OXM comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos representada en CAS No. 62340-29-8.
En otra modalidad, OXM es OXM humana o cualquier OXM de mamífero. En otra modalidad, OXM se conoce también como glucagón-37 o enteroglucagón bioactivo. En otra modalidad, OXM es un GLP-1/agonista del receptor glucagón dual. En otra modalidad, OXM es un fragmento biológicamente activo de OXM. En otra modalidad, OXM biológicamente activa se extiende desde el aminoácido 30 al aminoácido 37 de SEQ ID No: 1. En otra modalidad, OXM biológicamente activa se extiende desde el aminoácido 19 al aminoácido 37 SEQ ID NO: 1. En otra modalidad, OXM de la invención corresponde a un octapéptido del cual se eliminan los dos aminoácidos C-terminal. En otra modalidad, OXM de la invención corresponde a cualquier fragmento de SEQ ID NO: 1 que mantiene la actividad de OXM como se proporciona en el presente.
En una modalidad, OXM se refiere a un homólogo de péptido del péptido de SEQ ID NO: 1. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de OXM de la presente invención es por lo menos 50% homologa a la secuencia de OXM establecida en SEQ ID NO: 1 según lo determinado utilizando el software de BlastP por el Centro Nacional de información de bioteenología (NCBI) usando los parámetros por defecto. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos OXM de la presente invención es al menos 60% homologa a la secuencia de OXM establecida en SEQ ID NO: 1 según lo determinado utilizando el software de BlastP del NCBI usando parámetros por defecto. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de OXM de la presente invención es por lo menos 70% homologa a la secuencia de OXM establecida en SEQ ID NO: 1 según lo determinado utilizando el software de BlastP del NCBI usando parámetros por defecto. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de OXM de la presente invención es por lo menos 80% homologa a la secuencia de OXM establecida en SEQ ID NO: 1 según lo determinado utilizando el software de BlastP del NCBI usando parámetros por defecto. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de OXM de la presente invención es por lo menos 90% homologa a la secuencia OXM establecida en SEQ ID NO: 1 según lo determinado utilizando el software de BlastP del NCBI usando parámetros por defecto. En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de OXM de la presente invención es por lo menos 95% homologa a la secuencia de OXM establecida en SEQ ID NO: 1 según lo determinado utilizando el software de BlastP del NCBI usando parámetros por defecto.
En una modalidad, la OXM de acción prolongada de la invención mantiene la actividad biológica de OXM no modificada. En otra modalidad, la OXM de acción prolongada de la invención comprende la actividad biológica de OXM. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende reducción de las secreciones digestivas. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención implica reducir y retrasar el vaciado gástrico. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención implica la inhibición del patrón de motilidad en el intestino delgado. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención implica la inhibición de la secreción ácida estimulada por pentagastrina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende un aumento de la liberación de somatostatina gástrica. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención implica potenciar los efectos del peptido YY. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención implica la inhibición de la liberación de grelina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la estimulación de la acumulación de aminopirina y producción de cAMP. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende unir el receptor de GLP-1. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende unir el receptor de glucagón. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende estimular la producción de H+ mediante la activación de la adenilato cielasa. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención consta de la inhibición de la secreción de ácido gástrico estimulado con histamina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende inhibir la ingesta de alimentos. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención implica estimular la secreción de insulina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención consta de la inhibición de la secreción pancreática exocrina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende aumentar la sensibilidad a la insulina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende reducir los niveles de glucosa.
En una modalidad, la presente invención además proporciona un metodo para extender la vida media biológica de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una proporción molar de 1 :1 : 1 , en donde, en otra modalidad, el polímero PEG es conjugado a un residuo de lisina en el número 12 de la posición o a un residuo de lisina en el número de posición 30 o al amino terminal de la secuencia del aminoácido de la oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la invención se refiere a un método para extender la vida media biológica de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una proporción molar de 1 :1 :1 , en donde dicho polímero PEG es conjugado a un residuo de lisina en el número 12 de la posición de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la invención se refiere a un método para extender la vida media biológica de oxintomodulina, consistente en el paso de conjugar oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una proporción molar de 1 :1 :1 , en donde dicho polímero PEG es conjugado a un residuo de lisina en el número 30 de la posición dicha secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la invención se refiere a un método para extender la vida media biológica de oxintomodulina, consistente en el paso de conjugar oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS) en una proporción molar de 1 :1 :1 , en donde dicho polímero PEG es conjugado al amino terminal de dicha secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la relación molar del OXM-PEG y el enlazador es 1 : 1 : 1 -1 :1 :3.5. En otra modalidad, la relación molar es de 1 : 1 :1 -1 : 1 :10.0. En otra modalidad, la proporción más alta de enlazador permite un rendimiento optimizado de la composición.
En una modalidad, la invención se refiere a un metodo de mejorar el área bajo la curva (AUC) de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) a los residuos de sina en número de posición 12 o al residuo de lisina en el número de posición 30 o al amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la invención se refiere a un método de mejorar el área bajo la curva (AUC) de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al residuo de lisina en el número 12 de la posición de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En una modalidad, la invención se refiere a un método de mejorar el área bajo la curva (AUC) de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al residuo de lisina en el número 30 de la posición de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En una modalidad, la invención se refiere a un método de mejorar el área bajo la curva (AUC) de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En un aspecto, se proporciona en el presente documento un metodo para reducir la frecuencia de dosificación de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al residuo de Usina en número de posición 12 o al residuo de Usina en el número de posición 30 o al amino terminal de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otro aspecto, se proporciona un método para reducir la frecuencia de dosificación de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al residuo de Usina en el número 12 de la posición de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otro aspecto, en este documento se proporciona un método para reducir la frecuencia de dosificación de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al residuo de Usina en el número 30 de la posición de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otro aspecto, en este documento se proporciona un metodo para reducir la frecuencia de dosificación de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) al amino terminal de la secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
En otra modalidad, la presente invención además proporciona un método para reducir la ingesta de alimentos, en un sujeto, que comprende el paso de la administración al sujeto de una composición que consta de oxintomodulina conjugada ai polímero de polietilenglicol (polímero PEG) vía un enlazador flexible, en donde dicho enlazador flexible es 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), y en donde dicho polímero PEG es conjugado a un residuo de Usina en el número 12 de posición o a un residuo de Usina en el número de posición 30 o al amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía el Fmoc o el FMS.
En otra modalidad, la presente invención además proporciona un método para reducir el peso corporal en un sujeto, que comprende el paso de la administración al sujeto de una composición que consta de oxintomodulina conjugada al polímero de polietilenglicol (polímero PEG) vía un enlazador flexible, en donde dicho enlazador flexible es 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), y en donde dicho polímero PEG es conjugado a un residuo de Usina en el número 12 de la posición o a un residuo de sina en el número de posición 30 o al amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía el Fmoc o el FMS.
En otra modalidad, la presente invención además proporciona un método para inducir el control glucémico en un sujeto, que comprende el paso de la administración al sujeto de una composición que consta de oxintomodulina conjugada al polímero de polietilenglicol (polímero PEG) vía un enlazador flexible, en donde dicho enlazador flexible es 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), y en donde dicho polímero PEG es conjugado a un residuo de Usina en el número 12 de la posición o a un residuo de Usina en el número de posición 30 o al amino terminal de la secuencia de aminoácidos de la oxintomodulina vía el Fmoc o el FMS.
La variante amino proporcionada en este documento inesperadamente logra una ingesta reducida de alimentos, control de peso y control de glucemia, como se ejemplifica en este documento (véase el ejemplo 5). En una modalidad, la modificación de PEG del péptido de OXM proporcionado en este documento inesperadamente no interfiere con la función de OXM.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para mejorar los niveles de colesterol en un sujeto, que comprende el paso de la administración de una cantidad efectiva de una composición provista aquí. En otra modalidad, mejorar los niveles de colesterol comprende reducir el colesterol de LDL mientras aumenta el colesterol HDL en un sujeto. En otra modalidad, se reducen los niveles de colesterol LDL por debajo de 200 mg/dl, pero por encima de 0 mg/dl.
En otra modalidad, los niveles de colesterol LDL se reducen a aproximadamente 100-129 mg/dl. En otra modalidad, se reducen los niveles de colesterol LDL por debajo de 100 mg/dl, pero por encima de 0 mg/dL. En otra modalidad, se reducen los niveles de colesterol LDL por debajo de 70 mg/dL, pero por encima de 0 mg/dL. En otra modalidad, se reducen los niveles de colesterol LDL por debajo de 5.2 mmol/L, pero por encima de 0 mmol/L. En otra modalidad, se reducen los niveles de colesterol LDL a aproximadamente 2.6 a 3.3 mmol/L. En otra modalidad, se reducen los niveles de colesterol LDL por debajo de 2.6 mmol/L, pero por encima de 0 mmol/L. En otra modalidad, se reducen los niveles de colesterol LDL por debajo de 1.8 mmol/L, pero por encima de 0 mmol/L.
En otra modalidad, la presente invención además proporciona un método para reducir la resistencia a la insulina en un sujeto, que comprende el paso de la administración de una cantidad efectiva de una composición proporcionada aquí.
En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención consta de inhibición de la secreción pancreática mediante un mecanismo indirecto neural vagal. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende reducción del transporte hidromineral a través del intestino. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención implica estimular la captación de glucosa. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende controlar/estimular la secreción de somatostatina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la reducción en la ingesta de alimentos y el aumento del peso corporal. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la reducción de adiposidad. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende inapetencia. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención consta de inducir la anorexia. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende la reducción del peso corporal en sujetos con sobrepeso y con obesidad. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende inducir cambios en los niveles de las hormonas adiposas leptina y adiponectina. En otra modalidad, la actividad biológica de una OXM de acción prolongada de la invención comprende aumentar el gasto de energía además de disminuir el aporte calórico en sujetos con sobrepeso y obesidad.
En otra modalidad, un polímero de PEG se une al amino terminal o residuo de lisina de oxintomodulina vía Fmoc o FMS. En otra modalidad, los términos "unido" y "enlazado" sirven indistintamente. En otra modalidad, el polímero de PEG está unido a la cadena a-amino lateral de OXM. En otra modalidad, el polímero PEG está unido a la cadena lateral e-amino de OXM. En otra modalidad, el polímero PEG está unido a una o más cadenas laterales e-amino de OXM. En otra modalidad, el polímero PEG comprende un radical sulfhidrilo.
En otra modalidad, PEG es lineal. En otra modalidad, PEG es ramificado. En otra modalidad, PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 200 a 200,000 Da. En otra modalidad, PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 5,000 a 80,000 Da. En otra modalidad, PEG tiene un peso molecular en el intervalo de 5,000 a 40,000 Da. En otra modalidad, PEG tiene un peso molecular en la gama de 20,000 Da a 40,000 Da.
En otra modalidad, una OXM de acción prolongada se prepara usando agentes de PEGilación, significa cualquier derivado de PEG que es capaz de reaccionar con un grupo funcional tal como, pero no limitado a, NH2, OH, SH, COOH, CHO, -N=C=0, ~N=C=S, -S02CI, -S02CH=CH2, — P02CI, — (CH2)xHal, presente en el anillo de fluoreno del radical Fmoc o FMS. En otra modalidad, el agente de PEGilación se utiliza generalmente en forma mono-metoxilada donde solamente un grupo hidroxilo en un extremo de la molécula PEG está disponible para la conjugación. En otra modalidad, una forma bifuncional de PEG donde ambos términos están disponibles para la conjugación puede utilizarse si, por ejemplo, se desea obtener un conjugado con dos residuos péptido o proteína unidos covalentemente a un radical sencillo de PEG.
En otra modalidad, PEG ramificados son representados como R (PEG-OH)m en donde R representa un radical de núcleo central como pentaeritritol o glicerol, y m representa el número de brazos de ramificación. El número de brazos de ramificación (m) puede variar de tres a cien o más. En otra modalidad, los grupos hidroxilo están sujetos a modificación química. En otra modalidad, moléculas de PEG ramificado se describen en la Patente de Estados Unidos No. 6, 113,906, No. 5,919,455, No. 5,643,575 y No. 5,681 ,567, que por la presente se incorporan por referencia en su totalidad.
En otra modalidad, la presente invención proporciona OXM con un radical de PEG que no está conectado directamente a la OXM, al igual que en el procedimiento de pegilación estándar, pero más bien el radical PEG se une a traves de un enlazador como Fmoc o FMS. En otra modalidad, el enlazador es altamente sensible a las bases y es removible bajo condiciones básicas suaves. En otra modalidad, OXM conectada a PEG vía Fmoc o FMS es equivalentemente activa a la OXM libre. En otra modalidad, OXM conectada a PEG vía Fmoc o FMS es más activa que la OXM libre. En otra modalidad, OXM conectada a PEG vía Fmoc o FMS consta de diferentes actividades que la OXM libre. En otra modalidad, OXM conectada a PEG vía Fmoc o FMS a diferencia de la OXM libre, no tiene actividad del sistema nervioso central. En otra modalidad, OXM conectada a PEG vía Fmoc o FMS a diferencia de la OXM libre, no puede entrar en el cerebro a través de la barrera hematoencefálica. En otra modalidad, OXM conectada a PEG vía Fmoc o FMS consta de una vida media de circulación ampliada en comparación con la OXM libre. En otra modalidad, OXM conectada a PEG vía Fmoc o FMS pierde su radical de PEG junto con el radical Fmoc o FMS, recuperando así la OXM libre.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula: (X)n— Y, en donde Y es un radical de OXM que tiene un amino libre, carboxilo, o hidroxilo y X es un radical de la fórmula (i): En otra modalidad, es un radical que contiene una proteína o radical portador de polímero; radical de polietilenglicol (PEG); R2 es seleccionado del grupo formado por hidrógeno, alquilo, alcoxi, alcoxialquilo, arilo, alcarilo, aralquilo, halógeno, nitro, — S03H, — S02NHR, amino, amonio, carboxilo, P03H.sub.2 y OP03H2; R es seleccionado del grupo formado por hidrógeno, alquilo y arilo; R3 y R4, el mismo o diferente, cada uno se selecciona del grupo formado por hidrógeno, alquilo y arilo; A es un enlace covalente cuando el radical está unido a un grupo amino o hidroxilo de la OXM-Y; n es un entero de por lo menos uno, y sus sales farmaceuticamente aceptables.
En otra modalidad, los términos "alquilo", "alcoxi", "alcoxialquilo", "arilo", "alcarilo" y "aralquilo" se utilizan para denotar radicales alquilo de 1-8, preferentemente 1 a 4 átomos de carbono, por ejemplo los radicales metilo, etilo, propilo, isopropilo y butilo y arilo de 6-10 átomos de carbono, por ejemplo, fenilo y naftilo. El término "halógeno" incluye fluoro, cloro, bromo y yodo.
En otra modalidad, R2, R3 y R4 son cada hidrógeno y es — OCO— , es decir el radical 9-fluorenilmetoxicarbonilo (en lo sucesivo "Fmoc"). En otra modalidad, R es -S03H en la posición 2 del anillo fluoreno, R3 y R son cada uno hidrógeno y A es --OCO--, es decir el radical 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (en lo sucesivo "FMS").
En otra modalidad, la pegilación de OXM y preparación de los conjugados (PEG-Fmoc)n- OXM o (PEG-FMS)n-OXM incluye unir MAL-FMS-NHS o MAL-Fmoc-NHS al componente amina de OXM, obteniendo así un conjugado MAL-FMS-OXM o MAL-Fmoc-OXM y luego sustituir PEG-SH para el radical maleimida, produciendo el conjugado (PEG-FMS)n-OXM o (PEG-Fmoc)n-OXM, respectivamente.
En otra modalidad, la pegilación de OXM incluye la reacción de MAL-FMS-NHS o MAL-Fmoc-NHS con PEG-SH, así formando un conjugado PEG-FMS-NHS o PEG-Fmoc-NHS y luego reacciona con el componente de amina de OXM dando por resultado el conjugado (PEG-FMS)n-OXM o (PEG-Fmoc)n-OXM deseado, respectivamente. En otra modalidad, se describe la pegilación de péptidos/proteínas tales como OXM en la patente de Estados Unidos No. 7585837, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. En otra modalidad, pegilación-inversa de péptidos/proteínas tales como OXM con Fmoc o FMS se describen en la patente Estados Unidos No. 7585837.
En otra modalidad, las frases "OXM de acción prolongada" y "OXM pegilada inversa" se usa indistintamente. En otra modalidad, OXM pegilada inversa se compone de PEG-FMS-OXM y PEG-Fmoc-OXM identificados en el presente por las fórmulas: (PEG-FMS)n-OXM o (PEG-Fmoc)n-OXM, donde n es un entero de al menos uno, y OXM está unida con el radical de FMS o Fmoc a través de por lo menos un grupo amino.
En otra modalidad, la conjugación de PEG-Fmoc o PEG-FMS a Lys12 o Lys30 o al amino terminal de OXM no hace que la OXM sea inactiva.
En una modalidad, la variante Lys12 es más eficaz para proporcionar el control de peso que las otras variantes provistas aquí. En otra modalidad, la variante Lys30 provista aquí es más efectiva para lograr el control del peso que las otras variantes provistas aquí. En otra modalidad, la variante amino provista aquí es más efectiva para lograr el control de peso que las otras variantes provistas aquí.
En una modalidad, la variante Lys12 es más efectiva para lograr el control glucémico crónica que las otras variantes provistas aquí. En otra modalidad, la variante Lys30 provista aquí es más efectiva para lograr el control glucémico crónico que las otras variantes provistas aquí. En otra modalidad, la variante amino provista es más efectiva para lograr el control glucémico que las otras variantes provistas aquí.
Usos terapéuticos En otra modalidad, PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para la prevención de hiperglucemia, para mejorar el control glucémico, para el tratamiento de la diabetes mellitus seleccionada del grupo consiste en diabetes mellitus no insulino dependiente (en una modalidad, diabetes tipo 2), diabetes mellitus insulino dependiente (en una modalidad, diabetes tipo 1 ) y diabetes mellitus gestacional o cualquier combinación de éstas. En otra modalidad, PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para el tratamiento de la Diabetes tipo 2. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y composiciones farmaceuticas que los comprenden se utilizan para aumentar la sensibilidad a la insulina. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para reducir la resistencia a la insulina.
En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para la supresión del apetito. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para inducir la saciedad. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para la reducción del peso corporal. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para la reducción de la grasa corporal. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para la reducción del índice de masa corporal. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprende se utilizan para la reducción del consumo de alimentos. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para el tratamiento de la obesidad. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para el tratamiento de la diabetes asociada a la obesidad. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para aumentar el ritmo cardíaco. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para aumentar la tasa metabólica basal (BMR). En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para aumentar el gasto de energía. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para la inducción de la tolerancia a la glucosa. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para inducir el control glucémico. En una modalidad, el control glucémico se refiere a niveles de glucosa en sangre no altos y/o sin fluctuación y/o niveles de hemoglobina glicosilada no altos y/o sin fluctuación.
En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para inhibir el aumento de peso, donde en otra modalidad, el aumento de peso es debido al aumento de grasa. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para reducir los niveles de glucemia. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para disminuir la ingesta calórica. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para disminuir el apetito. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para el control del peso. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para inducir o promover la pérdida de peso. En otra modalidad, las variantes de PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para el mantenimiento de uno o más de un peso corporal deseado, un índice de masa corporal deseado, una apariencia deseada y buena salud. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para el control de un perfil lipídico. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para reducir los niveles de triglicéridos. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmaceuticas que los comprenden se utilizan para reducir los niveles de glicerol. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para aumentar los niveles de adiponectina. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para reducir los niveles de ácidos grasos libres.
En una modalidad, los términos "reducir el nivel de" se refiere a una reducción de alrededor del 1 -10% en relación con un nivel original, tipo salvaje, normal o nivel de control. En otra modalidad, la reducción es de alrededor de 1 1 -20%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 21 -30%. En otra modalidad, la reducción es de alrededor de 31-40%. En otra modalidad, la reducción es de 41 -50%. En otra modalidad, la reducción es de 51 -60%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 61 -70%. En otra modalidad, la reducción es de alrededor de 71 -80%. En otra modalidad, la reducción es de alrededor de 81 -90%. En otra modalidad, la reducción es de aproximadamente 91 -95%. En otra modalidad, la reducción es de alrededor del 96-100%.
En una modalidad, los términos "que aumenta el nivel de" o "que extiende" se refiere a un aumento de alrededor del 1 -10% en relación con un nivel original, tipo salvaje, normal o de control. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 11 -20%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 21 -30%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 31 -40%. En otra modalidad, el incremento es de 41 -50%. En otra modalidad, el incremento es de 51 -60%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 61-70%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 71 -80%. En otra modalidad, el incremento es de 81 -90%. En otra modalidad, el aumento es de aproximadamente 91 -95%. En otra modalidad, el aumento es de alrededor del 96-100%.
En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y composiciones farmaceuticas que los comprenden se utilizan para reducir los niveles de colesterol. En una modalidad, la reducción de los niveles de colesterol es mayor que la reducción observada tras la administración de OXM nativa. En una modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden disminuyen los niveles de colesterol en un 60-70%. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden bajan niveles de colesterol por 50-100%. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprende bajan los niveles de colesterol por 25-90%. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden bajan los niveles de colesterol en un 50-80%. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmaceuticas que los comprenden bajan niveles de colesterol por 40-90%. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se utilizan para aumentar los niveles de colesterol HDL.
En una modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden pueden utilizarse para los fines descritos en este documento sin una disminución significativa en la efectividad en el transcurso de la administración. En una modalidad, PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces durante 1 día. En otra modalidad, PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces por 2-6 días. En una modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces durante 1 semana. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces durante 2 semanas. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces durante 3 semanas. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces durante 4 semanas. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces durante 6 semanas. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces durante 2 meses. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces durante 4 meses. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces durante 6 meses. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden siguen siendo eficaces durante 1 año o más.
En una modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden se pueden utilizar para los fines descritos en este documento y pueden ser efectivas inmediatamente después de la administración de la primera dosis. En otra modalidad, las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden son eficaces después que dos o más dosis se han administrado.
En otra modalidad, los métodos para utilizar las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionados aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden como se describe arriba se aplican a un sujeto humano afligido con una enfermedad o condición que puede ser aliviada, inhibida y/o tratada por OXM. En otra modalidad, los métodos para utilizar las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden como se describe antes son métodos de veterinaria. En otra modalidad, los métodos para utilizar las variantes PEG-Fmoc-OXM y PEG-FMS-OXM proporcionadas aquí y las composiciones farmacéuticas que los comprenden como se describen aquí se aplican a los animales tales como animales de granja, mascotas y animales de laboratorio. Así, en una modalidad, un sujeto de la presente invención es felino, canino, bovino, porcino, murino, equmo, etc.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o reducir una enfermedad tratable o reducible por OXM o una formulación farmacéutica que la comprende, en un sujeto, que comprende el paso de la administración a un sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de las variantes PEG-Fmoc-OXM y/o PEG-FMS-OXM proporcionadas en este documento, para tratar o reducir de este modo una enfermedad tratable o reducible por OXM en un sujeto.
En otra modalidad, OXM, "péptido" o "proteína" como se usa aquí abarca péptidos nativos (productos de degradación, proteínas sintetizadas sintéticamente o proteínas recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, proteínas sintéticamente sintetizadas), así como peptoides y semipeptoides que son análogos de la proteína, que tienen, en algunas modalidades, modificaciones que hacen a las proteínas aún más estables mientras estén en un cuerpo o más capaces de penetrar en las células.
En otra modalidad, una "variante PEG-Fmoc-OXM o una variante PEG-FMS-OXM" es una variante PEG-Fmoc-OXM y/o una variante PEG-FMS-OXM con lo cual FMS o Fmoc se une a OXM en Lys12. En otra modalidad, la variante PEG-Fmoc-OXM y/o PEG-FMS-OXM es una variante PEG-Fmoc-OXM y/o PEG-FMS-OXM en donde FMS o Fmoc está unido a OXM en Lys30. En otra modalidad, la variante PEG-Fmoc-OXM y/o PEG-FMS-OXM es una variante PEG-Fmoc-OXM o PEG-FMS-OXM con lo cual FMS o Fmoc está unido a OXM en el amino terminal.
En otra modalidad, las modificaciones incluyen, pero no se limitan a la modificación N terminal, modificación terminal C, modificación de enlace peptídico, incluyendo pero no limitado a, CH2-NH, CH2-S, S = CH2-0, 0=C-NH, CH2-0, CH2-CH2, S = C-NH, CH = CH o CF=CH, modificaciones de la columna vertebral y modificación de residuos. Los métodos para la preparación de compuestos peptidomiméticos son bien conocidos en la téenica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992) que se incorpora por referencia como si totalmente se estableciera aquí. Más detalles en este sentido se proporcionan abajo.
En otra modalidad, los enlaces peptídicos (-CO-NH-) en el péptido son sustituidos. En algunas modalidades, los enlaces peptídicos son sustituidos por enlaces N-metilados (-N(CH3)-CO-). En otras modalidades, los enlaces peptídicos son sustituidos por enlaces éster (-C(R)H-C-O-0-C(R)-N-). En otra modalidad, los enlaces de péptido son sustituidos por enlaces cetometileno (-CO-CH2-). En otra modalidad, los enlaces peptídicos son sustituidos por enlaces a-aza (-NH-N(R)-CO-), donde R es cualquier alquilo, por ejemplo, metilo, enlaces carba (-CH2-NH-). En otras modalidades, los enlaces peptídicos son sustituidos por enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2-). En otra modalidad, los enlaces peptídicos son sustituidos por enlaces tioamida (-CS-NH-). En algunas modalidades, los enlaces peptídicos son sustituidos por dobles enlaces olefínicos (-CH = CH-). En otra modalidad, los enlaces peptídicos son sustituidos por enlaces amida retro (-NH-CO-). En otra modalidad, los enlaces peptídicos son sustituidos por derivados de péptido (-N(R)-CH2-CO-), donde R es la cadena lateral "normal", presentados naturalmente en el átomo de carbono. En algunas modalidades, estas modificaciones se producen en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena peptídica e incluso en varios (enlaces de 2-3) al mismo tiempo.
En una modalidad, los aminoácidos aromáticos naturales de la proteína como Trp, Tyr y Phe, son sustituidos por ácido sintético no natural tales como fenilglicina, TIC, naftilelanina (Nol), derivados de anillo-metilado de Phe, derivados halogenados de Phe o o-metil-Tyr. En otra modalidad, los péptidos de la presente invención incluyen uno o más monómeros de aminoácido modificado o uno o más monómeros no amino ácido (por ejemplo, ácidos grasos, complejos de carbohidratos etc.).
En comparación con la OXM tipo silvestre, los derivados de OXM o variantes de la presente invención contienen varias sustituciones de aminoácido, y/o pueden ser pegilados o modificados de otra forma (por ejemplo por vía recombinante o química).
La OXM proporcionada aquí también cubre cualquier análogo de la secuencia OXM anterior. Cualquier residuo de aminoácido uno o más en la secuencia puede reemplazarse independientemente con un reemplazo conservador como es bien conocido en la téenica, es decir, reemplazando un aminoácido con uno de un tipo similar químico como la sustitución de un aminoácido hidrofóbico con el otro. Alternativamente, las mutaciones del aminoácido no conservador pueden hacer que resulte en un efecto mayor o actividad biológica de OXM. En una modalidad, la OXM es modificada para ser resistente a la división y la inactivación por dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV). Derivados y variantes de OXM y métodos de generación de la misma se describen en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No. 2011/0152182, publicación de solicitud de patente de Estados Unidos No. 2011/0034374, publicación de solicitud de patente de Estados Unidos Nos. 2010/0144617, todas las cuales están incorporadas por referencia en este documento.
En una modalidad, se puede modificar químicamente el agonista del receptor de GLP-1/glucagón dual proporcionado aquí. En otra modalidad, se puede modificar químicamente la OXM provista aquí. En particular, las cadenas laterales de aminoácidos, el amino terminal y/o el ácido carboxilo terminal de OXM pueden ser modificados. Por ejemplo, la OXM puede experimentar uno o más de alquilación, formación de disulfuro, complejo de metal, acilación, esterificación, amidación, nitración, tratamiento con ácido, tratamiento con base, oxidación o reducción. Los metodos para llevar a cabo estos procesos son bien conocidos en la téenica. En particular la OXM se proporciona como un éster de alquilo inferior, una amida de alquilo inferior, una amida de dialquilo inferior, una sal de adición de ácido, una sal carboxilato o una sal de adición de alquilo de la misma. En particular, los términos amino o carboxílico de la OXM puede derivarse por ejemplo, por esterificación, amidación, acilación, oxidación o reducción. En particular, el carboxílico terminal de la OXM puede derivarse para formar un radical de amida.
En una modalidad, "aminoácido" o "aminoácidos" se entiende que incluye los 20 aminoácidos naturales; a menudo esos aminoácidos son modificados de forma postraslación in vivo, incluyendo, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales incluyendo pero no limitado a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, no-valina, no-leucina y ornitina. En una modalidad, "aminoácido" incluye dos D- y L-aminoácidos. Debe entenderse que otros aminoácidos sintéticos o modificados pueden también utilizarse.
En una modalidad, la OXM de la presente invención se utilizan en la terapéutica que requiere OXM para estar en una forma soluble. En otra modalidad, OXM de la presente invención incluye uno o más aminoácidos naturales o no naturales polares, incluyendo pero no limitado a, serina y treonina, que son capaces de aumentar la solubilidad de la proteína debido a su cadena lateral que contiene hidroxilo.
En una modalidad, OXM de la presente invención se sintetiza bioquímicamente al usar téenicas estándar de fase sólida. En otra modalidad, estos métodos bioquímicos incluyen síntesis en fase sólida exclusiva, síntesis en fase sólida parcial, condensación de fragmento o síntesis de solución clásica.
En una modalidad, los procedimientos de síntesis de OXM de fase sólida son bien conocidos por un experto en la técnica y se describe además por John Morrow Stewart y Janis Dillaha Young, Solid Phase Protein Syntheses (2a Ed., Pierce Chemical Company, 1984). En otra modalidad, las proteínas sintéticas son purificadas por cromatografía líquida de alto rendimiento preparativa [Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principies. WH Freeman and Co. N.Y.] y cuya composición se puede confirmarse a través de la secuencia del aminoácido por métodos conocidos por un experto en la técnica.
En otra modalidad, técnicas de la proteína recombinante se utilizan para generar la OXM de la presente invención. En algunas modalidades, las técnicas de proteína recombinante se utilizan para la generación de grandes cantidades de OXM de la presente invención. En otra modalidad, técnicas recombinantes se describen por Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:51 1 -514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311 , Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680 y Brogli et al., (1984) Science 224:838-843, Gurlcy et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463.
En otra modalidad, OXM de la presente invención se sintetiza utilizando un polinucleótido de codificación de OXM de la presente invención. En algunas modalidades, el polinucleótido de codificación de OXM de la presente invención está ligado a un vector de expresión, que comprende un control transcripcional de una secuencia cis-reguladora (por ejemplo, secuencia del promotor). En algunas modalidades, la secuencia cis-reguladora es adecuada para dirigir la expresión constitutiva de la OXM de la presente invención.
En una modalidad, la frase "un polinucleótido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla o de doble cadena que es aislada y proporcionada en la forma de una secuencia de RNA, una secuencia de polinucleótido complementaria (cDNA), una secuencia genómica de polinucleótido y/o secuencias de polinucleótido compuestas (por ejemplo, una combinación de las anteriores).
En una modalidad, "secuencia complementaria de polinucleótido" se refiere a una secuencia, que resulta de la transcripción inversa del RNA mensajero usando una transcriptasa inversa o cualquier otra DNA polimerasa dependiente del RNA. En una modalidad, la secuencia puede ser amplificada posteriormente in vivo o in vitro usando una DNA polimerasa.
En una modalidad, "secuencia genómica de polinucleótido" se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y por lo tanto representa una porción contigua de un cromosoma.
En una modalidad, "secuencia de polinucleótido compuesta" se refiere a una secuencia de, por lo menos parcialmente complementaria y por lo menos parcialmente genómica. En una modalidad, una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exonales requeridas para codificar el péptido de la presente invención, así como algunas secuencias intrónicas interpuestas entre éstas. En una modalidad, las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, incluyendo de otros genes y típicamente incluirá secuencias de señal de empalme conservadas. En una modalidad, las secuencias intrónicas incluyen elementos reguladores de la expresión cis.
En una modalidad, polinucleótidos de la presente invención se preparan mediante téenicas de PCR, o cualquier otro método o procedimiento conocido por un experto en la técnica. En algunas modalidades, el procedimiento consiste en la ligadura de dos diferentes secuencias de DNA (véase, por ejemplo, "Current Protocols in Molecular Biology”, eds. Ausubel et al., John Wilcy & Sons, 1992).
En una modalidad, una variedad de células procarióticas o eucarióticas puede utilizarse como sistemas de expresión hospedera para expresar la OXM de la presente invención. En otra modalidad, éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos como bacterias transformadas con un bacteriófago recombinante de DNA, DNA plásmido o vector de expresión cósmido DNA que contienen la secuencia de codificación de proteína; levadura transformada con vectores de expresión recombinante, levadura que contienen la secuencia de codificación de proteína; sistemas de células infectadas con vectores virus recombinante de la expresión (por ejemplo, virus del mosaico del coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de la expresión del plásmido recombinante, como el plásmido Ti, que contiene la secuencia de codificación de la proteína.
En una modalidad, sistemas de expresión no bacteriana son usados (por ejemplo, sistemas de expresión de mamíferos tales como células CHO) para expresar la OXM de la presente invención. En una modalidad, el vector de expresión utilizado para expresar polinucleótidos de la presente invención en células de mamífero es el vector de pCI-DHFR compuesto por un promotor de CMV y un gene de resistencia a neomicina.
En otra modalidad, en los sistemas bacterianos de la presente invención, un número de vectores de la expresión puede ser ventajosamente seleccionado dependiendo del uso previsto para la proteína expresada. En una modalidad, se desean grandes cantidades de OXM. En una modalidad, vectores que dirigen la expresión de niveles elevados del producto de proteína, posiblemente como una fusión con una secuencia de señal hidrofóbica, que dirige el producto expresado en la periplasma de las bacterias o el medio de cultivo donde fácilmente se purifica el producto de proteína se desean. En una modalidad, cierta proteína de fusión diseñada con un sitio específico de división para ayudar en la recuperación de la proteína. En una modalidad, vectores adaptables a tal manipulación incluyen, pero no se limitan a, la serie pET de vectores de la expresión de E. coli [Studier et al., Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
En una modalidad, se utilizan sistemas de expresión de la levadura. En una modalidad, puede utilizarse un número de vectores que contienen promotores inducibles o constitutivos en la levadura como se describe en la solicitud de patente de Estados Unidos No: 5,932,447. En otra modalidad, se utilizan los vectores que promueven la integración de secuencias extranjeras de DNA en el cromosoma de la levadura.
En una modalidad, el vector de expresión de la presente invención adicional puede incluir secuencias de polinucleótido adicionales que permiten, por ejemplo, la traducción de varias proteínas de un mRNA solo como un sitio de entrada interna del ribosoma (IRES) y secuencias para integración genómica de la proteína quimérica-promotor.
En una modalidad, los vectores de expresión de mamífero incluyen, pero no están limitados a, pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1 , pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT 1 , pNMT41 , pNMT81 , que están disponibles de Invitrogen, pCI disponible en Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV que están disponibles de Strategene, pTRES que está disponible en Clontech y sus derivados.
En otra modalidad, los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucarióticos como los retrovirus son utilizados por la presente invención. Los vectores de SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. En otra modalidad, los vectores derivados de virus del papiloma bovino incluyen VGP-1 MTHA, y vectores derivados de virus Epstein Bar incluyen pHEBO y p205. Otros vectores ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus y cualquier otro vector que permite la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano SV-40, SV-40 promotor posterior, metalotioneína promotor, promotor del virus de tumor mamario murino, promotor de virus sarcoma de Rous, promotor polihedrina u otros promotores se muestra eficaces para su expresión en las células eucarióticas.
En una modalidad, se utilizan los vectores de expresión vegetal. En una modalidad, la expresión de secuencia de codificación de OXM es impulsada por un número de promotores. En otra modalidad, los promotores virales como los 35S RNA y promotores de 19S RNA de CaMV [Brlsson et al. , Nature 310:511 -514 (1984)], o el promotor de la proteína de capa a TMV [Takamatsu et al., EMBO J. 6:307-31 1 (1987)] se utilizan. En otra modalidad, los promotores de planta se utilizan como, por ejemplo, la subunidad pequeña de RUBISCO [Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671-1680 (1984); y Brogli et al., ciencia 224:838-843 (1984)] o promotores de choque térmico, por ejemplo, soya hsp17.5-E o hsp17.3-B [Gurlcy et al., Mol. Cell Biol 6:559-565 (1986)]. En una modalidad, constructos se introducen en las células vegetales mediante Ti plásmido, Ri plásmido, vectores virales vegetales, transformación directa de DNA, micromyección, electroporación y otras téenicas bien conocidas por el experto en la técnica. Véase, por ejemplo, Weissbach & Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academlc Press, NY, Section VIII, pp 421 -463 (1988)]. Otros sistemas de expresión tales como los sistemas de célula huésped de insecto y mamífero, que son bien conocidos en la téenica, también pueden ser utilizados por la presente invención.
Se apreciará que otros que contienen los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada (codificación de la proteína), el constructo de la expresión de la presente invención también puede incluir secuencias diseñadas para optimizar la estabilidad, la producción, purificación, producción o actividad de la proteína expresada.
Varios métodos, en algunas modalidades, pueden utilizarse para introducir el vector de expresión de la presente invención en el sistema de célula huésped. En algunas modalidades, tales métodos se describen generalmente en Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Coid Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wilcy and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al. , Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, véase la patente de Estados Unidos No. 5,464,764 y 5,487,992 para los métodos de selección positiva-negativa.
En una modalidad, las células transformadas se cultivan en condiciones efectivas, que permiten la expresión de altas cantidades de OXM recombinante. En otra modalidad, las condiciones de cultivo efectivo incluyen, pero no se limitan a, los medios eficaces, biorreactor, temperatura, pH y condiciones oxígeno que permiten la producción de proteínas. En una modalidad, un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el cual una célula se cultiva para producir la OXM recombinante de la presente invención. En otra modalidad, un medio típicamente incluye una solución acuosa teniendo carbono asimilable, nitrógeno y fuentes de fosfato y sales apropiadas, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas. En una modalidad, las células de la presente invención pueden ser cultivadas en biorreactores para la fermentación convencional, matraces de agitar, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas de petri. En otra modalidad, el cultivo se realiza a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiado para una célula recombinante. En otra modalidad, las condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de uno de ordinaria habilidad en la téenica.
En una modalidad, dependiendo del sistema de vector y hospedero utilizado para la producción de OXM resultante de la presente invención que permanece dentro de la célula recombinante, secretado en el medio de fermentación, secretado en un espacio entre dos membranas celulares, tales como el espacio periplásmico en E. coli; o retenidas en la superficie exterior de una célula o membrana viral.
En una modalidad, después de un tiempo predeterminado en el cultivo, se efectúa la recuperación de la OXM recombinante.
En una modalidad, la frase "recuperando la OXM recombinante " en este documento se refiere a recoger el medio de fermentación entera que contiene la OXM y no necesita implicar pasos adicionales de separación o purificación.
En una modalidad, la OXM de la presente invención es purificada usando una variedad de téenicas de purificación de proteínas estándar, tales como, pero no limitado a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, gel para cromatografía de filtración, cromatografía de fase reversa, cromatografía concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.
En una modalidad, para facilitar la recuperación, la secuencia de codificación expresada puede diseñarse para codificar la proteína de la presente invención y un radical fusionado divisible. En una modalidad, una proteína de fusión puede ser diseñada para que la proteína pueda aislarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad; por ejemplo, por inmovilización en una columna específica para el radical divisible. En una modalidad, se ha creado un sitio divisible entre la proteína y el radical divisible y la proteína puede ser liberada de la columna cromatográfica por tratamiento con una enzima apropiada o agente que divide específicamente la proteína de fusión en este sitio [por ejemplo, véase Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y Gardella et al., 265: 15854 J. Biol Chem-15859 (1990)]. En otra modalidad, la OXM de la presente invención se recupera en forma " sustancialmente pura". En otra modalidad, la frase "sustancialmente pura" se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la OXM en los usos descritos aquí.
En una modalidad, la OXM de la presente invención puede también ser sintetizada usando sistemas de expresión in vitro. En una modalidad, los métodos de síntesis in vitro son bien conocidos en la téenica y los componentes del sistema están comercialmente disponibles.
En otra modalidad, actividad in vitro es comprobada mediante la medición de la capacidad de OXM nativa, recombinante y/o inversa pegilada como se describe en este documento, así como composiciones farmacéuticas que comprende la misma para tratar o aliviar enfermedades o afecciones tales como pero no limitada a: diabetes mellitus, obesidad, trastornos alimentarios, trastornos metabólicos, etc. En otra modalidad, la actividad in vivo es deducida por las medidas conocidas de la enfermedad que está siendo tratada.
En otra modalidad, una dosis de péptido OXM de la presente invención consta de 0.005 a 0.1 mg/kg en solución inyectable. En otra modalidad, el consta de 0.005 a 0.5 mg/kg de péptido OXM. En otra modalidad, la dosis se compone de 0.05 a 0.1 microgramos de péptido OXM. En otra modalidad, la dosis comprende de 0.005 a 0.1 mg/kg de péptido OXM de solución inyectable.
En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez al día. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 36 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 48 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 60 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 72 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 84 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 96 horas. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 5 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 6 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 7 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 8-10 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 10-12 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 12-15 días. En otra modalidad, una dosis de OXM pegilada inversa se administra una vez cada 15-25 días.
En otra modalidad, la OXM pegilada inversa de la presente invención es administrada por una inyección intramuscular ( I M) , subcutánea (SC) o la inyección intravenosa (IV) una vez por semana.
En otra modalidad, la OXM pegilada inversa de la presente invención se puede proporcionar al individuo propiamente. En una modalidad, la OXM pegilada inversa de la presente invención puede proporcionar al individuo como parte de una composición farmaceutica donde se mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de acción prolongada OXN como se describe en este documento con otros componentes químicos como portadores fisiológicos adecuados y excipientes. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es responsable del efecto biológico.
En otra modalidad, cualquiera de las composiciones de esta invención constará de al menos una OXM pegilada inversa. En una modalidad, la presente invención proporciona preparaciones combinadas. En una modalidad, "una preparación combinada" define especialmente un "kit de partes" en el sentido de que los socios de combinación, como se definió anteriormente pueden dosificarse independientemente o por el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades distinguidos de los socios de combinación es decir, al mismo tiempo, simultáneamente, por separado o secuencialmente. En algunas modalidades, las piezas del kit de piezas, por ejemplo, se pueden administrar simultáneamente o cronológicamente escalonados, en momentos diferentes y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. El cociente de las cantidades totales de los interlocutores de la combinación, en algunas modalidades, puede ser administrado en la preparación combinada. En una modalidad, la preparación combinada puede ser variada, por ejemplo, con el fin de hacer frente a las necesidades de una subpoblación de pacientes para ser tratados y las necesidades del paciente individual que diferentes necesidades pueden ser debido a una enfermedad particular, severidad de la enfermedad, edad, sexo o peso corporal pueden realizar fácilmente por una persona experta en la téenica.
En otra modalidad, las frases "portador fisiológicamente aceptable " y "portador farmacéuticamente aceptable" que se usan indistintamente se refieren a un portador o un diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no deroga la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Un adyuvante está incluido en estas frases. En una modalidad, uno de los ingredientes incluidos en el portador farmacéuticamente aceptable puede ser por ejemplo polietilenglicol (PEG), un polímero biocompatible con una amplia gama de solubilidad en medios tanto orgánicos y acuosos (Mutter et al (1979).
En otra modalidad, "excipiente" se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de una OXN de acción prolongada. En una modalidad, los excipientes incluyen el carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de la celulosa, gelatina, aceites vegetales y glicoles de polietileno.
Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se encuentran en " Remington’s Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co. , Easton, PA, última edición de Easton, PA, que se incorporan aquí por referencia.
En otra modalidad, las vías adecuadas de administración del péptido de la presente invención, por ejemplo, incluyen oral, rectal, vía transmucosa, transnasal, intestinal o administración parenteral, incluyendo intramuscular, subcutánea e intramedular inyecciones así como intratecal, inyecciones directas intraventriculares, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
La presente invención también incluye OXM pegilada inversa para uso en la fabricación de un medicamento para la administración por vía periférica al cerebro para cualquiera de los métodos de tratamiento descrito anteriormente. Ejemplos de rutas periféricas oral, rectal, parenteral intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, por ejemplo la mucosa nasal por ejemplo bucal, sublingual, subcutánea o administración transdérmica, incluyendo la administración por inhalación. A continuación se recogen cantidades de dosis preferidas de OXM para los medicamentos.
La presente invención proporciona una composición farmacéutica compuesta por OXM pegilada inversa y un portador farmacéuticamente adecuado, en un formato adecuado para la administración oral, rectal, parenteral, por ejemplo vía intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, la mucosa nasal por ejemplo bucal, sublingual, subcutáneo o administración transdérmica, incluyendo la administración por inhalación. Si está en la forma de dosificación unitaria, puede ser la dosis por unidad, por ejemplo, como se describe a continuación o como se calcula sobre la base por kg de dosis dadas abajo.
En otra modalidad, la preparación es administrada de forma local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante la inyección de la preparación directamente en una región específica del cuerpo del paciente. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa está formulado en una forma de dosificación intranasal. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa está formulado en una forma de dosificación inyectable.
Se contemplan varias modalidades de intervalos de dosis por esta invención: el componente de peptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa es administrado en un intervalo de 0.01 -0.5 mg/kg peso corporal por 3 días (sólo el peso de la OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa es proporcionado como el tamaño del PEG puede diferir sustancialmente). En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa es administrado en un intervalo de 0.01-0.5 mg/kg peso corporal por 7 días. En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa es administrado en un intervalo de 0.01 -0.5 mg/kg peso corporal por 10 días. En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa es administrado en un intervalo de 0.01-0.5 mg/kg peso corporal por 14 días. En otra modalidad, inesperadamente, la cantidad efectiva de OXM en una composición de OXM pegilada inversa es 1/4-1/10 de la cantidad efectiva de OXM libre. En otra modalidad, inesperadamente, la pegilación de OXM inversa permite limitar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por al menos un 50% en comparación con OXM libre. En otra modalidad, inesperadamente, la pegilación inversa de OXM permite limitar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por lo menos 70% comparado con OXM libre. En otra modalidad, inesperadamente, la pegilación de OXM inversa permite limitar la cantidad de OXM prescrita a un paciente al menos un 75% en comparación con OXM libre. En otra modalidad, inesperadamente, la pegilación de OXM inversa permite limitar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por al menos un 80% en comparación con OXM libre. En otra modalidad, inesperadamente, la pegilación inversa de OXM permite limitar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por lo menos un 85% en comparación con OXM libre. En otra modalidad, inesperadamente, la pegilación inversa de OXM permite limitar la cantidad de OXM prescrita a un paciente por al menos 90% comparado con OXM libre.
En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilado inversa es administrado en un intervalo de 0.01 -0.5 mg/kg de peso corporal una vez cada 3 días (sólo el peso de la OXM dentro de la composición de OXM pegilado inversa es proporcionado como el tamaño del PEG puede diferir sustancialmente). En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilado inversa es administrado en un intervalo de 0.01 -0.5 mg/kg peso corporal una vez cada 7 días. En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa es administrado en un intervalo de 0.01-0.5 mg/kg peso corporal una vez cada 10 días. En otra modalidad, el componente de péptido OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa es administrado en un intervalo de 0.01 -0.5 mg/kg de peso corporal una vez cada 14 días.
En otra modalidad, la OXM inversa pegilada comparada con OXM libre reduce la frecuencia de dosificación eficaz por al menos 2 veces y reduce la dosis efectiva semanal por al menos 2, así limitando el riesgo de eventos adversos y aumentando de conformidad con el uso de terapia de OXM. En otra modalidad, la OXM inversa pegilada comparado con OXM libre reduce la frecuencia de dosificación eficaz por al menos 3 y reduce la dosis efectiva semanal por al menos 3, así limitando el riesgo de eventos adversos y aumento de conformidad con el uso de terapia de OXM. En otra modalidad, la OXM inversa pegilada comparado con OXM libre reduce la frecuencia de dosificación efectiva por lo menos identificable y reduce la dosis efectiva semanal por menos identificable, por lo tanto limitar el riesgo de eventos adversos y aumento de conformidad con el uso de terapia de OXM. En otra modalidad, la OXM inversa pegilada comparado con OXM libre reduce la frecuencia de dosificación eficaz por al menos 5 veces y reduce la dosis semanal eficaz por al menos 5 veces, por lo tanto limita el riesgo de eventos adversos y aumenta de conformidad con el uso de terapia de OXM. En otra modalidad, OXM inversa pegilada comparado con OXM libre reduce la frecuencia de dosificación efectiva por menos doblez y reduce la dosis semanal efectiva por menos doblez, así limitando el riesgo de eventos adversos y aumentando de conformidad con el uso de terapia de OXM. En otra modalidad, la frecuencia de dosificación efectiva y eficaz de la dosis semanal se basan en: (1 ) el peso del componente administrado de OXM dentro de la composición de OXM pegilada inversa; y (2) el peso del componente administrado de OXM dentro de la composición de OXM libre (OXM sin modificar).
En otra modalidad, los métodos de la invención incluyen aumentar el cumplimiento de los pacientes afligidos con enfermedades crónicas que necesitan terapia de OXM. En otra modalidad, los métodos de la invención permiten la reducción en la frecuencia de dosificación de OXM por pegilación inversa de OXM como se describe arriba. En otra modalidad, los métodos de la invención incluyen aumentar el cumplimiento de los pacientes que necesitan terapia de OXM reduciendo la frecuencia de administración de OXM. En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración de la OXM se logra gracias a la pegilación inversa que hace que la OXM se más estable y más potente. En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración de la OXM se obtiene como resultado del aumento de T1/2 de la OXM. En otra modalidad, reducción en la frecuencia de administración de la OXM se obtiene como resultado de la reducción de la separación de la sangre de OXM. En otra modalidad, reducción en la frecuencia de administración de la OXM se obtiene como resultado del aumento de T1/2 de la OXM. En otra modalidad, reducción en la frecuencia de administración de la OXM se obtiene como resultado del aumento en la medida de la AUC de la OXM.
En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez al día. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez cada dos días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez cada tres días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez cada cuatro días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez cada cinco días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez cada seis días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez por semana. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez cada 7-14 días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez cada 10-20 días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez cada 5-15 días. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa es administrada a un sujeto una vez cada 15-30 días.
La administración oral, en una modalidad, comprende una forma de dosificación unitaria que comprende las tabletas, cápsulas, pastillas, tabletas masticables, suspensiones, emulsiones y similares. Tales formas de dosificación unidades comprenden una cantidad segura y efectiva de OXM de la invención, cada una de ellas es en una modalidad, de 0.7 o 3.5 mg a aproximadamente 280 mg/70 kg, o en otra modalidad, 0.5 o 10 mg a aproximadamente 210 mg/70 kg. Los portadores farmaceuticamente aceptables adecuados para la preparación de formas de dosificación de la unidad de administración peroral son bien conocidos en la téenica. En algunas modalidades, las tabletas normalmente comprenden adyuvantes convencionales farmacéuticamente compatibles como diluyentes inertes, tales como el carbonato de calcio, carbonato de sodio, manitol, lactosa y celulosa; aglutinantes tales como almidón, gelatina y sacarosa; disgregantes tales como almidón, ácido algínico y croscarmelosa; lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. En una modalidad, los deslizantes como el dióxido de silicio pueden utilizarse para mejorar las características del flujo de la mezcla del polvo. En una modalidad, colorear agentes, tales como los colorantes FD & C, puede agregarse para el aspecto. Los edulcorantes y aromatizantes, como aspartame, sacarina, mentol, menta y sabores de la fruta, son coadyuvantes útiles para tabletas masticables. Cápsulas normalmente comprenden uno o más sólidas diluyentes descritos anteriormente. En algunas modalidades, la selección de los componentes portadores depende de consideraciones secundarias como sabor, costos y estabilidad de la plataforma, que no son críticos para los propósitos de esta invención y puede realizarse fácilmente por una persona experta en la teenica.
En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende el perfil de liberación predefinido. En una modalidad, la forma de dosificación oral de la presente invención comprende tabletas de liberación prolongada, cápsulas, pastillas o tabletas masticables. En una modalidad, la forma de dosificación oral de la presente invención comprende tabletas de lenta liberación, cápsulas, pastillas o tabletas masticables. En una modalidad, la forma de dosificación oral de la presente invención comprende tabletas de liberación inmediata, cápsulas, pastillas o tabletas masticables. En una modalidad, la forma de dosificación oral está formulada según el perfil de liberación deseado de la OXN de acción prolongada como lo conoce un experto en la técnica.
En otra modalidad, las composiciones para su uso en los métodos de esta invención comprenden soluciones o emulsiones, que en otra modalidad son soluciones acuosas o emulsiones que comprende una cantidad segura y efectiva de los compuestos de la presente invención y, opcionalmente, otros compuestos, destinados a la administración tópica intranasal. En algunas modalidades, las composiciones abarcan desde alrededor de 0.001 % 10.0% p/v de un compuesto en cuestión, preferiblemente más de aproximadamente 00.1 % a aproximadamente 2.0, que se utiliza para la administración sistémica de los compuestos por vía intranasal.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas son administradas por inyección intravenosa, intraarterial, subcutánea o intramuscular de una preparación líquida. En otra modalidad, formulaciones líquidas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En una modalidad, las composiciones farmacéuticas son administradas por vía intravenosa y así se formulan en un formato adecuado para la administración intravenosa. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas son administradas por vía intraarterial y así se formulan en un formato adecuado para la administración intraarterial. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas son administradas por vía intramuscular y por lo tanto se formulan en un formato adecuado para la administración intramuscular.
Además, en otra modalidad, las composiciones farmacéuticas son administradas por vía tópica para las superficies del cuerpo y así se formulan en un formato adecuado para la administración tópica. Convenientes formulaciones tópicas incluyen geles, ungüentos, cremas, lociones, gotas y similares. Para la administración tópica, los compuestos de la presente invención se combinan con un agente terapéutico apropiado adicional o agentes, elaborados y aplicados como soluciones, suspensiones o emulsiones en un diluyente fisiológico aceptable con o sin un portador farmacéutico.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas de la presente invención son fabricadas por procesos conocidos en la téenica, por ejemplo, por medio de convencional mezcla, disolución, granulación, toma gragea, levigación, emulsificantes, encapsulando, atrapamiento o los procesos de liofilización.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas para uso de acuerdo con la presente invención están formuladas de manera convencional usando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprende excipientes y auxiliares, que facilitan la transformación de OXM en preparaciones que, se puede utilizar farmacéuticamente. En una modalidad, formulación es dependiente sobre la vía de administración elegida.
En una modalidad, inyectables, de la invención se formulan en soluciones acuosas. En una modalidad, inyectables, de la invención se formulan en amortiguadores fisiológicamente compatibles como amortiguador salino fisiológico, solución de Ringer o solución de Hank. En algunas modalidades, para la administración de la vía transmucosa, penetrantes apropiados a la barrera para ser penetrado se utilizan en la formulación. Tan penetrantes generalmente son conocidos en la técnica.
En una modalidad, las preparaciones descritas son formuladas para la administración parenteral, por ejemplo, por inyección del bolo o infusión continua. En otra modalidad, formulaciones para la inyección se presentan en forma de dosificación de la unidad, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis con opcionalmente, un conservadorañadido. En otra modalidad, composiciones son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos con apariencia aceitosas o acuosas y contienen a agentes formuladores como suspensión, estabilización o agentes dispersantes.
Las composiciones tambien comprenden, en otra modalidad, conservadores, como el cloruro de benzalconio y timerosal y similares; quelantes agentes como edetato de sodio y otros; amortiguadores como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfoto de sodio y otros; agentes aromáticos; Ajustadores de viscosidad, tales como polímeros, incluyendo celulosa y derivados y alcohol de polivinilo y ácidos y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas según sea necesario. Las composiciones conforman, asimismo, en algunas modalidades, los anestésicos locales u otros activos. Las composiciones pueden utilizarse como aerosoles, nieblas, gotas y similares.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Además, suspensiones de OXM de acción prolongada, en algunas modalidades, se preparan como suspensiones de inyección a base de agua o aceitosas apropiadas.
Vehículos o solventes lipofílicos convenientes incluyen, en algunas modalidades, aceites grasos como el aceite de ajonjolí o esteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. La suspensión acuosa inyectable contiene, en algunas modalidades, sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como la carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. En otra modalidad, la suspensión también contienen estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de OXM de acción prolongada para permitir la preparación de soluciones concentradas.
En otra modalidad, el compuesto activo se puede entregar en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer, Science 249: 1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cáncer, López- Berestein y Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid . , pp. 317-327; ver generalmente ibídem).
En otra modalidad, la composición farmacéutica entregada en un sistema de liberación controlada está formulada para infusión intravenosa, bomba osmótica implantable, parche transdérmico, liposomas u otros modos de administración. En una modalidad, se utiliza una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321 :574 (1989). En otra modalidad, pueden utilizarse los materiales poliméricos. En otra modalidad, puede colocarse un sistema de liberación controlada en proximidad al objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, por lo que requiere sólo una relación de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984). Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión por Langer (Science 249: 1527-1533 (1990).
En una modalidad, la OXM de acción prolongada está en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, a base de solución, antes de usar agua estéril, libre de pirógenos. Las composiciones se formulan, en algunas modalidades, para la administración de la atomización y la inhalación. En otra modalidad, composiciones están contenidas en un recipiente con medio atomizante adjunto.
En una modalidad, la preparación de la presente invención está formulada en composiciones rectales como supositorios o enemas de retención, usando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales como la manteca de cacao u otros glicéridos.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en contexto de la presente invención incluyen composiciones donde la OXM de acción prolongada está contenida en una cantidad efectiva para lograr el propósito previsto. En modalidades de la otra, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de OXM de acción prolongada eficaz para evitar, aliviar o aliviar los síntomas de la enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que es tratado.
En una modalidad, la determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la capacidad de los expertos en la téenica.
Las composiciones también comprenden conservadores, como el cloruro de benzalconio y timerosal y similares; agentes quelantes como edetato de sodio y otros; amortiguadores como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfoto de sodio y otros; agentes aromáticos; ajustadores de viscosidad, tales como polímeros, incluyendo celulosa y derivados y alcohol de polivinilo y ácidos y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas según sea necesario. Las composiciones también forman los anestésicos locales a otros activos. Las composiciones pueden utilizarse como aerosoles, nieblas, gotas y similares.
Algunos ejemplos de sustancias que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables o sus componentes son azúcares, como la lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, como la carboximetilcelulosa sódica, celulosa de etilo y metil celulosa; goma tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; lubricantes sólidos, tales como el ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, como el aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles como el glicol de propileno, glicerina, sorbitol, manitol y glicol de polietileno; ácido algínico; emulsificantes, tales como los emulsores marca Tween™; agentes humectantes, tal como lauril sulfato de sodio; agentes colorantes; aromatizantes; agentes formadores de tableta, estabilizadores; antioxidantes; conservadores; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; y las soluciones amortiguadoras de fosfato. La elección de un portador farmacéuticamente aceptable para ser utilizado en conjunción con el compuesto está determinada básicamente por el compuesto debe ser administrado. Si el compuesto en cuestión debe ser inyectado, en una modalidad, el portador farmacéuticamente aceptable es solución salina estéril, fisiológica, con un agente suspende compatible con sangre, el pH de los cuales ha sido ajustado a alrededor de 7.4.
Además, las composiciones además comprenden aglutinantes (por ejemplo, acacia, almidón de maíz, gelatina, carbómero, etilcelulosa, goma de guar, hidroxipropil celulosa, hldroxipropil metil celulosa, povidona), agentes de desintegración (almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, dióxido de silicio, croscarmelosa de sodio, crospovidona, goma de guar, glicolato sódico de almidón), amortiguadores (por ejemplo, tris-HCI, acetato, fosfato) de diferentes pH y fuerza iónica, aditivos como albúmina o gelatina para prevenir la absorción de las superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, las sales del ácido de bilis), inhibidores de la proteasa, agentes surfactantes (por ejemplo lauril sulfato de sodio), potenciadores de impregnación, solubilizar agentes (por ejemplo, glicerina, glicerol de polietileno), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, butilhidroxianisol), estabilizadores (por ejemplo, hidroxipropil celulosa, celulosa hiroxipropilmetil), agentes de aumento de viscosidad (por ejemplo, carbómero, dióxido de sílice coloidal, celulosa de etilo, goma de guar), edulcorantes (aspartame, ácido cítrico), preservativos (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), lubricantes (ácido por ejemplo ácido esteárico, estearato de magnesio, polietilenglicol, lauril sulfato de sodio), auxiliares de flujo (por ejemplo, dióxido de sílice coloidal), plastificantes (dietil ftalato, citrato de trietilo), emulgentes (por ejemplo, carbómero, hidroxipropil celulosa, lauril sulfato de sodio), revestimientos polimericos (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas), recubrimiento y agentes de formación de película (por ejemplo, celulosa de etilo, acrilatos, polimetacrilatos) y/o adyuvantes.
Los componentes típicos de los portadores de jarabes, elíxires, emulsiones y suspensiones incluyen etanol, glicerol, glicol de propileno, polietileno glicol, sacarosa líquida, sorbitol y agua. Una suspensión, agentes suspende típicos incluyen metil celulosa, carboximetilcelulosa sódica, celulosa (por ejemplo, Avicel™, RC-591), tragacanto y alginato de sodio; agentes humectantes típicos incluyen lecitina y polietileno óxido sorbitan (por ejemplo, polisorbato 80). Conservadores típicos incluyen metilparabeno y benzoato de sodio. En otra modalidad, composiciones líquidas perorales también contienen uno o más componentes como los edulcorantes, aromatizantes y colorantes descritos antes.
Las composiciones también incluyen la incorporación del material activo en o en preparaciones de partículas de compuestos poliméricos como hidrogeles, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, etc. o en liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, eritrocito fantasma o esferoplastos.) Tales composiciones influirán en el estado físico, solubilidad, estabilidad, tasa de liberación in vivo y tasa de aclaramiento in vivo.
También comprendidas por la invención son las composiciones partículas recubiertas con polímeros (por ejemplo poloxámeros o poloxaminas) y el compuesto acoplado a los anticuerpos dirigidos contra los receptores específicos de tejido, ligandos o antígenos o acoplado a ligandos de receptores específicos de tejido.
En una modalidad, compuestos modificados por la unión covalente de polímeros solubles en agua tales como polietileno glicol, copolímeros de polietilenglicol y glicol de polipropileno, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol de polivinilo, polivinilpirrolidona o poliprolina. En otra modalidad, los compuestos modificados exhiben una vida media substancialmente más larga en sangre después de la inyección intravenosa en comparación con los correspondientes compuestos sin modificar. En una modalidad, las modificaciones también aumentan la solubilidad del compuesto en solución acuosa, eliminan la agregación, mejoran la estabilidad física y química del compuesto y reducen considerablemente la inmunogenicidad y reactividad del compuesto. En otra modalidad, la actividad biológica in vivo deseada es alcanzada por la administración de tales aductos polímero-compuesto menos frecuentemente o en dosis más bajas que con los compuestos no modificados.
En otra modalidad, la preparación de cantidad efectiva o dosis puede estimarse inicialmente de ensayos in vitro. En una modalidad, una dosis puede ser formulada en modelos animales y dicha información puede utilizarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en los seres humanos.
En una modalidad, la toxicidad y eficacia terapeutica de OXM de acción prolongada como se describe en este documento pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos in vitro en cultivos celulares o en animales de experimentación. En una modalidad, los datos obtenidos en estos ensayos de cultivo in vitro y de la célula y los estudios en animales pueden utilizarse en la formulación de un intervalo de dosis para uso en humanos. En una modalidad, las dosis varían dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. En una modalidad, la formulación exacta, vía de administración y dosificación puede ser elegido por el médico individual teniendo en cuenta la condición del paciente. [Véase por ejemplo, Fingí, et al., (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Cap. 1 p.1 ] .
En una modalidad, dependiendo de la severidad y la respuesta de la afección a tratar, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones, con el curso del tratamiento durando desde varios días a varias semanas o hasta que se efectúe la curación o la disminución del estado de la enfermedad se logre.
En una modalidad, la cantidad de una composición que debe ser administrada, por supuesto, será dependiente de la materia tratada, la severidad de la enfermedad, la forma de administración, el juicio del médico tratante, etc.
En una modalidad, composiciones, incluyendo la preparación de la presente Invención formulada en un portador farmacéutico compatible también se preparan, colocado en un contenedor apropiado y etiquetados para el tratamiento de una condición indicada.
En otra modalidad, una OXM pegilada inversa como se describe en este documento se administra mediante la administración sistémica. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa como se describe en este documento es administrado por inyección intramuscular, intravenosa o subcutánea. En otra modalidad, una OXM pegilada inversa como se describe en este documento es liofilizada (es decir, secada por congelamiento) preparación en combinación con complejos orgánicos excipientes y estabilizadores como agentes surfactantes no iónicos (es decir, agentes surfactantes), diversos azúcares, polioles orgánicos y/o albúmina sérica humana. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un OXM liofilizada pegilada inversa como se describe en agua estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende una OXM liofilizada pegilada inversa como se describe en PBS estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende una OXM liofilizada pegilada inversa como se describe en 0.9% NaCI estéril para la inyección.
En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una OXM inversa pegilada como se describe en este documento y portadores complejos tales como albúmina sérica humana, polioles, azucares y agentes estabilizadores activos de superficie aniónicos. Véase, por ejemplo, WO 89/10756 (Hara et al - conteniendo poliol y p-hidroxibenzoato). En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una OXM inversa pegilada como se describe en este documento y ácido lactobiónico y un amortiguador de acetato/glicina. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una OXM inversa pegilada como se describe en este documento y aminoácidos como la arginina o glutamato que aumentan la solubilidad de las composiciones de interferón en el agua. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un OXM liofilizada pegilada, inversa como se describe en este documento y glicina o albúmina sérica humana (HSA), un amortiguador (por ejemplo, acetato) y un agente ¡sotónico (por ejemplo NaCI). En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una OXM liofilizada pegilada inversa como se describe en este documento y amortiguador de fosfato, glicina y HSA.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada o OXM inversa pegilada como se describe en este documento se estabiliza cuando se coloca en soluciones amortiguadoras que tiene un pH entre 4 y 7.2. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM inversa pegilada como se describe en este documento se estabiliza con un aminoácido como un agente estabilizador y en algunos casos una sal (si el aminoácido no contiene una cadena lateral cargada).
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM inversa pegilada como se describe en este documento es una composición líquida que comprende un agente estabilizador entre cerca de 0.3% y 5% en peso, que es un aminoácido.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM inversa pegilada como se describe en este documento proporciona dosificación precisión y seguridad del producto. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento proporciona una formulación líquida biológicamente activa y estable para su uso en aplicaciones inyectables. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento proporciona una formulación líquida permitiendo almacenaje durante un largo periodo de tiempo en un estado líquido facilitando el almacenaje y envío antes de la administración.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento comprende I í pidos sólidos como material de la matriz. En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento comprende lípidos sólidos como material de la matriz. En otra modalidad, la producción de micropartículas de lípidos por congelación de aerosol fue descrita por Speiser (Speiser y otros, Pharm. Res. 8 (1991 ) 47-54) seguido de lípidos nanopellets para la administración peroral (Speiser EP 0167825 (1990)). En otra modalidad, los lípidos, que se utilizan, son bien tolerados por el organismo (por ejemplo, glicéridos compuestos de ácidos grasos que están presentes en las emulsiones para nutrición parenteral).
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento está en forma de liposomas (J. E. Diederichs y otros, Pharm./nd. 56 (1994) 267 - 275).
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento comprende micropartículas poliméricas. En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento comprende micropartículas poliméricas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento comprende nanopartículas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento comprende liposomas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento comprende emulsión de lípidos. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento comprende microesferas. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento comprende nanopartículas de lípidos. En otra modalidad, la composición farmaceutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento consta de nanopartículas de lípidos que comprende lípidos anfifílicos. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende una OXM pegilada inversa como se describe en este documento comprende nanopartículas de lípidos compuestas por una fármaco, una matriz de lípidos y un agente surfactante. En otra modalidad, la matriz de lípidos tiene un contenido monoglicérido que es al menos del 50% p/p.
En una modalidad, las composiciones de la presente invención se presentan en un paquete o dispositivo dispensador, como por ejemplo un kit aprobado por la FDA, que contiene uno o más formas de dosificación unitaria que contiene la acción prolongada OXM. En una modalidad, el paquete, por ejemplo, comprende una hoja de metal o de plástico, tal como un blíster. En una modalidad, el dispositivo de paquete o dispensador es acompañado de las instrucciones para la administración. En una modalidad, el paquete o el dispensador se acomoda en un aviso asociado con el contenedor en un formulario prescrito por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, que aviso es un reflejo de la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o administración humana o veterinaria. Tal aviso, en una modalidad, es etiquetado aprobado por la U.S. Food y Drug Administration para los fármacos de prescripción o de un inserto producto aprobado.
En una modalidad, se apreciará que la OXM pegilada inversa de la presente invención puede ser proporcionada al individuo con agentes activos adicionales para lograr un efecto terapéutico mejorado en comparación con el tratamiento con cada agente por sí mismo. En otra modalidad, se toman medidas (por ejemplo, dosificación y selección del agente complementario) a efectos adversos que se asocian con las terapias de combinación.
Objetivos adicionales, ventajas y características novedosas de la presente invención serán aparentes a uno de experiencia en la materia en el examen de los siguientes ejemplos, que no están destinados a ser limitantes. Además, cada uno de los varios aspectos de la presente invención como delineado arriba y reclamado en la sección de reivindicaciones posterior encuentra el soporte experimental los hallazgos en los siguientes ejemplos.
Ejemplos Generalmente, la nomenclatura utilizada en este documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen las téenicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y recombinantes de DNA. Estas técnicas se explican minuciosamente en la literatura. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes l-lll Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wilcy and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1 -4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologías como se expone en la Patentes estadounidenses Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801 ,531 ; 5, 192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes l-lll Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshncy, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Tercera Edición; "Current Protocols in Immunology" Volumes l-lll Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a Edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles son descritos de forma extensiva en la patente y literatura de patente, por ejemplo, Patentes estadounidenses Nos. 3,791 ,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901 ,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,01 1 ,771 y 5,281 ,521 ; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J. , ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D. , and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1 -317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos los cuales se incorporan por referencia. Otras referencias generales son proporcionadas a lo largo de este documento.
Materiales y metodos Síntesis de PEG30-FMS-OXM - heterogénea 1.1 Fase 1 : Síntesis de OXM Oxintomodulina fue sintetizada y consiste en la siguiente secuencia de péptido: HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA (SEQ ID NO: 1 ) El péptido fue sintetizado por el método de la fase sólida empleando la estrategia de Fmoc durante el montaje de la cadena peptídica (Almac Sciences, Escocia).
La secuencia del péptido fue montada usando los siguientes pasos: 1. Recubrimiento La resina fue recubierta con solución de anhídrido acético (Fluka) de 0.5 M en DMF (Rathburn). 2. Desprotección Grupo de protección Fmoc fue eliminado de la cadena peptídica creciente con solución 20% v/v de piperidina (Rathburn) en DMF (Rathburn). 3. Acoplamiento del aminoácido Solución de aminoácidos (Novabiochem) 0.5 M en DMF (Rathburn) fue activada con 1 M TOHB (Carbosynth) solución en DMF (Rathburn) y 1 M DIC (Carbosynth) en DMF (Rathburn). Se utilizaron 4 equivalentes de cada aminoácido por acoplamiento.
El peptido crudo es dividido de la resina y los grupos de protección removidos por agitación en un cóctel de triisopropilsilano (Fluka), agua, sulfuro de dimetilo (Aldrich), yoduro de amonio (Aldrich) y TFA (Applied Biosystems) durante 4 horas. El péptido crudo es recogido por precipitación de éter dietílico frío.
Purificación del péptido El péptido crudo fue disuelto en acetonitrilo (Rathburn)/agua (MilliQ) (5:95) y cargado en la columna de HPLC preparativa. Los parámetros cromatográficos son como siguen: Columna: Phenomenex Luna C18 250 mm x 30, 15pm, 300A Fase móvil A: agua + 0.1 % v/v TFA (Applied Biosystems) Fase móvil B: acetonitrilo (Rathburn) + 0.1 % v/v TFA (Applied Biosystems) Detección de UV: 214 ó 220 nm Gradiente: 25 %B a 31 %B en 4 volúmenes de columna Velocidad de flujo de 43 ml/min.
Etapa 2 - síntesis del enlazador Esquema 1 Síntesis de enlazador de MAL-FMS-NHS , Paso 4 HCl/dioxano 84% (en 3 pasos ) I 7, MAL Fmoc NHS La síntesis de compuestos 2-5 se basa en los procedimientos descritos por Albericio et el. en Synthetic Communication, 2001 , 31 (2), 225-232. 2-(Boc-amino)fluoreno (2): 2-Aminofluoreno (18 g, 99 mmol) fue suspendido en una mezcla de dioxano: agua (2: 1 ) (200 mi) y NaOH 2N (60 mi) en un baño de hielo con agitación magnetica. Boc20 (109 mmol, 1.1 eq) entonces fue agregado y la agitación continua a ta. La reacción fue supervisada por TLC (Rf = 0.5, hex./ acetato de etilo 2: 1 ) y el pH mantenido entre 9 y 10 por la adición de NaOH 2N. Al finalizar la reacción, la suspensión se acidificó con KHS04 1 M a pH = 3. El sólido fue filtrado y lavado con agua fría (50 mi), dioxano-agua (2: 1 ) y luego formó azeótropo con tolueno dos veces antes de usarlo en el siguiente paso. 9-Formil-2-(Boc-amino)fluoreno (3): En un RBF de 3 cuellos, NaH (60% en aceite; 330 mmol, 3.3 eq) fue suspendido en THF seco (50 mi), una solución de-(Boc-amino)flúor se describe en el paso 2 (28 g; 100 mmol) en THF seco (230 mi) se añadió gota a gota por más de 20 minutos. Se observó una suspensión espesa amarilla y se agitó la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Formiato de etilo (20.1 mi, 250 mmol, 2.5 eq) se adicionó gota a gota (Precaución: evolución del gas). La suspensión se convirtió en una solución marrón pálida. La solución se agitó durante 20 minutos. La reacción fue supervisada por TLC (Rf = 0.5, acetato de etilo/hexano 1 : 1) y cuando se observó sólo rastros del material de partida, fue templada con agua helada (300 mi). La mezcla se evaporó en presión reducida hasta que se ha eliminado la mayor parte del THF. La mezcla resultante fue tratada con ácido acético a pH = 5. El precipitado blanco obtenido se disolvió en acetato de etilo y separó la capa orgánica. La capa acuosa fue extraída con acetato de etilo y toda la capa orgánica combinada y se lavó con bicarbonato de sodio saturado, salmuera y se secó sobre MgSO4. Despues de la extracción solvente y filtración se obtuvo un sólido amarillo. Este material fue utilizado en el paso siguiente. 9-Hidroximetil-2-(Boc-amino)fluoreno (4): El compuesto 3 anterior fue suspendido en MeOH (200 mi) y borohidruro de sodio fue agregado en porciones durante 15 minutos. La mezcla se agitó durante 30 minutos (Precaución: evolución de gas y reacción exotérmica). La reacción fue supervisada por TLC (Rf = 0.5, hex/EtOAc 1 : 1 ) y se completó. Se agregó agua (500 mi) y el pH se ajustó a 5 con ácido acético. El trabajo involucra la extracción dos veces con acetato de etilo, se lavaron las capas orgánicas combinadas con bicarbonato de sodio y salmuera, se secó sobre MgS04, filtración y concentración a sequedad. El crudo obtenido se purificó por cromatografía con matraz usando heptano/EtOAc (3: 1 ) para dar una espuma amarilla (36 g, 97.5% de pureza, rastros de acetato de etilo y éter dietílico observados en la 1 H-RMN).
MAL-Fmoc-NHS (7): A un RBF de 500 mi limpio y seco con agitación en la parte superior fue cargó con trifosgeno (1.58 g, 0.35 eq.) en THF seco (55 mi) para formar una solución en el ambiente. Esto fue enfriado a 0°C con un baño de hielo/agua y una solución de NHS (0.67 g, 0.38 eq) en THF seco (19 mi) añadida gota a gota durante 10 minutos bajo nitrógeno a 0°C. La solución resultante se agitó durante 30 minutos. Una porción mayor del NHS (1.34 g, 0.77 eq) en THF seco (36 mi) se agrega gota a gota a 0°C durante 10 minutos y se agitó durante 15 minutos.
El compuesto 6 (5.5 g, 1 eq) THF seco (55 mi) y piridina (3.07 mi, 2.5 eq) se agitaron juntos para formar una suspensión. Esto se agregó a la solución del NHS en porciones un 0-5°C y entonces se deja a RT quitando el baño de hielo.
Despues de 20 horas, la reacción fue interrumpida (material de partida aún presente, si la reacción es empujada a la terminación se ha observado una impureza de dímero).
La mezcla de reacción se filtró y al filtrado, se añadieron 4% salmuera (200 mi) y EtOAc (200 mi). Después de la separación, la capa orgánica fue lavada con ácido cítrico al 5% (220 mi) y agua (220 mi). La capa orgánica se concentró entonces para dar 7.67 g de MAL-Fmoc-NHS crudo. El material se purificó por cromatografía en columna utilizando un gradiente cicIohexano/EtOAc 70:30 a 40:60. Las fracciones que contienen producto se concentraron bajo vacío a 3.47 g (45%) de MAL-Fmoc-NHS.
MAL-FMS-NHS A una solución de MAL-Fmoc-NHS (100 mg, 0.2 mmol) en ácido trifluoroacético (10 mi), se añadió ácido clorosulfónico (0.5 mi). Después de 15 minutos, éter dietílico helado (90 mi) fue agregado y precipitó el producto. El material fue recogido por centrifugación, lavado con eter dietílico y secado bajo vacío. Se obtuvieron 41.3 mg (35%) de un sólido color beige.
Etapa 3 - conjugación La conjugación heterogénea de los 3 sitios de aminas en el péptido OXM (Lys12, Lys30 y amino terminal) realizado como "reacción en una olla" en donde 1 eq de cada componente: OXM, mPEG-SH y enlazador FMS como mezclados junto a pH 7.2 durante 30 minutos. La reacción se detiene añadiendo ácido acético para reducir el pH a 4.
Síntesis de PEG30-FMS-OXM - homogénea Etapa 1 : El espaciador - síntesis de MAL-FMS-NHS (FMS): como se describe para el conjugado heterogéneo Etapa 2: Síntesis de oxintomodulina (OXM): El sitio N-terminal dirigido a OXM - como se describió anteriormente para el conjugado heterogéneo.
Lysi 2 o Lys30 en el sitio dirigido OXM - usando la misma estrategia excepto usando Fmoc-Lys (ivDde)-OH en la posición 12 ó 30 de lisina y Boc-His(Boc)-OH como el último aminoácido a acoplarse.
Etapa 3: Conjugación homogénea Acoplamiento de FMS a OXM: Solución del enlazador MAL-FMS-NHS (0.746 mi, 10 mg/ml en DMF, 2 eq) se añadió a la resina OXM (1 eq, resina de 200 mg, 31.998 pmol/g de amina libre). DMF fue agregado hasta que la resina fue sólo libremente móvil y luego sonicada durante 19 hrs. La resina se lavó con DMF y metanol antes de secar toda la noche en desecador de vacío. El coctel de división contenía TFA/TIS/H20. La división se realizó por 3.5 horas a temperatura ambiente. Después de la filtración de la resina, el FMS-OXM fue precipitado en el éter dietílico frío. 42.1 mg de FMS-OXM crudo (36% puro) se obtuvo al final de la etapa de división.
Acoplamiento de FMS al sitio Lys12 dirigido a OXM: La solución de enlazador MAL-FMS-NHS (10 mg/ml en DMF, 2.5 equiv.) se añadió a la resina (Lys12)OXM (1 equiv.) con la adición de DIEA (5 equiv.). DMF fue añadido hasta que la resina sólo fuera libremente móvil y luego sonicada durante la noche. La resina se lavó con DMF y metanol antes de secar toda la noche en desecador de vacío. La división y precipitación es como se describe para el sitio de N-terminal dirigido.
Acoplamiento de FMS al sitio Lys30 dirigido a OXM: El enlazador MAL-FMS-NHS (2.5 equiv.) fue solubilizado en DCM con adición de DIEA (5 equiv.). Solución de enlazador/DIEA se añadió a la resina (Lys30)OXM y entonces se sonicó durante la noche. La resina se lavó con DCM y metanol antes de secar toda la noche en desecador en vacío. La división y precipitación como se describe para el sitio de N-terminal dirigido.
Purificación El FMS-OXM crudo resultante se purificó en una porción. Diluyente de muestra: 10% acetonitrilo en agua Columna: Luna C18 (2), 100A, 250 x 21.2 mm Velocidad de flujo de inyección: 9 ml/min Velocidad de flujo de la corrida: 9 ml/min Amortiguador A: agua (TFA 0.1 %) Amortiguador B: acetonitrilo (TFA 0.1 %) Gradiente: 10-45 %B por 32 mins Monitoreo: 230 nm Conjugación de PEG30 a FMS-OXM La solución FMS-OXM (1 equiv, 15.1 mg en 1.5 mi de DMF) se preparó. PEG30 (1 equiv, 9.2 mi de 10 mg/ml de Amortiguador de fosfato pH 6.5) se añadió a la solución de FMS-OXM. La mezcla de reacción luego se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de agregar el ácido acético glacial (200) para templar la reacción al disminuir el pH.
La mezcla de reacción resultante entonces se purificó mediante RP-HPLC.
Columna: Luna C18 (2), 100 A, 250 x 21.2 mm Velocidad de flujo de inyección: 5 ml/min.
Velocidad de flujo de la corrida: 20 ml/min Amortiguador A: agua & TFA 0.1 % Amortiguador B: acetonitrilo/agua (75) & TFA 0.1 % Gradiente: 10-65 %B por 41 mins Monitoreo: 220, 240, 280 nm Prueba de tolerancia a la glucosa IP Ratones macho C57BL/6 se mantuvieron en ayuno durante la noche luego se pesaron, y se midieron los niveles de glucemia en la vena de la cola utilizando un glucómetro portátil de muestreo. Los ratones fueron inyectados con PEG-SH (vehículo), PEG30-FMS-OXM (heterogeneo) y las tres variantes homogéneas de PEG30-FMS-OXM (amino, Lys12 y Lys30) de IP. Glucosa (1.5 gr/kg) fue administrada IP 15 min después de la administración del artículo de prueba. Se midieron los niveles de glucemia en la vena de cola de muestreo a antes de la administración de glucosa y 10, 20, 30, 60, 90, 120 y 180 minutos después de la administración de glucosa mediante un glucómetro portátil.
Caracterización in Vitro de la activación de los receptores de glucagón La activación del receptor de GLP-1 se evaluó mediante dos diferentes líneas celulares; HTS163C2 (Millipore) y cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1 R (Discoverx), ambos expresando el receptor del GLP-1. El HTS163C2 (Millipore) fue sembrado en una placa blanca de media-área de 96 pozos (Greiner) con una densidad de 100,000 células/ml y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Las células se incubaron con crecientes concentraciones de PEG30-FMS-OXM heterogéneo y 3 variantes PEG30-FMS-OXM homogéneas (amino, Lys12 y Lys30). Las concentraciones de células cAMP fueron cuantificadas mediante ensayo de HTRF (Cisbio 62AM4PEB) y parámetro EC50 fue analizada por el software PRISM. El cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1 R segrega cAMP sobre la anión del ligando al receptor. Las células a una densidad de 500000 células/ml fueron sembradas en placas de 96 pozos y se incubaron durante 24 horas a 37°C con 5% de CO2. Los ligandos se diluyeron en diluyente que contiene IBMX y fueron agregados por duplicado en los pozos del cultivo durante 30 min a 37°C con 5% de C02. El rango de concentración de PEG30-FMS-OXM era de 1.5 * 10 10 a 1.2 * 10 6 M. El amortiguador de lisis y los reactivos detectores se agregaron a los pozos y las concentraciones de cAMP fueron detectados usando una señal quimioluminiscente. Se establecieron las curvas dependientes de la dosis y las afinidades de unión (CE50) de varios ligandos se calcularon utilizando el software PRISM aplicando el mejor modelo de ajuste de respuesta a la dosis (cuatro parámetros).
Caracterización in vitro de la activación de los receptores de glucagón La activación de receptores de glucagón se evaluó mediante cAMP Hunter™ GCGR CHO-K1 -línea celular que sobre expresa los receptores de glucagón. Esta línea celular segrega cAMP en la unión del ligando al receptor de glucagón. Las células fueron sembradas a una densidad de 500000 células/ml en placas de 96 pozos y se incubaron durante 24 horas a 37°C con 5% de C02. Los ligandos se diluyeron en diluyente que contiene IBMX y fueron agregados por duplicado en los pozos de la cultivo durante 30 min a 37°C con 5% de C02. El intervalo de concentración de MOD-6031 fue de 5.8 * 10 11 a 2.7 * 10 7 M. El amortiguador de lisis y los reactivos detectores se agregaron a los pozos y las concentraciones de cAMP fueron detectadas usando una señal quimioluminiscente. Se establecieron las curvas dependientes de la dosis y las afinidades de unión (CE50) de varios ligandos se calcularon utilizando el software PRISM aplicando el mejor modelo de ajuste de respuesta a la dosis (cuatro parámetros).
Modelo de ratones obesos (ob/ob) Estudio 1 : Veinte cinco ratones ob/ob (machos, B6. V-LepAob/OlaHsd, de 5-6 semanas de edad, Harían) fueron aclimatados a la instalación (10 días) seguido por el protocolo de manejo mediante el cual los animales se manejaron para la dosificación pero en realidad no se pesaron o dosificaron (10 días). Posteriormente, los animales experimentaron el período de línea base por 7 días en que ellos se dosificación dos veces por semana con el vehículo apropiado por la vía subcutánea con un volumen de 20 ml/kg. La ingesta de agua, comida y peso corporal se registraron diariamente, y se tomaron muestras para mediciones de alimentos y de la glucosa en ayuno y de la insulina en ayuno y alimentos. Los animales fueron asignados posteriormente en cinco grupos de tratamiento (N = 5) basados en el perfil glucémico y de peso corporal. Los animales fueron dosificados cada cuatro días (días: 1 , 5, 9, 13 y 16) como se describe en la tabla 1. Durante el período de tratamiento, la ingesta de alimentos, la ingesta de agua y el peso del cuerpo se midieron y registraron diariamente, antes de la dosificación.
Se han realizado varios procedimientos y muestreo: glucosa con alimentos y en ayuno en los días 2, 6, 14 y 17 (en el día 17 sólo se midió la glucosa con alimentos), insulina en ayuno y con alimentos (días 2, 6 y 14). Se analizaron muestras terminales día 19 para el colesterol.
Tabla 1 Diseño del estudio Estudio 2: Cien ratones ob/ob macho (5-6 semanas de edad, Charles River) fueron aclimatados a la instalación (3 días) seguido por el protocolo de manejo mediante el cual los animales se manejaron como para dosificar pero en realidad no se pesaron o dosificaron (7 días). Posteriormente, los animales experimentaron el período de referencia para 7 días en los que fueron dosificados dos veces por semana con vehículo PEG30-SH (146 mg/ml) por vía subcutánea en un volumen de 20 ml/kg. La ingesta de agua y comida, y el peso corporal se registraron diariamente. Posteriormente los animales fueron asignados a 8 grupos de tratamiento, control y alimentados en par (grupos A-H, N = 8) (tabla 2). El grupo alimentado en par fue alimentado en par con el grupo de dosis alta (6000 nmol/kg) de MOD-6031 y recibió la ración diaria de comida igual a lo comido por su homólogo emparejado en el grupo D el día anterior. 3 grupos adicionales (grupos l-K, N = 12) fueron administrados con MOD-6031 en 1000, 3000 y 6000 nmol/kg y fueron utilizados para la toma de muestras para el análisis de PK. El vehículo PEG-SH (292 mg/ml), MOD-6031 en 1000, 3000 y 6000 nmol/kg y los grupos alimentados en par fueron administrados dos veces por semana durante 32 días mientras se administraron OXM, liraglutida® y PBS dos veces al día. La ingesta de agua, comida y el peso corporal se midieron diariamente. La glucosa en ayuno y no ayuno se midieron una vez por semana, OGTT fueron realizadas durante los días 2 y 30. Se analizaron las muestras de sangre terminal (día 33) para la glucosa, insulina, colesterol y MOD-6031 , PEG-FMS y concentraciones de OXM. Los ratones en los grupos PK recibieron una sola dosis de MOD-6031 y las muestras de sangre fueron tomadas en 4, 8, 24, 36, 48, 72, 96 y 120 horas (n = 3 por momento) para el análisis de PK permite cuantificar MOD-6031 y sus concentraciones de compuestos por el método LC- MS/MS.
Tabla 2 Diseño del estudio Resultados Ejemplo 1 Síntesis de fabricación y desarrollo La composición del conjugado PEG-FMS-OXM depende de su procedimiento de síntesis. Se produjeron diversas variantes del conjugado PEG-FMS-OXM (Figura 1 ).
Conjugado heterogéneo: La síntesis de MOD-6030 (PEG30-FMS-OXM) se realizó de la siguiente manera: espaciador FMS se mezcló con OXM y PEG(30)-SH (como un reacción en una olla). El espaciador FMS fue acoplado a OXM por su ester NHS activado por un lado y PEG-SH conectado simultáneamente al grupo maleimida en el otro lado. De esta manera, una mezcla heterogénea de conjugado PEG-FMS-OXM se compone de tres variantes conectadas por una de las 3 aminas del péptido de OXM (N-terminal, Lys12 y Lys30).
Conjugado homogéneo: El procedimiento de conjugación fue desarrollado en un proceso de dos pasos en donde la unión al espaciador de FMS fue ejecutado en una manera controlada y dirigida el sitio. En el primer paso, el espaciador FMS fue acoplado a la OXM (en la resina parcialmente protegida OXM), entonces se dividió seguido por la protección y purificación de FMS-OXM (por RP-HPLC). El segundo paso fue la unión de PEG30-SH a la FMS-OXM homogénea purificada. El producto final conjugado además se purifica por RP-HPLC. Los pasos de purificación adicionales pueden aplicarse tales como intercambio de iones o SEC-HPLC o cualquier otro paso de purificación.
Tres péptidos en la resina se sintetizaron mediante la estrategia de fase sólida Fmoc. Para la síntesis del conjugado homogéneo conectado por medio del aminoácido sina en la posición 12 ó 30 de la OXM, se aplicó un grupo selecto de protección para Lys12 o Lys30 de OXM como ivDde (1 -[(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1 -ilidina)etil]), que puede ser retirado bajo condiciones básicas mientras el resto del péptido está en la resina con los demás grupos protectores.
Por lo tanto, se sintetizaron tres resinas OXM: N-terminal- con los grupos de protección adecuados para la síntesis en fase sólida con estrategia Fmoc (generalmente grupo de protección Boc se utiliza para la e amina) y Lys12 o Lys30 con el grupo de protección ivDde. Estos peptidos OXM fueron destinados para el acoplamiento más selectivo con el enlazador FMS.
Los conjugados homogéneos se comportan como 'síntesis de resina'. El conjugado sintetizado en dos pasos: 1. acoplamiento entre la OXM y FMS, división y purificación 2. Pegilación de OXM-FMS con PEG3O-SH. En este procedimiento, el acoplamiento del enlazador de FMS se hace con la OXM, mientras está unida a la resina. La OXM fue totalmente protegida, permitiendo que el sitio amino deseado sin protección específico en OXM reaccione con el radical de NHS. La FMS-OXM purificada se une a la PEG-SH. El conjugado crudo se purificó mediante HPLC (RP o intercambio catiónico o ambos).
Ejemplo 2 Caracterización in Vitro de la activación del receptor de GLP-1 La activación de la unión del receptor de GLP-1 de PEG-FMS-OXM (MOD-6030; heterogéneo) y 3 variantes homogéneas de PEG-FMS-OXM; el amino (MOD-6031 ), Lys12 y Lys30 fueron evaluados usando dos líneas celulares diferentes sobre la expresión del receptor de GLP-1 ; la línea celular de Millipore HTS163C2 y el cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1 R. Las potencias se determinaron mediante el cálculo de la EC50 de cada variante, seguido por el cálculo de la potencia relativa de cada variante de la versión (MOD-6030) heterogénea (dividiendo EC50 de cada variante homogénea por la CE50 de la versión heterogénea y multiplicarlo por 100). En la tabla 3 se presentan los valores CE50 y potencias relativas calculadas. Para la comparación, se midió la afinidad de unión de OXM y receptor GLP-1 de GLP-1 de la línea celular cAMP Hunter CHO-K1 GLP1 R.
Tabla 3 Activación de la unión de receptores de GLP-1 y glucagón Las potencias relativas de las variantes homogéneas se comparan con la versión heterogenea y se resume en la tabla 3. La bioactividad comparable de la variante de aminoácidos y la variante heterogénea exhibió una potencia relativa del 72.2% y 99.1 % medido usando el Millipore HTS163C2 y el cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1 R, respectivamente.
Las variantes Lys12 y Lys30 han demostrado una reducción de 2 y 4 veces de la activación de unión del receptor GLP-1 mediante la línea de células Millipore HTS163C2 mientras sólo muestra una reducción de 2 veces y menor, respectivamente, usando el cAMP Hunter™ CHO-K1 GLP1 R línea celular. El hecho que la variante amino demostró actividad de unión superior en comparación con las otras variantes es inesperado como la N-terminal de OXM fue reportado por estar involucrado en la unión de OXM al receptor de GLP-1 (Druce et al., 2008). La bioactividad en general, comparable fue mostrada por la variante de amino y la variante heterogénea. Se midieron las activaciones de la unión del receptor de GLP-1 de péptidos OXM y GLP-1. Se encontró que OXM y GLP-1 han demostrado mayor activación de unión del receptor por 5.9 y 508.7 veces comparado con la PEG30-FMS-OXM heterogénea.
Ejemplo 3 Caracterización in Vitro de la activación del receptor glucagón Afinidades de unión de las variantes de PEG-FMS-OXM al receptor de glucagón se determinaron utilizando cAMP Hunter™ GCGR CHO-K1 -línea celular que expresa receptores de glucagón. Esta línea celular fue utilizada para caracterizar la PEG-FMS-OXM heterogéne< (MOD-6030) y 3 variantes homogéneas diferentes de PEG-FMS-OXM; el amino (MOD-6031 ), Lys12 y Lys30. Las potencias se determinaron mediante el cálculo de EC50 de cada variante, seguido de calcular la potencia relativa de cada variante a la versión heterogénea (dividiendo EC50 de cada variante homogénea por la CE50 de la versión heterogénea y multiplicando el valor por 100). En la tabla 3 se presentan los valores de EC50 y potencias relativas calculadas. La variante amino demostró actividad comparable a la versión heterogénea. La variante de Lys30 mostró la alta bioactividad y Lys12 mostró una reducción de 1.8 veces. Las activaciones de unión del receptor de glucagón de péptidos OXM y glucagón fueron medidos. Se encontró que OXM y glucagón habían mostrado mayor activación de unión del receptor por 1 1.1 y 283 veces en comparación con el PEG30-FMS-OXM heterogéneo.
Ejemplo 4 Inducción de tolerancia a la glucosa por variantes PEG30-FMS-OXM Para evaluar la actividad in vivo de la PEG30-FMS-OXM heterogénea y las tres variantes de PEG3o-FMS-OXM (amino, Lysi2 y Lys30), se aplicó el modelo IPGTT. Los ratones C57BL/6 en ayunas durante la noche se inyectaron IP con los diferentes compuestos y un vehículo (PEG-SH) seguido por inyección IP de glucosa y medición de los niveles de glucosa en sangre de la vena de la cola mediante un glucómetro. PEG-SH (238.10 nmol/kg), PEG30-FMS-OXM homogénea y heterogénea, contenido del péptido 100 nmol/kg) fueron administradas IP 15 minutos antes de la inyección de glucosa IP (1.5 g/kg). Todos los compuestos indujeron tolerancia a la glucosa en comparación con el grupo de vehículo. Sorprendentemente, la variante amino homogenea era ligeramente menos potente en comparación con las otras dos variantes y a la PEG30-FMS-OXM heterogénea (tabla 4, figura 3) reflejada por la glucosa ligeramente superior AUC en comparación con otras variantes, en comparación con los resultados de la actividad ¡n vitro. Sin embargo, todas las variantes mejoraron significativamente la tolerancia a la glucosa en comparación con el control de vehículo de PEG-SH.
Tabla 4 Tolerancia a la glucosa en ratones C57BL/6 Las variantes homogéneas y heterogéneas de la PEG30-FMS-OXM reversible mostraron que eran activas in vitro y en el modelo IPGTT in vivo. Sorprendentemente, los resultados in vitro no estaban alineados con lo que se sugiere en la literatura, tal que N-terminal de OXM nativa está implicado en el enlace de péptido al receptor de GLP-1 ; por lo tanto, se esperaba que la variante del amino terminal mostraría la potencia menor in vitro e in vivo. Sin embargo, la variante amino homogénea de PEG30-FMS-OXM mostró una mejora en la activación del receptor de GLP-1 en comparación con las dos otras variantes homogéneas utilizando dos diferentes líneas celulares (tabla 3) mientras demuestra eficacia comparable en IPGTT en el modelo in vivo. El modelo IPGTT in vivo parece presentar actividad comparable (teniendo en cuenta la variabilidad entre los animales). Aunque diferentes actividades de unión in vitro al GLP-1 R y el GCGR fueron observadas entre las diferentes variantes de PEG30-FMS-OXM, capacidad comparable para inducir tolerancia a la glucosa fue demostrado (tablas 3 y 4). Inesperadamente, la actividad superior in vitro de amino homogéneo PEG30-FMS-OXM como se muestra en el ensayo de inducción de cAMP no se reflejó en la prueba de tolerancia a la glucosa IP in vivo. Las variantes amino homogéneas PEG30-FMS-OXM mostraron el perfil de tolerancia de glucosa menor comparado con las otras dos variantes y la PEG30-FMS-OXM heterogénea. Sin embargo, todavía demostró efecto de tolerancia de glucosa significativa en comparación con el vehículo (figura 3).
Ejemplo 5 Mejora de los perfiles de lípidos, glucemia y peso corporal por variantes de PEG30-FMS-OXM en el modelo de ratones ob/ob El modelo de ratones ob/ob exhibe una mutación del gene ob tal que no pueden producir leptina y desarrollar un fenotipo caracterizado por hiperinsulinemia, obesidad, hiperfagia, resistencia a la insulina y posteriormente hiperglucemia. Estos ratones fueron utilizados como un modelo genético de diabetes en dos diferentes estudios para evaluar la eficacia de la PEG30-FMS-OXM (heterogénea) y las tres variantes homogéneas de PEG30-FMS-OXM (amino, Lys12 y Lys30).
Estudio 1 : Este estudio comparó la eficacia de las variantes homogéneas (aminoácidos, Lys12 y Lys30) y la MOD-6030 heterogénea cuando se administra en 2000 nmol/kg. Se obtuvieron reducciones de peso corporal para todos los artículos probados en comparación con el grupo de vehículo (PEG-SH) con reducción final (el día 18) de 3.1 %, 4.7%, 4.9% y 6.5% para Lys12, MOD-6030, amino y variantes de Lys30, respectivamente (figura 4). Se observaron reducciones de peso corporal después de la inyección de fármacos en los días 1 , 5, 13 y 16 (figura 4). Se observó disminución de la ingesta de alimentos para todos los grupos tratados después de la administración de fármacos (excepto el día 9) (figura 5). La medición de parámetros de glucemia a lo largo del estudio ha mostrado mejora de glucosa en ayuno (figura 6a) para los grupos tratados con amino y Lys12 y mejora la glucemia en ayunas para todos los grupos de tratamiento (figura 6b). Todos los grupos tratados muestran significativamente menor nivel de insulina en comparación con el control de los grupos. Es de destacar que la dosis administrada en este estudio fue de 2000 nmol/kg, que es la dosis efectiva más baja de MOD-6030 y así la mejora del peso corporal, ingesta de alimentos y el perfil glucémico fueron relativamente moderados. Inesperadamente la variante amino era la única variante que mostró eficacia superior en la capacidad de reducir el peso, inhibir la ingesta de alimentos y mejorar el control glucémico. Desde una perspectiva de la fabricación, la síntesis en las resina de la variante amino es el procedimiento más directo teniendo en cuenta que el péptido en la síntesis en fase sólida se extiende desde el amino terminal. La amina terminal tiene disponibilidad preferida para el acoplamiento de los grupos internos amino de la lisina en la posición 12 y 30. Esta accesibilidad se refleja en los mayores rendimientos de producción de la variante de amino en comparación con las variantes Lys12 y Lys30. Un beneficio adicional es que la síntesis hacia la variante amino permanece inalterada en relación con la síntesis de OXM para la variante heterogénea, mientras que la síntesis de las variantes de Lys12 y Lys30 fue modificada cambiando la Lys utilizada para la síntesis de péptidos y mediante la adición de un paso selectivo de división (selectivamente quitando el grupo de protección del Lys). La síntesis de OXM como se desarrolló anteriormente para la heterogénea ya se ha optimizado para lograr el mejor rendimiento y robustez. En general, desde una perspectiva de fabricación, síntesis de la variante amino en resina es directa y posee una ventaja sobre las variantes alternativas. Siendo una variante homogénea, tiene también una ventaja sobre una variante heterogénea en que es más conveniente para el desarrollo de medicamentos y tratamiento farmacológico.
Estudio 2: Este estudio investigó el efecto crónico de una administración dos veces por semana de MOD-6031 (las variantes de amino) en 1000, 3000 y 6000 nmol/kg, sobre los parámetros farmacocinéticos y farmacológicos en el modelo de ratones ob/ob, mientras OXM y liraglutida (agonista del receptor de GLP-1 de acción prolongada) fueron evaluados como compuestos de referencia. Los parámetros farmacológicos medidos fueron el peso corporal, ingesta de alimentos y agua, control de la glucosa y perfil de los lípidos. Dos veces por semana la administración de altas dosis de la ingesta de MOD 6031 reduce significativamente la ingesta de alimentos (6000 nmol/kg) y el peso del cuerpo (figuras 7, 8), mientras que las dosis más bajas (3000 y 1000 nmol/kg) han mostrado efectos menores. En la conclusión de los animales del estudio (día 33) de 1000, 3000 y 6000 nmol/kg mostraron reducción del peso corporal de 5.2%, 12.3% y 28.3%, respectivamente. El grupo alimentado en par, que fueron emparejados con el grupo de dosis alta y comió igual cantidad de alimentos (excepto los días en ayunas), tuvo una reducción del peso corporal de 12.7% mientras experimentó la ingesta de alimentos similar. Este fenómeno puede atribuirse a la capacidad de la variante amino de PEG30-FMS-OXM para aumentar el gasto de energía y así los animales que fueron tratados con 6000 nmol/kg de la variante amino tenían una mayor reducción de peso corporal sobre la reducción de peso del cuerpo de su grupo alimentado en par. Sobre el estudio OXM y liraglutida disminuyeron significativamente el peso corporal, un 10.3% y 8.3% respectivamente. La medición del perfil glucémico que controlar la glucosa no en ayunas en los días 1 , 5, 12, 19, 26 y 29 y la glucosa en ayunas en los días 2, 9, 16, 23 y 30 han mostrado una mejoría significativa de estos parámetros, especialmente para los 6000 nmol/kg (figuras 9a, 9b). Los estudios de la prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) fueron realizados en los días 2 y 30 (figuras 10 y 1 1 , respectivamente). Los resultados mostraron que MOD-6031 (la variante amino) mejora significativa y dependientemente de la dosis la tolerancia a la glucosa con glucosa en plasma siendo reducida significativamente en 1000, 3000 y 6000 nmoles/kg grupo. Los animales alimentados en par a la mayor dosis de MOD-6031 exhibieron una excursión de glucosa post-dosis de glucosa que no fue significativamente diferente a los controles en cualquiera de los puntos del tiempo probados. El día 2 de los estudios de OGTT, el perfil mejorado de glucosa se asoció con un retraso de la respuesta de la insulina, que ligeramente retrasó y dio mayor estímulo para la AUC 0-120 min (figura 10). Esto puede ser debido a la inhibición del vaciado gástrico inducido por la actividad farmacológica de MOD-6031 que se traduce en un retraso en la liberación de glucosa en la sangre y una segunda fase de secreción de insulina. El día 30 de los estudios de OGTT estuvo asociado con una respuesta de la insulina reducida en comparación con los controles que muestran que el compuesto mejora la sensibilidad a la insulina (figura 11 ). Además, MOD-6031 redujo de una forma dependiente de la dosis el colesterol terminal; la reducción observada con las 6000 nmoles/kg dosis de MOD 6031 fue significativamente mayor que la de sus contrapartes alimentadas en par (figura 12). Todas estas mejoras farmacológicas en el peso corporal, la ingesta de alimentos, perfiles de glucemia y lípidos eran mayores no sólo que los animales tratados bi-diariamente con OXM o liraglutida, sino también fueron significativamente mayores que los efectos observados en las contrapartes alimentadas en par.
El nivel de sangre terminal de MOD-6031 (PEG-FMS-OXM) y sus compuestos hidrolizados (PEG-FMS y OXM) fueron medidos usando un metodo de LC-MS/MS calificado. Los resultados mostraron concentraciones dependientes de las dosis para los grupos MOD-6031 tratados (tabla 5). La comparación de estos datos a los niveles del compuesto en el día 2 (después de la administración única) mostró que el péptido OXM no se acumuló durante el período de estudio cuando se administró dos veces por semana. PEG-FMS y PEG-FMS-OXM mostraron acumulación moderada durante el estudio (tabla 5). La concentración real del péptido MOD-6031 y OXM para la dosis superior de MOD-6031 en 24 horas después de la última inyección (día 33) eran 490 mg/ml y 0.37 pg/ml, respectivamente. Todas las muestras de animales de control estaban por debajo del límite inferior del ensayo.
Tabla 5 Comparación de las concentraciones plasmáticas 24 horas despues de dosis única (día 2) y última inyección del régimen de repetición de dosificación MOD-6031 (día 33) - - - - Dosis que incluyen las impurezas son 1515, 4545 y 9090 nmol/kg Ejemplo 6 Mejora de los parámetros farmacocinéticos por la variante MOD-6031 en el modelo de ratones ob/ob Tres grupos (n = 12) de ratones ob/ob fueron administrados individualmente con 1000, 3000 y 6000 nmol/kg de MOD-6031 y fueron desangrados en 4, 8, 24, 36, 48, 72, 96 y 120 horas después de la administración (n = 3 por punto temporal) para el análisis de PK y la cantidad de MOD-6031 y sus concentraciones de compuestos determinadas por el método LC-MS/MS. Los parámetros farmacocinéticos como Cmax, Tmax, AUC, T1/2 Cl y Vz se calcularon para MOD-6031 (PEG-FMS-OXM) y sus productos hidrolizados; PEG-FMS y OXM, estos parámetros se presentan en las tablas 6a, 6b y 6C, respectivamente. La AUC 0-¥ estaba dentro del 15% de la AUC 0-t para todos los componentes en todas las dosis, indicando que el programa de muestreo era adecuado para caracterizar el perfil farmacocinético de cada componente. Para los tres componentes, la exposición parecía ser proporcional a la dosis. En general, Cmax y AUCO-t aumentaron con la dosis y en aproximadamente la misma proporción que el aumento de la dosis.
Los parámetros para cada componente se expresan en las concentraciones molares en la tabla 7. Los valores de Cmax fueron aproximadamente equivalentes para la PEG-FMS-OXM y PEG-FMS e inferior para OXM. El T1/2 observado para PEG-FMS-OXM y OXM fueron aproximadamente 9 y 12 horas, respectivamente. El T1/2 terminal de PEG-FMS fue mucho más largo, aproximadamente 30 horas. Todas las muestras de animales de control y todas las muestras antes de la dosificación estuvieron por debajo del límite inferior del ensayo.
Los datos farmacocinéticos y farmacológicos confirman las propiedades de acción prolongada MOD-6031. Dos veces por semana una dosis de 3000 nmoles/kg de MOD-6031 redujo significativamente el consumo de alimento y peso del cuerpo que era comparable a dos veces al día del brazo del tratamiento del péptido OXM administrado a una dosis de 6000 nmoles/kg lleva también a una reducción significativa de la carga de fármaco.
Tabla 6a Parámetros farmacocinéticos de PEG-FMS-OXM tras la inyección SC de 1000, 3000 o 6000 nmoles/kg Tabla 6b Parámetros farmacocinéticos de PEG-FMS tras la inyección SC de 1000, 3000 o 6000 nmoles/kg de MOD-6031 Nota: Debido a la impureza de PEG-FMS en las soluciones de dosificación, las dosis administradas de PEG-FMS (MOD-6031 más la impureza PEG-FMS) fueron 1515, 4545 y 9090 nmol/kg en lugar de 1000, 3000 y 6000 nmol/kg, respectivamente.
Tabla 6C Parámetros farmacocineticos de OXM tras la inyección de SC de 1000, 3000 o 6000 nmoles/kg de MOD-6031 NC = debido a la forma de la concentración versus perfil de tiempo, los parámetros no pueden ser calculados Tabla 7 Parámetros farmacocineticos que comparan los tres componentes sobre una base Molar aDosis de PEG-FMS representa las impurezas (MOD-6031 más la impureza PEG-FMS).
Mientras que ciertas características de la invención han sido ilustradas y descritas, muchas modificaciones, sustituciones, cambios y equivalentes ocurrirán ahora a aquellos de ordinaria habilidad en la téenica. Es, por tanto, debe entenderse que las reivindicaciones anexadas se destinan a cubrir dichas modificaciones y cambios como si estuvieran dentro del verdadero espíritu de la invención.

Claims (43)

REIVINDICACIONES
1.- Una composición que consta de oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde dicho polímero de PEG se une al amino terminal de dicha oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque dicha oxintomodulina consiste en la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1.
3.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizada porque dicho polímero PEG es un polímero de PEG con un grupo sulfhidrilo.
4.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque dicho polímero PEG es PEG30.
5.- Una composición farmacéutica que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4 y un portador farmacéuticamente aceptable.
6.- Una composición que consta de oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde dicho polímero de PEG se une al residuo sina en el número de posición doce (Lys12) de dicha secuencia de aminoácidos de oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
7.- La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque dicha oxintomodulina consiste en la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1.
8.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizada porque dicho polímero PEG es un polímero de PEG con un grupo sulfhidrilo.
9.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque dicho polímero PEG es PEG30.
10.- Una composición farmaceutica que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 y un portador farmacéuticamente aceptable.
1 1.- Una composición que consta de oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde dicho polímero de PEG se une al número de residuo de lisina trece (Lys30) de dicha oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
12.- La composición de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada porque dicha oxintomodulina consiste en la secuencia de aminoácido establecida en SEQ ID NO: 1.
13.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, caracterizada porque dicho polímero PEG es un polímero de PEG con un radical sulfidrilo.
14.- La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizada porque dicho polímero PEG es PEG30.
15.- Una composición farmaceutica que comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones de 11 a 14 y un portador farmacéutico aceptable.
16.- Un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de oxintomodulina, que consiste del paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (PEG polímero) a los residuos de lisina en el número de posición 12 o a los residuos de lisina en el número de posición 30 o al amino terminal de dicha secuencia de amino oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
17.- El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque dicha oxintomodulina consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
18.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 17, caracterizado porque se conjuga dicho polímero PEG al residuo amino terminal o lisina de dicha oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
19.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, caracterizado porque dicho polímero PEG es un polímero de PEG con un grupo sulfhidrilo.
20.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, caracterizado porque dicho polímero PEG es PEG30.
21.- Un método para reducir la frecuencia de dosificación de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) a los residuos de lisina en el número de la posición 12 o al residuo de lisina en el número de posición 30 o al amino terminal de dicha secuencia de aminoácidos oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
22.- El metodo de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado porque dicha oxintomodulina consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
23.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22, caracterizado porque dicho polímero PEG es un polímero de PEG con un grupo sulfhidrilo.
24.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque dicho polímero PEG es PEG30.
25.- Un método para extender la vida media de oxintomodulina, que consiste en el paso de conjugar oxintomodulina, un polímero de polietilenglicol (polímero PEG) y 9-fluorenílmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS), en donde dicho polímero PEG se conjuga al residuo de lisina en el número de posición 12 o al residuo de lisina en el número de posición 30 o al amino terminal de dicha secuencia de aminoácidos oxintomodulina vía 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) o 2-sulfo-9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMS).
26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque dicha oxintomodulina consiste en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
27.- El metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 26, caracterizado porque se conjuga dicho polímero PEG al residuo amino terminal o lisina de dicha oxintomodulina vía Fmoc o FMS.
28.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, caracterizado porque dicho polímero PEG es un polímero de PEG con un grupo sulfhidrilo.
29.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, caracterizado porque dicho polímero PEG es PEG30-
30.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, caracterizado porque dicha oxintomodulina es liberada en un fluido biológico por hidrolízación química de dicho FMS o dicho enlazador Fmoc de dicha composición.
31.- El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la oxintomodulina liberada está intacta y recupera la actividad de unión del receptor de GLP-1 y glucagón.
32.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 31 , caracterizado porque dicho fluido biológico es sangre, sueros o líquido cefalorraquídeo.
33.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 32, caracterizado porque dicho líquido biológico está en un sujeto humano.
34.- El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, caracterizado porque hidroliza químicamente dicho FMS o dicho Fmoc extiende el tiempo de circulación de dicho péptido de OXM en dicho líquido biológico.
35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque extender el tiempo de circulación de dicha OXM permite que dicha OXM cruce la barrera hematoencefálica y se dirija al CNS.
36.- El uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, 6-10 o 11 -15 para la inducción de tolerancia a la glucosa en un sujeto que lo necesita.
37.- El uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, 6-10 o 11 -15 para inducir el control glucémico en un sujeto que lo necesita.
38.- El uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, 6-10 o 1 1-15 para reducir la ingesta de alimentos en un sujeto.
39.- El uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 6-10 o 11 -15 para reducir el peso corporal en un sujeto.
40.- El uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, 6-10 o 11 -15 para mejorar los niveles de colesterol en un sujeto.
41.- El uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, 6-10 o 1 1 -15 para el método de aumentar la sensibilidad a la insulina en un sujeto.
42.- El uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, 6-10 o 1 1 -15 para reducir la resistencia a la insulina en un sujeto.
43.- El uso de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, 6-10 o 11 -15 para el metodo de aumento del gasto de energía en un sujeto.
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