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MX2014014649A - Composiciones de polisacáridos y métodos de uso. - Google Patents

Composiciones de polisacáridos y métodos de uso.

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MX2014014649A
MX2014014649A MX2014014649A MX2014014649A MX2014014649A MX 2014014649 A MX2014014649 A MX 2014014649A MX 2014014649 A MX2014014649 A MX 2014014649A MX 2014014649 A MX2014014649 A MX 2014014649A MX 2014014649 A MX2014014649 A MX 2014014649A
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MX
Mexico
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pnag
positive
further characterized
ica
pga
Prior art date
Application number
MX2014014649A
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Inventor
Gerald B Pier
Colette Cywes-Bentley
David Skurnik
Original Assignee
Brigham & Womens Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=49673891&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=MX2014014649(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Brigham & Womens Hospital filed Critical Brigham & Womens Hospital
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Abstract

La invención se relaciona, en parte, con el uso de composiciones de poli N-glucosamina acetilada (PNAG) y anticuerpos específicos de PNAG en la prevención y tratamiento de infecciones por determinados patógenos -positivos a PNAG y en métodos de detección (que incluyen diagnóstico).

Description

COMPOSICIONES DE POLISACÁRIDOS Y MÉTODOS DE USO SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional Estadounidense No. 61/653389, presentada el 30 de mayo de 2012, y Solicitud Provisional Estadounidense No. 61/827661, presentada el 26 de mayo de 2013. Los contenidos de estas solicitudes provisionales, excluyendo las reivindicaciones, se incorporan mediante referencia aquí.
APOYO GUBERNAMENTAL La presente invención fue financiada en parte por el número de otorgamiento R01 AI046706 del NIH (NIAID). El Gobierno de Estados Unidos tiene determinados derechos en la invención.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el uso de determinadas composiciones de antígeno de polisacárido y de anticuerpos en la detección, prevención y/o tratamiento de infecciones por patógenos particulares.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El desarrollo de inmunoterapias para diversas infecciones, ya sean bacterias, virus, hongos o parásitos en la naturaleza, es una alta prioridad. Muchas inmunoterapias actuales se dirigen a especies microbianas particulares mediante antígenos específicos a especies. Menos comunes son las inmunoterapias que se dirigen y son efectivas contra una amplia gama de microbios.
El Staphylococcus aureus y S. epidermidis expresan un antígeno de polisacárido de poli-N-acetil glucosamina (PNAG) en su superficie. El PNAG se sintetiza in vivo por los productos génicos del locus del gen ica en estas bacterias. De forma similar, la Escherichia coli y otras bacterias gram-negativas contienen un locus genético homólogo denominado locus pga que también codifica la síntesis de las proteínas que se pueden utilizar para sintetizar PNAG. De este modo, las bacterias con un locus ica o pga intacto pueden producir PNAG. Se encontró previamente que las formas desacetiladas de este antígeno son particularmente efectivas en estimular respuestas inmunes específicas a antígeno que se caracterizan en parte por la inducción de anticuerpos opsónicos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa, en parte, en el descubrimiento inesperado y sorprendente de que el polisacárido de poli N-acetil glucosamina (PNAG) se expresa por un número y una variedad de patógenos que anteriormente no eran conocidos o sugeridos por expresar este polisacárido. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden este polisacárido o anticuerpos específicos para este polisacárido para su uso en la prevención y/o tratamiento de infecciones por estos patógenos particulares, y opcionalmente tratar y/o prevenir una enfermedad o trastorno que puede resultar de dicha infección.
De forma sorprendente, se encuentran que los patógenos expresan PNAG, de acuerdo con la invención, varían sobre una serie de clases y tipos. Estas clases y patógenos específicos son los siguientes: (a) cocos gram-positivos: cepas de vacuna y no vacuna de Streptococcus pneumoniae , estreptococos del grupo A, tales como Streptococcus pyogenes, Streptococcus del grupo B tales como Streptococcus pneumoniae , Streptococcus del Grupo A tales como Streptococcus pyogenes, Streptococcus del Grupo B tales como Streptococcus agaiactiae, y Streptococcus del Grupo C tales como Streptococcus dysagalactiae, y Enterococcus faecalis ; (b) bacilos gram-positivos: Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis, y M. smegmatis ; (c) cocos y cocobacilos gram-negativos: Neisseria meningitides, N. gonorrhoeae, Hemophilus influenzae no tipificable, Hemophilus ducreyi, Helicobacter pylorí, y Campylobacter jejunr, (d) bacilos gram-negativos: Bacteroides fragilis, B. thetaiotamicron, B vulgatis, Citrobacter rodentium, Vibrio cholerae, Salmonella enterica serovariedad typhi y Salmonella entérica serovariedad typhimurium; (e) hongos: Candida albicans (levadura), Candida albicans (hifas), Aspergillus flavus, Fusarium spp tales como Fusarium solani, y Cryptococcus neoformans ; y (f) parásito: Plasmodium bergei y P. falciparum (que incluye esporozoitos); y Trichomonas vaginalis ( T . vaginalis). La expresión de PNAG por estos patógenos es particularmente sorprendente, ya que ninguno de ellos tiene un locus genético identificable relacionado con el locus ica de Staphylococci o un locus pga de E. coli, que codifican proteínas implicadas en la síntesis relacionada con polisacáridos y PNAG en determinadas bacterias. Por lo tanto, estos patógenos se denominan aquí como patógenos sin ica/pga para indicar que no tienen locus ica ni pga identificable.
La invención también proporciona métodos para detectar cualquiera de los patógenos anteriores utilizando, por ejemplo anticuerpos específicos para PNAG.
De esta manera, en un aspecto, la invención proporciona un método que comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG pero sin ica/pga una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunitaria contra el patógeno de un polisacárido aislado que tiene la fórmula _ en donde n es por lo menos 5, R se selecciona del grupo que consiste de -NH-CO-CH3 y -NH2, siempre y cuando menos del 50% de los grupos R sean -NH-CO-CH3.
En otro aspecto, la invención proporciona un metodo que comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunitaria contra el patógeno de un polisacárido aislado conjugado con un portador, en donde el polisacárido tiene la fórmula en donde n es 5 o mayor, R se selecciona del grupo que consiste de -NH-CO-CH3 y -NH2, siempre y cuando menos del 50% de los grupos R sean -NH-CO-CH3.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmaceutica que comprende un polisacárido aislado que tiene la fórmula en donde n es por lo menos 5, R se selecciona del grupo que consiste de -NH-CO-CH3 y -NH2, siempre y cuando menos del 50% de los grupos R sean -NH-CO-CH3, para uso en prevenir o tratar, en un sujeto, una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un polisacárido aislado conjugado con un portador, en donde el polisacárido tiene la fórmula en donde n es 5 o mayor, R se selecciona del grupo que consiste de -NH-CO-CH3 y -NH2, siempre y cuando menos del 50%> de los grupos R sean -NH-CO-CH3, para uso en prevenir o tratar, en un sujeto, una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga.
En algunas realizaciones, el polisacárido aislado se conjuga con el portador a través de un ligador. En algunas realizaciones, el portador es un portador de péptido. Cada polisacárido puede estar conjugado con uno o más portadores. El portador puede ser un polisacárido. En algunas realizaciones, el portador polisacárido no es una N-acetil beta (b) 1-6 glucosamina.
En algunas realizaciones, igual a o menor de 45%>, igual a o menor de 40%>, igual a o menor de 35%>, igual a o menor de 30%>, igual a o menor de 25%>, igual a o menor de 20%>, igual a o menor de 15%>, igual a o menor de 10%>, igual a o menor de 5%>, o igual a o menor de 1% de los grupos R son -NH-CO-CH3. En alguna realización, ninguno de los grupos R es -NH-CO-CH3.
En algunas realizaciones, n es por lo menos 9, por lo menos 10, por lo menos 20, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 200, por lo menos 300, por lo menos 400 o por lo menos 500.
En algunas realizaciones, el polisacárido aislado tiene un peso molecular de 100 a 500 kDa. En algunas realizaciones, el polisacárido aislado tiene un peso molecular de por lo menos 900 Daltons, por lo menos 2,000 Daltons, por lo menos 2,500 Daltons, por lo menos 5,000 Daltons, por lo menos 7,500 Daltons, por lo menos 10,000 Daltons, por lo menos 25,000 Daltons, por lo menos 50,000 Daltons, por lo menos 75,000 Daltons, por lo menos 100,000 Daltons, por lo menos 125,000 Daltons, por lo menos 150,000 Daltons, por lo menos 200,000 Daltons, por lo menos 250,000 Daltons, por lo menos 300,000 Daltons, por lo menos 350,000 Daltons, por lo menos 400,000 Daltons, por lo menos 450,000 Daltons, o por lo menos 500,000 Daltons.
En algunas realizaciones, el polisacárido aislado se administra o formula con un adyuvante o se utiliza en conjunto con un adyuvante.
En algunas realizaciones, el polisacárido aislado se administra por vía sistemica o se formula para administración sistémica. En algunas realizaciones, el polisacárido aislado se administra por vía local o se formula para administración local.
En algunas realizaciones, el polisacárido aislado se proporciona en una composición que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto, la invención proporciona un método que comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG sin icalpga una cantidad efectiva de un anticuerpo específico a PNAG o fragmento de anticuerpo específico a PNAG.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmaceutica que comprende un anticuerpo específico a PNAG o fragmento de anticuerpo específico a PNAG para uso en prevenir o tratar, en un sujeto, una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga.
En algunas realizaciones, el patógeno positivo a PNAG sin icalpga es un coco gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga. En algunas realizaciones, el coco gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga es S. pneumonía , Streptococcus del Grupo A, Streptococcus del Grupo B, Streptococcus del Grupo C, o Enterococcus.
En algunas realizaciones, el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un bacilo gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga. En algunas realizaciones, el bacilo gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga es Listeria, Clostridium difficile, B. subtilis, M. tuberculosis, o M. smegmatis.
En algunas realizaciones, el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un coco o cocobacilo gram-negativo positivo a PNAG sin icalpga. En algunas realizaciones, el coco o cocobacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga es Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, H. influenzae no tipificable, Helicobacter spp, o Campylobacter spp.
En algunas realizaciones, el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga. En algunas realizaciones, el bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga es Bacteroides fragilis, B. thetaiotamicron, B. vulgatis, Citrobacter rodentium , Vibrio cholerae , Salmonella enterica serovariedad typhi y Salmonella entérica serovariedad typhimurium. En algunas realizaciones, el patógeno positivo a PNAG sin icalpga es un hongo positivo a PNAG sin ica/pga. En algunas realizaciones, el hongo positivo a PNAG sin ica/pga es Candida albicans (levadura); Candida albicans (hitas), Aspergillus, Fusarium, o Cryptococcus.
En algunas realizaciones, el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un parásito positivo a PNAG sin ica/pga. En algunas realizaciones, el parásito positivo a PNAG sin ica/pga es P. bergei o P. falciparum.
En algunas realizaciones, el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es T. vaginalis.
En algunas realizaciones, el sujeto es humano. En algunas realizaciones, el sujeto es un primate, caballo, vaca, cerdo, cabra, oveja, perro, o gato.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga. En algunas realizaciones, el sujeto está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra por vía sistémica o se formula para administración sistémica. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra por vía local o se formula para administración local.
En otro aspecto, la invención proporciona un método que comprende precipitar con etanol una preparación de polisacáridos cruda a partir de una preparación de cuerpo de celula microbiana concentrada; digerir al mismo tiempo el polisacárido crudo con lisozima y lisostafina seguido por digestión secuencial con una nucleasa y proteinasa K para formar una preparación de polisacáridos digerida; fraccionar en tamaño la preparación de polisacáridos digerida; aislar una fracción de polisacárido acetilada; y desacetilar la fracción de polisacárido acetilada para producir un polisacárido PNAG que tiene menos de 50% de sustituciones de acetato, en donde la preparación de cuerpo de célula microbiana se deriva de un microbio positivo a PNAG sin ica/pga. En algunas realizaciones, la preparación de polisacárido se divide utilizando una columna. En algunas realizaciones, el método produce el polisacárido PNAG que tiene menos de 40% de sustituciones de acetato.
En otro aspecto, la invención proporciona un método que comprende preparar un polisacárido impuro a partir de un cultivo microbiano; incubar el polisacárido impuro con un ácido o una base para producir una preparación de polisacárido semi-pura; neutralizar la preparación; incubar la preparación neutralizada en ácido fluorhídrico; aislar un polisacárido acetilado a partir de la preparación; y desacetilar el polisacárido acetilado para producir un polisacárido PNAG que tiene menos de 50% de sustituciones de acetato, en donde el cultivo microbiano es un cultivo microbiano positivo a PNAG sin ica/pga. En algunas realizaciones, el método produce un polisacárido PNAG que tiene menos de 40%> sustituciones de acetato.
En otro aspecto, la invención proporciona un metodo que comprende preparar un polisacárido impuro a partir de un cultivo microbiano; incubar el polisacárido impuro con un ácido o una base para producir una preparación de polisacárido semi-pura; neutralizar la preparación; incubar la preparación neutralizada en ácido fluorhídrico; y aislar a partir de la preparación un polisacárido PNAG que tiene menos de 50% de sustituciones de acetato, en donde el cultivo microbiano es un cultivo microbiano positivo a PNAG sin icalpga. En algunas realizaciones, se aísla el polisacárido PNAG que tiene menos de 40%> sustituciones de acetato.
En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente conjugar un portador al polisacárido aislado. En algunas realizaciones, el portador es un portador de péptido.
En algunas realizaciones, el polisacárido acetilado se desacetila químicamente.
En algunas realizaciones, el polisacárido acetilado se desacetila mediante incubación con una solución básica. En algunas realizaciones, el polisacárido acetilado se desacetila enzimáticamente.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir anticuerpos que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva para producir anticuerpos de un polisacárido PNAG aislado a partir de un patógeno positivo a PNAG sin icalpga, y un adyuvante, y aislar anticuerpos del sujeto. En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos policlonales.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir anticuerpos monoclonales que comprende administrar a un sujeto una cantidad efectiva para producir anticuerpos de un polisacárido PNAG aislado a partir de un patógeno positivo a PNAG sin icalpga, y un adyuvante, cosechar células de bazo del sujeto, fusionar células de bazo del sujeto a células de mieloma, y cosechar anticuerpo producido a partir de un subclón de fusión.
En algunas realizaciones, el método comprende adicionalmente aislar el anticuerpo.
En algunas realizaciones, el polisacárido PNAG es menos del 50% acetilado.
En algunas realizaciones, el sujeto es un conejo. En algunas realizaciones, el sujeto es humano.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para detectar un patógeno positivo a PNAG sin icalpga, que comprende poner en contacto una muestra que se sospecha contiene un patógeno positivo a PNAG sin icalpga con un anticuerpo específico a PNAG o fragmento de anticuerpo, y detectar la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a la muestra, en donde la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo indica que el patógeno positivo a PNAG sin icalpga está presente en la muestra.
En algunas realizaciones, la muestra es Estafilococo negativo.
En algunas realizaciones, la muestra es una muestra biológica de un sujeto. En algunas realizaciones, la muestra biológica es orina, sangre, pus, piel, esputo, fluido articular, linfa o leche. En algunas realizaciones, la muestra se deriva de un hisopo de un dispositivo implantable o medico implantado o una pieza de equipo médico o una superficie en una instalación para el cuidado de pacientes.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es anticuerpo F598 (ATCC PTA-5931) o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es anticuerpo F628 (ATCC PTA-5932) o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es anticuerpo F630 (ATCC PTA-5933) o un fragmento del mismo. En algunos casos, también se puede utilizar antisuero policlonal producido para PNAG.
En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se conjuga con un agente.
En algunas realizaciones, el agente es un agente citotóxico tal como un antibiótico o un radioisótopo. En algunas realizaciones, el agente es una etiqueta detectable. En algunas realizaciones, la etiqueta detectable es una etiqueta radioactiva, una enzima, una molécula de biotina, una molécula de avidina o un fluorocromo.
Cada una de las limitaciones de la invención puede abarcar diversas realizaciones de la invención. Por lo tanto se anticipa que cada una de las limitaciones de la invención que involucra cualquier elemento o combinaciones de elementos se pueden incluir en cada aspecto de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Efecto de MAb F598 sobre el PNAG suministrado por vía intraperitoneal (ip) y por vía tópica partiendo en 4 horas post-infección. Esta Figura muestra datos a partir del experimento de 48 horas, de inoculo más bajo. Detalles del experimento: El inoculo es 1x105 /ojo; 200 mg de MAbs inyectado ip 4 y 24 horas post-infección; 20 pg de MAbs aplicado por vía tópica 24 y 32 horas post-infección. Los puntos de datos representan el valor para ratón individual; las barras representan la calificación promedio para el grupo. Valor P: prueba U de Mann Whitncy.
Figura 2. Efecto de MAb F598 sobre el PNAG dado IP y por vía tópica partiendo en 4 horas post-infección. Esta Figura muestra datos a partir del inoculo bajo, experimento de 48 horas. Detalles del experimento: El inoculo es 2x105/ojo; 500 pg de MAbs inyectado IP 4 horas post-infección; 50 pg de MAbs aplicado por vía tópica 24 y 32 horas post-infección. Los puntos de datos representan valor para ratón individual; las barras representan la calificación promedio por el grupo. Valor P: prueba U de Mann Whitney.
Figura 3. Efecto de MAb F598 sobre el PNAG dado por vía tópica partiendo 4 horas post-infección. Esta Figura muestra datos a partir del experimento de 32 horas de inoculo medio. Detalles del experimento: El inoculo es 5.1x106/ojo; MAbs aplicado por vía tópica 4, 8, 24 horas postinfección. Los puntos de datos representan valor para ratón individual; las barras representan la calificación promedio por el grupo. Valor P: prueba U de Mann Whitncy.
Figura 4. Efecto de MAb F598 sobre el PNAG dado por vía tópica partiendo 4 horas post-infección Esta Figura muestra datos a partir del experimento de 32 horas de inoculo alto. Detalles del experimento: Inoculo: 5x107/ojo; MAbs aplicado por vía tópica 4, 8, 24 horas post-infección. El experimento se termina a 32 horas. Los puntos de datos representan valor para ratón individual; las barras representan la calificación promedio por el grupo. Valor P: prueba U de Mann Whitney.
Figura 5. Supervivencia de ratones CBA/N inoculados con S. pneumoniae D39 (N=12/grupo).
Figura 6. Eficacia protectora del anticuerpo producido para la vacuna conjugada 9GlcNH2-TT contra la infección letal de la piel provocada por S. pyogenes (Grupo A Streptococcus).
Figura 7. Eficacia protectora del anticuerpo producido en conejos para la vacuna conjugada 9GlcNH2-TT contra meningitis (bacterias en el cerebro) de crías de ratón de 2 a 3 día de edad inoculadas con cepa B16B6 de N. meningitides del Grupo B. Los puntos de datos representan logio CFU/cerebro para un ratón individual; las barras representan la clasificación mediana por el grupo. Valor P: prueba U de Mann Whitney.
Figura 8. Reducciones en calificaciones de colitis en ratones a los que se administra MAb lgG1 humano a PNAG comparado ya sea con PBS (experimento 1) o un lgG1 MAb humano para VIH (MAb F105, experimento 2). Los puntos de datos representan la clasificación para el ratón individual; las barras representan clasificación mediana por el grupo. Valor P: prueba U de Mann Whitncy.
Figura 9. Comparación de las clasificaciones individuales para los cuatro parámetros utilizados para encontrar la clasificación histológica total en ratones TRUC tratados con ya sea MAb F598 a PNAG o control lgG1 MAb humano a VIH (F 105).
Figura 10. Eficacia protectora del anticuerpo elevado EN conejos a la vacuna conjugada 9GlcNH2-TT contra L. monocytogenes.
Figura 11. Muerte opsónica de 4 cepas de S. pneumoniae mediadas por anticuerpo de conejo producido para dPNAG-TT. La muerte se compara con aquella obtenida en control con suero de conejo normal.
Figura 12. Muerte opsónica de 4 cepas de S. pneumoniae mediadas por lgG1 MAb humano F598 para PNAG20. La muerte se compara con MAb F429 de control específico a alginato de P. aeruginosa.
Figura 13. Muerte opsónica de 3 cepas de E .faecalis mediadas por anticuerpo de conejo producido para 9GlcNH2-TT. La muerte se compara con aquella obtenida en control con suero de conejo normal.
Figura 14. Muerte opsónica de Streptococcus del Grupo A por MAb F598 a PNAG. La muerte se compara con MAb F429 de control específico a alginato de P. aeruginosa.
Figura 15. Muerte opsónica de Candida albicans por MAb F598 a PNAG. La muerte se compara con MAb F429 de específico a alginato de P. aeruginosa.
Figura 16. Muerte bactericida de cepas del serogrupo B de N. meningitidis.
Figura 17. Muerte bactericida de N. gonorrhoeae.
Figura 18. Inhibición de muerte bactericida de N. meningitidis. Figura 19. Inhibición de muerte bactericida de N. gonorrhoeae.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona, en parte, con el hallazgo inesperado de la expresión de PNAG sobre un número de patógenos bacterianos y no bacterianos. El hallazgo es inesperado por lo menos en dos razones. En primer lugar, ninguno de los agentes patógenos que se encuentran expresan PNAG, de acuerdo con la invención, tienen un locus ica o un pga. Los loci ica y pga cada uno codifica cuatro proteínas implicadas en la síntesis de polisacáridos, que incluyen síntesis de PNAG. Se ha considerado, antes de la invención, que un agente patógeno debe tener un locus ica o locus pga con el fin de sintetizar PNAG. El locus ica está presente en S. aureus y S. epidermidis , los cuales se sabe que expresan PNAG antes de la invención, aunque se ha identificado el locus pga en algunos organismos gram- negativos. No es claro cómo los patógenos positivos a PNAG recien descubiertos en realidad sintetizan PNAG en la ausencia aparente de estos loci. Los hallazgos de la invención sugieren que el PNAG se puede sintetizar incluso en ausencia de dichos loci y las proteínas que los codifican. En segundo lugar, existe una gran variedad en los patógenos encontrados por expresar PNAG, que incluyen patógenos bacterianos y no bacterianos. Antes de la invención, no se contemplaba que los agentes patógenos que no expresan un locus ica/pga discernible pueden hacer PNAG. Tampoco se contempla que los agentes patógenos no bacterianos puedan expresar PNAG.
El hallazgo de que estos diversos patógenos bacterianos y no bacterianos expresan PNAG proporciona nuevos enfoques para prevenir, tratar y/o diagnosticar infecciones provocadas por dichos patógenos. Por lo tanto, la invención contempla, entre otras cosas, el aislamiento y/o derivación de PNAG y dPNAG a partir de los patógenos positivos a PNAG descritos recientemente, y su uso en la estimulación de respuestas inmunes (que incluyen las respuestas inmunes requeridas para producir anticuerpos específicos para PNAG), detectar PNAG y patógenos que expresan PNAG, y prevenir y tratar infecciones de patógenos que expresan PNAG. Dichos patógenos que expresan PNAG incluyen, pero no se limitan a los patógenos que expresan PNAG sin ica/pga descritos aquí.
Patógenos positivos a PNAG sin ica/pga Los patógenos recién descubiertos por expresar PNAG se denominan aquí como patógenos positivos a PNAG sin ica/pga para indicar que no contienen un locus genetico con base en ADN con cualquier similitud significativa al loci icalpga de cuatro genes de patógenos que expresan PNAG conocidos tales como S. aureus, S. epidermidis o E. coli. Los loci ica o pga codifican cuatro proteínas (2 glicosíltransferasas, una N-histona, y una proteína para exportar el polisacárido sintetizado). Algunos patógenos de PNAG sin ica/pga no comprenden los genes que codifican estas cuatro proteínas en un solo locus.
La secuencia de nucleótidos de un locus ica de ejemplo (es decir, uno de S. aureus) se ha depositado en GenBank bajo el número de acceso AF086783. Un patógeno que se considera un patógeno “sin ica”, de acuerdo con la invención, no posee un locus ica discernible. Como un ejemplo, dicho patógeno, puede no poseer una secuencia de nucleótidos que ocurre en el mismo tramo contiguo de ADN cromosómico y que tiene por lo menos 25% de homología con la secuencia completa de nucleótidos 4 genes del locus ica depositada bajo AF086783. Los patógenos positivos a PNAG sin ica excluyen Staphylococci.
La secuencia de nucleótidos de un locus pga de ejemplo (es decir, uno a partir de E. coli K12 substr. MG1655) se ha depositado en el GenBank bajo los números de acceso para cada uno de los 4 genes dentro del locus como AAC74106.1, AAC74107.1, AAC74108.1 y AAC74109.1. Un patógeno que se considera un patógeno “sin pga”, de acuerdo con la invención, no posee un locus de pga discernible. Como un ejemplo, dicho patógeno, no puede poseer una secuencia de nucleótidos que ocurra en el mismo tramo contiguo de ADN cromosómico y que tiene por lo menos 25% de homología para todas las cuatro secuencias de nucleótidos depositadas bajo AAC74106.1 , AAC74107.1, AAC74108.1 y AAC74109.1. Los patógenos positivos a PNAG sin png excluyen E. coli, Klebsiella pneumoniae, Bordetella pertussis, B. parapertussis, B. bronchoseptica, Burkholderia cenocepacia, B. dolosa, Actinobacillus pleuropneumoniae, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Acinetobacter baumarmii, y algunas cepas del género Shigella.
Los patógenos positivos a PNAG sin icalpga P incluyen organismos, bacterias, hongos y parásitos gram-negativos y gram-positivos. Más específicamente, las bacterias positivas a PNAG incluyen cocos gram-positivos, bacilos gram-positivos, cocos o cocobacilos gram-negativos y bacilos gram-negativos. Los cocos gram-positivos positivo a PNAG incluyen S. pneumoniae, Streptococcus del Grupo A ( Streptococcus pyogenes), Streptococcus del Grupo B ( Streptococcus agalactiae), Grupo C Streptococcus ( Streptococcus dysagalactiae), y Enterococcus (E.faecalis y EJaecium). Los bacilos gram-positivos positivos a PNAG sin icalpga incluyen Listeria monocytogenes, Clostridium difficile, Bacillus subtilis, Mycobacterium tuberculosis, y M smegmatis. Los cocos o cocobacilos gram-negativos positivos a PNAG sin icalpga incluyen Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, H. influenzae no tipificable, Hemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, y Campylobacter jejuni. El bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga incluye Bacteroides fragilis, B. thetaiotamicron, B. vulgatis, Citrobacter rodentium, Vibrio cholerae, Salmonella enterica serovariedad typhi y Salmonella entérica serovariedad typhimurium.
Los hongos positivos a PNAG sin ica/pga incluyen Candida albicans (levadura), Candida albicans (hitas), Aspergillus, Fusarium, y especies Cryptococcus. Los parásitos positivos a PNAG sin ica/pga incluyen Plasmodium bergei y P. falciparum.
El patógeno positivo a PNAG sin ica/pga puede ser T. vaginalis.
La invención contempla el uso del polisacárido PNAG como un antígeno para inducir respuestas inmunes que son específicas para el polisacárido PNAG en sujetos. Dicha inmunidad se denomina aquí como inmunidad activa. Los sujetos pueden ser aquellos que tienen o están en riesgo de desarrollar infecciones provocadas por uno de los patógenos positivos a PNAG sin ica/pga anteriores. Las infecciones se pueden prevenir o tratar a través del uso del polisacárido PNAG.
La invención también contempla el uso de anticuerpos específicos a PNAG (o fragmentos de anticuerpo) para inducir respuestas inmunes que son específicas para el polisacárido PNAG en sujetos. Dicha inmunidad se denomina aquí como inmunidad pasiva. Los sujetos pueden ser aquellos que tienen o están en riesgo de desarrollar infecciones provocadas por uno cualquiera de los patógenos positivos a PNAG sin ica/pga. Las infecciones se pueden prevenir o tratar a través del uso de los anticuerpos específicos a PNAG (o fragmentos de anticuerpo).
Polisacárido PNAG v dPNAG El polisacárido PNAG es poli N-acetil beta (b) 1-6 glucosamina (es decir, está comprendido de unidades de monómero de glucosamina ligados por enlaces beta (b) 1-6). El grupo acetilo, cuando está presente, es N-ligado al monómero de glucosamina (en lugar de ser O-ligado). El PNAG tiene la estructura de la siguiente fórmula — donde n es un entero y R se selecciona del grupo que consiste de -NH-CO-CH3 y -NH2. “n” puede variar, sin limitación, desde 2 hasta 500.
El PNAG se puede sintetizar in vitro o se puede aislar a partir de una fuente de origen natural, tal como por ejemplo los patógenos positivos a PNAG descritos nuevamente. En su forma nativa, el PNAG existe como una mezcla de formas que varían en acetilación (es decir, donde R es -NH-CO-CH3) desde 1 hasta 100%, las formas más altamente acetiladas (es decir, aquellas que tienen más del 50% de acetilación) son las formas más predominantes.
Se descubrió previamente que las formas pobremente acetiladas son altamente inmunogenicas y más capaces de provocar anticuerpos protectores opsónicos en comparación con las formas más altamente acetiladas en los ensayos de estimulación inmune in vivo. Los anticuerpos producidos después de la administración de dPNAG reconocen dPNAG y, en algunos casos, también las formas altamente acetiladas de PNAG. Estos hallazgos hacen de las formas pobremente acetiladas de PNAG el candidato de vacuna adecuado para estimular respuestas inmunes protectoras en vivo. Como resultado, la presente invención también contempla el uso de formas pobremente acetiladas de PNAG para estimular la inmunidad activa en sujetos. Dichas formas pobremente acetiladas de PNAG se denominan aquí como PNAG desacetilado (o dPNAG). El dPNAG tiene la misma estructura como aquella mostrada anteriormente con la excepción que menos del 50% de los grupos R son -NH-CO-CH3 (es decir, menos de 50%> de los grupos amino se sustituyen con acetato). El dPNAG puede ser completamente o parcialmente desacetilado, dado que el rango de acetilación es desde 0 hasta menos de 50%. El dPNAG completamente desacetilado (es decir, donde solo R=NH2) se puede denominar aquí como un homopolímero. El dPNAG (es decir, en donde R puede ser -NH2 o -NH-CO-CH3, siempre y cuando menos del 50% de R sean -NH-CO-CH3) se puede denominar aquí como un heteropolímero. Por ejemplo, menos de 49%, menos de 45%), menos de 40%>, menos de 35%, menos de 30%>, menos de 25%, menos de 20%>, menos de 15%), menos de 10%>, menos de 5%, o menos de 1% de grupos R may be -NH-CO-CH3. En algunos casos, el nivel de acetilación es 40% o menos, 35% o menos, 20% o menos, o 15% o menos.
La invención contempla el uso de formas altamente acetiladas y pobremente acetiladas de PNAG en diversas aplicaciones. Como un ejemplo no limitante, se puede utilizar PNAG altamente acetilado para elaborar anticuerpos para ser utilizados como un diagnóstico o para otro propósito no terapeutico.
La invención contempla el uso de formas de origen natural de PNAG, ya sea altamente o pobremente acetilado, así como formas sintéticas de PNAG (es decir, aquellas elaboradas completamente de novo). Como se apreciará, se pueden sintetizar dichas formas sintéticas con un número y secuencia conocida de unidades de glucosamina y N-acetil glucosamina que son b-1-6 ligadas entre sí. Las formas sintéticas pueden ser tan pequeñas como 4 monómeros en algunos casos.
La solicitud de patente Estadounidense No. US-2011-0150880 describe oligosacáridos sintéticos, su síntesis y su conjugación a portadores. Las enseñanzas específicas y completas de esta referencia se incorporan mediante referencia aquí. Se pueden utilizar los oligosacáridos sintéticos conjugados a un portador, en algunas realizaciones. Un ejemplo es un conjugado portador de oligosacárido que comprende un oligosacárido conjugado a un portador a través de un enlace que es Fórmula I o Fórmula II en donde n es mayor que 1, m es un número seleccionado desde 1 hasta 10, p es un número seleccionado desde 1 hasta 20, y R es H o un grupo alquilo, y en donde el ligador es O-ligado al oligosacárido y N- ligado al portador, “n” puede ser 2 a 10, 2 a 5, o 2, 3, o 4, en algunas realizaciones.
Otro ejemplo es un oligosacárido que lleva un ligador O-ligado, en donde el ligador comprende Fórmula III, en donde el oligosacárido es una poliglucosamina. La poliglucosamina puede ser un glucosamina b-1-6 ligada que es 2 a 20 monómeros de longitud, 5 a 11 monómeros de longitud, por ejemplo.
El tamaño de PNAG y dPNAG puede variar y puede ser dictado por la aplicación particular. Normalmente el peso molecular del PNAG y dPNAG puede variar desde aproximadamente 900 Daltons (Da) a 750 kilodaltons (kDa). En algunos aspectos, el PNAG o dPNAG tiene un peso molecular de menos de 2 kDa. En algunas realizaciones, el peso molecular de PNAG o dPNAG puede ser por lo menos aproximadamente 2200 Daltons, o por lo menos aproximadamente 2500 Daltons, o por lo menos aproximadamente 3000 Daltons. En algunas realizaciones, el PNAG o dPNAG pueden tener por lo menos 9, por lo menos 10 unidades de monómero de longitud, o por lo menos 12 unidades de monómero de longitud, o por lo menos 15 unidades de monómero de longitud. En otros aspectos, el PNAG o dPNAG tiene un peso molecular de por lo menos 100 kDa, opcionalmente en el rango de 100 a 500 kDa.
Como se discute en mayor detalle en este documento, el PNAG y dPNAG, que incluyen las versiones de bajo peso molecular de PNAG y dPNAG, se pueden conjugar a un portador tal como una proteína portadora. Cuando se conjuga a un portador, el PNAG y dPNAG pueden ser tan pequeños como de 2 a 3 unidades monomericas, pero preferiblemente tienen por lo menos 4 a 6 unidades monoméricas de longitud. Serán típicos los polisacáridos entre 800 de y 1000 kDa. Las formas de PNAG o dPNAG de este tamaño se pueden sintetizar de novo, como se describe aquí. Cuando se utiliza sin un compuesto portador, el PNAG o dPNAG puede ser de aproximadamente 100 kDa o mayor.
Preparación de PNAG La invención contempla el uso de origen natural y formas sintéticas de dPNAG y PNAG, que incluyen dPNAG y PNAG aislado o derivado de patógenos que expresan PNAG sin icalpga descritos aquí. Como se utiliza aquí, PNAG o dPNAG de origen natural es uno que existe en y, opcionalmente, se puede aislar o derivar a partir de fuentes naturales.
Se pueden proporcionar y/o utilizar antígenos PNAG y dPNAG en forma aislada. Un polisacárido aislado, tal como dPNAG aislado, es uno que se ha retirado y de esta manera separado por lo menos en parte del entorno en el que existe normalmente o en que se ha sintetizado. En algunos casos, un polisacárido aislado se separa suficientemente de otros compuestos que se caracterizan estructuralmente o funcionalmente. Por ejemplo, un polisacárido aislado se puede “secuenciar” con el fin de determinar su composición química.
Se puede aislar el dPNAG a partir de PNAG nativo o se puede derivar de PNAG de origen natural más altamente acetilado utilizando los metodos de-acetilación descritos aquí. El dPNAG que se sintetiza in vitro también se puede aislar a partir de su mezcla de reacción de síntesis, separando de esta manera sus sustratos de reacción, enzimas, cofactores, catalizadores, o productos de reacción falsos.
Se pueden preparar el PNAG y dPNAG de cualquier cepa microbiana (incluyendo bacteriana) que lleva el locus ica. Estas cepas que llevan ica incluyen aquellas que expresan de forma natural el locus ica tales como, pero no limitadas a S. epidermis y S. aureus. Las cepas específicas incluyen S. epidermis RP62A (número ATCC 35984), S. epidermis RP12 (número ATCC 35983), S. epidermis M187, S. aureus RN4220 (pCN27), y S. aureus MN8 mucoide. Las cepas que portan ica también incluyen aquellas que se han transformado con los genes en el locus ica (por ejemplo, S. carnosus TM300 (pCN27)).
Se puede preparar PNAG nativo mediante una variedad de métodos que incluyen extraer una preparación nativa PNAG cruda de un cultivo microbiano, que incluye células y sobrenadantes de cultivo libre de células, que resultan en el aislamiento de un material enriquecido con PNAG nativo de alto peso molecular a partir de la preparación de PNAG crudo, y obtenida inicialmente mediante precipitación de un PNAG impuro que contiene el material enriquecido con PNAG de alto peso molecular con un disolvente tal como metanol, etanol, acetona o cualquier otro disolvente orgánico conocido por un experto en la téenica que sea capaz de provocar la precipitación de polisacáridos a partir soluciones acuosas. Las etapas de extraer la preparación PNAG nativa cruda y aislar y precipitar la preparación PNAG nativa impura se pueden realizar utilizando métodos conocidos en la técnica y descritos en la solicitud Estadounidense publicada No. US-2005-0118198-A1.
Este material de PNAG impuro luego se puede purificar y desacetilar para producir dPNAG. Se puede llevar a cabo la desacetilación química o enzimáticamente. En algunos casos, la desacetilación química puede implicar incubar la preparación de PNAG impuro con una base o un ácido para producir una preparación de PNAG semi-pura, neutralizar la preparación, y adicionalmente tratar la preparación neutralizada para producir dPNAG.
La desacetilación enzimática normalmente implica incubar PNAG impuro con enzimas, tales como enzimas bacterianas, que digieren materiales biológicos, que incluyen agentes que interrumpen la pared celular tales como lisozima, lisostafina, y proteinasa K, y enzimas de nucleasa tales como DNasa y RNasa para digerir el ADN y el ARN. Esto se sigue por una adición de un disolvente que precipitará PNAG fuera de la solución, la recolección del precipitado y re-disolución de PNAG en una base, tal como NaOH o un ácido tal como HCI, seguido por neutralización. Se puede lograr la neutralización utilizando una base si la etapa de incubación se realiza con un ácido, o con un ácido si la etapa de incubación se realiza con una base. La fracción insoluble a partir del material neutro luego se trata, por ejemplo, mediante incubación en ácido fluorhídrico para producir un antígeno de PNAG nativo puro o por redisolución en amortiguadores con un pH < 4.0, seguido por tamiz molecular y/o cromatografía de intercambio iónico.
Otro método de aislamiento incluye las etapas de extraer una suspensión de PNAG crudo de un cultivo microbiano (incluyendo bacteriano) al incubar el cultivo con una base o ácido fuerte. Preferiblemente, el cultivo se agita en la base o ácido fuerte durante por lo menos 2 horas, y más preferiblemente por lo menos 5, 10, 15, 18 o 24 horas. La base o ácido fuerte puede ser cualquier tipo de base o ácido fuerte, pero preferiblemente tiene una resistencia de por lo menos NaOH o HCI 1 M. En algunas realizaciones, la base o ácido fuerte es NaOH 5 M o HCI 5 M. La solución de ácido o base luego se somete a centrifugación para recolectar cuerpos celulares. En algunas realizaciones, el procedimiento de extracción se repite varias veces. La solución de ácido o base resultante se neutraliza a aproximadamente pH 7 y luego se dializa para producir PNAG impuro insoluble.
Tambien se puede sintetizar el dPNAG de novo. Los métodos para la síntesis de novo de dPNAG se describen en la solicitud de patente Estadounidense publicada Nos. US-2005-0118198-A1 y US-2011-0150880-A1.
Algunos métodos pueden derivar el dPNAG a partir de materiales de partida, tales como pero no limitados a poliglucosa (es decir, dextrano), poliglucosaminas tales como quitina o quitosano, ácido poliglucosaminourónico, y ácido poligalactosaminourónico también se pueden utilizar para producir el antígeno de dPNAG de la invención.
Las preparaciones de PNAG y dPNAG pueden ser de pureza variable. Como se utiliza aquí, una preparación de PNAG o dPNAG pura es una preparación de PNAG o dPNAG que es mayor de 92% libre de contaminantes. Estos contaminantes incluyen galactosa, fosfato, ácido teicoico, y similares. En algunas realizaciones, las composiciones de PNAG y dPNAG son por lo menos 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% libres de contaminantes o son 100% libres de contaminantes. En algunas realizaciones, una composición de dPNAG está libre de PNAG altamente acetilado.
El grado de pureza de un PNAG o una composición de dPNAG se puede evaluar por cualquier medio conocido en la téenica. Por ejemplo, la pureza se puede evaluar mediante ensayos de análisis químico así como también cromatografía de gases y resonancia magnética nuclear para verificar los aspectos estructurales del material.
Portadores Se pueden utilizar el PNAG y dPNAG, ya sea se sinteticen de novo o se deriven de una fuente de origen natural, en una forma conjugada o no conjugada. En una forma conjugada, el PNAG o dPNAG se pueden conjugar con un portador (o un compuesto portador, ya que los términos se utilizan indistintamente en este documento), ya sea directamente o a través de un ligador. La conjugación puede ocurrir en cualquier posición en el polisacárido, incluyendo en uno o ambos de sus extremos.
Un “portador” como se utiliza aquí es un compuesto que se puede conjugar a un polisacárido, ya sea directamente o a través del uso de un ligador. El portador puede ser inmunológicamente activo (es decir, inmunogénico) o puede ser inerte. Cuando se utiliza in vivo, se debe entender que el portador es seguro para la administración a un sujeto.
Los portadores incluyen pero no se limitan a proteínas o péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, u otros polímeros, lípidos, y moléculas pequeñas. Las proteínas transportadoras incluyen, por ejemplo, proteínas plasmáticas tales como albúmina sérica, inmunoglobulinas, apolipoproteínas y transferrina; polipéptidos bacterianos tales como TRPLE, b-galactosidasa, polipéptidos tales como proteína gD del herpes, alérgenos, difteria y tétanos, salmonella flagelina, haemophilus pilina, haemophilus 15 kDa, proteínas de membrana de 28 a 30kDa y 40 kDa, Escherichia coli, enterotoxina Itb con etiqueta de calor, toxina del cólera, y proteínas virales que incluyen rotavirus VP y proteínas f y g del virus sincicial respiratorio.
Las proteínas portadoras que pueden ser particularmente útiles para la inmunización incluyen hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soya. Se puede utilizar cualquier otro compuesto que sea inmunogenico en el sujeto que se va a inmunizar como un portador.
Se conocen muchos métodos en la téenica para conjugar un polisacárido con una proteína. En general, se debe activar el polisacárido o de otra forma se hacen susceptible a conjugación (es decir, por lo menos un grupo funcional debe ser declarado capaz de unirse de forma covalente a una proteína u otra molécula). Muchos de dichos métodos se conocen en la técnica. Se puede hacer referencia a las Solicitudes de patente Estadounidenses publicadas Nos. US-2005-0118198-A1 y US-2011-0150880-A1 y las Patentes Estadounidenses Nos. 4356170, 4663160, 4619828, 4808700, 4711779.
El portador se puede conjugar a PNAG o dPNAG a través de un ligador o espaciador. Un polisacárido se puede acoplar a un ligador o un espaciador mediante cualquier medio conocido en la técnica que incluye, por ejemplo, utilizar un extremo de reducción libre del polisacárido para producir un enlace covalente con un espaciador o ligador. Se puede producir un enlace covalente al convertir un extremo de reducción libre de PNAG o dPNAG en un 1-aminoglucósido libre, que puede posteriormente unirse covalentemente a un espaciador mediante acilación. (Lundquist et al, J. Carbohydrate Chem., 10:377 (1991)). Alternativamente, el PNAG o dPNAG se puede unir de forma covalente al espaciador utilizando un ester activo de N-hidroxisuccinimida como grupo activado en el espaciador. (Kochetkow, Carbohydrate Research, 146: C1 (1986)). El extremo de reducción libre de PNAG o dPNAG también se puede convertir en una lactona utilizando yodo e hidróxido de potasio. (Isebell et al, Methods of Carbohydrate Chemistry, Academic Press, Nueva York (1962)). La lactona se puede ligar de forma covalente al espaciador por medio de un grupo amino primario en el espaciador o ligador. El extremo de reducción libre de PNAG o dPNAG también se puede unir de forma covalente al ligador o espaciador utilizando la aminación reductora.
Anticuerpos La invención abarca anticuerpos que se unen a PNAG y/o dPNAG. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales. Los anticuerpos que se unen a dPNAG también se pueden unir a formas de formas altamente acetiladas de PNAG. Los anticuerpos se pueden elaborar utilizando dPNAG o PNAG u oligosacáridos sintéticos compuestos de >3 unidades de monosacáridos de glucosamina o N-acetil glucosamina, opcionalmente conjugada a un portador y/o se utiliza en conjunto con un adyuvante. Los anticuerpos se pueden producir utilizando PNAG o dPNAG derivados de patógenos positivos a PNAG sin icaípga o patógenos que llevan ica o que llevan pga.
Los anticuerpos policlonales generalmente se generan en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales de un antígeno y un adyuvante. Los anticuerpos policlonales a PNAG o dPNAG u oligosacáridos sinteticos conjugados se pueden generar al inyectar PNAG o dPNAG en forma conjugada o no conjugada o los oligosacáridos sintéticos en una forma conjugada, sola o en combinación con un adyuvante. Los métodos para preparar dichos anticuerpos policlonales se describen en la solicitud de patente Estadounidense No. US-2005-0118198-A1.
Brevemente, el dPNAG o dPNAG, en la forma conjugada o no conjugada, o oligosacáridos conjugados, se combinan con un adyuvante tal como el adyuvante incompleto de Freund (por ejemplo, 100 mg de conjugado para conejos o ratones en 1 a 3 volúmenes de Freund) y se inyecta por vía intradérmica en múltiples sitios. Aproximadamente un mes después, los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de antígeno, o conjugado de antígeno, en adyuvante mediante inyección subcutánea en múltiples sitios. Una o dos semanas más tarde los animales se hacen sangrar y se analiza el suero para la presencia de anticuerpo. Los animales se pueden reforzar repetidamente hasta que se estabiliza el título de anticuerpo. Se puede reforzar al animal con PNAG o dPNAG o solo conjugados de oligosacáridos sintéticos, conjugados de PNAG o dPNAG o conjugados de oligosacáridos sintéticos, o PNAG o dPNAG conjugado con un compuesto portador diferente, o conjugados de oligosacáridos sintéticos, con o sin un adyuvante. En algunas realizaciones, los refuerzos pueden comprender PNAG en lugar de dPNAG, o pueden contener una mezcla de dPNAG y PNAG.
Además de suministrar una fuente de anticuerpos policlonales, se pueden utilizar animales inmunizados para generar anticuerpos monoclonales específicos a PNAG y específicos a dPNAG. Como se utiliza aquí, el termino “anticuerpo monoclonal” se refiere a una población de inmunoglobulinas homogénea (es decir, solo clonal) que se unen al mismo epítopo de un antígeno. Los anticuerpos monoclonales tienen la misma redisposición de gen Ig y por lo tanto demostrar la especificidad de unión idéntica. En el caso donde se utiliza dPNAG o conjugados de oligosacáridos sintéticos para generar los anticuerpos, el epítopo puede estar presente en PNAG altamente acetilado así como dPNAG y por lo tanto los anticuerpos generados contra dPNAG también se pueden unir a PNAG.
Los métodos para preparar anticuerpos monoclonales se conocen en la téenica. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar por una variedad de métodos. En uno de dichos métodos, las células de bazo aisladas del animal inmunizado se inmortalizan mediante fusión con células de mieloma o mediante transformación de Virus Epstein Barr, y los clones que expresan el anticuerpo deseado se tamizan e identifican. Otros métodos implican el aislamiento de secuencias de genes Ig redispuestos y la clonación en estirpes celulares inmortalizadas. Dichos métodos se describen en mayor detalle en las solicitudes de patente Estadounidenses publicadas Nos. US-2005-0118198-A1 y US-2011-0150880-A1 , y dichas enseñanzas se incorporan mediante referencia en el presente documento.
Los anticuerpos específicos para PNAG pueden ser, sin limitación, anticuerpos de murino, humano o quiméricos tales como, pero no limitados a los anticuerpos humanizados.
Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden elaborar por cualquiera de los métodos conocidos en la téenica, que incluyen los descritos en la Patente Estadounidense No. 5567610, Patente Estadounidense No. 5565354, Patente Estadounidense No. 5571893, Kozber, J. Immunol. 133: 3001 (1984), Brodeur, et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications , p. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, new York, 1987), y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86-95 (1991). Se pueden obtener anticuerpos humanos al recuperar los linfocitos que producen anticuerpos de la sangre u otros tejidos de humanos que producen anticuerpos para un antígeno de interés (por ejemplo, dPNAG o PNAG). Se pueden tratar estos linfocitos para producir células que crecen por si mismas en el laboratorio bajo condiciones de cultivo apropiadas. Los cultivos celulares se pueden detectar para la producción de anticuerpos contra el antígeno de interés y luego se clonan. Se pueden utilizar cultivos clónales para producir anticuerpos monoclonales humanos para dPNAG o PNAG, o los elementos genéticos que codifican las porciones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo se pueden clonar e insertar en vectores de ácidos nucleicos para producción de anticuerpos de diferentes tipos. Adicionalmente a los métodos convencionales para preparar anticuerpos monoclonales humanos, dichos anticuerpos también se pueden preparar mediante la inmunización de animales transgénicos que son capaces de producir anticuerpos humanos (por ejemplo, Jakobovits et al., PNAS USA, 90: 2551 (1993), Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993), Bruggermann et al, Year in Immunol, 7:33 (1993) y la Patente Estadounidense No. 5569825, otorgada a Lonberg).
Como se utiliza aquí, un “anticuerpo monoclonal humanizado” es un anticuerpo monoclonal o fragmento funcionalmente activo del mismo que tiene por lo menos regiones constantes humanas y una región de unión al antígeno, tal como una, dos o tres CDRs, a partir de una especie no humana. Los anticuerpos humanizados tienen particular utilidad clínica, ya que reconocen específicamente antígenos de interes, pero no evocan una respuesta inmunitaria en humanos contra el anticuerpo en sí mismo. Como un ejemplo, las CDR de murino se pueden injertar en la región marco de un anticuerpo humano para preparar el anticuerpo humanizado. Véase, por ejemplo, L. Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988); MS Neuberger et al., Nature 314, 268 (1985) y EPA 0 239 400. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales humanizados se pueden construir al reemplazar las regiones no CDR de un anticuerpo no humano con regiones similares de anticuerpos humanos mientras que retiene la especificidad epitópica del anticuerpo original. Por ejemplo, las CDR no humanas y, opcionalmente, algunas de las regiones de estructura se pueden unir de forma covalente a regiones FR y/o Fc/pFC’ humanas para producir un anticuerpo funcional. Existen entidades comerciales en los Estados Unidos que sintetizarán anticuerpos humanizados a partir de regiones de anticuerpos de murino específicas, tales como Proteína Design Labs (Mountain View California), Abgenix y Medarex. También se puede hacer referencia a la Solicitud de Patente EP No.0239400.
Los fragmentos de anticuerpo de unión a antígeno también se abarcan por la invención. Como se conoce en la téenica, sólo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el parátopo, está implicado en la unión del anticuerpo a su epítopo (véase, en general, Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology Wilcy & Sons, Inc., New York; Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford). Las regiones pFc’ y Fe del anticuerpo, por ejemplo, son efectoras de la cascada de complemento pero no están implicadas en la unión a antígeno. Un anticuerpo del cual se ha dividido enzimáticamente la región pFc’, o del cual se ha producido sin la región pFc’, designada un fragmento F(ab’)2, retiene ambos sitios de unión a antígeno de un anticuerpo intacto. Un fragmento F(ab’)2 aislado se denomina como un fragmento monoclonal bivalente debido a sus dos sitios de unión a antígeno. De forma similar, un anticuerpo dei cual se ha dividido enzimáticamente la región Fe, o de I cual se ha producido sin la región Fe, designado un fragmento Fab, conserva uno de los sitios de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo intacta. Procediendo adicionalmente, los fragmentos Fab consisten en una cadena ligera de anticuerpo unida de forma covalente y una porción de la cadena pesada del anticuerpo denotada Fd (región variable de cadena pesada). Los fragmentos Fd son el principal determinante de la especificidad del anticuerpo (un único fragmento Fd se puede asociar con hasta diez cadenas ligeras diferentes sin alterar la especificidad del anticuerpo) y los fragmentos Fd conservan la capacidad de unión al epítopo en aislamiento.
Los términos Fab, Fe, pFc’, F(ab’) 2 y Fv se emplean con cualquiera de los significados inmunológicos estándar [Klein, Immunology (John Wilcy, New York, NY, 1982); Clark, W.R. (1986) The Experimental Foundations of Modern Immunology (Wiley & Sons, Inc., New York); Roitt, I. (1991) Essential Immunology, 7th Ed., (Blackwell Scientific Publications, Oxford)]. Los fragmentos de anticuerpos funcionalmente activos bien conocidos incluyen, pero no se limitan a fragmentos F(ab’)2, Fab, Fv y Fd de anticuerpos. Estos fragmentos que carecen del fragmento Fe del anticuerpo intacto, se depuran más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión de tejido no específica que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucí. Med. 24: 316-325 (1983)). Por ejemplo, los anticuerpos de cadena sencilla se pueden construir de acuerdo con los métodos descritos en la Patente Estadounidense No.4,946,778 otorgada a Ladner et al. Dichos anticuerpos de cadena sencilla incluyen las regiones variables de las cadenas ligera y pesada unidas por un grupo funcional ligador flexible. Los métodos para obtener un anticuerpo de dominio único (“Fd”) que comprende un dominio único de la cadena pesada variable aislado, también se ha reportado (véase, por ejemplo, Ward et al ., N ature 341: 644-646 (1989), que describe un método de detección para identificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo (anticuerpo de dominio único VH) con suficiente afinidad para que su epítopo objetivo se una a la misma en forma aislada). Los métodos para elaborar fragmentos Fv recombinantes con base en anticuerpos conocidos de secuencias de región variable de cadena pesada y cadena ligera se conocen en la teenica y se han descrito, por ejemplo, Moore et al., Patente Estadounidense No. 4,462,334. Otras referencias que describen el uso y generación de fragmentos de anticuerpos incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab (Tijssen, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays (Elsevieer, Amsterdam, 1985)), fragmentos Fv (Hochman et al., Biochemistry 12: 1130 (1973); Sharon et al, Biochemistry 15: 1591 (1976); Ehrilch et al, Patente Estadounidense No. 4,355,023) y porciones de moléculas de anticuerpo (Audilore-Hargreaves, patente Estadounidense 4,470,925). Por lo tanto, los expertos en la técnica pueden construir fragmentos de anticuerpo a partir de diversas porciones de anticuerpos intactos sin destruir la especificidad de los anticuerpos para el epítopo dPNAG. Se debe entender que el epítopo reconocido por los anticuerpos anti-dPNAG también puede estar presente en el PNAG altamente acetilado.
Usos Los polisacáridos, oligosacáridos sintéticos y anticuerpos de la invención son útiles en una variedad de diferentes aplicaciones, que incluyen aplicaciones in vitro , in situ e in vivo. Los polisacáridos y oligosacáridos sintéticos se pueden utilizar para inmunizar sujetos in vivo para prevenir o tratar la infección por patógenos positivos a PNAG sin ica/pga. También se pueden utilizar polisacáridos y oligosacáridos sintéticos para desarrollar anticuerpos específicos a PNAG o dPNAG que, a su vez, se pueden utilizar para inmunizar sujetos in vivo para prevenir o tratar infección por patógenos positivos a PNAG sin ica/pga.
Se pueden utilizar PNAG y/o dPNAG derivados de patógenos positivos a PNAG sin icalpga para la detección de socios de unión tales como anticuerpos. Tambien se pueden utilizar anticuerpos para detectar patógenos que expresan PNAG, que incluyen detectar la infección (es decir, diagnóstico) en un sujeto. La invención también proporciona métodos para generar anticuerpos que se unen a PNAG y dPNAG.
Se pueden utilizar PNAG y/o dPNAG derivados de patógenos no ica/pga PNAG-positivas para inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una infección por cualquier patógeno que expresa PNAG, que incluyen aquellos que llevan un locus ica y aquellos que no. Se debe entender que “el PNAG y/o dPNAG derivados de patógenos positivos a PNAG sin icalpga” significa los polisacáridos producidos a partir de patógenos positivos a PNAG sin ica/pga utilizando los métodos descritos aquí. La inducción de respuesta inmunitaria puede prevenir o puede tratar parcial o totalmente la infección. El tratamiento parcial de la infección puede incluir la reducción en la gravedad o frecuencia de los síntomas y/o reducción parcial en la carga de patógenos en el sujeto. El tratamiento parcial puede ser útil cuando a un sujeto se le administra o administrará uno o más de otros agentes terapéuticos. La inducción de respuesta inmunitaria se logra mediante al administrar al sujeto una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunitaria tal como una respuesta de anticuerpos contra PNAG o dPNAG (o patógenos que expresan PNAG) de cualquiera de PNAG o dPNAG o composiciones de los mismos.
Como se utiliza aquí, un sujeto es un mamífero de sangre caliente e incluye, por ejemplo, humanos, primates, caballos, vacas, cerdos, cabras, ovejas, perros y gatos. En algunas realizaciones, el sujeto es un sujeto no roedor. Un sujeto no roedor es cualquier sujeto como se definió anteriormente, pero que excluye específicamente roedores tales como ratones, ratas y conejos. En algunas realizaciones, el sujeto preferido es un humano.
El sujeto puede ser uno que tenga o uno en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno que expresa PNAG ya sea si dicho patógeno lleva un locus ¡ca o no. Un sujeto en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno que^xpresa PNAG puede estar en riesgo de estar expuesto a dicho patógeno. Como se describe aquí, un número de patógenos positivos a PNAG sin ica/pga son resistentes a una o más clases de antibióticos. Por lo tanto, es probable que la exposición a dichos patógenos pueda ocurrir ya que no se han erradicado antes en un sujeto a traves del uso de antibióticos. Las poblaciones en riesgo de desarrollar una infección incluyen, por ejemplo, sujetos neonatales, sujetos inmunodeprimidos (tales como aquellos que reciben quimioterapia), sujetos que utilizan inmunosupresores (que incluyen los receptores de trasplantes), sujetos sometidos a diálisis, sujetos sometidos a cirugía de alto riesgo, y sujetos con dispositivos médicos permanentes tales como conductos intravenosos (por ejemplo, conductos centrales) o prótesis (por ejemplo, prótesis de reemplazo de cadera o de rodilla).
El PNAG o dPNAG y oligosacáridos sintéticos conjugados con portadores de proteína se pueden administrar al sujeto en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunitaria. Dicha cantidad efectiva puede ser una cantidad suficiente para ayudar al sujeto en la producción de su propia protección inmunitaria por ejemplo al inducir la producción de anticuerpos específicos a PNAG y/o dPNAG, inducir la producción de células de memoria, y posiblemente una reacción de linfocitos citotóxicos, etc. La respuesta inmunitaria puede a su vez prevenir que ocurra infección por un patógeno que expresa PNAG en un sujeto que está expuesto a dicho patógeno. Una persona medianamente versada en la téenica puede evaluar si una cantidad de PNAG o dPNAG o vacunas conjugadas de oligosacáridos sintéticos son suficientes para inducir inmunidad activa mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la capacidad de las vacunas de PNAG o dPNAG o de conjugados de oligosacáridos sintéticos para producir anticuerpo específico a PNAG en un mamífero se puede evaluar al detectar los anticuerpos producidos en un ratón u otro sujeto utilizando el antígeno PNAG. Las cantidades de PNAG o dPNAG para inducir respuestas inmunes pueden variar de aproximadamente 1 a 100 mg, aunque no son tan limitadas.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para PNAG y/o dPNAG es útil para inducir inmunización pasiva en un sujeto, por ejemplo, al prevenir el desarrollo de la infección sistémica en aquellos sujetos en riesgo de exposición a los patógenos que expresan PNAG, incluyendo patógenos positivos a PNAG sin ica/pga. El metodo para inducir inmunidad pasiva a la infección implica administrar a un sujeto una cantidad efectiva de un anticuerpo específico para PNAG y/o dPNAG o los oligosacáridos sintéticos para inducir una respuesta inmunitaria a patógenos que expresan PNAG, que incluyen patógenos positivos a PNAG sin ica/pga.
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se puede administrar a cualquier sujeto en riesgo de desarrollar una infección por patógenos positivos a PNAG sin ica/pga, y en algunas realizaciones puede ser particularmente adecuado para sujetos incapaces de inducir inmunidad activa a PNAG y/o dPNAG. Las vacunas de PNAG o dPNAG o de conjugados de oligosacáridos sintéticos pueden no ser completamente efectivas en prevenir o eliminar una infección en determinados sujetos, y por lo tanto dichos sujetos se pueden beneficiar del tratamiento con anticuerpo específico para PNAG y/o dPNAG. Un sujeto que es incapaz de inducir una respuesta inmunitaria incluye un sujeto inmunodeprimido (por ejemplo, un sujeto sometido a quimioterapia, un sujeto que tiene SIDA, etc.) o un sujeto que todavía no ha desarrollado un sistema inmunitario (por ejemplo, neonato prematuro).
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra al sujeto en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunitaria a PNAG o patógenos que expresan PNAG tales como patógenos positivos a PNAG sin ica/pga. Como se utiliza aquí, una cantidad o anticuerpo o fragmento de anticuerpo efectivo para inducir una respuesta inmunitaria es una cantidad de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es suficiente para (i) prevenir que ocurra infección en un sujeto que está expuesto al patógeno; (ii) inhibir el desarrollo de infección, es decir, detener o ralentizar su desarrollo; y/o (iii) aliviar la infección, es decir, erradicación del microbio en sujetos infectados. Los microbios incluyen bacterias, virus, hongos, parásitos y similares.
Utilizando procedimientos conocidos por aquellos medianamente versados en la téenica, se puede determinar si una cantidad de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es una cantidad efectiva en un ensayo de opsonización in vitro que es predictivo del grado de opsonización de un anticuerpo. Un anticuerpo que opsoniza un microbio tal como una bacteria es uno que cuando se agrega a una muestra de microbios provoca la fagocitosis de los microbios. Un análisis de opsonización puede ser un ensayo colorimétrico, un ensayo quimioluminiscente, un ensayo fluorescente o ensayo de absorción de radiomarcador, un ensayo citotóxico mediado por células u otro ensayo que mida el potencial opsónico de un material.
Composiciones v formulaciones farmacéuticas En general, cuando se administra in vivo, los polisacáridos, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención se aplican en composiciones farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender portadores farmacéuticamente aceptables, sales, agentes reguladores, conservantes, adyuvantes, y opcionalmente otros ingredientes profilácticos o terapéuticos. Un portador farmacéuticamente aceptable significa una o más rellenos sólidos o líquidos compatibles, diluyentes o sustancias encapsulantes que son adecuadas para administración a un humano u otro animal. En el contexto de un portador farmaceuticamente aceptable, el término “portador” denota un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que el polisacárido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo se combina para facilitar el uso que incluye la administración. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también deben ser capaces de ser mezclados con el polisacárido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, y entre sí, de una manera tal que no se presente interacción que perjudique sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.
Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-tolueno-sulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico, y bencenosulfónico. También, las sales farmacéuticamente aceptables se pueden preparar como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo ácido carboxílico.
Los agentes reguladores adecuados incluyen ácido acético y una sal (1-2% W/V); ácido cítrico y una sal (1-3% W/V); ácido bórico y una sal (0.5-2.5% W/V); y ácido fosfórico y una sal (0.8-2% W/V). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0.003 a 0.03%) W/V); clorobutanol (0.3-0.9% W/V); parabenos (0.01-0.25% W/V) y timerosal (0.004 a 0.02% W/V).
Las composiciones adecuadas para administración parenteral comprenden típicamente una preparación acuosa esteril del polisacárido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que puede ser isotónica con la sangre del sujeto receptor. Entre los portadores y disolventes aceptables que se pueden emplear están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Adicionalmente, los aceites fijos estériles se emplean convencionalmente como un medio disolvente o de suspensión. Para este propósito cualquier aceite fijo suave se puede emplear incluyendo mono o d¡-glicéridos sintéticos. Adicionalmente, los ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables. Las formulaciones de portador adecuadas para la administración subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, etc. se pueden encontrar en Pharmaceutical Sciences de Remington, Mack Publishing Company, Easton, PA.
Los polisacáridos, oligosacáridos, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos se administran en cantidades eficaces. Las dosis de polisacáridos u oligosacárido que varían desde 1 hasta 100 mg pueden ser eficaces, dependiendo del modo de administración. Las dosis de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que varían desde 0.1 hasta 100 mg/kg y 0.1 hasta 20 mg/kg, dependiendo del modo de administración, pueden ser eficaces. La cantidad absoluta dependerá de una variedad de factores que incluyen si la administración se realiza en un sujeto de alto riesgo todavía no Infectado con los microbios o en un sujeto que ya tiene una infección, el tratamiento concurrente, el número de dosis y los parámetros individuales del paciente que incluyen edad, condición física, tamaño y peso. Estos son factores bien conocidos por aquellos medianamente versados en la teenica y se pueden abordar con no más que experimentación de rutina. Se prefiere generalmente que se utilice una dosis máxima, es decir, la más alta dosis segura de acuerdo con el juicio médico.
Se contemplan dosis múltiples de polisacáridos, anticuerpos y/o fragmentos de anticuerpo. Generalmente los esquemas de inmunización implican la administración de una alta dosis de un antígeno seguido de dosis de antígeno más bajas posteriores después de un período de espera de varias semanas. Adicionalmente también se pueden administrar otras dosis. El cronograma de dosificación para inmunización pasiva sería muy diferente con una administración más frecuente si es necesaria. Se puede utilizar cualquier régimen que resulte en una respuesta inmunitaria potenciada a la infección microbiana y/o la posterior protección de la infección. Se pueden determinar intervalos de tiempo deseados para el suministro de dosis múltiples de un antígeno particular por una persona medianamente versada en la técnica que emplea no más que experimentación de rutina. Se pueden administrar dosis de vacunas durante un período de 1 a 6 meses, opcionalmente con dosis igualmente separadas en el tiempo. Para los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, los intervalos de dosificación generalmente varían desde 14 hasta 180 días.
Están disponibles una variedad de rutas de administración. El modo particular seleccionado dependerá, por ejemplo, de la condición particular que se va a tratar y la dosificación requerida para la eficacia terapeutica. Los métodos de esta invención, generalmente hablando, se pueden practicar utilizando cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable, lo que significa cualquier modo que produzca niveles eficaces de una respuesta inmunitaria sin provocar efectos adversos clínicamente inaceptables. Los modos preferidos de administración son rutas parenterales. El término “parenteral” incluye inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, e intraesternal, o téenicas de infusión. Otras rutas incluyen, pero no se limitan a oral, nasal, dérmica, sublingual, y local.
Otros sistemas de administración pueden incluir sistemas de liberación en el tiempo, liberación retardada o liberación sostenida. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de los polisacáridos de la invención, aumentando la comodidad para el sujeto y el médico. Muchos tipos de sistemas de liberación están disponibles y son conocidos por aquellos medianamente versados en la técnica. Incluyen sistemas con base en polímeros tales como ácido poliláctico y poliglicólico, polianhídridos y policaprolactona; sistemas no poliméricos que son lípidos que incluyen esteróles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-, di y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas con base en péptidos; recubrimientos de cera, comprimidos que utilizan aglutinantes y excipientes convencionales, implantes parcialmente fusionados y similares. Ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas de erosión en los que el polisacárido está contenido en una forma dentro de una matriz, encontrados en las Patentes Estadounidenses Nos. 4,452,775 (Kent); 4,667,014 (Nestor et al.); y 4,748,034 y 5,239,660 (Leonard) y (b) sistemas de difusión en los que un componente activo se permea a un índice controlado a través de un polímero, encontrados en las Patentes Estadounidenses Nos. 3,832,253 (Higuchi et al.) y 3,854,480 (Zaffaroni). Adicionalmente, se puede utilizar un sistema de suministro de hardware con base en una bomba, algunos de los cuales se adaptan para implante.
Agentes secundarios Se pueden suministrar anticuerpos específicos a dPNAG y/o PNAG en combinación con otros agentes. La naturaleza de los otros agentes puede depender de si se está administrando el anticuerpo específico a dPNAG o PNAG.
Por ejemplo, cuando se administra para inducir inmunidad activa y/o para producir anticuerpos, se puede utilizar dPNAG en conjunto con un adyuvante. Como se utiliza aquí, el término adyuvante se refiere a una sustancia que se administra en conjunto con (que incluye al mismo tiempo, en la misma formulación, etc.) un antígeno (tal como dPNAG) con el fin de potenciar una respuesta inmunitaria específica a antígeno. Los adyuvantes incluyen, pero no se limitan a compuestos de aluminio, por ejemplo, geles, hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, y adyuvante completo o incompleto de Freund (por ejemplo, en el que el antígeno dPNAG se incorpora en la fase acuosa de agua estabilizada en emulsión de aceite de parafina). El aceite de parafina se puede reemplazar por diferentes tipos de aceites, por ejemplo, aceite de escualeno o maní. Otros materiales con propiedades adyuvantes incluyen BCG ( Mycobacterium tuberculosis atenuado), fosfato de calcio, levamisol, isoprinosina, polianiones (por ejemplo, poli A: U), lentinan, toxina pertussis, lípido A, saponinas, QS-21 y péptidos, por ejemplo, dipéptido de muramilo. También se pueden utilizar sales de tierras raras, por ejemplo, lantano y cerio, como adyuvantes. La cantidad de adyuvantes depende del sujeto y el antígeno dPNAG particular utilizado (por ejemplo, el nivel de sustitución de acetato) y se puede determinar fácilmente por un experto en la téenica sin experimentación indebida.
El agente puede ser un anti-microbiano, tal como antibacteriano, anti-viral, anti-parásito, anti-fúngico, y similares.
El agente puede ser un fármaco anti-bacteriano (por ejemplo, un antibiótico), otro antígeno bacteriano, u otro anticuerpo anti-bacteriano, o mezclas o combinaciones de los mismos. El uso de antibióticos en el tratamiento de infección bacteriana es rutinario. El uso de antígenos para inducir inmunización activa y de anticuerpos para inducir inmunización pasiva también es rutinario. En esta realización, un vehículo de administración común (por ejemplo, comprimido, implante, solución inyectable, etc.) puede contener el agente activo de la invención y un antibiótico y/u otro antígeno y/u otro anticuerpo. Alternativamente, el antibiótico y/u otro antígeno y/u otro anticuerpo se pueden administrar por separado. El antibiótico se puede conjugar a dPNAG o a un anticuerpo anti-dPNAG.
Los fármacos antibióticos antibacterianos son bien conocidos e incluyen, sin limitación, penicilina G, penicilina V, ampicilina, amoxicilina, bacampicilina, cielacilina, epicilina, hetacilina, pivampicilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, carbenicilina, ticarcilina, avlocilina, mezlocilina, piperacilina, amdinocilina, cefalexina, cefradina, cefadoxil, cefaclor, cefazolina, cefuroxima axetilo, cefamandol, cefonicida, cefoxitina, cefotaxima, ceftizoxima, cefmenoxina, ceftriaxona, moxalactama, cefotetan, cefoperazona, ceftazidme, ¡mipenem, clavulonato, timentina, sulbactam, neomicina, eritromicina, metronidazol, cloranfenicol, clindamicina, lincomicina, vancomicina, trimetoprim-sulfametoxazol, aminoglucósidos, quinolonas, tetraciclinas y rifampicina. (Vease Goodman and Gilman's, Pharmacological Basics of Therapeutics, 8th Ed., 1993, McGraw Hill Inc.).
Los antígenos de polisacáridos (excepto PNAG y dPNAG) y anticuerpos específicos a polisacáridos (distintos de anticuerpos específicos a PNAG) se conocen en la téenica. Ejemplos incluyen antígeno Vi de cápsula de Salmonella typhi (Szu, S.C., X. Li, A.L. Stone and J.B. Robbins, Relation between structure and immunologic properties of the Vi capsular polysaccharide, Infection and Immunity. 59:4555-4561 (1991)); cápsula K5 de E. Coli (Vann, W., M.A. Schmidt, B. Jann and K. Jann, The structure of the capsular polysaccharide (K5 antigen) of urinary tract infective Escherichia coli, 010:K5:H4. A polymer similar to desulfo-heparin, European 10urnal of Biochemistry. 116: 359-364, (1981)); cápsula tipo 5 de Staphylococcus aureus (Fournier, J.-M., K. Hannon, M. Moreau, W.W. Karakawa and W.F. Vann, Isolation of type 5 capsular polysaccharide from Staphylococcus aureus, Ann. Inst. Pasteur IMicrobiol. (Paris). 138: 561-567, (1987)); expopolisacárido II de Rhizobium melilori (Glazebrook, J. and G.C. Walker, a novel expolysaccharide can function in place of the calcofluor-binding exopolysaccharide in nodulation of alfalfa by Rhizobium mellloti, Cell. 65:661-672 (1989)); Streptococcus tipo III del grupo B (Wessels, M.R., V. Pozsgay, D.L. Kasper and H. J. Jennings, Structure and immunochemistry of an oligosaccharide repeating unit of the capsular polysaccharide of type III Group B Streptococcus, Journal of Biological Chemistry. 262:8262-8267 (1987)); cadena lateral específica a O Fisher 7 de Pseudomonas aeruginosa (Knirel, Y.A., N.A. Paramonov, E.V. Vinogradov, A.S. Shashkow, B.A. N.K. Kochetkov, E.S. Stanislavsky and E.V. Kholodkova, Somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa The structure of O-specific polysaccharide chains of lipopolysaccharides of P. aeruginosa 03 (Lanyi), 025 (Wokatsch) and Fisher immunotypes 3 and 7, European Journal of Biochemistry. 167:549, (1987)); cadena lateral específica a O de Shigella sonnei (Kenne, L, B. Lindberg and K. Petersson, Structural studies of the O-specific side-chains of the Shigella sonnei phase I lipopolysaccharide, Carbohydrate Research. 78: 119-126, (1980)); cápsula tipo I de S. pneumoniae (Lindberg, B., Undqvist, B., Lonngren, J., Powell, D.A., Structural studies of the capsular polysaccharide from S. pneumoniae type 1, k78: 1 li li? (1980)); y antígeno del grupo S. pneumoniae (Jennings, H.J., C. Lugowski and N. M. Young, Structure of the complex polysaccharide C-substance from S. pneumoniae type 1, Biochemistry. 19:4712-4719 (1980)). Otros antigenos no polipeptídicos y anticuerpos específicos que no son polisacáridos son conocidos por aquellos expertos en la teenica y se pueden utilizar en conjunto con las composiciones de la invención.
Detección v ensayos de diagnóstico El dPNAG y antígenos de oligosacáridos sintéticos y anticuerpos de los mismos también son útiles en ensayos de diagnóstico para determinar un estado inmunológico de un sujeto o muestra o se pueden utilizar como reactivos en inmunoensayos. Por ejemplo, se pueden utilizar los anticuerpos para detectar la presencia en una muestra de un microbio tal como una bacteria que tiene PNAG en la superficie. Si el microbio está presente en la muestra, luego se pueden utilizar los anticuerpos para tratar el sujeto infectado. Los anticuerpos también se pueden utilizar para detectar microbios para la presencia de antígeno PNAG y aislar el antígeno dPNAG o PNAG y los microbios que contienen el antígeno dPNAG o PNAG a partir de mezclas complejas.
Los ensayos descritos anteriormente y cualquier otro ensayo conocido en la teenica se pueden lograr al etiquetar el dPNAG o los anticuerpos y/o inmovilizar del dPNAG o los anticuerpos sobre una matriz insoluble. Los métodos analíticos y de diagnóstico para el uso de dPNAG y/o sus anticuerpos utilizan por lo menos uno de los siguientes reactivos: análogo de analito marcado, análogo del analito inmovilizado, socio de unión marcado, socio de unión inmovilizado, y conjugados estéricos. El marcador utilizado puede ser cualquier funcionalidad detectable que no interfiera con la unión del analito y su socio de unión. Se conocen numerosas etiquetas para dicho uso en inmunoensayos. Por ejemplo, los compuestos que se pueden detectar directamente, tales como fluorocromo, marcadores quimioluminiscentes, y radiactivas, así como compuestos que se pueden detectar a través de reacción o derivación, tales como enzimas. Ejemplos de estos tipos de etiquetas incluyen radioisótopos 32P, 14C, 125l 3H 1311, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luciferasas tales como luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (patente estadounidense No. 4,737,456), luciferina, 2,3 -dihidroftalavinedionas, peroxidasa de rábano (HRP), fosfatasa alcalina, b-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacáridos tales como glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. Oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas a una enzima que utiliza peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina avidina, marcadores de espín, marcadores de bacteriófagos, y radicales libres estables.
Los marcadores se pueden conjugar con dPNAG o anti-dPNAG anticuerpo mediante metodos conocidos por aquellos expertos en la téenica. Por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 3,940,475 y 3,645,090 demuestran la conjugación de fluoróforos y enzimas a anticuerpos. Otros ensayos que según se informa se utilizan comúnmente con antígenos y anticuerpos y que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen ensayos de competición y de intercalado.
Se incluyen Los siguientes ejemplos para propósitos de ilustración y no pretenden limitar el alcance de la invención.
EJEMPLOS EJEMPL0 1 Expresión de el polisacárido poli-N-acetil qlucosamina (PNAG) de superficie bacteriana por una variedad de especies de microbios.
Unión directa de anticuerpos: Se hacen crecer organismos en diversos medios para promover producción de PNAG a temperaturas que varían desde 20° C hasta 37° C durante 24 a 72 horas en ya sea condiciones de oxígeno atmosférico (21% de 02), 5% de CO2 o bajo condiciones anaeróbicas. Las células de las placas se suspenden directamente en PBS (solución salina regulada con fosfato), mientras que aquellas en el caldo se lavan y resuspenden en PBS.
Se colocan las muestras sobre portaobjetos seguido por fijación con metanol durante 1 min. Las muestras se incuban adicionalmente con ya sea MAb F429 (control negativo, lgG1 humano específico a Antígeno de alginato de Pseudomonas aeruginosa) directamente conjugado con Alexafluor 488 (AF488) (dilución 1:313 de 1.63 mg/ml de solución madre, concentración final 5.2 ug/ml) o MAb F598 (lgG1 humano específico a PNAG) directamente conjugado con AF488 (dilución 1:833 de 4.35 mg/ml de solución madre, concentración final 5.2 ug/ml) en PBS que contiene 0.5% de BSA durante la noche a 4o C y 4 uM de Syto 83. Las muestras se lavan con PBS y se montan con cubreobjetos de 1.5 para análisis confocal.
Especificidad de unión de MAb F598 a PNAG: Se hacen crecer organismos en diversos medios para promover producción de PNAG a temperaturas que varían desde 20° C hasta 37° C durante 24 a 72 h en ya sea condiciones de oxígeno atmosférico (21% de 02), 5% de CO2 o bajo condiciones anaeróbicas. Las células bacterianas de las placas se suspenden directamente en TBS (solución salina regulada con tris, pH 6.5), mientras que aquellas en el caldo se lavan y resuspenden en TBS.
Generalmente, las muestras se tratan con quitinasa, Dispersina B o peryodato y luego se exponen a MAb F598. Las muestras en TBS pH 6.5 se incuban con (a) 50 mg/ml de quitinasa (control negativo), (b) Dispersina B (digiere PNAG) durante 24 horas a 37° C, o (c) con peryodato 0.4 M durante 2 horas a 37° C. El PNAG se divide mediante peryodato, se digiere por Dispersina B, y no es afectado por la quitinasa. Luego se hacen reaccionar células con anticuerpo monoclonal IgG humano (MAb) a PNAG o MAb lgG1 para alginato de Seudomonas aeruginosa - antígeno irrelevante (MAb F429 (control negativo, lgG1 humano específico a Antígeno de alginato de Pseudomonas aeruginosa). El Anticuerpo para el antígeno ¡rrelevante no se debe unir a PNAG.
Específicamente, las muestras se lavan y alícuotas de 10 mI se secan al aire sobre portaobjetos de vidrio, seguido por fijación con metanol durante 1 min. El MAb F429 (control negativo) se conjuga directamente con AF488 (dilución 1:313 de 1.63 mg/ml de solución madre, concentración final 5.2 mg/ml) y MAb F598 (anti-PNAG, lote 2) se conjuga directamente con AF488 (dilución 1:833 de 4.35 mg/ml de solución madre, concentración final 5.2 ug/ml) en PBS que contiene 0.5% de BSA durante la noche a 4o C junto con 4 mM de Syto 83 (manchas de ADN rojas). Las muestras se lavan con PBS y se montan sobre portaobjetos de vidrio con cubreobjetos de 1.5 para análisis confocal.
TABLA 1 = no realizada.
Adicionalmente, el PNAG resistente a quitinasa, sensible a dispersina B se detecta en bacterias de infección en muestras de efusiones del oído medio (MEF) de niños con otitis media por S. pneumoniae y dos muestras MEF de niños con otitis media por H. influenzae no tipificable. Las mismas bacterias de infección también se tiñen con ya sea un anticuerpo específico a S. pneumoniae o a H. influenzae. El PNAG también se detecta en tejido de pulmón de un paciente infectado con M. tuberculosis. En el fluido nasofaríngeo de chinchillas infectadas de forma experimental con el serogrupo 19A de S. pneumoniae, se observa rápidamente la colocalización del antígeno de PNAG resistente a quitinasa, sensible a dispersina B con la cápsula del serogrupo 19A. El tracto gastrointestinal de un ratón infectado de forma experimental con C. rodentium, el PNAG se detecta alrededor de microbios asociados con las células epiteliales. En tejidos oculares de ratones con queratitis por C. albicans, el PNAG se detecta en la poción positiva a ADN de las células fúngicas.
Adicionalmente, las cepas bacterianas que reaccionan con MAb F598 pero no con MAb F429 en análisis microscópico confocal incluyen Vibrio cholerae 2R1 y Vibrio cholerae 0395.
Las cepas bacterianas que reaccionan con anticuerpo policlonal de conejo para PNAG pero no con suero de conejo normal incluyen Bacteroides thetaiotamicron y Bacteroides vulgatis.
EJEMPLO 2 C. rodentium en el tracto G1 Las muestras se hacen reaccionar con ya sea MAb F429 (control negativo, lgG1 humano específico a antígeno de alginato de P. aeruginosá) directamente conjugado con AF488 (dilución 1:313 de 1.63 mg/ml de solución madre, concentración final 5.2 ug/ml) o MAb F598 (lgG1 humano específico a PNAG) directamente conjugado con AF488 (dilución 1:833 de 4.35 mg/ml de solución madre, concentración final 5.2 ug/ml) en PBS que contiene 0.5% de BSA durante la noche a 4o C y 4 mM de Syto 83 (para teñido de núcleos). Las muestras se lavan con PBS y se montan con cubreobjetos de 1.5 para análisis confocal.
Los resultados muestran la presencia de PNAG en colonias de C. rodentium en el tracto Gl de un ratón infectado utilizando el anticuerpo F598. El MAb F429 no tiñe las colonias que confirman la especificidad de teñido por el F598 MAb (datos no mostrados).
EJEMPLO 3 S. pneumoniae en fluido de lavado de oído v nasal.
Este Ejemplo demuestra la co-expresión sobre S. pneumoniae de tipo de cápsula 19A con antígeno PNAG en el fluido de lavado de oído y nasal de una chinchilla con otitis media.
Se incuban las muestras con 50 mg/ml de Dispersina B o quitinasa en TBS durante la noche y luego se marcan con ya sea 1:50 de F598 (1 mg/ml) o F429 (1 mg/ml) y polisacárido capsular 19A anti-S. pneumoniae de conejo (1: 100) en BSA/PBS durante la noche a 4o C seguido por IgG anti-humano de cabra conjugado con AF 488 y anti- conejo de cabra AF 568 a 1:200 durante 1 hora a temperatura ambiente.
Los resultados muestran la presencia de PNAG que rodea las celulas bacterianas de S. pneumoniae en lavados nasofaríngeos de una chinchilla con otitis media. Las muestras tratadas con quitinasa y Dispersina B y luego expuestas a MAb F429 de control son negativas. Las muestras tratadas con Dispersina B y luego expuestas a MAb F598 son negativas, mientras que las muestras tratadas con quitinasa y luego expuestas a MAb F598 son positivas, lo que demuestra la presencia de PNAG en el lavado nasofaríngeo de una chinchilla con otitis media. Los patrones de teñido se superponen con teñido anti-SPn 19A de conejo (datos no mostrados).
De forma similar, el PNAG se detecta en el fluido del oído (lavado) y pasajes nasales de una chinchilla infectada con S. pneumonía 19A y que tiene otitis media, según se determina mediante teñido con MAb F598 específico a PNAG pero no con MAb F429 de control seguido por tratamiento de quitinasa. Los patrones de teñido se superponen con teñido anti-SPn 19A de conejo (datos no mostrados).
EJEMPLO 4 S. pneumonía o H. influenza no tipificable en fluido de oído humano de niños con otitis media.
Se incuban muestras de fluido de oído con 100 mg/ml de DNasel durante la noche a 37° C y luego se tratan con 50 pg/ml de quitinasa o Dispersina B en TBS durante 24 horas a 37° C. Las muestras se lavan y alícuotas de 10 mI se secan al aire sobre portaobjetos de vidrio, se fijan con calor y se marcan con 50 pg/ml de F598 (AP01) o F429 (1 mg/ml) y fosfatidilcolina anti -S. pneumoniae de ratón (1: 100) o anti-H. influenzae de conejillos de indias (celulas completas muertas por calor; 1: 100) en PBS que contiene 0.5% de BSA (PBS/BSA) durante la noche a 4o C. Las muestras se lavan con PBS y se incuban con 1:250 de IgG anti-humano conjugado con AF488 y ya sea con 1 :200 de IgG anti-ratón de cabra o IgG anti-conejillo de indias de cabra conjugado con AF568 en PBS/BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavan y se montan.
Los resultados demuestran la presencia de PNAG en el fluido de oído del sujeto humano que tiene una infección en el oído por S. pneumoniae (otitis media). Las muestras expuestas a quitinasa seguida por MAb F429 o Dispersina B seguida por MAb F598 son negativas, mientras que las muestras expuestas a quitinasa seguida por MAb F598 son positivas. Los patrones de teñido se superponen con aquellos observados con el anticuerpo de ratón para el teñido con fosfatidilcolina de S. pneumoniae (datos no mostrados).
EJEMPLO 5 P. berghei v P. falciparum en sangre.
Microscopía confocal de frotis de sangre fresca, no teñida hecha de ratones infectados con Malaria (BALB/CJ infectados con P. berghei NK-65, Día 18 después de infección). El frotis se divide en partes con un marcador en 3 pozos para tratamientos con quitinasa, Dispersina B, y peryodato. El portaobjetos se fija con calor y se trata con 50 mg/ml de quitinasa o Dispersina B en TBS durante 24 horas a 37° C o con peryodato 0.4 M durante 2 horas a 37° C. El portaobjetos se lava con PBS y se incuba con MAb F598 (1.3 mg/ml de solución madre; se utiliza dilución 1:250, igual a 2.4 mI en 600 mI; concentración final 5.2 mg/ml o 3.12 mg en 600 mI; 200 mI agregada por pozo) directamente conjugado con AF488 (color verde). También se agrega 4 mM de Syto 83 (tinte rojo para ADN) en PBS que contiene 0.5% de BSA (BSA/PBS); ambos se incuban durante 4 horas a temperatura ambiente. El portaobjetos se lava con PBS y se cubre con cubreobjetos de 1.5 mm para ver mediante microscopía confocal.
Los resultados muestran la presencia de PNAG en la sangre de un ratón que muere de malaria cerebral. Las muestras tratadas con Dispersina B o peryodato seguido por teñido con MAb F598 son negativas, mientras que las muestras tratadas con quitinasa seguido por teñido con MAb F598 son positivas (datos no mostrados).
Utilizando un método similar, la expresión de PNAG se analiza en la sangre de un humano infectado con P. falciparum. Las muestras teñidas con MAb F429 de control y las muestras tratadas con Dispersina B o peryodato seguido por teñido con MAb F598 son negativas (datos no mostrados). Las muestras tratadas con quitinasa o muestras que no se tratan, y luego se tiñen con F598 son positivas (datos no mostrados). Los patrones de teñido de F598 se superponen con la identificación de ADN dentro de los glóbulos rojos, lo que indica la presencia del parásito de malaria cuando los glóbulos rojos humanos no contienen un núcleo o ADN (datos no mostrados).
EJEMPLO 6 B. dolosa en el pulmón.
Utilizando un metodo similar a aquel descrito en los Ejemplos anteriores, el tejido pulmonar de un paciente con fibrosis quística que murió de neumonía por B. dolosa y sepsis se secciona y analiza para expresión de PNAG. Se utiliza TO-PRO-3 para teñir los núcleos de células pulmonares. Las células de B. dolosa se visualizan utilizando suero de ratón anti-b. dolosa seguido por IgG de anti-ratón de burro AF568. El PNAG se visualiza utilizando antisuero de conejo a la glicoforma 9GlcNH2-TT PNAG seguido por IgG de anti- conejo de cabra AF488. El control negativo es suero normal de conejo con tinción nuclear con TO-PRO-3. La expresión de PNAG se superpone con teñido de células de B. dolosa (datos no mostrados).
EJEMPLO 7 C. albicans en OÍOS.
Secciones de histología embebidas en parafina de ojos de ratón infectado con C. albicans se desparafinan utilizando EzDewax según instrucciones del fabricante. Se rehidratan los portaobjetos en agua durante 2 horas a temperatura ambiente, seguido por bloqueo en 0.5% de BSA/PBS durante 2 horas a temperatura ambiente. Las muestras se incuban adicionalmente ya sea con MAb F429 (control negativo) directamente conjugado con AF488 (dilución 1:313 de 1.63 mg/ml de solución madre, concentración final 5.2 ug/ml) o MAb F598 para PNAG directamente conjugado con AF488 (dilución 1:833 de 4.35 mg/ml de solución madre, concentración final 5.2 ug/ml) PBS que contiene 0.5% de BSA durante la noche a 4o C y 4 uM de Syto 83. Las muestras se lavan con PBS y se montan con cubreobjetos de 1.5 para análisis confocal.
Los resultados muestran teñido confocal de núcleos con MAb F598 pero sin MAb F429, lo que demuestra la expresión de PNAG por C. albicans in vivo (datos no mostrados).
EJEMPLO 8 Eficacia de MAb F598 a PNAG microbiano en un modelo murino de queratitis por C. albicans.
Se induce queratitis mediante rascado (3X 1 mm) de las córneas de ratones C57B1/6 machos anestesiados seguido por inoculación con ~105-107 CFU/ojo de Candida albicans SC5314 en un volumen de 5 mI. El MAb específico a PNAG (F598) o MAb de lgG1 humano de control (F429) se suministra ya sea por inyección IP y/o aplicación tópica 4 h después de infección y el anticuerpo adicional que se aplica por vía tópica 24 y 32 horas después de infección. Los ratones se controlan a 24 y 32 horas después de infección, y si los controles muestran daño corneal irrecuperable en este momento a los animales se les practica eutanasia y se determina el CFU/ojo. Si los controles a las 36 horas no tienen más de 3+ daños en el ojo dañado, la infección se deja progresar a 48 horas, después de lo cual los ratones se someten a eutanasia y se determina el CFU/ojo y la calificación de patología corneal de 0 a 4 por el observador sin conocimiento del tratamiento ratón. La calificación patología corneal fue la siguiente: Calificación 4: perforación de la córnea Calificación 3: Opacidad densa que cubre el segmento anterior Calificación 2: Opacidad densa que cubre la pupila Calificación 1: Opacidad de Faint que cubre parcialmente la pupila Calificación 0: Identico al ojo contralateral no infectada.
Ratones infectados con C. albicans tratados terapéuticamente mediante inyección IP y/o aplicación tópica de MAb F598 han reducido marcadamente los niveles de bacterias en el ojo y reducido la patología corneal en comparación con los ratones tratados con MAb F429 control. Estos datos se presentan en las Figuras 1 a 4.
El anticuerpo para PNAG demuestra eficacia terapéutica en un modelo de queratitis por C. albicans, lo que indica la expresión in vivo de PNAG y el potencial para prevenir o tratar las infecciones fúngicas de vacunas e inmunoterapia a PNAG.
EJEMPLO 9 Eficacia protectora de anticuerpo policlonal a la vacuna conjugada de 9GlcNH2-TT contra neumonía letal provocada por S. neumonía.
Se cultiva cepa de S. pneumoniae cepa D39 durante la noche en caldo de soya tripticasa (TSB) a 37° C en 5% de CO2. El cultivo se diluye en caldo Todd-Hewitt + 1% de glucosa hasta un OD a 650 nm = 0.1 y se hace crecer a 37° C hasta OD = 0.45 (aproximadamente 2.5 horas). Ratones CBA/N se inyectan por vía retrorbital (RO) bajo anestesia con isoflurano con 37.5 mI de suero normal de cabra o antisuero de cabra inactivado por calor elevado a la vacuna conjugada anti-9GlcNH2-TT diluida a 50 mL en PBS. Se inyectan los ratones. Veinticuatro horas más tarde, la preparación bacteriana se diluye a OD a 650 nm = 0.45 (es decir, para este experimento, se diluyen 83 pl_ en 917 mL en PBS para dar 3 x 107 CFU/mL. Los ratones se anestesian con ketamina/xilazina (250pL por ratón), y 2 x 10 pL de dosis de bacterias se instilan por vía intranasal. Los ratones se monitorean para supervivencia durante 7 días. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Adicionalmente, el mAb F598 4 dado h antes de infección intranasal con el serotipo 9V de cepa la DSM 11865 en ratones FVB se encuentra que es tan potente como el antibiótico de cefotaxima (administrado a 1 y 4 h después de la infección) en reducir las cargas bacterianas en los pulmones del ratón.
EJEMPLO 10 Eficacia protectora del anticuerpo policlonal para la vacuna conjugada 9GlcNH2-TT contra la infección letal de ia piel provocada por S. pyoaenes (Streptococcus del grupo A).
Los ratones son ratones CD1 (ICR) de 6 semanas de edad hembras. El Grupo 1 (8 ratones) corresponde a ratones inyectados con suero de conejo normal (NRS). El Grupo 2 (8 ratones) corresponde a ratones inyectados con 9GlcNH2-TT. Las bacterias son cepa 950771 de Streptococcus del grupo A (GAS) utilizadas en el 107 CFU/ml en la fase log. Los anticuerpos son anti-9GlcNH2-TT de conejo policlonal utilizados a 200 pl/ratón/dosis y NRS utilizado a 200 ml/ratón/dosis.
En el día O, una solución madre de células bacterianas GAS se siembra en una placa de agar sangre (BAP) y se incuba a 37° C durante la noche y la utiliza para inocular un tubo de caldo de Extracto de Levadura Todd-Hewitt con 1% de glucosa (THY + G) para cultivo estático a 37° C. Los ratones se inyectan IP 24 horas antes de la infección. En el día 1, se inmunizan ratones una segunda vez IP 4 horas antes de infección. Para preparar el inoculo para la infección, se utiliza 10 mi de THY + G y una suspensión bacteriana en una ODeoonm = 0.05 hecha y colocada a 37° C hasta que se alcanza un OD6oonm = 0.15. Este se diluye y coloca en placa para determinaciones CFU en BAP como sigue: 10 ml de 105 y 106 diluciones se siembran en BAP (2 placas para cada dilución). Para preparar el inoculo infeccioso, 10 mi del cultivo THY + G se transfiere a un tubo cónico de 15 mi y se centrifuga el tubo a 2000 rpm durante 20 minutos para sedimentar las células bacterianas. El sobrenadante se descarta y el sedimento se suspende en 1 mi de caldo de THY+G que se transfiere a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga a 8000 rpm durante 2 minutos. El sobrenadante se descarta y el sedimento de células bacterianas se suspende en 500 pl de agua inyectable, luego se transfiere a una jeringa de 1 mi de calibre 27, y se mantiene en hielo. Una dilución 1: 4 de 50 mg/ml de Nembutal con agua inyectable [concentración final de 10 mg/ml] se elabora y se inyecta IP (0.3 mi de solución anestésica por ratón). El flanco derecho se afeita y limpia con etanol, luego se inyecta con 0.1 mi de la suspensión bacteriana por vía subcutánea por ratón (es decir, 5x105 CFU/ratón). Para confirmar el inoculo real, la suspensión bacteriana se diluye y se siembra para enumeración. La suspensión bacteriana inyectada tiene una concentración de 1.7x106 CFU/ml, lo que significa que 1.7x105 CFU se ha inyectado en cada ratón. Se observan los ratones y los ratones moribundos se someten a eutanasia. Los resultados se muestran en la Figura 6 EJEMPLO 11 Eficacia protectora del anticuerpo producido en conejos para la vacuna conjugada 9GlcNH2-TT contra meningitis (bacterias en el cerebro) de crías de ratón de 2 a 3 días de edad inoculados con N. meningitidis del grupo B.
Los ratones son ratones CD-1 recién nacidos en el día 2 al día 3 de vida. La N. meningitidis se cultiva en una placa de agar sangre durante la noche y las células bacterianas se raspan en PBS y el OD a 600 nm se ajusta para dar varias dosis de inoculación como se ha señalado. Los ratones se inyectan una vez 24 horas antes de infección, ya sea con NRS (50 mI IP (NRS de Accurate)) o suero de conejo generado a la vacuna conjugada 9GlcNH2-TT (50 mI IP (conejo 4.2, Sangre 4-3/4-4)). Los ratones se inoculan 24 horas más tarde IP con 50 mI de cepa B16B6 del serogrupo B de N. meningitidis en las siguientes diluciones: 5x105, 5x106 o 5x108. Los ratones se someten a eutanasia 24 horas más tarde, y se retiran los cerebros, se homogeneizan y se colocan en placas de agar de chocolate para enumeración de bacterias.
Los resultados se muestran en la Figura 7.
EJEMPLO 12 Eficacia protectora de un MAb F598 lqG1 completamente humano cuando se administra a ratones susceptibles a colitis infecciosa.
Los ratones TRUC carecen de sistemas adquiridos y inmunes innatos (Garrett et al. Cell 2007 131 (1): 33-45; Garrett et al. Cell Host Microbio, 2010 8 (3): 292-300). Estos ratones desarrollan espontáneamente colitis infecciosa por 8 semanas de edad. Se inyectan ip ratones recien nacidos TRUC, a partir de la primera semana de vida, con 50 mg de MAb F598 o PBS, o MAb F598 o un MAb lgG1 de control humano, 3 veces a la semana hasta el sacrificio a las 8 semanas. El tracto intestinal de los ratones se retira y se trata para la evaluación de la colitis como se describe (Garrett et al. Cell 2007 131 (1): 33-45; Garrett et al. Host Cell Microbe, 2010 8 (3): 292-300). Las calificaciones generales de patología de colitis se comparan entre los grupos de ratones que reciben ya sea mAb F598 o el control MAb lgG1. Los resultados se muestran en las Figuras 8 y 9.
En otros experimentos, la administración semanal de mAb F598 a partir de los 7 días de vida reduce significativamente el daño histopatológico total determinado a las 8 semanas de edad (de una manera ciega por un patólogo).
Cuando los recién nacidos WT se someten a adopción cruzada por las hembras TRUC, desarrollan colitis espontánea a las 8 semanas, aunque es menos grave que en la descendencia TRUC. Para evaluar el potencial terapéutico del mAb F598 contra la colitis en una configuración de la función del sistema inmune no perturbada, se inicia el tratamiento de los ratones WT adoptados por hembras TRUC a las 4 semanas de edad con inyecciones quincenales de mAb F598 o controlar mAb F105 de lgG1 humano de control y se determina el nivel de patología del colon a las 8 semanas de edad. El mAb F598 reduce significativamente la calificación total de la patología en los ratones receptores en comparación con los controles, con reducciones significativas en infiltración de monocitos e hiperplasia reactiva, pero no lesión, porque la mayoría de los controles tenían calificaciones de lesiones de cero (datos no mostrados).
EJEMPLO 13 Eficacia protectora de anticuerpo producido en conejos para la vacuna conjugada 9GlcNH2-TT contra cepa 10403S de L. monocvtoaenes.
Ratones CD1 infantes de dos a tres días de edad se inmunizan IP 24 horas antes de la exposición con 50 ml de cualquiera de NRS (n = 15) o suero de conejo inmune producido para vacuna 9GlcNH2-TT conjugada (n = 15). Los ratones se inoculan IP con L monocytogenes (% X 108 CFU en 50 ul). Se controla la supervivencia durante 24 horas. La supervivencia global se analiza por Chi cuadrado con corrección de Yates, P.001. Los resultados se muestran en la Figura 10.
Una vacuna eficaz para la malaria es probable que requiera múltiples antígenos de parásitos, pero como una etapa inicial en la determinación de si el PNAG puede ser un componente de antígeno de vacuna candidato para una vacuna multivalente, ratones C57BL/6 infectados con P. berghei ANKA positivo a PNAG se tratan con 200 mI_ de anticuerpo policlonal a PNAG o suero normal de control se inyecta ¡p cada 3 días comenzando el día antes de la infección y a lo largo de 20 días posteriores a la infección. El anticuerpo para PNAG extiende significativamente la supervivencia de los ratones tratados y evita el desarrollo de la malaria cerebral. Cinco de los ocho ratones tratados con suero normal mueren en el día 9 con bajos niveles de parasitemia, y los tres restantes mueren en el día 30 con altos niveles de parasitemia. Para los ratones tratados con el anticuerpo para PNAG durante 3 semanas, solo uno muere de malaria cerebral en el día 7, cuatro desarrollan niveles aumentados de parasitemia y mueren en el día 33, que es 13 días despues de la última inyección del anticuerpo, uno no tenía parasitemia detectable hasta el día 22 y muere en el día 40 (20 d después de la última inyección de anticuerpo), y dos ratones tenían poca o ninguna parasitemia detectable y sobreviven el periodo experimental de 45 d. El tratamiento con anticuerpo se detiene en el día 20 según la estipulación inicial del protocolo. Es probable que se pueda observar supervivencia prolongada con el aumento de la duración del tratamiento de anticuerpos.
EJEMPLO 14 El anticuerpo para PNAG media va sea la muerte opsónica o bactericida de diversos patógenos que expresan PNAG.
El protocolo de muerte opsónica de S. pneumoniae y E. faecalis es similar a aquella publicada para S aureus por Skurnik et al. (J Clin Invest. 2010, 120 (9): 3220-33), excepto que se utilizan células HL60 como la fuente de las células fagocíticas en lugar de PMN humano fresco. Las células HL60 se diferencian con 0.8% de DMF durante 6 días y se ajustan a 1.3x106/ml. Las bacterias se cultivan durante la noche a 37° C (sin agitación). S. pneumoniae se coloca en 5% de CO2 en THY + 1% de glucosa (THY + G). E. faecalis se cultiva en condiciones atmosféricas. Las cepas bacterianas se cultivan en agar sangre + TSB al final del ensayo. El complemento se adsorbe con el crecimiento de la bacteria MN8 S. aureus objetivo durante la noche en CSB, con agitación. C: suero complemento de Invitrogen Cat # 31203/S Lote # 510908698270 absorbido con células MN8 de S. aureus. El anticuerpo de conejo se produce con uno de los dos antígenos: 1. PNAG desacetilado (dPNAG) conjugado con toxoide tetánico (dPNAG-TT): Maira-Litran et al. Infecí Immun. 2005, 73 (10): 6752-62. Fe de erratas en: Infecí Immun. 2005, 73 (11): 7789; y 2. oligosacáridos 9GlcNH2 sintéticos conjugados con TT: Gening et al. Infecí Immun. 2010, 78 (2): 764-72.
También se ensaya MAb humano para PNAG, MAb F598, (Kelly-Quintos et al. Infecí Immun.2006, 74 (5): 2742-50).
Los resultados se muestran en las Figuras 11 a 13.
El protocolo de muerte opsónica de Streptococus del grupo A es el siguiente: se utilizan cepas 771, 188 de Streptococcus del Grupo A (GAS). Lote v utilizando: F598 AP1-01 en [19 mg/ml], recien descongelado 1 vez. Control para MAb F598: MAb F429 para alginato de P. aeruginosa [1.0 mg/ml]. La cepa de MN8 de S. aureus se cultiva a partir de la solución madre congelada inoculada en 10 mi de THB + G en 50 mi cónico 37° C con agitación con tapa suelta. El GAS 771 y 188 se cultivan en THY + G de placa ON y se inoculan en OD650 = 0.05 a 37° C de cultivo estático. El S. aureus MN8 Dica se cultiva a partir de solución madre congelada inoculada en THB + G en 10 mi de CSB en 50 mi de cónico a 37° C con agitación con tapa suelta. Las cepas de GAS se colocan en placas sobre TSA con sangre objetivo al final del ensayo. El complemento se adsorbe con MN8Aica de S. aureus objetivo o las bacterias GAS 771 se hacen crecer durante la noche en THB+G con agitación o THY+G estático respectivamente. Regulador: HBSS + 0.1% de Gelatina. C: Suero de complemento de Invitrogen Cat # 31203/S lote # 510908698270 absorbido con células de S. aureus MN8 Oica o GAS 771 o 188.
Los resultados se muestran en la Figura 14.
El protocolo de muerte opsónica de C. albicans es como sigue: C. albicans se hace crecer en caldo YPD (Extracto de levad ura/peptona/dextrosa) a OD 1.0, luego se centrifuga, resuspende en MEM+1% de BSA, el OD se ajusta a 0.4 a 650 nm luego la suspensión se diluye 1: 10. El MAb F429 se purifica a partir del sobrenadante de hibridoma por la Proteína A y se dializa en pH 6.5 PBS, se almacena a -20° C. Regulador: MEM + 1% de BSA. C: Suero de complemento de conejo, lote Sigma 106K6029, catálogo no. S7764. Se absorbe el complemento con celulas de C. albicans. Se obtienen células fagocíticas del donante de collar TRIMA.
Los resultados se muestran en la Figura 15.
El protocolo de muerte bactericida de N. meningitidis y N. gonorrhoeae es como sigue: Suero de conejo normal (NRS de -20° de solución madre, Accurate Chemical, lote 2008) y se utilizan anticuerpo de conejo producido para vacuna conjugada 9GlcNH2-TT, almacenado a -20° C, suero de conejos 4.3 y 4.4. El suero se equilibra a 4o C y se mantiene a 4o C hasta el ensayo. Se hacen crecer bacterias N. meningitidis o N. gonorrhoeae durante 24 a 48 horas sobre agar de chocolate en 5% de CO2. Se suspenden las bacterias en PBS que contiene 0.5% de glucosa, 9 mM de CaCI2, y 4.9 mM de MgCI2-6Fl20 y 1% (wt/vol) de albúmina de suero bovino (Lifeblood Medical, Freehold, NJ)= PBS++, pH 7.4. se diluyen las suspensiones bacterianas de la suspensión OD6so nm elaborada a partir de suspensión de agar de chocolate a ~ 1.5-2 X 104 CFU/ml en PBS++. El ensayo implica mezclar juntos 80 ml de las diluciones del suero y 20 pl de células de Neisseria luego incubar las mezclas a 37° C durante 1 hora. Los tubos se colocan a 37° C con agitación leve (orbital cuando sea posible). 10 mI de ambas disoluciones 1:2 y 10 se hacen en Caldo Muller-Hinton luego se colocan sobre agar de chocolate. Los cultivos se incuban a 37° C en 5% de CO2 durante la noche. Se cuentan las colonias al siguiente día. Los resultados se muestran en la Figuras 16 y 17.
La muerte bactericida de cepas de N. meningitidis y N. gonorrhoeae en presencia de suero de conejo para 9GlcNH2-TT con y sin inhibición de antígeno específica se lleva a cabo como sigue: Regulador: PBS Regulador que contiene 0.5% de glucosa, 9 mM de CaCI2, y 4.9 mM de MgCI2-6H2O y 1% (wt/vol) de albúmina de suero bovino (Lifeblood Medical, Freehold, NJ)= PBS++, pH 7.4.
Cepas bacterianas utilizadas y preparación: se resuspenden las bacterias en PBS que contiene 0.5% de glucosa, 9 mM de CaCI2, y 4.9 mM de MgCI2-6H20 y 1% (wt/vol) de albúmina de suero bovino (Lifeblood Medical, Freehold, NJ)= PBS++, pH 7.4. Suspensión bacteriana diluida de la suspensión OD650nm de suspensión de agar de chocolate de OD a ~ 1.5-2 X 104 CFU/ml in PBS++.
Antígenos de inhibición: Disueltos a 200 ug/ml de concentración final en PBS++ Antígeno PNAG utilizado: lote 27. Antígeno de alginato utilizado a partir de la cepa 2192, Pk 3 (serie 1) Antisuero utilizado: Suero de conejo normal (NRS de -20° C de solución madre, Accurate Chemical). Anticuerpo de conejo producido para vacuna conjugada 9GlcNH2-TT, almacenado a -20° C, suero de conejos 4.3 y 4.4 utilizado.
Ensayo: Mezclar junto 40 mI de la fuente de suero (dilución basada en la dilución más alta en el ensayo bactericida directo que se necesita para lograr > 80-90% de muerte, a menos que la muerte máxima a una dilución 1: 2 de suero sea menor, en cuyo caso se utilizará suero a dilución finaM: 2), 40 mI de antígeno y 20 mI de celulas de Neisseria (tubos sin antígeno se agrega 80 mI de antisuero adecuadamente diluido). Colocar los tubos a 37° C con agitación suave (orbital si es posible). Colocar en placa de agar de chocolate y se incuba 37 ° C en 5% de CO2 durante la noche, contar las colonias al día siguiente.
Los resultados se muestran en las Figuras 18 y 19.
Equivalentes La especificación escrita anteriormente se considera que es suficiente para permitir a un experto en la téenica poner en práctica la invención. La presente invención no se limita en su alcance por los ejemplos proporcionados, puesto que los ejemplos pretenden ser una simple ilustración de un aspecto de la invención y otras realizaciones funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Diversas modificaciones de la invención adicionalmente a las mostradas y descritas aquí serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y caerán dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las ventajas y objetos de la invención necesariamente no se abarcan por cada realización de la invención.
Todas las referencias, patentes y publicaciones de patentes que se citan en esta solicitud se incorporan aquí mediante referencia en su totalidad, a menos que se indique lo contrario.
Lo que se reivindica es:

Claims (122)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Un metodo que comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunitaria : contra el patógeno de un polisacárido aislado que tiene la fórmula en donde n es por lo menos 5, R se selecciona del grupo que consiste de -NH-CO-CH3 y -NH2I siempre y cuando menos del 50% de los grupos R sean -NH-CO-CH3.
2. Un método que comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ¡ca/pga una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmunitaria contra el patógeno de un polisacárido aislado conjugado con un portador, en donde el polisacárido tiene la fórmula en donde n es 5 o mayor, R se selecciona del grupo que consiste de -NH-CO-CH3 y -NH2, siempre y cuando menos del 50% de los grupos R sean -NH-CO-CH3.
3. El metodo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el polisacárido aislado se conjuga con el portador a través de un ligador.
4. El método de conformidad con la reivindicación 2 o 3, caracterizado además porque el portador es un portador de péptido.
5. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, o menos de 5% de los grupos R son -NH-CO-CH3.
6. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque ninguno de los grupos R es -NH-CO-CH3.
7. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque n es por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 200, por lo menos 300, por lo menos 400 o por lo menos 500.
8. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado además porque el polisacárido aislado tiene un peso molecular de 100 a 500 kDa
9. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un coco gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el coco gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga es S. pneumonía, Streptococcus del Grupo A, Streptococcus del Grupo B, o Enterococcus.
11. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un bacilo gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el bacilo gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga es Listeria, Clostridium difficile, B. subtiiis, M. tuberculosis, o M. smegmatis.
13. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un coco o cocobacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el coco o cocobacilo gram-negativo positivo a PNAG sin icalpga es Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, H. influenzae no tipificable, Helicobacter, o Campylobacter.
15. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque e el bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga es Bacteroides fragilis, B. thetaiotamicron, B. vulgatis , Citrobacter rodentium , Vibrio cholera, Salmonella entérica serovariedad typhi, o Salmonella entérica serovariedad typhimurium.
17. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin icalpga es un hongo positivo a PNAG sin icalpga.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el hongo positivo a PNAG sin ica/pga es Candida albicans (levadura), Candida albicans (hifas), Aspergillus, Fusarium, o Cryptococcus.
19. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un parásito positivo a PNAG sin ica/pga.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque el parásito positivo a PNAG sin ica/pga es P. bergei o P. falciparum.
21. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sujeto es humano.
22. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el sujeto es un primate, caballo, vaca, cerdo, cabra, oveja, perro, o gato.
23. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado además porque el sujeto tiene una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga.
24. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado además porque el sujeto está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga.
25. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el polisacárido aislado se administra con un adyuvante.
26. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el polisacárido aislado se administra por vía sistemica.
27. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el polisacárido aislado se administra por vía local.
28. Una composición farmacéutica que comprende un polisacárido aislado que tiene la fórmula en donde n es por lo menos 5, R se selecciona del grupo que consiste de -NH-CO-CH3 y -NH2, siempre y cuando menos del 50% de los grupos R sean -NH-CO-CH3, para uso en prevenir o tratar, en un sujeto, una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga.
29. Una composición farmacéutica que comprende un polisacárido aislado conjugado con un portador, en donde el polisacárido tiene la fórmula en donde n es 5 o mayor, R se selecciona del grupo que consiste de -NH-CO-CH3 y -NH2, siempre y cuando menos del 50% de los grupos R sean -NH-CO-CH3, para uso en prevenir o tratar, en un sujeto, una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga.
30. La composición farmaceutica de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada además porque el polisacárido aislado se conjuga con el portador a través de un ligador.
31. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 29 o 30, caracterizada además porque el portador es un portador de péptido.
32. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31 , caracterizada además porque menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, o menos de 5% de los grupos R son -NH-CO-CH3.
33. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, caracterizada además porque ninguno de los grupos R es -NH-CO-CH3.
34. La composición farmaceutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, caracterizada además porque n es por lo menos 15, por lo menos 20, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 200, por lo menos 300, por lo menos 400 o por lo menos 500.
35. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, caracterizada además porque el polisacárido aislado tiene un peso molecular de 100 a 500 kDa
36. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un coco gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga.
37. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque el coco gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga es S. pneumonía, Streptococcus del Grupo A, Streptococcus del Grupo B, o Enterococcus.
38. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un bacilo gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga.
39. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada además porque el bacilo gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga es Listeria, Clostridium difficile, B. subtilis, M. tuberculosis, o M. smegmatis.
40. La composición farmaceutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin ¡calpga es un coco o cocobacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga.
41. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada además porque el coco o cocobacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga es Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, H. influenzae no tipificable, Helicobacter, o Campylobacter.
42. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga.
43. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque el bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga es Bacteroides fragilis, B. thetaiotamicron, B. vulgatis, Citrobacter rodentium, Vibrio cholera, Salmonella entérica serovariedad typhi, o Salmonella entérica serovariedad typhimurium.
44. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un hongo positivo a PNAG sin ica/ ga.
45. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el hongo positivo a PNAG sin icalpga es Candida albicans (levadura), Candida albicans (hitas), Aspergillus, Fusarium , o Cryptococcus.
46. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 35, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin icalpga es un parásito positivo a PNAG sin icalpga.
47. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada además porque el parásito positivo a PNAG sin icalpga es P. bergei o P. falciparum.
48. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 47, caracterizada además porque el sujeto es humano.
49. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada además porque el sujeto es un primate, caballo, vaca, cerdo, cabra, oveja, perro, o gato.
50. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49, caracterizada además porque el sujeto tiene una infección por un patógeno positivo a PNAG sin icalpga.
51. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49, caracterizada además porque el sujeto está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG sin icalpga.
52. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 51, caracterizada además porque el polisacárido aislado se utiliza con un adyuvante.
53. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 52, caracterizada además porque el polisacárido aislado se formula para administración sistémica.
54. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 52, caracterizada además porque el polisacárido aislado se formula para administración local.
55. Un método que comprende administrar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga una cantidad efectiva de un anticuerpo específico a PNAG o fragmento de anticuerpo específico a PNAG.
56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin icaJpga es un coco gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga.
57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el coco gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga es S. pneumonía, Streptococcus del Grupo A, Streptococcus del Grupo B, o Enterococcus.
58. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un bacilo gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga.
59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque el bacilo gram-positivo positivo a PNAG sin ica/pga es Listeria , Clostridium difficile , B. subtilis, M. tuberculosis, o M. smegmatis.
60. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin icalpga es un coco o cocobacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga.
61. El método de conformidad con la reivindicación 60 caracterizado además porque el coco o cocobacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga es Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, H. influenzae no tipificable, Helicobacter, o Campylobacter.
62. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin icalpga es un bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga.
63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado además porque el bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin icalpga es Bacteroides fragilis, B. thetaiotamicron, B. vulgatis, Citrobacter roderrtium, Vibrio cholera, Salmonella entérica serovariedad typhi, o Salmonella entérica serovariedad typhimurium.
64. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin icalpga es un hongo positivo a PNAG sin ica/pga.
65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado además porque el hongo positivo a PNAG sin ica/pga es Candida albicans (levadura), Candida albicans (hitas), Aspergillus, Fusarium, o Cryptococcus.
66. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el patógeno positivo a PNAG sin icaipga es un parásito positivo a PNAG sin ica/pga.
67. El método de conformidad con la reivindicación 66, caracterizado además porque el parásito positivo a PNAG sin icaipga es P. bergei o P. falcipamm.
68. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 55 a 67, caracterizado además porque el sujeto es humano.
69. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 55 a 67, caracterizado además porque el sujeto es un primate, caballo, vaca, cerdo, cabra, oveja, perro, o gato.
70. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 55 a 69, caracterizado además porque el sujeto tiene una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/pga.
71. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 55 a 69, caracterizado además porque el sujeto está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ica/ ga.
72. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 55 a 71, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra por vía sistemica.
73. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 55 a 71, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se administra por vía local.
74. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 55 a 73, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es anticuerpo F598 (ATCC PTA-5931) o un fragmento del mismo.
75. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 55 a 73, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es anticuerpo F628 (ATCC PTA-5932) o un fragmento del mismo.
76. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 55 a 73, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es anticuerpo F630 (ATCC PTA-5933) o un fragmento del mismo.
77. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 55 a 74, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se conjuga con un agente.
78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado además porque el agente es un agente citotóxico.
79. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo especifico a PNAG o fragmento de anticuerpo específico a PNAG para uso en prevenir o tratar, en un sujeto, una infección por un patógeno positivo a PNAG sin icalpga.
80. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin icalpga es un coco gram-positivo positivo a PNAG sin icalpga.
81. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 80, caracterizada además porque el coco gram-positivo positivo a PNAG sin icalpga es S. pneumonía , Streptococcus del Grupo A, Streptococcus del Grupo B, o Enterococcus.
82. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin icalpga es un bacilo gram-positivo positivo a PNAG sin icalpga.
83. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 82, caracterizada además porque el bacilo gram-positivo positivo a PNAG sin icalpga es Listeria, Clostrídium difficile, B. subtilis, M. tuberculosis , o M. smegmatis.
84. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin icalpga es un coco o cocobacilo gram-negativo positivo a PNAG sin icalpga.
85. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 84, caracterizada además porque el coco o cocobacilo gram-negativo positivo a PNAG sin icalpga es Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, H. influenzae no tipificable, Helicobacter, o Campylobacter.
86. La composición farmaceutica de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga.
87. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada además porque el bacilo gram-negativo positivo a PNAG sin ica/pga es Bacteroides fragilis, B. thetaiotamicron, B. vulgatis, Citrobacter rodentium, Vibrio choierae, Salmonella entérica serovariedad typhi o Salmonella entérica serovariedad typhimurium.
88. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un hongo positivo a PNAG sin ica/pga.
89. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 88, caracterizada además porque el hongo positivo a PNAG sin ica/pga es Candida albicans (levadura), Candida albicans (hifas), Aspergillus, Fusarium, o Cryptococcus.
90. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada además porque el patógeno positivo a PNAG sin ica/pga es un parásito positivo a PNAG sin ica/pga.
91. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 90, caracterizada además porque el parásito positivo a PNAG sin ica/pga es P. bergei o P. falciparum.
92. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 79 a 91, caracterizada además porque el sujeto es humano.
93. La composición farmaceutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 79 a 91, caracterizada además porque el sujeto es un primate, caballo, vaca, cerdo, cabra, oveja, perro, o gato.
94. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 79 a 93, caracterizada además porque el sujeto tiene una infección por un patógeno positivo a PNAG sin icaJpga.
95. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 79 a 93, caracterizada además porque el sujeto está en riesgo de desarrollar una infección por un patógeno positivo a PNAG sin ¡calpga.
96. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 79 a 95, caracterizada además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se formula para administración sistémica.
97. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 79 a 95, caracterizada además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se formula para administración local.
98. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 79 a 97, caracterizada además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es anticuerpo F598 (ATCC PTA-5931) o un fragmento del mismo.
99. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 79 a 97, caracterizada además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es anticuerpo F628 (ATCC PTA-5932) o un fragmento del mismo.
100. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 79 a 97, caracterizada además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es anticuerpo F630 (ATCC PTA-5933) o un fragmento del mismo.
101. La composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 79 a 98, caracterizada además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se conjuga con un agente.
102. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 101, caracterizada además porque el agente es un agente citotóxico.
103. Un método que comprende precipitar con etanol una preparación de polisacáridos cruda a partir de una preparación de cuerpo de célula microbiana concentrada; digerir al mismo tiempo el polisacárido crudo con lisozima y lisostafina seguido por digestión secuencial con una nucleasa y proteinasa K para formar una preparación de polisacáridos digerida; dividir por tamaños la preparación de polisacáridos digerida; aislar una fracción de polisacárido acetilada; y desacetilar la fracción de polisacárido acetilada para producir un polisacárido PNAG que tiene menos de 50% de sustituciones de acetato, en donde la preparación de cuerpo de célula microbiana se deriva de un microbio positivo a PNAG sin ica/pga.
104. Un método que comprende preparar un polisacárido impuro a partir de un cultivo microbiano; incubar el polisacárido impuro con un ácido o una base para producir una preparación de polisacárido semi-pura; neutralizar la preparación; incubar la preparación neutralizada en ácido fluorhídrico; aislar un polisacárido acetilado a partir de la preparación; y desacetilar el polisacárido acetilado para producir un polisacárido PNAG que tiene menos de 50% de sustituciones de acetato, en donde el cultivo microbiano es un cultivo microbiano positivo a PNAG sin icalpga.
105. Un método que comprende preparar un polisacárido impuro a partir de un cultivo microbiano; incubar el polisacárido impuro con un ácido o una base para producir una preparación de polisacárido semi-pura; neutralizar la preparación; incubar la preparación neutralizada en ácido fluorhídrico; y aislar a partir de la preparación un polisacárido PNAG que tiene menos de 50% de sustituciones de acetato, en donde el cultivo microbiano es un cultivo microbiano positivo a PNAG sin icalpga.
106. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 103 a 105, caracterizado además porque comprende adicionalmente conjugar un portador al polisacárido aislado.
107. El método de conformidad con la reivindicación 106, caracterizado además porque el portador es un portador de péptido.
108. El método de conformidad con la reivindicación 103 o 104, caracterizado además porque el polisacárido acetilado se desacetila químicamente.
109. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado además porque el polisacárido acetilado se desacetila mediante incubación con una solución básica.
110. El método de conformidad con la reivindicación 103 o 104, caracterizado además porque el polisacárido acetilado se desacetila enzimáticamehte.
111. Un método para producir anticuerpos que comprende: administrar a un sujeto una cantidad efectiva para producir anticuerpos de un polisacárido PNAG aislado a partir de un patógeno positivo a PNAG sin icalpga, y un adyuvante, y aislar anticuerpos del sujeto.
112. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado además porque los anticuerpos son anticuerpos policlonales.
113. Un método para producir anticuerpos monoclonales que comprende: administrar a un sujeto una cantidad efectiva para producir anticuerpos de un polisacárido PNAG aislado a partir de un patógeno positivo a PNAG sin icalpga , y un adyuvante, cosechar células de bazo del sujeto, fusionar células de bazo del sujeto a células de mieloma, y cosechar el anticuerpo producido a partir de un subclón de fusión.
114. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 111 a 113, caracterizado además porque el polisacárido PNAG es acetilado menos del 50%.
115. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 111 a 114, caracterizado además porque comprende adícionalmente aislar el anticuerpo.
116. El metodo de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 111 a 115, caracterizado además porque el sujeto es un conejo.
117. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 111 a 116, caracterizado además porque el sujeto es humano.
118. Un método para detectar un patógeno positivo a PNAG sin icalpga, que comprende poner en contacto una muestra que se sospecha contiene un patógeno positivo a PNAG sin icalpga con un anticuerpo específico a PNAG o fragmento de anticuerpo, y detectar la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo a la muestra, en donde la unión del anticuerpo o fragmento de anticuerpo indica que el patógeno positivo a PNAG sin icalpga está presente en la muestra.
119. El método de conformidad con la reivindicación 118, caracterizado además porque la muestra es Estafilococo negativo.
120. El método de conformidad con la reivindicación 118 o 119, caracterizado además porque la muestra es una muestra biológica de un sujeto.
121. El método de conformidad con la reivindicación 120, caracterizado además porque la muestra biológica es orina, sangre, pus, piel, esputo, fluido articular, linfa o leche.
122. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 118 a 121, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se conjuga con una etiqueta detectable.
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