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MX2014014174A - Inhibidores selectivos de celulas no diferenciadas. - Google Patents

Inhibidores selectivos de celulas no diferenciadas.

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MX2014014174A
MX2014014174A MX2014014174A MX2014014174A MX2014014174A MX 2014014174 A MX2014014174 A MX 2014014174A MX 2014014174 A MX2014014174 A MX 2014014174A MX 2014014174 A MX2014014174 A MX 2014014174A MX 2014014174 A MX2014014174 A MX 2014014174A
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MX
Mexico
Prior art keywords
cells
compound
plurisin
formula
undifferentiated
Prior art date
Application number
MX2014014174A
Other languages
English (en)
Inventor
Uri Ben-David
Nissim Benvenisty
Payal Arora
Qing-Fen Gan
Ralph J Garippa
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of MX2014014174A publication Critical patent/MX2014014174A/es

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Abstract

Se describen en la presente usos de un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-VI como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas, así como composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de cualquiera de las Fórmulas I-VI, y métodos para identificar un candidato principal para inhibir células no diferenciadas. Además se describen usos de un inhibidor de SCD-1 como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas.

Description

INHIBIDORES SELECTIVOS DE CÉLULAS NO DIFERENCIADAS CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se relaciona a la terapia y, más particularmente, pero no exclusivamente, al tratamiento de células no diferenciadas tales como células pluripotentes y células de cáncer no diferenciadas, a compuestos novedosos adecuados para las mismas, y a métodos para identificar compuestos adecuados para las mismas.
Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) mantienen gran promesa para la medicina regenerativa, debido a sus habilidades únicas para auto-renovarse y para diferenciarse en todos los tipos de células del cuerpo humano. Sin embargo, las mismas propiedades también hacen a estas células potencialmente tumorigénicas.
La formación de tumor se reportó que se correlaciona positivamente con la presencia residual de células pluripotentes no diferenciadas [Miura y colaboradores, Nature Biotechnology 27:743-745 (2009)]. Muy pocas hPSCs·se requieren para la formación de teratoma [Lee y colaboradores, Cell Cycle 8:2608-2612 (2009); Hentze y colaboradores, Stem Cell Research 2:198-210 (2009)] y aún después de la diferenciación prolongada en cultivo algunas células pluripotentes tumorigénicas permanecen [Narsinh y colaboradores, Journal of Clinical Investigation 121:1217- 1221 (2011); Ghosh y colaboradores, Cáncer Research 71:5030-5039 (2011); Fu y colaboradores, Stem Cells and Development 21:521-529 (2012)].
Por lo tanto se ha recomendado eliminar las células pluripotentes residuales antes de la aplicación clínica de sus derivados [Ben-David & Benvenisty, Nature Reviews Cáncer 11:268-277 (2011)].
De manera importante, mientras que la generación de células madre pluripotentes inducidas (iPS) puede haber resuelto el problema del rechazo inmunogénico, el riesgo de la formación de teratoma permanece como un obstáculo mayor que es igualmente relevante para las células madre embriónicas (ES) y para células iPS [Miura y colaboradores, Nature Biotechnology 27:743-745 (2009); Fu y colaboradores, Stem Cells and Development 21:521-529 (2012); Ben-David & Benvenisty, Nature Reviews Cáncer 11:268-277 (2011); Puri & Nagy, Stem Cells 30:10-14 (2012).
Para promover la remoción de células pluripotentes residuales de los cultivos diferenciados, se han sugerido varias estrategias, basadas en ya sea manipulaciones genéticas o clasificación de células, que incluyen: introducción de genes suicidas (Schuldiner y colaboradores, Stem Cells 21:257-265 (2003); Hara. y colaboradores, Stem Cells and Development 17:619-627 (2008)]; interferencia con los genes de progresión de tumor [Blum y colaboradores, Nature Biotechnology 27:281-287 (2009)]; o con supresores de tumor [Menendez y colaboradores, Aging Cell 11:41-50 (2012)]; clasificación de células activadas con fluorescencia o activadas magnéticas (FACS o MACS) en base a anticuerpos contra antigenos de superficie específicos de PSC [Fong y colaboradores, Stem Cell Reviews 5:72-80 (2009); Tang y colaboradores, Nature Biotechnology 29:829-834 (2011); Wang y colaboradores, Cell Research 21:1551-1563 (2011)]; y el uso de anticuerpos citotóxicos contra las células pluripotentes [Choo y colaboradores, Stem Cells 26:1454-1463 (2008); Schriebl y colaboradores, Tissue Engineering Part A (4 de junio del 2012, electrónicamente publicados)].
Los estudios previos han sugerido que las hPSCs pueden ser especialmente sensibles a algunas perturbaciones celulares, y de esta manera están más propensas que otros tipos de células a someterse a apoptosis bajo algunas circunstancias [Qin y colaboradores, Journal of Biological Chemistry 282:5842-5852(2007); Momcilovic y colaboradores, PloS One 5:el3410 (2010)].
La hipótesis de célula madre de cáncer postula que el crecimiento del cáncer es inducido por un subconjunto de células de cáncer, referidas en la téenica como células madre de cáncer o células semejantes a madre de cáncer (CSCs), que se caracterizan por el potencial de iniciación de tumor, capacidad de auto-renovación, resistencia a la terapia y una habilidad para diferenciarse en células de cáncer heterogéneas y posiblemente no tumorigénicas [Scaffidi & Misteli, Nature Cell Biology 13:1051-1061 (2011); Campos y colaboradores, Clinical Cáncer Research 16:2715-2728 (2010); Medema, Nature Cell Biology 15:338-344 (2013); Visvader & Lindeman, Nature Reviews Cáncer 8:755-768 (2008)]. Las CSCs que se han reportado incluyen una subpoblación de células de leucemia que expresan CD34 pero no CD38 [Bonnet & Dick, Nature Medicine 3:730-737 (1997], asi como subpoblaciones de células de cáncer en el cáncer de cerebro [Singh y colaboradores, Cáncer Research 63:5821-5828 (2003)], cáncer de mama [Al-Hajj y colaboradores, PNAS 100:3983-3988 (2003)], cáncer de colon [O'Brien y colaboradores, Nature 445:106-110], cáncer ovárico [Zhang y colaboradores, Cáncer Research 68:4311-4320 (2008)], cáncer pancreático [Li y colaboradores, Cáncer Research 67:1030-1037 (2007)], cáncer de próstata [Maitland & Collins, Journal of Clinical Oncology 26:2862-2870 (2008); Lang y colaboradores, Journal of Pathology 217:299-306 (2009)], melanoma [Schatton y colaboradores, Nature 451:345-349 (2008); Boiko y colaboradores, Nature 466:133-137 (2010); Schmidt y colaboradores, PNAS 108:2474- 2479 (2011); Civenni y colaboradores, Cáncer Research 71:3098-3109 (2011)] y mieloma múltiple [Matsui y colaboradores, Blood 103:2332-2336 (2004); Matsui y colaboradores, Cáncer Research 68:190-197 (2008)].
La estearoil-CoA desaturasa (SCD) es una enzima que cataliza la producción de ácido oleico mediante la desaturación de ácido esteárico. Dos isoformas, SCD1 y SCD5, se han reportado en humanos.
La inhibición de SCD1 se ha reportado que induce estrés del retículo endoplásmico (ER) y respuesta de proteina desplegada (UPR) en algunas líneas de células de cáncer humanas, conduciendo a la apoptosis de estas células, y se ha sugerido como un objetivo potencial para la terapia de cáncer [Roongta y colaboradores, Molecular Cáncer Research 9:1551-1561 (2011); Minville-Walz y colaboradores, PloS One 5:el4363 (2010); Scaglia y colaboradores, PloS One 4:e6812 (2009); Hess y colaboradores, PloS One 5:ell394 (2010); Morgan-Lappe y colaboradores, Cáncer Research 67:4390-4398 (2007); Masón y colaboradores, PloS One 7:e33823 (2012)]. SCD1 se ha reportado que se expresa en hPSCs [Assou y colaboradores, Stem Cells 25:961-973 (2007)], pero su función en estas células no se ha descrito previamente.
La acumulación de substratos de SCD1 de ácido graso saturado se ha reportado que inducen estrés de ER y UPR mediante varios mecanismos: generación de especies de oxígeno reactivas (ROS), que conduce al agotamiento de calcio del ER [Borradaile y colaboradores, Molecular Biology of t he Cell 17:770-778 (2006)]; alteración de la composición de membrana de ER, que da por resultado un deterioro notable en su estructura e integridad [Borradaile y colaboradores, Journal of Lipid Research 47:2726-2737 (2006)]; y deterioro del tráfico de ER a Golgi, que da por resultado la acumulación de proteínas en el ER [Preston y colaboradores, Diabetologia 52:2369-2373 (2009)]. El ácido oleico, el producto de la actividad de SCD1, se ha reportado que compite con los ácidos grasos saturados, bloquea la distribución de lípido anormal y atenúa el estrés de ER [Peng y colaboradores, Endocrinology 152:2206-2218 (2011); Hapala y colaboradores, Biology of the Cell/under the auspices of the European Cell Biology Organization 103:271-285 (2011)].
La alta actividad de SCD se ha reportado que está asociada con el perfil de riesgo cardiovascular incrementado, incluyendo triglicéridos de plasma elevados, alto índice de masa corporal y HDL de plasma reducido [Attie y colaboradores, J. Lipid Res 43:1899-1907 (2002)].
La Solicitud de Patente Internacional PCT/CA2006/000949 (publicada como WO 2006/130986), Solicitud de Patente Internacional PCT/CA2007/001026 (publicada como WO 2007/143823), Solicitud de Patente Internacional PCT/CA2007/001027 (publicada como WO 2007/143824), Solicitud de Patente Internacional PCT/CA2007/001396 (publicada como WO 2008/017161), Solicitud de Patente Internacional PCT/CA2007/001858 (publicada como WO 2008/046226), Solicitud de Patente Internacional PCT/CA2007/002139 (publicada como WO 2008/064474) y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2008/0182838 describe inhibidores de SCD1 y usos de los mismos en el tratamiento de la enfermedad cardiovascular, obesidad, diabetes, enfermedad neurológica, síndrome metabólico, resistencia a la insulina, cáncer y esteatosis del hígado.
La téenica antecedente adicional incluye Behrouzian y Buist [ Prostaglandíns , leukotrienes and Essential Fa tty Acids 68:107-112 (2003)]; Raju y Reiser [J Biol Chem 242:379-384 (1967)]; Park y colaboradores [Biochim Biophys Acta 1486:285-292 (2000)]; Liu y colaboradores [J Med Chem 50:3086-3100 (2007)]; Zhao y colaboradores [Bioorg Med Chem Lett 17:3388-3391 (2007)]; Xin y colaboradores [Bioorg Med Chem Lett 18:4298-4302 (2008)]; y las Solicitudes de Patentes Internacionales que tienen números de publicación WO 2005/011653, WO 2005/011654, WO 2005/011655, WO 2005/011656, WO 2005/011657, WO 2006/014168, WO 2006/034279, WO 2006/034312, WO 2006/034315, WO 2006/034338, WO 2006/034341, WO 2006/034440, WO 2006/034441, WO 2006/034446, WO 2006/086445, WO 2006/086447, WO 2006/101521, WO 2006/125178, WO 2006/125179, WO 2006/125180, WO 2006/125181, WO 2006/125194, WO 2007/044085, WO 2007/046867, WO 2007/046868, WO 2007/050124, WO 2007/130075, WO 2007/136746, WO 2008/074835, WO 2008/074835, 7, WO 2008/029266, WO 2008/062276, WO 2008/127349, WO 2008/003753, WO 2007/143697, WO 2008/024390, WO 2008/096746 y WO 2008/056687; y Liu [ Exper t Opini n on Therapeutic Patents 19:1169-1191 (2009)].
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un uso de un compuesto de la Fórmula I Fórmula I como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas, en donde: R1 es hidrógeno, y R2 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, 2,4-dioxo-5-fluoropirimidin-1-ilcarbonilo, 2-metilbenzofuran-3-ilmetilenamino y -NH-R5, en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de: piridinilcarbonilo, 2-hidroxil-2-fenil-2-tiofen-2-il-acetilo, alquil(Ci-b)-carbonilo, N-(etoxicarbonilmetil)-2,4-dioxo-pirrolidin-3- iliden-metilo, naftilsulfonilo, y N-hidroxi-acetimidoilo; o en donde: R1 es benzoilo y R2 es 4-clorobenzamido; y R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halo, NH2, bifeniloximetilo y alquilo(C1-4), con la condición de que por lo menos uno de R1, R2, R3 y R4 no sea hidrógeno, halo, NH2 o alquilo(C1-4).
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, R1 es hidrógeno y R2 se selecciona del grupo que consiste de: 2,4-dioxo-5-fluoropirimidin-1-ilcarbonilo, 2-metilbenzofuran-3-ilmetilenamino, y -NH-R5, en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de: piridinilcarbonilo, 2-hidroxi-2-fenil-2-tiofen-2-il-acetilo, alquil(Ci_6)-carbonilo, N-(etoxicarbonilmetil)-2,4-dioxo-pirrolidin-3- iliden-metilo naftilsulfonilo, y N-hidroxi-acetimidoilo; o: R1 es benzoilo y R2 es 4-clorobenzamido; y R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, cloro, NH2 y metilo.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se -proporciona un uso de un compuesto de la Fórmula II: Fórmula II como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un uso de un compuesto de la Fórmula III: Fórmula III como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un uso de un compuesto de la Fórmula IV: Fórmula IV como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un uso de un compuesto de Fórmula V: .
Fórmula V como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un uso de un compuesto de la Fórmula VI: Fórmula VI como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto descrito en la presente y un portador farmacéuticamente aceptable.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto descrito en la presente.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un uso de un compuesto descrito en la presente en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas en un sujeto en necesidad del mismo.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un compuesto descrito en la presente para el uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas en un sujeto en necesidad del mismo.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la composición se identifica para el uso en la inhibición de células no diferenciadas.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, las células no diferenciadas comprenden células madre pluripotentes.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, las células no diferenciadas comprenden células de cáncer no diferenciadas.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la composición se identifica para el uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la enfermedad o trastorno proliferativo se selecciona del grupo que consiste de un teratoma, un cáncer no diferenciado, una leucemia, un cáncer de cerebro, cáncer de mama, un cáncer de colon, un cáncer ovárico, un cáncer pancreático, un cáncer de próstata, un melanoma, un cáncer de hígado, un cáncer de pulmón, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer mesenquimal y un mieloma múltiple.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un método para identificar un candidato principal para inhibir las células madre pluripotentes, el método que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de muestras de células madre pluripotentes, cada una de las muestras que comprende un tipo diferente de células madre pluripotentes; (b) poner en contacto las muestras con un compuesto candidato; y (c) monitorear una viabilidad de las células madre en las muestras, mediante lo cual si la viabilidad se reduce en por lo menos dos de las muestras, el compuesto candidato se identifica como que capaz de inhibir las células madre pluripotentes, para de esta manera identificar el candidato principal.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el método es para identificar un candidato principal para inhibir selectivamente las células madre pluripotentes, el método que además comprende: (d) proporcionar por lo menos una muestra de células diferenciadas; (e) poner en contacto la por lo menos una muestra con el compuesto identificado como capaz de reducir una población de células madre pluripotentes; y (f) monitorear una viabilidad de las células diferenciadas en por lo menos una muestra, mediante lo cual si la viabilidad se mantiene en la por lo menos una muestra, el compuesto se identifica como capaz de inhibir selectivamente las células madre pluripotentes.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la invención, se proporciona un uso de un inhibidor de SCD1 (Estearoil-CoA desaturasa-1) como un inhibidor citotóxico de células madre pluripotentes.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el inhibidor de SCD1 se selecciona del grupo que consiste de A939572, CAY-10566, MF-438, CVT-11127, GSK-993, ácido 5-(tetradeciloxi)-2-furoico y una secuencia de silenciamiento de ácido nucleico para SCDl.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos téenicos y/o científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual la invención pertenece. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o prueba de las modalidades de la invención, métodos y/o materiales ejemplares se describen enseguida. En caso de conflicto, la especificación de patente, incluyendo las definiciones, lo controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se proponen para ser necesariamente limitantes .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Algunas modalidades de la invención se describen en la presente, a manera de ejemplo únicamente, con referencia a los dibujos acompañantes. Con referencia especifica ahora a los dibujos en detalle, se acentúa que los detalles particulares mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de las modalidades de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente para aquellos expertos en la téenica de cómo se pueden llevar a la práctica las modalidades de la invención.
En los dibujos: Las FIGS. 1A y IB presentan imágenes microscópicas de células madre embriónicas humanas CSES2-S02/3 genéticamente marcadas, obtenidas mediante el microscopio con luz (FIG. 1A) y mediante la microscopía fluorescente que muestra Oct-4 marcado con fluorescencia (FIG.1); las FIGs. 2A y 2B presentan imágenes de células madre embriónicas humanas H9 manchadas para fosfatasa alcalina, con (FIG.2A) y sin (FIG.2B) aumento; la FIG. 3 presenta imágenes de microscopía fluorescente de células madre embriónicas humanas Mel-l manchadas para Oct-4, 24, 72 y 120 horas después de ser sembradas en placas de 384 cavidades; la FIG. 4 presenta imágenes de microscopía fluorescente de células madre embriónicas humanas CSES2-S02/genéticamente marcadas que muestran Oct-4 marcado con fluorescencia, 48 y 96 horas después de ser sembradas en placas 384 cavidades; la FIG. 5 es una gráfica que muestra las unidades de luz relativas (RLU) medidas en un ensayo de luminiscencia basado en ATP de células madre embriónicas humanas H9 vivientes, como una función del número de células madre H9 sembradas en una muestra (k = 1,000; el ensayo se realizó 24 horas después del sembrado); la FIG. 6 presenta una imagen de células H9 manchadas con azul de metileno en cavidades de una placa 384 cavidades, 3, 24, 48 y 72 horas después de ser sembradas; la FIG.7 presenta gráficas de barras que muestran los resultados ejemplares de una clasificación para citotoxicidad para maleato de timolol (48), actidiona (6), clorhidrato de amsacrina (10), amodiaquina (9), carboplatino (13), ciprofloxacina (16), crotalina (19), doxicielina (22), estradiol (24), famotidina (25), fenofibrato (26), acetato de fludrocortisona (27), imipramina (29), isoproterenol (31), ketoconazol (33) y tetraciclina (46), después de la exposición a los compuestos durante 6, 24, 48 o 72 horas; 5 barras para cada tiempo de exposición representan, de izquierda a derecha, dosis de 30 mM, 10 mM, 3 mM, 1 mM y 300 nm; la FIG. 8 es un esquema que muestra un protocolo ejemplar para clasificar la citotoxicidad hacia las células pluripotentes; la FIG. 9 es una gráfica que muestra el factor Z' calculado para cada una de las 149 placas de 384 cavidades de una clasificación ejemplar para citotoxicidad hacia células pluripotentes (cada color indica un lote de placas que se clasificaron conjuntamente); la FIG. 10 es un histograma que muestra el número de compuestos probados como una función de la inhibición de célula pluripotente exhibida por los compuestos (valor de corte de 60% inhibición indicada por la flecha); la FIG.11 es una gráfica de dispersión que muestra la inhibición de las células madre embriónicas humanas CSES2 y H9 (ESCs) mediante 20 mM de compuestos ejemplares (r2=0.87, datos mostrados únicamente para compuestos que inhiben ambos tipos de célula por arriba de 60%); las FIGs. 12A-C son gráficas de dispersión bi-dimensionales (FIGs. 12A y 12B) y tri-dimensionales (FIG. 12C) que muestran valores de pEC5o (pEC50 = -logEC5o, valores EC5O están en unidades M, FIGs. 12A y 12B) para compuestos ejemplares o por ciento de inhibición por 20 m de compuestos ejemplares (FIG. 12C), para CSES2 (FIGs. 12A-12C), CSES2-S02/3 (FIGs. 12A y 12C) y células embriónicas humanas (ESCs) y H9 (FIG. 12C) y células madre pluripotentes inducidas por BJ-ÍPS28 (FIG.12B); la FIG.13 es una gráfica de dispersión que muestra los valores de pECso para compuestos ejemplares, como es obtenido para el tratamiento de células CSES2 durante 24 horas (eje x) y durante 48 horas (eje y) (pEC50 = -logEC50, valores de EC50 están en unidades M); la FIG. 14 es un esquema que muestra la relación entre las células pluripotentes ejemplares (células madre embriónicas (ES) y células madre pluripotentes inducidas (iPS), y células pluripotentes ejemplares o células progenitoras, células diferenciadas y células de cáncer; la FIG.15 es un gráfica de dispersión que muestra la inhibición de células CSES2 (eje y) y cardiomiocitos (eje x) mediante 20 mM de compuestos ejemplares (r2 = 0.03, datos mostrados únicamente para compuestos que inhiben células CSES2 por arriba de 60%, inhibidores selectivos de células CSES2 (menor que 20% de inhibición de cardiomiocitos) son indicados por el rectángulo); la FIG.16 es una gráfica de dispersión que muestra la inhibición de células CSES2 y fibroblastos mediante 20 mM « de compuestos ejemplares (datos mostrados únicamente para compuestos que inhiben células CSES2 por arriba de 60%, inhibidores selectivos de células de CSES2 (menor que 20% de inhibición de fibroblastos) se indica por el rectángulo); la FIG.17 es un gráfica de dispersión que muestra la inhibición de células CSES2 y hepatocitos mediante 20 mM de compuestos ejemplares (datos mostrados únicamente para compuestos que inhiben células CSES2 por arriba de 60%, inhibidores selectivos de células CSES2 (menor que 20% de inhibición de hepatocitos) se indica por el rectángulo); la FIG.18 es una gráfica de dispersión que muestra la inhibición de células CSES2 y células de neuroblastoma (Kelly) mediante 20 mM de compuestos ejemplares (datos mostrados únicamente para compuestos que inhiben células CSES2 por arriba de 60%, inhibidores selectivos de células CSES2 (menor que 20% de inhibición de células de neuroblastoma) se indica por el rectángulo); la FIG.19 es una gráfica de dispersión que muestra la inhibición de células CSES2 y células HeLa mediante 20 mM de compuestos ejemplares (datos mostrados únicamente para compuestos que inhiben células CSES2 por arriba de 60%, inhibidores selectivos de células CSES2 (menor que 20% de inhibición de células HeLa) se indica por el rectángulo); la FIG.20 es una gráfica de dispersión que muestra la inhibición de las células CSES2 y células Huh7 mediante 20 mM de compuestos ejemplares (datos mostrados únicamente para compuestos que inhiben células CSES2 por arriba de 60%, inhibidores selectivos de células CSES2 (menor que 20% de inhibición de células Huh7) se indica por el rectángulo); la FIG.21 es una gráfica de dispersión que muestra la inhibición de las células CSES2 y las células progenitoras endodérmicas mediante 20 mM de compuestos ejemplares (datos mostrados únicamente para compuestos que inhiben células CSES2 por arriba de 60%, inhibidores selectivos de células CSES2 (menor que 20% de inhibición de las células progenitoras endodérmicas) se indica por el rectángulo); la FIG. 22 presenta imágenes de microscopía fluorescentes que muestran la marcación de fluorescencia roja de Oct-4 (izquierda) y la marcación de fluorescencia verde de SOX17 (derecha) en células CSES2-S02/3 genéticamente marcadas antes (día 0) y después (día 8) de la diferenciación (barras de escala = 200 mm); la FIG.23 presenta histogramas que muestran 98% de células CSES2-S02/3 que exhibieron manchado fluorescente para CXCR4 después de la diferenciación, mientras que 3% exhibieron manchado fluorescente para CXCR4 antes de la diferenciación; la FIG. 24 presenta imágenes de microscopía fluorescentes que muestran la marcación de fluorescencia roja de Oct-4 (izquierda, nada de fluorescencia es visible, indicando la carencia de Oct-4) y la marcación de fluorescencia verde de SOX17 (derecha) en células CSES2-S02/3 diferenciadas después de ser colocadas en la diferenciación de placas de 384 cavidades (barras de escala = 200 mm); las FIGs.25A y 25B son gráficas de dispersión que muestran valores pEC50 para compuestos ejemplares, como es obtenido para el tratamiento de BJ-fibroblastos (FIG. 25A, eje y) y células madre pluripotentes inducidas derivadas de BJ-fibroblastos (FIG.25B, eje x) así como para células madre embriónicas CSES2-S02/3 (FIG. 25B, eje x) y células diferenciadas derivadas de CSES2-S02/3 (FIG. 25B, eje y) (PEC50 = -logEC5o, los valores de CE50 están en unidades M); la FIGs.26A y 26B presentan gráficas que muestran la inhibición de las células madre embriónicas CSES2 (FIG. 26A, izquierda) y células progenitoras endodérmicas derivadas de CSES2 diferenciadas (EPCs) (FIG.26A, derecha), así como la inhibición de BJ-fibroblastos (FIG. 26B, izquierda) y células madre pluripotentes inducidas con BJ-ÍPS28 derivadas de BJ-fibroblasto (FIG.26B, derecha) como una función de la concentración del compuesto ejemplar PluriSIn #1 (unidades de concentración mostradas en una escala logarítmica); la FIG. 27 presenta gráficas que muestran la inhibición (%) de células madre embriónicas CSES2-S02/3 (S02/3 ESCs), células diferenciadas derivadas de CSES2-S02/3 (S02/3 diff.), BJ-fibroblastos y células madre pluripotentes inducidas, derivadas de fibroblasto BJ-ÍPS28 como una función de la concentración de los 15 compuestos ejemplares PluriSIns #1 a #15 (PluriSIn # se muestra en la esquina izquierda superior de cada panel, las unidades de concentración mostradas en una escala logarítmica); la FIG. 28 presenta una gráfica que muestra la agrupación jerárquica de tipos de célula en base a su inhibición por los compuestos (cada compuesto es representado por una hilera), que además muestra los 15 compuestos (marcados por el rectángulo amarillo) que inhibieron únicamente las células madre pluripotentes (4 hileras superiores) (H = alta inhibición, L = baja inhibición); la FIG.29 es una gráfica de barras que muestra el número de células madre embriónicas H9 viables (con relación a las células de control no tratadas) 72 horas después del tratamiento con 20 mM de cada uno de PluriSIns #1 a #11, como es determinado por un ensayo de azul de etileno; la FIG. 30 presenta imágenes microscópicas que muestran las células madre embriónicas H9, 72 horas después del tratamiento con 20 mM de cada uno de PluriSIns #1 a #11, asi como las células de control no tratadas; la FIG. 31 presenta imágenes de microscopía fluorescentes que muestran la marcación de fluorescencia roja de Oct-4 en células madre embriónicas CSES2-S02/3 (FIGs. 31A-31C) y la marcación de fluorescencia verde de S0X17 en células diferenciadas derivadas de CSES2-S02/3, después del tratamiento con el compuesto ejemplar PluriSIn #6, con DMSO al 0.5% como un control negativo (NC), o con clorhidrato de amsacrina 5 mM como un control positivo citotóxico (PC) (barras de escala = 100 mm); las FIGs.32A-32C presentan imágenes de microscopía fluorescentes que muestran la marcación de fluorescencia roja de Oct-4 en células madre embriónicas CSES2-S02/3 (FIG.32A), marcación de fluorescencia verde de SOX17 en células diferenciadas derivadas de CSES2-S02/3 (FIG. 32B), y la marcación de fluorescencia roja de células madre embriónicas y la marcación fluorescente azul de núcleos de células en una mezcla de células madre embriónicas CSES2-S02/3 y células diferenciadas derivadas de CSES2-S02/3 (FIG. 32C), después del tratamiento con el compuesto ejemplar PluriSIn #1 (paneles derecho) o con un control de DMSO (paneles izquierdos) (barras de escala = 100 mm); la FIG.33 es una gráfica de barras que muestra el número de BJ-fibroblastos viables, células HeLa, células HepG2 y células Kelly (con relación a las células control no tratadas) 72 horas después del tratamiento con PluriSIn #1, 20 mM, como es determinado mediante un ensayo de azul de metileno; la FIG. 34 presenta imágenes microscópicas que muestran BJ-fibroblastos, células HeLa, células HepG2 y células Kelly 72 horas después del tratamiento con PluriSIn #1, 20 mM, asi como las células de control no tratadas; la FIG. 35 presenta una gráfica que muestra la agrupación jerárquica basada en la expresión génica de células madre embriónicas no diferenciadas (ESCs) y células progenitoras endodérmicas diferenciadas derivadas de ESC, tratadas con PluriSIn #1, PluriSIn #6, o sin tratamiento (control); el mapa presenta todos los genes diferencialmente expresados (>2 veces) entre el control y las condiciones de tratamiento (resultados de 2 experimentos se presentan para cada uno de los controles ESC y ESC con el tratamiento de PluriSIn #1, rojo indica alta (H) expresión, azul indica baja (L) expresión); la FIG.36 es una gráfica de barras que muestra los cambios en la expresión de genes asociados con apoptosis, después del tratamiento de las células madre embriónicas con PluriSIn #1 (ES PluriSIn#l) o PluriSIn #6 (ES PluriSIn#6), o el tratamiento de células diferenciadas derivadas de ES con PluriSIn #1 (Diff. PluriSIn#l); las FIG.37A y 37B presentan gráficas que muestran un análisis de FACS representativo (FIG. 37A) de la fluorescencia con isotiocianato de Anexin-V-f luoresceina (FITC) y la fluorescencia con yoduro de propidio (PI), y una gráfica de barras (FIG. 37B) que muestra la apoptosis de célula madre embriónica después del tratamiento durante 16 horas con 20 mM del compuesto ejemplar PluriSIn #1 (FIG.37A, fondo y FIG.37B), o con control (DMSO al 0.2%; FIG. 37A, parte superior y FIG.37B) (* p<0.05); la FIG.38 presenta imágenes de inmunomanchados que muestran niveles de procaspasa-3 y caspasa-3 segmentada en células madre embriónicas tratadas 20 mM del compuesto ejemplar PluriSIn #1 o con ditiotreitol 1 m (DTT, un control positivo) o en células de control no tratadas (los niveles de b-catenina sirvieron como control de carga); la FIG.39 es una gráfica de barras que muestra la viabilidad de las células madre embriónicas humanas tratadas durante 24 horas con 20 mM del compuesto ejemplar PluriSIn #1 y de las células de control no tratadas, en la presencia de 0, 25 o 100 mM de Z-VAD-FMK (* p<0.05; ** p<0.01); la FIG.40 es una gráfica de barras que muestra los cambios en la expresión de genes asociados con el estrés del retículo endoplásmico (ER) y la respuesta de proteína desplegada (UPR), después del tratamiento de las células madre embriónicas con ditiotreitol (DTT, un inductor de estrés de ER general) PluriSIn #1 (ES PluriSIn#l) o PluriSIn #6 (ES PluriSIn#6), o el tratamiento de células diferenciadas derivadas de ES con PluriSIn #1 (Diff. PluriSIn #1); la FIG.41 es una gráfica de barras que muestra la expresión (con relación al control) de la isoforma empalmada sXBPl (normalizada a niveles de sRP2) en células madre embriónicas (ESCs) y en células derivadas de ESCs mediante la diferenciación de 8 dias (ESCs 8d diff), después del tratamiento durante 12 horas con 20 mM del compuesto ejemplar PluriSIn #1, con ditiotreitol 1 mM (DTT) o con el control (* p=0.007); la FIG. 42 presenta imágenes de un inmunomanchado que muestra los niveles de fosfo-eIF2a en células madre embriónicas y células diferenciadas tratadas con PluriSIn #1, 20 mM, con ditiotreitol (DTT) 1 mM o con el control (a-tubulina sirvió como un control de carga); la FIG.43 es una gráfica de barras que muestra la síntesis de proteína en células madre embriónicas (ES) y en fibroblastos, como es determinado mediante la incorporación de 35S-Met (normalizada a la proteina total), después del tratamiento durante 12 horas con PluriSIn #1, 20 mM, con 10 mM de cicloheximida o con el control (* p=0.005); la FIG.44 es una gráfica de barras que muestra los cambios en la expresión de genes ejemplares después del tratamiento de las células madre embriónicas (ESC) o células diferenciadas derivadas de ES (Diff.) con los compuestos ejemplares PluriSIn #1 y PluriSIn #6, y el tratamiento de células de cáncer H19299 con el inhibidor de SCD D939572; la FIG.45 es una gráfica de barras que muestra la actividad de SCD1 (normalizada a niveles de control) después del tratamiento durante 12 horas con PluriSIn #1, 20 mM o con control (* p=2.106); la FIG.46 es una gráfica de barras que muestra la viabilidad de la célula madre embriónica (normalizada a niveles de control) después del tratamiento durante 48 horas con 75 nM de los inhibidores de SCD1 A939572 y CAY-10566 en la presencia o ausencia de ácido oleico (OA) 100 mM o con control (* p<0.0003); la FIG.47 es una gráfica que muestra la viabilidad de células madre pluripotentes (con relación a valores de control promedio), tratados con PluriSIn #1, 20 mM o amsacrina (AMS) 2 mM o no tratados (control), como una función de la concentración de ácido oleico (OA) o el ácido oleico conjugado a la albúmina de suero bovina (BSA); la FIG. 48 presenta imágenes que muestran células madre pluripotentes sin tratamiento (control) o después del tratamiento con PluriSIn #1, 20 mM (3 columnas a la derecha), con ácido oleico 0, 6.25, 25 y 100 mM conjugado con albúmina de suero bovina; la FIG.49 es una gráfica de barras que muestra la viabilidad de las células madre embriónicas después del tratamiento con 20 mM de los compuestos ejemplares PluriSIn #1, #2, #3, #5 o #6, con y sin ácido oleico 100 mM conjugado con albúmina de suero bovina (OA) (* p<0.006); la FIG. 50 presenta gráficas que muestran un análisis FACS representativo de la fluorescencia de isotiocianato de Anexin-V-fluoresceína (FITC) y la fluorescencia de yoduro de propidio (PI) después del tratamiento durante 18 horas con 20 mM del compuesto ejemplar PluriSIn #1, 100 nm o A939572, o con DMSO (control); la FIG.51 es una gráfica de barras que muestra la expresión (con relación al control) de la isoforma empalmada sXBPl en las células madre embriónicas (ESCs) y en células derivadas de ESC diferenciadas después del tratamiento con A939572 100 nm o con ditiotreitol (DTT) 1 mM (* p<0.05); la FIG. 52 presenta imágenes de un inmunomanchado que muestra los niveles de fosfo-eIF2a en células madre embriónicas (izquierda) y en células diferenciadas derivadas de ESC (derecha) tratadas con PluriSIn #1, 20 mM, A939572 100 nm, ditiotreitol (DTT) 1 mM o con control (a-tubulina sirvió como un control de carga); la FIG.53 es una gráfica de barras que muestra la síntesis de proteína en células madre embriónicas, como es determinado mediante la incorporación de 35S-Met (normalizado a proteína total), después del tratamiento durante 12 horas con A939572100 nm, con 10 mM de cicloheximida o con control (* p<0.05); la FIG.54 es una gráfica de barras que muestra la síntesis de proteína en células madre embriónicas (ESCs) H9 o BJ-fibroblastos (Diferenciado) como es determinado por la incorporación de 35S-Met (normalizada a proteína total), después del tratamiento durante 48 horas con ditiotreitol (DTT) 1 mM o 10 mM de cicloheximida (Compuesto) con o sin ácido oleico (OA) 100 mM, o con control; la FIG. 55 es un esquema que muestra un mecanismo potencial de los compuestos ejemplares (por ejemplo, PluriSIn #1), ácido palmítico y ácido oleico sobre la función y viabilidad celular; la FIG. 56 presenta una gráfica de barras que muestra la viabilidad de las células madre pluripotentes de ratón después del tratamiento con 20 mM de los compuestos ejemplares PluriSIn #1, #2, #4 o #6, con relación a aquel de las células no tratadas (control); la FIG. 57 presenta imágenes microscópicas de células madre embriónicas de ratón R1 Oct4-GFP, obtenidas mediante la microscopía con luz (paneles inferiores) y mediante la microscopía fluorescente que muestra Oct-4 marcado con fluorescencia (paneles superiores), después del tratamiento con el compuesto ejemplar PluriSIn #6, con DMSO al 0.5% como un control negativo (NC), o con clorhidrato de amsacrina 5 mM como un control positivo citotóxico (PC) (barra de escala = 100 mp\); la FIG. 58 presenta imágenes microscópicas de embriones de ratón representativos en 4 y 4.5 dias de poscoito, que muestran blastocistos de buena calidad (Grado A/B) después del tratamiento con control (DMSO al 0.2% y sin DMSO) y en 7 de 17 muestras después del tratamiento con PluriSIn #1, 20 mM, asi como blastocistos de mala calidad (Grado C, nada de masa de célula interior (ICM)) en 6 de 17 muestras, y blastocistos impedidos (mórulas) en 4 de 17 muestras después del tratamiento con PluriSIn #1, 20 mM (PluriSIn #1 administrado con DMSO al 0.2%, barra de escala = 100 mm); la FIG.59 es una gráfica de barras que muestra la proporción de blastocistos de buena calidad (Grado A/B), blastocistos de mala calidad (Grado C) y blastocistos impedidos después del tratamiento con control, o con PluriSIn #1, 20 mM en la presencia o ausencia de oleico ácido (OA) 100 mM (* p=0.0001); la FIG. 60 presenta imágenes microscópicas de embriones de ratón representativos en 4.5 días de poscoito, que muestran blastocistos de buena calidad (Grado A/B) después del tratamiento durante 24 horas con el control en la ausencia o presencia de ácido oleico (OA) 100 mM, en 5 de 7 muestras después del tratamiento con PluriSIn #1, 20 mM o A939572 100 nm con ácido oleico (OA) 100 mM, y en 5 de 9 muestras después del tratamiento con A939572 100 nm solo, así como blastocistos de mala calidad (Grado C, nada de masa de célula interior (ICM )) y blastocistos impedidos (mórulas) en algunas muestras después del tratamiento con PluriSIn #1, 20 mM o A939572 100 nm con ácido oleico (OA) 100 mM o con A939572 100 nm solo (barra de escala = 100 mm); la FIG.61 es una gráfica de barras que muestra la proporción de blastocistos de buena calidad (Grado A/B), blastocistos de mala calidad (Grado C) y blastocistos impedidos después del tratamiento durante 24 horas con control, o con A939572 100 nm en la presencia o ausencia de ácido oleico (OA) 100 mM (* p=0.007); la FIG. 62 presenta imágenes microscópicas de células madre H9 en una placa de 6 cavidades después de la exposición durante 24 o 48 horas a PluriSIn #1, 20 mM o sin PluriSIn #1 (control) (barra de escala = 200 mm); las FIGs . 63A y 63B presentan imágenes microscópicas de células madre H9 sobre fibroblastos embriónicos de ratón en una placa de 10 cm con el medio de células madre embriónicas, después de la exposición durante 48 horas a PluriSIn #1, 20 mM (FIG.63B) o sin PluriSIn #1 (FIG. 63B de la muestra mostrada en la FIG.63A); la FIG. 64 es un histograma que muestra el número de células como una función del manchado fluorescente para TRA-1-60, después de un tratamiento de 48 horas de una población de células mezclada (células CSES2-S02/3 diferenciadas y no diferenciadas) con PluriSIrt #1 (Tra-1-60 PluriSIn #1) o con DMSO (control de DMSO de Tra-1-60) (resultados para células únicamente, sin manchado, también se muestran como un control); la FIG. 65 presenta imágenes de microscopía fluorescentes que muestran la marcación de fluorescencia de Oct-4, después de un tratamiento de 48 horas de una población de células mezcladas (células CSES2-S02/3 diferenciadas y no diferenciadas) con PluriSIn #1 o con control; las FIGs. 66A y 66B presentan imágenes de ratones inyectados en ambos lados con células madre embriónicas CSES2-S02/3 (FIG. 66A) o células madre pluripotentes inducidas BJ-ÍPS28 (FIG. 66B), en donde las células inyectadas en un lado (ubicaciones de inyección marcadas por flechas) se pre-trataron con PluriSIn #1 y nada de teratoma es visible, y las células inyectadas sobre el otro lado no se pre-trataron, y produjeron un teratoma (marcado por elipses y mostrado en el panel derecho); las FIGs. 67A y 67B presentan imágenes de ratones inyectados sobre ambos lados con una mezcla de células madre embriónicas H9 diferenciadas y no diferenciadas (FIG.67A) o células madre pluripotentes inducidas de BJ-ÍPS28 diferenciadas y no diferenciadas (FIG. 67B), en donde las células inyectadas en un lado (ubicaciones de inyección marcadas por flechas) se pre-trataron con PluriSIn #1 y no es visible teratoma, y las células inyectadas sobre el otro lado no se pre-trataron, y produjeron un teratoma (marcado por elipses y mostrado en el panel derecho); la FIG. 68 presenta imágenes que muestran la histología de teratomas derivados de ES manchados con hematoxilina/eosina y derivados de iPS; la FIG.69 presenta una imagen (panel izquierdo) de un ratón inyectado sobre ambos lados con células madre embriónicas humanas, en donde las células inyectadas en un lado (ubicación de inyección marcada por una flecha) se pre-trataron con PluriSIn #1 y no es visible teratoma, y las células inyectadas sobre el otro lado no se pre-trataron, y produjeron un teratoma (marcado por una elipse, y mostrado en el panel derecho); la FIG. 70 presenta imágenes microscópicas de muestras representativas de células madre embriónicas humanas 72 horas después de la transfección con siRNA para SCD1 o con siRNA de imitación (siRNA para proteína fluorescente verde); la FIG.71 es una gráfica de barras que muestra la viabilidad relativa de las células madre embriónicas humanas no tratadas y las células madre embriónicas humanas transfectadas con siRNA 40 nM u 80 nM para SCD1, siRNA 80 nM para SCDl con ácido oleico (OA) 100 mM, o con siRNA de control (siRNA para proteina fluorescente verde) 72 horas después de la transfección (* p<0.05); la FIG.72 es una gráfica que muestra la viabilidad de célula relativa de fibroblastos BJ normales inmortalizados por la expresión de transcriptasa inversa de telomerasa humana (BJ + hTERT) y fibroblastos BJ transformados por la expresión de hTERT y H-RasV12 y la inhibición de p53 y la proteina de retinoblastoma (BJ + hTERT - RB - P53) como una función de la concentración del compuesto ejemplar PluriSIn #1, después de la exposición a PluriSIn #1 durante 72 horas (viabilidad relativa sin PluriSIn #1 se define como 1); y la FIG.73 es una gráfica que muestra la viabilidad de célula relativa de células de glioma similares a madre diferenciadas y no diferenciadas (SLGCs) como una función de la concentración del compuesto ejemplar PluriSIn #1, después de la exposición a PluriSIn #1 durante 72 horas (viabilidad relativa sin PluriSIn #1 se define como 1).
DESCRIPCIÓN DE MODALIDADES ESPECÍFICAS DE LA INVENCIÓN La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se relaciona a la terapia y, más particularmente, pero no exclusivamente, al tratamiento de células no diferenciadas tales como células pluripotentes y células de cáncer no diferenciadas, a compuestos novedosos adecuados para las mismas, y a métodos para identificar compuestos adecuados para las mismas.
Como se discutió anteriormente en la presente, los métodos previamente sugeridos para remover las células madre pluripotentes residuales potencialmente tumorigénicas (PSC) de cultivos diferenciados se basan en ya sea manipulaciones genéticas o en clasificación de células. Tales procesos no son generalmente adecuados para propósitos de terapias de células. Además, hasta la fecha ningún anticuerpo solo y ningún ciclo solo de clasificación de células que remueve completamente todas las células no diferenciadas de los cultivos mezclados son conocidos. Por lo tanto hay una necesidad por un método más potente para la eliminación de las células madre pluripotentes no diferenciadas del cultivo, particularmente un método que es adecuado para propósitos de terapia de células.
También hay una necesidad por compuestos capaces de eliminar las células no diferenciadas (por ejemplo, células de cáncer no diferenciadas), particularmente para el uso en el tratamiento de enfermedades y trastornos proliferativos.
Los presentes inventores han contemplado que la remoción mejorada de células madre pluripotentes (PSCs) se puede obtener al identificar moléculas pequeñas que selectivamente perturban las rutas cruciales en la PSCs, y de esta manera inducen la muerte celular en estas células únicamente. Mientras que se reduce la presente invención a la práctica, los inventores diseñaron una clasificación de alto rendimiento no desviada de moléculas pequeñas. Las moléculas pequeñas se seleccionaron con PSCs humanas objetivo selectivamente, y eliminaron de manera eficiente y potente todas las células no diferenciadas en el cultivo, sin afectar sus derivados diferenciados. La aplicación de estas moléculas pequeñas a cultivos de células diferenciadas antes de su trasplante en pacientes, de acuerdo con algunas modalidades de la invención, por lo tanto disminuiría considerablemente y aún eliminaría, el riesgo de formación de tumor debido a las células no diferenciadas residuales.
La estrategia que implica algunas modalidades de la invención tiene varias ventajas sobre las estrategias existentes, por ejemplo, son más rápidas, eficientes, potentes y escalables que cualquier otro método previamente sugerido. Además, la estrategia descrita en la presente no necesita manipulación genética de las células o disociación en células únicas. De esta manera, las modalidades de la presente invención permiten que las PSCs genéticamente normales sean inducidas a diferenciarse en estructuras complejas, que necesitan ser desensambladas antes de su trasplante.
Mientras que se reduce la presente invención a la práctica, los inventores además descubrieron que los compuestos que las células no diferenciadas objetivo selectivamente sin afectar sus derivados diferenciados, son capaces de eliminar de manera eficiente y potente las células de cáncer no diferenciadas.
Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención en detalle, se va entender que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificadas por los Ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o de ser practicada o llevada a cabo de varias maneras.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un uso de cualquiera de los compuestos como es descrito en la presente como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes, células de cáncer no diferenciadas).
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un uso de cualquiera de los compuestos como es descrito en la presente en la fabricación de un medicamento para inhibir células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes, células de cáncer no diferenciadas).
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para inhibir células madre pluripotentes, que se efectúa al poner en contacto las células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes, células de cáncer no diferenciadas) con cualquiera de los compuestos como es descrito en la presente.
En algunas modalidades, el contacto de las células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes) con los compuestos como es descrito en la presente se efectúa in vitro.
En algunas modalidades, el contacto se efectúa ex vivo. Por ejemplo, en algunas modalidades, el contacto se efectúa ex vivo con el fin de inhibir las células madre pluripotentes en una muestra (por ejemplo, de células diferentes de las células madre pluripotentes) que son administradas a un sujeto.
En algunas modalidades, el contacto se efectúa in vivo, al administrar los compuestos a un sujeto en necesidad del mismo.
El contacto de las células con el inhibidor se puede realizar mediante cualquiera de las condiciones in vitro que incluyen, por ejemplo, adicionar el inhibidor a las células derivadas de un sujeto (por ejemplo, un cultivo de células primario, una linea de células) o a una muestra biológica que comprende las mismas (por ejemplo, un fluido, liquido que comprende las células) tal que el inhibidor está en contacto directo con las células. De acuerdo con algunas modalidades de la invención, las células del sujeto se incuban con el inhibidor. Las condiciones utilizadas para incubar las células se seleccionan durante un periodo de tiempo/concentración de células/concentración de inhibidor/relación entre las células y fármaco y los similares que permiten al inhibidor inducir los cambios celulares en células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes), tales como cambios en la tasa de transcripción y/o traducción de genes específicos, tasa de proliferación, diferenciación, muerte celular, necrosis, apoptosis y los similares.
Los métodos para monitorear los cambios celulares inducidos por el inhibidor son conocidos en la téenica e incluyen por ejemplo, la prueba de MTT que se basa en la habilidad selectiva de las células vivientes para reducir la sal amarilla de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazolio) (Sigma, Aldrich St Louis, MO, USA) a un precipitado de formazán insoluble a morado-azul; el ensayo BrdU [equipo colorimétrico BrdU de ELISA de Proliferación Celular (Roche, Mannheim, Alemania)]; el ensayo de TUNEL [Roche, Mannheim, Alemania]; el ensayo de Anexina V [Equipo de Apoptosis de Anexina V ApoAlert® (Clontech Laboratories, Inc., CA, USA)]; el ensayo de b-galactosidasa asociado con Senescencia [Dimri y colaboradores, Proc Nati Acad Sci USA 92:9363-9367 (1995)]; así como diversos métodos de detección de RNA y de proteína (el nivel que detecta la expresión y/o actividad) que se describen adicionalmente anteriormente en la presente.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un compuesto como es descrito en la presente para el uso como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes, células de cáncer no diferenciadas) o en un método para inhibir las células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes, células de cáncer no diferenciadas).
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de cualquiera de los compuestos como es descrito en la presente.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un uso de cualquiera de los compuestos como es descrito en la presente en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un compuesto como es descrito en la presente, para el uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas.
Como se utiliza en la presente, la frase "células no diferenciadas" describe células caracterizadas por una falta de características mmoorrffoollóóggiiccaass y funcionales específicas adquiridas por las células normales durante el desarrollo (un proceso conocido en la téenica como "diferenciación"). La diferenciación de células durante el desarrollo da por resultado diferentes tipos de tejidos y células (caracterizados por diferentes tamaños, conformaciones, potenciales de membrana, actividades metabólicas y/o responsividad a señales) derivadas de un cigoto no indiferenciado simple. Una célula no diferenciada puede ser parte de un linaje que nunca se ha sometido a diferenciación, o derivada de una célula diferenciada mediante un proceso que elimina las características morfológicas y funcionales específicas de la célula diferenciada.
En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos descritos en la presente, las células no diferenciadas comprenden células madre pluripotentes.
En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos descritos en la presente, las células no diferenciadas comprenden células de cáncer no diferenciadas. En algunas modalidades, las células de cáncer no diferenciadas comprenden células madre de cáncer y/o células similares a madre de cáncer.
Como se utiliza en la presente, la frase "células madre pluripotentes" describe células madre (es decir, células que pueden dividirse y diferenciarse en varios tipos de células) que tienen un potencial para diferenciarse en cualquiera de las tres capas germinales: endodermo, mesodermo o ectoder o. Ejemplos conocidos en la téenica incluyen células madre embriónicas y células madre pluripotentes inducidas.
Como se utiliza en la presente y en la técnica, la frase "células de cáncer no diferenciadas" describe células de cáncer caracterizadas como que son muy inmaduras y distintas de las células en el tejido circundante, por ejemplo, células anapiásticas. La caracterización de las células de cáncer no diferenciadas es bien conocido en la técnica, por ejemplo, las células no diferenciadas se pueden clasificar como Grado 4 utilizando las guias del American Joint Committee on Cáncer [ AJCC Cáncer Staging Manual . 7th ed. New York, NY: Springer; 2010].
Las células de cáncer no diferenciadas pueden formar una proporción grande de células de cáncer en un sujeto (por ejemplo, en un tumor). Tales cánceres (por ejemplo, tumores de Grado 4 de acuerdo con las guias American Joint Committee on Cáncer [AJCC Cáncer Staging Manual . 7th ed. New York, NY: Springer; 2010] son referidas en la presente y en la técnica como un "cáncer no diferenciado".
Alternativamente, las células de cáncer no diferenciadas pueden formar una proporción pequeña de células de cáncer en un sujeto (por ejemplo, en un tumor). Sin embargo, aún en pequeñas cantidades, las células de cáncer no diferenciadas pueden tener una importancia clínica muy alta, por ejemplo, al actuar como células madre de cáncer.
Como se utiliza en la presente y en la téenica, las frases "célula madre de cáncer" y "células similar a madre de cáncer" son intercambiables y se refieren a un subconjunto de células de cáncer (por ejemplo, células encontradas dentro de tumores o cánceres hematológicos) que poseen la habilidad para dar origen a varios tipos de células encontrados en una muestra de cáncer particular. Esta capacidad para dar origen a diferentes tipos de células de cáncer (que da ]bor resultado una habilidad de formación de tumor considerable) es similar a las propiedades de las células madre normales, que da origen a diferentes tipos de células normales.
Múltiples ejemplos de células madre de cáncer y marcadores que las caracterizan son conocidos en la técnica. Los marcadores adecuados para identificar células madre de cáncer se describen, por ejemplo, por Medema [Nature Cell Biology 15:338-344 (2013)] y Visvader & Lindeman [Nature Reviews C ncer 8:755-768 (2008)]. Ejemplos incluyen, sin limitación, células de leucemia que expresan el marcador CD34, pero no el marcador CD38, como es descrito por Bonnet & Dick [Nature Medicine 3:730-737 (1997]; cáncer de cerebro (por ejemplo, glioma) células que expresan el marcador CD133, como es descrito por Singh y colaboradores [ Cáncer Research 63:5821 a 5828 (2003)] y/o los marcadores CD15, CD90, a6-integrina y/o nestina; células de cáncer de mama que expresan CD44 pero no CD2, CD3, CD10, CD16, CD18, CD31, CD64 y CD140b ("marcadores de Linaje") y bajas cantidades o nada de CD24 (células de Linaje CD44+CD24/bajo) como es descrito en Al-Hajj y colaboradores [ PNAS 100:3983-3988 (2003)] y/o ALDH1, CD24, CD90, CD133, actividad de Hedgehog-Gli y/o ot6-integrina; células de cáncer de colon que expresan CD133, como es descrito por O'Brien y colaboradores [Nature 445:106-110], CD44 (por ejemplo, células EpCAMhl/CD44+ como es descrito por Dalerba y colaboradores [ PNAS 104:10158-10163 (2007)], ABCB5, ALDH1, actividad de b-catenina, CD24, CD26, CD29, CD166 y/o LGR5; células de cáncer ovárico que expresan CD44 y CD117 como es descrito por Zhang y colaboradores [Cáncer Research 68:4311-4320 (2008)], CD24 y/o CD133; células de cáncer pancreático que expresan CD44, CD24 y antigeno especifico epitelial (ESA) como es descrito por Li y colaboradores [ Cáncer Research 67:1030-1037 (2007)], ABCG2, ALDH1, CD133, c-Met, CXCR4, nestina y/o activina nodal; células de cáncer de próstata que expresan CD133, a2bi integrina y CD144 +), como es descrito por Maitland & Collins [Journal of Clinical Oncology 26:2862-2870 (2008)] y/o Lang y colaboradores [Journal of Pathology 217:299-306 (2009)], ALDH1, CD44, CD166, a6-integrina y/o Trop2; células de melanoma que expresan ABCB5, como es descrito por Schatton y colaboradores. [Nature 451:345-349 (2008)] y/o CD271, tal como es descrito por Boiko y colaboradores [Nature 466:133-137 (2010)] y/o Civenni y colaboradores [Cáncer Research 71:3098-3109 (2011)] y/o antigeno asociado al melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA) y CD20, como es descrito por Schmidt y colaboradores [ PNAS 108:2474-2479 (2011)] y/o ALDHl y/o CD133; células de cáncer de hígado que expresan CD13, CD24, CD44, CD90 y/o CD133; células de cáncer de pulmón que expresan ABCG2, ALDHl, CD90, CD117 y/o CD133; células de cáncer de cabeza y cuello que expresan CD44; células de cáncer mesenquimales caracterizadas por el efluente de 333342tinte Hoechst; y múltiples células de míeloma que no expresan CD138 (CD138-), como es descrito por Matsui y colaboradores [Blood 103:2332-2336 (2004)], por ejemplo, células CD138-/CD20+/CD27+, tal como es descrito por Matsui y colaboradores [Cáncer Research 68:190-197 (2008)].
Se espera que durante la vida de una patente que sale a partir de esta solicitud muchas células madre de cáncer, relevantes y células similares a madre de cáncer serán identificadas y caracterizadas y el alcance de los términos "célula madre de cáncer" y "célula similar a madre de cáncer" se propone para incluir todas dé tales células a prior i .
Como se utiliza en la presente, "un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas" describe un compuesto que, cuando hace contacto con las células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes, células de cáncer no diferenciadas), reduce la población de estas células, al inhibir el crecimiento y/o proliferación de estas células y/o al exterminar por lo menos una porción de estas células.
La frase "que inhibe células no diferenciadas" de esta manera describe la reducción de una población de células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes, células de cáncer no diferenciadas) , al inhibir el crecimiento y/o proliferación de estas células y/o al exterminar por lo menos una porción de estas células.
Como se utiliza en la presente, la frase "cantidad terapéuticamente efectiva" describe una cantidad del compuesto que es administrada que aliviará en algún grado uno o más de los síntomas de la condición que es tratada.
Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" incluye mamíferos, de preferencia seres humanos en cualquier edad afligidos por una condición (por ejemplo, una enfermedad o trastorno proliferativo) descrita en la presente, incluyendo individuos quienes están en riego de desarrollar la condición.
En algunas modalidades, el sujeto es un individuo diagnosticado por tener células de cáncer no diferenciadas, que se pueden presentar en un grado tal que ese sujeto es diagnosticado con una condición asociada con las células no diferenciadas (por ejemplo, una enfermedad o trastorno proliferativo), como es descrito en la presente, o el sujeto está en riesgo de desarrollar tal condición.
Como se discute en la presente, la inhibición de células madre pluripotentes (PSCs) puede prevenir a estas células de madurar en células cancerosas, y de esta manera es ventajoso en casos del sujetos que se somete a la terapia de células madre (u otra terapia celular) con el fin de reducir un riesgo de cáncer en tales sujetos.
Por consiguiente, en algunas modalidades, cualquiera de los métodos y usos descritos en la presente se utiliza para reducir un riesgo de cáncer en el sujeto tratado por una terapia de células madre.
Los sujetos que se someten a la terapia de células madre pueden ser, por ejemplo, sujetos quienes han sufrido, antes de someterse a la terapia de células madre, de enfermedades o trastornos que son tratables por la terapia de células madre. Tales enfermedades y trastornos incluyen, pero no están limitados a, cáncer, diabetes mellitus de Tipo I, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, enfermedad de Alzheimer, daño cerebral, lesión de médula espinal, enfermedad celíaca, falla del corazón, daño del corazón, anemia, calvicie, sordera, ceguera, deterioro de la visión, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de injerto contra hospedero, enfermedad de Crohn, infertilidad, heridas, enfermedades o trastornos ortopédicos, daño muscular y trastornos neurológicos.
La inhibición de PSCs también es ventajosa en casos donde debido a la proliferación de PSCs, un sujeto está en riesgo de desarrollar, o ya ha desarrollado, una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de las células madre.
Como se utiliza en la presente, un "enfermedad o trastorno proliferativo" describe cualquier condición médica que está asociada con la proliferación anormal de células no diferenciadas (por ejemplo, células madre, células de cáncer no diferenciadas). Tales condiciones incluyen, pero no están limitadas a, neoplasia benigna y maligna (por ejemplo, cáncer), carcinoma in situ e hiperplasia.
Ejemplos de enfermedades o trastornos proliferativos asociados con la proliferación de células no diferenciadas incluyen, sin limitación, teratomas, cánceres no diferenciados, leucemias, cánceres cerebrales (por ejemplo, gliomas), cánceres de mama, cánceres de colon, cánceres ováricos, cánceres pancreáticos, cánceres de próstata, melanomas, cánceres de hígado, cáncer de pulmón, cánceres de cabeza y cuello, cánceres mesenquimales y mielo as múltiples.
En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno proliferativo es un teratoma y/o un cáncer no diferenciado.
En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno proliferativo es un cáncer tal como leucemia, cáncer cerebral (por ejemplo, glioma), cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer mesenquimal y/o mieloma múltiple, el cáncer que es asociado con la proliferación de células madre de cáncer.
Los sujetos en riesgo de desarrollar tales enfermedades o trastornos proliferativos son, por ejemplo, sujetos quienes se les administraron (por ejemplo, como parte de una terapia celular) células madre o células derivadas (por ejemplo, mediante diferenciación) de las células madre, en donde tales células son células madre pluripotentes se conocen que comprenden células madre pluripotentes o llevan un riesgo de incluir una o más células madre pluripotentes.
Los sujetos que sufren de enfermedades o trastornos asociados con la proliferación de células madre son, por ejemplo, sujetos quienes tienen un tumor de célula germinal benigno o maligno (por ejemplo, tumor de célula germinal no seminatouso), por ejemplo, un teratoma.
De acuerdo con algunas modalidades de la presente invención, los compuestos utilizables en cualquiera de los métodos y usos descritos en la presente se representan por la Fórmula I: Fórmula I en donde: R1 es hidrógeno, y R2 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, 2,4-dioxo-5-fluoropirimidin-1-ilcarbonilo, 2-metilbenzofuran-3-ilmetilenamino, y -NH-R5, en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de: piridinilcarbonilo (por ejemplo, piridin-4- ilcarbonilo), 2-hidroxi-2-fenil-2-tiofen-2-il-acetilo, alquil(Ci-6)-carbonilo (por ejemplo, un alquil- carbonilo lineal, un alquil-carbonilo no sustituido), N-(etoxicarbonilmetil)-2,4-dioxo-pirrolidin-3- iliden-metilo, naftilsulfonilo (por ejemplo, 2-naftilsulfonilo), y N-hidroxi-acetimidoilo (-C(=NOH)CH3); o en donde: R1 es benzoilo y R2 es 4-clorobenzamido.
R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halo, NH2, bifeniloximetilo (por ejemplo, ([1,1'-bifenil]-4-iloxi)metilo) y alquilo(Ci-4) (por ejemplo, un alquilo lineal, un alquilo no sustituido). En algunas modalidades, el halo es cloro. En algunas modalidades, el alquilo es metilo.
En algunas modalidades, por lo menos uno de R1, R2, R3 y R4 no es hidrógeno, halo, NH2 o alquilo(Ci_4).
En algunas modalidades, R1 es hidrógeno y R2 es como se definió anteriormente en la presente.
En algunas modalidades, R1 es hidrógeno y R2 se selecciona del grupo que consiste de: 2,4-dioxo-5-fluoropirimidin-1-ilcarbonilo, 2-metilbenzofuran-3-ilmetilenamino, y -NH-R5, en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de: piridinilcarbonilo, 2-hidroxi-2-fenil-2-tiofen-2-il-acetilo, alquil(Ci_6)-carbonilo, N-(etoxicarbonilmetil)-2,4-dioxo-pirrolidin-3- iliden-metilo, naftilsulfonilo, y N-hidroxi-acetimidoilo; y R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, cloro, N¾ y metilo.
En algunas modalidades, R1 es benzoilo y R2 es 4-clorobenzamido; y R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, cloro, NH2 y metilo.
En algunas modalidades, R2 se selecciona del grupo que consiste de 2-metilbenzofuran-3-ilmetilenamino, -NH-R5 (como se definió en la presente) y 4-clorobenzamido. En algunas modalidades, R2 se selecciona del grupo que consiste de -NH-R5 (como se definió en la presente) y 4-clorobenzamido. En algunas modalidades, R2 se selecciona del grupo que consiste de 2-metilbenzofuran-3-ilmetilenamino y -NH-R5 (como se definió en la presente). En algunas modalidades, R2 es -NH-R5.
Un compuesto ejemplar que es utilizable en cualquiera de los métodos y usos como es descrito en la presente es un compuesto de la Fórmula II: Fórmula II Otro compuesto ejemplar que es utilizable en cualquiera de los métodos y usos como es descrito en la presente es un compuesto de la fórmula III: Fórmula III Otro compuesto ejemplar que es utilizable en cualquiera de los métodos y usos como es descrito en la presente es un compuesto de la fórmula IV: Fórmula IV Otro compuesto ejemplar que es utilizable en cualquiera de los métodos y usos como es descrito en la presente es un compuesto de la fórmula V: Fórmula V Otro compuesto ejemplar que es utilizable cualquiera de los métodos y usos como es descrito en la presente es un compuesto de la fórmula VI: Fórmula VI término "alquilo" describe un hidrocarburo alifático que incluye grupos de cadena recta y de cadena ramificada. En la presente, el número de átomos de carbono en un grupo alquilo es indicado. El grupo alquilo puede ser sustituido o no sustituido. En algunas modalidades, el alquilo es no sustituido, a menos que se establezca explícitamente de otra manera. El alquilo sustituido puede tener uno o más sustituyentes, mediante lo cual cada grupo sustituyente independientemente puede ser, por ejemplo, amina, halo, sulfonato, sulfóxido, fosfonato, hidroxi, alcoxi, tiohidroxi, tioalcoxi, ciano, isocianato, nitro, azo, sulfonamida, oxo, carbonilo, carboxi, tiocarbamato, urea, tiourea, carbamato, epóxido, tiirano, aziridina, amida e hidrazina.
Como se utiliza en la presente, el término "amina" describe tanto un grupo -NRxRy como un grupo -NRx-, en donde Rx y Ry son cada uno independientemente hidrógeno, metilo (CH3) O etilo (CH2CH3).
El grupo amina por lo tanto puede ser una amina primaria, donde tanto Rx como Ry son hidrógeno, una amina secundaria, donde Rx es hidrógeno y Ry es alquilo, o una amina terciaria, donde cada uno de Rx y Ry es alquilo.
Los términos "haluro" y "halo" describen flúor, cloro, bromo o yodo.
El término "sulfóxido" describe un grupo -S(=0)Rx, donde Rx es como se definió anteriormente en la presente.
El término "sulfonato" describe un grupo -S(=0)2-RX, donde Rx es como se definió en la presente.
El término "sulfonamida" como se utiliza en la presente, abarca tanto S-sulfonamidas como N-sulfonamidas.
El término "S-sulfonamida" describe un grupo -S(=0)2-NRxRY, con Rx y RY como se definió en la presente.
El término "N-sulfonamida" describe un grupo RxS(=0)2-NRY-, donde Rx y RY son como se definió en la presente.
El término "carbonilo" o "carbonato" como se utiliza en la presente, describe un grupo -C(^0)-Rx, con Rx como se definió en la presente.
El término "oxo", como se utiliza en la presente, describe un grupo =0.
Los términos "hidroxi" y "hidroxilo" describen un grupo -OH.
El término "alcoxi" describen un grupo -O-alquilo(Ci_2)· El término "tiohidroxi" describe un grupo -SH.
El término "tioalcoxi" describe ambos un grupo -S-alquilo(C1-2)· Los términos "ciano" y "nitrilo" describen un grupo -CºN.
El término "isocianato" describe un grupo -N=C=0.
El término "nitro" describe un grupo -NO2.
El término "azo" describe un grupo -N=NRx, con Rx como se define en la presente.
El término "carboxi", como se utiliza en la presente, abarca ambos grupos C-carboxi y O-carboxi.
El término "C-carboxi" describe un grupo -C(=0)-0Rx, donde Rx es como se define en la presente.
El término "O-carboxi" describe un grupo -0C(=0)-Rx, donde Rx es como se define en la presente.
El término "urea" describe un grupo -NRxC (=0)-NRyRw, donde Rx y Ry son como se definen en la presente y Rw es como se define en la presente para Rx y Ry.
El término "tiourea" describe un grupo -NRx-C(=S)-NRyRw, con Rx, Ry y Ry como se define en la presente.
El término "amida", como se utiliza en la presente, abarca tanto C-amidas como N-amidas.
El término "C-amida" describe un grupo -C(=0)-NRxRy, donde Rx y Ry son como se definen en la presente.
El término "N-amida" describe un grupo RxC(=0)-NRy-, donde Rx y Ry son como se definen en la presente.
El término "carbamato", como se utiliza en la presente, abarca tanto N-carbamatos como O-carbamatos.
El término "N-carbamato" describe un grupo RyOC(=0)-NRx-, con Rx y Ry como se define en la presente.
El término "O-carbamato" describe un grupo -0C(=0)-NRxRy, con Rx y Ry como se define en la presente.
El término "tiocarbamato", como se utiliza en la presente, abarca tanto O-tiocarbamatos como N-tiocarbamatos.
El término "O-tiocarbamato" describe un grupo -0C(=S)-NRxRy, con Rx y Ry como se define en la presente.
El término "N-tiocarbamato" describe un grupo RyOC(=S)NRx-, con Rx y Ry como se define en la presente.
Como se utiliza en la presente, el término "epóxido" describe RxRy un grupo donde Rx, Ry y Rw son como se definen en la presente.
Como se utiliza en la presente, el término "tiirano" describe un grupo que es equivalente a un epóxido, en donde el átomo de oxigeno del epóxido se reemplaza con un átomo de azufre.
Como se utiliza en la presente, el término "aziridina" describe un grupo que es equivalente a un epóxido, en donde el átomo de oxigeno del epóxido se reemplaza con un átomo de nitrógeno, y el átomo de nitrógeno enlaza, además de dos átomos de carbono adyacentes, Rq, en donde Rq se define de acuerdo con la misma definición como Rx.
El término "hidrazina", como se utiliza en la presente, describe un grupo -NRx-NRyRw, con Rx, Ry, y Rw como se define en la presente.
En cualquiera de los métodos y usos descritos en la presente, los compuestos como se describen en la presente como inhibidores citotóxicos de células no diferenciadas (por ejemplo, PSCs, células de cáncer no diferenciadas) se pueden utilizar ya sea per se o, de preferencia como una composición farmacéutica que además comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
De esta manera, de acuerdo con aspectos adicionales de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende uno o más compuestos descritos en la presente (por ejemplo, inhibidores citotóxicos) y un portador farmacéuticamente aceptable.
Como se utiliza en la presente, una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de los compuestos presentados en la presente, con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes farmacéuticamente aceptables y adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
Después en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador o un diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Ejemplos, sin limitaciones, de portadores son: propilenglicol, solución salina, emulsiones y mezclas de solventes orgánicos con agua, así como portadores sólidos (por ejemplo, en polvo) y gaseosos.
En la presente el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte adicionada a una composición farmacéutica para facilitar además la administración de un compuesto. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Las téenicas para formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington Pharmaceutical Sciences" Mack Publishing Co., Easton, PA, más última edición, que se incorpora en la presente por referencia.
Las composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con modalidades de la presente invención de esta manera se pueden formular de manera convencional utilizando uno o más portadores farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los compuestos en preparaciones que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la ruta de administración elegida. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. La formulación exacta, ruta de administración y dosificación se pueden elegir por el médico individual en vista de la condición del paciente (ver, por ejemplo, Fingí y colaboradores, 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.1).
La composición farmacéutica se puede formular para administración en ya sea una o más de las rutas dependiendo de si es de elección el tratamiento local o sistémico o la administración, y sobre el área que es tratada. La administración se puede hacer oralmente, mediante inhalación, o parenteralmente, por ejemplo mediante goteo intravenoso o intraperitoneal, subcutánea, inyección intramuscular o intravenosa, o tópicamente (que incluye oftálmicamente, vaginalmente, rectalmente, intranasalmente).
Las formulaciones para administración tópica pueden incluir, pero no están limitadas a lociones, ungüentos, geles, cremas, supositorios, gotas, líquidos, rocíos y polvos.
Los portadores farmacéuticos convencionales, acuosos, bases en polvo o aceitosos, espesantes y los similares pueden ser necesarios o deseables.
Las composiciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, saquitos, píldoras, caplets, cápsulas o tabletas. Los espesantes, diluyentes, saborizantes, auxiliares de dispersión, emulsificantes o aglutinantes pueden ser deseables.
Las formulaciones para administración parenteral pueden incluir, pero no están limitadas a, soluciones estériles que también pueden contener soluciones amortiguadoras, diluyentes y otros aditivos adecuados. Las composiciones de liberación lenta se contemplan para el tratamiento.
La cantidad de una composición que es administrada, por supuesto, será dependiente del sujeto que es tratado, la severidad de la aflicción, la manera de administración, el buen juicio del médico que prescribe, etc.
Las composiciones de modalidades de la presente invención, si se desea, se pueden presentar en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un equipo aprobado por la FDA (la U.S. Food and Drug Administration), que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contiene el ingrediente activo. El paquete, por ejemplo, puede comprender lámina delgada de metal o de plástico, tal como, pero no limitada a un paquete de ampollas o un recipiente presurizado (para inhalación). El paquete o dispositivo dispensador se puede acompañar por instrucciones para la administración. El paquete o dispensador también se puede acompañar por una notificación asociada con el recipiente en una forma que es prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de sustancias farmacéuticas, la notificación que es reflectiva de la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones para administración humana o veterinaria. Tal notificación, por ejemplo, puede ser de etiquetación aprobada por la U.S. Food and Drug Administration para drogas de prescripción o de un inserto de producto aprobado. Las composiciones que comprenden un compuesto de la invención formulada en un portador farmacéutico compatible también se pueden preparar, colocar en un recipiente apropiado y etiquetar para el tratamiento de una condición descrita en la presente (por ejemplo, una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas), como es detallado en la presente.
De esta manera, de acuerdo con una modalidad de la presente invención, la composición farmacéutica de la presente invención está siendo empacada en un material de empaquetamiento e identificada en impresión, dentro o sobre el material de empaquetamiento, para el uso en el tratamiento de una condición descrita en la presente (por ejemplo, una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas).
De acuerdo con modalidades adicionales de cualquiera de los métodos, usos y composiciones presentados en la presente, los compuestos de la presente invención se pueden combinar con otros ingredientes activos que se utilizan comúnmente para tratar una condición descrita en la presente (por ejemplo, una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas).
De acuerdo con otro aspecto de las modalidades de la invención, se proporciona un compuesto descrito en la presente que es identificado para el uso en la inhibición de células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes y/o células de cáncer no diferenciadas, como es descrito en la presente).
Como se muestra en los ejemplos en la presente, los presentes inventores han demostrado que la inhibición de SCD (estearoil-CoA desaturasa) da por resultado una inhibición citotóxica selectiva de células madre pluripotentes.
De esta manera, de acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un uso de un inhibidor de SCD como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas. En modalidades ejemplares, las células no diferenciadas son células madre pluripotentes.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un uso de un inhibidor de SCD en la fabricación de un medicamento para inhibir células no diferenciadas. En modalidades ejemplares, las células no diferenciadas son células madre pluripotentes.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para inhibir las células no diferenciadas, que se efectúa al poner en contacto las células no diferenciadas con un inhibidor de SCD. En modalidades ejemplares, las células no diferenciadas son células madre pluripotentes.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de SCD y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, tal composición se formula, se identifica para el uso y/o se empaqueta como es descrito en la presente (por ejemplo, como es descrito en la presente con respecto a los compuestos descritos en la presente).
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD (como es descrito en cualquiera de los aspectos de la invención) es un inhibidor de SCD1.
Los inhibidores de SCD1 ejemplares incluyen A939572 (4-(2-clorofenoxi) -N- (3-(metilcarbamoil)fenil)piperidina-1-carboxamida), CAY-10566 (3-[4-(2-cloro-5-fluorofenoxi)-1-piperidinil]-6-(5-metil-l,3,4-oxadiazol-2-il)piridazina), MF-438 (2-metí1-5-[6-[4-[2-(trifluorometil)fenoxi]piperidin-1-il]piridazin-3-il]-1,3,4-tiadiazol), CVT-11127 (N- {2-(6- (3,4-dichlorobencilamino)-2-(4-metoxifenil)-3-oxopirido[2,3-b]pirazin-4( 3H) -yl)etil)acetamida), TOFA (ácido 5- (tetradeciloxi)-2-furoico) y GSK-993 [N- (1-(5-cloro-2-isobutoxibencil)-5-metil-1H-pirazol-3-il)-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-6-carboxamida, por ejemplo, como es descrito por Issandou y colaboradores [Eur J Pharmacol . 618:28-36 (2009)] y Masón y colaboradores [ PloS One 7:e33823 (2012)]).
CVT-11127 GSK-993 En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es MF-438, CAY-10566, A939572, CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, CAY-10566, A939572, CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, MF-438, A939572, CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, MF-438, CAY-10566, CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, MF-438, CAY-10566, A939572 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es CAY-10566, A939572, CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es CAY-10566, A939572, MF-438 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es CAY-10566, A939572, MF-438 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es CAY-10566, MF-438, CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es A939572, MF-438, CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es A939572, CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es A939572, MF-438 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es A939572, MF-438 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es CAY-10566, CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es CAY-10566, MF-438 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es CAY-10566, MF-438 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es A939572, CAY-10566 y/o GSK- 993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es A939572, MF-438 y/o CAY-10566.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es A939572 , CAY-10566 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, A939572 y/o CAY-10566.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, A939572 y/o MF-438.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, A939572 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, A939572 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, CAY-10566 y/o MF-438.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, CAY-10566 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, CAY-10566 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, MF-438 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, MF-438 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA, CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es A939572 y/o CAY-10566.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es A939572 y/o MF-438.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es A939572 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es A939572 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es CAY-10566 y/o MF-438.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es CAY-10566 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es CAY-10566 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es MF-438 y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es MF-438 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es CVT-11127 y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es TOFA y/o CAY-10566.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es TOFA y/o MF-438.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD1 es TOFA y/o CVT-11127.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es TOFA y/o GSK-993.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es TOFA y/o MF-438.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es TOFA y/o A939572.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD es una secuencia de silenciamiento de ácido nucleico para un SCDl (por ejemplo, SCDl). El siRNA para SCDl es una secuencia de silenciamiento de ácido nucleico ejemplar.
Como se utiliza en la presente, el término "secuencia de silenciamiento de ácido nucleico" se refiere a un ácido nucleico (por ejemplo, RNA) que comprende una secuencia que es capaz de inhibir o "silenciar" específicamente la expresión de un gen objetivo (por ejemplo, SCDl). En ciertas modalidades, la secuencia de silenciamiento de ácido nucleico es capaz de prevenir el procesamiento completo (por ejemplo, la traducción completa y/o expresión) de una molécula de mRNA a través de un mecanismo de silenciamiento pos-transcripcional. Las secuencias de silenciamiento de ácido nucleico incluyen moléculas de RNA de no codificación, por ejemplo dúplexes de RNA que comprenden hebras emparejadas, asi como RNAs precursores de los cuales se pueden generar tales RNAs de no modificación pequeños. Las secuencias de silenciamiento de RNA ejemplares incluyen RNAs de doble hebra (dsRNAs) tales como siRNAs, miRNAs y shRNAs. En una modalidad, la secuencia de silenciamiento de ácido nucleico es capaz de inducir interferencia de RNA. En otra modalidad, la secuencia de silenciamiento de ácido nucleico es capaz de mediar la represión traduccional.
De acuerdo con una modalidad de la invención, la secuencia de silenciamiento de ácido nucleico es especifica al RNA objetivo (por ejemplo, SCDl) y no cruza un gen de inhibición o silenciamiento o una variante de empalme que exhibe 99% o menos homología global al gen objetivo, por ejemplo, menor que 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% de homología global al gen objetivo.
La interferencia de RNA se refiere a un proceso de silenciamiento génico pos-transcripcional específico de secuencia en animales mediado RNAs de interferencia corta (siRNAs).
La presencia de dcRNAs largas en células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III referida como dicer. El dicer se involucra en el procesamiento de dsRNA en piezas cortas de dsRNA conocidas como RNAs de interferencia cortas (siRNAs). Los RNAs de interferencia cortos derivados de la actividad de dicer son de manera típica aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos en longitud y comprenden aproximadamente dúplexes de 19 pares de bases. La respuesta de RNAi también caracteriza un complejo de endonucleasa, comúnmente referido como un complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC), que media la segmentación de RNA de una sola hebra que tiene secuencia complementaria a la hebra antisentido del dúplex de siRNA. La segmentación del RNA objetivo toma lugar en la parte media de la región complementaria a la hebra antisentido del dúplex de siRNA.
Por consiguiente, algunas modalidades de la invención contemplan el uso de dsRNA para regular hacia abajo la expresión de proteina del mRNA.
De acuerdo con una modalidad, el dsRNA es mayor que 30 bp. El uso de dsRNAs largos (es decir, dsRNA mayor que 30 bp) ha sido muy limitado debido a la creencia de que estas regiones más largas de RNA de doble hebra darán por resultado la inducción de la interferona y la respuesta de PKR. Sin embargo, el uso de dsRNAs largos puede proporcionar numerosas ventajas en que la célula puede seleccionar la secuencia se silenciamiento óptima que alivia la necesidad de probar numerosos siRNAs; dsRNAs largos permitirán librerías de silenciamiento que tengan menos complejidad que sería necesario para siRNAs; y, quizás más importantemente, el dsRNA largo podría prevenir las mutaciones de escape virales cuando se utilizan como terapéuticos.
Varios estudios demuestran que los dsRNAs largos se pueden utilizar para silenciar la expresión génica sin inducir la respuesta al estrés o causar efectos fuera del objetivo significativo [Strat y colaboradores, Nucleic Acids Research, 34:3803-3810 (2006); Bhargava y colaboradores, Brain Res. Protoc. 13:115-125 (2004); Diallo y colaboradores, 01igonucleotid.es 13:381-392 (2003); Paddison y colaboradores, PNAS 99:1443-1448 (2002); Tran y colaboradores, FEBS Lett . 573:127-134 (2004)].
En particular, la invención de acuerdo con algunas modalidades de la misma contempla la introducción de dsRNA largo (sobre 30 transcriptos de base) para el silenciamiento génico en células donde las rutas de interferona no es activada (por ejemplo, células embriónicas y oocitos) - ver por ejemplo Billy y colaboradores [ PNAS 98:14428-14433 (2001)] y Diallo y colaboradores [Oligonucleotides 13:381-392 (2003)].
La invención de acuerdo con algunas modalidades de la misma también contempla la introducción de dsRNA largo específicamente diseñado que no induce la ruta de interferona y PKR para regular hacia abajo la expresión génica. Por ejemplo, Shinagwa e Ishii [Genes & Dev. 17:1340-1345 (2003)] han desarrollado un vector, nombrado pDECAP, para expresar RNA de doble hebra largo a partir de un promotor de RNA polimerasa II (Pol II). Debido a que los transcriptos de pDECAP carecen de tanto la estructura de 5'-terminación y el extremo de 3'-poli(A) que facilitan la exportación de ds-RNA al citoplasma, el ds-RNA largo de pDECAP no induce la respuesta de interferona.
Otro método para evadir las rutas de interferona y PKR en sistemas mamíferos es mediante la introducción de RNAs inhibidores pequeños (siRNAs) ya sea por la via de la transfección o la expresión endógena.
El término "siRNA" se refiere a dúplexes de RNA inhibidores pequeños (generalmente entre 18-30 pares de bases) que inducen la ruta de interferencia de RNA (RNAi). Típicamente, los siRNAs se sintetizan químicamente como 21mers con una región de dúplex de 19 bp central y 3'-colgantes de 2 bases simétricas en las terminales, aunque se ha descrito que los dúplexes de RNA químicamente sintetizados de longitud de 25-30 bases puede tener tanto como un incremento de 100 veces en potencia comparado con los 21mers en la misma ubicación. La potencia incrementada observada, obtenida utilizando RNAs más largos en la activación de RNAi se plantea como teoría que da por resultado la provisión de Dicer con un substrato (27mer) en lugar de un producto (21mer) y que esto mejora la velocidad o eficiencia de entrada del dúplex siRNA en RISC.
Se ha encontrado que la posición del 3'-colgante influye en la potencia de un siRNA y dúplexes asimétricos que tiene un 3'-colgante en la hebra de antisentido son generalmente más potentes que aquellos con el 3'-colgante en la hebra de sentido (Rose y colaboradores, 2005). Esto se puede atribuir a la hebra asimétrica que carga en RISC, ya que los patrones de eficacia opuestos se observan cuando se dirige el transcripto antisentido.
Las hebras de un RNA de interferencia de doble hebra (por ejemplo, un siRNA) se pueden conectar para formar una estructura de horquilla o tronco-bucle (por ejemplo, un shRNA). De esta manera, como se mencionó, la secuencia de silenciamiento del ácido nucleico de algunas modalidades de la invención también puede ser un RNA de horquilla corto (shRNA).
El término "shRNA", como se utiliza en la presente, se refiere a un agente de RNA que tiene una estructura de tronco-bucle, que comprende una primera y segunda región de la secuencia complementaria, el grado de complementariedad y orientación de las regiones que es suficiente tal que el emparejamiento de base ocurre entre las regiones, la primera y segunda regiones que son unidas por una región de bucle, el bucle que resulta de una falta de emparejamiento de base entre los nucleótidos (o análogos de nucleótidos) dentro de la región de bucle. El número de nucleótidos en el bucle es un número entre y que incluye 3 a 23 o 5 a l5 o 7 a l3 o 4 a 9 o 9 a 11. Algunos de los nucleótidos en el bucle se puede, involucrar en interacciones de par de base con otros nucleótidos en el bucle. Ejemplos de secuencias de oligonucleótido que se pueden utilizar para formar el bucle incluyen 5'-UUCAAGAGA-3' [Brummelkamp y colaboradores, Science 296:550 (2002)] y 5'-UUUGUGUAG-3' [Castanotto y colaboradores RNA 8:1454 (2002)]. Será reconocido por uno de habilidad en la téenica que el oligonucleótido de una sola cadena resultante forma una estructura de tronco-bucle u horquilla que comprende una región de doble hebra capaz de interactuar con la maquinaria de RNAi.
La síntesis de secuencias de silenciamiento de ácido nucleico adecuadas para el uso con algunas modalidades de la invención se puede efectuar como sigue. Primero, la secuencia de mRNA objetivo se escanea corriente abajo del codón de inicio AUG para secuencias de dinucleótido AA. La ocurrencia de cada AA y los 19 nucleótidos 3' adyacentes se registra como sitios objetivo de siRNA potenciales. De preferencia, los sitios objetivo de siRNA se seleccionan de la estructura de lectura abierta, ya que las regiones no traducidas (UTRs) son más ricas en sitios de enlace de proteina reguladores. Las proteínas de enlace de UTR y/o complejos de iniciación de traducción pueden interferir con el enlace del complejo de endonucleasa siRNA [Tuschl, ChemBiochem. 2:239-245 (2001)]. Será apreciado aunque, que si los siRNA dirigidos en las regiones no traducidas también puede ser efectivos, como es demostrado para GAPDH en donde siRNA dirigido en el 5' UTR medió aproximadamente 90% de disminución de mRNA de GAPDH celular y completamente anuló el nivel de proteina.
Segundo, los sitios objetivo potenciales se comparan con una base de datos genómica apropiada (por ejemplo, humano, ratón, rata, etc.) utilizando cualquier software de alineación de secuencia, tal como el software BLAST disponible en el servidor NCBI. Los sitios objetivo putativos que exhiben homología significativa a otras secuencias de codificación son filtrados.
Las secuencias objetivo de calificación se seleccionan como plantilla para la síntesis de siRNA. Las secuencias preferidas son aquellas que incluyen un bajo contenido de G/C ya que estas se han probado que son más efectivas en mediar el silenciamiento génico como es comparado con aquellas con contenido de G/C más alto que 55%. Varios sitios objetivo de preferencia se seleccionan a lo largo de la longitud del gen objetivo para la evaluación. Para mejor evaluación de los siRNAs seleccionados, un control negativo de preferencia se utiliza en conjunción. El siRNA de control negativo de preferencia incluye la misma composición de nucleótido como los siRNAs pero carece de homología significativa al genoma. De esta manera, una secuencia de nucleótido enmarañada del siRNA se utiliza de preferencia, siempre y cuando no exhiba cualquier homología significativa a cualquier otro gen.
Será apreciado que la secuencia de silenciamiento de ácido nucleico de algunas modalidades de la invención, no necesitan ser limitadas a esas moléculas que contienen únicamente RNA, sino que además abarca nucleótidos químicamente modificados y no nucleótidos.
En algunas modalidades, la secuencia de silenciamiento de ácido nucleico proporcionada en la presente puede ser funcionalmente asociada con un péptido penetrante de célula. Como se utiliza en la presente, un "péptido penetrante de célula" es un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos corta (aproximadamente 12-30 residuos) o motivo funcional que confiere las propiedades de translocación independientes de energía (es decir, no endocitótica) asociadas con el transporte del complejo de membrana-permeable a través del plasma y/o membrana nucleares de una célula. El péptido penetrante de célula utilizado en el complejo permeable de membrana de algunas modalidades de la invención de preferencia comprende por lo menos un residuo de cisteína no funcional, que está ya sea libre o derivada para formar un enlace de disulfuro con un ácido ribonucleico de doble hebra que ha sido modificado para tal enlace. Los motivos de aminoácidos representativos que confieren tales propiedades se lista en la Patente de los Estados Unidos No. 6,348,185, los contenidos de las cuales se incorporan expresamente en la presente por referencia. Los péptidos penetrantes de células de algunas modalidades de la invención de preferencia incluyen, pero no están limitados a, penetratina, transportan, plsl, TAT(48-60), pVEC, MTS y MAP.
De acuerdo con algunas modalidades la secuencia de silenciamiento de ácido nucleico es una miRNA.
El término "microRNA", "miRNA" y "miR" son sinónimos y se refieren a una colección de moléculas de RNA de una sola hebra de no codificación de aproximadamente 19-28 nucleótidos en longitud, que regulan la expresión génica. Los miRNAs se encuentran en una amplia variedad de organismos y se han mostrado que desempeñan una función en el desarrollo, homeostasis y etiología de la enfermedad.
De acuerdo con algunas modalidades la secuencia de silenciamiento de ácido nucleico es una imitación de microRNA.
El término "imitación de microRNA" se refiere a RNAs de no codificación sintéticos que son capaces de introducir la ruta de RNAi y regular la expresión génica. Las imitaciones de miRNA imitan la función de microRNAs endógenos (miRNAs) y se pueden diseñar como moléculas de doble hebra maduraos o precursores de imitación (por ejemplo, o pre-miRNAs). Las imitaciones de miRNA pueden estar comprendidas de RNA modificado o no modificado, DNA, híbridos de RNA-DNA, o químicas de ácido nucleico alternativo (por ejemplo, LNAs o ácidos nucleicos con puente de 2'-0,4'-C-etileno (ENA)). Para imitaciones de miRNA de doble hebra, maduras, la longitud de la región de dúplex puede variar entre 13-33, 18-24 o 21-23 nucleótidos. El miRNA también puede comprender un total de por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. La secuencia de miRNA puede ser los primeros 13-33 nucleótidos del pre-miRNA. La secuencia del miRNA también puede ser los últimos 13-33 nucleótidos del pre-miRNA. La preparación de imitaciones de miRNAs se puede efectuar mediante métodos de síntesis química o por métodos recombinantes.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCDl es un compuesto como es descrito en la presente (por ejemplo, un compuesto PluriSIn descrito en la presente). PluriSIns #1 (N'-fenilhidrazida de ácido isonicotinico) y #6 (4-metil-N'-fenilhidrazida de ácido (2-hidroxi-2-(tiofen-2-il)-2-fenilacético) son inhibidores de SCD ejemplares.
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD es un compuesto de la Fórmula II (como es descrito en la presente) y/o un compuesto de la Fórmula I (como es describe en la presente), en donde R2 de la Fórmula I se selecciona del grupo que consiste de 2-metilbenzofuran-3-ilmetilenamino, -NH-R5 (como se define en la presente), y 4-clorobenzamido. Tales compuestos comprenden una porción de fenilhidrazina, una estructura que está asociada con la inhibición de SCD, como es ejemplificado en la sección de Ejemplos en la presente.
En algunas de estas modalidades, R2 se selecciona del grupo que consiste de -NH-R5 (como se define en la presente) y 4-clorobenzamido. En algunas de estas modalidades, R2 se selecciona del grupo que consiste de 2-metilbenzofuran-3-ilmetilenamino y -NH-R5 (como se define en la presente). En algunas de estas modalidades, R2 es -NH-R5.
Los inhibidores de SCD adicionales que son adecuados para el uso de acuerdo con modalidades de la invención incluyen, por ejemplo, análogos de substrato de ácido tia-grasos (por ejemplo, ácido 9-tiaesteárico) tal como es descrito por Behrouzian y Buist [ Prostaglandins , Leukotrienes and Essential Fatty Acids 68:107-112 (2003)]; ácidos grasos ciclopropenoides (por ejemplo, ácido estercúlico (ácido 8-(2-octilciclopropenil)octanoico) y ácido malválico (ácido 7-(2-octilciclopropenil)heptanoico)) tal como es descrito por Raju y Reiser [J Biol Chem 242:379-384 (1967)]; isómeros de ácido graso de cadena larga conjugados tal como es descrito por Park y colaboradores [Biochim Biophys Acta 1486:285-292 (2000)]; inhibidores de SCD1 de molécula pequeña tal como es descrito por Liu y colaboradores, [J Med Chem 50:3086-3100 (2007)] por Zhao y colaboradores, [ Bioorg Med Chem Le tt 17:3388-3391 (2007)] y por Xin y colaboradores, [Bioorg Med Chem Lett 18:4298-4302 (2008)]; e inhibidores de SCD como es descrito en las Solicitudes de Patentes Internacionales que tienen números de publicación. WO 2005/011653, WO 2005/011654, WO 2005/011655, WO 2005/011656, WO 2005/011657, WO 2006/014168, WO 2006/034279, WO 2006/034312, WO 2006/034315, O 2006/034338, WO 2006/034341, WO 2006/034440, O 2006/034441, WO 2006/034446, WO 2006/086445, WO 2006/086447, WO 2006/101521, WO 2006/125178, WO 2006/125179, WO 2006/125180, WO 2006/125181, WO 2006/125194, WO 2007/044085, WO 2007/046867, WO 2007/046868, WO 2007/050124, WO 2007/130075, WO 2007/136746, WO 2008/074835, WO 2008/074835, WO 2008/074824, WO 2008/036715, WO 2008/044767, WO 2008/029266, WO 2008/062276, WO 2008/127349, O 2006/130986, WO 2007/009236, WO 2007/056846, WO 2007/071023, WO 2007/134457, WO 2007/143823, O 2007/143824, WO 2008/017161, WO 2008/046226, O 2008/064474, WO 2008/003753, O 2007/143697, WO 2008/024390, WO 2008/096746 y WO 2008/056687, y en la Solicitud de Patente de Estados Unidos número 2008/0182838 y por Liu [Expert Opinión on Therapeutic Patents 19:1169-1191 (2009)]. En algunas modalidades, un inhibidor de SCD es un oligonucleótido anti-sentido, por ejemplo un oligonucleótido adecuado para efectuar la interferencia de RNA de SCD-1, como es descrito por Morgan-Lappe y colaboradores, [ C ncer Research 67:4390-4398 (2007)].
Las enseñanzas de todos los documentos citados en lo anterior se incorporan por referencia como si se expusieran completamente en la presente.
Se espera que durante la vida de una patente que sale de esta solicitud muchos inhibidores de SCD de relevantes (por ejemplo, inhibidores de SCD1) sean desarrollados y el alcance del término "inhibidor de SCD" se propone para incluir todas las nuevas teenologías a priori .
En algunas modalidades, el contacto de las células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes) con el inhibidor de SC se efectúa in vitro (por ejemplo, como es descrito en la presente con respecto a los compuestos descritos en la presente).
En algunas modalidades, el contacto se efectúa ex vivo (por ejemplo, como es descrito en la presente con respecto a los compuestos descritos en la presente).
En algunas modalidades, el inhibidor de SCD (como es descrito en cualquiera de los aspectos de la invención) es un compuesto descrito la presente. En algunas modalidades, el compuesto que comprende una porción de fenilhidrazina sustituida o no sustituida y/o es un derivado de una fenilhidrazina sustituida o no sustituida.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un uso de un compuesto descrito en la presente (por ejemplo un inhibidor de SCD descrito en la presente) en el tratamiento de una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con células proliferantes caracterizado por una sensibilidad a la inhibición de SCD.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un uso de un compuesto descrito en la presente (por ejemplo un inhibidor de SCD descrito en la presente) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con células proliferantes caracterizadas por una sensibilidad a la inhibición de SCD.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con células proliferantes caracterizadas por una sensibilidad a la inhibición de SCD, que se efectúa al poner en contacto las células no diferenciadas con un compuesto descrito en la presente (por ejemplo un inhibidor de SCD descrito en la presente). En algunas modalidades, las células no diferenciadas son células madre pluripotentes.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto descrito en la presente (por ejemplo un inhibidor de SCD descrito en la presente) y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, tal 9 composición se formula, se identifica para el uso y/o se empaqueta como es descrito en la presente.
En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno proliferativo asociado con células proliferantes caracterizadas por una sensibilidad a la inhibición de SCD es un cáncer.
Como se ejemplifica adicionalmente en la presente, los presentes inventores han descubierto una téenica novedosa y eficiente para identificar compuestos para inhibir células no diferenciadas, que se puede utilizar, por ejemplo, como candidatos principales en una búsqueda para inhibidores útiles de células no diferenciadas.
De esta manera, de acuerdo con otro aspecto de las modalidades de la invención, se proporciona, un método para identificar un candidato principal para inhibir células no diferenciadas, el método que comprende: (a) proporcionar una pluralidad de muestras de células no diferenciadas, cada una de las muestras que comprende un tipo diferente de células no diferenciadas; (b) poner en contacto las muestras con un compuesto candidato; y (c) monitorear una viabilidad de las células no diferenciadas en las muestras, mediante lo cual la viabilidad se reduce en por lo menos dos de las muestras, el compuesto candidato se identifica como capaz de inhibir células no diferenciadas, para de esta manera identificar el candidato principal.
En modalidades ejemplares, las células no diferenciadas son células madre pluripotentes, el método que es para identificar un candidato principal para inhibir células madre pluripotentes.
En algunas modalidades, la pluralidad de muestras de células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes) comprende por lo menos tres muestras. En algunas modalidades, la pluralidad de muestras de células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes) comprende por lo menos cuatro muestras. En algunas modalidades, la pluralidad de muestras de células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes) comprende por lo menos cinco muestras.
En algunas modalidades, la viabilidad se reduce en por lo menos tres de las muestras de células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes). En algunas modalidades, la viabilidad se reduce por lo menos cuatro de las muestras. En algunas modalidades, la viabilidad se reduce por lo menos cinco de las muestras.
En algunas modalidades, la viabilidad se reduce en todas las muestras de células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes) o en todas las muestras excepto para una muestra. En algunas modalidades, la viabilidad se reduce en todas las muestras.
En algunas modalidades, el método es para identificar un candidato principal para inhibir selectivamente células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes), el método que además comprende: (d) proporcionar por lo menos una muestra de células diferenciadas; (e) poner en contacto la por lo menos una muestra con el compuesto identificado como capaz de reducir una población de células no diferenciadas (por ejemplo, una población de células madre pluripotentes); y (f) monitorear una viabilidad de las células diferenciadas en la por lo menos una muestra, mediante lo cual si la viabilidad se mantiene en la por lo menos una muestra, el compuesto se identifica como capaz de inhibir selectivamente células no diferenciadas (por ejemplo, células madre pluripotentes).
En algunas modalidades, el compuesto se pone en contacto con una pluralidad de muestras de células diferenciadas. En algunas modalidades, la pluralidad de muestras de células diferenciadas comprende por lo menos tres muestras. En algunas modalidades, la pluralidad de muestras de células diferenciadas comprende por lo menos cuatro muestras. En algunas modalidades, la pluralidad de muestras de células diferenciadas comprende por lo menos cinco muestras. En algunas modalidades, la pluralidad de muestras de células diferenciadas comprende por lo menos seis muestras. En algunas modalidades, la pluralidad de muestras de células diferenciadas comprende por lo menos siete muestras. En algunas modalidades, la pluralidad de muestras de células diferenciadas comprende por lo menos ocho muestras.
En algunas modalidades, la viabilidad se reduce en ninguna de las muestras de células diferenciadas, excepto por una muestra. En algunas modalidades, la viabilidad se reduce en ninguna de las muestras.
Las células no diferenciadas adecuadas (por ejemplo, células madre pluripotentes, células de cáncer no diferenciadas) y células diferenciadas se describen en los Ejemplos enseguida.
En algunas modalidades, las células diferenciadas se derivan de las células no diferenciadas (por ejemplo, mediante diferenciación de células madre pluripotentes y/o células de cáncer no diferenciadas) o viceversa (por ejemplo, mediante inducción de pluripotencia y/o malignidad de células diferenciadas).
En algunas modalidades, una pluralidad de compuestos candidatos se prueba como es descrito en la presente. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 5 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 10 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 20 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 50 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 100 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 200 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 500 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 1000 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 2000 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 5000 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 10000 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 20000 compuestos candidatos. En algunas modalidades, se prueban por lo menos 50000 compuestos candidatos.
El monitoreo de la viabilidad se puede realizar de acuerdo con téenicas conocidas en el arte, por ejemplo, un ensayo descrito en la presente.
En algunas modalidades, la viabilidad se monitorea utilizando un ensayo espectroscópico de viabilidad de células. Los ensayos espectroscópicos pueden proporcionar una habilidad para ensayar muchas muestras (por ejemplo, diferentes tipos de células y/o diferentes compuestos candidatos) de una manera eficiente y no costosa.
Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluye pero no limitado a".
El término "consiste de" significa "que incluye ilimitado a" .
La palabra "ejemplar" se utiliza en la presente para dar a entender "que sirve como un ejemplo, caso o ilustración". Cualquier modalidad descrita como "ejemplar" necesariamente no se va considerar como preferida o ventajosa sobre otras modalidades y/o excluir la incorporación de características de otras modalidades.
La palabra "opcionalmente" se utiliza en la presente para dar a entender "se proporciona en algunas modalidades y no se proporcionada en otras modalidades". Cualquier modalidad particular de la invención puede incluir una pluralidad y características "opcionales" a menos que tales características entre en conflicto.
Como se utiliza en la presente, la forma singular "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "por lo menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.
Por toda esta solicitud, varias modalidades de esta invención se pueden presentar en un formato de intervalo. Se debe entender que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no se debe considerar como una limitación inflexible sobre el alcance de la invención. Por consiguiente, la descripción de un intervalo se debe considerar que ha divulgado específicamente todos los subintervalos posibles así como valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 debe ser considerada que tiene subintervalos específicamente descritos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto aplica sin considerar la amplitud del intervalo.
Cada vez que un intervalo numérico se indica en la presente, se propone para incluir cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las frases "que varía/varía entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que varía/varía desde" un primer número indicado "a" un segundo número indicado como se utiliza en la presente intercambiablemente y se proponen para incluyen el primero y segundo números indicados y todos los números fraccionarios y enteros entre los mismos.
Como se utiliza en la presente, el término "método" se refiere a maneras, medios, téenicas y procedimientos para realizar una tarea dada que incluye pero no limitado a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos ya sean conocidos, o fácilmente desarrollados de las maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los profesionales de las técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas y médicas.
Como se utiliza en la presente, los términos "tratar", "que trata", "tratamiento" y los similares incluyen la anulación, sustancialmente la inhibición, retardo o reversión de la progresión de una condición, sustancialmente aminorando los síntomas clínicos o estéticos de una condición o sustancialmente previniendo la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una condición.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que son, por claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una sola modalidad. A la inversa, varias características de la invención, que son, por brevedad, descritas en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como sea adecuado en cualquier otra modalidad descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de varias modalidades no se van considerar características esenciales de esas modalidades, a menos que la modalidad sea no funcional sin esos elementos.
Varias modalidades y aspectos de la presente invención como son delineados anteriormente en la presente y como es reclamado en la sección de reivindicaciones encuentran soporte experimental en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS La referencia ahora se hace a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas modalidades de la invención en un aspecto no limitante.
MATERIALES Y MÉTODOS Materiales: D939572 se obtuvo de BioFine International (Vancouver, Canadá); activina A se obtuvo de R&D Systems; clorhidrato de amsacrina se obtuvo de Sigma- Aldrich; albúmina de suero bovina se obtuvo de Sigma- Aldrich; CAY 10566 se obtuvo de Cayman Chemical; 2',7'-diclorofluoresceína se obtuvo de Sigma- Aldrich; cloroformo se obtuvo de Sigma-Aldrich; ditiotreitol (DTT) se obtuvo de Bio-Lab (Israel); DMEM (medio de Eagle modificado de Dulbecco) se obtuvo de Sigma-Aldrich; el medio de DMEM/F12 (1:1) se obtuvo de Sigma- Aldrich; DMSO (sulfóxido de dimetilo) se obtuvo de Sigma- Aldrich; suero bovino fetal se obtuvo de Biological Industries (Beit Haemek, Israel); FGF-2 (factor de crecimiento de fibroblasto 2) se obtuvo de PeproTech; solución Folch se obtuvo de Sigma-Aldrich; sulfato de geneticina G418 se obtuvo de GIBCO; glutamina se obtuvo de Biological Industries (Beit Haemek, Israel); glutardialdehido se obtuvo de Sigma-Aldrich; hCG (gonadotropina coriónica humana) se obtuvo de Sigma-Aldrich; isopropanol se obtuvo de Sigma-Aldrich; el medio DMEM inactivado se obtuvo de Invitrogen; el reemplazo de suero inactivado se obtuvo de Invitrogen; factor inhibidor de leucemia (LIF) se obtuvo de Invitrogen; b-mercaptoetanol se obtuvo de Sigma-Aldrich; medio M2 se obtuvo de Sigma-Aldrich; medio M16 se obtuvo de Sigma-Aldrich; matriz MatrigelMR se obtuvo de BD Biosciences; metanol se obtuvo de Sigma-Aldrich; metionina se obtuvo de Biological Industries (Beit Haemek, Israel); azul de metileno se obtuvo de Sigma Aldrich; aceite mineral se obtuvo de Sigma-Aldrich; el medio definido mTeSRl se obtuvo de STEMCELL Technologies (Vancouver, Canadá); n-hexano se obtuvo de Sigma-Aldrich; aminoácidos no esenciales se obtuvieron de Invitrogen; ácido oleico ([1-14C]-marcado y no marcado y ácido oleico-albúmina) se obtuvo de Sigma-Aldrich; penicilina se obtuvo de Biological Industries (Beit Haemek, Israel); PMSG (gonadotropina de suero de madre embarazada) se obtuvo de Sigma-Aldrich; puromicina se obtuvo de Sigma-Aldrich; ácido retinoico se obtuvo de Sigma-Aldrich; medio RPMI-1640 se obtuvo de Invitrogen; metionina marcada con S35 se obtuvo de Izotop (Hungría); leche descremada (polvo) se obtuvo de Difeo; butirato de sodio se obtuvo de Sigma-Aldrich; piruvato de sodio se obtuvo de Sigma-Aldrich; ácido esteárico marcado con ([1—14C] y no marcado) se obtuvo de Sigma-Aldrich; estreptomicina se obtuvo de Biological Industries (Beit Haemek, Israel); ácido tricloroacético se obtuvo de Merck Millipore; Tritón X-100 se obtuvo de Sigma-Aldrich; tripsina-EDTA se obtuvo de Biological Industries (Beit Haemek, Israel); Z-VAD-FMK se obtuvo de Santz Cruz Biotechnology.
Líneas de células: fibroblastos BJ (inmortalizados) se obtuvieron de Clontech Laboratories; células madre pluripotentes inducidas con BJ-ÍPS28 se derivaron como es descrito en Pick y colaboradores [Stem Cells 27:2686-2690 (2009)]; células madre embriónicas humanas CSES2 se derivaron como es descrito en Lavon y colaboradores [Stem Cells 26:1874- 1882 (2008)]; células madre embriónicas CSES2-S02/3 se derivaron como es descrito en Kopper & Benvenisty [Stem Cells Research 8:335-345 (2011)]; hepatocitos derivados de células madre embriónicas humanas se obtuvieron de Cellartis (Goteborg, Sweden) y se manejaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante; cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas se obtuvieron de Cellular Dynamics International (Madison, WI) y se manejaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante; células madre embriónicas humanas Mel-1 se obtuvieron de Millipore.
Cultivo de células: Las lineas de células madre embriónicas (ES) humanas H9 (Thomson y colaboradores Science 282:1145-1147 (1998)], CSES2, CSES2-S02/3 y Mel-1 y la linea de células madre pluripotentes inducidas (iPS) BJ-ÍPS28, se cultivaron sin células alimentadoras en cajas de cultivo de tejido de 10 cm CELLSTAR® (Greiner Bio-One) pre-recubiertas con MatrigelMR, utilizando el medio definido de mTeSRl suplementado con penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 mg/ml). Las células se sometieron a pasaje utilizando AccutaseMR (Millipore).
La linea de células de neuroblastoma Kelly se cultivó en el medio RPMI-1640, suplementado con suero bovino fetal al 15% (FBS), penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 pg/ml).
La linea de células de hepatocarcinoma Huh-7 se cultivó en un medio DMEM/F12 (1:1), suplementado con FBS al 10%, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 mr/pi?).
La línea de células de carcinoma cervical HeLa, línea de células de teratocarcinoma NTERA-2 y la línea de células de fibroblasto BJ inmortalizadas, se cultivaron en DMEM suplementado con FBS al 10%, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 mg/ml).
Las células madre embriónicas CSES2-S02/3 se diferenciaron a progenitores endodérmicos utilizando un protocolo establecido [Duan y colaboradores, Stem Cells 28:674-686 (2010)]. Las células no diferenciadas se sembraron a una densidad de 10,000 células/cm2 sobre placas recubiertas de MatrigelMR, con el medio mTeSRl. Al siguiente día (día 1), el medio se reemplazó con RPMI-1640 libre de suero, suplementado con glutamina 2 mM, 100 ng/ml de Activina A 60 mg/ml de sulfato de geneticina G418 y 0.3 g/ml de puromicina. A partir del día 3 al día 8, el mismo medio también se suplemento con el suplemento lxB27 (Invitrogen) y butirato de sodio 0.5 M. La identidad celular de las células como progenitores endodérmicos se verificó al cuantificar el porcentaje de células SOX17+ verdes, y el porcentaje de células CXCR4+, utilizando un sistema de citometría de flujo Guava® EasyCyteMR Plus (Millipore). La validación adicional se obtuvo mediante el manchado de fluorescencia de las células con un anticuerpo contra el marcador de superficie endodérmico temprano CXCR4 (anticuerpo CXCR4-PE, 1:25; BD Biosciences). El porcentaje de células CXCR4+ también se cuantificó utilizando el sistema de citometria de flujo Guava® EasyCyteMR Plus.
Las células ES humanas (SA001) se diferenciaron a células madre neurales (NSCs) utilizando un protocolo de inhibición de SMAD doble como es descrito en Chambers y colaboradores, [ Nature Biotechnology 27:275-280 (2009)]. El protocolo para generación de células progenitoras neurales a partir de hPSCs (STEMCELL Technologies) se ajustó a aquel de los agregados de modo que los agregados neuronales estuvieron comprendidos de hasta 5,000 células; el medio de inducción de células neuroepiteliales fue N2B27 (Invitrogen), suplementado con SB431542 10 mM al 0.2% (Tocris), Noggin humana al 0.2% 133 mr/pi? (PeproTech) y FGF-2 humana 10 mr/ih? al 0.05%.
Las células ES humanas (SA001) se diferenciaron a las células madre mesenquimales (MSCs) utilizando un protocolo tal como es descrito en Lai y colaboradores, [Methods Mol Biol 698:141-150 (2011)]. El protocolo se ajustó a aquellas de modo que las células se cultivaron durante 10-15 dias con DMEM inactivado, FBS al 20%, aminoácidos no esenciales al 1%, Glutamax al 1% (Invitrogen), penicilina al 0.1% y estreptomicina, b-mercaptoetanol al 0.1%, FGF-2 10 mg/ml al 0.1% y 2-fosfato de ácido ascórbico al 1% (100 mM). Las células se sometieron a pasaje 3-6 veces para obtener un fenotipo estable.
Las células madre embriónicas de ratón R1 Oct4-GFP [Yeom y colaboradores, Development 122:881-894 (1996)] se cultivaron sobre placas recubiertas de gelatina con DMEM, FBS al 15%, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales 0.1 mM, b-mercaptoetanol 0.1 mM y el factor inhibidor de leucemia 1000 U/ l (LIE).
Calcificación de Librería Química: El ensayo de viabilidad de células luminiscente CellTiter-Glo® (Promega, Madison, WI) se implemento como un ensayo de clasificación de alto rendimiento (HTS) para una clasificación de librería química en un formato de 384 cavidades. Después de que se estimó la tolerancia de DMSO del ensayo, y los números de células óptimas se determinaron para cada tipo de célula, una clasificación piloto se realizó con los siguientes 50 compuestos comercialmente disponibles: 3-acetamidofenol, 4-acetamidofenol, 6-metilcoumarina, acetaminofén, acetazolamida, actidiona, clorhidrato de amantadina, ácido aminosalicílico, amodiaquina, clorhidrato de amsacrina, aztreonam, cafeína, carboplatino, cefamandol sódico, ácido cólico, ciprofloxacina, clozapina, coumarina, crotalina, diflunisal, dopamina, doxicielina, eritromicina, estradiol, famotidina, fenofibrato, acetato de fludrocortisona, gentamicina, imipramina, isoniazid, isoproterenol, kanamicina, cetoconazol, L-tiroxina, ácido mefenámico, nadolol, hidrato de clorhidrato de nalbufina, nizatidina, norepinef riña, fenobarbital, clorhidrato de quinina, salicilato, 2-mercapto-etanosulfonato de sodio, sulfasalazina, sulindac, tetracielina, disulfuro de tetraetiltiarum, maleato de timolol, ácido valproico sódico y WY- 14643.
Para una clasificación primaria, una librería de clasificación de 52,448 compuestos ensamblada con compuestos internos de Roche (referido como la librería "dorada") se probó en un formato de 384 cavidades. Los compuestos se distribuyeron en placas de 384 cavidades (352 compuestos por placa) como 0.5 ml de soluciones de DMSO 4 mM. Para clasificaciones de confirmación, contra clasificaciones y clasificaciones de perfilado de compuesto, compuestos que se definieron como "acierto" se obtuvieron de un inventario de compuestos patentados de Roche y se distribuyeron en un formato de 384 cavidades como 8 ml de soluciones DMSO 5 mM. 5,000 células CSES2 se colocaron en 50 m? por cavidad del medio mTeSRl en placas de fondo claro de 384 cavidades negras (Falcón BD) pre-recubiertas con MatrigelMR utilizando el dispensador de células WellMate (Matrix, Hudson, NH). 24 horas después de la colocación, el medio de reemplazó con 25 m? de medio fresco y 25 m? de soluciones del medio de compuesto 40 mM en DMSO al 1% de las placas de dilución de compuesto intermedias. Las placas se incubaron a 37°C, en una atmósfera de CO2 al 5%, por la duración completa de la clasificación, aparte del tiempo requerido para el manejo de liquido. La viabilidad de células se determinó 24 horas después del tratamiento con el compuesto utilizando equipos de ensayo de viabilidad de células luminiscentes CellTiter-Glo®. 50 ml del reactivo CellTiter-Glo® se adicionó a cada cavidad de las placas de ensayo y se mezcló completamente. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 15 minutos, 25 ml de liquido se transfirió de cada cavidad en una placa de 384 cavidades de fondo opaco blanco (PerkinElme ) y la luminiscencia se midió utilizando el lector de placas EnVision® (PerkinElmer).16 cavidades de control neutra (DMSO al 0.5%) y 8 cavidades de control positiva (clorhidrato de amsacrina 5 mM se utilizaron para normalizar el efecto del compuesto. Todas las etapas de transferencia de líquidos se manejaron con una Estación de Trabajo de Automatización de Laboratorio Biomek® FXP (Beckman Coulter, Fullerton, CA) y el dispensador de líquido Multidrop Combi (Thermo Fisher, Waltham, MA). Un Analizador de Ensayo (Genedata, Basel, Switzerland) se utilizó para la corrección del patrón de datos y el cálculo. El software Spotfire (Spotfire, Somerville, MA) se utilizó para la ilustración de datos.
Los compuestos identificados como aciertos de la clasificación primaria se volvieron aprobar en una concentración de 20 mM contra tres líneas de células madre pluripotentes (CSES2, H9 y CSES2-S02/3) para clasificaciones de confirmación . 696 aciertos confirmados de la clasificación de confirmación se probaron para el perfilado en un panel de 13 tipos de células diferentes, utilizando el mismo protocolo de clasificación descrito en lo anterior (excepto en el caso de células madre neurales derivadas de células madre embriónicas (NSCs) y células madre mesenquimales (MSCs), para el cual el protocolo se describe enseguida). Como se discute enseguida, los compuestos se probaron ya sea en una manera de concentración múltiple dependiente de dosis o en manera de una sola concentración. Las lineas de células CSES2 y CSES2-S02/3 y los progenitores endodérmicos tempranos derivados de esta linea de células (CSES2-S02/3-diferenciada) se clasificaron en 8 concentraciones que varían de 50 mM a 23 nM con 1:3 etapas de dilución seriales. La linea de células BJ-ÍPS28 y los fibroblastos BJ de los cuales se derivaron, se clasificaron en 6 concentraciones que varían de 50 mM a 200 nM con 1:3 etapas de dilución seriales. Los cardiomiocitos se clasificaron en una concentración de 20 mM. Las lineas de células HeLa y NTERA-2 se clasificaron por duplicado de 20 mM. Kelly y Huh-7 se clasificaron por triplicado de 20 mM. Los hepatocitos se clasificaron por duplicados de 20 mM en las placas de 96 cavidades originales en las cuales las células arribaron (40,000 células por cavidad, en 160 ml del medio, los volúmenes de todos los reactivos involucrados se ajustaron por consiguiente). MSCs y NSCs se clasificaron por duplicado de 12.5 mM.
MSCs y NSCs se colocaron en placas de fondo claro de 384 cavidades blancas (Corning Inc.) pre-recubiertas con poli-ornitina/laminina. Las células se sembraron a una densidad de 4,000 células por cavidad en 38 ml del medio. Después de la incubación durante 4 horas, 2 ml de compuestos pre-diluidos se adicionaron a las células a una concentración final de 12.5 mM con DMSO al 0.25%. Las células se incubaron con los compuestos durante 24 horas, luego 25 m? del medio se removió y 15 m? del reactivo CellTiter-Glo® se adicionaron a la placa. La señal de luminiscencia se lcyó dentro de una hora.
Los datos de intensidad en bruto para cada cavidad se corrigieron en antecedente mediante la sustracción de las intensidades medias a través de todas las cavidades de control positivas sobre la misma placa, y se utilizaron para calcular el efecto inhibidor de cada compuesto por línea de células. Un Analizador de Ensayo Genedata y Condoseo se utilizaron para la corrección del patrón de datos, el cálculo y el ajuste de la curva IC5o Un factor Z' se determinó para cada placa.
Manchado con fosfatasa alcalina, inmunocitoquímica e inmunomanchado : El manchado con fosfatasa alcalina se realizó de acuerdo con las instrucciones del Equipo de Fosfatasa Alcalina de Leucocitos (Sigma-Aldrich).
Para el manchado de inmunocitoquimica, las células se lavaron dos veces con PBS (solución salina amortiguadora de fosfato), se fijaron con PBS que contiene paraformaldehído al 4% (p/v) durante 30 minutos a temperatura ambiente, se permeabilizaron con Tritón X-100 al 0.2% y se bloquearon durante 2 horas con PBS que contiene albúmina de suero bovina (BSA) al 3% (p/v). El manchado con anticuerpos primarios se realizó con los siguientes anticuerpos (diluidos en solución amortiguadora bloqueante, como se indicado) : anti-Oct3/4 humana de ratón (IgG, 1:200, SantaCruz Biotechnology) , anti-NANOG humana de cabra (IgG, 1:100, R&D Systems). Las células se incubaron durante la noche a 4°C con anticuerpo primario, se lavaron y se incubaron con anticuerpos secundarios Alexa Flúor (Invitrogen) durante 2 horas.
Para el inmunomanchado, gel de poliacrilamida al 10% se utilizó para la separación y detección de la proteína. El gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa y la hibridación de anticuerpo y quimioluminiscencia se realizaron de acuerdo con procedimientos estándares. Los anticuerpos primarios en este análisis fueron anti-eIF2a fosforilada de conejo (1:250, Cell Signaling Technology), anti-caspasa 3 de conejo (1:1000, Cell Signaling Technology), anti b-catenina de ratón (1:10,000, BD Biosciences) y anti-a-tubulina de ratón (1:50,000, Sigma-Aldrich). Los anticuerpos secundarios anti-conejo y anti-ratón conjugados con peroxidasa de rábano picante se obtuvieron de Jackson Immunoresearch Laboratories. Aislamiento de RNA, transcripción inversa y PCR cuantitativa: El RNA total se extrajo utilizando el Equipo de Células Cultivadas de RNA PerfectPureMR (5 Prime). Un microgramo de RNA total se utilizó- para la reacción de transcripción inversa utilizando la transcriptasa inversa ImProm-IIMR (Promega). La PCR en tiempo real cuantitativa se realizó con 1 mg de RNA inversa transcripta a cDNA y la Mezcla Maestra de PCR Verde Poder SYBR® (Applied Biosystems) y se analizó con el Sistema de PCR de tempo real 7300 (Applied Biosystems). Las secuencias cebadoras para XBP1 empalmado (sXBPl) fueron ctgctgagtccgcagcaggtgca (delantero) y ggtccaagttgtccagaatgc (trasero); las secuencias cebadoras para RPB1 fueron tgcgcaccatcaagagagtc (delantero) y ctccgtcacagacattcgctt (control); las sondas Taqman para OCT4, NANOG y GAPDH fueron: Hs 00005111_gl, Hs 02387400_gl y Hs 99999905_ml, respectivamente.
Ensayos de viabilidad celular: Para las clasificaciones de alto rendimiento, el número de células relativo se determinó utilizando un Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo® como es descrito en lo anterior. De otra manera, los números de células relativos se determinaron al fijar las células con glutardialdehído al 0.5% y el manchado con azul de metileno disuelto en ácido bórico 0.1 M (pH 8.5). La extracción de color se realizó utilizando ácido clorhídrico 0.1 M, y el manchado (que es proporcional al número de células) se cuantificó al medir la absorbancia a una longitud de onda de 650 nm.
Análisis de FACS: Para la cuantificación de células progenitoras endodérmicas derivadas de célula madre embriónicas humanas, las células se disociaron con AccutaseMR (Millipore), filtrado con un colador de células de nylon de 40 mM (Falcón BD) y se lavaron dos veces con PBS. Las células disociadas se suspendieron a una concentración final de 105 células/ml. Las células se incubaron sobre hielo con el anticuerpo CXCR4-PE (1:25 dilución, BD Biosciences) durante 1 hora, se lavaron dos veces con PBS, se suspendieron en PBS con FBS al 2% y se analizaron utilizando un sistema de citómetro de flujo Guava® EasyCyteMR Plus (Millipore) con el software Guava® Express (Millipore).
Para la cuantificación de células no diferenciadas restante después del tratamiento, las células se trataron con PluriSIn #1, 20 mM (N-fenilhidrazida de ácido isonicotinico) durante 48 horas o 72 horas, se disociaron utilizando TrypLEMR Select (Invitrogen) y se lavaron con PBS suplementado con FBS al 10% y azida de sodio al 0.05%. Las células disociadas se suspendieron a una concentración final de 106 células/ml. Las células se incubaron sobre hielo con anticuerpo TRA1-60-PE (1:40, BD Biosciences), se lavó y se analizaron utilizando LSR II FACS (BD Biosciences) con el software FCS Express (De Novo Software, Los Ángeles, CA).
Para la cuantificación de apoptosis, se utilizó un Equipo de Detección de Apoptosis Annexin V-FITC (eBioscience). Las células se trataron con PluriSIn #1, 20 mM durante 16 horas, se disociaron utilizando TrypLEMR Select y se lavaron con PBS suplementado con FBS al 10% y azida de sodio al 0.05%. Las células disociadas se suspendieron a una concentración final de 2-5xl05 células/ml y se trataron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis se realizó utilizando LSR II FACS con el software FCS Express. Formación de imagen con microscopía: La formación de imagen de alto contenido de células fluorescentes CSES2-S02/3 (mCherry+ o EGFP+) se realizó en placas de ensayo de 384 cavidades de fondo claro negro (Falcón BD), utilizando la plataforma de formación de imagen de clasificación de alto contenido Opera (PerkinElmer). De otra manera, la formación de imagen de luz y de fluorescencia de todas las células se realizó en placas CELLSTAR® de 24 cavidades, 6 cavidades o 10 cm (Greiner Bio-One), utilizando una estación de formación de imagen Olympus CellR. La formación de imagen de luz de embriones de ratón en desarrollo se realizó en cajas de cultivo de 35 mm (Falcón BD) utilizando un microscopio Olympus 1X70.
Análisis de la expresión genios global: Células madre embriónicas humanas, y progenitores endodérmicos tempranos derivados de células madre embriónicas humanas, se trataron durante 12 horas con los compuestos PluriSIn #1 (N'-fenilhidrazida de ácido isonicotinico) o PluriSIn #6 (4-metil-N'-fenilhidrazida de ácido 2-hidroxi-2-(tiofen-2il)-2-fenilacético), o con el control de DMSO al 0.2%. El RNA total se extrajo utilizando un Equipo de Células Cultivadas de RNA PerfectPureMR (5 Prime) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se analizaron utilizando una plataforma de microarreglo de Human Genome U133A 2.0 (Affymetrix); el lavado y la exploración se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos del microarreglo originales son accesibles en la base de datos NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) bajo el acceso número GSE37040.
Los arreglos se normalizaron utilizando el algoritmo MAS5 en la Consola de Expresión Affymetrix. Los conjuntos de sondas ausentes en ambas de las condiciones de control y tratamiento se filtraron mediante el MAS5 Absent/Present cali. Los conjuntos de sondas con valores de expresión menores que 50 se elevaron a este nivel. Utilizando un umbral de 2 veces, una lista de genes diferencialmente expresados estuvo comprendida para cada par de condiciones: células madre embriónicas tratadas con PluriSIn #1 contra control, ESCs tratadas con PluriSIn #6 contra control y las células progenitoras endodér icas tratadas con PluriSIn #1 contra control.
Para detectar los procesos biológicos GO (ontologia génica) sobre-representados significativamente, las listas de genes diferencialmente expresados se sometieron a la herramienta de agrupación de anotación funcional DAVID (wwwdotdaviddotabccdotncifcrfdotgov).
Para descubrir las similitudes entre las alteraciones de expresión génica inducida por PluriSIns y aquellas inducidas por fármacos conocidos, las listas de genes diferencialmente expresados se sometieron a un análisis de mapa de conectividad (cmap), de acuerdo con las instrucciones del desarrollador (wwwdotbroadinstitutedotorg/cmap).
Las listas de genes diferencialmente expresados se utilizaron como entradas para la agrupación jerárquica no supervisada, realizada con la versión 6.3 de Partek Genomics Suite (Partek, St. Louis, MO).
Marcación metabólica de sintesis de proteína: Células madre embriónicas H9 se sembraron en placas de cultivo de tejido de 6 cavidades pre-recubiertas MatrigelMR a una densidad de 2xl05 células/cavidad, y se cultivaron utilizando el medio definido mTeSRl. Los fibroblastos BJ se sembradas en la placa de cultivo de tejido de 6 cavidades a la misma densidad, y se cultivaron con DMEM suplementado con FBS al 10%, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 mV/pi?). Las células se trataron durante 12 horas con ya sea PluriSIn #1, 20 mM (N'-fenilhidrazida de ácido isonicotinico) o con DMSO al 0.2%. Las células luego se lavaron con PBS, y se renovaron con el medio deficiente de metionina durante 1 hora. La marcación metabólica de la célula luego se realizó durante 1 hora con 10 m<3? de metionina marcada con S35 en 1 ml/cavidad, en la presencia de PluriSIn #1, 20 mM o DMSO al 0.2%. Las células se lavaron con PBS que contiene metionina 10 mM y luego se U saron en 0.4 mi de ácido tricloroacético (TCA) enfriado en hielo al 30% que contiene metionina 10 mM durante 15 minutos. Un pre-filtro de 3MM y un filtro de GF/C en la parte superior de éste se ajustaron en un aparato de filtración, y se ensambló un cilindro de acero inoxidable. El filtro se pre-humedeció con TCA al 10% bajo vacio. Los precipitados de TCA se recolectaron al pasar el contenido de cada cavidad a través del filtro, y se lavaron tres veces con TCA al 5% y una vez con etanol. Los filtros se secaron con aire y luego se sometieron a la espectrometría de centelleo líquido utilizando un Analizador de Centelleo Líquido Tri-Carb® 2900TR (PerkinElmer). La concentración de proteína total se determinó utilizando un Ensayo de Proteína Bradford (Sigma-Aldrich), y las mediciones de radioactividad se normalizaron por consiguiente. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Medición de la actividad SCD1: Las células se colocaron en placas de 6 cavidades a una densidad de 50,000 a 100,000 células por cavidad. 24 horas después, PluriSIn #1, 20 mM (N'-fenilhidrazida de ácido isonicotinico) o DMSO al 0.2% (control) se adicionaron a las células. Después de 12 horas de incubación a 37°C, bajo CO2 al 5%, el medio viejo se removió, las células se lavaron con PBS y se adicionó el medio nuevo que contiene 2.3 mM de 0.75 UCi de ácido [1-14C] esteárico. Las células luego se incubaron por hasta 4 horas a 37°C, bajo C02 al 5%.
Después del periodo de incubación, el medio se desechó y las células se lavaron 3 veces con 2 mi de PBS. 2 mi de una mezcla de n-hexano:isopropanol (3:2 v:v) se adicionaron, y las células luego se incubaron durante 30 minutos a una temperatura de 37°C, bajo C02 al 5%.2 mi de solución Folch (una mezcla de cloroformormetanol 2:1 v:v)) se adicionaron subsecuentemente. El liquido se transfirió a tubos para la partición de fases al adicionar 1 mi de agua. La fase orgánica inferior se evaporó y se utilizó para la saponificación de lipido y la separación de TLC (cromatografía de capa fina) del ácido [1-14C] esteárico libre (substrato) y ácido [1—14C] oleico (producto formado). Los lipidos extraídos de las células se aplicaron a placas de TLC previamente sumergidas en AgN03 al 10% y activadas a una temperatura de 120°C durante 60 minutos. Se adicionaron ácido esteárico y oleico no marcado a cada punto de aplicación como portadores y como estándares internos para la identificación. Las placas luego se corrieron con una mezcla de solvente de cloroformo: metanol: ácido acético: agua destilada doble (DDW) (90:8:1:0.8). Los ácidos grasos libres se detectaron mediante iluminación ultravioleta después del rociado del TLC con una solución de 2',7'-diclorofluoresceína. Los puntos correspondientes al ácido esteárico y oleico se rasparon y la radioactividad se contó en un contador de centelleo Packard Tri-Carb® 1600TR. La actividad de desaturasa de SCD1 se calculó a partir del por ciento de conversión del substrato a producto y la conversión a picomoles por minuto por 106 células. Los experimentos se realizaron por triplicado.
Ensayo de rescate de ácido oleico: Células madre embriónicas humanas se cultivaron sin células alimentadoras en placas de cultivo de tejido de 24 cavidades CELLSTAR® (Greiner Bio-One) pre-recubiertas con MatrigelMR, utilizando el medio definido mTeSRl. Las células se trataron con 20 mM de los compuestos PluriSIn probados, clorhidrato de amsacrina 5 mM o D SO al 0.02%, en la presencia o ausencia de ya sea ácidos oleico-albúmina o albúmina sola. Después de 24 horas, las células se sometieron a la formación de imagen de microscopía y a las mediciones de viabilidad celular.
Experimentos de desarrollo embriónico in-vitro: La superovulación se indujo en ratones hembra (CB6F1/0LAHSD y ICR:HSD(CD-I)), mediante inyección de gonadotropinas: la inyección intraperitoneal de 5 IU de PMSG (gonadotropina de suero de yegua preñada) en 1:00 P.M. fue seguida por una inyección intraperitoneal de 5 IU de hCG (gonadotropina coriónica humana) 47 horas después, de acuerdo con los procedimientos descritos por Najy y colaboradores, [Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3rd Edn., Coid Spring Harbor Laboratory Press (2003)].
Las hembras se aparearon con machos sementales inmediatamente después de la segunda inyección, y el acoplamiento fue evidente en la siguiente mañana. Los ratones hembras preñadas se sacrificaron en aproximadamente 36 horas p.c. (poscoito, y embriones de dos células se recolectaron de acuerdo con los procedimientos descritos por Najy y colaboradores, [ Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual, 3rd Edn., Coid Spring Harbor Laboratory Press (2003)]. La cavidad abdominal se abrió, y el oviducto se cortó y se transfirió a una caja de Petri que contiene medio M2 a temperatura ambiente. El oviducto se inundó con el medio M2, y los embriones se recolectaron utilizando una pipeta y se lavaron en el medio M2 para el enjuague de los restos. Los embriones luego se transfirieron a microgotas de medio M16. Una caja de cultivo de 35 mm (Falcón BD) que contiene gotas de 40 ml del medio M16, cubierta con aceite mineral, se preparó el día antes, y se incubó durante la noche a una temperatura de 37°C bajo CO2 al 5%. Los embriones luego se transfirieron a estas microgotas después de su recolección, y se incubaron a una temperatura de 37°C bajo C02 al 5%. El desarrollo de los embriones se examinó dos veces al dia utilizando la formación de imagen de microscopía de luz. En la etapa de mórula (aproximadamente 3.5 días p.c.), los embriones se transfirieron ya sea a microgotas de 40 ml del medio MI6 con PluriSIn #1, 20 mM (N'-fenilhidrazida de ácido isonicotínico) en DMSO al 0.2%, o a microgotas de control con DMSO al 0.2%. Otros embriones de control se dejaron en las microgotas originales para controlar los posibles efectos de la transferencia misma. En aproximadamente 4 días de p.c. y 4.5 días de p.c., los embriones se examinaron utilizando la formación de imagen de microscopía de luz, y los blastocistos se clasificaron como es descrito por Cortes y colaboradores, [Stem Cells and Development 17:255-267 (2008)].
Formación de teratoma: Las líneas de células madre embriónicas humanas y células madre pluripotentes inducidas se cultivaron sin células alimentadoras en placas de cultivo de tejido de 6 cavidades CELLSTAR® (Greiner Bio-One) pre-recubiertas con MatrigelMR, utilizando el medio definido mTeSRl. Las células se trataron durante 24 horas con ya sea PluriSIn #1, 20 mM (N'-fenilhidrazida de ácido isonicotinico) en DMSO al 0.2% o con DMSO al 0.2%, seguido por el reemplazo del medio y un segundo tratamiento durante otras 24 horas.48 horas después de la exposición inicial al compuesto probado, las células se recolectaron con tripsina-EDTA y se resuspendieron en una mezcla de mTeSRl:MatrigelMR 1:1 a un volumen total de 200 ml. Las células luego se inyectaron subcutáneamente a la espalda de los ratones NOD-SCID IL2Ry-/- (Jackson Laboratory). Seis semanas después de la inyección los ratones se sacrificaron, se examinó la formación de tumores y los teratomas resultantes se fotografiaron, se extirparon y se criopreservaron en el compuesto O.C.T. (Sakura Finetek, Torrance, CA).
Alternativamente, las células madre embriónicas humanas y las células madre pluripotentes inducidas se diferenciaron espontáneamente en el cultivo durante un periodo de 10 dias, al hacerlas crecer sobre placas de cultivo recubiertas de gelatina con el medio DMEM inactivado al 85% suplementado con el reemplazo de suero inactivado al 15%, glutamina 1 mM, b-mercaptoetanol 0.1 mM, aminoácidos no esenciales al 1%, penicilina (50 U/ml) y estreptomicina (50 mg/ l), sin el factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF). El ácido retinoico se adicionó al medio a una concentración final de 1 mM. 10 dias después, las células diferenciadas se recolectaron y se colocaron en una relación 1:1 con sus células parentales no diferenciadas en placas de cultivo de tejido de 6 cavidades CELLSTAR® (Greiner Bio-One) pre-recubiertas con MatrigelMR, con el medio definido mTeSRl. Las células se trataron durante 24 horas con ya sea PluriSIn #1, 20 mM o DMSO al 0.2%, seguido por el reemplazo del medio y un segundo tratamiento durante otras 24 horas. 48 horas después de la exposición inicial al compuesto, las células se recolectaron con tripsina-EDTA y se contaron utilizando un contador de células automatizado Countess (Invitrogen). 1 millón de células viables de cada condición se resuspendieron en una mezcla de mTeSRl:MatrigelMR 1:1 a un volumen total de 200 ml. Las células luego se inyectaron subcutáneamente a la espalda de los ratones NOD-SCID IL2Ry-/-. Cada ratón se inyectó con células trastadas con PluriSIn #1 en un lado se cuerpo y células tratadas con control en el otro lado. Seis semanas después la inyección los ratones se sacrificaron, se examinó la formación de tumores, y los teratomas resultantes se fotografiaron, se extirparon y se criopreservaron en el compuesto O.C.T..
Inactivación de SCD1: Para la ablación genética de SCD1, se realizó la inactivación de SCDl utilizando siRNA de acumulación ON-TARGETplus S ART contra SCDl humana (Dharmacon RNAi Technologies, Lafayette, CO). La transfección de siRNAs en células ES humanas se realizó como es descrito previamente [Ma y colaboradores, RNA 16:2564-2569 (2010), utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los oligos de siRNA se utilizaron a una concentración final de 40 nM u 80 nM. El siRNA contra la proteina fluorescente verde (GFP) se utilizó como siRNA simulado (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). La viabilidad celular se midió 72 horas después de la transfección.
Estadística : La agrupación jerárquica mediante perfiles de niveles de expresión génica, y mediante perfiles de reacción a los compuestos, se realizó con la versión 6.3 de Partek Genomics Suite (Partek, St. Louis, MO).
Los niveles de expresión génica de genes seleccionados, asi como las actividades de SCD y síntesis de proteína entre las células de control y tratadas, se compararon utilizando una prueba t del Estudiante de un extremo.
Para el análisis de anotación funcional DAVID, un umbral para significado se determinó como p=0.05 después de la aplicación de la corrección de Benjamini.
El significado de enriquecimiento para compuestos con fenilhidrazina en la lista de compuestos PluriSIn, y aquel de los inhibidores de síntesis de proteína en los resultados cmap, se determinaron utilizando una prueba de buen ajuste de chi-cuadrado de Pearson. El significado de los experimentos de desarrollo embriónico in-vitro se determinó utilizando la prueba exacta de Fisher.
Los factores Z' se calcularon de acuerdo con la fórmula: l-[3(s.d. de pos. con. - s.d. de neg. con.)/ 1media de pos. con. - media de neg. con.|] en donde s.d. = desviación estándar; pos. = positivo; neg. = negativo; con. = control.
EJEMPLO 1 Clasificación para citotoxicidad hacia células madre Con el fin de identificar inhibidores citotóxicos de células madre pluripotentes humanas (hPSCs), una clasificación de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas se diseñó y se utilizó, como es descrito anteriormente en la presente. Para facilitar la clasificación, un protocolo se desarrolló y se optimizó para·habilitar el cultivo de hPSCs no diferenciadas en un formato de 384 cavidades, la aplicación automática de moléculas pequeñas a estas placas de células, y la medición precisa de la viabilidad celular después de la exposición de las células a los compuestos probados.
Primero, células madre embriónicas (ES) y células madre pluripotentes inducidas (iPS) se cultivaron en placas recubiertas con atrigelMR sin alimentadores, utilizando un medio definido libre de suero (mTeSRl).
La pluripotencia de las células bajo estas condiciones se evaluó al examinar su morfología, al manchar para fosfatasa alcalina (AP) y mediante el manchado inmunocitoquímico para Oct-4, como es descrito anteriormente en la presente.
Como se muestra en las Figuras 1A y IB, las células exhibieron morfología normal (Figura 1A) y expresaron Oct-4 (Figura IB).
Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, las células exhibieron manchado positivo para fosfatasa alcalina.
Estos resultados confirman la pluripotencia de las células madre.
Las células luego se recolectaron y se sembraron en placas de 384 cavidades, a una densidad de 5000 células por cavidad. La PCR cuantitativa y el manchado de immunofluorescencia para Oct-4 y NANOG se realizaron con el fin de verificar que las células permanecieron no diferenciadas por al menos 5 días bajo estas condiciones.
Como se muestra en las Figuras 3 y 4, mientras que se cultivan en las placas, las células mantuvieron su morfología normal, formaron colonias y proliferaron, y permanecieron no diferenciadas por al menos 5 dias.
Un ensayo de viabilidad celular luminiscente a base de ATP (CellTiter-Glo®) se utilizó para medir de manera precisa la cantidad de células vivientes en un cultivo de células no diferenciadas, como es descrito anteriormente en la presente.
Como se muestra en la Figura 5, la luminiscencia a base de ATP observada en células no diferenciadas fue correlacionada notablemente a número de células sembradas en una muestra 24 horas antes de la medición.
Como se muestra en la Figura 6, el ensayo de la viabilidad celular no diferenciada por medio del manchado de azul de metileno proporcionó resultados similares a aquellos obtenidos por medio del ensayo de viabilidad celular luminiscente a base de ATP.
Estos resultados confirman que el ensayo de viabilidad celular luminiscente a base de ATP mide de manera precisa la viabilidad de las células no diferenciadas en cultivo.
Una clasificación piloto luego se realizó con 50 compuestos comercialmente disponibles (como es descrito en la sección de Materiales y Métodos anteriormente en la presente) que se seleccionaron aleatoriamente a partir de un banco de compuestos citotóxicos conocidos. Las células se expusieron a los compuestos en 5 diferentes concentraciones que varían de 30 mM a 300 nM, por 4 duraciones de exposición (6, 24, 48 o 72 horas) y luego se sometieron al ensayo de viabilidad.
Como se muestra en la Figura 7, todos los compuestos probados que exhibieron citotoxicidad observable exhibieron tal actividad en 24 horas. Un periodo de prueba de 24 horas por lo tanto se eligió para la siguiente clasificación primaria.
Además, como se muestra en la Figura 7, el clorhidrato de amsacrina (un inhibidor de topoisomerasa de DNA), exterminó casi todas las células dentro de 24 horas, y cicloheximida (un inhibidor de traducción, también conocido en la téenica como actidiona), dio por resultado aproximadamente 50% de disminución en la viabilidad celular después de 24 horas, a una concentración de 1-3 mM.
En base a estos resultados, el clorhidrato de amsacrina se seleccionó como un control positivo para la clasificación primaria, y cicloheximida (actidiona) se seleccionó como un control de EC50 (es decir, un compuesto de control que da por resultado 50% de toxicidad a las células).
En la clasificación primaria para inhibidores citotóxicos de hPSCs, 52,448 moléculas pequeñas se clasificaron contra las células ES humanas no diferenciadas, como es descrito en la sección de Materiales y Métodos. Estas moléculas pertenecen a la librería de compuestos "dorado" de Hoffman-La Roche, que está comprendida de diversas entidades químicas. Esta librería se diseña para representar la librería de compuestos completa de la compañía farmacéutica, que incluye arriba de un millón de moléculas distintas.
El protocolo para la clasificación primaria se representa esquemáticamente en la Figura 8. Células ES humanas (CSES2) se cultivaron en placas recubiertas con MatrigelMR con el medio definido mTeSRl. Antes de su colocación en placas de 384 cavidades, se verificó la pluripotencia de las células mediante su morfología y mediante el manchado con fosfatasa alcalina. Las células luego se recolectaron, se contaron y se dispensaron automáticamente a una densidad de 5000 células por cavidad. Las placas se incubaron durante la noche para permitir que las células se asienten de manera apropiada.149 tales placas de ensayo se prepararon, para corresponder a las 149 placas de compuestos de la librería "dorada".24 horas después de la colocación de células, los compuestos se diluyeron y se transfirieron a las placas de ensayo, tal que cada uno de los 52,448 se adicionó una cavidad, a una concentración final de 20 mM (con DMSO al 0.5%). Además de los 352 compuestos de la librería, cada placa de ensayo también incluyó sus propios controles: 16 cavidades con DMSO al 0.5% únicamente (control negativo), 8 cavidades con clorhidrato de amsacrina 5 mM (control positivo) y 8 cavidades con cicloheximida 2 mM (control de EC50). 24 horas después de la adición del compuesto, un ensayo de viabilidad CellTiter-Glo® se utilizó para cuantificar el número de células vivientes en cada cavidad. La intensidad de luminiscencia se midió en cada cavidad utilizando un lector de placas de luminiscencia y los datos se normalizaron y se analizaron como es descrito en la sección de Materiales y Métodos.
Como se muestra en la Figura 9, el ensayo exhibió un factor Z' consistentemente alto (0.078+/-0.06 por placa de ensayo de 384 cavidades), indicando que la clasificación primaria fue muy robusta.
Los aciertos se determinaron como los compuestos que indujeron arriba de 60% de inhibición. Utilizando este umbral, 2031 compuestos (<4% de los compuestos probados) se identificaron como aciertos. La distribución de la inhibición exhibida por los compuestos probados se presenta en la Figura 10.
Estos 2,031 aciertos luego se seleccionaron para ser probados de nuevo en confirmación y ensayos de validación contra cuatro lineas de células ES iPS humanas. La primera clasificación de confirmación se realizó con dos lineas de células ES humanas, CSES2 y H9, en una sola concentración (20 mM). La clasificación de confirmación removió los aciertos positivos falsos de la clasificación primaria, asi como los compuestos con efectos específicos en la línea de células.
Cómo se muestra en la Figura 11, la clasificación de confirmación dio por resultado 696 aciertos que fueron citotóxicos a ambas de las células CSES2 y H9.
Estos 696 aciertos confirmados luego se probaron contra la linea de células ES humana CSES2, y su clon CSES2-S02/3, en 8 concentraciones (que varían de 50 mM a 23 nM, con etapas de dilución 1:3 en serie).
Como se muestra en las Figuras 12A y 12C, las potencias de los compuestos en las diversas líneas de células ES humanas probadas fueron muy altamente correlacionadas. Además, el efecto citotóxico de los compuestos fue dependiente de la dosis en arriba de 98% de los casos.
Como se muestra adicionalmente en la Figura 12B, la potencia de los compuestos en células iPS fue altamente correlacionada con aquellos obtenidos para células ES. No se encontraron compuestos que sean citotóxicos hacia un tipo de célula sin tener un efecto perjudicial sobre el otro.
Con el fin de verificar que el efecto inhibidor de los compuestos persiste a través del tiempo, las células CSES2 se expusieron a los compuestos en 6 concentraciones por una duración de 48 horas.
Como se muestra en la Figura 13, el efecto citotóxico de cada uno de los compuestos probados se mantuvo durante 48 horas. No se observó recuperación de células después de la exposición a cualquiera de los compuestos.
El efecto de los compuestos seleccionados sobre las células iPS humanas luego se determinó. Las Células BJ-ÍPS28 se cultivaron precisamente en las mismas condiciones como las células ES, y se probaron en 6 concentraciones (que varían de 50 mM a 200 nM, con etapas de dilución 1:3 en serie).
Estos resultados indican que los 696 compuestos identificados como es descrito anteriormente en la presente son inhibidores citotóxicos potentes de PSCs humanas.
EJEMPLO 2 Clasificación para coapuestos que exhiben citotoxicidad selectiva hacia las células madre (PluriSIns) Con el fin de identificar inhibidores citotóxicos altamente selectivos de hPSCs, los 696 inhibidores citotóxicos de hPSCs identificados como es descrito en el Ejemplo 1 se contra-clasificaron como es descrito en la sección de Materiales y Métodos contra otros tipos de células, representativas de todas las capas germinales y etapas de desarrollo. De manera importante, muchos de estos tipos de células se diferenciaron de células ES humanas o iPS. Los tipos de células clasificados incluyeron células madre neurales derivadas de ES (NSCs), células madre mesenquimales derivadas de ES (MSCs), células progenitoras endodérmicas derivadas de ES, hepatocitos derivados de ES, cardiomiocitos derivados de iPS, fibroblastos derivados de iPS de origen (fibroblastos BJ) y tres líneas de células de cáncer: neuroblastoma (Kelly), cáncer cervical (HeLa) y hepatocarcinoma (Huh7). Los tipos de células y su relación a las células madre se representan esquemáticamente en la Figura 14.
Cada tipo de célula se clasificó por duplicado o triplicado a una concentración de 20 mM, contra la mayoría o todos los 696 compuestos mencionados en lo anterior.
Como se muestra en las Figuras 15-21, hubo poca correlación entre la citotoxicidad de los compuestos probados hacia hPSCs y citotoxicidad hacia cardiocitos (Figura 15), fibroblastos (Figura 16), hepatocitos (Figura 17), células de neuroblastoma (Kelly) (Figura 18), células HeLa (Figura 19), o células Huh7 (Figura 20), aunque hubo un poco de más correlación con la citotoxicidad hacia las células progenitoras endodérmicas (Figura 21).
Estos resultados permanecen en algún contraste a los resultados mencionados en lo anterior indicando que la potencia de los compuestos en diferentes tipos de hPSCs se correlacionaron altamente (comparar la Figura 15 con la Figura 11 y 12A-12C).
Con el fin de verificar adicionalmente la citotoxicidad selectiva de compuestos identificados, múltiples concentraciones de los compuestos se clasificaron contra células diferenciadas, así como contra células no diferenciadas genéticamente correspondientes.
CSES2-S02/3 es una línea de células marcada genéticamente que expresa mCherry bajo el promotor del gen de referencia de pluripotencia OCT-4, y GFP bajo el promotor del marcador endodérmico temprano SOX17. Por lo tanto, estas células son rojas mientras que son no diferenciadas, y llegan a ser verdes en su diferenciación en el linaje endodérmico [Kopper & Benvenisty, Stem Cell Research 8:335-345 (2011)]. Las células progenitoras endodérmicas tempranas verdes se generaron a partir de las células no diferenciadas rojas, utilizando un protocolo de diferenciación de 8 dias como es descrito por Duan y colaboradores [Stem Cells 28:674-686 (2010)].
Como se muestra en la Figura 22, las células fueron rojas antes de la diferenciación, pero después de 8 días, las mayorías de las células fueron verdes, mientras que las células no diferenciadas rojas podrían ser difícilmente detectadas. Esos resultados indican que el protocolo de diferenciación fue altamente eficiente.
La eficiencia del protocolo de diferenciación se confirmó mediante el análisis FACS para el marcador endodérmico CXCR4.
Como se muestra en la Figura 23, 98% de las células expresaron el marcador endodérmico temprano CXCR4, para de esta manera confirmar la eficiencia del protocolo de diferenciación .
Como se muestra en la Figura 24, las células diferenciadas permanecieron viables y verdes después de ser colocadas en placas de 384 cavidades. Este resultado indicó que las células diferenciadas podrían ser clasificadas contra las moléculas pequeñas.
Los compuestos identificados se clasificaron en 8 concentraciones utilizando tanto las células rojas no diferenciadas como las células verdes diferenciadas, y los valores de EC50 confiables de esta manera se calcularon para las células diferenciadas y no diferenciadas genéticamente idénticas.
Además, los compuestos identificados se clasificaron en 6 concentraciones utilizando los fibroblastos BJ de los cuales se ha derivado la línea de iPS BJ-ÍPS28, y los valores de EC50 confiables se calcularon de esta manera para tanto las células iPS como sus células somáticas de origen.
Como se muestra en las Figuras 25A y 25B, muchos de los compuestos probados exhibieron potente citotoxicidad hacia BJ-ÍPS28 (Figura 25A) y CSES2-S02/3 (Figura 25B) células madre pluripotentes, pero considerablemente menos citotoxicidad hacia las células diferenciadas genéticamente idénticas (BJ-fibroblastos (Figura 25A) y células CSES2-S02/3 diferenciadas (Figura 25B) respectivamente).
Con el fin de identificar los compuestos que exhiben citotoxicidad altamente selectiva hacia hPSCs, se ajustó un umbral, caracterizado por aproximadamente 80% o más de inhibición (en 20 mM) en cada uno de los tipos de hPSC probados, con menor que 20% de inhibición (en 20 mM) en los tipos de células no de hPSC probadas (con la excepción de las células madre neurales derivadas de ES, que son relativamente similares a las células ES). Por otra parte, los criterios requirieron que el valor de EC5o sea aproximadamente 5 mM o menor para las células CSES2, CSES2-S02/3 y BJ-ÍPS28, pero más alto que 50 mM para las células CSES2-S02/3 diferenciadas de 8 dias y para los BJ-fibroblastos.
Como se muestra en las Tablas 1, 2 y 3 enseguida, 15 compuestos cumplieron con los criterios mencionados en lo anterior o estuvieron cercanos a cumplir los criterios mencionados en lo anterior (por ejemplo, exhibieron una diferencia de más de 10 veces en EC50 entre hPSCs y células diferenciadas), y de esta manera se nombraron Inhibidores Específicos Pluripotentes (PluriSIns). Los 15 PluriSIns se identificados se muestran en la Tabla 1. Como se muestra en la Tabla 1, muchos (9 de 15) de los PluriSIns comprenden una porción de fenilhidrazina. Los efectos inhibidores de los PluriSIns se presentan en las tablas 2 y 3.
Tabla 1 : Estructuras del compuesto PluriSIn y nombres químicos (énfasis en porciones compartidas) _ i N'-fenilhidrazona de 1- PluriSln #13 fenil-3-(ciclopentadienona 2-il)-2-propen-1-ona '-fenilhidrazida de ácido PluriSln #14 N'-benzoil 4-clorobenzoico 3- (4- PluriSln #15 7 (ciclohexilmetil)ciclohexil- iminometoxi)tetrahidrofurano K\ OK) o i Tabla 2:Inhibición (%)devarios tiposde células por compuestosPluriSIn (en 20uM) Tabla 3: Valores de EC50 (mM) para la inhibición de varios tipos de células mediante los compuestos PluriSIn Como se muestra en la Figura 26A y en la Tabla 3, las células Es humanas (células CSES2) pierden su sensibilidad a PluriSIn #1 en su diferenciación a las células progenitoras endodérmicas derivadas de CSES2 (EPCs).
De manera similar, como se muestra en la Figura 26B y en la Tabla 3, las células somáticas humanas (BJ-fibroblastos) adquirieron sensibilidad a PluriSIn #1 en su reprogramación a las células iPS (células BJ-ÍPS28).
De manera similar, como se muestra en la Figura 27 y en la Tabla 3, las células ES humanas (células CSES2-S02/3) pierden su sensibilidad a cada uno de los 15 compuestos PluriSIn en su diferenciación a células progenitoras endodérmicas, y la sensibilidad adquirida de los BJ-fibroblastos a cada uno de los 15 compuestos PluriSIn en su reprogramación a células iPS (células BJ-ÍPS28).
La agrupación jerárquica no supervisada se realizó utilizando los perfiles de inhibición del compuesto de los tipos de células probadas.
Como se muestra en la Figura 28, las hPSCs se agruparon conjuntamente mediante su respuesta a moléculas pequeñas, con un subgrupo de 15 compuestos que exhiben citotoxicidad altamente selectiva hacia hPSCs. Estos resultados indican que las hPSCs están en sensibilidad general a diferentes compuestos, como es comparado con otros tipos de células (por ejemplo, células diferenciadas).
Con el fin de confirmar el efecto citotóxico de varios PluriSIns en ensayos adicionales, las células se trataron con PluriSIns y se sometieron a un ensayo de viabilidad de azul de metileno independiente de ATP y tambien se examinaron mediante la formación de imagen microscópica de alto contenido.
Como se muestra en la Figura 29, los PluriSIns #1 a #11 cada uno redujo la viabilidad de las células ES H9 considerablemente, como es determinado mediante un ensayo de azul de metileno.
Como se muestra en la Figura 30, los PluriSIns #1 a #11 cada uno redujo el número de células ES H9 considerablemente, como es observado mediante microscopía.
De manera significativa, ninguno de los PluriSIns se identificó como citotóxico en una clasificación de citotoxicidad de alta resolución previa realizada con células HepG2 (datos no mostrados), indicando adicionalmente que su citotoxicidad es selectiva para PSCs.
Con el fin de verificar adicionalmente la selectividad de los PluriSIns, y excluir cualquier interferencia relacionada con el ensayo potencial, las células no diferenciadas y diferenciadas CSES2-S02/3 se sometieron a la formación de imagen de microscopía después de 24 horas de exposición a PluriSIns.
Como se muestra en la Figura 31, PluriSIn #6 eliminó las células no diferenciadas rojas sin exhibir algún efecto detectadle sobre las células diferenciadas verdes.
Como se muestra adicionalmente en la misma, el efecto del PluriSIn sobre las células no diferenciadas fue comparable a aquel del clorhidrato de amsacrina 5 mM, utilizado como un compuesto de control citotóxico, mientras que las células diferenciadas tratadas con PluriSIn fueron comparables a las células diferenciadas no tratadas.
De manera similar, como se muestra en la Figura 32A-32C, PluriSIn #1 eliminó las células no diferenciadas (Figura 32A) sin exhibir algún efecto detectable sobre las células diferenciadas (Figura 32B), y también eliminó las células no diferenciadas en una mezcla de células diferenciadas y no diferenciadas (Figura 32C).
Con el fin de averiguar que la selectividad de la citotoxicidad de PluriSIn es de dependiente del tipo de célula antes que dependiente del medio de célula, cuatro tipos de células no pluripotentes (BJ-fibroblastos, células HeLa, HepG2 y Kelly) se cultivaron en el medio de células madre embriónicas humanas y se expusieron a PluriSIn #1 durante 72 horas. La viabilidad celular luego se determinó mediante un ensayo de azul de metileno, como es descrito anteriormente en la presente.
Como se muestra en las Figuras 33 y 34, el PluriSIn #1 no tuvo efecto sobre la viabilidad de las células no pluripotentes en el medio de células madre embriónicas, para de esta manera confirmar que la citotoxicidad de PluriSIn #1 es dependiente del tipo de célula antes que dependientes del medio de células.
Los resultados anteriores indican que PluriSIns exhiben un efecto citotóxico significativo, robusto, rápido y selectivo hacia hPSCs.
EJEMPLO 3 Mecanismo de acción de los PluriSIns Como es descrito anteriormente en la presente, 9 de los 15 PluriSIns identificados comprenden una porción de fenilhidrazina (ver la Tabla 1). Específicamente, PluriSIns #1, #5, #6, #9, #10 y #14 comprenden una porción de N'-fenilhidrazida (un derivado de ácido de una fenilhidrazina), PluriSIns #8 y #13 comprenden una porción de N'-fenilhidrazona (un derivado de cetona o de aldehido de una fenilhidrazina) y PluriSIn #11 comprende una porción de N'-fenilhidrazina que puede tautomerizarse a una porción N'-fenilhidrazona.
Esta presencia de una porción de fenilhidrazina común en 9 de 15 de los PluriSIns es aproximadamente una sobre-representación de 60 veces de esta porción comparada con la librería "dorada" completa (p<10~16), sugiriendo que esta porción puede ser ligada al mecanismo de acción o a la especificidad de los PluriSIns.
En un intento para poner en claro adicionalmente el mecanismo de acción de los PluriSIns, la actividad del compuesto más potente y selectivo, PluriSIn #1 (N'-fenilhidrazida de ácido isonicotinico), así como aquel de PluriSIn #6 (4-metil-N'-fenilhidrazida de ácido 2-hidroxi-2-(tiofen-2-il)-2-fenilacético se estudiaron adicionalmente).
En un estudio toxicogenómico, varios tipos de células ES humanas se expusieron a PluriSIns #1 o #6, o al DMSO de control, durante 12 horas, un punto de tiempo en el cual todavía no se observó muerte celular. Por comparación, los progenitores endodérmicos tempranos derivados de las células ES humanas (como es descrito anteriormente en la presente) se trataron del mismo modo. El RNA luego se derivó de las células, y los microarreglos de expresión génica (Affymetrix U133A) se utilizaron para analizar la expresión génica, como es descrito en la sección de Materiales y Métodos. Varias herramientas bioinformáticas luego se aplicaron para analizar los cambios de expresión génica, con el fin de identificar rutas perturbadas, como es descrito en la sección de Materiales y Métodos.
Como se muestra en la Figura 35, la agrupación jerárquica no supervisada reveló cambios de expresión génica marcados en las células no diferenciadas tratadas con PluriSIn comparado con sus controles no tratados, mientras que no ocurrieron tales cambios de expresión génica en las células diferenciadas tratadas.
Como se muestra en la Figura 36, el tratamiento con PluriSIn dio por resultado múltiples cambios de expresión génica (>2 veces de cambios) asociados con la apoptosis.
El análisis funcional de genes desregulados (>2 veces de cambios) se condujo utilizando la herramienta de Anotación Funcional DAVID, como es descrito por Huang y colaboradores, [Nature Protocols 4:44-57 (2009)] y reveló enriquecimiento significativo para apoptosis (2.7 veces de enriquecimiento, p=0.007 después de la corrección de Benjamini).
El descubrimiento de la expresión génica asociada con la apoptosis es consistente con los reportes previos de que las células pluripotentes están propensas a la apoptosis [Qin y colaboradores, Journal of Biological Chemistry 282:5842-5852 (2007); Momcilovic y colaboradores, PloS One 5:el3410 (2010)]. Sin embargo, las células pluripotentes también se han reportado que son susceptibles a otros tipos de muerte celular, tal como oncosis [Tan y colaboradores, Stem Cells 27:1792-1801 (2009)] y la autofagia [Alexander y colaboradores, PNAS 108:15828-15833 (2011)]. Un ensayo de detección de Anexin V-FITC e inmunomanchado para caspasa-3 (una referencia citada de apoptosis) por lo tanto se utilizó con el fin de confirmar que la muerte de hPSC masiva inducida por PluriSIn #1 es en realidad apoptosis.
Como se muestra en las Figuras 37A y 37B, el tratamiento con PluriSIn #1 incrementa el número de células apoptóticas aproximadamente 7 veces del pos-tratamiento de 16 horas.
Como se muestra en la Figura 38, el tratamiento con PluriSIn #1 aumentó la activación de caspasa-3.
El efecto del inhibidor de pancaspasa Z-VAD-FMK sobre la muerte celular inducida por PluriSIn #1 también se examinó. Las células se trataron con 25 mM o 100 mM de Z-VAD-FMK, y 1 hora después de adicionó PluriSIn #1 (20 mM) al medio. Después de 24 horas, los cultivos se sometieron a mediciones de viabilidad celular, como es descrito anteriormente en la presente.
Como se muestra en la Figura 39, Z-VAD-FMK significativamente suprimió la muerte celular inducida por PluriSIn #1, en una manera dependiente de la dosis.
Estos resultados confirman que la apoptosis es el mecanismo primario de la muerte celular inducida por PluriSIn #1.
Además, como se muestra en la Figura 40, el tratamiento con PluriSIn #1 y #6 dio por resultado cambios considerables de la expresión génica asociados con el estrés del retículo endoplásmico (ER) y la respuesta de proteína desplegada (UPR). El cambio de expresión génica conferido por ditiotreitol (1 mM), un inductor de estrés de ER general, se utilizó como un control positivo.
El análisis funcional DAVID reveló el enriquecimiento para la respuesta de estrés de ER (enriquecimiento de 12 veces).
El gen más regulado hacia arriba después del tratamiento de PluriSIn fue CHOP (también conocido como DDIT3), una marca de referencia de UPR (9 veces de regulación hacia arriba, p=0.01).
Para estudiar adicionalmente el significado de UPR, XBPl y empalme de mRNA y la fosforilación de eIF2a, los puntos de referencia de UPR, además se examinaron. Las células ES humanas y las células diferenciadas derivadas de ES se trataron con PluriSIn #1 durante 12 horas, y la expresión de la isoforma empalmada sXBPl se determinó mediante la PCR cuantitativa y mediante el inmunomanchado, como es descrito en la sección de Materiales y Métodos. El cambio de expresión génica conferido por el ditiotreitol (1 mM) se utilizó como un control positivo.
Como se muestra en la Figura 41, la expresión incrementada de PluriSIn #1 de la isoforma empalmada sXBPl por aproximadamente 3.5 veces, como es determinado mediante la PCR cuantitativa.
Como se muestra en la Figura 42, PluriSIn #1 incrementó los niveles de eIF2a fosforilado en hPSCs, como es determinado mediante el inmunomanchado.
Estos resultados confirman que PluriSIn #1 induce UPR en hPSCs.
Co o se muestra adicionalmente en las Figuras 41 y 42, respectivamente, PluriSIn #1 no incrementó la expresión de la isoforma empalmada sXBPl o fosforilación de eIF2a en células diferenciadas de 8 dias.
Los datos de expresión génica luego se analizaron utilizando el Mapa de Conectividad (cmap), una base de datos de la expresión transcripcional de genoma amplio a partir de células humanas cultivas tratadas con moléculas pequeñas bioactivas. Cmap se desarrolló para facilitar el descubrimiento de rutas perturbadas por moléculas pequeñas de actividad desconocida, en base a los cambios comunes de la expresión génica que confieren moléculas pequeñas similares [Lamb y colaboradores, Science 313:1929-1935 (2006)]. Cmap incluye arriba de 7000 perfiles de expresión que representan 1309 moléculas distintas, incluyendo los compuestos citotóxicos que trabajan a través de mecanismos variados (tales como bloqueadores del ciclo celular, inhibidores de CDK, inhibidores de topoisomerasa, alcaloides, etc.). El análisis lista todos los compuestos por su similitud al compuesto probado, y proporciona "valores de conectividad" entre -1 a 1 que representa el grado de similitud.
La base de datos cmap se cuestionó con una lista de genes que fueron por lo menos 2 veces regulados hacia arriba o regulados hacia abajo en hPSCs después del tratamiento de 12 horas con PluriSIn #1. Una lista que describe los 10 compuestos que exhiben la actividad más similar a aquella de PluriSIn #1 se presenta en la Tabla 4. Un interrogante similar se realizó para PluriSIn #6, y una lista que describe los 10 compuestos que exhiben la actividad más similar a aquella de PluriSIn #6 se presenta en la Tabla 5.
Tabla 4: 10 Compuestos superiores que exhiben altos registros de conectividad de cmap con respecto a PluriSIn #1 (p=0.00000 para cada compuesto) ** Inhibidor de síntesis de proteina (como es definido en cmap) * Compuestos no definidos en cmap como inhibidores de síntesis de proteina, pero conocidos que atenúan la traducción de proteína.
Tabla 5: 10 Compuestos superiores que exhiben altos registros de conectividad de c ap con respecto a PluriSIn #6 (p=0.00000 para cada compuesto) ** Inhibidor de síntesis de proteína (como es definido en cmap) * Compuestos no definidos en cmap como inhibidores de síntesis de proteína, pero conocidos que atenúan la traducción de proteína.
Como se muestra en la Tabla 4, la actividad de PluriSIn #1 es altamente similar a aquella de los inhibidores de síntesis de proteína (PSIs), como los PSIs se clasificaron más altos en la lista, con muy alto registros de conectividad.
En realidad, solamente 4 compuestos (cefaelina, emetina, anisomicina, cicloheximida) se clasifican como PSIs genuinos en la base de datos cmap [lorio y colaboradores, PNAS 107:14621-14626 (2010)], y todos éstos aparecieron entre los 10 compuestos más similares a PluriSIn #1 (enriquecimiento de 65 veces, p<0.0001).
En comparación, la base de datos cmap también se interrogó con una lista de genes que fueron por lo menos 2 veces regulados hacia arriba o regulados hacia abajo en células diferenciadas de 8 dias después de 12 horas de tratamiento con PluriSIn #1. El análisis no detectó similitud a cualquier molécula pequeña, confirmando adicionalmente que PluriSIn #1 no altera la expresión génica global en estas células.
De manera similar, como se muestra en la Tabla 5, la actividad de PluriSIn #6 es muy similar a aquella de los inhibidores de síntesis de proteína (PSIs).
La similaridad entre PSIs y PluriSIn #1 y #6 es consistente con el hecho de que UPR puede conducir a la atenuación traduccional. Con el fin de confirmar este enlace, se determinó el efecto del tratamiento con PluriSIn #1 sobre la síntesis de proteína. Se utilizó un ensayo de marcación radioactiva de pulso para medir la incorporación de 35S-Met en células ES y células diferenciadas (fibroblastos) en la presencia o ausencia de PluriSIn #1. La cicloheximida (10 mM), un inhibidor de síntesis de proteína general, se utilizó como un control positivo.
Como se muestra en la Figura 43, PluriSIn #1 disminuyó la síntesis de proteína en hPSCs por aproximadamente 30% (p=0.005), pero no exhibió efecto en las células diferenciadas (fibroblastos).
Los resultados anteriores indican que PluriSIn #1 ejerce su efecto citotóxico al conducir a UPR y PSI en células no diferenciadas, para dar por resultado de esta manera su apoptosis. Además, no se identificaron cambios de expresión génica globales en las células diferenciadas y no se desregularon los genes apoptóticos/UPR. Como PluriSIn #1 no induce UPR e ISP en células diferenciadas, PluriSIn #1 selectivamente se dirige a las células no diferenciadas, mientras que las células diferenciadas permanecen intactas EJEMPLO 4 Inhibición de SCDl mediante PluriSIns Estudios previos han mostrado que ninguno de los PluriSIns exhibe un efecto citotóxico (datos no mostrados). Sin embargo, tres de estos compuestos, que incluyen PluriSIn #1 y PluriSIn #6, se han identificado, en una clasificación bioquímica in vitro, como inhibidores directos posibles de SCDl, una enzima clave en la biosíntesis de ácidos grasos mono-insaturados (MUFA). La inhibición de SCDl se ha reportado que induce estrés de ER y UPR en algunas líneas de células de cáncer humanas, conduciendo a la apoptosis de estas células [Roongta y colaboradores, Molecular Cáncer Research 9:1551-1561 (2011); Minville-Walz y colaboradores, PloS One 5:el4363 (2010); Scaglia y colaboradores, PloS One 4:e6812 (2009); Hess y colaboradores, PloS One 5:ell394 (2010); Morgan-Lappe y colaboradores, Cáncer Research 67:4390-4398 (2007); Masón y colaboradores, PloS One 7:e33823 (2012)].
Con el fin de averiguar si PluriSIns ejercen un efecto significativo por la vía de la inhibición de SCD, los cambios de expresión génica que los inventores observaron en hPSCs después de su tratamiento con PluriSIn #1 se compararon con aquellos previamente reportados en una línea de células de cáncer humanas (H19299) después de la inhibición farmacológica de SCDl por el inhibidor específico A939572 [Roongta y colaboradores, Molecular Cáncer Research 9:1551-1561 (2011)].
Como se muestra en la Figura 44, 12 de los 18 genes que exhibieron los cambios de expresión más significativos (p<0.05, >2 veces de cambio) después de la inhibición de SCDl (como es reportado por Roongta y colaboradores [Molecular Cáncer Research 9:1551-1561 (2011)]), también fueron significativamente desregulados después del tratamiento con PluriSIns #1 o #6. Además, muchos de los genes mencionados en lo anterior se relacionan a la ruta de estrés de ER.
Estos resultados sugieren que la citotoxicidad selectiva (y estrés de ER) inducida por PluriSIns se efectúa por la via de la inhibición de SCD.
Los resultados presentados en la presente son consistentes con un reporte de que la inhibición de SCD1 indujo una activación de UPR peculiar en lineas de células de cáncer humanas, caracterizadas por un incremento agudo en la expresión de CHOP sin afectar la expresión de ER acompañante GRP78 [Minville-Walz y colaboradores, PloS One 5:el4363 (2010)]. Como es descrito en el Ejemplo 3, el tratamiento con PluriSIn indujo una respuesta de proteina desplegada (UPR), con CHOP que es el gen más regulado hacia arriba. En contraste, la expresión GRP78 no fue significativamente alterada por el tratamiento de PluriSIn (1.2 veces, p=0.13).
Con el fin de examinar directamente si PluriSIn #1 inhibe la actividad de SCD, y si esta inhibición es restringida a células pluripotentes, la actividad de SCD1 se midió mediante un ensayo de marcación de oportunidad de impulso, como es descrito en la sección de Materiales y Métodos. La ES humana y células diferenciadas (H9 y BJ-fibroblastos, respectivamente) se trataron con PluriSIn #1 durante 12 horas, y luego se marcaron con ácido [1-14C] esteárico, el substrato de SCD1. Después de hasta 4 horas de incubación, los lipidos se purificaron y la actividad enzimática luego se evaluó mediante la medición directa de las intensidades radiactivas del substrato SCD1 y el producto, ácido [1-14C] oleico.
Como se muestra en la Figura 45, PluriSIn #1 disminuyó la actividad de SCD1 por aproximadamente 65% de disminución en las células ES (p=2.lxlO-6).
Con el fin de determinar si la viabilidad de hPSC en realidad depende de la actividad de SCD1 funcional, las hPSCs se expusieron a 75 nM de los inhibidores de SCDl específicos A939572 y CAY-10566 durante 48 horas. Algunas muestras se suplementaron con ácido oleico 100 mM con el fin de evaluar el efecto de la suplementación exógena del ácido oleico (un producto de la actividad de SCDl) sobre la muerte celular.
Como se muestra en la Figura 46, los inhibidores de SCDl A939572 y CAY-10566 cada uno causó una disminución considerable en la viabilidad de hPSCs (> 80% de disminución, p=6.4xl0-6 para A939572, p=2xl0-5 para CAY-10566). Como se muestra adicionalmente en la misma, el oleico completamente rescató las células de la muerte celular inducida por el inhibidor de SCDl (p=3xl04 para ácido oleico con A939572, p=10-4 para ácido oleico con CAY-10566).
Estos resultados confirman que las hPSCs requieren actividad de SCD para la supervivencia.
Con el fin de investigar adicionalmente el efecto de la actividad de SCD sobre la viabilidad de hPSC, la habilidad de la suplementación exógena de ácido oleico (el producto directo de SCD1) para el rescate de células de la apoptosis inducida por PluriSIn además se estudió, utilizando los procedimientos descritos en la sección de Materiales y Métodos. Las células se expusieron a PluriSIn #1 en la presencia de concentraciones incrementadas de ácido oleico conjugado con BSA (BSA-OA).
Como se muestra en las Figuras 47 y 48, las células protegidas de BSA-OA contra PluriSIn #1 de la apoptosis inducida en una manera dependiente de la dosis, con el rescate completo que ocurre en la presencia de altas concentraciones, mientras que BSA solo no proporcionó alguna protección contra la apoptosis. Como se muestra adicionalmente en la misma, esta protección fue especifica, como BSA-OA no afectó la proliferación en las células de control, y no protegió a las células contra la citotoxicidad de un inhibidor de DNA-topoisomerasa (amsacrina, Figura 47).
Para comparación, las células se expusieron a 20 mM de PluriSIn #1, #2, #3 y #6 en la presencia de BSA-OA 100 mM.
Como se muestra en la Figura 49, las células protegidas con BSA-OA contra la muerte celular inducida por PluriSIn #1 (p=0.0004), PluriSIn #5 (p=0.0006) o PluriSIn #6 (p=0.006), pero ninguna muerte celular inducida por PluriSIn #2 o PluriSIn #3.
Como PluriSIn #1, PluriSIn #5 y PluriSIn #6 cada uno comprende una porción de fenilhidrazina, y PluriSIn #2 o PluriSIn #3 no comprendió tal porción, los resultados anteriores sugieren que los PluriSIns que comprenden una porción de fenilhidrazina comparten un mecanismo citotóxico.
Con el fin de confirmar que la inhibición de SCD1 se somete a las perturbaciones celulares observadas después de la exposición de hPSCs a PluriSIn #1, se averiguó que el inhibidor de SCDl, A939572, recapitula la respuesta celular inducida por PluriSIn #1. El estrés de ER, inhibición de síntesis de proteína y la apoptosis se evaluaron como es descrito en lo anterior, después de ambos tratamientos con PluriSIn #1 y con A939572.
Como se muestra en la Figura 50, PluriSIn #1 y A939572 ambos aumentaron la apoptosis de células no diferenciadas de una manera similar.
Como se muestra en la Figura 51, A939572 incremento la expresión de la isoforma empalmada sXBPl por aproximadamente 2 veces en células ES no diferenciadas, como es determinado mediante la PCR cuantitativa, y no incrementó la expresión en células diferenciadas.
Como se muestra en la Figura 52, PluriSIn #1 y A939572 ambos incrementaron los niveles de eIF2a fosforilada en células ES de manera similar, como es determinado mediante la inmunomanchado, y no incrementaron los niveles en las células diferenciadas.
Como se muestra en la Figura 53, A939572 disminuyó la sintesis de proteina en células ES por aproximadamente 50%.
Como se muestra en la Figura 54, el inductor de estrés de ER ditiotreitol y el inhibidor de síntesis de proteína cicloheximida son citotóxicos hacia tanto las células madre e briónicas como las células diferenciadas (fibroblastos humanos) y el ácido oleico no proteger a las células contra su citotoxicidad.
Los resultados anteriores indican que la supervivencia de las hPSCs depende de la actividad normal del SCD1, y que las hPSCs son altamente sensibles a perturbaciones en la ruta de biosíntesis de ácido graso monoinsaturado (MUFA), y que la citotoxicidad selectiva de por lo menos algún PluriSIns (por ejemplo, PluriSIns que comprende una porción de fenilhidrazina) hacia hPSCs está asociada con su interferencia con la actividad de SCD1 y la sensibilidad de estas células a la interferencia con la actividad de SCDl. De manera similar a algunas líneas de células de cáncer, la inhibición de la actividad de SCDl en hPSCs induce el estrés de ER y UPR, seguido por la atenuación traduccional, y finalmente puede dar por resultado la apoptosis de las células. La Figura 55 describe tal mecanismo esquemáticamente.
EJEMPLO 5 Efecto de la citotoxicidad de PluriSIn en celulas madre pluripotentes de ratón y blastocistos Las células madre pluripotentes de ratón (mPSCs) se utilizan ampliamente en la investigación relacionada con la pluripotencia, y la generación de cultivos puros de células diferenciadas de mPSCs por lo tanto es de gran importancia. Por lo tanto se determinó si las mPSCs también son sensibles a PluriSIns. Las células de Es de ratón R1 0ct4-GFP se colocaron en placas de 96 cavidades y se expusieron a PluriSIns #1, #2, #4 o #6 a una concentración de 20 mM, y la viabilidad de las células luego se estimó después de 24 horas, 48 horas y 72 horas, utilizando un ensayo de viabilidad luminiscente y la formación de imagen de microscopía fluorescente, como es descrito en la sección de Materiales y Métodos.
Como se muestra en la Figura 56, cada uno de los cuatro PluriSIns probados indujo un grado considerable de muerte celular en las mPSCs. Una muestra representativa que muestra la muerte celular inducida por PluriSIn #6 se muestra en la Figura 57. Estos resultados indican que la sensibilidad de PluriSIn es compartida por las PSCs de ratón y humanas. La inhibición de mPSCs por PluriSIns no fue tan eficiente co o la inhibición de hPSCs, y requirió una exposición más larga a los compuestos. Esto puede ser la consecuencia de diferencias inherentes entre las PSCs de ratón y humanas, pero también puede ser atribuida al diferente medio y factores utilizados en el cultivo de estos tipos de células.
Sistema de ratón luego se utilizó con el fin de averiguar si PluriSIn #1 es citotóxico a las células de la masa de célula interior (ICM), de las cuales se derivan las células ES. Se planteó como hipótesis que si la actividad de SCD1 es crucial a las células pluripotentes in vivo , entonces PluriSIn #1 será citotóxico a las células ICM y de esta manera será perjudicial al desarrollo embriónico normal.
Como es descrito en la sección de Materiales y Métodos, se realizaron una serie de experimentos independientes con dos razas de ratones, en las cuales embriones de dos células se recolectaron de los oviductos de ratones preñados en aproximadamente 1.5 dias de poscoito, y estos embriones luego se dejaron desarrollar in vitro. Los embriones alcanzaron la etapa de mórula en aproximadamente 3.5 dias de poscoito, y luego se transfirieron ya sea a recipientes PluriSIn #1, 20 mM (17 embriones en total), recipientes con PluriSIn #1, 20 mM y ácido oleico 100 mM (7 embriones en total) o a recipientes de control con DMSO al 0.2% (8 embriones en total), mientras que otros embriones de control se dejaron desarrollar sin transferencia en todo (10 embriones en total). Utilizando la formación de imagen de microscopía de luz, el desarrollo de los embriones se siguió hasta que llegaron a ser blastocistos maduros (en aproximadamente 4.5 días de poscoito, después de lo cual todos los embriones se desintegraron en el cultivo). Los blastocistos luego se clasificaron en tres categorías distintas: (A) blastocistos de ratón de buena calidad con ICM grande y distinta; (B) blastocistos de ratón con ICM distinta, pero más pequeña; y (C) blastocistos de ratón de mala calidad con ICM indistinguible, como es descrito por Cortes y colaboradores, [ Stem Cells and Development 17:255-267 (2008)].
Todas los 8 blastocistos de control que se han transferido a recipientes con DMSO al 0.2%, y todos los 10 blastocistos de control que no se han transferido a nuevos recipientes, se desarrollaron en blastocistos con ICM distinta (categoría A/B).
En contraste, menos de la mitad (17/7) de los embriones expuestos a PluriSIn #1 se desarrollaron en blastocistos de buena calidad (categoría A/B), mientras que otros embriones (6/17) se desarrollaron en blastocistos sin ICM distinguidas (categoría C) o se apilaron en la etapa de mórula (4/17). Esta diferencia marcada en el destino embriónico después de la exposición a PluriSIn #1 fue altamente significativa (p=0.0001).
Ejemplos representativos de blastocistos se muestra en la Figura 58, que muestra blastocistos de control de buena calidad y blastocistos tratados con PluriSIn, blastocistos tratados con PluriSIn de mala calidad y apilamiento de embriones tratados con PluriSIn en la etapa de mórula.
Como se muestra en las Figuras 59 y 60, la suplementación de ácido oleico rescató la mayoría de los embriones de los efectos de PluriSIn #1, con 5 de 7 embriones suplementados con ácido oleico (71%) que se desarrollan en blastocistos de alta calidad, como es opuesto a 7 de 17 (41%) en la ausencia de ácido oleico.
Los experimentos anteriores con embriones de ratón luego se repitieron utilizando el inhibidor de SCDl A939572 en lugar de PluriSIn #1, y se compararon con los resultados obtenidos con PluriSIn #1, con el fin de confirmar que los efectos de PluriSIn #1 están asociados con la inhibición de la actividad de SCDl.
Como se muestra adicionalmente en las Figuras 60 y 61, A939572 significativamente inhibió el desarrollo de los blastocistos, con únicamente 5 de 9 embriones (56%) expuestos a A939572 que se desarrollan en blastocistos de alta calidad, como es opuesto a 18 de 18 embriones de control (p=0.007). Como se muestra adicionalmente en la misma, la suplementación con ácido oleico incrementó la proporción de blastocistos de alta calidad a 5 de 7 (71%).
Estos resultados indican que PluriSIn #1 es citotóxico a las células ICM y de esta manera evita el desarrollo normal del blastocisto. Estos resultados además indican que la dependencia de PSCs sobre SCD1 (por ejemplo, como es descrito en el Ejemplo 4) es inherente al estado pluripotente, tanto in vi tro como in vivo, y que la citotoxicidad de PluriSIn #1 hacia las células ICM está asociada con la inhibición de la actividad de SCD1.
EJEMPLO 6 Efecto de la citotoxicidad de PluriSIn sobre teratomas Un objetivo particularmente deseable de la inhibición de hPSC selectiva es la prevención de la formación de teratoma mediante la remoción eficiente de células no diferenciadas residuales del cultivo. La utilidad de los PluriSIns para tal aplicación por lo tanto se probó utilizando en ensayos in vitro e in vivo, como es descrito en la sección de Materiales y Métodos.
Los PluriSIns primero se probaron en varias condiciones de cultivo y duraciones de exposición. De manera interesante, los PluriSIns fueron más potentes en placas más pequeñas (384 y 96 cavidades) que en placas más grandes (6 cavidades o 10 cm) y más potentes en bajas densidades de células que en altas densidades de células, sugiriendo un efecto protector posible conferido por las colonias grandes.
De esta manera, por ejemplo, como se muestra en la Figura 62, una exposición de 48 horas de las células a PluriSIn #1, 20 mM se requirió para completar la eliminación de células no diferenciadas cultivadas en placas de 6 cavidades.
Además, como se muestra en las Figuras 63A y 63B, las hPSCs cultivadas sobre MEFs (fibroblastos embriónicos de ratón) con el medio de células ES regulares fueron menos sensibles a PluriSIns. Este resultado puede ser debido a las diferentes composiciones de los medios, o debido a un efecto protector de los MEFs.
Entre las condiciones probadas, los PluriSIns se encontraron que eliminan hPSCs más potentemente cuando se cultivan sobre placas recubiertas de MatrigelMR, sin células alimentadoras, utilizando el medio definido mTeSRl.
El número de células no diferenciadas residual que permaneció en cultivo después de la aplicación de PluriSIn #1 in vitro luego se evaluó, y se determinó la tumorigenicidad in vivo de tales células.
Las poblaciones de células mezcladas se cultivaron en placas de 6 cavidades y se expusieron a PluriSIn #1 durante 48 horas. Las células luego se analizaron mediante el análisis de FACS, utilizando el manchado para el marcador pluripotente TRA-1-60, y mediante la formación de imagen de microscopía de fluorescencia de 0CT4, como es descrito en la sección de Materiales y Métodos.
Como se muestra en la Figura 64, la exposición a PluriSIn #1 durante 48 horas eliminó arriba de 99% de las células pluripotentes del cultivo, como es determinado mediante el análisis de FACS.
Como se muestra en la Figura 65, la exposición a PluriSIn #1 durante 48 horas eliminó casi todas las células que expresan OCT4, como es determinado mediante la formación de imagen de microscopía de fluorescencia de células CSES2-S02/3.
Estos resultados indican que PluriSIn #1 es altamente efectivo en eliminar las células pluripotentes de las poblaciones de células mezcladas.
Para evaluar la tumorigenicidad in vivo, las hPSCs se cultivaron bajo las condiciones mencionadas en lo anterior en la presencia o ausencia de PluriSIn #1, y los cultivos luego se inyectaron subcutáneamente en ratones inmunocomprometidos NOD-SCID IL2Ry-/-, que se han reportado previamente que son especialmente susceptibles a tumores derivados de humano [Quintana y colaboradores, Nature 456:593-598 (2008)]. Los ratones se sacrificaron después de 4-6 semanas, y luego se estimó la formación de teratoma.
Todos los ratones (3/3) inyectados con las células ES H9 de control desarrollaron teratomas, mientras que ninguno de los ratones (0/3) inyectados con células ES H9 tratadas con PluriSIn #1 desarrollaron teratomas.
De manera similar, las líneas de células CSES2-S02 y BJ-ÍPS28 se inyectaron en ratones inmunocomprometidos (2 ratones para cada línea de células), con células de control y células tratadas que son inyectadas en los dos lados del cuerpo del mismo animal.
Todos los ratones inyectados (4/4) desarrollaron teratomas solamente en el lado inyectado con hPSCs de control. Las Figuras 66A y 66B muestran ejemplos representativos del desarrollo de teratoma únicamente en el lado inyectado con células no tratadas.
El efecto de PluriSIns fue en la formación de teratoma que luego se evaluó en un modelo diseñado para simular una instalación clínica. Las células ES e iPS humanas se diferenciaron espontáneamente en cultivo durante un periodo de 10 días, y las células diferenciadas luego se recolectaron y se colocaron conjuntamente con células no diferenciadas, en una mezcla 1:1 de células no diferenciadas y diferenciadas, como es descrito en la sección e Materiales y Métodos. Después de una exposición de 48 horas a PluriSIn #1, las células se recolectaron y se inyectaron subcutáneamente en ratones NOD-SCID IL2Ry-/-, con cada ratón que es inyectado con células tratadas con PluriSIn #1 en un lado de su cuerpo y con células de control en el otro lado. El mismo número total de células se inyectó en ambos lados.
Todos los ratones inyectados (4/4) desarrollaron teratomas únicamente en el lado inyectado con hPSCs de control. Las Figuras 67A y 67B muestran ejemplos representativos del desarrollo de teratoma únicamente en el lado inyectado con células no tratadas. Como se muestra en la Figura 68, el desarrollo del teratoma se confirmó mediante el examen histológico.
Como se muestra en la Tabla 6 enseguida, tomados conjuntamente, no se generaron teratomas (0/11) en ratones en el trasplante con hPSCs tratadas con PluriSIn #1, mientras que las células no tratadas siempre generados teratomas (10/10) en ratones en el trasplante. De manera similar, no se generaron teratomas (0/4) en los ratones en el trasplante con mezclas 1:1 tratadas con PluriSIn #1 de hPSCs diferenciadas y no diferenciadas, mientras que las mezclas no tratadas siempre generaron teratomas (4/4) en los ratones en el trasplante.
Tabla 6: Incidencia de la formación de -teratoma después de la inyección de las hPSCs tratadas con PluriSIn #1 o no tratadas Los resultados anteriores indican que PluriSIns se pueden utilizar eficientemente para remover células no diferenciadas tumorigénicas de los cultivos de células derivadas de HPSC.
E ) MPLO 7 Efectos de los inhibidores de SCD1 sobre la inhibición de célula madre pluripotente Como es descrito anteriormente en la presente, los inhibidores de SCD1, A939572 y CAY-10566 causaron una disminución considerable en la viabilidad de las células madre pluripotentes, y los PluriSIns, que exhiben un efecto inhibidor de SCD, son efectivos en eliminar las células pluripotentes de las poblaciones de células mezcladas, y la remoción de células no diferenciadas tumorigénicas de los cultivos de las células derivadas de HPSC.
Con el fin de averiguar la eficacia de los inhibidores de SCD1 contra células no diferenciadas tumorigénicas, el inhibidor de SCD especifico A939572 se probó para la prevención de la formación de teratoma después del trasplante de células madre embriónicas, utilizando procedimientos tal como es descrito en el Ejemplo 6.
Como se muestra en la Figura 69, el tratamiento con A939572 exhibió un efecto protector contra la formación de teratoma en el trasplante de células madre embriónicas en ratones.
Los resultados anteriores indican que la inhibición de la actividad de SCD1 se puede utilizar de manera eficiente para remover las células no diferenciadas tumorigénicas de los cultivos de células derivadas de hPSC.
Con el fin de averiguar adicionalmente la eficacia de los inhibidores de SCD1 contra células no diferenciadas tumorigénicas, un inhibidor de SCD especifico adicional (por ejemplo, CAY-10566) se prueba para la prevención de formación de teratoma después del trasplante de células madre embriónicas, como es descrito anteriormente en la presente.
EJEMPLO 8 Efecto de la inactivación de siRNA de la expresión SCDl sobre la inhibición de células madre pluripotentes Como es descrito anteriormente en la presente, los inhibidores de SCDl, A939572 y CAY-10566 causaron una disminución considerable en la viabilidad de las células madre pluripotentes, que es consistente con el efecto inhibidor de SCD del PluriSIns.
Con el fin de demostrar adicionalmente que la inhibición de SCDl en general puede inhibir las células madre pluripotentes, la expresión SCDl se inhibió utilizando la inactivación de siRNA del gen SCDl, utilizando procedimientos descritos en la sección de Materiales y Métodos. Las células no tratadas y células tratadas con siRNA de imitación se utilizaron como un control. Luego se determinó la viabilidad de las células madre pluripotentes.
Como se muestra en las Figuras 70 y 71, la inactivación de siRNA del SCDl dio por resultado una disminución considerable en la viabilidad de las células madre (p=0.002).
Como se muestra adicionalmente en la Figura 71, la disminución en la viabilidad fue dependiente de la dosis de siRNA.
Como se muestra adicionalmente en la Figura 71, la suplementación exógena del ácido oleico rescató a las células de la inactivación de siRNA del gen SCDl (p=0.006) Estos resultados además confirman que la inhibición de SCDl en general puede inhibir las células madre pluripotentes, y que la inhibición de SCDl se puede efectuar por la vía de una secuencia de silenciamiento de ácido nucleico.
EJEMPLO 9 Efecto de la citotoxicidad en PluriSIn en células de cáncer no diferenciadas Una inhibición selectiva de células no diferenciadas permite la posibilidad de inhibición selectiva de células de cáncer, por ejemplo, tratamiento del cáncer. El efecto de PluriSIn #1 sobre las células de cáncer no diferenciadas por lo tanto se probó y se comparó con el efecto en células diferenciadas relacionadas.
En un experimento, los fibroblastos BJ inmortalizados sirvieron como células diferenciadas y se compararon con los fibroblastos BJ inducidos a someterse a transformación celular, que sirvió como sus contrapartes cancerosas no diferenciadas. Los fibroblastos se inmortalizaron mediante la expresión de transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), y se transformó mediante una combinación de la expresión de hTERT y el H-RasV12 mutante oncogénico, concomitantemente con la inhibición de p53 y la proteina de retinoblastoma (RB) mediante el virus 40 de simio (SV40) antigenos T Grande (LT) y T Pequeño (ST), de acuerdo con los procedimientos descritos en Scaffidi & Misteli [ Nature Cell Biology 13:1051-1061 (2011)].
En un segundo experimento, las células de glioma similares a madre no diferenciadas (SLGCs) se compararon con SLGCs diferenciadas por la adhesión de monocapa y la exposición a ácido retinoico 1 mM durante una semana, de acuerdo con los procedimientos descritos por Campos y colaboradores, [Clinical C ncer Research 16:2715-2728 (2010)]. La diferenciación de SLGCs está asociada con una reducción en la tumorigenicidad [Campos y colaboradores, Clinical C ncer Research 16:2715-2728 (2010)].
Las células diferenciadas y no diferenciadas se expusieron a PluriSIn #1 en concentraciones de hasta 100 mM durante 72 horas bajo condiciones de suero bovino fetal bajo (2%). Su viabilidad luego se midió utilizando un ensayo de viabilidad de azul de metileno, como es describe anteriormente en la presente.
Como se muestra en la Figura 72, PluriSIn #1 fue altamente citotóxico hacia los fibroblastos BJ transformados, mientras que tiene poco efecto sobre los fibroblastos BJ normales (inmortalizados).
Este resultado indica que la transformación celular, que da por resultado células de cáncer, significativamente incrementa la sensibilidad celular a PluriSIn #1.
Como se muestra en la Figura 73, PluriSIn #1 fue altamente citotóxico hacia SLGC no diferenciada, pero no tuvo efecto aparente sobre las SLGCs diferenciadas.
Este resultado indica que las células de cáncer pierden su sensibilidad a PluriSIn #1 en la diferenciación a células no tumorigénicas, aún después de únicamente una semana de diferenciación.
Los resultados anteriores sugieren que PluriSIns son selectivamente citotóxicos a las células de cáncer no diferenciadas (por ejemplo, células similares a madre de cáncer) de la misma manera que PluriSIns son selectivamente citotóxicos a las células madre pluripotentes.
Aunque la invención se ha descrito en conjunción con modalidades especificas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para aquellos expertos en la téenica. Por consiguiente, se propone abarcar todas de tales alternativas, modificaciones y variaciones que caen dentro del espíritu y alcance amplio de las reivindicaciones adjuntas.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente en su totalidad por referencia en la especificación, al mismo grado como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada en la presente por referencia. Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no debe ser considerada como una admisión de que tal referencia está disponible como la téenica previa para la presente invención. Al grado que se utilizan encabezados de sección, no se deben considerar como necesariamente limitantes.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste Fórmula I, un compuesto de la Fórmula II Fórmula II, un compuesto de la Fórmula III Fórmula III, un compuesto de la Fórmula IV Fórmula IV, . Fórmula V, y un compuesto de la Fórmula VI Fórmula VI, caracterizado porque es para uso como un inhibidor citotóxico de células no diferenciadas, en donde: R1 es hidrógeno y R2 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, 2,4-dioxo-5-fluoropirimidin-1-ilcarbonilo, 2-metilbenzofuran-3-ilmetilenamino, y -NH-R5, en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de: piridinilcarbonilo, 2-hidroxil-2-fenil-2-tiofen-2-il-acetilo, alquil(Ci-6)-carbonilo, N-(etoxicarbonilmetil)-2,4-dioxo-pirrolidin-3- iliden-metilo, naftilsulfonilo, y N-hidroxi-acetiraidoilo; o en donde: R1 es benzoilo y R2 es 4-clorobenzamido; y R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, halo, NH2, bifeniloximetilo y alquilo (Ci_4), con la condición de que por lo menos uno de R1, R2, R3 y R4 no sea hidrógeno, halo, NH2, o alquilo(Ci_4)·
2. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es de la Fórmula I.
3. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque R1 es hidrógeno, y R2 se selecciona del grupo que consiste de: 2,4-dioxo-5-fluoropirimidin-1-ilcarbonilo, 2-metilbenzofuran-3-ilmetilenamino, y -NH-R5, en donde R5 se selecciona del grupo que consiste de: piridinilcarbonilo, 2-hidroxil-2-fenil-2-tiofen-2-il-acetilo, alquil(Ci_e)-carbonilo, N-(etoxicarbonilmetil)-2,4-dioxo-pirrolidin-3- iliden-metilo, naftilsulfonilo, y N-hidroxi-acetimidoilo; o en donde: R1 es benzoilo y R2 es 4-clorobenzamido; y R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, cloro, NH2 y metilo.
4. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es de la Fórmula II: Fórmula II
5. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es de la Fórmula III: Fórmula III
6. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es de la Fórmula IV : Fórmula IV
7. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es de la Fórmula V: Fórmula V
8. El compuesto para uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto es de la Fórmula VI: Fórmula VI
9. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto como es descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un portador farmacéuticamente aceptable.
10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque es para el uso en la inhibición de células no diferenciadas.
11. El compuesto para uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composición para uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las células no diferenciadas comprenden células madre pluripotentes.
12. El compuesto para uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composición para uso de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las células no diferenciadas comprenden células de cáncer no diferenciadas.
13. Un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o la composición de la reivindicación 9, caracterizado porque es para el uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno proliferativo asociado con la proliferación de células no diferenciadas en un sujeto en necesidad del mismo.
14. Un método para identificar un candidato principal para inhibir células madre pluripotentes, el método caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una pluralidad de muestras de células madre pluripotentes, cada una de las muestras que comprende un tipo diferente de células madre pluripotentes; (b) poner en contacto las muestras con un compuesto candidato; y (c) monitorear una viabilidad de las células madre en las muestras, mediante lo cual si la viabilidad se reduce en por lo menos dos de las muestras, el compuesto candidato se identifica como capaz de inhibir las células madre pluripotentes, para de esta manera identificar el candidato principal.
15. Uso de un inhibidor de SCD1 (Estearoil-CoA desaturasa-1), caracterizado porque es como un inhibidor citotóxico de células madre pluripotentes.
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