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MX2014013319A - Análogos de péptido-2 tipo glucagón (glp-2). - Google Patents

Análogos de péptido-2 tipo glucagón (glp-2).

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MX2014013319A
MX2014013319A MX2014013319A MX2014013319A MX2014013319A MX 2014013319 A MX2014013319 A MX 2014013319A MX 2014013319 A MX2014013319 A MX 2014013319A MX 2014013319 A MX2014013319 A MX 2014013319A MX 2014013319 A MX2014013319 A MX 2014013319A
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MX
Mexico
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ser
gly
glp
absent
lys
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MX2014013319A
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Ditte Riber
Rasmus Just
Kirsten Lindegaard Bovbjerg
Wayne Shaun Russell
Original Assignee
Zealand Pharma As
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Publication date
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Abstract

Se divulgan análogos de GLP-2 que comprenden una o más sustituciones en comparación con h[Gly2]GLP-2 y que pueden tener la propiedad de una actividad GLP-1 alterada, y su uso médico. Los análogos son particularmente útiles para la profilaxis, tratamiento o mejora de los efectos secundarios gastrointestinales asociados a la diabetes.

Description

ANÁLOGOS DE PÉPTIDO-2 TIPO GLUCAGÓN (GLP-21 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a análogos de peptido-2 tipo glucagón (GLP-2) con actividad GLP-1 alterada y a su uso médico, por ejemplo en la profilaxis, tratamiento o mejora de enfermedades y afecciones tales como endotoxemia metabólica, diabetes, obesidad, y el síndrome metabólico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La inflamación de bajo grado es un factor de riesgo independiente de enfermedad cardiaca, apoplejía, diabetes y mortalidad. Los hallazgos de investigación sugieren que la aterosclerosis, que implica la formación de depósitos grasos (placas) y la actividad de radicales libres y agentes infecciosos en las arterias, puede vinculares a artritis de los huesos y articulaciones porque ambos son trastornos inflamatorios. La inflamación precede a la detección de resistencia a la insulina y por lo tanto puede ser un buen indicador de diabetes.
Además, se ha demostrado que los ratones obsesos (ob/ob y db/db) tienen una función alterada de la barrera mucosa e inflamación sistémica aumentada (Brun et al., Am J Physiol Gastrointesl Liver Physiol 292:G518-G525, 2007, 5 de octubre de 2008). Estas observaciones se extendieron adicionalmente a ratones C57BL8/J mantenidos en dieta de elevado contenido de grasas (Cani et al., DIABETES, VOL 57, junio de 2008, pág. 1470-1481) y ratones diabéticos no obesos (Hadjiyanni etal., 2009). Cani y colaboradores, gut.bmj.com, 2009) informaron de que en ratones ob/ob, la alteración de la microbiota intestina reducía la permeabilidad e inflamación intestinal mediante una vía dirigida por GLP-2. Además, la permeabilidad aumentada observada en pacientes obsesos y diabéticos ahora es probable que tenga un papel más vital en el progreso de la enfermedad que lo anticipado previamente. La permeabilidad intestinal aumentada conduce a transporte aumentado de lipopolisacárido (LPS) bacteriano a través de la luz intestinal. Este LPS aumentado activa las células inmunes tales como macrófagos en circulación y que redicen en órganos en el cuerpo causando inflamación crónica de grado bajo implicada en la patogénesis de muchas enfermedades. Este fenómeno se llama endotoxemla metabólica (ME) y puede verse como un nuevo concepto en la patología de enfermedad crónica.
El abordamiento de ME y enfermedades asociadas está dentro del alcance de esta invención. Las enfermedades que incluyen diabetes mellitus tipo II, aterosclerosis, Enfermedad de Parkinson y metástasis cancerosa surgen en el contexto de inflamación crónica de bajo grado, cuya fuente no se ha definido claramente. De forma interesante, varios estudios recientes han demostrado correlaciones significativas entre el desarrollo de enfermedad y los niveles plasmáticos de endotoxina (Chang 2011, J Med Sci 2011; 31 (5): 191 -209).
El mecanismo hipotetizado por el cual un agonista dual de GLP2-GLP1 funcionaría en un entorno de diabetes con obesidad se representa en la Figura 1. El componente GLP2 reduce la inflamación y la endotoxemia metabólica mientras que el componente GLP1 proporciona control de la glucosa y perdida de peso a través de mecanismos clásicos dependientes de GLP1.
El GLP-2 humano es un péptido de 33 aminoácidos derivado del procesamiento post-traduccional específico de proglucagón en las células L enteroendocrinas del intestino y en regiones específicas del tronco encefálico. Se co-secreta junto con péptido-1 tipo glucagón (GLP-1), oxintomodulina, y glicentina, en respuesta a la ingesta de nutrientes.
GLP-2 induce crecimiento significativo del epitelio mucoso del intestino delgado mediante la estimulación de proliferación de células madre en las criptas e inhibición de la apoptosis en las vellosidades (Drucker et al., Proc Nati Acad Sci U S A 93:7911 -7916 (1998)). GLP-2 también tiene efectos de crecimiento sobre el colon. Además, GLP-2 inhibe el vaciado gástrico y la secreción de ácido gástrico (Wojdemann et al., J Clin Endocrinol Metab.84:2513-2517 (1999)), potencia la función de barrera intestinal (Benjamín et al., Gut47:112-9 (2000)), estimula el transporte intestinal de hexosa mediante la regulación positiva de transportadores de glucosa (Cheeseman, Am J Physiol. R1965-71 (1997)), y aumenta el flujo de sangre intestinal (Guan et al., Gastroenterology125: 138147 (2003)).
GLP-2 se une a un único receptor acoplado a proteína G que pertenece a la familia de glucagón secretina de clase II. El receptor de GLP-2 se expresa en el intestino delgado, colon y estómago, que tambien son sitios conocidos por ser sensibles a GLP-2 (Yusta et al., Gastroenterology 119:744-755 (2000)). Sin embargo, el tipo celular diana para la estimulación del receptor de GLP-2 en el tracto gastrointestinal sigue sin estar claro, y los mediadores intracelulares corriente abajo acoplados al Receptor de GLP-2 están mal comprendidos.
Los efectos específicos y beneficiosos demostrados de GLP-2 en el intestino delgado han levantado mucho interés en cuanto al uso de GLP-2 en el tratamiento de enfermedad o lesión intestinal (Sinclair y Drucker, Physiology 2005: 357-85). Además, GLP-2 ha demostrado prevenir o reducir el daño del epitelio mucoso en una amplia cantidad de modelos preclínicos de lesión intestinal, incluyendo enteritis inducida por quimioterapia, lesión por isquemia-reperfusión, colitis inducida por sulfafo de dextrano y modelos genéticos de enfermedad inflamatoria del intestino (Sinclair y Drucker Physiology 2005: 357-65).
Además, la expresión del ARNm de GLP-2R en el estómago (Yusta et al., 2000) junto con la observación de que GLP-2 reduce la motilidad gástrica y la secreción de ácido gástrico (Meier et al., GASTROENTEROLOGY 2006; 130:44-54) proporciona amplias evidencias de que el estómago es directa o indirectamente sensible a GLP-2. No obstante, aún no se ha explorado el uso de GLP-2 o análogos de GLP-2 en condiciones caracterizadas por daño al revestimiento gástrico.
GLP-2 se secreta como un péptido de 33 aminoácidos con la siguiente secuencia His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-lle-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-lle-Asn-Trp-Leu-lle-GIn-Thr-Lys-lle-Thr-Asp (SEC ID N° 1). Se escinde rápidamente por la enzima DPP IV en la alanina (Ala) en la posición 2 relativa al extremo N-terminal para formar un péptido GLP-2 humano inactivo (3-33). Esta rápida degradación enzimática de GLP-2(1-33), además de la eliminación renal, provoca una semi-vida de aproximadamente 7 minutos (Tavares et al., Am. J, Physiol. Endocrinol, Metab.278?134-E139 (2000)).
Se describen análogos representativos de GLP-2, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N° 5.789.379; 5.994.500; 6.184.201; 6.184.208; publicaciones internacionales N° WO 97/39031; WO 01/41779; WO 02/066511 y DaCambra et al. (Biochemistry 2000, 39, 8888-8894). Todas las referencias citadas en este documento se incorporan de forma expresa por referencia en su totalidad.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Ampliamente, la presente invención se refiere a análogos de GLP-2 que comprenden una o más sustituciones en comparación con GLP-2 de tipo silvestre y que pueden tener la propiedad de una actividad GLP-1 alterada, preferiblemente aumentada, por ejemplo, evaluada en ensayos de eficacia in vitro. La actividad GLP-1 , por ejemplo, puede medirse determinando los valores de CE50 del receptor de GLP- 1 inferiores que para GLP-2 nativo. En algunas realizaciones, los análogos de GLP-2 de la invención comprenden una o más sustituciones en una posición de aminoácido correspondiente a una o más de las posiciones 2, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 19, 20, 21, 24, 27 y/o 28 de la secuencia de GLP-2 de tipo silvestre en combinación con Gln, Lys o Glu en la posición 17. En algunas realizaciones, los análogos de GLP- 2 de la invención comprenden una o más sustituciones en una posición de aminoácido correspondiente a una o más de las posiciones 2, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 20, 21 , 24, 27 y/o 28 de la secuencia de GLP-2 de tipo silvestre en combinación con Gln, Lys o Glu en la posición 17. En algunas realizaciones, los análogos de GLP-2 de la invención comprenden una sustitución conservativa o no conservativa en la posición 2 y/o una sustitución o deleción de uno o más de los aminoácidos correspondientes a un aminoácido de las posiciones 28 a 33 de la secuencia de GLP-2 de tipo silvestre. En algunas realizaciones, los análogos de GLP-2 de la presente invención opcionalmente comprenden sustituyentes lipófilos conjugados a una o más de las posiciones 12, 14, 16, 17, 19, 20, 24, 27, 28 y 32. En algunas realizaciones, los análogos de GLP-2 de la presente invención opcionalmente comprenden sustituyentes lipófilos conjugados a una o más de las posiciones 12, 16, 17, 20, 24, 27, 28 y 32.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP-2 está representado por la fórmula general I: R1 - His-X2-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-Ala- C19-X20-X21 -Phe-lle-X24-T rp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31 -X32-X33-R2 (I) (SEC ID N° 2) o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que: R1 es hidrógeno, alquilo Ci-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; X2 es Gly, Ala o Aib; X3 es Glu, Gln o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X8 es Asp, Glu o Ser; X9 es Glu o Asp; X10 es Met, Val, Leu o Tyr; X11 es Asn, Ser o Ala; X12 es Thr, Ser o Lys; X13 es lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln; X14 es Leu o Met; X15 es Asp o Glu; X16 es Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu o Lys; X17 es Gln, Lys, Arg, His o Glu; X19 es Ala o Val; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 es lie, Leu, Val, Glu o Lys: X28 es Gln, Asn, Lys, Ser, Y1 o ausente; X29 es Thr, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es lie, Pro o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; Y1 es Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, o Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es NH2 U OH; con la condición de que el análogo de GLP-2 de fórmula I no sea HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD; (SEC ID N° 3) HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; (SEC ID N° 4) o HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK (SEC ID N° 5) En esta fórmula, X31 también puede ser Y1. X28 también puede ser Gly. X29 también puede ser Ala.
Además, Y1 puede estar presente entre X33 y R2. Por tanto, puede concebirse una posición X34, donde X34 es Y1 o está ausente.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP-2 es un análogo de GLP-2 de acuerdo con la fórmula I o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: R1 es hidrógeno, X2 es Gly, Ala o Aib; X3 es Glu, Gln o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X8 es Asp, Glu o Ser; X9 es Glu o Asp; X10 es Met, Val, Leu o Tyr; X11 es Asn, Ser, o Ala; X12 es Thr o Lys; X14 es Leu o Met; X15 es Asp o Glu; X16 es Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu o Lys; X17 es Gln o Lys; X19 es Ala o Val; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 es lie, Leu, Val o Lys; X28 esGln,Asn,Y1oausente; X29 esThr,Y1oausente; X30 esLys,Y1oausente; X31 eslie,Pro,Y1oausente; X32 esThr,Y1oausente; X33 esAsp,Asn,Y1oausente; Y1 es-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2es NH2UOH; con la condición de que el análogo de GLP-2 de fórmula I no sea HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD; HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; o HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK.
En esta fórmula, X13 puede ser lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln.
X28 tambien puede ser Gly. X29 también puede ser Ala. Y1 puede estar presente entre X33 y R2.
En algunas realizaciones X14 de la fórmula I es Leu.
En algunas realizaciones X14 de la fórmula I es Met.
En algunas realizaciones, X17 de la fórmula I es Gln.
En algunas realizaciones, X17 de la fórmula I es Lys.
En algunas realizaciones, X17 de la fórmula I es Glu.
En algunas realizaciones X19 de la fórmula I es Ala.
En algunas realizaciones X19 de la fórmula I es Val.
En algunas realizaciones, X16 de la fórmula I es Gly y X17 de la fórmula I es Gln. En algunas realizaciones, X16 de la fórmula I es Gly y X17 de la fórmula I es Lys. En algunas realizaciones, X16 de la fórmula I es Gly y X17 de la fórmula I es Glu. En algunas realizaciones, X2 de la fórmula I es Aib, X16 de la fórmula I es Gly y X17 de la fórmula I es Gln.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula I es Aib, X16 de la fórmula I es Gly y X17 de la fórmula I es Lys.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula I es Aib, X16 de la fórmula I es Gly y X17 de la fórmula I es Glu.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula I es Gly, X16 de la fórmula I es Gly y X17 de la fórmula I es Gln.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula I es Gly, X16 de la fórmula I es Gly y X17 de la fórmula I es Lys.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula I es Gly, X16 de la fórmula I es Gly y X17 de la fórmula I es Glu.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP-2 está representado por la fórmula general la: R1 - His-X2-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-Leu-X15-X16-X17-Ala- Ala-X20-X21 -Phe-lle-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31 -X32-X33-R2 (la) (SEC ID N° 6) o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que: R1 es hidrógeno, alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; X2 es Gly, Ala o Aib; X3 es Glu, Gln o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X8 es Asp, Glu o Ser; X9 es Glu o Asp; X10 es Met, Val, Leu o Tyr; X11 es Asn o Ser; X12 es Thr, Ser o Lys; X13 es lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln; X15 es Asp o Glu; X16 es Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu o Lys; X17 es Gln, Lys, Arg, His o Glu; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 eslie,Leu,Val,GluoLys; X28 esGln,Asn,Lys,Ser,Y1oausente; X29 esThr,Y1oausente; X30es Lys,Y1oausente; X31 eslie,Prooausente; X32 esThr,Y1oausente; X33 esAsp,Asn,Y1oausente; Y1 esGly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser,o Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser;y R2es NH2uOH; con la condición de que el análogo de GLP-2 de fórmula la no sea HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD; HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; o HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK.
En esta fórmula, X31 también puede ser Y1.
Además, Y1 puede estar presente entre X33 y R2. Por tanto, puede concebirse una posición X34, donde X34 es Y1 o está ausente.
X28 también puede ser Gly. X29 también puede ser Ala.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP-2 es un análogo de GLP-2 de acuerdo con la fórmula la o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que; R1 es hidrógeno, X2 es Gly, Ala o Aib; X3 es Glu, Gln o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X8 es Asp, Glu o Ser; X9 es Glu o Asp; X10 es Met, Val, Leu o Tyr; X11 es Asn o Ser; X12 es Thr o Lys; X15 esAspo Glu; X16 esAsn,Gln,Gly,Ser,Ala,GluoLys; X17 esGlnoLys; X20es Arg,LysoHis; X21es Asp,GluoLeu; X24es Asn,Ala,GluoLys; X27es lie,Leu,ValoLys; X28es Gln,Asn,Y1oausente; X29es Thr,Y1oausente; X30es Lys,Y1oausente; X31es lie,Pro,Y1oausente; X32es Thr,Y1oausente; X33es Asp,Asn,Y1oausente; Y1 es-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2es NH2UOH; con la condición de que el análogo de fórmula la no sea HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD; HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; o HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK.
En esta fórmula, X13 puede ser lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln.
X28 también puede ser Gly. X29 también puede ser Ala.
Y1 puede estar presente entre X33 y R2.
En algunas realizaciones, X17 de la fórmula la es Gln.
En algunas realizaciones, X17 de la fórmula la es Lys.
En algunas realizaciones, X17 de la fórmula la es Glu.
En algunas realizaciones, X16 de la fórmula la es Gly y X17 de la fórmula la es Gln.
En algunas realizaciones, X16 de la fórmula la es Gly y X17 de la fórmula la es Lys.
En algunas realizaciones, X16 de la fórmula la es Gly y X17 de la fórmula la es Glu.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula la es Aib, X16 de la fórmula la es Gly y X17 de la fórmula la es Gln.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula la es Aib, X16 de la fórmula la es Gly y X17 de la fórmula la es Lys.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula la es Aib, X16 de la fórmula la es Gly y X17 de la fórmula la es Glu.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula la es Gly, X16 de la fórmula la es Gly y X17 de la fórmula la es Gln.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula la es Gly, X16 de la fórmula la es Gly y X17 de la fórmula la es Lys.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula la es Gly, X16 de la fórmula la es Gly y X17 de la fórmula la es Glu.
En una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o independientemente, X8-X9-X10-X11 puede ser Ser-Glu-Leu-Ala.
En las fórmulas genericas descritas anteriormente, las posiciones X28 a X33 pueden seleccionarse entre ciertos restos de aminoácido, o pueden ser Y1, o pueden estar ausentes. Se pretende que el análogo de GLP-2 contenga no más de un resto Y1, y que si está presente, Y1 forme la parte C-terminal de la molécula. Por tanto, si cualquiera de las posiciones X28 a X33 es Y1, todas las posiciones cadena abajo estarán ausentes; es decir aquellas posiciones X29 a X33 (o X34) cadena abajo de la de Y1 están ausentes). En este contexto, las posiciones "cadena abajo" de una posición dada son aquellas localizadas C-terminales de esa posición.
Además, si cualquiera de las posiciones X28 a X33 está ausente, entonces todas las posiciones cadena debajo de esa posición también estarán ausentes (excepto que Y1 puede estar presente). Por tanto, las únicas combinaciones de estas posiciones que pueden estar ausentes son X33; X32-X33; X31-X32-X33; X30-X31-X32-X33; X29-X30-X31-X32-X33; y X28-X29-X30-X31-X32-X33. Dicho de otro modo, si la posición XN está presente (donde N es un número entero entre 28 y 33) entonces la posición X(N-1) también está presente.
El análogo de GLP-2 puede estar representado por la fórmula general II; R1 - H ¡S-X2-X3-G ly-X5-Phe-X7 -Ser-G lu-Leu-Ala-X 12-X13-X14-X15-X16-X17- Ala-X19-X20-X21 -Phe-lle-X24-T rp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31 -X32-X33-X34-R2 (II) (SEC ID N° 7) o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, en la que: R1 es hidrógeno, alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; X2 es Gly, Ala o Aib; X3 es Glu, Gln o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X12 es Thr, Ser o Lys; X13 es lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln; X14 es Leu o Met; X15 es Asp o Glu; X16 es Gly, Ser, Ala, Glu o Lys; X17 es Gln o Lys; X19 es Ala o Val; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 es lie, Leu, Val, Glu o Lys: X28 es Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1 o ausente; X29 es Thr, Ala, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es lie, Pro, Y1 o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; X34 es Y1 o ausente; Y1 es Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, o Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es NH2 u OH; en la que el análogo de GLP-2 contiene no más de un Y1; si cualquiera de X28 a X33 es Y1 , aquellas posiciones X29 a X34 cadena abajo de la de Y1 están ausentes; si cualquiera de X28 a X33 está ausente, aquellas posiciones X29 a X33 cadena abajo de esa posición también están ausentes.
En algunas realizaciones, X16 de la fórmula II es Gly, Ser o Ala. En dichas realizaciones, X17 de la fórmula II puede ser Lys, o X17 de la fórmula II puede ser Gln.
Además adicionalmente o como alternativa, X2 de la fórmula II puede ser Gly o Ala.
Por tanto, en algunas realizaciones, X16 de la fórmula II es Gly y X17 de la fórmula II es Gln.
En algunas realizaciones, X16 de la fórmula II es Gly y X17 de la fórmula II es Lys.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula II es Gly, X16 de la fórmula II es Gly y X17 de la fórmula II es Gln.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula II es Gly, X16 de la fórmula II es Gly y X17 de la fórmula II es Lys.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula II es Aib, X16 de la fórmula II es Gly y X17 de la fórmula II es Gln.
En algunas realizaciones, X2 de la fórmula II es Aib, X16 de la fórmula II es Gly y X17 de la fórmula II es Lys.
Por tanto, en algunas realizaciones de fórmula II; R1 es hidrógeno, alquilo Ci^ (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; X2 es Gly o Aib; X3 es Glu o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X12 es Thr, Ser o Lys; X13 es lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln; X14 es Leu o Met; X15 es Asp o Glu; X16 es Gly, Ser o Ala; X17 es Gln o Lys; X19 es Ala o Val; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 es lie, Leu, Val, Glu o Lys; X28 es Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1 o ausente; X29 es Thr, Ala, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es He, Pro, Y1 o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; X34 es Y1 o ausente; Y1 es Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, o Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es NH2 u OH; en la que el análogo de GLP-2 contiene no más de un Y1; si cualquiera de X28 a X33 es Y1 , aquellas posiciones X29 a X34 cadena abajo de la de Y1 están ausentes; si cualquiera de X28 a X33 está ausente, aquellas posiciones X29 a X33 cadena abajo de esa posición tambien están ausentes.
En algunas realizaciones, X16 es Gly y X17 es Gln.
En algunas realizaciones, X16 es Gly y X17 es Lys.
En algunas realizaciones, X2 es Gly, X16 es Gly y X17 es Gln.
En algunas realizaciones, X2 es Gly, X16 es Gly y X17 es Lys.
En algunas realizaciones, X2 es Aib, X16 es Gly y X17 es Gln.
En algunas realizaciones, X2 es Aib, X16 es Gly y X17 es Lys.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP-2 está representado por la fórmula general III: R1- His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-Ser-Glu-Leu-Ala-X12-X13-Leu-X15-Gly-X17-Ala- C19-X20-X21 -Phe-lle-X24-T rp-Leu-X27-X28-X29-X3Q-X31 -X32-X33-X34-R2 (III) (SEC ID N° 21) o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del miso, en la que: R1 es hidrógeno, alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; X3 es Glu o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X12 es Thr, Ser o Lys; X13 es lie, Tyr, o Gln; X15 es Asp o Glu; X17 es Gln o Lys; X19 es Ala o Val; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu; X27 es lie, Leu, Glu o Lys; X28 es Gln, Lys, Ser, Gly, Y1 o ausente; X29 es Thr, Ala, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es lie, Pro, Y1 o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; X34 es Y1 o ausente; Y1 es Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, o Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es NH2 u OH; en la que el análogo de GLP-2 contiene no más de un Y1 ; si cualquiera de X28 a X33 es Y1, aquellas posiciones X29 a X34 cadena abajo de la de Y1 están ausentes; si cualquiera de X28 a X33 está ausente, aquellas posiciones X29 a X33 cadena abajo de esa posición también están ausentes.
En cualquiera de las realizaciones anteriores de la invención, puede ser deseable que la secuencia de aminoácidos del análogo de GLP-2 tenga no más de 5 cambios amino, por ejemplo no más de 4, no más de 3, no más de 2 o no más de 1 cambio a partir de la secuencia de aminoácidos HGDGSFSSELATILDGKAARDFINWLIQTKITD o HGDGSFSSELATILDGQAARDFIAWLIQTKITD.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP-2 de la invención está representado por una cualquiera de las siguientes secuencias: H-Aib-DGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; (SEC ID N° 8) HGDGSFSDEMNTILDNKAARDFINWLIQTKSTD; (SEC ID N° 9) HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK; (SEC ID N° 10) HGDGSFSSEMNTILDSQAARDFINWLIQTKITD; (SEC ID N° 11) HGEGTFTSDLSKQMEGQAVRDFIEWLIQTKITD; (SEC ID N° 12) HGEGTFTSDLSKQMESKAARDFIEWLIQTKITD; (SEC ID N° 13) HGDGSFSSELATILDGKAARDFINWLIQTKITD; (SEC ID N° 14) HGEGTFTSDLSTILENKAARDFIEWLIQTKITD; (SEC ID N° 15) HGEGSFSSDLSTILENKAARDFIEWLIGTKITD; (SEC ID N° 16) H-Aib-DGSFSDELNTILDGKAARDFINWLIQTK; (SEC ID N° 17) HGDGSFSSELATILDGQAARDFIAWLIQTKITD; (SEC ID N° 18) HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK; (SEC ID N° 19) y HGEGSFSSDLSTILEGKAARDFIEWLIQTKITD; (SEC ID N° 20) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Por tanto, el análogo de GLP-2 de la invención puede ser un compuesto R1-Z-R2, en el que R1 y R2 son como se han definido en las fórmulas genéricas y Z es una secuencia peptídica seleccionada entre aquellas enumeradas anteriormente.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP-2 de la invención comprende un sustituyente lipófilo conjugado a un aminoácido en una posición correspondiente a una o más de las posiciones 12, 14, 16, 17,19, 20, 24, 27, 28 y 32 de GLP-2 nativo.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP-2 de la invención comprende un sustituyente lipófilo conjugado a un aminoácido en una posición correspondiente a una o más de las posiciones 12, 16, 17, 20, 24, 27, 28 y 32 de GLP-2 nativo.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP-2 de la invención puede usarse en una terapia.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una composición farmaceutica que comprende un análogo de GLP-2 de la invención, o una sal o derivado del mismo, en mezcla con un vehículo. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede comprender un análogo de GLP-2 que es una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula como un líquido adecuado para administración por inyección o infusión, o que se formula para causar una liberación lenta de un análogo de GLP-2 de la invención.
En algunas realizaciones, la invención proporciona el uso de un análogo de GLP-2 de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de inflamación de grado bajo.
En algunas realizaciones, la invención proporciona el uso de un análogo de GLP-2 de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de inflamación de grado bajo relacionada con diabetes (que puede ser diabetes tipo I o tipo II, pero particularmente tipo II). En algunas realizaciones, la inflamación de grado bajo es inflamación de grado bajo local o sistémica. En algunas realizaciones, la inflamación de grado bajo incluye el síndrome metabólico, obesidad (por ejemplo, obesidad), diabetes, enfermedades cardiovasculares, inflamación gastrointestinal, depresión, Alzheimer, artritis, hipertensión, dislipidemia y apoplejía, trastornos gastrointestinales en el tracto gastrointestinal superior del esófago, el estómago, duodeno, el intestino delgado, colon y recto incluyendo úlceras de cualquier etiología (por ejemplo, úlceras pépticas, síndrome de Zollinger-Ellison, úlceras inducidas por fármacos, úlceras relacionadas con infecciones u otros patógenos), trastornos de digestión, síndromes de mala absorción, síndrome del intestino corto, síndrome de cul-de-sac, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), esprúe celiaco (por ejemplo que surge de enteropatía inducida por gluten o enfermedad celiaca), esprúe tropical, esprúe de hipogammaglobulinemia, y mucositis y diarrea inducida por quimioterapia y/o hemoterapia por radiación. Algunas de las enfermedades, afecciones y trastornos anteriores pueden caracterizarse como asociados con inflamación de grado bajo.
En algunas realizaciones, la invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un análogo de GLP-2 de la invención.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un análogo de GLP-2 de la invención en combinación con secuencias de control para dirigir la expresión del análogo de GLP-2. En algunas realizaciones, la invención proporciona una célula hospedadora transformada con el vector de expresión.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para producir un análogo de GLP-2 de la invención, comprendiendo el método cultivar células hospedadoras que expresan el análogo de GLP-2 en condiciones adecuadas para la expresión y purificar el análogo de GLP-2 así producido.
En algunas realizaciones, puede usarse una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector de expresión de la invención, o una célula hospedadora de la invención en una terapia.
En algunas realizaciones, la invención proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector de expresión de la invención, o una célula hospedadora de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de inflamación de grado bajo. En algunas realizaciones, la inflamación de grado bajo es local o sistémica, y puede incluir, por ejemplo, síndrome metabólico (definición más amplia), obesidad (por ejemplo, obesidad abdominal), diabetes, enfermedades cardiovasculares, inflamación gastrointestinal, depresión, enfermedad de Alzheimer, artritis, hipertensión, dislipidemia y apoplejía, trastornos gastrointestinales en el tracto gastrointestinal superior del esófago, el estómago, duodeno, el intestino delgado, colon y recto incluyendo úlceras de cualquier etiología (por ejemplo, úlceras pépticas, síndrome de Zollinger-Ellison, úlceras inducidas por fármacos, úlceras relacionadas con infecciones u otros patógenos), trastornos de digestión, síndromes de mala absorción, síndrome del intestino corto, síndrome de cul-de-sac, enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), esprúe celiaco (por ejemplo que surge de enteropatía inducida por gluten o enfermedad celiaca), esprúe tropical, esprúe hipogammaglobulinemico, y mucositís y diarrea inducida por quimioterapia y/o hemoterapia por radiación.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para tratar un trastorno relacionado con el tracto gastrointestinal (por ejemplo, estómago o intestino) en un paciente que lo necesita por administración de una cantidad eficaz de un análogo de GLP-2 de la invención, una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector de expresión de la invención, o una célula hospedadora de la invención. En algunas realizaciones, el trastorno relacionado con el tracto gastrointestinal es inflamación de grado bajo. La inflamación de grado bajo puede ser local o sistémica, y puede incluir el síndrome metabólico, obesidad (por ejemplo, obesidad abdominal), diabetes, enfermedades cardiovasculares, inflamación gastrointestinal, depresión, Alzheimer, artritis, hipertensión, dislipidemia y apoplejía, trastornos gastrointestinales en el tracto gastrointestinal superior del esófago, el estómago, duodeno, el intestino delgado, colon, o recto, incluyendo úlceras de cualquier etiología (por ejemplo, úlceras pépticas, síndrome de Zollinger-Ellison, úlceras inducidas por fármacos, úlceras relacionadas con infecciones u otros patógenos), trastornos de digestión, síndromes de mala absorción, síndrome del intestino corto, síndrome de cul-de-sac, enfermedad inflamatoria del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), esprúe celiaco (por ejemplo que surge de enteropatía inducida por gluten o enfermedad celiaca), esprúe tropical, esprúe hipogammaglobulinémico, y mucositis y diarrea inducida por quimioterapia y/o hemoterapia por radiación.
En algunas realizaciones, la invención proporciona un kit terapéutico que comprende un fármaco quimioterapéutico contra el cáncer y un análogo de GLP-2 de la invención, una molécula de ácido nucleico de la invención, un vector de expresión de la invención o una célula hospedadora de la invención, cada uno opcionalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los efectos de GLP-1 y GLP-2 sobre vías metabólicas (adaptado de Cani et al., Pharmacology and Therapeutics 130 (2011) 202-212.) La Figura 2 muestra los efectos de la administración de compuesto 12 o vehículo en el ensayo de tolerancia a glucosa oral (OGTT). Una hora antes de la exposición a glucosa, se tomaron mediciones básales y se administró el compuesto 12/vehículo. (A) Niveles de glucosa en sangre durante el periodo experimental (B) AUG de las mediciones de glucosa en sangre.
La Figura 3 muestra los efectos de la administración de compuesto 7 o vehículo sobre el peso húmedo intestinal. Los animales se trataron con compuesto 7 o vehículo una vez al día, durante cuatro días y en el día 5 se retiró y pesó el intestino delgado.
La Figura 4 muestra los efectos de dos semanas de administración de compuesto de ensayo 7 o administración de vehículo sobre el peso intestinal. (A) Peso húmedo del intestino delgado (B) Peso húmedo del intestino grueso.
La Figura 5 muestra los efectos de dos semanas de administración de compuesto de ensayo 7 o administración de vehículo sobre la homeostasis de glucosa. Los animales se mantuvieron en ayunas durante una noche, y se extrajo sangre para el análisis de (A) glucosa sanguínea en ayunas (B) insulina plasmática en ayunas y (C) evaluación de modelo homeostático-resistencia a la insulina (HOMA-IR).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Salvo que se defina de otro modo en este documento, los terminos científicos y téenicos usados en esta solicitud tendrán los significados que entienden habitualmente los especialistas en la técnica. Generalmente, la nomenclatura usada en relación con, y técnicas de, química, biología molecular, biología celular y del cáncer, inmunología, microbiología, farmacología, y química de proteínas y ácidos nucleicos, descritas en este documento, son aquellas bien conocidas y habitualmente usadas en la técnica.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente publicadas a las que se hace referencia en esta solicitud se incorporan específicamente por referencia en este documento. En caso de conflicto, dominará la presente memoria descriptiva, incluyendo sus definiciones específicas.
Cada realización de la invención descrita en este documento puede tomarse sola o en combinación con uno o más realizaciones diferentes de la invención.
Definiciones Salvo que se especifique de otro modo, se proporcionan las siguientes definiciones para terminos específicos, que se usan en la anterior descripción escrita.
En toda esta memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implica la inclusión de un número entero (o componentes) o grupo de números enteros (o componentes) indicado, pero no la exclusión de cualquier otro número entero (o componentes) o grupo de números enteros (o componentes).
Las formas singulares "un", "una", y "el", "la" incluyen los plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario.
El término "incluyendo" se usa para indicar "incluyendo aunque sin limitación". "Incluyendo" e "incluyendo aunque sin limitación" se usan de forma intercambiable.
Los términos "paciente", "sujeto" e "individuo" pueden usarse de forma intercambiable y hacen referencia a un ser humano o un animal no humano. Estos términos incluyen mamíferos tales como seres humanos, primates, animales de ganadería (por ejemplo, bovinos, porcinos), animales de compañía (por ejemplo, caninos, felinos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas).
El término "solvato" en el contexto de la presente invención se refiere a un complejo de estequiometría definida formado entre un soluto (en este caso, un conjugado peptídico o sal farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la invención) y un disolvente. El disolvente a este respecto puede ser, por ejemplo, agua, etanol u otro farmacéuticamente aceptable, típicamente especies orgánicas moleculares pequeñas tales como, aunque sin limitación, ácido acético o ácido láctico. Cuando el disolvente en cuestión es agua, dicho solvato se menciona normalmente como hidrato.
El término "agonista" empleado en el contexto de la invención se refiere a una sustancia (ligando) que activa el tipo de receptor en cuestión.
En toda la descripción y reivindicaciones se usan los códigos convencionales de una letra y tres letras para aminoácidos naturales así como códigos de tres letras generalmente aceptados para otros a-aminoácidos, tales como sarcosina (Sar), norleucina (Nle) y ácido a-aminoisobutírico (Aib). Todos los restos de aminoácido en los péptidos de la invención son preferiblemente de la configuración L. Sin embargo, también pueden estar presentes aminoácidos de la configuración D.
Entre las secuencias descritas en este documento hay secuencias que incorporan el resto "Hy-" en el extremo amino (N-terminal) de la secuencia, y un resto "-OH" o un resto "-NH2" en el extremo carboxi (C-terminal) de la secuencia. En dichos casos, y salvo que se indique de otro modo, un esto "Hy-" en el extremo N-terminal de la secuencia en cuestión indica un átomo de hidrógeno [por ejemplo, R1 = Hy- en las fórmulas I y la; correspondiente a la presencia de un grupo amino primario o secundario libre en el extremo N-terminal], mientras que un resto "-OH" o un resto "-NH2" en el extremo C-terminal de la secuencia indica un grupo hidroxi [por ejemplo, R2 = OH en las fórmulas I y la; correspondiente a la presencia de un grupo carboxi (COOH) en el extremo C-terminal] o un grupo amino [por ejemplo, R2 = NH2 en las fórmulas I y la; correspondiente a la presencia de un grupo amido (CONH2) en el extremo C-terminal], respectivamente. En cada secuencia de la invención, un resto "-OH" C-terminal puede estar sustituido por un resto "-NH2" C-terminal, y viceversa.
Como se usa en este documento una "sustitución conservativa" significa que un resto de aminoácido que pertenece a una cierta posición de la secuencia peptídica de GLP-2 humano nativo se ha intercambiado con un resto de aminoácido que pertenece al mismo grupo (I, II, III, IV, V, 1 , 2, 3) definidos en la siguiente tabla: Una sustitución "no conservativa" como se usa en este documento significa cualquier sustitución diferente a una sustitución conservativa de un resto de aminoácido de la secuencia de GLP-2 humano nativo, por ejemplo, sustitución con un aminoácido no natural no proteico (Sar, Nle, Aib) o sustitución con un aminoácido que no pertenece al mismo grupo.
En algunas realizaciones de la invención, un compuesto de la invención tiene al menos una actividad biológica GLP-2 y una GLP-1. Actividades ejemplares incluyen reducir la permeabilidad del intestino y alterar la inflamación en el intestino. Esto puede evaluarse en ensayos in vivo, por ejemplo como se describe en los ejemplos, en que se determina la masa y la permeabilidad del intestino, o una parte del mismo, despues de haber tratado o expuesto a un animal de ensayo a un análogo de GLP-2.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP-2 de la invención tiene al menos un 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con GLP-2 de tipo silvestre (1-33) que tiene la secuencia His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-lle-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-lle-Asn-Trp-Leu-lle-GIn-Thr-Lys-lle-Thr-Asp. Por ejemplo, un análogo de GLP-2 de la invención puede tener de aproximadamente el 50% al 88% de identidad de secuencia, por ejemplo, entre aproximadamente el 60% -80% y en ciertas realizaciones, al menos el 83%, 66%, o 89% de identidad de secuencia.
"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias polipeptídicas de GLP-2 se define como el porcentaje de restos de aminoácido en una secuencia candidata que son identicos a los restos de aminoácido en la secuencia de tipo silvestre de GLP-2, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación de secuencia puede realizarla el especialista en la téenica usando técnicas bien conocidas en la técnica por ejemplo usando software disponible al público tal como BLAST, BLAST2 o el software Align. Por ejemplo, véase Altschul et al., Methods in Enzymology 288:460-480 (1996), Pearson et al., Genomics-46: 24-36, 1997, y el programa de alineación en el sitio en molbiol.soton.ac.uk/compute/align.
Los porcentajes de identidad de secuencia usados en este documento y de acuerdo con la presente invención pueden determinarse usando estos programas con sus configuraciones por defecto. De forma más general, los especialistas en la técnica pueden determinar fácilmente los parámetros apropiados para determinar la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para conseguir la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se están comparando.
En algunas realizaciones de la invención, un análogo de GLP-2 de la invención comprende más de una sustitución (es decir, más de una sustitución respecto a la secuencia de tipo silvestre de GLP-2 dada anteriormente) en las posiciones X2, X3, X5, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16, X17, X19, X20, X21, X24, X27, X28, X29, X30, X31 , X32 y X33.
En algunas realizaciones de la invención, un análogo de GLP-2 de la invención comprende más de una sustitución (es decir, más de una sustitución respecto a la secuencia de tipo silvestre de GLP-2 dada anteriormente) en las posiciones X2, X3, X5, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X15, X16, X17, X20, X21, X24, X27, X28, X29, X30, X31, X32 y X33.
En algunas realizaciones, los restos de aminoácido en las posiciones X28, X29, X30, X31, X32 y X33 están opcionalmente delecionadas.
Sin limitarse a teoría alguna, se cree que un resto polar o cargado (por ejemplo, Gln, Lys o Glu) en una posición correspondiente a la posición 17 de una secuencia peptídica de GLP-2 nativo, en lugar de la Leu encontrada en la secuencia peptídica de GLP-2 nativo, puede interaccionar con y activar el receptor de GLP-1. Un aminoácido polar o cargado en la posición 17, por tanto, puede alterar la selectividad del receptor de peptidos GLP-2 o análogos de los mismos, produciendo péptidos agonistas duales que activan tanto el receptor de GLP-1 como el de GLP-2.
Sin limitarse a teoría alguna, se cree que un resto de aminoácido pequeño (por ejemplo, Gly, Ser o Ala) en la posición 18 puede ser preferible para introducir o potenciar la actividad del receptor de GLP-1 de un análogo peptídico de GLP-2. Sin embargo, también puede ser posible obtener actividad potenciada del receptor de GLP-1 con las otras sustituciones de aminoácido siempre que el aminoácido en la posición 17 sea polar o esté cargado.
En algunas realizaciones de la invención, un análogo de GLP-2 como se ha descrito anteriormente comprende un sustituyente lipófilo conjugado a una o más de las posiciones 12, 14, 16, 17, 19, 20, 24, 27, 28 y 32.
En algunas realizaciones de la invención, un análogo de GLP-2 como se ha descrito anteriormente comprende un sustituyente lipófilo conjugado a una o más de las posiciones 12, 16, 17, 20, 24, 27, 28 y 32.
En una realización preferida de la presente invención el análogo de GLP-2 como se ha descrito anteriormente comprende un sustituyente lipófilo conjugado a una o más de las posiciones 16, 17, 20 y 24.
A continuación se describen compuestos ejemplares de la invención (derivados de la fórmula I, fórmula la o fórmula II), donde dichos compuestos pueden estar modificados en el extremo N-terminal y C-terminal como se describe para R1 y R2 e incluyendo una sal o derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos: Hy-H-Aib-DGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD-OH; (Compuesto 1) Hy-HGDGSFSDEMNTILDNKAARDFINWLIQTKITD-OH; (Compuesto 2) Hy-HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK-NH2; (Compuesto 3) Hy-HGDGSFSSEMNTILDSQAARDFINWLIQTKITD-OH; (Compuesto 4) Hy-HGEGTFTSDLSKQMEGQAVRDFIEWLIQTKITD-OH; (Compuesto 5) Hy-HGEGTFTSDLSKQM ESKAARDFI EWLIQTKITD-OH ; (Compuesto 8) Hy-HGDGSFSSELATILDGKAARDFINWLIQTKITD-OH; (Compuesto 7) Hy-HGEGTFTSDLSTILENKAARDFIEWLIQTKITD-OH; (Compuesto 8) Hy-HGEGSFSSDLSTILENKAARDFIEWLIQTKITD-OH; (Compuesto 9) Hy-H-Aib-DGSFSDELNTILDGKAARDFINWLIQTK-NH2; (Compuesto 10) Hy-HGDGSFSSELATILDGQAARDFIAWLIQTKITD-OH; (Compuesto 11) Hy-HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK-NHa; (Compuesto 12) Hy-HGEGSFSSDLSTILEGKAARDFIEWLIQTKITD-OH (Compuesto 13).
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de análogos de GLP-2 de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de inflamación gastrointestinal, por ejemplo, inflamación gastrointestinal de nivel bajo relacionada con diabetes.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un análogo de GLP-2 definido en este documento.
En aspectos adicionales, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende la anterior secuencia de ácido nucleico, opcionalmente en combinación con secuencias para dirigir su expresión, y células hospedadoras transformadas con los vectores de expresión. Preferiblemente las células hospedadoras son capaces de expresar y secretar el análogo de GLP-2. En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona un método para producir el análogo de GLP-2, comprendiendo el método cultivar las células hospedadoras en condiciones adecuadas para expresar el análogo de GLP-2 y purificar el análogo de GLP-2 así producido.
La invención proporciona adicionalmente un ácido nucleico de la invención, un vector de expresión de la invención, o una célula hospedadora capaz de expresar y secretar un análogo de GLP-2 de la invención, para su uso en terapia. Se entenderá que el ácido nucleico, el vector de expresión y las células hospedadoras pueden usarse para el tratamiento de cualquiera de los trastornos descritos en este documento que pueden tratarse con los propios análogos de GLP-2. Por lo tanto debe considerarse que referencias a una composición terapéutica que comprende un análogo de GLP-2 de la invención, o administración de un análogo de GLP-2 de la invención, abarcan administración de un ácido nucleico, vector de expresión o celula hospedadora de la invención excepto cuando el contexto exija lo contrario.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico, un vector de expresión, o una célula hospedadora como se define en este documento, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de inflamación gastrointestinal.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para tratar una inflamación gastrointestinal de nivel bajo relacionada con diabetes.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir la inflamación gastrointestinal de nivel bajo relacionada con diabetes en un paciente que lo necesita, comprendiendo el método administrar una cantidad eficaz de un ácido nucleico, vector de expresión o célula hospedadora de la invención.
Como se ha descrito anteriormente, los análogos de GLP-2 de la invención tienen una o más sustituciones, deleciones, inversiones o adiciones de aminoácido en comparación con GLP-2 nativo. Esta definición también incluye los términos sinónimos miméticos de GLP-2 y/o agonistas de GLP-2. Además, un análogo de la presente invención puede tener adicionalmente una modificación química de uno o más de sus grupos laterales de aminoácido, átomos de a-carbono, grupo amino terminal, o grupo ácido carboxílico terminal. Una modificación química incluye, aunque sin limitación, añadir restos químicos, crear nuevos enlaces, y retirar restos químicos. Las modificaciones en los grupos laterales de aminoácido incluyen, sin limitación, acilación de grupos e-amino de lisina, N-alquilación de arginina, histidina, o lisina, alquilación de grupos ácido carboxílico glutámico o aspártico, y desamidación de glutamina o asparagina. Las modificaciones del grupo amino N-terminal incluyen, sin limitación, modificaciones des-amino, N-alquilo inferior, N-dialquilo inferior, y N-acilo. Las modificaciones del grupo carboxi C-terminal incluyen, sin limitación, modificaciones amida, alquilo inferior amida, dialquilo amida, y éster de alquilo inferior. Preferiblemente, un alquilo inferior es alquilo C1-C4. Además, puede protegerse uno o más grupos funcionales en cadenas laterales o grupos terminales, mediante grupos protectores conocidos para los especialistas en la teenica. En algunas realizaciones, el alfa-carbono de un aminoácido puede estar mono- o di-metilado.
Cuando está presente, un aminoácido de remplazo de Met oxidativamente estable significa uno que se selecciona entre el grupo que consiste en Met(O) (sulfóxido de metionina), Met(0)2 (sulfona de metionina), Val, lie, Ser y preferiblemente lie, Leu, Vai, Lys o Ser.
Sustituventes lipófilos Una o más de las cadenas laterales de aminoácido en un compuesto empleado en el contexto de la invención puede conjugarse a un sustituyente lipófilo Z1. Sin limitarse a teoría alguna, se cree que un sustituyente lipófilo se une a albúmina en el torrente sanguíneo, protegiendo de este modo los compuestos empleados en el contexto de la invención de la degradación enzimática, lo que puede potenciar la semi-vida de los compuestos. El sustituyente lipófilo también puede modular la potencia del compuesto, por ejemplo, con respecto al receptor de GLP-2 y/o el receptor de GLP-1.
En ciertas realizaciones, solamente una cadena lateral de aminoácido se conjuga a un sustituyente lipófilo. En otras realizaciones, dos cadenas laterales de aminoácido se conjugan cada una a un sustituyente lipófilo. En realizaciones adicionales más, tres o incluso más cadenas laterales de aminoácido se conjugan cada una a un sustituyente lipófilo. Cuando un compuesto contiene dos o más sustituyentes lipófilos, pueden ser sustituyentes iguales o diferentes.
El sustituyente lipófilo Z1 puede unirse covalentemente a un átomo en la cadena lateral de aminoácido, o como alternativa puede conjugarse a la cadena lateral de aminoácido mediante uno o más espaciadores Z2.
El término "conjugado" se usa aquí para describir la unión covalente de un resto químico identificable a otro, y la relación estructural entre dichos restos. No debe aceptarse que implica algún método particular de síntesis. El uno o más espaciadores Z2, cuando están presentes, se usan para proporcionar un espaciado entre el compuesto y el resto lipófilo.
Un sustituyente lipófilo puede unirse a una cadena lateral de aminoácido o a un espaciador mediante un éster, un sulfonil éster, un tioéster, una amida o una sulfonamida. Por consiguiente, se entenderá que un sustituyente lipófilo puede incluir un grupo acilo, un grupo sulfonilo, un átomo de N, un átomo de O o un átomo de S que forma parte del ester, sulfonil éster, tioéster, amida o sulfonamida. Preferiblemente, un grupo acilo en el sustituyente lipófilo forma parte de una amida o éster con la cadena lateral de aminoácido o el espaciador. El sustituyente lipófilo puede incluir una cadena de hidrocarburo que tiene de 10 a 24 átomos de carbono (C), por ejemplo de 10 a 22 átomos de C, por ejemplo de 10 a 20 átomos de C. Preferiblemente, tiene al menos 11 átomos de C, y preferiblemente tiene 18 átomos de C o menos. Por ejemplo, la cadena de hidrocarburo puede contener 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18 átomos de carbono. La cadena de hidrocarburo puede ser lineal o ramificada y puede estar saturada o insaturada. A partir del análisis anterior se entenderá que la cadena de hidrocarburo está preferiblemente sustituida con un resto que forma parte de la unión a la cadena lateral de aminoácido o el espaciador, por ejemplo un grupo acilo, un grupo sulfonilo, un átomo de N, un átomo de O o un átomo de S. Más preferiblemente, la cadena de hidrocarburo está sustituida con un grupo acilo, y en consecuencia la cadena de hidrocarburo puede ser parte de un grupo alcanoílo, por ejemplo un grupo dodecanoílo, 2-butiloctanoílo, tetradecanoílo, hexadecanoílo, heptadecanoílo, octadecanoílo o eicosanoílo.
Como se ha mencionado anteriormente, el sustituyente lipófilo Z1 puede conjugarse a la cadena lateral de aminoácido mediante uno o más espaciadores Z2. Cuando está presente, el espaciador se une al sustituyente lipófilo y a la cadena lateral de aminoácido. El espaciador puede unirse al sustituyente lipófilo y a la cadena lateral de aminoácido independientemente por un éster, un sulfonil éster, un tioéster, una amida o una sulfonamida. Por consiguiente, puede incluir dos restos independientemente seleccionados entre acilo, sulfonilo, un átomo de N, un átomo de O o un átomo de S. El espaciador puede consistir en una cadena de hidrocarburo Ci-10 lineal o más preferiblemente una cadena de hidrocarburo Ci-5 lineal. Además, el espaciador puede sustituirse con uno o más sustituyentes seleccionados entre alquilo Ci-6, alquil amina C1-6, hidroxi alquilo Ci-6y carboxi alquilo C1-6.
El espaciador puede ser, por ejemplo, un resto de cualquier aminoácido de origen natural o no natural. Por ejemplo, el espaciador puede ser un resto de Gly, Pro, Ala, Val, Leu, lie, Met, Cys, Phe, Tyr, Trp, His, Lys, Arg, Gln, Asn, a-Glu, g-Glu, e-Lys, Asp, Ser, Thr, Gaba, Aib, b-Ala (es decir, 3-aminopropanoílo), 4-aminobuianoílo, 5-aminopentanoílo, 6-aminohexanoílo, 7-aminoheptanoílo, 8-aminooctanoílo, 9-aminononanoílo, 10-aminodecanoílo o 8-amino-3,8-dioxaoctanoílo. En ciertas realizaciones, el espaciador es un resto de Glu, g-Glu, e-Lys, b-Ala (es decir, 3-aminopropanoílo), 4-aminobutanoílo, 8-aminooctanoílo o 8-amino-3,6-dioxaoctanoílo. En la presente invención, g-Glu e isoGlu se usan de forma intercambiable. La cadena lateral de aminoácido a la cual se conjuga el sustituyente lipófilo puede ser una cadena lateral de un resto Glu, Lys, Ser, Cys, Dbu, Dpr u Orn. Por ejemplo, puede ser una cadena lateral de un resto Lys, Glu o Cys. Cuando dos o mas cadenas laterales portan un sustituyente lipófilo, pueden seleccionarse independientemente entre esos restos. Por tanto, la cadena lateral de aminoácido incluye un grupo carboxi, hidroxilo, tiol, amida o amina, para formar un ester, un sulfonil éster, un tioéster, una amida, o una sulfonamida con el espaciador o sustituyente lipófilo.
Un ejemplo de un sustituyente lipófilo que comprende un resto lipófilo Z1 y el espaciador Z2 se muestra en la siguiente fórmula: Aquí, la cadena lateral de un resto Lys se une covalentemente a un espaciador g-Glu (Z2) mediante un enlace amida. Un grupo hexadecanoílo (Z1) se une covalentemente al espaciador g-Glu mediante un enlace amida. Esta combinación de resto lipófilo y espaciador, conjugado a un resto Lys, puede mencionarse mediante la notación abreviada K(hexadecanoil-y-Glu), por ejemplo, cuando se muestra en fórmulas de compuestos específicos. g-Glu también puede mencionarse como isoGlu, y un grupo hexadecanoílo como grupo palmitoílo. Por tanto, será evidente que la notación (hexadecanoil-y-Glu) es equivalente a las notaciones (isoGlu(Palm)) o (isoGlu(Palmitoílo)) usadas por ejemplo en el documento PCT/GB2008/004121.
Los especialistas en la teenica serán muy conscientes de técnicas adecuadas para preparar los compuestos empleados en el contexto de la invención. Para ejemplos de química adecuada, véanse los documentos WO98/08871, WOOO/55184, WOOO/55119, Madsen et al., J. Med. Chem. 50:6126-32 (2007), y Knudsen et al., J. Med Chem.43:1664-1669 (2000), incorporados en este documento por referencia.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP2 de la invención tiene un sustituyente lipófilo como se ha descrito anteriormente conjugado a un aminoácido en una o más de las posiciones correspondientes a las posiciones 12, 14, 16, 17, 19, 20, 24, 27, 28 y 32 del GLP-2 nativo.
En algunas realizaciones, un análogo de GLP2 de la invención tiene un sustituyente lipófilo como se ha descrito anteriormente conjugado a un aminoácido en una o más de las posiciones correspondientes a las posiciones 12, 16, 17, 20, 24, 27, 28 y 32 del GLP-2 nativo.
Debe entenderse que los péptidos de la invención también podrían proporcionarse en forma de una sal u otro derivado. Las sales incluyen sales farmacéuticamente aceptables tales como sales de adición de ácidos y sales básicas. Ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen sales clorhidrato, sales citrato, sales lactato, sales malato y sales acetato. Ejemplos de sales básicas incluyen sales donde el catión se selecciona entre metales alcalinos, tales como sodio y potasio, metales alcalino-térreos, tales como calcio, e iones amonio +N(R3)3(R4), donde R3 y R4 designan independientemente alquilo C1-6 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-6 opcionalmente sustituido, arilo opcionalmente sustituido, o heteroarilo opcionalmente sustituido. Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17a edición, Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, EEUU, 1985 y ediciones más recientes, y en la Enciclopaedia of Pharmaceutical Technology.
Otros derivados de los análogos de GLP-2 de la invención incluyen complejos de coordinación con iones metálicos tales como Mn2+ y Zn2+, ésteres tales como ésteres hidrolizables in vivo, ácidos o bases libres, hidratos, profármacos o lípidos. Los ásteres pueden formarse entre grupos hidroxilo o ácido carboxílico presentes en el compuesto y un compañero de reacción apropiado de ácido carboxílico o alcohol, usando teenicas bien conocidas en la técnica. Los derivados que son profármacos de los compuestos se puede convertir in vivo o in vitro en uno de los compuestos precursores. Típicamente, al menos una de las actividades biológicas del compuesto se reducirá en la forma de profármaco del compuesto, y puede activarse por conversión del profármaco para liberar el compuesto o un metabolito del mismo. Ejemplos de profármacos incluyen el uso de grupos protectores que pueden retirarse in situ liberando el compuesto activo o sirven para inhibir la eliminación del fármaco in vivo.
Los análogos de GLP-2 que tienen un valor de CE50 de 1 nM o inferior, y preferiblemente por debajo de 1 nM, se definen como agonistas de GLP-2.
La presente invención incluye los siguientes péptidos descritos adicionalmente los siguientes experimentos.
Síntesis de análogos de GLP-2 Se prefiere sintetizar los análogos de la invención mediante síntesis peptídica en fase sólida o fase líquida. En este contexto, los especialistas en la técnica puede mirar la publicación PCT WO 98/11125 y Fields, GB et al., 2002, "Principies and practice of solid-phase peptide synthesis" en: Synthetic Peptides (2a Edición) (incorporado en este documento por referencia) y los Ejemplos en este documento.
Por tanto, los análogos de GLP-2 pueden sintetizarse de varias formas incluyendo, por ejemplo, un método que comprende: (a) sintetizar el péptido mediante síntesis peptídica en fase sólida o fase líquida y recuperar el péptido sintético así obtenido; (b) cuando el péptido consiste en aminoácidos de origen natural, expresar una construcción de ácido nucleico que codifica el péptido en una célula hospedadora y recuperar el producto de expresión del cultivo de células hospedadoras; (c) cuando el péptido consiste en aminoácidos de origen natural, realizar expresión in vitro sin células de una construcción de ácido nucleico que codifica el péptido y recuperar el producto de expresión; o una combinación de los metodos de (a), (b), y (c) para obtener fragmentos del péptido, posteriormente unir (por ejemplo, ligar) los fragmentos para obtener el péptido, y recuperar el péptido.
Por tanto, par algunos análogos de la invención puede ser ventajoso explotar téenicas de ingeniería genética. Este puede ser el caso cuando el péptido es suficientemente grande (o producido como una construcción de fusión) y cuando el péptido solamente incluye aminoácidos de origen natural que pueden traducirse desde ARN en organismos vivos.
Para los propósitos de tecnología genética recombinante, los fragmentos de ácido nucleico que codifican los péptidos de la invención son productos químicos importantes. Por tanto, un aspecto adicional de la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un análogo de GLP-2 de la invención, donde el péptido preferiblemente está compuesto de aminoácidos de origen natural. Los fragmentos de ácido nucleico de la invención pueden ser fragmentos de ADN o ARN.
Los fragmentos de ácido nucleico de la invención normalmente se insertarán en vectores adecuados para formar vectores de clonación o expresión que portan los fragmentos de ácido nucleico de la invención. Dichos nuevos vectores también son parte de la invención. Se analizarán detalle respecto a la construcción de estos vectores de la invención en contexto de células y microorganismos transformados a continuación. Los vectores pueden estar, dependiendo del propósito y el tipo de aplicación, en forma de plásmidos, fagos, cósmidos, mini-cromosomas, o virus, pero el ADN desnudo que se expresa solamente de forma transitoria en ciertas células también es un vector importante. Los vectores de clonación y expresión preferidos (vectores plasmídicos) de la invención tienen capacidad de replicación autónoma, posibilitando de este modo elevados números de copias con fines de expresión de alto nivel o replicación de lato nivel para posterior clonación.
El esquema general de un vector de la invención comprende los siguiente elementos en la dirección 5' a 3' y en enlace funcional: un promotor para dirigir la expresión del fragmento de ácido nucleico de la invención, opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido líder que posibilite la secreción (a la fase extracelular o, donde sea aplicable, en el periplasma) de o un péptido líder para usos múltiples por ejemplo secreción combinada, marca de purificación y recorte enzimático para corregir el péptido o la integración en la membrana del fragmento polipeptídico, el fragmento de ácido nucleico que codifica el péptido de la invención, y opcionalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica un terminador. Cuando se hacen funcionar con vectores de expresión en cepas o líneas celulares productoras, con fines de estabilidad genética de la célula transformada se prefiere que el vector, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integre en el genoma de la célula hospedadora.
Los vectores de la invención pueden usarse para transformar células hospedadoras para producir un análogo de GLP-2 de la invención. Dichas células transformadas, que también son parte de la invención, pueden ser células o líneas celulares cultivadas usadas para la propagación de los fragmentos de ácido nucleico y vectores de la invención, o usarse para producción recombinante de los péptidos de la invención.
Las células transformadas preferidas de la invención son micro-organismos tales como bacterias incluyendo, por ejemplo, bacterias de los géneros Escherichia (por ejemplo, E. coli), Bacillus (por ejemplo, Bacillus subtilis), Salmonella, o Mycobacterium (preferiblemente no patogénica, por ejemplo, M. bovis BCG)), levaduras (tales como Saccharomyces cerevisiae), y protozoos. Como alternativa, las células transformadas pueden derivarse de un organismo multicelular, por ejemplo, células fúngicas, células de insecto, células vegetales, o células de mamífero (por ejemplo, células derivadas de un ser humano). Con fines de clonación y/o expresión optimizada, se prefiere que la célula transformada sea capaz de replicar un fragmento de ácido nucleico de la invención. Las células que expresar un fragmento de ácido nucleico de la invención son realizaciones útiles preferidas de la invención. Pueden usarse para preparación a pequeña escala o gran escala de los péptidos de la invención.
Cuando se produce un péptido de la invención mediante células transformadas, es conveniente, aunque no esencial, que las células exporten el producto de expresión al medio de cultivo o porten el producto de expresión sobre la superficie de la célula transformada.
Cuando se ha identificado una celula productora eficaz se prefiere, en base a la misma, establecer una línea celular estable que porte el vector de la invención y que exprese el fragmento de ácido nucleico que codifica el péptido. Preferiblemente, esta línea celular estable secreta o porta el péptido de la invención, facilitando de este modo la purificación del mismo.
En general, los vectores plasmídicos que contienen replicón y secuencias de control, que se obtienen de especies compatibles con la célula hospedadora, se usan en relación un hospedador. El vector habitualmente porta un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras, que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli puede transformarse típicamente usando pBR322 (aunque existen otros numerosos plásmidos útiles), un plásmido derivado de una especie de E. coli (véase, por ejemplo, Bolívar et al., 1977). El plásmido pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetracielina y, por tanto, proporciona un medio fácil para identificar células transformadas. El plásmido pBR, u otro plásmido microbiano o fago también debe contener, o estar modificado para contener, promotores, que pueden usarse por el microorganismo procariota para expresión.
Aquellos promotores más habitualmente usados en construcción de ADN recombinante procariota incluyen los sistemas de beta-lactamasa (penicilinasa) y del promotor de la lactosa (Chang et al., 1978; Itakura etal., 1977; Goeddel et al., 1979) y un sistema del promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., 1979; documento EP 0038 778 A). Aunque estos son los más habitualmente usados, se han descubierto y utilizado otros promotores microbianos, y se han publicado detalles respecto a sus secuencias de nucleótidos, que posibilitan a un especialista en la téenica ligarlos de forma funcional con vectores plasmídicos (Siebwenlist et al., 1980).
Además de procariotas, también pueden usarse microbios eucariotas, tales como cultivos de levaduras. En estas realizaciones, un promotor también debe ser capaz de dirigir la expresión. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común del pan, es la más comúnmente usada entre los microorganismos eucariotas, aunque están habitualmente disponibles otras varias cepas. Por ejemplo, también pueden usarse Pichia stiptis y Schizosaccharomyces pombe. Para la expresión en Saccharomyces, se usa habitualmente el plásmido YRp7, por ejemplo (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Este plásmido ya contiene el gen trpl que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano (por ejemplo ATCC N° 44076 o PEP4-1) (Jones, 1977, The presence of the trpl lesión as a characteristic of the yeast host cell genome then provides an effective environment for detecting transformation by growth in the absence of tryptophan).
Las secuencias promotoras adecuadas en vectores levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzman et al., 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-8-fosfato ¡somerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. En la construcción de plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas con estos genes también se ligan en el vector de expresión 3' de la secuencia deseada a expresar para proporcionar poliadenilación del ARNm y terminación.
Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por las condiciones de cultivo, son la región promotora para la alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas de degradación asociadas con el metabolismo del nitrógeno, y la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa mencionada anteriormente, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Cualquier vector plasmídico que contenga un promotor, origen de replicación y secuencias de terminación compatibles con levaduras es adecuado.
Además de los microorganismos, también pueden usarse cultivos de células derivadas de organismos multicelulares como hospedadores. En principio, es viable cualquiera de dichos cultivos celulares, ya sea de cultivo de vertebrado o invertebrado. Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrado, y la propagación de vertebrados en cultivo (cultivo tisular) ha llegado a ser un procedimiento rutinario en los últimos años (Tissue Culture, 1973). Ejemplos de dichas líneas celulares hospedadoras útiles son células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), y celulas W138, BHK, COS-7 293, de Spodoptera frugiperda (SF) (disponibles en el mercado como sistemas de expresión completa de i. a. Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, EEUU y de Invitrogen), la línea celular de D. melanogaster S2 disponible en Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Groningen, Países Bajos, y líneas celulares MDCK.
Los vectores de expresión para dichas células habitualmente incluyen (si fuera necesario) un origen de replicación, un promotor localizado delante del gen a expresar, junto con cualquier sitio de unión al ribosoma necesario, sitios de corte y ayuste del ARN, sitio de poliadenilación, y secuencias terminadoras de la transcripción.
Para su uso en células de mamífero, las funciones de control en los vectores de expresión a menudo se proporcionan mediante material viral. Por ejemplo, los promotores habitualmente usados se obtienen de polioma, Adenovirus 2, y más frecuentemente del virus de simio 40 (SV40). Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son particularmente útiles porque ambos se obtienen fácilmente del virus como un fragmento, que también contiene el origen de replicación viral de SV40 (Fiers et al., 1978). También pueden usarse fragmentos más pequeños o más grandes de SV40, con la condición de que se incluya la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio Hindlll hacia el sitio Bgll localizado en el origen de replicación viral. Además, también es posible, y a menudo deseable, utilizar secuencias promotoras o de control normalmente asociadas con la secuencia génica deseada, con la condición de que dichas secuencias de control sean compatibles con los sistemas celulares hospedadores.
Un origen de replicación puede proporcionarse por construcción del vector para que incluya un origen exógeno, tal como puede obtenerse de SV40 u otro virus (por ejemplo, Polioma, Adenovirus, VSV, y BPV), o puede proporcionarse mediante el mecanismo de replicación cromosómico de la célula hospedadora, si el vector se integra en el cromosoma de la célula hospedadora, el último a menudo es suficiente.
Para obtener rendimientos satisfactorios en un proceso de producción recombinante, puede ser ventajoso preparar los análogos como proteínas de fusión, fusionando el péptido a un compañero de fusión que puede servir como marca de afinidad (para facilidad de purificación) y/o teniendo múltiples repeticiones del péptido.
Estos métodos requieren la presencia de un sitio de escisión adecuado para una peptidasa. Los especialistas en la téenica conocerán el modo de adaptar las construcciones genéricas subyacentes.
Después de la preparación recombinante, los péptidos de la invención pueden purificarse por métodos generalmente conocidos en la técnica, incluyendo cromatografía multi-etapas (por ejemplo, técnicas cromatográficas de intercambio iónico, exclusión de tamaño, y afinidad).
Como alternativa, los péptidos compuestos por aminoácidos de origen natural pueden prepararse in vitro en sistemas sin células. Esto es especialmente oportuno en casos donde los péptidos podrían ser tóxicos para las células hospedadoras putativas. Por tanto, la presente invención también contempla el uso de traducción/expresión in vitro sin células para preparar los péptidos de la invención. En este contexto, se hace referencia a kits de traducción in vitro, materiales y documentación técnica disponible en el mercado en por ejemplo Ambion Inc., 2130 Woodward, Austin, TX 78744-1832, EEUU.
Finalmente, los métodos disponibles pueden combinarse, por supuesto, para preparar, por ejemplo, análogos semi-sintéticos. En dicha configuración, los fragmentos peptídicos se preparan usando al menos 2 etapas o métodos diferentes, seguidos por unión (por ejemplo, ligamiento) de los fragmentos para obtener el producto peptídico final.
Actividad biológica Típicamente los análogos de GLP-2 de la invención tienen actividad tanto en el receptor de GLP-1 como de GLP-2.
Los valores de CEso pueden usarse como medida numérica de la potencia agonista en un receptor dado. Un valor de CEso es una medida de la concentración de un compuesto necesaria para conseguir la mitad de la actividad máxima del compuesto en un ensayo particular. Puede considerarse que un compuesto que tiene un CEso en un receptor particular que es inferior de la CEso de un compuesto de referencia en el mismo ensayo tiene mayor potencia en ese receptor que el compuesto de referencia.
Los análogos de GLP-2 de la invención típicamente tienen mayor actividad en el receptor de GLP-1 (por ejemplo, el receptor humano de GLP-1) que GLP-2 humano de tipo silvestre (hGLP-2). Por tanto, en cualquier ensayo dado para la actividad GLP-1 , los análogos de GLP-2 tendrán una CI50 inferior que GLP-2 humano de tipo silvestre o [Gly2]-hGLP-2 (es decir GLP-2 humano que tiene glicina en la posición 2, tambien conocido como teduglutida). Cuando se evalúan en el mismo ensayo de actividad GLP- 1 , la proporción de CE50 del análogo de GLP-2 a la de hGLP-2 o [Gly2]-hGLP-2 es por lo tanto típicamente menor de 1. Puede ser, por ejemplo, menor de 0,5 o menor de 0,1, o menor de 0,01.
La CEsoen el receptor de GLP-1 puede inferiora 100 nM, inferiora 50 nM, inferior a 10 nM, o más preferiblemente inferior a 1,0 nM, inferior a 0,9 nM, inferior a 0,8 nM, inferior a 0,7 nM, inferior a 0,6 nM, inferior a 0,5 nM, inferior a 0,4 nM, inferior a 0,3 nM, inferiora 0,2 nM, inferior a 0,1 nM, inferiora 0,09 nM, inferior a 0,08 nM, inferiora 0,07 nM, inferior a 0,08 nM, inferior a 0,05 nM, inferior a 0,04 nM, inferior a 0,03 nM, inferior a 0,02 nM, inferior a 0,01 nM, inferior a 0,009 nM, inferior a 0,008 nM, inferior a 0,007 nM, inferior a 0,006 nM, o inferior a 0,005 nM, por ejemplo cuando se evalúan usando el ensayo de eficacia del receptor de GLP-1 descrito en el Ejemplo 1.
Los análogos de GLP-2 de la invención retienen actividad GLP-2, aunque su potencia en el receptor de GLP-2 no tiene que ser la misma que la de hGLP-2 o [Gly2j-hGLP-2. Pueden tener potencia inferior siempre que se retengan niveles adecuados de actividad GLP-2. En cualquier ensayo dado para la actividad GLP-2, los análogos de GLP-2 pueden tener una CE50 inferior o superior que GLP-2 humano de tipo silvestre o [Gly2]-hGLP-2. Cuando se evalúan en el mismo ensayo de actividad GLP- 2, la proporción de la CE50 del análogo de GLP-2 a la CEsode hGLP-2 o [Gly2]-hGLP-2 en el mismo ensayo puede ser, por ejemplo, menor de 200, menor de 100, menor de 10, menor de 5, menor de 1, menor de 0,1, menor de 0,5 o menor de 0,1.
También puede ser deseable comparar la proporción de valores de CE50 en el receptor de GLP-2 y GLP-1 para el análogo de la invención y para hGLP-2 o [Gly2j-hGLP-2. Preferiblemente, para cualquier par de ensayos de GLP-2 y GLP-1, el análogo de la invención tiene una CEso[GLP-2] / CE5o[GLP-1] que es superior que la proporción equivalente para hGLP-2 o [Gly2]-hGLP-2 en los mismos ensayos, por ejemplo, la proporción para el análogo de la invención puede ser al menos 2, al menos 5 o al menos 10 veces mayor que la para hGLP-2 o [Gly2]-hGLP-2.
Composiciones farmaceuticas v administración Los análogos de GLP-2 de la presente invención, o sales o derivados de los mismos, pueden formularse como composiciones farmacéuticas preparadas para almacenamiento o administración, y que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido GLP-2 de la presente invención, o una sal o derivado del mismo, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención dependerá de la vía de administración, el tipo de mamífero que se esté tratando, y las características físicas del mamífero específico en consideración. Estos factores y su relación para determinar esta cantidad son bien conocidos para los especialistas en las téenicas médicas. Esta cantidad y el método de administración pueden adaptarse para conseguir eficacia óptima para suministrar el péptido al intestino grueso, pero dependerán de factores tales como el peso, la dieta, la medicación concurrente y otros factores, bien conocidos para los especialistas en las técnicas médicas.
Dentro de la invención se proporciona una composición farmacéutica, en la que está presente un análogo de GLP-2 de la invención, o una sal del mismo, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir trastornos relacionados con el estómago y el intestino.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención que tienen un resto ácido pueden formarse usando bases orgánicas e inorgánicas. Las sales adecuadas formadas con bases incluyen sales metálicas, tales como sales de metales alcalinos o alcalino-térreos, por ejemplo sales de sodio, potasio, o magnesio; sales de amoniaco y sales de amina orgánica, tales como las formadas con morfolina, tiomorfolina, piperidina, pirrolidina, una mono-, di- o tri-alquilo inferior amina (por ejemplo, etil-terc-butil-, dietil-, diisopropil-, trietil-, tributil- o dimetilpropilamina), o una mono-, di- o trihidroxi alquilo inferior amina (por ejemplo, mono-, di- o trietanolamina). También pueden formarse sales internas. Asimismo, cuando un compuesto de la presente invención contiene un resto básico, pueden formarse sales usando ácidos orgánicos e inorgánicos. Por ejemplo, pueden formarse sales a partir de los siguientes ácidos: acetico, propiónico, láctico, cítrico, tartárico, succínico, fumárico, maleico, malónico, mandélico, málico, itálico, clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, metanosulfónico, naftalenosulfónico, bencenosulfónico, toluenosulfónico, y canforsulfónico así como otros ácidos farmacéuticamente aceptables conocidos. También pueden formarse sales de adición de aminoácidos con aminoácidos tales como lisina, glicina, y fenilalanina.
Como es evidente para los especialistas en la téenica, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de los péptidos o composiciones farmacéuticas de la presente invención variará dependiendo de la edad, peso y especie de mamífero tratada, los compuestos particulares empleados, el modo particular de administración y los efectos deseados y la indicación terapéutica. Como estos factores y si relación para determinar esta cantidad son bien conocidos, la determinación de los niveles de dosificación terapéuticamente eficaces, la cantidad necesaria para conseguir el resultado deseado para prevenir y/o tratar las enfermedades relacionadas con el intestino y el estómago descritas en este documento, así como otras indicaciones médicas descritas en este documento, estarán dentro de las habilidades de los especialistas en la técnica.
Como se usa en este documento, "una cantidad terapéuticamente eficaz" es una que reduce los síntomas de una afección o patología dada, y preferiblemente que normaliza las respuestas fisiológicas en un individuo con la afección o patología. La reducción de los síntomas o la normalización de las respuesta fisiológicas puede determinarse usando métodos rutinarios en la técnica y puede variarse con una afección o patología dada. En un aspecto, una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más análogos de GLP-2 de la invención o una composición farmacéutica que comprende uno o más análogos de GLP-2 de la invención es una cantidad que restaura un parámetro fisiológico medióle hasta sustancialmente el mismo valor (preferiblemente en el 30%, más preferiblemente en el 20%, y aún más preferiblemente, en el 10% del valor) del parámetro en un individuo sin la afección o patología.
En una realización de la invención la administración de los compuestos o composición farmacéutica de la presente invención se comienza a niveles de dosificación inferiores, aumentándose los niveles de dosificación hasta que se consigue el efecto deseado de prevenir/tratar la indicación medica relevante, tal como enfermedades relacionadas con el intestino y el estómago. Esto puede definir una cantidad terapéuticamente eficaz. Para los péptidos de la presente invención, solos o como parte de una composición farmacéutica, dichas dosis puede ser entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 100 mg/kg de peso corporal, tal como entre aproximadamente 0,01 mg/kg y 10 mg/kg de peso corporal, por ejemplo entre 10-100 microgramos/kg de peso corporal.
Para uso terapéutico, un análogo de GLP-2 de la invención puede formularse con un vehículo que es farmacéuticamente aceptable y es apropiado para suministrar el péptido mediante la vía de administración elegida. Para los propósitos de la presente invención, las vías parenterales periféricas incluyen vías intravenosa, intramuscular, subcutánea, e intra peritoneal de administración. Ciertos compuestos usados en la presente invención también pueden ser susceptibles a administración por vía oral, rectal, nasal, o respiratoria inferior. Estas son las llamadas vías no parenterales. La presente composición farmacéutica comprende un análogo de GLP-2 de la invención, o una sal o derivado del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados son aquellos usados de forma convencional con fármacos basados en péptido, tales como diluyentes, excipientes y similares. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la téenica farmacéutica, y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985). Por ejemplo, puede usarse solución salina estéril y solución salina tamponada con fosfato a pH ligeramente ácido o fisiológico. Los agentes tamponantes del pH adecuados pueden ser fosfato, citrato, acetato, tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido N-Tris(hidroximetil)metil-3-aminopropanosulfónico (TAPS), bicarbonato de amonio, dietanolamina, histidina, que es un tampón preferido, arginina, lisina, o acetato o mezclas de los mismos. Los intervalos de tampón preferidos en ciertas realizaciones son pH 4-8, pH 6,5-8, y más preferiblemente pH 7-7,5. Pueden proporcionarse conservantes, tales como para, meta, y orto-cresol, metil- y propilparabeno, fenol, alcohol bencílico, benzoato sódico, ácido benzoico, bencil-benzoato, ácido sórbico, ácido propanoico, ásteres de ácido p-hidroxibenzoico en la composición farmacéutica. Pueden proporcionarse estabilizadores que evitan la oxidación, desamidación, isomerización, racemización, cielación, hidrólisis peptídica, tales como por ejemplo ácido ascórbico, metionina, triptófano, EDTA, asparagina, sina, arginina, glutamina y glicina en la composición farmacéutica. También pueden proporcionarse estabilizadores que evitan la agregación, fibrilación y precipitación, tales como dodecil sulfato sódico, polietilenglicol, carboximetil celulosa, ciclodextrina en la composición farmacéutica. Pueden proporcionarse modificadores orgánicos para solubilización o evitar la agregación, tales como etanol, ácido acético o acetato y sales de los mismos en la composición farmacéutica. Pueden proporcionarse agentes de isotonicidad tales como sales por ejemplo cloruro sódico o más preferiblemente carbohidratos por ejemplo dextrosa, manitol, lactosa, trehalosa, sacarosa o mezclas de los mismos en la composición farmacéutica.
Pueden proporcionarse detergentes, tales como Tween 20, Tween 80, SDS, Poloxámeros por ejemplo Pluronic F-68, Pluronic F-127, en una composición farmacéutica de la invención. También peden proporcionarse colorantes y agentes aromatizantes en la composición farmacéutica. En otra realización, se proporciona una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable de un análogo de GLP-2 de la invención. También pueden usarse agentes de suspensión.
Pueden proporcionarse modificadores orgánicos, tales como etanol, butanol terciario, 2-propanol, etanol, glicerol, y polietilenglicol en una formulación farmacéutica para liofilización de un producto liofilizado. Pueden proporcionarse agentes de volumen y agentes de isotonicidad tales como sal por ejemplo cloruro sódico, carbohidratos por ejemplo dextrosa, manitol, lactosa, trehalosa, sacarosa o mezclas de los mismos, aminoácidos (por ejemplo, glicina y glutamato), o excipientes tales como cisteína, lecitina o albúmina sérica humana, o mezclas de los mismos, en la composición farmacéutica para liofilización.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse y usarse como comprimidos, cápsulas o elixires para administración oral; supositorios para administración rectal; preferiblemente soluciones estériles o polvos estériles o suspensiones para administración inyectable; y similares. La dosis y método de administración pueden adaptarse para conseguir eficacia óptima, pero dependerán de factores tales como el peso, dieta, medicación concurrente, que son reconocibles para los especialistas en la teenica.
Cuando la administración tiene que ser parenteral, tal como administración intravenosa y subcutánea, pueden prepararse composiciones farmacéuticas inyectables en formas convencionales, como soluciones o suspensiones acuosas; formas sólidas liofilizadas adecuadas para reconstitución inmediatamente antes de su uso o suspensión en líquido antes de inyección, o como emulsiones.
Los diluyentes para reconstitución del producto liofilizado pueden elegirse, por ejemplo, entre los tampones enumerados anteriormente, o seleccionarse entre agua, solución salina, dextrosa, manitol, lactosa, trehalosa, sacarosa, lecitina, albúmina, glutamato sódico, clorhidrato de cisteína), o agua para inyección con la adición de detergentes, tales como Tween 20, Tween 80, poloxámeros (por ejemplo, pluronic F-68 o pluronic F-127), polietilenglicol, y/o con la adición de conservantes tales como para-, meta-, y orto-cresol, metil- y propilparabeno, fenol, alcohol bencílico, benzoato sódico, ácido benzoico, bencil-benzoato, ácido sórbico, ácido propanoico, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, y/o con la adición de un modificador orgánico tal como etanol, ácido acítico, ácido cítrico, ácido láctico o sales de los mismos.
Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas inyectables pueden contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes, o agentes tamponantes del pH. También pueden utilizarse preparaciones potenciadoras de la absorción (por ejemplo, liposomas, detergentes y ácidos orgánicos).
En una realización de la invención, los compuestos se formulan para administración por infusión, por ejemplo, cuando se usan como suplementos líquidos nutricionales para pacientes en terapia de nutrición parenteral total (por ejemplo neonatos, o paciente que padecen caquexia o anorexia), o por inyección, por ejemplo subcutánea, intraperitoneal o intravenosa, y se utilizan por consiguiente como soluciones acuosas en forma estéril y libre de pirógenos y opcionalmente tamponadas a pH fisiológicamente tolerable, por ejemplo, un pH ligeramente ácido o fisiológico. La formulación para administración intramuscular puede basarse en soluciones o suspensiones en aceite vegetal, por ejemplo aceite de colza, aceite de maíz o aceite de soja. Estas formulaciones basadas en aceite pueden estabilizarse mediante antioxidantes, por ejemplo BHA (hidroxianisol butilado) y BHT (hidroxitolueno butilado).
Por tanto, los análogos de GLP-2 de la invención pueden administrarse en un vehículo, tal como agua destilada o en solución salina, solución salina tamponada con fosfato, soluciones de dextrosa al 5% o aceites. La solubilidad de un análogo de GLP-2 de la invención puede potenciarse, si se desea, incorporando un potenciador de solubilidad, tal como un detergente y/o emulsionante.
El medio o vehículo acuoso puede suplementarse para uso inyectable con una cantidad de gelatina que sirve para depositar el análogo de GLP-2 en o cerca del sitio de inyección, para proporcionar una liberación lenta al sitio deseado de acción. Tambien pueden ser útiles agentes gelificantes alternativos, tales como ácido hialurónico, como agentes de deposición.
Los compuestos peptídicos de la presente invención puede usarse solos, o en combinación con compuestos que tienen un efecto anti-inflamatorio. Sin limitarse a teoría alguna, dicho tratamiento de combinación puede reforzar los efectos beneficiosos de tratamiento de los análogos peptídicos de la invención.
La dosificación y régimen terapéuticos más apropiados para el tratamiento del paciente variarán, por supuesto, con la enfermedad o afección a tratar, y de acuerdo con el peso del paciente y otros parámetros. Sin el deseo de limitarse a teoría particular alguna, se espera que las dosis, en el intervalo de microgramos/kg o mg/kg, y duración o frecuencia más corta o más larga de tratamiento puedan producir resultados terapéuticamente útiles, tales como un aumento estadísticamente significativo, particularmente en la masa del intestino delgado. En algunos casos, el régimen terapéutico puede incluir la administración de dosis de mantenimiento apropiadas para prevenir la regresión tisular que sucede después del cese del tratamiento inicial. Los tamaños de dosificación y régimen de dosificación más apropiados para uso humano pueden guiarse mediante los resultados obtenidos por la presente invención, y pueden confirmarse en ensayos clínicos apropiadamente diseñados.
Puede determinarse una dosificación y protocolo de tratamiento eficaces por medios convencionales, partiendo con una baja dosis en animales de laboratorio y despues aumentando la dosificación controlando al mismo tiempo los efectos, y variando sistemáticamente el régimen de dosificación también. Pueden tomarse en consideración numerosos factores por un médico cuando se determina una dosificación óptima para un sujeto dado. Dichas consideraciones son conocidas para los especialistas en la téenica.
Una dosis humana de un péptido GLP-2 de acuerdo con la invención puede, en una realización, ser de aproximadamente 10 microgramos/kg de peso corporal/día a aproximadamente 10 mg/kg/día, preferiblemente de aproximadamente 50 microgramos/kg/día a aproximadamente 5 mg/kg/día, y mucho más preferiblemente de aproximadamente 100 microgramos/kg/día a 1 mg/kg/día.
Afecciones médicas Los análogos de GLP-2 de la presente invención son útiles como agente farmacéutico para prevenir o tratar a un individuo que padece inflamación de grado bajo, por ejemplo, inflamación de grado bajo local o sistémica. La inflamación de grado bajo puede incluir, aunque sin limitación: síndrome metabólico, obesidad (por ejemplo, obesidad abdominal), diabetes, enfermedades cardiovasculares, inflamación gastrointestinal, depresión, Alzheimer, artritis, hipertensión, dislipidemia y apoplejía. Los trastornos gastrointestinales, incluyen los trastornos del tracto gastrointestinal superior del esófago, y pueden tratarse puede administrando una cantidad eficaz de un análogo de GLP-2 de la invención, o una sal del mismo como se describe en este documento. Los trastornos relacionados con el estómago y el intestino incluyen úlceras de cualquier etiología (por ejemplo, úlceras pépticas, síndrome de Zollinger-Ellison, úlceras inducidas por fármacos, úlceras relacionadas con infecciones u otros patógenos), trastornos de digestión, síndromes de mala absorción, síndrome del intestino corto, síndrome de cul-de-sac, enfermedad inflamatoria del intestino (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), esprúe celiaco (por ejemplo que surge de enteropatía inducida por gluten o enfermedad celiaca), esprúe tropical, esprúe hipogammaglobulinémico, y mucositis y diarrea inducida por quimioterapia y/o hemoterapia por radiación.
Para pacientes que tienen neoplasia de mucosa gastrointestinal, o un riesgo aumentado de neoplasia de mucosa gastrointestinal, puede ser deseable seleccionar un compuesto para reducir o anular el riesgo de efectos secundarios reducidos tales como estimulación o agravamiento de la neoplasia de mucosa gastrointestinal.
Afecciones particulares que pueden tratarse con un análogo de GLP-2 de la invención incluyen las diversas formas de esprúe incluyendo esprúe celiaco que resulta de una reacción tóxica a alfa-gliadina con calor y puede ser un resultado de enteropatía inducida por gluten o enfermedad celiaca, y está marcado por una perdida significativa de vellosidades del intestino delgado; esprúe tropical que resulta de infección y está marcado por aplanamiento parcial de las vellosidades; esprúe hipogammaglobulinémico que se observa comúnmente en pacientes con inmunodeficiencia variable común o hipogammaglobulinemia y está marcado por disminución significativa en la altura de las vellosidades. La eficacia terapéutica del tratamiento con análogo de GLP-2 puede controlarse mediante biopsia entérica para examinar la morfología de las vellosidades, por evaluación bioquímica de la absorción de nutrientes, por determinación no invasiva de la permeabilidad intestinal, por ganancia de peso del paciente, o por mejora de los síntomas asociados con estas afecciones.
Los análogos de GLP-2 de la presente invención pueden ser útiles como agentes farmacéuticos para prevenir o tratar trastornos relacionados con el estómago incluyendo úlceras de cualquier etiología (por ejemplo, úlceras pépticas, síndrome de Zollinger-Ellison, úlceras inducidas por fármacos, úlceras relacionadas con infecciones u otros patógenos).
Otras afecciones que pueden tratarse con los análogos de GLP-2 de la invención, o para las cuales los análogos de GLP-2 pueden ser útiles profilácticamente, incluyen además de la enteritis por radiación mencionada anteriormente, enteritis infecciosa o post-infecciosa, y daño al intestino delgado debido a agentes quimioterapéuticos o tóxicos contra el cáncer.
Los análogos de GLP-2 también pueden usarse para el tratamiento de mala nutrición, por ejemplo caquexia y anorexia.
Una realización particular de la invención se refiere al uso de los presentes péptidos para la prevención y/o tratamiento de daño y disfunción intestinal. Las células madre de la mucosa del intestino delgado son particularmente susceptible a los efectos citotóxicos de la quimioterapia debido a su rápida tasa de proliferación (Keefe et al., Gut 2000; 47: 632-7). La administración de los presentes agonistas de peptido GLP-2 puede potenciar el efecto trófico en las criptas intestinales y proporcionar rápidamente nuevas células para remplazar el epitelio intestinal dañado después de quimioterapia y/o radioterapia. Un objetivo a conseguir administrando los análogos de GLP-2 de la invención es reducir la morbilidad relacionada con daño gastrointestinal de pacientes que experimentan tratamiento con quimioterapia aumentando al mismo tiempo la tolerancia a quimioterapia más agresiva, radiación y terapias de combinación de quimioterapia y radiación. El tratamiento profiláctico o terapéutico concomitante puede proporcionarse de acuerdo con la presente invención a pacientes que experimentan o están próximos a experimentar radioterapia.
La mucositis gastrointestinal después de quimioterapia anti-cáncer es un problema creciente que es esencialmente insuperable una vez establecido, aunque remite gradualmente. Estudios realizados con los fármacos contra el cáncer citostáticos comúnmente usados 5-FU e irinotecano han demostrado que la quimioterapia eficaz con estos fármacos afecta predominantemente a la integridad estructural y función del intestino delgado, mientras que el colon es menos sensible y responde principalmente con formación aumentada de mucosidad (Gibson et al., J Gastroenterol Hepatol. 18(9): 1095-1100, 2003; Tamaki et al., J Int Med Res. 31(1 ):6-16, 2003).
En otra realización, la invención describe un método para tratar afecciones mediadas por DPP-IV (dipeptidilpeptidasa-IV) administrando a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un análogo de GLP-2, o una sal del mismo. Dichas enfermedades incluyen afecciones en que la enzima DPP-IV se sobre-expresa.
La composición farmacéutica puede formularse en una realización para causar liberación lenta de dicho análogo de GLP-2, o una sal o derivado del mismo como se ha descrito anteriormente.
Se concibe que los presentes péptidos pueden emplearse en un método para tratar neonatos administrando una cantidad eficaz de un análogo de GLP-2, o una sal del mismo, de la invención. Las complicaciones con la alimentación de neonatos debido a la ausencia de desarrollo del intestino pueden superarse usando los agonistas peptídicos de la invención.
En algunas realizaciones, la invención describe un metodo para tratar afecciones mediadas por DPP-IV (dipeptidilpeptidasa-IV) administrando a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un análogo de GLP-2, o una sal del mismo, de la invención. Dichas enfermedades incluyen afecciones en que la enzima DPP-IV se sobre-expresa.
Ejemplos Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar aspectos preferidos de la invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Síntesis peptídica general Aparato y estrategia sintética Los péptidos se sintetizaron por lotes en un recipiente de polietileno equipado con un filtro de polipropileno para filtración usando 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc) como grupo protector de N-a-amino y grupos comunes de protección adecuados para funcionalidades de cadena lateral.
La síntesis peptídica en fase sólida se realizó en un GEM Liberty Peptide Synthesizer usando química convencional de Fmoc. Se hinchó resina TentaGel S Ram (1 g; 0,25 mmol/g) en NMP (10 mi) antes de su uso y se transfirió entre el tubo y el vaso de reacción usando DCM y NMP.
Acoplamiento Se añadió un Fmoc-aminoácido en NMP/DMF/DCM (1:1:1 ; 0,2 M; 5 mi) a la resina en una unidad de microondas CEM Discover junto con HATU/NMP (0,5 M; 2 mi) y DIPEA/NMP (2,0 M; 1 mi). La mezcla de acoplamiento se calentó a 75°C durante 5 min mientras se burbujeó nitrógeno a través de la mezcla. La resina después se lavó con NMP (4 x 10 mi).
Como alternativa, se añadió un Fmoc-aminoácido en DMF/DCM (2:1; 0,2 M; 5 mi) a la resina en una unidad de microondas CEM Discover junto con COMU/DMF (0,5 M; 2 mi) y DIPEA/DMF (2,0 M; 1 mi). La mezcla de acoplamiento se calentó a 75°C durante 5 min mientras se burbujeó nitrógeno a través de la mezcla. La resina después se lavó con NMP (4 x 10 mi).
Desprotección Se añadió piperidina/NMP (20%; 10 mi) a la resina para una desprotección inicial y la mezcla se calentó por microondas (30 segundos; 40°C). El recipiente de reacción se drenó y se añadió una segunda porción de piperidina/NMP (20%; 10 mi) y se calentó (75°C; 3 min.) de nuevo. La resina despues se lavó con NMP (6x10 mi).
Como alternativa, se añadió piperidina/DMF (20%; 10 mi) a la resina para una desprotección inicial y la mezcla se calentó por microondas (30 segundos; 40°C). El recipiente de reacción se drenó y se añadió una segunda porción de piperidina/DMF (20%; 10 mi) y se calentó (75°C; 3 min.) de nuevo. La resina después se lavó con DMF (6 x 10 mi).
Acilación de cadenas laterales (opcional) Se introduce Fmoc-Lys(ivDde)-OH o como alternativa otro aminoácido con un grupo protector de cadena lateral ortogonal en la posición de la acilación. El extremo N-terminal de la estructura peptídica después se protege con Boc usando Boc20 o como alternativa usando un aminoácido protegido con Boc en el último acoplamiento. Aunque el péptido está aún unido a la resina, el grupo protector de cadena lateral ortogonal se escinde selectivamente usando hidrazina hidrato recién preparada (2-4%) en NMP durante 2 x 15 min. La cadena lateral de lisina no protegida se acopla primero con Fmoc-Glu-OtBu u otro aminoácido espaciador, que se desprotege con piperidina y se acila con un resto lipófilo usando la metodología de acoplamiento peptídico descrita anteriormente. Las abreviaturas empleadas son las siguientes: ivDde: 1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)3-metil-butilo Dde: 1 -(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-etilo DCM: diclorometano BMP: N,N-d¡metilformamida DIPEA: diisopropiletilamina EtOH: etanol Et20: éter dietílico HATU: N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazol[4,5- b]piridina-1-ilmetileno]-N-metilmetanaminio MeCN: acetonitrilo NMP: N-metilpirrolidona TFA: ácido trifluoroacético TIS: triisopropilsilano Escisión La resina se lavó con EtOH (3x10 mi) y Et20 (3x10 mi) y se secó hasta peso constante a temperatura ambiente (t.a.). El péptido en bruto se escindió de la resina por tratamiento con TFA/TIS/agua (95/2,5/2,5; 40 mi, 2 h; t.a.) o TFA/DODT (95/5; 40 mi, 2 h; t.a.). La mayor parte del TFA se retiró a presión reducida y el péptido en bruto se precipitó y se lavó tres veces con éter dietílico y se secó hasta peso constante a temperatura ambiente.
Purificación por HPLC del péptido en bruto El péptido en bruto se purificó hasta aproximadamente o más del 90% por HPLC preparativa de fase inversa usando una PerSeptive Biosystems VISION Workstation equipada con una columna C-18 (5 cm; 10 miti) y un colector de fracciones y se procesó a 35 ml/min con un gradiente de tampón A (TFA al 0,1%, ac.)y tampón B (TFA al 0,1%, MeCN al 90%, ac.). Las fracciones se analizaron por HPLC analítica y MS y se combinaron y liofilizaron las fracciones relevantes. El producto final se caracterizó por HPLC y MS.
Los aminoácidos protegidos con Fmoc se adquirieron de Advanced ChemTech (ACT) en formas protegidas de cadena lateral adecuadas.
Reactivos de acoplamiento El reactivo de acoplamiento diisopropilcarbodiimida (DIG) se adquirió en Riedel de-Háen, Alemania.
Soporte sólidos Los péptidos se sintetizaron en resinas TentaGel S de 0,22-0,31 mmol/g. Se usaron TentaGel S-Ram, TentaGel S RAM-Lys(Boc)Fmoc (Rapp polymere, Alemania) en casos donde se prefería peptido amidado C-terminal, mientras que TentaGel S PHB, por ejemplo TentaGel S PHB Asp(Boc)Fmoc se usaron cuando se prefería un ácido carboxílico libre C-terminal.
La desprotección de Asp (por ejemplo, en la posición 15) se realizó usando ácido fórmico 0,1 M en Piperidina al 30%/NMP cuando el aminoácido en la siguiente posición (por ejemplo, posición 16) era Gly y sin calentamiento durante la síntesis o desprotección.
Catalizadores y otros reactivos La diisopropiletilamina (DIEA) se adquirió en Aldrich, Alemania, la piperidina y piridina en Riedel-de Háen, Frankfurt, Alemania. El etanoditiol se adquirió en Riedel-de Háen, Frankfurt, Alemania. La 3,4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (Dhbt-OH), el 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) (HOAt) se obtuvieron en Fluka, Suiza.
Procedimiento de acoplamiento Los aminoácidos se acoplaron como ásteres HObt o HOAt generados in situ preparados a partir de los aminoácidos N-a-protegidos apropiados y HObt o HOAt mediante DIC en DMF. La acilación se comprobó mediante el ensayo de ninhidrina realizado a 80°C para evitar la desprotección con Fmoc durante el ensayo (Larsen, B, D. y Holm, A., Int. J. Peptide Protein Res.43, 1994, 1-9).
Desprotección del grupo protector de N-a-amino (Fmoc) Purificación por HPLC del péptido en bruto Los productos de péptido en bruto se purificaron en PerSeptive Biosystems VISION Workstation. Se usó el software VISION 3.0 para el control del instrumento y la adquisición de datos. Se usó la siguiente columna y sistema de tampón de HPLC: Columna: Kromasil KR 100A, 10 mm C-8, 250 x 50,8 mm.
Sistema de tampón: Tampones: A: TFA al 0,1% en MQV; B: TFA al 0,085%, MQV al 10%, MeCN al 90%.
Gradiente: 0-37 min. 0-40% de B Flujo: 35 ml/min, detección UV: I = 215 nm y 280 nm.
Espectroscopia de masas Los péptidos se disolvieron en metanol súper gradiente (Labscan, Dublín, Irlanda), agua milli-Q (Millipore, Bedford, MA) y ácido fórmico (Merck, Damsfadt, Alemania) (50:50:0,1 v/v/v) para dar concentraciones entre 1 y 10 mg/ml. Las soluciones de péptido (20 mi) se analizaron en modo de polaridad positiva por ESI-TOF-MS usando un espectrómetro de masas LCT (Micromass, Manchester, RU) con precisión de +/- 0,1 m/z.
Después de la purificación usando HPLC preparativa como se ha descrito anteriormente, el producto peptídico se recogió y se confirmó la identidad de péptido por ES-MS. Este procedimiento se usó para la síntesis de todos los péptidos ejemplificados adicionalmente a continuación.
Compuestos sintetizados Los compuestos de la Tabla 1 se sintetizaron usando las téenicas anteriores.
Tabla 1: Compuestos sintetizados Ejemplo 1 Síntesis del compuesto 12 Se realizó síntesis peptídica en fase sólida en un CEM Liberty Peptide Synthesizer usando química convencional de Fmoc. Se hinchó resina TentaGel S Ram S (1,33 g; 0,25 mmol/g) en DMF (10 mi) antes de su uso y se transfirió entre el tubo y el vaso de reacción usando DCM y DMF.
Acoplamiento Se añadió un Fmoc-aminoácido en DMF/DCM (2:1; 0,2 M; 5 mi) a la resina en una unidad microondas CEM Discover junto con COMU/DMF (0,5 M; 2 mi) y DIPEA y DMF (2,0 M; 1 mi). La mezcla de acoplamiento se calentó a 75°C durante 5 min mientras se burbujeó nitrógeno a traves de la mezcla. La resina después se lavó con DMF (4 x 10 mi). Se usó Fmoc-Phe-Ser(Psi Me,Me,Pro)-OH pseudoprolina para el número de aminoácido seis y siete.
Desprotección Se añadió piperidina/DMF (20%; 10 mi) a la resina para una desprotección inicial y la mezcla se calentó por microondas (30 segundos; 40°C). El recipiente de reacción se drenó y se añadió una segunda porción de piperidina/DMF (20%; 10 mi) y se calentó (75°C; 3 min.) de nuevo. La resina después se lavó con DMF (8x10 mi).
La resina se lavó con EtOH (3x10 mi) y Et20 (3x10 mi) y se secó hasta peso constante a temperatura ambiente (t.a.). El péptido en bruto se escindió de la resina por tratamiento con TFA/DODT (95/5; 60 mi, 2 h; t.a.). La mayor parte del TFA se retiró a presión reducida y el péptido en bruto se precipitó y lavó tres veces con éter dietílico y se secó hasta peso constante a temperatura ambiente.
Purificación por HPLC del péptido en bruto El péptido en bruto se purificó primero hasta el 45% por HPLC preparativa de fase inversa usando una PerSeptive Biosystems VISION Workstation equipada con una columna Gemini NX 5m C-18 110A, 10x250 mm y un colector de fracciones y se procesó a 35 ml/min con un gradiente de tampón A (TFA al 0,1 %, ac.) y tampón B (TFA al 0,1%, MeCN al 90%, ac.). Las fracciones se analizaron por HPLC analítica y MS y las fracciones relevantes se combinaron y liofilizaron. El producto (143 mg) se purificó una segunda vez con una columna C4 Júpiter 2, 12x25 cm, para producir 27 mg, con una pureza del 89% caracterizada por HPLC y MS. PM monoisotópico calculado = 3377,61, encontrado 3377,57.
Ejemplo 2. Ensayos de eficacia del receptor de GLP-2 Se usó un ensayo de AMPc AlphaScreen® de Perkin Elmer para cuantificar una respuesta de AMPc a un análogo de GLP-2. Teduglutida fue el compuesto de referencia en este ensayo y tiene una CEso de aproximadamente 0,01 nM. Se ensayaron los compuestos de ensayo que inducían un aumento en el nivel intracelular de AMPc en este ensayo, y la respuesta se normalizó respecto a un control positivo y negativo para calcular la CEso y la respuesta máxima a partir de la curva de respuesta a concentración. Los resultados se enumeran en la Tabla 2.
Generación de línea celular que expresa receptores de GLP-1 humano Se clonó el ADNc que codifica el receptor de péptido-1 tipo glucagón (GLP-1 R) humano (número de acceso principal P43220) a partir del ADNc BC112126 (MGC: 138331 /IMAGE:8327594). El ADN que codifica el GLP-1 -R se amplificó por PGR usando cebadores que codificaban sitios de restricción terminales para subclonación. Los cebadores del extremo 5' codificaban adicionalmente una secuencia consenso casi Kozak para asegurar la traducción eficaz. La fidelidad del ADN que codifica el GLP-1 -R se confirmó por secuenciación de ADN. Los productos de PCR que codifican el GLP-1-R se subclonaron en un vector de expresión de mamífero que contenía un marcador de resistencia a neomicina (G418). Los vectores de expresión de mamífero que codifican el GLP-1 -R se transfectaron en células HEK293 mediante un método convencional de transfección con fosfato cálcico. Unas 48 horas después de la transfección, las células se sembraron para clonación de dilución limitada y se seleccionaron con 1 mg/ml de G418 en el medio de cultivo. Tres semanas después, se picaron 12 colonias supervivientes de células que expresaban GLP-1 -R, se propagaron y se ensayaron en los ensayos de eficacia del receptor de GLP-1 como se describe a continuación. Se seleccionó un clon que expresaba GLP-1 -R para el perfilado de compuesto.
Generación de línea celular que expresa receptores de GLP-2 humano El hGLP2-R se adquirió en MRC-geneservice, Babraham, Cambridge como el clon Image: 5363415 (11924-117). Para subclonación en un vector de expresión de mamífero, se obtuvieron cebadores para subclonación de DNA-Technology, Risskov, Dinamarca. Los cebadores 5' y 3' usados para la reacción de PCR incluyen sitios de restricción terminales para clonación y el contexto del cebador 5' está modificado en una secuencia consenso Kozak sin cambiar la secuencia del producto codificado por la ORF. Se ejecutó una reacción de PCR convencional usando el clon Image 5363415 (11924-117) como molde con los cebadores mencionados anteriormente y Polimerasa Herculase II Fusión en un vol. total de 50 mI. El producto de PCR generado se purificó usando GFX PCR y kit de purificación de bandas de gel, se digirió con enzimas de restricción y se clonó en el vector de expresión de mamífero usando kit de ligamiento de ADN Rapid. La reacción de ligamiento se transformó en células XL10 Gold Ultracompetent y las colonias se picaron para la producción de ADN usando el Endofree Plasmid maxi kit. Se realizó análisis de secuencia posterior por MWG Eurofins, Alemania. Se confirmó que el clon era la variante de corte y ayuste del receptor de hGLP-2, rs17681684.
Se transfectaron células HEK293 usando el método de transfección con Lipofectamina PLUS. El día antes de la transfección, las células HEK293 se sembraron en dos matraces T75 a una densidad de 2x106 células/matraz T75 en medio de cultivo celular sin antibióticos. En el día de la transfección, las células se lavaron con 1x DPBS y el medio se remplazó con Optimem hasta un volumen de 5 ml/matraz T75 antes de la adición de complejos Lipofectamina-plásmido, que se añadieron suavemente y gota a gota a las células en matraces T75 y se remplazaron con medio de cultivo después de 3 horas y de nuevo a medio de cultivo suplementado con 500 mg/ml de G418 después de 24 horas. Después de 4 semanas en selección con G418, las colonias se picaron y ensayaron en un ensayo funcional. Se seleccionó una colonia para su uso en perfilado de compuesto.
Ensayos de eficacia de receptor de GLP-1 Se usó el ensayo de AMPc AlphaScreen® de Perkin Elmer para cuantificar la respuesta de AMPc a activación del receptor de GLP1 y GLP2, respectivamente. Se usó Exendina-4 (ZP24) como compuesto de referencia para la activación del receptor de GLP1 y Teduglutida (ZP1559) como compuesto de referencia para la activación del receptor de GLP2. Los datos de los compuestos de ensayo que provocaban un aumento en el nivel intracelular de AMPc se normalizaron respecto al control positivo y negativo (vehículo) para calcular la CEso y la respuesta máxima a partir de la curva de respuesta a concentración. Los resultados se enumeran en la Tabla 2.
Tabla 2: Mediciones de CE50 de GLP-1R y GLP-2R Ejemplo 3: Efecto sobre la tolerancia a la glucosa en ratones normales Se usaron ratones macho C57BL/6J alimentados con comida normal. Los ratones se mantuvieron en condiciones convencionales de alojamiento (habitación con luz, temperatura, y humedad controladas (ciclo de 12:12 h luz-oscuridad, con luces encendidas a las 06.00-18.00 h; 24°C; 50% de humedad relativa)), y cada grupo de dosificación constaba de 10 animales.
Antes del ensayo de tolerancia a glucosa oral (OGTT), los animales estuvieron en ayunas durante 5 h. Una hora antes de la exposición a glucosa (tiempo t = -60 min) se midió la glucosa basal en sangre. Inmediatamente despues de la muestra de sangre, se dosificó a los animales una vez por vía subcutánea el compuesto a la cantidad indicada o PBS (vehículo). Una hora después en t = 0 min, se dio una sonda oral de 2 g/kg de glucosa (0,4 g/ml en agua diluida a partir de glucosa SAD 0,456 g/l; volumen de dosis 5 ml/kg) a los animales. Después de la administración de glucosa, se extrajo sangre de la vena de la cola para las mediciones de glucosa en t = 15, 30, 60, 120 min.
Resultados Los ratones tratados con vehículo presentaban una respuesta típica de exposición a glucosa, con un aumento en los niveles de glucosa en sangre en los primeros 30 minutos, seguido de un retorno a los niveles básales después de 120 minutos. El compuesto de ensayo redujo significativamente la respuesta de glucosa en sangre (Figura 2).
Ejemplo 4: Efecto sobre el peso intestinal en ratas normales Se usaron ratas macho Wistar alimentadas con comida normal. Las ratas se mantuvieron en condiciones convencionales de alojamiento (habitación con luz, temperatura, y humedad controladas (ciclo de 12:12 h luz-oscuridad, con luces encendidas a las 06.00-18.00 h; 24°C; 50% de humedad relativa)), y cada grupo de dosificación constaba de 6 animales. Se dosificó a las ratas una vez al día mediante vía subcutánea, durante cuatro días compuesto en la cantidad indicada o PBS (vehículo). En el día cinco, se sacrificó a las ratas y se midió el peso del intestino delgado.
Resultados El compuesto de ensayo aumentó el peso intestinal de un modo dependiente de dosis (Figura 3).
Ejemplo 5: Efecto del compuesto 7 en ratones con obesidad inducida por la dieta Se generó obesidad inducida por la diente alimentando a ratones macho C57BL/6J con dieta rica en grasas (Research Diet 60% de grasas (D12492) Research Diet Inc., New Brunswick, EEUU). Los ratones se mantuvieron en condiciones convencionales de alojamiento (habitación con luz, temperatura, y humedad controladas (ciclo de 12:12 h luz-oscuridad, con luces encendidas a las 06.00-18.00 h; 24°C; 50% de humedad relativa)).
El grupo de dosificación tratado con vehículo contenía 8 animales y los grupos tratados con compuesto 7 constaban de 12 animales/grupo. Todos los animales se trataron de forma simulada durante 7 días (una vez al día, SC, 100 mI de vehículo) para aclimatar a los animales a la manipulación e inyecciones, seguido de tratamiento (vehículo o compuesto 7) durante 14 días (dos veces al día, SC, 5 ml/kg). Los animales se dejaron en ayunas durante una noche (día 11-12) y se les extrajo sangre para el análisis de glucosa e insulina. En el día 14, se sacrificó a los animales y se retiraron, lavaron y pesaron el intestino delgado y grueso.
Resultados El compuesto 7, dosificado dos veces al día durante 14 días, aumentó significativamente la masa del intestino delgado y grueso en comparación con controles tratados con vehículo (Figura 4).
El compuesto 7, dosificado dos veces al día durante 14 días, redujo los niveles de glucosa en sangre e insulina en plasma en ayunas, y dio un índice HOMA-IR inferior que los controles tratados con vehículo (Figura 5).
Aunque la invención se ha descrito junto con las realizaciones ejemplares descritas anteriormente, serán evidentes muchas modificaciones y variaciones equivalentes para los especialistas en la téenica cuando se les de esta descripción. Por consiguiente, las realizaciones ejemplares de la invención expuesta se consideran ilustrativas y no limitantes. Pueden hacerse diversos cambios a las realizaciones descritas sin alejarse del espíritu y alcance de la invenpión. Todos los documentos citados en este documento se incorporan expresamente por referencia.

Claims (39)

REIVINDICACIONES
1. Un análogo de GLP-2 caracterizado porque está representado por la fórmula general I: R1-His-X2-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-X9-X10-X11 -X12-X13-X14-X15- C16-X17-Ala-X19-X20-X21 -Phe-lle-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31 -X32- X33-X34-R2 (I) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: R1 es hidrógeno, alquilo Ci-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; X2 es Gly, Ala o Aib; X3 es Glu, Gln o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X8 es Asp, Glu o Ser; X9 es Glu o Asp; X10 es Met, Val, Leu o Tyr; X11 es Asn, Ser o Ala; X12 es Thr, Ser o Lys; X13 es lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln; X14 es Leu o Met; X15 es Asp o Glu; X16 es Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu o Lys; X17 es Gln, Lys, Arg, His o Glu; X19 es Ala o Val; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 es lie, Leu, Val, Glu o Lys; X28 es Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1 o ausente; X29 es Thr, Ala, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es lie, Pro, Y1 o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; Y1 es Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, o Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es Nhte u OH; en el que el análogo de GLP-2 contiene no más de un Y1 ; si cualquiera de X28 a X33 es Y1, aquellas posiciones X29 a X34 cadena abajo de esa Y1 están ausentes; si cualquiera de X28 a X33 está ausente, aquellas posiciones X29 a X33 cadena abajo de esa posición tambien están ausentes; y con la condición de que el análogo de GLP-2 de fórmula I no sea HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD; HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; o HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK.
2. El análogo de GLP-2 o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque: R1 es hidrógeno, X2 es Gly, Ala o Aib; X3 es Glu, Gln o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X8 es Asp, Glu o Ser; X9 es Glu o Asp; X10 es Met, Val, Leu o Tyr; X11 es Asn o Ser; X13 es lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln; X14 es Leu o Met; X12 es Thr o Lys; X15 es Asp o Glu; X16 es Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu o Lys; X17 es Gln o Lys; X19 es Ala o Val; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 es lie, Leu, Val o Lys; X28 es Gln, Asn, Gly, Y1 o ausente; X29 es Thr, Ala, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es lie, Pro, Y1 o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; Y1 es -Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es NH2 U OH; en el que el análogo de GLP-2 contiene no más de un Y1 ; si cualquiera de X28 a X33 es Y1, aquellas posiciones X29 a X34 cadena abajo de esa Y1 están ausentes; si cualquiera de X28 a X33 está ausente, aquellas posiciones X29 a X33 cadena abajo de esa posición tambien están ausentes; y con la condición de que el análogo de GLP-2 de fórmula I no sea HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD; HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; o HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK.
3. Un análogo de GLP-2 caracterizado porque está representado por la fórmula general la: R 1 -H is-X2-X3-G ly-X5- P he-X7 -X8-X9-X 10-X11 -X12-X13-Leu-X15- C16-X17-Ala-Ala-X20-X21 -Phe-lle-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31 -X32- X33-R2 (la) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que: R1 es hidrógeno, alquilo Ci-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; X2 es Gly, Ala o Aib; X3 es Glu, Gln o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X8 es Asp, Glu o Ser; X9 es Glu o Asp; X10 es Met, Val, Leu o Tyr; X11 es Asn o Ser; X12 es Thr, Ser o Lys; X13 es lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln; X15 es Asp o Glu; X16 es Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu o Lys; X17 es Gln, Lys, Arg, His o Glu; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 es lie, Leu, Val, Glu o Lys; X28 es Gln, Asn, Lys, Ser, Gly, Y1 o ausente; X29 es Thr, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es lie, Pro, Y1 o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; Y1 es Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es NH2 U OH; en el que el análogo de GLP-2 contiene no más de un Y1 ; si cualquiera de X28 a X33 es Y1, aquellas posiciones X29 a X34 cadena abajo de esa Y1 están ausentes; si cualquiera de X28 a X33 está ausente, aquellas posiciones X29 a X33 cadena abajo de esa posición tambien están ausentes; y con la condición de que el análogo de GLP-2 de fórmula la no sea HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD; HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; o HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK.
4. El análogo de GLP-2 o sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque; R1 es hidrógeno, X2 es Gly, Ala o Aib; X3 es Glu, Gln o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X8 es Asp, Glu o Ser; X9 es Glu o Asp; X10 es Met, Val, Leu o Tyr; X11 es Asn o Ser; X12 es Thr o Lys; X13 es lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln; X15 es Asp o Glu; X16 es Asn, Gln, Gly, Ser, Ala, Glu o Lys; X17 es Gln o Lys; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 es lie, Leu, Val o Lys; X28 es Gln, Asn, Gly, Y1 o ausente; X29 es Thr, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es lie, Pro, Y1 o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; Y1 es Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es NH2 U OH; en el que el análogo de GLP-2 contiene no más de un Y1 ; si cualquiera de X28 a X33 es Y1, aquellas posiciones X29 a X34 cadena abajo de esa Y1 están ausentes; si cualquiera de X28 a X33 está ausente, aquellas posiciones X29 a X33 cadena abajo de esa posición tambien están ausentes; y con la condición de que el análogo de GLP-2 de fórmula la no sea HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTKITD; HGDGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; o HGDGSFSDEMNTILDSQAARDFINWLIQTK.
5. El análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque X17 es Gln.
6. El análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque X17 es Lys.
7. El análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque X17 es Glu.
8. El análogo de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque X14 es Leu.
9. El análogo de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque X14 es Met.
10. El análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque: (i) X16 es Gly y X17 es Gln; (ii) X16 es Gly y X17 es Lys; o (iii) X16 es Gly yX17 es Glu.
11. El análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque X2 es Aib.
12. El análogo de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, o cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, como dependientes de la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque X19 es Ala.
13. El análogo de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2, o cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, como dependientes de la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque X19 es Val.
14. Un análogo de GLP-2 representado por la fórmula general II: R1 -His-X2-X3-Gly-X5-Phe-X7-Ser-Glu-Leu-Ala-X12-X13-X14-X15- C16-X17-Ala-X19-X20-X21 -Phe-lle-X24-Trp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31 -X32- X33-X34-R2 (II) o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo, caracterizado porque: R1 es hidrógeno, alquilo Ci-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; X2 es Gly, Ala o Aib; X3 es Glu, Gln o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X12 es Thr, Ser o Lys; X13 es lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln; X14 es Leu o Met; X15 es Asp o Glu; X16 es Gly, Ser, Ala, Glu o Lys; X17 es Gln o Lys; X19 es Ala o Val; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 es lie, Leu, Val, Glu o Lys; X28 es Gln, Asn, Lys, Ser, Y1 o ausente; X29 es Thr, Ala, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es lie, Pro, Y1 o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; X34 es Y1 o ausente; Y1 es Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, o Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser- Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es NH2 u OH; en el que el análogo de GLP-2 contiene no más de un Y1 ; si cualquiera de X28 a X33 es Y1 , aquellas posiciones X29 a X34 cadena abajo de esa Y1 están ausentes; si cualquiera de X28 a X33 está ausente, aquellas posiciones X29 a X33 cadena abajo de esa posición tambien están ausentes.
15. Un análogo de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque X16 de la fórmula II es Gly, Ser o Ala, y opcionalmente X17 es Lys o Gln.
16. Un análogo de GLP-2 de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizado porque: R1 es hidrógeno, alquilo C-M (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; X2 es Gly o Aib; X3 es Glu o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X12 es Thr, Ser o Lys; X13 es lie, Leu, Val, Tyr, Phe o Gln; X14 es Leu o Met; X15 es Asp o Glu; X16 es Gly, Ser o Ala; X17 es Gln o Lys; X19 es Ala o Val; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu o Lys; X27 es lie, Leu, Val, Glu o Lys; X28 es Gln, Asn, Lys, Ser, Y1 o ausente; X29 es Thr, Ala, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es lie, Pro, Y1 o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; X34 es Y1 o ausente; Y1 es Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, o Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es NH2 u OH; en el que el análogo de GLP-2 contiene no más de un Y1 ; si cualquiera de X28 a X33 es Y1, aquellas posiciones X29 a X34 cadena abajo de esa Y1 están ausentes; si cualquiera de X28 a X33 está ausente, aquellas posiciones X29 a X33 cadena abajo de esa posición tambien están ausentes.
17. Un análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque (i) X16 es Gly y X17 es Gln; o (ii) X16 es Gly y X17 es Lys.
18. Un análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque: (i) X2 es Gly; o (ii) X2 es Aib.
19. Un análogo de GLP-2 representado por la fórmula general III: R1-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-Ser-Glu-Leu-Ala-X12-X13-Leu-X15- Gly-X17-Ala-X19-X20-X21 -Phe-lle-X24-T rp-Leu-X27-X28-X29-X30-X31 -X32- X33-X34-R2 (III) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, caracterizado porque: R1 es hidrógeno, alquilo C1-4 (por ejemplo, metilo), acetilo, formilo, benzoílo o trifluoroacetilo; X3 es Glu o Asp; X5 es Ser o Thr; X7 es Ser o Thr; X12 es Thr, Ser o Lys; X13 es lie, Tyr, o Gln; X15 es Asp o Glu; X17 es Gln o Lys; X19 es Ala o Val; X20 es Arg, Lys o His; X21 es Asp, Glu o Leu; X24 es Asn, Ala, Glu; X27 es lie, Leu, Glu o Lys; X28 es Gln, Lys, Ser, Gly, Y1 o ausente; X29 es Thr, Ala, Y1 o ausente; X30 es Lys, Y1 o ausente; X31 es lie, Pro, Y1 o ausente; X32 es Thr, Y1 o ausente; X33 es Asp, Asn, Y1 o ausente; X34 es Y1 o ausente; Y1 es Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser, o Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser; y R2 es NH2 U OH; en el que el análogo de GLP-2 contiene no más de un Y1 ; si cualquiera de X28 a X33 es Y1, aquellas posiciones X29 a X34 cadena abajo de esa Y1 están ausentes; si cualquiera de X28 a X33 está ausente, aquellas posiciones X29 a X33 cadena abajo de esa posición tambien están ausentes.
20. El análogo de GLP-2 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se selecciona de H-Aib-DGSFSDEMNTILDNQAARDFINWLIQTKITD; HGDGSFSDEMNTILDNKAARDFINWLIQTKSTD; HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK; HGDGSFSSEMNTILDSQAARDFINWLIQTKITD; HGEGTFTSDLSKQMEGQAVRDFIEWLIQTKITD; HGEGTFTSDLSKQMESKAARDFIEWLIQTKITD; HGDGSFSSELATILDGKAARDFINWLIQTKITD; HGEGTFTSDLSTILENKAARDFIEWLIQTKITD; HGEGSFSSDLSTILENKAARDFIEWLIGTKITD; H-Aib-DGSFSDELNTILDGKAARDFINWLIQTK; HGDGSFSSELATILDGQAARDFIAWLIQTKITD; HGDGSFSDEMNTILDGQAARDFINWLIQTK; y HGEGSFSSDLSTILEGKAARDFIEWLIQTKITD; o una sal o solvato farmaceuticamente aceptable del mismo.
21. El análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque un sustituyente lipófilo está conjugado a una o más de las posiciones 12, 14, 16, 17, 19, 20, 24, 27, 28 y 32.
22. El análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque un sustituyente lipófilo está conjugado a una o más de las posiciones 12, 16, 17, 20, 24, 27, 28 y 32.
23. El análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque un sustituyente lipófilo está conjugado a una o más de las posiciones 16, 17, 20, 24, 27, 28 y 32.
24. El análogo de GLP-2 de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, para su uso en terapia.
25. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un análogo de GLP-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, o una sal o derivado del mismo, en mezcla con un vehículo.
26. La composición farmacéutica de la reivindicación 25, caracterizada porque el análogo de GLP-2 es una sal de adición de ácidos farmacéuticamente aceptable.
27. La composición farmacéutica de la reivindicación 25 o reivindicación 26, caracterizada porque se formula como un líquido adecuado para administración por inyección o infusión, o que se formula para causar una liberación lenta de dicho análogo de GLP-2.
28. Uso de un análogo de GLP-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de inflamación de grado bajo.
29. Uso de un análogo de GLP-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, para la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de inflamación de grado bajo relacionada con diabetes.
30. El uso de la reivindicación 29, en el que la inflamación de grado bajo relacionada con diabetes está asociada con: síndrome metabólico, obesidad (por ejemplo, obesidad abdominal), diabetes, enfermedades cardiovasculares, inflamación gastrointestinal, depresión, Alzheimer, artritis, hipertensión, dislipidemia, apoplejía; trastornos gastrointestinales en el tracto gastrointestinal superior del esófago, el estómago, duodeno, el intestino delgado, colon y recto, úlceras de cualquier etiología, trastornos de digestión, síndromes de mala absorción, síndrome del intestino corto, síndrome de cul-de-sac, enfermedad inflamatoria del intestino, esprúe celiaco, esprúe tropical, esprúe hipogammaglobulinémico, y mucositis y diarrea inducida por quimioterapia y/o hemoterapia por radiación.
31. Una molecula de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un análogo de GLP-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.
32. Un vector de expresión caracterizado porque comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 31 , en combinación con secuencias de control para dirigir su expresión.
33. Una célula hospedadora caracterizada porque esta transformada con el vector de expresión de la reivindicación 32.
34. Un procedimiento de producción del análogo de GLP-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, el procedimiento estando caracterizado porque comprende cultivar las células hospedadoras de la reivindicación 33 en condiciones adecuadas para expresar el análogo de GLP-2 y purificar el análogo de GLP-2 así producido.
35. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31 , un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 32 o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 33 para su uso en terapia.
36. Uso de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31 , un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 32 o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 33, en la preparación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de inflamación de grado bajo asociada con obesidad (por ejemplo, obesidad abdominal), diabetes, enfermedades cardiovasculares, inflamación gastrointestinal, depresión, Alzheimer, artritis, hipertensión, dislipidemia, apoplejía, trastornos gastrointestinales en el tracto gastrointestinal superior del esófago, el estómago, duodeno, el intestino delgado, colon y recto incluyendo úlceras de cualquier etiología, trastornos de digestión, síndromes de mala absorción, síndrome del intestino corto, síndrome de cul-de-sac, enfermedad inflamatoria del intestino, esprúe celiaco, esprúe tropical, esprúe hipogammaglobulinemico, y mucositis y diarrea inducida por quimioterapia y/o hemoterapia por radiación.
37. Un procedimiento de tratamiento de un trastorno relacionado con el estómago y el intestino en un paciente que lo necesite administrando una cantidad eficaz de un análogo de GLP-2 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, una molecula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31 , un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 32, o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 33.
38. El procedimiento de la reivindicación 37, en el que el trastorno relacionado gastrointestinal es inflamación de grado bajo asociado con síndrome metabólico, obesidad (por ejemplo, obesidad abdominal), diabetes, enfermedades cardiovasculares, inflamación gastrointestinal, depresión, Alzheimer, artritis, hipertensión, dislipidemia, apoplejía; trastornos gastrointestinales en el tracto gastrointestinal superior del esófago, el estómago, duodeno, el intestino delgado, colon y recto incluyendo úlceras de cualquier etiología, trastornos de digestión, síndromes de mala absorción, síndrome del intestino corto, síndrome de cul-de-sac, enfermedad inflamatoria del intestino, esprúe celiaco, esprúe tropical, esprúe hipogammaglobulinémico, y mucosltis y diarrea inducida por quimioterapia y/o hemoterapia por radiación.
39. Un kit terapéutico caracterizado porque comprende un fármaco quimioterapéutico contra el cáncer y un análogo de GLP-2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 31, un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 32 o una célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 33, cada uno opcionalmente en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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