MX2014013081A - Moleculas de anticuerpo anti-gcc y uso de las mismas para probar la susceptibilidad a la terapia dirigida a gcc. - Google Patents

Abstract

Se describen anticuerpos y fragmentos de enlace de antígeno de anticuerpos que enlazan GCC. La invención también proporciona métodos de diagnóstico para identificar pacientes quiénes deben recibir una terapia dirigida a GCC utilizando los anticuerpos anti-GCC proporcionados en la presente.

Description

MOLÉCULAS DE ANTICUERPO ANTI-GCC Y USO DE LAS MISMAS PARA PROBAR LA SUSCEPTIBILIDAD A LA TERAPIA DIRIGIDA A GCC SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio y prioridad de la solicitud provisional estadounidense con el número de serie 61/639,376, presentada el 27 de abril de 2012. Todo el contenido de la solicitud provisional estadounidense con el número de serie 61/639,376 se incorpora a la presente mediante esta referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a moléculas de anticuerpo las cuales enlazan la GCC, y métodos para usar las mismas para seleccionar pacientes para el tratamiento con una terapia dirigida a GCC, tal como un inmunoconjugado que contiene una molécula de anticuerpo anti-GCC, o fragmento de la misma, conjugada a un agente tal como un agente terapéutico .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La guanilil ciclasa C ("GCC") es un receptor de la superficie celular de transmembrana que funciona en el mantenimiento del fluido intestinal, homeostasis de electrolitos y proliferación celular, ver, por ejemplo, Carrithers et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 100:3018-3020 (2003) . La GCC se expresa en las células mucosales que revisten el intestino delgado, intestino grueso y recto (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996)). La expresión de GCC se mantiene en la transformación neoplásica de células epiteliales intestinales, con expresión en todos los tumores colorrectales primarios y metastásicos (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cáncer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994)).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La descripción se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de nuevos anticuerpos anti-GCC. Por consiguiente, en un aspecto, la invención caracteriza una molécula de anticuerpo anti-GCC como se describe en la presente. Las moléculas de anticuerpo anti-GCC son útiles como moléculas de anticuerpo desnudo y como componentes de inmunoconjugados . Por consiguiente, en otro aspecto, la invención caracteriza inmunoco jugados que comprenden una molécula de anticuerpo anti-GCC y una etiqueta o agente terapéutico. La invención también caracteriza métodos para usar las moléculas de anticuerpo anti-GCC e inmunoconjugados descritos en la presente, por ejemplo, para la detección de GCC y de células o tejidos que expresan GCC. Tales métodos son útiles, ínter alia, para diagnóstico, pronóstico, imágenes, o estadificación de una enfermedad mediada por GCC. Por consiguiente, en algunos aspectos, la invención caracteriza métodos para identificar un sujeto para tratamiento con una terapia dirigida a GCC, por ejemplo, una terapia de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, un inmunoconj ugado que comprende un anticuerpo anti-GCC conjugado con un agente terapéutico. La invención también caracteriza un método in vitro o in vivo para determinar que un sujeto que tiene cáncer es un candidato potencial para una terapia dirigida a GCC, por ejemplo, una terapia dirigida a GCC descrita en la presente.

Los anticuerpos anti-GCC, por ejemplo, los anticuerpos anti-GCC descritos en la presente también son útiles, por ejemplo, para modular una actividad o función de una proteína de GCC; y para el tratamiento de una enfermedad mediada por GCC, como se describe en la presente. En algunos aspectos, el tratamiento incluye adquirir el reconocimiento y/o evaluación de una muestra o sujeto a niveles de expresión de GCC determinados, y si el sujeto expresa GCC, entonces administrar una terapia dirigida a GCC, por ejemplo, una terapia dirigida a GCC descrita en la presente. En otros aspectos, el método caracteriza la generación de un reporte de tratamiento personalizado, por ejemplo, un reporte de tratamiento dirigido a GCC, obteniendo una muestra de un sujeto y determinando los niveles de expresión de GCC, por ejemplo, por un método de detección descrito en la presente, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-GCC descrito en la presente, y con base en la determinación, seleccionando un reporte de tratamiento dirigido para el sujeto.

En otro aspecto, la invención también caracteriza ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican las secuencias de aminoácidos de molécula de anticuerpo anti-GCC, así como también vectores y células huéspedes que comprenden tales ácidos nucleicos, y métodos para producir moléculas de anticuerpo anti-GCC. También caracterizadas en la presente están las mezclas de reacción y kits que comprenden los anticuerpos anti-GCC, por ejemplo, un inmunoconjugado, descrito en la presente, así como también ensayos in vitro, por ejemplo, que comprenden un anticuerpo anti-GCC descrito en la presente, para detectar la expresión de GCC.

Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan para referencias en su totalidad.

Otras características, objetos, y ventajas de las invenciones descritas en la presente serán evidentes a partir de la descripción y figuras, y a partir de las reivindicaciones .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un mapa circular de un vector de expresión de proteína usado para generar una proteína de fusión Fe de ratón (mFc) de dominio extracelular (ECD) de GCC humana (hGCC) (hGCC-ECD-mFc) de la invención.

Las Figuras 2A-2D representan gráficas de barra que resumen la distribución de puntuación H de combinada/agregada (apical y citoplásmica) de expresión de GCC a través de tipos de tumor de pacientes con cáncer seleccionados para el enrolamiento en el Estudio C26001, un ensayo clínico Fase I de un inmunoconjugado dirigido a GCC. La Figura 2A representa la distribución de puntuación H combinada agregada a través de pacientes con cáncer colorrectal seleccionados; la Figura 2B representa la distribución de puntuación H combinada agregada a través de pacientes con cáncer gástrico seleccionados; la Figura 2C representa la distribución de puntuación H combinada agregada a través de pacientes con cáncer pancreático seleccionados; la Figura 2D representa la distribución de puntuación H combinada agregada a través de pacientes con cáncer esofágico seleccionados.

Las Figuras 3A-3C representan gráficas de barra que resumen la distribución de puntuación H combinada/agregada (apical y citoplásmica) de expresión de GCC através de varios microarreglos específicos de tumor que fueron seleccionados. La Figura 3A representa la distribución de puntuación H combinada/agregada a través de muestras en varios microarreglos de tumor colorrectal seleccionados para la expresión de GCC; la Figura 3B representa la distribución de puntuación H combinada/agregada a través de muestras en un microarreglo de tumor gástrico seleccionado para la expresión de GCC; la Figura 3C representa la distribución de puntuación H combinada/agregada a través de muestras en varios microarreglos de tumor pancreático seleccionados para la expresión de GCC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La guanilil ciclasa C (GCC) (también conocida como STAR, Receptor ST, GUC2C, y GUCY2C) es un receptor de la superficie celular de transmembrana que funciona en el mantenimiento del fluido intestinal, homeostasis de electrolitos, y proliferación celular (Carrithers et al., Proc Nati Acad Sci USA 100: 3018-3020 (2003); Mann et al., Biochem Biophys Res Commun 239: 463-466 (1997); Pitari et al., Proc Nati Acad Sci USA 100: 2695-2699 (2003)) ; No. de Acceso de GenBank. NM_004963, cada una de las cuales se incorpora para referencia en su totalidad) . Esta función es mediada mediante el enlace de guanilina (Wiegand et al. FEBS Lett. 311:150-154 (1992)) . GCC también es un receptor para la enterotoxina termoestable (ST, por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácidos de NTFYCCELCCNPACAGCY, SEC ID NO: 1) el cual es un péptido producido por E. coli, así como también otros organismos infecciosos (Rao, M. C. Ciba Found. Symp. 112:74-93 (1985); Knoop F. C. y Owens, M. J. Pharmacol. Toxicol. Methods 28:67-72 (1992)) . El enlace de ST a GCC activa una cascada de señal que resulta en enfermedad entérica, por ejemplo, diarrea.

Secuencia de nucleótidos para GCC humana (No. de Acceso de GenBank NM_004963; SEC ID NO: 2) : 1 gaccagagag aagcgtgggg aagagtgggc tgagggactc cactagaggc tgtccatctg 61 gattccctgc ctccctagga gcccaacaga gcaaagcaag tgggcacaag gagtatggtt 121 ctaacgtgat tggggtcatg aagacgttgc tgttggactt ggctttgtgg tcactgctct 181 tccagcccgg gtggctgtcc tttagttccc aggtgagtca gaactgccac aatggcagct atgaaatcag cgtcctgatg atgggcaact cagcctttgc agagcccctg aaaaacttgg aagatgcggt gaatgagggg ctggaaatag tgagaggacg tctgcaaaat gctggcctaa atgtgactgt gaacgctact ttcatgtatt cggatggtct gattcataac tcaggcgact gccggagtag cacctgtgaa ggcctcgacc tactcaggaa aatttcaaat gcacaacgga tgggctgtgt cctcataggg ccctcatgta catactccac cttccagatg taccttgaca cagaattgag ctaccccatg atctcagctg gaagttttgg attgtcatgt gactataaag aaaccttaac caggctgatg tctccagcta gaaagttgat gtacttcttg gttaactttt ggaaaaccaa cgatctgccc ttcaaaactt attcctggag cacttcgtat gtttacaaga atggtacaga aactgaggac tgtttctggt accttaatgc tctggaggct agcgtttcct atttctccca cgaactcggc tttaaggtgg tgttaagaca agataaggag tttcaggata tcttaatgga ccacaacagg aaaagcaatg tgattattat gtgtggtggt ccagagttcc tctacaagct gaagggtgac cgagcagtgg ctgaagacat tgtcattatt ctagtggatc ttttcaatga ccagtacttt gaggacaatg tcacagcccc tgactatatg aaaaatgtcc ttgttctgac gctgtctcct gggaattccc ttctaaatag ctctttctcc aggaatctat caccaacaaa acgagacttt gctcttgcct atttgaatgg aatcctgctc tttggacata tgctgaagat atttcttgaa aatggagaaa atattaccac ccccaaattt gctcatgctt tcaggaatct cacttttgaa gggtatgacg gtccagtgac cttggatgac tggggggatg ttgacagtac catggtgctt ctgtatacct ctgtggacac caagaaatac aaggttcttt tgacctatga tacccacgta aataagacct atcctgtgga tatgagcccc acattcactt ggaagaactc taaacttcct aatgatatta caggccgggg ccctcagatc ctgatgattg cagtcttcac cctcactgga gctgtggtgc tgctcctgct cgtcgctctc ctgatgctca gaaaatatag aaaagattat gaacttcgtc agaaaaaatg gtcccacatt cctcctgaaa atatctttcc tctggagacc aatgagacca atcatgttag cctcaagatc gatgatgaca 1621 aaagacgaga tacaatccag agactacgac agtgcaaata cgacaaaaag cgagtgattc 1681 tcaaagatct caagcacaat gatggtaatt tcactgaaaa acagaagata gaattgaaca 1741 agttgcttca gattgactat tacaacctga ccaagttcta cggcacagtg aaacttgata 1801 ccatgatctt cggggtgata gaatactgtg agagaggatc cctccgggaa gttttaaatg 1861 acacaatttc ctaccctgat ggcacattca tggattggga gtttaagatc tctgtcttgt 1921 atgacattgc taagggaatg tcatatctgc actccagtaa gacagaagtc catggtcgtc 1981 tgaaatctac caactgcgta gtggacagta gaatggtggt gaagatcact gattttggct 2041 gcaattccat tttacctcca aaaaaggacc tgtggacagc tccagagcac ctccgccaag 2101 ccaacatctc tcagaaagga gatgtgtaca gctatgggat catcgcacag gagatcatcc 2161 tgcggaaaga aaccttctac actttgagct gtcgggaccg gaatgagaag attttcagag 2221 tggaaaattc caatggaatg aaacccttcc gcccagattt attcttggaa acagcagagg 2281 aaaaagagct agaagtgtac ctacttgtaa aaaactgttg ggaggaagat ccagaaaaga 2341 gaccagattt caaaaaaatt gagactacac ttgccaagat atttggactt tttcatgacc 2401 aaaaaaatga aagctatatg gataccttga tccgacgtct acagctatat tctcgaaacc 2461 tggaacatct ggtagaggaa aggacacagc tgtacaaggc agagagggac agggctgaca 2521 gacttaactt tatgttgctt ccaaggctag tggtaaagtc tctgaaggag aaaggctttg 2581 tggagccgga actatatgag gaagttacaa tctacttcag tgacattgta ggtttcacta 2641 ctatctgcaa atacagcacc cccatggaag tggtggacat gcttaatgac atctataaga 2701 gttttgacca cattgttgat catcatgatg tctacaaggt ggaaaccatc ggtgatgcgt 2761 acatggtggc tagtggtttg cctaagagaa atggcaatcg gcatgcaata gacattgcca 2821 agatggcctt ggaaatcctc agcttcatgg ggacctttga gctggagcat cttcctggcc 2881 tcccaatatg gattcgcatt ggagttcact ctggtccctg tgctgctgga gttgtgggaa 2941 tcaagatgcc tcgttattgt ctatttggag atacggtcaa cacagcctct aggatggaat 3001 ccactggcct ccctttgaga attcacgtga gtggctccac catagccatc ctgaagagaa 3061 ctgagtgcca gttcctttat gaagtgagag gagaaacata cttaaaggga agaggaaatg 3121 agactaccta ctggctgact gggatgaagg accagaaatt caacctgcca acccctccta 3181 ctgtggagaa tcaacagcgt ttgcaagcag aattttcaga catgattgcc aactctttac 3241 agaaaagaca ggcagcaggg ataagaagcc aaaaacccag acgggtagcc agctataaaa 3301 aaggcactct ggaatacttg cagctgaata ccacagacaa ggagagcacc tatttttaaa Secuencia de aminoácidos para humana (No. de Acceso de GenPept NP_004954; SEC ID NO: 3) 1 mktllldlal wsllfqpgwl sfssqvsqnc hngsyeisvl mmgnsafaep lknledavne 61 gleivrgrlq naglnvtvna tfmysdglih nsgdcrsstc egldllrkis naqrmgcvli 121 gpsctystfq myldtelsyp misagsfgls cdyketltrl msparklmyf lvnfwktndl 181 pfktys sts yvykngtete dcfwylnale asvsyfshel gfkvvlrqdk efqdilmdhn 241 rksnviimcg gpeflyklkg dravaedivi ilvdlfndqy fednvtapdy mknvlvltls 301 pgnsllnssf srnlsptkrd falaylngil lfghmlkifl engenittpk fahafrnltf 361 egydgpvtld dwgdvdstmv llytsvdtkk ykvlltydth vnktypvdms ptftwknskl 421 pnditgrgpq ilmiavftlt gavvllllva llmlrkyrkd yelrqkkwsh ippenifple 481 tnetnhvslk idddkrrdti qrlrqckydk krvilkdlkh ndgnftekqk ielnkllqid 541 yynltkfygt vkldtmifgv ieycergslr evlndtisyp dgtfmdwefk isvlydiakg 601 msylhsskte vhgrlkstnc vvdsrmvvki tdfgcnsilp pkkdlwtape hlrqanisqk 661 gdvysygi a qeiilrketf ytlscrdrne kifrvensng mkpfrpdlf1 etaeekelev 721 yllvkncwee dpekrpdfkk iettlakifg lfhdqknesy mdtlirrlql ysrnlehlve 781 ertqlykaer dradrlnfml lprlvvkslk ekgfvepely eevt yfsdi vgfttickys 841 tpmevvdmln diyksfdhiv dhhdvykvet igdaymvasg lpkrngnrha idiakmalei 901 lsfmgtfele hlpglpiwir igvhsgpcaa gvvgikmpry clfgdtvnta srmestglpl 961 rihvsgstia ilkrtecqfl yevrgetylk grgnettywl tgmkdqkfnl ptpptvenqq 1021 rlqaefsdmi anslqkrqaa girsqkprrv asykkgtley lqlnttdkes tyf La proteína GCC tiene algunos dominios generalmente aceptados cada uno de los cuales contribuye a una función separable a la molécula de GCC. Las porciones de GCC incluyen una secuencia de señal (para dirigir la proteína a la superficie celular) desde el residuo de aminoácido 1 a aproximadamente el residuo 23, o el residuo 1 a aproximadamente el residuo 21 de SEC ID NO: 3 (extirpado para maduración para producir la proteína madura funcional desde aproximadamente los residuos de aminoácido 22 o 24 a 1073 de SEC ID NO: 3), un dominio extracelular para ligando, por ejemplo, guanilina o ST, que enlaza desde aproximadamente el residuo de aminoácido 24 a aproximadamente el residuo 420, o aproximadamente el residuo 54 a aproximadamente el residuo 384 de SEC ID NO: 3, un dominio de transmembrana desde aproximadamente el residuo de aminoácido 431 a aproximadamente el residuo 454, o aproximadamente el residuo 436 a aproximadamente el residuo 452 de la SEC ID NO: 3, un dominio de homología de cinasa, predicho para tener actividad de tirosina cinasa desde aproximadamente el residuo de aminoácido 489 a aproximadamente el residuo 749, o aproximadamente el residuo 508 a aproximadamente el residuo 745 de la SEC ID NO: 3 y un dominio catalítico de guanilil ciclasa desde aproximadamente el residuo 750 a aproximadamente el residuo 1007, o aproximadamente el residuo 816 a aproximadamente el residuo 1002 de la SEC ID NO : 3.

En tejidos humanos normales, la GCC se expresa en las células de mucosa, por ejemplo, en las membranas de borde en cepillo apical, que revisten el intestino delgado, intestino grueso y recto (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996)). La expresión de GCC se mantiene en la transformación neoplásica de células epiteliales intestinales, con expresión en todos los tumores colorrectales primarios y metastásicos (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cáncer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994)). Las células neoplásicas del estómago, esófago y la unión gastroesofágica también expresan GCC (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 6,767,704; Debruyne et al. Gastroenterology 130:1191-1206 (2006)). La expresión específica de tejido y asociación con el cáncer, por ejemplo, de origen gastrointestinal, (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer estomacal, cáncer esofágico o cáncer de intestino delgado) , se puede aprovechar para el uso de GCC como un marcador de diagnóstico para esta enfermedad (Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cáncer 41: 1618-1627 (2005)). Adicionalmente , como se demuestra en los Ejemplos en la presente, se ha mostrado que diversos tipos diferentes de cáncer de origen no gastrointestinal expresan la GCC, incluyendo pero no limitado a cáncer pancreático, cáncer pulmonar, sarcomas de tejido blando (por ejemplo, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma) , tumores neuroendocrinos gastrointestinales o broncopulmonares , y tumores neuroectodérmicos .

Como una proteína de superficie celular, la GCC también puede servir como un objetivo de diagnóstico o terapéutico para proteínas de enlace de receptor tales como anticuerpos o ligandos. En el tejido intestinal normal, la GCC se expresa en el lado apical de las uniones estrechas de células epiteliales que forman una barrera impermeable entre el ambiente luminal y compartimiento vascular (Almenoff et al., Mol Microbiol 8: 865-873); Guarino et al., Dig Dis Sci 32: 1017-1026 (1987)). Como tal, la administración intravenosa sistémica de un terapéutico de proteína de enlace de GCC tendrá mínimo efecto en los receptores de GCC intestinal, mientras que tiene acceso a células neoplásicas del sistema gastrointestinal, incluyendo células de cáncer de colon invasivo o metastásico, tumores de colon extraintestinal o metastásicos , tumores esofágicos o tumores estomacales, adenocarcinoma en la unión gastroesofágica . Adicionalmente, la GCC se internaliza mediante la endocitosis mediada por receptor en el enlace de ligando (Buc et al. Eur J Cáncer 41: 1618-1627 (2005); Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36 (1995)).

Los anticuerpos policlonales generados contra el dominio extracelular de GCC (Nandi et al. Protein Expr. Purif. 8:151-159 (1996)) fueron capaces de inhibir el péptido de ST que enlaza a GCC humana y de rata e inhibir la producción de cGMP mediada por ST por GCC humana.

La GCC se ha caracterizado como una proteína involucrada en cánceres, incluyendo cánceres de color. Ver también, Carrithers et al., Dis Colon Rectum 39: 171-181 (1996); Buc et al. Eur J Cáncer 41: 1618-1627 (2005); Carrithers et al., Gastroenterology 107: 1653-1661 (1994); Urbanski et al., Biochem Biophys Acta 1245: 29-36 (1995). Las moléculas de anticuerpo dirigidas a GCC, por consiguiente, se pueden usar solas en forma no conjugada para inhibir las células cancerosas que expresan GCC. Adicionalmente, las moléculas de anticuerpo dirigidas a GCC se pueden usar en forma desnuda o etiquetada, para detectar las células cancerosas que expresan GCC. Las moléculas de anticuerpo anti-GCC de la invención pueden enlazar la GCC humana. En algunas modalidades, una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención puede inhibir el enlace de un ligando, por ejemplo, guanilina o enterotoxina termoestable a GCC. En otras modalidades, una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención no inhibe el enlace de un ligando, por ejemplo, guanilina o enterotoxina termoestable a GCC.

Los anticuerpos monoclonales específicos para GCC incluyen GCC:B10 (Nandi et al., J. Cell. Biochem. 66:500-511 (1997)), GCC:4D7 (Vij ayachandra et al. Biochemistry 39:16075-16083 (2000)) y GCC:C8 (Bakre et al. Eur. J. Biochem. 267:179-187 (2000)). GCC:B10 tiene una cadena ligera kappa y un isotipo IgG2a y reacciona cruzado a GCC de rata, cerdo y mono. GCC:B10 enlaza a los primeros 63 aminoácidos del dominio intracelular de GCC, específicamente a los residuos 470-480 de SEC ID NO: 3 (Nandi et al. Protein Sci. 7:2175-2183 (1998)). GCC:4D7 enlaza al dominio de homología de cinasa, dentro de los residuos 491-568 de GCC (Bhandari et al. Biochemistry 40:9196-9206 (2001)) . GCC:C8 enlaza al dominio tipo proteína cinasa en la porción citoplásmica de GCC.

Definiciones A menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente invención tienen los significados que son comúnmente entendidos por aquellos de experiencia ordinaria en el arte. Generalmente, la nomenclatura utilizada en conexión con, y técnicas de, cultivo de células y tejidos, biología molecular, y química de proteína y oligo- o polinucleótido e hibridación descritas en la presente son aquellas conocidas en el arte. Los números de acceso de GenBank o GenPept y secuencias de ácido nucleico y péptido útiles se pueden encontrar en el sitio web mantenido por el Centro Nacional para Información Biotecnológica, Bethesda Md. Las técnicas estándares se usan para ADN recombinante , síntesis de oligonucleótido, y cultivo de tejido y transformación y transfección (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como comúnmente se realiza en el arte o como se describe en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores generalmente se realizan de acuerdo con los métodos conocidos en el arte, por ejemplo, como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten en toda la presente especificación. Ver por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)) o ver generalmente, Harlow, E. and Lañe, D. (1988) Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Las nomenclaturas utilizadas en conexión, y los procedimientos de laboratorio y técnicas, descritas en la presente se conocen en el arte. Además, a menos que se requiera por contexto de otra manera, los términos singulares deben incluir pluralidades y los términos plurales deben incluir el singular .

Como se usa en la presente, el término "molécula de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo, inmunoglobulina o péptidos de anticuerpo, o un fragmento de enlace de antígeno de cualquiera de los anteriores, por ejemplo, de un anticuerpo. Las moléculas de anticuerpo incluyen moléculas de anticuerpo de cadena única, por ejemplo, scFv, ver por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883), y moléculas de anticuerpo de dominio único, ver, por ejemplo, WO9404678. Aunque no está dentro el término "moléculas de anticuerpo", la invención también incluye "análogos de anticuerpo", otros andamiajes basados en proteína de molécula no de anticuerpo, por ejemplo, proteínas de fusión y/o inmunoconjugados que usan CDRs para proporcionar enlace de antígeno específico.

Una "molécula de anticuerpo anti-GCC" se refiere a una molécula de anticuerpo (es decir, un anticuerpo, fragmento de enlace de antígeno de un anticuerpo o análogo de anticuerpo) la cual interactúa con o reconoce, por ejemplo, enlaza (por ejemplo, enlaza específicamente) a GCC, por ejemplo, GCC humana. Las moléculas de anticuerpo anti-GCC ejemplares son tales como aquellas resumidas en las Tablas 1 y 2.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo", "péptidos de anticuerpo" o "inmunoglobulina" se refiere a glicoproteínas y proteínas de cadena única, dos cadenas, y múltiples cadenas. El término anticuerpo incluye anticuerpos policlonales , monoclonales , quiméricos, injertados a CDR y humanos o humanizados, todos los cuales se discuten con más detalle en otra parte en la presente. También incluidos dentro del término están los anticuerpos camélidos, ver, por ejemplo, US2005/0037421, y nanocuerpos, por ejemplo, IgNARs (anticuerpos de tiburón) , ver, por ejemplo, WO03/014161. El término "anticuerpo" también incluye variantes sintéticas y genéticamente modificadas.

Como se usa en la presente, el término "fragmento de anticuerpo" o "fragmento de enlace de antígeno" de un anticuerpo se refiere, por ejemplo, a fragmentos Fab, Fab 1 , F(ab' )2# y Fv, anticuerpos de cadena única, anticuerpos de cadena pesada funcional (nanocuerpos) , así como también cualquier porción de un anticuerpo que tiene especificidad hacia al menos un epítope deseado, que compite con el anticuerpo intacto para el enlace específico (por ejemplo, un fragmento que tiene suficientes secuencias de CD y que tiene suficientes secuencias de armazón para enlazar específicamente a un epítope) . Por ejemplo, un fragmento de enlace de antígeno puede competir para enlazar un epítope el cual enlaza el anticuerpo del cual el fragmento fue derivado. Derivado, como se usa en este y contextos similares, no implica cualquier método o proceso de derivación particular, pero puede referirse solamente a similitud de secuencia. Los fragmentos de enlace de antígeno se pueden producir por técnicas recombinantes , o por escisión enzimática o química de un anticuerpo intacto. El término, fragmento de enlace de antígeno, cuando se usa con una cadena única, por ejemplo, una cadena pesada, de un anticuerpo que tiene una cadena ligera y pesada significa que el fragmento de la cadena es suficiente de modo que cuando se empareja con una región variable completa variable completa de la otra cadena, por ejemplo, la cadena ligera, permitirá el enlace de al menos 25, 50, 75, 85 o 90% de aquel visto con la región variable pesada y ligera completa.

El término "constelación de CDRs de enlace de antígeno" o "un número de CDRs suficiente para permitir el enlace" (y lenguaje similar), como se usa en la presente, se refiere a suficientes CDRs de una cadena, por ejemplo, la cadena pesada, de modo que cuando se coloca en un armazón y se empareja con una región variable completa de la otra cadena, o con una porción de la otra región variable de la cadena de longitud similar y que tiene el mismo número de CDRs, por ejemplo, la cadena ligera, permitirá el enlace, por ejemplo, de al menos 25, 50, 75, 85 o 90% de aquel visto en la región variable de cadena pesada y ligera completa.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que se deriva de un anticuerpo no humano por ejemplo, conejo, roedor (por ejemplo, murino) , oveja o cabra, que retiene o sustancialmente retiene las propiedades de enlace de antígeno del anticuerpo progenitor que es menos inmunogénico en humanos. Humanizado como se usa en la presente se propone que incluya anticuerpos desinmunizados . Típicamente, los anticuerpos humanizados incluyen CDRs no humanas y regiones constantes y de armazón derivadas de humano o humanas .

El término anticuerpo "modificado", como se usa en la presente, se refiere a anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aislan por medio recombinante, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpo combinatorio recombinante, anticuerpos aislados de un animal no humano (por ejemplo, un conejo, ratón, rata, oveja o cabra) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucra el empalme de secuencias de gen de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos modificados incluyen anticuerpos humanizados, injertados a CDR (por ejemplo, un anticuerpo que tiene CDRs de un primer anticuerpo y una región de armazón de una diferente fuente, por ejemplo, un segundo anticuerpo o un armazón de consenso) , quiméricos, generados in vitro (por ejemplo, por expresión en fagos) , y opcionalmente pueden incluir regiones variables o constantes derivadas de secuencias de inmuno-globulina de línea germinal humana o genes de inmunoglobulina humana o anticuerpos los cuales se han preparado, expresado, creado o aislado por cualquier medio que involucra el empalme de secuencias de gen de inmunoglobulina humana a secuencias de inmunoglobulina alternativas. En modalidades, una molécula de anticuerpo modificado incluye una molécula de anticuerpo que tiene un cambio de secuencia de un anticuerpo de referencia.

El término "anticuerpo monoespecífico" se refiere a un anticuerpo o preparación de anticuerpo que exhibe una afinidad y especificidad de enlace único para un epítope particular. Este término incluye un "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal".

El término "anticuerpo biespecífico" o "anticuerpo bifuncional" se refiere a un anticuerpo que exhibe especificidad de enlace dual para dos epítopes, donde cada sitio de enlace difiere y reconoce un epítope diferente.

Los términos "anticuerpo no conjugado" y "anticuerpo desnudo" se usan intercambiablemente para referirse a una molécula de anticuerpo que no se conjuga a una porción no de anticuerpo, por ejemplo, un agente o una etiqueta .

Cada uno de los términos "inmunoconjugado" , "conjugado de anticuerpo-fármaco" y "conjugado de anticuerpo", se usan intercambiablemente y se refieren a un anticuerpo que se conjuga a una porción no de anticuerpo, por ejemplo, un agente o una etiqueta. El término "agente" se usa en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica, o un extracto hecho de materiales biológicos. El término "agente terapéutico" se refiere a un agente que tiene actividad biológica. Los agentes terapéuticos ejemplares son agentes quimioterapéuticos .

El término "agente anti-cáncer" o "agente quimioterapéutico" se usa en la presente para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir un desarrollo o progresión de un neoplasma en un humano, particularmente una lesión maligna (cancerosa) , tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma, o leucemia. La inhibición de metástasis o angiogénesis frecuentemente es una propiedad de agentes anti-cáncer o quimioterapéuticos. Un agente quimioterapéutico puede ser un agente citotóxico o citostático. El término "agente citostático" se refiere a un agente el cual inhibe o suprime el crecimiento celular y/o multiplicación de las células.

"Agentes citotóxicos" se refieren a compuestos los cuales causan la muerte celular principalmente interfiriendo directamente con el funcionamiento de las células, incluyendo, pero no limitado a, agentes de alquilación, factor de necrosis de tumor, intercaladores , inhibidores de microtubulos , inhibidores de cinasa, inhibidores de proteasoma e inhibidores de topoisomerasa . Una "carga tóxica" como se usa en la presente se refiere a una cantidad suficiente de agente citotóxico el cual, cuando se administra a una célula resulta en muerte celular. El suministro de una carga tóxica se puede realizar por la administración de una cantidad suficiente de inmunoconjugado que comprende un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de la invención y un agente citotóxico. El suministro de una carga tóxica también se puede realizar por la administración de una cantidad suficiente de un inmunoconjugado que comprende un agente citotóxico, en donde el inmunoconjugado comprende un anticuerpo secundario o fragmento de enlace de antígeno del mismo el cual reconoce y enlaza un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de la invención.

Como se usa en la presente, una secuencia "derivada de" o "específica para una secuencia designada" se refiere a una secuencia que comprende una secuencia contigua de aproximadamente al menos 6 nucleótidos o al menos 2 aminoácidos, al menos aproximadamente 9 nucleótidos o al menos 3 aminoácidos, al menos aproximadamente 10-12 nucleótidos o 4 aminoácidos, o al menos aproximadamente 15-21 nucleótidos o 5-7 aminoácidos correspondiente, es decir, idénticos o complementarios a, por ejemplo, una región contigua de la secuencia designada. En ciertas modalidades, la secuencia comprende toda una secuencia de aminoácidos o nucleótidos designada. La secuencia puede ser complementaria (en el caso de una secuencia de polinucleótidos) o idéntica a una región de secuencia que es única para una secuencia particular como se determina por las técnicas conocidas en el arte. Las regiones de las cuales se pueden derivar las secuencias, incluyen pero no se limitan a, regiones que codifican epítopes específicos, regiones que codifican CDRs, regiones que codifican secuencias de armazón, regiones que codifican regiones de dominio constante, regiones que codifican regiones de dominio variable, así como también regiones no traducidas y/o no transcritas. La secuencia derivada no necesariamente será derivada físicamente de la secuencia de interés bajo estudio, sino se puede generar en cualquier manera, incluyendo, pero no limitado a, síntesis química, replicación, transcripción inversa o transcripción, que se basa en la información proporcionada por la secuencia de bases en las regiones de las cuales se deriva el polinucleótido . Como tal, puede representar ya sea una orientación de sentido o antisentido del polinucleótido original. Además, las combinaciones de regiones correspondientes a aquellas de la secuencia designada se pueden modificar o combinar en maneras conocidas en el arte para ser consistentes con el uso propuesto. Por ejemplo, una secuencia puede comprender dos o más secuencias contiguas las cuales comprenden cada una parte de una secuencia designada, y se interrumpen con una región la cual no es idéntica a la secuencia designada sino se propone para representar una secuencia derivada de la secuencia designada. Con respecto a las moléculas de anticuerpo, "derivado del mismo" incluye una molécula de anticuerpo la cual funcionalmente o estructuralmente se refiere a un anticuerpo de comparación, por ejemplo, "derivado del mismo" incluye una molécula de anticuerpo que tiene similar o sustancialmente la misma secuencia o estructura, por ejemplo, que tiene las mismas o similares CDRs, armazón o regiones variables. "Derivado del mismo" para un anticuerpo también incluye residuos, por ejemplo, uno o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más residuos, los cuales pueden o no pueden ser contiguos, pero se definen o identifican de acuerdo con un esquema de numeración u homología a la proximidad tridimensional o estructura de anticuerpo general, es decir, dentro de una CDR o una región de armazón, de una secuencia de comparación. El término "derivado del mismo" no se limita a físicamente derivado del mismo sino incluye la generación por cualquier manera, por ejemplo, por el uso de información de secuencia de un anticuerpo de comparación para diseñar otro anticuerpo.

Como se usa en la presente, la frase "codificado por" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de polipéptidos , en donde la secuencia de polipéptidos o una porción de la misma contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 3 a 5 aminoácidos, al menos 8 a 10 aminoácidos, o al menos 15 a 20 aminoácidos de un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico.

Como se usa en la presente, el término "cáncer colorrectal" , también conocido comúnmente como cáncer de colon o cáncer de intestinos, se refiere a cáncer de crecimiento celular no controlado en el colon o recto (partes del intestino grueso), o en el apéndice.

Los términos "cáncer estomacal" y "cáncer gástrico" se usan en la presente intercambiablemente.

Los cálculos de "homología" entre dos secuencias se pueden realizar como sigue. Las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir aberturas en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o ácido nucleico para la alineación óptima y secuencias no homologas se pueden ignorar para propósitos de comparación) . La longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es al menos 30%, 40%, o 50%, al menos 60%, o al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondiente luego se comparan. Cuando una posición en la primera secuencia se ocupa por el mismo residuo aminoácido o nucleótido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición (como se usa en la presente "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico) . El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de aberturas, y la longitud de cada abertura, las cuales necesitan ser introducidas para alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y determinación del porcentaje de homología entre dos secuencias se pueden realizar usando un algoritmo matemático. El porcentaje de homología entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando cualquier método conocido en el arte. Por ejemplo, Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol . 48:444-453 (1970) , algoritmo el cual se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG, usando ya sea una matriz de Blossum 62 o una matriz de PAM250, y una ponderación de abertura de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y una ponderación de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. El porcentaje de homología entre dos secuencias de nucleótido también se puede determinar usando el programa GAP en el paquete de software GCG (Accelerys, Inc. San Diego, Calif.), usando una matriz de WSgapdna . CMP y una ponderación de abertura de 40, 50, 60, 70, u 80 y una ponderación de longitud de l, 2, 3, 4, 5, o 6. Un conjunto de parámetros ejemplares para la determinación de la homología es una matriz de puntuación de Blossum 62 con una penalidad de abertura de 12, una penalidad de extensión de abertura de 4, y una penalidad de abertura de desplazamiento de marco de 5.

Como se usa en la presente, el término "se híbrida bajo condiciones severas" describe condiciones para hibridación y lavado. La guía para realizar las reacciones de hibridación se pueden encontrar en Current Protocole in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en esta referencia y se puede usar cualquiera. Las condiciones de hibridación específicas referidas en la presente son como sigue: 1) condiciones de hibridación de baja severidad en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido por dos lavados en 0.2X SSC, 0.1% SDS al menos a 50° C. (la temperatura de los lavados se puede incrementar a 5o C para condiciones de baja severidad); 2) condiciones de hibridación de media severidad en 6X SSC a aproximadamente 45° C, seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% SDS a 60° C; 3) condiciones de hibridación de alta severidad en 6X SSC a aproximadamente 45° C, seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC, 0.1% SDS a 65° C; y 4) las condiciones de hibridación de muy alta severidad son fosfato de sodio 0.5M, 7% SDS a 65° C, seguido por uno o más lavados a 0.2X SSC, 1% SDS a 65° C. Las condiciones de muy alta severidad (4) son frecuentemente las condiciones preferidas y que se deben usar a menos que se especifique de otra manera.

Se entiende que los anticuerpos y fragmento de enlace de antígeno de los mismos de la invención pueden tener sustituciones de aminoácido no esenciales o conservadoras adicionales, las cuales no tienen un efecto sustancial en las funciones de polipéptido. Si o no una sustitución particular será tolerada, es decir, no afectarán adversamente las propiedades biológicas deseadas, tal como actividad de enlace, se puede determinar como se describe en Bowie, J U et al. Science 247:1306-1310 (1990) o Padlan et al. FASEB J. 9:133-139 (1995). Una "sustitución de aminoácido conservadora" es una en la cual el residuo aminoácido se remplaza con un residuo aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano) , cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) .

Un residuo aminoácido "no esencial" es un residuo que se puede alterar de la secuencia tipo silvestre del agente de enlace, por ejemplo, el anticuerpo, sin abolir o, sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que un residuo aminoácido "esencial" resulta en tal cambio. En un anticuerpo, un residuo aminoácido esencial puede ser un residuo determinante de especificidad (SDR) .

Como se usa en la presente, el término "aislado" se refiere a material que se remueve de su ambiente original (por ejemplo, el ambiente natural si se presenta naturalmente) . Por ejemplo, un polipéptido o polinucleótido que se presenta naturalmente en un animal viviente no se aisla, sino el mismo polinucleótido o ADN o polipéptido, separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, se aisla. Tal polinucleótido o polipéptido podría ser parte de un vector y/o tal polinucleótido o polipéptido podría ser parte de una composición, por ejemplo, una mezcla, solución o suspensión o comprende una célula aislada o una célula cultivada la cual comprende el polinucleótido o polipéptido, y aún es aislado porque el vector o composición no es parte de su ambiente natural.

Como se usa en la presente, el término "replicón" se refiere a cualquier elemento genético, tal como un plásmido, un cromosoma o un virus, que se comporta como una unidad autónoma de replicación de polinucleótido dentro de una célula.

Como se usa en la presente, el término "operativamente enlazado" se refiere a una situación en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera propuesta. Por consiguiente, por ejemplo, una secuencia de control "operativamente enlazada" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra bajo condiciones compatibles con la secuencia de control.

Como se usa en la presente, el término "vector" se refiere a un replicón en el cual otro segmento de polinucleótido se une, tal como para causar la replicación y/o expresión del segmento unido.

Como se usa en la presente, el término "secuencia de control" se refiere a una secuencia de polinucleótido que es necesaria para efectuar la expresión de una secuencia codificante a la cual se liga. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de enlace ribosomal y terminadores y, en algunos casos, mej oradores. El término "secuencia de control" por consiguiente se propone que incluya a un mínimo todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también pueden incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias guía.

Como se usa en la presente, el término "producto purificado" se refiere a una preparación del producto el cual se ha aislado de los constituyentes celulares con los cuales el producto normalmente está asociado y/o de otros tipos de células que pueden estar presentes en la muestra de interés.

Como se usa en la presente, el término "epítope" se refiere a una proteína determinada capaz de enlazar específicamente un anticuerpo. Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activa tales como cadenas laterales de azúcar o aminoácidos y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como también características de carga específicas. Algunos epítopes son epítopes lineales mientras que otros son epítopes conformacionales . Un epítope lineal es un epítope en donde una secuencia primara de aminoácido contiguo comprende el epítope reconocido. Un epítope lineal típicamente incluye al menos 3, y más usualmente, al menos 5, por ejemplo, aproximadamente 8 a aproximadamente 10 aminoácidos contiguos. Un epítope conformacional puede resultar de al menos dos situaciones, tales como: a) una secuencia lineal la cual solamente se expone a enlace de anticuerpo en ciertas conformaciones de prote na, por ejemplo, dependiente del enlace de ligando, o dependiente de la modificación (por ejemplo, fosforilación) por señalización de moléculas; o b) una combinación de características estructurales de más de una parte de la proteína, o en proteínas de múltiples sub-unidades, de más de una sub-unidad, en donde las características están en proximidad suficientemente cercana en el espacio tridimensional para participar en el enlace.

Como se usa en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM, IgA, IgE o IgG) que se codifica por genes de región constante de cadena pesada.

Como se usa en la presente, los términos "agente detectable", "etiqueta" o "etiquetado" se usan para referirse a la incorporación de un marcador detectable en un polipéptido o glicoproteína . Varios métodos de etiquetado de polipéptidos y glicoproteínas son conocidos en el arte y se pueden usar. Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, indio (li:LIn) , yodo (131I o 125I), itrio (90Y) , lutetio (177Lu) , actinio (225Ac) , bismuto (212Bi o 13Bi) , azufre (35S) , carbono (1C) , tritio (3H) , rodio (188Rh) , tecnetio (" mTc) , praseodimio, o fósforo (32P) o un radionúclido emisor de positrones, por ejemplo, carbono-11 ( "O , potasio-40 (40K) , nitrógeno-13 (13N) , oxígeno-15 (150) 9, fluoro-18 (18F) , galio-68 (68Ga) , y yodo- 121 (121I) ) , etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos lantánidos) , etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscentes , grupo biotinilo (los cuales se pueden detectar por una avidina marcada, por ejemplo, una molécula que contiene una porción de estreptavidina y un marcador fluorescente o una actividad enzimática que se puede detectar por métodos ópticos o calorimétricos) , y epítopes de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportero secundario (por ejemplo, secuencias pares de cremallera de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace de metal, marcas de epítope) . En algunas modalidades, las etiquetas se unen por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial .

Como se usa en la presente, "enlace específico", "enlaza específicamente" o "especificidad de enlace" significa, para una molécula de anticuerpo anti-GCC, que la molécula de anticuerpo enlaza a GCC, por ejemplo, proteína GCC humana, con mayor afinidad que como lo hace una proteína no GCC, por ejemplo, BSA. Típicamente, una molécula anti-GCC tendrá una ¾ para la proteína no GCC, por ejemplo, BSA, la cual es mayor que 2, mayor que 10, mayor que 100, mayor que 1,000 veces, mayor que 104, mayor que 105, o mayor que 106 veces su ¾ para GCC, por ejemplo, proteína GCC humana. En la determinación de la ¾, la ¾ para GCC y la proteína no GCC, por ejemplo, BSA, se debe hacer bajo las mismas condiciones.

El término "afinidad" o "afinidad de enlace" se refiere a la constante de asociación aparente o Ka. La Ka es lo recíproco de la constante de disociación (¾) . Un anticuerpo, por ejemplo, puede tener una afinidad de enlace de al menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 y 1011 NT1 para una molécula objetivo particular. El enlace de afinidad mayor de un anticuerpo a un primer objetivo con relación a un segundo objetivo se puede indicar por una KA mayor (o valor numérico menor de KD) para el enlace del primer objetivo que la KA (o valor numérico de KD) para el enlace del segundo objetivo. En tales casos, el anticuerpo tiene especificidad para el primer objetivo (por ejemplo, una proteína en una primera conformación o imitación de la misma) con relación al segundo objetivo (por ejemplo, la misma proteína en una segunda conformación o imitación de la misma; o una segunda proteína) . Las diferencias de afinidad de enlace (por ejemplo, para especificidad u otras comparaciones) pueden ser al menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, o 105 veces.

La afinidad de enlace se puede determinar por una variedad de métodos incluyendo diálisis de equilibrio, enlace de equilibrio, filtración en gel, ELISA, resonancia de superficie 19act ce, o espectroscopia (por ejemplo, usando un ensayo de fluorescencia) . Por ejemplo, la afinidad relativa de una molécula de anticuerpo anti-GCC se puede medir de mediciones de ELISA contra proteína GCC (por ejemplo, el inmunógeno usado para producir moléculas de anticuerpo anti-GCC) , por mediciones de FACs con células que expresan GCC.

Las condiciones ejemplares para evaluar la afinidad de enlace están en amortiguador TRIS (50mM TRIS, 150mM NaCl, 5mM CaCl2 a pH7.5) . Estas técnicas se pueden usar para medir la concentración de unión y proteína de enlace libre como una función de la concentración de proteína de enlace (u objetivo) . La concentración de proteína de enlace unida ( [Unida] ) se relaciona a la concentración de proteína de enlace libre ( [Libre] ) y la concentración de sitios de enlace para la proteína de enlace en el objetivo donde (N) es el número de sitios de enlace por molécula objetivo por la siguiente ecuación: [Unida] = N · [Libre] /(( 1/KA) + [Libre]).

No siempre es necesario hacer una determinación exacta de KA, sin embargo, puesto que algunas veces es suficiente obtener una medición cuantitativa de afinidad, por ejemplo, determinada usando un método tal como análisis FACS o ELISA, es proporciona a KA, y por consiguiente se puede usar para comparaciones, tal como se determina si una mayor afinidad es, por ejemplo, 2 veces mayor, para obtener una medición cualitativa de afinidad, o para obtener una inferencia de afinidad, por ejemplo, por actividad en una manera funcional, por ejemplo, un ensayo in vi tro o in vivo. La afinidad de moléculas de anticuerpo anti-GCC también se puede medir usando una tecnología tal como Análisis de Interacción Biomolecular en tiempo real (BIA) (ver, por ejemplo, Sjolander, S, and Urbaniczky, C, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al., 1995, Curr . Opin. Struct. Biol . 5:699-705). Como se usa en la presente "BIA" o "resonancia de plasmón superficial" es una tecnología para estudiar las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin etiquetar algunos de los interactuantes (por ejemplo, BIACORE™) . Los cambios en la masa en la superficie de enlace (indicativo de un evento de enlace) resultan en alteraciones del índice de refracción de luz cercana a la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR) ) , que resultan en una señal detectable la cual se puede usar como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

La medición de afinidad de moléculas de anticuerpo anti-GCC usando un sistema BIACORE™ T100 (GE Healthcare, Piscataway, N.J.) se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. US2011/0110936 , los contenidos de la cual se incorporan para referencia en su totalidad. Brevemente, un anticuerpo anti-GCC (Prep A) se diluye a una concentración apropiada (por ejemplo, 20 yg/mL) en 10 mM acetato de sodio, pH 4.0 y un anticuerpo de referencia/control (Prep B) se diluye a una concentración apropiada (por ejemplo, 10 pg/mL) en 10 mM acetato de sodio, pH 4.0. Cada anticuerpo se inmoviliza covalentemente a diversas microplacas CM4 BIACORE usando acoplamiento de amina estándar. Para cada microplaca CM4 preparada, el anticuerpo Prep A se inmoviliza sobre dos células de flujo a alrededor de 75-100 RU mientras que el anticuerpo Prep B se inmoviliza a una célula de flujo de alrededor de 70-80 RU. La cuarta célula de flujo remanente de cada placa CM4 se usa como la célula de flujo de referencia.

La concentración de proteína GCC se puede determinar usando los métodos detallados por Pace et al. in Protein Science, 4:2411 (1995), y Pace and Grimsley in Current Protocols in Protein Science 3.1.1-3.1.9 (2003) . Para cada placa CM4 preparada, la proteína GCC se inyecta por 2 minutos a un intervalo de concentración de 202 nM -1.6 nM (dilución serial de 2 veces) seguido por una disociación de 7 minutos. Las muestras se inyectan aleatoriamente por triplicado con diversos ciclos de inyección de amortiguador intercalados para doble referencia. Para obtener datos de decaimiento de constante de disociación más significativos, tres inyecciones de proteína GCC de 101 nM adicionales y tres inyecciones de amortiguador adicionales se realizaron con una inyección de 2 minutos y un tiempo de disociación de 4 horas. Una velocidad de flujo de 100 µ?/ml se utilizó para todos los experimentos y todas las superficies se regeneraron con un impulso de 20 segundos de 10 mM Glicina-HCl (pH 2.0) . Todas las muestras se prepararon en el amortiguador de corrida (por ejemplo, solución salina amortiguada con Hepes, 0.005% polisorbato 20, pH 7.4 (HBS-P) ) con 100 g/mL de BSA agregada. Todos los datos de sensograma (gráfica de resonancia de plasmón superficial vs tiempo) se pueden procesar con software Scrubber 2.0 (BioLogic Software, Campbell, Australia) y se ajustan globalmente a un modelo de interacción de 1:1 que incluye un término para la constante de transporte de masas km usando software CLAMP™ (Myszka and Morton Trends Biochem. Sci. 23:149-150 (1998) ) .

Como se usa en la presente, el término "tratar" o "tratamiento" se define como la administración de una molécula de anticuerpo anti-GCC a un sujeto, por ejemplo, un paciente, o administración, por ejemplo, por aplicación, a una célula o tejido aislado de un sujeto que se regresa al sujeto. La molécula de anticuerpo anti-GCC se puede administrar sola o en combinación con un segundo agente. El tratamiento puede ser para curar, sanar, mitigar, aliviar, alterar, remediar, aminorar, paliar, mejorar o afectar el trastorno, los síntomas del trastorno o la predisposición hacia el trastorno, por ejemplo, un cáncer. Sin querer limitarse a la teoría, se cree que el tratamiento causa la inhibición, ablación, o matanza de una célula in vitro o in vivo, o de otra manera reduce la capacidad de una célula, por ejemplo, una célula aberrante, para mediar un trastorno, por ejemplo, un trastorno como se describe en la presente (por ejemplo, un cáncer) .

Como se usa en la presente, el término "sujeto" se propone que incluya mamíferos, primates, humanos y animales no humanos. Por ejemplo, un sujeto puede ser un paciente (por ejemplo, un paciente humano o un paciente veterinario) , que tiene un cáncer en el cual al menos algunas de las células expresan GCC, tal como un cáncer de origen gastrointestinal (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer estomacal, cáncer de intestino delgado, o cáncer esofágico) , cáncer pancreático, cáncer pulmonar (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma) , sarcoma de tejido blando (por ejemplo, leiosarcoma o rabdomiosarcoma) , tumores neuroendocrinos (por ejemplo, gastrointestinal o broncopulmonar) , o tumores neuroectodérmicos ; un síntoma de tales cánceres que expresan GCC; o una predisposición hacia tales cánceres que expresan GCC. Como otro ejemplo, el sujeto puede ser un paciente que tiene un trastorno gastrointestinal en el cual al menos algunas de las células del sistema gastrointestinal expresan GCC, tal como en el síndrome inflamatorio de intestinos, enfermedad de Crohn y estreñimiento. Como todavía otro ejemplo, el sujeto puede ser un paciente que tiene un trastorno neurológico en el cual al menos algunas neuronas dentro del sistema nervioso central del paciente expresan GCC, tal como enfermedad de Parkinson. El término "animales no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados no humanos, por ejemplo, mamíferos no humanos y no mamíferos, tales como primates no humanos, oveja, perro, vaca, pollos, anfibios, réptiles, ratón, rata, conejo o cabra etc., a menos que se señale de otra manera. En una modalidad, "sujeto" excluye uno o más o todos de un ratón, rata, conejo o cabra.

Como se usa en la presente, una cantidad de una molécula de anticuerpo anti-GCC "efectiva" o "suficiente" para tratar un trastorno, o una "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad terapéuticamente suficiente" se refiere a una cantidad de la molécula de anticuerpo la cual es efectiva, en la administración de dosis única o múltiples a un sujeto, en el tratamiento de una célula, por ejemplo, células de cáncer (por ejemplo, una célula de tumor que expresa GCC) , o en la prolongación de la cura, mitigación, alivio o mejora de un sujeto con un trastorno como se describe en la presente más allá de lo que se espera en la ausencia de tal tratamiento. Como se usa en la presente, "inhibición del crecimiento" del tumor o cáncer se refiere a la ralentización, interrupción, detención o paro de su crecimiento y/o metástasis y no necesariamente indica una eliminación total del crecimiento de tumor.

Como se usa en la presente, "GCC", también conocida como proteína "STAR", "GUC2C", "GUCY2C" o "receptor ST" se refiere a GCC de mamífero, preferiblemente proteína GCC humana. GCC humana se refiere a la proteína mostrada en la SEC ID NO : 3 y variantes de la misma de proteína alécica que se presenta naturalmente. El alelo en la SEC ID NO : 3 se puede codificar por la secuencia de ácido nucleico de GCC mostrada en la SEC ID NO: 2. Otras variantes son conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, número de acceso Ensp0000261170 , Ensembl Datábase, European Bioinformatics Institute y Wellcome Trust Sanger Institute, que tiene una leucina en el residuo 281; SEC ID NO: 14 de la solicitud de patente de Estados Unidos publicada número 20060035852; o número de acceso de GenBank AAB 19934. Típicamente, una variante alélica que se presenta naturalmente tiene una secuencia de aminoácidos al menos 95%, 97% o 99% idéntica a la secuencia de GCC de la SEC ID NO: 3. El transcripto codifica un producto de proteína de 1073 aminoácidos, y se describe en No. de acceso de GenBank: NM_004963. La proteína GCC se caracteriza como una proteína de receptor de superficie celular de transmembrana, y se cree que juega un papel crítico en el mantenimiento del fluido intestinal, homeostásis de electrolitos y proliferación celular.

Anticuerpos Antx-GCC Descritas en la presente están las moléculas de anticuerpo anti-GCC útiles, ínter alia, para detectar la expresión de GCC. Las moléculas de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, útiles para la detección de GCC, pueden incluir moléculas de anticuerpo anti-GCC no humanas (por ejemplo, moléculas de anticuerpo no humanas y no murinas) que específicamente enlazan a GCC, por ejemplo, con una afinidad de enlace de al menos 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 y 1011 M"1 para GCC. La molécula de anticuerpo anti-GCC puede ser una molécula de anticuerpo no humana, no murina y no de rata, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC de conejo, por ejemplo, como se describe en la presente.

En ciertos aspectos, la invención se refiere a moléculas de anticuerpo anti-GCC que incluyen características tales como aquellas resumidas en las Tablas 1 y 2. En otros aspectos, la invención se refiere a moléculas de anticuerpo anti-GCC que incluyen características tales como aquellas resumidas en las Tablas 3, 4, 5 y/o 6.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti-GCC es un anticuerpo de hibridoma de conejo y es uno del anticuerpo MIL-44-148-2 o IL-44 -67-4. En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti-GCC se deriva del anticuerpo MIL-44-148-2 O MIL-44-67-4.

En una modalidad, una molécula de anticuerpo anti-GCC tendrá una afinidad para GCC, por ejemplo, como se mide por ensayos de enlace directo o enlace de competición. En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti-GCC tiene una ¾ menor que lxlO"6 M, menor que lxlO"7 M, menor que lxlO"8 M, menor que lxlCT9 M, menor que lxlCT10 M, menor que lx 10"11 M, menor que lxlO"12 M, o menor que lxlO"13 M. En una modalidad, la molécula de anticuerpo es una IgG, o fragmento de la misma de enlace de antígeno, y tiene una Ka menor que lxlO"6 M, menor que lxlO"7 M, menor que lxlO"8 M, o menor que lxlO"9 M. En una modalidad, una molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, un anticuerpo MIL-44-148-2 o anticuerpo derivado del mismo tiene una Ka de aproximadamente 80 a aproximadamente 200 pM, preferiblemente aproximadamente 100 a aproximadamente 150 pM o aproximadamente 120 pM. En una modalidad, una molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, un anticuerpo MIL-44-148-2 o anticuerpo derivado del mismo tiene una ka de aproximadamente 0.9 a aproximadamente 1.25xl05 M"1 s"1, preferiblemente aproximadamente 1.1x10s M"1 s"1. En una modalidad, la molécula de anticuerpo es un ScFv y tiene una ¾ menor que lxlO-6 M, menor que lxlO"7 M, menor que lxlO"8 M, menor que lxlO"9 M, menor que lxlO-10 M, lx 10"11 M, menor que lxlO"12 M, o menor que lxlO"13 M.

En modalidades, las moléculas de anticuerpo no son inmunoconjugados, es decir, son "desnudas" y en modalidades causan una reacción celular en el enlace a GCC. En modalidades relacionadas, la reacción celular se realiza por la célula que expresa GCC a la cual se enlace el anticuerpo. Tal reacción celular puede ser transducción de señal mediada por GCC, por ejemplo, si la molécula de anticuerpo es un agonista de GCC (ver, por ejemplo, publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos no. US20040258687) . En otras modalidades, la reacción celular se realiza por una segunda célula, por ejemplo, una célula efectora inmune (por ejemplo, una célula asesina natural) la cual reconoce la molécula de anticuerpo unida a GCC en la primera célula. En algunas modalidades, las moléculas de vigilancia, por ejemplo, moléculas de complemento, hacen contacto con la molécula de anticuerpo unida a GCC antes de la reacción celular. Las reacciones celulares en estas modalidades pueden causar la muerte de la célula que expresa GCC.

En modalidades adicionales, las moléculas de anticuerpo las cuales son inmunoconjugados pueden tanto causar una reacción celular en el enlace a GCC como internalizarse para suministrar un agente a la célula que expresa GCC a la cual se enlaza.

En algunas modalidades, una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención puede bloquear el enlace de ligando a GCC.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo no es GCC:B10, GCC:4D7 o GCC : C8. En otra modalidad, una molécula de anticuerpo anti-GCC no enlaza un dominio intracelular de GCC, aproximadamente el residuo aminoácido 455 a 1073 de la SEC ID NO: 3. Por ejemplo, en esta modalidad, una molécula de anticuerpo anti-GCC no enlaza el dominio de homología de cinasa o el dominio de guanilil ciclasa de GCC.

La unidad estructural de anticuerpo de mamífero que se presenta naturalmente se tipifica por un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares de cadenas de polipéptido. Cada par tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa) . La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se pueden clasificar como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se pueden clasificar como mu, delta, gamma, alfa, o epsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variables y constantes se unen por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada también incluyendo una región "D" de aproximadamente 10 o más aminoácido. Ver generalmente, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed. , 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Las regiones variables de cada par de cadena ligera/pesada forman el sitio de enlace de anticuerpo. Los isotipos preferidos para las moléculas de anticuerpo anti-GCC son inmunoglobulinas de IgG, las cuales se pueden clasificar en cuatro subclases, IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4 , que tienen diferentes cadenas pesadas gamma. La mayoría de los anticuerpos terapéuticos son anticuerpos humanos, quiméricos, o humanizados del isotipo de IgGl. En una modalidad particular, la molécula de anticuerpo anti-GCC es un anticuerpo de IgG de conejo.

Las regiones variables de cada par de cadena pesada y ligera del sitio de enlace de antígeno. Por consiguiente, un anticuerpo de IgG intacto tiene dos sitios de enlace los cuales son los mismos. Sin embargo, los anticuerpos bifuncionales o biespecíficos son constructos híbridos artificiales los cuales tienen dos diferentes pares de cadena pesada/ligera, que resultan en dos diferentes sitios de enlace .

Todas la cadenas exhiben la misma estructura general de regiones de armazón (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de complementariedad o CDRs . Las CDRs de las dos cadenas de cada par se alinean por las regiones de armazón, habilitando el enlace a un epítope específico. De N-terminal a C-terminal, ambas cadenas ligera y pesada comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de conformidad con las definiciones de las Secuencias Kabat de Proteínas de Interés Inmunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), o Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989) . Como se usa en la presente, las CDRs se refieren a cada una de las cadenas pesada (HCDR1, HCDR2 , HCDR3) y ligera (LCDR1, LCDR2 , LCDR3) .

Una molécula de anticuerpo anti-GCC puede comprender todos, o un subconjunto de las CDRs de enlace de antígeno, de una o ambas, la cadena pesada y ligera, de uno de los anticuerpos de conejo referenciados anteriormente. Las secuencias de aminoácido de anticuerpos de hibridoma de conejo, incluyendo regiones variables y CDRs, se pueden encontrar en la Tabla 3 y Tabla 5.

Por consiguiente, en una modalidad la molécula de anticuerpo incluye una o ambas de: (a) una, dos, tres, o un número de enlace de antígeno de, CDRs de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y/o LCDR3) de uno de los anticuerpos de hibridoma de conejo referenciados anteriormente. En modalidades, las CDRs pueden comprender una secuencia de aminoácido de una o más o todas de LCDR1-3 como sigue: LCDR1, o LCDR1 modificada en donde uno a siete aminoácidos se sustituyente conservadoramente) , LCDR2 , o LCDR2 modificada en donde uno o dos aminoácidos se sustituyen conservadoramente); o LCDR3 , o LCDR3 modificada en donde uno o dos aminoácidos se sustituyen conservadoramente; y (b) una, dos, tres, o un número de enlace de antígeno de, CDRs de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y/o HCDR3) de uno de los anticuerpos de hibridoma de conejo referenciados anteriormente. En modalidades, las CDRs pueden comprender una secuencia de aminoácido de una o más o todas de HCDR1-3 como sigue: HCDR1, o HCDR1 modificada en donde uno o dos aminoácidos se sustituyen conservadoramente; HCDR2 , o HCDR2 modificada en donde uno a cuatro aminoácidos se sustituyen conservadoramente; o HCDR3 , o HCDR3 modificada en donde uno o dos aminoácidos se sustituyen conservadoramente.

Los inmunógenos útiles para la producción de moléculas de anticuerpo anti-GCC incluyen GCC por ejemplo, células que expresan GCC humana (por ejemplo, una línea celular de tumor, por ejemplo, células T84, o células de tumor de colon congeladas o frescas, células recombinantes que expresan GCC) ; fracciones de membrana de células que expresan GCC (por ejemplo, una línea de células de tumor de colon, por ejemplo, células T84), o células de tumor colónico congeladas o frescas; células recombinantes que expresan GCC; GCC aislada o purificada, por ejemplo, proteína GCC humana (por ejemplo, GCC bioquímicamente aislada, por ejemplo, aislada de células de tumor gastrointestinal o células recombinantes que expresan GCC o una variante de las mismas) , o una porción de la misma (por ejemplo, el dominio extracelular de GCC, el dominio de homología de cinasa de GCC o el dominio catalítico de guanilil ciclasa de GCC o péptido correspondiente a una porción de la misma, por ejemplo, que comprende al menos aproximadamen e 8, 10, 12, 14, 16, 20, 24, 28 o 32 residuos aminoácidos de la SEC ID NO: 3); o un inmunógeno que comprende la SEC ID NO: 46 o que comprende una porción madura del mismo sin la secuencia señal (es decir, sin residuos aminoácidos 1 a aproximadamente 21 o 23 de la SEC ID NO: 46), por ejemplo, la proteína hGCC (ECD) -mIgG2a FcR r-mutll madura (también referida en la presente como "pLKTOK108") , SEC ID NO : 48.

Los inmunogenos se pueden fusionar a las secuencias heterólogas para ayudar en la manipulación, purif cación, inmunización bioquímica o medición de título de anticuerpo. Tales inmunogenos pueden comprender una porción de GCC, por ejemplo, el dominio extracelular, y una porción que comprende un polipéptido no de GCC. Existen muchas opciones para construir una proteína de fusión para la fácil purificación o inmovilización sobre un soporte sólido, por ejemplo, una columna de afinidad o una placa de microtitulación u otra microplaca/sustrato de ensayo adecuado. Por ejemplo, una porción de fusión puede agregar un dominio, por ejemplo, glutationa-S-transferasa/cinasa (GST) , el cual puede enlazar la glutationa; una región de Fe de una inmunoglobulina, la cual puede enlazar la proteína A o proteína G; los residuos aminoácido, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, preferiblemente seis residuos histidina los cuales pueden enlazar a níquel o cobalto en una columna de afinidad; una marca de epítope, por ejemplo, una porción de oncógeno c-myc (marca de myc) , una marca FLAG (Patente de Estados Unidos No. 4,703,004), una marca de hemaglutinina (HA), una marca de gen T7 10, una marca de V5 , una marca de HSV, o una marca de VSV-G la cual puede enlazar un anticuerpo específico de marca; o un cofactor, por ejemplo, biotina, la cual puede enlazar estreptavidina .

Los inmunógenos los cuales comprende la porción de Fe de una inmunoglobulina pueden contener la GCC, ya sea en solución o unida a una célula, en una configuración la cual permite el acceso estructural a epítopes de GCC por los componentes de vigilancia inmunes huéspedes para la eficiente generación de anticuerpo. Debido a que las cadenas pesadas de inmunoglobulina que comprenden las regiones de Fe se asocian en dímeros mediante enlaces de disulfuro de intercadena, los inmunógenos resultantes de la fusión con las regiones de Fe son dímeros. La valencia de proteínas de fusión puede reflejar el tipo de inmunoglobulina que contribuye a una región de Fe. Por ejemplo, las fusiones con proteínas de IgG pueden ser dímeros, las fusiones de IgA pueden producir inmunógenos tetraméricos , y las fusiones de IgM pueden producir inmunógenos decaméricos, las últimas dos se facilitan con la co-transíección de la cadena J. Una inmunoglobulina ejemplar para una proteína de fusión Fe es IgGl . La porción usada típicamente tiene la bisagra de IgGl, dominios de CH2 y CH3 codificados por un exón único. Debido a que este exón también tiene una porción de la región de CHl, la cual tiene una cisteína orientada al enlace de disulfuro con una cisteína de la cadena ligera, una modificación útil es mutar la cisteína de CHl, por ejemplo, a una serina, para asegurar que no hay cisteína no emparejada en la proteína de fusión. Tal mutación también incrementa la flexibilidad de la bisagra .

Una porción de Fe derivada de una especie no huésped, por ejemplo, región de Fe de Ig humana, para fusionar un inmunógeno para inmunización en una especie huésped, por ejemplo, ratón, rata, conejo, cabra, actúa como un adyuvante., Esta función adyuvante puede activar los anticuerpos específicos tanto contra Fe como epítopes de GCC. Los anticuerpos reactivos a Fe se pueden identificar y descartar durante la selección. La porción de Fe puede tener una secuencia tipo silvestre o una secuencia la cual es mutada para modificar la función efectora. Por ejemplo, una región constante mutada (variante) se puede incorporar en una proteína de fusión para minimizar el enlace a los receptores de Fe y/o capacidad de fijar el complemento (ver por ejemplo inter et al, GB 2,209,757 B; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351). En un ejemplo preferido, la lisina 235 y glicina 237, numeradas de acuerdo con los estándares de región de Fe, son mutadas, por ejemplo, a alanina. Una proteína de fusión/inmunógenocon IgG de Fe mutada puede tener interacción reducida con los receptores de Fe en el huésped. Una proteína de fusión de inmunógeno soluble preferida (después de la maduración para escindir el péptido señal y secreción) es hGCC(ECD) -mIgG2a FcR r-mutll (pLKTOK108) , la cual consiste de residuos aminoácidos 24 a 430 de la SEC ID NO: 3 fusionados a Fe de inmunoglobulina de IgG2a de ratón mutada (colectivamente SEC ID NO: 48) .

Para preparar un inmunógeno expresado en célula, la porción de inmunoglobulina se puede estructurar para imitar una porción de inmunoglobulina del receptor de células B. Por ejemplo, la región de Fe de inmunoglobulina se puede fusionar adicionalmente a un polipéptido que comprende una región de transmembrana de un receptor inmune, tales como receptores de Fcy, receptores de Fea, receptor de Fca/u o receptores de Fc . La orientación apropiada de tal inmunógeno unido a célula de receptor de Fe con exposición adecuada en la superficie celular se puede mejorar si la célula que expresa la proteína de fusión de inmunógeno adicionalmente comprende componentes adicionales del complejo de receptor de antígeno, por ejemplo, receptor de IgD o receptor de IgM de células B o receptor. Los componentes adecuados del complejo incluyen proteínas envolventes de inmunoglobulina (Ig) , tales como MB-1 y B29 (CD79A y CD79B ; Hombach et al. Eur. J. Immunol . 20:2795-2799 (1990) para receptor de IgM) , las cuales forman un heterodímero . Las proteínas envolventes de Ig se pueden proporcionar endógenamente por la célula transfectada, por ejemplo, si es transfectada una línea celular de linfoma de células B; o por co-transfección del inmunógeno con proteínas envolventes, por ejemplo, en un vector separado o en el mismo vector.

Los epítopes útiles, por ejemplo, epítopes de referencia, de la molécula de GCC, a los cuales las moléculas de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, anticuerpos monoclonales de conejo, o versiones humanizadas de los mismos, como se describe en la presente, pueden enlazar, se pueden encontrar en la porción extracelular de GCC. Tales epítopes de GCC pueden enlazar moléculas de anticuerpo en la superficie de las células, por ejemplo, en el exterior de la célula.

Por ejemplo, un epítope para una molécula de anticuerpo anti-GCC puede residir dentro, o incluir un residuo de, los residuos 1-50 de la SEC ID NO: 3, o un fragmento de los mismos que enlaza una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención, por ejemplo, un fragmento de la misma de enlace de MIL-44-148-2. Tales fragmentos pueden comprender los residuos 1-25, 5-30, 10-35, 15-40, 20-45, 25-50, 5-45, 10-40, 15-35, 20-30 o 33-50 de la SEC ID NO: 3. En algunas modalidades, un epítope para una molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, un anticuerpo MIL-44-148-2 , es un epítope conformacional que adicionalmente comprende uno o más residuos aminoácidos adicionales en la secuencia de aminoácidos de GCC más allá del residuo 50, es decir, seleccionados desde aproximadamente el residuo 50 a 1073 de la SEC ID NO: 3.

Los anticuerpos surgidos contra tales epítopes o el dominio extracelular, por ejemplo, epítopes que residen dentro, o incluyen un residuo de los residuos aminoácidos 24 a 420 de la SEC ID NO: 3, o una porción de referencia de los mismos, por ejemplo, los residuos 24 a 75, 75 a 150, 150 a 225, 225 a 300, 300 a 375 o 375 a 420 de GCC, o moléculas de anticuerpo derivadas de los mismos, pueden ser útiles como anticuerpos terapéuticos o de diagnóstico, como se describe en la presente.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti- GCC tiene una o más de las siguientes propiedades: a) compite para el enlace, por ejemplo, enlace a la GCC de superficie celular o GCC purificada, con una de las moléculas de anticuerpo anti-GCC referenciadas anteriormente resumidas en las Tablas 1 y 2 por ejemplo, anticuerpos de hibridoma de conejo (por ejemplo, MIL-44- 148-2) ; b) enlaza el mismo, o sustancialmente el mismo, epítope en GCC como una de las moléculas de anticuerpo anti-GCC referenciadas anteriormente resumidas en las Tabla 1 y 2, por ejemplo, anticuerpos de hibridoma de conejo (por ejemplo, MIL-44-148-2) . En una modalidad, el anticuerpo enlaza el mismo epítope, como se determina por uno o más de un ensayo de arreglo de péptidos o por enlace a mutantes de truncado, quimeras o mutantes de punto expresados en la superficie celular o preparaciones de membrana, por ejemplo, como aquellos ensayos descritos en la presente; c) enlaza un epítope el cual tiene al menos 1, 2, 3, 4, 5, 8, 10, 15 o 20 residuos aminoácidos contiguos en común con el epítope de una de las moléculas de anticuerpo anti-GCC referenciadas anteriormente resumidas en las Tablas 1 y 2, por ejemplo, anticuerpos de hibridoma de conejo (por ejemplo, MIL-44-148-2) ; d) enlaza una región de GCC humana que se une por un anticuerpo anti-GCC de la invención, en donde la región por ejemplo, una región extracelular o citoplásmica, es de 10-15, 10-20, 20-30, o 20-40 residuos de longitud, y el enlace se determina, por ejemplo, por el enlace a imitantes de truncado. En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti-GCC enlaza la región extracelular de GCC humana. En una modalidad, una molécula de anticuerpo anti-GCC puede enlazar la porción de GCC humana del dominio extracelular definido por los residuos aminoácidos 24 a 420 de la SEC ID NO: 3. En una modalidad, una molécula de anticuerpo anti-GCC puede enlazar el sitio de firma de guanilato ciclasa en los residuos aminoácidos 931 a 954 de la SEC ID NO: 3; o e) enlaza un epítope de referencia descrito en la presente .

En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti-GCC enlaza la secuencia de GCC ILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS (SEC ID NO: 8) .

En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti- GCC enlaza la secuencia de GCC FAHAFRNLTFEGYDGPVTLDD GDV (SEC ID NO: 9) .

En una modalidad, la molécula de anticuerpo enlaza un epítope conformacional . En otras modalidades, una molécula de anticuerpo enlaza un epítope lineal.

Las moléculas de anticuerpo anti-GCC pueden ser anticuerpos policlonales , anticuerpos monoclonales , anticuerpos monoespecífieos , anticuerpos quiméricos (Ver Patente de Estados Unidos No. 6,020,153) o anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpo o derivados de los mismos. Las variantes sintéticas y genéticamente modificadas (Ver Patente de Estados Unidos No. 6,331,415) de cualquiera de los anteriores también se contemplan por la presente invención. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir por una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpo monoclonal murino convencional (por ejemplo, la técnica de hibridación de célula somática estándar de Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975); ver generalmente, Harlow, E. and Lañe, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y) , y la tecnología de anticuerpo monoclonal de conejo y servicios proporcionados por Epitomics (Burlingame, CA) que produce anticuerpos monoclonales de conejo habituales (RabMAbs®) usando hibridomas de conejo-conejo generados fusionando las células B aisladas de un conejo inmunizado con la línea celular de socio de fusión propiedad de Epitomics, como se describe en las Patentes de Estados Unidos 7,402,409, 7,429,487, 7,462,697, 7,575,896, 7,732,168, y 8,062,867, cada una de las cuales se incorpora para referencia en la presente en sus totalidades.

La inmunización con proteína, por ejemplo, GCC o una porción soluble, o proteína de fusión que comprende una porción de GCC (por ejemplo, hGCC (ECD) -mIgG2a FcRbr-mutlI (pLKTOK108) , o células o fracciones de membrana de las mismas, por ejemplo, células que expresan GCC expuesta en la superficie o una porción de la misma (por ejemplo, el producto pLKT0K4), se puede realizar con el inmunógeno preparado para inyección en una manera para inducir una respuesta, por ejemplo, con adyuvante, por ejemplo, adyuvante de Freund completo. Otros adyuvantes adecuados incluyen, adyuvante Titermax Gold® (CYTRX Corporation, Los Angeles, Calif.) y alumbre. Los inmunógenos de péptido pequeño se pueden enlazar a una molécula grande, tal como hemocianina de lapa californiana . Los ratones o conejos se pueden inyectar en un número de maneras, por ejemplo, subcutánea, intravenosa o intramuscular en un número de sitios, por ejemplo, en el peritoneo (i.p.), base de la cola, o almohadilla plantar, o una combinación de sitios, por ejemplo, iP y base de la cola (BIP) . Las inyecciones de refuerzo pueden incluir el mismo o un diferente inmunógeno y pueden incluir adicionalmente adyuvante, por ejemplo, adyuvante de Freund incompleto. La inmunización con ADN, por ejemplo, ADN que codifica GCC o una porción del mismo o proteína de fusión que comprende GCC o una porción de la misma (por ejemplo, que codifica hGCC(ECD)- mIgG2a FcRbr-mutll) se puede inyectar usando tecnología de pistola de genes. Por ejemplo, el ADN se carga sobre partículas de oro microscópicas y se inyecta en ratones o conejos a intervalos frecuentes durante un período breve.

Generalmente, donde se desea un anticuerpo monoclonal, se produce un hibridoma fusionando una célula adecuada de una línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma tales como SP2/0, P3X63Ag8.653 o un heteromieloma) con células que producen anticuerpos. Las células que producen anticuerpos se pueden obtener de la sangre periférica o, preferiblemente el bazo o nodulos linfáticos, de humanos, animales transgénicos de anticuerpo humano u otros animales adecuados (por ejemplo, conejos) inmunizados el antígeno de interés. Las células que producen anticuerpos de origen humano (por ejemplo, un anticuerpo humano) se pueden producir usando métodos adecuados, por ejemplo, fusión de una célula que produce anticuerpo humano y un heteromieloma o trioma, o inmortalización de una célula B humana activada vía infección con virus de Epstein Barr. (Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 6,197,582 (Trakht) ; Niedbala et al., Hybridoma, 17:299-304 (1998); Zanella et al., J Immunol Methods, 156:205-215 (1992); Gustafsson et al., Hum Antibodies Hybridomas, 2:26-32 (1991).) Las células que producen anticuerpo inmortalizadas o fusionadas (hibridomas) se pueden aislar usando condiciones de cultivo selectivas, y clonar por dilución limitada. Las células las cuales producen anticuerpos con la especificidad deseada se pueden identificar usando un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA (por ejemplo, con inmunógeno, por ejemplo, hGCC (ECD) -mIgG2a FcRbr-mutlI, inmovilizado en la cavidad de microtitulación) o por FACS en una célula que expresa GCC o una porción de la misma, por ejemplo, una célula que expresa el producto pLKT0K4) . Por ejemplo, si el GCC- inmunógeno comprende una porción de fusión que es un reactivo de afinidad, esta porción puede permitir que la proteína de fusión que comprende GCC o una porción de la misma sea unida a una matriz, por ejemplo, microplacas de ensayo o placas de microtitulación revestidas con proteína G, revestidas con estreptavidina, derivadas de glutationa o revestidas con anticuerpo, que luego se combinan con el medio acondicionado o de suero inmune de un hibridoma o célula recombinante que expresa anticuerpo, y la mezcla se incuba bajo condiciones conducentes para acomplejar la formación (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH) . Después de la incubación, las células de microplaca o cavidades de la placa de microtitulación se lavan para remover cualquiera de los componentes no unidos y el enlace por anticuerpo anti-GCC se mide .

En modalidades, para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanizados. La ventaja de los anticuerpos humanizados es que disminuyen o eliminan potencialmente la inmunogenicidad del anticuerpo en un receptor huésped, permitiendo un incremento de la biodisponibilidad y una reducción de la posibilidad de reacción inmune adversa, potencialmente habilitando así múltiples administraciones de anticuerpo.

Los anticuerpos modificados incluyen anticuerpos humanizados, quiméricos o injertados a CDR. Las respuestas de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) han llevado al desarrollo de anticuerpos quiméricos o de otra manera humanizados. Mientras que los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable no humana, se espera que ciertas respuestas de anticuerpo anti-quimérico humano (HACA) sean observadas, particularmente en utilizaciones crónicas o de dosis múltiples del anticuerpo. La presencia de proteínas derivadas no humanas (por ejemplo, murinas, de rata, conejo, oveja o cabra) puede llevar a la rápida depuración de los anticuerpos o puede llevar a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por un paciente.

Para evitar la utilización de anticuerpos derivados no humanos, los anticuerpos humanizados donde las secuencias se introducen a una secuencia de anticuerpo para hacerla más cercana a la secuencia de anticuerpo humano, o anticuerpos completamente humanos generados por la introducción de la función de anticuerpo humano en una especie no humana, tal como un ratón, rata, conejo, oveja o cabra, se han desarrollado de modo que las especies no humanas producirían anticuerpos que tienen secuencias completamente humanas. Los anticuerpos humanos evitan ciertos de los problemas asociados con los anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes de conejo, roedor, oveja o cabra.

Tecnologías de Expresión y Humanización y Modificaciones a los Anticuerpos Las moléculas de anticuerpo humanizado pueden minimizar las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a los mAbs derivados no humanos o no humanos y por consiguiente incrementar la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. El uso de moléculas de anticuerpo humanizado puede proporcionar ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación, autoinmunidad, y cáncer, las cuales requieren administraciones repetidas de anticuerpo.

La producción de anticuerpos humanizados con inmunogenicidad reducida se puede realizar en conexión con las técnicas de humanización y técnicas de expresión que usan bibliotecas apropiada. Se apreciará que los anticuerpos de especies no humanas, tales como ratones, ratas, conejos, oveja, cabras, etc., se pueden humanizar o primatizar usando técnicas conocidas en el arte. Ver por ejemplo, inter and Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) and Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). El anticuerpo de interés se puede modificar por técnicas de ADN recombinante para sustituir los dominios de bisagra CH1, CH2, CH3 , dominios de bisagra, y/o el dominio de armazón con la secuencia humana correspondiente (ver O 92/02190 y Patentes de Estados Unidos Nos. 5,530,101, 5,585,089, 5,693,761, 5,693,792, 5,714,350, y 5,777,085). Además, el uso de cADN de Ig para la construcción de genes de inmunoglobulina quimérica se conoce en el arte (Liu et al. Proc Nati Acad Sci USA. 84:3439 (1987) y J. Immunol. 139:3521 (1987)). El mARN se aisla de un hibridoma u otra célula que produce el anticuerpo y se usa para producir cADN. El cADN de interés se puede amplificar por la reacción en cadena de polimerasa usando cebadores específicos (Patentes de Estados Unidos Nos. 4,683, 195 y 4,683,202) .

Al ernativamente, la tecnología de expresión en fagos (ver, por ejemplo, McCafferty et al, Nature, 348:552-553 (1990) ) se puede usar para producir anticuerpos humanos o anticuerpos de otras especies, así como también fragmentos de anticuerpo in vitro, de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina, por ejemplo, de repertorios de donantes no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpo se clonan en cuadro ya sea en un gen de proteína de capa mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y expresan como fragmentos de anticuerpo funcional en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de cadena única del genoma de fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también resultan en la sección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe aquellas propiedades. Por consiguiente, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La expresión en fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión ver, por ejemplo, Johnson and Chis ell, Current Opinión in Structural Biology, 3:564-571 (1993) . Diversas fuentes de segmentos de gen V se pueden usar para la expresión en fagos. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron un arreglo divero de anticuerpos anti-oxazolona de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados se puede construir y los anticuerpos para un arreglo diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) se pueden aislar esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), o Griffith et al, EMBO J. , 12:725-734 (1993). Ver, también, las Patentes de Estados Unidos Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Las bibliotecas de expresión pueden contener anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno de anticuerpos que contienen secuencias de aminoácidos artificiales. Por ejemplo, la biblioteca puede contener fragmentos Fab los cuales contienen CDRs artificiales (por ejemplo, secuencias de aminoácidos aleatorios) y regiones de armazón humanas. (Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 6,300,064 (Knappik, et al.).) Las secuencias de genes de región constante humanos se pueden encontrar en Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, N.I.H. publicación no. 91-3242. Los genes de región C humanos están fácilmente disponibles de clones conocidos. La elección del isotipo estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tal como fijación de complemento, o actividad en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Los isotipos pueden ser IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4. En modalidades particulares, las moléculas de anticuerpo de la invención son IgGl e IgG2. Se puede usar cualquiera de las regiones constante de cadena ligera humana, kappa o lambda. El anticuerpo quimérico, humanizado luego se expresa por métodos convencionales.

En algunas modalidades, una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención puede extraer citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) a una célula que expresa GCC, por ejemplo, una célula de tumor. Los anticuerpos con los isotipos de IgGl e IgG3 son útiles para provocar la función efectora en una capacidad citotóxica dependiente de anticuerpo, debido a su capacidad de enlazar el receptor de Fe. Los anticuerpos con los isotipos IgG2 e IgG4 son útiles para minimizar una respuesta de ADCC debido a su baja capacidad para enlazar el receptor de Fe. En modalidades relacionadas, las sustituciones en la región de Fe o cambios en la composición de glicosilación de un anticuerpo, por ejemplo, por crecimiento en una línea celular eucariota modificada, se pueden hacer para mejorar la capacidad de los receptores de Fe para reconocer, enlazar, y/o mediar la citotoxicidad de las células a las cuales enlazan los anticuerpos anti-GCC (ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 7,317,091, 5,624,821 y publicaciones incluyendo WO 00/42072, Shields, et al. J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001), Lazar et al. Proc . Nati. Acad. Sci. U.S.A. 103:4005-4010 (2006), Satoh et al. Expert Opin Biol. Ther. 6:1161-1173 (2006) ) . En ciertas modalidades, el anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno (por ejemplo, anticuerpo de origen humano, anticuerpo humano) puede incluir sustituciones o remplazos de aminoácidos que alteran o adaptan la función (por ejemplo, función efectora) . Por ejemplo, una región constante de origen humano (por ejemplo, región constante ??, región constante ?2) se puede diseñar para reducir la activación de complemento y/o enlace de receptor de Fe. (Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 5,648,260 ( inter et al.), 5,624,821 (Winter et al.) y 5,834,597 (Tso et al.), las enseñanzas completas de las cuales se incorporan en la presente para referencia). Preferiblemente, la secuencia de aminoácido de una región constante de origen humano que contiene tales sustituciones o remplazos de aminoácidos es al menos aproximadamente 95% idéntica sobre la longitud completa con la secuencia de aminoácido de la región constante no alterada de origen humano, más preferiblemente al menos aproximadamente 99% idéntica sobre la longitud completa con la secuencia de aminoácido de la región constante no alterada de origen humano.

En aún otra modalidad, las funciones efectoras también se pueden alterar modulando el patrón de glicosilación del anticuerpo. Por alteración se entiende suprimir una o más porciones de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o agregar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos con actividades mejoradas de ADCC con una estructura de carbohidrato madura que carece de fucosa unida a una región de Fe del anticuerpo se describen en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2003/0157108 (Presta) . Ver también Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co. , Ltd) . Glycofi también han desarrollado líneas celulares de levadura capaces de producir glicoformas específicas de anticuerpos.

Adicionalmente o alternativamente, se puede producir un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos fucosilo o un anticuerpo que tiene estructuras de GlcNac de bisección incrementada. Se ha demostrado que tales patrones de glicosilación alterados incrementan la capacidad de ADCC de anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidrato se pueden realizar, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con maquinaria de glicosilación alterada. Las células con maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en el arte y se pueden usar como células huéspedes en las cuales se modifican genéticamente para expresar anticuerpos recombinantes de la invención para producir un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, EP 1,176,195 de Hang et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente interrumpido, el cual codifica una fucosil transferasa, de modo que los anticuerpos expresados en tal línea celular exhiben hipofucosilación . La Publicación de PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea celular de CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos enlazados a Asn(297), que también resulta en hipofucosilación de anticuerpos expresados en esta célula huésped (ver también Shields, R. L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La Publicación de PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe líneas celulares modificadas genéticamente para expresar glicosil transferasas que modifican la glicoproteína (por ejemplo, beta(l,4)-N acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) ) de modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares genéticamente modificadas exhiben estructuras de GlcNac de bisección incrementada lo cual resulta en actividad incrementada de ADCC de los anticuerpos (ver también Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180).

Los anticuerpos humanizados también se pueden producir usando un procedimiento de injerto a CDR. Las técnicas de generación de tales anticuerpos humanizados son conocidas en el arte. Generalmente, los anticuerpos humanizados se producen obteniendo secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias pesada variable y ligera variable de un anticuerpo que enlaza a GCC, identificando la región determinante de complementariedad o "CDR" en las secuencias pesada variable y ligera variable e injertando las secuencias de ácido nucleico de CDR en las secuencias de ácido nucleico de armazón humanas. (Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 4,816,567 y 5,225,539) . La ubicación de las CDRs y residuos de armazón se puede determinar (ver, Kabat , E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, y Chothia, C. et al. J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987)). Las moléculas de anticuerpo anti-GCC descritas en la presente tienen las secuencias de aminoácidos de CDR y secuencias de ácido nucleico que codifican CDRs listadas en las Tablas 5 y 6. En algunas modalidades, las secuencias de las Tablas 5 y 6 se pueden incorporar en moléculas las cuales reconocen GCC para el uso en los métodos terapéuticos y de diagnóstico descritos en la presente. El armazón humano que se selecciona es uno que es adecuado para la administración in vivo, significando que no exhibe inmunogenicidad. Por ejemplo, tal determinación se puede hacer por experiencia previa con el uso in vivo de tales anticuerpos y estudios de similitudes de aminoácidos. Una región de armazón adecuada se puede seleccionar de un anticuerpo de origen humano que tiene al menos aproximadamente 65% de identidad de secuencia de aminoácidos, y preferiblemente al menos aproximadamente 70%, 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia de aminoácidos sobre la longitud de la región de armazón dentro de la secuencia de aminoácidos de la porción equivalente (por ejemplo, región de armazón) del anticuerpo donante, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC (por ejemplo, 3G1) . La identidad de secuencia de aminoácidos se puede determinar usando un algoritmo de alineación de secuencia de aminoácidos adecuado tal como CLUSTAL W, usando los parámetros por defecto.

(Thompson J. D. et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-4680 (1994) . ) Una vez que se identifican las CDRs y FRs del anticuerpo clonado que será humanizado, las secuencias de ácido nucleico que codifican las CDRs se identifican y las secuencias de ácido nucleico correspondientes se injertan en las FRs humanas seleccionadas. Esto se puede hacer usando cebadores y enlazantes conocidos, la selección de los cuales se conoce en el arte. Todas las CDRs de un anticuerpo humano particular se pueden remplazar con al menos una porción de una CDR no humana o solamente algunas de las CDRs se pueden remplazar con CDRs no humanas. Solo es necesario remplazar el número de CDRs requerido para el enlace del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado. Después que las CDRs se injertan sobre las FRs humanas seleccionadas, las secuencias pesada variable y ligera variable "humanizadas" resultantes se expresan para producir un anticuerpo humanizado o Fv humanizado que enlaza a GCC. Preferiblemente, el anticuerpo injertado a CDR (por ejemplo, humanizado) enlaza una proteína GCC con una afinidad similar a, sustancialmente la misma como, o mejor que aquella del anticuerpo donante. Típicamente, las secuencias pesada variable y ligera variable humanizadas se expresan como una proteína de fusión con secuencias de dominio constante humanas de modo que se obtiene un anticuerpo intacto que enlaza a GCC. Sin embargo, se puede producir un anticuerpo de Fv humanizado que no contiene las secuencias constantes.

Además dentro del alcance de la invención están anticuerpos humanizados en los cuales los aminoácidos específicos se han sustituido, suprimido o agregado. En particular, los anticuerpos humanizados pueden tener sustituciones de aminoácidos en la región de armazón, tal como para mejorar el enlace al antígeno. Por ejemplo, un número pequeño seleccionado de residuos de armazón aceptor de la cadena de inmunoglobulina humanizada se puede remplazar por los aminoácidos donantes correspondientes. Las ubicaciones de las sustituciones incluyen residuos aminoácidos adyacentes a la COR, o que son capaces de interactuar con una CDR (ver por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 5,585,089 o 5,859,205). El armazón aceptor puede ser una secuencia de armazón de anticuerpo humano maduro o una secuencia de consenso. Como se usa en la presente, el término "secuencia de consenso" se refiere a la secuencia encontrada más frecuentemente, o concebida de los residuos más comunes en cada posición en una secuencia en una región entre los miembros de familia relacionados. Un número de secuencias de consenso de anticuerpo humano está disponible, incluyendo secuencias de consenso para los diferentes subgrupos de regiones variables humanas (ver, Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991)) . La base de datos de Kabat y sus aplicaciones están libremente disponibles en línea, por ejemplo vía IgBLAST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica, Bethesda, Md. (también ver, Johnson, G. and u, T. T. , Nucleic Acids Research 29:205-206 (2001) ) .

Otras técnicas para la humanización de anticuerpos se describen en Padlan et al. EP 519596 Al, publicada el 23 de Diciembre de 1992.

La molécula de anticuerpo anti-GCC incluye otros anticuerpos humanizados los cuales también se pueden modificar por supresión específica de epítopes de células T humanas o "desinmunización" por los métodos descritos en las Publicaciones de PCT Nos. WO 98/52976 y WO 00/34317, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente para referencia. Brevemente, las regiones variables de cadena pesada y ligera de conejo, u otra especie no humana, de un anticuerpo anti-GCC se pueden analizar para péptidos que enlazan a MHC Clase II; estos péptidos representan epítopes de células T potenciales. Para la detección de epítopes de células T potenciales, un procedimiento de modelación por computadora llamado "enhebrado de péptidos" se puede aplicar, y además de una base de datos de péptidos de enlace de MHC clase II humana se puede buscar para motivos presentes en las secuencias de VH y VL de conejo, como se describe en las Publicaciones de PCT Nos. O 98/52976 y O 00/34317. Estos motivos enlazan a cualquiera de los 18 alotipos de DR de MHC clase II principales, y por consiguiente constituyen los epítopes de células T potenciales. Los epítopes de células T potenciales detectados se pueden eliminar sustituyendo números pequeños de residuos aminoácidos en las regiones variables, o preferiblemente, por sustituciones de aminoácido único. Hasta donde sea posible, se hacen sustituciones conservadoras, frecuentemente per no exclusivamente, se puede usar un aminoácido común en esta posición en secuencias de anticuerpo de línea germinal humana. Las secuencias de línea germinal humana se describen en Tomlinson, I. A. et al., J. Mol. Biol. 227:776-798 (1992); Cook, G. P. et al., Immunol . Today Vol . 16 (5) : 237-242 (1995); Chothia, D. et al., J. Mol. Bio. 227:799-817 (1992). El directorio de V BASE proporciona un directorio comprensivo de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana (compiladas por Tomlinson, I. A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) . Después que la VH y VL desinmunizadas de un anticuerpo anti-GCC se construyen por mutagénesis de los genes de VH y VL de conejo, la secuencia variable mutagenizada, opcionalmente , se puede fusionar a una región constante humana, por ejemplo, regiones constantes K (kappa) o de IgGl humana .

En otras modalidades, la reducción de una respuesta inmunogénica por un anticuerpo injertado a CDR se puede lograr por cambios, por ejemplo, supresiones, sustituciones, de residuos aminoácidos en CDRs (Kashmiri et al. Methods 36:25-34 (2005), Patente de Estados Unidos No. 6,818,749, Tan et al. J. Immunol. 169:1119-1125 (2006)). Por ejemplo, los residuos en las posiciones involucradas en contacto con el antígeno preferiblemente no serían cambiados. Típicamente, tales residuos, los residuos determinantes de especificidad (SDRs) , están en posiciones las cuales juegan altos niveles de variabilidad entre los anticuerpos. Las secuencias de consenso derivadas, por ejemplo, por el método de Clustal (Higgins D. G. et al., Meth. Enzymol . 266:383-402 (1996)), de moléculas de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, de anticuerpos descritos en la presente, ayudan en la identificación de SDRs . En las moléculas de anticuerpo anti-GCC descritas en la presente, los SDRs son los siguientes, al menos el primer residuo o en algunas modalidades, los primeros cuatro residuos de CDR1 de cadena pesada; al menos la porción N-terminal, por ejemplo, los primeros siete, diez o 13 residuos de CDR2 de cadena pesada; casi todos de la CDR3 de cadena pesada; la porción C-terminal, por ejemplo, después del residuo seis, ocho, o nueve de la CDR1 de cadena ligera; aproximadamente el primero, intermedio y/o último residuo de CDR2 de cadena ligera; y la mayoría de CDR3 de cadena ligera, o al menos después del residuo dos o tres. Por consiguiente, para mantener el enlace a la proteína GCC después de la humanización o modificación de una molécula de anticuerpo anti-GCC, tales residuos SDR en las CDRs de las moléculas de anticuerpo anti-GCC son menos sensibles a cambios, por ejemplo, de residuos de conejo a residuos de consenso humanos que son residuos en otros residuos de las CDRs o las regiones de armazón. A la inversa, puede ser benéfico cambiar los residuos en CDRs no humanas, por ejemplo, de conejo a residuos identificados como consenso en CDRs humanas, por ejemplo, CDRs de moléculas de anticuerpo anti-GCC descritas en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Publicada No. 20110110936, los contenidos de la cual se incorporan para referencia en la presente en su totalidad.

Los anticuerpos anti-GCC que son anticuerpos no intactos también son útiles en esta invención. Tales anticuerpos se pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Las moléculas de anticuerpo útiles de este tipo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios de VL., VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab' )2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios de VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios de VL y VH de un brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb ( ard et al., Nature 341:544-546 (1989)), el cual consiste de un dominio de VH; (vii) un anticuerpo de cadena pesada funcional de dominio único, el cual consiste de un dominio de VHH (conocido como un nanocuerpo) , ver por ejemplo, Cortez-Retamozo, et al., Cáncer Res. 64: 2853-2857 (2004), y referencias citadas en la presente; y (vii) una CDR aislada, por ejemplo, una o más CDRs aisladas conjuntamente con suficiente armazón para proporcionar un fragmento de enlace de antígeno. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por un enlazante sintético que los habilita para hacerse como una cadena de proteína única en la cual las regiones de VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv) ; ver por ejemplo, Bird et al. Science 242:423-426 (1988); y Huston et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988). Tales anticuerpos de cadena única también se proponen para ser abarcados dentro del término "fragmento de enlace de antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por aquellos con experiencia en el arte, y los fragmentos se seleccionan para utilidad de la misma manera como son anticuerpos intactos. Los fragmentos de anticuerpo, tales como Fv, F(ab' )2 y Fab se pueden preparar por escisión de la proteína intacta, por ejemplo por ecisión química o proteasa .

En modalidades, algunas o todas las secuencias de CDRs, de una o ambas cadena pesada y ligera, se pueden usar en otra molécula de anticuerpo, por ejemplo, en una molécula de anticuerpo injertado a CDR, humanizado, o quimérico.

Las modalidades incluyen una molécula de anticuerpo que comprende suficientes CDRs, por ejemplo, todas las seis CDRs de uno de los anticuerpos de hibridoma de conejo descritos en la presente para permitir el enlace a la GCC de superficie celular.

En una modalidad, las CDRs, por ejemplo, todas las HCDRs, o todas las LCDRs, o todas las seis, se incrustan en regiones de armazón derivadas humanas o humanas. Los ejemplos de regiones de armazón humanas incluyen secuencias de armazón de línea germinal humana, secuencias de línea germinal humana que se han madurado por afinidad (ya sea in vivo o ín vitro) , o secuencias humanas sintéticas, por ejemplo, secuencias de consenso. En una modalidad, el armazón de cadena pesada es un armazón de IgGl o IgG2. En una modalidad, el armazón de cadena ligera es un armazón kappa.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, una molécula de anticuerpo injertado a CDR o humanizado, comprende suficientes CDRs, por ejemplo, todas las seis CDRs de uno de los anticuerpos descritos en la presente, por ejemplo, secuencias listadas en la Tabla 5, para permitir el enlace a GCC. (Las secuencias de ácido nucleico ejemplares las cuales pueden codificar las secuencias de aminoácidos de CDRs listadas en la Tabla 5, se proporcionan, en la Tabla 6 en la presente) . En modalidades particulares, una molécula de anticuerpo anti-GCC puede comprender CDRs de MIL-44-148-2 o MIL-44-67-4.

Los fragmentos de anticuerpo para el uso terapéutico o de diagnóstico in vivo pueden beneficiarse de las modificaciones las cuales mejorar sus vidas medias en suero. Las porciones orgánicas adecuadas propuestas para incrementar la vida media en suero in vivo del anticuerpo pueden incluir una, dos o más porciones lineales o ramificadas seleccionadas de un grupo polimérico hidrofílico (por ejemplo, un polímero lineal o ramificado (por ejemplo, un polialcano glicol tal como polietilenglicol , monometoxi-polietilenglicol y similares) , un carbohidrato (por ejemplo, un dextrano, una celulosa, un polisacárido y similares) , un polímero de un aminoácido hidrofílico (por ejemplo, polilisina, poliaspartato y similares) , un óxido de polialcano y polivinil pirrolidona) , un grupo ácido graso (por ejemplo, un ácido raono-carboxílico o un ácido di-carboxílico) , un grupo éster de ácido graso, un grupo lípido (por ejemplo, grupo diacilglicerol) , grupo esfingolípido (por ejemplo, ceramidilo) ) o un grupo fosfolípido (por ejemplo, grupo fosfatidil etanolamina) . Preferiblemente, la porción orgánica se une a un sitio predeterminado donde la porción orgánica no deteriora la función (por ejemplo, disminución de la afinidad de enlace de antígeno) del inmunoconjugado resultante en comparación con la porción de anticuerpo no conjugada. La porción orgánica puede tener un peso molecular de aproximadamente 500 Da a aproximadamente 50,000 Da, preferiblemente aproximadamente 2000, 5000, 10,000 o 20,000 Da. Los ejemplos y métodos para modificar polipéptidos , por ejemplo, anticuerpos, con porciones orgánicas se pueden encontrar, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,179,337 y 5,612,460, Publicaciones de PCT Nos. WO 95/06058 y WO 00/26256, y Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 20030026805.

Una molécula de anticuerpo anti-GCC puede comprender todos, o un fragmento de enlace de antígeno de la región variable, de una o ambas, cadena pesada y ligera, de uno de los anticuerpos de hibridoma de conejo referenciados anteriormente .

En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de (a) puede diferir de una de las secuencias de aminoácidos de referencia referidas en (a) (i-ii) por tanto como 1, 2, 3, 4, 5, 10, o 15 residuos. En modalidades, las diferencias son sustituciones conservadoras. En modalidades, las diferencias están en las regiones de armazón. En una modalidad, la secuencia de aminoácido de cadena pesada de (b) puede diferir de una de las secuencias de aminoácidos de referencia referidas en (b) (i-ii) por tanto como 1, 2, 3, 4, 5, 10, o 15 residuos. En modalidades, las diferencias son sustituciones conservadoras. En modalidades, las diferencias están en las regiones de armazón.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti-GCC comprende una o ambas de : (a) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de todos, o un fragmento de enlace de antígeno, ya sea, (i) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena ligera de la Tabla 3, por ejemplo, SEC ID NO: 13, o (ii) un aminoácido de región variable de cadena ligera codificado por una secuencia de nucleótidos de la Tabla 4, por ejemplo, SEC ID NO: 12; y (b) una secuencia de aminoácido de cadena pesada de todos, o un fragmento de enlace de antígeno de, ya sea (i) una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena pesada de la Tabla 3, por ejemplo, SEC ID NO: 11, o (ii) una secuencia de aminoácido de cadena pesada codificada por una secuencia de nucleótidos de la Tabla 4, por ejemplo, SEC ID NO: 10.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti- GCC comprende una o ambas de : a) una región variable de cadena ligera, o un fragmento de enlace de antígeno de la misma, que tiene al menos 85, 90, 95, 97 o 99% de homología con la región variable de cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención; y (b) una región variable de cadena pesada, o un fragmento de enlace de antígeno de la misma, que tiene al menos 85, 90, 95, 97 o 99% de homología con la región variable de cadena pesada de una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención.

Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de los anticuerpos anti-GCC de la invención se pueden encontrar en la Tabla 3.

En un procedimiento, las secuencias de consenso que codifican las regiones J de cadena pesada y ligera se pueden usar para diseñar oligonucleótidos para uso como cebadores para introducir sitios de restricción útiles en la región J para enlace subsecuente de los segmentos de región V a segmentos de región C humanos . El cADN de región C se puede modificar por mutagénesis dirigida al sitio para colocar un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana .

Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, cósmidos, YACs , episomas derivados de EBV, y similares. Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina de CH o Cl humana f ncionalmente completa, con sitios de restricción apropiados modificados genéticamente de modo que cualquier secuencia de VH o VL se puede insertar fácilmente y expresar. En tales vectores, el empalme usualmente ocurre entre el sitio donante de empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede la región C humana, y también en las regiones de empalme que se presentan dentro de los exones de CH humana. Los vectores de expresión adecuados pueden contener un número de componentes, por ejemplo, un origen de replicación, un gen de marcador seleccionable , o uno o más elementos de control de expresión, tal como un elemento de control de transcripción (por ejemplo, promotor, mejorador, terminador) y/o una o más señales de traducción, una secuencia señal o secuencia guía, y similares. La terminación de transcripción y poliadenilación ocurre en sitios cromosómicos nativos cadena abajo de las regiones codificantes. El anticuerpo quimérico resultante se puede unir a cualquier promotor fuerte. Los ejemplos de vectores adecuados. Los ejemplos de vectores adecuados que se pueden usar incluyen aquellos que son adecuados para huéspedes mamíferos y basados en sistemas de replicación viral, tal como virus de simio 40 (SV40) , virus de sarcoma Rous (RSV) , adenovirus 2, virus de papiloma bovino (BPV) , imitante BK de papovavirus (BKV) , o citomegalovirus de ratón y humano (CMV) , y virus de leucemia murino de moloney (MMLV) , promotores de Ig nativa, etc. Una variedad de vectores adecuados se conocen en el arte, incluyendo vectores los cuales se mantienen en copia única o múltiples copias, o los cuales llegan a ser integrados en el cromosoma de célula huésped, por ejemplo, vía LTRs, o vía cromosomas artificiales modificados genéticamente con múltiples sitios de integración (Lindenbaum et al. Nucleic Acids Res. 32:el72 (2004), Kennard et al. Biotechnol . Bioeng. Online May 20, 2009) . Los ejemplos adicionales de vectores adecuados se listan en una sección más tarde.

Por consiguiente, la invención proporciona un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo, fragmento de enlace de antígeno de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo quimérico humanizado o fragmento de enlace de antígeno de cualquiera de los anteriores) , cadena de anticuerpo (por ejemplo, cadena pesada, cadena ligera) o porción de enlace de antígeno de una cadena de anticuerpo que enlaza una proteína GCC.

La expresión en células huéspedes eucariotas es útil debido a que tales células son más propensas que las células procariotas a ensamblar y segregar un anticuerpo apropiadamente plegado e inmunológicamente activo. Sin embargo, cualquier anticuerpo producido que es inactivo debido al plegado inapropiado puede ser renaturable de acuerdo con los métodos conocidos (Kim and Baldwin, "Specific Intermediates in the Folding Reactions of Small Proteins and the Mechanism of Protein Folding", Ann. Rev. Biochem. 51, pp. 459-89 (1982)). Es posible que las células huéspedes produzcan porciones de anticuerpos intactos, tales como dímeros de cadena ligera o dímeros de cadena pesada, los cuales también son homólogos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención.

Además, como se describe en otra parte en la presente, los anticuerpos o anticuerpos de especies humana o no humana se pueden generar mediante tecnologías tipo expresión, incluyendo, sin limitación, expresión en fagos, expresión retroviral, expresión ribosomal, y otras técnicas, usando técnicas bien conocidas en el arte y las moléculas resultantes se pueden someter a maduración adicional, tal como maduración por afinidad, tales técnicas son conocida en el arte. Winter and Harris Immunol Today 14:43-46 (1993) y Wright et al. Crit. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes and Plucthau PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (expresión ribosomal), Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988) (expresión en fagos), Scott TIBS 17:241-245 (1992), Cwirla et al. Proc Nati Acad Sci USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucí. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol . Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992), y Patente de Estados Unidos No. 5,733,743. Si las tecnologías de expresión se utilizan para producir anticuerpos que no son humanos, tales anticuerpos se pueden humanizar como se describió anteriormente.

Se apreciará que los anticuerpos que se generan no necesitan poseer inicialmente un isotipo deseado particular sino, más bien, el anticuerpo como se generó puede poseer cualquier isotipo. Por ejemplo, el anticuerpo producido por el hibridoma de conejo MIL-44-148-2 tiene un isotipo de IgG. El isotipo del anticuerpo se puede cambiar después, por ejemplo, a IgG2, o IgG3 para provocar una respuesta de ADCC cuando el anticuerpo enlaza GCC en una célula, usando técnicas convencionales que se conocen en el arte. Tales técnicas incluyen el uso de técnicas recombinantes directas (ver por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 4,816,397), técnicas de fusión célula-célula (ver por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 5,916,771), entre otras. En la técnica de fusión célula-célula, se prepara un mieloma u otra línea celular que posee una cadena pesada con cualquier isotipo deseado y se prepara otro mieloma u otra línea celular que posee la cadena ligera. Tales células, después, se pueden fusionar y se puede aislar una línea celular que expresa un anticuerpo intacto.

En ciertas modalidades, la molécula de anticuerpo de GCC es un anticuerpo de IgGl anti-GCC de conejo. Puesto que tales anticuerpos poseen enlace deseado a la molécula de GCC, cualquiera de tales anticuerpos puede ser fácilmente intercalado en isotipo para generar otro isotipo mientras aún posee la misma región variable (la cual define la especificidad y afinidad del anticuerpo, a un cierto grado) . Por consiguiente, cuando se generan candidatos de anticuerpo que cumplen los atributos "estructurales" deseado como se discutió anteriormente, generalmente se pueden proporcionar con al menos ciertos atributos "funcionales" adicionales que se desean mediante la intercalación de isotipo.

En una modalidad, la región variable o fragmento de enlace de antígeno de la misma se puede acoplar a una región constante (o fragmento de la misma) diferente de la región constante que fue generada, por ejemplo, con una región constante (o fragmento de la misma) de otro anticuerpo o a una región constante sintética (o fragmento de la misma) . En modalidades, la región constante es una región constante de IgGl o IgG2 (o fragmento de la misma) . Los cambios de secuencia se pueden hacer en las regiones variables o constantes para modificar la actividad efectora de la molécula de anticuerpo.

Diseño y Generación de Otros Terapéuticos Los anticuerpos que se producen y caracterizan en la presente con respecto a GCC proporciona el diseño de otras modalidades terapéuticas que incluyen otros anticuerpos, se facilitan otros antagonistas, o porciones químicas diferentes de los anticuerpos. Tales modalidades incluyen, sin limitación, anticuerpos que tienen funcionalidad o actividad de enlace similar, terapéuticos de anticuerpo avanzados, tales como anticuerpos biespecífieos , inmunoconjugados , y terapéuticos radioetiquetados, generación de terapéuticos de péptido, particularmente intracuerpos , y moléculas pequeñas. Además, como se discutió anteriormente, la función efectora de los anticuerpos de la invención se puede cambiar por intercalación de isotipo a una IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4 , IgD, IgAl, IgA2 , IgE, o IgM para varios usos terapéuticos.

En conexión con los anticuerpos biespecíficos , se pueden generar anticuerpos biespecíficos que comprenden (i) dos anticuerpos, uno con una especificidad a GCC y otro a una segunda molécula de modo que se conjugan juntos, (ii) un anticuerpo único que tiene una cadena específica para GCC y una segunda cadena específica para una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de cadena única que tiene especificidad para GCC y la otra molécula. Tales anticuerpos biespecíficos se pueden generar usando técnicas que son conocidas. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden producir reticulando dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos) . Los reticulantes adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales , que tienen dos grupos distintamente reactivos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster dem-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifunctional (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo) . Tales enlazantes están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, 111. Ver también, por ejemplo, Fanger et al. Immunomethods 4:72-81 (1994) y Winter and Harris Im unol Today 14:43-46 (1993) y right et al. Crít. Reviews in Immunol. 12125-168 (1992) y en conexión con (iii) ver por ejemplo, Traunecker et al. Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52 (1992) . Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny et al. J. Immunol. 148 : 1547-1553 (1992) .

Además, "Kappacuerpos" (111. et al. "Design and construction of a hybrid immunoglobulin domain with properties of both heavy and light chain variable regions" Protein Eng 10:949-57 (1997)), "Minicuerpos" (Martin et al . EMBO J. 13:5303-9 (1994), Patente de Estados Unidos No. 5,837,821), "Diacuerpos" (Holliger et al. Proc Nati Acad Sci USA 90:6444-6448 (1993)), o "Janusins" (Traunecker et al. EMBO J. 10:3655-3659 (1991) y Traunecker et al. Int J Cáncer Suppl 7:51-52 (1992)) también se pueden preparar. Ácidos Nucleicos y Folipéptidos En otra modalidad, la presente invención se refiere a secuencias de polinucleótidos y polipéptidos que codifican o representan las moléculas de anticuerpo descritas en la presente. Tales polinucleótidos codifican las regiones tanto variable como constante de cada una de las cadenas pesada y ligera, aunque otras combinaciones también se contemplan por la presente invención de conformidad con las composiciones descritas en la presente. La presente invención también contempla fragmentos de oligonucleótido derivados de las secuencias de ácido nucleico y polinucleótidos descritas complementarias a estos polinucleótidos.

Los polinucleótidos pueden estar en la forma de ARN o ADN. Los polinucleótidos en la forma de ADN, cADN, ADN genómico, análogos de ácido nucleico y ADN sintético están dentro del alcance de la presente invención. El ADN puede ser de cadena doble o cadena única, y si es de cadena única, puede ser la cadena codificante (sentido) o cadena no codificante (anti-sentido) . La secuencia codificante que codifica el polipéptido puede ser idéntica a la secuencia codificante proporcionada en la presente o puede ser una secuencia codificante diferente, la secuencia codificante, como un resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica el mismo polipéptido como el ADN proporcionado en la presente.

En modalidades proporcionadas, los polinucleótidos codifican al menos una región variable de cadena pesada y al menos una región variable de cadena ligera de la presente invención, por ejemplo, como se resume en la Tabla 4.

La presente invención también incluye polinucleótidos variantes que contienen modificaciones tales como supresiones, sustituciones o adiciones de polinucleótido, y cualquier modificación de polinucleótido resultante de la secuencia de polinucleótido variante. Un polinucleótido de la presente invención también puede tener una secuencia codificante que es una variante de la secuencia codificante proporcionada en la presente. Por ejemplo, un polinucleótido variante puede tener al menos 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 97% de identidad con un polinucleótido listado en la Tabla 4. En modalidades, el polinucleótido variante codifica una molécula de anticuerpo anti-GCC.

La presente invención adicionalmente se refiere a polipéptidos que representan los anticuerpos de la presente invención así como también fragmentos, análogos y derivados de tales polipéptidos. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes , polipéptidos naturalmente producidos o polipéptidos sintéticos. El fragmento, derivado o análogos de los polipéptidos de la presente invención pueden ser unos en los cuales uno o más de los residuos aminoácidos se sustituye con un residuo aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un residuo aminoácido conservado) y tal residuo aminoácido sustituido puede o no puede ser uno codificado por el código genético; o puede ser uno en el cual uno o más de los residuos aminoácidos incluye un grupo sustituyente ; o puede ser uno en el cual el polipéptido se fusiona con otro compuesto, tal compuesto incrementa la vida media del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol ) ; o puede ser uno en el cual los aminoácidos adicionales se fusionan al polipéptido, tal como una secuencia guía o secretora o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido o una secuencia de proproteína. Tales fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de la presente invención. En varios aspectos, los polipéptidos de la invención pueden ser producto parcialmente purificado, o purificado.

Un polipéptido de la presente invención puede tener una secuencia de aminoácidos que es idéntica a aquella de los anticuerpos descritos en la presente, por ejemplo, resumidos en las Tablas 2 o 3, o que es diferente por variaciones menores debido a una o más sustituciones de aminoácidos. La variación puede ser un "cambio conservador" típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos, en donde el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares, por ejemplo, remplazo de leucina con isoleucina o treonina con serina; remplazo de lisina con arginina o histidina. En contraste, las variaciones pueden incluir cambios no conservadores, por ejemplo, remplazo de una glicina con un triptofano. Las variaciones menores similares también pueden incluir supresiones o inserciones de aminoácidos o ambas. La guía en la determinación de cuales y cuántos residuos aminoácidos se pueden sustituir, insertar, o suprimir sin cambio de la actividad biológica o inmunológica se puede encontrar usando programas de computadora conocidos en el arte, por ejemplo software DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wis . ) .

En otro aspecto, la invención caracteriza ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que codifican moléculas de anticuerpo anti-GCC. En modalidades, los ácidos nucleicos codifican una o más de una molécula de anticuerpo, una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable de cadena ligera, una región variable de cadena pesada, porciones de las cadenas pesada y cadenas ligera de las moléculas de anticuerpo descritas en la presente (por ejemplo, un fragmento de región variable de cadena ligera el cual cuando es emparejado con una región variable de cadena pesada de longitud completa es enlace de antígeno, o un fragmento de región variable de cadena pesada el cual cuando se empareja con una región variable de cadena ligera de longitud completa es enlace de antígeno), y CDRs . Las modalidades incluyen tales ácidos nucleicos colocados en vectores, por ejemplo, vectores de expresión. Aún adicionalmente , la invención abarca moléculas de anticuerpo producidas por células huéspedes, por ejemplo que expresan las moléculas de anticuerpo codificadas por tales plásmidos.

En una modalidad, se proporciona un vector, por ejemplo, un vector de expresión, que comprende una o ambas de : secuencias que codifican una región variable de cadena ligera, por ejemplo, una región variable de cadena ligera descrita en la Tabla 3, por ejemplo, una secuencia listada en la Tabla 4, un fragmento de enlace de antígeno de la misma, o una, dos o tres CDRs de una cadena ligera (y opcionalmente una región de armazón) , descrita en la presente, por ejemplo, CDRs descritas en la Tabla 5, por ejemplo, una CDR que codifica la secuencia en la Tabla 6; y secuencias que codifican una región variable de cadena pesada, por ejemplo, una región variable de cadena pesada descrita en la Tabla 3, por ejemplo, una secuencia listada en la Tabla 4, un fragmento de enlace de antígeno de la misma, o una, dos o tres CDRs de una cadena pesada (y opcionalmente una región de armazón) , descrita en la presente, por ejemplo, CDRs descritas en la Tabla 5, por ejemplo, una CDR que codifica la secuencia en la Tabla 6.

En modalidades proporcionadas, los polinucleótidos codifican al menos una región variable de cadena pesada o al menos una región variable de cadena ligera de los anticuerpos de la presente invención. En modalidades proporcionadas, los polipéptidos pueden codificar al menos una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera de los anticuerpos de la presente invención.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti-GCC comprende una o ambas de : (a) una región variable de cadena ligera, o un fragmento de enlace de antígeno de la misma, codificada por un ácido nucleico que se híbrida bajo condiciones de severidad seleccionadas con, (i) el complemento de una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 4, o (ii) cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención, por ejemplo, uno de los anticuerpos de conejo referenciados anteriormente resumidos en las Tablas 1 y 2; y (b) una región variable de cadena pesada, o un fragmento de enlace de antígeno de la misma, codificada por un ácido nucleico que se híbrida bajo condiciones de severidad seleccionadas con, (i) el complemento de una secuencia de ácido nucleico que codifica la molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente, por ejemplo, en la Tabla 4, o (ii) cualquier secuencia de ácido nucleico que codifica una cadena pesada de una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención, por ejemplo, uno de los anticuerpos de conejo referenciados anteriormente resumidos en las Tablas 1 y 2.

En una modalidad, las condiciones de severidad seleccionadas son condiciones de alta severidad o muy alta severidad, por ejemplo, como aquellas condiciones descritas en la presente.

La presente invención también proporciona vectores que incluyen los polinucleótidos de la presente invención, células huéspedes las cuales se modifican genéticamente con vectores de la presente invención y la producción de los anticuerpos de la presente invención por técnicas recombinantes .

La secuencia de ADN apropiada se puede insertar en el vector por una variedad de procedimientos. En general, la secuencia de ADN se inserta en sitios de endonucleasa de restricción apropiados por procedimientos conocidos en el arte. La secuencia de polinucleótidos en el vector de expresión se enlaza operativamente a una secuencia de control de expresión apropiada (es decir, promotor) para dirigir la síntesis de mARN. Los ejemplos de tales promotores incluyen, pero no se limitan a, el virus de sarcoma de Rous LTR o el promotor de SV40 temprano o tardío, el lac o trp de E. coli, el promotor PL lambda de fagos y otros promotores conocidos por controlar la expresión de genes en células procariotas (por ejemplo, promotores tac, T3, T7 para E. coli) o eucariotas (por ejemplo, promotor de citomegalovirus , promotor tardío de adenovirus, promotor EF-la) o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de enlace de ribosoma para iniciación de traducción y un terminador de transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión. Por ejemplo, el vector puede contener mejoradores, los cuales son secuencias de ADN estimulantes de transcripción de origen viral, tales como aquellas derivadas de virus de simio tales como SV40, virus de polioma, citomegalovirus, virus de papiloma bovino o virus de sarcoma de Moloney, o de origen genómico. El vector preferiblemente también contiene un origen de replicacion. El vector se puede construir para contener un origen exógeno de replicacion o, tal origen de replicacion se puede derivar de SV40 u otra fuente viral, o por el mecanismo de replicacion cromosomal de célula huésped.

Además, los vectores opcionalmente contienen un gen de marcador para la selección de células huéspedes transíectadas tales como genes de marcador de dihidrofolato reductasa para permitir la selección con metotrexato en una variedad de huéspedes, o antibióticos, tales como genes de beta-lactamasa (resistencia a ampicilina) , genes Tet (para resistencia a tetraciclina) usados en células procariotas o neomicina, GA418 (geneticina, un derivado de neomicina) , gpt (ácido micofenólico) , ampicilina, o genes resistentes a higromicina, o genes los cuales complementan una lesión genética de las células huéspedes tal como la ausencia de timidina cinasa, hipoxantina fosforribosil transferasa, dihidrofolato reductasa, etc. Los genes que codifican el producto genético de marcadores auxotróficos del huésped (por ejemplo, LEU2, URA3 , HIS3) son frecuentemente usados como marcadores seleccionables en levadura.

Para obtener los anticuerpos de la presente invención, una o más secuencias de polinucleótidos que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada y regiones constantes de cadena ligera y pesada de los anticuerpos de la presente invención se deben incorporar en un vector. Las secuencias de polinucleótido que codifican las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos de la presente invención se pueden incorporar en uno o múltiples vectores y luego incorporar en las células huéspedes.

Los vectores de expresión adecuados para la expresión en células de mamíferos incluyen, por ejemplo, pCDM8, pcDNAl .1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5 , pXTl (Stratagene, La Jolla, Calif.), pCDEF3 (Goldman, L. A. , et al., Biotechniques, 21:1013-1015 (1996)), pSVSPORT (GIBCO división de Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, Calif.), pEF-Bos (Mizushima, S., et al., Nucleic Acids Res., 18:5322 (1990)), Bicistronic GPEX® Retrovector (Gala Biotech, Middleton, Wis.) y similares. Los vectores de expresión los cuales son adecuados para el uso en varios huéspedes de expresión, tales como células procariotas (E. coli) , células de insecto (células S2 de Schnieder Drosophila , Sf9) y levadura (P. methanolica , P. pastoris, S. cerevisíae) también están disponibles. Los vectores ejemplares son pLKTO 58 (secuencia de Fe de IgGl tipo silvestre) y pLKTOK59 (secuencia de Fe de IgGl mutada) (ver publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos no. 20060147445) .

Como se apreciará, los anticuerpos de conformidad con la presente invención se pueden expresar en líneas celulares diferentes de líneas celulares de hibridoma. Las secuencias que codifican los cADNs o clones genómicos para los anticuerpos particulares se pueden usar para unas células huéspedes de mamífero o no mamífero adecuadas. La transformación puede ser por cualquier método conocido para introducir polinucleótidos en una célula huésped, incluyendo, por ejemplo, empaquetar el polinucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducir una célula huésped con el virus (o vector) o por procedimientos de transfeccion conocidos en el arte, para introducir polinucleótidos heterólogos en células de mamífero, por ejemplo, transfeccion mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfeccion mediada por polibreno, fusión de protoplastos , electroporación, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas y microinyeccion directa de la molécula de ADN. El procedimiento de transformación usado depende del huésped a ser transformado. Los métodos para introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen en el arte e incluyen, pero no se limitan a, transfeccion mediada por dextrano, precipitación de fosfato de calcio, transfeccion mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, bombardeo de partículas, encapsulación de los polinucleótidos en liposomas, conjugados de péptidos, dendrímeros, y microinyeccion directa del ADN en núcleos.

En otro aspecto, la invención caracteriza, una célula huésped que comprende un ácido nucleico descrito en la presente. En modalidades, la célula expresa una molécula de anticuerpo, o componente de la misma, descrita en la presente. Una modalidad aún adicional proporciona un método para producir una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente, por ejemplo una molécula de anticuerpo de conejo, o una versión humanizada de la misma, que comprende mantener la célula huésped bajo condiciones apropiadas para expresión, por lo cual las cadenas de inmunoglobulina se expresan y se produce una molécula de anticuerpo. Una modalidad adicional proporciona una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión anteriores que codifican las secuencias de anticuerpo de cadena pesada y ligera. La célula huésped puede ser una célula eucariota, por ejemplo, una célula de mamífero, una célula de insecto, una célula de levadura, o una célula procariota, por ejemplo, E. coli. Por ejemplo, la célula de mamífero puede ser una célula cultivada o una línea celular. Las células de mamífero ejemplares incluyen líneas celulares linfocíticas (por ejemplo, NSO) , células de ovarios de hámster chino (CHO) , células COS. En una modalidad particular, la célula huésped cultivada es una célula CHO que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican una molécula de anticuerpo MIL-44-148-2. En otra modalidad, la célula huésped es Hibridoma MIL-44-148-2 (PTA-8132) . Adicionalmente , las células incluyen células de ovocitos, y células de un animal transgénico, por ejemplo, célula epitelial mamaria. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican una molécula de anticuerpo descrita en la presente se pueden expresar en un animal no humano transgénico.

Las líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para expresión se conocen en el arte e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC) , incluyendo pero no limitado a células de ovarios de hámster chino (CHO) , células NSO, células HeLa, células de riñon de hámster bebé (BHK) , células de riñon de mono (COS) , células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) , y un número de otras líneas celulares. Las células no de mamífero, incluyendo pero no limitado a, bacterianas, de levadura, insecto, y plantas también se pueden usar para expresar anticuerpos recombinantes . La mutagénesis dirigida al sitio del dominio de CH2 de anticuerpo para eliminar la glicosilación se puede preferir para prevenir cambios en la inmunogenicidad, farmacocinética, y/o funciones efectoras resultantes de la glicosilación no humana. Los métodos de expresión se seleccionan determinando cual sistema genera los niveles de expresión más altos y produce anticuerpos con propiedades de enlace de GCC constitutivas.

Una modalidad aún adicional proporciona un método para producir una molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, una molécula de anticuerpo de conejo o una versión humanizada de la misma, que comprende mantener la célula huésped que comprende ácidos nucleicos descritos en la presente, por ejemplo, una o más secuencias de ácido nucleico listadas en la Tabla 4 o 6, bajo condiciones apropiadas para la expresión de una inmunoglobulina, por lo cual las cadenas de inmunoglobulina se expresan y se produce una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una molécula de anticuerpo de conejo, o una versión humanizada de la misma, que enlaza GCC, o un fragmento o variante de la misma. Por ejemplo, los métodos de expresión de moléculas de anticuerpo incluyen el uso de células huéspedes en donde una primera molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una cadena ligera de anticuerpo de conejo o una versión humanizada de la misma, y una segunda molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una molécula de anticuerpo, por ejemplo, una cadena pesada de anticuerpo de conejo o una versión humanizada de la misma, están comprendidas en un vector de expresión único. En otras modalidades, están en vectores separados. El método puede comprender adicionalmente la etapa de aislar o recuperar el anticuerpo, fragmento de enlace de antígeno de un anticuerpo, cadena de anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno de una cadena de anticuerpo, si se desea.

Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico (es decir, una o más moléculas de ácido nucleico) que codifica las cadenas pesada y ligera de un anticuerpo de conejo (o humanizado) que enlaza una proteína GCC, o un constructo de expresión (es decir, uno o más constructos) que comprende tales moléculas de ácido nucleico, se puede introducir en una célula huésped adecuada para crear una célula huésped recom inante usando cualquier método apropiado a la célula huésped seleccionada (por ejemplo, transformación, transíección, electroporación, infección) , de modo que las moléculas de ácido nucleico se enlazan operativamente a uno o más elementos de control de expresión (por ejemplo, en un vector, en un constructo creado por procesos en la célula, integrados en el genoma de célula huésped) . La célula huésped recombinante resultante se puede mantener bajo condiciones adecuadas para la expresión (por ejemplo, en la presencia de un inductor, en un animal no humano adecuado, en medios de cultivo adecuados suplementados con sales apropiadas, factores de crecimiento, antibióticos, suplementos nutricionales , etc.), por lo cual los polipéptidos codificados se producen. Si se desea, la proteína codificada se puede aislar o recuperar (por ejemplo, del animal, la célula huésped, medio, leche) . Este proceso abarca la expresión en una célula huésped de un animal no humano transgénico (ver, por ejemplo, WO 92/03918, GenPharm International) o planta.

Además, la expresión de anticuerpos de la invención (u otras porciones de los mismos) de producción de líneas celulares se puede mejorar usando un número de técnicas conocidas. Por ejemplo, los sistemas de expresión de gen DHFR y glutamina sintetasa son procedimientos comunes para mejorar la expresión bajo ciertas condiciones. Los clones de células de alta expresión se pueden identificar usando técnicas convencionales, tal como clonación por dilución limitada, tecnología Microdrop, o cualquier otro método conocido en el arte. El sistema GS se discute por completo o en parte en conexión con las Patentes Europeas Nos. 0 216 846, 0 256 055, y 0 323 997 y Solicitud de Patente Europea No. 89303964.4.

En un sistema ejemplar para expresión recombinante de un anticuerpo modificado, o porción de enlace de antígeno del mismo, de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada de anticuerpo como la cadena ligera de anticuerpo se introduce en células dhfr-CHO por transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante , los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo son cada uno operativamente enlazados a elementos regulatorios de mej orador/promotor (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tal como un elemento regulatorio de mejorador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulatorio de mejorador de SV40/promotor de AdMLP) para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen de DHF , el cual permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando amplificación/selección con metotrexato. Las células huéspedes transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera de anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Las técnicas de biología molecular estándares se usan para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células huéspedes, seleccionar los transformantes, cultivar las células huéspedes y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.

Los anticuerpos de la invención también se pueden producir transgénicamente mediante la generación de un mamífero o planta que es transgénico para las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de interés y producción del anticuerpo en una forma recuperable del mismo. En conexión con la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos se pueden producir en, y recuperar de, la leche de cabras, vacas, u otros mamíferos. Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5, 750, 172, y 5, 741, 957.

Los anticuerpos, fragmentos de enlace de antígeno, cadenas de anticuerpo y porciones de enlace de antígeno de los mismos descritos en la presente también se pueden producir en un sistema de expresión in vitro adecuado, por síntesis química o por cualquier otro método adecuado.

Proteínas de Fusión e Inmunoconjugados Los anticuerpos anti-GCC descritos en la presente se pueden enlazar funcionalmente por cualquier método adecuado (por ejemplo, acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares no de anticuerpo.

Se pueden producir proteínas de fusión en las cuales una molécula de anticuerpo anti-GCC como se describe en la presente y una porción no de anticuerpo son componentes de una cadena de polipéptido continua única. La porción no de anticuerpo se puede ubicar N-terminalmente , C-terminalmente , o internamente, con respecto a la porción de anticuerpo. Por ejemplo, algunas modalidades se pueden producir por la inserción de unas secuencias de inmunoglob lina que codifican ácido nucleico en un vector de expresión adecuado, tal como un vector pET (por ejemplo, pET-15b, Novagen) , un vector de fagos (por ejemplo, pCNATAB 5 E, Pharmacia) , u otro vector, por ejemplo, vector de fusión de proteína A pRIT2T, Pharmacia) . El constructo resultante se puede expresar para producir cadenas de anticuerpo que comprenden una porción no de anticuerpo (por ejemplo, marca de histidina, marca E, o dominio de enlace de IgG de Proteína A) . Las proteínas de fusión se pueden aislar o recuperar usando cualquier técnica adecuada, tal como cromatografía usando una matriz de afinidad adecuada (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M et al., eds., Vol . 2, Suppl . 26, pp. 16.4.1-16.7.8 (1991)).

La invención proporciona moléculas de anticuerpo anti-GCC las cuales se dirigen a y, en modalidades, se internalizan en células. Son capaces de suministrar agentes terapéuticos o agentes detectables a o en células que expresan GCC, pero no a o en células donde el objetivo no se expresa. Por consiguiente, la invención también proporciona inmunoconjugados ant i -GCC que comprenden una molécula de anticuerpo anti-GCC como se describe en la presente, que se conjuga a un agente terapéutico o un agente detectable. En modalidades, la afinidad para GCC de un inmunoconjugado anti-GCC es al menos 10, 25, 50, 75, 80, 90, o 95% de aquella para el anticuerpo no conjugado. Esto se puede determinar usando la GCC de superficie celular o GCC aislada. En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti-GCC, por ejemplo, un inmunoconj ugado , tiene una LD50, como se determina por un ensayo descrito en la presente, menor que 1,000, 500, 250, 100, o 50 pM.

La molécula de anticuerpo anti-GCC se puede modificar para actuar como un inmunoconjugado utilizando técnicas que son conocidas en el arte. Ver por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993) . Ver también Patente de Estados Unidos No. 5,194,594. La preparación de anticuerpos radioetiquetados también se puede preparar fácilmente utilizando técnicas que son conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Junghans et al. in Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds . , Lippincott Raven (1996)) . Ver también Patentes de Estados Unidos Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (Patente de Estados Unidos Re. No. 35,500), 5,648,471, y 5, 697, 902.

En algunas modalidades, la molécula de anticuerpo y porción no de anticuerpo se conectan por medio de un enlazante. En tales modalidades, el inmunoconjugado se representa por la fórmula (I): en donde , Ab es una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente; X es una porción la cual conecta Ab y Z, por ejemplo, el residuo de un enlazante descrito en la presente después del enlace covalente a uno o ambos de Ab y Z; Z es una etiqueta o agente terapéutico; y m varía desde aproximadamente 1 a aproximadamente 15.

La variable m representa el número de --X—Z porciones por molécula de anticuerpo en un inmunocon ugado de la fórmula (I) . En varias modalidades, m varía desde 1 a 15, 1 a 10, 1 a 9, 1 a 8, 1 a 7, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, 1 a 3, o 1 a 2. En algunas modalidades, m varía desde 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4 o 2 a 3. En otras modalidades, m es 1, 2, 3, 4, 5 o 6. En composiciones que comprenden una pluralidad de inmunoconjugados de la fórmula (I) , m es el número promedio de --X--Z porciones por Ab, también referido como la carga de fármaco promedio. La carga de fármaco promedio puede variar desde 1 a aproximadamente 15 -X—Z porciones por Ab. En algunas modalidades, cuando m representa la carga de fármaco promedio, m es aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5 , aproximadamente 6 , aproximadamente 7 , o aproximadamente 8. En modalidades ejemplares, m es desde aproximadamente 2 a apro imadamente 8. En una modalidad, m es aproximadamente 8. En otra modalidad, m es aproximadamente 4. En otra modalidad, m es aproximadamente 2.

El número promedio de --X--Z porciones por Ab se puede caracterizar por medios convencionales tales como espectroscopia de masas, ensayo ELISA, y HPLC. La distribución cuantitativa de inmunoconjugados en términos de m también se puede determinar. En algunos casos, la separación, purificación, y caracterización de inmunoconjugados homogéneos donde mes un cierto valor, como se distingue de inmunoconj ugados con otras cargas de fármaco, se pueden lograr por medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis .

Los inmunoconjugados de la fórmula (I) pueden existir como mezclas, en donde cada componente de la mezcla tiene un valor m diferente. Por ejemplo, un inmunoconjugado de la fórmula (I) puede existir como una mezcla de dos componentes de inmunoconjugado separados: un componente de inmunoconjugado en donde m es 7, y el otro componente de inmunoconjugado en donde m es 8.

En una modalidad, el inmunoconjugado de la fórmula (I) existe como una mezcla de tres inmunoconjugados separados en donde m para los tres inmunoconjugados separados es 1, 2, y 3, respectivamente; 3, 4, y 5, respectivamente; 5, 6, y 7, respectivamente; 7, 8, y 9, respectivamente; 9, 10, y 11, respectivamente; 11, 12, y 13 , respectivamente; o 13, 14, y 15, respectivamente.

Una variedad de enlazantes adecuados (por ejemplo, reactivos heterobifuncionales para conectar una molécula de anticuerpo a una etiqueta o agente terapéutico) y métodos para preparar inmunoconjugados son conocidos en el arte. (Ver, por ejemplo, Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992)). El enlazante se puede escindir, por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas, por ejemplo, bajo condiciones intracelulares , de modo que la escisión del enlazante libera el fármaco (es decir, agente terapéutico o etiqueta) en el ambiente intracelular . En otras modalidades, el enlazante no es escindible, y el fármaco se libera, por ejemplo, por degradación del anticuerpo.

El enlazante se puede unir a un grupo químicamente reactivo en la porción de anticuerpo, por ejemplo, a un grupo amino, imino, hidroxilo, tiol o carboxilo libre (por ejemplo, al N- o C-término, al grupo amino epsilon de uno o más residuos lisina, el grupo ácido carboxílico libre de uno o más residuos ácido aspártico o ácido glutámico, o al grupo sulfhidrilo de uno o más residuos cisteinilo) . El sitio al cual el enlazante se une puede ser un residuo natural en la secuencia de aminoácidos de la porción de anticuerpo o se puede introducir en la porción de anticuerpo, por ejemplo, por tecnología de ADN recombinante (por ejemplo, introduciendo un sitio de escisión de proteasa o cisteína en la secuencia de aminoácidos) o por bioquímica de proteína (por ejemplo, reducción, ajuste de pH o proteólisis) .

Uno de los métodos no específicos más comúnmente usados de unión covalente es la reacción de carbodiimida para enlazar un grupo carboxi (o amino) de un compuesto a grupos amino (o carboxi) de la molécula de anticuerpo. Adicionalmente , los agentes bifuncionales tales como dialdehídos o imidoésteres se han usado para enlazar el grupo amino de un compuesto a grupos amino de una molécula de anticuerpo. También disponible para la unión de fármaco (es decir, agente terapéutico o etiqueta) a moléculas de anticuerpo está la reacción de basa de Schiff. Este método involucra la oxidación de peryodato de un fármaco que contiene grupos hidroxi o glicol, formando así un aldehido el cual luego se hace reaccionar con la molécula de anticuerpo. La unión ocurre vía la formulación de una base de Schiff con grupos amino de la molécula de anticuerpo. Los isotiocianatos también se pueden usar como agentes de acoplamiento para unir covalentemente fármacos a la molécula de anticuerpo. Otras técnicas son conocidas por el artesano experto y dentro del alcance de la presente invención.

En ciertas modalidades, un intermediario, el cual es el precursor del enlazante (X) , se hace reaccionar con el fármaco (Z) bajo condiciones apropiadas. En ciertas modalidades, los grupos reactivos se usan en el fármaco y/o el intermediario. El producto de la reacción entre el fármaco (es decir, agente terapéutico o etiqueta) y el intermediario, o el fármaco derivado, se hace reaccionar subsecuentemente con la molécula de anticuerpo bajo condiciones apropiadas.

El inmunoconjugado se puede purificar de reactivos empleando metodologías bien conocidas por aquellos de experiencia en el arte, por ejemplo, cromatografía de columna (por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración en gel, cromatografía por interacción hidrofóbica) , diálisis, diafiltración o precipitación. El inmunoconjugado se puede evaluar empleando metodologías bien conocidas por aquellos expertos en el arte, por ejemplo, SDS-PAGE, espectroscopia de masas, o electroforesis capilar.

En algunas modalidades, el enlazante es escindible por un agente de escisión que está presente en el ambiente intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola) . El enlazante puede ser, por ejemplo, un enlazante de peptidilo que se escinde por una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluyendo, pero no limitado a, proteasa lisosomal o endosomal . En algunas modalidades, el enlazante de peptidilo es de al menos dos aminoácidos de largo o al menos tres aminoácidos de largo. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todas las cuales son conocidas para hidrolizar los derivados de fármaco de dipéptido resultando en la liberación de fármaco activo (es decir, agente terapéutico o etiqueta) dentro de las células objetivo (ver, por ejemplo, Dubowchik and alker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Los más típicos son los enlazantes de peptidilo que son escindibles por enzimas que están presentes en células que expresan GCC. Por ejemplo, un enlazante de peptidilo que es escindible por la proteasa catepsina B dependiente de tiol, la cual es altamente expresada en tejido canceroso, se puede usar (por ejemplo, un enlazante de Phe-Leu o Gly-Phe-Leu-Gly (SEC ID NO:319)). Otros ejemplos de tales enlazantes se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 6,214,345, incorporada en la presente para referencia en su totalidad y para todo propósito. En una modalidad específica, el enlazante de peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un enlazante de Val-Cit o un enlazante de Phe-Lys (ver, por ejemplo. Patente de Estados Unidos No. 6,214,345, la cual describe la síntesis de doxorrubicina con el enlazante de val-cit) . Una ventaja de usar la liberación proteolítica intracelular del fármaco (es decir, agente terapéutico o etiqueta) es que el fármaco típicamente se atenúa cuando se conjuga y las estabilidades en suero de los conjugados típicamente son altas.

En otras modalidades, el enlazante escindible es de pH sensible, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Típicamente, el enlazante de pH sensible es hidrolizable bajo condiciones ácidas. Por ejemplo, se puede usar un enlazante lábil ácido que es hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal , o similares) . (Ver, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos Nos. 5,122,368; 5,824,805; 5,622,929; Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661). Tales enlazantes son relativamente estables bajo condiciones de pH neutro, tales como aquellas en la sangre, pero son inestables a pH inferior de 5.5 o 5.0, el pH aproximado del lisosoma. En ciertas modalidades, el enlazante hidrolizable es un enlazante de tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter unido al agente terapéutico vía un enlace de acilhidrazona (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos No. 5,622,929).

En todavía otras modalidades, el enlazante es escindible bajo condiciones de reducción (por ejemplo, un enlazante de disulfuro) . Una variedad de enlazantes de disulfuro se conocen en el arte, incluyendo, por ejemplo, aquellos que se pueden formar usando SATA (N-succinimidil-5-acetiltioacetato) , SPDP (N-succinimidil-3 - (2-piridilditio) propionato) , SPDB (N-succinimidil-3- (2-piridilditio) butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa- (2 -piridil -ditio) tolueno) - , SPDB y SMPT (Ver, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cáncer Res. 47:5924-5931; Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates : Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cáncer (C. W. Vogel ed. , Oxford U. Press, 1987. Ver también Patente de Estados Unidos No. 4, 880, 935) .

En todavía otras modalidades específicas, el enlazante es un enlazante de malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93), un enlazante de maleimidobenzoilo (Lau et al., 1995, Bioorg Med. Chem. 3 (10) : 1299-1304) , o un análogo de 31 -N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg- ed-Chem. 3 (10) : 1305-12) .

En todavía otras modal idade, la unidad enlazante no es escindible y el fármaco (es decir, agente terapéutico o etiqueta) se libera por degradación del anticuerpo. (Ver por ejemplo, Publicación de Estados Unidos No. 20050238649 incorporada para referencia en la presente en su totalidad y para todo propósito) .

Típicamente, el enlazante no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular . Como se usa en la presente, "no sustancialmente sensible al ambiente extracelular", en el contexto de un enlazante, significa que no más de aproximadamente 20%, típicamente no más de aproximadamente 15%, más típicamente no más de aproximadamente 10%, y aún más típicamente no más de aproximadamente 5%, no más de aproximadamente 3%, o no más de aproximadamente 1% de los enlazantes, en una muestra de inmunoconjugado, se escinden cuando el inmunoconj gado presente en un ambiente extracelular (por ejemplo, en plasma) . Si un enlazante no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular se puede determinar, por ejemplo, por incubación con plasma del inmunoconjugado por un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8, 16, o 24 horas) y luego cuantificando la cantidad de fármaco libre presente en el plasma.

En otras modalidades no mutuamente exclusivas, el enlazante promueve la internalización celular cuando se conjuga al agente terapéutico o etiqueta (Z) . En todavía otras modalidades, el enlazante promueve la internalización celular cuando se conjuga tanto a la porción Z como a la molécula de anticuerpo anti-GCC.

Una variedad de enlazantes ejemplares que se pueden usar con las presentes composiciones y métodos se describen en WO 2004-010957, Publicación de Estados Unidos No. 20060074008, Publicación de Estados Unidos No. 20050238649, y Publicación de Estados Unidos No. 20060024317 (cada una de las cuales se incorpora para referencia en la presente en su totalidad y para todo propósito) .

Los ejemplos de enlazantes capaces de ser usados para acoplar una molécula de anticuerpo a un agente terapéutico o etiqueta incluyen, por ejemplo, maleimidocaproilo (me) ; maleimidocaproil-p-aminobencilcarbamato; enlazantes de maleimidocaproil-péptido-aminobencilcarbamato, por ejemplo, maleimidocaproil-L-fenilalanina-L-lisina-p-aminobencilcarbamato y maleimidocaproil-L-valina-L-citrulina-p-aminobencilcarbamato (ve); N-succinimidil 3- (2-piridilditio) proprionato (también conocido como N-succinimidil 4- (2-piridilditio) entanoato o SPP) ; 4-succinimidil-oxicarbonil-2-metil-2- (2-piridilditio) -tolueno (SMPT) ; N-succinimidil 3- (2-piridilditio) ropionato (SPDP) ; N-succinimidil 4 - (2 -piridilditio) butirato (SPDB) ; 2-iminotiolano; anhídrido S-acetilsuccínico; disulfuro bencil carbamato; carbonato; enlazantes de hidrazona; éster de N- ( -Maleimidoacetoxi ) succinimida ; N- [4- (p- Azidosalicilamido) butil] -31 - (21 -piridilditio) propionamida (AMAS); éster de N- [ .beta. -Maleimidopropiloxi] succinimida (BMPS) ; éster de [N- e -Maleimidocaproiloxi] succinimida (EMCS) ; éster de N- [?-Maleimidobutiriloxi] succinimida (GMBS) ; Succinimidil-4- [N-Maleimidometil] ciclohexano- 1-carboxi- [6-amidocaproato] (LC-SMCC) ; Succinimidil 6 -( 3 - [2 -piridilditio] - propionamido) hexanoato (LC-SPDP) ; éster de m- Maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS) ; N- Succinimidil [4 -yodoacet il] aminobenzoato (SIAB) ; Succinimidil 4- [N-maleimidometil] ciclohexano- 1-carboxi lato (S CC) ; N-Succinimidil 3- [2 -piridilditio] -propionamido (SPDP) ; éster de [N- e -Maleimidocaproiloxi] sulfosuccinimida (Sulfo-EMCS) ; éster de N- [?-Maleimidobutiriloxi] sulfosuccinimida (Sulfo-GMBS) ; 4-Sulfosuccinimidil-6-metil-oí- (2-piridilditio) toluamido] hexanoato) (Sulfo-LC-SMPT) ; Sulfosuccinimidil 6- (3 ' - [2-piridilditio] -propionamido) hexanoato (Sulfo-LC-SPDP) ; éster de m-Maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (Sulfo-MBS) ; N-Sulfosuccinimidil [4-yodoacetil] aminobenzoato (Sulfo-SIAB) ; Sulfosuccinimidil 4- [N-maleimidometil] ciclohexano- 1-carboxilato (Sulfo-SMCC) ; Sulfosuccinimidil 4- [p-maleimidofenil] butirato (Sulfo-SMPB) ; etilenglicol -bis (éster de N-hidroxisuccinimida de ácido succínico) (EGS) ; disuccinimidil tartrato (DST) ; ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano- 1 , 4 , 7 , 10- tetraacético (DOTA); ácido dietilentriamin-pentaacético (DTPA) ; y enlazantes de tiourea.

En algunas modalidades, el agente terapéutico es un agente citostático o citotóxico. Los ejemplos incluyen, sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, azatioprina, 6- mercaptopurina, 6 -tioguanina , fludarrabina , pentostatina, cladribina, 5-fluorouracilo (5FU) , floxurridina (FUDR) , citosina arabinósido (citarrabina) , metotrexato, trimetoprim, pirimetamina, pemetrexed) ; agentes de alquilación (por ejemplo, ciclofosfamida, mecloretamina, uramustina, melfalan, clorambucil, tiotepa/clorambucil , ifosfamida, carmustina, lomustina, estreptozocina , busulfan, dibromomanitol , cisplatina, carboplatina, nedaplatina, oxaliplatina, satraplatina, triplatin tetranitrato, procarbazina, altretamina, dacarbazina, mitozolomida, temozolomida) ; antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina, valrrubicina) ; antibióticos (por ejemplo, dactinomicina, bleomicina, mitramicina, antramicina, estreptozotocina, gramicidina D, mitomicinas (por ejemplo, mitomicina C) , duocarmicinas (por ejemplo, CC-1065) , caliqueamicinas) ; agentes antimitóticos (incluyendo, por ejemplo, maitansinoides , auristatinas , dolastatinas , criptoficinas , vinca alcaloides (por ejemplo, vincristina, vinblastina, vindesina, vinorrelbina) , taxanos (por ejemplo, paclitaxel, docetaxel, o un nuevo taxano (ver, por ejemplo, Publicación de Patente Internacional No. O 01/38318, publicada el 31 de Mayo de 2001)), y colquicinas ; inhibidores de topoisomerasa (por ejemplo, irinotecan, topotecan, amsacrina, etopósido, tenipósido, mitoxantrona) ; e inhibidores de proteasoma (por ejemplo, ácidos peptidil borónicos) .

En algunas modalidades, el agente terapéutico es un maitansinoide . Los compuestos maitansinoides y métodos para su conjugación a anticuerpos se describen, por ejemplo, en Chari et al., Cáncer Res., 52: 127-131 (1992); Widdison et al., J. Med. Chem. 49: 4392-4408 (2006); y Patentes de Estados Unidos Nos. 5,208,020 y 6,333,410. Los ejemplos de maitansinoides incluyen análogos de maitansina que tienen un anillo aromático modificado (por ejemplo, C-19-decloro, C-20-demetoxi, C-20-aciloxi) y aquellos que tienen modificaciones en otras posiciones (por ejemplo, C-9-CH, C-14-alcoximetilo, C-14-hidroximetilo o aciloximetilo, C-15-hidroxi/aciloxi , C-15-metoxi, C-18-N-demetilo, 4,5-desoxi). En ciertas modalidades, el maitansinoide es N. sup .21 -desacetil-N . sup .21 -(4 -mercapto- 1-oxopentil ) maitansina (DM3), N. sup .21 -desacetil-N. sup.2 ' - (3 -mercapto- 1-oxopropil) -maitansina (DM1), o . sup .2 ' -desacetil-N . sup .21 - (4 -mercapto-4 -metil - 1-oxopentil) maitansina (DM4) .

Los compuestos maitansinoides que comprenden un grupo sulfhidrilo se pueden acoplar a anticuerpos usando un enlazante heterobi uncional que se conecta al compuesto maitansinoide por vía de un enlace de tioéter o disulfuro. En algunas modalidades, el enlazante se acopla a un grupo amino en el anticuerpo (por ejemplo, un grupo amino terminal o el grupo amino epsilon de un residuo lisina. En algunas modalidades, el enlazante heterobifuncional que se usa para acoplar un compuesto maitansinoide a un anticuerpo es N-succinimidil 3 - (2 -piridilditio) proprionato (también conocido como N-succinimidil 4- (2-piridilditio) entanoato, o SPP) , 4-succinimidil-oxicarbonil-2-metil-2- (2-piridilditio) -tolueno (SMPT) , N-succinimidil 4 [N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , N-succinimidil 3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) ; N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butirato (SPDB) , 2-iminotiolano, o anhídrido S-acetolsuccínico .

En algunas otras modalidades, el agente terapéutico es una dolastatina. En algunas modalidades, el agente terapéutico es una auristatina, tal como auristatina E (también conocida en el arte como un derivado de dolastatina-10) o un derivado de la misma. Los compuestos auristatina y métodos para su conjugación a anticuerpos se describen, por ejemplo, en Doronina et al., Nature Biotech. , 21: 778-784 (2003) ; Hamblett et al, Clin. Cáncer Res., 10: 7063-7070 (2004) ; Cárter and Senter, Cáncer J. , 14 154-169 (2008); Patentes de Estados Unidos Nos. 7,498,298, 7,091,186, 6,884,869; 6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; y 4,486,414; Publicaciones de Patente de Estados Unidos Nos. 20090010945, 20060074008, 20080300192, 20050009751, 20050238649, y 20030083236; y Publicaciones de Patente Internacional Nos. WO 04/010957 y O 02/088172, cada una de las cuales se incorpora para referencia en la presente en su totalidad y para todo propósito.

La auristatina puede ser, por ejemplo, un éster formado entre auristatina E y un ceto ácido. Por ejemplo, la auristatina E se puede hacer reaccionar con ácido paraacetil benzoico o ácido benzoilvalérico para producir AEB y AEVB, respectivamente. Otras auristatinas típicas incluyen auristatina fenilalanina fenilendiamina (AFP) , monometil auristatina E (MMAE) , y monometil auristatina F (MMAF) .

En algunas modalidades, el agente terapéutico es un radionúclido . Los ejemplos de radionúclidos útiles como toxinas en terapia de radiación incluyen: 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 199Au, 211At, 212Pb y 212B. Otros radionúclidos los cuales se han usado por aquellos que tienen experiencia ordinaria en el arte incluyen: 32P y 33P, 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, 11??9, 119Sb, 121Sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 1910s, 193MPt, 197Hg, todos emisores auger y/o beta negativos. Algunos radionúclidos preferidos incluyen: 90Y, 131I, 211At y 212Pb/212 Bi.

Uno que tiene experiencia ordinaria en el arte puede conjugar una molécula de anticuerpo anti-GCC a un radionúclido usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, Magerstadt, M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Ratón, Fia.,; y Barchel, S. . and Rhodes, B. H. , (1983) Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, N.Y., cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia, enseñan la conjugación de varios radionúclidos terapéuticos y de diagnóstico a aminoácidos de anticuerpos. Tales reacciones se pueden aplicar para conjugar radionúclidos a moléculas de anticuerpo anti-GCC de la invención con enlazante y/o agente quelante apropiado.

Secuencias de Anticuerpo Anti-GCC Los anticuerpos anti-GCC monoclonales de conejo fueron generados por diversos métodos, como se discute con más detalle en los Ejemplos. Brevemente, los anticuerpos monoclonales de conejo MIL-44-148-2 y MIL-44-67-4 fueron generados por tecnología de inmunización tradicional en conejos. Los hibridomas de conejo-conejo verdaderos fueron generados en Epitomics (Burlingame, CA) fusionando células B aisladas de un conejo inmunizado con la línea celular de socio de fusión propiedad de Epitomics (ver Patentes de Estados Unidos 7,402,409; 7,429,487; 7,462,697; 7,575,896; 7,732,168; y 8,062,867). La especificidad de los anticuerpos contra GCC fue probada por ELISA y citometría de flujo (FCM) .

La Tabla 1 a continuación resume los anticuerpos anti-GCC monoclonales de conejo de la invención generados usando el inmunógeno hGCC (ECD) /mIgG2a FcR-mutlI.

Las secuencias de las regiones variables de cadena ligera y pesada fueron determinadas. La Tabla 2 a continuación es un resumen de las SEC ID NOs para las regiones variables de diversos anticuerpos. Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico para las regiones variables de cada una de las cadenas pesada y ligera para anticuerpos anti-GCC de conejo se muestran en las Tablas 3 y 4, respectivamente .

Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico para cada una de las CDRs de las cadenas pesada y ligera para anticuerpos anti-GCC se muestran en las Tablas 5 y 6, respectivamente .

La secuenciación de las CDRs permitió la determinación de la abundancia de residuos que pueden servir como sitios de conjugación de toxina. Por ejemplo, una cisteína libre no emparejada en la región de enlace de antígeno podría ser un sitio para la conjugación de auristatina y una lisina podría ser un sitio para la conjugación de maitansina. La conjugación de toxina a un aminoácido de la CDR elevaría el interés de la alteración de la afinidad de enlace del anticuerpo a GCC. Por consiguiente, en modalidades las CDRs carecen de un aminoácido el cual se puede conjugar a un agente terapéutico.

Tabla 1 : Resumen de SEC ID NOs para cadenas pesada y ligera de mAbs de conejo anti-GCC Ácido Nucleico MIL-44-148-2 H2 (SEC ID NO: 4) ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGT CAGTGAAGGAGTCCGGGGGAGGCCTCTTCAAGCCAACGGATACCCTGACACTCACCTGCAC CGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGTCATAGAATGAACTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAG GGGCTGGAATGGATCGCAATCATTACTCATAATAGTATCACATACTACGCGAGCTGGGCGA AAAGCCGATCCACCATCACCAGAAACACCAGCGAGAACACGGTGACTCTGAAAATGACCAG TCTGACAGCCGCGGACACGGCCACTTATTTCTGTGCCAGAGAGGATAGTATGGGGTATTAT TTTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCT CCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTG GAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGC CTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACG TGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAA GCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGC CCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCC ATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCAC TCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGT CTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATG ATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGG ACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAA GCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCAC GAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGA Aminoácido MIL-44-148-2 H2 (SEC ID NO: 42) METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVKESGGGLFKPTDTLTLTCTVSGFSLSSHRMNWVRQTPGK GLEWIAI ITHNSITYYASWAKSRSTITR TSENTVTLKJ TSLTAADTATYFCAREDSMGYY FDLWGPGTLVTISSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLT GVRTFPSVRQSSGLYSLSSWSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPP ELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLRE QQFNSTIRWSTLPIAHQD LRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPP REELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTS EWQRGDVFTCSV HEALHNHYTQKS ISRSPGK Ácido Nucleico MIL-44-148-2 L5 (SEC ID NO: 5) ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCA GATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGT CACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAA CCAGGGCAGTCTCCCAAGCCCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCAT CGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGGCGTGGAGTG TGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAGCAGACTTATACTAATAATCATCTTGATAATGGT TTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTG GAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGA GGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCA GATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACA AAGAGTACACCTGCAGGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGG TGACTGTTAG Aminoácido MIL-44-148-2 L5 (SEC ID NO: 43) MDTRAPTQLLGLLLL LPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSISNWLAWYQQK PGQSPKPLIYRASTLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQTYTNNHLDNG FGGGTEVWKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGI ENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCRVTQGTTSWQSFNRGDC Ácido Nucleico MIL-44-67-4 H2 (SEC ID NO: 6) ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGT CGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCAC AGCCTCTGGATCCGACATCAGTAACTATGCAATATCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAG GGGCTGGAATTCATCGGATATATTAGTTATGGTAAAAGTATATACTACGCGAGCTGGGCGA AAGGCCGGTTCGCCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGGAAATCACCAGTCC GACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTTTGTGCCAGAGAGGATAGTGCTACTTATAGTCCT AACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCT CCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTG GAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGC CTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACG TGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAA GCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGC CCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCC ATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCAC TCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGT CTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATG ATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGG ACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAA GCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCAC GAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGA Aminoácido IL-44-67-4 H2 (SEC ID NO: 44) METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGSDISNYAIS VRQAPGK GLEFIGYISYGKSIYYASWAKGRFAISKTSSTTVDLEITSPTTEDTATYFCAREDSATYSP NLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTW SGTLTN GVRTFPSVRQSSGLYSLSSWSVTSSSQPVTCNVAHPATNT VDKTVAPSTCSKPTCPPPE LLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQ QFNSTIRWSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPR EELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVE EKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSE WQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK Ácido Nucleico MIL-44-67-4 L4 (SEC ID NO: 7) ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCA GATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGT CACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGTATTAACACCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAA CCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCAT CGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTG TGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTTATAATAATCTTGATCGTGCT TTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCACA GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTG GAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGA GGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCA GATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACA AAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGG TGACTGTTAG Aminoácido MIL-44-67-4 L4 (SEC ID NO: 45) MDTRAPTQLLGLLLL LPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTVTIKCQASQSINTYLAWYQQK PGQRPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISGVECADAATYYCQQGYSYNNLDRA FGGGTEVWTGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGI ENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSWQSFNRGDC Tabla 2 : Resumen de SEC ID NOs para regiones variables de mAbs de conejo anti-GCC Tabla 3 : Secuencias de Aminoácidos de regiones variables de mAb de mAbs de conejo anti-GCC Tabla 4 : Secuencias de Ácido Nucleico de regiones variables de mAb de mAbs de conejo anti-GCC Tabla 5: Secuencias de Aminoácidos de CDRs de mAbs de conejo anti-GCC Tabla 6 : Secuencias de Ácido Nucleico de CDRs de mAbs de conejo anti-GCC Usos Terapéuticos Las moléculas de anticuerpo anti-GCC monoclonales de conejo descritas en la presente tienen utilidades in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas de anticuerpo se pueden administrar a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o administrar en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar y/o prevenir, una variedad de trastornos. En ciertas modalidades de las aplicaciones terapéuticas de la invención, las moléculas de anticuerpo anti-GCC monoclonales de conejo de la invención son humanizadas, usando una o más técnicas descritas anteriormente en la presente.

Las moléculas de anticuerpo, inmunoconjugados , y proteínas de fusión descritos en la presente se pueden usar para modular una actividad o función de una proteína GCC, tal como enlace de ligando (por ejemplo, enlace de ST o guanilina) , transducción de señal mediada por GCC, mantenimiento de fluido intestinal, homeóstasis de electrolitos, liberación de calcio intracelular (flujo de calcio) , diferenciación celular, proliferación celular, o activación celular.

En un aspecto, la invención caracteriza un método para acabar, inhibir o modular el crecimiento de, o interferir con el metabolismo de, una célula que expresa GCC. En una modalidad, la invención proporciona un método para inhibir la señalización celular mediada por GCC o un método para matar una célula. El método se puede usar con cualquier célula o tejido que expresa GCC, tal como una célula cancerosa. Los ejemplos de células cancerosas las cuales expresan GCC incluyen, pero no se limitan a, una célula de un cáncer de origen gastrointestinal (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer estomacal, cáncer de intestino delgado, o cáncer esofágico) , cáncer pancreático, cáncer de pulmón (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma) , sarcomas de tejido blando tales como leiosacroma o rabdomiosarcoma, tumores neuroendocrinos gastrointestinales o broncopulmonares , o tumores neuroetodérmicos , o cualquier lesión metastásica de los mismos. Los ejemplos no limitantes de células que expresan GCC incluyen células de adenocarcinoma colónico humano T84 , células de tumor colónico congeladas o frescas, y células que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica GCC o una porción de la misma.

Los métodos de la invención incluyen las etapas de poner en contacto la célula con una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma, como se describe en la presente, en una cantidad efectiva, es decir, cantidad suficiente para inhibir la señalización celular mediada por GCC o una cantidad suficiente para matar la célula. El método se puede usar en células en cultivo, por ejemplo, in vitro, in vivo, ex vivo, o in situ. Por ejemplo, las células que expresan GCC (por ejemplo, células colectadas por biopsia de un tumor o lesión metastásica ; células de una línea celular de cáncer establecida; o células recombinantes) , se pueden cultivar in vitro en medio de cultivo y la etapa de contacto se puede efectuar agregando la molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado al medio de cultivo. En los métodos para matar una célula, el método comprende usar una molécula de anticuerpo anti-GCC desnudo, o un inmunoconjugado que comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC y un agente citotóxico. El método resultará en la aniquilación de células que expresan GCC, incluyendo en particular células de tumor que expresan GCC (por ejemplo, células de tumor colónico) .

Los anticuerpos monoclonales de conejo de la invención, o versiones humanizadas de los mismos, se pueden probar para internalización celular después del enlace a GCC usando técnicas de microscopía de inmunofluorescencia bien conocidas por aquellos expertos en el arte. Tales anticuerpos que se confirma que se internalizan serían útiles cuando enlazan una porción citotóxica para propósitos terapéuticos, o una porción para imágenes de células. Los anticuerpos los cuales no se internalizan aún se pueden usar para propósitos de diagnóstico o para métodos terapéuticos que usan anticuerpo desnudo diseñados para provocar una respuesta citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpo, o quizás para métodos de suministro de liposoma.

Las moléculas de anticuerpo anti-GCC de la presente invención enlazan dominios extracelulares de GCC o porciones de la misma en células que expresan el antígeno. Como un resultado, cuando se practican los métodos de la presente invención para matar, suprimir, o detectar células cancerosas, los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno, enlazan todas las células, no solamente las células las cuales son fijas o células cuyos dominios antigénicos intracelulares son de otra manera expuestos al ambiente extracelular . En consecuencia, el enlace de los anticuerpos o fragmentos de enlace de antígeno, se concentra en áreas donde hay células que expresan GCC, sin considerar si estas células son fijas o no fijas, viables o necróticas. Adicionalmente o alternativamente, las moléculas de anticuerpo anti-GCC, enlazan y se internalizan con GCC en el enlace de células que expresan el antígeno.

El método también se puede realizar en células presentes en un sujeto, como parte de un protocolo in vivo. En una modalidad, el sujeto es un sujeto humano.

Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa un antígeno de GCC con el cual reacciona cruzado una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente. Una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma se puede administrar a un sujeto humano para propósitos terapéuticos. Una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado también se puede administrar a un mamífero no humano que expresa el antígeno tipo GCC con el cual reacciona cruzado el anticuerpo (por ejemplo, un primate, cerdo o ratón) para propósitos veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Los modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de anticuerpos de la invención (por ejemplo, prueba de dosificaciones y transcursos de tiempo de administración) . Para modalidades in vivo, la etapa de contacto se efectúa en un sujeto e incluye la administración de una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma al sujeto bajo condiciones efectivas para permitir tanto el enlace de la molécula de anticuerpo como el dominio extracelular de GCC expresada en la célula, y el tratamiento de la célula.

En una modalidad, la invención proporciona un método para tratar cáncer administrando una molécula de anticuerpo anti-GCC o un inmunoconjugado que comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC y un agente citotóxico a un paciente en necesidad de tal tratamiento. El método se puede usar para el tratamiento de cualquier trastorno canceroso el cual incluye al menos algunas células que expresan el antígeno de GCC. Como se usa en la presente, el término "cáncer" se entiende que incluye todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células transformadas de manera maligna, tejidos, u órganos, sin considerar el tipo histopatológico o etapa de invasividad. Los términos "cáncer" y "tumor" se pueden usar intercambiablemente (por ejemplo, cuando se usan en el contexto de métodos de tratamiento, "tratamiento de un cáncer" y "tratamiento de un tumor" tienen el mismo significado) .

En modalidades, el tratamiento es suficiente para reducir o inhibir el crecimiento del tumor del sujeto, reducir el número o tamaño de lesiones metastásicas , reducir la carga de tumor, reducir la carga de tumor primario, reducir la invasividad, prolongar el tiempo de supervivencia, o mantener o mejorar la calidad de vida.

Los ejemplos de trastornos cancerosos incluyen, pero no se limitan a, tumores sólidos, tumores de tejido blando, y lesiones metastásicas. Los ejemplos de tumores sólidos incluyen malignidades, por ejemplo, sarcomas, adenocarcinomas, y carcinomas, de los diversos sistemas de órganos, tales como aquellos que afectan el colon. Los adenocarcinomas incluyen malignidades tal como carcinoma de células no pequeñas del pulmón. Las lesiones metastásicas de los cánceres mencionados antes también se pueden tratar o prevenir usando los métodos y composiciones de la invención.

En algunas modalidades, el cáncer que expresa GCC a ser tratado es un cáncer primario o metastásico de origen gastrointestinal, tal como cáncer colorrectal, cáncer estomacal, cáncer de intestino delgado, o cáncer esofágico. En algunas modalidades, el cáncer que expresa GCC a ser tratado es cáncer pancreático primario o metastásico. En algunas modalidades, el cáncer que expresa GCC a ser tratado es cáncer pulmonar primario o metastásico, tal como carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso o adenocarcinoma . En algunas modalidades, el cáncer que expresa GCC a ser tratado es un sarcoma, tal como leiomiosarcoma o rabdomiosarcoma . En algunas modalidades, el cáncer que expresa GCC a ser tratado es un tumor neuroectodérmico metastasizado o primario, tal como afaecromotcitoma o un paraganglioma . En algunas modalidades, el cáncer que expresa GCC es un tumor neuroendocrino gastrointestinal o broncopulmonar metastasizado .

El método puede ser útil en el tratamiento de un trastorno relevante en cualquier etapa o subclasificación . Por ejemplo, el método se puede usar para tratar cáncer de colon de etapa temprana o tardía, o cáncer de colon de cualquiera de las etapas 0, I, HA, IIB, IIIA, IIIB, IIIC, y IV.

En algunas modalidades, el método para tratar cáncer que expresa GCC (por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer estomacal, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer pulmonar, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, tumor neuroendocrino, tumor neuroectodérmico, etc.) comprende administrar a un paciente en necesidad de tal tratamiento una molécula de anticuerpo anti-GCC desnudo descrita en la presente. En otras modalidades, el método comprende administrar un inmunoconjugado que comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente y un agente citotóxico tal como un maitansanoide o una auristatina, o derivados de los mismos. Los métodos para administrar moléculas de anticuerpo e inmunoconjugados se describieron anteriormente. Las dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y peso del sujeto y el compuesto particular usado.

En algunas modalidades, la molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado se administra en ciclos de tratamiento. Un "ciclo de tratamiento" consiste de un período de tratamiento, durante el cual la molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado se administra como se describió anteriormente, seguido por un período de reposo, durante el cual no se administra molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado . El ciclo de tratamiento se puede repetir como sea necesario para lograr el efecto deseado.

Los anticuerpos anti-GCC descritos en la presente (por ejemplo, moléculas de anticuerpo anti-GCC desnudo o inmunoconjugados que comprenden una molécula de anticuerpo anti-GCC y un agente terapéutico) se pueden usar en combinación con otras terapias. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir una composición de la presente invención co-formulada con, y/o co-administrada con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más agentes anti-cáncer, por ejemplo, agentes citotóxicos o citostáticos , tratamiento hormonal, vacunas, y/u otras inmunoterapias . En otras modalidades, los anticuerpos anti-GCC se administran en combinación con otras modalidades de tratamiento terapéutico, incluyendo cirugía, radiación, criocirugía, y/o termoterapia. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias .

Administrado "en combinación", como se usa en la presente, significa que dos (o más) diferentes tratamientos se suministran al sujeto durante el transcurso de la aflicción del sujeto con el trastorno, por ejemplo, los dos o más tratamientos se suministran después que el sujeto ha sido diagnosticado con el trastorno y antes que el trastorno haya sido curado o eliminado. En algunas modalidades, el suministro de un tratamiento aún está ocurriendo cuando el suministro del segundo comienza, de modo que hay traslape. Esto es algunas veces referido en la presente como "simultáneo" o "suministro concurrente". En otras modalidades, el suministro de un tratamiento finaliza antes que el suministro del otro tratamiento comience. En algunas modalidades de cualquier caso, el tratamiento es más efectivo debido a la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más efectivo, por ejemplo, un efecto equivalente es visto con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas a un grado mayor, que sería visto si el segundo tratamiento fuera administrado en la ausencia del primera tratamiento, o la situación análoga es vista con el primer tratamiento. En algunas modalidades, el suministro es tal que la reducción de un síntoma, u otro parámetro relacionado con el trastorno es mayor que el que sería observado con un tratamiento suministrado en la ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, completamente aditivo, o más que aditivo. El suministro puede ser tal que un efecto del primer tratamiento suministrado aún es detectable cuando se suministra el segundo.

En algunas modalidades, la molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma se usa con un agente quimioterapéutico . Los ejemplos no limitantes de agentes quimioterapéuticos que dañan el ADN incluyen inhibidores de topoisomerasa I (por ejemplo, irinotecan, topotecan, camptotecina y análogos o metabolitos de los mismos, y doxorrubicina) ; inhibidores de topoisomerasa II (por ejemplo, etopósido, tenipósido, y daunorrubicina) ; agentes de alquilación (por ejemplo, melfalan, clorambucil, busulfan, tiotepa, ifosfamida, carmustina, lomustina, semustina, estreptozocina, decarbazina, metotrexato, mitomicina C, y ciclofosfamida) ; intercaladores de ADN (por ejemplo, cisplatina, oxaliplatina, y carboplatina) intercaladores de ADN y generadores de radicales libres tal como bleomicina; y miméticos de nucleósido (por ejemplo, 5-fluorouracilo, capecitibina, gemcitabina, fludarrabina, citarrabina, mercaptopurina, tioguanina, pentostatina, e hidroxiurea) .

Los agentes quimioterapéuticos que interrumpen la replicación celular incluyen: paclitaxel, docetaxel, y análogos relacionados; vincristina, vinblastina, y análogos relacionados; talidomida, lenalidomida, y análogos relacionados (por ejemplo, CC-5013 y CC-4047) ; inhibidores de proteína tirosina cinasa (por ejemplo, mesilato de imatinib y gefitinib) ; inhibidores de proteasoma (por ejemplo, bortezomib) ; inhibidores de NF- ?, incluyendo inhibidores de IKB cinasa; anticuerpos los cuales enlazan proteínas sobre-expresadas en cánceres y por lo cual bajo- regulan la replicación celular (por ejemplo, trastuzumab, rituximab, cetuximab, y bevacizumab) ; y otros inhibidores de proteínas o enzimas conocidos por estar sobre-regulados , sobre-expresados o activados en cánceres, la inhibición de los cuales bajo-regula la replicación celular.

La selección de agentes terapéuticos o modalidad de tratamiento a ser combinado con una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunocon ugado de la invención dependerá del trastorno a ser tratado. Los agentes adicionales o modalidad de tratamiento pueden incluir, por ejemplo, terapias aprobadas estándares para la indicación a ser tratada. Por ejemplo, cuando la molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma se usa para tratar cáncer de colon, se puede usar en combinación con, por ejemplo, cirugía; terapia de radiación; 5-fluorouricilo (5-FU) , capecitibina, leucovorin, irinotecan, oxaliplatina , bevacizumab, cetuximab, panitumum, o combinaciones de los mismos (por ejemplo, oxaliplatina/capecitibina (XELOX) , 5-fluorouricilo/leucovorin/ -oxaliplatina (FOLFOX) , 5-fluorouricilo/leucovorin/irinotecan (FOLFIRI) , FOLFOX más bevacizumab, o FOLFIRI más bevacizumab) .

En otro aspecto, la invención caracteriza el uso de una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado como se describe en la presente en la manufactura de un medicamento. En una modalidad, el medicamento es para tratar cáncer, por ejemplo, un cáncer gastrointestinal. En algunas modalidades, el medicamento comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC que tiene las características resumidas en las Tablas 1-6. En algunas modalidades, el medicamento comprende una molécula de anticuerpo MIL-44-148-2 o MIL-44 - 67-4 , o versiones humanizadas del mismo.

Etiquetado y Detección de Anticuerpo Las moléculas de anticuerpo anti-GCC usadas en los métodos descritos en la presente, por ejemplo, en los métodos de detección in vitro e in vivo, por ejemplo, de diagnóstico, estadificación, o imágenes, se pueden etiquetar directamente o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del agente de enlace unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas biológicamente activas, ligandos, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales quimioluminiscentes , materiales bioluminiscentes , materiales cromofóricos, materiales de densidad electrónica, materiales paramagnéticos (por ejemplo, activos a resonancia magnética nuclear), y materiales radioactivos. En algunas modalidades, la molécula de anticuerpo anti-GCC se acopla a un ion radioactivo, por ejemplo., indio (11:LIn) , yodo (131I o 125I), itrio (90Y) , lutetio (177Lu) , actinio (225Ac) , bismuto (212Bi o 213Bi) , azufre (35S) , carbono (14C) , tritio (3H) , rodio (188Rh) , tecnetio (" mTc) , praseodimio, o fósforo (32P) ; o un radionúclido emisor de positrones, por ejemplo, carbono-11 ("O , potassio-40 (40K) , nitrógeno-13 (13N) , oxígeno-15 (150) , fluoro-18 (18F) , galio (68Ga) , y yodo-121 (121I) . Los agentes radioactivos adicionales que se pueden conjugar a los anticuerpos de la invención para uso en métodos de diagnóstico/detección in vitro o in vivo se describen a continuación .

Las etiquetas ejemplares incluyen fluoroforos tales como quelatos de tierra rara o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas , por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de Estados Unidos No. 4,737,456), luciferina, y 2 , 3 -dihidroftalazindionas . Otras etiquetas ejemplares incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, galactosidasa, glucoamilasa , lisozima, sacárido oxidasa, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa 6 -fosfato deshidrogenasa , oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidina, etiquetas de espin, etiquetas de bacteriófagos, radicales libres estables, y similares.

Las moléculas de anticuerpo etiquetadas con fluoróforo o cromóforo se pueden preparar de porciones estándares conocidas en el arte. Puesto que los anticuerpos y otras proteínas absorben luz que tiene longitudes de onda hasta aproximadamente 310 nm, las porciones fluorescentes se deben seleccionar para tener absorción sustancial a longitudes de onda arriba de 310 nm y preferiblemente arriba de 400 nm. Una variedad de compuestos fluorescentes adecuados y cromóforos se describe por Stryer Science, 162:526 (1968) and Brand, L. et al. Annual Review of Biochemistry, 41:843-868 (1972) . Los anticuerpos se pueden etiquetar con grupos cromóforos fluorescentes por procedimientos convencionales tales como aquellos descritos en las Patentes de Estados Unidos Nos. 3,940,475, 4,289,747, y 4,376,110.

Un grupo de fluorescentes que tienen un número de las propiedades deseables descritas anteriormente es los tintes de xanteno, los cuales incluyen las fluoresceínas derivadas de 3 , 6-dihidroxi-9-fenilxantidrol y resaminas y rodaminas derivadas de 3 , 6 -diamino- - fenilxantidrol y lissanima rodamina B. Los derivados de fluoresceína y rodamina de 9-o-carboxifenilxantidrol tienen un grupo a 9-o-carboxifenilo . Los compuestos fluoresceína que tienen grupos de acoplamiento reactivo tales como grupos isotiocianato y amino tales como fluorescamina y fluoresceína isotiocianato son fácilmente disponibles. Otro grupo de compuestos fluorescentes son las naftilaminas , que tienen un grupo amino en la posición a o ß.

Las moléculas de anticuerpo etiquetadas se pueden usar, por ejemplo, diagnósticamente y/o experimentalmente en un número de contextos, incluyendo (i) aislar un antígeno predeterminado por técnicas estándares, tal como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación; (ii) detectar un antígeno predeterminado (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante celular) para evaluar la abundancia y patrón de expresión de la proteína; (iii) monitorear los niveles de proteína en tejido como parte de un procedimiento de prueba clínica, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado.

Diagnósticos In Vitro Los anticuerpos anti-GCC e inmunoconjugados descritos en la presente se pueden usar para detectar la presencia o ausencia de GCC, por ejemplo, para detectar la presencia o ausencia de GCC en una muestra biológica ex vivo obtenida de un sujeto (es decir, detección in vitro) o para detectar la presencia o distribución o ausencia de GCC en un sujeto (es decir, detección in vivo) . Tales métodos de detección son útiles para detectar o diagnosticar una variedad de trastornos, o para guiar decisiones terapéuticas. El término "detectar" como se usa en la presente abarca la detección cuantitativa o cualitativa. La detección de GCC o proteína GCC, como se usa en la presente, significa detectar la proteína GCC intacta o detectar una porción de la proteína GCC que comprende el epítope al cual enlaza la molécula de anticuerpo anti-GCC.

Por consiguiente, en otro aspecto, la invención caracteriza un método para detectar la expresión de GCC en una muestra biológica tal como una célula o tejido, por ejemplo, una célula de tumor, o un tumor que tiene una o más células que expresan GCC. El método comprende: poner en contacto una muestra biológica, con una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente (por ejemplo, MIL-44-148-2 o MIL-44-67-4) , bajo condiciones las cuales permiten la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y proteína GCC; detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y proteína GCC, para detectar la presencia de proteína GCC, por ejemplo, para detectar un tumor o célula que expresa GCC.

En una modalidad, la molécula de anticuerpo anti-GCC es un inmunoconjugado que comprende una etiqueta detectable. La etiqueta detectable puede ser un agente radioactivo. Alternativamente, la etiqueta detectable es un agente no radioactivo (por ejemplo, un fluoróforo o un cromóforo como se describió anteriormente) .

En ciertas modalidades, la muestra biológica incluye tejidos o células cancerosas y/o normales que expresan GCC. Los ejemplos de células o tejidos normales que expresan GCC incluyen, pero no se limitan a, células o tejidos de origen gastrointestinal, particularmente células o tejidos colorrectales normales. Los ejemplos de células o tejidos cancerosos que expresan GCC incluyen, pero no se limitan a: cáncer de origen gastrointestinal, tal como cáncer colorrectal, cáncer estomacal, cáncer de intestino delgado y cáncer esofágico; cáncer pancreático; cáncer pulmonar tales como carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso y adenocarcinoma; sarcomas de tejido blando tales como leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma; tumores neuroendocrinos broncopulmonares y gastrointestinales; y tumores neuroectodérmicos . En modalidades particulares, los tejidos de células normales y/o cancerosas pueden expresar GCC a niveles mayores con relación a otros tejidos, por ejemplo otro tejido tales como células B y/o tejidos asociados con células B.

Los métodos de detección descritos en la presente, si son in vítro o in vivo, se pueden usar para evaluar un trastorno en un sujeto. En ciertas modalidades, el trastorno es un trastorno proliferativo celular, tal como un cáncer o un tumor, por ejemplo, cáncer colorrectal, cáncer estomacal o cáncer pancreático.

En un aspecto, la invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de proteína GCC en una muestra biológica in vitro (por ejemplo, en una biopsia de tejido o célula obtenida de un sujeto). El método comprende: (i) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un sujeto con una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma y (ii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y proteína GCC. La formación de complejo es indicativo de la presencia o nivel de proteína GCC en la muestra biológica, mientras que ninguna formación de complejo es indicativo de la ausencia de proteína GCC en la muestra biológica.

Las muestras biológicas ejemplares para métodos descritos en la presente comprenden una célula, células, tejido o fluido corporal, tal como un exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido intestinal, muestra de heces. En modalidades particulares, la muestra biológica comprende un tejido o célula cancerosa. Por ejemplo, la muestra puede ser una biopsia de tumor, por ejemplo, biopsias de un tumor colorrectal, un tumor gástrico, un tumor esofágico, un tumor de intestino delgado, un tumor pulmonar, un sarcoma de tejido blando, un tumor neuroendocrino, un tumor neuroectodérmico, o de una muestra de tejido de cualquier sitio metastásico del mismo. En otras modalidades, la muestra biológica puede ser sangre u otro fluido, donde el fluido comprende una célula de cáncer. Una muestra biológica se puede obtener usando cualquiera de un número de métodos en el arte. Además, una muestra biológica se puede tratar con un fijador tal como formaldehído e incrustar en parafina y seccionar para su uso. Alternativamente, el tejido fresco o congelado se puede emplear. En otras modalidades, los aspirados con aguja fina se pueden usar.

En ciertas modalidades, un tejido o célula de prueba se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene un trastorno asociado con la expresión de GCC. En ciertas modalidades, un tejido o célula de prueba se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene un trastorno asociado con la expresión de GCC en una ubicación diferente de la superficie apical de las células epiteliales intestinales (por ejemplo, expresión de GCC citoplásmica en células epiteliales intestinales) , o un trastorno asociado con la expresión de GCC en células o tejidos no intestinales, tal como tejido pancreático, pulmón, tejido blando, o tejido de origen neuroendocrino o neuroectodérmico . En ciertas modalidades, un tejido o célula de prueba se obtiene de un individuo que se sospecha que tiene un trastorno asociado con la expresión incrementada de GCC.

En una modalidad, el nivel de GCC, en una muestra del sujeto, o en el sujeto, se compara con un nivel de referencia, por ejemplo, el nivel de GCC en un material de control, por ejemplo, una célula normal del mismo origen de tejido como la célula del sujeto o una célula que tiene GCC a niveles comparables con tal célula normal. El método puede comprender, por ejemplo, respuesta al nivel detectado de GCC, proporcionando un diagnóstico, un pronóstico, una evaluación de la eficiencia del tratamiento, o la estadificación de un trastorno. Un nivel mayor de GCC en la muestra o sujeto, en comparación con el material de control, indica la presencia de un trastorno asociado con la expresión incrementada de GCC. Un nivel mayor de GCC en la muestra o sujeto, en comparación con el material de control, también puede indicar, la carencia relativa de eficacia de un tratamiento, un pronóstico relativamente más pobre, o una etapa tardía de la enfermedad. El nivel de GCC también se puede usar para evaluar o seleccionar el tratamiento futuro, por ejemplo, la necesidad de tratamiento más o menos agresivo, o la necesidad de cambio de un régimen de tratamiento a otro. En algunas modalidades, los métodos adicionalmente comprenden seleccionar una terapia dirigida a GCC, por ejemplo, una terapia dirigida a GCC descrita en la presente, con base, al menos en parte, en los niveles de GCC determinados, y opcionalmente administrar la terapia dirigida a GCC seleccionada al sujeto.

La formación de complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y GCC se puede detectar midiendo o visualizando ya sea el anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) unido al antígeno de GCC o molécula de anticuerpo no unida. Uno que tiene experiencia ordinaria en el arte puede apreciar fácilmente la multitud de maneras para detectar el enlace de anticuerpos anti-GCC a GCC. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, ensayos de enlace de antígeno que son conocidos en el arte, tales como análisis Western blot, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas), inmunoensayos de "intercalación", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, e inmunohistoquímica (IHC) .

En una modalidad particular, la GCC se detecta o mide por inmunohistoquímica usando un anticuerpo anti-GCC de la invención. Las técnicas de inmunohistoquímica se pueden usar para identificar y esencialmente teñir células que expresan GCC. Tal "tinción" permite el análisis de migración metastásica. Los anticuerpos anti-GCC tales como aquellos descritos en la presente se ponen en contacto con células fijas y la GCC presente en las células reacciona con los anticuerpos. Los anticuerpos son detectablemente etiquetados o detectados usando segundo anticuerpo etiquetado o proteína A para teñir las células. En una modalidad particular, el anticuerpo MIL-44-148-2 se usa en un ensayo de IHC para detectar o medir la expresión de GCC en una muestra biológica .

Se pueden usar otros ensayos de detección convencionales, por ejemplo, análisis Western blot, radioinmunoensayos , ELISA (ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas), inmunoensayos de "intercalación", ensayos de inmunoprecipitación, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos de proteína A, e inmunohistoquímica (IHC) o radioinmunoensayo (RIA) .

Alternatrivo al etiquetado de la molécula de anticuerpo anti-GCC, la presencia de GCC se puede someter a ensayo en una muestra por un inmunoensayo de competición que utiliza estándares etiquetados con una sustancia detectable y una molécula de anticuerpo anti-GCC no etiquetado. De esta manera, la muestra biológica, los estándares etiquetados y el agente de enlace de GCC se combinan y se determina la cantidad de estándar etiquetado unido al anticuerpo no etiquetado. La cantidad de GCC en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de estándar etiquetado unido al agente de enlace de GCC.

También es posible detectar directamente la GCC a la formación de complejo de molécula de anticuerpo anti-GCC sin manipulación o etiquetado adicional de cualquier componente (molécula de anticuerpo o GCC) , por ejemplo utilizando la técnica de transferencia de energía de fluorescencia (FET, ver, por ejemplo, Lakowicz et al., Patente de Estados Unidos No. 5,631,169; Stavrianopoulos , et al., Patente de Estados Unidos No. 4,868,103).

Una etiqueta de fluoróforo en la primera molécula "donante" se selecciona de modo que, en la excitación con luz incidente de longitud de onda apropiada, su energía fluorescente emitida será absorbida por una etiqueta fluorescente en una segunda molécula "aceptora", la cual a su vez es capas de fluorescer debido a la energía absorbida. Alternativamente, la molécula de proteína "donante" simplemente puede utilizar la energía fluorescente natural de residuos triptofano. Se eligen etiquetas que emiten diferentes longitudes de onda de luz, de modo que la etiqueta de molécula "aceptora" se puede diferenciar de aquella del "donante". Puesto que la eficiencia de transferencia de energía entre las etiquetas se relaciona con la distancia que separa las moléculas, se pueden evaluar las relaciones espaciales entre las moléculas. En una situación en la cual el enlace ocurre entre las moléculas, la emisión fluorescente de la etiqueta de molécula "aceptoraa" en el ensayo debe ser máxima. Un evento de enlace de FET se puede medir convencionalmente mediante medios de detección fluorométrica estándares bien conocidos en el arte (por ejemplo, usando un fluorímetro) .

En otra modalidad, la determinación de la capacidad de una molécula de anticuerpo para reconocer GCC se puede realizar sin etiquetar cualquier componente de ensayo (GCC o molécula de anticuerpo) utilizando una tecnología tal como Análisis de Interacción Biomolecular en tiempo real (BIA) (ver, por ejemplo, Sjolander, S, and Urbaniczky, C, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345 and Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol . 5:699-705). Como se usa en la presente "BIA" o "resonancia de plasmón superficial" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin etiquetar cualquiera de los interactuantes (por ejemplo, BIACORE™) . Los cambios en la masa en la superficie de enlace (indicativo de un evento de enlace) resultan en alteraciones del índice de refracción de luz cercana a la superficie (el fenómeno óptico de resonancia de plasmón superficial (SPR) ) , que resultan en una señal detectable la cual se puede usar como una indicación de reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

En algunos aspectos, la descripción caracteriza una mezcla de reacción que incluye una molécula de anticuerpo descrita en la presente (por ejemplo, un inmunoconjugado que incluye una molécula de anticuerpo descrita en la presente y, por ejemplo, una etiqueta) y una muestra biológica, por ejemplo, una muestra biológica descrita en la presente. En otras modalidades, la mezcla de reacción puede incluir una molécula de anticuerpo descrita en la presente (por ejemplo, un inmunoconjugado que incluye una molécula de anticuerpo descrita en la presente y, por ejemplo, una etiqueta) y GCC obtenida de una muestra biológica, por ejemplo, una muestra biológica descrita en la presente.

En ciertas modalidades, un método, tales como aquellos descritos anteriormente, comprende detectar el enlace de un anticuerpo anti-GCC a GCC expresada en la superficie de una célula o en una preparación de membrana obtenida de una célula que expresa GCC en su superficie. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto una célula con un anticuerpo anti-GCC bajo condiciones permisivas para el enlace del anticuerpo anti-GCC a GCC, y detectar si se forma un complejo entre el anticuerpo anti-GCC y GCC en la superficie celular. Un ensayo ejemplar para detectar el enlace de un anticuerpo anti-GCC a GCC expresada en la superficie de una célula es un ensayo "FACS".

Diagnósticos In Vivo En aún otra modalidad, la invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia tejidos o células que expresan GCC in vivo. El método incluye (i) administrar a un sujeto (por ejemplo, un paciente que tiene un cáncer) una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención (es decir, MIL-44-148-2 o MIL-44 - 67 -4 ) , o fragmento de enlace de antígeno del mismo, preferiblemente un anticuerpo o fragmento de enlace de antígeno del mismo conjugado a un marcador o etiqueta detectable; (ii) exponer el sujeto a un medio para detectar el marcador o etiqueta detectable a las células o tejidos que expresan GCC. Tales métodos in vivo se pueden usar para evaluación, diagnóstico, estadif icación y/o pronóstico de un paciente que sufre de un trastorno tal como cáncer. El método comprende: (i) administrar a un sujeto, una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado de la misma; y (ii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y proteína GCC. La formación de complejo es indicativa de la presencia o nivel de GCC en el sujeto mientras que ninguna formación de complejo es indicativa de la ausencia de GCC en el sujeto.

Tales individuos pueden ser diagnosticados con cáncer que expresa GCC metastasizada y la células de cáncer que expresan GCC metastasizada se pueden detectar administrando al individuo, preferiblemente por administración intravenosa, una composición farmacéutica que comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC y una porción activa en donde la porción activa es un agente radioactivo, y detectar la presencia de una acumulación o agregación localizada de radioactividad, indicando la presencia de células que expresan GCC. En algunas modalidades de la presente invención, la composición farmacéutica comprende un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC y una porción activa en donde la porción activa es un agente radioactivo y la molécula de anticuerpo anti-GCC es el anticuerpo MIL-44 - 148-2 descrito en la presente, o fragmentos o derivados del mismo .

En una modalidad particular, los radionúclidos se pueden conjugar a una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención para el uso como un agente de imágenes en procedimiento de imágenes in vivo. Los agentes de imágenes son procedimientos de diagnóstico útiles así como también los procedimientos usados para identificar la ubicación de células metastasizadas . Por ejemplo, los individuos pueden ser diagnosticados con cáncer colorrectal metastasizado y las células de cáncer colorrectal metastasizado se pueden detectar administrando al individuo, preferiblemente por administración intravenosa, una composición farmacéutica que comprende un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable y un compuesto conjugado que comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención y una porción activa en donde la porción activa es un radionúclido y detectar la presencia de una acumulación o agregación localizada de radioactividad, indicando la presencia de células que expresan GCC.

Las imágenes se pueden realizar por muchos procedimientos bien conocidos por aquellos que tienen experiencia ordinaria en el arte y el agente de imágenes apropiado útil en tales procedimientos se puede conjugar a una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención por medios bien conocidos. Los ejemplos de etiquetas útiles para imágenes de diagnóstico de conformidad con la presente invención son radioetiquetas tales como 32P, 3H, 14C, 188Rh, 43K, 52Fe, 5 Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/ 81MKr, 87MSr, 99Tc, ^In, 113M In, 123I, 1251 , 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb y 206Bi, y 213Bi; etiquetas fluorescentes tales como fluoresceína y rodamina; etiquetas activas de resonancia magnética nuclear; isótopos emisores de positrones de oxígeno, nitrógeno, hierro, carbono, o galio (por ejemplo, 68Ga, 18F) detectables por una tomografía computarizada de emisión de fotón único ("SPECT") ; escáner de tomografía de emisión de positrones ("PET") o detector; quimioluminiscentes tal como luciferina; y marcadores enzimáticos tales como peroxidasa o fosfatasa. Los emisores de radiación de rango corto, tales como isótopos detectables por sondas detectoras de rango corto, tal como una sonda trans - rectal , también se pueden emplear. Las imágenes también se pueden realizar, por ejemplo, por radioescint igrafía, imágenes de resonancia magnética nuclear (MRI) o tomografía computarizada (exploración CT) . Las imágenes por barrido de CT pueden emplear un metal pesado tales como quelados de hierro. La exploración de MRI puede emplear quelados de gadolinio o manganeso .

El anticuerpo se puede etiquetar con tales reactivos usando técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, Magerstadt , M. (1991) Antibody Conjugates And Malignant Disease, CRC Press, Boca Ratón, Fia.; y Barchel, S. W. and Rhodes, B. H., (1983) Radioimaging and Radiotherapy, Elsevier, NY, N.Y. , cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia, enseñan la conjugación de varios radionúclidos terapéuticos y de diagnóstico a aminoácidos de anticuerpos. Tales reacciones se pueden aplicar para conjugar radionúclidos a moléculas de anticuerpo anti-GCC de la invención con un agente quelante y/o enlazante apropiado. Ver también Wensel and Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y., para técnicas relacionadas con el radioetiquetado de anticuerpo. Ver también, D. Colcher et al. Meth. Enzymol . 121: 802-816 (1986) .

En el caso de un anticuerpo radioetiquetado, el anticuerpo se administra al paciente, se localiza en el tumor que porta el antígeno con el cual el anticuerpo reacciona, y se detecta o "se capta la imagen" in vivo usando técnicas conocidas tal como barrido radionuclear usando, por ejemplo, una cámara gamma o tomografía de emisiones o tomografía computarizada . Ver, por ejemplo, A. R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", onoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al., (eds.), pp 65-85 (Academic Press 1985) . Alternativamente, un escáner de tomografía transaxial de emisión de positrones, tal como Pet VI designado ubicado en Brookhaven National Laboratory, se puede usar donde la radioetiqueta emite positrones (por ejemplo, llc, 18F, 150, y 13N, 68Ga) .

En otras modalidades, la invención proporciona métodos para determinar la dosis, por ejemplo, dosis de radiación, a la que se exponen diferentes tejidos cuando un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, es administrado con un isótopo radioactivo. El método incluye: (i) administrar una molécula de anticuerpo anti-GCC como se describe en la presente, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC, que se etiqueta con un isótopo radioactivo, a un sujeto; (ii) medir la cantidad de isótopo radioactivo ubicado en diferentes tejidos, por ejemplo, tumor, o sangre, en varios puntos de tiempo hasta que algo o todo el isótopo radioactivo se ha eliminado del cuerpo del sujeto; y (iii) calcular la dosis total de radiación recibida por cada tejido analizado.

Las mediciones se pueden tomar en puntos de tiempo programados, por ejemplo, día 1, 2, 3, 5, 7, y 12, después de la administración (en el día 0) de la molécula de anticuerpo anti-GCC radioactivamente etiquetada al sujeto. La concentración de radioisótopo presente en un tejido dado, integrado con el tiempo, y multiplicado por la actividad específica del radioisótopo se puede usar para calcular la dosis que recibe un tejido dado. La información farmacológica generada usando moléculas de anticuerpo anti-GCC etiquetadas con un isótopo radioactivo, por ejemplo, un emisor gamma, por ejemplo, e.g., 1:L1In, se puede usar para calcular la dosis esperada que el mismo tejido recibiría de un diferente isótopo radioactivo la cual no puede ser fácilmente medida, por ejemplo, un emisor beta, por ejemplo, 90Y.

Diagnóstico Acompañante para Terapia Dirigida a GCC Los métodos de diagnóstico in vitro e in vivo descritos en la presente son útiles para informar si un paciente que sufre de una enfermedad proliferativa tal como cáncer, o un trastorno gastrointestinal tal como síndrome inflamatorio de intestino, enfermedad de Crohn o estreñimiento, o debe ser tratado o no con una terapia dirigida a GCC, con base en la presencia o ausencia, respectivamente, de expresión de GCC en la superficie de o dentro del tejido o células del paciente. Un paciente que tiene una o más células que expresan GCC en la superficie celular o dentro de la célula es un candidato para el tratamiento con una terapia dirigida a GCC.

En ciertos aspectos, la invención proporciona un método para determinar la sensibilidad de un paciente que se sospecha que sufre de un trastorno o enfermedad que expresa GCC a una terapia dirigida a GCC, que comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra biológica obtenida de un su eto con una molécula de anticuerpo anti-GCC de la invención; (ii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y proteína GCC; en donde la formación de complejo es indicativo de la presencia o nivel de proteína GCC en la muestra biológica, mientras que ninguna formación de complejo es indicativo de la ausencia de proteína GCC en la muestra biológica, determinando la sensibilidad del paciente a una terapia dirigida a GCC. En una modalidad particular, la formación de complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y proteína GCC en la muestra biológica se detecta vía inmunohistoquímica usando una molécula de anticuerpo descrita en la presente, por ejemplo, el anticuerpo MIL-44-1482 descrito en la presente.

Las muestras biológicas ejemplares pueden comprender una célula, células, tejido o fluido corporal, tal como un exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido intestinal, muestra de heces. En modalidades particulares, la muestra biológica comprende un tejido o células cancerosas. Por ejemplo, la muestra puede ser una biopsia de tumor, por ejemplo, biopsia de un tumor colorrectal, un tumor gástrico, un tumor esofágico, un tumor de intestino delgado, un tumor pulmonar, un sarcoma de tejido blando, un tumor neuroendocrino, un tumor neuroectodérmico, o de una muestra de tejido de cualquier sitio metastásico del mismo. En otras modalidades, la muestra biológica puede ser sangre u otro fluido, donde el fluido comprende una célula de cáncer. Una muestra biológica se puede obtener usando cualquiera de un número de métodos en el arte. Además, una muestra biológica se puede tratar con un fijador tal como formaldehído e incrustar en parafina y seccionar para el uso. Alternativamente, el tejido fresco o congelado se puede emplear. En otras modalidades, se pueden usar aspirados en aguja fina.

Las enfermedades/trastornos ejemplares que se pueden evaluar (por ejemplo, diagnosticas) y tratar usando los métodos de diagnóstico acompañantes descritos en la presente incluyen, pero no se limitan a trastornos proliferativos incluyendo, pero no limitado a, cáncer colorrectal, cáncer estomacal, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer pulmonar (por ejemplo, carcinoma de células escamosas, carcinoma adenoescamoso, adenocarcinoma) , sarcoma de tejido blando tales como leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma, tumores neuroendocrinos broncopulmonares y gastrointestinales, y tumores neuroectodérmicos , trastornos gastrointestinales tales como síndrome inflamatorio de intestino, enfermedad de Crohn, y estreñimiento, y trastornos neurológicos tal como enfermedad de Parkinson.

Los métodos de la invención guían las decisiones del médico para determinar si se trata un paciente con una terapia dirigida a GCC. Los métodos proporcionados en la presente también permiten la generación de un reporte de tratamiento personalizado, por ejemplo, un reporte de tratamiento de cáncer personalizado, por ejemplo, con una terapia dirigida a GCC descrita en la presente.

Una terapia dirigida a GCC es un agente terapéutico que trata o previene una enfermedad que expresa GCC o una enfermedad mediada por GCC, por ejemplo, una enfermedad que expresa GCC o enfermedad mediada por GCC descrita en la presente. En ciertos aspectos de la invención, la terapia dirigida a GCC es un ligando de GCC tal como una molécula de anticuerpo anti-GCC o ligando de péptido (por ejemplo, un péptido de ST) conjugado a un agente, tal como un agente terapéutico. Los ligandos de GCC ejemplares conjugados a agentes terapéuticos (es decir, inmunoconjugados) se describen, por ejemplo, Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos No. 20110110936, los contenidos de la cual se incorporan para referencia en la presente en su totalidad. En una modalidad particular, el agente terapéutico dirigido a GCC es anticuerpo monoclonal de IgGl humana anti-GCC conjugado a un agente citotóxico, en donde el mAb incluye una región variable de cadena ligera (VL) que tiene las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) y una región variable de cadena pesada (VH) que tiene las tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 , y CDR3) listadas en la Tabla 7 (secuencias de aminoácidos) y 8 (secuencias de ácido nucleico correspondientes) a continuación, y una región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera listadas en la Tabla 9 (secuencias de aminoácidos) y 10 (secuencia de ácido nucleico correspondiente) a continuación.

Tabla 7 : Secuencia de aminoácidos de VL CDRs y VH CDRs Tabla 8 : Secuencia de ácido nucleico VL CDRs y VH CDRs Tabla 9 : Secuencia de aminoácidos de región variable de mAb Tabla 10: Secuencia de ácido nucleico de región variable de mAb Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico correspondientes para las secuencias de cadena pesada de hlgGl completa y cadena ligera hKappa que contienen las VL CDRs y VH CDRs mostradas en las Tablas 7 y 8, y regiones de cadena pesada y ligera variables mostradas en las Tablas 9 y 10 son listadas a continuación: La secuencia de nucleótidos de cadena pesada de hlgGl es: GAATTCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTG TCCACTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCT GTCCCTCACCTGCGCTGTCTTTGGTGGGTCTTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGC CAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATCGTGGAAACACCAACG ACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCGC CCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGAACGT GGATACACCTATGGTAACTTTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCAGCTCAG CCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGG CACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGAC TCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACAT CTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAG TCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAC GGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACC GTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTG CAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGG CAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACC AGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGA GAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGC TCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCT TCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCT GTCTCCGGGTAAATAATAGGGATAACAGGGTAATACTAGAG (SEC ID NO : 83) La secuencia de proteína de cadena pesada de hlgGl es : MG SCIILFLVATATGVHSQVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVFGGSFSGYYWSWIRQPPG KGLEWIGEINHRGNTNDNPSLKSRVTISVDTSKNQFALKLSSVTAADTAVYYCARERGYTY GNFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN YVDGVEV HNAKTKPREEQY STYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVYTLPPSRDELTK QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEC ID NO: 84) La secuencia de nucleótidos de cadena ligera Kappa es: GCGGCCGCCTCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGG TGTCCACTCCGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAA AGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGAAACTTAGCCTGGTATCAGC AGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGAAT CCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCGGCAGCCTG CAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATAAAACCTGGCCTCGGACGTTCG GCCAAGGGACCAACGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC GCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTC TATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCC AGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGAC CCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGC CTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGTCTAGA (SEC ID NO: 85) La secuencia de proteína de cadena ligera hKappa es: MGWSCIILFLVATATGVHSEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQKPGQ APRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTIGSLQSEDFAVYYCQQYKTWPRTFGQGTN VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLN FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEC ID NO: 86) En un aspecto particular de la invención, la terapia dirigida a GCC es un inmunoconjugado que tiene una molécula de anticuerpo anti-GCC conjugada a una molécula de auristatina. En una modalidad, el inmunoconjugado comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC que incluye tres CDRs de cadena pesada (VH) de acuerdo con las SEC ID NOs : 67, 68 y 69, y tres regiones CDR de cadena ligera (VL) de acuerdo con las SEC ID NOs: 70, 71, y 72, conjugadas a una molécula de auristatina. En otra modalidad, el inmunoconjugado comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC que incluye una región variable de cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 79, y una región variable de cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 80, conjugadas a una molécula de auristatina. En aún otra modalidad, el inmunoconjugado comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC que incluye las regiones variables de cadena pesada y ligera de acuerdo con las SEC ID NOs 79 y 80, respectivamente, conjugadas a una molécula de auristatina.

En algunas modalidades, la molécula auristatina se enlaza a una porción de cisteína en la molécula de anticuerpo anti-GCC por vía de un enlazante que contiene una porción de maleimida, por ejemplo, una porción de maleimidocaproilo .

En algunas modalidades, la molécula de auristatina se acopla a una molécula de anticuerpo anti-GCC usando un enlazante heterobifuncional que se conecta a un grupo hidroxilo en la molécula de auristatina. En algunas modalidades, el enlazante comprende una hidrazona. En algunas modalidades, el enlazante es un compuesto hidrazona formado por la reacción de maleimidocaproilhidrazida y un ácido cetocarboxílico, por ejemplo, ácido 5-benzoilvalérico. En modalidades particulares, el enlazante es ácido (Z)-6-(2-(6-(2 , 5-dioxo-2 , 5-dihidro- lH- irrol -1- il ) hexanoil) hidrazono) -6 -fenilhexanoico .

En algunas otras modalidades, la molécula de auristatina se acopla a la molécula de anticuerpo anti-GCC usando un enlazante heterobifuncional que se conecta a un grupo monometil amino en la molécula de auristatina. En algunas modalidades, el enlazante comprende una porción escindible, por ejemplo, una porción de péptido, y un espaciador de p-aminobencilcarbamato auto-destructivo. Los enlazantes ejemplares incluyen maleimidocaproilo (me) , maleimidocaproil-L-fenilalanina-L-1 isina-p-aminobencil-carbamato, y maleimidocaproil-L-valina-L-citrulina-p-aminobencilcarbamato (ve) .

En ciertas modalidades, la terapia dirigida a GCC es un inmunoco jugado caracterizado por la Ab- (vc-MMAF) m (fórmula (1-4)) ; Ab- (vc-MMAE) m (fórmula (1-5)); Ab- (me -MMAE) m (fórmula (1-6) ) ; o Ab- (mc-MMAF) m, (fórmula (1-7)) , en donde Ab es una molécula de anticuerpo anti-GCC que incluye características tales como las características descritas en cualquiera de las Tablas 7, 8, 9 o 10, S es un átomo de azufre del anticuerpo, y m varía desde aproximadamente 1 a aproximadamente 15. En ciertas modalidades, m es un entero desde 1 a aproximadamente 5.

En algunas modalidades, la variable m en la fórmula (1-4) , (1-5) , (1-6) , o (1-7) varía desde aproximadamente 2 a aproximadamente 10, desde aproximadamente 6 a aproximadamente 8, desde aproximadamente 4 a aproximadamente 6, desde aproximadamente 3 a aproximadamente 5, o desde aproximadamente 1 a aproximadamente 3.

En ciertas modalidades particulares, la terapia dirigida a GCC es un inmunoconjugado de la fórmula (1-4) , ( J-5) , {1-6) , o (1-7) , en donde Ab es una molécula de anticuerpo que incluye tres CDRs de cadena pesada (VH) de acuerdo con las SEC ID NOs : 67, 68 y 69, y tres regiones CDR de cadena ligera (VL) de acuerdo con las SEC ID NOs: 70, 71 y 72, y m es aproximadamente 3 a aproximadamente 5 (por ejemplo, aproximadamente 4) . En ciertos aspectos, el Ab que incluye las CDRs de cadena pesada de acuerdo con las SEC ID NOs: 67, 68 y 69, y las tres CDRs de cadena ligera de acuerdo con las SEC ID NOs: 70, 71 y 72, respectivamente, es un anticuerpo monoclonal humano, preferiblemente anticuerpo de IgGl humano.

En otras modalidades particulares, la terapia dirigida a GCC es un inmunoconjugado de la fórmula (1-4) , (I-5) , (1-6) , o (1-7) , en donde Ab es una molécula de anticuerpo monoclonal que incluye una región variable de cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 79, y una región variable de cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 80, y m es aproximadamente 3 a aproximadamente 5 (por ejemplo, aproximadamente 4) . En ciertos aspectos, el Ab que incluye las regiones variables de cadena pesada y ligera de acuerdo con las SEC ID NOs 79 y 80, respectivamente, es un anticuerpo monoclonal humano, preferiblemente anticuerpo de IgGl humano.

En aún otras ciertas modalidades, la terapia dirigida a GCC es un inmunoconjugado de la fórmula (1-4) , (I-5) , (1-6) , o (1-7) , en donde Ab es una molécula de anticuerpo monoclonal de IgG humana que incluye una secuencia de IgGl de cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 84, y una secuencia de cadena ligera Kappa de acuerdo con la SEC ID NO: 86, y m es aproximadamente 3 a aproximadamente 5 (por ejemplo, aproximadamente 4) .

En todavía otra modalidad, la terapia dirigida a GCC es un conjugado de ligando de GCC capaz de cruzar la barrera hematoencefálica . Por ejemplo, en ciertos aspectos la invención se refiere a un ligando de GCC conjugado a un agente neuroprotector tal como L-dopa, el cual es capaz de cruzar la barrera hematoencef lica . Los ejemplos de tales conjugados de ligando de GCC se describen en la solicitud de PCT publicada WO2013/016662 , los contenidos de la cual se incorporan para referencia en la presente en su totalidad. En modalidades de la invención, los pacientes que sufren de o se sospecha que tienen un trastorno neurológico (por ejemplo, enfermedad de Parkinson) cuyas neuronas expresan GCC serían considerados buenos candidatos para el tratamiento con un ligando de GCC conjugado a un agente neuroprotector.

En algunos aspectos de la invención, la terapia dirigida a GCC es un antagonista de GCC. En una modalidad, la terapia dirigida a GCC es un antagonista de péptido (por ejemplo, un péptido de ST) o un inhibidor de molécula pequeña de GCC.

En algunos aspectos, la terapia dirigida a GCC es un agonista de GCC. En una modalidad, el agonista de GCC es un péptido de ST. En una modalidad particular, el agonista de GCC es un péptido de ST que comprende la secuencia de aminoácidos : H-Cys1-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys^-Thr^-Gly^-Cys^-Tyr^-OH (SEC ID NO: 87), en donde hay tres enlaces de disulfuro: Entre Cys1 y Cys6, entre Cys2 y Cys10, y entre Cys5 y Cys13. En una modalidad particular, el agonista de GCC es un agonista de péptido que enlaza GCC tal como Linaclotide (Ironwood Pharmaceuticals) .

En ciertas modalidades de la invención, pacientes cuyas células de tumor expresan GCC en sus superficies serían considerados buenos candidatos para el tratamiento con moléculas de anticuerpo anti-GCC conjugadas a toxina, tal como un inmunoconjugado como se describe en la presente, o los anticuerpos conjugados a toxina como se describe en la Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos No. 20110110936, los contenidos de la cual se incorporan para referencia en la presente en su totalidad. Sin querer limitarse a la teoría, los pacientes cuyas células de tumor expresan bajas cantidades de GCC en su superficie no pueden ser tan buenos candidatos para esto o pueden ser candidatos para combinar la terapia dirigida a GCC con un método de tratamiento adicional, o ser candidatos para terapia de anticuerpo desnudo. En otro ejemplo, la dosis de terapia dirigida a GCC se podría ajustar para reflejar el número de moléculas de GCC expresadas en las superficies de células de tumor. Por ejemplo, los pacientes con altos números de moléculas de GCC en sus superficies celulares de tumor se pueden tratar con dosis menores de una terapia dirigida a GCC que los pacientes con bajos números de moléculas de GCC expresadas en la superficie celular de tumor. La detección de la presencia de células de tumor que expresan GCC in vivo puede permitir la identificación de tejidos en el tumor que expresa GCC primaria que se ha metastasizado . El reconocimiento de cuáles tejidos tienen metástasis puede llevar a la aplicación dirigida de terapia de tumor.

Como se discutió anteriormente, las moléculas de anticuerpo descritas en la presente permiten la valoración de la presencia de una proteína GCC en tejidos normales versus neoplásicos, mediante la cual se puede evaluar la presencia o severidad de la enfermedad, progreso de la enfermedad y/o la eficiencia de la terapia. Por ejemplo, la terapia se puede monitorear y la eficacia se valoró. En un ejemplo, una proteína GCC se puede detectar y/o medir en una primera muestra obtenida de un sujeto que tiene una enfermedad proliferativa y la terapia se puede iniciar. Más tarde, se puede obtener una segunda muestra del sujeto y la proteína GCC en la muestra se puede detectar y/o medir. Una disminución de la cantidad de proteína GCC detectada o medida en la segunda muestra puede ser indicativa de la eficacia terapéutica.

Sin pretender estar unido a cualquier teoría, la vascularización se puede requerir para que un terapéutico dirigido a GCC acceda a un tumor de expresión de GCC, particularmente en casos donde el terapéutico dirigido a GCC se administra intravenosamente. Por consiguiente, en ciertas modalidades de los métodos de la invención, puede ser útil evaluar o caracterizar la vasculatura de tumor además de o en conjunto con la detección de proteína GCC. Por ejemplo, una muestra de tejido se puede teñir con un agente que identifica una célula endotelial vascular, tal como un anticuerpo anti-CD-31 o una molécula de anticuerpo anti-Factor de von Willebrand, y un anticuerpo anti-GCC de la invención para caracterizar simultáneamente o contemporáneamente la expresión de GCC y vascularización de tejido. En ciertos aspectos de la invención, tal caracterización simultánea o contemporánea de expresión de GCC y vasculatura es útil como una herramienta de selección de paciente para un terapéutico dirigido.

En otro aspecto, la expresión de superficie celular de GCC se puede requerir para un terapéutico dirigido a GCC para afectar la matanza de una célula de tumor que expresa GCC. Por ejemplo, algunas células de tumor pueden expresar GCC, pero no en la superficie celular. Si un terapéutico depende de la expresión de GCC de superficie celular, tal terapéutico no puede ser capaz de matar una célula donde GCC es principalmente intracelular . Por consiguiente, en algunas modalidades de la invención, el ensayo de diagnóstico o pronóstico puede incluir adicionalmente análisis y/o cuantificación de locación celular de GCC, por ejemplo, un método el cual puede distinguir y/o cuantificar la expresión de superficie celular de la expresión intracelular. Sin pretender estar unido a cualquier teoría, un paciente cuyo tumor principalmente tiene expresión de GCC intracelular no puede ser un buen candidato para una molécula de anticuerpo anti-GCC la cual enlaza el dominio extracelular de GCC. Alternativamente, tal resultado analítico puede sugerir el tratamiento inicial con un agente el cual induce la expresión de superficie celular de GCC (ver, por ejemplo, Publicación de PCT No. WO04/071436) . Después, o en conjunto con la inducción de superficie celular de GCC, se puede administrar una molécula de anticuerpo anti-GCC la cual tiene acceso a o enlaza solamente la GCC extracelularmente expresada.

Kits También dentro del alcance de la invención están los kits que comprenden una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado como se describe en la presente. Adicionalmente están incluidos kits que comprenden composiciones de liposoma que comprenden una molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado . El kit puede incluir uno o más otros elementos incluyendo: instrucciones de uso; otros reactivos, por ejemplo, una etiqueta, un agente terapéutico, o un agente útil para quelación, o de otra manera acoplamiento, un anticuerpo para una etiqueta o agente terapéutico, o una composición radioprotectora ; dispositivos u otros materiales para preparar el anticuerpo para administración; portadores farmacéuticamente aceptables; y dispositivos u otros materiales para la administración a un sujeto. Las instrucciones de uso pueden incluir instrucciones para aplicaciones de diagnóstico de la molécula de anticuerpo anti-GCC o inmunoconjugado para detectar GCC, in vi tro, por ejemplo, en una muestra, por ejemplo, una biopsia o células de un paciente que tiene cáncer, o in vivo. Las instrucciones pueden incluir guía para la aplicación terapéutica incluyendo dosificaciones y/o modos de administración sugeridos, por ejemplo, en un paciente con un cáncer (por ejemplo, un cáncer de origen gastrointestinal, tal como, por ejemplo, cáncer de colon, cáncer estomacal, cáncer esofágico). Otras instrucciones pueden incluir instrucciones sobre el acoplamiento del anticuerpo a un quelante, una etiqueta o un agente terapéutico, o para la purificación de un anticuerpo conjugado, por ejemplo, de componentes de conjugación sin reaccionar. Como se discutió anteriormente, el kit puede incluir una etiqueta, por ejemplo, cualquiera de las etiquetas descritas en la presente. Como se discutió anteriormente, el kit puede incluir un agente terapéutico, por ejemplo, un agente terapéutico descrito en la presente. En algunas aplicaciones, el anticuerpo reaccionará con otros componentes, por ejemplo, un quelante o una etiqueta o agente terapéutico, por ejemplo, un radioisótopo, por ejemplo, itrio o lutetio. En tales casos, el kit puede incluir uno o más de un recipiente de reacción para realizar la reacción o un dispositivo de separación, por ejemplo, una columna cromatográfica , para el uso en la separación del producto terminado de materiales de partida o intermediarios de reacción .

El kit puede contener adicionalmente al menos un reactivo adicional, tal como un agente de diagnóstico o terapéutico, por ejemplo, un agente de diagnóstico o terapéutico como se describe en la presente, y/o una o más moléculas de anticuerpo anti-GCC adicionales o inmunocon ugados , formulados como sea apropiado, en una o más preparaciones farmacéuticas separadas.

El kit adicionalmente puede contener un radioprotector . Se conoce la naturaleza radiolítica de isótopos, por ejemplo, 90Yttrium (90Y) . Para superar esta radiólisis, los radioprotectores se pueden incluir, por ejemplo, en el amortiguador de reacción, siempre y cuando tales radioprotectores sean benignos, significando que no inhiben o de otra manera afectan adversamente la reacción de etiquetado, por ejemplo, de un isótopo, tal como de 90Y, al anticuerpo. El amortiguador de formulación de la presente invención puede incluir un radioprotector tal como albúmina de suero humano (HSA) o ascorbato, el cual minimiza la radiólisis debido al itrio u otros radionúclidos fuertes.

Otros radioprotectores son conocidos en el arte y también se pueden usar en el amortiguador de formulación de la presente invención, es decir, depuradores de radiales libres (fenol, sulfitos, glutationa, cisteína, ácido gentísico, ácido nicotínico, palmitato de ascorbilo, HOP(:0)H2I glicerol, formaldehído sulfoxilato sódico, Na2S20, Na2S203, y S02, etc.).

Un kit proporcionado es uno útil para el radioetiquetado de un péptido o proteína conjugada con quelante con un radioisótopo terapéutico para la administración a un paciente. El kit incluye (i) un vial que contiene anticuerpo conjugado a quelante, (ii) un vial que contiene amortiguador de formulación para estabilizar y administrar el anticuerpo radioetiquetado a un paciente, y (iii) instrucciones para realizar el procedimiento de radioetiquetado. El kit proporciona la exposición de un anticuerpo conjugado a quelante al radioisótopo o una sal del mismo por una cantidad de tiempo suficiente bajo condiciones amables, por ejemplo, como se recomienda en las instrucciones. Se produce un anticuerpo radioetiquetado que tiene suficiente pureza, actividad específica y especificidad de enlace. El anticuerpo ratioetiquetado se puede diluir a una concentración apropiada, por ejemplo, en amortiguador de formulación, y se administra directamente al paciente con o sin purificación adicional. El anticuerpo conjugado a quelante se puede suministrar en forma liofilizada.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos pero no se proponen para ser limitantes de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Generación de una proteína de fusión de Fe de ratón de dominio extracelular de GCC humana (hGCC-ECD-mFc) La generación de (Fe) constante de cadena pesada de (lg)G2a de inmunoglobulina de ratón/dominio extracelular (ECD) de guanilil ciclasa humana (h) secretada (GCC) (hGCC) (con proteína de fusión de mutación de región de enlace de receptor (FcRbr-mutlI ) (es decir, proteína de fusión hGCC (ECD) -mIgG2a RcRbr-mutlI, también referida en la presente como pLKTOK108 y MIL-44) para inmunización y selección se realizó como sigue. El antígeno de GCC se preparó subclonando una porción del gen de GCC que codifica una secuencia que comprende la siguiente secuencia de GCC (secuencia señal y dominio extracelular) en el vector de expresión pLKT0K4 : MKTLLLDLALWSLLFQPGWLSFSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEP LK LEDAVNEGLEIVRGRLQNAGLNVTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTC EGLDLLRKISNAQRMGCVLIGPSCTYSTFQMYLDTELSYPMISAGSFGLS CDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNF KTNDLPFKTYSWSTSYVYK GTETE DCF YLNALEASVSYFSHELGFKWLRQDKEFQDILMDHNRKSNVIIMCG GPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYFEDNVTAPDYMKNVLVLTLS PGNSLLNSSFSRNLSPTKRDFALAYLNGILLFGH LKIFLENGENITTPK FAHAFR LTFEGYDGPVTLDD GDVDSTMVLLYTSVDTKKYKVLLTYDTH VNKTYPVDMSPTFTWKNSKL (SEC ID NO : 46) La secuencia de aminoácidos GLy-Arg-Gly-Pro-Gln (SEC ID NO: 66), en las posiciones 427 a 430, se seleccionó para terminar el fragmento de GCC extracelular . En GCC, esta secuencia se siguió inmediatamente por una Pro que se alinea bien dentro de una Pro en la posición homologa a la Pro que se usa históricamente para iniciar las proteínas de fusión de Fe de IgGl humana.

La región Fe de IgG2a de ratón de pLKTOK108 se diseñó para iniciar con la secuencia de aminoácidos que funcionalmente es el final del dominio CH1 [Pro-Arg-Valina (Val) -Pro- Isoleucina (lie) -Treonina (Thr) -Glu-Asparagina (Asn) ] (SEC ID NO: 58) . Dos regiones fueron mutadas en la región constante de IgG2a de ratón. Además de las mutaciones de leucina (Leu) -Leu-Gly-Gly (SEC ID NO: 59) a Leu-alanina (Ala) -Gly-Ala (SEC ID NO: 60) (posiciones 234 a 237 Lisina [Lys] -Lys-Gly-Gly (SEC ID NO: 61) a Lys-Ala-Gly-Ala (SEC ID NO: 62) , la segunda región de receptor de Fe en las posiciones 318 a 322 también se mutó como sigue: ácido glutámico (Glu) -Fenilalanina (Phe) -Lys-Cisteína (Cys) -Lys (SEC ID NO: 63) a Ala-Phe-Lys-Cys-Lys (SEC ID NO : 64) y luego a Phe-Lys-Cys-Lys (SEC ID NO: 65) .

Una vez que se diseñó la secuencia de proteína de fusión completa, las secuencias de enzima de restricción de flanqueo para BamHI y Xbal, así como también la secuencia Kozak (CTCACC) y un codón de detención terminal se agregaron para completar el cADN de proteína de fusión. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la proteína de fusión pLKTOK108 (hGCC/mIgG2a FcRmutlI) se proporcionan a continuación (los sitios de restricción BamHI y Xbal se muestran en letras minúsculas en la SEC ID NO: 47) : Secuencia de nucleótidos de Fe de IgG2a de ratón/GCC-ECD humana (SEC ID NO: 47) : cgcggatccctcaccATGAAGACGTTGCTGTTGGACTTGGCTTTGTGGTCACTGCTCTTCC AGCCCGGGTGGCTGTCCTTTAGTTCCCAGGTGAGTCAGAACTGCCACAATGGCAGCTATGA AATCAGCGTCCTGATGATGGGCAACTCAGCCTTTGCAGAGCCCCTGAAAAACTTGGAAGAT GCGGTGAATGAGGGGCTGGAAATAGTGAGAGGACGTCTGCAAAATGCTGGCCTAAATGTGA CTGTGAACGCTACTTTCATGTATTCGGATGGTCTGATTCATAACTCAGGCGACTGCCGGAG TAGCACCTGTGAAGGCCTCGACCTACTCAGGAAAATTTCAAATGCACAACGGATGGGCTGT GTCCTCATAGGGCCCTCATGTACATACTCCACCTTCCAGATGTACCTTGACACAGAATTGA GCTACCCCATGATCTCAGCTGGAAGTTTTGGATTGTCATGTGACTATAAAGAAACCTTAAC CAGGCTGATGTCTCCAGCTAGAAAGTTGATGTACTTCTTGGTTAACTTTTGGAAAACCAAC GATCTGCCCTTCAAAACTTATTCCTGGAGCACTTCGTATGTTTACAAGAATGGTACAGAAA CTGAGGACTGTTTCTGGTACCTTAATGCTCTGGAGGCTAGCGTTTCCTATTTCTCCCACGA ACTCGGCTTTAAGGTGGTGTTAAGACAAGATAAGGAGTTTCAGGATATCTTAATGGACCAC AACAGGAAAAGCAATGTGATTATTATGTGTGGTGGTCCAGAGTTCCTCTACAAGCTGAAGG GTGACCGAGCAGTGGCTGAAGACATTGTCATTATTCTAGTGGATCTTTTCAATGACCAGTA CTTGGAGGACAATGTCACAGCCCCTGACTATATGAAAAATGTCCTTGTTCTGACGCTGTCT CCTGGGAATTCCCTTCTAAATAGCTCTTTCTCCAGGAATCTATCACCAACAAAACGAGACT TTGCTCTTGCCTATTTGAATGGAATCCTGCTCTTTGGACATATGCTGAAGATATTTCTTGA AAATGGAGAAAATATTACCACCCCCAAATTTGCTCATGCTTTCAGGAATCTCACTTTTGAA GGGTATGACGGTCCAGTGACCTTGGATGACTGGGGGGATGTTGACAGTACCATGGTGCTTC TGTATACCTCTGTGGACACCAAGAAATACAAGGTTCTTTTGACCTATGATACCCACGTAAA TAAGACCTATCCTGTGGATATGAGCCCCACATTCACTTGGAAGAACTCTAAACTTCCTAAT GATATTACAGGCCGGGGCCCTCAGCCCAGAGTGCCCATAACACAGAACCCCTGTCCTCCAC TCAAAGAGTGTCCCCCATGCGCAGCTCCAGACCTCGCAGGTGCACCATCCGTCTTCATCTT CCCTCCAAAGATCAAGGATGTACTCATGATCTCCCTGAGCCCCATGGTCACATGTGTGGTG GTGGATGTGAGCGAGGATGACCCAGACGTCCAGATCAGCTGGTTTGTGAACAACGTGGAAG TACACACAGCTCAGACACAAACCCATAGAGAGGATTACAACAGTACTCTCCGGGTGGTCAG TGCCCTCCCCATCCAGCACCAGGACTGGATGAGTGGCAAGGCATTCAAATGCAAGGTCAAC AACAGAGCCCTCCCATCCCCCATCGAGAAAACCATCTCAAAACCCAGAGGGCCAGTAAGAG CTCCACAGGTATATGTCTTGCCTCCACCAGCAGAAGAGATGACTAAGAAAGAGTTCAGTCT GACCTGCATGATCACAGGCTTCTTACCTGCCGAAATTGCTGTGGACTGGACCAGCAATGGG CGTACAGAGCAAAACTACAAGAACACCGCAACAGTCCTGGACTCTGATGGTTCTTACTTCA TGTACAGCAAGCTCAGAGTACAAAAGAGCACTTGGGAAAGAGGAAGTCTTTTCGCCTGCTC AGTGGTCCACGAGGGTCTGCACAATCACCTTACGACTAAGACCATCTCCCGGTCTCTGGGT AAATAAtctagagca Secuencia de aminoácidos de Fe de IgG2a de ratón/GCC-ECD Humana (SEC ID NO: 48) : MKTLLLDLALWSLLFQPG LSFSSQVSQNCHNGSYEISVLMMGNSAFAEPLK LEDAWEG LEIVRGRLQNAGL VTVNATFMYSDGLIHNSGDCRSSTCEGLDLLRKISNAQRMGCVLIGP SCTYSTFQ YLDTELSYPMISAGSFGLSCDYKETLTRLMSPARKLMYFLVNFWKTNDLPFK TYS STSYVYKNGTETEDCFWYLNALEASVSYFSHELGFKWLRQDKEFQDILMDHNRKSN VIIMCGGPEFLYKLKGDRAVAEDIVIILVDLFNDQYLEDNVTAPDYMK VLVLTLSPGNSL LNSSFSR LSPTKRDFALAYLNGILLFGHMLKIFLENGENITTPKFAHAFRNLTFEGYDGP VTLDDWGDVDSTMVLLYTSVDTKKY VLLTYDTHV KTYPVDMSPTFT KNSKLPNDITGR GPQPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLAGAPSVFIFPPKIKDVLMISLSP VTCWVDVSE DDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRWSALPIQHQD MSGKAFKCKVNNRALP SPIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKEFSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQN YK TATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSWHEGLHNHLTTKTISRSLGK Como se estableció anteriormente, la proteína recombinante pLKTOK108 combina la región extracelular de GCC humana fusionada a una región de Fe de IgG2a de ratón en la cual las dos regiones de enlace de receptor de Fe mutado (FcRs) fueron mutadas para prevenir el enlace de receptor de Fe (m!gG2a FcRmutlI) . El inserto de ADN recombinante para pLKTOK108 se creó por un proceso de PCR de tres etapas como sigue : La primera etapa creó la GCC humana extracelular adaptada y los fragmentos de ADN de IgG2a FcRmutlI de ratón adaptados que contienen 35 nucleótidos de secuencias sobrepuestas. Estas reacciones de PCR usaron los modelos y cebadores descritos en la Tabla 11 y Tabla 12 con el protocolo descrito en la Tabla 13 para crear los dos fragmentos. Estos fragmentos de ADN fueron aislados de un gel de 1% agarosa usando un kit de Purificación de Gel Qiagen (Valencia, CA) . El modelo de GCC humana se proporcionó por un vector de expresión de proteína que contiene la secuencia para GCC humana (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA. El modelo para el dominio de Fe se obtuvo de un constructo de expresión para 1228 humana fusionada a IgG2aFc de ratón con dos regiones de enlace de receptor de Fe mutado (FcRmutlI) , referido como pLKTOK84, que por si solos fueron creados usando el vector pLKTOK61 (descrito en la Patente de Estados Unidos 7,053,202, los contenidos de la cual se incorporan para referencia en la presente en su totalidad) como un modelo. ala 11 : Modelos Usados en las Reacciones de Montaje de PCT Primera Etapa para Crear ADN Recombinante para pLKTOK108 Tabla 12 : Cebadores Usados en Todas las Reacciones de PCR para Crear pLKTOK108 Tabla 13 : Protocolo de Reacción Usado en las Reacciones de Montaje de PCR de Primera Etapa para Crear ADN Recombinante para pLKTOK108 La segunda reacción de PCR combinó los modelos en las concentraciones listadas en ¡Error! Texto original de referencia no encontrado. El protocolo de reacción listado en ¡Error! Texto original de referencia no encontrado creó un gen de proteína de fusión recombinante único. El producto de esta reacción se utilizó directamente como el modelo en la tercera reacción de PCR.

Tabla 14: Modelos Usados en las Reacciones de Montaje de PCR de Segunda Etapa para Crear ADN Recombinante para pLKTOK108 Tabla 15 : Protocolo de Reacción Usado en las Reacciones de Montaje de PCR de Segunda Etapa para Crear ADN Recombinante para pLKTOK108 La tercera reacción de PCR utilizó los modelos y cebadores descritos en ¡Error! Texto original de referencia no encontrado y ¡Error! Texto original de referencia no encontrado con el protocolo descrito en ¡Error! Texto original de referencia no encontrado a continuación para crear los fragmentos completos. Estos fragmentos de ADN fueron aislados de un gel de 0.7% agarosa usando un kit de Purificación de Gel Qiagen (Apéndice F) , y un kit de Clonación TOPO® TA de tiamina adenosina (TA) voladiza (Apéndice F) . Los clones únicos fueron aislados y el ADN se purificó usando kit miniprep de ADN de Qiagen (Apéndice F) . El ADN se secuenció con los cebadores M13f, M13r y pSMUCH2 para identificar aquellos con la secuencia deseada. El clon TOPO intermediario TOK108-15 contuvo la secuencia de ADN recombinante deseada.

Tabla 16: Modelos Usados en las Reacciones de Montaje de PCR de Tercera Etapa para Crear ADN Recombinante para pLKTOK108 Tabla 17: Protocolo de Reacción Usado en la Reacción de Montaje de PCR de Tercera Etapa para Crear ADN Recombinante para pLKTOK108 Para crear el vector de expresión pLKT0K4, se utilizó pcDNA3.1™ como un vector de esqueleto. Contiene el gen de neomicina (NEO) para resistencia a G-418 (Geneticin®) para permitir la fácil selección bajo condiciones de búsqueda. El sitio de restricción Spel fue eliminado de pcDNA™3.1 por mutagénesis dirigida al sitio. El promotor EF-la del plásmido pcDEF3 (originalmente pEF-BOS4) se insertó en pcDNA ™3.1, eliminando asi el promotor de C V. Un mapa circular para el vector de expresión pLKTOK4 se representa en la Figura 1.

La clonación se realizó en los productos de PCR final usando un kit de Clonación TOPO8 TA. Después de la digestión con enzimas de restricción BamHI y Xbal, el fragmento deseado del clon TOPO se ligó al vector de expresión pLKTOK4 que también fue digerido con BamHI y Xbal .

La reacción de ligación se utilizó para transformar células de E. coli químicamente competentes 12 y luego se seleccionó en placas de agar de ampicilina/caldo Luria (LB) . Los plásmidos de clones de E. coli individuales se aislaron usando kit miniprep de ADN de QIAGEN y se secuenciaron con los cebadores SP6 (SEC ID NO: 55) , EF5S (SEC ID NO: 54) y pSMUCH2 (SEC ID NO : 53) .

Un clon determinado para contener el ADN recombinante deseado por secuenciación de ADN y usado para hacer una gran cantidad de ADN de plásmido puro usando un kit QIAGEN Maxiprep kit. Este ADN maxiprep se utilizó para la transfección en células de ovarios de hámster chino deficientes de dihidrofolato reductasa (CHO-DG44) .

Una línea celular de CH0-DG44 adaptada a suspensión, libre de suero, llamada S1-CHO-DG44, se utilizó para desarrollar las líneas celulares de producción de pLKTOK108. Brevemente, las transfecciones se hicieron usando un dispositivo Nucleofector° de Amaxa Biosystems y Nucleofect ion® kit V usando ya sea ADN circular no linealizado o ADN de plásmido linealizado tratado con enzima de restricción Pvu I . Las células transfectadas se mantuvieron en medio de crecimiento IS-CHO-V-GS por 48 horas antes del intercambio en medio de selección G-418. Las células transfectadas vivas se alimentaron con medio de selección G-418 fresco y se mantuvieron en cultivo hasta la confluencia (-10 a 14 días) . La productividad de pLKTOK108 de cada grupo de transfección se valoró usando un ensayo ELISA de IGg2a de ratón y las células se expandieron para hacer bancos de células congeladas. El grupo de transfección con la más alta productividad por ELISA de IgG2a de ratón se identificó para clonación de dilución limitada donde las células se colocaron en placas de cultivo de tejido 5 x 96 cavidades en Medio de Selección G-418 (aproximadamente 1 célula en cada otra cavidad) . Las placas de 96 cavidades se incubaron en un incubador a 37°C con 5% C02 por 2 semanas sin alimentación. Cincuenta µ? de sobrenadante de cada cavidad que tuvo una colonia única se transfirieron directamente en una placa de ensayo de 96 cavidades para realizar el ensayo ELISA de IgG2a de ratón. Veintitrés clones con alta productividad se identificaron y expandieron secuencialmente a través de las placas de cultivo celular de 24 cavidades y luego placas de cultivo celular de 6 cavidades. El título de anticuerpo del sobrenadante de estos clones se midió a 3 diluciones diferentes en el ensayo ELISA de IgG2a de ratón.

Los mejores 6 clones basado en el título de IgG2a de ratón se expandieron en Medio de Selección G-418 para hacer bancos de células congeladas y se adaptaron a medio Sigma #21 de suspensión libre de suero. La densidad y viabilidad celular se determinaron usando el analizador de Cultivo Celular Automatizado Cedex, y la concentración de proteína en el sobrenadante se midió usando el ensayo ELISA de IgG2a de ratón. Una vez que las células lograron la fase de crecimiento logarítmico, se recolectaron y congelaron a -80°C durante la noche y luego se transfirieron a una cámara criogénica de nitrógeno líquido para almacenamiento.

Para producir la proteína de fusión, las células se descongelaron y colocaron en placas, y subsecuentemente se expandieron serialmente en matraces T grandes y luego en matraces agitadores a densidades de inicio de 3.0xl05 células/mL y se incubaron en un incubador humidificado ajustado a 37°C, con 5% de C02 en un agitador orbital ajustado a 105 rpm. Los cultivos finales se alimentaron con 10% volumen del Medio de Alimentación Especial Sigma #21 en los Días 4 y 7, y 5% de volumen en el día 10. El Medio de Alimentación Sigma #21 consiste de Medio Sigma #21 suplementado con 40 g/L de glucosa, 10 g/L de L-glutamina, 10 g/L de extracto de levadura, y 10 g/L de peptona de soya. El cultivo agitado se recolectó por centrifugación. El sobrenadante que contiene la proteína pLKTOK108 secretada se filtró a través de una unidad de filtro de membrana de poliétersulfona (PES) de bajo enlace de proteína de 0.2 µ??, con el filtrado que contiene pLKTOK108 crudo listo para la purificación o almacenamiento a -80°C para purificación futura.

La purificación inicial involucró sobrenadantes filtrados circulantes que contienen pLKTOK108 sobre la columna de Proteína A Sefarosa a aproximadamente 4°C. La resina luego se lavó con PBS pH 7.4, y la proteína se eluyó con 0.1 M glicina en PBS a pH 3.0 y se neutralizó con 1M fosfato de sodio a pH 6.5. El eluido neutralizado se concentró usando un concentrador Vivaspin con un corte de peso molecular (MWCO) de 30kDa y se cargó en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex 200 (SEC) (Apéndice G) que fue pre-equilibrada con amortiguador PBS pH 7.4 para separar los agregados de esta proteína. La proteína pLKTOK108 purificada se eluye como un pico único, con pureza confirmada en SDS-PAGE y tinción con Coomassie. Las fracciones que contienen los homodímeros de Fe de hGCC (ECD) /mIgG2a se agruparon. Después que la concentración del material agrupado se determinó por absorbancia UV a 280 nm en un espectrofotómetro NanoDrop™ ND1000, la proteína pLKTOK108 purificada se dividió en alícuotas y se almacenó a -80°C.

Ejemplo 2: Generación de mAbs de conejo por inmunización de proteína Los anticuerpos monoclonales de conejo contra la proteína de fusión hGCC (ECD) -mIgG2a RcRbr-mutlI (pLKTOK108) se generaron usando el servicio RabMAb° proporcionado por Epitomics (Burlingame, CA) . Para los propósitos de generación de MAb, la proteína de fusión hGCC (ECD) -mIgG2a RcRbr-mutlI (pLKTOK108) es referida en la presente como MIL-44.

Tres conejos (ML1009, ML1010 y ML1011) se inmunizaron con MIL-44 usando técnicas de inmunización convencionales. El título de suero contra MIL-44 y un antígeno de selección inversa no de GCC (hMadCAM-mFc) se evaluaron usando sangrados de prueba. Las inmunizaciones de refuerzo se administraron subsecuentes a las inmunizaciones iniciales. El conejo con el título de suero más alto, conejo ML1010, se eligió como un candidato para esplenectomía y fusión monoclonal usando los métodos y línea celular de socio de fusión propiedad de Epitomics.

En dos días separados (Día 1 y Día 2), doscientos millones de células de linfocito se fusionaron con 100 millones de células socias de fusión y se colocaron en 20X placas de 96 cavidades, respectivamente. Las placas se mantuvieron en incubadores de cultivo de tejido bajo condiciones estándares. El crecimiento celular se examinó 2-3 semanas después de la fusión y la eficiencia de fusión se computó usando el número de cavidades con crecimiento dividido por el número total de cavidades examinadas. La eficiencia de fusión para la fusión en el Día 1 se midió a 72% de eficiencia de fusión, mientras que la eficiencia de fusión en el Día 2 fue 79%. Un mínimo de dos placas se examinaron para cada fusión como sigue : Todas las 40 placas se seleccionaron usando métodos de ELISA estándar con placas revestidas con 50 ng de MIL-44/cavidad. Un sangrado de ML1010 a dilución de 1:10K se utilizó como un control positivo. 151 clones que tienen un O.D. mayor que 0.5 se consideraron putativamente positivos y fueron expandidos adicionalmente en una placa de 24 cavidades .

Una selección confirmatoria subsecuente se realizó por ELISA usando placas revestidas con 50 ng de MIL-44 o 50 ng de hMadCAM-mFc/cavidad . 143 clones fueron confirmados positivos contra MIL-44 y entre los 72 fueron identificados como MIL-44 específico, es decir, fueron negativos contra la proteína hMadCAM-mFc .

Después de la evaluación de sobrenadante de clones múltiples, varios de los clones múltiples específicos de MIL-44 fueron sub-clonados : incluyendo los clones múltiples #148 y #67. La subclonación se hizo usando el método de dilución de célula limitada. Diversos sobrenadantes de subclon se seleccionaron por ELISA. Las células de hibridoma para los subclones #148-2 y #67-4 se seleccionaron para congelación/banco y para selección y análisis adicional como un reactivo de detección de GCC en un ensayo de inmunohistoquímica (IHC), como se describe en el Ejemplo 3.

Los anticuerpos MIL-4 - 148-2 y MIL-44-67-4 también se clonaron en pcDNA3.1+ neo (Invitrogen) para la producción por transfección transitoria en células de mamífero y para secuenciación . Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos para las cadenas pesada y ligera para los anticuerpos MIL-4 -148-2 y MIL-44-67-4 se proporcionan a continuación. La secuencia señal en cada cadena de IgG se muestra en cursivas; la región variable en cada cadena de IgG se muestra en negrillas; las CDRs se muestran subrayadas.

Secuencia de Ácido Nucleico MIL-44-148-2 H2 (SEC ID NO: 4) ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGT CAGTCAGTGAAGGAGTCCGGGGGAGGCCTCTTCAAGCCAACGGATACCCTGACACTCACCT GCACCGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGTCATAGAATGAACTGGGTCCGCCAGACTCCAGG GAAGGGGCTGGAATGGATCGCAATCATTACTCATAATAGTATCACATACTACGCGAGCTGG GCGAAAAGCCGATCCACCATCACCAGAAACACCAGCGAGAACACGGTGACTCTGAAAATGA CCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCACTTATTTCTGTGCCAGAGAGGATAGTATGGGGTA TTATTTTGACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCATCTCCTCA GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCT CCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTG GAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGC CTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACG TGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAA GCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGC CCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCC ATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCAC TCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGT CTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATG ATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGG ACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAA GCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCAC GAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGA Secuencia de Aminoácidos MIL-44-148-2 H2 (SEC ID NO: 42) M£rGL^¡VL¿¿UAV¿KGVQCQSVKESGGGLFKPTDTLTLTCWSGFSLSSHRM WVRQTPGK GLE IAII HNSI YYASWAKSRSTITl TSENTVTLKMTSIiTAADTATYFCAREDSMGYY FDLWGPGTLVTISS GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSG LYSLSSWSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPK PKDTLMISRTPEVTCWVDVSQDDPEVQFTWYIN EQVRTARPPLREQQFNSTIRWSTLP IAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCM INGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSE QRGDVFTCSVMH EALH HYTQKSISRSPGK Secuencia de Ácido Nucleico MIL-44-148-2 L5 (SEC ID NO: 5) ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCA GATGTGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGT CACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAA CCAGGGCAGTCTCCCAAGCCCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCAT CGCGGTTCAGAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGTGGCGTGGAGTG TGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAGCAGACTTATACTAATAATCATCTTGATAATGGT TTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTG GAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGA GGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCA GATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACA AAGAGTACACCTGCAGGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGG TGACTGTTAG Secuencia de Aminoácidos MIL-44-148-2 L5 (SEC ID NO: 43) MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGGTV IKCQA^QSISNWLAWYQQK PGQSPKPLIYRASTLASGVSSRFRGSGSGTQFTLTISGVECADAATYYCQQTYTNNHLDNG FGGGTEVWK GDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSA DCTYNLSSTLTLTSTQY SHKEYTCRVTQGTTSWQSFNRGDC Secuencia de Ácido Nucleico IL-44-67-4 H2 (SEC ID NO: 6) ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGT CGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCAC AGCCTCTGGATCCGA(^T(^GTAACTATGCAATATCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAG GGGCTGGAATTCATCGGATATATTAGTTATGGTAAAAGTATATACTACGCGAGCTGGGCGA AAGGCCGGTTCGCC^TCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGGATCTGGAAATCACCAGTCC GACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTTTGTGCCAGAGAGGATAGTGCTACTTATAGTCCT AACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA GGGCAACCTAAGGCTCCATCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCT CCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGGTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTG GAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGC CTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACG TGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAA GCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAA CCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGA GCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGC CCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCC ATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCAC TCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGT CTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATG ATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGG ACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAA GCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCAC GAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATGA Secuencia de Aminoácidos MIL-44-67-4 H2 (SEC ID NO: 44) METGLRWLLLVAVL GVQOQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGSDISNYAISWVRQAPGK GLEFIGYISYGKSIYYASWAKGRFAISKTSSTTVDLEITSPTTEDTATYFCAREDSATYSP NLWGPGTLVTVSS GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVT NSGTLTNGVRTFPSVRQSSG LYSLSSWSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPK PKDTLMISRTPEVTCVWDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRWSTLP IAHQDWLRGKEFKC VHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCM INGFYPSDISVEWEK GKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSE QRGDVFTCSV H EALHNHYTQKSISRSPGK Secuencia de Ácido Nucleico MIL-44-67-4 L4 (SEC ID NO: 7) ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCA GATGrGCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGT CACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGTATTAACACCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAA CCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCTCAT CGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGGCGTGGAGTG TGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTTATAATAATCTTGATCGTGCT TTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCACA GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTG GAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGA GGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCA GATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACA AAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGG TGACTGTTAG Secuencia de Aminoácidos MIL-44-67-4 L4 (SEC ID NO: 45) MDraAPrg¿¿GI,¿LLiVLPGARCAYDMTQTPASVEVAVGG VTIKCQASQSINTYLAWYQQK PGQRPKLLIYRASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTISGVECADAATYYCQQGYSYNNLDRA FGGGTEWVT GDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVA KYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSA DCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSWQSFNRGDC Ejemplo 3: Inmunohistoquímica usando anticuerpos anti-GCC Detección de expresión de GCC en modelos de xenoinjerto de tumor humano de mCRC Un ensayo de IHC que usa el anticuerpo MIL-44 -148-2 se desarrolló para evaluar la expresión de GCC en tumores de xenoinjerto de HEK293-GCC y varios xenoinjertos de tumor humano primarios (PHTX) derivados de muestras de pacientes con cáncer colorrectal metastásico (mCRC) en ratones SCID hembras .

Los niveles de proteína GCC en tejidos Fijados en Formal ina, Incrustados en Parafina (FFPE) se evaluaron en secciones de 5 pm de espesor y se incubaron con anticuerpo MIL-44-148-2 (3.5 g/mL) por 1 hora en el teñidor automatizado Ventana Medical Systems (Tucson, AZ) Discovery XT°. Los anticuerpos fueron biotinilados con un anticuerpo secundario anti-cabra de conejo (Vector Laboratories) y se desarrollaron con sistema de mapa de sustrato de 3,3'-diaminobexidina (DAB) (Ventana Medical Systems) . Las placas se contratiñeron con hematoxilina y se capturaron imágenes usando el sistema de barrido de placas completo Aperio.

Los niveles de GCC difirieron significativamente entre estos tumores con puntuaciones H (sistema de puntuación descrito a continuación) que varían desde 4+ en xenoinjertos de tumor HEK293-GCC, y desde 1+ , 1-2+ , 2+ , 2-3+, y 4+ en varios xenoinjertos de tumor PHTX. En general, en tumores con células de tumor diferenciadas en cavidad/moderadas que mantuvieron una estructura epitelial polarizada, GCC se concentró en la placas luminales del tejido de tumor.

Detección de expresión de GCC en muestras de colon humano y microarregios de tumor Los anticuerpos MIL-44-148-2 y MIL-44-67-4 descritos en la presente también fueron seleccionados como un reactivo de detección de GCC en un protocolo de IHC descrito anteriormente usando los xenoinjertos de tumor humano primarios (PHTX) referenciados anteriormente, pelotillas celulares transfectadas con GCC HT29 y HEK293, además de muestras de colon humano maligno y benigno (FFPE y microarreglos de tumor (TMAs) ) .

Las pelotillas celulares transfectadas con GCC HT- 29 y HEK293 GCC se tiñeron como se esperó. Los PHTXs demostraron un amplio intervalo de intensidades de tinción con los clones MIL-44-148-2 y MIL-44-67-4. Tanto MIL-44-148-2 como MIL-44-67-4 se tiñeron positivos en cavidad o moderadamente diferenciaron el carcinoma de colon in si tu o metástasis. Los tumores pobremente diferenciados se tiñeron menos intensamente. El tejido de colon normal demostró tinción apical positiva usando anticuerpos producidos por ambos subclones MIL-44 -148-2 y MIL-44-67-4.

Los anticuerpos de ambos subclones MIL-44 -148-2 y MIL-44 -67-4 proporcionaron tinción intensa y específica fácilmente evidente en las células HEK293 transfectadas con GCC y células HT29 sin alguna tinción no específica en las líneas celulares parentales HEK293 y HT29. Ambos clones también se tiñeron positivos en cavidad o moderadamente diferenciaron el carcinoma de colon in situ o metástasis. Menos tinción fue vista para ambos subclones en carcinomas pobremente diferenciados. El colon normal demostró tinción apical positiva para ambos clones, como se esperó. MIL-44 -148-2 demostró una especificidad y sensibilidad mayor total que MIL-44-67-4 en IHC. Mientras que MIL-44-67-4 demostró un mejor intervalo dinámico que MIL-44-148-2 en pelotillas celulares, MIL-44-148-2 demostró un intervalo dinámico superior sobre aquel de MIL-44-67-4 en TMAs . En general, el subclon MIL-44-148-2 mostró superioridad sobre el MIL-67-4, demostrando mayor sensibilidad y especificidad en IHC, y un intervalo dinámico completo en TMA, y una tinción intensa (puntuación de IHC +2) en colon normal a una baja concentración .

Con base en los resultados de los experimentos de IHC iniciales descritos anteriormente, el subclon MIL-44-148-2 se seleccionó para el desarrollo y validación de un protocolo automatizado equivalente al protocolo de IHC descrito anteriormente usando un teñidor automatizado Tek-Mate. El ensayo de IHC automatizado es una herramienta útil para seleccionar pacientes con cáncer para tumores que expresan GCC como un criterio de enrolamiento de ensayo clínico para un terapéutico de cáncer dirigido a GCC, y generalmente como una herramienta de selección para seleccionar pacientes (por ejemplo, pacientes con cáncer) quiénes deben recibir una terapia dirigida a GCC.

El protocolo de IHC mostrado en la Tabla 18 se desarrolló para la detección de GCC en tejidos y células humanas FFPE, y aproximadamente 53 tumores colorrectales y 20 tejidos de colon normal, así como también 2 TMAs de cáncer de colon (adquiridos de US Biomax) se seleccionaron para la expresión de GCC. Estos tumores cubrieron un intervalo de grados de tumor así como también tejidos metastásicos de cáncer de colon.

Secciones de cuatro mieras se prepararon de las diversas muestras de tejido. Las secciones de tejido se desenceraron mediante cambios de 4 , 5 minutos de xileno seguido por una serie graduada de alcohol a agua destilada. Se utilizó recuperación de epítope inducida por calor de vapor (SHIER) con solución SHIER2 por 20 minutos en la abertura capilar en la cámara superior de un Vaporizador Black and Decker.

Tabla 18A: Procedimiento de IHC Tabla 18B: Hoja de datos de la reactividad de los anticuerpos Un experto en la técnica reconocerá que el potenciador del anticuerpo principal puede ser un anticuerpo secundario anticonejo cultivado en una especie distinta al conejo (por ejemplo, humano, rata, cabra, ratón, etc.) que tiene el mismo isotipo que mAb de conejo de MIL-44-148-2 o MIL-44-67 (IgG de conejo) o un reactivo que es adecuado para amplificar la señal MIL-44.

El protocolo anterior utilizó una incubación de anticuerpo durante la noche de MIL-44-148-2 a 1.0ug/ml con una detección de peroxidasa no basada en biotina (kit Ultravision de Thermo/Lab Vision) y DAB como cromógeno. Este procedimiento fue completamente automatizado usando el TechMate 500 o TechMate 1000 (Roche Diagnostics) . Después de la tinción, las placas se deshidrataron a través de una serie de alcohol a etanol absoluto seguido por enjuagues con xileno. Las placas se colocaron permanentemente en cubreobjetos con cubreobjetos de vidrio y CytoSeal . Las placas se examinaron bajo un microscopio para valorar la tinción. La tinción positiva se indicó por la presencia de un producto de reacción café (DAB-HRP) . La contratinción de hematoxilina proporciona una tinción nuclear azul para valorar la morfología de célula y tejido.

En la evaluación de la tinción de GCC, se determinó que un procedimiento de puntuación H sería el mejor procedimiento para cuantificar la expresión de GCC. El procedimiento de puntuación H proporciona resolución de datos óptima para determinar la variación de intensidad y porcentaje de tumor de tinción dentro y entre los tipos de tumor. También proporciona una buena herramienta para determinar umbrales para tinción positiva. En este método, se proporciona el porcentaje de células (0-100) dentro de un tumor con intensidades de tinción que varían desde 0-3+ . Con el método actual, se proporcionaron puntuaciones con intensidades de 0, 0.5, 1, 2 y 3. Dependiendo del marcador, la tinción de 0.5 se puede clasificar como positivo o negativo, y refleja tinción ligera pero perceptible para el marcador. Para obtener una puntuación H, el porcentaje de células de tumor se multiplicó por cada intensidad y se agregó conjuntamente: Puntuación H = (% tumor*l) + (% tumor*2) + (% tumor*3) . Por ejemplo, si un tumor es 20% negativo (0) , 30% +1, 10% +2, 40% +3, esto daría una puntuación H de 170.

La puntuación H máxima es 300 (100% * +3) , por localización sub-celular (es decir, apical o citoplásmica) , si 100% de etiqueta de células de tumor con intensidad de 3+. Inicialmente, como un control, la puntuación H total sola no será usada para comparar las muestras, sino se evaluará además para una revisión del desglose del porcentaje de células en cada intensidad. Por ejemplo, una puntuación de 90 podría representar 90% de tinción de células de tumor con intensidad de 1+ o 30% de células con intensidad de 3+. Estas muestras tienen la misma puntuación H pero expresión de GC muy diferente. El porcentaje de células que se clasifican en cada intensidad puede variar, pero normalmente se clasifican en incrementos de 10%; sin embargo, un pequeño porcentaje de puntuación de un componente único se puede estimar a 1% y 5% también para demostrar que algún nivel de tinción está presente. Para GCC, la tinción apical se puede considerar para evaluación a incrementos de bajo nivel, tales como 1 y 5%.

Dos diferentes localizaciones sub-celulares se clasificaron para GCC usando el procedimiento de puntuación H. Estas incluyen tinción citoplásmica y tinción asociada apical. El patrón de tinción citoplásmica generalmente se obsevó como difuso en todo el citoplasma de células de tumor. Sin embargo, en algunos casos hubo variaciones de la tinción citoplásmica, las cuales incluyeron tinción globular intensa o tinción granular gruesa, punteada. La tinción globular intensa se clasificó como tinción citoplásmica 3+. La tinción punteada estuvo asociada con la tinción apical y no se dio una puntuación separada para este tipo de tinción citoplásmica (n=4 muestras para tinción punteada) . La tinción apical de GCC se observó cuando estuvieron presentes lúmenes. Otros patrones de tinción de GCC observados incluyeron tinción no de lumen tipo membrana (un caso) y tinción extracelular presente en el lumen de tumor. En tejidos de colon normal, la tinción generalmente fue apical junto con tinción citoplásmica difusa.

Puesto que las puntuaciones H se obtuvieron para expresión de GCC tanto citoplásmica como apical, y puesto que no se sabe si un tipo de localización es más crítico sobre otro para la eficiencia de una terapia dirigida a GCC, todos los datos se capturaron y en algunos casos, una puntuación H agregada se generó usando la suma de expresión de GCC tanto apical como citoplásmica. En tales casos, la puntuación H máxima llegó a ser 600 para la puntuación agregada (300 apical + 300 citoplásmica) .

En general, la tinción en unas muestras de colon normal ilustró que la GCC está anatómicamente privilegiada, siendo expresada en la superficie apical. La GCC se expresó en más de 95% de muestras de tumor y, en contraste con el tejido normal, demostró tinción citoplásmica difusa en algunos casos. La tinción de GCC focal fuerte en muestras de metástasis de hígado de CRC humana también se observó.

La Tabla 19A muestra los resultados de tinción de puntuación H citoplásmica y apical para tejidos normales y de tumor que fueron seleccionados. Los datos mostrados en la Tabla 19A se desglosan de acuerdo con el origen de la muestra (interno (denotado como MLN ) , TMAs (denotado como BIOMAX) , y CRO (denotado como QualTek) ) y grado de tumor. Los datos de resumen de positividad se proporcionan cuando se usan umbrales de intensidad de tinción de 0.5 y 1.0+. Un total de 173 muestras de tumor se clasificaron. Cuando se usa un corte de 0.5+ para la intensidad de tinción positiva para tinción ya sea citoplásmica o apical, 95% de tumores se consideran positivos. Cuando se usa un corte de 1.0+, 92% de muestras se consideraron positivas.

La fuente de tejidos muestra la variación del porcentaje de células de tumores positivos así como también las puntuaciones H. Para umbral de positividad de tinción de 1+, el intervalo es desde 84% (muestras de MTB de tumor CRO) a 100% (muestras internas o muestras de tejido único de CRO -nótese el número menor de muestras en estos grupos) . Los tejidos de tumor internos mostraron una puntuación H apical muy alta de 253 (n=9 muestras) . También hubo diferencias en los resultados de puntuación de los 2 TMAs . US Biomax TMA C0992 se tiñó más fuerte que C0701. Sin querer limitarse a la teoría, la diferencia en los TMAs puede ser debido a una diferencia con la fijación con la fuente de tejidos o un bloque podría haber sido cortado más recientemente que el otro .

Se consideraron la estabilidad del antígeno en una sección cortada y la frescura de las muestras cortadas. Las muestras probaron las muestras incluidas en el estudio actual que fueron cortada y almacenadas y las muestras que fueron cortadas frescas, indicando una necesidad de búsqueda adicional de la estabilidad de las muestras de tejido con el tiempo .

Algunas diferencias fueron observadas en positividad de GCC y grado de tumor (ver Tabla 19B) , con mayor tinción positiva asociada con tumores bien diferenciados vs tumores pobremente diferenciados (seis tumores de US Biomax no incluyen un grado) . Los tumores grado 1 (n=20) mostraron 100% de positividad; los tumores grado 2 (n=95) se etiquetaron con 98% de casos positivos; y los tumores grado 3 (n=44) se etiquetaron a una tasa de positividad de 88%. Los tumores pobremente diferenciados generalmente carecen de lumen, lo cual puede dar razón de algo de esta disminución en la tinción debido a una carencia de tinción apical. Este porcentaje de positividad estuvo basado en un umbral de intensidad de tinción de 0.5+. Siete de 7 metástasis distantes fueron positivas (de tejidos CRO e internos) . Los tumores metastásicos del US Biomax TMA fueron listados como metástasis a nodulos linfáticos.

En general, la GCC tiñe un porcentaje muy alto de tumores de color y tejidos de colon normal sin considerar la fuente del tejido o el grado de tumor.

Tabla 19A: Resumen de tinción de cáncer por fuente de muestra Tabla 19B: Resumen de tinción de cáncer de colon por grado de tumor La precisión intra-ensayo del ensayo de IHC de GCC se evaluó dentro de una corrida utilizando 5 replicas cada una de tres pelotillas celulares y 14 diferentes tejidos de carcinoma de colon. Las pelotillas celulares se prepararon en placas separadas . Las muestras de tumor de colon se incluyeron en dos diferentes bloques de múltiples tumores. Estos tejidos fueron clasificados para reactividad de IHC de GCC.

Precisión de tinción de pelotillas celulares: Se observó tinción casi idéntica en todas las 5 replicas intra-corrida de las 3 pelotillas celulares.

Precisión de tinción de muestras de tumor de colon: Se observó tinción muy similar a casi idéntica entre las 5 replicas intra-corrida de las 14 muestras de tumor de colon. Las muestras fueron clasificadas por un patólogo certificado usando el procedimiento de puntuación H como se describió previamente antes. La desviación estándar demostró que en todos los casos la varianza fue mínima, demostrando así buena precisión de tinción dentro de la misma corrida. En general, hubo tinción de IHC de GCC intra-corrida muy consistente de la pelotilla celular y muestras de carcinoma de colon probadas .

La variabilidad de ensayo en medio de la corrida y la variabilidad debido a diferentes operadores fueron evaluadas en 5 corridas de tinción de IHC de GCC separadas.

Cuatro corridas fueron realizadas en diferentes días por un operador y un segundo operador realizó la quinta corrida. La tinción incluyó la prueba de los mismos tejidos en la prueba de precisión descrita anteriormente.

Reproducibilidad de tinción de pelotillas celulares: Tinción casi idéntica como se observó en todas las 5 replicas inter-corrida de las 3 pelotillas celulares.

Reproducibilidad de tinción de muestras de tumor de colon: Se observó tinción muy similar a casi idéntica entre las 5 replicas inter-corrida de las 14 muestras de tumor de colon. Las muestras se clasificaron por un patólogo certificado usando el procedimiento de puntuación H como se describió previamente. La desviación estándar demostró que en todos los casos la varianza como mínima, demostrando así buena reproducibilidad de tinción de día a día y con un diferente operador. En general, hubo tinción de IHC de GCC inter-operador e inter-corrida muy consistente de la pelotilla celular y muestras de carcinoma de colon probadas.

La especificidad del ensayo de IHC de GCC se evaluó probando un panel de tejidos humanos normales. Estos tejidos humanos normales incluyeron 30 diferentes tipos de tejido: glándula suprarrenal, vejiga, médula ósea, mama, corteza cerebral, trompas de falopio, corazón, riñon, hígado, pulmón, nodulo linfático, nervios, ovarios, páncreas, parótida (glándula salivar), pituitaria, placenta, próstata, músculo esquelético, piel, médula espinal, bazo, estómago, testículos, timo, tiroides, amígdalas, uretra, y útero. Para cada tipo de tejido, al menos 3 especímenes únicos se tiñeron y evaluaron para inmunorreactividad de GCC.

En general, el ensayo de IHC de GCC usando el anticuerpo MIL-44-148-2 se mostró por el ensayo de IHC descrito en la presente como muy específico para las muestras de tumor de colon en comparación con la tinción de tejido normal, particularmente para tinción apical. La tinción apical solamente se detectó en 2 de las muestras estomacales; si embargo, esta tinción solamente se observó en el control negativo. La tinción citoplásmica, generalmente ligera, se observó en diversos tipos de tejido, incluyendo folículos de ovarios (1 de 3 muestras), piel (2 de 3 muestras), epitelio glandular de próstata (ligero en 3 de 3 casos) , pituitaria (2 de 3 casos) , epitelio de útero (3 de 3 casos) , epitelio de trompas de falopio (2 de 3 casos) , trofoblastos de placenta (ligero en 2 de 3 casos) y pulmón (endotelio en 3 de 3 casos y epitelio del bronquiolo en 1 de 3 casos) . La tinción citoplásmica más fuerte (2+) estuvo presente en un caso de las trompas de falopio y un caso de pituitaria. En ambos casos hubo tinción más ligera en los mismos compartimientos en el control negativo. Las células de plasma fueron positivas en un número de tejidos, incluyendo bazo, amígdala y nodulo linfático. Los histiocitos fueron positivos en bazo, pulmón y nodulo linfático. La tinción estromal estuvo presente en los testículos (2 de 3 casos) , útero (3 de 3 casos) y ovarios (1 de 3 casos) . La tinción extracelular de vasos sanguíneos se observó ampliamente y pareció ser enlace no específico de suero.

El ensayo de GCC, usando el anticuerpo monoclonal de conejo, MIL-44-148-2 , en la plataforma de tinción TechMate muestra tinción inter e intra-corrida consistente de tumores y pelotillas celulares de control. El ensayo de GCC parece ser altamente sensible en carcinoma de colon ya que tiñe la vasta mayoría de muestras de tumor de colon probadas. El ensayo de GCC también parece ser mucho más específico para tumores de colon en comparación con tejidos normales. La expresión de GCC observada en muchos tumores de colon es mucho más fuerte que cualquier tinción observada en un panel normal de 30 tejidos con al menos 3 replicas de cada tipo de tejido. No se detectó tinción de GCC apical específica en cualquiera de los tejidos normales, mientras que la tinción apical es común en la mayoría de las muestras de GCC.

Solamente la tinción citoplásmica se observó en algunos tipos de tejido normal y esta tinción es generalmente ligera. El anticuerpo MIL-44-148-2 parece ser un marcador de IHC reproducible , sensible y relativamente específico para la tinción de tumores de colon fijados en formalina, incrustados en parafina (FFPE) .

Ejemplo 4: Inmunohistoquímica Adicional en Modelos de PHTX No Colorrectales y Microarreglos de Tumor y Muestras Clínicas Humanas Colorrectales y No Colorrectales El ensayo de IHC automatizado descrito en el Ejemplo 3 se utilizó para evaluar la expresión de GCC (es decir, expresión de GCC apical, citoplásmica y/o agregada) en una variedad de muestras no colorrectales de diferentes fuentes, incluyendo xenoinjertos de tumor humano primario (PHTX) derivados de muestras de pacientes con cáncer gástrico y cáncer pancreático en ratones SCID hembras, y varios microarreglos de tumor (TMAs) comprada de US BioMax, Pantomics y otras fuentes comerciales) específicos para cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de pulmón y leiomiosarcomas/rabdomiosarcomas . La expresión de GCC también se valoró vía el ensayo de IHC automatizado descrito en el Ejemplo 3 en una variedad de muestras clínicas humanas, incluyendo muestras de tumor gástrico, pancreático y esofágico humano obtenidas de la base de datos de tejidos de una CRO especial (QualTek) acoplada para procesar el ensayo de IHC automatizado, y cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer esofágico, y cáncer de intestino delgado derivados de pacientes con cáncer analizados para expresión de GCC previo al enrolamiento en un estudio primero en humanos, de escalación de dosis, multicéntrico, abierto de un conjugado de anticuerpo-fármaco dirigido a GCC, designado como MLN0264, en pacientes adultos con malignidades gastrointestinales avanzadas que expresan Guanilil Ciclasa C (Estudio C26001, ClinicalTrials.gov identificador NCT01577758) .

Los resultados de la tinción de IHC en varias muestras de tejido colorrectal canceroso y normal y te idos no colorrectales (gástrico, pancreático, de intestino delgado, de esófago, de pulmón, rabdomiosarcoma, leiomiosarcoma) de varias fuentes (PHTX, muestras clínicas humanas y microarreglos de tumores) se muestran en las Tablas 20-32 a continuación. Las Tablas 20-32 incluyen las puntuaciones de IHC (0, 0.5+, 1+, 2+ y 3+) y las puntuaciones H correspondientes calculadas con base en las puntuaciones de IHC para tinción de GCC tanto Apical ("A") como citoplásmica ("C" o "Cito") en los diversos tejidos probados. Además, la Tabla 32 muestra una comparación de los datos de expresión de IHC de GCC en muestras clínicas humanas de cáncer metastásico o primario, en cada caso obtenido del mismo paciente. Tal como se muestra en la primera columna a la izquierda, las muestras "A" (es decir, 1A, 2A, 3A, 4A, 5A, 6A, 7A, 8A, 9A 10A, etc.) se refieren a muestras de tumores primarios, donde las muestras "B" (es decir, IB, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 8B, 9B, 10B, etc.) se refieren a muestras de tumor metastásico obtenidas del mismo paciente del cual se obtuvo la muestra de tumor primaria correspondiente (la muestra "A" correspondiente). En otras palabras, la designación "1A" y "IB" se refieren a tumores primarios y metastásicos respectivamente, obtenidos del mismo paciente; la designación "2A" y "2B" se refieren a tumores primarios y metastásicos, respectivamente, obtenidos de otro paciente, y así sucesivamente. Una mayoría de las muestras de tumores, mostradas en la Tabla 32, se obtuvieron de pacientes que tenían cáncer colorrectal primario y mestastásico, excepto donde se indicó lo contrario, tal como se refleja en la columna titulada "Comentarios", en cuyo caso se especifica el tipo de cáncer que no es colorrectal particular. Como se puede ver en la columna "Comentarios" en la Tabla 32, algunas muestras de tumores neuroendócrinos, carcinomas de células renales, tumores gástricos, GIST gástricos, tumores pancreáticos y leiomiosarcoma uterino, también se utilizaron para la expresión GCC mediante el ensayo IHC.

Tabla 20 : Ensayo de IHC en Modelo PHTX de Cáncer Gástrico Humano Tabla 21: Modelo PHTZ de Cáncer Pancreático Humano Tabla 22A : Tinción IHC de GCC en MicroAr eglo de Tumor (TMA) Pancreático US Biomax Pl 921 ?99 314 ( 317 323 325 328 Tabla 22B: Resumen de Tinción de GCC en MicroArreglo de Tumor (TMA) Pancreático DS Biomax P1 21 33 16 38 106 171 62 % Tabla 23A: Tinción IHC de GCC en MicroArreglo de Ttimor (TMA) Pancreático US Biomax PA1002 335 337 338 Tabla 23B: Resumen de Tinción de GCC en MicroArreglo de Tumor (TMA.) Pancreático US Biomax PA1002 Tabla 24A: Tinción IHC de GCC en MicroArreglo de Tumor Pancreático Pantomics PAC 81 - Tabla 24B : Resumen de Tinción de GCC en TMA Pancreático Pantomics PAC481 - Parte 1 Tabla 24C : Tinción IHC de GCC en MicroArreglo de Tumor Pancreático Pantomics PAC481 - Parte 2 360 361 363 Tabla 2 D: Resumen de Tinción de GCC en TMA Pancreático Pantomics PAC481 - Parte 2 Tabla 25: Tinción IHC de GCC en MicroArreglo de Tumor Gástrico US Bxomax STC1501 - Parte 1 ??? 373 ??? Tabla 25B : Resumen de Tinción de GCC en TMA Gástrico US Biomax STC1501 - Parte 1 Tabla 25C : Tinción IHC de GCC en Microarreglo de Tumor Gástrico US Bioma STC1501 - Parte 2 Tabla 25D: Resumen de Tinción de GCC en TMA Gástrico US Biomax STC1501 - Parte 2 Tabla 26A: Tinción de IHC de GCC en Microftrreglo de Tumor Pantomics ESC1021 EsophEdadal Tabla 26B: Resumen de Tinción de GCC en MicroArreglo de Tumor Pantomics ESC1021 EsophEdadal Tabla 27A: Tinción IHC de GCC en MicroArreglo de Tumor US BioMax ES8010 EsophEdadal -Parte 1 Tabla 27B : Resumen de Tinción de GCC en TMA US BioMax ES8010 EsophEdadal - Parte 1 Tabla 27C : Tinción IHC de GCC en MioroArreglo de Tumor US BioMax ES8010 EsophEdadal Parte 2 Tabla 27D: Resumen de Tinción de GCC en TMA US BioMax ES8010 EsophEdadal -Parte 2 Tabla 28A: Tinción IHC de GCC en MicroArreglo de Tumor de Pulmón US BioMax LC20813 Tabla 28B: Resumen de Tinción de GCC en TMA de Pulmón US BioMax LC20813 Tabla 29A: Tinción IHC de GCC en MicroArreglo de Tumor Leiomiosarcoma/Rabdomiosarcoma a 29B: Resultados de Puntuación de Ab de Control Negativo en icroArreglo de Tumor Leiomiosarcorna/Rabdomiosarcoma Tabla 30A: Tinción IHC de GCC en Muestras Clínicas Humanas de Cáncer No Colorrectal de una Base de Datos de Tejido CRO (QualTek) Tabla 30B : _Tinción IHC de GCC en Muestras Clínicas Humanas de Cáncer Colorrectal y de Colon Normal (Grado de Tumor, 1, 2, 2 y 3 o 3) de una Base de Datos de Tejido CRO (QualTek) Tabla 31: Muestars Clínicas del Estudio de Escalación de Dosis de Fase 1 C260001 de Terapéutico MLN0264 dirigido a GCC Tabla 32: Expresión IBC de GCC en Maestras de Tomo res Colorrectales Metastasi cos y Primari os in Primary Resumen de los Resultados de Tinción de IHC de GCC Los resultados de tinción de IHC de GCC mostrados en los Ejemplos 3 y 4 demuestran que la GCC se expresa en una variedad de malignidades gastrointestinales, incluyendo tumores colorrectales , estomacales, del intestino delgado y esofágicos, así como también tumores no gastrointestinales incluyendo tumores pancreáticos y adenocarcinomas de pulmón, carcinomas de células escamosas de pulmón, leiomiosarcomas y rabdomiosarcomas . Un resumen de los diversos análisis de microarreglo de tumor se muestra en la Tabla 33 a continuación .

Tabla 33 : El análisis de ??? muestra que la GCC se expresa en una variedad de malignidades * (% positivo se define por puntuación H >10) Las muestras clínicas humanas de malignidades gastrointestinales y relacionadas con GI también probaron ser positivas para niveles variados de expresión de GCC, como se resume en la Tabla 34 a continuación.

Tabla 34: Porcentaje de Tumores Seleccionados en C26001 positivo (Positivo se define como una puntuación H > = a 10 ya sea apical o citoplásmica) Los resultados resumidos en la Tabla 34 son similares a los resultados observados mediante la selección de TMA resumida en la Tabla 33.

La distribución de Puntuación H combinada/agrehada de expresión de GCC mediante tipos de tumor de la selección de enrolamiento de paciente para el ensayo C26001 se representa en las Figuras 2A-2D.

La distribución de puntuación H combinada/agregada de expresión de GCC de los diversos microarreglos de tumor colorrectal, gástrico, y pancreático seleccionados se representa en las Figuras 3A-3C.

Claims (104)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de anticuerpo anti-GCC, caracterizada porque comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2, and CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos SEC ID NOs : 21, 22 y 23, respectivamente, o SEC ID NOs: 33, 34 y 35, respectivamente; y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 , y CDR3) que comprenden que comprenden secuencias de aminoácidos SEC ID NOs: 27, 28 y 29, respectivamente, o SEC ID NOS: 39, 40 y 41, respectivamente.

2. Una molécula de anticuerpo anti-GCC, caracterizada porque compite para el enlace o enlaza el mismo epítope como un anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 , y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos SEC ID NOs: 21, 22 y 23, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2, y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos SEC ID NOs: 27, 28 y 29, respectivamente.

3. Una molécula de anticuerpo anti-GCC, caracterizada porque compite para el enlace o enlaza el mismo epítope como un anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 , y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos SEC ID NOs : 33, 34 y 35, respectivamente; y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2, y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos SEC ID NOS: 39, 40 y 41, respectivamente.

4. La molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque caracterizada porque la molécula de anticuerpo anti-GCC es un anticuerpo monoclonal.

5. La molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula de anticuerpo anti-GCC es un anticuerpo de conejo o derivado de conejo.

6. La molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal de conejo.

7. La molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque adicionalmente comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 11 o SEC ID NO: 15, and una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 13 o SEC ID NO: 17.

8. La molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada comprenden las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 21, 22 y 23, respectivamente, y las CDRs de cadena ligera comprenden las secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs: 27, 28 y 29, respectivamente.

9. La molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porquela región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 11 y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 13.

10. La molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada porque la molécula de anticuerpo anti-GCC se conjuga a una etiqueta detectable.

11. La molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la etiqueta detectable se selecciona del grupo que consiste de peroxidasa de rábano picante (HRP) , fosfatasa alcalina, galactosidasa , glucoamilasa, lisozitna, sacárido oxidasas, por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas heterocíclicas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidina, etiquetas de espin, etiquetas de bacteriófagos, radicales libres estables.

12. La molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la etiqueta detectable es un fluoróforo seleccionado de fluoresceína o un derivado de la misma, rodamine o un derivado de la misma, dansilo, umbeliferona, una luceriferasa, luciferina, y 2 , 3 -dihidroftalazindionas .

13. La molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la etiqueta detectable es un agente radioactivo seleccionado del grupo que consiste de 32P, 3H, 14C, 188Rh, 43K, 52Fe, 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 99Tc, ^??, 113M In, 123I, 125I , 127Cs, 129Cs, 131I, 132I, 197Hg, 203Pb y 206Bi, y 213Bi.

14. Secuencias de ácido nucleico aisladas, caracterizadas porque codifican una molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 7, 8 y 9.

15. Una célula, caracterizada porque comprende las secuencias de ácido nucleico aisladas de conformidad con la reivindicación 14.

16. Un método para producir una molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 7, 8 o 9, caracterizado porque comprende cultivar la célula de conformidad con la reivindicación 15 bajo condiciones que permiten la producción de una molécula de anticuerpo, por lo cual se produce la molécula de anticuerpo conformidad con la reivindicación 1, 7, 8 o 9.

17. Un vector, caracterizado porque comprende una o ambas de la cadena ligera y cadena pesada de una molécula de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 7, 8 o 9.

18. Un método para detectar una molécula de GCC en una muestra biológica, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra biológica con una molécula de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 y determinar si la molécula de anticuerpo enlaza la molécula de GCC.

19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el método de detección comprende un ensayo de inmunohistoquímica .

20. El método de conformidad con la reivindicación 18 o claim 19, caracterizado porque la muestra biológica es una biopsia de tumor derivada de un paciente que se sospecha que tiene un cáncer que expresa GCC.

21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-20, caracterizado porque adicionalmente comprende la etapa de cuantificar la expresión de GCC en la muestra biológica.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la cuantificación de la expresión de GCC comprende la expresión de GCC apical en la muestra biológica, expresión de GCC citoplásmica en la muestra biológica, o ambas.

23. El método de conformidad con la reivindicación 21 o 22, caracterizado porque la etapa de cuantificación comprende un procedimiento de puntuación H.

24. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el cáncer que expresa GCC se selecciona del grupo que consiste de: cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, un sarcoma de tejido blando, un tumor neuroectodérmico y un tumor neuroendocrino . 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el cáncer de pulmón es carcinoma de células escamosas o adenocarcinoma .

25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el sarcoma de tejido blando es leiomiosarcoma o rabdomiosarcoma .

26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el tumor neuroendocrino es un tumor neuroendocrino gastrointestinal o broncopulmonar .

27. Un kit, caracterizado porque comprende la molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13 e instrucciones de uso.

28. El kit de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque adicionalmente comprende un agente terapéutico dirigido a GCC.

29. El kit de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el agente terapéutico dirigido a GCC comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC.

30. El kit de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC terapéutica es un anticuerpo monoclonal.

31. El kit de conformidad con la reivindicación 29 o 30, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC terapéutica es un anticuerpo de IgGl humano.

32. El kit de conformidad con la reivindicación 29, 30 o 31, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC terapéutica comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 67, 68 y 69, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs: 70, 71 y 72, respectivamente.

33. El kit de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC terapéutica comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 79, and una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 80.

34. El kit de conformidad con la reivindicación 29-33, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC terapéutica se conjuga a un agente citotóxico.

35. El kit de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el agente citotóxico es una molécula de auristatina.

36. El kit de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la molécula de auristatina es monometil auristatina E (MMAE) o monometil auristatina F (MMAF) .

37. El kit de conformidad con la reivindicación 34-36, caracterizado porque el agente citotóxico se conjuga al anticuerpo vía un enlazante que contiene una porción de maleimida .

38. El kit de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el enlazante de maleimida se selecciona del grupo que consiste de maleimidocaproilo (me) , maleimidocaproil-L-fenilalanina-L-lisina-p-aminobencilcarbamato, y maleimidocaproil-L-valina-L-citrulina-p-aminobencilcarbamato (ve) .

39. El kit de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el agente terapéutico dirigido a GCC es un inmunoconjugado caracterizado por cualquiera de las fórmulas (1-4) , {1-5) o (1-6) : en donde Ab es una molécula de anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 67, 68 y 69, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 70, 71 y 72, respectivamente, y en donde m es un entero desde 1 a 8.

40. El kit de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque m es desde 3 a 5.

41. El kit de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque m es aproximadamente 4.

42. Un método para tratar un paciente que tiene una enfermedad caracterizada por una o más células que expresan GCC, caracterizado porque comprende: a. detectar la expresión de proteína GCC en una muestra biológica obtenida del paciente, por ejemplo, por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-26; y b. administrar un agente terapéutico dirigido a GCC, por ejemplo, un agente terapéutico dirigido a GCC descrito en la presente, al paciente si la muestra biológica expresa GCC.

43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la etapa de detección comprende las etapas de: i) poner en contacto la muestra biológica con una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 , y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 21, 22 y 23, o SEC ID NOs : 33, 34 y 35, respectivamente; y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 , y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs: 27, 28 y 29, o SEC ID NOS: 39, 40 y 41, respectivamente; y ii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y proteína GCC.

44. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la etapa de detección se realiza vía inmunohistoquímica .

45. El método de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el agente terapéutico dirigido a GCC comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC.

46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC terapéutica es un anticuerpo monoclonal .

47. El método de conformidad con la reivindicación 45 o 46, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti- GCC terapéutica es un anticuerpo de IgGl humano.

48. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 67, 68 y 69, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 70,71 y 72, respectivamente.

49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC adicionalmente comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO : 79, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 80.

50. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC se conjuga a un agente citotóxico.

51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el agente citotóxico es una molécula de auristatina.

52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la molécula de auristatina es monometil auristatina E (MMAE) o monometil auristatina F (MMAF) .

53. El método de conformidad con la reivindicación 50-53, caracterizado porque el agente citotóxico se conjuga vía un enlazante que contiene una porción de maleimida.

5 . El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el enlazante de maleimida se selecciona del grupo que consiste de maleimidocaproilo (me) , maleimidocaproil-L-fenilalanina-L-lisina-p-aminobencil-carbamato, y maleimidocaproil-L-valina-L-citrulina-p-aminobencilcarbamato (ve) .

55. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la terapia dirigida a GCC es un inmunoconjugado caracterizado por cualquiera de las fórmulas (1-4) , (1-5) O (1-6) : en donde Ab es una molécula de anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 67, 68 y 69, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs: 70, 71 y 72, respectivamente, y en donde m es un entero desde 1 a 8.

56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque m es desde aproximadamente 3 a aproximadamente 5.

57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque m es aproximadamente 4.

58. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-57, caracterizado porque la enfermedad caracterizada por una o más células que expresan GCC se selecciona del grupo que consiste de: cáncer, síndrome inflamatorio del intestino, enfermedad de Crohn o enfermedad de Parkinson.

59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, un sarcoma de tejido blando, un tumor neuroectodérmico y un tumor neuroendocrino .

60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el cáncer de pulmón es carcinoma de células escamosas o adenocarcinoma .

61. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el sarcoma de tejido blando es leiomiosarcoma o rabdomiosarcoma .

62. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el tumor neuroendocrino es un tumor neuroendocrino gastrointestinal o broncopulmonar.

63. El método de conformidad con la reivindicación 42-62, caracterizado porque la muestra biológica es una biopsia de tejido o célula.

64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la biopsia de tejido o célula es una biopsia de tumor.

65. Un método para determinar la sensibilidad de células de cáncer a un agente terapéutico dirigido a GCC y/o evaluar si un sujeto es un candidato potencial para una terapia dirigida a GCC, caracterizado porque el método comprende las etapas de : i) proporcionar una muestra de células de cáncer de un paciente que tiene cáncer; ii) poner en contacto la muestra con una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente, por ejemplo, un anticuerpo anti-GCC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, por ejemplo, un anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs: 21, 22 y 23, o SEC ID NOs : 33, 34 y 35, respectivamente; y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 , y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 27, 28 y 29, o SEC ID NOS: 39, 40 y 41, respectivamente; y iii) detectar la formación de un complejo entre la molécula de anticuerpo anti-GCC y proteína GCC, por lo cual se determina la sensibilidad del cáncer al agente terapéutico dirigido a GCC, por ejemplo, un agente terapéutico dirigido a GC descrito en la presente, y/o se determina si un sujeto es un candidato para el tratamiento con una terapia dirigida a GCC, por ejemplo, una terapia dirigida a GCC descrita en la presente .

66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la etapa de detección se realiza vía inmunohistoquímica .

67. El método de conformidad con la reivindicación 65 o 66, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, un sarcoma de tejido blando, un tumor neuroectodérmico y un tumor neuroendocrino .

68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el cáncer de pulmón es carcinoma de células escamosas o adenocarcinoma .

69. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el sarcoma de tejido blando es leiomiosarcoma o rabdomiosarcoma .

70. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el tumor neuroendocrino es un tumor neuroendocrino gastrointestinal o broncopulmonar.

71. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65-70, caracterizado porque adicionalmente comprende la etapa de administrar el agente terapéutico dirigido a GCC, por ejemplo, un agente terapéutico dirigido a GCC descrito en la presente, al paciente.

72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el agente terapéutico dirigido a GCC comprende una molécula de anticuerpo anti-GCC.

73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC terapéutica es un anticuerpo monoclonal .

7 . El método de conformidad con la reivindicación 72 o 73, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC terapéutica es un anticuerpo de IgGl humano.

75. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72, 73 o 74, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC terapéutica comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3 ) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 67, 68 y 69, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 70,71 y 72, respectivamente .

76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC terapéutica adicionalmente comprende una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 79, y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la SEC ID NO: 80.

77. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 72-76, caracterizado porque la molécula de anticuerpo anti-GCC se conjuga a un agente citotóxico.

78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el agente citotóxico es una molécula de auristatina.

79. El método de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque la molécula de auristatina es monometil auristatina E (MMAE) o monometil auristatina F (MMAF) .

80. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 77, 78 o 79, caracterizado porque el agente citotóxico se conjuga vía un enlazante que contiene una porción de maleimida.

81. El método de conformidad con la reivindicación 80, caracterizado porque el enlazante de maleimida se selecciona del grupo que consiste de maleimidocaproilo (me) , maleimidocaproil-L-fenilalanina-L-1isina-p-aminobencil-carbamato, y maleimidocaproil-L-valina-L-citrulina-p-aminobencilcarbamato (ve) .

82. El método de conformidad con la reivindicación 65-71, caracterizado porque el agente terapéutico dirigido a GCC es un inmunoconjugado caracterizado por cualquiera de las fórmulas (1-4), {1-5) o {1-6): en donde A es una molécula de anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 67, 68 y 69, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 70, 71 y 72, respectivamente, y en donde m es un entero desde 1 a 8.

83. El método de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque m es desde aproximadamente 3 a aproximadamente 5.

84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque m es aproximadamente 4.

85. Una mezcla de reacción, caracterizada porque comprende una muestra biológica y una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente, por ejemplo, un anticuerpo anti-GCC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 , y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs: 21, 22 y 23, o SEC ID NOs : 33, 34 y 35, respectivamente; y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2 , y CDR3 ) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 27, 28 y 29, o SEC ID NOS: 39, 40 y 41, respectivamente .

86. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque la muestra biológica comprende una o más células.

87. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque la muestra biológica comprende una muestra de tejido.

88. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque la muestra de tejido es una muestra de tejido incrustada en parafina.

89. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque la muestra biológica es una muestra de biopsia de tumor metastásico o primario.

90. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque la muestra biológica se monta en una placa.

91. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 89, caracterizada porque el tumor es un tumor colorrectal, un tumor gástrico, un tumor de intestino delgado, un tumor esofágico, un tumor pancreático, un tumor de pulmón, un sarcoma de tejido blando, un tumor neuroectodérmico o un tumor neuroendocrino .

92. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque el tumor de pulmón es un carcinoma de células escamosas o un adenocarcinoma .

93. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque el sarcoma de tejido blando es un leiomiosarcoma o un rabdomiosarcoma .

94. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque el tumor neuroendocrino es un tumor neuroendocrino gastrointestinal o broncopulmonar .

95. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque la muestra biológica se sospecha que contiene proteína GCC.

96. La mezcla de reacción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 85-95, caracterizada porque adicionalmente comprende un reactivo adecuado para la detección de formación de un complejo entre el anticuerpo anti-GCC y proteína GCC.

97. Un método para generar un reporte de tratamiento de cáncer personalizado, caracterizado porque el método comprende las etapas de: poner en contacto una muestra biológica que comprende una o más células de cáncer obtenidas de un paciente con cáncer que se sospecha que tiene cáncer que expresa GCC con una molécula de anticuerpo anti-GCC descrita en la presente, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, por ejemplo, una molécula de anticuerpo anti-GCC que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (CDR1, CDR2 , y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 21, 22 y 23, o SEC ID NOs : 33, 34 y 35, respectivamente; y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (CDR1, CDR2, y CDR3) que comprenden secuencias de aminoácidos de acuerdo con las SEC ID NOs : 27, 28 y 29, o SEC ID NOS: 39, 40 y 41, respectivamente; detectar la formación de un complejo entre la molécula anti-GCC y proteína GCC en la muestra biológica, por ejemplo, por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-26; cuantificar la expresión de GCC en la muestra biológica; comparar el nivel de expresión de GCC contra una base de datos que comprende la terapia dirigida a GCC, por ejemplo, una terapia dirigida a GCC descrita en la presente ,-y seleccionar una terapia dirigida a GCC y, opcionalmente , un régimen de dosificación basado en el nivel de expresión de GCC.

98. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque el cáncer que expresa GCC es cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de intestino delgado, cáncer esofágico, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, sarcoma de tejido blando, un tumor neuroectodérmico o un tumor neuroendocrino .

99. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque el tumo de pulmón es un carcinoma de células escamosas o un adenocarcinoma .

100. El método de conformidad con la reivindicación 98, caracterizado porque el sarcoma de tejido blando es un leiomiosarcoma o un rabdomiosarcoma .

101. La mezcla de reacción de conformidad con la reivindicación 98, caracterizada porque el tumor neuroendocrino es un tumor neuroendocrino gastrointestinal o broncopulmonar .

102. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 97-101, caracterizado porque la etapa de detección se realiza vía inmunohistoquímica .

103. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 97-102, caracterizado porque la cuantificación de expresión de GCC comprende expresión de GCC apical en la muestra biológica, expresión de GCC citoplásmica en la muestra biológica, o ambas.

104. El método de conformidad con la reivindicación 97-103, caracterizado porque la etapa de cuantificación comprende un procedimiento de puntuación H. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se describen anticuerpos y fragmentos de enlace de antígeno de anticuerpos que enlazan GCC. La invención también proporciona métodos de diagnóstico para identificar pacientes quiénes deben recibir una terapia dirigida a GCC utilizando los anticuerpos anti-GCC proporcionados en la presente.