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MX2014012890A - Anticuerpos anti-fcrn. - Google Patents

Anticuerpos anti-fcrn.

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MX2014012890A
MX2014012890A MX2014012890A MX2014012890A MX2014012890A MX 2014012890 A MX2014012890 A MX 2014012890A MX 2014012890 A MX2014012890 A MX 2014012890A MX 2014012890 A MX2014012890 A MX 2014012890A MX 2014012890 A MX2014012890 A MX 2014012890A
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MX
Mexico
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antibody
seq
fcrn
human
igg
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MX2014012890A
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MX365861B (es
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Kerry Louise Tyson
Helene Margaret Finney
Alastair David Griffiths Lawson
Stevan Graham Shaw
Bryan John Smith
Lara Kevorkian
Christoph Meier
Kaushik Sarkar
Paul Alan Atherfold
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Ucb Pharma Sa
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Publication date
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Application filed by Ucb Pharma Sa filed Critical Ucb Pharma Sa
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Abstract

La descripción se refiere a los anticuerpos específicos para FcRn, a las formulaciones que comprenden los mismos, el uso de cada uno en terapia, los procesos para expresar y para formar opcionalmente el anticuerpo, el ADN que codifica para los anticuerpos y hospederos que comprenden el ADN.

Description

ANTICUERPOS ANTI-FcRn CAMPO DE LA INVENCION La descripción se refiere a los anticuerpos específicos para FcRn, las formulaciones que comprenden los mismos, el uso de cada uno de ellos en terapia, los procesos para expresar y formular opcionalmente el anticuerpo, el ADN que codifica para los anticuerpos y los hospederos que contienen el ADN.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION El FcRn es un complejo no covalente de la cadena a de la proteína membranal FcRn y la microglobulina ß2 (ß2?). En mamíferos adultos, FcRn juega un papel clave en el mantenimiento de los niveles de anticuerpo en suero al actuar como un receptor que se enlaza y coopera los anticuerpos del isotipo IgG. Las moléculas de IgG son sometidas a endocitosis por las células endoteliales , y si éstas se enlazan a FcRn, son recicladas transcitosadas hacia afuera, por ejemplo, a la circulación. En contraste, las moléculas de IgG que no se enlazan a FcRn entran a las células y son dirigidas a la vía lisosomal donde éstas son degradadas. Una IgGl variante en la cual His435 es mutada a alanina, da como resultado la pérdida selectiva del enlace de FcRn y una vida media en suero significativamente reducida (Firan et al. 2001, International Immunology 13:993).
REF. 251638 Se lanza la hipótesis de que FcRn es un objetivo terapéutico potencial para ciertos trastornos autoinmunitarios provocados al menos en parte por los autoanticuerpos . El tratamiento actual para ciertos de tales trastornos incluye la plasmaferesis . Algunas veces la plasmaferesis es empleada junto con la terapia inmuríosupresora para el manejo a largo plazo de la enfermedad. El intercambio plasmático ofrece la respuesta a corto plazo más rápida para eliminar los autoanticuerpos dañinos. No obstante, puede ser también deseable suprimir la producción de los autoanticuerpos por el sistema inmunitario, por ejemplo mediante el uso de medicamentos tales como prednisona, ciclofosfamida, ciclosporina, micofenolato mofetil, rituximab o una mezcla de éstos.
Los ejemplos de trastornos que pueden ser tratados con la plasmaferesis incluyen: el síndrome de Guillain-Barre ; polineuropatía de desmielinización inflamatoria crónica; síndrome de Goodpasture ; síndromes de hiperviscosidad; crioglobulinemia ; paraproteinemia ; macroglobulinemia de Waldenstróm; miastenia gravis; púrpura trombocitopénica trombótica (TTP, por sus siglas en Inglés) /síndrome urémico hemolítico; granulomatosis de Wegener; síndrome de Lambert-Eaton; síndrome del anticuerpo antifosfolípido (APS o APLS) ; poliangiitis microscópica; glomeruloesclerosis focal y segmental recurrente en el riñon trasplantado; síndrome de HELLP; síndrome de PANDAS; enfermedad de Refsum; síndrome de Behcet; neuropatía relacionada al VIH; enfermedad de Graves en infantes y neonatos; pénfigo vulgar; esclerosis múltiple, rabdomiolisis y trastornos aloinmunitarios .
La plasmaferesis es algunas veces utilizada como una terapia de rescate para la eliminación de agentes terapéuticos que contiene Fe, por ejemplo en emergencias para reducir los efectos colaterales serios.
Aunque la plasmaferesis es útil en ciertas condiciones médicas existen riesgos potenciales y complicaciones asociadas con la terapia. La inserción de un catéter intravenoso más bien grande puede conducir a sangrado, punción pulmonar (dependiendo del sitio de la inserción del catéter) y, si el catéter es dejado demasiado tiempo, esto puede conducir a infección y/o daño a las venas dando una oportunidad limitada para repetir el procedimiento.
El procedimiento tiene complicaciones adicionales asociadas con el mismo, por ejemplo cuando la sangre de un paciente está fuera del cuerpo pasando a través del instrumento de plasmaferesis , la sangre tiene una tendencia a coagularse. Para reducir esta tendencia, en un protocolo común, es administrado por venoclisis citrato mientras que la sangre está corrida a través del circuito. El citrato se enlaza al calcio en la sangre, el calcio esencial para que la sangre se coagule. El citrato es muy efectivo en prevenir que la sangre se coagule; sin embargo, su uso puede conducir a niveles de calcio bajos que amenazan la vida. Esto puede ser detectado utilizando el signo de C vostek o el signo de Trousseau. Para prevenir esta complicación, el calcio es infundido intravenosamente mientras que el paciente está sufriendo la plasmaferesis; además, la suplementación con calcio oralmente también puede ser dada.
Otras complicaciones del procedimiento incluyen: hipotensión; exposición potencial a productos sanguíneos, con el riesgo de reacciones de transfusión o enfermedad transmitidas por la transfusión, supresión del sistema inmunitario del paciente y sangrado o hematoma por la colocación de la aguja.
Adicionalmente las instalaciones que proporcionan plasmaferesis son limitadas y el procedimiento es muy costoso.
Una alternativa a la plasmaferesis es la inmunoglobulina intravenosa (IVIG, por sus siglas en inglés) , la cual es un producto sanguíneo que contiene IgG policlonal combinada extraída del plasma de más de mil donadores de sangre. La terapia es administrada intravenosamente y dura en el intervalo de 2 semanas a 3 meses.
Las complicaciones del tratamiento por IVIG incluyen dolor de cabeza, dermatitis, infección viral proveniente de la contaminación del producto terapéutico, por ejemplo VIH o hepatitis, edema pulmonar, reacciones alérgicas, insuficiencia renal aguda, trombosis venosa y meningitis aséptica.
Existe de este modo una necesidad significativa no cumplida para terapias para trastornos autoinmunitarios que sean menos invasoras y que expongan a los pacientes a menos complicaciones médicas.
De este modo, existe una necesidad significativa no cumplida para terapias para trastornos inmunitarios y/o trastornos autoinmuntarios , que sean menos invasoras y que expongan a los pacientes a menos complicaciones médicas.
En consecuencia, los agentes que bloquean o que reducen el enlace de IgG a FcRn pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de tales trastornos o enfermedades autoinmunitarias inflamatorias. Los anticuerpos anti-FcRn han sido descritos previamente en los documentos WO2009/131702 , WO2007/087289 y WO2006/118772.
Sin embargo, sigue existiendo una necesidad para anticuerpos anti-FcRn mejorados.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION De este modo, en un aspecto se proporciona un anticuerpo anti-FcRn el fragmento de enlace del mismo que comprende un fragmento de cadena pesada o una cadena pesada que tiene una región variable, en donde la región variable comprende una, dos o tres Regiones de Determinación de la Complementariedad (CDRs, por sus siglas en Inglés) independientemente seleccionadas de la SEQ ID No.: 1, SEQ ID No. : 2 y SEQ ID No. : 3, por ejemplo en donde CDR Hl es SEQ ID No. : 1, CDR H2 es SEQ ID No. : 2 y CDR H3 es SEQ ID No. : 3.
En otro aspecto más, se proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una secuencia o combinaciones de secuencias como se definen en la presente, por ejemplo una región variable de par cognado.
Los anticuerpos de la descripción bloquean el enlace de IgG a FcRn y se piensa que son útiles en la reducción de una o más funciones biológicas de FcRn, incluyendo la reducción en la vida media de los anticuerpos de circulación. Esto puede ser benéfico ya que permite que el paciente depure más rápidamente los anticuerpos, tales como autoanticuerpos .
De manera importante, los anticuerpos de la presente invención son capaces a enlazarse a FcRn humana a pH6 y a pH7.4 , con afinidad de enlace comparable y alta. Ventajosamente, por lo tanto, los anticuerpos son capaces de continuar enlazándose a FcRn incluso dentro del endosoma, con lo cual se eleva al máximo el bloqueo del enlace de FcRn a la IgG, ver Figura 10 para una ilustración del mecanismo.
En una modalidad, los anticuerpos o los fragmentos de enlace de acuerdo a la presente descripción comprenden una cadena ligera o fragmento de cadena ligera que tienen una región variable, por ejemplo que comprende una, dos o tres CDRs independientemente seleccionadas de la SEQ ID No.: 4, SEQ ID No. : 5 y SEQ ID No. : 6, en particular en donde CDR Ll es la SEQ ID No. : 4, CDR L2 es la SEQ ID No. : 5 y CDR L3 es la SEQ ID No. : 6.
En una modalidad, los anticuerpos o los fragmentos de enlace de acuerdo a la presente descripción comprende las secuencias de CDR de las SEQ ID Nos: 1 a la 6, por ejemplo en donde CDR Hl es la SEQ ID No.: 1, CDR H2 es la SEQ ID No.: 2, CDR H3 es la SEQ ID No.: 3, CDR Ll es la SEQ ID No.: 4, CDR L2 es la SEQ ID No. : 5 y CDR L3 es la SEQ ID No. : 6.
La descripción también se extiende a un polinucleótido, tal como ADN, que codifica para un anticuerpo o fragmento como se describe en la presente.
También se proporciona una célula hospedera que comprende el polinucleótido.
Se proporcionan en la presente los métodos para expresar un anticuerpo o fragmento, como son los métodos de conjugación de un anticuerpo o fragmento a un polímero, tal como PEG.
La presente descripción también se refiere a las composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y fragmentos.
En una modalidad, se proporciona un método de tratamiento que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo, fragmento o composición como se describe en la presente.
La presente descripción también se extiende a un anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo a la presente descripción para usarse en el tratamiento, particularmente en el tratamiento de un trastorno inmunitario y/o autoinmunitario .
De este modo, la presente descripción proporciona los anticuerpos, fragmentos de los mismos y métodos para la eliminación de la IgG patógena, que es logrado por la aceleración del mecanismo natural del cuerpo para catabolizar la IgG.
En esencia, los anticuerpos y los fragmentos de acuerdo a la descripción bloquean el sistema que recicla la IgG en el cuerpo.
La presente terapia va a proporcionar un reemplazo o suplemento para ciertos trastornos donde la plasmaferesis es una terapia o terapia de IVIg, lo cual es ventajoso para los pacientes.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra ciertas secuencias de aminoácidos y polinucleótidos del anticuerpo CA170_1519 representadas por las SEQ ID No. : 1 a la SEQ ID No. : 9, en donde: la SEQ ID No.: 1 representa CDRH1; la SEQ ID No.: 2 representa CDRH2 ; la SEQ ID No.: 3 representa CDRH3 ; la SEQ ID No. : 4 representa CDRL1; la SEQ ID No.: 5 representa CDRL2; la SEQ ID No . : 6 representa CDRL3 ; la SEQ ID No . : 7 representa la región VL del anticuerpo 1519 de rata; la SEQ ID No.: 8 representa la región VL del anticuerpo 1519 de rata; la SEQ ID No. : 9 representa la región VL del anticuerpo 1519 de rata con la secuencia de señal subrayada y en cursivas .
La Figura 1A representa las SEQ ID No. : 10 a SEQ ID No.: 14 en donde: la SEQ ID No.: 10 representa la región VL del anticuerpo 1519 de rata, con las secuencias de señal subrayada y en cursivas; la SEQ ID No.: 11 representa la región VH del anticuerpo 1519 de ratas; la SEQ ID No . : 12 representa la región VH del anticuerpo 1519 de ratas; la SEQ ID No.: 13 representa la región VH del anticuerpo 1519 de rata, con las secuencias de señal subrayada y en cursivas; la SEQ ID No.: 14 representa la región VH del anticuerpo 1519 de rata, con las secuencias de señal subrayada y en cursivas.
La Figura IB representa la SEQ ID No. : 15 a la SEQ ID No.: 19 en donde: la SEQ ID No.: 15 representa la región V de 1519 gL20; la SEQ ID No . : 16 representa la región V de 1519 gL20 (expresión en E. coli) ; la SEQ ID No. : 17 representa la región V de 1519 gL20 (expresión en mamífero) ; la SEQ ID No. : 18 representa la región V de 1519 gL20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión en E. coli) ; la SEQ ID No. : 19 representa la región V de 1519 gL20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión en E. coli) .
La Figura 1C representa la SEQ ID No.: 20 a la SEQ ID No. : 23, en donde la SEQ ID No . : 20 representa la región V de 1519 gL20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión de mamífero) ; la SEQ ID No. : 21 representa la región V de 1519 gL20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión de mamífero) ; la SEQ ID No.: 22 representa la cadena ligera de 1519 gL20 (V + constante); la SEQ ID No.: 23 representa la cadena ligera de 1519 gL20 (V + constante, expresión de E. coli) .
La Figura ID representa la SEQ ID No. : 24 a la SEQ ID No.: 26, en donde la SEQ ID No.: 24 representa la cadena ligera de 1519 gL20 (V + constante + expresión de mamífero) ; la SEQ ID No. : 25 representa la cadena ligera de 1519 gL20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión E. coli) ; la SEQ ID No. : 26 representa la cadena ligera de 1519 gL20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión E. coli) .
La Figura 1E representa la SEQ ID No. : 27 a la SEQ ID No.: 30, en donde la SEQ ID No.: 27 representa la cadena ligera de 1519 gL20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión de mamífero) ; la SEQ ID No. : 28 representa la cadena ligera de 1519 gL20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión de mamífero) ; la SEQ ID No.: 29 representa la región V de 1519 gH20; la SEQ ID No. : 30 representa la región V de 1519 gH20 (expresión de E. coli) .
La Figura 1F representa la SEQ ID No.: 31 a la SEQ ID No. : 34 (donde las secuencias de señal están subrayadas y en cursivas) , en donde la SEQ ID No. : 31 representa la región V de 1519 gH20 (expresión de mamífero) ; la SEQ ID No. : 32 representa la región V de 1519 gH20 (expresión de E. coli) ; la SEQ ID No . : 33 representa la región V de 1519 gH20 (expresión de E . coli) ; la SEQ ID No. : 34 representa la región V de 1519 gH20 (expresión de mamífero); la SEQ ID No.: 35 representa la región V de 1519 gH20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión de mamífero) .
La Figura 1G representa la SEQ ID No.: 36 a la SEQ ID No. : 38, en donde la SEQ ID No.: .36 representa la cadena pesada de Fab' 1519gH20 (V + CHl de gamma-1 humana + bisagra); la SEQ ID No.: 37 representa la cadena pesada de Fab' 1519gH20 (V + CHl de gamma-1 humana + bisagra, expresión E. coli) ; la SEQ ID No. : 38 representa la cadena pesada de Fab' 1519gH20 (V + CHl de gamma-1 humana + bisagra, expresión de mamífero) .
La Figura 1H representa la SEQ ID No. : 39 a la SEQ ID No. : 41, la SEQ ID No. : 39 representa la cadena pesada de Fab' 1519gH20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión E. coli) ; la SEQ ID No. : 40 representa la cadena pesada de Fab' 1519gH20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión E. coli) ; la SEQ ID No.: 41 representa la cadena pesada de Fab' 1519gH20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión de mamífero) .
La Figura II representa la SEQ ID No. : 42 a la SEQ ID No . : 43, en donde la SEQ ID No . : 42 representa la cadena pesada de Fab' 1519gH20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas (expresión de mamífero); la SEQ ID No.: 43 representa la cadena pesada de Fab' 1519gH20 (V + constante de gamma-4P humana) .
La Figura 1J representa la SEQ ID No.: 44 en donde la SEQ ID No. : 44 representa la cadena pesada de IgG4 1519gH20 (V + constante de gamma-4P humana, exones subrayados) .
La Figura 1K representa la SEQ ID No. : 45 en donde la SEQ ID No. : 45 representa la cadena pesada de IgG4 1519gH20 (V + constante de gamma-4P humana) , con las secuencias de señal subrayada y en cursivas.
La Figura 1L representa la SEQ ID No. : 46 a la SEQ ID No. : 48, en donde la SEQ ID No. : 46 representa la cadena ligera de FabFv 1519gL20; la SEQ ID No. : 47 representa la cadena ligera de FabFv 1519gL20; la SEQ ID No. : 48 representa la cadena ligera de FabFv 1519gL20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas.
La Figura 1M representa la SEQ ID No. : 49 a la SEQ ID No. : 50, en donde la SEQ ID No. : 49 representa la cadena ligera de FabFv 1519gL20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas; la SEQ ID No.: 50 representa la cadena pesada de FabFv 1519gH20.
La Figura 1N representa la SEQ ID No. : 51 a la SEQ ID No. : 52, en donde la SEQ ID No. : 51 representa la cadena pesada de FabFv 1519gH20; la SEQ ID No. : 52 representa la cadena pesada de FabFv 1519gH20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas.
La Figura 10 representa la SEQ ID No. : 53 a la SEQ ID No. : 55, en donde la SEQ ID No. : 53 representa la cadena pesada de FabFv 1519gH20 con las secuencias de señal subrayada y en cursivas; la SEQ ID No. : 54 representa la estructura aceptora VKl 2-1- (1) A30 JK2 humana; la SEQ ID No.: 55 representa la estructura aceptora VKl 2-1- (1) A30 JK2 humana .
La Figura 1P representa la SEQ ID No. : 56 a la SEQ ID No.: 60, en donde la SEQ ID No.: 56 representa la estructura aceptora VH3 1-3 3-07 JH4 humana; la SEQ ID No.: 57 representa la estructura aceptora VH3 1-3 3-07 JH4 humana; la SEQ ID No. : 58 representa la región VL del anticuerpo 1548 de rata; la SEQ ID No. : 59 representa la región VL del anticuerpo 1548 de rata; la SEQ ID No.: 60 representa la región VL del anticuerpo 1548 de rata.
La Figura 1Q representa la SEQ ID No. : 61 a la SEQ ID No.: 65, en donde la SEQ ID No.: 61 representa la región VH del anticuerpo 1548 de rata; la SEQ ID No. : 62 representa la región VL del anticuerpo 1548 de rata; la SEQ ID No. : 63 representa la región VH del anticuerpo 1548 de rata; la SEQ ID No. : 64 representa la región VH del anticuerpo 1548 de rata; la SEQ ID No . : 65 representa la región VH del anticuerpo 1548 de rata.
La Figura IR representa la SEQ ID No. : 66 a la SEQ ID No. : 72, en donde la SEQ ID No.: 66 representa la región VK del anticuerpo 1496 de rata; la SEQ ID No. : 67 representa la región VK del anticuerpo 1496 de rata; la SEQ ID No. : 68 representa la región VH del anticuerpo 1496 de rata; la SEQ ID No. : 69 representa la región VH del anticuerpo 1496 de rata; la SEQ ID No. : 72 representa la cadena pesada de IgGl 1519hH20 (V + gamma-1 humana constante) .
La Figura 1S representa la SEQ ID No. : 73, en donde la SEQ ID No. : 73 representa la cadena pesada de IgGl 1519hH20 (V + gamma-1 humana constante, exones subrayados) .
La Figura IT representa la SEQ ID No.: 74, que describe la cadena pesada de IgGl 1519hH20 (V + gamma-1 humana constante, con la secuencia de señal subrayada y en cursivas) .
La Figura 1U representa la SEQ ID No. : 75 a la SEQ ID No. : 77, en donde la SEQ ID No. : 75 representa la cadena ligera de 1519gL20 (V + constante, expresión de mamífero alterativa) ; la SEQ ID No. : 76 representa la cadena pesada de Fab' 1519gH20 (V + CH1 de gamma- 1 + bisagra, de expresión de mamífero, un cambio base de la SEQ ID No. : 38) ; la SEQ ID No.: 77 representa la cadena pesada de Fab' 1519gH20 con la secuencia de señal subrayada y en cursivas (expresión de mamífero, un cambio base de la SEQ ID No. : 42) .
La Figura IV representa la SEQ ID No.: 78 a la SEQ ID No. : 79, en donde la SEQ ID No. : 78 representa la cadena ligera de FabFv 1519gL20 (secuencia alternativa a la SEQ ID No. : 46) ; la SEQ ID No . : 79 representa la cadena ligera de FabFv 1519gL20 (secuencia alternativa a la SEQ ID No.: 47).
La Figura 1W representa la SEQ ID No. : 80, que describe la cadena ligera de FabFv 1519gH20 (secuencia alternativa a la SEQ ID No. : 51) .
La Figura IX representa la SEQ ID No.: 81 a la SEQ ID No. : 79, en donde la SEQ ID No . : 84 (en donde la secuencia de señales están subrayadas y en cursivas) , en donde la SEQ ID No.: 81 representa la región VL del anticuerpo 1548 de rata (secuencia alternativa a la SEQ ID No. : 58) ; la SEQ ID No. : 82 representa la región VL del anticuerpo 1548 de rata (secuencia alternativa a la SEQ ID No.: 59); la SEQ ID No.: 83 representa la región VH del anticuerpo 1548 de rata (secuencia alternativa a la SEQ ID No. : 60) ; la SEQ ID No. : 84 representa la región VH del anticuerpo 1548 de rata (secuencia alternativa a la SEQ ID No. : 61) .
La Figura 1Y representa la SEQ ID No. : 85, que describe la cadena pesada de IgGl 1519gH20 (V + gamma-1 humana constante, exones subrayados, un cambio de base a la SEQ ID No. : 71) .
La Figura 1Z representa la SEQ ID No.: 86 a la SEQ ID No. : 87, en donde la SEQ ID No.: 86 representa la cadena pesada de IgGl 1519gH20 (V + gamma-1 humana constante) con la secuencia de señal subrayada y en cursivas (un cambio de base de la SEQ ID No. : 72) ; la SEQ ID No . : 87 representa la cadena pesada de IgG4 1519gH20 (V + gamma-4 humana constante sin mutaciones de P) .
La Figura 1AA representa la SEQ ID No. : 88, que describe la cadena pesada de IgG4 1519gH20 (V + gamma-4 humana constante, exones subrayados, sin mutaciones de P) .
La Figura 1BB representa la SEQ ID No. : 89, que describe la cadena pesada de IgG4 1519gH20 (V + gamma-4 humana constante, con la secuencia de señal subrayada y en cursivas - sin mutación de P) .
La Figura ICC representa la SEQ ID No. : 90 a la SEQ ID No. : 91, en donde la SEQ ID No. : 90 representa la región V de 1519 gL20 (expresión de mamífero alternativa a la SEQ ID No. : 17) ; la SEQ ID No. : 91 la cadena ligera de 1519 gL20 (V + constante, expresión de mamífero alternativa a la SEQ ID No. : 24) .
La Figura 1DD representa la SEQ ID No. : 92, que describe la región V de 1519 gH20 (expresión de mamífero alternativa a la SEQ ID No. : 31) .
La Figura 1 EE representa la SEQ ID No. : 93 y la SEQ ID No. : 95, en donde la SEQ ID No. : 93 representa la cadena pesada de IgG4 de 1519 gH20 (V + gamma-4P humana constante alternativa a la SEQ ID No. : 44) ; la SEQ ID No . : 95 representa ß2? humana.
Las Figuras 2A-2B muestran las alineaciones de ciertas secuencias, en donde la Figura 2A representa la cadena ligera del injerto 1519, en donde 1519 es la secuencia de cadena ligera variable de rata; 1519 gL20 es el injerto humanizado de la cadena ligera variable de 1519 utilizando la línea germinal humana VK1 2-1- (1) A30 como la estructura aceptora; la CDRs son mostradas en negritas/subrayadas ; los residuos donadores son mostrados en negritas/cursivas y están iluminados. L36, F37 e 158.
La Figura 2B representa la cadena pesada del injerto 1519, en donde 1519 es la secuencia de cadena ligera variable de rata; 1519 gH20 es el injerto humanizado de la cadena pesada variable de 1519 utilizando la línea germinal humana VK1 1-3 3-07 como la estructura aceptora; la CDRs son mostradas en negritas/subrayadas; los residuos donadores son mostrados en negritas/cursivas y están iluminadas. P3, V24, S76, T93 y T9 .
Las Figuras 3A-3B muestran una comparación del enlace sobre la MDCK II humana para un fragmento Fab' de acuerdo a la presente descripción y una versión PEGilada del mismo .
La Figura 4 muestra un fragmento Fab' de acuerdo a la presente descripción y una versión PEGilada del mismo, que inhibe el reciclamiento de IgG sobre las células MDCK II.
La Figura 5 muestra un fragmento Fab' PEGilado de acuerdo a la presente descripción, que inhibe la trancitosis de IgG apical a baso lateral en las células MDCK II.
La Figura 6A muestra una comparación del enlace de la MDCK II de mono cynomolgus para un fragmento Fab' de acuerdo a la presente descripción y la Figura 6B muestra una versión PEGilada del mismo.
La Figura 7 muestra un fragmento Fab' PEGilado de acuerdo a la presente invención que inhibe el reciclamiento de IgG en las células MDCK II para las versiones de humano y de mono cynomolgus de las mismas.
La Figura 8 muestra el efecto de una dosis simple de la molécula de Fab' PEGilada de acuerdo a la descripción sobre los niveles de IgG en plasma en los monos cynomolgus.
La Figura 9 muestra el efecto de cuatro dosis semanales de la molécula de Fab' PEGilada de acuerdo a la descripción sobre los niveles plasmáticos de IgG.
La Figura 10 muestra una representación diagramática de la función de reciclamiento de anticuerpos de FcRn inhibido por una proteína de bloqueo.
La Figura 11 muestra la prueba de IgG humana, basada en citometría de flujo, utilizando los anticuerpos IgG gamma 1 purificados.
La Figura 12 muestra la farmacodinámica de la IgG de las dosis IV simples/intermitentes de Fab'PEG en monos cynomolgus normales, de 20 mg/kg en los días 1 y 67.
La Figura 13 muestra la farmacodinámica de la IgG de dosis IV repetidas de Fab'PEG en monos cynomolgus normales - 4 x 20 0 100 mg/kg por semana.
La Figura 14 muestra la farmacodinámica de la IgG de las dosis IV simples/intermitentes de Fab'PEG en monos cynomolgus normales - 20 mg/kg y 100 mg/kg en los días 1 y 67.
La Figura 15 muestra los niveles plasmáticos de IgG en 4 monos cynomolgus después de 2 dosis IV de 20 mg/kg y 1519.g57 de Fab'PEG.
La Figura 16 muestra los niveles plasmáticos de IgG en 4 monos cynomolgus que reciben 10 dosis IV de 20 mg/kg 1519. g57 Fab'PEG, una vez cada 3 días.
La Figura 17 muestra el efecto de dos dosis IV de 30 mg/kg de 1519. g57 IgG4P sobre la IgG plasmática endógena en monos cynomolgus .
La Figura 18 muestra el efecto de 30 mg/kg si es seguido por 41 dosis diarias de 5 mg/kg 1519. g57 IgG4P sobre el nivel de IgG plasmática en monos cynomolgus.
La Figura 19 muestra el resultado de la dosificación diaria con el vehículo sobre la IgG plasmática en monos cynomolgus .
La Figura 20 muestra la depuración incrementada de la hlgG IV en plasma de ratones transgénicos hFcRn tratados con CA170_01519.g57 Fab ' PEG o PBS IV.
La Figura 21 muestra la depuración incrementada de la hlgG IV en plasma de ratones transgénicos hFcRn tratados con CA170_01519.g57 IgGl o IgG4 o PBS IV.
La Figura 22 muestra la depuración incrementada de la hlgG IV en plasma de ratones transgénicos hFcRn tratados con CA170 01519. g57 Fab'- albúmina sérica humana o PBS IV.
La Figura 23 muestra la depuración incrementada de la hlgG IV en plasma de ratones transgénicos hFcRn tratados con CA170_01519.g57 FabFv o PBS IV.
La Figura 24 muestra la depuración incrementada de la hlgG IV en plasma de ratones transgénicos hFcRn tratados con CA170_01519.g57 Fab o Fab 'PEG o PBS IV.
La Figura 25 muestra una proteína de fusión de anticuerpo biespecífica de la presente invención, denominada como Fab-dsFv.
La Figura 26 muestra el resultado de la selección por cristalización, que muestra el cristal utilizado para el análisis de rayos X.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La FcRn como es empleada en la presente, se refiere a un complejo no covalente entre la cadena alfa del receptor de IgG humano, también conocido como el receptor de Fe neonatal, la secuencia de aminoácidos del cual está en UniProt bajo el número P55899 junto con la microglobulina ß2 (ß2?) , la secuencia de aminoácidos de la cual está en UniProt bajo el número P61769.
La molécula de anticuerpo como es empleada en la presente, se refiere a un anticuerpo o fragmento de enlace del mismo.
El término 'anticuerpo' como se utiliza en la presente, se refiere en general a los anticuerpos intactos (completos) es decir, que comprende los elementos de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. El anticuerpo puede comprender además los dominios de enlace adicionales, por ejemplo por la molécula DVD-Ig como se describe en el documento WO2007/024715 , o la denominada (FabFv)2Fc descrita en el documento WO2011/030107. De este modo, el anticuerpo como es empleado en la presente incluye los anticuerpos de longitud completa bi, tri o tetra-valentes .
Los fragmentos de enlace de los anticuerpos incluyen anticuerpos de cadena simple (es decir, una cadena pesada y cadena ligera de longitud completa) ; Fab, Fab modificado, Fab', Fab ' modificado, F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, anticuerpos de dominio simple (por ejemplo, VH o VL o VHH) , scFv, anticuerpos bi, tri o tetra-valentes , Bis-scFv, diacuerpos, tricuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de enlace al epitopo de cualquiera de los anteriores (ver por ejemplo Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217) . Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo Verma et al, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). El formato Fab-Fv fue primeramente descrito en el documento WO2009/040562 y las versiones estabilizadas con disulfuro del mismo, el Fab-dsFv fue primeramente descrito en el documento WO2010/035012 , ver también Figura 25 en ésta. Otros fragmentos de anticuerpo para usarse en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab1 descritos en las solicitudes de patente Internacionales WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171. Los anticuerpos multi-valentes pueden comprenden múltiples especificidades, por ejemplo, biespecíficos o pueden ser monoespecíficos (ver por ejemplo, documentos WO 92/22583 y WO05/113605) . Un ejemplo tal de los últimos es el Tri-Fab (o TFM) como se describe en el documento W092/22583.
Una molécula Fab' típica comprende un par de cadena pesada y ligera en el cual la cadena pesada comprende una región variable VH, un dominio constante CHI y una región de bisagra natural o modificada, y la cadena ligera comprende una región variable VL y un dominio constante CL.
En una modalidad, se proporciona un dímero de un Fab' de acuerdo a la presente descripción para crear un F(ab')2, por ejemplo la dimerización puede ser a través de la bisagra .
En una modalidad, el anticuerpo o el fragmento de enlace del mismo comprende un dominio de enlace. Un dominio de enlace comprenderá en general 6 CDRs, tres provenientes de una cadena pesada y tres provenientes de una cadena ligera. En una modalidad, las CDRs están en una estructura y conjuntamente forman una región variable. De este modo, en una modalidad, un anticuerpo o fragmento de enlace comprende un dominio de enlace específico para el antígeno que comprende una región variable de cadena ligera y una región variable de cadena pesada.
Se apreciará que una o más sustituciones de aminoácidos (por ejemplo 1, 2, 3 ó 4), adiciones y/o supresiones de los mismos pueden ser realizados en las CDRs o a otras secuencias (por ejemplo, dominios variables) proporcionados por la presente invención sin alterar de manera significativa la habilidad del anticuerpo para enlazarse a FcRn. El efecto de cualesquiera sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos, puede ser fácilmente probado por una persona experta en la técnica, por ejemplo, mediante el uso de los métodos descritos en la presente, en particular en los Ejemplos, para determinar FcRn.
En uno o más (por ejemplo 1, 2, 3 o 4) aminoácidos, pueden ser realizadas las sustituciones, adiciones y/o supresiones a la región estructural empleada en el anticuerpo o el fragmento proporcionado por la presente invención, y en donde la afinidad de enlace a FcRn es conservada o incrementada .
Los residuos en los dominios variables del anticuerpo son convencionalmente numerados de acuerdo a un sistema considerado por Kabat et al. Este sistema es descrito en Kabat et al, 1987, en Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH, Estados Unidos (de aquí en adelante "Kabat et al. (supra)") . Este sistema de numeración es utilizado en la presente especificación excepto donde se indique de otro modo.
Las designaciones de los residuos de Kabat no siempre corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal efectiva, puede contener menos o más aminoácidos que en la numeración estricta de Kabat, lo que corresponde a un acortamiento de, o inserción dentro de, un componente estructural, ya sea la región estructural o la región de determinación de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), de la estructura de dominio variable básica. La numeración correcta de Kabat de los residuos puede ser determinada por un anticuerpo dado mediante la alineación de los residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada con Kabat "estándar" .
Las CDRs del dominio variable de cadena pesada están localizadas en los residuos 31-35 (CDR-Hl) , los residuos 50-65 (CDR-H2) y los residuos 95-102 (CDR-H3) de acuerdo al sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, de acuerdo a Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M. J. Mol. Biol, 196, 901-917 (1987)), el equivalente de bucle a CDR-Hl se extiende desde el residuo 26 hasta el residuo 32. De este modo, a no ser que se indique de otro modo "CDR-Hl" como es empleado en la presente, est destinado a referirse a los residuos 26 a 35, como es descrito por una combinación del sistema de numeración de Kabat y la definición de bucle topológico de Chothia.
Las CDRs del dominio variable de cadena ligera están localizadas en los residuos 24-34 (CDR-L1) , los residuos 50-56 (CDR-L2) y los residuos 89-97 (CDR-L3) de acuerdo al sistema de numeración de Kabat.
Los anticuerpos y fragmentos de la presente descripción bloquean FcRn y pueden con esto prevenir su funcionamiento en el reciclamiento de IgG. El bloqueo, como es empleado, en la presente se refiere al bloqueo físicamente, tal como la oclusión del receptor, pero también incluirá donde el anticuerpo o los fragmentos se enlazan a un epitopo que provoca, por ejemplo un cambio conformacional que significa que el ligando natural al receptor ya no se enlaza más. Las moléculas de anticuerpo de la presente invención se enlazan a FcRn y con esto disminuyen o previenen (por ejemplo, inhiben) el enlace de FcRn a una región constante de la IgG.
En una modalidad, el anticuerpo o el fragmento del mismo se enlaza a FcRn competitivamente con respecto a la IgG.
En un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de enlace del mismo funciona como un inhibidor competitivo del enlace de FcRn humano a la IgG humana. En un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de enlace del mismo se enlaza al sitio de enlace a IgG sobre FcRn. En un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de enlace del mismo no se enlaza a ß2?.
Los anticuerpos para usarse en la presente descripción pueden ser obtenidos utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. El Polipéptido FcRn/proteína, incluyendo las proteínas de fusión, células (recombinantemente o naturalmente) que expresan el polipéptido (tales como las células T activadas) pueden ser utilizados para producir los anticuerpos que reconocen específicamente a FcRn. El polipéptido puede ser el polipéptido "maduro" o un fragmento biológicamente activo o derivado del mismo. La proteína humana está registrada en Swiss-Prot bajo el número P55899. El dominio extracelular de la cadena alfa FcRn humano es proporcionada en la SEQ ID No.: 94. La secuencia de ß2? es proporcionada en la SEQ ID No. : 95.
En una modalidad, el antígeno es una forma mutante de FcRn que es manipulada por ingeniería para presentar FcRn sobre la superficie de una célula, tal que existe poco o ningún procesamiento dinámico donde el FcRn es internalizado en la célula, por ejemplo éste puede ser logrado por la realización de una mutación en la cola citoplásmica de la cadena alfa de FcRn, en donde la di-leucina es mutada a di-alanina como se describe en Ober et al 2001 Int. Immunol . 13, 1551-1559.
Los polipéptidos , para utilizarse para inmunizar un hospedero, pueden ser preparados mediante procesos bien conocidos en la técnica, a partir de células hospederas manipuladas por ingeniería genética, que comprenden los sistemas de expresión, o éstos pueden ser recuperados a partir de fuentes biológicas naturales. En la presente solicitud, los términos "polipéptidos " incluyen los péptidos, polipéptidos y proteínas. Éstos son utilizados intercambiablemente a no ser que se especifique de otro modo. El polipéptido de FcRn puede, en algunos casos, ser parte de una proteína más grande, tal como una proteína de fusión, por ejemplo fusionada a una cola de afinidad o similar.
Los anticuerpos generados contra el polipéptido de FcRn pueden ser obtenidos, donde la inmunización de un animal es necesaria, mediante la administración de los polipéptidos a un animal, preferentemente a un animal no humano, utilizando protocolos bien conocidos y rutinarios, ver por ejemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986) . Muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos o cerdos pueden ser inmunizados. Sin embargo, los ratones, conejos, cerdos y ratas son en general los más adecuados.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985) .
Los anticuerpos para usarse en la invención pueden también ser generados utilizando métodos de anticuerpos linfocitarios simples, mediante clonación y expresión de los cADNs de la región variable de la inmunoglobulina, generados a partir de los linfocitos simples seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al, 1996, Proc . Nati. Acad. Sci . Estados Unidos 93 (15 ): 7843 -78481 ; documentos WO92/02551; WO2004/051268 y la Solicitud de Patente Internacional número WO2004/106377.
La selección para los anticuerpos puede ser llevada a cabo utilizando ensayos para medir el enlace a FcRn humano y/o ensayos para medir la habilidad para bloquear el enlace de IgG al receptor. Un ejemplo de un ensayo de enlace es un ELISA, en particular, utilizando una proteína de fusión del FcRn humano y la Fe humana, que se inmoviliza sobre placas, empleando un anticuerpo secundario para detectar el anticuerpo anti-FcRn enlazado a la proteína de fusión. Los ejemplos de los ensayos agonísticos y de bloqueo adecuados son descritos en los Ejemplos de la presente.
Los anticuerpos humanizados (los cuales incluyen anticuerpos injertados con CDR) son moléculas de anticuerpo que tienen una o más regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) provenientes de una especie no humana, y una región estructural proveniente de una molécula de inmunoglobulina humana (ver por ejemplo, los documentos US 5,585,089; W091/09967). Se apreciará que puede ser únicamente necesario transferir los residuos de determinación de la especif cidad de las CDRs en vez de la CDR completa (ver por ejemplo, ashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Los anticuerpos humanizados pueden comprender además opcionalmente uno o más residuos estructurales derivados de las especies no humanas de las cuales fueron derivadas las CDRs. Los últimos son a menudo denominados como residuos donadores .
El término "específico" como es empleado en la presente, está destinado a referirse a un anticuerpo que únicamente reconoce el antígeno para el cual éste es específico o un anticuerpo que tiene afinidad de enlace significativamente superior al antígeno al cual éste es específico, en comparación al enlace a los antígenos a los cuales éste es no específico, por ejemplo al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces mayor afinidad de enlace. La afinidad de enlace puede ser medida mediante técnicas tales como BIAcore, como se describe más adelante en la presente. En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención no se enlaza a la microglobulina ß2 (ß2?) . En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención se enlaza a FcRn de cynomolgus . En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención no se enlaza a FcRn de rata o de ratón.
Las secuencias de aminoácidos y las secuencias de polinucleótidos de ciertos anticuerpos de acuerdo a la presente descripción se proporcionan en las Figuras.
En una modalidad, el anticuerpo o los fragmentos de acuerdo a la descripción son humanizados.
Como se utiliza en la presente, el término "molécula de anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula de anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o más CDRs (incluyendo, si se desea, uno o más CDRs modificadas) proveniente de un anticuerpo donador (por ejemplo, un anticuerpo no humano tal como un anticuerpo monoclonal murino) injertado dentro de una estructura de la región variable de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano) . Para una revisión, ver Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. En una modalidad, en vez de que la CDR completa sea transferida, únicamente uno o más de los residuos de determinación de la especificidad provenientes de cualquiera de las CDRs descritas anteriormente en la presente, son transferidos a la estructura del anticuerpo humano (ver por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una modalidad, únicamente los residuos de determinación de la especificidad provenientes de una o más de las CDRs descritas anteriormente en la presente, son transferidos a la estructura del anticuerpo humano. En otra modalidad más, únicamente los residuos de determinación de la especificidad provenientes de cada una de las CDRs descritas anteriormente en la presente, son transferidos a la estructura del anticuerpo humano.
Cuando las CDRs o los residuos de determinación de la especificidad son injertados, cualquier secuencia estructural de la región variable aceptora apropiada, puede ser utilizada tomando en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donador del cual son derivadas las CDRs, incluyendo las regiones estructurales de ratón, de primate, y de humano.
Adecuadamente, el anticuerpo humanizado de acuerdo a la presente invención tiene un dominio variable que comprende las regiones estructurales aceptoras humanas así como una o más de las CDRs proporcionadas específicamente en la presente. De este modo, en una modalidad se proporciona el bloqueo del anticuerpo humanizado que se enlaza al FcRn humana, en donde el dominio variable comprende las regiones estructurales aceptoras humanas y las CDRs donadoras no humanas .
Los ejemplos de las estructuras humanas que pueden ser utilizadas en la presente invención son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY and POM (Kabat et al, supra) . Por ejemplo, KOL y NEWM pueden ser utilizadas para la cadena pesada, REI puede ser utilizada para la cadena ligera y EU, LAY y POM pueden ser utilizadas para la cadena pesada y la cadena ligera. Alternativamente, las secuencias de línea germinal humana pueden ser utilizadas; éstas están disponibles en: http : //vbase . mrc-cpe . cam . ac . uk/ En un anticuerpo humanizado de la presente invención, las cadenas pesadas y ligeras aceptoras no necesariamente necesitan ser derivadas del mismo anticuerpo y pueden, si se desea, comprender cadenas compuestas que tienen regiones estructurales derivadas de diferentes cadenas.
Una región estructural adecuada de este tipo para la cadena pesada del anticuerpo humanizado de la presente invención es derivada de la secuencia 1-3 3-07 del subgrupo VH3 humano, junto con JH4 (SEQ ID No. : 56) .
En consecuencia, en un ejemplo, se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No. : 1 para la CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID No. : 2 para la CDR-H2 y la secuencia dada en la SEQ ID No. : 3 para la CDRH3 , en donde la cadena pesada región estructural es derivada de la secuencia 1-3 3-07 del subgrupo VH3 humano, junto con JH4.
La secuencia del JH4 humano es como sigue: (YFDY) WGQGTLVTVS (Seq ID No: 70) . La porción YFDY es parte de la CDR-H3 y no es parte de la estructura 4 (Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591).
En un ejemplo, el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 29.
Una región estructural adecuada para la cadena ligera del anticuerpo humanizado de la presente invención es derivada de la secuencia 2-1- (1) A30 de subgrupo VKl de línea germinal humana junto con JK2 (SEQ ID No. : 54) .
En consecuencia, en un ejemplo, se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No. : 4 para la CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID No. : 5 para la CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID No. : 6 para la CDRL3 , en donde la región estructural de cadena ligera es derivada de la secuencia 2-1- (1) A30 del subgrupo VKl humano, junto con JK2.
La secuencia de JK2 es como sigue: (YT) FGQGTKLEIK (SEQ ID No: 71) . La porción YT es parte de la CDR-L3 y no es parte de la estructura 4 (Hieter, PA. , et al., 1982, J. Biol . Chem., 257, 1516-1522).
En un ejemplo, el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 15.
En un anticuerpo humanizado de la presente invención, las regiones estructurales no necesitan tener exactamente la misma secuencia que aquellas del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los residuos inusuales pueden ser cambiados a residuos que aparecen más frecuentemente para esa clase o tipo de cadena aceptora . Alternativamente, los residuos seleccionados en las regiones estructurales aceptoras pueden ser cambiados de modo que éstos correspondan al residuo encontrado en la misma posición en el anticuerpo donador (ver Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Tales cambios deben ser mantenidos al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donador. Un protocolo para seleccionar los residuos en las regiones estructurales aceptoras que pueden necesitar ser cambiados, se describe en el documento W091/09967.
De este modo, en una modalidad 1, 2, 3, 4, ó 5 residuos en la estructura son reemplazados con un residuo de aminoácido alternativo.
En consecuencia, en un ejemplo, se proporciona un anticuerpo humanizado, en donde al menos los residuos en cada una de las posiciones 3, 24, 76, 93 y 94 del dominio variable de la cadena pesada (numeración de Kabat) son residuos donadores, ver por ejemplo la secuencia dada en la SEQ ID No . : 29.
En una modalidad, el residuo 3 del dominio variable de cadena pesada es reemplazado con un aminoácido alternativo, por ejemplo glutamina.
En una modalidad, el residuo 24 del dominio variable de cadena pesada es reemplazado con un aminoácido alternativo, por ejemplo alanina.
En una modalidad, el residuo 76 del dominio variable de cadena pesada es reemplazado con un aminoácido alternativo, por ejemplo asparagina.
En una modalidad, el residuo 93 de la cadena pesada es reemplazado con un aminoácido alternativo, por ejemplo alanina .
En una modalidad, el residuo 94 de la cadena pesada es reemplazado con un aminoácido alternativo, por ejemplo arginina .
En una modalidad, el residuo 3 es glutamina, el residuo 24 es alanina, el residuo 76 es asparagina, el residuo 93 es alanina y el residuo 94 es arginina en la región variable de cadena pesada humanizada de acuerdo a la presente descripción.
En consecuencia, en un ejemplo, se proporciona un anticuerpo humanizado, en donde al menos los residuos de cada una de las posiciones 36, 37 y 58 del dominio variable de la cadena ligera (numeración de Kabat) son residuos donadores, ver por ejemplo la secuencia dada en la SEQ ID No.: 15.
En una modalidad, el residuo 36 del dominio variable de cadena ligera es reemplazado con un aminoácido alternativo, por ejemplo tirosina.
En una modalidad, el residuo 37 del dominio variable de cadena ligera es reemplazado con un aminoácido alternativo, por ejemplo glutamina.
En una modalidad, el residuo 58 del dominio variable de cadena ligera es reemplazado con un aminoácido alternativo, por ejemplo valina.
En una modalidad, el residuo 36 es tirosina, el residuo 37 es glutamina y el residuo 58 es valina, en la región variable de cadena pesada humanizada de acuerdo a la presente descripción.
En una modalidad la descripción proporciona una secuencia de anticuerpo que es 80% similar o idéntica a una secuencia descrita en la presente, por ejemplo 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96% o, 97%, 98% o 99%) sobre parte o la totalidad de la secuencia relevante, por ejemplo una secuencia de dominio variable, una secuencia de CDR o una secuencia de dominio variable, excluyendo las CDRs . En una modalidad, la secuencia relevante es la SEQ ID No.: 15. En una modalidad, la secuencia relevante es la SEQ ID No.: 29.
En una modalidad, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo que se enlaza a FcRn humano, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% o 99% de identidad o similitud a la secuencia dada en la SEQ ID No . : 29.
En una modalidad, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo que se enlaza a FcRn humano, que comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% o 99% de identidad o similitud a la secuencia dada en la SEQ ID No.: 15.
En una modalidad, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo que se enlaza a FcRn humano, en donde el anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% o 99% similar o idéntico a la secuencia dada en la SEQ ID No.:29 pero en donde el molécula de anticuerpo tiene la secuencia dada en la SEQ ID No.: 1 para la CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID No. : 2 para la CDR-H2 y la secuencia dada en la SEQ ID No. : 3 para la CDR-H3.
En una modalidad, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo que se enlaza a FcRn humano en donde el anticuerpo tiene un dominio variable de cadena ligera que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% o 99% similar o idéntico a la secuencia dada en la SEQ ID No. : 15 pero en donde el molécula de anticuerpo tiene la secuencia dada en la SEQ ID No. : 4 para la CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID No. : 5 para la CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID No. : 6 para la CDR-L3.
En una modalidad, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo que se enlaza a FcRn humano, en donde el anticuerpo tiene un dominio variable de cadena pesada que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% o 99% similar o idéntico a la secuencia dada en la SEQ ID No.: 29 y un dominio variable de cadena ligera que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% o 99% similar o idéntico a la secuencia dada en la SEQ ID No. : 15 pero en donde el molécula de anticuerpo tiene la secuencia dada en la SEQ ID No. : 1 para la CDR-H1, la secuencia dada en la SEQ ID No.: 2 para la CDR-H2, la secuencia dada en la SEQ ID No.: 3 para la CDR-H3, la secuencia dada en la SEQ ID No.: 4 para la CDR-L1, la secuencia dada en la SEQ ID No.: 5 para la CDR-L2 y la secuencia dada en la SEQ ID No. : 6 para la CDR-L3.
"Identidad", como se utiliza en la presente, indica que cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es idéntico entre las secuencias. "Similitud", como se utiliza en la presente, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, la leucina puede ser sustituida por isoleucina o valina. Otros aminoácidos que pueden ser sustituidos frecuentemente por otro más incluyen, pero no están limitados a: fenilalanina, tirosina y triptofano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas) ; lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas) ; aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas) ; asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida) ,- y cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre) . Los grados de identidad y similitud pueden ser fácilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. , ed. , Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed. , Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Secuencia Analysis en Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M Stockton Press, New York, 1991, el software BLASTMR disponible de NCBI (Altschul, S.F. et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. y States, D.J. 1993, Nature Genet . 3:266-272. Madden, T.L. et al, 1996, Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, S.F. et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. y Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).
Las moléculas de anticuerpo de la presente invención pueden comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o un fragmento de las mismas y, puede ser, pero no está limitada a Fab, Fab modificada, Fab1, Fab' modificada, F(ab' )2, Fv, anticuerpos de dominio simple (por ejemplo, VH o VL o VHH) , scFv, anticuerpos bi, tri o tetra-valentes , Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de enlace al epitopo de cualquiera de los anteriores (ver por ejemplo Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair y lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Los métodos para la crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo Verma et al, 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Otros fragmentos de anticuerpo para usarse en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab1 descritos en las Solicitudes de Patente Internacionales WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171. Los anticuerpos multi-valentes pueden comprenden especificidades múltiples, por ejemplo biespecíficos o pueden ser monoespecífieos (ver por ejemplo, los documentos WO 92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 y WO2010/035012 ) .
En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente descripción es un fragmento Fab' de anticuerpo que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID Nos. : 15 y 29, por ejemplo para la cadena ligera y pesada respectivamente. En una modalidad, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 22 y una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.:36.
En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente descripción es un anticuerpo IgGl de longitud completa que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID Nos.: 15 y 29, por ejemplo para la cadena ligera y pesada respectivamente. En una modalidad, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No. :22 y una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 72.
En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente descripción está en un formato de IgG4 de longitud completa que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID Nos.: 15 y 29, por ejemplo para la cadena ligera y pesada respectivamente. En una modalidad, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 22 y una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.:87.
En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente descripción está en un formato IgG4P longitud completa que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID Nos.: 15 y 29, por ejemplo para la cadena ligera y pesada respectivamente. En una modalidad, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 22 y una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.:43.
IgG4P como se empleada en la presente, es una mutación del isotipo IgG4 de tipo silvestre donde el aminoácido 241 es reemplazado por prolina, ver por ejemplo donde la serina en la posición 241 ha sido cambiada a prolina como se describe en Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108.
En una modalidad, el anticuerpo de acuerdo a la presente descripción es proporcionada como la proteína de fusión del anticuerpo que se enlaza a FcRn, que comprende una porción de inmunoglob lina, por ejemplo un fragmento Fab o Fab', y uno o dos anticuerpos de dominio simple (dAb) enlazados directa o indirectamente al mismo, por ejemplo como se describe en los documentos WO2009/040562 , O2010035012 , WO2011/030107, WO2011/061492 y WO2011/086091 todos incorporados por referencia en la presente.
En una modalidad, la proteína de fusión comprende anticuerpos de dos dominios, por ejemplo como una pareja pesada variable (VH) y ligera variable (VL) , opcionalmente enlazada por un enlace disulfuro.
En una modalidad, el elemento Fab o Fab' de la proteína de fusión tiene la misma o una similar especificidad al anticuerpo o anticuerpos de dominio simple. En una modalidad, el Fab o Fab1 tiene un especificidad diferente al anticuerpo o anticuerpos de dominio simple, es decir, la proteína de fusión es multivalente . En una modalidad una proteína de fusión multivalente de acuerdo a la presente invención, tiene un sitio de enlace a la albúmina, por ejemplo un par VH/VL en éste, proporciona un sitio de enlace a la albúmina. En una modalidad de este tipo, la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 50 y la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 46 o SEQ ID No.:78. El formato Fab-dsFv es ilustrado en la Figura 25 en la presente.
En una modalidad, el Fab o Fab' de acuerdo a la presente descripción es conjugado a una molécula de PEG o a la albúmina sérica humana.
CA170_01519g57 y 1519 y 1519. g57 son empleados de manera intercambiable en la presente, y son utilizados para referirse a un par específico de las regiones variables las cuales pueden ser utilizadas en un número de formatos diferentes. Estas regiones variables son la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID No.:29 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID No. : 15 (Figura 1) .
Los dominios de la región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, si están presentes, pueden ser seleccionados con respecto a la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que pueden ser requeridas. Por ejemplo, los dominios de la región constante pueden ser los dominios humanos de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM. En particular, los dominios de la región constante de IgG humana pueden ser utilizados, especialmente de los isotipos IgGl e IgG3 , cuando la molécula de anticuerpo está destinada para usos terapéuticos y son requeridas funciones efectoras del anticuerpo. Alternativamente, los isotipos IgG2 e IgG4 pueden ser utilizados cuando la molécula de anticuerpo está destinada para fines terapéuticos y no son requeridas funciones efectoras del anticuerpo. Se apreciará que las variantes de secuencia de estos dominios de la región constante pueden ser también utilizados. Por ejemplo, las moléculas de IgG4 en las cuales la serina en la posición 241 ha sido cambiada a prolina como se describe en Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108, pueden ser utilizadas. Podría ser entendido también por alguien de experiencia ordinaria en la técnica que los anticuerpos pueden sufrir una variedad de modificaciones post-traduccionales . El tipo y el grado de estas modificaciones depende a menudo de la línea celular hospedera utilizada para expresar el anticuerpo, así como de las condiciones de cultivo. Tales modificaciones pueden incluir las variaciones en glucosilación, la oxidación de la metionina, la formación de dicetopiperazina, la isomerización del aspartato, y la desamidación de la asparagina . Una modificación frecuente es la pérdida de un residuo básico carboxilo-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de las carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995). En consecuencia, la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo puede estar ausente .
En una modalidad, la cadena pesada del anticuerpo comprende un dominio CH1 y la cadena ligera del anticuerpo comprende un dominio CL, ya sea kappa o lambda.
En una modalidad, la cadena ligera tiene la secuencia dada en la SEQ ID No.: 22 y la cadena pesada tiene la secuencia dada en la SEQ ID No. :43.
En una modalidad la cadena ligera tiene la secuencia dada en la SEQ ID No.: 22 y la cadena pesada tiene la secuencia dada en la SEQ ID No. : 72.
En una modalidad un aminoácido C-terminal proveniente de la molécula de anticuerpo es escindido durante las modificaciones post-traduccionales .
En una modalidad, un aminoácido N-terminal proveniente de la molécula de anticuerpo es escindido durante las modificaciones post-traduccionales.
También en la presente invención se proporciona una región específica o epitopo de FcRn humano, que es enlazado con un anticuerpo proporcionado por la presente invención, en particular un anticuerpo que comprende la secuencia gH20 de cadena pesada (SEQ ID No.:29) y/o la secuencia gL20 de cadena ligera (SEQ ID No. : 15) .
La región específica o epitopo del polipéptido de FcRn humano puede ser identificado mediante cualquier método de mapeo de epitopos conocido en la técnica, en combinación con cualquiera de los anticuerpos proporcionado por la presente invención. Los ejemplos de tales métodos incluyen la selección de péptidos de longitudes variantes derivados de FcRn para el enlace al anticuerpo de la presente invención con el fragmento más pequeño que puede enlazarse específicamente al anticuerpo que contiene la secuencia del epitopo reconocido por el anticuerpo. Los péptidos de FcRn pueden ser producidos sintéticamente o mediante digestión proteolítica del polipéptido de FcRn. Los péptidos que se enlazan al anticuerpo pueden ser identificados por, por ejemplo, análisis espectrométrico de masa. En otro ejemplo más, se puede emplear espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) o cristalografía de rayos X, para identificar el epitopo enlazado por un anticuerpo de la presente invención. Una vez identificado, el fragmento epitópico que se enlaza a un anticuerpo de la presente invención puede ser utilizado, si se requiere, como un inmunógeno para obtener los anticuerpos adicionales que se enlazan al mismo epitopo.
En una modalidad, el anticuerpo de la presente descripción se enlaza a la secuencia extracelular de la cadena alfa de FcRn humano, se como muestra en seguida: AESHLSLLYH LTAVSSPAPG TPAFWVSGWL GPQQYLSYNS LRGEAEPCGA WVWENQVSWY WEKETTDLRI KEKLFLEAFK ALGGKGPYTL QGLLGCELGP DNTSVPTAKF ALNGEEFMNF DLKQGTWGGD WPEALAISQR WQQQDKAA K ELTFLLFSCP HRLREHLERG RGNLEWKEPP SMRLKARPSS PGFSVLTCSA FSFYPPELQL RFLRNGLAAG TGQGDFGPNS DGSFHASSSL TVKSGDEHHY CCIVQHAGLA QPLRVELESPAKSS (SEQ ID No. : 94) .
Los residuos subrayados son aquellos que se sabe son críticos para la interacción del FcRn humano con la región Fe de la IgG humana, y aquellos residuos subrayados en negritas son los que están involucrados en la interacción de FcRn con el anticuerpo 1519 de la presente descripción, que comprende la secuencia de cadena pesada gH20 (SEQ ID No.:29) y la secuencia de cadena ligera gL20 (SEQ ID No. : 15) .
En un ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que se enlaza a un epitopo del FcRn humano, que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de residuos V105, P106, T107, A108 y K109 de la SEQ ID No.:94 y al menos un residuo, por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos seleccionado del grupo que consiste de P100, E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, G129, D130, W131, P132 y E133 de la SEQ ID No.:94.
En un ejemplo, el epitopo de la molécula de anticuerpo es determinado mediante cristalografía de rayos X utilizando la secuencia extracelular de cadena alfa de FcRn (SEQ ID No.:94) en complejo con ß2?.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que se enlaza a un epitopo de FcRn humano el cual comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos V105, P106, T107, A108 y K109 de la SEQ ID No.:94 y al menos un residuo, por ejemplo al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 residuos, seleccionados del grupo que consiste de E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123 y Q124 de la SEQ ID No. : 94.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que se enlaza a un epitopo de FcRn humano que comprende al menos dos, tres, cuatro o cinco aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de los residuos V105, P106, T107, A108 y K109 de la SEQ ID No.: 94 y al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste de E115, E116, F117, 118, N119, F120, D121, L122, K123 y Q124 de la SEQ ID No.: 94.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que se enlaza a un epitopo de FcRn humano que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos V105, P106, T107, A108 y K109 de la SEQ ID No.:94 y al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste de P100, E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, G129, D130, W131, P132 y E133 de la SEQ ID No.: 94.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que se enlaza a un epitopo de FcRn humano que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de los residuos V105, P106, T107, A108 y K109 de la SEQ ID No.:94 y al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste de P100, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124 y G128 de la SEQ ID No.: 94.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que se enlaza a un epitopo de FcRn humano que comprende los residuos VIO5, P106, T107, A108 y K109 de la SEQ ID No.:94 y al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste de P100, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124 y G128 de la SEQ ID No.: 94.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que se enlaza a un epitopo de FcRn humano que comprende los residuos V105, P106, T107, A108 y K109 de la SEQ ID No.:94 y al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste de P100, E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, G129, D130, W131, P132 y E133 de la SEQ ID No.: 94.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que se enlaza a un epitopo de FcRn humano que comprende los residuos P100, V105, P106, T107, A108 y K109 de la SEQ ID No.:94 y al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste de E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, G129, D130, W131, P132 y E133 de la SEQ ID No.: 94.
En un ejemplo, "al menos un residuo" puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ó 16 residuos.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que se enlaza a un epitopo de FcRn humano que comprende o que consiste de los residuos 100, 105 al 109, 115 al 124 y 129 al 133 de la SEQ ID No. : 94.
Los anticuerpos que bloquean cruzadamente el enlace de una molécula de anticuerpo de acuerdo a la presente invención en particular, una molécula de anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID No. :29 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID No.: 15, pueden ser similarmente útiles en el bloqueo de la actividad de FcRn. En consecuencia, la presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn, que bloquea cruzadamente el enlace de cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas anteriormente en la presente al FcRn humano y/o es bloqueado cruzadamente de enlazarse a FcRn humano por cualquiera de estos anticuerpos. En una modalidad, tal anticuerpo se enlaza al mismo epitopo que un anticuerpo descrito anteriormente en la presente. En otra modalidad más, el anticuerpo neutralizador de bloqueo cruzado se enlaza a un epitopo que limita y/o que se traslapa con el epitopo enlazado por un anticuerpo descrito anteriormente en la presente .
Los anticuerpos de bloqueo cruzado pueden ser identificados utilizando cualquier método adecuado en la técnica, por ejemplo mediante el uso de los ensayos de ELISA de competencia o BIAcore, donde el enlace del anticuerpo de bloqueo cruzado al FcRn humano previene el enlace de un anticuerpo de la presente invención o viceversa. Tales ensayos de bloqueo cruzado pueden utilizar FcRn natural o recombinante aislado o una proteína/polipéptido de fusión, adecuado. En un ejemplo, el enlace y el bloqueo cruzado es medido utilizando el dominio extracelular de FcRn humano recombinante (SEQ ID No. : 94) . En un ejemplo, el dominio extracelular de cadena alfa de FcRn humano, recombinante, es utilizado en un complejo con la microglobulina ß2 (ß2?) (SEQ ID No. : 95) .
En una modalidad, se proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que bloquea el enlace de FcRn a la IgG y que bloquea cruzadamente el enlace de un anticuerpo cuya cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 29 y cuya cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID No. : 15 al FcRn humano. En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención inhiben el enlace de un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID No. :29 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID No. : 15, por más de 80%, por ejemplo, por más de 85%, tal como por más de 90%, en particular por más de 95%.
Alternativamente o en adición, los anticuerpos anti-FcRn de acuerdo a este aspecto de la invención pueden ser bloqueados cruzadamente al enlace al FcRn humano por un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID No. :29 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID No.: 15. También, por lo tanto se proporciona una molécula de anticuerpo anti-FcRn que bloquea el enlace de FcRn a la IgG y que es bloqueado cruzadamente de enlazarse a FcRn humano por un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID No. :29 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID No.: 15. En una modalidad, los anticuerpos anti-FcRn proporcionados por este aspecto de la invención son inhibidos de enlazarse al FcRn humano por un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada dada en la SEQ ID No. :29 y la secuencia de cadena ligera dada en la SEQ ID No. : 15 por más de 80%, por ejemplo por más de 85%, tal como por más de 90%, en particular por más de 95%.
En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención son completamente humanos. En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención son humanizados. En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención tienen una afinidad por el FcRn humano de 100 pM o menor. En una modalidad, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención tienen una afinidad por el FcRn humano de 50 pM o menor. La afinidad puede ser medida utilizando los métodos descritos más adelante en la presente.
Las moléculas biológicas, tales como los anticuerpos o los fragmentos, contienen grupos funcionales ácidos y/o básicos, con lo cual le dan a la molécula una carga positiva o negativa neta. La cantidad de carga total "observada" dependerá de la secuencia de aminoácidos absoluta de la entidad, del ambiente local de los grupos cargados en la estructura tridimensional y las condiciones ambientales de la molécula. El punto isoeléctrico (pl) es el pH al cual la molécula particular o la superficie accesible al solvente de la misma no lleva carga eléctrica neta. En un ejemplo, el anticuerpo para FcRn y los fragmentos de la invención pueden ser manipulados por ingeniería para tener un punto isoeléctrico apropiado. Esto puede conducir a los anticuerpos y/o a los fragmentos con propiedades más robustas, en particular perfiles de solubilidad y/o estabilidad adecuados y/o características de purificación mejoradas.
De este modo, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo para FcRn humanizado, manipulado por ingeniería para tener un punto isoeléctrico diferente de aquel del anticuerpo originalmente identificado. El anticuerpo puede, por ejemplo, ser manipulado por ingeniería mediante el reemplazo de un residuo de aminoácido tal como el reemplazo de un residuo de aminoácido ácido con uno o más residuos de aminoácidos básicos. Alternativamente, los residuos de aminoácidos básicos pueden ser introducidos o los residuos de aminoácidos ácidos pueden ser eliminados. Alternativamente, si la molécula tiene un valor de pl inaceptablemente alto, pueden ser introducidos residuos ácidos para disminuir el pl, como se requiera. Es importante que cuando se manipula el pl se debe tener cuidado en conservar la actividad deseable del anticuerpo o el fragmento. De este modo, en una modalidad el anticuerpo o el fragmento manipulado por ingeniería tiene la misma o sustancialmente la misma actividad que el anticuerpo o el fragmento "no modificado" .
Los programas tales como * ExPASY htt : //www. expasy. ch/tools/pi_tool . htmL y http : //www. iut-arles . u . univ-mrs . fr/w3bb/dabim 1 compo- . html , pueden ser utilizados para predecir el punto isoeléctrico del anticuerpo o el fragmento.
Las moléculas de anticuerpo de la presente invención tienen adecuadamente una alta afinidad de enlace, en particular en el intervalo nanomolar. La afinidad puede ser medida utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluyendo BIAcore, como se describe en los Ejemplos de la presente, utilizando FcRn natural o recombinante , aislado, o una proteína/polipéptido de fusión, adecuado. En un ejemplo, la afinidad es medida utilizando el dominio extracelular de FcRn humano, recombinante, como se describe en los Ejemplos en la presente (SEQ ID No. :94) . En un ejemplo, la afinidad es medida utilizando el dominio extracelular de la cadena alfa de FcRn humano, recombinante (SEQ ID No.:94) en asociación con la microglobulina ß2 (ß2?) (SEQ ID No.:95) . De manera adecuada, las moléculas de anticuerpo de la presente invención tienen una afinidad de enlace por el FcRn humano aislado de aproximadamente 1 nM o menor. En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace de aproximadamente 500 pM o menor (es decir, más alta afinidad) . En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace de aproximadamente 250 pM o menor. En una modalidad, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de enlace de aproximadamente 200 pM o menor. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-FcRn con una afinidad de enlace de aproximadamente 100 pM o menor. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado anti-FcRn con una afinidad de enlace de aproximadamente 100 M o menor. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-FcRn con una afinidad de enlace de 50 pM o menor.
De manera importante, los anticuerpos de la presente invención son capaces de enlazarse a FcRn humano a pH 6 y a pH 7.4 con afinidad de enlaces comparables. Por lo tanto, de manera ventajosa, los anticuerpos son capaces de continuar enlazándose a FcRn incluso dentro del endosoma, con lo cual se eleva al máximo el bloqueo del enlace de FcRn a la IgG, ver Figura 10 para una ilustración del mecanismo.
En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-FcRn con una afinidad de enlace de 100 pM o menor, cuando se mide a pH 6 y a pH 7.4.
La afinidad de un anticuerpo o fragmento de enlace de la presente invención, así como el grado al cual un agente de enlace (tal como un anticuerpo) inhibe el enlace, puede ser determinado por una persona de experiencia ordinaria en la técnica utilizando técnicas convencionales, por ejemplo aquellas descritas por Scatchard et al. (Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)) o mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) utilizando sistemas tales como BIAcore. Para la resonancia de plasmón superficial, las moléculas objetivo son inmovilizadas sobre una fase sólida y expuestas a ligandos en una fase móvil que corre a lo largo de una celda de flujo. Si el enlace del ligando al objetivo inmovilizado ocurre, cambia el índice de refracción local, lo que conduce a un cambio en el ángulo de SPR, el cual puede ser monitorizado en tiempo real al detectar los cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las proporciones de cambio de la señal de SPR pueden ser analizadas para producir las constantes de velocidad aparentes para las fases de asociación y disociación de la reacción de enlace. La proporción de estos valores da la constante de equilibrio aparente (afinidad) (ver por ejemplo, olff et al, C ncer Res. 53 :2560-65 (1993) ) .
En la presente invención, la afinidad de la molécula de anticuerpo de prueba es típicamente determinada utilizando SPR como sigue. La molécula de anticuerpo de prueba es capturada sobre la fase sólida y el dominio extracelular de la cadena alfa de FcRn humano, en el complejo no covalente con ß2? es corrido sobre el anticuerpo capturado en la fase móvil y la afinidad de la molécula de anticuerpo de prueba para el FcRn humano determinado. La molécula de anticuerpo de prueba puede ser capturada sobre la superficie de chip en fase sólida utilizando cualquier método apropiado, por ejemplo utilizando un agente de captura específico de anti-Fc o anti Fab ' . En un ejemplo, la afinidad es determinada a pH 6. En un ejemplo, la afinidad es determinada a pH 7.4.
Se apreciará que la afinidad de los anticuerpos proporcionados por la presente invención puede ser alterada utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. La presente invención también se refiere por lo tanto a las variantes de las moléculas de anticuerpo de la presente invención, que tienen una afinidad mejorada por FcRn. Tales variantes pueden ser obtenidas por un número de protocolos de maduración de afinidad incluyendo la mutación de las CDRs (Yang et al, J. Mol. Biol, 254, 392-403, 1995), el entremezclado de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), el uso de cepas mutadoras de E. coli (Lo et al., J. Mol. Biol, 250, 359-368, 1996), el entremezclado de ADN (Patten et al, Curr. Opin. BiotechnoL, 8, 724-733, 1997), visualización de fago (Thompson et al , J. Mol. Biol, 256, 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al, Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) discute estos métodos de maduración por afinidad.
En una modalidad, las moléculas de anticuerpo de la presente invención bloquean la actividad de FcRn humano. Los ensayos adecuados para determinar la habilidad de un anticuerpo para bloquear FcRn son descritos en los Ejemplos de la presente. Los ensayos adecuados para determinar si los anticuerpos bloquean o no la interacción de FcRn con las moléculas de IgG en circulación se describe en los Ejemplos de la presente. El ensayo adecuado para determinar la habilidad de una molécula de anticuerpo para bloquear el reciclamiento de la IgG in vifcro, se describe más adelante en la presente.
Si se desea, un anticuerpo para usarse en la presente invención puede ser conjugado a una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una molécula efectora simple o dos o más de tales moléculas ligadas de tal manera como para formar una porción simple que puede ser enlazada a los anticuerpos de la presente invención. Donde se desea obtener un fragmento de anticuerpo enlazado a una molécula efectora, éste puede ser preparado mediante procedimientos estándares químicos o de ADN recombinante en los cuales el fragmento de anticuerpo es enlazado ya sea directamente o vía un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para la conjugación de tales moléculas efectoras a los anticuerpos, son bien conocidas en la materia (ver, Hellstrom et al, Controlled Drug Delivery, 2a Edición, Robinson et al, eds . , 1987, pp. 623-53; Thorpe et al, 1982, Immunol . Rev. , 62: 119-58 y Dubowchik et al, 1999, Pharmacology and Therapeutics , 83, 67-123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en los documentos WO 93/06231, O 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO 03/031581. Alternativamente, donde la molécula efectora es una proteína o polipéptido el enlace puede ser logrado utilizando los procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745.
El término "molécula efectora" como se utiliza en la presente incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos , fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo enzimas, otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos, y fragmentos de los mismos, por ejemplo ADN, ARN y fragmentos de los mismos, radionúclidos , particularmente radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos reporteros, tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden ser detectados mediante espectroscopia de RMN o de ESR.
Los ejemplos de las moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos que incluyen cualquier agente que sea dañino para (por ejemplo, matar) las células. Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas , rizoxina, halicondrinas , roridinas, hemiasterlinas , taxol, citochalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubiciña, dihidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides , procaina, tetracaina, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.
Las moléculas efectoras también incluyen, pero no están limitadas a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil-decarbazina) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida , busulfan, dibomomanitol , estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino) , antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (antiguamente daunomicina) y doxorrubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (antiguamente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, antramicina (A C) , caliqueamicinas o duocarmicinas) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina) .
Otras moléculas efectoras pueden incluir radionúclidos quelados tales como li:LIn y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252, Iridio192 y Tungsteno188/Renio188 ; o fármacos tales como, pero no limitados a, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina .
Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero no están limitadas a, enzimas proteolíticas , hidrolasas, liasas, isomerasas, transíerasas . Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero no están limitadas a, inmunoglobulinas , toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de la difteria, una proteína tal como insulina, factor de necrosis tumoral, oc-interferón, ß-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador del plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente anti-angiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina, o, un modificador de la respuesta biológica tal como linfocina, interleucina-1 (IL-1) , interleucina-2 (IL-2), factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF, por sus siglas en Inglés) , factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF, por sus siglas en Inglés) , factor de crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en Inglés) u otros factores de crecimiento e inmunoglobulinas .
Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles por ejemplo en el diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes , núclidos radioactivos, metales emisores de positrones (para usarse en tomografía de emisión de positrones) , e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Ver en general la Patente de los Estados Unidos No. 4,741,900 para los iones metálicos que pueden ser conjugados a los anticuerpos para usarse como diagnósticos. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina-fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina, y aecuorina; y los núclidos radioactivos adecuados incluyen 125I , 1311, l lIn y "Te.
En otro ejemplo más, la molécula efectora puede incrementar la vida media del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o aumentar la distribución de un anticuerpo a través de una barrera epitelial hacia el sistema inmunitario. Los ejemplos de las moléculas efectoras adecuadas de ese tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas que se enlazan a la albúmina o compuestos que se enlazan a la albúmina, tales como aquellos que se describen en el documento WO05/117984.
En una modalidad, una vida media proporcionada por una molécula efectora que es independiente de FcRn es ventaj osa .
Donde la molécula efectora es un polímero ésta puede ser, en general, un polímero sintético o uno de origen natural, por ejemplo un polímero de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituido, de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno, o un polisacárido ramificado o no ramificado, por ejemplo un homo- o hetero-polisacárido .
Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes sobre los polímeros sintéticos anteriormente mencionados incluyen uno o más grupos hidroxilo, metilo o metoxi .
Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen poli (etilenglicol) , poli (propilenglicol) poli (alcohol vinílico) o derivados de los mismos, de cadena lineal o ramificada, opcionalmente sustituidos, especialmente el poli (etilenglicol ) opcionalmente sustituido tal como metoxipoli (etilenglicol ) o derivados de los mismos.
Los polímeros de origen natural específicos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de los mismos.
En una modalidad, el polímero es albúmina o un fragmento de la misma, tal como albúmina sérica humana o un fragmento de la misma.
"Derivados" como se utiliza en la presente, está destinado a incluir los derivados reactivos, por ejemplo los grupos reactivos selectivos al tiol tales como las maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar enlazado directamente o a través de un segmento ligador al polímero. Se apreciará que el residuo de tal grupo en algunos casos formará parte del producto como el producto de enlace entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.
El tamaño del polímero puede ser variado como se desee, pero en general estará en un intervalo de peso molecular promedio de 500Da a 50000Da, por ejemplo de 5000 a 40000Da tal como de 20000 a 4000ODa. El tamaño del polímero puede ser seleccionado en particular con base en el uso pretendido del producto, por ejemplo la habilidad para localizar ciertos tejidos tales como tumores o extender la vida media en circulación (para revisión ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). De este modo, por ejemplo, donde el producto está destinado a abandonar la circulación y penetrar el tejido, por ejemplo para usarse en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso utilizar un polímero de pequeño peso molecular, por ejemplo con un peso molecular de alrededor de 5000 Da. Para aplicaciones donde el producto permanece en la circulación, puede ser ventajoso utilizar un polímero de más alto peso molecular, por ejemplo que tiene un peso molecular en el intervalo de 20000 Da a 40000 Da.
Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno, tal como un poli (etilenglicol) o, especialmente, un metoxipoli (etilenglicol) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15000 Da a aproximadamente 40000 Da.
En un ejemplo, los anticuerpos para usarse en la presente invención son enlazados a las porciones de poli (etilenglicol) (PEG) . En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG pueden ser enlazadas a través de cualquier cadena lateral de aminoácido disponible o grupo funcional de aminoácido terminal localizado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libres. Tales aminoácidos pueden aparecer de manera natural en el fragmento de anticuerpo o pueden ser manipulados por ingeniería dentro del fragmento utilizando los métodos de ADN recombinante (ver por ejemplo, los documentos US 5,219,996; US 5,667,425; W098/25971, WO2008/038024) . En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado, en donde la modificación es la adición al extremo C de su cadena pesada, de uno o más aminoácidos para permitir el enlace de una molécula efectora. Adecuadamente, los aminoácidos adicionales forman una región de bisagra modificada que contiene uno o más residuos de cisteína a los cuales puede ser enlazada la molécula efectora. Pueden ser utilizados múltiples sitios para enlazar dos o más moléculas de PEG.
Adecuadamente, las moléculas de PEG son covalentemente enlazadas a través de un grupo tiol de al menos un residuo de cisteína localizado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula polimérica enlazada al fragmento de anticuerpo modificado puede ser covalentemente enlazada al átomo de azufre de un residuo de cisteína localizado en el fragmento. El enlace covalente será en general un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono . Donde el grupo tiol es utilizado como el punto de enlace pueden ser utilizadas moléculas efectoras apropiadamente activadas, por ejemplo derivados selectivos del tiol, tales como las maleimidas y los derivados de cisteína. Un polímero activado puede ser utilizado como el material inicial en la preparación de los fragmentos de anticuerpo modificados con polímero, como se describió anteriormente. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo al tiol tal como un ácido ot-halocarboxílico o un éster, por ejemplo, yodoacetamida, una imida, por ejemplo, maleimida, una vinilsufona o un disulfuro. Tales materiales inicial pueden ser obtenidos comercialmente (por ejemplo de Nektar, antiguamente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, Estados Unidos) o pueden ser preparados a partir de materiales iniciales comercialmente disponibles utilizando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen metoxi-PEG-amina de 20 K (obtenible de Nektar, antiguamente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, antiguamente Shearwater) .
En una modalidad, el anticuerpo es un fragmento de Fab modificado, un fragmento Fab1 o diFab el cual está PEGilado, es decir, tiene PEG (poli (etilenglicol) ) covalentemente enlazado al mismo, por ejemplo, de acuerdo al método descrito en las Patentes Europeas EP 0948544 o EP 1090037 [ver también " Poly (ethyleneglycol ) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed) , Plenum Press, New York, "Poly (ethyelenglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds) , American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. En un ejemplo, el PEG es enlazado a una cisteína en la región de bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab modificado con PEG tiene un grupo maleimida covalentemente enlazado a un grupo tiol simple en una región de bisagra modificada. Un residuo de lisina puede ser covalentemente enlazado al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina sobre el residuo de lisina puede estar enlazado a un polímero de metoxipoli (etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20,000 Da. El peso molecular total del PEG enlazado al fragmento de Fab puede ser por lo tanto de aproximadamente 40,000 Da.
Las moléculas de PEG particulares incluyen 2-[3-(N-maleimido) propionamido] etilamida de la lisina modificada con N, N 1 -bis (metoxipoli (etilenglicol) PM 20,000), también conocido como PEG2MAL40K (obtenible de Nektar, antiguamente Shearwater) .
Las fuentes alternativas de enlazadores de PEG incluyen NOF quienes suministran GL2-400MA3 (en donde m en la estructura de abajo es 5) y GL2-400MA (donde m es 2) y n es aproximadamente 450: m es 2 ó 5 Es decir, cada PEG es de aproximadamente 20,000 Da.
De este modo, en una modalidad el PEG es 2,3-Bis (metilpolioxietilen-oxi) -l-{ [3- (6-maleimido-l-oxohexil ) amino] ropiloxi }hexano (el PEG ramificado de 2 brazos, -CH2) 3NHC0 (CH2) s-MAL, PM 40,000 conocido como SUNBRIGHT GL2-400MA3.
Las moléculas efectoras de PEG alternativas, adicionales del siguiente tipo: están disponibles del Dr Reddy, NOF y Jenkem.
En una modalidad, se proporciona un anticuerpo que está PEGilado (por ejemplo con un PEG descrito en la presente) , enlazado a través de un residuo aminoácido cisteína en o aproximadamente el aminoácido 226 en la cadena, por ejemplo el aminoácido 226 de la cadena pesada (por numeración secuencial) , por ejemplo, el aminoácido 226 de la SEQ ID No. :36.
En una modalidad, la presente descripción proporciona una molécula de Fab 1 PEG que comprende uno o más polímeros de PEG, por ejemplo 1 ó 2 polímeros tales como un polímero de 40 kDa o varios polímeros.
Las moléculas de Fab1- PEG de acuerdo a la presente descripción pueden ser particularmente ventajosas, ya que éstas tienen una vida media independiente del fragmento Fe. En un ejemplo, la presente invención proporciona un método de tratamiento de un trastorno, que es mejorado por el bloqueo del FcRn humano, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo, en donde el anticuerpo o el fragmento de enlace del mismo tiene una vida media que es independiente del enlace de Fe a FcRn.
En una modalidad, se proporciona un fragmento Fab1 conjugado a un polímero, tal como una molécula de PEG, una molécula de almidón o una molécula de albúmina.
En una modalidad, se proporciona un scFv conjugado a un polímero, tal como una molécula de PEG, una molécula de almidón o una molécula de albúmina.
En una modalidad el anticuerpo o fragmento es conjugado a una molécula de almidón, por ejemplo para incrementar la vida media. Los métodos de conjugación del almidón a una proteína son como se describe en la Patente de los Estados Unidos US 8,017,739 incorporada por referencia en la presente .
En una modalidad, se proporciona una molécula de enlace a anti-FcRn la cual: • Provoca 70% de la reducción de la concentración de IgG en plasma, • Con no más de 20% de la reducción de la concentración de albúmina plasmática, y/o • Con la posibilidad de repetir la dosificación para lograr el mantenimiento a largo plazo de la baja concentración de IgG en plasma.
La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica para la o las cadenas pesadas y/o ligeras de una molécula del anticuerpo de la presente invención. De manera adecuada, la secuencia de ADN codifica para la cadena pesada o la cadena ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo producido mediante procesamiento químico, cADN, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos .
Las secuencias de ADN que codifican para una molécula de anticuerpo de la presente invención pueden ser obtenidas mediante métodos bien conocidos para aquellas personas expertas en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican para parte o todas las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo, pueden ser sintetizadas como se desee a partir de las secuencias determinadas de ADN, o con base en las secuencias de aminoácidos correspondientes.
El ADN que codifica para las secuencias estructurales aceptoras es ampliamente disponible para aquellas personas expertas en la técnica y puede ser fácilmente sintetizado con base en sus secuencias de aminoácidos conocidas .
Las técnicas estándares de biología molecular pueden ser utilizadas para preparar las secuencias de ADN que codifican para la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias deseadas de ADN pueden ser sintetizadas completamente o en parte utilizando técnicas de síntesis de oligonucleótidos . La mutagénesis dirigida al sitio y las técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en Inglés) pueden ser utilizadas, como sea apropiado.
Los ejemplos de secuencias de ADN adecuadas se proporcionan en la presente.
Los ejemplos de secuencias adecuadas de ADN que codifican para la región variable de cadena ligera 1519 son proporcionadas en la SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 17 y SEQ ID No.: 90. Los ejemplos de las secuencias de ADN adecuadas que codifican para la región variable de cadena pesada 1519 son proporcionadas en la SEQ ID No.: 30, SEQ ID No.: 31 y SEQ ID No. : 92.
Los ejemplos de las secuencias de ADN adecuadas que codifica para la cadena ligera 1519 (variable y constante) son proporcionadas en la SEQ ID No.: 23, SEQ ID No.: 75 y SEQ ID No. : 91.
Los ejemplos de las secuencias de ADN adecuadas que codifica para la cadena pesada 1519 (variable y constante, dependiendo del formato) son proporcionadas en las SEQ ID Nos.: 37, 38 y 76 (Fab'), SEQ ID No.: 72 u 85 (IgGl) , SEQ ID No.: 44 ó 93 (IgG4P) y SEQ ID:88 (IgG4).
En consecuencia en un ejemplo, la presente invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica para la cadena pesada de un fragmento Fab' de anticuerpo de la presente invención, que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 37. También se proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica para la cadena ligera de un fragmento Fab' de anticuerpo de la presente invención, que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 23.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica para la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo IgG4 (P) de la presente invención, en el cual el ADN que codifica para la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 44 ó SEQ ID No. : 93, y el ADN que codifica para la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID No. : 75 o SEQ ID No. : 91.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica para la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo Fab-dsFv de la presente invención en la cual el ADN que codifica para la cadena pesada comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 51 o SEQ ID No.: 80 y el ADN que codifica para la cadena ligera comprende la secuencia dada en la SEQ ID No. : 47 o SEQ ID No. : 79.
La presente invención también se refiere a un vector de clonación o de expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. En consecuencia, se proporciona un vector de clonación o de expresión que comprende una o más secuencias de ADN que codifican para un anticuerpo de la presente invención. De manera adecuada, el vector de clonación o de expresión comprende dos secuencias de ADN, que codifican para la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de la presente invención, respectivamente, y las secuencias de señal adecuadas. En un ejemplo, el vector comprende una secuencia intergénica entre las cadenas pesadas y las cadenas ligeras (ver documento WO03/048208) .
Los métodos generales mediante los cuales pueden ser construidos los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo, son bien conocidos para aquellas personas expertas en la técnica. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed) , Wiley Interscience , New York y el Manual de Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing.
También se proporciona una célula hospedera que comprende uno o más vectores de clonación o de expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican para un anticuerpo de la presente invención. Cualquier sistema de célula hospedera/vector adecuado puede ser utilizado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican para la molécula de anticuerpo de la presente invención. Sistemas bacterianos, por ejemplo E. coli, y otros sistemas bacterianos pueden ser utilizados, o bien pueden también ser utilizados los sistemas eucarióticos , por ejemplo de mamífero, como sistemas de expresión de célula hospedera. Las células hospederas de mamífero adecuadas incluyen las células CHO, células de mieloma o células de hibridoma.
Los tipos adecuados de células de Ovario de Hámster Chino (células CHO, por sus siglas en Inglés) para usarse en la presente invención pueden incluir las células CHO y CHO-Kl incluyendo las células de dhfr-CHO, tales como las células de CH0-DG44 y las células de CH0-DXB11, y que pueden ser utilizadas con un marcador seleccionable de DHFR o las células CH0K1-SV que pueden ser utilizadas como un marcador seleccionable de la glutamina-sintetasa . Otros tipos celulares de uso en la expresión de los anticuerpos, incluyen en las líneas celulares linfocitarias , por ejemplo, las células de mieoloma NSO y las células SP2 , células COS.
La presente invención también proporciona un proceso para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo a la presente invención que comprende el cultivo de una célula hospedera que contiene un vector de la presente invención bajo condiciones adecuadas para conducir a la expresión de la proteína a partir del ADN que codifica para la molécula de anticuerpo de la presente invención, y el aislamiento de la molécula de anticuerpo.
La molécula de anticuerpo puede comprender únicamente un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso únicamente se necesita ser utilizada una secuencia que codifica para el polipéptido de cadena pesada o de cadena ligera, para transfectar las células hospederas. Para la producción de los productos que comprenden las cadenas pesadas y ligeras, la línea celular puede ser transfectada con dos vectores, un primer vector que codifica para un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica para un polipéptido de cadena pesada. Alternativamente, puede ser utilizado un vector simple, el vector simple incluye las secuencias que codifican para los polipéptidos de la cadena ligera y de la cadena pesada.
Los anticuerpos y los fragmentos de acuerdo a la presente descripción son expresados a buenos niveles a partir de las células hospederas. De este modo, las propiedades de los anticuerpos y/o los fragmentos son conducentes al procesamiento comercial .
De este modo, se proporciona un proceso para cultivar una célula hospedera, y expresar un anticuerpo o fragmento del mismo, aislando el último y opcionalmente purificando el mismo para proporcionar un anticuerpo o fragmento aislado. En una modalidad, el proceso comprende además el paso de conjugar una molécula efectora al anticuerpo o fragmento aislado, por ejemplo conjugando a un polímero de PEG, en particular como se describe en la presente .
En una modalidad, se proporciona un proceso para purificar un anticuerpo (en particular un anticuerpo o fragmento de acuerdo a la invención) que comprende los pasos de: realizar la cromatografía de intercambio aniónico en el modo de no enlace, tal que las impurezas son retenidas sobre la columna y el anticuerpo es eluido.
En una modalidad, la purificación emplea la captura por afinidad sobre una columna de FcRn.
En una modalidad, la purificación emplea el azul cibacron o similar para la purificación de las moléculas de fusión o conjugadas de albúmina.
Las resinas de intercambio iónico, adecuadas para usarse en el proceso incluyen la resina Q.FF (suministrada por GE-Healthcare) . El paso puede ser, por ejemplo realizado a un pH de aproximadamente 8.
El proceso puede comprender además un paso inicial de captura que emplea la cromatografía de intercambio catiónico, llevada a cabo por ejemplo a un pH de aproximadamente 4 a 5, tal como 4.5. La cromatografía de intercambio catiónico puede, por ejemplo emplear una resina tal como la resina CaptoS SP sefaróse FF (suministrada por GE-Healthcare) . El anticuerpo o el fragmento puede ser luego eluido a partir de la resina empleando una solución salina iónica tal como cloruro de sodio, por ejemplo a una concentración de 200 mM.
De este modo, el paso o pasos de cromatografía pueden incluir uno o más pasos de lavado, como sea apropiado.
El proceso de purificación puede también comprender uno o más pasos de filtración, tal como un paso de diafiltración .
De este modo, en una modalidad se proporciona un anticuerpo anti-FcRn o fragmento, purificado, por ejemplo un anticuerpo o fragmento humanizado, en particular un anticuerpo o fragmento de acuerdo a la invención, en forma sustancialmente pura, en particular libre o sustancialmente libre de endotoxina y/o de proteínas o ADN de la célula hospedera .
La "forma purificada" como se usa anteriormente, se pretende referir al menos a 90% de pureza, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%) p/p o más de pureza.
Se pretende que "sustancialmente libre de endotoxina" se refiera en general a un contenido de endotoxina de 1 EU por mg de producto anticuerpo o menos, tal como 0.5 ó 0.1 EU por mg de producto .
Se pretende que "sustancialmente libre de proteína o ADN de célula hospedera" se refiera en general al contenido de proteína de célula hospedera y/o de ADN de 400 pg por mg de producto de anticuerpo o menos, tal como 100 \ig por mg o menos, en particular 20 yg por mg, como sea apropiado.
La molécula de anticuerpo de la presente invención puede también ser utilizada en el diagnóstico, por ejemplo en el diagnóstico in vivo y la formación de imagen de estados de enfermedad que involucran FcRn.
Ya que los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o la profilaxis de una condición patológica, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables. En consecuencia, se proporciona el uso de una molécula de anticuerpo de la invención para la fabricación de un medicamento. La composición usualmente será suministrada como parte de una composición farmacéutica, estéril, que normalmente incluirá un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona un proceso para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende agregar y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención, junto con uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables.
La molécula de anticuerpo puede ser el único ingrediente activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico, o puede estar acompañada por otros ingredientes activos, incluyendo otros ingredientes anticuerpos o ingredientes no anticuerpos, tales como esteroides u otras moléculas farmacológicas, en particular moléculas de fármaco cuya vida media sea independiente del enlace a FcRn.
Las composiciones farmacéuticas comprenden adecuadamente una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención. El término "cantidad terapéuticamente efectiva" como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir un trastorno o condición objetivo, o para mostrar un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente efectiva puede ser estimada inicialmente ya sea en ensayos de cultivo celular o en modelos de animales, usualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal puede también ser utilizado para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Tal información puede ser entonces utilizada para determinar las dosis útiles y las vías para la administración en humanos.
La cantidad terapéuticamente efectiva, precisa para un sujeto humano dependerá de la severidad del estado de enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta y la frecuencia de administración, la o las combinaciones del fármaco, las sensibilidades a la reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad puede ser determinada mediante experimentación rutinaria y está dentro del juicio del clínico. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva será de 0.01 mg/kg hasta 500 mg/kg, por ejemplo 0.1 mg/kg hasta 200 mg/kg, tal como 100 mg/kg.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser convenientemente presentadas en formas de dosis unitaria que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención, por dosis.
Las dosis terapéuticas de los anticuerpos de acuerdo a la presente descripción no muestran efectos de toxicología aparentes in vivo.
En una modalidad de un anticuerpo o fragmento de acuerdo a la invención, una dosis puede proporcionar hasta una reducción del 70% en los niveles de IgG en circulación.
La reducción terapéutica máxima en la IgG en circulación puede ser observada a aproximadamente 1 semana después de la administración de la dosis terapéutica relevante. Los niveles de IgG pueden recuperarse después de aproximadamente un periodo de seis semanas si no se distribuyen dosis terapéuticas adicionales.
Ventajosamente, los niveles de la IgG in vivo pueden ser mantenidos a un nivel apropiadamente bajo por la administración de dosis secuenciales del anticuerpo o los fragmentos de acuerdo a la descripción.
Las composiciones pueden administradas individualmente a un paciente o pueden ser administradas en combinación (por ejemplo, simultáneamente, secuencialmente , o de manera separada) con otros agentes, fármacos u hormonas.
En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de acuerdo a la presente descripción son empleados con una terapia inmunosupresora, tal como un esteroide, en particular prednisona .
En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de acuerdo a la presente descripción son empleados con Rituximab u otras terapias de células B.
En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de acuerdo a la presente descripción son empleados con cualquier agente modulador o inmunomodulador de células B o de células T. Los ejemplos incluyen metotrexato, microfeniolato y azatioprina.
La dosis a la cual es administrada la molécula de anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la condición que va a ser tratada, el grado de la inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo está siendo o no utilizada profilácticamente, o bien para tratar una condición existente.
La frecuencia de la dosis dependerá de la vida media de la molécula de anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula de anticuerpo tiene una vida media corta (por ejemplo, 2 a 10 horas) puede ser necesario administrar una o más dosis por día. Alternativamente, si la molécula de anticuerpo tiene una vida media prolongada (por ejemplo, 2 a 15 días) y/o un perfil farmacodinámico de larga duración (PD) puede ser únicamente necesario administrar una dosis una vez al día, una vez a la semana o una vez cada 1 ó 2 meses.
En una modalidad, la dosis es administrada bisemanalmente , es decir dos veces al mes.
La vida media, como es empleada en la presente, está destinada a referirse a la duración de la molécula en la circulación, por ejemplo en suero/plasma.
La farmacodinámica como es empleada en la presente, se refiere al perfil y en particular a la duración de la acción biológica de la molécula de acuerdo a la presente descripción.
El portador farmacéuticamente aceptable por sí mismo no debe inducir la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición, y no debe ser tóxico. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas, tales como proteínas, polipéptidos , liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácido poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas virales inactivas.
Las sales farmacéuticamente aceptables pueden ser utilizadas, por ejemplo las sales de ácidos minerales, tales como los clorhidratos, bromhidratos , fosfatos y sulfatos, o las sales de ácidos orgánicos, tales como los acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los portadores farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etano. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes o sustancias amortiguadoras del pH, en tales composiciones. Tales portadores hacen posible que las composiciones farmacéuticas sean formuladas como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y soluciones, para la ingestión por el paciente.
Las formas adecuadas para la administración incluyen las formas adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o venoclisis, por ejemplo mediante inyección de bolo o venoclisis continua. Donde el producto es para inyección o venoclisis, éste puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo aceitoso o acuoso, y puede contener agentes de formulación, tales como agentes suspensores, conservantes, estabilizadores y/o dispersantes. Alternativamente, la molécula de anticuerpo puede estar en forma anhidra, para la reconstitución antes del uso, como un líquido estéril apropiado .
Una vez formuladas, las composiciones de la invención pueden ser administradas directamente al sujeto. Los sujetos que van a ser tratados pueden ser animales. No obstante, una o más modalidades de las composiciones están adaptadas para la administración a sujetos humanos.
Adecuadamente, las formulaciones de acuerdo a la presente descripción, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o el fragmento, por ejemplo si el pl de la proteína está en el intervalo de 8-9 o superior, entonces una formulación de pH de 7 puede ser apropiada. Mientras que no se desee estar comprometido por alguna teoría, se piensa que esto puede al final proporcionar una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo o el fragmento permanece en solución.
En un ejemplo, la formulación farmacéuticamente aceptable a un pH en el intervalo de 4.0 a 7.0 comprende: 1 a 200 mg/ml de una molécula de anticuerpo de acuerdo a la presente descripción, 1 a 100 mM de un amortiguador, 0.001 a 1% de un tensioactivo, a) 10 a 500 mM de un estabilizador, b) 10 a 500 mM de un estabilizador y 5 a 500 mM de un agente de tonicidad, o c) 5 a 500 mM de un agente de tonicidad.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden ser administradas mediante cualquier número de vías incluyendo, pero no limitadas a, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial , intramedular, intratecal, intraventricula , transdérmica, transcutánea (por ejemplo, ver el documento WO98/20734) , subcutánea, intraperitoneal , intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Los hidrorrocíos pueden ser también utilizados para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Típicamente, las composiciones terapéuticas pueden ser preparadas como formulaciones inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección, pueden ser también preparadas .
La administración directa de las composiciones será lograda en general mediante inyección, subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, o intramuscularmente, o administrada al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones pueden ser también administradas dentro de una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un esquema de dosis simple o un esquema de dosis múltiple.
Se apreciará que el ingrediente activo en la composición será una molécula de anticuerpo. Como tal, éste será susceptible a la degradación en el tracto gastrointestinal. De este modo, si la composición va a ser administrada mediante una vía utilizando el tracto gastrointestinal, la composición necesitará contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez que éste ha sido absorbido desde el tracto gastrointestinal.
Una discusión completa de los portadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
En una modalidad, la formulación es proporcionada como una formulación para la administración tópica, incluyendo inhalación.
Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles de dosificación que contienen gases propelenes o soluciones inhalables libres de gases propelentes. Los polvos inhalables de acuerdo a la descripción que contienen la sustancia activa pueden consistir únicamente de las sustancias activas anteriormente mencionadas, o de una mezcla de las sustancias activas anteriormente mencionadas con el excipiente fisiológicamente aceptable .
Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (por ejemplo, glucosa o arabinosa) , disacáridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa) , oligo- y polisacáridos (por ejemplo, dextranos) , polialcoholes (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol) , sales (por ejemplo, cloruro de sodio, carbonato de sodio) o mezclas de éstos con otro más. Los mono- o disacáridos son adecuadamente utilizados, el uso de lactosa o glucosa, particularmente pero no exclusivamente en la forma de sus hidratos.
Las partículas para la deposición en los pulmones requieren un tamaño de partícula menor de 10 micrómetros, tal como 1-9 micrómetros, por ejemplo de 1 a 5 µt?. El tamaño de la partícula del ingrediente activo (tal como el anticuerpo o fragmento del mismo) es de importancia primordial.
Los gases propelentes que pueden ser utilizados para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la técnica. Los gases propelentes adecuados son seleccionados de entre los hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano, y los halohidrocarburos tales como los derivados clorados y/o fluorados derivados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propelentes anteriormente mencionados pueden ser utilizados por si solos o en mezclas de los mismos.
Los gases propelentes particularmente adecuados son los derivados de alcano halogenados seleccionados de entre TG11, TG12, TG134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados anteriormente mencionados, TG134a (1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano) y TG227 (1 , 1 , 1 , 2 , 3 , 3 , 3 -heptafluoropropano) y mezclas de los mismos, que son particularmente adecuados.
Los aerosoles inhalables que contienen el gas propelente pueden también contener otros ingredientes tales como cosolventes, estabilizadores, agentes activos de superficie (tensioactivos) , antioxidantes, lubricantes y los medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica.
Los aerosoles inhalables que contienen gas propelente, de acuerdo a la invención pueden contener hasta 5% en peso de la sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo a la invención contienen, por ejemplo, 0.002 a 5% en peso, 0.01 a 3% en peso, 0.015 a 2% en peso, 0.1 a 2% en peso, 0.5 a 2% en peso ó 0.5 a 1% en peso del ingrediente activo.
Alternativamente, las administraciones tópicas a los pulmones pueden también ser mediante administración de una solución líquida o formulación o suspensión, por ejemplo empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus (R) conectado a un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va . ) .
El anticuerpo de la invención puede ser distribuido disperso en un solvente, por ejemplo, en la forma de una solución o una suspensión. Éste puede ser suspendido en una solución fisiológica apropiada, por ejemplo, en solución salina u otro solvente farmacológicamente aceptable o una solución amortiguada. Las soluciones amortiguadas conocidas en la técnica pueden contener 0.05 mg a 0.15 mg de edetato disódico, 8.0 mg a 9.0 mg de cloruro de sodio, 0.15 mg a 0.25 mg de polisorbato, 0.25 mg a 0.30 mg de ácido cítrico anhidro, y 0.45 mg a 0.55 mg de citrato de sodio por 1 mi de agua, para lograr así un pH de aproximadamente 4.0 a 5.0. Una suspensión puede emplear, por ejemplo, el anticuerpo liofilizado.
Las suspensiones terapéuticas o las formulaciones en solución pueden también contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de citrato, amortiguador de fosfato, amortiguador de acetato y amortiguador de bicarbonato) , aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos , proteínas (por ejemplo, albúmina sérica) , EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol, y glicerol. Las soluciones o suspensiones pueden ser encapsuladas en liposomas o en microesferas biodegradables . La formulación en general será proporcionada en una forma sustancialmente estéril, empleando procesos de fabricación estériles. Ésta puede incluir la producción y la esterilización mediante filtración del solvente/solución amortiguada utilizada para la formulación, la suspensión aséptica del anticuerpo en la solución solvente amortiguada estéril, y el surtido de la formulación dentro de los receptáculos estériles mediante métodos familiares para aquellas persona de experiencia ordinaria en la técnica.
La formulación nebulizable de acuerdo a la presente descripción puede ser proporcionada, por ejemplo, como unidades de dosis simple (por ejemplo, recipientes o viales de plástico sellados) empacados en envolturas de papel metálico. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen de, por ejemplo, 2 mi, de solvente/solución amortiguadora.
Los anticuerpos descritos en la presente pueden ser adecuados para la distribución vía la nebulización.
Se considera también que el anticuerpo de la presente invención puede ser administrado mediante el uso de terapia génica. Con el fin de lograr esto, las secuencias de ADN que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de la molécula de anticuerpo bajo el control de los componentes de ADN apropiados, son introducidas dentro de un paciente tal que las cadenas de anticuerpos son expresadas a partir de las secuencias de ADN y ensambladas in situ.
La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo (o las composiciones que comprenden la misma) para usarse en el control de trastornos autoinmunitarios , por ejemplo Encefalomielitis Diseminada Aguda (ADEM, por sus siglas en Inglés) , leucoencefalitis hemorrágica necrotizante aguda, enfermedad de Addison, Agamaglobulinemia, Alopecia areata, Amiloidosis, vasculitis asociada a ANCA, espondilitis Anquilosante, nefritis Anti-GBM/Anti-TBM, síndrome Antifosfolípido (APS, por sus siglas en Inglés) , angioedema autoinmunitario, anemia aplásica autoinmunitaria, disautonomía autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, hiperlipidemia autoinmunitaria, inmunodeficiencia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno (AIED, por sus siglas en Inglés) , miocarditis autoinmunitaria, pancreatitis autoinmunitaria, retinopatía autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (ATP, por sus siglas en Inglés) , enfermedad autoinmunitaria de la tiroides, urticaria autoinmunitaria, neuropatías axonales y nales, enfermedad de Balo, enfermedad de Behcet, penfigoide huloso, cardiomiopatía, enfermedad de Castlemán, enfermedad Celíaca, enfermedad de Chagas, polineuropatía desmielizante inflamatoria crónica (CIDP, por sus siglas en Inglés) , osteomelitis multifocal recurrente crónica (CRMO, por sus siglas en Inglés) , síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial/penpigoide mucosal benigno, enfermedad de Crohn, síndrome de Cogans, enfermedad de aglutinina por frío, bloqueo cardiaco congénito, miocartitis de Coxsackie, enfermedad de CREST, crioglobulinemia mixta esencial, neuropatías desmielinizantes , dermatitis herpetiforme, dermatomiositis , enfermedad de Devic (neuromielitis óptica) , cardiomiopatía dilatada, lupus discoide, síndrome de Dressler, Endometriosis , fibrosis angiocéntrica eosinofílica, fascitis eosinofílica, Eritema nodoso, encefalomielitis alérgica experimental, síndrome de Evans, alveolitis fibrosante, arteritis macrocítica (arteritis temporal), Glomerulonefritis , síndrome de Goodpasture, Granulomatosis con Poliangiitis (GPA) ver enfermedad de egener y de Graves, síndrome de Guillain-Barre, encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, Hipogamaglobulinemia, nefritis de túbulo intersticial hipocomplementémica idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP, por sus siglas en Inglés) , nefropatía por IgA, enfermedad relacionada a IgG4 , enfermedad esclerosante relacionada a IgG , lipoproteínas inmunorreguladoras , aneurisma aórtico inflamatorio, pseudotumor inflamatorio, miositis por cuerpos de inclusión, diabetes dependiente de insulina (tipo 1) , cistitis Intersticial, artritis Juvenil, diabetes Juvenil, síndrome de Kawasaki, tumor de Kuttner, síndrome de Lambert-Eaton, vasculitis Leucocitoclástica , Liquen plano, Liquen escleroso, conjuntivitis leñosa, enfermedad por IgA lineal (LAD, por sus siglas en Inglés) , Lupus (SLE) , enfermedad de Lyme, fibrosis mediastinal crónica, enfermedad de Meniere, poliangitis microscópica, síndrome de Mikulicz, enfermedad del tejido conectivo mixto (MCTD, por sus siglas en Inglés) , úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, fibrosclerosis multifocal, esclerosis múltiple, Miastenia gravis, Miositis, Narcolepsia, Neuromielitis óptica (Devic) , Neutropenia, penfigoide cicatricial ocular, neuritis óptica, enfermedad de Ormond (fibrosis retroperitoneal ) , reumatismo Palindrómico, Trastornos Neuropsiquiátricos Autoinmunitarios Pediátricos Asociados con Esptreptococus (PANDAS, por sus siglas en Inglés) , degeneración cerebelar paraneoplásica, polineuropatías paraproteinémicas , hemoglobinuria nocturna paroxismal (PNH, por sus siglas en Inglés) , síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, Pars planitis (uveítis periférica) , Pénfigo vulgar, Periaortitis , Periarteritis , neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, anemia perniciosa, síndrome de POEMS, Poliarteritis nodosa, síndromes poliglandulares autoinmunitarios Tipo I, II, y III, Polimialgia reumática, Polimiositis , síndrome de infarto postmiocardiaco, síndrome postpericardiotomía, dermatitis por progesterona , cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, Psoriasis, artritis psoriática, fibrosis pulmonar idiopática, pioderma gangrenoso, aplasia de glóbulos rojos puros, fenómeno de Raynauds, distrofia de reflejo simpático, síndrome de Reiter, policondritis en residivas, síndrome de la pierna sin descanso, fibrosis retroperitoneal (enfermedad de Ormond) , fiebre reumática, artritis reumatoide, tiroiditis de Riedel, Sarcoidosis, síndrome de Schmidt, Escleritis, Esclerodermia, síndrome de Sjogren, autoinmunidad de esperma y testicular, síndrome de la persona rígida, endocartitis bacteriana subaguda (SBE, por sus siglas en Inglés) , síndrome de Susac, oftalmía simpática, arteritis en Takayasu, arteritis temporal/arteritis macrocítica, púrpura trombocitopénica trombótica (TTP, por sus siglas en Inglés) , síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversal, colitis ulcerativa, enfermedad de tejido conectivo no diferenciado (UCTD, por sus siglas en Inglés) , Uveítis, Vasculitis, dermatosis vesiculobulosa, Vitíligo, Macroglobulinemia de Waldenstrom, anemia hemolítica y hepática por calor y granulomatosis de Wegener (ahora denominada Granulomatosis con Poliangiitis (GPA, por sus siglas en Inglés) .
En una modalidad, los anticuerpos o los fragmentos de acuerdo a la descripción son empleados en el tratamiento o profilaxis de la epilepsia o ataques.
En una modalidad, los anticuerpos o fragmentos de acuerdo a la descripción son empleados en el tratamiento o profilaxis de esclerosis múltiple.
En algunas modalidades, los anticuerpos y fragmentos de la descripción son empleados en trastornos aloinmunitarios/indicaciones que incluyen: • No concordancia de trasplante y donador debido a anticuerpos anti-HLA • Trombocitopenia aloinmunitaria fetal y neonatal, FNAIT (o tromobocitopenia aloinmunitaria neonatal, NAITP o NAIT o NAT, o trombocitopenia aloinmunitaria feto-materna, F AITP o FMAIT) .
Las indicaciones adicionales incluyen: depuración rápida de los fármacos biofarmacéuticos que contienen Fe de los pacientes humanos, y la combinación de la terapia anti-FcRn con otras terapias - IVIg, Rituxan, plasmaferesis . Por ejemplo, la terapia anti-FcRn puede ser empleada después de la terapia con Rituxan.
En algunas modalidades, los anticuerpos y los fragmentos de la descripción son empleados en un trastorno neurológico tales como: • Polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP) • Síndrome de Guillain-Barre • Polineuropatías paraproteinémicas · Neuromielitis óptica (trastornos de espectro de NMO, NMO o enfermedades del espectro de NMO) , y • Miastenia gravis.
En algunas modalidades, los anticuerpos y los fragmentos de la descripción son empleados en un trastorno dermatológico tales como: • Penfigoide bulosa • Pénfigo vulgar • Vasculitis asociada a ANCA • Cardiomiopatía dilatada En algunas modalidades, los anticuerpos y los fragmentos de la descripción son empleados en un trastorno inmunitario hematológico, tales como: • Púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) • Púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) • Anemia hemolítica y hepática por calor • Síndrome de Goodpasture • No concordancia de trasplante y donador debido a anticuerpos anti-HLA En una modalidad, el trastorno se selecciona de Miastenia Gravis, Neuro-mielitis Óptica, CIDP, Síndrome de Guillaume-Barre, Poli neuropatía Para-proteinémica, Epilepsia Refractoria, ITP/TTP, Anemia Hemolítica, Síndrome de Goodpasture, no concordancia ABO, Nefritis por lupus, Vasculitis Renal, Esclerodermia, Alveolitis fibrosante, Cardiomatía dilatada, enfermedad de Grave, diabetes Tipo 1, Diabetes autoinmunitaria, pénfigo, esclerodermia, lupus, vasculitis por ANCA, Dermatomiositis , síndrome de Sjogren, y Artritis Reumatoide.
En una modalidad, el trastorno se selecciona del síndrome de poliendócrino autoinmunitario tipo 1 (APECED o Síndrome de Whitaker) y tipo 2 (Síndrome de Schmidt) ; alopecia universal; crisis miasténica; crisis tiroidea; enfermedad oftálmica asociada a la tiroides; oftalmopatía tiroidea; diabetes autoinmunitaria; encefalitis asociada a autoanticuerpos y/o encefalopatía; pénfigo foliáceo; epidermólisis bulosa; dermatitis herpetiforme ; Corea de Sydenham; neuropatía axonal motora aguda (AMAN, por sus siglas en Inglés) ; síndrome de Miller-Fisher; neuropatía motora multifocal (MMN, por sus siglas en Inglés) ,-opsoclonus; miopatía inflamatoria; síndrome de Isaac (neuromiopatía autoinmunitaria) , Síndromes Paraneoplásicos y Encefalitis Límbica.
Los anticuerpos y los fragmentos de acuerdo a la presente descripción pueden ser empleados en el tratamiento o profilaxis.
La presente invención también proporciona un método para reducir la concentración de los anticuerpos no deseados en un individuo, que comprende los pasos de administrarle a un individuo una dosis terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo, descritos en la presente.
En una modalidad, la presente descripción comprende el uso de los anticuerpos o los fragmentos de los mismos como un reactivo para el diagnóstico, por ejemplo conjugado a una molécula reportera. De este modo, se proporciona el anticuerpo o el fragmento de acuerdo a la descripción, que está marcado. En un aspecto, se proporciona una columna que comprende un anticuerpo o fragmento de acuerdo a la descripció .
De este modo, se proporciona un anticuerpo anti- FcRn o el fragmento de enlace para usarse como un reactivo para usos tales como: 1) purificación de la proteína FcRn (o fragmentos de las mismas) - estando conjugada a una matriz o utilizada como una columna de afinidad, o (como una forma modificada de anti-FcRn) como un agente de precipitación (por ejemplo, como una forma modificada con un dominio reconocido por otra molécula, que puede ser modificada por la adición de un Fe (o producida como IgG de longitud completa) , que es opcionalmente precipitada por un reactivo anti-Fc) 2) la detección y/o cuantificación de FcRn sobre las células o en las células, vivas o fijas (células in vitro o en secciones tisulares o celulares) .
Los usos para ésta pueden incluir la cuantificación de FcRn como un biomarcador, para seguir el efecto del tratamiento anti-FcRn. Para estos propósitos, el candidato puede ser utilizado en una forma modificada (por ejemplo, por la adición de un dominio de Fe, como en la IgG de longitud completa, o alguna otra porción, como una proteína de fusión genética o conjugado químico, tal como la adición de un marcador fluorescente utilizado para fines de detección) . 3) purificación o clasificación de las células que poseen FcRn marcadas mediante el enlace al candidato modificado por las vías ejemplificadas en (1) y (2) .
También se proporciona por la presente invención, un ensayo adecuado para evaluar la habilidad de una molécula de prueba tal como una molécula de anticuerpo, para bloquear la actividad de FcRn y en particular la habilidad de las células para reciclar la IgG. Tal ensayo puede ser útil para identificar inhibidores de la actividad de FcRn, tales como las moléculas de anticuerpo o moléculas pequeñas, y como tales pueden ser también útiles como un ensayo de liberación por lotes, en la producción de tal inhibidor.
En un aspecto, se proporciona un ensayo adecuado para evaluar la habilidad de una molécula de prueba tal como una molécula de anticuerpo para bloquear la actividad de FcRn humano, y en particular la habilidad del FcRn humano para reciclar la IgG, en donde el método comprende los pasos de: a) el recubrimiento sobre una superficie, de las células de mamífero no humanas que expresan recombinantemente cadena alfa de FcRn humano y la microglobulina ß2 (ß2?) , b) poner en contacto las células bajo condiciones levemente ácidas, tales como aproximadamente pH 5.9 con una molécula de prueba y una IgG que va a ser reciclada por la célula, por un periodo de tiempo suficiente para permitir el enlace de la molécula de prueba e IgG a la FcRn, agregando opcionalmente la molécula de prueba antes de que la IgG sea reciclada, e incubando por un periodo de tiempo suficiente para permitir el enlace de la molécula de prueba a FcRn. c) lavar con un amortiguador ligeramente ácido, y d) detectar la cantidad de IgG internalizada y/o reciclada por las células.
En un aspecto, se proporciona un ensayo adecuado para evaluar la habilidad de una molécula de prueba tal como una molécula de anticuerpo para bloquear la actividad de FcRn humano y en particular la habilidad del FcRn humano para reciclar la IgG, en donde el método comprende los pasos de: a) recubrir sobre una superficie células de mamífero no humanas, que expresan recombinantemente la cadena alfa de FcRn humano y la microglobulina ß2 humana (ß2?) , b) poner en contacto las células bajo condiciones levemente ácidas tal como aproximadamente pH 5.9 con una molécula de anticuerpo de prueba y una IgG que va a ser reciclada por la célula, por un periodo de tiempo suficiente para permitir el enlace de la molécula de anticuerpo de prueba y la IgG al FcRn, agregando opcionalmente la molécula del anticuerpo de prueba antes de que el IgG sea reciclado, e incubando por un periodo de tiempo suficiente para permitir el enlace de la molécula del anticuerpo de prueba a FcRn. c) lavar con un amortiguador ligeramente ácido para eliminar la IgG no enlazada y la molécula del anticuerpo de prueba, y d) detectar la cantidad de la IgG reciclada por las células .
En un aspecto más, se proporciona un ensayo adecuado para evaluar la habilidad de una molécula de prueba tal como una molécula de anticuerpo para bloquear la actividad de FcRn humano y en particular la habilidad del FcRn humano para reciclar la IgG, en donde el método comprende los pasos de : a) recubrir sobre una superficie las células de mamífero no humanas, que expresan recombinantemente la cadena alfa de FcRn humano y la microglobulina ß2 humana (ß2?) , b) poner en contacto las células bajo condiciones ligeramente acidas tal como aproximadamente pH 5.9, con una molécula de anticuerpo de prueba y una IgG que va a ser reciclada por la célula, por un periodo de tiempo suficiente para permitir el enlace de la molécula del anticuerpo de prueba y la IgG al FcRn, agregando opcionalmente la molécula de anticuerpo de prueba antes de que la IgG sea reciclada e incubando por un periodo de tiempo suficiente para permitir el enlace de la molécula de anticuerpo de prueba a FcRn. c) lavar con un amortiguador ligeramente ácido para eliminar la IgG no enlazada y la molécula de anticuerpo de prueba, d) incubar las células en un amortiguador neutral tal como aproximadamente pH 7.2 e) detectar la cantidad de la IgG reciclada por las células, mediante la determinación de la cantidad de la IgG liberada hacia el sobrenadante.
Las células adecuadas incluyen las células II de Riñon Canino Madin-Darby (MDCK) . La transfección de las células MDCKII con la cadena alfa del FcRn humano y la microglobulina ß2 humana (ß2?) ha sido previamente descrita por Claypool et al., 2002, Journal of Biological Chemistry, 277, 31, 28038-28050. Este documento también describe el reciclamiento de la IgG por estas células transfectadas .
Los medios para soportar las células durante la prueba incluyen el medio completo que comprende ME (Gibco #21090-022) , 1 x de aminoácidos no esenciales (Gibco 11140-035) , 1 x de piruvato de sodio (Gibco #11360-039) , y L-glutamina (Gibco # 25030-024) .
El lavado con ácido puede ser preparado al tomar HBSS+ (PAA #H15-008) y agregar MES 1M hasta que es alcanzado un pH de 5.9 +/- 0.5. Puede ser también agregado aproximadamente 1% de BSA (Sigma # A9647) .
Un lavado neutro puede ser preparado al tomar HBSS+ (PAA #H15-008) y agregar Hepes 10M hasta que es alcanzado un pH de 7.2 +/- 0.5. Puede ser también agregado aproximadamente 1% de BSA (Sigma # A9647) .
El lavado de las células con el amortiguador ácido elimina el anticuerpo de prueba no enlazado y la IgG no enlazada, y permite que sea realizado el análisis posterior. Las condiciones ácldas utilizadas en el paso (b) promueven el enlace de la IgG al FcRn y la internalización y el reciclamiento de los mismos.
La cantidad del anticuerpo de prueba o del fragmento del mismo y la IgG únicamente sobre la superficie de las células puede ser determinada mediante el lavado de las células con el lacado neutro y analizando el sobrenadante/lavados para detectar la cantidad del anticuerpo de prueba o la IgG. De manera importante, no es empleado un amortiguador de lisis. Para determinar la cantidad de la IgG internalizada por las células, el anticuerpo puede ser primeramente eliminado de la superficie de la célula con un lavado neutro, y las células son lisadas por un amortiguador de lisis y luego se analizan los contenidos internos. Para determinar la cantidad de la IgG reciclada por las células, las células son incubadas bajo condiciones neutras por un periodo de tiempo adecuado y el amortiguador que lo rodea es analizado para el contenido de IgG. Si la superficie y el contenido del anticuerpo interno de la célula es requerido, entonces la célula puede ser lavada con un lavado con ácido para mantener la presencia del anticuerpo sobre la superficie celular, seguido por la lisis y el análisis del material combinado .
Donde se desea medir la internalización y el reciclamiento de la IgG, las muestras son corridas por duplicado y se prueba la internalización y el reciclamiento que son conducidos separadamente.
Un amortiguador de lisis adecuado incluye cloruro de sodio 150 mM Tris 20 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, EGTA 1 m , 1% de Tritón-X100, para cada 10 mi agregar inhibidores de proteasa/inhibidores de fosfatasa como se describe en los lineamientos del fabricante.
Típicamente, la IgG que va a ser reciclada, es marcada, en un ejemplo, puede ser utilizado una IgG humana biotinilada. La IgG puede ser luego detectada empleando, por ejemplo un anticuerpo de detección de estreptavidina marcado con sulfo (tal como MSD # r32ad-5) 25 mi a 0.2 ug/ml del amortiguador de bloqueo MSD. El amortiguador de bloqueo puede comprender Tris 500 mM, pH 7.5. Cloruro de sodio 1.5 M y 0.2% de Tween-20 y 1.5% de BSA.
Alternativamente, la IgG puede ser previamente marcada con un fluoróforo o un marcador similar.
En una modalidad, una superficie adecuada es una placa de plástico o un pozo tal como una placa de 96 pozos o similar, un portaobjetos de vidrio o una membrana. En un ejemplo, las células son recubiertas sobre la superficie a una densidad que da como resultado la formación de una monocapa .
En una modalidad, el ensayo descrito en la presente no es una medición de la transcitosis de un anticuerpo desde arriba hacia abajo a través de una membrana con un gradiente de pH a través de ésta, por ejemplo las condiciones ácidas de un lado de la membrana y las condiciones neutras sobre el lado inferior de la membrana.
En un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de prueba y la IgG pueden ser incubados con las células en el paso (b) por aproximadamente 1 hora por ejemplo a temperatura ambiente bajo condiciones ácidas para permitir el enlace.
En un ejemplo, el anticuerpo o el fragmento de prueba pueden ser incubados con las células en el paso (b) por aproximadamente 1 hora por ejemplo a temperatura ambiente, bajo condiciones ácidas para permitir el enlace antes de la adición de la IgG que va a ser reciclada. Subsecuentemente, la IgG que va a ser reciclada por la célula puede ser incubada por las células en el paso (b) por aproximadamente 1 hora por ejemplo, a temperatura ambiente, bajo condiciones ácidas para permitir el enlace.
Las condiciones neutras facilitan la liberación de la IgG hacia el sobrenadante.
"Que comprende" en el contexto de la presente especificación se entiende que significa "que incluye" .
Donde sea técnicamente apropiado, pueden ser combinadas las modalidades de la invención.
Las modalidades son descritas en la presente comprendiendo ciertas características/elementos. La descripción también se extiende a las modalidades separadas que consisten o que consisten esencialmente de las características/elementos .
Las referencias técnicas tales como patentes y solicitudes son incorporadas por referencia aquí.
EJEMPLOS Las siguientes inmunizaciones fueron llevadas a cabo con el fin de generar el material para el cultivo de células B y la selección de anticuerpos: Ratas Sprague Dawley fueron inmunizadas con tres dosis de fibroblastos de ratón NIH3T3 que co-expresan FcRn humano mutante (L320A; L321A) (Ober et al, 2001 Int. Immunol . 13, 1551-1559) y ß2? de ratón con un cuarto refuerzo final del dominio extracelular de FcRn humano .
Los sueros fueron monitorizados para el enlace sobre el FcRn mutante a las células HEK-293 y para la habilidad de prevenir el enlace de la IgG humana marcada con Alexafluor 488. Ambos métodos fueron llevados a cabo mediante citometría de flujo. Para el enlace, fueron utilizados reactivos secundarios específicos anti-Fc de ratón o de rata, marcados con ficoeritrina (PE) para revelar el enlace de la IgG en los sueros .
Los cultivos de células B fueron preparados utilizando un método similar a aquel descrito en Zubler et al. (1985). En resumen, las células B a una densidad de aproximadamente 5000 células por pozo fueron cultivadas en las placas de cultivo de tejido de 96 pozos, con código de barras, con 200 µ?/???? de medio RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado con 10% de FCS (PAA laboratories ltd) , 2% de HEPES (Sigma Aldrich) , 1% de L-Glutamina (Gibco BRL) , 1% de solución de penicilina/estreptomicina (Gibco BRL), 0.1% de ß-mercaptoetanol (Gibco BRL) , 2-5% de sobrenadante de cultivo de esplenocitos de conejo, activados y células de timoma murino EL-4-B5 irradiados con radiación gamma (5 x 104/pozo) por siete días a 37 °C en una atmósfera de 5% de CO2.
La presencia de los anticuerpos específicos de FcRn en los sobrenadantes de cultivo de células B fue determinada utilizando un ensayo de enlace basado en fluorescencia homogénea utilizando las células HEK-293 transitoriamente transfectadas con FcRn mutante (estabilizado superficialmente) como una fuente del antígeno objetivo. 10 µ? del sobrenadante fueron transferidos de las placas de cultivo de tejidos de 96 pozos o códigos de barras, dentro de placas de ensayo (negra) , de 384 pozos, con código de barras, que contenían 5000 células HEK-293 transfectadas por pozo, utilizando el manejador de líquidos Matrix Platemate. El enlace fue revelado con un conjugado Cy-5 específico de Fcy de cabra anti-IgG de rata o de ratón (Jackson) . Las placas fueron leídas sobre un sistema de detección celular Applied Biosystems 8200. A partir de las placas de cultivo de 3800 x 96 pozos, que representan 38 diferentes animales inmunizados, fueron identificados 9800 enlazadores anti-FcRn humano. Se estimó que esto representó la selección de aproximadamente 2.5 billones de células B.
Después de la selección primaria, los sobrenadantes positivos fueron consolidados sobre placas maestras de 96 pozos, con códigos de barras utilizando un robot de recolección Aviso Onyx y las células B en las placas de cultivo celular congeladas a -80°C. Las placas maestras fueron luego seleccionadas en un ensayo Biacore con el fin de identificar los pozos que contenía los anticuerpos de alta afinidad, y aquellos que inhibieron el enlace de la igG humana a FcRn (ver más adelante) .
El análisis de interacción biomolecular utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR, por sus siglas en Inglés) fue llevado a cabo sobre un sistema BIAcore T200 (GE Healthcare) . La Fe gamma de cabra anti-IgG de rata (Chemicon International Inc.) en NaAc 10 mM, amortiguador de pH 5, fue inmovilizado sobre un Chip Sensor CM5 vía la química de acoplamiento de amina a un nivel de captura de aproximadamente 19500 unidades de respuesta (RU, por sus siglas en Inglés) utilizando HBS-EP+ como el amortiguador de corrida. Se utilizó fosfato 50 mM, de pH 6 + cloruro de sodio 150 mM como el amortiguador de corrida para el ensayo de afinidad y de bloqueo. Los sobrenadantes de cultivo de células B fueron diluidos 1 en 5 en fosfato 200 mM, pH 6 + cloruro de sodio 150 mM. Una inyección de 600s del sobrenadante de células B diluido a 5 µ?/minuto fue utilizado para la captura por Fe anti-IgG de rata inmunizado. El FcRn humano a 100 nM fue inyectado sobre el sobrenadante de cultivo de células B capturadas para 180s a 30 µ?/minuto, seguido por disociación a 360s. La IgG humana (Jackson ImmunoResearch) fue inyectada por 60s con disociación de 180s a 30 µ?/minuto.
Los datos fueron analizados utilizando el software de evaluación T200 (versión 1.0) para determinar las constantes de afinidad (KD) de los anticuerpos y para determinar aquellos que bloquearon el enlace de IgG.
Como un ensayo alternativo, los sobrenadantes de placas maestras fueron también seleccionados en un ensayo de bloqueo de IgG humana basada en células. 25 µ? de sobrenadante de cultivo de células B provenientes de las placas maestras fueron agregados a la placa de polipropileno de 96 pozos con fondo en U. Las células HEK-293 transfectada con hFcRn mutante (50,000 células por pozo en 25 µ? de PBS de pH 6/1% de FCS) fueron luego agregadas a cada pozo e incubadas por 1 hora a 4°C. Las células fueron lavadas dos veces con 150 µ? de medio PBS. Las células fueron luego re-suspendidas en 50 µ?/???? de medio PBS/FCS que contenía la IgG humana marcada con Alexafluor 488 ó 649 a 7.5 µg/ml y se incubaron por 1 hora a 4°C. Las células fueron luego lavadas dos veces con 150 µ? del medio y luego fueron re-suspendidas en 35 µ?/???? en el medio de PBS/FCS que contenía 1% de formaldehído como fijador. Las placas fueron luego leídas sobre un citómetro de flujo a FACS Canto 2. Los datos ejemplares se dan en la Figura 11. Para permitir la recuperación de los genes de la región variable del anticuerpo a partir de una selección de los pozos de interés, tuvo que ser realizado un paso de desconvolución para hacer posible la identificación de las células B específicas del antígeno en un pozo dado que contenía una población heterogénea de células B. Esto fue logrado utilizando el método de focos Fluorescentes. En resumen, las células B que secretan inmunoglobulina provenientes de un pozo positivo fueron mezcladas con esferas de estreptavidina (New England Biolabs) recubiertas con FcRn humano biotinilado y una dilución final 1:1200 de un conjugado de FITC específico de cabra anti- fragmento Fcy de rata o ratón (Jackson) . Después de la incubación estática a 37°C por 1 hora, las células B específicas del antígeno pudieron ser identificadas debido a la presencia de un halo fluorescente que rodeaba esa célula B. Estas células B individuales, identificadas utilizando un microscopio Olympus fueron luego recogidas con un micromanipulador Eppendorf y depositadas dentro de un tubo de PCR. Los focos fluorescentes fueron generados a partir de 268 pozos seleccionados. Los genes de la región variable del anticuerpo fueron recuperados de las células simples mediante la reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa ( (RT) -PCR, por sus siglas en Inglés) utilizando los cebadores específicos de la región variable de cadena pesada y ligera. Fueron llevadas a cabo dos rondas de PCR sobre un robot de manejo de líquidos Aviso Onyx con la PCR de 2° aminada que incorpora sitios de restricción en los extremos 3' y 5' permitiendo la clonación de las regiones variables dentro de un vector de expresión de mamífero de IgG ?? de ratón (VH) o kappa de ratón (VL) . Las construcciones de cadena pesada y ligera apareadas fueron co- transíectadas dentro de las células HEK-293 utilizando Fectina 293 (Invitrogen) y cultivadas en placas de 48 pozos en un volumen de 1 mi. Después de 5-7 días de expresión, los sobrenadantes fueron cosechados y el anticuerpo sometido a procesamiento adicional .
La PCR recuperó exitosamente los pares cognados de cadena pesada y ligera a partir de células B simples provenientes de 156 de los pozos seleccionados. El análisis de la secuencia de ADN de los genes de la región variable clonados identificaron un número de familias únicas del anticuerpo recombinante . Después de la expresión, los sobrenadantes transitorios fueron interrogados en los ensayos de bloqueo de FACS de IgG humana (anteriormente descrito) y de reciclamiento de IgG. En algunos casos, la IgG ?? de ratón, purificada, fue producida y probada. (datos etiquetados consecuentemente) .
El ensayo de reciclamiento utilizó las células MDCK II (clon 34 como se describe en los Ejemplos 4 y 5 siguientes) que sobre-expresan el FcRn humano y la microblobulina beta 2, se sembraron en placas a 25,000 células por pozo de una placa de 96 pozos. Estas se incubaron luego toda la noche a 37 °C, con 5% de C02. Las células fueron lavadas con HBSS+ Ca/Mg de pH 7.2 + 1% de BSA y luego se incubaron con 50 µ? de concentraciones variantes del sobrenadante transitorio de HEK-293 o el anticuerpo purificado por 1 hora a 37°C, con 5% de CO2. El sobrenadante fue retirado y se agregaron a las células 500 ng/ml de la IgG humana biotinilada (Jackson) en 50 µ? de HBSS + Ca/Mg de pH 5.9 + 1% de BSA y se incubaron por 1 hora a 37°C, con 5% de CÜ2. Las células fueron luego lavadas tres veces en HBSS + Ca/Mg de pH 5.9 y se agregaron 100 µ? de HBSS + Ca/Mg de pH 7.2 a las células y se incubaron a 37 °C, con 5% de CO2 por 2 horas. El sobrenadante fue retirado de las células y analizado para la IgG total utilizando un ensayo de MSD con un anticuerpo de captura anti-IgG humana (Jackson) y un anticuerpo de revelación del marcador de estreptavidina-sulfo (MSD) . La curva de inhibición fue analizada mediante regresión no lineal para determinar los valores de IC50.
Con base en el desempeño en éstos, se seleccionó una familia de anticuerpos que comprendían seis CDRs dadas en las SEQ ID Nos.: 1 a la 6. El anticuerpo CA170_01519 tuvo la mejor actividad y fue seleccionado para la humanización.
Ejemplo 1 Método de Humanización El anticuerpo CA170 01519 fue humanizado mediante el injerto de las CDRs provenientes de las regiones V del anticuerpo de rata sobre las estructuras de la región V del anticuerpo de línea germinal humana. Con el fin de recuperar la actividad el anticuerpo, fueron también retenidos un número de residuos estructurales provenientes de las regiones V de rata en la secuencia humanizada. Estos residuos fueron seleccionados utilizando el protocolo descrito por Adair et al. (1991) (Humanised antibodies, documento O91/09967) . Las alineaciones de las secuencias de la región V del anticuerpo de rata (donador) con las secuencias de la región V de línea germinal humana (aceptor) se muestran en las Figuras 2A y 2B, junto con las secuencias humanizadas designadas. Las CDRs injertadas provenientes del donador a la secuencia aceptora son como se describen por Kabat (Kabat et al., 1987), con la excepción de la CDR-H1 donde es utilizada la definición combinada de Chothia/Kabat (ver Adair et al., 1991 Humanised antibodies, documento WO91/09967) . La región V humana VKl 2-1-(1) A30 más la región JK2J (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) fue elegida como el aceptor para las CDRs de cadena ligera. La región V humana VH3 1-3 3-07 más la región JH4J (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) fue elegida como el aceptor para las CDRs de cadena pesada.
Los genes que codifican para un número de secuencias de la región V de cadena pesada y ligera, variantes, fueron diseñados y éstos fueron construidos mediante un procedimiento de síntesis automatizada por Entelechon GmbH. Las variantes adicionales de las regiones V de cadena pesada y ligera fueron creadas mediante la modificación de los genes de VH y VK mediante mutagénesis dirigida al oligonucleótido . Estos genes fueron clonados dentro de un número de vectores para hacer posible la expresión del Fab 1 1519 humanizado en célula de mamífero y de E. coli. Las cadenas variantes, y combinaciones de las mismas, fueron evaluadas para su expresión en E. coli, su potencia en relación al anticuerpo progenitor, sus propiedades biofísicas y la idoneidad para el procesamiento corriente abajo, que conduce a la selección del injerto de cadena ligera gL20 y el injerto de cadena pesada gH20. Las secuencias de injerto gL20 y gH20 seleccionadas, finales son mostradas en las Figuras 2A y 2B, respectivamente. Este apareamiento de la región V fue nombrado 1519.g57.
Los residuos estructurales de cadena ligera en el injerto gL20 son todos provenientes del gen de línea germinal humana, con la excepción de los residuos 36, 37 y 58 (numeración de Kabat) , donde los residuos del donador Leucina (L36) , Fenilalanina (F37) e Isoleucina (158) fueron conservados, respectivamente. La retención de estos tres residuos fue esencial para la potencia completa del Fab' humanizado. Los residuos estructurales de cadena pesada en el injerto gH20 son todos provenientes del gen humano de línea germinal, con la excepción de los residuos 3, 24, 76, 93 y 94 (numeración de Kabat) , donde los residuos del donador Prolina (P3) , Valina (V24) , Serina (S76) , Treonina (T93) y Treonina (T94) fueron conservados, respectivamente. La retención de estos cinco residuos fue importante para la potencia completa del Fab1 humanizado.
Para la expresión en E. coli, los genes de la región V de cadena pesada y cadena ligera fueron clonados dentro del vector de expresión de UCB pTTOD, que contiene ADN que codifica para la región constante C-kappa humana (alotipo Klm3) y la región de bisara CH1 de gamma- 1 humana (alotipo Glml7) . El gen FkpA de E. colí fue también introducido dentro del plásmido de expresión, ya que la co-expresión de esta proteína chaperona se encontró que mejora el rendimiento de Fab' humanizado en la cepa de E. coli MXE016 (descrito en el documento WO2011/086136) durante la fermentación alimentada por lotes, utilizando IPTG para inducir la expresión de Fab'. Las cadenas ligera y pesada Fab' 1519 y el polipéptido FkpA fueron todos expresados a partir de un multi-cistrón simple bajo el control del promotor tac inducible por IPTG.
Para la expresión de células de mamífero, la genes de la región V de la cadena ligera humanizada fueron clonados dentro del vector de expresión de cadena ligera humano de UCB-Celltech, pMhCK, el cual contiene el ADN que codifica para la región constante de cadena Kappa humana (alotipo Km3) . Los genes de la región V de cadena pesada humanizada fueron clonados dentro del vector de expresión pMhg4P FL de la cadena pesada de gamma-4 humana de UCB-Celltech, que contiene el ADN que codifica para la región constante de cadena pesada gamma-4 humana con la mutación de estabilización de bisagra S241P (Angal et al, Mol Immunol . 1993, 30(1) : 105-8). La co-transíección de los vectores de cadena ligera y pesada dentro de las células en suspensión HEK293 fue lograda utilizando la Fectina 293 (12347-019 Invitrogen) , y dieron la expresión de los anticuerpos 1519 recombinantes , humanizados.
Ejemplo 1A Preparación del conjugado 1519. g57 Fab" -PEG Fab' expresado en el periplasma de E.coli fue extraído de las células mediante extracción con calor. El Fab1 purificado mediante la purificación por afinidad de Proteína G con una elución ácida. Fab' reducido y PEGilado con PEG de 40 kDa (SUNBRIGHT GL2-400MA3) . PEG es covalentemente enlazado vía un grupo maleimida a uno o más tiol dentro del fragmento de anticuerpo. La eficiencia de PEGilación fue confirmada mediante SE-HPLC. Fab 'PEG fue separado de un Fab' no PEGilado y diFab' mediante cromatografía de intercambio catiónico. Las fracciones fueron analizadas mediante SE-HPLC y SDS-PAGE. La combinación fue llevada a cabo para minimizar los niveles de impurezas. La muestra final fue concentrada y diafiltrada dentro del amortiguador deseado.
Ejemplo IB Preparación del conjugado 1519.g57 Fab' (Anti FcRn humano) con albúmina sérica humana El Fab1 1519. g57 anti FcRn humano fue químicamente conjugado con la albúmina sérica humana (derivada recombinante) la cual fue luego utilizada para estudios en animales .
• Albúmina sérica humana: Recombumin de Novozyme (Cat No: 200-010) presentada como solución al 20% p/v recombinantemente producida en Saccharomyces cerevisiae . • 1519. g57Fab' : 30 mg/ml presentada en Fosfato de Sodio 0.1 M, EDTA 2 mM, pH 6.0 (amortiguador de reducción) • 1 , 6 -Bismaleimidohexano (BMH) de Thermo fisher (Cat No. 22330) Reducción de Albúmina: La albúmina fue reducida utilizando clorhidrato de cisteamina preparado en fresco (Sigma cat no: 30078) el cual fue preparado en el amortiguador de reducción. A la solución de albúmina se agregó clorhidrato de cisteamina a un exceso molar de 10 veces y luego se incubó en un baño de agua a 37°C por 30 minutos. Después de la reducción, la solución fue desalada utilizando las columnas PD10 (GE Healthcare Cat. No: 17-0851-01) para eliminar cualquier agente reductor en exceso .
Adición del ligador de BMH; Una solución patrón de 1, 6-bismaleimidohexano fue preparada en un vial de vidrio utilizando dimetilformamida. La solución fue agitada en torbellino para asegurar la disolución completa de BMH. La solución de BMH fue agregada a la solución de albúmina reducida desalada a un exceso molar de 10 veces con respecto a la concentración de albúmina. La solución fue luego incubada a 37 °C por 30 minutos seguido por la incubación de toda la noche a temperatura ambiente en un rodillo para asegurar el mezclado adecuado. Se observó un precipitado blanco que fue luego centrifugado utilizando una centrífuga de laboratorio. Después de la terminación de la reacción, la solución fue desalada utilizando columnas PD10.
Reducción de 1519. g57 Fab' 1519. g57 Fab1 fue reducido utilizando clorhidrato de cisteamina recién preparado (Sigma cat no: 30078) el cual fue preparado en amortiguador de reducción. A la solución de 1519. g57 Fab' se agregó clorhidrato de cisteamina a un exceso molar de 10 veces, y luego se incubó en un baño de agua a 37°C por 30 minutos. Después de la reducción la solución fue desalada utilizando las columnas PD10 (de GE Healthcare Cat. No: 17-0851-01) para eliminar cualquier agente reductor en exceso.
Mezclado del Fab reducido y albúmina-BMH Cantidades iguales (en términos molares) del Fab1 reducido y del ligador de albúmina fueron agregadas e incubadas a temperatura ambiente toda la noche en un mezclador de rodillos.
Purificación por afinidad; La mezcla anterior fue luego purificada por afinidad utilizando Blue Sefarose que se enlazó al conjugado albúmina-Fab y la albúmina libre. La purificación fue llevada a cabo de acuerdo a las instrucciones del fabricante que se resumen brevemente aquí : Blue sefarose fue reconstituido en DPBS pH7. y lavado tres veces con PBS. Después del lavado, la mezcla de Fab y la albúmina enlazada al ligador se agregó y se incubó a temperatura ambiente por 1 hora sobre un mezclador de rodillos. Después de la incubación, la matriz fue lavada nuevamente con PBS para eliminar cualesquiera materiales no enlazados y luego se eluyó con PBS7.4 que contenía KCl 2M.
Purificación por exclusión de tamaño: El material purificado por afinidad contenía la albúmina conjugada a Fab junto con algo de HSA sin reaccionar. Esto requirió la limpieza adicional y esto fue logrado utilizando la cromatografía de exclusión de tamaño (S200 16X60 de GE Healthcare) . Las fracciones combinadas finales fueron presentadas en DPBS pH7.4. El conjugado 1519.g57Fab-HSA final fue concentrado hasta 20 mg/ml en DPBS de pH 7.4 y analizado sobre una cromatografía de exclusión de tamaño analítica (Agilent Zorbax GF250 y GF450 en tándem) y se encontró que era predominantemente el conjugado monomérico. El ensayo de endotoxina fue también llevado a cabo a la muestra y se encontró que estaba por debajo del límite inferior especificado del contenido de endotoxina.
Ejemplo 2 Selección de las moléculas candidatos Fab' y Fab' PEG en el ensayo de reciclamiento de IgG Para determinar la habilidad de las moléculas Fab' PEG candidatas para bloquear la cantidad de FcRn en un ensayo de células funcionales, las moléculas fueron seleccionadas en el ensayo de reciclamiento de IgG (descrito con más detalle en el Ejemplo 5) . En resumen, las células del clon 34 de MDCK II fueron pre- incubadas con el Fab ' o Fab ' PEG candidatos antes de la adición de la IgG humana biotinilada, en un amortiguador ácido. Las células fueron lavadas para eliminar toda la IgG en exceso y luego incubadas en un amortiguador de pH neutro para facilitar la liberación de la IgG hacia el sobrenadante. La cantidad de la IgG liberada hacia el sobrenadante fue medida mediante el ensayo de MSD y fueron calculados los valores de EC50. Los valores de EC50 de las moléculas candidatas humanizadas de Fab' y Fab' PEG que inhiben el reciclamiento de IgG se muestran en la tabla siguiente. Después de la PEGilación existe una pérdida de la potencia para todos los anticuerpos candidatos, sin embargo, el grado en que esto varía depende del candidato.
Tabla 1 Valores medios de EC50 para las moléculas de Fab' y Fab1 PEG en el ensayo de reciclamiento de IgG.
Las células del clon 34 de MDCK II establemente transfectadas con el FcRn humano y la microglobulina beta 2, estuvieron a 25,000 células por pozo en una placa de 96 pozos y se incubaron toda la noche a 37°C, con 5% de C02. Las células fueron incubadas con el Fab' o Fab ' PEG candidatos en HBSS+ (Ca/Mg) de pH 5.9 + 1% de BSA por 1 hora a 37°C, con 5% de CO2 antes de la adición de 500 ng/ml de IgG humana biotinilada (Jackson) y la incubación por 1 hora adicional. Las células fueron lavadas con HBSS+ de pH 5.9 y luego incubadas a 37 °C, con 5% de C02 por 2 horas en HBSS+ de pH 7.2. El sobrenadante fue eliminado de las células y analizado para la IgG total utilizando un ensayo de MSD (utilizando un anticuerpo de captura anti-IgG humana (Jackson) y un anticuerpo de revelación del marcador de estreptavidina-sulfo (MSD) ) . La curva de inhibición fue analizada mediante regresión no lineal (Graphpad Prism®) para determinar la EC50 -La Tabla 1 representa los datos combinados provenientes de 2 a 7 experimentos .
Ejemplo 3 Afinidad para el enlace de hFcRn El análisis de interacción biomolecular utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) fue llevado a cabo sobre un sistema Biacore T200 (GE Healthcare) y el enlace al dominio extracelular de FcRn humano fue determinado. El dominio extracelular de FcRn humano fue proporcionado como un complejo no covalente entre el domino extracelular de FcRn humano (SEQ ID No. : 94) y la microglobulina ß2 (ß2?) (SEQ ID No. : 95) . El fragmento F(ab' )2 Affinipure de cabra anti-IgG humana, el fragmento F(ab' )2 específico (para la captura de Fab'-PEG) o el fragmento Fe específico (para la captura de IgGl o IgG4) (Jackson Immuno Research Lab, Inc.) en NaAc 10 mM, amortiguador de pH 5, fue inmovilizado sobre un Chip CM5 Sensor por medio de la química de acoplamiento de amina a un nivel de captura 4000 - 5000 unidades de respuesta (RU) utilizando HBS-EP+ (GE Healthcare) como el amortiguador de corrida .
Se utilizó fosfato 50 mM, de pH 6 + cloruro de sodio 150 mM + 0.05% de P20 o HBS-P, de pH 7.4 (GE Healthcare) como el amortiguador de corrida para el ensayo de afinidad. El anticuerpo relevante, ya sea anti-hFcRn Fab'-PEG, IgGl ó IgG4P fue diluido a 5 yg/ml (Fab'-PEG), o 0.3 ug/ml (IgGl) ó 4 yg/ml (IgG4) en el amortiguador de corrida. Una inyección 60s de Fab'-PEG ó IgGl ó IgG4 a 10 µ?/min se utilizó para la Captura por el F(ab')2 anti-IgG humana, inmovilizado. El dominio extracelular de FcRn humano fue titulado desde 20 nM hasta 1.25 nM utilizando el anticuerpo anti-FcRn capturado (Fab'-PEG, IgGl ó IgG4) para 300s a 30 µ?/minuto, seguido por la disociación a 1200s. La superficie fue regenerada por 2 x 60s de HCl 50 mM a 10 µ?/min.
Los datos fueron analizados utilizando el software de evaluación T200 (versión 1.0) .
Tabla 2 Datos de afinidad para anti-hFcRn 1519. g57 Fab'-PEG a pH 6 1519 g57fab' -PEG ka (M-1s-1) Kd (s -1) KD (M) 1 4. 37 X 105 1 .59 X 10 -5 3 .6 X 10"11 2 4. 20 X 105 2 .01 X 10 -5 4 .7 x 10"11 3 4. 35 X 105 1 .43 X 10 -5 3. 29 x 10"11 4 4. 37 X 105 2 .75 X 10 -5 6. 30 x 10-11 5 4. 33 X 105 1 .28 X 10 -5 2. 97 X 10"11 4. 32 X 105 1 .81 X 10 -5 4 .19x 10-11 Tabla 3 Datos de afinidad para anti-hFcRn 1519. g57 Fab'-PEG a pH7.4 1519 g57fab' -PEG ka (M^s"1) kd (s -1) KD (M) 1 3.40 x 105 1.87 X ío-5 5 .49 x IO'11 2 3.31 x 105 1.85 X ío-5 5 .58 x IO"11 3 3.25 x 105 1.99 X IO"5 6 .13 x IO"11 4 3.23 x 105 1.52 X IO"5 4 .70 x IO"11 5 3.20 x 105 1.99 X IO"5 6 .21 X IO"11 4.28 x 105 1.84 X IO"5 5 .62 x IO"11 En estos experimentos, el Fab ' PEG tuvo una afinidad promedio de alrededor de 42 pM a pH 6 y alrededor de 56 pM a pH 7.4. pH 7.4 1519. g57 ka (M-!s-1) kd (S-1) KD (M) KD (pM) IgGl 3.80 x 105 1.25 X 10"5 3.29 X 10"11 33 IgG4P 3.68 x 105 1.26 X 10-5 3.43 x 10"11 34 Tabla 3A Datos para anti-hFcRn 1519. g57 como IgGl e IgG4P pH 7.4 (promedio de tres experimentos) pH 6 1519.g57 ka (M^s-1) kd (s -1) KD (M) KD (pM) IgGl 4.56 x 105 1.01 X 10"5 2.21 x 10"11 22 IgG4 4.43 x 105 1.00 X 10-5 2.26 x 10"11 23 Tabla 3B Datos de afinidad para anti-hFcRn 1519.g57 como IgGl e IgG4P a pH6 (promedio de tres experimentos) Las Tablas 3A y 3B muestran que la afinidad de los anticuerpos de longitud completa es consistente con aquella observada para Fab'-PEG a pH 6 y a pH 7.4.
Ejemplo 4 Potencia basada en las células Los ensayos basados en células fueron llevados a cabo utilizando las células II de riñon canino Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) , las cuales habían sido establemente transfectadas con un FcRn humano y el vector del gen doble de B2M humano con un marcador de selección de Geneticina. Un clon celular estable fue seleccionado, el cual fue capaz de reciclar y de realizar la trancitosis de la IgG humana, y éste fue utilizado para todos los estudios subsecuentes. Éste será denominado como clon 34 de MDCK II.
Afinidad basada en Células del Fab'PEG CA170 01519.g57 para FcRn humano Fueron llevados a cabo experimentos de citometría de flujo cuantitativos utilizando la células del clon 34 de MDCK II y Fab' CA170_01519. g57 marcado con AlexaFluor 488 o Fab'PEG CA170_01519. g57. El enlace específico de anticuerpo FcRn a través de una gama de concentraciones de anticuerpo fue utilizada para utilizar la KD. Los análisis fueron realizados en amortiguadores neutros y ácidos para determinar si el pH ambiental, comparable a aquel encontrado en el plasma sanguíneo (pH 7.4) o los endosomas (pH 6) tenían algún efecto sobre el enlace del anticuerpo.
La Figura 3 muestra las curvas de enlace representativas para el Fab' CA170_01519. g57 (Figura 3A) y Fab'PEG (Figura 3B) . Los valores medios de KD (n = 2 Ó 3) fueron de 1.66 nM y 6.5 nM en el amortiguador neutro, y de 1.59 nM y 5.42 nM en el amortiguador ácido, respectivamente (ver Tabla 4) .
Tabla 4 - Valores medios de KD (nM) para el Fab' CA170_01519.g57 y Fab'PEG sobre las células del clon 34 de MDCK II.
La Figura 3 muestra el enlace de Fab1 CA170_01519.g57 (A) y Fab' PEG CA170_01519. g57 (B) sobre las células del clon 34 de MDCK II en pH ácido y neutro.
Las células del clon 34 de MDCK II fueron incubadas en el amortiguador de Facs (PBS con 0.2% p/v de BSA, 0.09% p/v de Na s) por 30 minutos antes de la adición del Fab1 o Fab' PEG CA17001519. g57 marcado con Alexa-fluor 488, por 1 hora en el amortiguador de Facs ya sea a pH 7.4 o bien a pH 6. Las concentraciones finales del anticuerpo estuvieron en el intervalo de 931 nM hasta 0.002 nM. Las células fueron lavadas en el amortiguador de Facs enfriado con hielo, luego analizadas mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo Guava (Millipore, Reino Unido) . Los grupos de datos de la titulación fueron también producidos para los anticuerpos control isotipo para cada formato de anticuerpo para determinar el enlace no específico. El número de moles del anticuerpo enlazado fue calculado utilizando los valores interpolados a partir de una curva estándar generada a partir de ceras comprendidas de diferentes cantidades del colorante fluorescente. Los valores de fluorescencia media geométrica fueron determinados en los análisis citométricos de flujo de las células y las esferas. El enlace no específico fue sustraído de los valores del anticuerpo - anti-FcRn y la curva de enlace específica generada fue analizada mediante regresión no lineal utilizando una ecuación de enlace de un sitio (Graphpad Prism®) para determinar la KD. Los datos son representativos de 2 ó 3 experimentos. Fab ' PEG CA170_01519. g57 puede enlazarse al FcRn humano expresado sobre las células a pH ácido y a pH neutro, y los valores de KD determinados son aproximadamente 3.5 a 4 veces más bajos que la molécula de Fab' equivalente.
Ejemplo 5 Ensayos basados en células funcionales Fab' PEG CA170_01519. g57 inhibe el reciclamiento de la IgG humana La expresión de FcRn es principalmente intracelular (Borvak J et al. 1998, Int. Immunol, 10 (9) 1289-98 y Cauza K et al. 2005, J. Invest . Dermatol , 124 (1) , 132-139), y asociada con las membranas endosomales y lisosomales. La porción Fe de la IgG se enlaza a FcRn a pH ácido (< 6.5), pero no a un pH fisiológico neutro (7.4) (Rhagavan M et al. 1995) y esta dependencia al pH facilita reciclamiento de la IgG.
Una vez que es recogido mediante pinocitosis y entra el endosoma ácido, la IgG enlazada a FcRn será reciclada junto con el FcRn a la superficie celular, mientras que al pH fisiológicamente neutro, la IgG será liberada. (Ober RJ et al. 2004, The Journal of Immunology, 172, 2021-2029) . Cualquier IgG no enlazada a la FcRn entrará a la vía degradat iva 1 isosomal .
Fue establecido un ensayo in vitro para examinar la habilidad de Fab' PEG o Fab' CA170 01519. g57, para inhibir las capacidades de reciclamiento de la IgG de FcRn. En resumen, las células del clon 34 de MDCK II fueron incubadas en presencia o ausencia de Fab' CA170_01519. g57 o Fab' PEG CA170_01519.g57 antes de la adición de la IgG humana biotinilada, en un amortiguador ácido (pH 5.9) para permitir el enlace a FcRn. Todo el anticuerpo en exceso fue retirado y las células incubadas en un amortiguador de pH neutro (pH 7.2) el cual permite la liberación de la IgG enlazada, expuesta en la superficie, hacia el sobrenadante. La inhibición de FcRn fue seguida utilizando un ensayo de MSD para detectar la cantidad de IgG reciclada, y de este modo liberada hacia el sobrenadante.
La Figura 4 muestra que CA170_01519. g57 inhibe el reciclamiento de la IgG en las células del clon 34 de MDCK II. Las células del clon 34 de MDCK II fueron sembradas en placa a 25,000 células por pozo en una placa de 96 pozos, e incubadas toda la noche a 37°C, con 5% de CO2. Las células fueron incubadas con Fab1 o Fab 'PEG CA170_01519. g57 en HBSS+ (Ca/Mg) de pH 5.9 + 1% de BSA por 1 hora a 37°C, 5% de C02 antes de la adición de 500 ng/ml de IgG humana biotinilada (Jackson) y la incubación por 1 hora adicional. Las células fueron lavadas con HBSS+ de pH 5.9, luego incubadas a 37°C, con 5% de C02 por 2 horas en HBSS+ de pH 7.2. El sobrenadante fue retirado de las células y analizado para la IgG total utilizado el ensayo MSD (utilizando un anticuerpo de captura anti-IgG humana (Jackson) y un anticuerpo de revelado de la etiqueta del marcador de estreptavidina-sulfo (MSD) ) . La curva de inhibición fue analizada mediante regresión no lineal (Graphpad Prism®) para determinar la EC50. La gráfica representa los datos combinados de 6 ó 7 experimentos .
Como se muestra en la Figura 4, Fab' CA170_01519.g57 y Fab 1 PEG CA170_01519. g57 inhiben el reciclamiento de la IgG de una manera dependiente de la concentración, con valores medios de EC50 (n= 6 ó 7) de 1.937 nM y 6.034 nM respectivamente. Por lo tanto, Fab1 PEG CA170_01519. g57 es aproximadamente 3 veces menos potente que Fab' CA170_01519. g57 en la inhibición de reciclamiento de la IgG.
Fab 1 PEG CA170_01519.g57 inhibe la transcitosis de la IgG humana FcRn puede transportar la IgG a través de las capas celulares epiteliales, polarizadas, en las direcciones apical a basolateral y basolateral a apical y de este modo juega un papel importante en permitir que la IgG se mueva entre la circulación y la luz en las barreras mucosas (Claypool et al. 2004 Mol Biol Cell 15(4): 1746-59) .
Fue establecido un ensayo in vitro para examinar la habilidad de Fab ' PEG CA170_01519. g57 para inhibir la transcitosis de IgG dependiente de FcRn. En resumen, las células del clon 34 de MDCK II fueron sembradas en placa, en una placa de 24 pozos y se dejaron formar las monocapas en 3 días. Las células fueron luego pre- incubadas con Fab'PEG CA170_01519.g57 sobre la superficie apical antes de la adición de la IgG humana biotinilada en un amortiguador ácido, lo cual facilita el enlace a FcRn. La IgG humana es transcitositada a través de las células desde el lado apical hacia el basolateral y liberadas hacia el amortiguador neutro en la cámara inferior. Los niveles de IgG sobre el lado basolateral fueron luego medidos utilizando el ensayo MSD.
La Figura 5 muestra Fab'PEG CA170_01519.g57 inhibe la transcitosis de IgG apical a basolateral en las células del clon 34 de MDCK II.
Las células 34 del clon de MDCK II fueron sembradas a 500,000 células por pozo de una placa de 24 pozos transwell e incubadas por 3 días a 37°C, con 5% de CO2 hasta que se formaron las monocapas. El pH del compartimiento apical fue ajustado a 5.9 y el lado basolateral a 7.2 en amortiguador de HBSS (Ca/Mg) + 1% de BSA. Las células sobre el compartimento apical fueron pre-incubadas con Fab'PEG CA170_01519. g57 por 1 hora antes de la adición de 2 µg/ml de IgG humana biotinilada (Jackson) a las concentraciones indicadas por 4 horas a 37°C, con 5% de CO2. El medio basolateral fue luego recolectado y la IgG total fue medida mediante el ensayo de MSD (utilizando un anticuerpo de captura anti-IgG humana (Jackson) y un anticuerpo de revelado del marcador estreptavidina-sulfo (MSD) ) . La curva de inhibición fue analizada mediante regresión no lineal (Graphpad Prism®) para determinar la EC50. La gráfica representa los datos combinados de 3 experimentos .
En resumen, la Figura 5 muestra que Fab ' PEG CA170_01519. g57 puede inhibir la transcitosis apical a basolateral de la IgG humana de una manera dependiente de la concentración con un valor de EC50 de 25.5 nM (n = 3) .
Sumario de los efectos in vitro de Fab¦ PEG CA170_01519.g57 Fab' PEG CA170_01519. g57 inhibe el reciclamiento y la transcitosis de la IgG. La EC50 de 6 nM lograda en el ensayo de reciclamiento de la IgG es comparable a los datos de enlace de afinidad celular en los cuales los valores de KD de 6.5 nM en el amortiguador neutro y 5.42 nM en el amortiguador ácido fueron obtenidos. Fab 'PEG CA170_01519.g57 sí muestra una ligera reducción en la potencia, en comparación con a Fab' sola, pero comparada a muchas de las otras moléculas candidatas evaluadas, mostró la más baja caída en la potencia entre los dos formatos (ver arriba) . En el ensayo de transcitosis de IgG, fue obtenida una EC50 de 25.5 nM.
Los datos en esta sección han mostrado claramente que el Fab 1 PEG CA170_01519. g57 puede inhibir la función de FcRn humano .
Ejemplo 6 Reactividad cruzada de Fab'PEG CA170 01519.g57 con FcRn de primate no humano.
Para validar el uso de Fab'PEG CA170_01519. g57 en un estudio de PK/PD de primate no humano y la toxicología pre-clínica, su afinidad relativa y potencia funcional con FcRn del macaco cynomolgus, fue examinada. Las células MDCK II establemente transíectadas con FcRn de macacos cynomolgus y B2M (MDCKII (cm) ) fueron utilizadas para los siguientes estudios junto con las células MDCK II previamente descritas, establemente transfectadas con FcRn humano y B2M (clon 34 de MDCK II) .
Afinidad basada en células de Fab'PEG CA170_01519.g57 para FcRn de monos cynomolgus Para determinar la afinidad de enlace basada en las células de Fab'PEG CA170_01519. g57 para la FcRn de monos cynomolgus, fueron llevados a cabo experimentos cuantitativos de citometría de flujo utilizando las células MDCK II (cm) y Fab' o Fab'PEG CA170_01519. g57 marcados con AlexaFluor 488. El enlace específico del anticuerpo al FcRn de macacos cynomolgus a través de una gama de concentraciones de anticuerpo, fue utilizado para determinar la KD. El enlace al anticuerpo fue llevado a cabo en pH neutro y ácido para determinar el efecto de FcRn de enlace en el plasma sanguíneo neutro o en endosomas ácidos, y para determinar por lo tanto cualquier efecto que el pH pueda tener sobre el enlace de CA170_01519. g57 al FcRn de macacos cynomolgus.
La Figura 6 muestra el enlace de Fab' CA170_01519.g57 (A) y Fab' PEG CA170_01519. g57 (B) sobre las células MDCK II (cm) en pH ácido y neutro.
Las células MDCK II (cm) fueron incubadas en el amortiguador de Facs (PBS con 0.2% p/v de BSA, 0.09% p/v de NaN3) por 30 minutos antes de la adición de Fab' o Fab'PEG CA170_01519.g57 marcados con el Alexa-fluor 488 por 1 hora en amortiguador Facs ya sea a pH 7.4 o pH 6. Las concentraciones finales del anticuerpo estuvieron en el intervalo de 931 nM a 0.002 nM. Las células fueron lavadas sobre amortiguador Facs enfriado con hielo, luego analizadas mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo Guava (Millipore, Reino Unido) . Los grupos de datos de titulación fueron también producidos para los anticuerpos control isotipo para cada formato de anticuerpo, para determinar el enlace no específico. El número de moles del anticuerpo enlazado fue calculado mediante el uso de los valores interpolados a partir de una curva estándar generada a partir de las esferas que llevan diversas cantidades del colorante fluorescente. Los valores de fluorescencia media geométrica fueron determinados en los análisis de citometría de flujo de las células y las esferas. El enlace no especifico fue sustraído de los valores del anticuerpo anti-FcRn y la curva de enlace específica generada fue analizada mediante regresión no lineal utilizando una ecuación de enlace de un sitio (Graphpad Pristn®) para determinar la KD. Los datos son representativos de entre 2 y 3 experimentos.
Tabla 5 Valores medios de KD (nM) para Fab' y Fab'PEG CA170 01519.g57 sobre las células MDCK II (cía) .
La Figura 6 muestra las curvas de enlace representativas para Fab' CA17001519.g57 (Figura 6A) y Fab'PEG (Figura 6B) que se enlazan al FcRn de macacos cynomolgus. Los valores de KD medios obtenidos para Fab' y Fab'PEG CA17001519.g57 son mostrados en la Tabla 5. Estos valores son comparables a los valores de KD obtenidos para el enlace de Fab' y Fab'PEG CA170_01519.g57 al FcRn humano (ver tabla 4) Fab'PEG CA170 01519.g57 inhibe el reciclamiento de la IgG de monos cynomolgus Para determinar si Fab'PEG CA170_01519. g57 es funcionalmente activo en el bloqueo de FcRn de monos cynomolgus, fueron utilizadas las células MDCK II (cm) para examinar la habilidad de Fab'PEG CA170_01519. g57 para inhibir el reciclamiento de la IgG de macacos cynomolgus, como se describe previamente para el ensayo de FcRn humano. El ensayo fue corrido junto con los ensayos humanos representativos para permitir una comparación entre los dos.
En resumen, las células MDCK II (clon 34 o cm) fueron centrifugadas con Fab'PEG CA170_01519. g57 antes de la adición de la IgG humana biotinilada (h) o de macacos cynomolgus (c) en un amortiguador ácido para permitir el enlace a FcRn. Todo el Fab'PEG CA170_01519. g57 en exceso y la IgG biotinilada fueron removidos y las células incubadas en un amortiguador de pH neutro para permitir la liberación de la IgG hacia el sobrenadante. La inhibición de FcRn fue evaluada mediante la detección de la cantidad de IgG presente en el sobrenadante mediante el ensayo MSD y se calculó el porcentaje de inhibición.
Como se muestra en la Figura 7, Fab'PEG CA170_01519.g57 puede inhibir el reciclamiento de la IgG de humano y de macacos cynomolgus de una manera dependiendo de la concentración, con los valores de EC50 de 8.448 nM y 5.988 nM respectivamente. La inhibición de FcRn mediante Fab'PEG CA170_01519.g57 en los ensayos de humano y de macacos cynomolgus son comparables, aunque parecen más ligeramente potentes contra el FcRn de cynomolgus.
Tabla 6 La Figura 7 muestra que CA170_01519. g57 inhibe el reciclamiento de la IgG en las células del clon 34 de MDCK II y las células MDCK II (cm) .
Las células del clon 34 de MDCK II y MDCK II (cm) fueron sembradas a 25,000 células por pozo en una placa de 96 pozos, y se incubaron toda la noche a 37°C, con 5% de CO2. Las células fueron luego pre-incubadas con Fab' o Fab' PEG CA170_01519.g57 en HBSS+ (Ca/Mg) de pH 5.9 + 1% de BSA por 1 hora a 37°C, con 5% de CO2 antes de la adición de 500 ng/ml de la IgG de humano o de cynomolgus biotinilada, y se incubaron por 1 hora adicional. Las células fueron luego lavadas con HBSS+ de pH 5.9 y se incubaron a 37°C, con 5% de C02 por 2 horas en HBSS+ de pH 7.2. El sobrenadante fue retirado de las células y analizado para la IgG total utilizando un ensayo MSD (utilizando un anticuerpo de captura anti-IgG humana (Jackson) y un anticuerpo de revelación del marcador de estreptavidina-sulfo (MSD) ) . La curva de inhibición fue realizada mediante regresión no lineal (Graphpad Prism®) para determinar la EC50. La gráfica representa los datos combinados provenientes de 2 experimentos .
Ejemplo 7 Efecto de Fab PEG 01519g en mono cynomolgus Este fue un estudio del efecto de la administración de Fab PEG 01519g en monos cynomolgus, en regímenes de dosificación simple, intermitente o repetida. Fab PEG 01519g fue administrada mediante inyección intravenosa, como una dosis simple o en dosis repetidas a grupos de cuatro monos cynomolgus, como se indica en la Tabla 7. La IgG plasmática y la farmacocinética de Fab PEG 01519g fueron monitorizadas mediante inmunoensayo (ver Tabla 7A para los métodos de inmunoensayo) y LC-MS/MS. El ensayo de albúmina plasmática fue conducida en Covancia.
Tabla 7 Grupos de dosis en estudio el NCD2241. La dosificación fue mediante inyección intravenosa. La re-dosis fue la misma que la primera dosis en cada caso. Las dosis repetidas (4 de cada una) fueron semanales.
Tabla 7A Métodos de inmunoensayo de IgG, PK y ADA en plasma Efecto sobre la concentración de IgG en plasma Las placas de IgG en plasma del inmunoensayo y LC-MS/MS estuvieron en buena concordancia. La IgG en plasma fue reducida por la administración de Fab PEG (ver Figura 12 y Figura 14) . Para ambos grupos de dosis de la Fase I, una dosis simple de Fab PEG redujo la IgG en plasma por aproximadamente 70-80%, alcanzando un nadir a 5 aproximadamente a los 7 días y regresando a los niveles pre- dosificación por el día 63. La re-dosificación en el día 67 logró resultados similares.
Para ambos grupos de dosis de Fase II, 4 dosis semanales de Fab PEG redujeron la IgG en plasma por aproximadamente 70-80%, alcanzando nuevamente un nadir aproximadamente a los 7 días después de la primera dosis . Los resultados son mostrados en la Figura 13.
Ejemplo 8 Efecto de Fab' PEG CA170_01519.g57 e IgG4P CA170_01519.g57, en monos cynomolgus Los efectos de Fab' PEG CA170_01519g.57 e IgG4P CA170_01519g.57 sobre la IgG en plasma endógena, fueron determinados en monos cynomolgus. Los animales fueron dosificados como se indica en la Tabla 8, con 4 animales por grupo de tratamiento. La IgG en plasma y la farmacocinética de las entidades anti-FcRn fueron monitorizados mediante inmunoensayo (ver Tabla 8A para métodos de inmunoensayo) y LC- MS/MS.
Tabla 8 Regímenes de tratamiento en monos cynomolgus.
Tabla 8A Métodos de inmunoensayo de IgG y PK en plasma Efecto sobre la concentración de IgG en plasma.
Los datos de IgG en plasma por inmunoensayo y LC-MS/MS estuvieron en buena concordancia. La IgG plasmática fue reducida por la administración de Fab'PEG anti-FcRn o IgG4P anti-FcRn (ver Figuras 15 y 16 y Figuras 17 y 18 respectivamente; ver Figura 19 para Control). Para ambas entidades anti-FcRn, una dosis simple redujo la IgG en plasma por aproximadamente 70-80%, alcanzando un nadir aproximadamente a los 7 días y regresando a los niveles pre-dosificación por el día 62. La re-dosificación en el día 63 o día 65, como se describe, logró resultados similares.
La dosificación repetida de Fab ' PEG o IgG4P anti-FcRn, redujo la IgG en plasma por aproximadamente 60-80%, y mantuvo el nivel de la IgG por la duración del periodo de dosis, nuevamente, el nadir fue alcanzado a aproximadamente los 7 días después de la primera dosis. Los resultados se muestran en las Figura 16 y 18.
Ejemplo 9 Efecto de Fab' PEG CA170 01519.g57 , IgGl CA170_01519.g57, IgG4P CA170 01519. g57 , Fab' HSA CA170_01519.g57, FabFv CA170_01519.g57 y Fab CA170_01519.g57 en ratones transgénicos hFcRn Fue determinado el efecto de los formatos diferentes del anticuerpo CA170_01519. g57 sobre la depuración de IVIG humana en ratones transgénicos con FcRn humano. Los formatos probados fueron Fab' PEG CA170_01519. g5 , IgGl CA170_01519.g57, IgG4P CA170_01519. g57 , Fab' HSA CA170_01519.g57, FabFv CA170_01519. g57 y Fab CA170_01519. g57 y los resultados se muestran en las Figuras 20, 21, 22, 23 y 24 respectivamente. Las dosis simples del compuesto activo fueron como se muestra en las Figuras. Con el fin de detectar sus efectos sobre la depuración de la IgG humana (IVIG) , los ratones fueron inyectados con 500 mg/kg de IVIG humano que fue cuantificado mediante LCMSMS en muestras de plasma en serie, retiradas de las colas de los ratones a intervalos. El bloqueo del hFcRn por cada uno de los diferentes formatos de anticuerpos probados, dio como resultado una depuración acelerada de hlVIG y concentraciones más bajas de IgG total fueron observadas en comparación a los ratones control .
El tratamiento Anti-FcRn aumenta la depuración de hlgG en ratones transgénicos hFcRn Los ratones transgénicos con FcRn humanizados (ratones B6. Cg-FcgrttralDer Tg (FCGRT) 32Dcr/DcrJ, JAX) fueron infundidos intravenosamente con 500 mg/kg de IgG humana (Igl humana 10% Gamunex-c, Talecris Biotherapeutics) . 24 horas más tarde los animales fueron dosificados con el vehículo control (PBS) o anti-FcRn intravenosamente como una dosis simple. Muestras de sangre de la punta de la cola fueron tomadas a las -24, 8, 24, 48, 72, 144 y 192 horas con relación al tratamiento con anti-FcRn. Los niveles en suero de la IgG humana en el ratón hFcRn y la farmacocinética de los inhibidores de FcRn fueron determinados mediante LC-MS/MS. Los datos presentados en las figuras 20 a la 24 son la media ± SEM con 3-6 ratones por grupo de tratamiento.
Cuantificación de la IgG humana, IgG de cynomolgus endógena e inhibidores de FcRn por LC-MS/MS La IgG humana, la IgG de cynomolgus y los inhibidores de FcRn (Fab'PEG 1519. g57, IgG4P 1519. g57, IgGl 1519. g57, FabFv 1519. g57, Fab 1519. g57 y Fab 1 HAS 1519. g57) fueron cuantificados utilizando el análisis de espectrometría de masa en tándem y cromatografía líquida (LC-MS/MS) después de la digestión con tripsina.
La cuantificación fue lograda mediante comparación al material estándar auténtico, adicionado a concentraciones conocidas dentro de la matriz testigo, con la mioglobina de caballo con adición conocida, utilizada como el estándar interno.
Los péptidos únicos ( "proteotípicos" ) para todos los analitos de interés investigados fueron seleccionados, y ambas muestras y las muestras de calibración fueron típicamente digeridas como se detalla más adelante.
En resumen, la digestión con tripsina de las muestras de suero de 5 µ? fue llevada a cabo toda la noche utilizando Tripsina Modificada Grado Secuenciamiento (Promega, Southampton, Reino Unido) después de la desnaturalización con acetonitrilo/tris (2 -carboxietil ) fosfina y carbamido-metilación con yodoacetamida (todos de Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido) .
Los analitos fueron separados utilizando la columna Onyx Monolithic C18 (100 x 4.6 mm, Phenomenex, Macclesfield, Reino Unido) con un gradiente de 2 a 95% (v/v) de agua/acetonitrilo (0.1% de ácido fórmico) administrado a 1.5 ml/min en 6 minutos.
El volumen de inyección fue de 10 µ?; todo el eluyente fue introducido entro de la fuente del espectrómetro de masa.
La temperatura fuente del espectrómetro de masa fue mantenida a 600°C y otros parámetros fuente (por ejemplo, la energía de colisión, el potencial de desagrupación, la presión de gas de cortina, etc.) fueron optimizados para lograr una sensibilidad máxima para cada uno de los péptidos de interés. Transiciones selectivas para cada péptido proteotípico de interés fueron monitorizadas .
Ejemplo 10: Cristalografía y epitopo de enlace.
La estructura cristalina del Fab' 1519g57 y el dominio extracelular de FcRn humano desglucosilado (dominio extracelular de cadena alfa (SEQ ID No.: 94) en asociación con la SEQ ID No. : 95 de la microglobulina beta2) fue determinada, con el oligosacárido FcRn excluido con el fin de facilitar la cristalización. Fab1 1519. g57 se hizo reaccionar con un exceso molar de 10 veces de la N-etil-maleimida para prevenir la formación de diFab' y cualquier diFab' eliminado por SEC (S200 y Akta FPLC) . El dominio extracelular FcRn humano fue tratado con PNGaseF para eliminar los azúcares N-enlazados . Para esto, la concentración de la muestra de FcRn fue ajustada utilizando PBS (pH 7.4) a 5 mg/ml y un volumen total de mi. Se agregaron 200 unidades de PNGaseF (Roche) a esta solución de FcRn humano. Éste fue incubado a 37°C por ~ 18 horas, después de lo cual fue verificado el grado de desglucosilación utilizando SDS PAGE. Después de la terminación de la reacción, el FcRn desglucosilado fue intercambiado con amortiguador en Acetato de Sodio 50 mM, Cloruro de Sodio 125 mM, pH 6.0.
El complejo fue formado mediante incubación de la mezcla de reactivos (Fab'rFcRn:: 1.2:1, p/p) a temperatura ambiente por 60 minutos, y luego purificado utilizando SEC (S200 utilizando Akta FPLC) . La selección fue realizada utilizando las diversas condiciones que fueron disponibles de Qiagen (aproximadamente 2000 condiciones) . La incubación y la formación de imagen fue realizada por Formulatrix Rock Imager 1000 (para un periodo de incubación total de 21 días) . El resultado de la selección es mostrado en la Figura 26 y en las Tablas 9 y 10.
Tabla 9 Condiciones para la colección y procesamiento de los datos de análisis de rayos X.
Nota: Los números en paréntesis se refieren a la capa de resolución exterior Tabla 10 Determinación de la estructura y refinación.
No existe cambio obvio en la estructura de FcRn después del enlace del Fab' 1519g57 (comparando este complejo con las estructuras publicadas de FcRn) . A partir de la estructura cristalina se calculó el contenido de la estructura secundaria como: hélice Ot 9.4%; lámina ß 45.2%; torsión 3-10 2.5%.
Los residuos que interactúan con Fab ' 1519g57 estuvieron todos en la cadena a de FcRn (no ß2?) y son indicados abajo en letras negritas. Los residuos en cuestión abarcan todos excepto 1 de los residuos críticos para el enlace a Fe. 1519g57 se enlaza en una región que traslapa la región de enlace a Fe, sugiriendo que el bloqueo de FcRn por Fab1 1519g57 es por simple competencia, siendo efectivo el anti-FcRn en virtud de su afinidad superior.
AESHLSLLYH LTAVSSPAPG TPAFWVSGWL GPQQYLSY S LRGEAEPCGA WVWENQVSWY WEKETTDLRI KE LFLEAFK ALGGKGPYTL QGLLGCELGP DNTSVPTAKF ALNGEEFMNF DLKQGTWGGD WPEALAISQR QQQDKAANK ELTFLLFSCP HRLREHLERG RGNLEWKEPP SMRLKARPSS PGFSVLTCSA FSFYPPELQL RFLRNGLAAG TGQGDFGPNS DGSFHASSSL TVKSGDEHHY CCIVQHAGLA QPLRVELESPAKSS La secuencia de cadena a FcRn, que muestra los residuos involucrados en la interacción con Fab' 1519g57 (negritas) y los residuos críticos para la interacción con Fe de IgG (subrayados) . Todos excepto 1 de los últimos son incluidos en los primeros.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (42)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo, caracterizado porque comprende una cadena pesada o fragmento de cadena pesada que tiene una región variable, en donde la región variable comprende una, dos o tres CDRs independientemente seleccionadas de la SEQ ID No. : 1, SEQ ID No.: 2 y SEQ ID No.: 3.
2. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque CDR Hl tiene la secuencia dada en la SEQ ID No. : 1.
3. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque CDR H2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID No. : 2.
4. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3, caracterizado porque CDR H3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID No.: 3.
5. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4 , caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace comprende además una cadena ligera o el fragmento del mismo, que tiene una región variable que comprende una, dos o tres CDRs independientemente seleccionadas de la SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 5 y SEQ ID No . : 6.
6. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque CDR Ll tiene la secuencia dada en la SEQ ID No. : 4.
7. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizado porque CDR L2 tiene la secuencia dada en la SEQ ID No. : 5.
8. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a la 7 , caracterizado porque CDR L3 tiene la secuencia dada en la SEQ ID No . : 6.
9. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 8, caracterizado porque el anticuerpo es humanizado.
10. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9, caracterizado porque tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.:29 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No. : 15.
11. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo que se enlaza a FcRn humano que comprende una cadena pesada, caracterizado porque el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad o similitud a la secuencia dada en la SEQ ID No.: 29 y en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos 80% de identidad o similitud a la secuencia dada en la SEQ ID No.: 15.
12. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento scFv, Fv, Fab o Fab 1.
13. Un fragmento Fab1 del anticuerpo anti-FcRn de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque tiene una cadena pesada que incluye la secuencia dada en la SEQ ID No. : 36 y una cadena ligera que incluye la secuencia dada en la SEQ ID No. : 22.
14. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 13, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de enlace es conjugado a un polímero, por ejemplo seleccionado de almidón, albúmina y polietilenglicol .
15. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polímero es PEG, por ejemplo con un peso molecular en el intervalo de 5 a 50 kDa.
16. El anticuerpo anti-FcRn de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.
17. El anticuerpo anti-FcRn de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el anticuerpo de longitud completa se selecciona del grupo que consiste de una IgGl, IgG4 e IgG4P.
18. El anticuerpo anti-FcRn de conformidad con la reivindicación 16 o 17, caracterizado porque tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No. : 72 o SEQ ID No. : 87 o SEQ ID No . : 43 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No.: 22.
19. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 11, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento de enlace del mismo es un Fab-dsFv que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No. : 50 y una cadena ligera que comprende la secuencia dada en la SEQ ID No. : 46 o SEQ ID No. : 78.
20. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo, caracterizado porque tiene una afinidad de enlace para FcRn humano de 100 pM o menor.
21. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la afinidad de enlace para el FcRn humano es 100 pM o menos cuando se mide a pH 6 y a pH 7.4.
22. Un anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo, caracterizado porque se enlaza al mismo epitopo del FcRn humano que el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10.
23. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo, caracterizado porque se enlaza a un epitopo de FcRn humano que comprende al menos un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de residuos V105, P106, T107, A108 y K109 de la SEQ ID No.: 94 y al menos un residuo seleccionado del grupo que consiste de P100, E115, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128, G129, D130, W131, P132 y E133 de la SEQ ID No.:94.
24. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo, caracterizado porque bloquea cruzadamente el enlace del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10 al FcRn humano o es bloqueado cruzadamente de enlazarse a FcRn humano por el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10.
25. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 a la 24, caracterizado porque es humanizado o completamente humano.
26. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 22 a la 25, caracterizado porque tiene una afinidad de enlace por FcRn humano de 100 pM o menos.
27. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 26, caracterizado porque se enlaza a FcRn humano.
28. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 27, caracterizado porque bloquea el enlace de la IgG humana al FcRn humano.
29. El anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 28, caracterizado porque no se enlaza a la microglobulina ß2.
30. Un ensayo para probar la habilidad de una molécula de prueba, tal como una molécula de anticuerpo para bloquear la actividad de FcRn humano, y en particular a la habilidad del FcRn humano para reciclar la IgG, caracterizado porque el método comprende los pasos de: a. recubrir sobre una superficie las células de mamífero no humanas, que expresan recombinantemente la cadena alfa de FcRn humano y la microglobulina ß2 humana (ß2?) , b. poner en contacto las células bajo condiciones levemente ácidas tal como aproximadamente pH 5.9 con una molécula de anticuerpo de prueba y una IgG que va a ser reciclada por la célula, por un periodo de tiempo suficiente para permitir el enlace de la molécula de anticuerpo de prueba y la IgG al FcRn, c. el lavado con un amortiguador ligeramente ácido, y d. la detección de la cantidad de IgG internalizada y/o reciclada por las células.
31. El ensayo de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la molécula de anticuerpo de prueba es agregada antes de que la IgG sea reciclada e incubada por un periodo de tiempo suficiente para permitirle el enlace de la molécula de anticuerpo de prueba a FcRn antes de la adición de la IgG que va a ser reciclada.
32. Una secuencia de ADN aislado, caracterizado porque codifica para la o las cadenas pesadas y/o ligeras de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones l a la 29.
33. Un vector de clonación o de expresión, caracterizado porque comprende una o más secuencias de ADN de conformidad con la reivindicación 32.
34. El vector de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el vector comprende (i) la secuencia dada en la SEQ ID No.: 37 y la secuencia dada en la SEQ ID No. : 23 o (ii) la secuencia dada en la SEQ ID No. : 80 y la secuencia dada en la SEQ ID No. : 79 o (iii) la secuencia dada en la SEQ ID No.: 93 y la secuencia dada en la SEQ ID No.: 91.
35. Una célula hospedera caracterizada porque comprende uno o más vectores de clonación o de expresión de conformidad con la reivindicación 33 o 34.
36. Un proceso para la producción de un anticuerpo que tiene especificidad de enlace por FcRn humano, caracterizado porque comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 35, y aislar el anticuerpo .
37. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo anti-FcRn o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 29, en combinación con uno o más excipientes, diluyentes o portadores farmacéuticamente aceptables .
38. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque comprende además otros ingredientes activos.
39. El anticuerpo o fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 29 o una composición de conformidad con la reivindicación 37 ó 38, para usarse en terapia.
40. El anticuerpo o fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 29 o una composición de conformidad con las reivindicaciones 37 ó 38, para usarse en el tratamiento de un trastorno autoinmunitario, tal como la miastenia gravis, pénfigo vulgar, neuromielitis óptica, síndrome de Guillain-Barre , y púrpura trombocitopénica trombótica.
41. Un método de tratamiento de un paciente, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o el fragmento de enlace del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 29, o una composición de conformidad con la reivindicación 37 o 38.
42. Un método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el tratamiento es para un trastorno autoinmunitario tal como miastenia gravis, pénfigo vulgar, neuromielitis óptica, síndrome Guillain-Barre, lupus, y púrpura trombocitopenica trombótica.
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