MX2014012351A

MX2014012351A - Anticuerpo anti-homologo 4 de roundabout (robo4).

Info

Publication number: MX2014012351A
Application number: MX2014012351A
Authority: MX
Inventors: Hasegawajun; Yoshitaka Isumi; Toshiyuki Sato; Tatsuya Inoue
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2012-04-27
Filing date: 2013-04-26
Publication date: 2015-01-12
Also published as: JP5897205B2; CA2868074A1; AU2013254313A1; EP2841457B1; KR20190020838A; TW201348257A; US20160108120A1; ZA201406235B; PH12014502382B1; CN104768973A; JP2015515490A; AU2013254313B2; HK1207093A1; EP2841457A1; RU2682451C2; ES2733434T3; NZ629291A; WO2013160879A1; US9562096B2; BR112014026649A2

Abstract

La presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene una actividad anti-angiogénesis. Más especificamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo contra ROBO4 y a una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo. Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo anti-ROBO4 que tiene un efecto anti-angiogénesis, una composición farmacéutica o similares que comprenden el anticuerpo, un método for suprimir angiogénesis usando el anticuerpo, etc. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir el anticuerpo. El anticuerpo de la presente invención activa la señal descendente de ROBO4 y tiene una actividad supresora contra migración celular inducida por VEGF o bFGF. El anticuerpo de la presente invención también presenta un efecto anti-angiogénesis en modelos in-vivo. De esta manera, se ha resuelto el problema.

Description

ANTICUERPO ANTI-HOMOLOGO 4 DE ROUNDABOUT (ROB04) CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un anticuerpo que tiene una actividad anti-angiogénesis . Más específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo contra R0B04 ya una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION El homólogo 4 de Roundabout (R0B04) , una proteína de 110 kDa en peso molecular, tiene una estructura de transmembrana de paso único (bibliografía no relacionada con patentes 1) y es conocida por suprimir la angiogénesis a través del enlace a un homólogo 2 de Slit (Slit2) (bibliografía relacionada con patentes 1 y bibliografía no relacionada con patentes 2) . Se ha informado que Slit2 suprime la migración de HUVEC promovida por un factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y también se ha informado que suprime la promoción de migración celular por VEGF o bFGF para células endoteliales vasculares transíectadas por el gen ROB04 (en lo sucesivo, nos referiremos a la célula endotelial vascular como "EC") en comparación con EC transfectada por un vector vacío (bibliografía relacionada con patentes 1 y bibliografía no relacionada con patentes 2 a 4) .

Además, se ha informado que el efecto supresor de Slit2 en la promoción de migración celular, promoción de formación de lumen o incremento en la permeabilidad por parte de VEGF Ref.:250693 se observa en EC derivada de un ratón de tipo silvestre o EC transfectada con AR ip de control, pero no se observa en EC derivada de un ratón con gen R0B04 bloqueado o EC transfectada con ARNip para bloquear el gen R0B04 (bibliografía relacionada con patentes 2 y bibliografía no relacionada con patentes 4 a 6) . Además se ha informado que Slit2 suprime, a través de R0B04 , la angiogénesis o incrementa en permeabilidad vascular en modelos de ratón con neovascularización coroidal inducida por láser o retinopatía inducida por oxígeno, las cuales son modelos de enfermedad animal con degeneración macular exudativa relacionada con la edad o retinopatía diabética (bibliografía relacionada con patentes 2 y bibliografía no relacionada con patentes 4) .

A pesar de estos hallazgos también hay informes que muestran que R0B04 no se enlaza a Slit2 (bibliografía no relacionada con patentes 9 y bibliografía relacionada con patentes 5) . También se ha informado en cuanto a sus funciones que ROB04 participa en la promoción de angiogénesis antes que en la supresión de angiogénesis, debido a que se inhibe la migración o la formación de lumen de EC con bloqueo del gen R0B04 (Bibliografía no relacionada con patentes 10 y 11) · En la práctica clínica se ha reportado que R0B04 se expresa altamente en vasos intratumorales en metástasis del hígado a partir del cáncer de colon, ganglioglioma, cáncer de vejiga, cáncer de mama, melanoma metastásico, cáncer de riñon, cáncer de pulmón, cáncer de hígado o cáncer de colon (bibliografía relacionada con patentes 3 y bibliografía no relacionada con patentes 1, 3, y 7) . Además se ha reportado que R0B04 también se expresa en vasos sanguíneos en las membranas fibrovasculares de pacientes con retinopatía diabética proliferativa (bibliografía no relacionada con patentes 8) . Como tal, R0B04 se expresa en células endoteliales vasculares, particularmente células endoteliales en vasos sanguíneos, formadas recientemente en una condición. Esto puede sugerir una angiogénesis patológica que resulta de la alta expresión de ROB04 , pero también puede sugerir la expresión compensatoria de R0B04 para suprimir angiogénesis patológica .

Tal como se describió antes, R0B04 está involucrado en un efecto anti-angiogénesis . De esta manera, un anticuerpo contra ROB04 fragmento funcional del mismo presumiblemente son útiles en el tratamiento de una enfermedad que involucra angiogénesis. Sin embargo, es incierto si un anticuerpo agonístico o antagonístico contra R0B04 suprime o promueve la angiogénesis .

Los anticuerpos descritos en la patente europea No. 1,565,491 (bibliografía relacionada con patentes 4) y W0 2008/100805 (bibliografía relacionada con patentes 5) se conocen como el anticuerpo contra ROB04 (en lo sucesivo denominado como un "anticuerpo anti-R0B04") . Pero ninguno de estos anticuerpos muestra un efecto supresor o inhibitorio sobre angiogénesis in vivo.

Lista de citas [Bibliografía relacionada con patentes] [Bibliografía relacionada con patentes 1] W02004/003163 [Bibliografía relacionada con patentes 2] W02008/073441 [Bibliografía relacionada con patentes 3] W02002/036771 [Bibliografía relacionada con patentes 4] Patente europea No. 1,565,491 [Bibliografía relacionada con patentes 5] W02008/100805 [Bibliografía no relacionada con patentes] [Bibliografía no relacionada con patentes 1] Genomics, 2002, vol. 79, p. 547-552 [Bibliografía no relacionada con patentes 2] Developmental Biology (Biología de desarrollo), 2003, vol. 261, p. 251-267 [Bibliografía no relacionada con patentes 3] Biochemical and Biophysical Research Communications (Comunicaciones de investigación bioquímica y biofísica), 2005, vol. 332, p. 533-541 [Bibliografía no relacionada con patentes 4] Nature Medicine (Medicina natural), 2008, No. 14, p. 448-453 [Bibliografía no relacionada con patentes 5] Science Translational Medicine (Ciencia Medicina traslacional ) , 2010, vol. 2, p. 23ral9 [Bibliografía no relacionada con patentes 6] Proceedings of the National Academy of Sciences (Actas de la Academia Nacional de Ciencias), 2010, vol. 107, p. 10520-10525 [Bibliografía no relacionada con patentes 7] Oncology Reports (Reportes de Oncología), 2006, vol. 15, p.1437-1443 [Bibliografía no relacionada con patentes 8] Molecular Vision, 2009, vol. 15, p. 1057-1069 [Bibliografía no relacionada con patentes 9] The FASEB Journal, 2005, vol. 19, p. 121-123 [Bibliografía no relacionada con patentes 10] BMC Cell Biology, 2008, vol. 9, p. 61-72 [Bibliografía no relacionada con patentes 11] The FASEB Journal, 2009, vol. 23, p. 513-522 SUMARIO DE LA INVENCION Problemas a resolverse mediante la invenció] Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo contra R0B04.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-ROB04 que tiene un efecto anti-angiogénesis , etc.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir el anticuerpo.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para suprimir angiogénesis usando el anticuerpo, etc.

Medios para resolver los problemas Los presentes inventores han llevado a cabo judíos diligentes para lograr los objetos y, por consiguiente, construir exitosamente un sistema de cribado que detecte la activación de la señal descendente de R0B04. Además, los presentes inventores han usado el sistema de cribado para obtener exitosamente un novedoso anticuerpo monoclonal anti-R0B04 que activa la señal descendente de R0B04, tiene una actividad supresora contra migración celular inducida por varios factores angiogénicos tales como VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB y SDF-1 en EC que expresan ROB04 , y exhibe un efecto anti-angiogénesis incluso en modelos in-vivo. De esta manera se ha finalizado la presente invención.

Específicamente, la presente invención se refiere a: (1) un anticuerpo que tiene propiedades descritas en los siguientes puntos (I) a (III) o un fragmento funcional del mismo : (I) enlazarse a la proteína R0B04 , preferiblemente con un valor KD de 1 x 10"8 o más bajo, específicamente preferido 5x 10"9 o más bajo; (II) suprimir o inhibir migración celular endotelial vascular en ausencia de un anticuerpo de enlace cruzado in vi tro; y (III) suprimir o inhibir angiogénesis in vivo; (2) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según (1) , en cuyo caso la proteína R0B04 es la proteína R0B04 humana; (3) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según (1) , en cuyo caso la proteína R0B04 es una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos Nos. 1 a 1007 de SEQ ID NO: 2 ; (4) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo según (1) , en cuyo caso la proteína R0B04 es una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos Nos. 46 a 1007 de SEQ ID NO: 2 ; (5) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con (3) o (4) , en cuyo caso el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se enlaza a un sitio que consiste en una secuencia de aminoácidos Nos. 132 a 209 de SEQ ID NO: 2; (6) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con (1) , en cuyo caso el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo; (7) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (6) , en cuyo caso el anticuerpo consiste en una cadena pesada que comprende CDRHI consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44 (Figura 25) , CDRH2 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 (Figura 26) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 por la sustitución de un aminoácido, y CDRH3 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 48 (Figura 27), y una cadena ligera que comprende CDRLI consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 50 (Figura 28) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 por la sustitución de uno a tres aminoácidos, CDRL2 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 52 (Figura 29), y CDRL3 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 54 (Figura 30); (8) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (7) , en cuyo caso el anticuerpo consiste en una cadena pesada que comprende CDRHI consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44 (Figura 25) , CDRH2 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 (Figura 26) o la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 68 (Figura 44), y CDRH3 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 48 (Figura 27), y una cadena ligera que comprende CDRLI consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 50 (Figura 28) o la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 70 (Figura 46) , CDRL2 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 52 (Figura 29), y CDRL3 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 54 (Figura 30); (9) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (7) , en cuyo caso el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 31 (Figura 16) , y una región variable de cadena ligera consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 33 (Figura 18); (10) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (8) , en cuyo caso el anticuerpo comprende cualquier región variable de cadena pesada seleccionada de los siguientes a) a d) y una región variable de cadena ligera seleccionada de e) y f) : a) una región variable de cadena pesada (tipo hMAbl-Hl) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 56 (Figura 32), b) una región variable de cadena pesada (tipo hMAbl-H2) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34), c) una región variable de cadena pesada (tipo hMAbl-H3 ) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 60 (Figura 36) , y d) una región variable de cadena pesada (tipo hMAbl-H4) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 62 (Figura 38) ; y e) una región variable de cadena ligera (tipo hMAbl-Ll) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 to 134 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) , y f) una región variable de cadena ligera (tipo hMAbl-L2) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42) ; (11) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (8) , en cuyo caso el anticuerpo comprende cualquiera de las siguientes combinaciones 1) a 6) de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera: 1) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40), 2) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42) , 3) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 62 (Figura 38) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42); 4) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 62 (Figura 38) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) , 5) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 56 (Figura 32) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) , y 6) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO : 60 (Figura 36) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) , (12) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (11) , en cuyo caso el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo quimérico o un fragmento funcional del mismo; (13) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (11), en cuyo caso el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo; (14) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (13), en cuyo caso el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada IgG 1 humana o IgG2 humana; (15) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (6) , en cuyo caso el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se enlaza a un sitio en un antígeno reconocido por cualquier anticuerpo de acuerdo con (7) a (14) ; (16) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (6) , en cuyo caso el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo compite con cualquier anticuerpo de acuerdo con (7) a (14) por enlazarse a la proteína R0B04 ; (17) el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (8) , en cuyo caso el anticuerpo comprende cualquiera de las siguientes combinaciones 1) a 6) de una cadena pesada y una cadena ligera: 1) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) (H-1140) , 2) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42) (H-1143) , 3) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 62 (Figura 38) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42) (H-2143); 4) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 62 (Figura 38) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) (H-2140) , 5) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 56 (Figura 32) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) (H-1040) , y 6) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 60 (Figura 36) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) (H-2040) , (18) un anticuerpo que comprende una forma modificada de la cadena pesada de cualquier anticuerpo de acuerdo con (17) , en cuyo caso la forma modificada carece de uno a varios aminoácidos con C-terminalarboxilo de la cadena pesada, preferiblemente de uno a ocho aminoácidos con C-terminalarboxilo de la cadena pesada, más preferiblemente de uno a dos aminoácidos con C-terminalarboxilo de la cadena pesada ; (19) el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (6) , en cuyo caso el anticuerpo es idéntico en un 95% o más en la secuencia de aminoácidos a cualquier anticuerpo de acuerdo con (17) ; tiene un valor KD de 1 x 10"8 o más bajo para un ROB04 humano; suprime o inhibe la migración celular endothelial vascular en ausencia de un anticuerpo de enlace cruzado in vitro; y suprime o inhibe angiogénesis in vivo; (20) el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con (15) , en cuyo caso el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo humano o un fragmento funcional del mismo; (21) una secuencia de nucleótido seleccionada del grupo consistente en los siguientes puntos (I) a (III) : (I) una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifican la secuencia de aminoácidos parcial o total de la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (20) ; (II) una secuencia de nucleótido consistente en una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifican la secuencia de aminoácidos parcial o total de la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (20) ; y (III) una secuencia de nucleótido consistente en una secuencia de nucleótido que codifican la secuencia de aminoácidos parcial o total de la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (20) ; (22) un vector recombinante que contiene un inserto de una secuencia de nucleótido de acuerdo con (21) ; (23) una célula recombinante que contiene un nucleótido de acuerdo con (21) o un vector recombinante de acuerdo con (22) introducido en la misma; (24) una célula que producen un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de (1) a (20) , en cuyo caso la célula es preferiblemente una célula de mamífero, más preferiblemente una célula CRO e incluso más preferible una CHOK1SV; (25) un método para producir un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (20) , que comprende los siguientes pasos (I) y (II) : (I) cultivar una célula de acuerdo con (23) o (24); y (II) recoger el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (20) a partir del cultivo obtenido en el paso (I) ; (26) un anticuerpo o a un fragmento funcional del mismo producido mediante un método de producción de acuerdo con (25); (27) una forma modificada de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (20) y (26) ; (28) una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (20) y (26) o una forma modificada de acuerdo con (27) como un ingrediente activo; (29) la composición farmacéutica de acuerdo con (28) , en cuyo caso la composición farmacéutica es un agente para tratar o prevenir una enfermedad angiogénica; (30) la composición farmacéutica de acuerdo con (28) , en cuyo caso la enfermedad angiogénica es una degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmune de un trasplante de tejido de córnea o trasplantes de otros tejidos, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, sepsis, u obesidad; (31) la composición farmacéutica de acuerdo con (28) , en cuyo caso la enfermedad angiogénica es una degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, fibroplasia retrolental, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa , glaucoma neovascular o rechazo inmune de un trasplante de tejido de córnea ; (32) un inhibidor de angiogénesis que comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (20) y (26) o una forma modificada de acuerdo con (27) como un ingrediente activo; (33) un método para tratar o prevenir una enfermedad angiogénica que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo o de un fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de (1) a (20) y (26) o una forma modificada de acuerdo con (27) , o la composición de acuerdo con cualquiera de (28) a (31) , preferiblemente en cuyo caso la enfermedad angiogénica es la enfermedad angiogénica en un individuo que tiene la proteína R0B04 expresada; y (34) la composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 to 31, en cuyo caso la composición se usa en combinación con otro agente terapéutico o profiláctico, preferably en cuyo caso el agente es un medicamento anti-angiogénesis, un medicamento antiinflamatorio y/o un medicamento anti-cáncer.

Efectos ventajosos de la invención De acuerdo con la presente invención, puede obtenerse un agente terapéutico o similar para una enfermedad angiogénica el cual contiene un anticuerpo que se enlaza a R0B04 y tiene un efecto antiangiogénesis .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un diagrama que muestra la presencia o ausencia de cambio en la actividad indicadora contra NF-KB, GAS, ISRE, promotor IL-8, o TCF como elementos de respuesta en la expresión transitoria de ROB04 en células HEK293. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n = 3 ) .

La Figura 2 es un diagrama que muestra la presencia o ausencia de cambio en la actividad promotora de IL-8 en la expresión transitoria de R0B04 humano de longitud completa o una variante de supresión de región intracelular de R0B04 humano en células HEK293. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n = 5 o 10) .

La Figura 3 es un diagrama que muestra cambio en la actividad promotora de IL-8 en células de HEK293 transfectadas por R0B04 humano, causado por un anticuerpo MAbl anti-R0B04. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n = 3) .

La Figura 4 es un diagrama que muestra cambio en la actividad promotora de IL-8 en en células de HEK293 transfectadas por R0B04 humano, causado por un anticuerpo MAb2, MAb3, o MAb4 anti-R0B04. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n = 3) .

La Figura 5 es un diagrama que muestra cambio en la capacidad migratoria de HUVEC en presencia de VEGF o bFGF causado por el anticuerpo MAbl anti-R0B04. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n = 3 o 4) .

La Figura 6 es un diagrama que muestra cambio en la capacidad migratoria de HUVEC en presencia de bFGF causado por el anticuerpo MAb2, MAb , o MAb4 anti-R0B04. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n = 4) .

La Figura 7 es un diagrama que muestra la presencia o ausencia de la actividad enlazante del anticuerpo MAbl anti-ROB04 contra R0B04 humano, R0B04 de ratón, R0B04 de rata, o ROB04 de mono cynomolgus .

La Figura 8 es un diagrama que muestra la presencia o la ausencia de la actividad enlazante del anticuerpo MAbl anti-R0B04 contra ROBOl humano, ROB02 humano, o ROB03 humano. Las cajas superiores muestran los resultados sobre MAb 1, y las cajas inferiores muestran los resultados sobre un anticuerpo de control positivo con el cual se confirmó la expresión de estas proteínas sobre la superficie celular.

La Figura 9 es un diagrama que muestra la presencia o la ausencia de la actividad enlazante del anticuerpo MAbl anti-ROB04 contra una región extracelular/variante de supresión de dominio de ROB04 humano. Las cajas superiores muestran los resultados sobre MAbl, y las cajas inferiores muestran los resultados sobre un anticuerpo anti-FLAG con el cual se confirmó la expresión de estas proteínas sobre la superficie celular .

La Figura 10 es un diagrama que muestra cambio en angiogénesis en modelos de neovascularización coroidal inducida por láser, causado por el anticuerpo MAbl anti-R0B04. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n = 4 ojos) , y ¦ o ? muestran los resultados de cada ojo.

La Figura 11 es un diagrama que muestra cambio en la actividad promotora de IL-8 en células HEK293 t ansfectadas por ROB04 humano, causado por un anticuerpo quimérico cMAbl-1 o cMAbl-2 anti-R0B04. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n = 3) .

La Figura 12 es un diagrama que muestra cambio en la capacidad migratoria de HUVEC en presencia de bFGF causado por el anticuerpo quimérico cMAbl-1 o cMAbl-2 anti-R0B04. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n= ) .

La Figura 13 muestra ADNc que codifica R0B04 humano de longitud completa (SEQ ID NO: 1 ) .

La Figura 14 muestra la secuencia de longitud completa de aminoácidos de R0B04 humano (SEQ ID NO: 2) .

La Figura 15 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de MAbl (SEQ ID NO: 30) .

La Figura 16 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada MAbl (SEQ ID NO: 31) .

La Figura 17 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de MAbl (SEQ ID NO: 32) .

La Figura 18 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de MAbl (SEQ ID NO: 33) .

La Figura 19 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica la cadena ligera de cMAbl (SEQ ID NO: 37) .

La Figura 20 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de cMAbl (SEQ ID NO: 38) .

La Figura 21 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica la cadena pesada de cMAbl-l (SEQ ID NO: 39) .

La Figura 22 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de cMAbl-l (SEQ ID NO: 40) .

La Figura 23 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica la cadena pesada de cMAbl-2 (SEQ ID NO: 41) .

La Figura 24 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de cMAbl-2 (SEQ ID NO: 42) • La Figura 25 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDRH1 de MAbl (SEQ ID NO: 44) • La Figura 26 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDRH2 de MAbl (SEQ ID NO: 46) • La Figura 27 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada CDRH3 de MAbl (SEQ ID NO: 48) • La Figura 28 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDRL1 de MAbl (SEQ ID NO: 50) • La Figura 29 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDRL2 de MAbl (SEQ ID NO: 52) La Figura 30 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera CDRL3 de MAbl (SEQ ID NO: 54) • Figura 31 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica una cadena pesada de tipo hMAbl -Hl (SEQ ID NO: 55) • La Figura 32 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAbl (SEQ ID NO: 56) La Figura 33 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica una cadena pesada de tipo hMAbl-H2 (SEQ ID NO: 57) .

La Figura 34 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAbl-H2 (SEQ ID NO: 58) .

La Figura 35 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica una cadena pesada de tipo hMAbl-H3 (SEQ ID NO: 59) .

La Figura 36 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAbl-H3 (SEQ ID NO: 60) .

La Figura 37 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica una cadena pesada de tipo hMAbl-H4 (SEQ ID NO: 61) .

La Figura 38 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo hMAbl-H4 (SEQ ID NO: 62) .

La Figura 39 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica una cadena ligera de tipo hMAbl-Ll (SEQ ID NO: 63) .

La Figura 40 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hMAbl-Ll (SEQ ID NO: 64) .

La Figura 41 muestra la secuencia de nucleótido de ADNc que codifica una cadena ligera de tipo hMAbl-L2 (SEQ ID NO: 65) .

La Figura 42 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo hMAbl-L2 (SEQ ID NO: 66) .

La Figura 43 muestra la secuencia de aminoácidos de CD Hl de la cadena pesada de tipo hMAbl-H2 o hMAbl-H4 (SEQ ID NO: 67) .

La Figura 44 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH2 de la cadena pesada de tipo hMAbl-H2 o hMAbl-H4 (SEQ ID NO: 68) .

La Figura 45 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRH3 de la cadena pesada de tipo hMAbl-H2 o hMAbl-H4 (SEQ ID NO: 69) .

La Figura 46 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRLl de la cadena ligera de tipo hMAbl-L2 (SEQ ID NO: 70) .

La Figura 47 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL2 de la cadena ligera de tipo hMAbl-L2 (SEQ ID NO: 71) .

La Figura 48 muestra la secuencia de aminoácidos de CDRL3 de la cadena ligera de tipo hMAbl-L2 (SEQ ID NO: 72) .

La Figura 49 es un diagrama que muestra cambio en la actividad promotora de IL-8 en células de HEK293 transfectadas por ROB04 , causado por H-1040, H-1143, H-1140, H-2040, H-2143, o H-2140.

La Figura 50 es un diagrama que muestra cambio en la capacidad migratoria de HUVEC en presencia de bFGF causado por H-1143, H-2140, o H-2143. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n = 4) .

La Figura 51 es un diagrama que muestra la reactividad entre especies de H-1143.

La Figura 52 un diagrama que muestra la reactividad entre especies de H-2140.

La Figura 53 es un diagrama que muestra la reactividad entre especies de H-2143.

La Figura 54 un diagrama que muestra la especificidad para enlazar de H-1143, H-2140, o H-2143.

La Figura 55 es un diagrama que muestra cambio en angiogénesis en modelos de neovascularización coroidal inducida por láser, causado por H-2143. La barra de error en el diagrama representa la desviación estándar (n = 3-4 ojos) .

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION 1. Definición En la presente invención, "gen" significa nucleótido (s) o secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica los aminoácidos de una proteina, o su hebra complementaria. El "gen" tiene un significado que incluye, por ejemplo, un polinucleótido , un oligonucleótido, ADN, ARNm, ADNc , y ARNc como la secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica los aminoácidos de una proteína, o su hebra complementaria. Un gen tal es una secuencia de una hebra, de hebra doble, de tres hebras o con más hebras, de nucleótidos y el "gen" también significa que incluye un asociado de hebras de ADN y ARN, una mezcla de ribonucleótidos (ARNs) y desoxiribonucleótidos (ADNs) en una hebra de nucleótido y en una secuencia de nucleótido de hebra doble, de tres hebras o de más hebras , la cual comprende tal hebra de nucleótido. Ejemplos del "gen R0BO4" de la presente invención pueden incluir ADN, ARNm, ADNc, y ARNc que comprenden una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína ROB04.

En la presente invención, el término "nucleótido (s) " o "secuencia de nucleótido" tiene el mismo significado que en un "ácido nucleico" y también significa que incluye, por ejemplo, ADN, ARN, una sonda, un oligonucleótido, un polinucleótido, y un cebador. Tal secuencia de nucleótido es un nucleótido monocatenario, bicatenario o triplecatenario o con más hebras, y la secuencia de "nucleótido" también significa que incluye un asociado de hebras de ADN y ARN, una mezcla de ribonucleótidos (ARNs) y desoxiribonucleótidos (ADNs) sobre una hebra de nucleótido, y un asociado de dos hebras o tres o más hebras que comprenden tal hebra de nucleótido .

En la presente invención, los términos "polipéptido" , "péptido", y "proteína" tienen el mismo significado.

En la presente invención, el "antígeno" también se usa como el significado de un "inmunogen" .

En la presente invención, la "célula" también incluye diversas células derivadas de individuos animales, células sub-cultivadas , células cultivadas primarias, líneas celulares, células recombinantes y similares.

En la presente invención, un anticuerpo que reconoce la proteína ROB04 también es llamado "anticuerpo anti-R0B04". El "anticuerpo anti-R0B04" incluye un anticuerpo quimérico anti-ROB04 , un anticuerpo humanizado anti-ROB04, un anticuerpo humano anti-ROB04, y similares.

En la presente invención, el "fragmento funcional del anticuerpo" significa un fragmento de anticuerpo que ejerce al menos una de las funciones, por ejemplo la afinidad enlazante (valor KD) del anticuerpo original. Ejemplos del "fragmento funcional del anticuerpo" pueden incluir, pero no limitarse a, Fab, F(ab')2, scFv, Fab', inmunoglobulina de cadena única, y similares. Tal fragmento funcional del anticuerpo puede obtenerse mediante el tratamiento de una molécula de longitud plena de la proteína del anticuerpo con un enzima tal como papaína o pepsina o puede ser una proteína recombinante producida en una célula hospedera apropiada que usa un gen recombinante. Los "fragmentos funcionales" preferidos también tienen al menos una de las actividades biológicas del anticuerpo original. Además, en el contexto de la presente invención, una secuencia de nucleótido que codifica "la secuencia parcial de aminoácidos" de la cadena pesada o ligera es o incluye una secuencia de nucleótido que codifica un "fragmento funcional del anticuerpo" tal como se ha definido antes en la presente.

En la presente invención, el "sitio" al cual se enlaza un anticuerpo, es decir, el "sitio" reconocido por un anticuerpo, significa un péptido parcial o una conformación parcial de un antígeno enlazado o reconocido por el anticuerpo. En la presente invención, tal sitio también se llama un epítopo o un sitio de enlazamiento de anticuerpo.

Ejemplos del sitio en la proteína R0B04 enlazado reconocida por el anticuerpo anti-R0B04 de la presente invención puede incluir un péptido parcial o una conformación parcial sobre la proteína R0B04.

Las cadenas pesada y ligera de una molécula de anticuerpo se conocen por tener, cada una, tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) . Las regiones determinantes de complementariedad también se llaman dominios hipervariables . Están localizadas en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo. Estos sitios tienen una estructura primaria particularmente muy variable y usualmente están separados en tres posiciones sobre las estructuras primarias respectivas de las hebras de polipéptido de cadenas pesada y ligera. En la presente invención, las regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo son referidas como CDRH1 , CDRH2 , y CDRH3 del extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada amino y como CDRL1, CDRL2 , y CDRL3 del extremo amino de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera en cuanto a las regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera. Estos sitios están próximos entre sí sobre la estructura tridimensional y determinan especificidad por el antígeno que va enlazarse.

En la presente invención, el "muíante anticuerpo" significa un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo original mediante sustitución, supresión, adhesión y/o inserción (en lo sucesivo, son referidas como "mutación") de aminoácido (s) y se enlaza a la proteina R0B04 de la presente invención. El número de aminoácidos multados en tal anticuerpo imitante es l a 2, l a 3, l a 4, l a 5, 1 a 6, l a 7, 1 a 8, 1 a 9, 1 a 10, 1 a 12, 1 a 15, 1 a 20, 1 a 25, 1 a 30, 1 a 40, o 1 a 50. Tal mutante anticuerpo también está comprendido por el "anticuerpo" de la presente invención.

En la presente invención, el término "varios" en "1 a varios" se refiere a 2 a 10, preferiblemente 2 a 8, más preferiblemente 2.

Ejemplos de actividades o propiedades ejercidas por el anticuerpo de la presente invención pueden incluir actividades biológicas o propiedades físico-químicas y pueden incluir específicamente diversas actividades biológicas, una actividad enlazante contra un antígeno o un epítopo, estabilidad durante la producción del almacenamiento y estabilidad térmica.

En la presente invención, la frase "que híbrida en condiciones severas" significa hibridación en condiciones que involucran hibridación a 65 °C en una solución que contiene 5 x SSC, seguida de lavado a 65 °C durante 20 minutos en una solución acuosa que contiene 2 x SSC-O.l % SDS, a 65°C durante 20 minutos en una solución acuosa que contiene 0.5 x SSC-O.l % SDS, y a 65°C durante 20 minutos en una solución acuosa que contiene 0.2 x SSC-O.l % SDS, o hibridación en condiciones equivalentes a éstas. SSC significa una solución acuosa de NaCI de 150 mM - citrato de sodio de 15 mM, y n x SSC significa SSC con una concentración multiplicada por n. 2. Proteína R0B04 En la presente descripción, los términos "ROB04" y "proteína ROB04" se usan significando lo mismo. (2-1) Propiedad La proteína ROB04 de la presente invención tiene las siguientes propiedades: (i) R0B04 tiene un peso molecular de aproximadamente 110 kDa y una estructura de transmembrana de paso único y es una proteína receptora de la proteína SLIT2 que participa en la angiogénesis . Cualquier proteína R0B04 de la presente invención puede encontrarse en una forma liberada de una membrana tal como una membrana celular y puede estar en una forma enlazada a una membrana tal como una membrana celular. En este contexto, el peso molecular significa un peso molecular aparente en condiciones no reductoras de SDS-PAGE. La región extracelular N-terminal de R0B04 contiene dos dominios similares a inmunoglobulina (en lo sucesivo, referidos como "dominios similares a Ig") y dos dominios de fibronectina tipo III, mientras que su región intracelular C-C-terminalontiene una región rica en proteína. En la presente descripción, estos dos dominios similares a inmunoglobulina se denominan dominio similar a Ig 1 y dominio similar a Ig 2, respectivamente, del terminal amino. La proteína R0B04 humana consiste en una secuencia de aminoácidos Nos. 28 a 1007 de SEQ ID NO: 2. Los aminoácidos Nos. 1 a 27 de SEQ ID NO: 2 representan una señal secretoria; los aminoácidos Nos. 28 a 467 de la misma representan una región extracelular; los aminoácidos Nos. 46 a 131 de la misma representan el dominio similar a Ig 1; los aminoácidos Nos. 137 a 224 de la misma representan un dominio similar a Ig 2; los aminoácidos Nos. 252 a 340 de la misma representan dominio 1 de fibronectina tipo III; los aminoácidos Nos. 347 a 438 de la misma representan dominio 2 de fibronectina tipo III; los aminoácidos Nos. 468 a 490 de la misma representan una región en la membrana celular; y los aminoácidos Nos. 491 a 1007 de la misma representan una región intracelular . (ii) ROB04 tiene un efecto anti-angiogénesis . En la presente invención, el término "antiangiogénesis" significa que la molécula directa o indirectamente suprime y/o inhibe la angiogénesis por sí misma, en colaboración con otro factor o como un asociado con otro factor. El efecto antiangiogénesis puede evaluarse, por ejemplo, con un efecto supresor sobre el incremento en la permeabilidad vascular, la actividad que promueve la migración celular o la actividad de formación del lumen por VEGF como un índice. (iii) R0B04 comprende una secuencia de aminoácidos descrita en cualquiera de los siguientes (a) a (e) (en lo sucesivo, referida como una "secuencia de aminoácidos de R0B04 " ) , consiste en una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia de aminoácidos de R0B04 , o consiste en la secuencia de aminoácidos de R0B04 : (a) la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 (Figura 14) ; (b) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que exhibe 80% o más, 82% o más, 84% o más, 86% o más, 88% o más, 90% o más, 92% o más, 94% o más, 96% o más, 98% o más, o 99% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 (Figura 14) y exhibe un efecto anti-angiogénesis ; (c) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO : 2 (Figura 14) que tiene una sustitución, supresión, adición o inserción de 1 a 50, 1 a 45, 1 a 40, 1 a 35, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, l a 15, 1 a 10, 1 to 8 , 1 a 6, 1 a 5, l a 4, 1 a 3, 1 o 2, o 1 aminoácidos (s) y suprime la angiogénesis ; (d) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que tiene la supresión de los aminoácidos Nos. 1 a 45 o 1 a 131 y suprime la angiogénesis ; y (e) la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que se codifica por la secuencia de nucleótido de un nucleótido que híbrida en condiciones severas aún nucleótido que tiene una secuencia de nucleótido complementaria a una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 (Figura 14) y suprime angiogénesis .

La proteína R0B04 puede estar presente como toda o como una porción de un homo- o hetero- oligo asociado constituido por dos o más subunidades .

La secuencia de aminoácidos y/u otras propiedades de la proteína ROB04 pueden no ser las mismas ni homogéneas en un individuo, un tejido, un fluido corporal, una célula, una fracción que contiene proteína ROB04 , una preparación de proteína R0B04 purificada o parcialmente purificada, o similares, o entre una pluralidad de individuos, tejidos, células, fracciones que contienen proteína R0B04 , o preparaciones de proteína R0B04. Un individuo, tejido, fluido corporal, célula, fracción que contiene proteína ROB04 , preparación de proteína ROB04 purificada o parcialmente purificada, o similares pueden contener tipos plurales de proteína ROB04 que difieren en la secuencia y/o propiedad de aminoácidos. De modo alternativo, una pluralidad de individuos, tejidos, células, fracciones que contienen proteína ROB04, o preparaciones de proteína R0B04 pueden diferir en la secuencia de aminoácidos y/u otras propiedades de la proteína R0B0 . Incluso aquellas proteínas que difieren en la secuencia de aminoácidos y/o las propiedades una de otra, están incluidas por el término "proteína R0B04 " de la presente invención en tanto posean las propiedades descritas previamente en (i) a (iii) . (iv) La proteína R0B04 de la presente invención puede obtenerse a partir del tejido de un vertebrado, preferiblemente mamífero, más preferiblemente un roedor tal como un ratón o una rata, o un humano, incluso más preferiblemente tejidos de un humano o un ratón, células derivadas de un tejido de este tipo, cultivos de células de este tipo y similares. Un tejido y las células de este tipo no se limitan particularmente en tanto contengan la proteína ROB04. Ejemplos de los mismos pueden incluir tejidos de articulación, sangre, linfa, glándula timo, bazo y células derivadas de cualquiera de estos. Tejidos y células preferidas son tejidos y células que se derivan de animales o de pacientes que tienenangiogénesis . Sin embargo, el origen de la proteína R0B04 de la presente invención no se limita a aquellos descritos previamente, y se pretende que la proteína ROB04 de la presente invención incluye incluso proteínas R0B04 derivadas de otras especies animales, otros tejidos, otras células o similares, en tanto posean las propiedades descritas previamente en (i) a (iii) .

La proteína R0B04 de la presente invención puede ser cualquiera de las proteínas nativas y recombinante . Se pretende que la proteína R0B04 también incluya productos de fusión con otro péptido o proteína tal como un soporte o una etiqueta. La proteína R0B04 significa además que incluye formas proporcionadas con modificación química que incluyen la adición de un polímero tal como PEG y/o con modificación biológica que incluye modificación de cadena de azúcar. Además, se pretende que la proteína R0B04 de la presente invención incluya un fragmento de proteína R0B04. Un fragmento de proteína ROB04 que posee la propiedad descrita previamente en (ii) se llama un fragmento funcional de la proteína R0B04. (2-2) Gen ROB04 El gen ROB04 de la presente invención comprende una secuencia de nucleótido descrita en cualquiera de los siguientes (a) a (c) (en lo sucesivo, referido como "una secuencia de gen ROB04" ), consiste en una secuencia de nucleótido que comprende el gen ROB04 , o consiste en la secuencia del gen R0B04 : (a) la secuencia de nucleótido representada por SEQ ID NO: 1 (Figura 13) ; (b) una secuencia de nucleótido que se híbrida en condiciones severas a un nucleótido consistente en una secuencia de nucleótido complementaria a la secuencia de nucleótido representada por SEQ ID NO: 1 (Figura 13) y codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que suprime la angiogénesis ; y (c) una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido representada por SEQ ID NO: 1 (Figura 13) que tiene una sustitución, supresión, adición o inserción de 1 a 150, 1 a 140, 1 a 130, 1 a 120, 1 a 110, 1 a 100, 1 a 90, 1 a 80, 1 a 70, l a 60, 1 a 50, 1 a 45, l a 40, 1 a 30, 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10, 1 a 8, 1 a 6, 1 a 5, 1 a 4, l a 3, 1 o 2, o 1 base(s) y codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que suprime la angiogénesis.

El gen ROB04 se sobre-expresa en vasos sanguíneos en membranas fibrovasculares o vasos intratumorales de pacientes con una enfermedad acompañada por angiogénesis, por ejemplo, retinopatía diabética proliferativa . Adicionalmente, el gen R0B04 parece sobre-expresarse en fracciones de tejidos sangre derivados de pacientes afectados con una enfermedad que involucra angiogénesis, tal como degeneración macular exudativa asociada a edad, edema macular, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechace inmune de un trasplante de tejido de córnea o trasplantes de otros tejidos, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, sepsis, u obesidad, o de animales modelos de estas enfermedades.

La expresión y el nivel de expresión del gen R0B04 puede ensayarse con cualquiera de un producto de transcripción del gen R0B04 y la proteína R0B04 como un índice y puede determinarse mediante RT-PCR, hibridación de Northern blot, o similares para el índice superior y mediante inmuno-ensayo (por ejemplo, ensayo por inmuno-absorción ligado a enzimas; en lo sucesivo, referido como "ELISA") o similares para el último índice. (2-3) Preparación de proteína La proteína R0B04 de la presente invención puede purificarse o aislarse a partir de tejidos animales (que incluyen fluidos corporales) , células derivadas de los tejidos o cultivo de las células y preparadas mediante recombinación de genes, traducción in vi ro, síntesis química, etc. (2-3-1) Purificación o aislamiento de R0B04 nativo La proteína ROB04 nativa puede purificarse o aislarse a partir de, por ejemplo, tejidos (incluidos fluidos celulares, células, etc.) derivados de pacientes o animales no humanos afectados con una enfermedad angiogénica tal como una degeneración macular exudativa asociada a edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, aterosclerosis, fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa , glaucoma neovascular, rechazo inmune de un trasplante de tejido de córnea o trasplantes de otros tejidos, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, sepsis, u obesidad, células derivadas de los tejidos, o cultivos de las células. Tales animales no humanos también incluyen animales modelos de estas enfermedades. Los animales sujetos a preparación modelo no están particularmente limitados, en tanto sean vertebrados. Los animales son preferiblemente mamíferos, más preferiblemente roedores tales como ratones o ratas, incluso más preferiblemente de ratones o ratas. Los tejidos y células de tales pacientes o animales modelo no están particularmente limitados en tanto contengan la proteína R0B04. Ejemplos de estos pueden incluir tejidos de articulaciones, sangre, linfa, glándulas timo, bazo y células derivadas de cualquiera de estos. Tejidos y células preferidos se derivan de pacientes o animales modelos que tienen angiogénesis puede exhiben síntomas similares. Sin embargo, el origen de la proteína ROB04 de la presente invención no se limita a aquellos descritos previamente, y la proteína ROB04 de la presente invención puede derivarse de otras especies animales, otros tejidos, otras células, o similares .

La purificación o aislamiento de tales tejidos, células, cultivos celulares o similares puede realizarse mediante la combinación de estrategias bien conocidas por aquellos versados en la materia, tal como fraccionamiento y cromatografía. Tales estrategias incluyen, pero no se limitan a, precipitación salina, filtración con gel, cromatografía por intercambio iónico, cromatografía por afinidad, cromatografía hidrófuga, cromatografía en fase normal o en fase inversa, y similares. Un gel de afinidad, reticulado con un anticuerpo monoclonal anti-R0B04 puede prepararse y cargarse en una columna para de esta manera preparar una columna para cromatografía por afinidad. Una fracción cruda o parcialmente purificada que contiene la proteína R0B04 se adiciona a tal columna. A continuación, se retira materia adsorbida no específica con solución salina amortiguada con fosfato, esterilizada (PBS) , y una solución amortiguadora para elución puede adicionarse luego a esta para que de esta manera se recoja selectivamente la proteína R0B04. La solución que contiene la proteína R0B04 puede someterse a filtración con gel o a reemplazo de un amortiguador y/o concentración usando un concentrador tal como Centriprep. (2-3-2) Preparación de proteína R0B04 recombinante La proteína ROB04 de la presente invención también puede prepararse en una forma recombinante. Específicamente se transfectan células hospederas con un gen que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína R0B04 o un fragmento de proteína R0B04, y la proteína R0B04 puede recogerse de cultivos de las células. Por ejemplo, el gen ROB04 o su fragmento se inserta en un vector de expresión. A continuación, se transfectan células hospederas procariotas o eucariotas con el vector recombinante resultante, y las células recombinantes obtenidas pueden incubarse para de esta manera expresar la proteína R0B04. Puede usarse un patrón de expresión conocido en la técnica, tal como la expresión de secreción, expresión intracelular de formas solubles, o un método de cuerpo de inclusión. La proteína ROB04 también puede expresarse no solamente como una molécula que tiene el mismo terminal amino (N-terminal) y/o C-terminalarboxi (C-terminal) que las nativas, sino que también la de una proteína de fusión con una señal secretoria, una señal de localización intracelular, una etiqueta para purificación por afinidad, o un péptido asociado. La proteína ROB04 puede purificarse o aislarse a partir de tales cultivos de células recombinantes mediante la combinación apropiada de operaciones tales como fraccionamiento y cromatografía descritos en (2-3-1) Purificación o aislamiento de proteína R0B04 nativa.

El gen R0B04 o su fragmento pueden prepararse mediante un método bien conocido por aquellos versados en la materia.

Ejemplos de esto pueden incluir: reacción en cadena de polimerasa (en lo sucesivo, referido como "PCR"; Saiki, R.K., et al., Science (1988) 239, p. 487-489) con una librería de expresión de ADNc de ROB04 como plantilla que usa un conjunto de cebadores capaces de amplificar específicamente la secuencia; PCR de transcripción inversa (en lo sucesivo referido como "RT-PCR") con una fracción de ARNm para expresión de ROB04 como una plantilla que usa un cebador capaz de transcripción inversa de la secuencia y conjunto de cebadores capaces de amplificar específicamente la secuencia; clonación de expresión usando inmuno-ensayo; y clonación de ADNc usando la secuencia de aminoácidos parcial de una proteína R0B04 purificada. (2-3-3) Traducción in-vitro La proteína R0B04 de la presente invención también puede prepararse mediante traducción in vitro. Tal método de traducción no se limita particularmente en tanto sea un método que usa un sistema de traducción libre de células que involucra enzimas necesarias para transcripción y traducción, sustratos y sustancias de energía. Ejemplos de esto pueden incluir un método que usa Sistema de Traducción Rápida (RTS por Rapid Translation System) fabricado por Roche Diagnostics. (2-3-4) Síntesis química La proteína R0B04 de la presente invención también puede prepararse mediante síntesis química. Ejemplos del método de síntesis química pueden incluir método de síntesis de péptido en fase sólida, tales como síntesis Fmoc y métodos de síntesis Boc . 3. Anticuerpo anti-R0B04 (3-1) Tipo de anticuerpo anti-R0B04 El anticuerpo de la presente invención puede ser cualquiera de los anticuerpos monoclonales o policlonales . Ejemplos del anticuerpo monoclonal de la presente invención pueden incluir un anticuerpo derivado de animal no humano (anticuerpo animal no humano) , un anticuerpo derivado de humano (anticuerpo humano) , un anticuerpo quimérico, y un anticuerpo humanizado, preferiblemente un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo derivado de humano (anticuerpo humano) , más preferiblemente un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo derivado de humano (anticuerpo humano) .

Ejemplos del anticuerpo animal no humano puede incluir anticuerpos derivados de vertebrados tales como mamíferos y aves. Ejemplos del anticuerpo derivado de mamífero puede incluir anticuerpos derivados de roedores tales como anticuerpos de ratón y anticuerpos de rata. Ejemplos de anticuerpo derivado de ave pueden incluir anticuerpos de gallina.

Ejemplos del anticuerpo quimérico pueden incluir, pero no limitarse a, un anticuerpo que comprende regiones variables derivadas de anticuerpo animal no humano, enlazadas con regiones constantes de anticuerpo humano ( inmunoglobulina humana) . Ejemplos de las regiones variables derivadas de anticuerpo animal no humano pueden incluir regiones variables de cadena pesada y ligera derivadas de MAb 1, que serán descritas más adelante.

Ejemplos del anticuerpo humanizado pueden incluir, pero no limitarse a, un anticuerpo humano (regiones variables de inmunoglobulina humana) injertado con CDRs en las regiones variables de un anticuerpo animal no humano, un anticuerpo humano injertado con los CDRs como también con secuencias parciales de regiones de armazón de un anticuerpo animal no humano, y un anticuerpo que tiene aminoácido (s) de anticuerpo humano reemplazado (s) por uno o dos o más aminoácido (s) derivado (s) de anticuerpo animal no humano en cualquiera de estos anticuerpos humanizados. Ejemplos de los CDRs en las regiones variables de un anticuerpo animal no humano pueden incluir CDRH1 a 3 en la región variable de cadena pesada y CDRL1 a 3 en la región variable de cadena ligera derivada de MAb 1 que se describe más adelante.

El anticuerpo humano no se limita particularmente en tanto que sea un anticuerpo que reconoce el antígeno de la presente invención. Ejemplos de esto pueden incluir un anticuerpo humano que se enlaza al mismo sitio en el que es enlazado por un anticuerpo que tiene los CDRs de anticuerpo de la presente invención, y un anticuerpo humano que se enlaza al mismo sitio sobre ROB04 que el enlazado por MAbl que se describe más adelante .

El anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede ser un anticuerpo constituido por sitios derivados de una pluralidad de diferentes anticuerpos. Ejemplos de esto pueden incluir un anticuerpo que comprende cadenas pesadas y/o ligeras intercambiadas entre una pluralidad de anticuerpos diferentes, un anticuerpo que comprende cadenas pesadas y/o ligeras de longitud completa intercambiadas entre sí, un anticuerpo que comprende regiones variables o constantes intercambiadas entre sí, y un anticuerpo que comprende todos o algunos CDRs intercambiados entre sí. Las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo quimérico pueden derivarse de diferentes anticuerpos de la presente invención. CDRH1 a 3 y CDRL1 a 3 en las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo humanizado pueden derivarse de dos o más anticuerpos diferentes de la presente invención. CDRH1 a 3 y CDRL1 a 3 en las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo humano puede ser la combinación de CDRs llevada a cabo por dos o más anticuerpos diferentes de la presente invención.

El isotipo del anticuerpo monoclonal de la presente invención no se limita particularmente y sus ejemplos pueden incluir IgG tal como IgGl, IgG2 , IgG3 , e IgG4 , IgM, IgA tal como IgAl e IgA2 , IgD, e IgE y puede incluir preferiblemente IgG e IgM, más preferiblemente IgG2. El isotipo y la subclase del anticuerpo monoclonal puede determinarse mediante, por ejemplo, un ensayo de Ouchterlony, ELISA, inmunoensayo de radio (en lo sucesivo, referido como "RIA"). Puede usarse un kit comercialmente disponible para identificación (Mouse Typer Kit, fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc., KIT DE ENSAYO DE ISOTIPIFICACIÓN DE ANTICUERPO MONOCLONAL DE RATA fabricado por AbD Serotec, etc.) . (3-2) Especificidad de enlace de anticuerpo anti-R0B04 El anticuerpo de la presente invención reconoce la proteína R0B04. En otras palabras, el anticuerpo de la presente invención se enlaza a la proteína R0B04. Un anticuerpo de este tipo es llamado "anticuerpo anti-R0B04". Además, el anticuerpo preferible de la presente invención específicamente reconoce la proteína R0B04. En otras palabras, el anticuerpo preferible de la presente invención se enlaza específicamente a la proteína R0B04. Además, el anticuerpo más preferible de la presente invención se enlaza específicamente a un dominio similar a Ig soportado por la proteína ROB04. Ejemplo de un dominio de este tipo, similar a Ig puede incluir un dominio 1 similar a Ig y un dominio 2 similar a Ig. El anticuerpo más preferible de la presente invención reconoce una región consistente en una secuencia de aminoácidos Nos. 132 a 209 de SEQ ID NO: 2. El anticuerpo de la presente invención se enlaza a una proteína ROB04 humano, una proteína ROB04 de mono, preferiblemente mono cynomolgus, y una proteína R0B04 de conejo, pero no se enlaza a proteínas R0B04 de ratón y de rata (reactividad entre especies en el ejemplo 4) -3 y ejemplo 11) -4) .

En la presente invención, el "reconocimiento específico", es decir, "enlazamiento específico", significa un enlazamiento que no es adsorción no específica. Ejemplo de criterios para determinación si el enlazamiento es específico o no pueden incluir una constante de disociación (en lo sucesivo, denominada "KD"). El anticuerpo preferible en de la presente invención tiene un valor de KD de 1 x 10"5 o más bajo, 5 x 10"6 o más bajo, 2 x 10~6 o más bajo, o 1 x 10~6 o más bajo, más preferiblemente 5 x 10-7 o más bajo, 2 x 10"7 o más bajo, o 1 x 10~7 o más bajo, incluso más preferiblemente 5 x 10"8 o más bajo, 2 x 10~8 o más bajo, o 1 x 10~8 o más bajo, aún más preferiblemente 5 x 10"9 o más bajo, 2 x 10"9 o más bajo, o 1 x 10"9 o más bajo, lo más preferiblemente 5 X 10~10 o más bajo, 2 x 10"10 o más bajo, o lxlO"10 o más bajo para la proteína ROB0 . Más específicamente, el anticuerpo preferible de la presente invención tiene un valor KD de 2x 10"8 o más bajo, más preferiblemente lx 10"8 o más bajo, incluso más preferiblemente 5x 10"9 o más bajo para la proteína R0B04.

En la presente invención, el enlazamiento del anticuerpo al antígeno puede ensayarse o determinarse mediante ELISA, RIA, análisis por resonancia plasmónica de superficie (en lo sucesivo, referida como "SPR" por surface plasmon resonance) , o similares. Ejemplos de equipo usado en el análisis de SPR pueden incluir BIAcore (TM) (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Crop.), ProteOn (TM) (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.), SPR-Navi (TM) (fabricado por BioNavis Oy Ltd.), Spreeta(TM) (fabricado por Texas Instruments Inc.), SPRi-PlexII (TM) (fabricado por Horiba, Ltd.), y Autolab SPR(TM) (fabricado por Metrohm) . El enlazamiento del anticuerpo al antígeno expresado sobre la superficie celular puede ensayarse mediante citometría de flujo o similares. (3-3) Actividad anti-angiogénesis ??-vitro del anticuerpo anti-R0B04 El anticuerpo de la presente invención tiene una actividad anti-angiogénesis en ausencia de un anticuerpo de enlace cruzado in vitro. Se sabe que ciertos anticuerpos no exhiben una actividad farmacológica en ausencia del anticuerpo de enlace cruzado in vitro, pero exhiben una actividad farmacológica en ausencia del anticuerpo de enlace cruzado in vivo (Cáncer Cell (2011), 19, p. 101-113). Esto es probablemente debido a que los leucocitos se encuentran in vivo para expresar receptor de Fcy que tiene las mismas funciones que aquellas del anticuerpo de enlace cruzado (Nature (2008), 8, p. 34-47); de esta manera, los anticuerpos exhiben una actividad farmacológica mediante enlace cruzado en presencia de leucocitos incluso sin el anticuerpo de enlace cruzado. En organismos verdaderos, sin embargo, el número de leucocitos en lesiones difieren entre individuos (Cáncer Res (2011) , 71, 5670-5677) , presumiblemente dando lugar, entre individuos, a los diferentes efectos de los anticuerpos que exhiben una actividad farmacológica dependiente de enlace cruzado inducido por leucocitos. El anticuerpo de la presente invención exhibe una excelente actividad anti-angiogénesis incluso en ausencia de un anticuerpo de enlace cruzado in vitro. De esta manera, el anticuerpo de la presente invención también puede tener un efecto anti-angiogénesis independiente del número de leucocitos in vivo y de esta manera es farmacéuticamente adecuado .

La actividad anti-angiogénesis significa la actividad de suprimir crecimiento, migración, de células endoteliales vasculares, formación de lumen, etc.. La actividad anti-angiogénesis in vitro puede evaluarse mediante una permeabilidad vascular, migración celular endotelial vascular, un ensayo de formación de lumen.

Por ejemplo, el ensayo de permeabilidad vascular para tal evaluación puede involucrar inocular una célula endotelial de vena umbilical humana normal (HUVEC) a la capa superior de la cámara de Boyden que tiene un tamaño de poro de 1 µp? para formar una capa única y luego medir la cantidad de dextrano etiquetado con FITC o similares que permean a través de la capa celular. La cantidad de dextrano etiquetado con FITC que permean a través de la capa celular pueden medirse usando, por ejemplo, el ensayo de permeabilidad vascular in vitro (Cat. ECM640, fabricado por Millipore Corp.). Cuando el anticuerpo adicionado a una concentración de 5 µg/mililitro o más baja exhibe el efecto de suprimir la cantidad de dextrano etiquetado con FITC que permea a través de la capa celular, este anticuerpo puede evaluarse con el resultado de que tiene un efecto supresor sobre la permeabilidad vascular y que tiene una actividad anti-angiogénesis . El anticuerpo de la presente invención exhibe una actividad supresora contra la permeabilidad vascular a una concentración preferiblemente de 5 µ9/????1??^? o más baja, más preferiblemente 1 g/mililitro o más baja, particularmente preferible 0.5 g/mililitro o más baja en condiciones de medición que ya se han descrito en la presente.

El ensayo de migración celular para tal evaluación puede involucrar inocular HUVEC a la capa superior de la cámara de Boyden que tiene un tamaño de poro de 3 a 8 µ??, adicionar un medio que contiene un promotor de migración celular endotelial, tal como VEGF a la capa inferior, y medir el número de células que migran a la capa inferior. Cuando el anticuerpo exhibe el efecto de disminuir el número de células migrantes de HUVEC, este anticuerpo puede evaluarse con el resultado que tiene un efecto supresor sobre la migración celular endotelial vascular y tiene una actividad anti-angiogénesis. El número de células migrantes puede medirse usando, por ejemplo, el sistema de ensayo de migración de células endoteliales vasculares (Cat. 354143, fabricado por BD Biosciences) . El anticuerpo de la presente invención exhibe una actividad supresora contra la migración celular a una concentración preferiblemente de 5 ug/mililitros o más baja, más preferiblemente de 1 pg/mililitro o más baja, particularmente preferible de 0.5 µg/mililitro o más baja, en condiciones de medición descritas previamente.

El ensayo de formación de lumen para tal evaluación puede involucrar inocular HUVEC a un contenedor de cultivo celular recubierto con Matrigel y medir el número de puntos de ramificación, longitud del tubo, o similares, de una estructura del lumen formada por HUVEC sobre el Matrigel . Cuando el anticuerpo exhibe el efecto de disminuir el número de puntos de ramificación o longitud del tubo de la estructura de lumen, este anticuerpo puede evaluarse con el resultado que tiene un efecto supresor sobre la formación de lumen y que tiene una actividad anti-angiogénesis . El número de puntos de ramificación o longitud del tubo de la estructura del lumen puede medirse usando, por ejemplo, el sistema de ensayo de formación de tubo celular endotelial vascular (Cat. 354149, fabricado por BD Biosciences) . El anticuerpo de la presente invención exhibe una actividad supresora contra la formación de lumen a una concentración preferiblemente de 5 ug/mililitro o más baja, más preferiblemente de 1 ug/mililitro o más baja, particularmente preferible 0.5 ug/mililitro o más baja, en las condiciones de medición descritas previamente.

Un sistema de ensayo de este tipo, sin embargo, no se limita a estos ensayos mientras sea capaz de ensayar la angiogénesis y su supresión inducida por la proteína R0B04. El anticuerpo de enlace cruzado significa un anticuerpo que se enlaza a la región Fe del anticuerpo de la presente invención y actúa para enlazar de modo cruzado dos o más moléculas de anticuerpo de la presente invención. Por ejemplo, cuando la región Fe del anticuerpo de la presente invención se deriva de un ratón, el anticuerpo de enlace cruzado se refiere a un anticuerpo que se enlaza a la región Fe de ratón y asocia dos o más moléculas de anticuerpo de la presente invención mediante el enlace de estas dos moléculas de anticuerpo de la presente invención en dos sitios de enlazamiento, respectivamente, del anticuerpo de enlace cruzado .

La frase "que tiene una actividad anti-angiogénesis en ausencia de un anticuerpo de enlace cruzado" significa que el anticuerpo exhibe un efecto anti -angiogénesis en un sistema de evaluación que se refiere a la supresión de angiogénesis, por ejemplo, el sistema de evaluación descrito previamente, incluso sin coexistir con un anticuerpo de enlace cruzado.

La frase "que tiene una actividad anti-angiogénesis en presencia de un anticuerpo de enlace cruzado" significa que el anticuerpo no exhibe una actividad anti-angiogénesis en ausencia de un anticuerpo de enlace cruzado en un sistema de evaluación que se relaciona con la angiogénesis, por ejemplo, el sistema de evaluación de actividad anti-angiogénesis descrito previamente, sino que exhibe la actividad anti-angiogénesis cuando coexisten con una o más moléculas de anticuerpo de enlace cruzado, preferiblemente dos o más moléculas de anticuerpo de enlace cruzado, con respecto a una molécula de anticuerpo de la presente invención. (3-4) Actividad supresora o inhibidora in-vivo del anticuerpo anti-R0B04 contra la angiogénesis El anticuerpo de la presente invención suprime o inhibe angiogénesis in vivo. La actividad supresora o inhibidora in vivo contra angiogénesis puede evaluarse con modelos de enfermedad animal de acuerdo con un método estándar. Por ejemplo, los modelos de neovascularización coroidal inducida por láser, que se describen más adelante en el ejemplo 4) -6, se usan ampliamente como modelos de enfermedad de angiogénesis y pueden usarse en evaluación con la cantidad de vasos sanguíneos recién formados como un puntaje. También el caso de pacientes, por ejemplo, se recogen muestras de tumor mediante biopsia de pacientes con tumor antes y después de la administración del anticuerpo de la presente invención, y pueden medirse las densidades vasculares de sus vasos interactúales mediante análisis inmuno-histo-químicos (IHC por immunohistochemical analysis) para darle un puntaje a la cantidad de vasos sanguíneos recién formados. (3-5) Activación de señal descendente por el anticuerpo anti-R0B04 El anticuerpo anti-R0B04 de la presente invención puede someterse a un sistema de evaluación que usa una línea celular o células cultivadas primarias que exhiben alguna respuesta inducida a la proteína R0B04. Ejemplos de una línea celular de este tipo pueden incluir una línea celular endotelial vascular de ratón (ATCC NO. CRL-2779) . Ejemplos de células cultivadas primarias pueden incluir células endoteliales vasculares de ratón y células endoteliales vasculares humanas .

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo agonístico contra R0B04. Específicamente, el anticuerpo de la presente invención se enlaza a R0B04 y activa la señal descendente deROB04. De esta manera, el efecto anti-angiogénesis del anticuerpo de la presente invención puede evaluarse con la activación de la señal descendente de R0B04 como un índice. Ejemplos de la señal descendente de R0B04 pueden incluir una actividad promotora de IL-8. La actividad promotora de IL-8 se incrementó drásticamente en las células que expresan ROB04 humano de longitud completa en comparación con las células que expresan R0B04 no humano y difícilmente se observó en las células que expresan R0B04 humano con dominio intracelular suprimido. De esta manera, el incremento en la actividad promotora de IL-8 demostró que la activación de la señal de R0B04 fue detectada (Ejemplo 3) . La actividad promotora de IL-8 puede evaluarse, por ejemplo, mediante la adición del anticuerpo anti-R0B04 o la co-adición del anticuerpo anti-R0B04 y un anticuerpo de enlace cruzado a células transfectadas con un vector reportero que tiene un inserto de secuencia promotora de IL-8 y plásmidos de expresión de R0B04 humano, seguido por la determinación de la actividad reportera. (3-6) El anticuerpo anti-R0B04 monoclonal de ratón y el anticuerpo quimérico MAbl es un anticuerpo anti-R0B04 monoclonal de ratón obtenido mediante un método descrito en el ejemplo 2.

La secuencia de nucleótido de ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de MAbl se muestra en SEQ ID NO: 30 (Figura 15) , y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 31 (Figura 16) . La secuencia de aminoácidos de CDR Hl se muestra en SEQ ID NO: 44 (Figura 25); la secuencia de aminoácidos of CDRH2 se muestra en SEQ ID NO: 46 (Figura 26) ; y la secuencia de aminoácidos de CDRH3 se muestra en SEQ ID NO: 48 (Figura 27) . La secuencia de nucleótido de ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de MAbl se muestra en SEQ ID NO: 32 (Figura 17) , y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 33 (Figura 18) . La secuencia de aminoácidos de CDRL1 se muestra en SEQ ID NO: 50 (Figura 28) ; la secuencia de aminoácidos de CDRL2 se muestra en SEQ ID NO: 52 (Figura 29); y la secuencia de aminoácidos de CDRL3 se muestra en SEQ ID NO: 54 (Figura 30) .

El anticuerpo mutante de la presente invención, preferiblemente, exhibe una sensibilidad reducida a la degradación u oxidación de proteína, una actividad biológica mejorada, una capacidad mejorada para enlazarse al antígeno, o propiedades físico químicas o funcionales impartidas al mismo, o similares. Ejemplos de un anticuerpo mutante de este tipo pueden incluir un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo original mediante sustitución conservadora de aminoácidos. La sustitución conservadora de aminoácidos es una sustitución que ocurre en un grupo de aminoácidos relacionado con cadenas laterales de aminoácidos.

Grupos preferidos de aminoácidos son tal como sigue: un grupo ácido que involucra ácido aspártico y ácido glutámico; un grupo básico que involucra lisina, arginina e histidina; un grupo no polar que involucra alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano; y una familia polar no cargada que involucra glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina. Otros grupos preferidos de aminoácidos son tal como sigue: un grupo hidroxi alifático que involucra serina y treonina; un grupo que contiene amida que involucra asparagina y glutamina; un grupo alifático que involucra alanina, valina, leucina e isoleucina; y grupo aromático que involucra fenilalanina, triptófano y tirosina. Una sustitución de aminoácidos de este tipo en el anticuerpo mutante se realiza preferiblemente sin reducir la actividad de enlazamiento a antígeno del anticuerpo original.

Un anticuerpo mutante que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de MAbl de la presente invención mediante sustitución conservadora de aminoácidos como también un anticuerpo de ratón, un anticuerpo de rata, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o similares que comprenden una secuencia de aminoácidos CDR derivada de la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los CDRH1 a 3 y CDRL1 a 3 derivados de MAbl mediante mutación conservadora de aminoácidos también está comprendido por la presente invención.

Las regiones constantes del anticuerpo de la presente invención no están limitadas de modo particular. Preferiblemente se usan aquellas derivadas de un anticuerpo humano en el anticuerpo de la presente invención para el tratamiento o prevención de una enfermedad en un humano. Ejemplos de la región constante de cadena pesada del anticuerpo humano pueden incluir Cyl, Cy2 , Cy3 , Cy4 , ?µ, C5, Cal, Ca2 , y Ce. Ejemplos de la región constante de cadena ligera del anticuerpo humano puede incluir CK y C .

Una secuencia de nucleótido que codifica la cadena ligera que contiene la señal secretoria de cMAbl-1 ejemplificada como el anticuerpo quimérico tipo IgGl humano-ratón de la presente invención y su secuencia de aminoácidos así como también una secuencia de nucleótido que codifica la cadena pesada de la misma y su secuencia de aminoácidos se muestran en SEQ ID NOs: 37, 38, 39, y 40 (Figuras 19, 20, 21, y 22), respectivamente. Asimismo, una secuencia de nucleótido que codifica la cadena ligera que contiene señal secretoria de cMAbl-2 ejemplificada como el anticuerpo quimérico del tipo IgG2 ratón-humano de la presente invención secuencia de aminoácidos así como también una secuencia de nucleótidos codifica la cadena pesada de la misma y su secuencia de aminoácidos se muestran en SEQ ID NOs: 37, 38, 41, y 42 (Figuras 19, 20, 23, y 24), respectivamente. (3-7) Fragmento funcional de anticuerpo anti-R0B04 De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un fragmento funcional del anticuerpo anti-R0B04 de la presente invención. El fragmento funcional del anticuerpo significa un fragmento que mantiene al menos una porción de las funciones del anticuerpo, o una forma modificada del mismo descrita más adelante en (3-10) . Ejemplos de tales funciones del anticuerpo pueden generalmente incluir una actividad enlazante de antígeno, una actividad reguladora de la actividad de antígeno, una actividad citotóxica dependiente de anticuerpo, y una actividad citotóxica dependiente de complemento. Ejemplos de las funciones del anticuerpo antiR0B04 de la presente invención pueden incluir una actividad de enlazamiento de proteína R0B04 , una actividad anti -angiogénesis , y un efecto activador de señal descendente de R0B04. Más específicamente, cualquier fragmento funcional que tiene todas o algunas de las actividades descritas antes (3-3) a (3-5) exhibidas por el anticuerpo contra R0B04 de la presente invención está incluido en el fragmento funcional del anticuerpo de la presente invención.

El fragmento funcional del anticuerpo no está limitado particularmente en tanto sea un fragmento del anticuerpo que mantiene al menos una porción de las actividades del anticuerpo, o una forma modificada del mismo. Ejemplos de esto pueden incluir, pero no limitarse a, Fab, F(ab')2, Fv, Fv (scFv) de cadena única que comprende cadena pesada y ligera Fvs ligada a través de un conector apropiado, diabodies (pequeños fragmentos de anticuerpo, diméricos y bivalentes) , anticuerpos lineales, anticuerpos poliespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo, y Fab', que es un fragmento monovalente de regiones variables de anticuerpo obtenidas mediante el tratamiento de F(ab')2 en condiciones de reducción. Una molécula que contiene un fragmento distinto del fragmento del anticuerpo de la presente invención, como en scFv que porta el fragmento conector, también está comprendida en el significado de fragmento funcional del anticuerpo de la presente invención.

Una molécula que se deriva de la proteína de anticuerpo mediante supresión de 1 a varios o más aminoácidos como su terminal amino y/o C-terminalarboxi y mantiene al menos una porción de las funciones del anticuerpo también está comprendida en el significado del fragmento funcional del anticuerpo de la presente.

El anticuerpo de la presente invención o el fragmento funcional del mismo puede ser un anticuerpo poliespecífico que tiene especificidad por al menos 2 tipos de diferentes antígeno. El anticuerpo poli específico no se limita a un anticuerpo bi- específico el cual se enlaza a 2 tipos de antígenos diferentes, y un anticuerpo que tiene especificidad por 3 o más tipos de antígenos diferentes también está comprendido en el significado del "anticuerpo poli específico" de la presente invención.

El anticuerpo poliespecífico de la presente invención puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento funcional del mismo (por ejemplo, anticuerpo biespecífico F(ab')2). El anticuerpo biespecífico también puede prepararse enlazando la cadena pesada y la cadena ligera (pares HL) de dos tipos de anticuerpos. El anticuerpo biespecífico también puede obtenerse funcionando dos o más tipos de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales para preparar células fusión que producen anticuerpo biespecífico (Millstein et ál., Nature (1983) 305, p. 537-539). El anticuerpo poli específico también puede prepararse de la misma manera que se describió antes .

De acuerdo con un aspecto, el anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de cadena única (Fv de cadena única; en lo sucesivo referida como "scFv") . El scFv se obtiene enlazando las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo mediante un conector de polipéptido (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (La farmacología de anticuerpos monoclonales), 113, ed Rosenburg y Moore, Springer Verlag, Nueva York, p.269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p .1126-1136) . Además, puede usarse bi-scFv que comprende dos scFvs enlazados por medio de un conector de polipéptido como un anticuerpo biespecífico. Además, también puede usarse multi-scFv que comprende tres o más scFvs como un anticuerpo poliespecífico .

La presente invención incluye una inmunoglobulina de cadena única que comprende secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa del anticuerpo enlazado mediante un conector apropiado (Lee, H-S, et . al., Molecular Immunology (1999) 36, p.61-71; Shirrmann, T. et . al., mAbs (2010), 2, (1) p.1-4). Tal inmunoglobulina de cadena única puede dimerizarse para mantener de esta manera una estructura y unas actividades similares a aquellas del anticuerpo el cual originalmente es un tetrámero. El anticuerpo de la presente invención también puede ser un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada única y no tiene secuencia de cadena ligera. Un anticuerpo de este tipo se llama un anticuerpo de dominio único (sdAb) o un nanocuerpo y ha sido reportado para mantener la capacidad de enlazar se al antígeno (Muyldemans S. et . al.. Proteína Eng. (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et . al . ( Nature (1993) 363 (6428) 446-8) . Estos anticuerpos también están comprendidos en el significado del fragmento funcional del anticuerpo de acuerdo con la presente invención. (3-8) Anticuerpo humanizado ROB04 anti-humano (en lo sucesivo "anticuerpo anti-R0B04 humanizado") De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo. El anticuerpo humanizado anti-ROB04 de la presente invención o el fragmento funcional del mismo tiene una actividad anti-angiogénesis in vivo. Preferiblemente, el anticuerpo humanizado o el fragmento funcional del mismo específicamente se enlazan a la proteína ROB04. Además, el anticuerpo humanizado o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo agonístico contra R0B04 y activa su señal descendente. Además, el anticuerpo humanizado o el fragmento funcional del mismo suprimen o inhiben la migración celular endotelial vascular en ausencia de un anticuerpo de enlace cruzado in vitro.

Ejemplos del anticuerpo humanizado de la presente invención pueden incluir un anticuerpo derivado de humano que tiene regiones determinantes de complementariedad de MAbl (CDRs) reemplazadas con las CDRs de un anticuerpo animal no humano (véase Nature (1986) 321, p. 522-525) , y un anticuerpo humano injertado con las secuencias de CDR y con algunos residuos de aminoácidos de la regiones de armazón mediante un método de injerto de CDR (Publicación internacional No. WO90/07861) . Además, una variante derivada del anticuerpo humanizado mediante la sustitución de 1 a 3 residuos de aminoácidos en cada CDR con otros residuos de aminoácidos también se incluye en el anticuerpo de la presente invención mientras que la variante tenga todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5).

Ejemplos preferidos del anticuerpo humanizado anti-R0B04 de la presente invención o del fragmento funcional del mismo pueden incluir un anticuerpo que consiste en una cadena pesada que tiene una región variable que comprende CDRH1 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44 (Figura 25) , CDRH2 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 (Figura 26) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 mediante la sustitución de un aminoácido, y CDRH3 que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 48 (Figura 27) , y una cadena ligera que tiene una región variable que comprende CDRL1 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 50 (Figura 28) o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 mediante la sustitución de 1 a 3 aminoácidos (s) , CDRL2 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 52 (Figura 29) , y CDRL3 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 54 (Figura 30) , y reconoce la proteína ROB04 de la presente invención, y una fracción del anticuerpo que mantiene la actividad enlazante de la proteína R0B04 del anticuerpo.

Ejemplos de la sustitución de aminoácidos en CDRH2 pueden incluir la sustitución del aminoácido representada por el aminoácido No.4 de SEQ ID NO: 46 en CDRH2. Específicamente, una asparagina, aminoácido No.4 de SEQ ID NO: 46, puede reemplazarse con una glutamina. El aminoácido a sustituirse por esta no se limita en tanto que el anticuerpo resultante tenga todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5) exhibidas por el anticuerpo contra R0B04 de la presente invención.

Ejemplos de la sustitución de aminoácido en CDRLI pueden incluir la sustitución de cualesquiera 1 a 3, preferiblemente 3, de los aminoácidoss representados por los aminoácidos Nos. 9, 11, y 13 de SEQ ID NO: 50 en CDRL1. Específicamente, una serina (aminoácido No.9), una glicina (aminoácido No.11) y una treonina (aminoácido No.13) de la SEQ ID NO: 50 puede reemplazarse con una secuencia de aminoácidos seleccionada de un ácido glutámico, una lisina y una leucina, preferiblemente con un ácido glutámico, una lisina y una leucina respectivamente. Los aminoácidos (s) a sustituirse por estos no se limitan en tanto que el anticuerpo resultante tenga todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5) exhibidas por el anticuerpo contra R0B04 de la presente invención.

Se reporta que un residuo de asparagina en péptidos o una proteína se someten fácilmente a la deamidación en algunas condiciones (Gerger et al : The Journal of Biological Chemistry Vol.262 No.2, 785-794, 1987), por lo tanto el reemplazo de aminoácidos en CDRs descrito antes puede incrementar la estabilidad de los anticuerpos humanizados de la presente invención.

Ejemplos de la región variable de cadena pesada del anticuerpo humanizado más preferido que tiene estas CDRHs pueden incluir una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 56 (Figura 32), en cuyo caso CDRH1, CDRH2 y CDRH3 están representados por los aminoácidos Nos. 50 a 54, 69 a 85 y 118 a 126 de la SEQ ID NO: 56 (Figura 32), respectivamente, una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34) , en cuyo caso CDRH1, CDRH2 y CDRH3 están representados por aminoácidos Nos. 50 a 54, 69 a 85 y 118 a 126 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34), respectivamente, una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 60 (Figura 36), en cuyo caso CDRH1, CDRH2 y CDRH3 están representados por aminoácidos Nos. 50 a 54, 69 a 85 y 118 a 126 de SEQ ID NO: 60 (Figura 36) , respectivamente, y una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 to 137 de SEQ ID NO: 62 (Figura 38) , en cuyo caso CDRH1, CDRH2 y CDRH3 están representados por aminoácidos Nos. 50 a 54, 69 a 85 y 118 a 126 de SEQ ID NO: 60 (Figura 38) . Ejemplos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo humanizado más preferido que tiene estos CDRLs pueden incluir una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) , en cuyo caso CDRL1, CDRL2 y CDRL3 están representados por aminoácidos Nos. 44 a 59, 75 a 81 y 114 a 122 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) , respectivamente, y una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42) , en cuyo caso CDRL1, CDRL2 y CDRL3 están representados por aminoácidos Nos. 44 a 59, 75 a 81 y 114 a 122 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42), respectivamente .

Ejemplos de combinaciones más preferibles de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de los anticuerpos humanizados más preferidos pueden incluir: un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO : 58 (Figura 34) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40); un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 to 137 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42); un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 62 (Figura 38) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42); un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 62 (Figura 38) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40); un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 to 137 de SEQ ID NO: 56 (Figura 32) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40); y un anticuerpo humanizado que comprende una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 to 137 de SEQ ID NO: 60 (Figura 36) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) .

Ejemplos aún más preferidos del anticuerpo humanizado de longitud completa que comprende la combinación más preferida de la región variable de cadena pesada y la región variable de pueden incluir: un anticuerpo humanizado (H -1140) que comprende una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40); un anticuerpo humanizado (H-1143) que comprende una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42); un anticuerpo humanizado (H-2143) que comprende una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 to 463 de SEQ ID NO: 62 (Figura 38) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 66 (Figura 42) ; un anticuerpo humanizado (H-2140) que comprende una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 to 463 de SEQ ID NO: 62 (Figura 38) y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) ; un anticuerpo humanizado (H-1040) que comprende una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 56 (Figura 32) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) ; y un anticuerpo humanizado (H-2040) que comprende una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 60 (Figura 36) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (Figura 40) .

Los anticuerpos más preferibles de la presente invención son H -1140, H -1143, H-2140 y H-2143. H-1140 tiene propiedades de 1) enlazarse específicamente a R0B04 humano y no a ROB01, ROB02, y ROB03, 2) tener un valor KD de 3.9nM para R0B04 humano, 3) mantener afinidad al R0B04 humano por debajo de 40°C durante 4 semanas, 4) inhibir migración de HUVEC inducida por uno o más factores angiogénicos seleccionados de VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB y SDF-1, específicamente VEGF o bFGF, 5) inhibir angiogénesis in vivo, y 6) baja inmunogenicidad en cribado de inmunogenicidad con base en Web ISPRI (EpiVax, Inc) .

H-1143 tiene propiedades de 1) enlazarse específicamente a ROB04 humano y no a ROB01, ROB02, y ROB03, 2) tener un valor KD de 3.5nM para ROB04 humano, 3) mantener afinidad a ROB04 humano por debajo de 40°C durante 4 semanas, 4) inhibir migración de HUVEC inducida por uno o más factores angiogénicos seleccionados de VEGF, bFGF, HGF, PDGF-BB y SDF-1, específicamente VEGF y bFGF, 5) inhibir angiogénesis in vivo, y 6) baja inmunogenicidad en ensayos de inmunogenicidad EpiScreen™ (Antitope Ltd.) H-2140 tiene propiedades de 1) enlazarse específicamente a ROB04 humano y no a ROB01, ROB02, y ROB03, 2) tener un valor KD de 1.8nM para ROB04 humano, 3) mantener afinidad a R0B04 humano por debajo de 40°C durante 4 semanas, 4) inhibir migración de HUVEC inhibida por diversos factores angiogénicos tales como VEGF, bFGF, HGF, PDGFBB y SDF-1, específicamente VEGF y bFGF, 5) inhibir angiogénesis in vivo, 6) baja inmunogenicidad en ensayos de inmunogenicidad EpiScreen™ (Antitope Ltd.) H-2143 tiene propiedades de 1) enlazarse específicamente a R0B04 humano y no a ROB01, ROB02, y ROB03, 2) tener un valor KD de 1.7nM para ROB04 humano, 3) mantener afinidad a ROB04 humano por debajo de 40°C durante 4 semanas, 4) inhibir migración de HUVEC inducida por diversos factores angiogénicos tales como VEGF, bFGF, HGF, PDGFBB y SDF-1, específicamente VEGF y bFGF, 5) inhibir angiogénesis in vivo, 6) baja inmunogenicidad en ensayos de inmunogenicidad EpiScreen™ (Antitope Ltd.), y 7) no mostrar cambios serios en señales clínicas, peso corporal, consumo de alimento, hematología, química de la sangre, patología, electroretinografía después de inyección intravítreal única (2.75mg/ojo) a un mono cynomolgus.

Un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 95% o más, preferiblemente 97% o más, más preferiblemente 99% o más de identidad con la secuencia de aminoácidos del anticuerpo tal como H-1140, H-1143, H-2143, H-2140, H-I040 y H-2040 también está incluido en el anticuerpo de la presente invención mientras que el anticuerpo tenga todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5) . Además, un anticuerpo que tiene CDRs idénticos en la secuencia de aminoácidos a los CDRs del anticuerpo que comprende la combinación de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera o el anticuerpo que comprende la combinación de la cadena pesada y la cadena ligera, y tiene una secuencia de aminoácidos distinta de la secuencia de aminoácidos CDR que tiene 95% o más, preferiblemente 97% o más, más preferiblemente 99% o más de identidad a la misma también se incluye en el anticuerpo de la presente invención mientras que en el anticuerpo tenga todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5). (3-9) Anticuerpo que se enlaza al mismo sitio Un "anticuerpo que se enlaza al mismo sitio" que el enlazado por el anticuerpo proporcionado por la presente invención también se incluye en el anticuerpo de la presente invención. El "anticuerpo que se enlaza al mismo sitio" que el enlazado por un cierto anticuerpo significa otro anticuerpo que se enlaza a un sitio sobre una molécula de antígeno reconocida por el anticuerpo. Si un segundo anticuerpo se enlaza a un péptido parcial o una estructura tridimensional parcial sobre una molécula de antígeno enlazada por un primer anticuerpo, puede determinarse que el primero y el segundo anticuerpos se enlazan al mismo sitio. Además, puede determinarse que el primero y el segundo anticuerpos se enlazan al mismo sitio confirmando que el segundo anticuerpo compite con el primer anticuerpo por enlazarse al antígeno, es decir que el segundo anticuerpo interfiere con el enlazamiento del primer anticuerpo al antígeno, incluso si no se determina la secuencia de péptido o la estructura tridimensional del sitio de enlace específico. Además, cuando el primero y el segundo anticuerpos se enlazan al mismo sitio y el primer anticuerpo tiene un efecto característico de un aspecto del anticuerpo de la presente invención, tal como una actividad anti-angiogénesis , el segundo anticuerpo también tiene una sumamente alta probabilidad de que tiene la misma actividad. De esta manera, si un segundo anticuerpo anti-R0B04 se enlaza al sitio enlazado por un primer anticuerpo anti-R0B04, puede determinarse que el primero y el segundo anticuerpos se enlazan al mismo sitio sobre la proteína R0B04. Además, puede determinarse que el primero y el segundo anticuerpos son anticuerpos que se enlazan al mismo sitio sobre la proteína R0B04 confirmando que el segundo anticuerpo anti-R0B04 compite con el primer anticuerpo anti-ROB04 por enlazarse a la proteína R0B04.

También se incluye en la presente invención un anticuerpo que se enlaza a un sitio sobre la proteína ROB04 reconocida por MAbl de la presente invención.

El sitio de enlace del anticuerpo puede determinarse mediante un método bien conocido por aquellos basados en la materia, tal como inmunoensayo . Por ejemplo, una serie de péptidos se preparan mediante truncado apropiado de C-terminal o N-terminal de la secuencia de aminoácidos del antígeno, y la reactividad del anticuerpo a esto se estudia para determinar aproximadamente un sitio de reconocimiento. Luego se sintetizan péptidos más cortos y puede estudiarse la reactividad del anticuerpo hacia estos péptidos para de esta manera determinar el sitio de enlace. Los péptidos del fragmento de antígeno pueden prepararse usando una técnica tal como recombinación de gen o síntesis de péptido.

Cuando el anticuerpo se enlaza a o reconoce la conformación parcial del antígeno, el sitio de enlace para el anticuerpo puede determinarse identificando residuos de aminoácidos sobre el antígeno adyacente al anticuerpo usando un análisis estructural de rayos X. (3-10) Forma modificada de anticuerpo anti-R0B04 o un fragmento funcional del mismo La presente invención proporciona una forma modificada del anticuerpo o el fragmento funcional del mismo. La forma modificada del anticuerpo de la presente invención o el fragmento funcional del mismo significa un anticuerpo de la presente invención o un fragmento funcional del mismo proporcionado con modificación química o biológica. La forma químicamente modificada incluye una forma que tiene un esqueleto de aminoácidos conjugado con un residuo químico, una forma que tiene una cadena de carbohidrato N-enlazada u O-enlazada químicamente modificada, y similares. El residuo o forma química puede ser tóxica o citotóxica. La forma biológicamente modificada incluye una forma que ha sufrido una modificación post-translacional (por ejemplo, glicosilación N-enlazada u O-enlazada, procesamiento de N-terminal o C-terminal, deamidación, isomerización de ácido aspártico, u oxidación de metionina) , una forma que contiene un residuo de metionina adicionado al N-terminal mediante expresión usando células hospederas procariotas, y similares. Se pretende que una forma modificada de este tipo también incluya una forma etiquetada para permitir detección o aislamiento del anticuerpo o del antígeno de la presente invención, por ejemplo, una forma etiquetada con enzima, una forma etiquetada de modo fluorescente, una forma etiquetada de afinidad. Una forma modificada de este tipo del anticuerpo de la presente invención o el fragmento funcional del mismo es útil en mejorar la estabilidad o la retención de sangre del anticuerpo original de la presente invención o del fragmento funcional del mismo, reducción en antigenicidad, detección o aislamiento del anticuerpo o del antígeno, etcétera.

Ejemplos del residuo químico contenido en la forma químicamente modificada puede incluir polímeros hidrosolubles tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano alcohol polivinílico.

Ejemplos de la forma biológicamente modificada pueden incluir una forma modificada mediante tratamiento enzimático, tratamiento celular, o similares, una forma usada con otro péptido tal como una etiqueta, adicionado mediante recombinación de genes y una forma preparada a partir de células hospederas que expresan una enzima modificado hora de cadena de azúcar endógena o exógena.

Una modificación de este tipo puede hacerse en una posición arbitraria o la posición deseada en el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo. De modo alternativo, la misma o dos o más modificaciones diferentes pueden hacerse en una o dos o más posiciones en el mismo.

En la presente invención, se pretende que la "forma modificada del fragmento de anticuerpo" también incluya incluso un "fragmento de la forma modificada del anticuerpo".

Por ejemplo, ocasionalmente, se conoce que un anticuerpo producido por células cultivadas de mamífero carece de un residuo de lisina con C-terminalarboxilo en su cadena pesada (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (199)). También se conoce que ocasionalmente faltan dos residuos de aminoácidos con C-terminalarboxilo (es decir, glicina y lisina) de una cadena pesada y que un residuo de prolina recién localizado en el C-terminalarboxilo es amidado (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). Sin embargo, una falta o una modificación de este tipo en estas secuencias de cadena pesada no afectan ni la habilidad del anticuerpo para enlazarse a su antígeno ni las funciones efectoras (activación del complemento, citotoxicidad dependiente de anticuerpo, etc.) del anticuerpo. De esta manera, un anticuerpo que tiene la modificación y fragmento funcional del anticuerpo también están incluidos en el anticuerpo de la presente invención. Ejemplos de un anticuerpo de este tipo pueden incluir un mutante de supresión derivado del anticuerpo de la presente invención mediante supresión o falta de 1 o 2 aminoácidos en el C-terminalarboxilo de la cadena pesada, y el mutante de supresión que tiene un residuo amidado (por ejemplo, un residuo de prolina amidada en el sitio C-terminalarboxilo de la cadena pesada) . Sin embargo, el mutante de supresión del anticuerpo según la presente invención no está limitado a los tipos descritos antes mientras que el votante de supresión mantenga la habilidad de enlazarse al antígeno y todas o algunas de las actividades (3-3) a (3-5). Dos cadenas pesadas que constituyen el anticuerpo según la presente invención pueden componerse de cualquier tipo de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en las cadenas pesadas de longitud completa y las cadenas pesadas del mutante de supresión o pueden componerse de la combinación de cualesquiera dos tipos seleccionados de los mismos. La relación cuantitativa de las cadenas pesadas de variante de supresión es susceptible al, por ejemplo, tipo de células cultivadas de mamífero que producen el anticuerpo según la presente invención, y las condiciones de cultivo de las células. Ejemplos de tales cadenas pesadas de variante de supresión como los componentes principales del anticuerpo según la presente invención pueden incluir dos cadenas pesadas, las cuales, ambas, carecen de un residuo de aminoácido con C-terminalarboxilo . Todas estas variantes de supresión están comprendidas en la variante de anticuerpo, el fragmento funcional del anticuerpo o la forma modificada del mismo de acuerdo con la presente invención. 4. Método para producir anticuerpo (4-1) Método que usa hibridoma A fin de preparar el anticuerpo anti-R0B04 de la presente invención, se aislan células que producen anticuerpo antiROB04 de los bazos de animales inmunizados con la proteína R0B04 de acuerdo con el método de Kohler y Milstein (Kohler y Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Anticuerpo, p.365-367, Prenum Press, N. Y. (1980)) . Las células se fusionan con células de mieloma para establecer de esta manera hibridomas, y los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse a partir de cultivos de estos hibridomas . (4-1-1) Preparation of antígeno El antígeno para la preparación del anticuerpo anti-ROB04 puede obtenerse de acuerdo con, por ejemplo, un método de preparación de proteína R0B04 nativa o recombinante descrito en otros párrafos de la presente descripción. Ejemplos del antígeno que pueden prepararse de esta manera pueden incluir la proteína R0B04 o un fragmento de la proteína R0B04 que comprende una secuencia parcial con al menos 6 aminoácidos consecutivos de la misma y sus derivados que comprenden además una secuencia arbitraria de aminoácidos o un soporte adicionado a la misma (en lo sucesivo referido colectivamente como un "antígeno R0B04 " ) .

El antígeno R0B04 recombinante puede prepararse transfectando células hospederas con un gen que comprende una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos del antígeno R0B04 , y recogiendo el antígeno de cultivos de las células. El antígeno ROB04 nativo puede purificarse o aislarse de, por ejemplo, tejidos humanos o de roedor con angiogénesis , células derivadas de los tejidos o cultivos de las células. Un antígeno R0B04 obtenido en un sistema de traducción in vitro libre de células a partir de un gen que comprende una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos del Antígeno R0B04 también se incluye en el "antígeno R0B0 " de la presente invención. (4-1-2) Producción de anticuerpo monoclonal anti-R0B04 El anticuerpo monoclonales se produce normalmente mediante los siguientes pasos : (a) preparar un antígeno, (b) preparar células que producen anticuerpo, (c) preparar células de mieloma (en lo sucesivo, llamadas "miélomas " ) , (d) fusionar las células que producen anticuerpo con los mielomas , (e) cribar para un grupo de hibridoma que produce el anticuerpo de interés, y (f ) obtener clones celulares sencillos (clonar) .

Este método de producción involucra además (g) un paso de cultivo de los hibridomas, un paso de criar animales trasplantados con hibridomas, etc., (h) un paso de ensayo o determinación de la actividad biológica del anticuerpo monoclonal, etc., si fuere necesario.

En lo sucesivo, el método para preparar el anticuerpo monoclonal se describirá en detalle con referencia a estos pasos . Sin embargo, el método para preparar el anticuerpo no se limita a estos y, por ejemplo, pueden usarse células que producen anticuerpo distintas de las células de bazo y mielomas. (a) Paso de preparación de antígeno Un antígeno puede prepararse de acuerdo con el método de preparación de proteína ROB04 que se describió antes en (2-3) . (b) Paso de preparación de células que producen anticuerpo El antígeno obtenido en el paso (a) se mezcla con un adyuvante tal como un adyuvante completo o incompleto de Freund o sulfato de potasio aluminio, y los animales de laboratorio se inmunizan con el inmunógeno resultante. Cualquier animal de laboratorio usado en un método de preparación de hibridoma conocido en la técnica puede usarse sin limitaciones. Específicamente pueden usarse, por ejemplo, ratones, ratas, cabras, ovejas, reses o caballos. Desde el punto de vista de células de mieloma fácilmente disponibles que van a fusionarse con las células que producen anticuerpo aislado, etc., los animales que van a inmunizarse son preferiblemente ratones o ratas.

Las cepas de ratón y rata que se usan efectivamente no se limitan de modo particular. En el caso de ratones pueden usarse, por ejemplo, A, AKR, BALB/c, BALB/cAnNCrj , BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, RIll, SJL, S R, B, 129. En el caso de ratas pueden usarse, por ejemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague-Dawley, ACI, BN, o Fischer.

Estos ratones y ratas pueden estar disponibles de criadores/distribuidores de animales de laboratorio, por ejemplo, CLEA Japan, Inc. o Charles River Laboratories Japan Inc .

De estos, se prefieren particularmente la cepa de ratones BALB/c o las cepas de rata Wistar y Low como animales que van a inmunizarse en consideración de la compatibilidad de fusión con las células de mieloma descritas más adelante.

También en consideración de la homología entre antígenos humano y de ratón, se usan preferiblemente ratones cuyo mecanismo biológico para retirar autoanticuerpos haya sido reducido, es decir ratones de enfermedad autoinmune.

En este contexto, estos ratones o ratas son preferiblemente ratones de 5 a 12 semanas de edad, más preferiblemente de 6 a 8 semanas de edad en el momento de inmunización.

Los animales pueden inmunizarse con la proteína R0B04 usando, por ejemplo, el método de Weir, D. M. , Handbook of Experimental Immunology (Manual de inmunología experimental) Vol . I. II. III., Blackwell Scientific Publications , Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M. , Experimental Immunochemistry ( Inmunoquímica experimental) , Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) .

Ejemplos de métodos de determinación del título del anticuerpo pueden incluir, sin limitarse a, inmunoensayo tal como RIA y ELISA.

Las células que producen anticuerpo, derivadas de células de bazo o linfocitos separados de animales inmunizados pueden prepararse de acuerdo con un método conocido en la técnica, por ejemplo, el método de Kohler et al., Nature (1975) 256, pA95,; Kohler et al., Eur. J. Immnol . (1977) 6, p.511,; Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550,; Walsh, Nature, (1977) 266, p.495, ) .

En el caso de células de bazo, puede adoptarse un método general que involucra cortar los bazos, filtrar células a través de un tamiz de acero y luego hacer flotar las células resultantes en un medio esencial mínimo de Eagle (MEM, por sus siglas en inglés) o similares para separar células que producen anticuerpo. (c) Paso de preparación de mielomas Las células de mieloma usadas en fusión celular no se limitan particularmente y pueden seleccionarse apropiadamente para uso a partir de líneas celulares conocidas en la técnica. Una línea deficiente de HGPRT (hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa) , es decir, derivada de ratón X63-Ag8 (X63), NSI-ANS/I (NS1) , P3X63-Ag8.UI (P3UI), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Agl4 (SP2/0) , MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, BU.l o similares, derivada de rata 210. RSY3.Ag .1.2.3 (Y3) o similares, o derivada de humano U266AR (SKO-007) , GMI500-GTG-AI2 (GMI500) , UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2 ) , 8226AR1NIP4 -1 (NP41) , o similares, cuyos procedimientos de cribado ya han sido establecidos, se usa preferiblemente en consideración de la conveniencia en la selección de hibridomas a partir de células de fusión. Estas líneas deficientes de HGPRT pueden estar disponibles a partir de, por ejemplo, la colección American Type Culture Collection (ATCC) (Colección de Cultivo de Tipo Americano) .

Estas líneas celulares se subcultivan en un medio apropiado, por ejemplo, un medio de 8-azaguanina [medio RPMI-1640 suplementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina, y suero un bovino fetal (en lo sucesivo, referido como "FCS ") y suplementado además con 8- azaguanina] , un medio de Dulbecco modificado con uno de Iscove (en lo sucesivo llamado "IMD ") , o un medio Eagle modificado con uno de Dulbecco (en lo sucesivo llamado "DMEM") y cultivado 3 a 4 días antes de la fusión celular en un medio normal [por ejemplo, medio ASF104 (fabricado por A inomoto Co.f Inc.) que contienen 10% de FCS] para asegurar el numero de células igual o mayor que 2xl07 células en el día de la fusión celular. (d) Paso de fusionar las células que producen anticuerpo con las células de mieloma Las células que producen anticuerpo pueden fusionarse con las células de mieloma en condiciones que impidan que se reduzca excesivamente la viabilidad de las células, de acuerdo con un método conocido en la técnica (Weir, D. M. , Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987) , Kabat, E. A. y Mayer, M. M. , Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Spigfield, Illinois (1964) etc.) . Por ejemplo, puede usarse un método químico que involucra mezclar células que producen anticuerpo con células de mieloma en una solución de alta concentración de un polímero como polietilenglicol , o un método físico que usa estimulación eléctrica. (e) Paso de cribado para un grupo de hibridoma que produce el anticuerpo de interés Un método de selección para los hibridomas obtenidos mediante fusión celular no se limita particularmente, y normalmente se usa el método de selección de HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina) (Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495; Milstein et al., Nature (1977) 266, p.550) . Este método es efectivo para obtener hibridomas usando una línea celular de mieloma deficiente de HGPRT, la cual no puede sobrevivir en presencia de aminopterina . Específicamente, las células e hibridomas no fusionadas pueden cultivarse en un medio HAT para permitir de esta manera solamente hibridomas resistentes a aminopterina para permanecer selectivamente y crecer. (f) Paso de obtención de clones sencillos de célula (clonar) Los hibridomas pueden clonarse usando un método conocido en la técnica, por ejemplo, un método de metilcelulosa, agarosa blanda o dilución limitante (véase, por ejemplo, Barbara, B. M. y Stanley, M. S.: Métodos seleccionados en inmunología celular, W. H. Freeman y Company, San Francisco (1980)). El método de dilución limitante es preferible. (g) paso de cultivar los hibridomas y paso de criar animales trasplantados con hibridoma Los hibridomas pueden cultivarse para que de esta manera produzcan anticuerpos monoclonales . Preferiblemente, se clonan los hibridomas deseados y luego se someten a producción de anticuerpo.

Los anticuerpos monoclonales producidos por este hibridoma pueden recogerse de cultivos del hibridoma. Además, también puede recogerse un anticuerpo recombinante de cultivos de células transfectadas con el gen del anticuerpo monoclonales . Además, los hibridomas pueden inyectarse por vía entreperitoneal a ratones de la misma cepa (por ejemplo, BALB/cAnNCrj descritos antes) o ratones Nu/Nu y se dejan crecer. Luego los anticuerpos monoclonales también pueden recogerse de sus ascitis. (h) Paso de ensayar o determinar la actividad biológica del anticuerpo monoclonal Pueden seleccionarse diversos ensayos biológicos y aplicarse de acuerdo con el propósito. (4-2) Método de inmunización celular Las células que expresan la proteína R0B04 nativa, las células que expresan la proteína R0B04 recombinante o su fragmento, o similares pueden usarse como inmunogenos para de esta manera preparar un anticuerpo anti-ROB04 mediante el método de hibridoma descrito previamente.

Ejemplos de las células que expresan la proteína ROB04 nativa pueden incluir células derivadas de pacientes afectados con una enfermedad angiogénica tal como retinopatía diabética proliferativa o tumor, y células derivadas de los tejidos de estos pacientes. Tales células son preferiblemente células endoteliales vasculares, pero no limitadas a éstas. Estas células que expresan proteína ROB04 se usan en una cantidad de 1 x 105 a 1 x 109 células, preferiblemente 1 x 106 a 1 x 108 células, más preferiblemente 0.5 a 2 x 107 células, aún más preferiblemente 1 x 107 células, en una inmunización. El número de células sometidas a inmunización puede cambiar de acuerdo con el nivel de expresión de la proteína ROB04. Los inmunógenos generalmente se administran por vía intraperitoneal y pueden administrarse a través de una ruta intradérmica o similares. El método descrito en (4-1-2) puede aplicarse a la estrategia de preparación de hibridoma. (4-3) Recombinación de genes y células hospederas Con el fin de preparar el anticuerpo de la presente invención, se transfectan células hospederas con un nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de su cadena pesada (nucleótido de cadena pesada) y un nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de su cadena ligera (nucleótido de cadena ligera) , o con un vector que contiene un inserto del nucleótido de la cadena pesada y un vector que contiene un inserto del nucleótido de la cadena ligera, y luego se cultivan y el anticuerpo puede recogerse de los cultivos. Los nucleótidos de cadena pesada y ligera pueden insertarse en un vector.

Como células hospederas pueden usarse células procariotas o eucariotas . Cuando se usan células eucariotas como hospederas, pueden usarse células animales, células vegetales o microbios eucariotas .

Ejemplos de las células animales deben incluir células derivadas de mamífero, es decir células COS derivadas de mono (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblasto de ratón NIH3T3 (ATCC No . CRL-1658 ) , líneas celulares NSO de ratón (ECACC) , células de ovario de hámster chino (células CHO, ATCC CCL-61) , líneas de las mismas, deficientes de dihidrofolato reductasa (CHOdhfr- : Urlaub, G. y Chasin, L. A. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A. (1980) 77, p.4126-4220) , CHOKISV desarrolladas por Lonza Biologics, células derivadas de aves, tales como pollos, y células derivadas de insectos.

Las células hospederas de la presente invención también incluyen células que pueden producir una proteína de anticuerpo, en cuyo caso se modifica la estructura de una cadena de azúcar adherida a la proteína de anticuerpo, en cuyo caso preferiblemente se incrementa una actividad biológica del anticuerpo con la modificación en comparación con el anticuerpo sin la modificación. Un ejemplo de tales células hospederas de la presente invención incluye células CHO que pueden producir una proteína de anticuerpo que tienen cadenas de azúcar enlazadas N-glicósido complejo ligadas a la región Fe del anticuerpo, en cuyo caso entre las cadenas de azúcar enlazadas a N-glicósido complejo ligadas a la región Fe del anticuerpo, la proporción de una cadena de azúcar en la cual la fucosa no está ligada a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar es de 20% o más (W02000/61739, W02002/31140) .

Ejemplos de los microbios eucariotas pueden incluir levaduras. Ejemplos de las células procariotas pueden incluir E. coli y Bacillus subtilis.

Se usan preferiblemente células derivadas de mamíferos, más preferiblemente se usan células CHO, y aún más preferiblemente se usan CHOK1SV como células hospederas para producir los anticuerpos antiR0B04 de la presente invención.

Un péptido de señal para la secreción del anticuerpo de la presente invención (anticuerpos monoclonales derivados de diversas especies animales, anticuerpo de rata, anticuerpo de ratón, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo humano, etc.) no se limita a la señal secretoria de un anticuerpo de la misma especie, el mismo tipo y el mismo subtipo que el anticuerpo o la señal secretoria del anticuerpo mismo. Puede seleccionarse y usarse cualquier señal secretoria de un anticuerpo de diferente tipo o subtipo de la misma o cualquier señal secretoria de una proteína derivada de una especie eucariota diferente de la misma o una especie procariota. (4-4) Métodos para diseñar y preparar un anticuerpo humanizado Ejemplos del anticuerpo humanizado pueden incluir, pero no limitarse a, un anticuerpo derivado de humano que tiene CDRs reemplazados con los CDRs de un anticuerpo animal no humano (véase Nature (1986) 321, p. 522-525), un anticuerpo humano insertado con las secuencias CDR y con algunos residuos de aminoácidos de regiones de armazón mediante un método de injerto de CDR (véase W090/07861 y US6972323), y un anticuerpo que tiene aminoácido (s) de anticuerpo humano reemplazado (s) por uno o dos o más aminoácidos derivados de anticuerpo animal no humano en cualquiera de estos anticuerpos humanizados. (4-5) Método para preparar un anticuerpo humano Otros ejemplos del anticuerpo de la presente invención pueden incluir un anticuerpo humano. El anticuerpo humano anti-ROB04 significa un anticuerpo anti-R0B04 consistente en la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo derivado de humano. El anticuerpo humano anti-ROB04 puede obtenerse mediante un método usando ratones que producen anticuerpo humano que llevan un fragmento de ADN genómico humano, el cual comprende genes que codifican la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143,; Kuroiwa, Y. et. al., Nuc. Acids Res. (1998) 26, .3447-3448 ; Yoshida, H. et . al., Animal Cell Technology: Basic y Applied Aspects vol. 10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. y Iijima, S. eds . ) , Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K. et . al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727 etc.).

Específicamente, tales animales que producen anticuerpo humano puede prepararse afectando los locus del gen de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena de mamíferos no humanos y en lugar de introducir a éstos los locuss de gen de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana a través de vectores de cromosoma artificial de levadura (YAC) , o similares. De modo alternativo se transforman células eucariotas con ADNcs que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de tal anticuerpo humano, preferiblemente con vectores que comprenden cada uno de los ADNcs, mediante una técnica de recombinación de gen, y se cultivan las células transformadas que producen un anticuerpo monoclonal humano recombinante . Este anticuerpo puede obtenerse a partir del sobrenadante de cultivo.

En este contexto, por ejemplo, pueden usarse como hospederas células eucariotas, preferiblemente células de mamíferos tales como células CHO, linfocitos o mielomas.

También se conoce un método para obtener un anticuerpo humano derivados de despliegue de fagos seleccionado de una biblioteca de anticuerpos humanos (véase Wormstone, 1. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7) , p .2301-2308 ; Carmen, S. et . al., Briefings in Functional Genomics y Proteomics (Informaciones en Genómica y Proteómica Funcional) (2002), 1 (2) , p.189-203; Siriwardena, D. et. al., Opthalmology (2002) 109 (3) , p.427-431 etc.) .

Por ejemplo, puede usarse un método de despliegue de fagos (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116), el cual involucra permitir que las regiones variables de un anticuerpo humano se expresen como un anticuerpo de cadena única (scFv) sobre la superficie del fago y seleccionar un fago que se enlace al antígeno.

El fago seleccionado basado en su enlace al antígeno puede someterse a análisis del gen para determinar de esta manera las secuencias de ADN que codifican las regiones variables del anticuerpo humano que se enlaza al antígeno.

Si se determina la secuencia de ADN de scFv que se enlaza al antígeno, se prepara un vector de expresión que tiene esta secuencia y pueden transíectarse hospederos apropiados con el vector de expresión y permitir expresar el anticuerpo humano (W092/01047, W092120791, W093/06213, W093111236, 093119172, W095/01438, W095/15388, Annu . Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116. (4-6) Método para preparar fragmentos funcionales de un an icuerpo El método para preparar un anticuerpo de cadena única es bien conocido en la técnica (véase por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 4,946,778, 5,260,203, 5,091,513, y 5,455,030). En este scFv, una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera están enlazados por medio de un conector que les impide formar un conjugado, preferiblemente un conector polipéptido (Huston, l.S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci . U.S.A. (1988), 85, p. 5879-5883). La región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera en scFv pueden derivarse del mismo anticuerpo o puede derivarse de diferentes anticuerpos.

Por ejemplo, un péptido de cadena única, arbitrario, que consiste de 12 a 19 residuos se usa como el conector de polipéptido que enlaza estas regiones variables.

A fin de obtener ADN que codifica scFv, de las secuencias de ADN que codifican la cadena pesada o la región variable de cadena pesada del anticuerpo y ADN que codifica la cadena ligera o la región variable de cadera ligera del mismo, cada porción de ADN que codifica toda la secuencia de aminoácidos, o la deseada, se usa como una plantilla y se amplifica mediante PCR usando un par de cebadores que están a los flancos de ambos extremos de la plantilla. A continuación, el ADN que codifica el residuo conector de polipéptido se sigue amplificando en combinación con un par de cebadores que están a los flancos de ambos extremos del mismo para enlazarlos a las cadenas pesada y ligera, respectivamente.

El ADN que codifica scFv puede usarse para preparar de esta manera, de acuerdo con un método rutinario, un vector de expresión que contiene el ADN y las células hospederas transformadas con el vector de expresión. Adicionalmente se cultivan las células hospederas y el scFv puede recogerse de los cultivos de acuerdo con un método rutinario.

También, a fin de obtener otros fragmentos funcionales del anticuerpo, se obtienen un gen que codifica cada fragmento funcional de acuerdo con el método descrito antes, y se transfectan células con el gen. El fragmento funcional de interés puede recogerse de los cultivos de las células.

El anticuerpo de la presente invención puede multimerizarse para aumentar de esta manera su afinidad por el antígeno. Los anticuerpos que van a multimerizarse pueden ser anticuerpos de un tipo o pueden ser una pluralidad de anticuerpos que reconocen una pluralidad de epítopos, respectivamente, o el mismo antígeno. Ejemplos de métodos de multimerización de anticuerpo pueden incluir el enlazamiento de dos scFvs a un dominio IgG CH3 , el enlazamiento del mismo a estreptavidina, y la introducción de un motivo hélice-giro-hélice .

El anticuerpo de la presente invención puede ser una mezcla los plurales de anticuerpos anti-R0B04 que difieren en secuencia de aminoácidos, es decir un anticuerpo policlonal. Ejemplos del anticuerpo policlonal pueden incluir una mezcla de tipos plurales de anticuerpos que difieren en una porción o en todo el conjunto de CDR. Un anticuerpo policlonal de este tipo puede recogerse de cultivos de diferentes células que producen anticuerpos, cultivadas de modo mezclado (W02004/061104) . Además, pueden mezclarse anticuerpos preparados por separado. Además, puede prepararse antisuero, que es un aspecto del anticuerpo policlonal, por animales inmunizantes con el antígeno deseado y recogiendo suero de los animales de acuerdo con un método estándar.

También pueden usarse anticuerpos conjugados con varias moléculas tales como polietilenglicol (PEG) como formas modificadas del anticuerpo.

El anticuerpo de la presente invención puede ser además cualquiera de los conjugados formados por estos anticuerpos con otros medicamentos ( inmunoconjugados) . Ejemplos de un anticuerpo de este tipo pueden incluir el anticuerpo conjugado con un material radioactivo o un compuesto que tiene un efecto farmacológico (Nature Biotechnology (2005) 23 , p. 1137-1146) . (4-7) Purificación de anticuerpo El anticuerpo obtenido puede purificarse hacia un nivel homogéneo. Pueden usarse métodos usuales de separación y purificación de proteína para la separación y purificación del anticuerpo.

El anticuerpo puede separarse y purificarse mediante estrategias apropiadamente seleccionadas o combinadas, por ejemplo, columnas de cromatografía, filtros, ultrafiltración, desalinización, diálisis, electroforesis preparativa en gel de poliacrilamida, y/o isoelectroenfoque (Estrategias para unificación y caracterización de proteína: un manual de curso de laboratorio, Daniel R. Marshak et al. eds . , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Anticuerpos: un manual de laboratorio. Ed Harlow y David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), pero sin limitarse a los mismos.

Ejemplos de cromatografía incluyen cromatografía por afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófuga, filtración de gel, cromatografía de fase inversa y cromatografía de adsorción.

Estas estrategias de cromatografía pueden realizarse usando cromatografía en fase líquida tal como HPLC o FPLC.

Ejemplos de columnas usadas en cromatografía por afinidad pueden incluir columnas de proteína A, de proteína G, y de antígeno .

Ejemplos de la columna de proteína A incluyen Hyper D (fabricado por Pall Corp.), POROS (fabricado por Applied Biosystems, Inc.), y Sepharose F.F. (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Crop.).

El anticuerpo también puede purificarse con base en su actividad enlazante contra el antígeno usando un portador de antígeno inmovilizado.

La presente invención proporciona incluso un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo, un vector recombinante que contiene un inserto del gen, una célula transfectada con el gen o el vector y una célula que produce el anticuerpo de la presente invención.

En la presente invención puede incluirse un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo que se produce por cualquiera de los métodos (4-1) a (4-6) . 5. Composición farmacéutica La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-R0B04 o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo .

La composición farmacéutica de la presente invención es útil en el tratamiento o prevención de una enfermedad que presenta angiogénesis como uno de los hallazgos patológicos durante el curso del inicio, progreso y/o exacerbación y puede mejorarse mediante la supresión de esta angiogénesis o permeabilidad vascular (en lo sucesivo, por conveniencia nos referiremos a la enfermedad como una "enfermedad angiogénica" ) . Ejemplos de la enfermedad angiogénica pueden incluir degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmune de trasplante de tejido de córnea u otros trasplantes de tejido, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, sepsis, y obesidad. La composición farmacéutica de la presente invención es útil como un agente en el tratamiento o prevención de una enfermedad angiogénica, preferiblemente útil en el tratamiento o prevención de degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, fibroplasia retrolental, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular y rechazo inmune de trasplante de tejido de córnea, más preferiblemente útil en el tratamiento o prevención de la degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, fibroplasia retrolental, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa y glaucoma neovascular.

En la presente invención, el tratamiento y/o tratamiento de una enfermedad incluye, sin limitarse a, la prevención del inicio de la enfermedad, preferiblemente la enfermedad en un individuo que tiene la proteína ROB04 expresada, la supresión o inhibición de la exacerbación o progreso de la misma, el alivio de uno o dos o más síntomas exhibidos por un individuo afectado por la enfermedad, la supresión o remisión de la exacerbación o progreso de la misma, el tratamiento o la prevención de una enfermedad secundaria y similares.

La composición farmacéutica de la presente invención puede contener una cantidad terapéuticamente o preventivamente efectiva del anticuerpo anti-R0B04 o del fragmento funcional del anticuerpo y un diluyente, vehículo, solubilizante, emulsionante, preservativo y/o aditivo farmacéuticamente aceptables.

La "cantidad terapéuticamente o preventivamente efectiva" significa una cantidad que ejerce efectos terapéuticos o preventivos sobre una enfermedad particular por medio de una forma de dosificación y una ruta de administración particulares .

La composición farmacéutica de la presente invención puede contener materiales para cambiar, mantener o retener el pH, la presión osmótica, la viscosidad, la transparencia, el color, la tonicidad, la esterilidad o la estabilidad, la solubilidad, la liberación sostenida, la capacidad de absorberse, la permeabilidad, la forma de dosificación, la fuerza, las propiedades, la forma, etc., De la composición o del anticuerpo contenido en la misma (en lo sucesivo, llamados "materiales farmacéuticos"). Los materiales farmacéuticos no están limitados de modo particular en tanto sean materiales farmacológicamente aceptables. Por ejemplo, la no toxicidad, o baja toxicidad, es una propiedad poseída preferiblemente por estos materiales farmacéuticos.

Ejemplos de los materiales farmacéuticos pueden incluir, sin limitarse a, los siguientes: aminoácidos tales como glicina, alanina, glutamina, asparagina, histidina, arginina y lisina; agentes antimicrobianos; antioxidantes tales como ácido ascórbico, sulfato de sodio y bisulfito de sodio; amortiguadores tales como fosfato, citrato o amortiguadores de borato, bicarbonato de sodio y soluciones de Tris-HCl; materiales de carga tales como manitol y glicina; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) ; agentes acomplej antes tales como cafeína, polivinilpirrolidona, ß-ciclodextrina e hidroxipropil-ß-ciclodextrina; agentes aumentadores tales como glucosa, manos y dextrina; otros carbohidratos tales como monosacáridos, disacáridos, glucosa, mañosa y dextrina; agentes colorantes; correctores; diluyentes; emulsionantes; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; polipéptidos con bajo peso molecular; contraiones que forman sal; antisépticos tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y peróxido de hidrógeno; solventes tales como glicerina, propilenglicol y polietilenglicol ; alcoholes de azúcar tales como manitol y sorbitol; agentes de suspensión; tensioactivos tales como PEG, éster de sorbitán, polisorbatos tales como polysorbate 20 y polysorbate 80, tritón, trometamina, lecitina y colesterol; promotores de estabilidad tales como sacarosa y sorbitol; promotores de elasticidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, manitol y sorbitol; agentes de transporte; diluyentes; excipientes; y/o aditivos farmacéuticos .

La cantidad de estos materiales farmacéuticos adicionados es de 0.001 a 1000 veces, preferiblemente 0.01 a 100 veces, más preferiblemente 0.1 a 10 veces el peso del anticuerpo anti-ROB04 o de un fragmento funcional del mismo, o de la forma modificada del mismo.

Una composición farmacéutica que contiene un inmunoliposoma que comprende el anticuerpo anti-R0B04 o el fragmento funcional del mismo o la forma modificada del mismo, encapsulados en un liposoma o una forma de anticuerpo modificada que comprende el anticuerpo conjugado con un liposoma (patente estadounidense No. 6214388, etc.) también se incluye en la composición farmacéutica de la presente invención .

Los excipientes o vehículos no están limitados de modo particular en tanto sean materiales líquidos o sólidos usados usualmente en agua inyectable, solución salina, fluidos cefalorraquídeos artificiales y otras preparaciones para administración oral o parenteral . Ejemplos de la solución salina pueden incluir solución salina neutral solución salina que contiene suero albúmina.

Ejemplos de los amortiguadores pueden incluir amortiguadores Tris ajustados para establecer el pH final de la composición farmacéutica en 7.0 a 8.5, amortiguador es diacetato ajustados para establecer el pH final de los mismos en 4.0 a 5.5, amortiguador es de citrato ajustados para establecer el pH final de los mismos en 5.0 a 8.0, y amortiguador es de histidina ajustados para establecer el pH final de los mismos en 5.0 a 8.0.

La composición farmacéutica de la presente invención es un sólido, un líquido, una suspensión o similares. Otro ejemplo de la composición farmacéutica de la presente invención puede incluir preparaciones secadas por congelamiento. Las preparaciones secadas por congelamiento pueden formarse usando un excipiente tal como sacarosa.

La ruta de administración de la composición farmacéutica de la presente invención puede ser cualquiera de administración enteral, administración local y administración parenteral y puede seleccionarse preferiblemente de acuerdo con la enfermedad objetivo. Ejemplos específicos de la misma pueden incluir administración intravenosa, administración intraarterial , administración intramuscular, administración intradérmica, administración hipodérmica, administración intraperitoneal , administración transdérmica, administración intraósea, y administración intraarticular . También puede usarse administración intraocular preferiblemente para enfermedad angiogénica oftálmica tal como una degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, fibroplasia retrolental, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, o rechazo inmune de un trasplante de tejido de córnea .

La receta de la composición farmacéutica puede determinarse de acuerdo con el método de administración, la afinidad de enlazamiento del anticuerpo por la proteína ROB04, etc. El anticuerpo anti-R0B04 de la presente invención o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo que tiene afinidad superior (valor KD más bajo) por la proteína ROB04 puede ejercer su eficacia medicamentosa a una dosis más baja.

La dosis del anticuerpo anti-ROB04 de la presente invención puede determinarse de modo apropiado según la especie de un individuo, el tipo de una enfermedad, síntomas, sexo, edad, condiciones preexistentes, la afinidad de enlazamiento del anticuerpo por la proteína R0B04 o su actividad biológica, y otros factores. Usualmente una dosis de 0.01 a 1000 mg/kg, preferiblemente de 0.1 a 100 mg/kg, puede administrarse una vez cada día hasta 180 días o dos o tres o más veces al día.

Ejemplos de la forma de la composición farmacéutica pueden incluir inyecciones (incluidas preparaciones y gotas secadas por congelación) , supositorios, preparaciones de absorción transnasal, preparaciones de absorción transdérmica, formulaciones sublinguales, cápsulas, pildoras, ungüentos, gránulos, aerosoles, pastillas, polvos, suspensiones, emulsiones, gotas oftálmicas y formulaciones de implante biológico.

La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-ROB04 de la presente invención o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo como un ingrediente activo puede usarse en combinación con otro agente terapéutico o profiláctico. Ejemplos del agente incluyen un medicamento anti -angiogénesis , medicamento antiinflamatorio y/o un medicamento anticanceroso. Por ejemplo, el medicamento anti-angiogénesis , el medicamento antiinflamatorio y/o el medicamento anticanceroso se administra a un sujeto y luego, la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-R0B04 o el fragmento funcional del anticuerpo como un ingrediente activo es administrado al mismo. De modo alternativo, la composición farmacéutica se administra a un sujeto y luego, el medicamento anti-angiogénesis, el medicamento antiinflamatorio y/o el medicamento anticanceroso se administran al mismo. De modo alternativo, la composición farmacéutica puede administrarse un sujeto simultáneamente con el medicamento anti-angiogénesis, el medicamento antiinflamatorio y/o el medicamento anticanceroso. Ejemplos del medicamento anti-angiogénesis pueden incluir ranibizumab.

La presente invención proporciona incluso un método para tratar o prevenir una enfermedad angiogénica tal como una degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmune de trasplante de tejido de córnea o trasplantes de otros tejidos, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, sepsis, u obesidad, el uso del anticuerpo de la presente invención para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de la enfermedad angiogénica, y el uso del anticuerpo de la presente invención para el tratamiento o la prevención de la enfermedad angiogénica. En la presente invención también se incluye un kit para el tratamiento o la prevención que comprende el anticuerpo de la presente invención. 6. Composición para diagnóstico La presente invención proporciona una composición para examen o diagnóstico que comprende el anticuerpo anticuerpo anti-ROB04 de la presente invención o el fragmento funcional del mismo, o la forma modificada del mismo (en lo sucesivo, llamada de manera colectiva "composición para diagnóstico") .

La composición para diagnóstico de la presente invención es útil en el examen o diagnóstico de una enfermedad angiogénica tal como una degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, humor benigno o maligno, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmune de un trasplante de tejido de córnea o trasplantes de otros tejidos, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, sepsis, o obesidad. La composición para diagnóstico de la presente invención también es útil en el examen o diagnóstico de síntomas de angiogénesis temprana o preangiogenesis, los cuales no satisfacen los criterios convencionales de diagnóstico, síntomas no diagnosticados que evolucionan en angiogénesis, etcétera. En la presente invención, el examen o el diagnóstico incluyen, por ejemplo, la determinación o verificación de un riesgo de adquirir una enfermedad, la determinación de la presencia o ausencia de una enfermedad, la verificación del grado de progreso o exacerbación, la verificación o determinación del efecto de la terapia medicamentosa usando la composición farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-R0B04 o similares, la verificación o determinación del efecto de la terapia distinta de la terapia medicamentosa, la verificación de un riesgo de recurrencia y la determinación de la presencia o ausencia de recurrencia. Sin embargo, el examen o el diagnóstico según la presente invención no se limita a estas en tanto sean examen o diagnóstico usuales.

Cuando se detecta la proteína ROB04 en una cantidad de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 veces o más, preferiblemente una cantidad de 10 veces o más en una muestra derivada de un sujeto de prueba en comparación con una muestra derivada de un individuo sano, el sujeto bajo prueba puede ser diagnosticado por tener una enfermedad angiogénica o por estar en un alto riesgo de adquirirla. Además, cuando la concentración en suero de la proteína ROB04 excede un valor de referencia particular, el sujeto bajo prueba se diagnostica por tener una enfermedad angiogénica o puede diagnosticarse por estar en alto riesgo de adquirirla. El valor de referencia es usualmente de 0.01 a 10 ng/ml, preferiblemente de 0.1 a 1 ng/ml, más preferiblemente de 0.1 a 0.3 ng/ml.

Tal composición para diagnóstico puede contener un amortiguador de pH, un osmoregulador, sales, un estabilizante, un antiséptico, un desarrollador de color, un sensibilizador, un inhibidor de agregación, y similares.

La presente invención proporciona incluso un método para examinar o diagnosticar una enfermedad angiogénica tal como una degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmune de un trasplante de tejido de córnea o de trasplantes de otros tejidos, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, sepsis, u obesidad, el uso del anticuerpo de la presente invención para la preparación de una composición para el diagnóstico de la enfermedad angiogénica, y el uso del anticuerpo de la presente invención para el examen o diagnóstico de la enfermedad angiogénica. En la presente invención también se incluye un kit para examen o diagnóstico que comprende el anticuerpo de la presente invención.

El método de examen o diagnóstico que involucra el anticuerpo de la presente invención es sandwich ELISA. Puede usarse un método usual de detección que usa anticuerpos tales como ensayos ELISA, RIA, ELISPOT (ensayo de puntos por inmunoabsorción unida a enzimas) , dot blot, un ensayo de Ouchterlony, o CIE (contrainmunoelectroforesis) . Los anticuerpos aplicados al sistema de ensayo sandwich ELISA pueden ser cualquier combinación de dos anticuerpos que reconozcan ROB04 , pero que no compitan entre sí. Además de la biotina, puede usarse un método de etiquetado que se pueda llevar a cabo en análisis bioquímico, tal como HRP, fosfatasa alcalina o FITC, como un método de etiquetado para los anticuerpos. Un sustrato cromogénico tal como TMB (3, 3', 5, 5 ' -tetrametilbencidina) , BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato) , p-NPP (p-nitrofenil fosfato) , OPD (o-fenilendiamina) , ABTS (ácido 3-etilbenzotiazolina-6- sulfónico) , sustrato quimioluminiscente SuperSignal ELISA Pico (Thermo Fisher Scientific Inc.)/ un sustrato fluorescente tal como sustrato de peroxidasa fluorogénico QuantaBlu (TM) (Thermo Fisher Scientific Inc.), y un sustrato quimioluminescente puede usarse en la detección usando etiquetado enzimático. Las muestras derivadas de animales humanos o no humanos, así como también las muestras tratadas artificialmente tales como proteína recombinante es, pueden someterse este ensayo. Ejemplos de muestras de ensayo derivadas de organismos individuales pueden incluir, sin limitarse a, sangre, fluidos sinoviales, ascitis, linfa, fluidos cefalorraquídeo los y sobrenadantes homogeneizados de tej ido .

El kit de sandwich ELISA para examen o diagnóstico que comprende el anticuerpo de la presente invención puede contener una solución de estándares de proteína R0B04 , un reactivo colorante, una solución amortiguador para dilución, un anticuerpo para fase sólida, un anticuerpo para detección y una solución para lavado, y similares. La cantidad del anticuerpo enlazado al antígeno puede medirse preferiblemente usando un método tal como un método de absorbancia, florescencia, luminiscencia o de RI (radioisótopo) . En esta medición preferiblemente se usa un lector de placa de absorbancia, un lector de placa de florescencia, un lector de placa de luminiscencia, un contador de centelleo líquido de RI, o similares.

Ej emplos En lo sucesivo, la presente invención se describirá con mayor detalle con referencia los ejemplos. Sin embargo, la presente invención no pretende limitarse a éstos.

En los ejemplos de más adelante, cada operación para ingeniería genética fue realizado mediante métodos descritos en "Molecular Cloning" (Clonación molecular) (Sambrook, J., Fritsch, E.F., y Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) o los métodos descritos en otros manuales experimentales usados por aquellos versados en la materia, o realizados de acuerdo con las instrucciones de los reactivos poquitos disponibles comercialmente que se usaron, a menos que se especifique algo diferente.

Ejemplo 1 Preparación de vector de expresión 1) -1 Preparación de vector de expresión de R0B04 humano 1) -1-1 Preparación de vector de expresión de ROB04 humano de longitud completa Se disoció ADNc de ROB04 humano con EcoRV y Notl de un plásmido (fabricado por Open Biosystems) que comprende ADNc de ROB04 humano (No. de acceso BC039602) e incorporado entre EcoRV y Notl de un vector pCI (fabricado por Promega Corp.) para preparar un vector de expresión de ROB04 humano de longitud completa (en lo sucesivo, llamado "pCI -hROB04 " ) . La secuencia del gen de R0B04 humano clonado en este vector se muestra en SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de ROB04 humano también se muestra en SEQ ID NO: 2 . l)-l-2 Preparación de vector de expresión de región extracelular de ROB04 humano ADNc que codifica un polipéptido de región extracelular de ROB04 humano (consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 1 a 461 de SEQ ID NO: 2; en lo sucesivo, abreviado a "R0B04 humano-ECD") se amplificó por medio de reacción de PCR usando un conjunto de cebadores: cebador 1 F: 5' -aaaggtaccaccatgggctctggaggagacagcctcctg-3 ' y cebador IR: 5' -aaagatatcctgctccagggtccagggaccatgctcact -3 1 El producto PCR obtenido se clonó en un vector pEF6N5-His-TOPO (fabricado por Life Technologies Corp.) (en lo sucesivo, el vector resultante se abrevia en "pEF6-ROB04-ECD" ; en lo sucesivo, una proteína recombinante expresada por "pEF6-ROB04-ECD" se denomina "rR0B04 -ECD" ) . 1) -1-3 Preparación de ROB04 humano de longitud completa etiquetada FLAG con N-terminal y vectores de expresión de variante de supresión de región/dominio extracelular de R0B04 humano Con el fin de construir vectores para expresión de una proteína que comprende una región consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 28 a 1007 de SEQ ID NO: 2 de ROB04 humano (en el diagrama, esta región se denomina "hROB04 -28 " ) , una región consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 46 a 1007 de la misma (en el diagrama, esta región se denomina "hROB04-46 " ) , una región consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 132 a 1007 de la misma (en el diagrama, esta región se denomina "hROB04-132 " ) , una región consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 210 a 1007 de la misma (en el diagrama, esta región se denomina "hROBO4-210 " ) , una región consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 225 a 1007 de la misma (en el diagrama, esta región se denomina "hROB04-225" ) , o una región consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 341 a 1007 de la misma (en el diagrama, esta región se denomina "hROB04-341 ") con el N-terminal etiquetado con FLAG, se realizó la reacción PCR con pCI-hR0B04 como una planilla usando cada conjunto de cebador: conjunto de cebadores para amplificación de hROB04-28: cebador 2F: 5 ' -ggtaccgccatgggctctggaggagacagcctcctcggcggcagaggttccctgcctctgc tgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaaggatgacgacgataagcaggactc cccgccccagatcctagtccac-31 y cebador 2R: 51 -gctagcggagtaatctacaggagaagcaccagccttg-31 , conjunto de cebadores para amplificación de hR0B04-46: cebador 3F: 5 ' -ggtaccgccatgggctetggaggagacagcctcetcggcggcagaggttccctgcctctgc tgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaaggatgacgacgataagcctggccc tgccaggatgagctgccaag-31 y el cebador 2R conjunto de cebadores para amplificación de hROB04-132: cebador 4F: 5 ' -ggtaccgccatgggctctggaggagacagcctcetcggcggcagaggttccctgcctctgc tgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaaggatgacgacgataaggtggctgt cctccgggaggatttccagatc-3 ' y el cebador 2R, conjunto de cebadores para amplificación de hROBO4-210: cebador 5F: 51 -ggtaccgccatgggctetggaggagacagcctcetcggcggcagaggttccctgcctctgc tgctcctgctcatcatgggag gcatggctgattacaaggatgacgacgataagaccaacagcgcaggacatagggaga gcc-3' y el cebador 2R, conjunto de cebador para amplificación de hROB04-225: cebador 6F: 51 -ggtaccgccatgggctctggaggagacagcctcctcggcggcagaggttccctgcctctgc tgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaaggatgacgacgataagatccagga gccccaggactacacggagcc-3 ' y el cebador 2R, conjunto de cebador para amplificación de hROB04-341: cebador 7F: 51 -ggtaccgccatgggctctggaggagacagcctcctcggcggcagaggttccctgcctctgc tgctcetgctcatcatgggag gcatggctgattacaaggatgacgacgataagaggctgccggaaaaagtgcccagtgcccc a-31 y el cebador 2R. El producto PCR obtenido se incorporó a un vector pCR4Blunt-T0P0 (fabricado por Life Technologies Corp.) para preparar un vector de clonación. De cada vector de clonación, el ADNc correspondiente se disoció con Kpnl y Nhel y se incorporó entre Kpnl y Nhel de un vector pCI para preparar vector de expresión de ROB04 humano de longitud completa, etiquetado con FLAG en el N-C-terminaluatro vectores de expresión de variante de supresión de región/dominio extracelular de ROB04 humano. El vector de ROB04 humano de longitud completa, etiquetado con FLAG en el N-C-terminalonsiste de un nucleótido que codifica la secuencia de señal de ROB04 (aminoácidos de aminoácidos Nos. 1 a 27 de SEQ ID NO: 2) + secuencia de FLAG (DYKDDDDK) + ROB04 (aminoácidos de aminoácidos Nos. 28 a 1007 de SEQ ID NO: 2) del N-terminal. En lo sucesivo, el vector para expresión de R0B04 humano de longitud completa, etiquetado con FLAG en el N-terminal se denomina "pCI-FLAGhR0B04 -28 " . De los vectores de expresión de variante de supresión de región/dominio extracelular de R0B04 humano, por ejemplo, el vector para expresión de ROB04 consistente en aminoácidos Nos. 46 a 1007 de SEQ ID NO: 2 consiste en un nucleótido que codifica la secuencia de señal de ROB04 (aminoácidos de aminoácidos Nos. 1 a 27 de SEQ ID NO: 2) + secuencia de FLAG (DYKDDDDK) + ROB04 de región suprimida (aminoácidos de aminoácidos Nos. 46 a 1007 de SEQ ID NO: 2) . Este vector se denomina "pCI-hROB04-46" . Asimismo, los vectores que codifican ROB04 que tiene una supresión parcial en la región extracelular de ROB04 se denominan "pCI-hROB04-132" , "pCI-hROBO4-210" , "pCI-hROB04-225" , y "pCI -hROB04-341 " , respectivamente.

La secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de R0B04 humano de longitud completa etiquetado con FLAG o cada variante de supresión de región/dominio extracelular de R0B04 humano clonada en el vector se muestra en SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, o 13. La secuencia de aminoácidos del correspondiente ROB04 humano de longitud completa, etiquetado con FLAG o variante de supresión de región/dominio extracelular de R0B04 humano se muestra en SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, o 14. 1 ) -1-4 Preparación de vector de expresión de variante de supresión de región intracelular de ROB04 A fin de construir un vector para expresión de una proteína que comprende una región consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 1 a 511 de SEQ ID NO: 2 de R0B04 humano (en lo sucesivo, esta región se denomina "hR0B04 -AC" ) , se insertó un codón de parada inmediatamente después de un codón que codifica the 511-mo aminoácido de R0B04 humano con pCI-hR0B04 como una plantilla que usa conjunto de cebadores para hR0B04-LlC: cebador 8F: 5' cagatataccagtgaggatgcctgaatcctaaaacacaggatggatc-3 ' y cebador 8R: 5' gatccatcctgtgttttaggattcaggcatcctcactggtatatctg-3 ' , y el kit de mutagénesis dirigido al sitio QuikChange XL (fabricado por Agilent Technologies, Inc.) para preparar un vector de expresión de hROB04-AC expression vector (en lo sucesivo, se denomina "pCI -hR0B04 -AC" ) . 1) -2 Preparación de vector de expresión de R0B04 de ratón Se realizó la reacción de PCR con ADNc de Mouse Heart QUICK-Clone (fabricado por Takara Bio Inc.) como una plantilla que usa un conjunto de cebadores: cebador 9F: 5' ggtaccgccatgggacaaggagaggagccgagagcagccatg-31 y cebador 9R: 5' -gcggccgcggaggaatcaccagccttgggcacagcaccag-3 ' El producto PCR obtenido se incorporó a un vector pCR-Blunt II-TOPO (fabricado por Life Technologies Corp.) para preparar un vector de clonación que comprende ADNc de R0B04 de ratón. Del vector de clonación se disoció ADNc de ROB04 de ratón con Kpnl y Notl y se incorporó entre Kpnl y Notl de un vector pCI para preparar vector de expresión de R0B04 de ratón (en lo sucesivo, denominado "pCI -mR0B04 " ) .

La secuencia de un sitio ORF en el gen de R0B04 de ratón clonado en este vector se muestra en el nucleótido Nos. 7 a 3051 de SEQ ID NO: 15. Asimismo, la secuencia de aminoácidos de R0B04 de ratón se muestra en SEQ ID NO: 16. 1) -3 Preparación de vector de expresión de ROB04 de rata Se realizó la reacción de PCR con ADNc de bazo de rata Rat Spleen QUICK-Clone (fabricado por Takara Bio Inc.) como una plantilla que usa un conjunto de cebadores: cebador 10F: 5' -ggtaccgccatgggacaaggagaggagctgagagcagcc- 3' y cebador 10R: 5' -gcggccgcggaggaatcaccagccttgggcacaacacc- 3¦ El producto PCR obtenido se incorporó a un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar un vector de clonación que comprende ADNc de ROB04 de rata. Del vector de clonación se disoció ADNc de ROB04 de rata con Kpnl y NoH y se incorporó entre Kpnl y NoH de un vector pCI para preparar un vector de expresión de R0B04 de rata (en lo sucesivo, denominado l,pCIraR0B04'1) .

La secuencia de nucleótido de ADNc de ROB04 de rata se muestra en SEQ ID NO: 17. La secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótido se muestra en SEQ ID NO: 18. 1 ) -4 Preparación de vector de expresión de R0B04 de mono cynomolgus, etiquetado con FLAG en el N-terminal La reacción de PCR se realizó con ADNc sintetizado a partir de ARN total de riñon de mono cynomolgus como una plantilla que usa un conjunto de cebadores: cebador 11F: 5' -ggtaccgccatgggctctggaggagaaagcctccggg-3 ' y cebador 11R: 51 -ggagtaatctacaggagaagcaccagccttg-3 ' El producto PCR obtenido se incorporó a un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar dos tipos de vectores de clonación que comprenden cada uno ADNc de ROB04 de mono cynomolgus (en lo sucesivo, denominado cynoROB04 - 1 o cynoROB04-2) (en lo sucesivo, estos vectores se denominan pCR-cynoROB04-l y pCR-cynoROB04 -2 , respectivamente) .

A continuación, la reacción de PCR se realizó con pCR-cynoR0B04-l o pCRcynoROB04 -2 como una plantilla que usa un conjunto de cebadores: cebador 12F: 51 -ggatccgccatgggctctggaggagaaagcctccg-3 ' y cebador 12R: 5' gcggccgctcaggagtaatctacaggagaagcaccagccttg-31 El producto PCR obtenido se incorporó a un vector pCR4Blunt-T0P0 para preparar un vector de clonación que comprende cada ADNc de R0B04 de mono cynomolgus. Del vector de clonación se disoció el correspondiente ADNc de ROB04 del mono cynomolgus con BamHI y Notl y se incorporó entre BamHI y Notl de un vector pCI para preparar dos tipos de vectores de expresión R0B04 de mono cynomolgus (en lo sucesivo, denominado pCI-cynoR0B04-l y pCI -cynoR0B04 -2 , respectivamente) .

A continuación, la reacción de PCR se realizó con pCI-cynoR0B04-l o pCIcynoR0B04 -2 como una plantilla que usa un conjunto de cebadores: cebador 13F: 51. ggtaccgccatgggctctggaggagaaagcctccgaggctcccgggcttcccgg cctctgctgctcctgctcatcatgggaggcatggctgattacaaggatgacgacgataagc aggactccccgccccagatcctagtccac-3 ' y el cebador 12R.

El producto PCR obtenido se incorporó a un pCR-TOPO vector (fabricado por Life Technologies Corp.) para preparar cada vector de clonación que comprende ADNc de R0B04 del mono cynomolgus, etiquetado con FLAG en N-terminal. Del vector de clonación se disoció el correspondiente ADNc de ROB04 de mono cynomolgus con Kpnl y Notl y se incorporó entre Kpnl y Notl de un vector pCI para preparar vectores de expresión de R0B04 de mono cynomolgus, etiquetado con FLAG en N-terminal (en lo sucesivo, denominado "pCI-FLAG-cynoR0B04-l" y "pCI-FLAG-cynoR0B04 -2 " , respectivamente). La secuencia de nucleótido de ADNc de R0B04 de mono cynomolgus clonada en cada uno de pC 1-FLAG-cynoROB04-l y pCI-FLAG-cynoROB04-2 se muestra en SEQ ID NOs : 19 y producto 21, respectivamente. La secuencia de aminoácidos codificada por cada secuencia de nucleótido se muestra en SEQ ID NOs : 20 y 22, respectivamente. 1) -5 Preparación de vector de expresión de ROBOl humano, etiquetado con FLAG en N-terminal La reacción de PCR se realizó con ADNc QUICK-Clone de corazón humano (fabricado por Takara Bio Inc.) como una plantilla que usa un conjunto de cebadores: cebador 13 F: 5' ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcaccatgattgcggagcccgctcacttttacctg-3 ' y cebador 13R: 51 ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcgctttcagtttcctctaattcttc-3 ' El producto PCR obtenido y un vector pDONR221 (fabricado por Life Technologies Corp.) se sometieron a reacción de BP para preparar un vector donante que comprende ADNc de ROBOl humano .

A continuación, la reacción de PCR se realizó con el vector donante como una plantilla usando un conjunto de cebadores : cebador 14F: 51 - gcggccgcatgattgcggagcccgctcacttttacctgtttggattaatatgtctct gttcaggctcccgtcttgattacaaggatgacgacgataagcgtcaggaagattttccacc tcgcattgttg-31 y cebador 14R: 5' -gctagctcagctttcagtttcctctaattcttc-31 El producto PCR obtenido se incorporó a un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar un vector de clonación que comprende ADNc de ROBOl humano etiquetado con FLAG en N-terminal. Del vector de clonación, se disoció ADNc de ROBOl humano etiquetado con FLAG en N-C-terminalon Nhel y Notl y se incorporó entre Nhel y Notl de a vector pCI para preparar un vector de expresión (en lo sucesivo, denominado "pCI-FLAG-hROBOl ") . La secuencia de nucleótido de ADNc de ROBOl humano etiquetado con FLAG en N-terminal se muestra en SEQ ID NO: 23. La secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótido se muestra en SEQ ID NO: 24 . 1) -6 Preparación de vector de expresión de ROB02 La reacción de PCR se realizó con ADNc QUICK-Clone de pulmón humano (fabricado por Takara Bio Inc.) como una plantilla que usa un conjunto de cebadores: cebador 15F: 5' -gcggccgcatgagtctgctgatgtttacacaactactg- 3' y cebador 15R: 5' gctagcctataattcacctgtaaactgtccttgactgttg-31 El producto PCR obtenido se incorporó a un vector pCR4Blunt-TOPO para preparar un vector de clonación que comprende ADNc de ROB02 humano. Del vector de clonación se disoció ADNc de ROB02 humano con Notl y Nhel y se incorporó entre Notl y Nhel de un vector pCI para preparar un vector de expresión (en lo sucesivo, denominado "pCIhROB02 " ) · La secuencia de nucleótido de ADNc de ROB02 humano se muestra en SEQ ID NO: 25. La secuencia de aminoácidos codificada por esta secuencia de nucleótido se muestra en SEQ ID NO: 26 . 1) -7 Preparación de vector de expresión R0B03 humano La reacción de PCR se realizó con R0B03 humano/pENTR223.1 (fabricado by Open Biosystems) como una plantilla que usa un conjunto de cebadores: cebador 16F: 5' -gcggccgcatgctgcgctacctgctgaaaacgctgctg- 3' y cebador 16R: 5' -gctagctcatcttggttcctctcggcgtttctgtcc-3 ' El producto PCR obtenido se incorporó a un vector pCR4Blunt-T0P0 para preparar un vector de clonación que comprende ADNc de R0B03 humano. Del vector de clonación se disoció ADNc de ROB03 humano con Notl y Nhel y se incorporó entre Notl y Nhel de un vector pCI para preparar un vector de expresión (en lo sucesivo, denominado "pCIhROB0 " ) . La secuencia de un sitio ORF en el gen de ROB03 humano clonado en este vector se muestra en nucleótido Nos. 35 to 4192 de SEQ ID NO: 27. La secuencia de aminoácidos de ROB03 humano también se muestra en SEQ ID NO : 28.

Ejemplo 2 Preparación de anticuerpo monoclonal 2) -1 Preparación de proteína antígena A fin de expresar rROB04-ECD, se transfectaron células FreeStyle 293-F (fabricadas por Life Technologies Corp.) con pEF6-ROB04-ECD usando 293fectin (fabricado por Life Technologies Corp.) y cultivadas a 37°C por 6 días en condiciones de C02 al 8%. Después de terminar el cultivo, se recogió la solución de cultivo mediante centrifugación y se usó como cepa de purificación rR0B04-ECD. El sobrenadante de cultivo obtenido se sometió a diálisis contra Tris-HCI de 20 mM, pH 7.5 usando un tubo de diálisis que tiene un peso molecular límite de 15000, filtrado a través de un filtro (0.45 µ???) , y luego se adicionó a HiTrap 16110 Q XL (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Crop.) se equilibró con Tris-HCI de 20 mM, pH 7.5. La elución se realizó con un gradiente de NaCI (Tris-HCI de 20 mM, pH 7.5/0.2 M NaCI, Tris-HCI de 20 mM, pH 7.5/ NaCI de 1 M) . Una porción de la fracción de elución se separó mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (en lo sucesivo, abreviada "SDS-PAGE"). Luego, el gel se sometió a tinturado con Coomassie Brilliant Blue (en lo sucesivo, abreviado "tinturado de CBB") y a detección mediante Western blotting para confirmar que contiene rR0B04-ECD. A continuación, la fracción que contiene rR0B04-ECD se recogió y se adicionó a HiLoad 16/60 Superdex 75 pg (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Crop.) se equilibró con PBS. Después de eluir con PBS, se separó una porción de la fracción de elución mediante SDS-PAGE. Luego se sometió el gel a tinturado con CBB y detección mediante Western blotting para confirmar una fracción que contiene rROB04-ECD. La fracción que contiene rR0B04-ECD se recogió y se usó como un antígeno para inmunización y como un antígeno para ensayo de afinidad de enlazamiento . La concentración de proteína se midió usando reactivo de ensayo de proteína BCA (fabricado por Pierce Biotechnology, Inc.) . 2) -2 Inmunización Se usaron ratones BALB/c hembras de seis semanas de edad. En el día 0, se administraron a cada ratón por vía hipodérmica o intradérmica 50 g de una mezcla de rROB04-ECD y un adyuvante completo de Freund. En los días 7, 14, y 21, a cada ratón se administraron por vía hipodérmica o intradérmica 50 ig de una mezcla de rROB04-ECD y un adyuvante incompleto de Freund. En el día 38, al ratón se le administraron por vía intraperitoneal 50 ug de rROB04-ECD. En el día 42, se recogió nodo linfático o bazo de ratón y se uso en preparación de hibridoma. 2) -3 Preparación de hibridoma Las células de nodo linfático o las células de bazo y las células SP2/0-agl4 de mieloma de ratón se fusionaron eléctricamente usando el sistema de producción de hibridoma Hybrimune (fabricado por Cyto Pulse Sciences, Inc.), se diluyeron con medio D de selección ClonaCell-HY (fabricado por StemCell Technologies Inc.), y se cultivaron. Se recogieron las colonias de hibridoma que aparecieron para preparar hibridomas monoclonales . Cada colonia de hibridoma recogida fue cultivada y el sobrenadante de cultivo de hibridoma obtenido fue cribado para hibridoma es que producen anticuerpo anti-R0B04. 2) -4 Cribado de anticuerpo 2) -4-1 Preparación de células que expresan gen antígeno para Célula-ELISA Se ajustaron células HEK293 a 7.5 x 105 células/mL en un medio DMEM que contiene 10% de FBS. Las células se transíectaron con pCI-hR0B04 o un modelo de pCI de control negativo usando Lipofectamine 2000 (fabricado por Life Technologies Corp.), dosificado a una concentración de 50 µ? /pozo a una placa con semi-área de 96 pozos (fabricado por Corning Inc.) , y se cultivaron por una noche en un medio DMEM que contenía 10% FBS a 37°C en condiciones de C02 al 5%. Las células transíectadas obtenidas se usaron en Célula-ELISA con ellas adheridas entre sí. 2) -4-2 Preparación de células que expresan gen de antígeno para análisis de citometría de flujo Se inocularon células HEK293T a una concentración de 1.125 x 107 células/matraz aún matraz de 225 cm2 (fabricado por Sumitomo Bakelite Co. , Ltd.) y se cultivaron por una noche en un medio de DMEM que contenía 10% de FBS a 37°C en condiciones de C02 al 5%. Al día siguiente, se transfectaron células HEK293T con pCI-ROB04 o un modelo pCI de control negativo usando Lipofectamine 2000 y siguieron cultivándose por una noche a 37°C en condiciones de C02 al 5%. Al día siguiente, las células HEK293T de vector de expresión fueron tratadas con TrypLE Express (fabricado por Life Technologies Corp.), lavadas con DMEM que contenía 10% de FBS, y luego suspendidas en PBS que contenía 5% de FBS.

La suspensión de células obtenida se usó en análisis de citometría de flujo. 2) -5 Célula-ELISA Después de retirar un sobrenadante de las células HEK293 transfectadas por el vector de expresión, preparadas en 2) -4-1, el sobrenadante de cultivo de hibridoma se adicionó a cada una de las células HEK293 de pCI-hR0B04 y de modelo pCI , y las células se dejaron en reposo a 4 °C por 1 hora. Las células en cada pozo se lavaron una vez con PBS que contenía 5% deFBS. Luego, el anticuerpo anti-ratón IgG-peroxidasa, producido en cabra (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.) diluido 500 veces con PBS que contenía 5% de 5% FBS se adicionó a las mismas y las células se dejaron en reposo a 4 °C por 1 hora. Las células en cada pozo se lavaron 5 veces con PBS que contenía 5% de FBS. Luego se adicionaron a la misma una solución colorante de OPD (o-fenilenediamina diclorhidrato (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.)) y H202 disuelto a concentraciones de 0.4 mg/mL y 0.6 % (v/v) , respectivamente, en una solución disolvente de OPD (acetato trisódico de 0.05 M, hidrofosfato disódico dodecahidrato de 0.1 M, pH 4.5)) a una concentración de 25 µ?/????. Se realizó una reacción a color revolviendo de modo intermitente y se detuvo por adición de HCl de 1 M a una concentración de 25 µ?/????. Luego se midió absorbancia a 490 nm usando un lector de placa (ENVISION; fabricado por Perkin Elmer, Inc.). A fin de seleccionar hibridoma es que producen un anticuerpo que se enlaza específicamente a R0BO4 expresado sobre la superficie de membrana celular, se seleccionaron híbrido más en los sobrenadante de cultivo que exhibían absorbancia más alta en las células HEK293 transfectadas de pCI-hROB04 en comparación con las células HEK293 transfectadas de modelo pCI como hibridomas positivos de producción de anticuerpo anti-ROB04. 2) -6 Análisis de citometría de flujo El anticuerpo producido por cada hibridoma determinado por ser positivo en 2) -5 Célula-ELISA fue además confirmado que se enlazaba a R0B04 mediante citometría de flujo. La suspensión de células HEK293T preparada en 2) -4-2 fue centrifugada. Después de retirar el sobrenadante, se adicionó el sobrenadante de cultivo de hibridoma a cada una de las células transfectadas de pCI-hR0B04 y las células transfectadas de modelo pCI , y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 °C durante 1 hora. Las células se lavaron dos veces con PBS que contenía 5% de FBS . Luego, el conjugado de FITC IgG anti ratón ( fabricado por Sigma-Aldrich Corp . ) diluido 1000 veces con PBS que contenía 5% de FBS o el conjugado FITC IgG anti rata (fabricado por Sigma-Aldrich Corp . ) diluido 320 veces con PBS que contenía 5% de FBS se adicionó a las mismas y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 °C por 1 hora. Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía 5% de FBS, luego se re suspendieran en PBS que contenía 5% de FBS y 2 ug/mililitro de 7-aminoactinomicina D (fabricada por Molecular Probes) , y se sometieron a detección usando un citómetro de f luj o (FC500 ; fabricado por Beckman Coulter, Inc . ) . Los datos se analizaron usando Flowjo ( fabricado por TreeStar Inc . ) . Las células muertas D-positivas por 7-aminoactinomicina se excluyeron mediante regulación del tiempo , y el histograma de la intensidad de f lorescencia FITC se preparó luego para células vivas . Los hibridomas que producen una muestra en la cual el histograma de las células HEK293T transfectadas por pCIR0B04 se desplazó a una región de intensidad de florescencia más fuerte en comparación con el histograma de células 293T transfectadas por el modelo pCI de control negativo se obtuvieron como hibridomas que producen anticuerpo anti -R0B04 . Los anticuerpos anti -R0B04 producidos por los hibridomas obtenidos se denominaron MAb 1 , MAb2 , MAb3 , y MAb4 , respectivamente . 2 ) - 7 Ensayo de isotipif icación de anticuerpo monoclonal El isotipo de cada anticuerpo monoclonal se determinó usando un kit de isotipif icación monoclonal de ratón poquito de isotipificación monoclonal de rata (fabricado por AbD Serotec) . Los resultados fueron IgGl (MAbl y MAb2) y IgG2b (MAb3 y MAb4) . 2) -8 Preparación de anticuerpo monoclonal Cada anticuerpo monoclonal se purificó a partir de un sobrenadante de cultivo de hibridoma (en lo sucesivo, denominado un "caldo de purificación de anticuerpo ") . El caldo de purificación de anticuerpo se preparó tal como sigue: se inocularon 8 a 9 X 107 de hibridomas a un matraz de 1272-cm2 (fabricado por Corning Inc.) y se cultivaron en un medio SFM de hibridoma (fabricado por Life Technologies Corp.) que contenía 20% de suero bovino fetal IgG Ultra-LoW a 37 °C por 4 días en condiciones de C02 al 5% y luego se recogió el sobrenadante .

El anticuerpo se purificó usando proteína Hitrap G HP o Hitrap MabSelect SuRe (fabricada por GE Healthcare Bio-Sciences Crop.). Para la Hitrap Protein G HP, el caldo de purificación de anticuerpo se adicionó a una columna y se lavó con un amortiguador de enlazamiento (fosfato de sodio de 0.02 M, pH 7.0), seguido por elusión con glicina de 0.1 M, pH 2.7. Por contraste, para Hitrap MabSelect SuRe, el caldo de purificación de anticuerpo se adicionó a una columna y se lavó con PBS, seguido por elución con arginina-HCl de 2 M, pH 4.0. La solución de anticuerpo eluida se neutralizó y el amortiguador se reemplazó luego por PBS. La concentración del anticuerpo purificado con Hitrap Proteína G HP se midió usando reactivo de ensayo de proteína BCA. IgG2a de ratón (fabricado por R&D systems, Inc.) se usó como un estándar para una curva de calibración. De modo alterno, la concentración del anticuerpo purificado con Hitrap MabSelect SuRe se determinó mediante la medición de absorbancia (D.O. 280 nm) en un eluido del anticuerpo enlazado a columna PEEK POROS G 20 µ?t?, 4.6 mm x 50 mm, 0.83 mL (fabricado por Applied Biosystems, Inc.) . Específicamente, la muestra de anticuerpo diluida con PBS fue adicionada a POROS G 20 µp equilibrada con un amortiguador de equilibrio (dihidrof osf ato de sodio dodecahidrato de 30.6 mM, fosfato mono potásico de 19.5, NaCl de 0.15 M, pH 7.0) . La columna se lavó con un amortiguador de equilibrio y luego se eluyó un anticuerpo enlazado a la columna con un eluente (0,1 % (v/v) de HCI , NaCI de 0.15 M) . El área de pico de absorbancia (D.O. 280 nm) en el eluido fue medida y la concentración fue calculada de acuerdo con la siguiente ecuación: concentración de muestra de anticuerpo (mg/mL) = (área de pico della muestra de anticuerpo) / (área de pico de estándar (IgGl humana)) x Concentration de estándar (mg/mL) x proporción de dilución de la muestra .

Ejemplo 3 Detección de activación de señal descendente de R0B04 3) -1 Preparación de vector reportero que comprende región promotora de interleucina-8 (IL-8) como elemento de respuesta La reacción de PCR se realizó con ADN de región promotora de IL-8 como plantilla usando un conjunto de cebadores: cebador 17F: 5' -ggtaccgataaggaacaaataggaag-31 y cebador 17R: 5' -gagctcagcttgtgtgctctgctgtc-3 ' El producto PCR obtenido se incorporó a un vector pCR4Blunt-T0P0 para preparar un vector de clonación que comprende ADN de región promotora (-253 a -59) de IL-8. Del vector de clonación, se disoció el ADN de región promotora (-253 a -59) de IL-8 con Kpnl y SacI y se incorporó entre Kpnl y SacI de un vector pGL4.15 (fabricado por Promega Corp.) para preparar un vector reportero que comprende la región promotora de IL-8 como un elemento de respuesta. La secuencia de nucleótido del ADN de región promotora de IL-8 (-253 to -59) se muestra en SEQ ID NO: 29. 3) -2 Vector reportero que comprende factor nuclear KB (NF-??) , secuencia de activación de gama interferón (GAS) , elemento de respuesta estimulado por interferón (ISRE) , factor celular grado T de transfeccion (TCF) como elemento de respuesta Vector pGL .32 [luc2PINF-KB-RE/Hygro] (fabricado por Prom ega Corp.), vector pGAS-TA-Luc (fabricado por Takara Bio Inc.), vector pISRE-TA-Luc (fabricado por Takara Bio Inc.), y TOPflash (fabricado por Millipore Corp.) se usaron respectivamente como vectores reporteros que comprenden NF-KB, GAS, ISRE, o TCF como un elemento de respuesta. De modo alternativo, el vector pTA-Luc libre de secuencia de respuesta (fabricado por Takara Bio Inc.) fue usado como un control negativo. El vector pRL-TK (fabricado por Takara Bio Inc.) fue usado como un control interno. 3) -3 Análisis de señal que varía en célula que expresa transitoriamente R0B04 humano Se inocularon células HEK293 a una concentración de 2 x 104 células/pozo a una placa de 96 pozos (recubierta con colágeno I; fabricado por Asahi Glass Co., Ltd.) y se cultivaron por una noche en un medio de DMEM que contenía 10% de FBS a 37°C en condiciones de C02 al 5%. Al día siguiente se transíectaron las células HEK293 con pCI-ROB04, pCI-R0B04-AC, o un modelo pCI de control negativo cada uno de los electores reporteros se muestran en 3)-l y 3) -2 usando reactivo de transfección FuGene6 Transfection Reagent, y se cultivaron además por una noche a 37 °C en condiciones de C02 al 5%. Al día siguiente, se determinaron las actividades de luciferasa de luciérnaga y luciferasa de renilla de cada pozo como intensidad de luminiscencia en un lector de placa (Mithras; fabricado por Berthold Technologies GmbH & Co, KG) usando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (fabricado por Promega Corp.), y se calculó la actividad reportera de cada pozo de acuerdo con la siguiente ecuación: actividad reportera = actividad de luciferasa de luciérnaga intensidad de luminiscencia derivada/ actividad de luciferasa de renilla - intensidad de luminiscencia derivada. Como resultado solamente se incrementó la actividad promotora de IL-8 en las células transfectadas con pCI-hR0B04 en comparación con las células transfectadas con el modelo pCI de control negativo (Figura 1) . Además, este incremento en la actividad promotora de IL-8 detectado en las células transfectadas con pCI-hR0B04 se atenuó drásticamente en las células transfectadas con pCI-hR0B04-AC (mutante de supresión de región intracelular de hR0B04), demostrando que el el incremento en la actividad promotora de IL-8 detectada en las células transfectadas con pCIhR0B04 requiere la región intracelular de ROB04 (Figura 2) . Por consiguiente, el incremento en la actividad promotora de IL-8 en las células transfectadas con pCI-hR0B04 demostró que fue detectada la activación de la señal descendente de ROB04 downstream signal .

Ejemplo 4 Propiedades de MAbl 4) -1 Activación de señal descendente de ROB04 por parte de MAbl Las células transfectadas con pCI-hROB04 o las células transfectadas con el modelo de preparadas en 3) -3 se cultivaron por una noche. Al día siguiente, cada anticuerpo anti-ROB04 (MAbl, MAb2 , MAb3 , o MAb4) o un IgGl de ratón de control negativo (fabricado por R&D systems, Inc.) se adicionó a las mismas a concentraciones de 0, 0.3125, 1.25, 5, y 20 ug/mL o 0, 0.25, 1.4, y 16 ug/ml, y las células se cultivaron a 37°C durante 5 horas en condiciones de C02 al 5%. Luego se determinaron las actividades de luciferasa de luciérnaga y luciferasa de renilla de cada pozo como intensidad de luminiscencia en un lector de placa (Mithras) usando el sistema de ensayo de luciferasa DualGlo (fabricado por Promega Corp.), y la actividad reportera de cada pozo fue calculada de acuerdo con la siguiente ecuación: actividad reportera = actividad de luciferasa de luciérnaga intensidad de luminiscencia derivada/actividad de luciferasa de renilla - intensidad de luminiscencia derivada. Como resultado, la IgG de ratón de control negativo no influyó en la actividad promotora de IL-8 en las células que expresan transitoriamente ROB04 humano, mientras que MAbl incrementó la actividad promotora de IL-8 (Figura 3) . Tal como en MAbl, MAb2 también incrementó la actividad promotora de IL-8, mientras que MAb3 o MAb4 no aumentaron la actividad promotora de IL-8 (Figura 4) . En las células del modelo pCI, MAbl o MAb2 no aumentaron la actividad promotora de IL-8. Estos resultados demostraron que MAbl activo la señal descendente de ROB04 y no todos los anticuerpos contra ROB04 activaron la señal descendente de R0B04.

MAb3 y MAb4 que de manera confirmada no incrementaron la actividad de la señal descendente de ROB04 se evaluaron para actividad promotora en presencia de anticuerpos de enlace cruzado (fragmento específico IgG Fe anti ratón de cabra AffiPure, Cat NO. 115-005-071, Jackson ImmunoResearch) (dos moléculas de anticuerpo de enlace cruzado con respecto a una molécula de Ab3 o MAb4) . Como resultado se observó el incremento en la actividad promotora para ambos anticuerpos. 4) -2 Ensayo de migración de HUVEC Se cultivó HUVEC (fabricado por KURABO INDUSTRIES LTD.) por una noche en HuMedia-EB2 (fabricado por KURABO INDUSTRIES LTD.) que contenía 0.1 % de BSA a 37°C en condiciones de CO2 al 5% y y luego se ajustó a 4 x 105 células/mL con HuMedia-EB2 que contenía 0.1 % de BSA. 0.25 mL de la suspensión de células que tenía una concentración de 4 x 105 células/mL se adicionaron a la capa superior de una cámara en un sistema de inserción de pozos múltiples BD Falcon FluoroBlok 24 (tamaño de poro: 8 yira) que tenía una membrana recubierta de gelatina. Luego, se adicionó HuMedia-EB2 que contenía 0.1 % de BSA y 10 ng/mL de VEGF165 humano (fabricado por PeproTech Inc.) o bFGF humano (BD Biosciences) y 2 µg/mililitros de IgG2a de ratón o de cada anticuerpo anti-ROB04 (MAbl , MAb2 , MAb3 , o MAb4) a la capa inferior de la cámara. Después de incubar a 37 °C durante 2 a 3 horas en condiciones de CO2 al 5%, el HUVEC que emigró a la capa inferior se tinturó con HuMedia-EB2 que contenía 4 µg/mililitro de Calcein-AM (fabricado por Life Technologies Corp.) durante 15 minutos. Luego se midió la intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación/longitud de onda de fluorescencia: 485 nm/538 nm) de cada pozo usando un lector de placa (Flex Station; Molecular Devices, LLC), y se calculó la cantidad de células migrantes en cada pozo de acuerdo con la siguiente ecuación: cantidad de células migrantes = intensidad de fluorescencia de pozo suplementado con HUVEC - intensidad de fluorescencia de pozo sin suplemento de HUVEC. Como resultado, MAbl suprimió la migración de HUVEC inducida por VEGF o bFGF (Figura 5) . Tal como en MAbl, MAb2 también suprimió la migración de HUVEC inducida por bFGF, mientras que MAb3 o MAb4 no suprimieron la migración de células (Figura 6) . Los resultados demostraron que el incremento de en la actividad promotora de IL-8 por el anticuerpo anti-R0B04 se correlacionó con la actividad supresora frente a la migración de HUVEC. 4) -3 Reactividad especies cruzadas 4) -3-1 Preparación de células que expresan gen de antígeno Se inocularon células HEK293 a una concentración de 1.5 x 106 células/plato a un plato de 60 mm (fabricado por Corning Inc.) y se cultivaron por una noche en un medio DMEM que contenía 10% de FBS a 37°C en condiciones de C02 al 5%. Al día siguiente, las células HEK293 se transíectaron con pCI-hR0B04, pCI-mR0B04, pCI-raR0B04, pCI-FLAGcynoR0B04 -1 , pCI-FLAG-cynoROB04-2, pCI-hROBOl, pCI-hROB02, o pCIhROB03 usando reactivo de transfeccion FuGENE6 y se siguió cultivándose por una noche a 37 °C en condiciones de CO2 al 5%. Al día siguiente, las células transf ectadas con el vector de expresión se trataron con TrypLE Express (fabricado por Life Technologies Corp.) , se lavaron con PBS que contenía 5% de FBS, y luego se suspendieron en PBS que contenía 5% de FBS. La suspensión de células obtenida se uso en análisis de citometría de flujo. 4) -3-2 Análisis de citometría de flujo Cada suspensión de células preparada en 4) -3-1 se centrifugó y se retiró el sobrenadantes. Luego se adicionó MAbl o una IgG2 de ratón de control negativo a una concentración de 10 ug/mililitro a 2 x 105 células transf ectadas con vector de expresión, y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 °C por 1 hora. Las células se lavaron una vez con PBS que contenía 5% de FBS. Luego, a esto se adicionó conjugado de IgG FITC anti ratón diluido 1000 veces con PBS que contenía 5% de FBS, y la suspensión resultante se dejó en reposo 4 °C durante 1 hora. Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía 5% de FBS, luego se re-suspendieron en PBS que contenía 5% de FBS, y se sometieron a detección usando un citómetro de flujo (BD FACSCalibur) . Los datos se analizaron usando Flowjo. Se preparó el histograma de intensidad de fluorescencia de FITC. Se determinó que el anticuerpo se enlaza de un modo de especies cruzadas cuando se ha desplazado el histograma de MAbl a una región de intensidad de fluorescencia más fuerte en comparación con el histograma de la IgG2a de ratón de control negativo. Los resultados del estudio de reactividad de especie cruzada demostraron que MAb 1 no se enlazaba a R0B04 de ratón o a R0B04 de rata, pero se enlazaba a R0B04 humano y R0B04 de mono cynomulgus (Figura 7) . 4) -4 Especificidad de enlazamiento 4) -4-1 Preparación de células que expresan gen de antígeno Se inocularon células HEK293 a una concentración de 1.2 x 106 células/plato o 1.5 x 106 células/plato a un plato de 60 mm (fabricado por Corning Inc.) y se cultivaron por una noche en un medio DMEM que contenía 10% de FBS a 37°C en condiciones de CO2 al 5%. Al día siguiente, las células HE 293 se transfectaron con pCI-hR0BO4, pCI-FLAG-hROBOl, pCI-hROB02, o pCI-hROB03 usando reactivo de transfección FuGEE6 y siguieron cultivándose por una noche a 37°C en condiciones de CO2 al 5%. Al día siguiente se trataron las células transíectadas con vector de expresión con TrypLE Express (fabricado por Life Technologies Corp.), se lavaron con PBS que contenía 5% de FBS, y luego se suspendieron en PBS que contenía 5% de FBS. La suspensión de células obtenida se usó en análisis de citometría de flujo. 4) -4-2 Análisis de citometría de flujo Cada suspensión de células preparada en 4) -4-1 fue centrifugada, y el sobrenadantes fue retirado. Luego, MAb 1, un anticuerpo R0B04 humano de control positivo (fabricado by R&D systems, Inc.), anticuerpo ANTI-FLAG M2 monoclonal producido en ratón (fabricado por Sigma-Aldrich Corp.), anticuerpo R0B02 humano (fabricado por R&D systems, Inc.), o anticuerpo R0B03 antihumano monoclonal (fabricado por R&D systems, Inc.), o una IgGl de ratón de control negativo o IgG2 de ratón se adicionó a una concentración de 10 µg/mililitro a 2 x 105 células transíectadas con vector de expresión, y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 °C por 1 hora. Las células se lavaron una vez con PBS que contenía 5% de FBS . Luego, se adicionó a esto conjugado de IgG FITC anti ratón diluido 1000 veces con PBS que contenía 5% de FBS, y la suspensión resultante se dejó en reposo 4 °C durante 1 hora. Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía 5% FBS, luego se re-suspendieron en PBS que contenía 5% de FBS, y se sometieron a detección usando un citómetro de flujo (BD FACSCalibur) . Se analizaron los datos usando Flowjo. Se preparó el histograma de intensidad de fluorescencia FITC. Se determinó que el anticuerpo se enlaza de manera específica cuando el histograma de MAb 1 se desplaza a una región de intensidad de fluorescencia más fuerte en comparación con el histograma de la IgGl de ratón o IgG2 de ratón. Los resultados demostraron que MAbl no se enlazaba con hROBOl, hROB02, o hROB03 y se enlazaba específicamente con hR0B04 (Figura 8) . En este contexto, se confirmó que hR0B04 , hROBOl, hROB02, y hROB03 se expresaba cada uno sobre la membrana celular usando el anticuerpo de control positivo (Figura 8) . 4) -5 Determinación de epítopo 4) -5-1 Preparación de células que expresan gen de antígeno Se inocularon células HEK293 a una concentración de 1.5 x 106 células/plato a un plato de 60 mm (fabricado por Corning Inc.) y se cultivó por una noche en un medio DMEM que contenía 10% FBS a 37°C en condiciones de CO2 al 5%. Al día siguiente se transíectaron las células HEK293 con pCI-FLAG-hR0B04-28, pCI-FLAG-hROB04-46, pCIFLAG-hR0B04 -132 , pCI-FLAG-hROBO4-210, pCI -FLAG-hR0B04 -225 , pCIFLAG-hROB04 -341 usando reactivo de transfección FuGENE6 y siguieron cultivándose por una noche a 37°C en condiciones de CO2 al 5%. Al día siguiente las células transfectadas con vector de expresión fueron tratadas con TrypLE Express (fabricado por Life Technologies Corp.), lavadas con PBS que contenía 5% de FBS, y luego suspendidas en PBS que contenía 5% de FBS. La suspensión celular obtenida se uso en análisis de citometría de flujo. 4) -5-2 Análisis de citometría de flujo Cada suspensión de células preparada en 4) -5-1 fue centrifugada y se retiró el sobrenadantes. Luego, MAbl, un anticuerpo ANTI-FLAG M2 monoclonal de control positivo, producido en ratón, o una IgG2a de ratón de control negativo se adicionaron a una concentración de 10 µg/mililitro a 2 x 105 células transfectadas con vector de expresión, y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4 °C por 1 hora. Las células se lavaron una vez con PBS que contenía 5% de FBS . Luego, a éstas se adicionó conjugado de FITC de IgG anti ratón diluido 1000 veces con PBS que contenía 5% de FBS, y la suspensión resultante se dejó en reposo a 4°C durante 1 hora. Las células se lavaron tres veces con PBS que contenía 5% de FBS, luego se resuspendieron en PBS que contenía 5% de FBS, y se sometieron a detección usando un citómetro de flujo (BD FACSCalibur; BD Biosciences) . Se analizaron los datos usando Flowjo. Se preparó el histograma de intensidad de fluorescencia FITC. Se determinó que el anticuerpo se enlazaba a una célula cuando el histograma de Ab 1 se desplazó a una región de intensidad de fluorescencia más fuerte en comparación con el histograma de IgG2a de ratón de control negativo. Los resultados demostraron que MAbl se enlazaba a las células transfectadas con pCI-FLAGhROB04-28, pCI-FLAG-hROB04-46 , o pCI -FLAG-hROB04 - 132 y nos enlazaba a las células transfectadas con pCI-FLAG-hROBO4-210, pCI-FLAG-hR0B04-225, o pCIFLAG-hR0B04 -3 1. De esta manera se mostró que MAbl reconocía la secuencia de aminoácidos de Nos. 132 a 209 en ROB04 humano mostrado en SEQ ID NO: 2 (Figura 9) . En este contexto, se confirmó que cada variante de supresión de región/dominio intracelular se expresaba sobre la membrana celular usando el anticuerpo anti-FLAG de control positivo (Figura 9) . 4) -6 Evaluación de la eficacia del medicamento en modelos de mono con neovascularización coroidal inducida con láser 4) -6-1 Anestesia Medetomidina clorhidrato (fabricado por Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) se inyectó intramuscularmente a una dosis de 0.04 mg/kg a cada mono cynomolgus . 15 minutos después se inyectó a éstos intramuscularmente quetamina clorhidrato (fabricado por Daiichi Sankyo Co., Ltd.) a una dosis de 15 mg/kg . 4) -6-2 Preparación de modelo Cada mono cynomolgus anestesiado en 4) -6-1 fue retenido en una silla para mono. Se aplicaron gotas oftálmicas de xilocaina al 4% (fabricadas por AstraZeneca pie) a ambos ojos para tratamiento anestésico/analgésico de la superficie del ojo. Se aplicaron gotas oftálmicas de una mezcla de 5 mg/mL detropicamida-5 mg/mL de fenilefrina clorhidrato (fabricadas por Santen Pharmaceutical Co., Ltd.) a los ojos para midriasis. La región macular de la retina se dañó térmicamente mediante irradiación con láser (cantidad de calor irradiado: 350-500 mW, tiempo de radiación: 0.1 segundos, tamaño del sitio: 50 µp?, número de sitios: 6 o 9 sitios) usando un fotocoagulador de láser verde OcuLight GLx (fabricado por Iridex Corp.). 4) -6-3 Administración de sustancia bajo prueba En el día 7 después de la preparación del modelo, se insertó una aguja 33G Nanopass al cuerpo vitreo de la conjuntiva, y se inyectaron 50 µ? de vehículo o 13.2 mg/mL de MAbl durante 2 minutos usando una jeringa Hamilton de 100 µ? por medio de un tubo de polietileno PE20. El ensayo se llevó a cabo en cada grupo involucrando 4 ojos. Después de terminar la administración, se aplicaron a los ojos 0.5% de hidrato de levofloxacina (fabricado por Santen Pharmaceutical Co., Ltd. ) . 4) -6-4 Evaluación de la eficacia del medicamento En los días 7, 14, y 21 después de la preparación de modelo, se fotografió el fondo del ojo mediante un método rutinario usando cámara de fondo híbrido CX-1 (fabricada por Canon Inc.) bajo anestesia. Luego se inyectó por vía intravenosa fluoresceína al 10% a una dosis de 0.1 mL/Kg. Después de terminar la inyección intravenosa de fluoresceína, se realizó una angiografía fluorescente cada 1 minuto hasta 6 minutos más tarde . Los datos de imagen se almacenaron y el área de un sitio en el cual se acumuló fluoresceína se calculó usando un analizador de imagen (WinRoof, fabricado por Mitani Corp.) . La cantidad de vasos sanguíneos recién formados se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: cantidad de vasos sanguíneos recién formados = área de sitio en el que se acumuló fluoresceína el día 21 después de la preparación de modelo - área del sitio donde se acumuló fluoresceína el día 7 después de la preparación de modelo. Como resultado de comparar la cantidad de vasos sanguíneos recién formados entre el grupo administrado con vehículo y el grupo administrado con MAbl, se confirmó que tres de los cuatro ojos en el grupo administrado con MAbl disminuyeron la cantidad de vasos sanguíneos recién formados aunque no se confirmó diferencia en la cantidad de vasos sanguíneos recién formados entre el ojo restante y el grupo de vehículo. Esto significa que la administración de MAbl suprimió la neovascularización coroidal inducida por láser (Figura 10) .

Ejemplo 5 Clonación y secuenciación de ADNc de MAbl 5) -1 Determinación de secuencias de aminoácidos con N-terminal de las cadenas pesada y ligera de MAbl A fin de determinar la secuencia de aminoácidos con N-terminal de las cadenas pesada y ligera de MAbl, se separó MAbl purificada en el ejemplo 2) -8 mediante SDS-PAGE. Las proteínas separadas de esta manera en el gel se transfirieron desde el gel a una membrana Sequi-Blot PVDF (Bio-Rad Laboratories, Inc.), la cual a su vez se lavó con un amortiguador de lavado (NaCl de 25 mM, amortiguador de borato de sodio de 10 mM, pH 8.0), luego se tinturó mediante inmersión por 5 minutos en una solución para tinturar (50% de metanol , 20% de ácido acético, 0.05% de Coomassie Brilliant Blue) , y luego se descolorizó 90% de metanol . Se disociaron porciones de banda correspondientes a la cadena pesada (banda con movilidad más pequeña) y la cadena ligera (banda con movilidad más grande) visualizadas en la membrana de PVDF. Sus respectivas secuencias de aminoácidos con N-terminal se identificaron de acuerdo con el método automático de Edman (véase Edman et al., (1967) Eur. J. Biochem. 1,80) usando secuenciador de proteína Procise cLC modelo 492cLC (Applied Biosystems, Inc.). Como resultado, la secuencia de aminoácidos con N-terminal de la banda correspondiente a la cadena pesada de MAbl fue EVQLVESGGGLVKPGGSLKL, y la secuencia de aminoácidos con N-terminal de la banda correspondiente a la cadena ligera fue DAVMTQTPLSLPVSL . 5) -2 Preparación de mRNA a partir de hibridoma que produce MAbl A fin de clonar ADNcs de MAbl que codifican cadena pesada y cadena ligera, se preparó ARNm a partir de hibridoma que produce MAbl usando un kit de aislamiento de ARNm (Roche Applied Science) . 5) -3 Clonación y secuenciación de ADNc de MAbl Se sintetizaron diversos cebadores de oligonucleótido que hibridan a la secuencia 51 -terminal de la región codificante del gen de anticuerpo y la secuencia 3' -terminal del mismo que contiene codón de parada, respectivamente, con referencia a las secuencias de aminoácidos N-terminal de las cadenas pesada y ligera determinadas con base en los isótopos ?? y ? de las cadenas pesada y ligera de MAbl, respectivamente (Ejemplos 2)-7) y 5-1), y la base de datos de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo preparada por Kabat et al. (véase Strausberg, R. L. , et al. (2002) Proc . Nati. Acad. Sci . U. S. A. 99. 16899-16903, y Kabat, E. A., et al. (1991) en Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico Vol . I y II, Departmento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos) . Se amplificaron ADNcs que codifican cadena pesada y cadena ligera usando el ARNm preparado en 5) -2 y el kit TaKaRa One Step RNA PCR (AMV) (Takara Bio Inc.). Como resultado, se amplificaron exitosamente los ADNcs del anticuerpo que codifican cadena pesada de cadena ligera usando el siguiente conjunto de cebadores: conjunto de cebador para la cadena pesada LYHF6 : 5 ' -cctcaccatgaactttgg-31 G1EVR1 : 5 ' -aagatatcttatttaccaggagagtgggagag-3 ' conjunto de cebador para la cadena ligera MK19EIF1 : 51 -aagaattcatgaagttgcctgttagg-31 KEVR1 : 51 -aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3 ' Los ADNcs de cadena pesada y ligera, amplificados mediante PCR, se clonaron por separado usando el kit de expresión pEF6N5-His TOPO TA (Invitrogen Corp.). Las secuencias de nucleótido de los ADNcs clonados que codifican las respectivas regiones variables de las cadenas pesada y ligera se determinaron usando un secuenciador de genes ( "ABI PRISM 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems" o "Applied Biosystems 3730x1 Analyzer; Applied Biosystems"). La reacción de secuenciación se realizó usando GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.).

La secuencia de nucleótido determinada de ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de MAbl se muestra en SEQ ID NO: 30, y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO : 31. La secuencia de nucleótido de ADNc que codifica la región variable de cadena ligera del anticuerpo de ratón MAbl se muestra en SEQ ID NO: 32, y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 33.

Ejemplo 6 Preparación de MAbl quimérica (cMAb 1) 6)-l Preparación de vectores de expresión pCMA-LK, pCMA-Gl, y pCMA-G2 6) -1-1 Construcción de vector de expresión de cadena ligera quimérico y humanizado pCMALK Se digirió un plásmido pADNc3.3 -TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.) con enzimas de restricción Xbal y Pmel, y el fragmento obtenido de aproximadamente 5.4 kb fue ligado a un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 34) que codifica una señal secretoria de cadena ? humana y una región constante de cadena ? humana usando el kit de clonación In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) para preparar pADNc3.3/LK.

Se realizó PCR con pADNc3.3/LK como una plantilla que usa un conjunto de cebadores mostrados más adelante. El fragmento obtenido de aproximadamente 3.8 kb se fosforiló y luego se auto-ligó para construir, a partir de pADNc3.3/LK, un vector de expresión pCMA -LK de cadena ligera quimérico y humanizado, el cual tiene una secuencia que codifica secuencia de señal, un sitio de clonación y una secuencia que codifica la región constante de cadena ? humana en dirección descendente de un promotor CMV.

Conjunto de cebadores 3. 3 -F 1: 51 -tataccgtcgacctctagctagagcttggc-31 3. 3-R 1: 51 -gctatggcagggcctgccgccccgacgttg-31 6) -1-2 Construcción de vector de expresión pCMA -Gl quimérico y de cadena pesada de tipo IgGl humanizado Se digirió pCMA-LK con Xbal y Pmel para retirar una secuencia que codifica una señal secretoria de cadena ? y una región constante de cadena ? humana. El fragmento de ADN resultante se ligó a un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 35) que codifica los aminoácidos de una secuencia de señal de cadena pesada humana y una región constante de IgGl humana usando el kit de clonación In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión pCMA-Gl de cadena pesada de tipo IgGl quimérico y humanizado que tiene una secuencia que codifica secuencia de señal, un sitio de clonación y una secuencia que codifica la región constante de la cadena pesada de IgGl humana en dirección descendente de un promotor CMV. 6) -1-3 Construcción de un vector de expresión pCMA-G2 quimérico y de cadena pesada de tipo IgG2 humanizada Se digirió pCMA-LK con Xbal y Pmel para retirar una secuencia que codifica una señal secretoria de cadena ? y una región constante de cadena ? humana. El fragmento de ADN resultante se ligó a un fragmento de ADN que comprende una secuencia de ADN (SEQ ID NO: 36) que codifica los aminoácidos de una secuencia de señal de cadena pesada humana y una región constante de IgG2 humana usando el kit de clonación In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de cadena pesada tipo IgG2 quimérico y humanizado, el cual tiene una secuencia que codifica secuencia de señal, un sitio de clonación y una secuencia que codifica la región constante de cadena pesada IgG2 humana en dirección descendente de un promotor CMV. 6) -2 Construcción de vector de expresión de cadena ligera MAbl quimérica Un sitio que comprende ADNc que codifica la región variable de cadena ligera se amplificó con ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de MAbl como una plantilla que usa KOD-Plus- (TOY0B0 CO . , LTD.) y un conjunto de cebadores mostrados más adelante, y se insertó en un sitio disociado con BsiWI enzima de restricción del vector pCMA-LK de propósitos generales para expresión de cadena ligera del anticuerpo quimérico y humanizado usando el kit de clonación In-Fusion Advantage PCR t (Clontech Laboratories, Inc.) para construir vector de expresión de cadena ligera MAbl quimérico. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-LK/MAbl L". La secuencia de nucleótido que codifica la cadena ligera de MAbl quimérico se muestra en SEQ ID NO: 37 ,y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 38. Nucleótidos Nos. 1 a 60 de SEQ ID NO: 37 representan la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de señal. Nucleótidos Nos. 61 a 402 de la misma representan la secuencia de nucleótido que codifica la región variable. Nucleótidos Nos. 403 a 717 de la misma representan la secuencia de nucleótido que codifica la región constante. Aminoácidos Nos. 1 a 20 de SEQ ID NO: 38 representan la secuencia de aminoácidoss de la secuencia de señal. Aminoácidos Nos. 21 a 134 de la misma representan la secuencia de aminoácidoss de la región variable región. Aminoácidos Nos. 135 a 239 representan los aminoácidos de la región constante.

Conjunto de cebadores para la cadena ligera MAbl LF: 5'-tctccggcgcgtacggcgatgctgtgatgacccaaactccactctcc-31 MAbl LR: 5'-ggagggggcggccacagcccgtttgatttccagcttggtgcctcc-31 6) -3 Construcción de vector de expresión de cadena pesada de tipo IgGl de MAbl quimérico Se amplificó un sitio que comprende ADNc que codifica la región variable de cadena pesada con ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de MAbl como una plantilla usando KOD-Plus- (TOYOBO CO.f LTD.) y un conjunto de cebadores mostrados más adelante, y se insertó a un sitio disociado con Esi I enzima de restricción del vector de expresión pCMA-Gl de cadena pesada tipo IgGl quimérico y humanizado usando el kit de clonación In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de cadena pesada tipo IgGl de MAbl quimérico. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-Gl/MAbl H" . La secuencia de nucleótido que codifica la cadena pesada tipo IgGl MAbl quimérico se muestra en SEQ ID NO: 39, y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 40. Nucleótidos Nos. 1 a 57 de SEQ ID NO: 39 representan la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de señal. Nucleótidos Nos. 58 a 411 de la misma representan la secuencia de nucleótido que codifica la región variable. Nucleótidos Nos. 412 to 1401 de la misma representan la secuencia de nucleótido que codifica la región constante. Aminoácidos Nos. 1 a 19 de SEQ ID NO: 40 representan la secuencia de aminoácidos de la secuencia de señal. Aminoácidos Nos. 20 a 137 de la misma representan la secuencia de aminoácidos de la región variable. Aminoácidos Nos. 138 a 467 representan la secuencia de aminoácidos de la región constante.

Conjunto de cebadores para la cadena pesada de tipo IgGl MAbl HF: 51 -cagatgggtgctgagcgaagtgcagctggtggagtctgggggag- 31 MAbl H1R: 5'-ttggtggaggctgagctgactgtgagagtggtgccgtggccccag-31 6) -4 Construcción de vector de expresión de cadena pesada tipo IgG2 MAbl quimérico Se amplificó un sitio A que comprende ADNc que codifica la región variable de cadena pesada con ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de MAbl como una plantilla que usa KOD-Plus- (T0Y0B0 CO., LTD.) y un conjunto de cebadores que se muestra más adelante, y se insertó a un sitio disociado por BsiWI enzima de restricción del vector de expresión pCMA-G2 de cadena pesada tipo IgG2 quimérico y humanizado usando el kit de clonación In-Fusion Advantage PCR (Clontech Laboratories, Inc.) para construir un vector de expresión de cadena pesada tipo IgG2 MAbl quimérico. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMAG2/MAbl " . La secuencia de nucleótido que codifica la cadena pesada tipo IgG2 MAbl quimérico se muestra en SEQ ID NO: 41 , y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 42.

Conjunto de cebador para la cadena pesada tipo IgG2 MAbl HF: 51 -cagatgggtgctgagcgaagtgcagctggtggagtctgggggag- 3 ' MAbl 2 : 5'-ttggtgctggctgagctgactgtgagagtggtgccgtggccccag-31 Ejemplo 7 Preparación de anticuerpo MAbl quimérico tipo IgGl y anticuerpo MAbl quimérico tipo IgG2 7) -1 Producción de anticuerpo MAbl quimérico tipo IgGl y anticuerpo MAbl quimérico tipo IgG2 Se subcultivaron y cultivaron de acuerdo con el manual células FreeStyle 293-F (Invitrogen Corp.). Se inocularon 1.2 x 109 células de células FreeStyle 293-F (Invitrogen Corp.) en fase de crecimiento logarítmico a un matraz de Erlenmeyer Fernbach de 3 1 (Corning Inc.), se diluyeron con medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) en 1.0 x 106 células/mL, y luego se cultivaron mientras se agitaban en una incubadora de C02 al 8% a 90 rpm a 37°C durante 1 hora. Se disolvieron 3.6 mg de polietilenimina (Polysciences , Inc., #24765) en 20 mi de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). A continuación se suspendieron un vector de expresión de cadena H (0.4 mg) y un vector de expresión de cadena L (0.8 mg) preparados usando el kit de plásmido PureLink HiPure (Invitrogen Corp.) en 20 mi de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.) . 20 mL de la noción de mezcla de vector de expresión/Opti-Pro SFM se adicionaron a 20 mi de solución de mezcla de polietilenimina/Opti-Pro SFM y la mezcla gradualmente se revolvió, se dejó por otros 5 minutos y luego se adicionaron a las células FreeStyle 293-F. Las células se cultivaron mientras se agitaban en una incubadora con CO2 al 8% a 90 rpm a 37°C por 7 días, y el sobrenadante de cultivo obtenido se filtró a través de un filtro de cápsula desechable Disposable Capsule Filter (Advantec, #CCS-045-EIH) .

Los anticuerpos MAbl quiméricos tipo IgGl-tipo y tipo IgG2 obtenidos mediante las combinaciones entre pCMA-Gl/MAbl H y pCMA-LK/MAbl L y entre pCMA-G2/MAbl H y pCMA-LK/MAbl L se abrevian a "cMAbl-l" y "cMAbl-2", respectivamente. El término "cMAbl" pica anticuerpos MAbl quimérico se tanto del tipo IgGl como del tipo IgG2. 7) -2 Purificación de cMAbl-l y cMAbl-2 El sobrenadante de cultivo obtenido antes en 7-1) fue purificado mediante cromatografía de afinidad de rProteína A (a 4-6°C) . Se llevó a cabo a temperatura ambiente un paso de reemplazo de amortiguador después de la purificación por cromatografía de afinidad de rProteína A. primero, se aplicaron 1100 a 1200 mi del sobrenadante de cultivo a MabSelect SuRe (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Crop . , columna HiTrap; volumen 1 mL x 2 conectado) se equilibró con PBS. Toda la solución de cultivo se colocó en la columna y luego la columna se lavó con PBS. A continuación se realizó una elución con una solución de arginina clorhidrato de 2 M (pH 4.0) para recoger una fracción que contiene anticuerpo. El amortiguador en esta fracción se reemplazó por PBS usando una columna de desalinización (fabricada por GE Healthcare Bio-Sciences Corp., columna de desalinización HiTrap; volumen 5 mL x 2 conectado) . Finalmente se concentró la fracción con un dispositivo de filtro UF de centrífuga VIVASPIN20 (peso molecular límite: 30 K, Sartorius, a 4°C) hasta una concentración de IgG de 20.0 mg/mL o superior y se uso como muestra de purificación. 7) -3 Propiedades de cMAbl-1 y cMAbl-2 7) -3-1 Activación de señal descendente de R0B04 Este ensayo se llevó a cabo de acuerdo con el método de 4)-l excepto que: se usó IgG humana (fabricada por Sigma-Aldrich Corp.) como un control negativo; y se adicionaron IgG humana, cMAbl-1, o cMAbl-2 a una concentración final de 0.313 µg/mililitro a un medio. Como resultado, la Ig humana de control negativo no influyó en la actividad promotora de IL-8 en las células que expresan transitoriamente R0B04 humano, mientras que cMAbl-1 y cMAbl-2 incrementaron la actividad promotora de IL-8 (Figura 11) . Estos resultados demostraron que cMAbl-1 o cMAbl-2 activaron la señal descendente de R0B04, tal como en MAbl. 7) -3-2 Ensayo de migración de HUVEC Este ensayo se llevó a cabo de acuerdo con el método de 4) -2 excepto que: se usó IgG humana como un control negativo; y se adicionaron IgG humana, cMAb 1-1, o cMAb 1-2 a una concentración final de 0.5 µg/mililitro a un medio. Como resultado, cMAbl-1 o cMAbl-2 suprimieron la migración de HUVEC inducida por bFGF (Figura 12) . Estos resultados demostraron que cMAbl-1 o cMAbl-2 suprimieron la migración de HUVEC, tal como en MAbl.

Ejemplo 8 Diseño de anticuerpo humanizado de anticuerpo MAbl monoclonal ROB04 anti-humano de ratón 8) -1 Diseño de versión humanizada de MAbl 8) -1-1 Modelación molecular de región variable de MAbl La modelación molecular de las regiones variables de MAb 1 se llevó a cabo mediante un método de modelación de homología conocido en términos generales (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). La secuencias de cebador (disponibles como estructuras tridimensionales inducidas a partir de estructuras cristalinas de rayos X) de las regiones variables de inmunoglobulina humana registradas en el banco de datos de proteínas (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) se compararon con aquellas de las regiones variables de MAbl determinada de esta manera. Como resultado se seleccionó 3FFD debido a su homología de secuencia más alta con la región variable de cadena pesada de MAbl entre anticuerpos deficientes en armazón. También se seleccionó 1T66 debido a su homología de secuencia más alta con la región variable de cadena ligera MAbl. Las estructuras tridimensionales de las regiones de armazón se prepararon obteniendo un "modelo de armazón"a partir de la combinación de las coordenadas de 3FFD y 1T66 correspondientes a las cadenas pesada y ligera de MAbl. En cuanto a los CDRs de MAbl, CDRL1, CDRL2, CDRL3 , CDRH1 , y CDRH2 se asignaron a los grupos 16A, 7A, 9A, 10A, y 10B, respectivamente, de acuerdo con la clasificación de Thomton et al. (J. Mol. Biol., 263,800-815, (1996)). Se clasificó CDRH3 en k(7)B usando la regla de H3 (FEBS letter 399, 1-8 (1996)) . A continuación, se incorporó la conformación típica de cada COR al modelo de armazón.

Finalmente se llevó a cabo un cálculo de energía para excluir contacto interactúa mi o desventajoso a fin de obtener un modelo molecular que probablemente sean las regiones variables de MAbl en términos de energía. Estos procedimientos se realizaron usando un programa Prime de predicción de estructura tridimensional de proteína, disponible comercialmente, y un programa de búsqueda coordinada MacroModel (Schrodinger, LLC) . 8) -1-2 Diseño de secuencia de aminoácidos de MAbl humanizado Cada anticuerpo MAbl humanizado (hMAbl) fue construido mediante un método de injerto de CDR conocido en términos generales (Proc. Nati. Acad. Sci . USA 86, 10029-10033 (1989) ) . Dos anticuerpos aceptantes diferentes se seleccionaron con base en la homología de aminoácidos en regiones de armazón. Las secuencias de las regiones de armazón de MAbl se compararon con todas las armazones humanas en la base de datos de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo Kabat (Nuc. Acid Res. 29,205-206 (2001)). Como resultado se seleccionó un anticuerpo B3 como un aceptante debido a su 83% de homología de secuencia con las regiones de armazón. Los residuos de aminoácidos de las regiones de armazón B3 se alinearon con aquellos de MAbl para identificar las posiciones de diferentes aminoácidos usados. Estas posiciones de los residuos se analizaron usando el modelo tridimensional de MAbl construido antes. Luego, se seleccionaron residuos donantes que iban a insertarse en el aceptante de acuerdo con los criterios dados por Queen et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Algunos residuos donantes seleccionados se integraron al anticuerpo aceptante reconstruir la secuencia de MAbl humanizado tal como se describe en los ejemplos más adelante. También se construyeron variantes de hMAbl mediante la sustitución de 1 a 3 residuos de aminoácidos en cada CDR de hMAbl con otros residuos de aminoácidos, tal como se describe en los ejemplos más adelante. 8) -2 Humanización de cadena pesada de cMAbl 8) -2-1 Cadena pesada de tipo hMAbl-Hl: Una cadena pesada de MAb 1 humanizada señalada mediante reemplazo de aminoácido No. 32 (lisina) con glutamina, aminoácido No. 38 (lisina) con arginina, aminoácido No. 59 (treonina) con alanina, aminoácido No. 61 (ácido glutámico) con glicina, aminoácido No. 63 (arginina) con glicina, aminoácido No. 95 (ácido glutámico) con lisina, aminoácido No. 103 (serina) con asparagina, aminoácido No. 107 (serina) con alanina, aminoácido No. 112 (metionina) con valina, aminoácido No. 114 ( fenilalanina) con tirosina, aminoácido No. 129 (histidina) con glutamina, aminoácido No. 132 (treonina) con leucina, y aminoácido No. 133 (leucina) con valina, en la cadena pesada de cMAbl -2 representada por SEQ ID NO: 42 se denominó "cadena pesada tipo hMAbl-Hl".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo hMAbl-Hl se muestra en SEQ ID NO: 56. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 1 a 19, una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 20 a 137, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 138 a 463 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 corresponden a una secuencia de señal, una región variable de cadena pesada, y una región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 50 a 54, una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 69 a 85, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 118 a 126 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 corresponden a una secuencia de CDRH1, una secuencia de CDRH2, y una secuencia de CDRH3 , respectivamente. Una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 se muestra en SEQ ID NO: 55. Una secuencia consistente de nucleótidos 1 a 57, una secuencia consistente de nucleótidos 58 a 411, y una secuencia consistente de nucleótidos 412 a 1389 en la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 55 codifican la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 55 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 también se muestran en las Figuras 31 y 32, respectivamente. 8) -2-2 Cadena pesada tipo hMAbl-H2: Una cadena pesada de MAbl humanizado diseñada mediante reemplazo de aminoácido No. 32 (lisina) con glutamina, aminoácido No. 38 (lisina) con arginina, aminoácido No. 59 (treonina) con alanina, aminoácido No. 61 (ácido glutámico) con glicina, aminoácido No. 63 (arginina) con glicina, aminoácido No. 72 (asparagina) con glutamina, aminoácido No. 95 (ácido glutámico) con lisina, aminoácido No. 103 (serina) con asparagina, aminoácido No. 107 (serina) con alanina, aminoácido No. 112 (metionina) con valina, aminoácido No. 114 (fenilalanina) con tirosina, aminoácido No. 129 (histidina) con glutamina, aminoácido No. 132 (treonina) con leucina, y aminoácido No. 133 (leucina) con valina, en la cadena pesada de cMAbl-2 representada por SEQ ID NO: 42 se denominó "cadena pesada tipo hMAb 1-H2".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo hMAbl-H2 se muestra en SEQ ID NO: 58. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos residues 1 a 19, una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 20 a 137, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 138 a 463 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 corresponden a una secuencia de señal, una región variable de cadena pesada, y una región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 50 a 54, una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 69 a 85, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 118 a 126 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 corresponden a una secuencia de CDRH1, una secuencia de CDRH2, y una secuencia de CDRH3 , respectivamente. Una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 se muestra en SEQ ID NO: 57. Una secuencia consistente en nucleótidos 1 a 57, una secuencia consistente de nucleótidos 58 a 411, y una secuencia consistente en nucleótidos 412 a 1389 en la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 57 codifican la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente.

La secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 57 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58 también se muestran en las Figuras 33 y 34, respectivamente. 8) -2-3 Cadena pesada tipo hMAbl-H3 : Una cadena pesada de MAbl humanizado diseñado por reemplazo de aminoácido No. 32 (lisina) con glutamina, aminoácido No. 38 (lisina) con arginina, aminoácido No. 59 (treonina) con alanina, aminoácido No. 61 (ácido glutámico) con glicina, aminoácido No. 95 (ácido glutámico) con lisina, aminoácido No. 103 (serina) con asparagina, aminoácido No. 107 (serina) con alanina, aminoácido No. 112 (metionina) con valina, aminoácido No. 114 (fenilalanina) con tirosina, aminoácido No. 129 (histidina) con glutamina, aminoácido No. 132 (treonina) con leucina, y aminoácido No. 133 (leucina) con valina, en la cadena pesada de cMAbl-2 representada por SEQ ID NO: 42 se denominó una "cadena pesada tipo hMAbl-H3 " .

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo hMAbl-H3 - se muestra en SEQ ID NO: 60. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 1 a 19, una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 20 a 137, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 138 a 463 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 corresponden a una secuencia de señal, una región variable de cadena pesada, y una región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 50 a 54, una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 69 a 85, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 118 a 126 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 corresponden a una secuencia de CDRH1, una secuencia de CDRH2, y una secuencia de CDRH3 , respectivamente. Una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 se muestra en SEQ ID NO: 59. Una secuencia consistente en nucleótidos 1 a 57, una secuencia consistente de nucleótidos 58 a 411, y una secuencia consistente en nucleótidos 412 a 1389 en la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 59 codifican la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente .

La secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 59 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 también se muestran en las Figuras 35 y 36, respectivamente. 8) -2-4 Cadena pesada tipo hMAbl-H4 : Una cadena pesada de MAbl humanizado diseñada reemplazando aminoácido No. 32 (lisina) con glutamina, aminoácido No. 38 (lisina) con arginina, aminoácido No. 59 (treonina) con alanina, aminoácido No. 61 (ácido glutámico) con glicina, aminoácido No. 72 (asparagina) con glutamina, aminoácido No. 95 (ácido glutámico) con lisina, aminoácido No. 103 (serina) con asparagina, aminoácido No. 107 (serina) con alanina, aminoácido No. 112 (metionina) con valina, aminoácido No. 114 (fenilalanina) con tirosina, aminoácido No. 129 (histidina) con glutamina, aminoácido No. 132 (treonina) con leucina, y aminoácido No. 133 (leucina) con valina, en la cadena pesada de cMAbl-2 representada por SEQ ID NO: 42 se denominó "cadena pesada tipo hMAbl-H4".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo hMAbl-H4 se muestra en SEQ ID NO: 62. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 1 a 19, una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 20 a 137, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 138 a 463 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 corresponden a una secuencia de señal, una región variable de cadena pesada, y una región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 50 a 54, una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 69 a 85, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 118 a 126 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 corresponden a una secuencia CDRH1, una secuencia CDRH2, y una secuencia CDRH3 , respectivamente. Una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 se muestra en SEQ ID NO: 61. Una secuencia consistente en nucleótidos 1 a 57, una secuencia consistente en nucleótidos 58 a 411, y una secuencia consistente en nucleótidos 412 a 1389 en la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 61 codifican la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 61 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 también se muestran en las Figuras 37 y 38, respectivamente . 8) -3 Humanización de cadena ligera de MAbl 8) -3-1 Cadena ligera de tipo hMAbl-Ll: Una cadena ligera de MAbl humanizado diseñada reemplazando aminoácido No. 22 (alanina) con isoleucina, aminoácido No. 27 (treonina) con serina, aminoácido No. 34 (serina) con treonina, aminoácido No. 37 (ácido aspártico) con ácido glutámico, aminoácido No. 38 (glutamina) con prolina, aminoácido No. 62 (fenilalanina) con leucina, aminoácido No. 84 (leucina) con prolina, aminoácido No. 108 (fenilalanina) con valina, aminoácido No. 112 (fenilalanina) con tirosina, aminoácido No. 125 (glicina) con prolina, aminoácido No. 129 (leucina) con valina, aminoácido No. 130 (ácido glutámico) con ácido aspártico, y aminoácido No. 134 (alanina) con treonina, en la cadena ligera de cMAbl representada por SEQ ID NO: 38 se denominó "cadena ligera de tipo hMAbl-Ll " .

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera tipo hMAbl-Ll se muestra en SEQ ID NO: 64. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 1 a 20, una secuencia consistente de residuos de aminoácidos 21 a 134, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 135 a 239 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 corresponden a una secuencia de señal, una región variable de cadena ligera, y una región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 44 a 59, una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 75 a 81, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 114 a 122 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 corresponden a una secuencia CDRL1, una secuencia CDRL2, y una secuencia CDRL3 , respectivamente. Una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 se muestra en SEQ ID NO: 63. Una secuencia consistente en nucleótidos 1 a 60, una secuencia consistente en nucleótidos 61 a 402, y una secuencia consistente en nucleótidos 403 a 717 en la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 63 codifican la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena ligera, y la secuencia de región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 63 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64 también se muestran en las Figuras 39 y 40, respectivamente . 8) -3-2 Cadena ligera tipo hMAbl-L2 : Una cadena ligera de MAbl humanizado diseñada reemplazando aminoácido No. 22 (alanina) con isoleucina, aminoácido No. 27 (treonina) con serina, aminoácido No. 34 (serina) con treonina, aminoácido No. 37 (ácido aspártico) con ácido glutámico, aminoácido No. 38 (glutamina) con prolina, aminoácido No. 52 (serina) con ácido glutámico, aminoácido No. 54 (glicina) con lisina, aminoácido No. 56 (treonina) con leucina, aminoácido No. 62 ( fenilalanina) con leucina, aminoácido No. 84 (leucina) con prolina, aminoácido No. 108 (fenilalanina) con valina, aminoácido No. 112 ( fenilalanina) con tirosina, aminoácido No. 125 (glicina) con prolina, aminoácido No. 129 (leucina) con valina, aminoácido No. 130 (ácido glutámico) con ácido aspártico, y aminoácido No. 134 (alanina) con treonina, en la cadena ligera de cMAbl representada por SEQ ID NO: 38 se denominó una "cadena ligera tipo hMAbl-L2 " .

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera tipo hMAbl-L2 se muestra en SEQ ID NO: 66. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 1 a 20, una secuencia consistente de residuos de aminoácidos 21 a 134, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 135 a 239 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 corresponden a una secuencia de señal, una región variable de cadena ligera, y una región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 44 a 59, una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 75 a 81, y una secuencia consistente en residuos de aminoácidos 114 a 122 en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 corresponden a una secuencia CDRL1, una secuencia CDRL2, y una secuencia CDRL3, respectivamente. Una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 se muestra en SEQ ID NO: 65. Una secuencia consistente en nucleótidos 1 a 60, una secuencia consistente en nucleótidos 61 a 402, y una secuencia consistente en nucleótidos 403 a 717 en la secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 65 codifican la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena ligera, y la secuencia de región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de nucleótido de SEQ ID NO: 65 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66 también se muestran en las Figuras 41 y 42, respectivamente .

Ejemplo 9 Preparación de MAbl humanizado 9) -1 Construcción de vector de expresión de cadena pesada MAbl humanizado 9) -1-1 Construcción de vector de expresión de cadena pesada tipo hMAbl-Hl Se sintetizó ADN que comprende el gen que codifica la región variable de cadena pesada tipo hMAbl-Hl representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 56 (servicio de síntesis de gen artificial de GeneArt) y se disoció con una enzima de restricción BlpI . El fragmento de ADN obtenido se inserto a un sitio disociado por una enzima de restricción BlpI del vector de expresión (pCMA-G2) de cadena pesada tipo lgG2 quimérico y humanizado para construir un vector de expresión de cadena pesada tipo hMAbl-Hl. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-G2/hMAbl-Hl " . La secuencia de nucleótido de la cadena pesada tipo hMAbl-Hl se muestra en SEQ ID NO: 55. 9) -1-2 Construcción de vector de expresión de cadena pesada tipo hMAbl-H2 Se construyó un vector de expresión de cadena pesada tipo hMAbl-H2 con el pCMA-G2/hMAbl-Hl construido en 9) -1-1 como una plantilla que usa un conjunto de cebadores mostrados más adelante y el kit de mutagénesis dirigido al sitio QuikChange XL (Agilent Technologies, Inc.). El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-Gl/hMAbl-H211. La secuencia de nucleótido de la cadena pesada tipo hMAbl-H2 se muestra en SEQ ID NO: 57, y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 58.

Conjunto de cebadores: H-N53Q-F: 5' -gggtggcaaccatcagccaaggcggcacctacacctac-31 H-N53Q-R: 5 ' -gtaggtgtaggtgccgccttggctgatggttgccaccc-3 ' 9) -1-3 Construcción de vector de expresión de cadena pesada tipo hMAbl-H3 Se sintetizó ADN que comprende el gen que codifica la región variable de cadena pesada tipo hMAbl-H3 representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 60 (servicio de síntesis de gen artificial GeneArt) y se disoció con una enzima de restricción Blpl. El fragmento de ADN obtenido se inserto a un sitio disociado con enzima de restricción Blpl del vector de expresión (pCMA-G2) de cadena pesada tipo IgG2 quimérico y humanizado para construir un vector de expresión de cadena pesada tipo hMAbl-H3. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-G2lhMAbl-H3 " . La secuencia de nucleótido de la cadena pesada tipo h Abl-H3 se muestra en SEQ ID NO: 59. 9) -1-4 Construcción de vector de expresión de cadena pesada tipo hMAbl-H4 Se construyó un vector de expresión de cadena pesada tipo hMAbl-H4 con el pCMA-G2/hMAbl-H3 construido en 9) -1-3 como una plantilla que usa un conjunto de cebadores mostrados más adelante y el kit de mutagénesis dirigido al sitio QuikChange XL (Agilent Technologies, Inc.) . El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-Gl/hMAbl-H4 " . La secuencia de nucleótido de la cadena pesada tipo hMAbl-H4 se muestra en SEQ ID NO: 61, y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 62.

Conjunto de cebadores: H-N53Q-F: 5' -gggtggcaaccatcagccaaggcggcacctacacctac-31 H-N53Q-R: 51 -gtaggtgtaggtgccgccttggctgatggttgccaccc-3 ' 9) -2 Construcción de vector de expresión de cadena ligera MAbl humanizado 9) -2-1 Construcción de vector de expresión de cadena ligera tipo hMAbl-Ll Se sintetizó ADN que comprende el gen gene que codifica la región variable de cadena ligera tipo hMAbl-Ll representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64 (servicio de síntesis de gen artificial GeneArt) y se disoció con una enzima de restricción BsiWI. El fragmento de ADN obtenido se inserto a un sitio disociado por enzima de restricción BsiWI del vector de propósito general (pCMA-LK) para la expresión de cadena ligera de anticuerpo quimérico y humanizado para construir un vector de expresión de cadena ligera tipo hMAb 1-L1. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-LK/hMAbl-Ll" . La secuencia de nucleótido de la cadena ligera tipo hMAbl-Ll se muestra en SEQ ID NO: 63 . 9) -2-2 Construcción de vector de expresión de cadena ligera tipo hMAbl-L2 Se obtuvieron fragmentos de ADN mediante PCR con el pCMA-LK/hMAbl-Ll construido en 9) -2-1 como una plantilla usando KOD-Plus- (T0Y0B0 CO . , LTD.) y cada uno de los conjuntos de cebadores A y B, y se enlazaron mediante PCR de extensión de solapamiento usando el conjunto de cebadores C para preparar ADN que comprende un gen que codifica la cadena ligera tipo h Abl-L2. Este ADN se disoció con enzimas de restricción Xbal y Pmel para obtener un fragmento de ADN que luego se inserto a un sitio disociado por enzima de restricción Xbal/Pmel del vector de propósito general (pCMA-LK) para expresión de la cadena ligera del anticuerpo quimérico y humanizado a fin de construir un vector de expresión de cadena ligera tipo hMAbl-L2. El vector de expresión obtenido se denominó "pCMA-LK/hMAbl-L2 " . La secuencia de nucleótido de la cadena ligera de tipo hMAbl-L2 se muestra en SEQ ID NO: 65, y su secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 66.

Conjunto de cebadores A L inf-F: 5 ' -gcctccggactctagagccaccatggtgctgcagacccaggtgttc-3 L-EKL-R: 51 -caggtacaggttcttgttctcgttttccaggctctggctgcttctgcagc-3 Conjunto de cebadores B L-EKL-F: 5 1 -gaaaacgagaacaagaacctgtacctgaactggtatctgcagaagcccg-3 L inf-R: 5 1 -tagcctcccccgtttaaacgggcccctaacactcccccctg-3 Conjunto de cebadores C L inf-F: 51 -gcctccggactctagagccaccatggtgctgcagacccaggtgttc-31 L inf-R: 5 tagcctcccccgtttaaacgggcccctaacactcccccctg-3 ' Ejemplo 10 Preparación de d MAbl humanizado 10-7 -1) Producción of humanized MAb 1 subcultivaron privaron FreeStyle 293-F (Invitrogen Corp . ) de acuerdo con el manua Se inocularon 1.2 x 109 células de células FreeStyle 293-F (Invitrogen Corp.) en la fase de crecimiento logarítmico a un matraz de Erlenmeyer Fernbach de 3L (Corning Inc.), diluidas con medio de expresión FreeStyle 293 (Invitrogen Corp.) en 1.0 X 106 células/mL, y luego se cultivaron mientras se sacudían en una incubadora con CO2 al 8% a 90 rpm a 37°C por 1 hora. Se disolvieron 3.6 mg de polietilenimina (Polysciences, Inc., #24765) en 20 mi de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). A continuación se suspendieron un vector de expresión de cadena H (0.4 mg) y un vector de expresión de cadena L (0.8 mg) preparados usando el kit de plásmido PureLink HiPure (Invitrogen Corp.) en 20 mL de Opti-Pro SFM (Invitrogen Corp.). Se adicionaron 20 mL de la solución mezcla de vector de expresión/Opti-Pro SFM a 20 mL de la solución mezcla de polietilenimina/Opti -Pro SFM, y la mezcla se revolvió gradualmente, se dejó por otros 5 minutos y luego se adicionó a las células FreeStyle 293 -F. Las células se cultivaron mientras se sacudían en una incubadora con CO2 al 8% a 90 rpm a 37°C por 7 días, y se filtró el sobrenadante de cultivo obtenido a través del filtro de cápsula desechable (Advantec, #CCS-045-ElH) , y se purificó de la misma manera que en 7) -2.

El anticuerpo MAbl humanizado obtenido por la combinación entre pCMAG2/hMAbl-Hl y pCMA-LK/hMAbl-Ll se denominó "H-1040". El anticuerpo MAbl humanizado obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAblH2 y pCMA-LK/hMAbl-Ll se denominó "H-1140". El anticuerpo MAbl humanizado obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAbl-H2 y pCMA-LK/hMAbl-L2 se denominó "H-1143". El anticuerpo MAbl humanizado obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAbl-H3 y pCMA-LK/hMAbl-Ll se denominó "H-2040". El anticuerpo MAbl humanizado obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAbl-H4 y pCMA -LK/hMAbl-Ll se denominó "H -2140". El anticuerpo MAbl humanizado obtenido por la combinación entre pCMA-G2/hMAbl-H4 y pCMA-LK/hMAbl-L2 se denominó "H-2143" .

Ejemplo 11 Propiedad de anticuerpo humanizado anti-ROB04 11) -1 Afinidad de enlazamiento La disociación constante entre cada anticuerpo y rR0B04-ECD se determinó con el anticuerpo inmovilizado como un ligando y el antígeno como un analito usando Biacore 3000 (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) .

Aproximadamente 80 RU del anticuerpo se enlazaron por medio de un anticuerpo IgG anti-humano (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) inmovilizado sobre una pastilla sensor CMS (fabricada por GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) mediante un método de acoplamiento de amina. El amortiguador corriente usado fue PBS que contenía 0.05% de tensioactivo P20. Se adicionaron soluciones de series de dilución (0.1-200 nM) del antígeno a una tasa de flujo de 30 µ?/minuto por 300 segundos en la pastilla enlazada con anticuerpo. A continuación se monitoreo una fase de disociación por 300 segundos. Se adicionó gCl2 de 3 M como una solución de regeneración a una tasa de flujo de 10 µ? /minuto por 30 segundos. Se analizaron los datos usando el modelo de enlazamiento 1:1 del software de análisis (BIAevaluation Software, versión 4.1) para calcular una constante de tasa de asociación kon, una constante de tasa de disociación koff, y una constante de disociación (KD; KD= koff/kon) . Como resultado, el valor de KD fue de 0.41 nM para H-1040, 3.5 nM para H-1143, 3.9 nM para H-1140, 0.40 nM para H-2040, 1.7 nM para H-2143, y 1.8 nM para H-2140. 11) -2 Activación de señal descendente de R0B04 Este ensayo se realizó de acuerdo con el método de 4)-l excepto que: se usó IgG humana como un control negativo; y se adicionó IgG humana, H-1040, H-1140, H-1143, H-2040, H-2140, H-2143, o cMAbl-2 a una concentración final de 0.63 yg/mililitro a un medio. Como resultado, la IgG humana de control negativo no influyó en la actividad promotora de IL-8 en las células que expresan transitoriamente ROB04 humano, mientras que todos los anticuerpos humanizados anti-R0B04 incrementaron la actividad promotora de IL-8 a un nivel equivalente a cMAbl-2 (Figura 49) . Estos resultados demostraron que todos los anticuerpos humanizados anti-R0B04 activaron la señal descendente de ROB04 , tal como en MAbl . 11) -3 Ensayo de migración de HUVEC Este ensayo se llevó a cabo de acuerdo con el método de 4) -2 excepto que: se usó IgG humana control negativo; se adicionó IgG humana, H-1143, H-2140, o H-2143 a una concentración final de 0.5 µg/mililitro a un medio; y la intensidad de fluorescencia (longitud de onda de excitación/longitud de onda fluorescente: 485 nm/538 nm) de cada pozo se midió usando un lector de placa (EnVision: Perkin Elmer, Inc.). Como resultado, H-1143, H-2140, o H-2143 suprimieron la migración de HUVEC inducida por bFGF (Figura 50) . Adicionalmente, H-1140 mostró la actividad supresora contra la migración de HUVEC. Estos resultados demostraron que H-1140, H-1143, H-2140, o H-2143 suprimieron la migración de HUVEC. 11) -4 Reactividad de especie cruzada 11) -4-1 Preparación de células que expresan gen de antígeno Las células se prepararon de acuerdo con el método de 4)- 3-1. 11) -4-2 Análisis de citometría de flujo Este ensayo se realizó de acuerdo con el método de 4) -3-2 excepto que: se usó IgG humana control negativo; se usó IgG anti-humana de cabra FITC-AffiniPure , Fcy Fragment Specific (fabricado por Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) como un anticuerpo secundario; y se uso un citómetro de flujo (FC500; fabricado por Beckman Coulter, Inc.) como detector. Como resultado, H-1143, H-2140, o H-2143 no se enlazaron a R0B04 de ratón o R0B04 de rata, pero se mostró que se enlazaba a R0B04 humano y R0B04 de mono cynomolgus, como en el anticuerpo progenitor MAb 1 (Figuras 51, 52, y 53). Adicionalmente , H-1140 mostró el mismo resultado que H-1143, H-2140 y H-2143. 11) -5 Especificidad de enlazamiento de H-1140, H-1143, H-2140, o H-2143 11) -5-1 Preparación de células que expresan gen de antígeno Las células se prepararon de acuerdo con el método de 4)-4-1 excepto que se usó pCIFLAG- hROB04-28 como vector de expresión de ROB04. 11) -5-2 Análisis de citometría de flujo Este ensayo se llevó a cabo de acuerdo con el método de 4) -4-2 excepto que: se usó IgG humana o IgG2A de ratón como un control negativo; como un anticuerpo secundario se usó una fracción de IgG de cabra conjugada con fluoresceína con IgG de ratón (fabricado por Cappel Laboratories, Inc.) o IgG anti-humana de cabra FITC-AffiniPure , Fcy Fragment Specific; y se uso un citómetro de flujo (FC500) como detector. Como resultado, H-1143, H-2140, o H-2143 no se enlazaron a hROBOl, hROB02, o hROB03, pero se mostró que se enlazaban específicamente a hR0B04 , tal como en el anticuerpo progenitor MAbl (Figura 54) . Adicionalmente , H-1140 mostró el mismo resultado que H-1143, H-2140 y H-2143. En este contexto se confirmó que hR0B04 , hROBOl , hROB02, y hROB03, cada uno, se expresaban en la membrana celular usando el anticuerpo de control positivo (Figura 54). 11) -6 Evaluación de eficacia del medicamento en modelos de mono con neovascularización coroidal inducida con láser 11) -6-1 Anestesia Se inyectó intramuscularmente medetomidina clorhidrato a una dosis de 0.08 mg/kg a cada mono cynomolgus . 15 minutos después, se inyectó intramuscularmente quetamina clorhidrato a una dosis de 15 mglkg. 11) -6-2 Preparación de modelo Cada mono cynomolgus anestesiado en 11) -6-1 se retuvo sobre una mesa de operación de acero inoxidable en posición supina. Se aplicaron gotas oftálmicas de una mezcla de 5 mg/mL de tropicamida-5 mg/mL de fenilefrina clorhidrato a los ojos para midriasis. La región macular de la retina se daño térmicamente mediante irradiación con láser (cantidad de calor irradiado: 500 mW, tiempo de radiación: 0.1 seconds, tamaño del sitio: 50 µp?, el número de sitios: 9 sitios) usando un fotocoagulador láser verde OcuLight GLx. Después de la operación, a los ojos operados se adicionaron a gotas las gotas oftálmicas Cravit . 11) -6-3 Administración de la sustancia a prueba El día 7 después de la preparación de modelo, cada mono cynomolgus fue anestesiado y luego retenido sobre la mesa de operaciones de acero en posición supina. Luego a los ojos se aplicaron P A IODO Solución Oftálmica y para Lavado de Ojos (Nitten Pharmaceutical Co., Ltd.) diluida 4 veces con agua y cada estéril para desinfectar los ojos externos. Una aguja 33G fue insertada en el cuerpo vitreo de la conjuntiva y se inyectó una solución salina o 0.05 mi de H-2143 ajustado a 1.1 mg/0.05 mL usando una jeringa de 1 mi. Después de terminar la administración, se aplicó Ungüento para Ojo y Oído Rinderon-A a la conjuntiva usando un hisopo y esparciendo por la superficie de los ojos con los ojos abiertos y cerrados. 11) -6-4 Evaluación de la eficacia del medicamento Los días 7, 14, y 21 después de la preparación de modelo, se fotografió el ojo mediante un método rutinario usando una cámara de fondo híbrida CX-1 bajo anestesia. Luego se inyectó por vía intravenosa fluoresceína a una dosis de 0.05 mL/kg. Después de terminar la inyección intravenosa de fluoresceína, se realizó angiografía fluorescente cada 1 minuto hasta 10 minutos más tarde y se almacenaron los datos de imágenes . A partir de los datos de imágenes se clasificó la severidad en una escala de notas de 1 a 5 con base en la intensidad de florescencia de cada sitio irradiado con láser en el cual se acumuló fluoresceína de acuerdo con el método de Zahn G et al. (Zahn G et al., Arch. Ophthalmol . 2009 127: 1329-1335). Luego, se calculó la proporción de un sitio correspondiente a las notas 4 y 5 en la clasificación de severidad entre los sitios irradiados con láser sobre la base del porcentaje para evaluar neovascularización coroidal. Como resultado de comparar neovascularización coroidal entre el grupo administrado con solución salina y el grupo administrado con H-2143, la proporción de notas 4 y 5 se incrementó en el grupo administrado con solución salina con un lapso de tiempo desde la preparación del modelo mientras que tal incremento no se observó en el grupo administrado con H-2143. Esto significa que la administración de H-2143 suprimió la neovascularización coroidal inducida con láser (Figura 55) .

Aplicabilidad industrial El uso de un anticuerpo proporcionado por la presente invención permite el tratamiento o la prevención de una enfermedad angiogénica tal como una degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía proliferativa, glaucoma neovascular, rechazo inmune de un trasplante de tejido de córnea u otros trasplantes de tejidos, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, sepsis, u obesidad, y el examen o diagnóstico de la enfermedad angiogénica.

Texto libre de listado de secuencias SEQ ID NO: 1: Secuencia de nucleótido de ADNc de ROB04 humano de longitud completa (Figura 13) SEQ ID NO: 2: secuencia de aminoácidos de ROB04 humano (Figura 14) SEQ ID NO: 3: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de R0B04 humano de longitud completa etiquetado con FLAG en el N-terminal SEQ ID NO: 4: Secuencia de aminoácidos de R0B04 humano de longitud completa etiquetado con FLAG en el N-terminal SEQ ID NO: 5: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una variante de supresión de región/dominio extracelular de ROB04 humano etiquetada con FLAG en el N-terminal, consistente en una secuencia de aminoácidos de aminoácidos Nos. 46 a 1007 de SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO : 6: Secuencia de aminoácidos de una variante de supresión de región/dominio extracelular de ROB04 humano etiquetada con FLAG en el N-terminal, consistente en una secuencia de aminoácidos de aminoácidos Nos. 46 a 1007 de SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 7: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una variante de supresión de región/dominio extracelular de ROB04 humano etiquetada con FLAG en el N-terminal, consistente en una secuencia de aminoácidos de aminoácidos Nos. 132 a 1007 de SEQ ID NO : 2 SEQ ID NO: 8: Secuencia de aminoácidos de una variante de supresión de región/dominio extracelular de ROB04 humano etiquetada con FLAG en el N-terminal, consistente en una secuencia de aminoácidos de aminoácidos Nos. 132 a 1007 de SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 9: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una variante de supresión de región/dominio extracelular de ROB04 humano etiquetada con FLAG en el N-terminal, consistente en una secuencia de aminoácidos de aminoácidos Nos. 210 a 1007 de SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 10: Secuencia de aminoácidos de una variante de supresión de región/dominio extracelular de R0B04 humano etiquetada con FLAG en el N-terminal, consistente en una secuencia de aminoácidos de aminoácidos Nos. 210 a 1007 de SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 11: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una variante de supresión de región/dominio extracelular de ROB04 humano etiquetada con FLAG en el N-terminal, consistente en una secuencia de aminoácidos de aminoácidos Nos. 225 a 1007 de SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 12: Secuencia de aminoácidos de una variante de supresión de región/dominio extracelular de R0B04 humano etiquetada con FLAG en el N-terminal, consistente en una secuencia de aminoácidos de aminoácidos Nos. 225 a 1007 de SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 13: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de una variante de supresión de región/dominio extracelular de R0B04 humano etiquetada con FLAG en el N-terminal, consistente en una secuencia de aminoácidos de aminoácidos Nos. 341 a 1007 de SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 14: Secuencia de aminoácidos de una variante de supresión de región/dominio extracelular de R0B04 humano etiquetada con FLAG en el N-terminal, consistente en una secuencia de aminoácidos de aminoácidos Nos. 341 a 1007 de SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 15: Secuencia de nucleótido de ADNc de ROB04 de ratón SEQ ID NO: 16: Secuencia de aminoácidos de ROB04 de ratón SEQ ID NO: 17: Secuencia de nucleótido de ADNc de ROB04 de rata SEQ ID NO: 18: La secuencia de aminoácidos de ROB04 de rata SEQ ID NO: 19: Secuencia de nucleótido de ADNcl de R0BO4 de mono SEQ ID NO: 20: Secuencia 1 de aminoácidos de ROB04 de mono SEQ ID NO: 21: Secuencia de nucleótido de ADNc de ROB04 de mono SEQ ID NO: 22: Secuencia 2 de aminoácidos de ROB04 de mono SEQ ID NO: 23: Secuencia de nucleótido de ADN de ROBOl humano SEQ ID NO: 24: Secuencia de aminoácidos de ROBOl humano SEQ ID NO: 25: Secuencia de nucleótido de ADNc de ROB02 humano SEQ ID NO: 26: Secuencia de aminoácidos de ROB02 humano SEQ ID NO: 27: Secuencia de nucleótido de ADNc de R0B03 humano SEQ ID NO: 28: Secuencia de aminoácidos de ROB04 humano SEQ ID NO: 29 : Secuencia de nucleótido de una región promotora de IL-8 SEQ ID NO: 30 : Secuencia de nucleótido de ADNc que codifica la región variable de cadena pesada de MAbl (Figura 15) SEQ ID NO: 31 : Secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena pesada de MAbl (Figura 16) SEQ ID NO: 32 : Secuencia de nucleótido de ADNc que codifica la región variable de cadena ligera de MAbl (Figura 17) SEQ ID NO : 33 : Secuencia de aminoácidos de una región variable de cadena ligera de MAbl (Figura 18 ) SEQ ID NO : 34 : Secuencia de nucleótido que comprende ADNc que codif ica los aminoácidos de la señal secretoria de cadena K humana y región constante de cadena ? humana SEQ ID NO : 35 : Secuencia de nucleótido que comprende ADNc que codif ica los aminoácidos de secuencia de señal de cadena pesada humana y región constante de IgGl humana SEQ ID NO : 36 : Secuencia de nucleótido que comprende ADNc que codif ica los aminoácidos de secuencia de señal de cadena pesada humana y región constante de IgG2 humana SEQ ID NO : 37 : Secuencia de nucleótido of ADNc que codifica cadena ligera de cMAbl (Figura 19 ) SEQ ID NO : 38 : Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de cMAbl (Figura 20 ) SEQ ID NO : 39 : Secuencia de nucleótido de ADNc que codifica cadena pesada de cMAb 1-1 (Figura 21) SEQ ID NO: 40: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de cMAbl-1 (Figura 22) SEQ ID NO: 41: Secuencia de nucleótido de ADNc que codifica cadena pesada de cMAb 1-2 (Figura 23) SEQ ID NO: 42: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de cMAbl-2 (Figura 24) SEQ ID NO: 43: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MAbl CDRH1 SEQ ID NO: 44: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MAbl CDRH1 (Figura 25) SEQ ID NO: 45: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MAbl CDRH2 SEQ ID NO: 46: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MAbl CDRH2 (Figura 26) SEQ ID NO: 47: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MAbl CDRH3 SEQ ID NO: 48: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada de MAbl CDRH3 (Figura 27) SEQ ID NO: 49: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de MAbl CDRLl SEQ ID NO: 50: Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de MAbl CDRLl (Figura 28) SEQ ID NO: 51: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de MAbl CDRL2 SEQ ID NO: 52: Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de MAbl CDRL2 (Figura 29) SEQ ID NO: 53: Secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de MAbl CDRL3 SEQ ID NO: 54: Secuencia de aminoácidos de cadena ligera de MAbl CDRL3 (Figura 30) SEQ ID NO: 55: Secuencia de nucleótido de ADNc que codifica cadena pesada tipo hMAbl-Hl (Figura 31) SEQ ID NO: 56: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada tipo hMAbl-Hl (Figura 32) SEQ ID NO: 57: Secuencia de nucleótido of ADNc que codifica cadena pesada tipo hMAbl-H2 (Figura 33) SEQ ID NO: 58: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada tipo hMAbl-H2 (Figura 34) SEQ ID NO: 59: Secuencia de nucleótido de ADNc que codifica cadena pesada tipo hMAbl-H3 (Figura 35) SEQ ID NO: 60: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada tipo hMAbl-H3 (Figura 36) SEQ ID NO: 61: Secuencia de nucleótido de ADNc que codifica cadena pesada tipo hMAbl-H4 (Figura 37) SEQ ID NO: 62: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada tipo hMAbl-H4 (Figura 38) SEQ ID NO: 63: Secuencia de nucleótido de ADNc que codifica cadena ligera tipo hMAbl-Ll (Figura 39) SEQ ID NO: 64: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada tipo hMAbl-Ll (Figura 40) SEQ ID NO: 65: Secuencia de nucleótido de ADNc que codifica cadena pesada tipo hMAbl-L2 (Figura 41) SEQ ID NO: 66: Secuencia de aminoácidos de cadena pesada tipo hMAhl-L2 (Figura 42) SEQ ID NO: 67: CDRHI de cadena pesada tipo hMAbl-H2 o hMAbl-H4 (Figura 43) SEQ ID NO: 68: CDRH2 de cadena pesada tipo hMAbl-H2 o hMAbl-H4 (Figura 44) SEQ ID NO: 69: CDRH3 de cadena pesada tipo hMAbl-H2 o hMAhl-H4 (Figura 45) SEQ ID NO: 70: CDRLI de cadena ligera tipo hMAbl-L2 (Figura 46) SEQ ID NO: 71: CDRL2 de cadena ligera tipo hMAbl-L2 (Figura 47) SEQ ID NO: 72: CDRL3 de cadena ligera tipo hMAbl-L2 (Figura 48) Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un anticuerpo caracterizado porque tiene propiedades descritas en las siguientes (I) a (III) o un fragmento funcional del mismo: (I) enlazarse a la proteína R0B04 con un valor KD de 1 x 10"8 o más bajo; (II) suprimir o inhibir migración celular endotelial vascular en la ausencia de un anticuerpo de enlace cruzado in vitro; y (III) suprimir o inhibir angiogénesis in vivo.

2. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína R0B04 es la proteína R0B04 humana.

3. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porgue la proteína ROB04 es una proteína consistente en una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos Nos. 1 a 1007 de SEQ ID NO: 2.

4 El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína R0B04 es una proteína consistente en una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos Nos. 46 to 1007 de SEQ ID NO: 2.

5. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 3 o 4, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo se enlaza a un sitio consistente en una secuencia de aminoácidos de los aminoácidos Nos. 132 a 209 de SEQ ID NO: 2.

6. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo monoclonal o un fragmento funcional del mismo.

7. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el anticuerpo consiste en una cadena pesada que comprende CDRH1 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44, CDRH2 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46 sustituyendo un aminoácido, y CDRH3 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 48, y una cadena ligera que comprende CDRL1 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 50 o una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 sustituyendo uno a tres aminoácidos (s) , CDRL2 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 52, y CDRL3 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 54.

8. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el anticuerpo consiste en una cadena pesada que comprende CDRH1 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44, CDRH2 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46 o la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 68, y CDRH3 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 48, y una cadena ligera que comprende CDRL1 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 50 o la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 70, CDRL2 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 52, y CDRL3 consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 54 .

9. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 31, y una región variable de cadena ligera consistente en la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 33.

10. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el anticuerpo comprende cualquier región variable de cadena pesada seleccionada de los siguientes a) a d) y una región variable de cadena ligera seleccionada de e) y f) : a) una región variable de cadena pesada (tipo hMAbl-Hl) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 56, b) una región variable de cadena pesada (tipo hMAbl-H2) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 58, c) una región variable de cadena pesada (tipo hMAbl-H3) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 60 y d) una región variable de cadena pesada (tipo hMAbl-H4) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 62; y e) una región variable de cadena ligera (tipo hMAbl-Ll) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64, y f) una región variable de cadena ligera (tipo hMAbl-L2) consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 66.

11. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende cualquiera de las siguientes combinaciones 1) a 6) de una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera: 1) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 58 y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64, 2) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 58 y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 66, 3) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 62 y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 66. 4) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 62 y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64, 5) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 56 y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64, y 6) una región variable de cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 137 de SEQ ID NO: 60 y una región variable de cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 134 de SEQ ID NO: 64,

12. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico o un fragmento funcional del mismo.

13. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado o un fragmento funcional del mismo.

14. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque comprende una región constante de cadena pesada de IgGl humana o IgG2 humana.

15. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se enlaza a un sitio sobre un antígeno reconocido por el anticuerpo de conformidad con las reivindicaciones 7 a 14.

16. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque compite con cualquier anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 14 por el enlazamiento a la proteína R0B04.

17. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque anticuerpo comprende cualquiera de los siguientes combinaciones 1) a 6) de una cadena pesada y una cadena ligera: 1) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 58 y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (H-1140) , 2) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 58 (Figura 34) y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 66 (H-1143) , 3) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 62 y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 66 (H-2143) . 4) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 62 y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (H-2140) , 5) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 56 y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (H-1040) , y 6) una cadena pesada consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 20 a 463 de SEQ ID NO: 60 y una cadena ligera consistente en una secuencia de aminoácidos representada por aminoácidos Nos. 21 a 239 de SEQ ID NO: 64 (H-2040) .

18. Un anticuerpo caracterizado porque comprende una forma modificada de una cadena pesada de cualquier anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, en donde la forma modificada carece de uno a varios aminoác idos ( s ) carboxi lo - termínale s de la cadena pesada .

19. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el anticuerpo es 95% o más idéntico en la secuencia de aminoácidos con cualquier anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17; tiene un valor KD de 1 x 10~ 8 o más bajo para una ROB04 humana; suprime o inhibe la migración celular endotelial vascular en la ausencia de un anticuerpo de enlace cruzado in vitro,-y suprime o inhibe angiogénesis in vivo.

20. El anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo es un anticuerpo humano o un fragmento funcional del mismo.

21. Una secuencia de nucleótido caracterizada porque es seleccionada del grupo consistente en los siguientes (I) a (III) : (I) una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos parcial o total de la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, (II) una secuencia de nucleótido consistente en una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos parcial o total de la cadena pesada o de la cadena ligera de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, y (III) una secuencia de nucleótido consistente en una secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos parcial o total de la cadena pesada o de la cadena ligera de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

22. Un vector recombinante caracterizado porque contiene un inserto de una secuencia de nucleótido de conformidad con la reivindicación 21.

23. Una célula recombinante caracterizada porque contiene una secuencia de nucleótido de conformidad con la reivindicación 21 o un vector recombinante de conformidad con la reivindicación 22 introducido en la mi sma .

24. Una célula caracterizada porque produce un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20.

25. Un método para producir un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado porque comprende los siguientes pasos (I) y (II) : (I) cultivar una célula de conformidad con la reivindicación 23 o 24; y (II) recoger el anticuerpo o el fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 del cultivo obtenido en e 1 paso ( I ) .

26. Un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo, caracterizados porque son producidos por un método de producción de conformidad con la reivindicación 25.

27. Una forma modificada de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo caracterizada porque es de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y 26.

28. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y 26 o una forma modificada de conformidad con la reivindicación 27 como un ingrediente activo.

29. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 28, para usarse en el tratamiento o prevención de una enfermedad angiogénica.

30. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 29, en dondé la enfermedad angiogénica es degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, tumor benigno o maligno, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, angioma, inflamación crónica, enfermedad neovascular ocular, retinopatía prolif erat iva , glaucoma neovascular, rechazo inmune de un trasplante de tejido de córnea u otros trasplantes de tejido, artritis reumatoide, psoriasis, inflamación aguda, sepsis, u obesidad.

31. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 29, en donde la enfermedad angiogénica es degeneración macular exudativa asociada a la edad, retinopatía diabética, edema macular, fibroplasia retrolental, enfermedad neovascular ocular, retinopatía pro 1 i ferativa , glaucoma neovascular, o rechazo inmune de un trasplante de tejido de córnea.

32. Un inhibidor de angiogénesis caracterizado porque comprende un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y 26 o una forma modificada de conformidad con la reivindicación 27 como un ingrediente activo.

33. Uso de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 y 26 o una forma modificada de conformidad con la reivindicación 27, o la composción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad angiogénica.

34. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, caracterizada porque se emplea en combinación con otro agente terapéutico o profiláctico.