MX2014012045A

MX2014012045A - Composiciones y metodos para inhibir masp-1 y/o masp-2 y/o masp-3 para el tratamiento de la hemoglobinuria paroxistica nocturna.

Info

Publication number: MX2014012045A
Application number: MX2014012045A
Authority: MX
Inventors: Gregory A Demopulos; Hans-Wilhelm Schwaeble
Original assignee: Omeros Corp
Priority date: 2012-04-06
Filing date: 2013-04-05
Publication date: 2015-05-15
Also published as: RU2655299C2; KR20200097808A; US20190382505A1; KR20150003785A; RU2018114903A; IL234991B; AU2013267909B2; SMT201800253T1; EP2833907B1; CN121401408A; IL234991A0; MX357540B; JP2021001199A; JP2018162307A; CL2014002694A1; JP2015514117A; IL274721B; DK2833907T3; AU2018200721B2; PL3366307T3

Abstract

En un aspecto, la invención proporciona métodos y composiciones para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-3 en un sujeto que padece de hemoglobinuria paroxística nocturna mediante la administración al sujeto de una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-3 en una cantidad eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-3. En otro aspecto, la invención proporciona métodos y composiciones para aumentar la supervivencia de los glóbulos rojos en un sujeto que padece de hemoblobinuria paroxística nocturna mediante la administración al sujeto de una composición que comprende una cantidad de al menos uno de un agente inhibidor de MASP-1 y/o un agente inhbidor de MASP-3 eficaz para aumentar la supervivencia de los glóbulos rojos. En algunas modalidades, se le administra al sujeto un agente inhibidor de MASP-2 y un agente inhibidor de MASP-1, un agente inhibidor de MASP-2 y un agente inhibidor de MASP-3, un agente inhbidor de MASP-3 y un agente inhibidor de MASP-1, o un agente inhibidor de MASP-1, un agente inhibidor de MASP-2 y un agente inhibidor de MASP-3.

Description

COMPOSICIONES ? MÉTODOS PARA INHIBIR MASP-1 Y/O MASP-2 Y/O MASP-3 PARA EL TRATAMIENTO DE LA HEMOGLOB INURIA PAROXÍSTICA NOCTURNA REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad de la solicitud No. 61/621,461 presentada el 6 de abril de 2012.

DECLARACIÓN CON RESPECTO AL LISTADO DE SECUENCIAS El listado de secuencias asociado con esta solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia en papel y por la presente es incorporado mediante referencia en la descripción. El nombre del archivo de texto que contiene el listado de secuencias es MP_l_0146_PCT_Sequence_20130327_ST25.txt. El archivo de texto es de 85 KB; fue creado el 1 de abril de 2013; y se presenta mediante EFS-Web con la presentación de la descripción.

ANTECEDENTES El sistema del complemento proporciona un mecanismo de actuación temprana para iniciar, ampliar y coordinar la respuesta inmune a la infección microbiana y otras amenazas agudas (M.K. Liszewski y J.P. Atkinson, 1993, en Fundamental Immunology, tercera edición, editado por W.E. Paul, Raven Press , Ltd. , Nueva York), en los seres humanos y otros vertebrados. Mientras que la activación del complemento proporciona una valiosa defensa de primera linea frente a patógenos potenciales, las actividades del complemento que promueven un respuesta inmune protectora pueden también representar una amenaza potencial para el anfitrión (K.R. Kalli, et al., Springer Semin . Immunopathol . 15:417 431, 1994; B.P. Morgan, EUR. J. Clínical Investíg. 24:219 228, 1994). Por ejemplo, los productos proteoliticos de C3 y C5 reclutan y activan los neutrófilos. Mientras que son indispensables para la defensa del huésped, los neutrófilos activados son indiscriminados en su liberación de enzimas destructivas y pueden causar daño a los órganos. Además, la activación del complemento puede causar la deposición de los componentes del complemento lítico en las células del huésped cercanas, así como en objetivos microbianos, lo que resulta en la lisis de la célula huésped.

El sistema del complemento también ha sido implicado en la patogenesia de numerosos estados de enfermedad aguda y crónica, incluyendo: infarto de miocardio, derrame cerebral, SDRA, lesión por reperfusión, choque séptico, fuga capilar después de quemaduras térmicas, inflamación de revascularización cardiopulmonar, rechazo de transplante, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, miastenia gravis y la enfermedad de Alzheimer. En casi todas estas condiciones, el complemento no es la causa sino uno de los varios factores implicados en la patogenia. Sin embargo, la activación del complemento puede ser un mecanismo patológico principal y representa un punto eficaz para el control clínico en muchos de estos estados de enfermedad. El creciente reconocimiento de la importancia de la lesión del tejido mediada por complemento en una variedad de estados de enfermedades subraya la necesidad de fármacos inhibidores de complemento eficaces. Hasta la fecha, Eculizumab (Solari ®), un anticuerpo contra C5, es el único fármaco enfocado a complemento que ha sido aprobado para uso humano. Sin embargo, C5 es una de las varias moléculas efectoras situadas "descendente" en el sistema del complemento, y el bloqueo de C5 no inhibe la activación del sistema del complemento. Por lo tanto, un inhibidor de las etapas de iniciación de la activación del complemento tendría ventajas significativas sobre un inhibidor de complemento "descendente".

En la actualidad está ampliamente aceptado que el sistema del complemento puede activarse a través de tres distintas vías: la vía clásica, la vía de las lectinas y la vía alternativa. La vía clásica es generalmente provocada por un complejo compuesto de anticuerpos de huésped unidos a una partícula extraña (es decir, un antígeno) y por lo tanto requiere una exposición previa a un antígeno para la generación de una respuesta de anticuerpos específica. Puesto que la activación de la vía clásica depende de una respuesta inmune adaptativa previa por el anfitrión, la vía clásica es parte del sistema inmune adquirido. En contraste, las vías de las lectinas y alternativas son independientes de la inmunidad adaptativa y forman parte del sistema inmune innato.

La activación del sistema del complemento resulta en la activación secuencial de zimógenos de serina proteasa. El primer paso en la activación de la vía clásica es la unión de una molécula de reconocimiento específico, Clq, a las moléculas de IgG e IgM unidas a antígeno. Clq se asocia con las proenzimas de serina proteasa Clr y Cls como un complejo denominado Cl. Al unir Clq a un complejo inmune, la escisión autoproteolítica del sitio Arg lie de Clr es seguida por la escisión mediada por Clr y la activación de Cls, que adquiere así la capacidad de escindir C4 y C2. C4 es escindido en dos fragmentos, designados C4a y C4b, y, asimismo, C2 es escindido en C2a y C2b. Los fragmentos de C4b son capaces de formar enlaces covalentes con grupos aminoácidos o hidroxilo adyacentes y generan la C3 convertasa (C4b2a) a través de la interacción no covalente con el fragmento C2a de C2 activado. La C3 convertasa (C4b2a) activa C3 por escisión proteolitica en subcomponentes C3a y C3b que llevan a la generación de la convertasa C5 (C4b2a3b), que, por escisión de C5, conduce a la formación del complejo de ataque a membrana (C5b combinado con C6, C7, C8 y C9, también conocida como "MAC") que puede perturbar las membranas celulares, lo que resulta en la lisis celular. Las formas activadas de C3 y C4 (C3b y C4b) son depositadas covalentemente sobre las superficies de objetivo extraño, que son reconocidas por los receptores del complemento en múltiples fagocitos.

Independientemente, el primer paso en la activación del sistema del complemento a través de la vía de las lectinas es también la unión de moléculas de reconocimiento especifico, que es seguida por la activación de proenzimas de serina proteasa asociadas. Sin embargo, en lugar de la unión de complejos inmunes de Clq, las moléculas de reconocimiento en la vía de las lectinas comprende un grupo de proteínas de unión de carbohidratos (lectina de unión a manano (MBL), ficolina H, ficolina M, ficolina L y lectina tipo-C CL-11), denominadas colectivamente como lectinas. Ver J. Lu et al., Biochim. Biophys. Acta 1572:387400, (2002); Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol . 21:547 578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225 232 (2000)). Ver también J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen et al, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010).

Ikeda et al. demostró por primera vez que, igual que Clq, MBL podría activar el sistema del complemento al unirse a los eritrocitos revestidos levadura de manano en una forma dependiente de C4 (Ikeda et al., J. Biol . Chem. 262:7451 7454, (1987)). MBL, un miembro de la familia de proteínas colectinas, es una lectina dependiente de calcio que une a los carbohidratos con grupos 3 y 4-hidroxi orientados en el plano ecuatorial del anillo de piranosa. Los ligandos prominentes para MBL son por lo tanto D-manosa y D-acetil-D-glucosamina, mientras que los carbohidratos que no cumplen con este requisito estérico tienen afinidad indetectable para MBL (Weis et al., Nature 360:127 134, (1992)). La interacción entre el MBL y los azúcares monovalentes es extremadamente débil, con constantes de disociación típicamente en el rango milimolar de un solo dígito. El MBL logra la unión fuerte, específica a ligandos glicanos por avidez, es decir, interactuando simultáneamente con múltiples residuos de monosacáridos situados en proximidad entre sí (Lee et al., Archiv. Biochem . Biophys. 299:129136, (1992)). El MBL reconoce los patrones de carbohidratos que adornan comúnmente los microorganismos tales como bacterias, levaduras, parásitos y ciertos virus. En contraste, el MBL no reconoce D-gaiactosa y ácido siálico, los azúcares penúltimo y último que suelen adornan los glicoconjugados complejos "maduros" presentes en pasma mamífero y glicoproteínas de superficie celular. Esta especificidad de unión se piensa que promueve el reconocimiento de las superficies "extrañas" y ayuda a proteger contra la "autoactivación". Sin embargo, el MBL se une con alta afinidad a grupos de glicanos de alta-manosa "precursores" en glicoproteínas N-ligadas y glicolípidos retenidos en el retículo endoplásmico y Golgi de las células mamíferas (Maynard et al., J. Biol . Chem. 257:3788-3794 (1982)). Además, se ha demostrado que el MBL puede unir los polinucleótidos, ADN y ARN, que pueden estar expuestos en células necrótica y apoptóticas (Palaniyar et al., Ann . N. Y. Acad. Sci ., 1010:467-470 (2003); Nakamura et al., J. Leuk. Biol . 86:737-748 (2009)). Por lo tanto, las células dañadas son objetivos potenciales para la activación de la vía de las lectinas a través de la unión de MBL.

Las ficolinas poseen un tipo diferente de dominio de lectina que el MBL, llamado el dominio tipo fibrinógeno. Las ricolinas se unen a los residuos de azúcar en una manera independiente de Ca++. En los seres humanos, se han identificado tres tipos de ficolinas (ficolina L, ficolina M y ficolina H). Los dos sueros de ficolinas, ficolina L y ficolina H, tienen en común una especificidad para N acetil D glucosamina; sin embargo, la ficolina H también se une a N acetil D galactosamina. La diferencia en la especificidad de azúcar de ficolina L, ficolina H, CL-11 y MBL significa que las diferentes lectinas pueden ser complementarias y dirigirse a glicoconjugados diferentes, aunque superpuestos. Este concepto es apoyado por el reciente informe de que, de las lectinas conocidas en la vía de las lectinas, sólo la ficolina L se une específicamente a ácido lipoteicoico, un glicoconjugado de pared celular encontrado en todas las bacterias Gram positivas (Lynch et al., J. Immunol . 172:1198 1202, (2004)). Además de las fracciones de azúcar acetilado, las ficolinas también puede unirse a aminoácidos y polipéptidos acetilados (Thomsen et al., Mol . Immunol . 48 (4): 369-81 (2011)). Las colectinas (es decir, MBL) y las ficolinas no tienen ninguna semejanza significativa con la secuencia de aminoácidos. Sin embargo, los dos grupos de proteínas tienen organizaciones similares de dominio y, como el Clq, se montan en estructuras oligoméricas, lo que maximiza la posibilidad de unión multisitio.

Las concentraciones séricas de MBL son altamente variables en poblaciones saludables y esto es controlado genéticamente por polimorfismos/mutaciones en las regiones de promotor y de codificación del gen MBL. Como una proteina de fase aguda, la expresión del MBL es aún más aumentada durante la inflamación. La ficolina L está presente en el suero en concentraciones similares a las de MBL. Por lo tanto, la rama de L ficolina de la vía de las lectinas es potencialmente comparable la rama de MBL en fuerza. El MBL y las ficolinas también pueden funcionar como opsoninas, gue permiten a los fagocitos enfocarse a las superficies decoradas de MBL y ficolina (ver Jack et al., J Leukoc Biol . , 3:328-36 (2004), Matsushita y Fujita, Immunobiology, 205 (4-5):490-7 (2002), Aoyagi et al, J Immunol, 17 (1): 18-25(2005). Esta opsonización requiere de la interacción de estas proteínas con receptores del fagocito (Kuhlman et al., J. Exp. Med. 169:1733, (1989); Matsushita et al., J. Biol . Chem. 271:2448 54, (1996)), cuya identidad no ha sido establecida.

El MBL humano forma una interacción específica y de alta afinidad a través de su dominio tipo colágeno con serinas proteasas tipo Clr/Cls únicas, denominadas serinas proteasas asociadas a MBL (MASPs). Hasta la fecha, se han descrito tres MASPs. En primer lugar, una sola enzima "MASP" fue identificada y caracterizada como la enzima responsable de la iniciación de la cascada del complemento (es decir, escisión de C2 y C4) (Matsushita et al, J Exp Med 176 (6): 1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol . 150:571 578, (1993)). Posteriormente, se determinó que la actividad MASP fue, de hecho, una mezcla de dos proteasas: MASP 1 y MASP 2 (Thiel et al., Nature 386:506510, (1997)). Sin embargo, se demostró que el MBL del complejo de MASP 2 solo es suficiente para la activación del complemento (Vorup Jensen et al., J. Immunol . 165:2093 2100, (2000)). Además, sólo MASP2 escindió C2 y C4 a altas tasas (Ambrus et al., J. Immunol . 170:1374 1382, (2003)). Por lo tanto, MASP 2 es la proteasa responsable de activar C4 y C2 para generar la C3 convertasa, C4b2a. Esta es una diferencia significativa del complejo C1 de la vía clásica, en donde la acción coordinada de dos serina proteasas especificas (Clr y Cls) conduce a la activación del sistema del complemento Cl. Además, una tercera proteasa novedosa, MASP 3, ha sido aislada (Dahl, M.R., et al., Immunlty 15:12735, 2001). MASP 1 y 3 MASP son productos alternativamente empalmados del mismo gen.

Las MASPs comparten organizaciones de dominio idénticas con las de Clr y Cls, los componentes enzimáticos del complejo Cl (Sim et al., Biochem . Soc. Trans.28:545 (2000)). Estos dominios incluyen un dominio N terminal/Clr/Cls/erizo de mar VEGF/proteina morfogénica ósea (CUB), un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico, un segundo dominio de CUB, un tándem de dominios de proteina de control de complemento y un dominio de serina proteasa. Al igual que las proteasas Cl, la activación del MASP 2 se produce a través de la escisión de una unión de Arg lie adyacente al dominio de serina proteasa, que empalma la enzima en cadenas ligadas de disulfuro A y B, esta última consiste en el dominio de la serina proteasa.

El MBL también puede asociarse con una forma alternativamente empalmada de MASP-2, conocida como proteina asociada a MBL de 19 kDa (MApl9) o proteina pequeña asociada a MBL (sMAP), que carece de la actividad catalítica de MASP-2. (Stover, J. Immunol . 162:3481 90, (1999); Takahashi et al., Int . Immunol . 11:859 863, (1999)). El MApl9 comprende los dos primeros dominios de MASP 2, seguido de una secuencia adicional de cuatro aminoácidos únicos. La función del Mapl9 es incierta (Degn et al., J Immunol . Methods, 2011). Los genes del MASP-1 y MASP-2 se encuentran en los cromosomas humanos 3 y 1, respectivamente (Schwaeble et al., Immunobiology 205:455 466, (2002)).

Varias líneas de evidencia sugieren que hay diferentes complejos de MBL MASP y una gran fracción del MASPs en el suero no está complejada con MBL (Thiel, et al., J. Immunol . 165:878887, (2000)). Tanto la Ficolina H como L se unen a todas las MASPs y activan la vía del complemento de lectinas, como lo hace el MBL (Dahl et al., Immunity 15:127 35, (2001); Matsushita et al., J. Inmuno 1. 168:3502 3506, (2002)). Tanto las vías de las lectinas como las clásicas forman una C3 convertasa común (C4b2a) y las dos vías convergen en este paso.

SLa vía de las lectinas tiene un papel importante en la defensa del huésped contra la infección en el huésped sin tratamiento. Fuerte evidencia de la implicación del MBL en la defensa del huésped proviene del análisis de los pacientes con niveles séricos disminuidos de MBL funcional (Kilpatrick, Biochim . Biophys. Acta 1572:401413, (2002)). Tales pacientes muestran susceptibilidad a las infecciones bacterianas y fúngicas recurrentes. Estos síntomas son generalmente evidentes en edad temprana en la vida, durante una aparente ventana de vulnerabilidad a medida que el anticuerpo maternal derivado de la concentración se desvanece, pero antes del desarrollo de respuestas de un repertorio completo de anticuerpos. Este síndrome a menudo resulta de mutaciones en varios sitios en la porción colagenosa del MBL, que interfieren con la formación adecuada de oligómeros de MBL. Sin embargo, puesto que el MBL puede funcionar como opsonina independiente del complemento, se desconoce en qué medida el aumento de la susceptibilidad a la infección es debido a la activación deteriorada del complemento.

En contraste con las vías clásicas y de las lectinas, no se han encontrado previamente iniciadores de la vía alternativa que cumplan con las funciones de reconocimiento que Clq y las lectinas realizan en las otras dos vías. Actualmente está ampliamente aceptado que la via alternativa se somete espontáneamente a un bajo nivel de activación de rotación, que puede ampliarse fácilmente a superficies extrañas u otras superficies anormales (bacterias, levaduras, células infectadas viralmente o tejido dañado) que carecen de los elementos moleculares adecuados que mantienen la activación espontánea del complemento en supervisión. Hay cuatro proteínas plasmáticas directamente implicadas en la activación de la vía alternativa: C3, factores B y D y properdina.

Aunque hay amplias pruebas que implican a ambas de las vías de complemento clásicas y alternativas en la patogenesia de enfermedades humanas no infecciosas, el papel de la vía de las lectinas está empezando a ser evaluado. Estudios recientes demuestran que la activación de la vía de las lectinas puede ser responsable de la activación del complemento y la inflamación relacionada con la lesión por isquemia/reperfusión. Collard et al. (2000) informó que las células endoteliales cultivadas sometidas a estrés oxidativo se unen a MBL y muestran la deposición de C3 con la exposición al suero humano (Collard et al., Am.

J. Pathol . 156:1549 1556, (2000)). Además, el tratamiento del suero humano con anticuerpos de bloqueo monoclonales anti MBL inhibieron la unión de MBL y la activación del complemento. Estos resultados se extendieron a un modelo de rata de reperfusión de isquemia miocárdica en el que las ratas tratadas con un anticuerpo de bloqueo dirigido contra MBL de rata demostró daño miocárdico significativamente menor a la obstrucción de una arteria coronaria que las ratas tratadas con un anticuerpo de control (Jordán et al., Circulation 104:1413 1418, (2001)). El mecanismo molecular de unión de MBL al endotelio vascular después del estrés oxidativo es confuso; un estudio reciente sugiere que la activación de la vía de las lectinas después del estrés oxidativo puede estar mediada por la unión de MBL a citoqueratinas endoteliales vasculares y no a glicoconjugados (Collard et al., Am . J. Pathol . 159:1045 1054, (2001)). Otros estudios han implicado las vías clásicas y alternativas en la patogenia de la isquemia/lesión por reperfusión y el papel de la vía de las lectinas en esta enfermedad sigue siendo polémico (Riedermann, North Carolina, et al., Am . J. Pathol . 162:363 367, 2003).

Estudios recientes han demostrado que MASP-1 y MASP-3 convierten el factor D de enzima de activación de la via alternativa de su forma de zimógena a su forma enzimáticamente activa (ver Takahashi M. et al., J Exp Med 207 (1): 29-37 (2010); Iwaki et al., J. Immunol . 187:3751- 58 (2011)). La importancia fisiológica de este proceso es subrayada por la ausencia de la actividad funcional de la vía alternativa en el plasma de ratones deficientes de MASP-1/3. La generación proteolitica de C3b a partir de C3 nativo es requerida para que vía alternativa funcione. Puesto que la vía alternativa de la C3 convertasa (C3bBb) contiene C3b como una subunidad esencial, la interrogante sobre el origen del primer C3b a través de la via alternativa ha presentado un problema desconcertante y ha fomentado una investigación considerable.

El C3 pertenece a una familia de proteínas (junto a C4 y a-2 macroglobulina) que contiene una modificación postraslacional rara conocida como un enlace tioéster. El grupo tioéster se compone de una glutamina cuyo grupo carbonilo terminal forma un enlace covalente tioéster con el grupo sulfihidrilo de una cisteína alejada por tres aminoácidos. Este enlace es inestable y el glutamil-tioéster electrofílico puede reaccionar con fracciones nucleofílicas tales como grupos aminoácidos o hidroxilo y así formar un enlace covalente con otras moléculas. El enlace de tioéster es razonablemente estable cuando es retenido dentro de un paquete hidrofóbico de C3 intacto. Sin embargo, la escisión proteolitica de C3 a C3a y C3b resulta en la exposición del enlace altamente reactivo de tioéster en C3b y, tras el ataque nucleofilico por las fracciones adyacentes que comprenden grupos aminoácidos o hidroxilo, C3b se vincula covalentemente a un objetivo. Además de su papel bien documentado en la fijación covalente de C3b a los objetivos de complemento, el C3 tioéster también se cree que tiene un papel fundamental en el desencadenamiento de la vía alternativa. Según la ampliamente aceptada "teoría tick-over", la vía alternativa es iniciada por la generación de una convertasa de fase fluida, iC3Bb, que es formada de C3 con tioéster hidrolizado (iC3; C3(H20)) y factor B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin . Immunopathol .7:143 162, (1984)). El C3 tipo C3b (H20) se genera de C3 nativa por una lenta hidrólisis espontánea del tioéster interno en la proteína (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med. 154:856867, 1981). A través de la actividad de la C3(H20)Bb convertasa, las moléculas de C3b son depositadas en la superficie objetivo iniciando así la vía alternativa.

Antes del descubrimiento aquí descrito, se conocía muy poco sobre los iniciadores de la activación de la vía alternativa. Se pensaba que los activadores incluían paredes celulares de levadura (zimosano), muchos polisacáridos puros, eritrocitos de conejo, ciertas inmunoglobulinas, virus, hongos, bacterias, células tumorales animal, parásitos y células dañadas. La única característica común a estos activadores es la presencia de carbohidratos, pero la complejidad y la variedad de estructuras de carbohidratos ha dificultado el establecer los determinantes moleculares compartidos que son reconocidos. Ha sido ampliamente aceptado que la activación de la vía alternativa es controlada a través del delicado equilibrio entre los componentes regulatorios inhibidoras de esta vía, tales como el factor H, factor I, DAF y CR1 y properdina, el último de los cuales es el regulador positivo único de la vía alternativa (ver Schwaeble W.J. y Reid K.B., Immunol Today 20 (1): 17-21 (1999)).

Además del mecanismo de activación aparentemente no regulado descrito anteriormente, la vía alternativa también puede proporcionar un circuito de amplificación potente para la convertasa C3 de la vía de la lectina/clásica (C4b2a) debido a que cualquier C3b generada puede participar con el factor B en la formación de C3 convertasa de vía alternativa adicional (C3bBb). La C3 convertasa de la vía alternativa es estabilizada por la unión de la properdina. La properdina extiende la vida media de la C3 convertasa de la vía alternativa de seis a diez veces. La adición de C3b a C3 convertasa de la vía alternativa conduce a la formación de C5 convertasa de la vía alternativa.

Las tres vías (es decir, la clásica, de lectinas y la alternativa) han sido pensadas para converger en C5, que es escindida para formar productos con múltiples efectos proinflamatorios. La via convergida ha sido denominada la via del complemento terminal. C5a es la más potente anafilatoxina, induciendo alteraciones en el músculo liso y el tono vascular, asi como en la permeabilidad vascular. También es una potente quimiotoxina y activador de neutrófilos y monocitos. La activación celular mediada por C5a puede ampliar significativamente las respuestas inflamatorias induciendo la liberación de varios mediadores inflamatorios adicionales, incluyendo citoquinas, enzimas hidroliticas, metabolitos del ácido araquidónico y especies reactivas de oxigeno. La escisión de C5 conduce a la formación de C5b9, también conocida como el complejo de ataque a membrana (MAC por sus siglas en inglés). Ahora hay pruebas sólidas de que la deposición sublitica de MAC puede desempeñar un papel importante en la inflamación además de su papel como un complejo formador de poro Utico.

Además de su papel esencial en la defensa inmune, el sistema del complemento contribuye al daño de tejido en muchas situaciones clínicas. Por lo tanto, hay una necesidad apremiante de desarrollar inhibidores de complemento terapéuticamente eficaces para prevenir estos efectos adversos.

BREVE DESCRIPCIÓN En un aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-3-en un sujeto que sufre de hemoglobinuria paroxistica nocturna (HPN). El método incluye el paso de la administración al sujeto de una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-3 eficaz para inhibir la activación del complemento dependient de MASP-3. En algunas encarnaciones, el método comprende además administrar al sujeto una composición que comprende un agente inhibidor del MASP-2.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende a al menos un agente inhibidor, en donde por lo menos un agente inhibidor comprende un agente inhibidor delMASP-2 y un agente inhibidor de MASP-3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor de MASP-3 que se une a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10: longitud total) y que también se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y un vehículo farmacéutico.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor de MASP-3 que se une a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5: longitud total) y que también se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y un vehículo farmacéutico.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor de MASP-3 que se une a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10: longitud total) y que también se une a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5) y un vehículo farmacéutico.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor de MASP-3 que se une a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10 longitud total), que se une a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5: longitud total) y que también se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y un vehículo farmacéutico.

Como se describe en este documento, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden utilizarse de acuerdo con los métodos de la invención.

Estos y otros aspectos y modalidades de la invención descrita en este documento será evidentes en referencia a la siguiente descripción detallada y los dibujos. Todas las patentes estadounidenses, publicaciones de solicitudes de patente estadounidenses, solicitudes de patente estadounidenses, patentes extranjeras, solicitudes de patentes y publicaciones de patentes extranjeras no contempladas en esta descripción se incorporan aquí por referencia en su totalidad, como si cada una se incorporara individualmente.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Los aspectos anteriores y muchas de las ventajas concomitantes de esta invención serán más fácilmente apreciadas a medida que la misma se entienda mejor por referencia a la siguiente descripción detallada, cuando se toma en conjunción con los dibujos adjuntos, en los cuales: La figura 1 ilustra un nuevo entendimiento de las vías de la lectina y alternativa; La Figura 2 es un diagrama esquemático adaptado de Schwaeble et al., Immunobiol 205:455-466 (2002), modificado por Yongqing et al., BBA 1824:253 (2012), que ilustra los dominios proteicos de MASP-2 y MApl9 y los exones que codifican los mismos; La Figura 3 es un diagrama esquemático adaptado de Schwaeble et al., Immunobiol 205:455-466 (2002), modificado por Yongqing et al., BBA 1824:253 (2012), que ilustra los dominios proteicos de MASP-1, MASP-3 y MAp44 y los exones que codifican los mismos; La Figura 4 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas MASP-1, MASP-2 y MASP-3 e indica el consenso de las regiones entre las mismas; La Figura 5 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de las cadenas alfa de MASP-1, MASP-2 y MASP-3; La Figura 6 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de las cadenas beta de MASP-1, MASP-2 y MASP-3; La Figura 7A muestra la alineación por pares de las secuencias de aminoácidos de los dominios de proteasa de MASP-1 y MASP-2 (cadenas beta); La Figura 7B muestra la alineación por pares de las secuencias de aminoácidos de los dominios de proteasa de MASP-1 y MASP-3 (cadenas beta); La Figura 7C muestra la alineación por pares de las secuencias de aminoácidos de los dominios de proteasa de MASP-2 y MASP-3 (cadenas beta); La Figura 8 es un gráfico de Kaplan-Mcyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia en ratones KO y WT con MASP-2 después de la administración de una dosis infectiva de 2.6 x 107 cfu del serogrupo A Z2491 de N. meningitidis, lo que demuestra que los ratones deficientes de MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por N. meningitidis, como se describe en el Ejemplo 1; La Figura 9 es un gráfico de Kaplan-Mcyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia en ratones KO y WT con MASP-2 después de la administración de una dosis infectiva de 6 x 106 cfu del serogrupo B cepa MC58 de N. meningitidis, lo que demuestra que los ratones deficientes de MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por N. meningitidis, como se describe en el Ejemplo 1; La Figura 10 ilustra gráficamente el registro de ufc/mL de N. meningitidis del serogrupo B cepa MC58 por mililitro de sangre recuperada de ratones KO y WT con MASP-2 en diferentes puntos de tiempo después de la infección i.p. con 6 x 106 cfu de N. meningitidis del serogrupo B cepa MC58 (n = 3 en diferentes puntos de tiempo para ambos grupos de ratones), demostrando que aunque los ratones KO con MASP-2 fueron infectados con la misma dosis de N. meningitidisdel serogrupo B cepa MC58 que los ratones WT, los ratones KO con MASP-2 tienen una separación mejorada de la bacteriemia en comparación con los WT, tal como se describe en el Ejemplo 1; La Figura 11 ilustra gráficamente el puntaje promedio de enfermedad de ratones KO y WT con MASP-2 a 3, 6, 12 y 24 horas después de la infección con 6 x 106 cfu de N. meningitidis del serogrupo B cepa MC58, demostrando que los ratones deficientes de MASP-2 mostraron puntuaciones mucho más bajas de enfermedad a 6 horas, 12 horas y 24 horas después de la infección, en comparación con los ratones WT, tal como se describe en el Ejemplo 1; La Figura 12 es un gráfico de Kaplan-Mcyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de los ratones tras la administración de una dosis infectiva de 4 x 106 cfu de N. meningitidis del serogrupo B cepa MC58, seguido por la administración 3 horas después de la infección de cualquiera de un anticuerpo inhibidor de MASP-2 (1 mg/kg) o anticuerpo de isotipo de control, demostrando que el anticuerpo MASP-2 es eficaz para tratar y mejorar la supervivencia en los sujetos infectados con N. meningitidis, como se describe en el Ejemplo 2; La Figura 13 ilustra gráficamente el registro ufc/mL de los recuentos viables de N. meningitidis del serogrupo B cepa MC58 recuperados en diferentes puntos de tiempo en las muestras de suero humano que se muestran en la TABLA 5 tomadas en varios puntos de tiempo después de la incubación con N. meningitidis del serogrupo B cepa MC58, tal como se describe en el Ejemplo 3; La Figura 14 ilustra gráficamente el registro ufc/mL de los recuentos viables de N. meningitidis del serogrupo B-MC58 recuperados en diferentes puntos de tiempo en las muestras de suero humano que se muestra en la TABLA 7, demostrando que la destrucción dependiente de complemento de N. meningitidis en suero humano 20% (v/v) es dependiente de MASP-3 y MBL, tal como se describe en el Ejemplo 3; La Figura 15 ilustra gráficamente el registro ufc/mL de los recuentos viables de N. meningitidis del serogrupo B-MC58 recuperados en diferentes puntos de tiempo en las muestras de sueros de ratón que se muestran en la TABLA 9, demostrando que el suero del ratón golpeado ( knockout ) con MASP-2- / - (referido como "MASP-2 tiene un mayor nivel de actividad bactericida para N. meningitidis que el suero de ratón WT, mientras que por el contrario, el suero de ratón MASP-1/3-/- no tiene ninguna actividad bactericida, como se describe en el Ejemplo 3; La Figura 16 ilustra gráficamente la cinética de la activación de C3 bajo condiciones especificas de la via de las lectinas (1% plasma ) en sueros de ratón WT, C4-/-, MASP-1/3-/-, Factor B-/ - y MASP-2-/-, como se describe en el Ejemplo 4; La Figura 17 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b (impulsado por AP) impulsado por la via alternativa en placas de microtitulación revestidas de zimosano en condiciones especificas de la via alternativa "tradicional" (AP-especifica) (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) como una función de la concentración sérica en muestras de suero obtenidas de sujetos humanos deficientes de MASP-3, deficientes de C4 y deficientes de MBL, como se describe en el Ejemplo 4; La Figura 18 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b impulsado por AP en placas de microtitulación revestida de zymosan en condiciones AP-específicas "tradicionales" (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) como una función del tiempo en muestras de suero humano al 10% obtenidas de sujetos humanos deficientes de MASP-3, deficientes de C4 y deficientes de MBL, como se describe en el Ejemplo 4; La Figura 19A ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b en placas de microtitulación revestidas de manano como una función de la concentración sérica en muestras de suero obtenidas de ratones WT, deficientes de MASP-2 y deficientes de MASP-1/3 en condiciones AP-específicas "tradicionales" (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) o bajo condiciones fisiológicas gue permiten que tanto la via de las lectinas como la vía alternativa (AP) para funcionar (BBS/Mg++/Ca++), tal como se describe en el Ejemplo 4; La Figura 1¾B ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b en placas de tnicrotitulación revestidas de zimosano como una función de la concentración sérica en muestras de suero obtenidas de ratones WT, deficientes de MASP-2 y deficientes de MASP-1/3 en condiciones AP-específicas "tradicionales" (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) o bajo condiciones fisiológicas que permiten que tanto la via de las lectinas como la vía alternativa para funcionar (BBS/Mg++/Ca++), tal como se describe en el Ejemplo 4; La Figura 19C ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b en placas de microtitulación revestidas de S. pneumoniae D39 como una función de la concentración sérica en muestras de suero obtenidas de ratones WT, deficientes de MASP-2 y deficientes de MASP-1/3 en condiciones AP-especificas "tradicionales" (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) o bajo condiciones fisiológicas que permiten que tanto la via de las lectinas como la via alternativa para funcionar (BBS/Mg++/Ca++), tal como se describe en el Ejemplo 4; La Figura 20A ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C3b en sueros altamente diluidos llevado a cabo en placas de microtitulación revestidas de manano en condiciones AP-específicas tradicionales (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) o bajo condiciones fisiológicas que permiten que tanto la via de las lectinas como la via alternativa funcionen (BBS/Mg++/ Ca++), utilizando concentraciones séricas que van desde 0% hasta 1.25%, como se describe en el Ejemplo 4; La Figura 20B ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C3b llevado a cabo en placas de microtitulación revestidas de zimosano en condiciones AP-especificas tradicionales (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) o bajo condiciones fisiológicas que permiten que tanto la vía de las lectinas como la vía alternativa funcionen (BBS/Mg++/ Ca++), utilizando concentraciones séricas que van desde 0% hasta 1.25%, como se describe en el Ejemplo 4; La Figura 20C ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C3b llevado a cabo en placas de microtitulación revestidas de 5. pneumoniae D39 en condiciones AP-especificas tradicionales (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) o bajo condiciones fisiológicas que permiten que tanto la via de las lectinas como la vía alternativa funcionen (BBS/Mg++/ Ca++), utilizando concentraciones séricas que van desde 0% hasta 1.25%, como se describe en el Ejemplo 4; La Figura 21 ilustra gráficamente el nivel de hemolisis (medido por liberación de hemoglobina de los eritrocitos de ratón lisados (Crry/C3-/-) en el sobrenadante medido por fotometría) de eritrocitos murinos revestidos de manano por suero humano bajo condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca++) sobre una serie de diluciones séricas en el suero de MASP-3-/-, suero humano normal inactivado por calor (HI NHS), MBL-/-, anticuerpo monoclonal de NHS + MASP-2 y NHS de control, como se describe en el Ejemplo 5; La Figura 22 ilustra gráficamente el nivel de hemolisis (medido por liberación de hemoglobina de los eritrocitos de ratón U sados (Crry/C3-/-) en el sobrenadante medido por fotometría) de eritrocitos murinos revestidos de manano por suero humano bajo condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca++) sobre una serie de concentraciones séricas en el suero de MASP-3-/-, suero humano normal inactivado por calor (HI NHS), MBL-/-, anticuerpo monoclonal de NHS + MASP-2 y NHS de control, como se describe en el Ejemplo 5; La Figura 23 ilustra gráficamente el nivel de hemolisis (medida por liberación de hemoglobina de los eritrocitos de ratón WT lisados en el sobrenadante medido por fotometría) de eritrocitos murinos sin recubrimiento por suero humano bajo condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca++) en un rango de concentraciones séricas en suero de 3MC (MASP - 3-/-), (HI) NHS inactivado por calor, MBL-/-, anticuerpos monoclonales de NHS + MASP-2 y NHS de control, como se describe en el Ejemplo 5; La Figura 24 ilustra gráficamente la hemolisis (medida por liberación de hemoglobina de los eritrocitos de ratón U sados (CD55/59-/-) en el sobrenadante medido por fotometría) de eritrocitos murinos sin recubrimiento por suero humano bajo condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca++) en un rango de concentraciones séricas en el suero de (HI NHS) inactivado por calor, MBL-/-, anticuerpo monoclonal de NHS + MASP-2 y NHS de control, como se describe en el Ejemplo 5; La Figura 25 ilustra gráficamente la hemolisis (medida por liberación de hemoglobina de los eritrocitos de conejo U sados en el sobrenadante medido por fotometría) de eritrocitos de conejo recubiertos de manano por suero de ratón MASP-1/3-/- y suero de ratón WT de control bajo condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca++) en un rango de concentraciones séricas, tal como se describe en el Ejemplo 6; La Figura 26 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b (OD 405 nm) en una placa de microtitulación recubierta de zimosano como una función de la concentración sérica en muestras de sueros de ratón de factor D-/-, MASP-2-/- y WT en un ensayo de deposición de C3 llevado a cabo bajo condiciones AP-específicas, tal como se describe en el Ejemplo 7; La Figura 27 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b (OD 405 nm) en una placa de microtitulación recubierta de zimosano como una función de la concentración sérica en muestras de sueros de ratón de factor D-/-, MASP-2-/- y WT en un ensayo de deposición de C3 llevado a cabo bajo condiciones fisiológicas (en la presencia de Ca++), tal como se describe en el Ejemplo 7; La Figura 28 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b (OD 405 nm) en una placa de microtitulación recubierta de zimosano como una función de tiempo de incubación en suero (minutos) en muestras de suero de ratón obtenido de factor D-/-; factor B-/-; anticuerpo monoclonal de MASP-2 más y menos en un ensayo de deposición de C3 llevado a cabo bajo condiciones fisiológicas (en la presencia de Ca++), tal como se describe en el Ejemplo 7; La Figura 29A ilustra gráficamente la deposición de C4b especifica de la vía de la lectina en una placa de microtitulación recubierta de zimosano, medida ex vivo en muestras de suero no diluido tomadas de ratones (n = 3 ratones/grupo) en varios puntos de tiempo después de la dosificación subcutánea de 0.3 mg/kg o 1.0 mg/kg del MoAb MASP-2 de ratón, como se describe en el Ejemplo 13; La Figura 29B ilustra gráficamente el curso de tiempo de la recuperación de la vía lectina durante tres semanas después de una sola administración intraperitoneal de MASP-2 MoAb de ratón a 0.6 mg/kg en ratones, tal como se describe en el Ejemplo 13; La Figura 30A es un histograma de FACS de la unión de antigeno de MASP-3/anticuerpo con el clon M3J5, como se describe en el Ejemplo 15; La Figura 30B es un histograma de FACS de la unión de antigeno de MASP-3/anticuerpo con el clon M3M1, como se describe en el Ejemplo 15; La Figura 31 ilustra gráficamente una curva de saturación de unión del clon M3J5 (clon 5) con el antigeno de MASP-3, como se describe en el Ejemplo 15; La Figura 32A es una alineación de secuencias de aminoácidos de las regiones VH de 3J5, M3M1, D14 y 1E10 a la secuencia de pollo DT40 VH, en donde los puntos representan la identidad del aminoácido con la secuencia DT40 y los guiones indican los espacios introducidos para maximizar la alineación, tal como se describe en el Ejemplo 15; La Figura 32B es una alineación de secuencias de aminoácidos de las regiones VL de M3J5, M3M1, D14 y 1E10 a la secuencia de pollo DT40 VL, en donde los puntos representan la identidad del aminoácido con la secuencia DT40 y los guiones indican los espacios introducidos para maximizar la alineación, tal como se describe en el Ejemplo 15; La Figura 33 es un gráfico de barras que muestra la actividad inhibitoria de mAblElO en el Filtro del Sistema de Complemento Wieslab, Via de MBL en comparación con el suero positivo suministrado con el kit de ensayo, asi como un anticuerpo de control de isotipo, demostrando que mAblElO inhibe parcialmente la activación dependiente de LEA-2, (a través de inhibición de la activación dependiente de MASP-1 de MASP-2), mientras que el anticuerpo de control de isotipo no lo hace, como se describe en el Ejemplo 15; La Figura 34 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b para 1% de suero humano normal más isotipo de control, SGMI-lFc o SGMI-2FC en un rango de concentración de 0.15 a 1000 nM, demostrando que tanto SGMI-lFc como SG I-2Fc inhiben la deposición de C3b del suero normal en pocilios de ELISA recubiertos de manano, con valores de IC50 de aproximadamente 27nM y 300nM, respectivamente, como se describe en el Ejemplo 16; La Figura 35A proporciona los resultados del análisis de citometria de flujo para la deposición de C3b sobre Staphylococcus aureus destriudo por calor, demostrando que en el suero humano normal en presencia de EDTA, que se conoce por inactivar las vías de las lectinas y alternativa, no se observó deposición de C3b (panel 1), en el suero humano normal tratado con Mg++/EGTA, se observa la deposición de C3b impulsada por la via alternativa (grupo 2) y como se muestra en el panel 3, 4 y 5, en el suero agotado de factor-B, agotado de factor-D y agotado de properdina (factor P), respectivamente, no se observa vía alternativa impulsada por deposición de C3b, tal como se describe en el Ejemplo 17; La Figura 35B proporciona los resultados del análisis de citometría de flujo para la deposición de C3b en S. aureus, destruido por calor, demostrando que, como en el suero normal tratado con EDTA (panel 1), la deposición de C3b impulsada por AP está ausente en el suero de 3MC en presencia de Mg++/EGTA (panel 3), mientras que los paneles 4 y 5 muestran que el rMASP-3 de longitud total (panel4) y rMASP-3 activo (CCP1-CCP2-SP) (panel 5) ambos restauran la deposición de C3b impulsada por AP en suero de 3MC a niveles observados en el suero normal tratado con Mg++/ EGTA (panel2), ni rMASP-3 inactivo (S679A) (panel 6) ni rMASP-1 silvestre (panel 7) pueden restaurar la deposición de C3b impulsada por AP en suero de 3MC, tal como se describe en el Ejemplo 17; La Figura 36 muestra los resultados de un análisis de inmunoblot para determinar la escisión del factor B en respuesta a S. aureus en suero de 3MC en la presencia o ausencia de rMASP-3, demostrando que el suero humano normal en presencia de EDTA (control negativo, carril 1) demuestra muy poca escisión de Factor B en relación con el suero humano normal en presencia de Mg++/ EGTA, mostrado en el carril 2 (control positivo), como se muestra además en el carril 3, el suero de 3MC demuestra muy poca escisión de Factor B en presencia de Mg++/ EGTA. Sin embargo, como se muestra en el carril 4, la escisión del Factor B es restaurada por la adición y la preincubación de proteina recombinante de longitudo total de MASP-3 al suero de 3MC, tal como se describe en el Ejemplo 17; La Figura 37 muestra tinción de Comassie un gel proteico en donde se analiza la escisión del Factor B, demostrando que la escisión del Factor B es más óptima en presencia de C3, MASP-3 y pro-factor D (carril 1), y como se muestra en los carriles 4 y 5, ya sea MASP-3 o pro factor D solos son capaces de mediar la escisión del Factor B, siempre que C3 esté presente, como se describe en el Ejemplo 17; La Figura 38 ilustra gráficamente las intensidades fluorescentes medias (MFI) de la tinción con C3b de S. aureus obtenidas de mAbD14 (que se une a MASP-3), mAblA5 (anticuerpo de control negativo) y un anticuerpo de control de isotipo trazadas como una función de la concentración de mAb en suero de 3MC en presencia de rMASP-3, demostrando que mAbD14 la deposición de C3b dependiente de MASP-3 de una manera dependiente de la concentración, como se describe en el Ejemplo 17; La Figura 39 muestra análisis de in unoblot de la escisión de sustrato de pro-facto D, en donde en comparación con el pro-factor D solo (carril 1) o el MASP-3 recombinante de longitud total inactivo (S679A; carril 3), o el MASP-1 (S646A; carril 3) MASP-3 recombinante silvestre de longitud completa (carril 2) y MASP-1 (carril 5), ya sea completamente o parcialmente, escinden el Pro-factor D para generar factor D maduro, como se describe en el Ejemplo 18; La Figura 40 es un inmunoblot que muestra la actividad inhibitoria de los mAbs que se unen a MASP-3 (carril 2) y M3M1 (carril 3) en la escisión del pro-factor D dependiente de MASP-3 en comparación con una reacción de control que contiene sólo MASP-3 y pro-factor D (sin mAb, carril 1), asi como una reacción de control que contiene un mAb obtenido de la biblioteca de DTLacO que se une a MASP-1, pero no a MASP-3 (carril 4), como se describe en el Ejemplo 18; La Figura 41 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b impulsada por AP en placas de microtitulación recubiertas de zimosano como una función de la concentración sérica en muestras de suero obtenidas de sujetos deficientes de MASP-3 (3MC), deficientes de C4 y deficientes de MBL, lo que demuestra que los sueros deficientes de MASP-3 del Paciente 2 y del Paciente 3 tienen actividad de AP residual a altas concentraciones séricas (concentraciones séricas de 25%, 12.5%, 6.25%) pero un AP50 significativamente mayor (es decir, se necesita 8.2% y 12.3% de suero para alcanzar el 50% de la deposición máxima de C3), como se describe en el Ejemplo 19; La Figura 42 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b impulsada por AP en placas de microtitulación revestida de zymosan en condiciones AP-específicas "tradicionales" (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) como una función del tiempo en muestras de suero humano al 10% obtenidas de sujetos humanos deficientes de MASP-3, deficientes de C4 y deficientes de MBL, como se describe en el Ejemplo 19; La Figura 43 ilustra gráficamente el porcentaje de hemolisis (según lo medido por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de conejo lisados en el sobrenadante medido por fotometría) de eritrocitos de conejo recubiertos de manano en un rango de concentraciones médicas en suero de dos sujetos humanos normales (NHS) y de dos pacientes de 3MC (paciente 2 y paciente 3), medidas en ausencia de Ca++, demostrando gue la deficiencia de MASP-3 reduce el porcentaje de lisis mediada por complemento de eritrocitos recubiertos de manano en comparación con el suero humano normal, como se describe en el Ejemplo 19; La Figura 44 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b impulsada por AP en placas de microtitulación recubiertas de zimosano como una función de la concentración de proteina recombinante de longitud total MASP-3 añadida a las muestras de suero obtenidas del Paciente 2 de 3MC (MASP-3-/-), demostrando que, en comparación con MASP-3 recombinante inactivo de control negativo (MASP-3A; S679A), la proteina de MASP-3 recombinante activa reconstituye la deposición de C3b impulsada por AP en las placas recubiertas de zimosano de una manera dependiente de la concentración, como se describe en el Ejemplo 19; La Figura 45 ilustra gráficamente el porcentaje de hemolisis (según lo medido por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de conejo U sados en el sobrenadante medido por fotometría) de eritrocitos de conejo recubiertos de manano en un rango de concentraciones séricas en (1) suero humano normal (NHS); (2) suero de 3MC del paciente; (3) suero de 3MC del paciente más MASP-3 recombinante de longitud total (20 mg/ml); y (4) suero humano inactivado con calor (HIS), medido en la ausencia de Ca++, lo que demuestra que el porcentaje de lisis de los eritrocitos de conejo aumenta perceptiblemente en el suero de 3MC que contiene rMASP-3 en comparación con el porcentaje de lisis en suero de 3MC sin MASP-3 recombinante (p = 0.0006), tal como se describe en el Ejemplo 19; La Figura 46 ilustra gráficamente el porcentaje de lisis de eritrocitos de conejo en 7% de suero humano del Paciente 2 de 3MC y del Paciente 3 de 3MC que contiene MASP-3 recombinante activa en un rango de concentración de 0 a 110 mg/ml (en BBS/Mg++/EGTA), lo que demuestra que el porcentaje de lisis de eritrocitos de conejo aumenta con la cantidad de MASP-3 recombinante de una manera dependiente de la concentración, como se describe en el Ejemplo 19; y Figura 47 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b impulsado por LEA-2 en placas de ELISA recubiertas de manano como una función de la concentración de suero humano diluido en una tampón de BBS, para el suero de un sujeto humano normal (NHS), de dos pacientes de 3MC (paciente 2 y paciente 3 ), de los padres del paciente 3 y de un sujeto deficiente de MBL.

DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 ADNc de MApl9 humano SEQ ID NO: 2 proteina de MApl9 humano (con líder) SEQ ID NO: 3 proteína de MApl9 humano (madura) SEQ ID NO: 4 ADNc de MASP 2 humano SEQ ID NO: 5 proteína de MASP 2 humano (con líder) SEQ ID NO: 6 proteína de MASP 2 humano (madura) SEQ ID NO: 7 ADNc de MASP-3 humano SEQ ID NO: 8 proteína de MASP-3 humano (con líder) SEQ ID NO: 9 ADNc de MASP-1 humano SEQ ID NO: 10 proteína de MASP-1 humano (con líder) SEQ ID NO: 11 proteína de MAp44 humano (con líder) SEQ ID NO: 12 ADNc de MASP-2 de rata SEQ ID NO: 13 proteína de MASP-2 de rata (con líder) SEQ ID NO:14 ADN que codifica la región variable de cadena pesada (VH) de 17D20_dc35VH2lNllVL (OMS646) (sin péptido señal) SEQ ID NO:15 Polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) de 17D20_dc35VH21NllVL (OMS646) SEQ ID NO:16 Polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) de 17N16mc SEQ ID NO:17 Polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) de 17D20_dc35VH21NllVL (OMS646) SEQ ID NO:18 ADN que codifica la región variable de cadena ligrea (VH) de 17N16_dcl7N9 (OMS641) (sin péptido señal) SEQ ID NO:19 Polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) de 17N16_dcl7N9 (OMS641) SEQ ID NO: 20: clon derivado de scFv de polipéptido de longitud total de 17N16m_dl7N9 SEQ ID NO: 21: clon derivado de scFv de polipéptido de longitud total de 17D20m_d3521Nll SEQ ID NO: 22: clon derivado de scFv de polipéptido de longitud total que codifica ADN de 17N16m_dl7N9 (sin péptido señal) SEQ ID NO: 23: clon derivado de scFv de polipéptido de longitud total que codifica ADN de 17D20m_d3521Nll (sin péptido señal) SEQ ID NO: 24: polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) de DTLacO principal SEQ ID NO: 25: Polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) de clon M3J5 especifico de MASP-3 SEQ ID NO: 26: Polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) de clon M3M1 especifico de MASP-3 SEQ ID NO: 27: polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) de DTLacO principal SEQ ID NO: 28: Polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) de clon M3J5 especifico de MASP-3 SEQ ID NO: 29: Polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) de clon M3M1 especifico de MASP-3 SEQ ID NO: 30: Polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) de clon D14 de MASP-3 SEQ ID NO: 31: Polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) de clon D14 de MASP-3 SEQ ID NO: 32: Polipéptido de región variable de cadena pesada (VH) de clon 1E10 de MASP-1 SEQ ID NO: 33: Polipéptido de región variable de cadena ligera (VL) de clon 1E10 de MASP-1 SEQ ID NO:34 Péptido de SGMI-1 SEQ ID NO:35 Péptido de SGMI-2 SEQ ID NO: 36 polipéptido de IgGl-Fc humano SEQ ID NO: 37 vinculador peptidico #1 (12aa); SEQ ID NO: 38 vinculador peptidico #2 (lOaa); SEQ ID NO:39: fusión polipeptidica que codifica el ácido nucléico que comprende la secuencia señal IL-2 humana, SGMI-1, vinculador #1 e IgGl-Fc humano; SEQ ID NO: 40: fusión polipeptidica madura que comprende SGMI-1, vinculador #1 e IgGl-Fc (SGMI-lFc); SEQ ID NO:41: fusión polipeptidica que codifica el ácido nucléico que comprende la secuencia señal IL-2 humana, SGMI-2, vinculador #1 e IgGl-Fc humano; SEQ ID NO: 42: fusión polipeptidica madura que comprende SGMI-2, vinculador #1 e IgGl-Fc (SGMI-2Fc).

DESCRIPCIÓN DETALLADA I. DEFINICIONES A menos que se defina específicamente en el presente documento, todos los términos utilizados en este documento tienen el mismo significado que el que se entendería por aquellos de conocimientos ordinarios en la téenica de la presente invención. Las siguientes definiciones son proporcionadas con el fin de dar claridad con respecto a los términos que se utilizan en la descripción y reivindicaciones para describir la presente invención.

Como se utiliza en este documento, el camino efector 1 de la vía de la lectina ("LEA-1" por sus siglas en inglés) se refiere a la activación dependiente de lectina del factor B y factor D por MASP-3.

Como se utiliza en este documento, el camino efector 2 de la via de la lectina ("LEA-2" por sus siglas en inglés) se refiere a la activación dependiente del complemento dependiente de MASP-2.

Como se utiliza en este documento, el término "activación del complemento dependiente de MASP-3" consta de dos componentes: (i) la activación dependiente de MASP-3 de lectina del factor B y factor D, comprendida en la activación del complemento mediado por LEA-1, se da en la presencia de Ca++, llevando comúnmente a la conversión de C3bB a C3bBb y del pro-factor D al factor D; y (ii) la conversión independiente de lectina del factor B y el factor D, que puede darse en la ausencia de Ca++, llevando comúnmente a la conversión de C3bB a C3bBb y del profactor D al factor D. La activación del complemento mediada por LEA-1 y la conversión independiente de lectina del factor B y factor D se ha determinado que provoca opsonización y/o lisis. Mientras que no se desea regirse por ninguna teoría en particular, se cree que sólo cuando múltiples moléculas de C3b se asocian y se unen en cercana proximidad, la C3bBb C3 convertasa cambia su especificidad de sustrato y escinde C5 como la C5 convertasa de vía alternativa denominada C3bBb(C3b) .

Como se utiliza en este documento, el término "activación del complemento dependiente de MASP-2", también mencionada en este documento como la activación del complemento mediada por LEA-2, comprende la activación de MASP-2 dependiente de lectina, que se produce en presencia de Ca++, conduciendo a la formación de la C3 convertasa C4b2a de la vía de la lectina y a la acumulación del producto C3b de la escisión de C3 subsecuentemente a la C5 convertasa C4b2a(C3b)n, que se ha determinado que causa opsonización y/o lisis.

Como se utiliza en este documento, el término "comprensión tradicional de la vía alternativa" también conocido como la "vía alternativa tradicional" se refiere a la vía alternativa antes del descubrimiento aquí descrito, es decir, la activación del complemento que se dispara, por ejemplo, por zymosan de paredes celulares fúngicas y de levaduras, lipopolisacárido (LPS) de membranas externas Gram negativas y los eritrocitos de conejo, asi como de muchos polisacáridos puros, virus, bacterias, células tumorales animales, parásitos y células dañadas, y que tradicionalmente se ha considerado que surgen de la generación proteolitica espontánea de C3b del factor de complemento C3. Como se utiliza en este documento, la activación de la "vía alternativa tradicional ", también conocida aquí como la "vía alternativa", se mide en Mg++/tampón de EGTA (es decir, en ausencia de Ca++).

Como se utiliza en este documento, el término "vía de las lectinas" se refiere a la activación del complemento que se produce a través de la unión específica del suero y proteínas de unión de carbohidrato no sérico que incluye la unión de manano a la lectina (MBL), CL-11 y las ficolinas (H ficolina, M ficolina o L ficolina). Como se describe en este documento, los inventores han descubierto que la vía de las lectinas es impulsada por dos caminos efectores, el camino efector 1 de la vía de la lectina (LEA-1), que se conoce por ser dependiente de MASP-3, y el camino efector 2 de la vía de la lectina (LEA-2), que es dependiente de MASP-2. Como se utiliza en este documento, la activación de la vía de la lectina es evaluada usando tampones con conentido de CA++.

Como se utiliza en este documento, el término "vía clásica" se refiere a la activación de complemento que se desencadena por la unión de anticuerpos a partículas extrañas y requiere de la unión de la molécula de reconocimiento Clq.

Como se utiliza en este documento, el término "HTRA-1 " se refiere a la serina proteasa Al que requiere de serina peptidasa de alta temperatura.

Como se utiliza en este documento, el término "agente inhibidor de MASP-3" se refiere a cualquier agente que inhibe directa o indirectamente la activación del complemento dependiente de MASP-3, incluidos los anticuerpos de MASP-3 y fragmentos de unión a MASP-3 de los mismos, péptidos naturales y sintéticos, sustratos competitivos, moléculas pequeñas, inhibidores de expresión e inhibidores aislados naturales, y también abarca péptidos que compiten con MASP-3 para la unión a otra molécula de reconocimiento (por ejemplo, MBL, CL-11, H-ficolina, M-ficolina o L-ficolina) en la vía de las lectinas. En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 es específico a MASP-3 y no se une a MASP-1 o MASP-2. Un agente inhibidor que inhibe directamente MASP-3 puede ser contemplado como un agente inhibidor directo de MASP-3 (por ejemplo, un anticuerpo de MASP-3), mientras que un agente inhibidor que inhibe indirectamente MASP-3 puede ser referido como un agente inhibidor indirecto de MASP-3 (por ejemplo, un anticuerpo de MASP-1 que inhibe la activación de MASP-3). Un ejemplo de un agente inhibidor directo de MASP-3 es un agente inhibidor especificode MASP-3, tal como un agente inhibidor de MASP-3 que se une específicamente a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) con una afinidad de unión de por lo menos 10 veces mayor que a otros componentes en el sistema del complemento. En una modalidad, un agente inhibidor del MASP-3 inhibe indirectamente la actividad de MASP-3, tal como, por ejemplo, un inhibidor de la activación del MASP-3, incluyendo un inhibidor de la activación de MASP-3 mediada por MASP-1 (por ejemplo, un anticuerpo de MASP-1 o fragmentos de unión a MASP-1 del mismo, péptidos sintéticos y naturales, moléculas pequeñas, losinhibidores de expresión e inhibidores naturales aislados y también abarca péptidos que compiten con MASP-1 para la unión a MASP-3). En otra modalidad, un agente inhibidor de MASP-3 inhibe la maduración mediada por MASP-3 del factor D. En otra modalidad, un agente inhibidor de MASP-3 inhibe la activación mediada por MASP-3 del factor B. Los agentes inhibidores de MASP-3 útiles en el método de la invención pueden reducir la activación del complemento dependiente de MASP-3 a más del 10%, tal como más del 20%, más del 50% o más del 90%. En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 reduce la activación del complemento dependiente de MASP-3 en más del 90% (es decir, resultando en la activación del complemento de MASP-3 de sólo el 10% o menos). Se espera que la inhibición MASP-3 bloqueará, en su totalidad o en parte, tanto la lisis y opsonización relacionadas con LEA-1 como la lisis y opsionización relacionadas con la conversión independiente de lectina del factor B y el factor D.

Como se utiliza en este documento, el término "agente inhibidor de MASP-1" se refiere a cualquier agente que se une a o interactúa directamente con MASP-1 e inhibe al menos uno de (i) activación del complemento dependiente de MASP-3 y/o (ii) activación del complemento dependiente de MASP-2 y/o (iii) maduración mediada por MASP-1 dependiente de lectina o independiente de lectina del factor D, en donde la maduración de MASP-1 dependiente de lectina del factor D implica la activación directa del factor D, incluyendo anticuerpos MASP-1 y fragmentos de unión a MASP-1 de los mismos, péptidos naturales y sintéticos, moléculas pequeñas, inhibidores de expresión e inhibidores naturales aislados, y también abarca péptidos que compiten con MASP-1 para la unión a otra molécula de reconocimiento (por ejemplo, MBL- CL11, H ficolina, M ficolina o L ficolina) en la via de las lectinas. En una modalidad, los agentes inhibidores de MASP-1 útiles en el método de la invención reducen la activación del complemento dependiente de MASP-3 en más del 10%, tal como en más del 20%, más del 50%, o más del 90%. En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-1 reduce la activación del complemento dependiente de MASP-3 en más del 90% (es decir, resultando en la activación del complemento de MASP-3 de sólo el 10% o menos). En otra modalidad, los agentes inhibidores de MASP-1 útiles en el método de la invención reducen la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más del 10%, tal como en más del 20%, más del 50%, o más del 90%. En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-1 reduce la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más del 90% (es decir, resultando en la activación del complemento de MASP-2 de sólo el 10% o menos).

En otra modalidad, los agentes inhibidores de MASP-1 útiles en el método de la invención reducen tanto la activación del complemento dependiente de MASP-3 (LEA-1), la conversión independiente de lectina del factor B y el factor D, y la activación del complemento dependiente de MASP-2 (LEA-2) en más del 10%, tal como en más del 20%, más del 50%, o más del 90%. En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-1 reduce la activación del complemento dependiente de MASP-3 (LEA-1), la conversión independiente de lectina del factor B y el factor D, y la activación del complemento dependiente de MASP-2 (LEA-2) en más del 90% (por ejemplo, resultando en la activación del complemento de MASP 3 de sólo el 10% o menos, y la activación del complemento de MASP-2 de sólo el 10% o menos).

Un ejemplo de un agente inhibidor directo de MASP-1 es un agente inhibidor especifico de MASP-1, tal como un agente inhibidor de MASP-3 que se une específicamente a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10) con una afinidad de unión de por lo menos 10 veces mayor que a otros componentes en el sistema del complemento. En muchos casos, dado que MASP-1 puede activar MASP-3 y considerando que MASP-1 puede activar MASP-2, se esperaría que la inhibición del MASP-1 fuera eficaz en la inhibición de MASP-3 y/o MASP-2. Sin embargo, en algunos casos, la inhibición de MASP-1 o MASP-3 o MASP-2 puede ser una modalidad preferida en relación con la inhibición de otros objetivos de MASP. Por ejemplo, en el establecimiento de la infección por Staphylococcus aureus [S. aureus ) , MASP-3 ha demostrado estar activado y ser responsable de la opsonización de S. aureus en ausencia de MASP-1 (ver Iwaki D. et al·., J Immunol 187(7): 3751-8 (2011)). Por lo tanto, en el tratamiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), por ejemplo, sería ventajoso inhibir directamente MASP-1 en lugar de MASP-3, reduciendo así la susceptibilidad potencial a S. aureus durante el tratamiento inhibidor de LEA-1 en la HPN.

Como se utiliza en este documento, el término "agente inhibidor de MASP-2" se refiere a cualquier agente que se une a o interactúa directamente con MASP-2 e inhibe al menos uno de (i) activación del complemento dependiente de MASP-2 y/o (ii) activación del complemento dependiente de MASP-1, incluyendo anticuerpos de MASP-1 y fragmenos de unión a MASP-1 de los mismos, péptidos naturales y sintéticos, moléculas pequeñas, inhibidores de expresión e inhibidores naturales aislados, y también abarca péptidos que compiten con MASP-2 para la unión a otra molécula de reconocimiento (por ejemplo, MBL, CL-11, H ficolina, M ficolina o L ficolina) en la vía de las lectinas. Los agentes inhibidores de MASP-2 útiles en el método de la invención reducen la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más del 10%, tal como en más del 20%, más del 50%, o más del 90%. En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-2 reduce la activación del complemento dependiente de MASP-2 en más del 90% (es decir, resultando en la activación del complemento de MASP-2 de sólo el 10% o menos). Un ejemplo de un agente inhibidor directo de MASP-2 es un agente inhibidor especifico de MASP-2, tal como un agente inhibidor de MASP-2 que se une específicamente a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5) con una afinidad de unión de por lo menos 10 veces mayor que a otros componentes en el sistema del complemento.

Como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo" abarca los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de los mismos, derivados de cualquier mamífero que produce anticuerpos (por ejemplo, ratón, rata, conejo y primates incluyendo humanos), o de un hibridoma, selección de fago, expresión recombinante o animales transgénicos (u otros métodos de producción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos), que se unen específicamente a un polipéptido objetivo, tal como, por ejemplo, polipéptidos de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 o porciones de los mismos. No se pretende que el término "anticuerpo" se limitado en lo que respecta a la fuente del anticuerpo o la forma en que se hace (por ejemplo, por hibridoma, selección de fago, expresión recombinante, animal transgénico, síntesis de péptidos, etc.). Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos recombinantes, monoclonales y policlonales; anticuerpos específicos, multiespecífíeos de pan ( pan-specific) (por ejemplo, anticuerpos bi-específíeos, anticuerpos tri-específicos); anticuerpos humanizados; anticuerpos murinos; anticuerpos quiméricos, de ratón humano, de ratón primate, de primate humano monoclonales; y anticuerpos anti-idiotipo, y pueden ser cualquier anticuerpo intacto o fragmento del mismo. Como se utiliza en este documento, el término "anticuerpo" abarca no sólo anticuerpos intactos policlonales o monoclonales, sino también fragmentos de éstos (tales como dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), de cadena única (ScFv), variantes sintéticas de los mismos, variantes de ocurrencia natural, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpos con un fragmento de unión a antígeno de la especifidad requerida, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio o fragmento de unión a antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especifidad requerida.

Un "anticuerpo monoclonal" se refiere a una población homogénea de anticuerpos en la cual el anticuerpo monoclonal está compuesto de aminoácidos (de origen natural y no natural) que participan en la unión selectiva de un epítopo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos para el antígeno objetivo. El término "anticuerpo monoclonal" abarca no sólo los anticuerpos monoclonales intactos y los anticuerpos monoclonales de longitud completa, sino también los fragmentos de éstos (tales como Fab, Fab', F(ab') 2, Fv), cadena única (ScFv), variantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de unión del antígeno, anticuerpos monoclonales humanizados, anticuerpos monoclonales quiméricos y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un fragmento de unión del antígeno (sitio de reconocimiento de epítopo) de la especificidad necesaria y la capacidad para unirse a un epitopo. No se pretende estar limitados en lo que respecta a la fuente del anticuerpo o la forma en que se hace (por ejemplo, por hibridoma, selección de fago, expresión recombinante, animal transgénico, etc.). El término incluye las inmunoglobulinas enteras asi como los fragmentos etc. descritos anteriormente en la definición de "anticuerpos".

Como se utiliza en este documento, el término "fragmento de anticuerpo" se refiere a una porción derivada de o relacionada con un anticuerpo de longitud completa, tal como, por ejemplo, un anticuerpo de MASP-1, MASP-2 o 3 MASP, generalmente incluyendo la unión del antigeno o región variable del mismo. Ejemplos ilustrativos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos de Fab, Fab', F (ab) 2, F(ab') 2 y Fv, fragmentos scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena única y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Como se utiliza en este documento, un "FV de cadena única" o fragmento de anticuerpos de "scFv" comprende los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptidica. Generalmente, el polipéptido Fv comprende además un enlazador de polipéptido entre los dominios VH y VL, lo que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión del antígeno.

Como se utiliza en este documento, un "anticuerpo quimérico" es una proteina recombinante que contiene los dominios variables y las regiones de determinación de complementariedad derivadas de anticuerpo de especies no humanas (por ejemplo, roedor), mientras que el resto de la molécula del anticuerpo se deriva de un anticuerpo humano.

Como se utiliza en este documento, un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo quimérico que comprende una secuencia mínima que se ajusta a regiones de determinación de complementariedad específicas derivadas de inmunoglobulina humana sin que se trasplanta en un marco de anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados son típicamente proteínas recombinantes en las que sólo las regiones de determinaión de complementariedad del anticuerpo son de origen no humano (incluidos los anticuerpos generados de presentación de fagos o levadura).

Como se utiliza en este documento, el término "lectina de unión a manano" ("MBL por sus siglas en inglés") es equivalente a la proteína de unión a manano ("MBP por sus siglas en inglés").

Como se utiliza en este documento, el "complejo de ataque a la mamebrana" ("MAC") se refiere a un complejo de los componentes de complemento de terminal cinco (C5b combinado con C6, C7, C8 y C9) que se inserta en y altera las membranas (también referido como C5b9).

Como se utiliza en este documento, "un sujeto" incluye todos los mamíferos, incluyendo, sin limitación, humanos, primates no humanos, perros, gatos, caballos, ovejas, cabras, vacas, conejos, cerdos y roedores.

Como se utiliza en este documento, los residuos de aminoácido se abrevian como sigue: alanina (Ala;A), asparagina (Asn;N), ácido aspártico (Asp;D), arginina (Arg;R), cisteína (Cys;C), ácido glutámico (Glu;E), glutamina (Gln;Q), glicina (Gly;G), histidina (His;H), isoleucina (Ile;I), leucina (Leu;L), lisina (Lys;K), metionina (Met;M), fenilalanina (Phe;F), prolina (Pro;P), serina (Ser;S), treonina (Thr;T), triptofano (Trp;W), tirosina (Tyr;Y), y valina (Val;V).

En el sentido más amplio, los aminoácidos de ocurrencia natural pueden dividirse en grupos con base en las características químicas de la cadena lateral de los aminoácidos correspondientes. Por aminoácido "hidrofóbico" se entiende lie, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys o Pro. Por aminoácido "hidrófilo" se entiende Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg o His. Esta agrupación de aminoácidos puede ser sub clasificada como sigue. Por aminoácido "hidrófilo sin carga" se entiende Ser, Thr, Asn o Gln. Por aminoácido "ácido" se entiende Glu o Asp. Por aminoácido "básico" se entiende Lys, Arg o His.

Como se utiliza en este documento el término "sustitución conservadora de aminoácidos" es ilustrado por una sustitución entre aminoácidos dentro de cada uno de los siguientes grupos: (1) glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina, (2) fenilalanina, tirosina y triptófano, (3) serina y treonina, (4) aspartato y glutamato, (5) glutamina y asparragina y (6) lisina, arginina e histidina.

El término "oligonucleótido" como se utiliza en este documento se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o análogos de los mismos. Este término también abarca las oligonucleobases compuestas de nucleótidos de ocurrencia natural, azúcares y enlaces covalentes internucleósidos (troncales), asi como oligonucleótidos que tienen modificaciones de ocurrencia no natural.

Como se utiliza en este documento, un "método" se refiere al sitio en una proteína (por ejemplo, una proteína humana de MASP-3 que está unida por un anticuerpo. "Superposición de epítopos" incluye al menos uno (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco o seis) residuo (s) común(es) de aminoácidos, incluyendo epítopos lineales y no lineales.

Como se utiliza en este documento, los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente y significan cualquier cadena de aminoácidos ligada a péptido, independientemente de su longitud o modificación post-translacional. Las proteínas MASP (MASP-1, MASP-2 o MASP-3) descritas en este documento pueden contener o ser proteínas de tipo salvaje o ser variantes que tienen no más de 50 (por ejemplo, no más de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ó 50) sustituciones conservadoras de aminoácido. Las sustituciones conservadoras incluyen típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina y alanina; valina, isoleucina y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina, glutamina, serina y treonina; lisina, histidina y arginina; y fenilalanina y tirosina.

La proteína humana MASP-1 (establecida como SEQ ID NO: 10), la proteina humana MASP-2 (establecida como SEQ ID NO: 5) y la proteina humana MASP-3 (establecida como SEQ ID NO: 8) descritas en este documento también incluyen "fragmentos de péptido" de las proteínas, que son proteínas MASP más cortas que la longitud completa y/o inmaduras (pre-pro), incluyendo fragmentos de péptido de proteína MASP que incluyen variantes de eliminación de terminal así como internas de la proteína. Las variantes de eliminación pueden carecer de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 segmentos de aminoácido (de dos o más aminoácidos) o aminoácidos individuales no contiguos. En algunas modalidades, la proteina humana MASP-1 puede tener una secuencia de aminoácidos que es de, o es superior a, 70 (por ej., 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100) % idéntica a la proteina humana MASP-1 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 10.

En algunas modalidades, la proteina humana MASP-3 puede tener una secuencia de aminoácidos que es de, o es superior a, 70 (por ej., 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100) % idéntica a la proteina humana MASP-3 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8.

En algunas modalidades, la proteina humana MASP-2 puede tener una secuencia de aminoácidos que es de, o es superior a, 70 (por e ., 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ó 100) % idéntica a la proteina humana MASP-2 que tiene la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 5.

En algunas modalidades, los fragmentos de péptido pueden ser por lo menos 6 (por ejemplo, por lo menos 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, ó 600 o más) residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, por lo menos 6 residuos de aminoácidos contiguos en cualquiera de las SEQ ID NOS: 5, 8 ó 10). En algunas modalidades,un fragmento de péptido de una proteina MASP humana es menor a 500 (por ejemplo, menor a 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7 ó 6) residuos de aminoácidos de longitud (por ejemplo, menos de 500 residuos de aminoácidos contiguos en cualquiera de las SEQ ID NOS: 5,8 6 10).

En algunas modalidades, en el contexto de generar un anticuerpo que une MASP-1, MASP-2 y/o MASP-3, los fragmentos de péptido son antigénicos y conservan al menos el 10% (por ejemplo, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99%, al menos el 99.5%, 100% o más) de la capacidad de la proteína de longitud completa para inducir una respuesta antigénica en un mamífero (véase bajo "Métodos para la Producción de un Anticuerpo").

El porcentaje de la identidad de la secuencia de aminoácidos (%) se define como el porcentaje de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los aminoácidos en una secuencia de referencia, después de alinear las secuencias y de introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. La alineación para efectos de determinar el porcentaje de la identidad de secuencia puede lograrse de diversas formas que están dentro de la experiencia en la materia, por ejemplo, utilizando el software de computadora disponible públicamente tal como el software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los parámetros adecuados para la medición de la alineación, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la máxima alineación sobre la longitud completa de las secuencias comparadas puede determinarse por métodos conocidos.

En modalidades representativas, la proteína humana MASP-1 (SEQ ID NO: 10) está codificada por la secuencia de ADNc establecida como SEQ ID NO: 9; la proteína humana MASP-2 (SEQ ID NO: 5) está codificada por la secuencia de ADNc establecida como SEQ ID NO: 4; y la proteina humana MASP-3 (SEQ ID NO: 8) está codificada por la secuencia de ADNc establecida como SEQ ID NO: 7. Los expertos en la materia reconocerán que las secuencias de ADNc divulgadas en SEQ ID NO: 9, SEQ ID: 4 y SEQ ID NO: 7 representan un solo alelo de 1 MASP, MASP-2 y MASP-3 humana, respectivamente, y que se espera que se produzcan variación alélica y empalme alternativo. Las variantes alélicas de las secuencias de nucleótidos mostradas en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 7, incluyendo aquellas que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las que las mutaciones resultan en cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención. Las variantes alélicas de la secuencia de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 pueden ser clonadas mediante el sondeo de ADNc o bibliotecas genómicas de individuos diferentes según los procedimientos estándar, o pueden ser identificadas por la búsqueda de comparación de homología (por ejemplo, búsqueda en BLAST) de bases de datos que contienen dicha información.

II. LA VÍA DE LAS LECTINAS: UN NUEVO ENTENDIMIENTO i. Información general: la Vía de las Lectinas se ha redefinido Como se describe en este documento, los inventores han hecho el sorprendente descubrimiento de que la vía de las lectinas del complemento tiene dos caminos efectores para activar el complemento, ambos impulsados por complejos de activación de la via de las lectinas formados por componentes de reconocimiento de carbohidratos (MBL, CL-11 y ficolinas): i) el camino efector formado por las serinas proteasas asociadas a la via de las lectinas MASP-1 y MASP-3, referido en el presente documento como "camino efector 1 de la via de la lectina" o "LEA-1"; y (ii) el camino efector de activación impulsado por MASP-2, referido en este documento como el "camino efector 2 de la via de la lectina", o "LEA-2". Tanto LEA-1 como LEA-2 pueden efectuar lisis y/u opsonización.

También se ha determinado que la conversión independiente de lectina del factor B de MASP-3 y la conversión independiente de lectina del factor D por HTRA-MASP-1 y MASP-3, que pueden ocurrir en la ausencia de Ca++, comúnmente conducen a la conversión de C3bB a C3bBb y del pro-factor D a factor D. Por lo tanto, la inhibición de MASP-3 puede inhibir tanto LEA-1 como la activación independiente de lectina de factor B y factor D, lo que puede resultar en la inhibición de la lisis y/u la opsonización.

La figura 1 ilustra este nuevo entendimiento de las vías de activación del complemento. Como se muestra en la figura 1, LEA-1 es impulsado por MASP-3 unido a lectina, lo que puede activar el zimógeno del factor D a su forma activa y/o escindir el factor B unido a C3b o C3b(H20), llevando a la conversión del complejo zimógeno de C3bB a su forma enzimáticamente activa de C3bBb. El factor activado D, generado por MASP-3, también puede convertir los complejos zimógenos de C3bB o C3b(H20) a su forma enzimáticamente activa. MASP-1 es capaz de la rápida auto-activación, mientras que MASP-3 no lo es. En muchos casos, MASP-1 es el activador de MASP-3.

Mientras en muchos ejemplos las lectinas (es decir, MBL, CL-11 o ficolinas) pueden dirigir la actividad a las superficies celulares, la figura 1 describe también las funciones independientes de lectina de MASP-3, MASP-1 y 1-HTRA en la activación de factor B o la maduración de factor D. Al igual que con la forma asociada a lectina de MASP-3 en LEA-1, la forma independiente de lectina de MASP-3 es capaz de mediar la conversión de C3bB o C3b(H20) a C3bBb (véase también figuras 36 y 37) y pro-factor D a factor D (véase figura 39). MASP-1 (véase también figura 39) y la proteina no relacionada con MASP, HTRA-1, también puede activar el factor D (Stanton et al., Evidence That the HTRA1 Interactome Influences Susceptibility to Age-Rela ted Macular Degenera tion, presentada en la conferencia de The Associa tion for Research in Vision and Ophthalmology 2011 el 4 de mayo de 2011) de una manera en la que no se requiere un componente de lectina.

Por lo tanto, MASP-1 (a través de las formas independientes de lectina y LEA-1), MASP-3 (a través de las formas independientes de lectina y LEA-1) y HTRA-1 (sólo independiente de lectina) son capaces de la activación directa o indirecta en uno o más puntos a lo largo de un eje de MASP-3-factor B-factor D. Al hacerlo, generan C3bBb, la convertasa C3 de la vía alternativa, y estimulan la producción y la deposición de C3b sobre superficies microbianas. La deposición de C3b desempeña un papel critico en la opsonización, etiquetado de las superficies de los microbios para la destrucción de las células fagociticas del húesped, tales como los macrófagos. Como un ejemplo en este documento (figura 35), MASP-3 es fundamental para la opsonización de S. aureus . La deposición de C3b se produce rápidamente en S. aureus expuesto a suero humano en una forma dependiente de MASP-3 (figura 35).

Sin embargo, las contribuciones de LEA-1 y las funciones independientes de lectina de MASP-3, MASP-1 o HTRA-1 no se limitan a la opsonización. Como se muestra en los diagramas de la figura 1, estos tres componentes también pueden causar lisis celular por activación directa o indirecta del factor B y la producción de C3b. Estos componentes forman complejos que generan la C5 convertasa de la vía alternativa, C3bBbn(C3b). Como se describe más en el presente documento, el requisito para MASP-3 y MBL, pero no MASP-2 (y, por tanto, no para LEA-2 en este ejemplo), en la lisis de N. meningitidis (vea las figuras 13, 14 y 15) demuestra un papel para LEA-1 en la lisis. En resumen, los resultados de opsonización obtenidos de los estudios de S. aureus y los resultados observados en la lisis en los estudios de N. meningitidis apoyan el papel de LEA-1 en ambos procesos (como se muestra en los diagramas de la figura 1). Además, estos estudios demuestran que tanto la opsonización como la lisis pueden resultar de la conversión del C3bB o C3b(H20) o del pro-factor D al factor D; por lo tanto, ambos procesos pueden ser los resultados de los papeles independientes de la lectina de MASP-3, MASP-1 o HTRA-1. Por lo tanto, el modelo desarrollado por los inventores en la figura 1 soporta el uso de inhibidores de principalmente MASP-3, pero también de MASP-1 o HTRA-1, para bloquear la opsonización o lisis y tratar patologías causadas por una desregulación de estos procesos. 1. Camino Efector de la Via de las Lectinas (LEA-1) El primer camino efector de la vía de las lectinas, LEA-1, está formado por las serina proteasas asociadas a la vía de las lectinas MASP-1 y MASP-3. Como se describe en este documento, los inventores han demostrado ahora que, en ausencia de MASP-3 y en presencia de MASP-1, la vía alternativa no es activada efectivamente en estructuras superficiales. Estos resultados demuestran que MASP-3 desempeña un papel antes no revelado en la iniciación de la vía alternativa, y esto se ve confirmado usando el suero de 3MC deficiente de MASP-3 obtenido de pacientes con el raro trastorno autosómico recesivo de 3MC (Rooryck C, et al., Nat Genet . 43 (3): 197-203 (2011)) con mutaciones que hacen el dominio de serina proteasa de MASP-3 disfuncional. Con base en estos resultados novedosos, se espera que la activación del complemento que involucra la vía alternativa, como se define convencionalmente, sea dependiente de MASP-3. De hecho, MASP-3 y su activación de LEA-1, pueden representar el iniciador hasta ahora esquivo de la vía alternativa.

Como se describe en los ejemplos 1-4, en los sueros deficientes de MASP-2, los inventores observaron una mayor actividad de la activación de la vía alternativa dependiente de lectina resultando en una mayor actividad bactericida (es decir, actividad lítica) contra N. meningitidis. Mientras que no se desea regirse por ninguna teoría particular, se cree que en ausencia de MASP-2, los complejos de reconocimiento de carbohidratos que ostentan MASP-1 son más propensos a unirse cerca de complejos de reconocimiento de carbohidratos que ostenant MASP-3 para activar el MASP-3. Se sabe que, en muchos casos, la activación del MASP-3 es dependiente de la actividad MASP-1, ya que MASP-3 no es una enzima auto-activadora y muy a menudo requiere la actividad del MASP-1 para convertirse de su forma de zimógeno a su forma enzimáticamente activa. MASP-1 (como el MASP-2) es una enzima auto-activadora, mientras que MASP-3 no se auto-activa y, en muchos casos, necesita la actividad enzimática de MASP-1 para convertirse a su forma enzimáticamente activa. Ver, Zundel S, et al, J Immunol . , 7:4342-50 (2004). En ausencia de MASP-2, todos los complejos de reconocimiento de la vía de las lectinas están ya sea cargados con MASP-1 o MASP-3. Por lo tanto, la ausencia de MASP-2 facilita la conversión de mediada por MASP-1 en MASP-3 en su forma enzimáticamente activa. Una vez que MASP-3 es activada, MASP-3 activada inicia la activación de la via alternativa, ahora referida como activación de "LEA-1", a través de una conversión de C3bB a C3bBb mediada por MASP-3 o conversión de pro-factor D al factor D. C3bBb, también referida como la C3 convertasa de via alternativa, escinde las moléculas de C3 adicionales arrojando la deposición de las moléculas de C3 opsónicas. Si varios fragmentos C3b se unen en las cercana proximidad al complejo de C3bBb convertasa, esto se traduce en la formación de la C5 convertasa C3bBb(C3b)n de la vía alternativa, que promueve la formación de MAC. Además, las moléculas de C3b depositadas en la superficie forman nuevos sitios de unión de factor B, que ahora puede ser escindido por el factor D y/o MASP-3 para formar otros sitios en donde pueden formarse complejos de C3 y C5 convertasa de vía alternativa. Este último proceso es necesario para la lisis eficaz y no requiere lectinas una vez que se ha producido la deposición inicial de C3b. Una publicación reciente (Iwaki D. et al, J Immunol 187 (7): 3751-8 (2011)) así como datos generados por los inventores (Figura 37) demuestran que el zimógeno del complejo C3bB de C3 convertasa de la vía alternativa se convierte en su forma enzimáticamente activa por MASP-3 activado. Los inventores ya han descubierto que la escisión mediada por MASP-3 del factor B representa un subcomponente del recientemente descrito LEA-1, que promueve la formación dependiente de lectina de la C3 convertasa C3bBb de la vía alternativa. 2. Camino Efector de la Via de las Lectinas (LEA-2) El segundo camino efector de la vía de las lectinas, LEA-2, está formado por la serina proteasa asociada a la vía de las lectinas MASP-2. MASP-2 se activa a la unión de los componentes de reconocimiento con sus respectivos patrones y también puede ser activada por MASP- 1 y posteriormente escinde el componente C4 del complemento en C4a y C4b. Tras la unión del producto escindido C4b a plasma C2, C2 unido a C4b, se convierte en sustrato de un segundo paso de escisión mediado por MASP-2 que convierte C2 unido a C4b en el complejo enzimáticamente activo de C4bC2a y un pequeño fragmento de escisión de C2b. C4b2a es la C3 convertasa convertidora de C3 de la vía de las lectinas, convirtiendo el componente plasmático abundante C3 en C3a y C3b. C3b se une a cualquier superficie en cercana proximidad a través de un enlace tioéster. Si varios fragmentos de C3b se unen en cercana proximidad al complejo de C3 convertasa C4b2a, esta convertasa altera su especificidad para convertir C5 en C5b y C5a, formando el complejo de C5 convertasa C4b2a(C3b)n. Mientras que esta C5 convertasa puede iniciar la formación de MAC, este proceso se cree que es insuficientemente eficaz para promover la lisis por sí mismo. Por el contrario, las opsoninas C3b iniciales producidas por LEA-2 forman el núcleo para la formación de los nuevos sitios de C3 convertasa y C5 convertasa de la vía alternativa, lo que en última instancia conduce a abundante formación de MAC y lisis. Este último evento es mediado por la activación de factor D del factor B asociada a C3b formada por LEA-2 y por lo tanto es dependiente de LEA-1 en virtud de la función esencial para MASP-1 en la maduración del factor D. También hay una ruta de activación de derivación de C4 dependiente de MASP-2 para activar C3 en la ausencia de C4, que desempeña un papel importante en la fisiopatologia de la reperfusión por isquemia, debido a que los ratones deficientes en C4 no están protegidos de la lesión por reperfusión por isquemia mientras que los ratones deficientes de MASP-2-deficientes si lo están (Schwaeble et al., PNAS, 2011 supra) . LEA-2 también está ligada a la vía de la coagulación, que implica la escisión de protrombina a trombina (vía común) y también la escisión del factor XII (factor de Hageman) para convertirse en su forma enzimáticamente activa Xlla. El factor Xlla segmenta alternadamente el factor XI a Xla (vía intrínseca). La activación de la vía intrínseca de la cascada de coagulación conduce a la formación de fibrina, que es de vital importancia para la formación del trombo.

La figura 1 ilustra el nuevo entendimiento de la via de las lectinas y la vía alternativa con base en los resultados proporcionados en este documento. La Figura 1 define el papel de LEA-2 en la opsonización y la lisis. Mientras que MASP-2 es el iniciador de la deposición "descendente" de C3b (y la opsonización resultante) en múltiples configuraciones fisiológicas dependientes de lectinas (Fig. 20A, 20B, 20C), también desempeña un papel en la lisis de las bacterias sensibles al suero. Como se ilustra en la figura 1, el mecanismo molecular propuesto responsable del aumento de la actividad bactericida del suero o plasma deficiente de MASP-2 o agotado de MASP-2 para patógenos sensibles al suero como N. meningitidis es que, para la lisis de las bacterias, los complejos de reconocimiento de la vía de las lectinas asociados con MASP-1 y MASP-3 para unirse en cercana proximidad entre si en la superficie bacteriana, permitiendo asi que MASP-1 escinda a MASP-3. En contraste con MASP-1 y MASP-2, MASP-3 no es una enzima de auto-activación, pero, en muchos casos, requiere activación/escisión por MASP-1 para convertirse a su forma enzimáticamente activa.

Como se muestra en la figura 1, MASP-3 activada puede entonces escindir el factor B unido a C3b en la superficie de patógeno para iniciar la cascada de activación alternativa por la formación de las C3 y C5 convertasas de la via alternativa enzimáticamente activa C3bBb y C3bBb(C3b)n, respectivamente. Los complejos de activación de la via de la lectina que ostentan MASP-2 no tienen parte en la activación de MASP-3 y, en ausencia de o después del agotamiento de MASP-2, todos los complejos de activación de la via de las lectinas se cargarán ya sea con MASP-1 o con MASP-3. Por lo tanto, en ausencia de MASP-2, la probabilidad se incrementa notablemente tal que los complejos de activación de la via de las lectinas que ostentan MASP-1 y MASP-2 se situarán en cercana proximidad entre si, llevando a que más MASP-3 sean activadas y por lo tanto llevando a una tasa más alta de escisión mediada por MASP-3 del factor B unido por C3b para formar las C3 y C5 convertasas de la vía alternativa C3bBb y C3bBb(C3b)n en la superficie microbiana. Esto nos lleva a la activación de las cascadas de activación de terminal C5b-C9 que forman el complejo de ataque a membrana, compuesto por C5b unido a la superficie asociado con C6, C5bC6 asociado con C7, C5bC6C7 asociado con C8, y C5bC6C7C8, llevando a la polimerización de C9 que se inserta en la estructura de la superficie bacteriana y forma un poro en la pared bacteriana, lo que llevará a la eliminación osmolitica de la bacteria dirigida al complemento.

El núcleo de este concepto novedoso es que los datos facilitados en el presente documento demuestran que los complejos de activación de la vía de las lectinas impulsan las dos siguientes rutas de activación distintas, como se ilustra en la figura 1: i) LEA-1: Una ruta de activación dependiente de MASP-3 que inicia e impulsa la activación del complemento generando la C3bBb convertasa de la vía alternativa mediante escisión inicial y la activación del factor B en las superficies activadoras, que luego catalizarán la deposición de C3b y la formación de la C3bBb convertasa de la vía alternativa. La ruta de activación impulsada por MASP-3 desempeña un papel esencial en la opsonización y la lisis de los microbios e impulsa la via alternativa en la superficie de las bacterias, llevando a tasas óptimas de activación para generar complejos de ataque de membrana; y ii) LEA-2: Una ruta de activación dependiente de MASP-2 que conduce a la formación de la C3 convertasa de la via de las lectinas C4b2a y, a la acumulación del producto de escisión de C3, C3b, posteriormente a la C5 convertasa C4b2a(C3b)n. En ausencia del complemento de C4, MASP-2 puede formar un complejo alternativo de C3 convertasa que implica C2 y factor de coagulación XI.

Además de su papel en la lisis, la ruta de activación impulsada por MASP-2 desempeña un papel importante en la opsonización bacteriana llevando a que los microbios sean recubiertos con C3b unido covalentemente y productos de escisión del mismo (es decir, iC3b y C3dg), que serán dirigidos para la captación y eliminación por los fagocitos que ostentan receptor de C3, tal como granulocitos, macrófagos, monocitos, células de la microglia y el sistema reticuloendotelial. Esta es la ruta más eficaz de la separación de bacterias y microorganismos que son resistentes para complementar la lisis. Estos incluyen la mayoría de las bacterias Gram-positivas.

Además de LEA-1 y 2-LEA, existe el potencial para la activación independiente de la lectina del factor D por MASP-3, MASP-1 y/o HTRA-1, y también existe la posibilidad de la activación independiente de la lectina del factor B por MASP-3.

Mientras que no desea regirse por ninguna teoría particular, se cree que cada uno de (i) LEA-1, (ii) LEA-2 y (iii) activación independiente de lectina del factor B y/o factor D llevan a la opsonización y/o a la formación de MAC con lisis resultante. ii._ Antecedentes de MASP-1, MASP-2 y MASP-3 Tres serina proteasas asociadas con lectina de unión a manano (MASP-1, MASP-2 y MASP-3) se conocen en la actualidad como asociadas en el suero humano con la lectina de unión a manano (MBL). La lectina de unión a manano también se llama "proteína de unión a mañosa" o "lectina de unión a mañosa" en la literatura reciente. El complejo de MBL - MASP desempeña un papel importante en la inmunidad innata en virtud de la unión de MBL a estructuras de carbohidratos presentes en una amplia variedad de microorganismos. La interacción de MBL con series específicas de estructuras de carbohidratos trae consigo la activación de las proenzimas de MASP que, a su vez, activan el complemento al escindir a los componentes del complemento C4 y C2 para formar la C3 convertasa C4b2b (Kawasaki et al., J. Biochem 106:483-489 (1989); Matsushita & Fujita, J. Exp Med. 176:1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol 150:571-578 (1993)).

El complejo de proenzima MBL-MASP era, considerado hasta hace poco, como que contenía un único tipo de proteasa (MASP-1), pero ahora está claro que hay otras dos proteasas distintas (es decir, MASP-2 y MASP-3) asociadas a MBL (Thiel et al., Nature 386:506-510 (1997); Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001)), así como una proteína de suero adicional de 19 kDa, denominada "MApl9" o "sMAP" (Stover et al., J. Immunol 162:3481-3490 (1999); Stover et al., J. Immunol 163:6848-6859 (1999); Takahashi et al., Int . Immunol 11:859-63 (1999)).

La MApl9 es un producto del gen alternativamente empalmado del gen estructural para MASP-2 y carece de los cuatro dominios C-terminal de MASP-2, incluido el dominio de serina endopeptidasa. La transcripción de ARNm truncada expresada en abundancia que codifica MApl9 se genera por un evento alternativo de empalme/poliadenilación del gen MASP-2. Por un mecanismo similar, el gen MASP-1/3 da lugar a tres productos principales del gen, las dos serinas proteasas MASP-1 y MASP-3 y un producto génico truncado de 44 kDa denominado "MAp44" (Degn et al., J. Immunol 183(11):7371-8(2009); Skjoedt et al, J Biol Chem 285:8234- 43 (2010)).

MASP-1 primero fue descrita como el componente de proteasa P-100 del factor Ra reactivo del suero, que ahora es reconocido como un complejo compuesto de MBL más MASP (Matsushita et al., Collectins and Innate Immunity, (1996); Ji et al, J Immunol 150:571-578 (1993). La capacidad de una endopeptidasa asociada con MBL dentro del complejo MBL-MASPs para para actuar sobre los componentes del complemento C4 y C2 de manera aparentemente idéntica a la de la enzima Cls dentro del complejo de Clq-(Clr)2-(Cls)2 de la vía clásica del complemento sugiere que hay un complejo de MBL-MASPs que es funcionalmente análogo al complejo Clq-(Clr)2-(Cls)2· El complejo Clq-(Clr)2-(Cls)2 es activado por la interacción de Clq con las regiones Fe del anticuerpo IgG o IgM presentes en los complejos inmunes. Esto trae consigo el autoactivation de la proenzima Clr que, a su vez, activa la proenzima Cls que luego actúa sobre los componentes del complemento C4 y C2.

La estequiometria del complejo MBL-MASPs difiere la encontrada para el complejo Clq-(Clr)2-(Cls)2 en que diferentes oligómeros de MBL parecen asociarse con diferentes proporciones de MASP-l/MApl9 o MASP-2/MASP-3 (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001). La mayoría de MASPs y MApl9 encontradas en el suero no son complejadas con MBL (Thiel et al., J Immunol 165:878-887 (2000)) y pueden asociarse en parte con ficolinas, un grupo recientemente descrito de lectinas que tienen un dominio tipo fibrinógeno capaz de unirse a los residuos de N-acetilglucosamina en superficies microbianas (Le et al., FEBS Lett 425:367 (1998); Sugimoto et al, J Bíol Chem 273:20721 (1998)). Entre éstos, L-ficolina, H-ficolina y M-ficolina humanas se asocian con MASPs asi como con MApl9 y pueden activar la vía de las lectinas al unirse a las estructuras de carbohidratos específicos reconocidos por ficolinas (Matsushita et al., J Immunol 164:2281 -2284 (2000); Matsushita et al, J Immunol 168:3502-3506 (2002)).

Además de las ficolinas y MBL, una colectina de lectinas tipo MBL, llamada CL-11, se ha identificado como una molécula de reconocimiento de la vía de las lectinas (Hansen et al. J Immunol 185:6096-6104 (2010); Schwaeble et al. PNAS 108:7523-7528 (2011)). Hay una abrumadora evidencia que subraya la importancia fisiológica de estas moléculas alternativas de reconocimiento de carbohidratos y por lo tanto, es importante entender que el MBL no solo es el único componente de reconocimiento de la vía de activación las lectinas y que la deficiencia de MBL no debe ser confundida por la deficiencia de la vía de las lectinas. La existencia de posiblemente una serie de complejos de alternativos de reconocimiento de carbohidratos estructuralmente relacionadas con MBL puede ampliar el espectro de las estructuras microbianas que inician una respuesta directa del sistema inmune innato vía la activación del complemento.

Todas las moléculas de reconocimiento de la via de las lectinas se caracterizan por un motivo especifico de unión de MASPs dentro de su región de colágeno-tallo homólogo (Wallis et al. J Biol Chem 279:14065-14073 (2004)). El sitio de unión de MASP en MBLs, CL-11 y ficolinas se caracteriza por un motivo distinto dentro de este dominio: Hyp-Gly-Lys-Xaa-Gly-Pro, en donde Hyp es hidroxiprolina y Xaa es generalmente un residuo alifático. Las mutaciones de punto en esta secuencia interrumpen la unión de MASP. 1. Estructuras respectivas, secuencias, localización cromosómica y variantes de empalme La Figura 2 es un diagrama esquemático que ilustra la estructura del dominio de polipéptido MASP-2 (SEQ ID NO: 5) y polipéptido MApl9 (SEQ ID NO: 2) y los exones que codifican los mismos. La Figura 3 es un diagrama esquemático que ilustra la estructura del dominio de polipéptido MASP-1 (SEQ ID NO: 10), polipéptido MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y polipéptido MAp44 (SEQ ID NO:11) y los exones que codifican los mismos. Como se muestra en las figuras 2 y 3, las serinas proteasas MASP-1, MASP-2 y MASP-3 consisten en seis dominios distintos dispuestos como los encontrados en Clr y Cls; es decir, (I) un dominio N terminal/Clr/Cls/erizo de mar VEGF/proteina morfogénica ósea (o CUBI); (II) dominio tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF); (III) un segundo dominio CUB (CUBII); (IV y V) dos dominios de proteina de control de complemento (CCP1 y CCP2); y (VI) un dominio de serina proteasa (SP).

Las secuencias de aminoácidos derivadas del ADNc de humano y ratón MASP-1 (Sato et al., Int Immunol 6:665-669 (1994); Takada et al., Biochem Biophys Res Commun 196:1003-1009 (1993); Takayama et al., J. Immunol 152:2308 -2316 (1994)), MASP-2 der humano, ratón y rata (Thiel et al., Nature 386:506-510 (1997); Endo et al, J Immunol 161:4924-30 (1998); Stover et al., 162:3481 J. Immunol-3490 (1999); Stover et al., J. Immunol 163:6848 -6859 (1999)), asi como MASP-3 humano (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001)) indican que estas proteasas son peptidasas serina con su triada característica, residuos de His, Asp y Ser dentro de sus dominios catalíticos putativos (Números de Acceso Genbank: MASP-1 humano: BAA04477.1; MASP-1 ratón: BAA03944; MASP-1 rata: AJ457084; MASP-3 Humano:AAK84071; MASP-3 ratón: AB049755, como se accedieron en Genbank el 15/02/2012, cada uno de los cuales se incorpora en este documento mediante referencia).

Como se muestra además en las figuras 2 y 3, a la conversión del zimógeno a su forma activa, la cadena pesada (cadena alfa, o A) y la cadena ligera (cadena beta, o B) son divididas para arrojar una cadena A ligada a disulfuro y una cadena B más pequeña que representa el dominio de la serina proteasa. La proenzima de cadena simple MASP-1 se activa (como proenzima Clr y Cls) por escisión de una unión de Arg-Ile ubicada entre el segundo dominio de CCP (dominio V) y el dominio de la serina proteasa (dominio VI). Las proenzimas MASP-2 y MASP-3 se consideran ser activadas en una manera similar a la de MASP-1. Cada proteina de MASP forma homodimeros y se asocia individualmente con MBL y las ficolinas en una manera dependiente de Ca++. 2. MASP-1/3 El polipéptido MASP-1 humano (SEQ ID NO: 10) y el polipéptido MASP-3 (SEQ ID NO: 8) surgen de un gen estructural (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001), que ha sido mapeado a la región 3q27-28 del camino largo del cromosoma 3 (Takada et al., Genomics 25:757-759 (1995)). Las transcripciones de ARNm de MASP-3 y MASP-1 se generan a partir de la transcripción primaria por un proceso de empalme/poliadenilación alternativo. El producto de la traslación de MASP-3 se compone de una cadena alfa, que es común a ambos MASP-1 y MASP-3, y una cadena beta (el dominio de serina proteasa), que es única a MASP-3. Como se muestra en la figura 3, el gen MASP-1 humano abarca 18 exones. El ADNc de MASP-1 humano (establecido como SEQ ID NO: 9) está codificado por los exones 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17 y 18. Como además se muestra en la figura 3, el gen MASP-3 humano abarca doce exones. El ADNc de MASP-3 humano (establecido como SEQ ID NO: 7) está codificado por los exones 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 y 12. Un empalme alternativo resulta en una proteina denominada proteina 44 asociada a MBL ("MAp44"), (establecida como SEQ ID NO: 11), derivada de los exones 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.

El polipéptido MASP-1 humano (SEQ ID NO: 10 de Genbank BAA04477.1) tiene 699 residuos de aminoácidos, que incluyen un péptido líder de 19 residuos. Cuando se omite el péptido líder, la masa molecular calculada de MASP-1 es 76.976 Da. Como se muestra en la figura 3, la secuencia de aminoácidos de MASP-1 contiene cuatro sitios de glicosilación N-ligados. Los dominios de la proteína MASP 1 humana (con referencia a SEQ ID NO: 10) se muestran en la figura 3 e incluyen un dominio N terminal/Clr/Cls/erizo de mar VEGF/proteína morfogénica ósea (CUBI) (aa 25-137 de SEQ ID NO: 10), un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico (aa 139-181 de SEQ ID NO: 10), un segundo dominio de CUB (CUBII) (aa 185-296 de SEQ ID NO: 10), así como un tándem de dominios de proteina de control de complemento (CCPl aa 301-363 y CCP2 aa 367-432 de SEQ ID NO: 10) y un dominio de serina proteasa (aa 449-694 de SEQ ID NO: 10).

El polipéptido MASP-3 humano (SEQ ID NO: 8, del Genbank AAK84071) tiene 728 residuos de aminoácidos, que incluye un péptido líder de 19 residuos. Cuando se omiten los péptidos líder, la masa molecular calculada de MASP-3 es de 81.873 Da. Como se muestra en la figura 3, existen siete sitios de glicosilación N-ligados en MASP-3. Los dominios de la proteina MASP 3 humana (con referencia a SEQ ID NO: 8) se muestran en la figura 3 e incluyen un dominio N terminal/Clr/Cls/erizo de mar VEGF/proteína morfogénica ósea (CUBI) (aa 25-137 de SEQ ID NO: 8), un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico (aa 139-181 de SEQ ID NO: 8), un segundo dominio de CUB (CUBII) (aa 185-296 de SEQ ID NO: 8), así como un tándem de dominios de proteína de control de complemento (CCP1 aa 301-363 y CCP2 aa 367-432 de SEQ ID NO: 8) y un dominio de serina proteasa (aa 450-711 de SEQ ID NO: 8).

El producto de la traslación de MASP-3 se compone de una cadena alfa (cadena pesada), que contiene los dominios CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2 (cadena alfa: aa 1-448 de SEQ ID NO: 8) que es común a ambos MASP-1 y MASP-3, y una cadena ligera (cadena beta: aa 449-728 de SEQ ID NO: 8), que contiene el dominio de serina proteasa, que es único para MASP-3 y MASP-1. 3. MASP-2 El gen MASP-2 humano está situado en el cromosoma lp36.3-2 (Stover et al., Cytogenet and Cell Genet 84:148-149 (1999) y abarca 12 exones, como se muestra en la figura 2. MASP-2 (SEQ ID NO: 5) y MApl9 (SEQ ID NO: 2) se codifican por las transcripciones de un solo gen estructural generado por empalme/poliadenilación alternativa (Stover et al., Genes and Immunity 2:119-127 (2001)). El ADNc de MASP-2 humano (establecido como SEQ ID NO: 4) está codificado por los exones 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12. La proteina 20 kDa denominada proteina 19 asociada a MBL ("MApl9", también referida como "sMAP") (SEQ ID NO: 2), codificada por (SEQ ID NO: 1) surge de los exones 2, 3, 4 y 5. MApl9 es una proteina no enzimática que contienen la región N terminal CUB1 EGF del MASP 2 con cuatro residuos adicionales (EQSL) derivada del exón 5 como se muestra en la figura 2.

El polipéptido MASP-2 (SEQ ID NO: 5) tiene 686 residuos de aminoácidos, que incluye un péptido líder de 15 residuos que es escindido después de la secreción, resultando en la forma madura de MASP-2 humana (SEQ ID NO: 6). Como se muestra en la figura 2, la secuencia de aminoácidos de MASP-2 no contiene ningún sitio de glicosilación N-ligado. El polipéptido MASP 2 muestra una estructura molecular similar a MASP 1, 3 MASP y Clr y Cls, las proteasas del sistema del complemento Cl. Los dominios de la proteina MASP 2 humana (numerados con referencia a SEQ ID NO: 5) se muestran en la figura 2 e incluyen un dominio N terminal/Clr/Cls/erizo de mar VEGF/proteina orfogénica ósea (CUBI) (aa 24-136 de SEQ ID NO: 5), un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico (aa 138180 de SEQ ID NO: 5), un segundo dominio de CÜB (CUBII) (aa 184295 de SEQ ID NO: 5), asi como un tándem de dominios de proteina de control de complemento (CCP1 aa 300-359 y CCP2 aa 364-431 de SEQ ID NO: 5) y un dominio de serina proteasa (aa 445-682 de SEQ ID NO: 5).

Como se muestra en la figura 2, el polipéptido MASP-2 tiene una cadena alfa (cadena pesada) que contiene los dominios CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2 (cadena alfa: aa 1-443 de SEQ ID NO: 5) y una cadena beta (cadena ligera) que contiene el dominio de serina proteasa (cadena beta: aa 444-686). Los dominios CUB-1, EGF y CUB-2 requieren de dimerización y los dominios CUB-1, EGF, CUB-2 y CCP-1 contienen el sitio de unión para MBP. Como se describe en Wallis et al., J. Biol Chem 279:14065-14073 (2004), cada dimero de MASP-2 se une a dos subunidades de MBL. 4. Comparación de las secuencias de aminoácidos MASP-1, MASP-2 y MASP-3 La Figura 4 es una alineación de aminoácidos de las secuencias de proteínas de MASP-1 (SEQ ID NO: 10), MASP-2 (SEQ ID NO: 6) y MASP-3 (SEQ ID NO: 8), que muestran los dominios CUBI, EGF, CUBII, CCP1, CCP2 y residuos de tríada catalítica conservados (H, D, S) en los dominios de serina proteasa (SP). El símbolo indica una secuencia de aminoácidos idéntica.

La Figura 5 es una alineación de aminoácidos de las secuencias de la cadena alfa, incluyendo CUBI-EGF-CUBII-CCP1-CCP2, de MASP-1 (cadena alfa: aa 1-447 de SEQ ID NO: 10) MASP-2 (cadena alfa: aa 1-443 de SEQ ID NO: 5) y MASP-3 (cadena alfa: aa 1-448 de SEQ ID NO: 8). Hay numerosos parches de identidad en los dominios CUBI, EGF y CUBII, como se indica por los recuadros punteados en la figura 5. Los dominios CCP1 y CCP2 están indicados por los recuadros sombreados. El porcentaje de identidad global entre las cadenas alfa de MASP1/3 humano y MASP-2 humano es proporcionado a continuación en la Tabla 1.

La Figura 6 es una alineación de aminoácidos de las secuencias de la cadena beta (incluyendo los dominios de serina proteasa) de MASP-1 (cadena beta: aa 448-699 de SEQ ID NO: 10) MASP-2 (cadena beta: aa 444-686 de SEQ ID NO: 5) y MASP-3 (cadena bata: aa 449-728 de SEQ ID NO: 8). La Figura 7A muestra una alineación en pares de aminoácidos entre las secuencias de cadena beta de MASP-1 (cadena beta: aa 448-699 de SEQ ID NO: 10) y MASP-2 (cadena beta: aa 444- 686 de SEQ ID NO: 5). La Figura 7B muestra una alineación en pares de aminoácidos entre las secuencias de cadena beta de MASP-1 (cadena beta: aa 448-699 de SEQ ID NO: 10) y MASP-3 (cadena beta: aa 449-728 de SEQ ID NO: 8). La Figura 7C muestra una alineación en pares de aminoácidos entre las secuencias de cadena beta de MASP-2 (cadena beta: aa 444-686 de SEQ ID NO: 5) y MASP-3 (cadena beta: aa 449-728 de SEQ ID NO: 8). Las regiones de identidad en las figuras 5-7 se muestran como recuadros punteados alrededor de los aminoácidos idénticos (mostrados como el símbolo El porcentaje de identidad entre las cadenas alfa y beta de las proteínas de MASP-1, MASP-2 y MASP-3 humanos se presenta en la Tabla 1.

TABLA 1: Porcentaje de Identidad entre proteínas de MASP humano Con respecto a las cadenas alfa (cadenas pesadas), como se indicó anteriormente en la Tabla 1, las cadenas alfa de MASP-1 y MASP-3 son idénticas (a excepción de la secuencia de 15 aminoácidos en el extremo 3'). El % total de identidad entre la cadena alfa de MASP-2 y MASP-3 es de 45.4%, con numerosos parches de identidad en los dominios CUBI-EGF-CUBII, como se muestra en la Figura 5.

Con respecto a las cadenas beta (cadenas ligeras), el porcentaje global de identidad entre las tres cadenas beta es bajo, en el rango de 27 a 28%. Sin embargo, aunque la identidad global entre las tres cadenas B es baja, existen numerosos parches de identidad, como se muestra en la figura 6. Como se muestra aún más en la figuras 7A-C, parches idénticos de secuencias se distribuyen más ampliamente entre MASP-2 y 3 que entre 1 y 2 ó 1 y 3.

Todos los residuos de cisteina presentes en MASP-2, MASP-3, Clr y Cls se alinean con residuos equivalentes en MASP-1; sin embargo, MASP-1 tiene dos residuos de cisteina (en las posiciones 465 y 481 de la cadena L) que no se encuentran en MASP-1, MASP-3, Clr y Cls. Estos dos residuos de cisteina en MASP-1 están en las posiciones previstas utilizadas para formar el puente disulfuro 'histidina-lazo' como se encuentra en la tripsina y la quimotripsina. Esto sugiere que MASP-2, 3-MASP, Clr y Cls pueden haber evolucionado, por la duplicación y divergencia del gen, de MASP-1 (Nonaka & Miyazawa, Genome Biology 3 Reviews 1001.1-1001.5 (2001)). 5. Funciones/actividades biológicas respectivas , incluyendo datos genéticos humanos relevantes El papel de los complejos de MBL/Ficolina-MASPs en la inmunidad innata está mediado por la unión dependiente del calcio de los dominios de lectina tipo C (presentes en la molécula de MBL) o por la unión de los dominios tipo fibrinógeno (presentes en la molécula de ficolina) a las estructuras de carbohidratos que se encuentran en la levadura, bacterias, virus y hongos. Esta fase de reconocimiento trae consigo la activación de la proenzima MASP-2, que después imita la acción de la Cls activada dentro del complejo de Clq-(Clr)2-(Cls)2 escindiendo C4 y C2 para formar la C3 convertasa C4b2b. Esto permite la deposición de C4b y C3b sobre los patógenos objetivo y asi promueve la eliminación y la separación a través de la fagocitosis.

La evidencia en la literatura reciente sugiere que el complejo de la activación de la vía de las lectinas sólo requiere la actividad de MASP-2 para escindir C4 y C2: i) la reconstitución de un complejo mínimo de la activación de la via de las lectinas usando MBL recombinante y MASP2 expresado recombinantemente parece ser suficiente para escindir eficazmente tanto C4 como C2 in vitro (Vorup-Jensen et al., J. Immunol 165:2093-2100 (2000); Rossi et al, J Biol Chem 276:40880-40887 (2001); Ambrus et al, J Immunol 170:1374-1382 (2003); Gál et al, J Biol Chem 280:33435-33444 (2005)); mientras que ii) el suero de ratones con una deficiencia de MASP-2 orientada por gen está desprovisto de cualquier actividad funcional de la via de las lectinas (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)). Recientemente, fue descrita una deficiencia genéticamente determinada de MASP 2 (Stengaard Pedersen et al., New Eng. J. Med. 349:554560, (2003)). La mutación de un solo nucleótido conduce a un intercambio de Asp Gly en el dominio CUBI e incapacita a MASP 2 para su unión a MBL.

Además, la caracterización funcional de sueros de ratones deficientes de MASP-1 y MASP-3 muestra que la actividad de la via de las lectinas es más lenta, pero no está ausente cuando se comparan los sueros de ratones silvestres KO de MASP-l/MASP-3 (MASP-1/3-/-) bajo condiciones fisiológicas (Takahashi et al., J. Immunol 180:6132-6138 (2008); Schwaeble et al., PNAS (2011)). Estos estudios sugieren que en contraste con la Cls endopeptidasa efectora de la via clásica, la activación de MASP-2 no implica o requiere esencialmente la actividad de cualquiera de las otras serina endopeptidasas asociadas a MBL (es decir, MASP-1 o MASP-3) y que la actividad proteolitica de MASP-2 es suficiente para la traslación de la unión de las moléculas de reconocimiento de carbohidratos de la via de las lectinas (es decir, MBL, ficolinas o CL-11) en la activación del complemento. Sin embargo, estudios más recientes han demostrado que mientras que MASP-2 tiene la capacidad de autoactivate, la tasa catalítica de la activación de MASP-1 del zimógeno MASP-2 excede la de la escisión de MASP-2 de su propia forma de zimógeno por 85,000 veces (Héja et al., PNAS 106:10498-503 (2011); Megyeri et al., J. Biol . Chem. 288 (13): 8922-34 (2013)). Por lo tanto, es probable que el activador principal del MASP-2 en configuraciones fisiológicas sea MASP-1. A juzgar por el tamaño de los fragmentos de C4 generados y la actividad funcional de la C3 convertasa generada, es probable que MASP-2 activada escinda C4 y C2 de manera idéntica a la llevada a cabo por Cls activado, es decir, en una unión única de arginil (Arg76 Ala77) dentro de la cadena alfa de C4 y en una unión única de arginil (Arg223 Lys224) dentro de la cadena de proenzima de C2. También se ha informado que el MASP de ratón (en la forma del complejo de MBL - MASP de ratón designado factor Ra-reactivo) puede, a diferencia de Cls, escindir la cadena alfa del componente C3 del complemento para arrojar los fragmentos biológicamente activos de C3a y C3b (Ogata et al·., J. Immunoll54 :2351-2357 (1995)). Si esto llegara a ocurrir en el sistema humano, se requeriría la escisión de una unión única de arginil (Arg77 Ser78) dentro de la cadena alfa de C3. MASP-2 activada, tal como el Cls, es incapaz de escindir el componente C5 del complemento. Las actividades proteoliticas de MASP-1 y MASP-2 son inhibidas por el inhibidor de C1 (Matsushita et al., J Immunol 165:2637-2642 (2000) mientras que el inhibidor de C1 no reacciona con MASP-3 (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001); Zundel et al, J Immunol 172:4342-4350 (2004)).

Las funciones biológicas de MASP y MASP 3 han emergido lentamente. La especificidad del sustrato y la función fisiológica de MASP-1 han sido objeto de debate desde su descubrimiento. Durante los últimos años se han identificado numerosos sustratos potenciales. Se sugirió que MASP-1 puede escindir C3 nativo lentamente y esta escisión directa de C3 puede iniciar la cascada del complemento tal vez con la contribución de la vía alternativa (Matsushita et al., J Immunol 165:2637 -2642 (2000)). Más tarde se comprobó que MASP-1 recombinante escinde la forma inactiva (tioéster hidrolizado) de C3 que es poco productiva en cuanto a la iniciación de la cascada del complemento (Ambrus et al., J Immunol 170:1374 -1382 (2003)). La falta de actividad de la vía de las lectinas en las diluciones de suero de ratones deficientes de MASP-2 ha demostrado inequívocamente que no existe el mecanismo de derivación de C3 impulsado por MASP-1 (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)). Los componentes del complemento que son escindidos por MASP-1 con considerable eficacia son C2 (Rossi et al, J Biol Chem 276:40880-40887 (2001); Ambrus et al., J Immunol 170:1374 -1382 (2003)) y la forma de zimógeno del factor D (Takahashi et al., J Exp Med 207:29 -37 (2010)). En cuanto a la capacidad de MASP-1 para escindir C2, resulta plausible por lo tanto que MASP-1 puede aumentar la C3 convertasa (C4b2a)-formando la capacidad de MASP-2 via la escisión de C2. Esta sugerencia es apoyada por la observación de que la actividad de la via de las lectinas se disminuye en suero humano agotado de MASP-1 y en el suero de ratones deficiente de MASP-1/3 (Takahashi et al., J Immunol 180:6132 -6138 (2008)), observación que también sugiere que el MASP-1 tiene un papel en la activación de MASP-2. Por otra parte, mientras que cada C4b depositado por el complejo MBL-MASPs puede formar C4b2a convertasa, sólo uno de cada cuatro C4b depositados por el complejo C1 de la via clásica puede hacer lo mismo (Rawal et al, J Biol Chem 283 (12): 7853-63 (2008)).

MASP-1 también escinde MASP-2 y MASP-3 (Megyeri M., et al, J Biol Chem. 2013 Mar 29;288(13):8922-34). Experimentos recientes sugieren que aunque MASP-2 puede autoactivarse, MASP-1 es el principal activador de MASP-2 zimógeno. La activación de MASP-2 se retrasó en el suero de ratones KO de MASP-1 (Takahashi et al, J Immunol 180: 6132- 6138 (2008)) y se obtuvo un resultado similar cuando la actividad del MASP-1 fue bloqueada por un inhibidor especifico en el suero humano normal (Kocsis et al, J Immunol 185 (7): 4169-78 (2010)). Por otra parte, Degn et al. (<J. Immunol . 189(8): 3957-69 (2012)) descubrieron que MASP-1 es critico para la activación de MASP-2 y su posterior escisión de C4 en suero humano. La tasa catalítica para la conversión de MASP-2 zimógeno a MASP-2 activo es más de 85,000 fold mayor que la tasa por la cual MASP-2 puede auto-activarse (Megyeri et al., J. Biol . Chem. 288:8922 - 8934 (2013); Héja et al., J. Biol . Chem. 287 (24): 20290-300 (2012); Héja et al., PNAS 109:10498-503 (2012)).

Descubrimientos recientes han vinculado también MASP-1 a la vía alternativa. MASP-1 puede convertir el zimógeno del factor D a su forma enzimáticamente activa (figura 39; Takahashi et al, J Exp Med 207:29-37 (2010)).

Además, MASP-1 activa la forma zimógena de MASP-3 (Megyeri et al., J. Biol . Chem. 288:8922 - 8934 (2013); Degn et al.

J. Immunol . 189(8): 3957-69 (2012)), que puede activar en sí el zimógeno de factor D (Figura 39) así como escindir el factor B, otro componente escencial de la vía alternativa, a su forma activa (Iwaki et al., J. Immunol . 187:3751-58 (2011)). La conversión del pro-factor D y el pro-factor B, sin embargo, es probable que sea independiente del estado de activación de LEA-2 y puede ocurrir a través de MASP-1 no unido a complejo.

Varias lineas de evidencia indican que MASP-1 es una enzima similar a trombina y es importante en la activación de la vía de la coagulación. MASP-1 puede escindir varios sustratos de trombina incluyendo fibrinógeno (Hajela K. et al., Immunobiology 205(4-5):467-75 (2002)), factor XIII (Krarup et al., Biochim Biophys Acta 1784 (9): 1294-1300 (2008)) y el receptor activado por proteasa 4 (PAR4) (Megyeri et al, J Immunol 183 (5): 3409- 16 (2009)). Por otra parte, la antitrombina en presencia de heparina es un inhibidor más eficiente de MASP-1 que el inhibidor de C1 (Dobó et al., J Immunol 183:1207-1214 (2009)). La conexión entre el complemento y la vía de la coagulación también es subrayada por la observación que MASP-2 es capaz de activar la protrombina (Krarup A. et al, PLoS One 2(7):e623 (2007)). La coagulación limitada representa un antiguo tipo de inmunidad innata cuando el esparcimiento de patógenos invasivos es prevenido por el coágulo de fibrina. El fibrinopéptido B liberado tiene actividad proinflamatoria. La escisión de PAR4 mediada por MASP-1 activa la reacción inflamatoria iniciada por células endoteliales (Megyeri et al, J Immunol 183(5) :3409-16(2009)).

MASP-3 no tiene ninguna actividad proteolitica hacia los sustratos C4, C2 o C3. Por el contrario, se informó MASP-3 actúa como un inhibidor de la vía de las lectinas (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001)). Esta conclusión ha llegado porque, en contraste con MASP-1 y MASP-2, MASP-3 no es una enzima auto-activante (Zundel S. et al., J Immunol 172:4342 -4350 (2004); Megyeri et al., J. Biol . Chem. 288:8922-8934 (2013).

Recientemente, surgieron evidencias de posibles funciones fisiológicas de MASP-1 y MASP-3 en estudios con ratones transgénicos utilizando una cepa de ratón con una deficiencia combinada de MASP-1 y MASP-3. Mientras que los ratones KO de MASP-1/3 tienen una vía de las lectinas funcional (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)), parece que carecen de actividad de la via alternativa (Takahashi et al., JEM 207 (1): 29-37 (2010)). La falta de actividad de la via alternativa parece ser debida a un defecto de procesamiento del factor del complemento D, que es necesario para la actividad de la via alternativa. En los ratones KO de MASP-1/3, todo el factor D está circulando como una pro-forma proteoliticamente inactiva, mientras que en el suero de ratones normales, prácticamente la totalidad de factor D está en la forma activa. El análisis bioquímico sugirió que MASP-1 puede ser capaz de convertir el factor D de complemento de su forma zimógena a su forma enzimáticamente activa (figura 39; Takahashi et al., JEM 207(1):29-37 (2010)). MASP-3 también escinde el zimógeno de pro-factor D y producir factor D activo in vitro (figura 39; Takahashi et al., JEM 207(1):29-37 (2010)). El factor D está presente como una enzima activa en la circulación en los individuos normales y MASP-1 y MASP-3, asi como HTRA-1, pueden ser responsables de esta activación. Además, los ratones con deficiencias combinadas de MBL y ficolina aún producen niveles normales de factor D y tienen una vía alternativa completamente funcional. Así, estas funciones fisiológicas de MASP-1 y MASP-3 no necesariamente implican lectinas y por lo tanto no están relacionadas con la vía de las lectinas. MASP-3 recombinante de ratón y humano también parece escindir el factor B y soportar la deposición de C3 en S. aureus in vitro (Figura 36; Iwaki D. et al, J Immunol 7:3751-8 (2011)).

Un inesperado papel fisiológico para MASP-3 ha surgido de los estudios recientes de pacientes con síndrome de 3MC (anteriormente designado el síndrome de Carnevale, Mingarelli, Malpuech y Michels; OMIM # 257920). Estos pacientes muestran graves anomalías del desarrollo, incluyendo paladar hendido, labio leporino, malformaciones craneales y retraso mental. El análisis genético identificó a los pacientes de 3MC gue eran homocigóticos para un gen de MASP-3 disfuncional (Rooryck et al., Nat Genet . 43 (3): 197-203 (2011)). Otro grupo de pacientes de 3MC resultó ser homocigótico para una mutación en el gen MASP-1 que conduce a la ausencia de MASP-1 funcional y proteínas de MASP-3. Sin embargo otro grupo de pacientes de 3MC carecía de un gen CL-11 funcional. (Rooryck et al., Nat Genet . 43(3):197-203(2011)). Por lo tanto, el eje de MASP-3 de CL-11 parece desempeñar un papel durante el desarrollo embrionario. No están claros los mecanismos moleculares de esta vía de desarrollo. Es poco probable, sin embargo, que sean mediados por un proceso impulsado por complemento convencional ya que los individuos con deficiencias de componentes de complemento C3 comunes no desarrollan este síndrome. Así, antes del descubrimiento de estos inventores, como se describe en este documento, un papel funcional para MASP-3 en la activación del complemento dependiente dependiente de lectinas no estaba previamente establecido.

Las estructuras del fragmento catalítico de MASP-1 y MASP-2 han sido determinadas por cristalografía de rayos x. La comparación estructural del dominio de proteasa MASP-1 con los de otras proteasas del complemento reveló la base de su especificidad de sustrato relajada (Dobó et al., J. Immunol 183:1207 -1214 (2009)). Mientras que la accesibilidad del surco de unión del sustrato de MASP-2 está restringido por lazos de superficie (Harmat et al, J Mol Biol 342:1533-1546 (2004)), MASP-1 tiene un empaque de unión de sustrato abierto que se asemeja a la tripsina en lugar de a otras proteasas del complemento. Una propiedad tipo trombina de la estructura de MASP-1 es el lazo inusualmente grande de 60 aminoácidos (lazo B) que puede interactuar con los sustratos. Otra característica interesante de la estructura de MASP-1 es el puente de sal interno entre SI Aspl89 y Arg224. Un puente de sal similar puede encontrarse en el empaque de unión de sustrato del factor D, que puede regular su actividad de proteasas. C1S y MASP-2 tienen especificidades de sustrato casi idénticas. Sorprendentemente, algunos de los ocho lazos de superficie de MASP-2, que determinan la especificidad del sustrato, tienen conformaciones bastante diferentes comparadas con las de Cls. Esto significa que las dos enzimas funcionalmente relacionadas con interactuan con con los mismos sustratos de manera diferente. La estructura del zimógeno de MASP-2 muestra un dominio de proteasa inactiva con agujero oxianión y empaque de unión de sustrato interrumpidos (Gál et al, J Biol Chem 280:33435-33444 (2005)). Sorprendentemente, el zimógeno de MASP-2 muestra considerable actividad sobre un sustrato de proteína grande, C4. Es probable que la estructura del zimógeno de MASP-2 sea bastante flexible, lo que permite la transición entre las formas inactivas y activas. Esta flexibilidad, que se refleja en la estructura, puede desempeñar un papel en el proceso de autoactivation.

El análisis de Northern blot indica que el hígado es la fuente principal de ARNm de MASP-1 y MASP-2. Mediante el uso de una sonda de 5' específica de ADNc para MASP-1, la principal transcripción de MASP-1 fue observada en 4.8 kb y una menor a aproximadamente 3.4 kb, ambas presentes en el hígado humano y de ratón (Stover et al., Genes Immunity 4:374-84 (2003)). El ARNm de MASP-2 (2.6 kb) y el ARNm de MApl9 (1.0 kb) se expresan abundantemente en el tejido hepático. MASP-3 se expresa en el hígado y también en muchos otros tejidos, incluyendo el tejido neuronal (Lynch N. J. et al, J Immunol 174:4998-5006 (2005)).

Un paciente con un historial de infecciones y enfermedades inflamatorias crónicas resultó tener una forma mutada de MASP-2 que es incapaz de formar un complejo de MBL-MASP activo (Stengaard-Pedersen et al., N Engl J Med 349:554-560 (2003)). Algunos investigadores han determinado que la deficiencia de MBL conduce a una tendencia a infecciones frecuentes en la infancia (Super et al., Lancet 2:1236-1239 (1989); Garred et al·., Lancet 346:941-943 (1995) y a una disminución de la resistencia a la infección por V1H (Nielsen et al., Clin Exp Immunol 100:219-222 (1995); Garred et al, Mol Immunol 33 (suppl 1): 8 (1996)). Sin embargo, otros estudios no han demostrado una correlación significativa de los niveles bajos de MBL con crecientes infecciones (Egli et al., PLoS One. 8 (1):e51983(2013); Ruskamp et al., J Infect Dis . 198 (11): 1707-13 (2008); Israels et al., Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 95(6):F452-61 (2010)). Mientras que la literatura es mixta, la deficiencia o falta de utilización de MASP puede tener un efecto adverso sobre la capacidad del individuo para montar una defensa inmediata, no dependiente de anticuerpos frente a ciertos patógenos. iii._ Datos_ complementarios_ para_ el_ nuevo entendimiento, subrayando las condiciones de ensayo tradicionales que están desprovistas de Ca++ y los resultados obtenidos mediante un conjunto de condiciones más fisiológicas que incluyen Ca++.

Varias lineas independientes de fuerte evidencia experimental se proporcionan en el presente documento que apuntan a la conclusión de que la ruta de activación del complementode la via de las lectinas activa el complemento mediante dos mecanismos efectores independientes: i) LEA-2: una via impulsada por MASP-2 que media la opsonización impulsada por complemento, la quimiotaxis (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)) y lisis celular y ii) LEA-1: una novedosa ruta de activación dependiente de MASP-3 que inicia la activación del complemento generando la convertasa C3bBb de la vía alternativa a través de la escisión y activación del factor B en superficies activadoras, que después catalizará la deposición de C3b y la formación de la convertasa C3bBb de la vía alternativa, lo cual puede ocasionar la lisis celular asi como opsonización microbiana. Además, como se describe en este documento, la activación separada independiente de lectinas del factor B y/o del factor D por MASP-1, MASP-3 o HTRA-1, o una combinación de cualquiera de las tres, también puede llevar a la activación del complemento mediante la vía alternativa.

Una activación de la vía alternativa impulsada por MASP-3 dependiente de la vía de las lectinas parece contribuir a la escisión bien establecida mediada por factor D del factor B unido a C3b para lograr tasas de activación óptimas para la lisis dependiente del complemento mediante la cascada de activación terminal para lisar las células bacterianas mediante la formación de complejos de ataque de membrana C5b-9 (MAC) en la superficie celular (Figuras 14-15). Este evento de tasa limitada parece requerir la coordinación óptima ya que es defectuosa en la ausencia de actividad funcional de MASP-3 asi como en la ausencia de la actividad funcional del factor D. Como se indica en los ejemplos 1-4, los inventores descubrieron esta función de la vía de las lectinas dependiente de MASP-3 al estudiar el fenotipo de la deficiencia de MASP-2 y la inhibición de MASP-2 en modelos experimentales de ratón de la infección por M. meningitidis . Los ratones deficientes de MASP-2 orientados a genes y los ratones silvestres tratados con inhibidores de MASP-2 a base de anticuerpos fueron altamente resistentes a la infección experimental de N. meningitidis (ver Figuras 8-12). Cuando la dosis infecciosa fue ajustada para dar aproximadamente 60% de mortalidad en las crias de camada silvestre, todos los ratones deficientes de MASP-2 o agotados de MASP-2 atacaron la infección y sobrevivieron (véase figura 8 y figura 12). Este elevadisimo grado de resistencia se reflejó en un aumento significativo de la actividad bactericida del suero en los ratones deficientes de MASP-2 o agotados de MASP-2. Los experimentos posteriores mostraron que esta actividad bactericida es dependiente de lisis bacteriana impulsada por la vía alternativa. El suero de ratón deficiente del factor B y factor D o C3 no demostró ninguna actividad bactericida hacia N. meningitidis , indicando que la vía alternativa es esencial para la conducción de la cascada de activación terminal. Un resultado sorprendente fue que el suero de ratón deficiente de MBL-A y MBL-C (ambos siendo moléculas de reconocimiento de la vía de las lectinas que reconocen N. meningitidis) así como sueros de ratón deficientes de de las serina proteasas asociadas a la vía de las lectinas MASP-1 y MASP-3 habían perdido toda actividad bacteriolítica hacia N. meningitidis (Figura 15). Un artículo reciente (Takahashi M. et al., JEM 207: (2010) 29-37) y trabajos presentados en este documento (figura 39) demuestran que MASP-1 puede convertir la forma zimógena del factor D a su forma enzimáticamente activa y puede explicar en parte la pérdida de actividad lítica a través de la ausencia del factor D enzimáticamente activo en estos sueros. Esto no explica la falta de actividad bactericida en ratones deficientes de MBL ya que estos ratones tienen factor D enzimáticamente activo normal (Banda et al., Mol Imunol 49(1-2):281-9 (2011)). Sorprendentemente, al hacer pruebas de suero humano de pacientes con el raro trastorno recesivo autosómico de 3MC (Rooryck C, et al·., Nat Genet . 43(3):197-203) con mutaciones que hacen al dominio de serina proteasa de MASP-3 disfuncional, ninguna actividad bactericida contra N. meningitidis fue perceptible (n.b.: Estos sueros tienen MASP-1 y factor D, pero no MASP-3).

La hipótesis de que el suero humano requiere de actividad dependiente de MASP-3 mediada por la vía de las lectinas para desarrollar actividad bactericida es apoyada por la observación de que los sueros humanos deficientes de MBL también fallaron en lisar N. meningitidis (figuras 13 y 14). MBL es la única molécula humana de reconocimiento humano de la vía de las lectinas que se une a este patógeno. Debido a que MASP-3 no se auto-activa, los inventores tienen la hipótesis de que la mayor actividad bacteriolitica en sueros deficientes de MASP-2 podría explicarse por una activación favorecida del MASP-3 a través del MASP-1 ya que, en ausencia del MASP-2, los complejos de activación de la vía de las lectinas que se unen a la superficie bacteriana se cargarán con MASP-1 o MASP-3. Puesto que el MASP-3 activado escinde tanto al factor D (figura 39) como al factor B para generar sus respectivas formas enzimáticamente activas in vitro (Figura 37 e Iwaki D., et al., J. Immunol . 187 (7): 3751-3758 (2011)), la función más probable del MASP-3 es facilitar la formación de la C3 convertasa de la vía alternativa (es decir, C3bBb).

Mientras que los datos para el papel dependiente de lectinas son convincentes, múltiples experimentos sugieren que el MASP-3 y MASP-1 no están necesariamente obligados a funcionar en un complejo con moléculas de lectinas. Experimentos como el mostrado en la figura 35B demuestran la capacidad del MASP-3 para activar la vía alternativa (según lo demostrado por la deposición de C3b en S. aureus) bajo condiciones (es decir, la presencia de EGTA) en las que los complejos con lectinas no estaría presentes. La Figura 35A demuestra que la deposición bajo estas condiciones depende del factor B, factor D y factor P, todos componentes críticos de la vía alternativa. Además, la activación del factor D por MASP-3 y MASP-1 (figura 39) y la activación del factor B por MASP-3 (Figura 37) pueden ocurrir in vitro en ausencia de lectinas. Finalmente, estudios de hemolisis de eritrocitos de ratón en presencia de suero humano demuestran un claro papel tanto para MBL como para MASP-3 para la lisis celular. Sin embargo, la deficiencia de MBL no reproduce completamente la severidad de la deficiencia del MASP-3, en contraste con lo gue se esperaría si todos los MASP-3 funcionales fueran complejados con MBL. Por lo tanto, los inventores no desean estar limitados por la noción de que todos los papeles para MASP-3 (y MASP-1) demostrados en el presente documento pueden atribuirse únicamente a la función asociada con lectinas.

La identificación de los dos caminos efectores de la vía de las lectinas, así como las posibles funciones de MASP-1, 3-MASP y HTRA-1 independientes de lectinas, representan nuevas oportunidades para que las intervenciones terapéuticas traten efectivamente patologías humanas definidas causadas por la excesiva activación del complemento en la presencia de patógenos microbianos o células huésped alteradas o depósitos metabólicos. Como se describe en este documento, los inventores han descubierto ahora que, en ausencia de MASP-3 y en presencia de MASP-1, la vía alternativa no es activada en estructuras superficiales (ver Figuras 17-18, 35B, 41-42, 45-46) . Puesto que la vía alternativa es importante para impulsar los eventos de limitación de tasa que conducen a lisis bacteriana asi como a lisis celular (Mathieson PW, et al, J Exp Med 177 (6): 1827-3 (1993)), nuestros resultados demuestran que el MASP-3 activado desempeña un papel importante en la actividad litica del complemento. Como se muestra en las figuras 14 y 15, 21-23, 43-44 y 46-47, en el suero de los pacientes con 3MC que carecen de MASP-3 pero no de MASP-1, la cascada de activación terminal litica del complemento es defectuosa. Los datos que se muestran en las figuras 14 y 15 demuestran una pérdida de actividad bacteriolitica en ausencia de MASP-3 y/o actividad funcional de MASP-l/MASP-3. Asimismo, la pérdida de actividad hemolitica en suero humano deficiente de MASP-3 (figuras 21-23, 43-44 y 46-47), junto con la capacidad de reconstituir la hemolisis añadiendo MASP-3 recombinante (figuras 46-47), apoya fuertemente la conclusión de que la activación de la via alternativa en las superficies objetivo (que es esencial para conducir la lisis mediada por complemento) depende de la presencia de MASP-3 activado. En base al nuevo entendimiento de la via de las lectinas detallado anteriormente, la activación de la via alternativa de las superficies objetivo depende por lo tanto de LEA-1, y/o de la activación independiente de lectinas del factor B y/o el factor D, que también está mediada por MASP-3, y por lo tanto, los agentes que bloquean la activación del complemento dependiente de MASP-3 evitarán la activación de la via alternativa en las superficies objetivo.

La divulgación del papel esencial de la iniciación dependiente de MASP-3 de la activación de la via alternativa, implica que la via alternativa no es una via independiente, separada, de la activación del complemento como se describe en básicamente todos los libros de textos médicos actuales y recientes artículos de revisión del complemento. La visión científica actual y generalizada es que la via alternativa es activada en la superficie de ciertos objetivos de partículas (microbios, zimosano y eritrocitos de conejo) a través de la amplificación de la activación espontánea " tick over " de C3. Sin embargo, la ausencia de cualquier activación de la vía alternativa en sueros ratones doble-deficiente de MASP-1 y MASP-3 y suero de paciente humano de 3MC en placas recubiertas de zimosano y dos bacterias diferentes (N. meningitidis y S. aureus) , y la reducción de la hemolisis de eritrocitos en sueros deficientes de MASP-3 de humano y ratón, indican que la iniciación de la activación de la vía alternativa en estas superficies requiere de MASP-3 funcional. El papel requerido para MASP-3 puede ser dependiente o independientede de lectinas y conduce a la formación de los complejos de C3 convertasa y C5 convertasa de la via alternativa, es decir los complejos C3bBb y C3bBb(C3b)n, respectivamente. Por lo tanto, los inventores divulgan en este documento la existencia de rutas de iniciación previamente esquivas para la vía alternativa. Esta ruta de iniciación es dependiente de (i) LEA-1, un camino de activación recientemente descubierto de la vía de las lectinas, y/o (ii) los papeles independientes de la lectina de las proteínas MASP-3, MASP-2 y HTRA-1.

III. EL PAPEL DE MASP 2 Y MASP-3 EN LA HEMOGLOBINURIA PAROXÍSTICA NOCTURNA Y MÉTODOS TERAPÉUTICOS QUE UTILIZAN AGENTES INHIBIDORES DE MASP 2 Y MASP-3 i. Información General de la HPN La Hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), a veces también denominada síndrome de Marchiafava-Micheli, es una enfermedad adquirida de la sangre, potencialmente peligrosa para la vida. La HPN puede desarrollarse por sí misma, referida como "HPN primaria" o en el contexto de otros trastornos de la médula ósea como anemia aplásica, conocida como "HPN secundaria". La mayoría de los casos es HPN primaria. La HPN se caracteriza por la destrucción inducida por el complemento de los glóbulos rojos (hemolisis), recuentos bajos de glóbulos rojos (anemia), trombosis e insuficiencia de la médula ósea. Los resultados del laboratorio en HPN muestran cambios constantes con anemia hemolitica intravascular: baja hemoglobina, deshidrogenasa de lactato elevada, recuento de reticulocitos elevado (glóbulos rojos inmaduros liberados por la médula ósea para reemplazar las células destruidas), bilirrubina elevada (un producto de degradación de la hemoglobina), en la ausencia de anticuerpos autorreactivos gue se unen a los glóbulos rojos como causa posible.

El sello de la HPN es la hemólisis crónica mediada por complemento causada por la activación no regulada de componentes del complemento terminal, incluyendo el complejo de ataque a membrana en la superficie de los glóbulos rojos circulantes. Los glóbulos rojos de la HPN están sujetos a la activación incontrolada del complemento y la hemólisis debido a la ausencia de los reguladores de complemento CD55 y CD59 en su superficie (Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11): 2283-91 (2010), Risitano, et al., Míni-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011)). CD55 y CD59 se expresan abundantemente en los glóbulos rojos normales y controlan la activación del complemento. CD55 actúa como un regulador negativo de la vía alternativa, inhibiendo el montaje del complejo de la C3 convertasa (C3bBb) de la vía alternativa y acelerando la decadencia de la convertasa preformada, bloqueando así la formación de los complejos de ataque a membrana (MAC). CD59 inhibe el complejo de ataque a membrana del complemento directamente al unir el complejo C5b678 e impidiendo la unión y la polimerización de C9.

Mientras que la hemolisis y anemia son las características clínicas dominantes de la HPN, la enfermedad es un trastorno hematológico complejo que incluye además trombosis e insuficiencia de médula ósea como parte de los resultados clínicos (Risitano et al., Mini Reviews in Med Chem 11:528-535 (2011)). A nivel molecular, la HPN es causada por la expansión clonal anormal de las células madre hematopoyéticas que carecen de un gen funcional PIG A. PIG A es un gen ligado al cromosoma X que codifica la transferasa de glicosil-fosfatidil inositol requerida para la expresión superficial estable de las glicoproteínas ancladas a GPI clase A, incluyendo CD55 y CD59. Por razones que están actualmente bajo investigación, las células madre hematopoyéticas con un gen PIG A disfuncional que surgen como resultado de mutaciones somáticas espontáneas, pueden experimentar expansión clonal hasta el punto donde sus progenies constituyen una porción significativa del grupo de células hematopoyéticas periféricas. Mientras que la progenie de eritrocitos y linfocitos del clon de células madre mutantes carece de CD55 y CD59, sólo los glóbulos rojos se someten a lisis después de que entran en la circulación.

El tratamiento actual para la HPN incluye la transfusión de sangre para la anemia, anticoagulante para la trombosis y el uso de los anticuerpos monoclonales eculizumab { Soliris®) , que protege las células sanguíneas contra la destrucción inmune inhibiendo el sistema del complemento (Hillmen P. et al., N. Engl . J. Med. 350(6):552-559(2004)). Eculizumab (Soliris®) es un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige al componente del complemento C5, bloqueando su escisión por convertasas C5, lo que impide la producción de C5a y el montaje de MAC. El tratamiento de los pacientes de HPN con eculizumab ha resultado en una reducción de la hemolisis intravascular, según lo medido por la deshidrogenasa de lactato (LDH), llevando a la estabilización de hemoglobina y a la independencia de la transfusión en aproximadamente la mitad de los pacientes (Risitano et al, Mini-Reviews in Medicinal Chemístry, 11(6) (2011)). Mientras que casi todos los pacientes sometidos a terapia con eculizumab logran niveles de LDH normales o casi normales (debido al control de la hemolisis intravascular), sólo alrededor de un tercio de los pacientes alcanzan un valor de hemoglobina de llgr/dL, y los pacientes en eculizumab restantes continúan mostrando anemia moderada a severa (es decir, dependiente de transfusiones) en proporciones iguales (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). Como se describe en Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011), se demostró que los pacientes de HPN cob eculizumab contenían grandes cantidades de fragmentos de C3 unidos a sus eritrocitos de HPN (mientras que los pacientes no tratados no lo hicieron). Este hallazgo condujo al reconocimiento que los pacientes de HPN tratados con Soliris, los glóbulos rojos de HPN que ya no son hemolizados debido al bloqueo de C5 pueden ahora acumular grandes cantidades de fragmentos de C3 unidos a membrana, los cuales operan como opsoninas, resultando en su atrapamiento en las células endoteliales mediante receptores específicos de C3 y la subsecuentes hemolisis extravascular. Por lo tanto, al mismo tiempo que previene la hemolisis intravascular y las secuelas resultantes, la terapia con eculizumab simplemente desvía la disposición de estos glóbulos rojos de de hemolisis intravascular a extravascular, resultando en anemia sustancial residual no tratada en muchos pacientes (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). Por lo tanto, las estrategias terapéuticas además del uso de eculizumab son necesarias para aquellos pacientes que desarrollan hemolisis extravascular mediada por fragmentos de C3, porque continúan requiriendo transfusiones de glóbulos rojos. Estos enfoques objetivos de fragmento de C3 han demostrado utilidad en sistemas experimentales (Lindorfer et al., Blood 115:2283-91, 2010). ii. Mecanismos de iniciación de complemento en HPN La vinculación causal entre la expresión superficial defectuosa de los reguladores de complemento negativos CD55 y CD59 en la HPN, combinada con la eficacia de eculizumab en la prevención de la hemolisis intravascular, definen claramente la HPN como una enfermedad mediada por el sistema del complemento. Mientras que este paradigma es ampliamente aceptado, la naturaleza de los eventos que inician la activación del complemento y las vías de activación del complemento siguen sin resolverse. Debido a que CD55 y CD59 regulan negativamente los pasos de ampliación terminal en la cascada de complemento común a todas las vías de iniciación de complemento, la deficiencia de estas moléculas conducirá a una formación e integración de membrana exagerada y de complejos de ataque de membrana, independientemente de si la activación del complemento se inicia por la vía de las lectinas, por la via clásica o por rotación espontánea de la vía alternativa. Así, en pacientes de HPN, cualquier evento de activación de complemento que conduzca a la deposición de C3b sobre la superficie de los glóbulos rojos puede provocar la subsecuente amplificación y hemolisis patológica (intravascular o extravascular) y precipitar una crisis hemolítica. Una comprensión mecanicista clara de los eventos moleculares que desencadenan la crisis hemolítica en pacientes con HPN ha permanecido esquiva. Debido a que ningún evento de iniciación de complemento es abiertamente evidente en pacientes con HPN que experimentan una crisis hemolítica, la opinión predominante es que la activación del complemento en HPN puede ocurrir espontáneamente debido a la activación espontánea de bajo nivel " tick-over " de la vía alternativa, que es posteriormente magnificada por el control inadecuado de la activación del complemento terminal debido a la falta de CD55 y CD59.

Sin embargo, es importante señalar que en su historia natural, la HPN se desarrolla o se agrava generalmente después de ciertos acontecimientos, como una infección o una lesión (Risitano, Biologics 2:205 -222 (2008)), que se han demostrado que desencadenan la activación del complemento. Esta respuesta de activación del complemento no depende de la inmunidad previa del huésped hacia el patógeno de incitación y por lo tanto, es probable que no implique la vía clásica. Por el contrario, parece que esta respuesta de activación del complemento se inicia por la unión de lectinas a patrones de carbohidratos extraños o "auto alterados" expresados en la superficie de agentes microbianos o el tejido del huésped dañado. Por lo tanto, los eventos que precipitan crisis hemolitica en la HPN están estrechamente vinculados para la activación del complemento iniciada mediante lectinas. Esto hace muy probable que las vías de activación de las lectinas proporcionen el disparo iniciador que conduce finalmente a la hemolisis en pacientes de HPN.

Usando agentes patógenos bien definidos que activan el complemento mediante lectinas como modelos experimentales para diseccionar las cascadas de activación a nivel molecular, demostramos que, dependiendo del microbio de incitación, la activación del complemento puede iniciarse por LEA-2 o LEA-1, llevando a la opsonización y/o lisis. Este mismo principio de respuestas duales (es decir, opsonización o lisis) a eventos de iniciación de lectinas es probable que también se aplique a otros tipos de agentes infecciosos, o a la activación del complemento por lectinas tras lesión del tejido al anfitrión, u otros eventos de activación de complemento impulsados por lectinas que pueden precipitar la HPN. En base a esta dualidad en la vía de las lectinas, inferimos que la activación del complemento iniciada por LEA-2 y/o LEA-1 en pacientes con HPN promueve la opsonización y/o la lisis de los glóbulos rojos con C3b y la subsecuente hemolisis extravascular e intravascular. Por lo tanto, en el marco de la HPN, la inhibición de LEA-1 y LEA-2 se esperaría que enfocara la hemolisis tanto intravascular como extravascular, proporcionando una ventaja significativa sobre el inhibidor de C5 eculizumab.

Se ha determinado que la exposición a S. pneumoniae desencadena preferentemente la activación dependiente de lectina de LEA-2, que conduce a la opsonización de este microbio con C3b. Puesto que la S. pneumonía es resistente a la lisis mediada por MAC, su separación de la circulación se produce a través de la opsonización con C3b. Esta opsonización y posterior retiro de la circulación es dependiente de LEA-2, según lo indicado por el control bacteriano comprometido en ratones deficientes de MASP-2 y en ratones tratados con anticuerpos monoclonales de MASP-2 ( PLOS Pathog. , 8: el002793. (2012)).

Al explorar el papel de LEA-2 en las respuestas innatas del huésped a los agentes microbianos, probamos los patógenos adicionales. Se observó un resultado radicalmente diferente cuando Neisseria meningitidis fue estudiado como un organismo modelo. N. meningitidis también activa el complemento mediante lectinas y la activación del complemento se requiere para la contención de infecciones de N. meningitidis en el huésped no infectado. Sin embargo, LEA-2 no juega ningún papel funcional protector del huésped en esta respuesta: Como se muestra en las figuras 8 y 9, el bloqueo de LEA-2 mediante ablación genética del MASP-2 no reduce la supervivencia después de la infección con N. meningitidis. Por el contrario, el bloqueo de LEA-2 por ablación de MASP-2 mejoró significativamente la supervivencia (figuras 8 y 9), así como las puntuaciones de enfermedad (Figura 11) en estos estudios. El bloqueo de LEA-2 por la administración del anticuerpo de MASP-2 rindió el mismo resultado (Figura 12), eliminando los efectos secundarios o compensatorios en la cepa de ratón KO como causa posible. Estos resultados favorables en los animales con ablación de LEA-2 se asociaron con una eliminación más rápida de N. meningitidis de la sangre (Figura 10). También, como se describe en este documento, la incubación de N. meningitidis con suero humano normal eliminó la N. meningitidis (Figura 13). La adición de un anticuerpo monoclonalefuncional específico para MASP-2 humano que bloquea LEA-2, pero no la administración de un anticuerpo monoclonal de control de isotipo, puede realzar esta respuesta de eliminación. Sin embargo, este proceso depende de lectinas y al menos un sistema de complemento parcialmente funcional, tal como suero humano deficiente de MBL o suero humano inactivado con calor, fue incapaz de eliminar a N. meningitidis (Figura 13). Colectivamente, estos nuevos hallazgos sugieren que las infecciones por N. meningitidis en presencia de un sistema de complemento funcional son controladas por una vía de activación de complemento dependiente de lectinas pero independiente de LEA-2.

La hipótesis de que LEA-1 puede ser la vía del complemento responsable de eliminar la N. meningitidis dependiente de lectinas fue probada utilizando a una muestra de suero de un paciente de 3MC. Este paciente era homocigótico para una mutación sin sentido en el exón 12 del gen de MASP-1/3. Como resultado, este paciente carecía de una proteína de MASP-3 funcional, pero al contrario tuvo suficiente complemento (el exón 12 es específico para la transcripción del MASP-3; la mutación no tiene ningún efecto sobre los niveles de la función o expresión de MASP-1) (ver Nat Genet 43 (3): 197-203 (2011)). El suero humano normal elimina eficientemente la N. meningitidis, pero el suero inactivado con calor deficiente en MBL (una de las moléculas de reconocimiento para la vía de las lectinas) y el suero deficiente de MASP-3 pudieron eliminar la N. meningitidis (Figura 14). Por lo tanto, LEA-1 parece mediar la eliminación de N. meningitidis . Este hallazgo fue confirmado usando muestras de suero de las cepas de ratón KO. Mientras que el complemento con suero normal de ratón fácilmente eliminó N. meningitidis, el suero de ratón deficiente de MBL o deficiente de MASP-1/3 fue ineficaz como el suero inactivado con calor que carece de complemento funcional (Figura 15). Por el contrario, el suero deficiente de MASP-2 mostró eficiente eliminación de N. meningitidis .

Estos resultados proporcionan evidencia de una dualidad hasta ahora desconocida en la vía de las lectinas al revelar la existencia de vías LEA-2 y LEA-1 separadas de activación del complemento dependiente de lectinas. En los ejemplos detallados anteriormente, LEA-2 y LEA-1 son resultados distintos, funcionales, no redundantes y mediatos. Los datos sugieren que ciertos tipos de activadores de la vía de las lectinas (incluyendo, sin limitarse a S. pneumonía) inician preferentemente la activación del complemento mediante LEA-2 llevando a la opsonización, mientras que otros (ejemplificado por N. meningitidis) inician preferentemente la activación del complemento mediante LEA-1 y promueven los procesos citoliticos. Los datos, sin embargo, no necesariamente limitan a LEA-2 a opsonización y a LEA-1 a procesos citoliticos, ya que ambas vias en otros contextos pueden mediar la opsonización y/o la lisis.

En el contexto de activación del complemento dependiente de lectinas por N. meningitidis, los caminos de LEA-2 y LEA-1 parecen competir entre si, ya que el bloqueo de LEA-2 mejoró la destrucción litica dependiente de LEA-1 del organismo in vitro (Figura 15). Como se indica anteriormente, este hallazgo puede explicarse por el aumento de la probabilidad de que los complejos de MASP-1 de lectina residan en cercana proximidad a los complejos de MASP-3 de lectinas en ausencia de MASP-2, lo que mejorará la activación de LEA-1 y promoverá más eficaz la lisis de N. meningitidis . Debido a que la lisis de N. meningitidis es el principal mecanismo de protección en el huésped no infectado, el bloqueo de LEA-2 in vivo aumenta la separación de N. meningitidis y conduce a la eliminación mejorada.

Mientras que los ejemplos mencionados ilustran los efectos opuestos de LEA-2 y LEA-1 con respecto a los resultados después de la infección con N. meningitidis, puede haber otras opciones donde tanto LEA-2 como LEA-1 pueden sinergizar para producir un determinado resultado. Como se detalla más abajo, en otras situaciones de activación del complemento patológico mediante lectinas como los presentes en HPN, la activación del complemento impulsada por LEA-2 y LEA-1 puede cooperar de una manera sinérgica para contribuir a la patología general de la HPN. Además, como se describe en este documento, MASP-3 también contribuye a la conversión independiente de lectina del factor B y el factor D, la cual puede ocurrir en la ausencia de Ca++ llevando comúnmente a la conversión de C3bB a C3bBb y del pro-factor D al factor D, la cual puede contribuir a la patología de la HPN. 111. Biología y actividad funcional esperadas en HPN Esta sección describe los efectos inhibitorios de bloqueo de LEA-2 y LEA-1 en hemolisis en un modelo in vitro de la HPN. Los resultados apoyan la utilidad de los agentes bloqueadores de LEA-2 (incluyendo, sin limitarse a, los anticuerpos que se unen y bloquean la función del MASP-2) y agentes de bloqueo de LEA 1 (incluyendo pero no limitado a, los anticuerpos que se unen y bloquean la función de la activación mediada por MASP-1 de MASP-2, MASP-3 o ambos) para tratar sujetos que sufren de uno o más aspectos de la HPN y también el uso de inhibidores de LEA-2 o LEA-1, o la activación del complemento dependiente de MASP-3, activación del complemento independiente de lectina (incluyendo inhibidores de MASP-2, inhibidores de MASP-3 y MASP-2/MASP-3 dual o biespecificos o inhibidores de MASP-l/MASP-2, e inhibidores pan específicos de MASP-l/MASP-2/MASP-3) para mitigar los efectos de la hemolisis extravascular mediada por fragmento de C3 en pacientes con HPN sometidos a terapia con un inhibidor de C5 como eculizumab.

IV . Inhibidores de MASP-2 para bloquear la opsonización y la hemolisis extravascular de eritrocitos HPN a través del sistema reticuloendotelial Como se detalla anteriormente, los pacientes con HPN se vuelven anémicos debido a dos mecanismos distintos de separación de los glóbulos rojos de la circulación: hemolisis intravascular través de la activación del complejo de ataque a la membrana (MAC), y la hemolisis extravascular siguiente a la opsonización con C3b y la separación posterior después de la unión del receptor del complemento y la captación por el sistema reticuloendotelial. La hemolisis intravascular se evita en gran medida cuando un paciente es tratado con eculizu ab. Debido a que eculizumab bloquea el mecanismo efector terminal U tico que se produce descendente de tanto el evento de iniciación de activación del complemento asi como la subsiguiente opsonización, eculizumab no bloquea la hemolisis extravascular (Risitano AM et al, Blood 113:4094-100 (2009)). En su lugar, los glóbulos rojos que se han sometido a la hemolisis en los pacientes con HPN sin tratar ahora pueden acumular proteínas activadas de C3b en su superficie, lo que aumenta la absorción por el sistema reticuloendotelial y mejora su hemolisis extravascular. Por lo tanto, el tratamiento con eculizumab desvía efectivamente la disposición de los glóbulos rojos por hemolisis intravascular y potencia la hemolisis extravascular. Como resultado, algunos pacientes con HPN tratados con eculizumab siguen siendo anémicos. De ello se desprende que los agentes que bloquean la activación del complemento ascendente y evitan la opsonización de eritrocitos de HPN pueden ser particularmente adecuados para bloquear la hemolisis extravascular ocasionalmente vista con eculizumab.

Los datos microbianos presentados aquí sugieren que LEA-2 es a menudo la ruta dominante para la opsonización dependiente de lectina. Además, cuando se evaluó la opsonización dependiente de lectina (medida como la deposición de C3b) en tres superficies prototípicas de activación de lectina (manano figura 19A; zimosano, Figura 19B, y S. neumonía figura 19C), LEA-2 parece ser la ruta dominante para la opsonización dependiente de lectina bajo condiciones fisiológicas (es decir, en presencia de Ca41- en donde todas las vías del complemento están en funcionamiento). Bajo estas condiciones experimentales, el suero deficiente de MASP-2 (que carece de LEA-2) es sustancialmente menos eficaz en la opsonización de las superficies de prueba que el suero WT. El suero deficiente de MASP-1/3 (que carece de LEA-1) también se ve comprometido, aunque este efecto es mucho menos pronunciado en comparación con el suero carente de LEA-2. La magnitud relativa de las contribuciones de LEA-2 y LEA-1 a la opsonización impulsada por lectinas se ilustra adicionalmente en las figuras 20A-20C. Mientras que la vía alternativa del complemento se ha informado que apoya la opsonización de las superficies de activación de lectina en ausencia de la vía de la lectina o la via clásica (Selander et al, J Clin Invest 116 (5):1425-1434 (2006)), la via alternativa en el aislamiento (medida por Ca++-condiciones de ensayo libres) parece sustancialmente menos eficaz que los procesos iniciados por el LEA-1 y LEA-2 descritos en este documento. Por extrapolación, estos datos sugieren que la opsonización de eritrocitos de HPN también puede ser iniciada preferentemente por LEA-2 y, en menor medida, por LEA-1 (posiblemente amplificada por el circuito de amplificación de la via alternativa), más que el resultado de la activación de la via alternativa independiente de lectinas. Por lo tanto, cabe esperar que los inhibidores de LEA-2 sean más eficaces en la limitación de la opsonización y la prevención de la hemolisis extravascular en la HPN. Sin embargo, el reconocimiento del hecho de que las lectinas diferentes de MBL, como ficolinas, se unen a estructuras no de hidratos de carbono tales como proteínas acetiladas, y que MASP-3 se asocia preferentemente con H-ficolina (Skjoedt et al, Immunobiol . 215:921- 931, 2010), deja abierta la posibilidad de un papel significativo para LEA-1 en la opsonización de los glóbulos rojos asociados a HPN también. Por lo tanto, se espera que los inhibidores de LEA-1 que tengan efectos adicionales de anti-opsonización, y la combinación de inhibidores de LEA-1 y LEA-2 se espera que sea óptima y medie el beneficio más robusto del tratamiento en la limitación de la opsonización y la hemolisis extravascular en pacientes con HPN. Este concepto se apoya además en los datos de opsonización que se muestran en la Figura 28: suero de ratón deficiente de factor D (que carece de la capacidad de activar la vía alternativa en fase fluida, pero tiene una vía clásica funcional, asi como vías funcionales de LEA-1 y LEA-2) no muestra ningún déficit en la opsonización en comparación con el suero WT. El suero deficiente de factor B, que carece de LEA-1, muestra opsonización reducida mientras que el suero deficiente de factor D tratado con anticuerpo monoclonal MASP-2 bloquea la activación del complemento mediada por LEA-2 produce una supresión más robusta de la opsonización (FIGURA 28). Es importante destacar que, la adición de anticuerpo monoclonal de MASP-2 al suero deficiente de factor B suprimió la opsonización de manera más eficaz que cualquiera de bloqueo de MASP-2 o bloqueo de factor D solos. Por lo tanto, LEA-2-1 y la LEA actúan de forma aditiva o sinérgica para promover la opsonización, y se espera que un inhibidor de reacción cruzada o biespecifico de LEA-l/LEA-2 sea más eficaz en el bloqueo de la opsonización y la hemolisis extravascular en la HPN. v._ Papel de los inhibidores de MASP-3 en la HPN Usando un modelo in vitro de HPN, hemos demostrado que la activación del complemento y la hemolisis resultante en HPN son efectivamente iniciados por la activación de LEA-2 y/o LEA-1, y que no es una función independiente de la vía alternativa. Estos estudios utilizaron glóbulos rojos sensibilizados de manano de varias cepas de ratón, incluyendo los glóbulos rojos de los ratones deficientes de Crry · (un importante regulador negativo de la vía del complemento terminal en ratones), asi como los glóbulos rojos de ratones deficientes de CD55-CD59, que carecen de los mismos reguladores del complemento que están ausentes en pacientes con HPN). Cuando los glóbulos rojos deficientes de Crry sensibilizados con manano fueron expuestos a suero humano suficiente en complemento, los glóbulos rojos se hemolizaron eficazmente a una concentración sérica de 3% (Figura 21 y 22) mientras que el suero deficiente de complemento (HI: inactivado por calor) no fue hemolítico. Sorprendentemente, el suero suficiente de en donde LEA-2 se bloqueó mediante la adición de anticuerpos de MASP-2 había reducido la actividad hemolítica, y 6% de suero fue necesario para la hemolisis eficaz. Se hicieron observaciones similares cuando los glóbulos rojos deficientes de CD55/CD59 fueron probados (Figura 24). El suero humano suficiente en complemento suplementado con anticuerpo monoclonal MASP-2 (es decir, suero en el que se suprime LEA-2) fue aproximadamente dos veces menos eficaz que el suero no tratado en el apoyo de hemolisis. Además, las concentraciones más altas de suero bloqueado de LEA-2 (es decir, tratado con anticuerpo monoclonal anti-MASP-2) se necesitaban para promover la hemolisis eficaz de los glóbulos rojos WT no tratados en comparación con el suero no tratado (Figura 23).

Aún más sorprendente, el suero de un paciente de 3MC homocigoto para una proteina disfuncional MASP-3 (y por lo tanto que carece de LEA-1) fue completamente incapaz de hemolizar los glóbulos rojos deficientes de Crry sensibilizados con manano (Figura 22 y Figura 23). Se observó un resultado similar cuando se utilizaron los glóbulos rojos normales no sensibilizados: Como se muestra en la Figura 23, el suero defectuoso en LEA-1 aislado de un paciente de 3MC fue completamente ineficaz en la mediación de hemolisis. Colectivamente, estos datos indican que mientras que LEA-2 contribuye significativamente a la respuesta de la hemolisis intravascular, LEA-1 es el iniciador predominante de la vía del complemento que conduce a la hemolisis. Asi, mientras que se espera que los agentes de bloqueo de LEA-2 reduzcan significativamente la hemolisis intravascular de los glóbulos rojos en pacientes con HPN, se espera que los agentes de bloqueo LEA-1 tengan un efecto más -profundo y eliminen en gran medida la hemolisis impulsada por complemento.

Cabe señalar que el suero del paciente de 3MC deficiente de LEA-1 utilizado en este estudio poseía una vía alternativa disminuida pero funcional cuando se probó bajo condiciones de ensayo convencionales de la via alternativa (Figura 17). Este hallazgo sugiere que la LEA-1 hace una mayor contribución a la hemolisis que la actividad de la via alternativa como convencionalmente se define en esta configuración experimental de la HPN. Por inferencia, se implica que los agentes bloqueadores de LEA-1 serán al menos tan eficaces como los agentes bloqueadores de otros aspectos de la via alternativa en la prevención o el tratamiento de la hemolisis intravascular en pacientes con HPN. vi. Papel de los inhibidores de MASP-2 en la HPN Los datos presentados en este documento sugieren los siguientes mecanismos patogénicos para la anemia en HPN: hemolisis intravascular debido a la activación no regulada de los componentes terminales del complemento y la lisis de glóbulos rojos mediante la formación de MAC, que se inicia predominantemente, aunque no exclusivamente, por LEA-1, y la hemolisis extravascular causada por la opsonización de los glóbulos rojos por C3b, que parece ser iniciada predominantemente por LEA-2. Mientras que un papel discernible para LEA-2 en la iniciación de la activación del complemento y la promoción de la formación de MAC y la hemolisis es aparente, este proceso parece sustancialmente menos eficaz que la activación del complemento iniciada por LEA-1 que conduce a la hemolisis. Por lo tanto, se espera que los agentes de bloqueo de LEA-2 reduzcan significativamente la hemolisis intravascular en pacientes con HPN, aunque se espera que esta actividad terapéutica sea sólo parcial. En comparación, se espera una reducción más sustancial en la hemolisis intravascular en pacientes con HPN para los agentes de bloqueo de LEA-1.

La hemolisis extravascular, un mecanismo menos dramático, pero igualmente importante de destrucción de glóbulos rojos que lleva a la anemia en la HPN, es principalmente el resultado de la opsonización por C3b, que parece estar mediada predominantemente por LEA-2. Por lo tanto, los agentes de bloqueo de LEA-2 se puede esperar que bloqueen preferentemente la opsonización de los glóbulos rojos y la subsiguiente hemolisis extravascular en HPN. Esta actividad terapéutica única de los agentes de bloqueo de LEA-1 se espera que proporcione un beneficio significativo del tratamiento para todos los pacientes con HPN ya que no existe actualmente ningún tratamiento para aquellos pacientes con HPN que experimentan este proceso patogénico. vii._ Inhibidores de LEA-2 como tratamiento adjunto a los inhibidores de LEA-1 o agentes de bloqueo de complemento terminal Los datos presentados en el presente documento detallan dos mecanismos patogénicos para la separación de los glóbulos rojos y la anemia en HPN que pueden ser dirigidos, por separado o en combinación, por distintas clases de agentes terapéuticos: la hemolisis intravascular inició predominantemente, aunque no exclusivamente, por LEA-1 y por lo tanto se espera que se prevenga eficazmente mediante un agente de bloqueo de LEA-1, y la hemolisis extravascular debido a opsonización de C3b impulsada predominantemente por LEA-2, y por lo tanto prevenida de forma eficaz por un agente de bloqueo de LEA-2.

Está bien documentado que ambos mecanismos intravasculares y extravasculares de hemolisis conducen a la anemia en pacientes con HPN (Risitano et al., Blood 113:4094 - 4100 (2009)). Por lo tanto, se espera que un agente de bloqueo de LEA-1 que previene la hemolisis intravascular en combinación con un agente de bloqueo de LEA-2 que previene principalmente hemolisis extravascular sea más eficaz que el agente solo en la prevención de la anemia que se desarrolla en los pacientes con HPN. De hecho, la combinación de los agentes de bloqueo de LEA-2 y LEA-1 se espera que eviten todos los mecanismos pertinentes de la iniciación del complemento en la HPN y asi bloquear todos los síntomas de la anemia en la HPN.

También se sabe que los agentes bloqueadores de C5 (tales como eculizumab) bloquean eficazmente la hemolisis intravascular, pero no interfieren con la opsonización. Esto deja a algunos pacientes con HPN tratados con anti-C5 con anemia residual sustancial debido a la hemolisis extravascular mediada por LEA-2 que permanece sin tratar. Por lo tanto, se espera que un agente de bloqueo de C5 (tal como eculizumab) que previene la hemolisis intravascular en combinación con un agente de bloqueo LEA-2 que reduce la hemolisis extravascular será más eficaz que cualquier agente solo en la prevención de la anemia que se desarrolla en los pacientes con HPN.

Otros agentes que bloquean el lazo de amplificación terminal del sistema del complemento conduce a la activación de C5 y la deposición de MAC (incluyendo, pero no limitado a agentes que bloquean la properdina, factor B o factor D o potencian la actividad inhibidora del factor I, factor H u otros factores inhibidores del complemento) también se espera que inhiban la hemolisis intravascular. Sin embargo, no se espera que estos agentes interfieran con la opsonización mediada por LEA-2 en pacientes con HPN. Esto deja a algunos pacientes con HPN tratados con dichos agentes con anemia residual sustancial debido a la hemolisis extravascular mediada por LEA-2 que permanece sin tratar. Por lo tanto, se espera que el tratamiento con estos agentes que impiden la hemolisis intravascular en combinación con un agente de bloqueo de LEA-2 que minimiza la hemolisis extravascular sea más eficaz que el agente solo en la prevención de la anemia que se desarrolla en los pacientes con HPN. De hecho, se espera que la combinación de dichos agentes y un agente de bloqueo de LEA-2 evite todos los mecanismos pertinentes de la destrucción de los glóbulos rojos en la HPN y asi bloquear todos los sintomas de la anemia en la HPN. vii. Uso de Anticuerpos de LEA-1 y LEA-2 múltiples, biespecificos, o pan-especificos para tratar la HPN.

Como se detalla anteriormente, se espera que el uso de una combinación de agentes farmacológicos que bloquean individualmente LEA-1 y LEA-2, y por lo tanto en combinación bloquean todos los eventos de activación del complemento que median la hemolisis intravascular, asi como la hemolisis extravascular proporcionen el mejor resultado clínico para los pacientes con HPN. Este resultado se puede conseguir, por ejemplo, por la co-administración de un anticuerpo que tiene actividad de bloqueo de LEA-1 junto con un anticuerpo que tiene actividad de bloqueo de LEA-2. En algunas modalidades, las actividades de bloqueo de LEA-2 y LEA-1 se combinan en una única entidad molecular, y que dicha entidad combinada con actividad de bloqueo de LEA-1 y LEA-2 bloqueará efectivamente la hemolisis intravascular, así como la hemolisis extravascular y prevendrá la anemia en la HPN. Tal entidad puede comprender o consistir en un anticuerpo biespecífico en un sitio de combinación de antígeno que reconoce específicamente MASP-1 y bloquea LEA-1 y disminuye LEA-2 y el segundo sitio de combinación de antígeno que reconoce específicamente MASP-2 y bloquea LEA-2. Alternativamente, una entidad de este tipo puede consistir en un anticuerpo monoclonal biespecífico donde un sitio de combinación de antígeno reconoce específicamente MASP-3 y por lo tanto bloquea LEA-1 y el segundo sitio de combinación de antígeno reconoce específicamente MASP-2 y bloquea LEA-2. Tal entidad puede consistir de manera óptima de un anticuerpo monoclonal biespecífico donde un sitio de combinación de antígeno reconoce específicamente tanto MASP-1 como MASP-3 y por lo tanto bloquea LEA-1 y disminuye LEA-2, mientras que el segundo sitio de combinación de antígeno reconoce específicamente MASP-2 y bloquea LEA-2. Sobre la base de las similitudes en la secuencia de proteínas y la arquitectura en general, también se puede prever que un anticuerpo convencional con dos sitios de unión idénticos puede ser desarrollado el cual se une específicamente a MASP-1 y MASP-2 y a MASP-3 de una manera funcional, logrando así el bloqueo funcional de LEA-1 y LEA-2. Se espera que tal anticuerpo con actividad inhibidora total de MASP bloquee tanto la hemolisis intravascular como la hemolisis extravascular y por lo tanto trate efectivamente la anemia en pacientes con HPN.

IV. AGENTES INHIBIDORES DE MASP Con el reconocimiento de que la vía de las lectinas del complemento está compuesta de dos caminos de activación de complemento principales, LEA-1 y LEA-2, y que también hay un camino de activación de complemento independiente de lectinas, llegamos a la realización de que seria altamente deseable inhibir específicamente uno o más de estos caminos efectores que provocan una patología asociada con la HPN sin desactivar completamente las capacidades de defensa inmune del complemento (es decir, dejar la vía clásica intacta). Esto hubiera dejado al sistema de activación del complemento dependiente de Clq intacto para manejar el procesamiento del complejo inmune y para ayudar en la defensa del huésped contra la infección. i_._ Composiciones para inhibir la activación del complemento mediada por LEA-1 Como se describe aquí, los inventores han descubierto inesperadamente que la activación de LEA-1, que lleva a la lisis, es dependiente de MASP-3. Como se describe adicionalmente en este documento, en condiciones fisiológicas, la activación de LEA-1 dependiente de MASP-3-también contribuye a la opsonización, proporcionando de este modo un efecto aditivo con la activación del complemento mediada por LEA-2. Como se demuestra en el Ejemplo 7, en presencia de Ca++, no se requiere el factor D, ya que MASP-3 puede conducir la activación de LEA-1 en los sueros de factor D/_. MASP-3, MASP-1 y HTRA-1 son capaces de convertir el pro-factor D al factor D activo. Asimismo, la activación de MASP-3 parece, en muchos casos, ser dependiente de MASP-1, ya que MASP-3 (en contraste con MASP-1 y MASP-2) no es una enzima de auto-activación y es incapaz de convertirse a su forma activa sin la ayuda de MASP-1 (Zundel, S. et al, J. Immunol 172:4342 -4350 (2004); Megyeri et al, J. Biol Chem 288: 8922 - 8934 (2013)).

Debido a que MASP-3 no se auto-activa y, en muchos casos, requiere la actividad de MASP-1 para ser convertida a su forma enzimáticamente activa, la activación mediada por MASP-3 de la C3 convertasa de la vía alternativa C3bB puede inhibirse ya sea por direccionamiento del zimógeno de MASP-3 o activarse por MASP-3, o por direccionamiento de la activación de MASP-3 mediada por MASP-1, o ambos, ya que, en muchos casos, en ausencia de actividad funcional de MASP-1, MASP-3 permanece en su forma zimógena y no es capaz de conducir LEA-1 a través de la formación directa de la C3 convertasa de la vía alternativa (C3bBb) .

Por lo tanto, en un aspecto de la invención, el componente de proteina preferido para dirigir en el desarrollo de agentes terapéuticos para inhibir específicamente LEA-1 es un inhibidor de MASP-3 (incluyendo inhibidores de la activación de MASP-1 mediada por MASP-3 de (por ejemplo, un inhibidor de MASP-1 que inhibe la activación de MASP-3).

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir los efectos adversos de LEA-1 (es decir, la hemolisis y la opsonización) en un sujeto que sufre de HPN, o en riesgo de desarrollar HPN, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-3 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los agentes inhibidores de MASP-3 se administran en una cantidad eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-3 en un sujeto libre que padece de, o en riesgo de desarrollar, HPN. En la práctica de este aspecto de la invención, los agentes inhibidores de MASP-3 representativos incluyen: moléculas que inhiben la actividad biológica de MASP 3, incluyendo moléculas que inhiben al menos uno o más de los siguientes: activación del factor B dependiente de MASP-3 de lectina, la activación del pro-factor D independiente de lectina (como inhibidores de molécula pequeña, anticuerpos de MASP-3 y fragmentos de los mismos, o péptidos de bloqueo que interactúan con MASP-3 o interfieren con una interacción proteína-proteína), y moléculas que disminuyen la expresión de MASP 3 (como moléculas de ácido nucleico antisentido de MASP-3, moléculas de ARNi específico de MASP-3 y ribozimas de MASP-3). Un agente inhibidor de MASP-3 puede bloquear de manera eficaz la proteína MASP-3 a las interacciones de proteínas, interferir con la dimerización o montaje de MASP-3, unión de bloque de Ca++, interferir con el sitio activo de la serina proteasa de MASP 3, o reducir la expresión de la proteína de MASP-3, evitando así que MASP-3 active la activación del complemento mediada por LEA-1, o independiente de lectina. Los agentes inhibidores de MASP-3 se pueden usar solos como terapia primaria o en combinación con otros agentes terapéuticos como una terapia adyuvante para mejorar los beneficios terapéuticos de otros tratamientos médicos, como se describe adicionalmente en este documento.

En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) con una afinidad de unión de al menos 10 veces mayor que a otros componentes en el sistema del complemento. En otra modalidad, un agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) con una afinidad de unión de al menos 100 veces mayor que a otros componentes en el sistema del complemento. En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente al dominio de serina proteasa de MASP-3 (aa 450 a 711 de la SEQ ID NO: 8) e inhibe la activación del complemento la dependiente de MASP-3, con la condición de que el agente inhibidor no se una al dominio de serina proteasa de MASP-1 (SEQ ID NO: 10), y no se una al dominio de serina proteasa de MASP-2 (SEQ ID NO: 5). En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal de MASP-3, o fragmento del mismo, que se une específicamente a MASP-3.

En otra modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10) con una afinidad de unión de al menos 10 veces mayor que a otros componentes en el sistema del complemento, e inhibe la activación de MASP-3 mediada por MASP-1. En otra modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10) con una afinidad de unión de al menos 100 veces mayor que a otros componentes (es decir, polipéptidos, o fragmentos del mismo) en el sistema del complemento, e inhibe la activación mediada por MASP-1 de MASP-3. En algunas modalidades, el agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente al dominio de serina proteasa de MASP-1 (aa 449-694 de la SEQ ID NO: 10) e inhibe la activación mediada por MASP-1 de MASP-3, con la condición de que el agente inhibidor no se una al dominio de serina proteasa de MASP-2 (SEQ ID NO: 5), y no se una al dominio de serina proteasa de MASP-3 (SEQ ID NO: 8). En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal de MASP-1, o un fragmento del mismo, que se une específicamente a MASP-1 e inhibe la activación mediada por MASP-1 de MASP-3. En algunas modalidades, el agente inhibidor de MASP-3 que se une a MASP-1 inhibe la activación mediada por MASP-1 de MASP-3 e inhibe aún más la maduración mediada por MASP-1 del factor D.

En otra modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y también se une a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10), con la condición de que el agente inhibidor no se una a MASP-2 (SEQ ID NO: 5), o MApl9 (SEQ ID NO: 3). En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y también se une a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10), con la condición de que el agente inhibidor no se una a MASP-2 (SEQ ID NO: 5) o MApl9 (SEQ ID NO: 3). En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y también se une a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10), con la condición de que el agente inhibidor no se una a MASP-2 (SEQ ID NO: 5), MApl9 (SEQ ID NO: 3), o MAp44 (SEQ ID NO: 11), proporcionando de este modo lo que permite una dosis más baja eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-3 debido a la falta de unión a MAp44, que está presente en una alta concentración en suero humano.

En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 es un agente inhibidor dual de MASP-l/MASP-3 que se une a un epitopo dentro de la región de aminoácidos que se conserva entre MASP-1 y MASP-3, tales como el dominio CUBI-CCP2 (aa 25-432 de la SEQ ID NO: 10), como se ilustra en las figuras 3-5. En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 es un agente inhibidor dual de MASP-l/MASP-3 que se une a un epitopo dentro de la región de aminoácidos que se conserva entre MASP-1 y MASP-3, con la condición de que el agente inhibidor no se una a MAp44, tal como el dominio CCP (aa 367-432 de la SEQ ID NO: 10). En otra modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 es un agente inhibidor biespecifico, tal como un anticuerpo monoclonal biespecifico, que se une específicamente a un epitopo en la proteína MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y un epitopo en la proteína MASP-1 (SEQ ID NO: 10). En algunas modalidades, el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal biespecífico que se une al dominio de serina proteasa de MASP-1 (aa 449-694 de la SEQ ID NO: 10) y también se une a un dominio de serina proteasa de MASP -3 (aa 450-711 de la SEQ ID NO: 8).

La afinidad de unión de los agentes inhibidores de MASP 3 se puede determinar usando un ensayo de unión adecuado.

La inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP 3 se caracteriza por al menos uno de los siguientes cambios en un componente del sistema del complemento que se producen como resultado de la administración de un agente inhibidor de MASP 3 de acuerdo con los métodos de la invención: la inhibición de la activación del complemento mediada por LEA-1 (inhibición de la hemólisis y/o la opsonización); la inhibición de la conversión del factor B independiente de lectina; la inhibición de la conversión del factor D independiente de lectina, la inhibición de la escisión especifica de sustrato de serina proteasa de MASP-3, la reducción de la hemólisis (medida, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 5) o la reducción de la escisión de C3 y la deposición de C3b (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4 y el Ejemplo 11).

En algunas modalidades, los agentes inhibidores de MASP-3 inhiben selectivamente la activación del complemento dependiente de MASP-3 (es decir, la activación del complemento mediada por LEA-1 y/o la conversión independiente de lectina del factor B y/o la conversión independiente de lectina del factor D), dejando el sistema de activación del complemento dependiente de Clq funcionalmente intacto.

En algunas modalidades, los agentes inhibidores de MASP-3 son anticuerpos, o fragmentos de los mismos, incluyendo los anticuerpos de MASP-3 y los fragmentos de unión a MASP-3 de los mismos, anticuerpos de MASP-1 y fragmentos de los mismos, péptidos naturales y sintéticos, o moléculas pequeñas. En algunas modalidades, los agentes inhibidores de MASP-3 son inhibidores de la proteasa de molécula pequeña que son selectivos para MASP-1, o selectivos para MASP-3, o selectivos para MASP-1 y MASP-3.

Composiciones para inhibir la activación de LEA-2 Como se describe aquí, la activación del complemento mediada por LEA-2 es dependiente de MASP-2-, que conduce a la opsonización y/o lisis. Por lo tanto, el componente de proteína preferido para dirigir en el desarrollo de agentes terapéuticos para inhibir específicamente el sistema de complemento dependiente de lectina LEA-1 es MASP-2. Varias proteínas han demostrado unirse a, o interactuar con MASP-2 a través interacciones de proteína-proteína. Por ejemplo, se sabe que MASP-2 se une a, y forma complejos dependientes de calcio con, las proteínas de lectina MBL, H ficolina y L ficolina y colectina-11. Ma Y., et al., J Innate Immun . Pub. E.4 de diciembre (2012). Cada complejo de MASP-2/lectina ha demostrado activar el complemento a través de la escisión dependiente de MASP-2 de las proteínas C4 y C2 (Ikeda, K., et al, J. Biol Chem 262:74517454, (1987); Matsushita, M., et al, J. Exp Med 176:1497-2284, (2000); Matsushita, M., et al, J. Immunol 168: 3502 3506, (2002)). Los estudios han demostrado que los dominios de EGF CUB1-MASP-2 son esenciales para la asociación de MASP-2 con MBL (Thielens, NM, et al, J. Immunol 166:5068, (2001)). También se ha demostrado que los dominios CUB1EGFCUBII median la dimerización de MASP-2, que se requiere para la formación de un complejo MBL activo (Wallis, R., et al, J. Bíol Chem 275: 30962-30969, 2000). Por lo tanto, los agentes inhibidores de MASP-2 pueden ser identificados porque se unen a o interfieren con las regiones MASP-2 objetivo conocidas por ser importantes para la activación del complemento dependiente de MASP-2.

De acuerdo con lo anterior, en un aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento mediada por LEA-2 en un sujeto que sufre de HPN, o en riesgo de desarrollar HPN, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los agentes inhibidores de MASP-2 se administran en una cantidad eficaz para inhibir LEA-2 dependiente de MASP-2 en un sujeto vivo que sufre de, o en riesgo de desarrollar HPN. En la práctica de este aspecto de la invención, los agentes inhibidores de MASP-2 representativos incluyen: moléculas que inhiben la actividad biológica de MASP-2 (tales como inhibidores de molécula pequeña, anticuerpos de MASP-2 o péptidos de bloqueo que interactúan con MASP-2 o interfieren con una interacción proteína-proteína), y moléculas que disminuyen la expresión de MASP-2 (tales como moléculas de ácido nucleico antisentido de MASP-2, moléculas de ARNi especifico de MASP-2 y ribozimas de MASP-2), impidiendo de este modo que MASP-2 active LEA-2.

Un agente inhibidor de MASP-2 puede bloquear de manera eficaz las interacciones proteina-a-proteina de MASP-2, interferir con la dimerización o montaje de MASP-2, unión de bloque de Ca++, interferir con el sitio activo de serina proteasa de MASP-2, o puede reducir la expresión de proteina de MASP-2, evitando de este modo la activación por MASP 2 de LEA-2. Los agentes inhibidores de MASP-2 se pueden usar solos como terapia primaria o en combinación con otros agentes terapéuticos como una terapia adyuvante para mejorar los beneficios terapéuticos de otros tratamientos médicos, como se describe adicionalmente en este documento.

En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-2 se une específicamente a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5) con una afinidad de unión de al menos 10 veces mayor que a otros antígenos en el sistema del complemento. En otra modalidad, el agente inhibidor de MASP-2 se une específicamente a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5) con una afinidad de unión de al menos 100 veces mayor que a otros antígenos en el sistema del complemento. En una modalidad, el agente inhibidor del MASP-2 se une específicamente a al menos uno de (i) el dominio CCP1-CCP2 (aa 300-431 de SEQ ID NO: 5) o el dominio de serina proteasa de MASP-2 (aa 445- 682 de SEQ ID NO: 5) e inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2, con la condición de que el agente inhibidor no se una al dominio de serina proteasa de MASP-1 (SEQ ID NO: 10), y no se una el dominio de serina proteasa de MASP-3 (SEQ ID NO: 8). En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal de MASP-2, o un fragmento del mismo que se une específicamente a MASP-2.

La afinidad de unión del agente inhibidor de MASP 2 se puede determinar usando un ensayo de unión adecuado.

La inhibición la activación del complemento dependiente de MASP 2 se caracteriza por al menos uno de los siguientes cambios en un componente del sistema del complemento que se producen como resultado de la administración de un agente inhibidor de MASP-2 de acuerdo con los métodos de la invención: la inhibición de la generación o la producción de productos del sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 C4b, C3a, C5a y/o C5b9 (MAC) (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2 de la Patente estadounidense No. 7,919,094), la reducción de la escisión de C4 y la deposición de C4b (medida, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 8 o el Ejemplo 9), o la reducción de la escisión de C3 y la deposición de C3b (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 11).

En algunas modalidades, los agentes inhibidores de MASP 2 inhiben selectivamente la activación del complemento de MASP 2 (es decir, LEA-2), dejando el sistema de activación de complemento dependiente de Clq funcionalmente intacto.

En algunas modalidades, los agentes inhibidores de MASP-2 son anticuerpos, o fragmentos de los mismos, incluyendo anticuerpos de MASP-2 fragmentos de unión de MASP-2 de los mismos, péptidos naturales y sintéticos, o moléculas pequeñas. En algunas modalidades, los agentes inhibidores de MASP-2 son inhibidores de la proteasa de molécula pequeña que son selectivos para MASP-2. iii. Composiciones para inhibir la activación del complemento mediada por LEA-1 y la activación del complemento mediada por LEA-2 En otro aspecto, la invención proporciona métodos para inhibir los efectos adversos de LEA-1 y la inhibición de los efectos adversos de LEA-2 en un sujeto que sufre de uno o más aspectos de HPN, o en riesgo de desarrollar HPN.

En una modalidad, este aspecto de la invención está dirigido a un método para aumentar la supervivencia de los glóbulos rojos en un sujeto que sufre de HPN, que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de al menos uno de un agente inhibidor de MASP-1 y/o un agente inhibidor de MASP-3 eficaz para aumentar la supervivencia de los glóbulos rojos.

En una modalidad, la composición comprende un agente inhibidor de MASP-1. En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-1 inhibe la activación del complemento mediada por MASP-3 y también inhibe la activación del complemento mediada por MASP-2.

En una modalidad, la composición comprende un agente inhibidor de MASP-3. En una modalidad, el agente inhibidor de MASP-3 inhibe al menos uno de: la activación del factor B dependiente de MASP-3 de lectinaM la activación del factor D dependiente de MASP-3 de lectina; la activación del factor B independiente de lectina, dependiente de MASP-3; y/o la activación del factor D independiente de lectina, dependiente de MASP-3.

En una modalidad, la composición comprende un agente inhibidor de MASP-1 y un agente inhibidor de MASP-3.

En algunas modalidades, el método comprende además administrar al sujeto una composición que comprende un agente inhibidor de MASP-2.

En otra modalidad, este aspecto de la invención comprende administrar a un sujeto que sufre de HPN una composición farmacéutica que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-2 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-2 y una cantidad de un agente inhibidor de MASP-3 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas modalidades, la composición comprende un solo agente que inhibe tanto LEA-1 como LEA-2 (es decir, un agente inhibidor dual de MASP-2/MASP-3, un agente inhibidor dual de MASP-l/MASP-2, un agente inhibidor biespecífico de MASP-2/MASP-3, un agente inhibidor biespecífico de MASP-1/MASP2, o un agente inhibidor total (pan) de MASP-1/2/3, o un agente inhibidor triespecífico de MASP-1/2/3). En algunas modalidades, la composición comprende una combinación de agentes inhibidores de LEA-1 y LEA-2, por ejemplo, una combinación de agentes inhibidores duales además de un único agente inhibidor, una combinación de agentes inhibidores biespecífíeos además de un único agente inhibidor, o una combinación de cualquiera de los agentes inhibidores de MASP-1, MASP-2 y/o 3-MASP como se describe en el presente documento que, en combinación inhiben tanto LEA-1 como LEA-2, como se describe adicionalmente en este documento.

En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica para inhibir tanto LEA-1 como LEA-2, que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-3 y al menos un agente inhibidor de MASP-2 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, la composición farmacéutica comprende una combinación de una primera molécula que es un agente inhibidor de MASP-3 y una segunda molécula que es un agente inhibidor de MASP-2. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende una entidad molecular única que incluye actividad como un agente inhibidor de MASP-3 y actividad como un agente inhibidor de MASP-2 (es decir, un agente inhibidor que inhibe tanto la activación de LEA-2 mediada por MASP-2 como la activación de LEA-1 mediada por MASP-3). En una modalidad, el agente inhibidor es un agente inhibidor dual de MASP-2/MASP-3 que se une a un epítopo dentro de una región de aminoácidos que se conserva entre MASP-2 (SEQ ID NO: 5) y MASP-3 (SEQ ID NO: 8), tal como el dominio de serina proteasa, por ejemplo la región N-terminal de la cadena beta (por ejemplo, la primera 150 aa de la región N-terminal de la cadena beta de la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 8), como se muestra en las figuras 4, 6 y 7C. En una modalidad, el agente inhibidor es un agente inhibidor biespecífico, tal como un anticuerpo monoclonal biespecífico, que se une específicamente a un epítopo en la proteína MASP-2 (SEQ ID NO: 5) y un epítopo en la proteína MASP-3 (SEQ ID NO: 8). En algunas modalidades, el agente inhibidor es un anticuerpo monoclonal biespecifico que se une a al menos uno del dominio CCP1-CCP2 de MASP-2 (aa 300-431 de SEQ ID NO: 5) o el dominio de serina proteasa de MASP-2 (aa 445 a 682 de SEQ ID NO: 5) y también se une a un epitopo en la serina proteasa de MASP-3 (aa 450 a 711 de SEQ ID NO: 8).

En otra modalidad, la invención proporciona una composición para inhibir tanto LEA-1 como LEA-2, que comprende un agente inhibidor que inhibe tanto la activación de LEA-2 mediada por MASP-2 como la activación mediada por MASP-1 de MASP-3, inhibiendo de este modo la activación de LEA-1 mediada por MASP-3 (y opcionalmente también inhibe la maduración mediada por MASP-1 del factor D). En una modalidad, el agente inhibidor es un agente inhibidor dual de MASP-l/MASP-2 que se une a un epitopo dentro de una región de aminoácidos que se conserva entre MASP-1 (SEQ ID NO: 10) y MASP-2 (SEQ ID NO: 5), tal como el dominio de serina proteasa, como se muestra en las figuras 4, 6 y 7A. En una modalidad, el agente inhibidor es un agente inhibidor biespecifico, tal como un anticuerpo monoclonal biespecifico, que se une específicamente a un epitopo en la proteína MASP-1 (SEQ ID NO: 10) y un epitopo en la proteina de MASP-2 (SEQ ID NO: 5). En algunas modalidades, el agente inhibidor es un anticuerpo monoclonal biespecifico que se une al dominio de serina proteasa de MASP-1 (aa 449-694 de SEQ ID NO: 10) y también se une a al menos uno del dominio CCP1-CCP2 de MASP -2 (aa 300-431 de SEQ ID NO: 5) o el dominio de serina proteasa de MASP-2 (aa 445-682 de SEQ ID NO: 5).

En otra modalidad, la invención proporciona una composición para inhibir tanto LEA-1 como LEA-2, que comprende un agente inhibidor que inhibe la activación de LEA-2 mediada por MASP-2, como la activación de LEA-1 mediada por MASP-3 mediante la unión directamente a MASP-3 y también inhibe la activación de MASP-3 mediada por MASP-1, inhibiendo de este modo la activación de LEA-1 mediada por MASP-3 (y opcionalmente también la inhibición de la maduración mediada por MASP-1 del factor D) . En una modalidad, el agente inhibidor es un inhibidor total {pan) de MASP que se une a una región de aminoácidos que se conserva entre MASP-1 (SEQ ID NO: 10), MASP-2 (SEQ ID NO: 5) y MASP-3 (SEQ ID NO: 8), por ejemplo una región conservada en el dominio CUBI-EGF-CUB2, como se muestra en las figuras 4 y 5. Como se ilustra en las figuras 4 y 5, hay numerosos parches de identidad compartida entre MASP-1, MASP-2 y MASP-3 en los dominios CUBI-EGF-CUBII, permitiendo asi la generación de anticuerpos pan-específicos de MASP. En algunas modalidades, el anticuerpo pan-específico de MASP puede unirse a un epitopo dentro del dominio CUB2 de MASP-1 (aa 185-296 de SEQ ID NO: 10), MASP-2 (aa 184-295 de SEQ ID NO: 5 ) y MASP-3 (aa 185 a 296 de SEQ ID NO: 8). Se observa que un inhibidor de pan-especifico de MASP especifico que se une a CUBI-EGF de MASP-1, MASP-2 y MASP-3 también se uniría a MApl9 y MAp44, por lo tanto la dosis terapéutica eficaz de un inhibidor de este tipo seria ajustada a un nivel más alto para compensar esta unión. Se observa, además, que un inhibidor pan-específico de MASP que se une al dominio CUBII de MASP-1, MASP-2 y MASP-3 también se unirla a MAp44, por lo tanto la dosis terapéutica eficaz de un inhibidor de este tipo se ajustaría a un mayor nivel para compensar esta unión.

En una modalidad, el agente inhibidor es un inhibidor triespecífico de MASP-1/2/3 que se une a un epítopo en la proteína de MASP-1 (SEQ ID NO: 10), un epítopo en la proteína de MASP-2 (SEQ ID NO: 5) y un epítopo en la proteína de MASP-3 (SEQ ID NO: 8). En algunas modalidades, el agente inhibidor es un anticuerpo monoclonal triespecífico que se une al dominio de serina proteasa de MASP-1 (aa 449-694 de SEQ ID NO: 10), se une a al menos uno del dominio CCP1-CCP2 de MASP- 2 (aa 300-431 de SEQ ID NO: 5) o el dominio de serina proteasa de MASP-2 (aa 445-682 de la SEQ ID NO: 5) y también se une a un epítopo en la serina proteasa de MASP-3 (aa 450-711 de SEQ ID NO: 8).

Los ejemplos de agentes inhibidores para inhibir LEA-1, LEA-2 o LEA-1 y LEA-2 se describen a continuación en la TABLA 2.

TABLA 2: Agentes Inhibidores de MASP-2 *Con respecto a la columna de reactividad cruzada como se expone en la Tabla 2, el inhibidor de MASP designado se une al dominio de unión del inhibidor con una afinidad de unión de al menos 10 veces mayor (por ejemplo, al menos 20 veces, al menos 50 veces o al menos 100 veces mayor) que a los demás componentes del complemento (es decir, polipéptidos o fragmentos de los mismos) que se listan como "no" unión.

En algunas modalidades, la composición comprende una combinación de agentes inhibidores de LEA-1-2 y LEA, por ejemplo, una combinación de agentes inhibidores individuales como se describe anteriormente y se muestra en la TABLA 2. Por ejemplo, en una modalidad, la composición comprende una combinación de un anticuerpo de MASP-1 y un anticuerpo de MASP- 2. En una modalidad, la composición comprende una combinación de un anticuerpo de MASP-1 y un anticuerpo de MASP- 3. En una modalidad, la composición comprende una combinación de un anticuerpo de MASP-2 y un anticuerpo de MASP-3. En una modalidad, la composición comprende una combinación de un anticuerpo de MASP-1 y MASP-2 y MASP-3. En algunas modalidades, los métodos de la invención comprenden la administración de una única composición que comprende una combinación de agentes inhibidores. En otras modalidades, los métodos de la invención comprenden la co-administración de composiciones separadas.

En algunas modalidades, las composiciones comprenden una combinación de un agente inhibidor dual además de un único agente inhibidor (es decir, un inhibidor dual de MASP-2/3 además de inhibidor de MASP-1; un inhibidor dual de MASP-1/3 además de inhibidor de MASP-2, o un inhibidor dual de MASP-1/2 más un inhibidor de MASP-3). En otras modalidades, los métodos de la invención comprenden la co-administración de composiciones separadas que comprenden un inhibidor dual y un solo inhibidor.

En algunas modalidades, las composiciones comprenden una combinación de un agente inhibidor biespecifico más un solo agente inhibidor (es decir, un inhibidor biespecifico de MASP-2/3 más un inhibidor de MASP-1, un inhibidor biespecifico de MASP-1/3 además de un inhibidor de MASP-2; o un inhibidor biespecifico de MASP-1/2 más un inhibidor de MASP-3). En otras modalidades, los métodos de la invención comprenden la co-administración de composiciones separadas que comprenden un inhibidor biespecifico y un solo inhibidor.

De acuerdo con diversas modalidades de la invención, se observa que agentes los inhibidores de MASP-3 y/o los agentes inhibidores de MASP-2 y/o los agentes inhibidores de MASP-1 se usarían para limpiar la proteína objetivo del plasma en comparación con un anticuerpo de C5 que debe localizarse hacia el sitio de acción.

V. ANTICUERPOS DE MASP En algunas modalidades de este aspecto de la invención, el agente inhibidor de MASP comprende un anticuerpo de MASP (por ejemplo, anticuerpo de un MASP-1, MASP-2 o MASP-3) que inhibe al menos una de las vías de activación del complemento de LEA-1 y/o LEA-2. Los anticuerpos de MASP útiles en este aspecto de la invención incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales o anticuerpos recombinantes derivados de cualquier mamífero productor de anticuerpos y pueden ser multiespecífíeos (es decir, biespecíficos o triespecificos), quiméricos, humanizados, completamente humanos, anti idiotipos, y fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab) 2, F(ab') 2, fragmentos de Fv, fragmentos de scFv y anticuerpos de cadena única como se describe adicionalmente en el presente documento.

Los anticuerpos de MASP pueden ser examinados para la capacidad de inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de LEA-1 o LEA-2 usando los ensayos descritos en el presente documento. Varios anticuerpos de MASP-1, MASP-2 y MASP-3 han sido descritos en la literatura y algunos han sido recién generados, algunos de los cuales se enumeran a continuación en la Tabla 3. Estos anticuerpos ejemplares de MASP pueden ser examinados para la capacidad de inhibir el sistema de activación del complemento dependiente de LEA-1 y/o LEA-2 usando los ensayos descritos en el presente documento. Por ejemplo, como se describe en los Ejemplos 11-13 de este documento, los anticuerpos Fab2 de MASP-2 anti-rata se han identificado porque bloquean la activación del complemento dependiente de MASP-2. Como se describe adicionalmente en el Ejemplo 14, los anticuerpos scFv de MASP-2 completamente humanos se han identificado porque bloquean la activación del complemento dependiente de MASP-2. Como se describe adicionalmente en el Ejemplo 15, se han generado anticuerpos de MASP-3. Una vez que un anticuerpo MASP se identifica porque funciona como un inhibidor de LEA-1 o LEA-2, se pueden utilizar en una composición farmacéutica como se describe en el presente documento, y también se pueden utilizar para generar agentes inhibidores biespecificos y triespecificos, como se establece en TABLA 2 y se describe adicionalmente en este documento (véase, por ejemplo, el Ejemplo 8).

TABLA 3: ANTICUERPOS ESPECÍFICOS DE MASP-1, MASP-2 Y MASP-3 - ¡ - - - — i - ID LD O in <N g invención, los anticuerpos de MASP descritos en este documento han reducido la función efectora con el fin de reducir la inflamación que puede derivarse de la activación de la vía clásica del complemento. La capacidad de las moléculas de IgG para activar la vía clásica del complemento ha demostrado que reside dentro de la porción Fe de la molécula (Duncan, AR, et al, Nature 332:738 740 (1988)). Las moléculas de IgG en las que la porción Fe de la molécula se ha eliminado por escisión enzimática carecen de esta función efectora (véase Harlow, Antibodies : A Labora tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988). Por consiguiente, los anticuerpos con la función efectora reducida pueden ser generados como resultado de que carecen de la porción Fe de la molécula por tener una secuencia de Fe de ingeniería genética que minimiza la función efectora, o por ser cualquiera de IgG2 humana o IgG4 de isotipo.

Los anticuerpos con la función efectora reducida pueden ser producidos por manipulación biológica molecular estándar de la porción Fe de las cadenas pesadas de IgG como se describe en Jolliffe et al., Int 'l Rev. Immunol . 10: 241 250, (1993), y Rodrigues et al, J. Immunol . 151: 6954 6961, (1998). Los anticuerpos con la función efectora reducida también incluyen isotipos IgG2 e IgG4 humanos que tienen una capacidad reducida para activar el complemento y/o interactuar con los receptores de Fe (Ravetch, JV, et al, Annu Rev. Immunol 9:457492, (1991); Isaacs, JD, et al, J. Immunol 148: 30623071, 1992; van de Winkel, JG, et al, Immunol Today 14:215 221, (1993)). Los anticuerpos humanizados o completamente humanos específicos para MASP-1, MASP-2 o MASP-3 humano (incluyendo anticuerpos duales, pan, biespecíficos o triespecíficos) compuestos de isotipos IgG2 o IgG4 pueden ser producidos por uno de varios métodos conocidos por un experto ordinario en la téenica, como se describe en Vaughan, TJ, et al, Nature Biotechnical 16:535 539, (1998). 11. Producción de anticuerpos de MASP Los anticuerpos de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 pueden producirse usando polipéptidos de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 (por ejemplo, MASP-1, MASP-1 o MASP-3 de longitud completa) o utilizando péptidos que llevan epitopos antigénicos de MASP-1, 2 ó 3 (por ejemplo, una porción del polipéptido de MASP-2). Los péptidos inmunogénicos pueden ser tan pequeños como cinco residuos de aminoácidos. Por ejemplo, el polipéptido de MASP-2 que incluye la secuencia entera de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 se puede utilizar para inducir anticuerpos de MASP 2 útiles en el método de la invención. Los dominios particulares de MASP que se sabe están involucrados en las interacciones proteina-proteina, tales como los dominios CUBI y CUBI-EGF, asi como la región que abarca el sitio activo de la serina proteasa, por ejemplo, como se exponen en la Tabla 2, se pueden expresar como polipéptidos recombinantes usando métodos bien conocidos en la téenica y utilizarse como antigenos. Además, los péptidos que comprenden una porción de al menos 6 aminoácidos del polipéptido MASP-1 (SEQ ID NO: 10), o del polipéptido MASP-2 (SEQ ID NO: 5) o del polipéptido MASP-3 (SEQ ID NO: 8) son también útiles para inducir anticuerpos de MASP-1, MASP-2 o MASP-3, respectivamente. Los péptidos y polipéptidos de MASP utilizados para generar anticuerpos se pueden aislar como polipéptidos naturales o recombinantes o péptidos sintéticos y polipéptidos recombinantes catalíticamente inactivos. Los antígenos útiles para producir anticuerpos de MASP también incluyen polipéptidos de fusión, tales como fusiones de un polipéptido de MASP o una porción del mismo con un polipéptido de inmunoglobulina o con la proteína de unión a maltosa. El inmunógeno polipeptídico puede ser una molécula de longitud completa o una porción del mismo. Si la porción de polipéptido es tipo hapteno, tal porción puede ser unida o enlazada ventajosamente a un portador macromolecular (tal como hemocianina de lapa californiana (KLH por sus siglas en inglés), albúmina de suero bovino (BSA por sus siglas en inglés) o toxoide tetánico) para la inmunización. iii._ Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales contra MASP 1, MASP-2 o MASP-3 se pueden preparar mediante la inmunización de un animal con polipéptido de MASP 1, MASP-2 o MASP-3 o una porción inmunogénica de los mismos usando métodos bien conocidos por los expertos normales en la téenica. Véase, por ejemplo, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera" en Immunochemical Protocole (Manson, ed.). La inmunogenicidad de un polipéptido de MASP se puede aumentar mediante el uso de un adyuvante, incluyendo geles minerales, tales como hidróxido de aluminio o adyuvante de Freund (completo o incompleto), sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, emulsiones de aceite, KLH y dinitrofenol. Los anticuerpos policlonales son típicamente generados en animales tales como caballos, vacas, perros, pollos, ratas, ratones, conejos, cobayas, cabras, u ovejas. Alternativamente, un anticuerpo de MASP útil en la presente invención también puede derivarse de un primate subhumano. Las técnicas generales para generar anticuerpos diagnóstica y terapéuticamente útiles en babuinos pueden encontrarse, por ejemplo, en Goldenberg et al., Publicación de Patente Internacional N° WO 91/11465, y en Losman, MJ, et al., Int . J. Cáncer 46: 310, (1990). Los sueros que contienen anticuerpos inmunológicamente activos se produce a partir de la sangre de tales animales inmunizados usando procedimientos convencionales bien conocidos en la téenica. iv._ Anticuerpos Monoclonales En algunas modalidades, el agente inhibidor de LEA 2 es un anticuerpo monoclonal de MASP-2 y/o el agente inhibidor de LEA-1 es un anticuerpo monoclonal de MASP-3 o un anticuerpo monoclonal de MASP-1. Como se describió anteriormente, en algunas modalidades, los anticuerpos monoclonales de MASP-1, MASP-2 y MASP-3 son altamente específicos, estando dirigidos contra un único epítopo de MASP-1, MASP-2 o MASP-3. Como se usa aquí, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como el obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo mediante cualquier procedimiento particular. Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo, tales como el método del hibridoma descrito por Kohler, G., et al, Nature 256:495, (1975), o puede hacerse por métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente estadounidense No. 4,816,567 de Cabilly) . Los anticuerpos monoclonales también se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando las téenicas descritas en Clackson, T., et al, Na ture 352:624 628, (1991), y Marks, JD, et al, J. Mol . Biol . 222: 581 597, (1991). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante la inyección a un mamífero adecuado (por ejemplo, un ratón BALB/c) con una composición que comprende un polipéptido de MASP-1, un polipéptido de MASP-2 o un polipéptido de MASP-3, o parte del mismo. Después de un período de tiempo predeterminado, los esplenocitos se retiran del ratón y se suspenden en un medio de cultivo celular. Los esplenocitos se fusionan con una linea celular inmortal para formar un hibridoma. Los hibridomas formados se cultivan en cultivo celular y se seleccionan por su capacidad para producir un anticuerpo monoclonal contra MASP-1, MASP-2 o MASP-3. (Véase también Current Protocols in Immunology, vol.1, John Wilcy & Sons, páginas 2.5.1-2.6.7, 1991).

Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden obtener mediante el uso de ratones transgénicos que han sido diseñados para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a una estimulación antigénica. En esta téenica, los elementos del locus de la inmunoglobulina humana de cadena pesada y ligera se introducen en cepas de ratones derivadas de lineas de células madre embrionarias que contienen interrupciones de los locus de inmunoglobulina endógena de cadena pesada y la cadena ligera objetivo. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos humanos, tales como los antigenos de MASP-2 descritos en este documento, y los ratones pueden ser utilizados para producir hibridomas secretores de anticuerpo de MASP-2 mediante la fusión de células B de dichos animales a las líneas celulares de mieloma adecuadas utilizando tecnología convencional de Kohler-Milstein. Los métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos se describen, por ejemplo, por Green, LL, et al., Nature Genet . 07:13, 1994; Lonberg, N., et al, Nature 368:.856, 1994; y Taylor, L. D., et al., Int . Immun . 6: 579, 1994.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados y purificados de cultivos de hibridoma mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Tales técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con sefarosa de proteína A, cromatografía de exclusión por tamaño, y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.12.7.12 y páginas 2.9.12.9.3;. Baines et al, " Purification of Immunoglobulin G (IgG) "en Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., vol. 10, páginas 79-104, 1992).

Una vez producidos, los anticuerpos monoclonales policlonales, o derivados de fago, se prueban en primer lugar para la unión específica de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 o, cuando se desee, la unión dual de MASP-1/3, MASP-2/3 o MASP-1/2. Los métodos para determinar si un anticuerpo se une a un antígeno de proteína y/o la afinidad de un anticuerpo a un antígeno de proteína son conocidos en la téenica. Por ejemplo, la unión de un anticuerpo a un antígeno de proteína se puede detectar y/o cuantificar usando una variedad de técnicas tales como, pero no limitadas a, inmunoblot, do t blot, método de resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, el sistema BIAcore; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, NJ), o ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA por sus siglas en inglés). Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) " Antibodies : A Laboratory Manual" Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY; Benny KC Lo (2004) "Antibody Engineering: Methods and Protocole", Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) " Antibody Engineerin , A Practical Guide" WH Freeman and Co., NY; Borrebaek (1995) "Antibody Engineering", 2a edición, Oxford University Press, Nueva York, Oxford; Johne et al. (1993), Immunol . Meth . 160: 191-198; Jonsson et al. (1993) Ann . Biol . Clin . 51: 19-26; y Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627. Véase también, la patente estadounidense N° 6,355,245.

La afinidad de anticuerpos monoclonales de MASP se puede determinar fácilmente por un experto normal en la téenica (véase, por ejemplo, Scatchard, A., NY Acad Sci 51:660 672, 1949). En una modalidad, los anticuerpos monoclonales de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 útiles para los métodos de la invención se unen a MASP-1, MASP-2, o MASP-3 con una afinidad de unión de <100 nM, preferiblemente <10 nM y lo más preferiblemente <2 nM.

Una vez que se identifican los anticuerpos que se unen específicamente a MASP-1, MASP-2 o MASP-3, los anticuerpos de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 se ensayan para la capacidad de funcionar como un agente inhibidor de LEA-1 o un agente inhibidor de LEA -2 en uno de varios ensayos funcionales, por ejemplo como se describe en la Tabla 2. Por ejemplo, los anticuerpos identificados que se unen específicamente a MASP-2 se ensayan para la capacidad de funcionar como un agente inhibidor de LEA-2 en uno de varios ensayos, tal como, por ejemplo, como se describe en la TABLA 2 (por ejemplo, un ensayo de escisión de C4 específico de lectina (tal como el ensayo descrito en el Ejemplo 8 o el Ejemplo 9), o un ensayo de deposición de C3b (tal como el ensayo descrito en el Ejemplo 4 o ejemplo 11)). Como un ejemplo adicional, los anticuerpos identificados que se unen específicamente a MASP-1 o MASP-3 se ensayan para la capacidad de funcionar como un agente inhibidor de LEA-1 en uno de varios ensayos, tales como, por ejemplo, como se describe en la TABLA 2 (por ejemplo, la reducción de la hemolisis, medida, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 5, o la reducción de la escisión de C3 y la deposición de C3b, medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4 y el Ejemplo 11). v. Anticuerpos Quimericos/Humanizados Los anticuerpos monoclonales útiles en el método de la invención incluyen anticuerpos quiméricos en los que una porción de cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase de anticuerpo particular o subclase, mientras el resto de la cadena es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo, asi como fragmentos de tales anticuerpos (patente estadounidense No. 4,816,567, de Cabilly; y Morrison, SL, et al, Proc Nat 'l Acad Sci USA 81:6851-6855, (1984)).

Una forma de un anticuerpo quimérico útil en la invención es un anticuerpo monoclonal humanizado de MASP-1, MASP-2 o MASP-3. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos monoclonales humanizados se producen mediante la transferencia de la regiones determinantes de complementariedad (CDR por sus siglas en inglés) no humana (por ejemplo, ratón), de las cadenas pesadas y ligeras variables de la inmunoglobulina de ratón a un dominio variable humano. Típicamente, los residuos de anticuerpos humanos son después sustituidos en las regiones marco de las contrapartes no humanas. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los que todos o sustancialmente todos los lazos hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco de Fv son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones, PT, et al, Nature 321:522 525, (1986);. Reichmann, L., et al, Nature 332:323-329, (1988); y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2: 593596, (1992).

Los anticuerpos humanizados útiles en la invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos que incluyen al menos un MASP-1, MASP-2 o MASP-3 de unión a la región CDR3. Además, las porciones de Fe pueden ser sustituidas para producir IgA o IgM, así como anticuerpos IgG humanos. Tales anticuerpos humanizados tendrán una utilidad particular clínica, porque reconocen específicamente MASP-1, MASP MASP-2 o 3 humanos pero no evocan una respuesta inmune en los seres humanos contra el propio anticuerpo. En consecuencia, son más adecuados para la administración in vivo en seres humanos, especialmente cuando la administración repetida o a largo plazo es necesaria.

Las téenicas para producir anticuerpos monoclonales humanizados se describen también, por ejemplo, por Jones, PT, et al, Nature 321:522, (1986); Cárter, P., et al., Proc. Nal . Acad. Ciencia . USA 89: 4285, (1992); Sandhu, J.S., Crít . Rev. Biotech. 12: 437, (1992); Singer, I.I., et al., J. Immun. 150: 2844, (1993); Sudhir, Antibody Engineering Protocole, Humana Press, Inc., (1995) (ed.); Kellcy, " Engineering Therapeutic Antibodies", en Protein Engineering: Principies and Paractice, Cleland et al. (eds.), John iley & Sons, Inc., páginas 399-434, (1996); y por la patente de Estados Unidos número 5,693,762, de Queen, 1997. Además, hay entidades comerciales que sintetizan los anticuerpos humanizados de las regiones de anticuerpos específicos murinos, tales como Protein Design Labs (Mountain View, CA). vi. Anticuerpos Recombinantes Los anticuerpos de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 también se pueden hacer usando métodos recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos humanos se pueden hacer usando bibliotecas de expresión de inmunoglobulina humana (disponibles por ejemplo, de Stratagene , Corp. , La Jolla, CA) para producir fragmentos de anticuerpos humanos (VH, VL, Fv, factor D, Fab o F(ab')2). Estos fragmentos se utilizan después para construir anticuerpos humanos completos utilizando téenicas similares a aquellas para producir anticuerpos quiméricos.

Anticuerpos anti-idiotipo Una vez que los anticuerpos de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 se identifican con la actividad inhibidora que se desea, estos anticuerpos pueden utilizarse para generar anticuerpos anti-idiotipo que se asemejan a una parte de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 utilizando téenicas que son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Greenspan, NS, et al, FASEB J. 7:437, (1993). Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a MASP-2 inhiben competitivamente la interacción de una proteina de MASP-2 necesaria para la activación del complemento que se puede utilizar para generar anti-idiotipos que se asemejan al sitio de unión a MBL en proteínas MASP-2 y, por tanto, unirse a y neutralizar un ligando de unión de MASP-2 tal como, por ejemplo, MBL. viii._ Fragmentos de Inmunoglobulina Los agentes inhibidores de MASP-2 y MASP-3 útiles en el método de la invención abarcan no sólo las moléculas de inmunoglobulina intactas, sino también los fragmentos bien conocidos que incluyen Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2 y fragmentos de Fv, fragmentos de scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de cadena única y anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, biespecificos y triespecificos) formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

Es bien conocido en la téenica que sólo una pequeña porción de una molécula de anticuerpo, el paratopo, está implicada en la unión del anticuerpo a su epitopo (véase, por ejemplo, Clark, WR, The Experimental Foundations of Modern Immunology, Wilcy & Sons, Inc., Nueva York, 1986). Las regiones pFc' y Fe del anticuerpo son efectores de la vía clásica del complemento, pero no participan en la unión al antigeno. Un anticuerpo del que la región pFc' se ha escindido enzimáticamente, o que ha sido producido sin la región pFc', se designa un fragmento de F(ab')2 y retiene ambos sitios de unión al antigeno de un anticuerpo intactos. Un fragmento de F(ab')2 aislado se denomina como un fragmento monoclonal bivalente debido a sus dos sitios de unión a antigeno. De manera similar, un anticuerpo del que la región Fe se ha escindido enzimáticamente, o que ha sido producido sin la región Fe, se designa un fragmento de Fab, y conserva uno de los sitios de una molécula de anticuerpo de unión a antigeno intacto.

Los fragmentos de anticuerpos se pueden obtener por hidrólisis proteolitica, tal como por digestión con pepsina o papaina de anticuerpos completos por métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden ser producidos por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento de 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes de 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de escisión se puede realizar usando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la escisión de enlaces disulfuro. Como una alternativa, una escisión enzimática usando pepsina produce directamente dos fragmentos monovalentes de Fab y un fragmento Fe. Estos métodos se describen, por ejemplo, la Patente estadounidense No. 4,331,647 de Goldenberg; Nisonoff, A., et al., Arch . Biochem. Biophys. 89: 230, (1960); Porter, R. R., Biochem. J. 73:119, (1959); Edelman, et. al., en Methods in Enzymology 1:422, Academic Press, (1967); y por Coligan en las páginas 2.8.12.8.10 y 2.10.-2.10.4.

En algunas modalidades, se prefiere el uso de fragmentos de anticuerpos que carecen de la región Fe para evitar la activación de la vía clásica del complemento que se inicia tras la unión de Fe al receptor Fe g. Hay varios métodos por los cuales se puede producir un anticuerpo monoclonal que evitan la interacción del receptor Fcy. Por ejemplo, la región Fe de un anticuerpo monoclonal se puede eliminar químicamente usando la digestión parcial por las enzimas proteolíticas (tales como la digestión de la ficina), generando de este modo, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos de unión a antígenos tales como fragmentos de Fab o F(ab)2 (Mariani, M., et al., Mol . Immunol . 28:6971, (1991)). Alternativamente, el isotipo humano IgG g4, que no se une a los receptores Fcy, se puede utilizar durante la construcción de un anticuerpo humanizado como se describe aquí. Los anticuerpos, anticuerpos de cadena simple y dominios de unión a antigeno que carecen del dominio Fe también pueden modificarse por ingeniería genética usando las téenicas recombinantes descritas en este documento. íx. Fragmentos de anticuerpos de cadena única Alternativamente, se puede crear moléculas de unión a cadena peptídica específicas para MASP-1, MASP MASP-2 o 3 en las que se conectan las regiones de unión de Fv de cadena pesada y ligera. Los fragmentos de Fv pueden estar conectados por un enlazador peptídico para formar una proteína de unión a antígeno de cadena única (scFv). Estas proteínas de unión a antígeno de cadena única se preparan construyendo un gen estructural que comprende secuencias de ADN que codifican los dominios VH y VL que están conectados por un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que se introduce posteriormente en una célula huésped, tal como E. coli. Las células huésped recombinantes sintetizan una única cadena polipeptidica con un péptido conector de puente de los dos dominios V. Los métodos para producir scFv se describen, por ejemplo, por Whitlow, et al, "Methods : A Companion to Methods ín Enzymology" 2:97, (1991); Bird, et al, Science 242:423, (1988); Patente estadounidense No. 4,946,778, a Ladner;. Pack, P., et al, Bio/Technology 11:1271, (1993).

Como un ejemplo ilustrativo, un scFv especifico de MASP-3 se puede conseguir mediante la exposición de linfocitos a polipéptido de MASP-3 in vitro y la selección de bibliotecas de presentación de anticuerpos en fagos o vectores similares (por ejemplo, mediante el uso de de proteínas o péptido de MASP-3 inmovilizadas o marcadas). Los genes que codifican polipéptidos que tienen dominios de unión potencial de polipéptidos de MASP-3 se pueden obtener mediante el cribado de bibliotecas de péptidos aleatorios en fagos o en bacterias tales como E. coli. Estas bibliotecas de presentación de péptidos aleatorios pueden ser utilizadas para la detección de péptidos que interactúan con MASP-3. Las téenicas para crear y rastrear tales bibliotecas de presentación de péptidos aleatorios son bien conocidas en la técnica (Patente estadounidense No. 5,223, 09, a Lardner; Patente estadounidense No. 4,946,778, a Ladner; Patente estadounidense No. 5,403,484, a Lardner; Patente estadounidense No.5,571,698, a Lardner, y Kay et al, Phage Display of Peptides and Proteins, Academic Press, Inc., 1996) y las bibliotecas de presentación de péptidos aleatorios y kits para la detección. Tales bibliotecas están disponibles comercialmente, por ejemplo de Clontech Laboratories , Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA.), y Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ).

Otra forma de un fragmento de anticuerpo de MASP-3 útil en este aspecto de la invención es un péptido que codifica una sola región determinante de la complementariedad (CDR) que se une a un epitopo en un antigeno de MASP-3 e inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-3 (es decir, LEA -1). Otra forma de un fragmento de anticuerpo de MASP-1 útil en este aspecto de la invención es un péptido que codifica una sola región determinante de la complementariedad (CDR) que se une a un epitopo en un antigenode MASP-1 e inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-3 (es decir, LEA -1). Otra forma de un fragmento de anticuerpo de MASP-2 útil en este aspecto de la invención es un péptido que codifica una sola región determinante de la complementariedad (CDR) que se une a un epitopo en un antigeno de MASP-2 e inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2 (es decir, LEA -2).

Los péptidos de CDR ("unidades mínimas de reconocimiento") pueden obtenerse construyendo genes que codifican el CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable a partir del ARN de células productoras de anticuerpos (ver, por ejemplo, Larrick y otros, Methods : . A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991); Courtenay Luck, " Genetic Manípula tíon of Monoclonal ñntibodies , " en Monoclonal Antibodies : Production , Engineering and Clinical Application, Ritter et. al., (eds), página 166, Cambridge University Press, (1995) y Ward et al, " Genetic Manípula tíon and Exoression of Antibodies” , en Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch et. al., (eds.), página 137, Wilcy Liss, Inc., 1995).

Los anticuerpos de MASP descritos en este documento se administran a un sujeto en necesidad de los mismos para inhibir LEA-1, LEA-2 o una combinación de la activación del complemento de LEA-1 y LEA -2. En algunas modalidades, el agente inhibidor de MASP es un anticuerpo monoclonal de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 de alta afinidad humana o humanizado con función efectora reducida.

Anticuerpos Biespecíficos Los agentes inhibidores de MASP-2 y MASP-3 útiles en el método de la invención abarcan los anticuerpos multiespecificos (es decir, biespecífíeos y triespecífíeos). Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, preferiblemente anticuerpos humanos o humanizados, que tienen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Como se ha descrito anteriormente y se muestra en la Tabla 2, en una modalidad, el método comprende el uso de un anticuerpo biespecífico que comprende una especificidad de unión para MASP-2 (por ejemplo, la unión a al menos uno de CCP1-CCP2 o dominio de serina proteasa de MASP-2) y una especificidad de unión para MASP-3 (por ejemplo, unión al dominio de serina proteasa de MASP-3). En otra modalidad, el método comprende el uso de un anticuerpo biespecífico que comprende una especificidad de unión para MASP-1 (por ejemplo, unión al dominio de serina proteasa de MASP-1) y una especificidad de unión para MASP-2 (por ejemplo, la unión a al menos uno de CCP1-CCP2 o dominio de serina proteasa de MASP-2). En otra modalidad, el método comprende el uso de un anticuerpo biespecífico que comprende una especificidad de unión para MASP-1 (por ejemplo, unión al dominio de serina proteasa de MASP-1) y una especificidad de unión para MASP-3 (por ejemplo, la unión a la serina dominio de proteasa de MASP-3). En otra modalidad, el método comprende el uso de un anticuerpo triespecífico que comprende una especificidad de unión para MASP-l (por ejemplo, unión al dominio de serina proteasa de MASP-l), una especificidad de unión para MASP-2 (por ejemplo, la unión a al menos uno de CCP1-CCP2 o dominio de serina proteasa de MASP-2) y una especificidad de unión para MASP-3 (por ejemplo, unión al dominio de serina proteasa de MASP-3).

Los métodos para preparar anticuerpos biespecificos están dentro del alcance de los expertos en la téenica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecificos se basa en la coexpresión de dos pares de inmunoglobulina de cadena pesada/cadena ligera, en donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature 305: 537-539 (1983)). Los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antigeno) pueden fusionarse con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo al menos parte de las regiones bisagra, CH2, y CH3. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Para más detalles de los métodos ilustrativos actualmente conocidos para la generación de anticuerpos biespecificos véase, por ejemplo, Suresh et al, Methods in Enzymology 121:210 (1986); WO96/27011; Brennan et al, Science 229: 81 (1985); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992); Kostelny et al., J. Immunol . 148 (5): 1547-1553 (1992); Hollinger et al. Proc. Nati . Acad. Sci U. S. A. 90:6444-6448 (1993); Gruber et al., J. Immunol . 152: 5368 (1994); y Tutt et al., J. Immunol . 147: 60(1991). Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulados o heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la téenica, y se describen en la patente estadounidense No.4,676,980, junto con una serie de técnicas de reticulación.

También se han descrito diversas técnicas para fabricar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecificos directamente de cultivos de células recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos han sido producidos usando cremalleras de leucina. (Véase, por ejemplo, Kostelny et al J. Immunol 148 (5):1547-1553 (1992)). La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati . Acad. Sci U. S.A. 90: 6444-6448 (1993), ha proporcionado un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecificos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a emparejarse con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando así dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos biespecificos, a diferencia de los anticuerpos biespecificos enteros, también pueden ser particularmente útiles porque pueden construirse y expresarse fácilmente en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como fragmentos de anticuerpos) de especificidades de unión apropiadas pueden seleccionarse fácilmente usando la presentación en fagos (WO94/13804) de bibliotecas. Si un camino del diacuerpo debe mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno X, entonces puede hacerse una biblioteca en la que el otro camino es variado y un anticuerpo seleccionado de especificidad apropiada.

También se ha reportado otra estrategia para fabricar fragmentos de anticuerpos biespecificos mediante el uso de dímeros de cadena única Fv (scFv). (Véase, por ejemplo, Gruber et al J. Immunol . , 152:5368 (1994)). Alternativamente, los anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" como se describe en, por ejemplo, Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995). Descrito brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos tándem de Factor D (VH-CHI-VH-CHI) que forman un par de regiones de unión a antigeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecificos o monoespecificos. Los métodos de la invención también abarcan el uso de formas variantes de anticuerpos biespecificos tales como las moléculas tetravalentes de de inmunoglobulina de dominio dual variable (DVD-Ig) descritos en Wu et al, Wat Biotechnol 25:1290-1297 (2007). Las moléculas de DVD-Ig están diseñadas de tal manera que dos dominios variables de cadena ligera diferentes (VL) de dos anticuerpos principales diferentes son unidos en tándem directamente o mediante un enlazador corto por téenicas de ADN recombinante, seguido por el dominio constante de cadena ligera. Los métodos para generar moléculas de DVD-Ig a partir de dos anticuerpos principales se describen adicionalmente en, por ejemplo, W008/024188 y W007/024715, las descripciones de cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

VI. INHIBIDORES NO PEPTÍDICOS En algunas modalidades, el agente inhibidor de MASP-3 o MASP-2 es un péptido inhibidor de MASP-3, MASP-2 o MASP-1, o un inhibidor no peptpidico de MASP-3, o de MASP-2 o de MASP-1. Los agentes inhibidores no peptidicos de MASP se pueden administrar al sujeto sistémicamente, tal como mediante administración intra-arterial, intravenosa, intramuscular, subcutánea u otra administración parenteral, o por administración oral. El agente inhibidor de MASP se puede administrar periódicamente durante un periodo extendido de tiempo para el tratamiento o control de una condición crónica, o puede ser por administración única o repetida en el periodo antes, durante o después de un traumatismo o lesión aguda.

VI. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN Dosificación En otro aspecto, la invención proporciona composiciones para inhibir los efectos adversos de la activación del complemento dependiente de MASP-3 en un sujeto que padece de una enfermedad hemolitica, tal como la HPN, comprendiendo la administración al sujeto de una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-3 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente de MASP-3 y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, el método comprende, además, la administración de una composición que comprende un agente inhibidor de MASP-2. Los agentes inhibidores de MASP-3 y MASP-2 se pueden administrar a un sujeto en necesidad de los mismos, a dosificaciones terapéuticamente eficaces para tratar o aminorar las condiciones asociadas con la activación del complemento dependiente de MASP-3 (LEA-1), y opcionalmente también la activación del complemento dependiente de MASP-2 (LEA-2). Una dosificación terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad del agente inhibidor de MASP-3, o una combinación de un agente inhibidor de MASP-3, y un agente inhibidor de MASP-2 suificiente para resultar en la disminución de los síntomas de la condición.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de los agentes inhibidors de MASP-3 y MASP-2 pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándares que usan modelos animales experimentales. Con el uso de dichos modelos animales, el nivel de efecto no adverso observado (NOAEL por sus siglas en inglés) y la dosificación mínimamente eficaz (MED por sus siglas en dosis), se pueden determinar usando métodos estándares. La relación de la dosificación entre los efectos de NOAEL y MED es la relación terapéutica, que se expresa como la relación NOAEL/MED. Los agentes inhibidores de MASP-3 y los agentes inhibidores de MASP-2 que muestran grandes relaciones o indices terapéuticos son los que más se prefieren. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios animales se pueden usar para la formulación de un rango de dosis para su uso en humanos. La dosis del agente inhibidor de MASP-3 y el agente inhibidor de MASP-2 yace preferentemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la MED con muy poca o nada de toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiente de la forma de dosificación y la vía de administración usadas.

Para cualquiera formulación compuesta, la dosificación terapéuticamente eficaz puede ser calculada usando modelos animales. Por ejemplo, una dosis se puede formular en un modelo animal para lograr un rango de concentración plasmática circulante que incluye la MED. Los niveles cuantitativos del agente inhibidor de MASP-3 o el agente inhibidor de MASP-2 en el plasma también se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento.

Además de los estudios de toxicidad, la dosificación eficaz también se puede calcular con base en la cantidad de proteina de MASP objetivo presente en un sujeto vivo y la afinidad de unión del agente inhibidor de MASP-3 o MASP-2.

Se ha reportado que los niveles de MASP-1 en los sujetos humanos normales está prsente en el suero en niveles en el rango de 1.48 a 12.83 mg/rnL (Terai I. et al, Clin Exp Immunol 110:317-323 (1997); Theil et al., Clin. Exp. Immunol. 169:38 (2012)). Las concentraciones séricas medias de MASP-3 en los sujetos humanos normales se han reportado estar en el rango de aproximadamente 2.0 a 12.9 pg/rnL (Skjoedt M et al., Immunobiology 215(11):921-31 (2010); Degn et al., J. Immunol Methods, 361-37 (2010); Csuka et al., Mol . Immunol . 54:271 (2013). Se ha demostrado que los niveles de MASP-2 en sujetos humanos normales está presente en el suero en niveles bajos en el rango de 500 ng/mL, y los niveles de MASP-2 en un sujeto particular se pueden determinar usando un ensayo cuantitativo para MASP-2 descrito en Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol . Methods 282·.159-167 (2003) and Csuka et al., Mol . Immunol . 54:271 (2013).

Generalmente, la dosificación de las composiciones adminsitradas que comprenden agentes inhibidores de MASP-3 o agentes inhibidores de MASP-2 varia dependiendo de factores tales como la edad del sujeto, el peso, la altura, el sexo, la condición médica general, y el historial médico previo. Como una ilustración, los agentes inhibidores de MASP-3 o los agentes inhibidores de MASP-2 (tales como anticuerpos de MASP-3, anticuerpos de MASP-2 o anticuerpos de MASP-2), se pueden administrar en rangos de dosificación desde aproximadamente 0.0010 a 100.00 mg/kg, preferentemente de 0.010 a 10 mg/kg, preferentmente de 0.010 a 1.0 mg/kg, más preferentemente de 0.010 a 0.1 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modaldiades, los agentes inhibidores de MASP-2 (tales como los anticuerpos de MASP-2) se administran en rangos de dosificación desde aproximadamente preferentemente 0.010 a 10 mg/kg, preferentemente de 0.010 a 1.0 mg/kg, más preferentemente de 0.010 a 0.1 mg/kg del peso corporal del sujeto. En algunas modalidades, los agentes inhibidores de MASP-1 (tales como anticuerpos de MASP-1) o los agentes inhibidores de MASP-3 (tales como anticuerpos de MASP-3), se administran en rangos de dosificación desde aproximadamente 0.010 a 100.0 mg/kg, preferentemente 0.010 a 10 mg/kg, preferentemente 0.010 a 1.0 mg/kg, más preferentemente 0.010 a 0.1 mg/kg del peso corporal del sujeto.

La eficacia terapéutica de las composiciones inhibidoras de MASP-3, opcionalmente en combinación con las composiciones inhibidoras de MASP-2, o de las composiciones inhibidoras de MASP-1, opcionalmente en combinacióncon las composiciones inhibidoras de MASP-2, y los métodos de la presente invención en un sujeto dado, y las dosificaciones apropiadas, se puede determinar de acuerdo con los ensayos de complemento bien conocidos para los expertos en la téenica. El complemento genera numerosos productos específicos. Durante la última década, se han desarrollado ensayos sensibles y específicos y están disponibles comercialmente para la mayoría de estos productos de activación, incluyendo los pequeños fragmentos de activación C3a, C4a y C5a, y los grandes fragmentos de activación iC3b, C4d, Bb y sC5b-9. La mayoría de estos ensayos utilizan anticuerpos monoclonales que reaccionan con nuevos antígenos (neoantígenos) expuestos en el fragmento, pero no en las proteínas nativas de las que están formados, vovliendo estos ensayos muy simples y específicos. La mayoría se basan en la tecnología de ELISA, aunque el radioinmunoensayo se usa aún algunas veces para C3a y C5a. Estos últimos ensayos miden tanto los fragmentos no procesados como sus fragmentos 'desArg', que son las principales formas encontradas en la circulación. Los fragmentos no procesados y C5adesArg son depurados rápidamente por la unión a los receptores de la superficie celular y por lo tanto están presentes en muy bajas concentraciones, mientras que C3adeSArg no se une a las células y se acumula en el plasma. La medición de C3a proporciona un indicador sensible, independiente de la via, de la activación del complemento. La activación de la via alternativa se puede evaluar midiendo el fragmento de Bb y/o midiendo la activación del factor D. la detección del producto de fase fluida de la activación de la vía de ataque a la membrana, sC5b-9, proporciona evidencia de que el complemento está siendo activado a su terminación. Debido a que tanto la vía de las lectinas como la vía clásica generan los mismos productos de activación, C4a y C4d, la medición de estos dos fragmentos no proporciona información alguna sobre cuál de estas dos vías ha generado los productos de activación.

La inhibición de la activación del complemento dependiente d eMASP-3 está caracterizada por al menos uno de los siguientes cambios en un componente del sistema del complemento que sucede como resultado de la administración de un agente inhibidor de MASP-3 de conformidad con los métodos de la invención: la inhibición de la activación del complemento mediada por LEA-1 (inhibición de la hemolisis y la opsonización); la inhibición de la escisión específica de sustrato de la serina proteasa de MASP-3, la reducción de la hemolisis (medida, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 5) o la reducción de la escisión de C3 y la deposición de C3b (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4 o el Ejemplo 11).

La inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-2 está caracterizada por al menos uno de los siguientes cambios en un componente del sistema del complemento que sucede como resultado de la administración de un agente inhibidor de MASP-2 de conformidad con los métodos de la invención: la inhibición de la generación o producción de los productos del sistema de activación del complemento dependiente de MASP-2 C4b, C3a, C5a y/o C5b-9 (MAC) (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 2 de la patente estadounidense No.7,919,094), la reducción de la escisión de C4 y la deposición de C4b (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 8 o el Ejemplo 9), o la reducción de la escisión de C3 y la deposición de C3b (medida, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 11). i. Portadores farmacéuticos y vehículos de administración En general, las composiciones de agentes inhibidores de MASP-3 y las composiciones de agentes inhibidores de MASP-2 de la presente invención, o las composiciones que comprenden una combinación de agentes inhibidores de MASP-2 y MASP-3, se pueden combinar con otros agentes terapéuticos seleccionados, son adecuadamente contenidas en un portador farmacéuticamente aceptable. El portador es no tóxico, biocompatible y se selecciona a fin de no afectar perjudicialmente a la actividad biológica del agente inhibidor de MASP-3 o el agente inhibidor de MASP-2 (con los mismos y cualesquiera otros agentes terapéuticos combinados). Ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables para los péptidos se describen en la Patente estadounidense No. 5,211,657 de Yamada. Los anticuerpos de MASP útiles en la invención, como se describe en el presente documento, se pueden formular en preparaciones en forma sólida, semi sólida, de gel, de liquido o formas gaseosas tales como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, depositarios inyecciones, inhalantes y que permitan administración oral, parenteral o quirúrgica. La invención también contempla la administración local de las composiciones mediante recubrimiento de dispositivos médicos y similares.

Los portadores adecuados para administración parenteral a través de administración inyectable, de infusión o irrigación y tópica incluyen agua, solución salina tamponada con fosfato fisiológico normal destilada o soluciones de lactato de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank, o propanodiol. Además, los aceites fijos estériles pueden ser empleados como un medio disolvente o de suspensión. Para este propósito cualquier aceite biocompatible puede ser empleado incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, los ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran uso en la preparación de inyectables. El portador y el agente se pueden componer como un liquido, suspensión, gel polimerizable o no polimerizable, pasta o pomada.

El portador también puede comprender un vehículo de administración para sostener (es decir, extender, retrasar o regular) la administración del(los) agente(s) o para mejorar la administración, la captación, la estabilidad o la farmacocinética del(los) agente (s) terapéutico (s). Tal vehículo de administración puede incluir, a modo de ejemplo no limitativo, micropartículas, microesferas, nanoesferas o nanopartículas compuestas por proteínas, liposomas, hidratos de carbono, compuestos orgánicos sintéticos, compuestos inorgánicos, hidrogeles poliméricos o copoliméricos y micelas poliméricas. Los sistemas de administración de hidrogel y de micelas adecuados incluyen los copolímeros de PEO:PHB:PEO y complejos de copolímero/ciclodextrina descritos en el documento WO 2004/009664 A2 y los complejos de PEO y PEO/ciclodextrina descritos en la Solicitud de Patente estadounidense No. de publicación 2002/0019369 Al. Tales hidrogeles se pueden inyectar localmente en el sitio de acción deseado, o por vía subcutánea o intramuscular para formar un depósito de liberación sostenida.

Las composiciones de la presente invención pueden formularse para la administración vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial o como un inhalante.

Para la administración intraarticular, el agente inhibidor de MASP-3 o el agente inhibidor de MASP-2 podrán transportarse en los portadores líquidos o en gel anteriormente descritos que son inyectables, en los vehículos anteriormente descritos de liberación sostenida que son inyectables, o en un derivado de ácido hialurónico o de ácido hialurónico.

Para la administración oral de agentes no peptidérgicos, el agente inhibidor de MASP-3 o el agente inhibidor de MASP-2 pueden ser transportados en un relleno o diluyente inerte tal como sacarosa, almidón de maíz, o celulosa.

Para la administración tópica, el agente inhibidor de MASP-3 o el agente inhibidor MASP-2 pueden transportarse en forma de ungüento, loción, crema, gel, gota, supositorio, aerosol, líquido o en polvo, o en sistemas de administración microcapsulares o en gel mediante un parche transdérmico.

Varios sistemas de administración nasal y pulmonar, incluyendo aerosoles, inhaladores de dosis medida, inhaladores de polvo seco y nebulizadores, se están desarrollando y pueden ser adaptados adecuadamente para la administración de la presente invención en un aerosol, por inhalación, o vehículo de administración nebulizada, respectivamente.

Para la administración intratecal (IT) o intracerebroventricular (ICV), los sistemas de suministro estéril apropiados (por ejemplo, líquidos, geles, suspensiones, etc.) pueden ser utilizados para administrar la presente invención.

Las composiciones de la presente invención también pueden incluir excipientes biocompatibles, tales como agentes dispersantes o humectantes, agentes de suspensión, diluyentes, tampones, potenciadores de penetración, emulsionantes, aglutinantes, espesantes, agentes aromatizantes (para administración oral). ii. Portadores farmacéuticos para anticuerpos y péptidos Más específicamente con respecto a los anticuerpos de MASP, tal como se describe en el presente documento, las formulaciones ejemplares se pueden administrar parenteralmente como dosificaciones inyectables de una solución o suspensión del compuesto en un diluyente fisiológicamente aceptable con un portador farmacéutico que puede ser un líquido estéril tal como agua, aceites, solución salina, glicerol o etanol. Además, las sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, tensioactivos, sustancias tamponantes de pH y similares pueden estar presentes en composiciones que comprenden anticuerpos de MASP. Los componentes adicionales de composiciones farmacéuticas incluyen petróleo (tales como de origen animal, vegetal o sintético), por ejemplo, aceite de soya y aceite mineral. En general, los glicoles tales como propilenglicol o polietilenglicol son los portadores líquidos preferidos para soluciones inyectables.

Los anticuerpos de MASP también se pueden administrar en forma de una inyección de depósito o preparación de implante que puede formularse de una manera tal que permita una liberación sostenida o pulsátil de los agentes activos.

VIII. MODOS DE ADMINISTRACIÓN Las composiciones farmacéuticas que comprenden los agentes inhibidores de MASP-3 o agentes inhibidores de MASP-2 se pueden administrar en un número de maneras, dependiendo de si un modo de administración local o sistémico es más apropiado para la afección a tratar. Además, las composiciones de la presente invención pueden ser administradas por el recubrimiento o la incorporación de las composiciones sobre o dentro de un dispositivo médico implantadle. i _ Administración Sistémica Tal como se utiliza aquí, los términos "administración sistémica" y "suministro sisté ico" están destinados a incluir, pero no se limitan a las vías oral y parenteral incluyendo la vía intramuscular (IM), subcutánea, intravenosa (IV), intraarterial, por inhalación, sublingual, bucal, tópica, transdérmica, nasal, rectal, vaginal y otras vías de administración que resultan efectivamente en la dispersión del agente administrado a uno o varios sitios de acción terapéutica pretendida. Las vías de administración sistémica preferidas para las presentes composiciones incluyen intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraarterial e inhalatoria. Se apreciará que la vía de administración sistémica exacta para los agentes seleccionados utilizados en composiciones particulares de la presente invención se determinará, en parte, para tener en cuenta la susceptibilidad del agente a las vías metabólicas asociadas con la transformación de una determinada vía de administración. Por ejemplo, los agentes peptidérgicos se pueden administrar más adecuadamente mediante vías diferentes a la vía oral.

Los anticuerpos inhibidores de MASP, tal como se describe en el presente documento, pueden ser administrados a un sujeto en necesidad de los mismos por cualquier medio adecuado. Los métodos de administración de los anticuerpos de MASP y los polipéptidos incluyen la administración por via oral, administración pulmonar, parenteral (por ejemplo, intramuscular, intraperitoneal, (IV) o subcutánea intravenosa), por inhalación (por ejemplo, a través de una formulación en polvo fino), transdérmica, nasal, vaginal, rectal, o sublingual, y se pueden formular en formas de dosificación apropiadas para cada via de administración.

A modo de ejemplo representativo, los anticuerpos y péptidos inhibidores de MASP se pueden introducir en un cuerpo vivo mediante la aplicación de una membrana corporal capaz de absorber los polipéptidos, por ejemplo, la membrana nasal, gastrointestinal y rectal. Los polipéptidos se aplican típicamente a la membrana de absorción en combinación con un potenciador de la permeación. (Véase, por ejemplo, Lee, BVS, Cri t Rev. Quimioter Sys Carrier 5:69, (1988); Lee, BVS, J. Controlled Release 13:213, (1990); Lee, BVS, Ed, Peptide and Protein Drug Delivery, Marcel Dekker, Nueva York (1991); DeBoer, AG, et al, J. Controlled Release 13:241, (1990). Por ejemplo, STDHF es un derivado sintético de ácido fusídico, un tensioactivo esteroideo que es similar en estructura a las sales biliares, y se ha utilizado como un potenciador de la permeación para la administración nasal. (Lee, WA, Biopharm 22, nov/dic de 1990).

Los anticuerpos inhibidores de MASP como se describen en el presente documento pueden introducirse en asociación con otra molécula, tal como un lipido, para proteger a los polipéptidos de la degradación enzimática. Por ejemplo, la unión covalente de polímeros, especialmente polietilenglicol (PEG), se ha utilizado para proteger ciertas proteínas de la hidrólisis enzimática en el cuerpo y por lo tanto para prolongar la vida media (Fuertges, F., et al, J. Controlled Release 11:139, (1990)). Muchos sistemas de polímeros se han reportado para la administración de proteínas (Bae, YH, et al, J. Controlled Release 9:271, (1989); Hori, R., et al, Pharm Res 6:813, (1989); Yamakawa, I., et al, J. Pharm Sci 79:505, (1990); Yoshihiro, I., et al, J. Controlled Release 10:195, (1989); Asano, M., et al, J. Controlled Release 9: 111, (1989); Rosenblatt, J., et al, J. Controlled Release 9:195, (1989); Makino, K., J. Controlled Release 12: 235, (1990); Takakura, Y., et al, J. Pharm Sci 78: 117, (1989); Takakura, Y., et al, J. Pharm Sci 78:219, (1989)).

Recientemente, se han desarrollado liposomas con una mejor estabilidad en suero y mejor vida media en circulación (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense No. 5,741,516, a Webb). Además, se han revisado diversos métodos de preparaciones de liposoma y tipo liposomas como portadores de fármacos potenciales (véase, por ejemplo, la Patente estadounidense No. 5,567,434, a Szoka; Patente estadounidense No. 5,552,157, de Yagi; Patente estadounidense No. 5,565,213, a Nakamori, patente estadounidense No. 5,738,868, a Shinkarenko y la patente estadounidense No.5,795,587, a Gao).

Para aplicaciones transdérmicas, los anticuerpos inhibidores de MASP, tal como se describen en el presente documento, se pueden combinar con otros ingredientes adecuados, tales como portadores y/o adyuvantes. No hay limitaciones sobre la naturaleza de tales otros ingredientes, excepto que deben ser farmacéuticamente aceptables para su administración pretendida, y no pueden degradar la actividad de los ingredientes activos de la composición. Ejemplos de portadores adecuados incluyen ungüentos, cremas, geles, o suspensiones, con o sin colágeno purificado. Los anticuerpos inhibidores de MASP también pueden impregnarse en parches transdérmicos, emplastos, y vendas, preferiblemente en forma liquida o semi líquida.

Las composiciones de la presente invención pueden administrarse sistémicamente en una base periódica a intervalos determinados para mantener un nivel de efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, las composiciones pueden administrarse tal como mediante inyección subcutánea, cada dos a cuatro semanas, o a intervalos menos frecuentes. El régimen de dosificación será determinado por el médico considerando diversos factores que pueden influir en la acción de la combinación de agentes. Estos factores incluyen el grado de progreso de la afección a tratar, la edad, el sexo y el peso del paciente, y otros factores clínicos. La dosificación para cada agente individual variará en función del agente inhibidor de MASP-3 o el agente inhibidor de MASP-2 que se incluye en la composición, así como la presencia y naturaleza de cualquier vehículo de administración de fármaco (por ejemplo, un vehículo de administración de liberación sostenida). Además, la cantidad de dosificación puede ajustarse para dar cuenta de la variación en la frecuencia de administración y el comportamiento farmacocinético del(los) agente(s) administrado(s). ii. Administración Local Tal como se utiliza aquí, el término "local" abarca la aplicación de un fármaco en o alrededor de un sitio de acción localizado previsto, y puede incluir, por ejemplo la administración tópica a la piel u otros tejidos afectados, administración oftálmica, intratecal (IT), intracerebroventricular (ICV ), intra-articular, dentro de la cavidad, administración intracraneal o intravesicular, colocación o irrigación. La administración local puede ser preferible para permitir la administración de una dosis más baja, para evitar los efectos secundarios sistémicos, y para el control más preciso de la sincronización de la administración y la concentración de los agentes activos en el sitio de administración local. La administración local proporciona una concentración conocida en el sitio objetivo, independientemente de la variabilidad entre pacientes en el metabolismo, flujo sanguíneo, etc. La mejora del control de dosificación también es proporcionada por el modo de administración directo.

La administración local de un agente inhibidor de MASP-3 o un agente inhibidor de MASP-2 se puede lograr en el contexto de métodos quirúrgicos para el tratamiento de una enfermedad o condición, como por ejemplo durante procedimientos tales como la cirugía de revascularización arterial, aterectomía, procedimientos con láser, procedimientos ultrasónicos, angioplastía con globo, y colocación de estent. Por ejemplo, un agente inhibidor de MASP-3 o un agente inhibidor de MASP-2 se pueden administrar a un sujeto en conjunción con un procedimiento de angioplastía con globo. Un procedimiento de angioplastía con globo implica la inserción de un catéter que tiene un globo desinflado en una arteria. El globo desinflado se coloca en la proximidad de la placa aterosclerótica y se infla de manera que la placa se comprima contra la pared vascular. Como resultado, la superficie del globo está en contacto con la capa de células endoteliales vasculares en la superficie del vaso sanguíneo. El agente inhibidor de MASP-3 o el agente inhibidor de MASP-2 pueden estar unidos al catéter de angioplastia con globo de una manera que permite la liberación del agente en el lugar de la placa aterosclerótica. El agente puede estar unido al catéter de globo de acuerdo con procedimientos estándares conocidos en la téenica. Por ejemplo, el agente puede ser almacenado en un compartimento del catéter de globo hasta que el globo se infla, momento en el que se libera en el medio ambiente local. Alternativamente, el agente puede ser impregnado en la superficie del globo, de tal manera que entre en contacto con las células de la pared arterial a medida que se infla el globo. El agente también puede ser administrado en un catéter de globo perforado tal como el descrito en Flugelman, MI, et al,. Circulation 85:1110-1117, (1992). Véase también la Solicitud publicada PCT WO 95/23161 para un procedimiento ejemplar para la fijación de una proteína terapéutica a un catéter de angioplastia con globo. Del mismo modo, el agente inhibidor de MASP-3 o el agente inhibidor de MASP-2 pueden ser incluidos en un gel o recubrimiento polimérico aplicado a un estent, o se pueden incorporar en el material del estent, de tal manera que el estent eluye el agente inhibidor de MASP-3 o el agente inhibidor de MASP-2 después de la colocación vascular.

Los agentes inhibidores de MASP-3 o los agentes inhibidores de MASP-2 utilizados en el tratamiento de la artritis y otros trastornos musculoesqueléticos se pueden administrar localmente por inyección intra-articular. Tales composiciones pueden incluir adecuadamente un vehículo de administración de liberación sostenida. Como un ejemplo adicional de casos en los que puede desearse la administración local, las composiciones inhibidoras MASP-2 utilizadas en el tratamiento de afecciones urogenitales pueden ser adecuadamente instiladas por vía intravesical o dentro de otra estructura urogenital.

IX. REGÍMENES DE TRATAMIENTO En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto susceptible a, o de otra manera en riesgo de, HPN en una cantidad suficiente para eliminar o reducir el riesgo de desarrollar los síntomas de la condición. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones farmacéuticas se administran a un sujeto que se sospecha de, o que ya sufre de, HPN en una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para aliviar, o reducir al menos parcialmente, los síntomas de la condición.

En una modalidad, los glóbulos rojos del sujeto son opsonizadas por fragmentos de C3 en ausencia de la composición, y la administración de la composición al sujeto aumenta la supervivencia de los glóbulos rojos en el sujeto. En una modalidad, el sujeto muestra uno o más síntomas en ausencia de la composición seleccionados del grupo que consiste de (i) niveles inferiores a los normales de hemoglobina, (ii) niveles inferiores a los normales de plaquetas; (iii) niveles superiores a los normales de reticulocitos, y (iv) niveles superiores a los normales de bilirrubina, y la administración de la composición al sujeto mejora al menos uno o más de los síntomas, lo que resulta en (i) niveles aumentados, normales o casi normales de hemoglobina; (ii) niveles aumentados, normales o casi normales de plaquetas; (iii) niveles reducidos, normales o casi normales de reticulositos, y/o (iv) niveles reducidos, normales o casi normales de bilirrubina.

En ambos regímenes profilácticos y terapéuticos, las composiciones que comprenden agentes inhibidores de MASP-3 y opcionalmente agentes inhibidores de MASP-2 se pueden administrar en varias dosis hasta que se haya logrado un resultado terapéutico suficiente en el sujeto. En una modalidad de la invención, el agente inhibidor de MASP-3 y/o MASP-2 comprende un anticuerpo de MASP-1, un anticuerpo de MASP-2 o un anticuerpo de MASP-3, que se puede administrar convenientemente a un paciente adulto (por ejemplo, un adulto con peso promedio de 70 kg) en una dosis de 0.1 mg a 10,000 mg, más adecuadamente de 1.0 mg a 5,000 mg, más adecuadamente de 10.0 mg a 2,000 mg, más adecuadamente de 10.0 mg a 1,000 mg y aún más adecuadamente de 50.0 mg a 500 mg, o de 10 a 200 mg. Para los pacientes pediátricos, la dosis puede ajustarse en proporción al peso del paciente.

La aplicación de las composiciones inhibidoras de MASP-3 y las composiciones inhibidoras de MASP-2 opcionales de la presente invención se puede llevar a cabo por una administración única de la composición (por ejemplo, una composición única que comprende agentes inhibidores de MASP-2 y MASP-3, o agentes inhibidores duales o biespecificos, o la co-administración de composiciones separadas), o una secuencia limitada de las administraciones, para el tratamiento de la HPN. Alternativamente, la composición se puede administrar a intervalos periódicos, tales como diario, quincenal, semanal, cada dos semanas, mensual o bimensual durante un periodo prolongado de tiempo para el tratamiento de la HPN.

En algunas modalidades, una primera composición que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-3 y una segunda composición que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-2 se administran a un sujeto que sufre de HPN. En una modalidad, la primera composición que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-3 y una segunda composición que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-2 se administran simultáneamente (es decir, dentro de una separación de tiempo de no más de aproximadamente 15 minutos o menos, tales como no más que cualquiera de 10, 5 ó 1 minuto). En una modalidad, la primera composición que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-3 y una segunda composición que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-2 se administran secuencialmente (es decir, la primera composición se administra ya sea antes o después de la administración de la segunda composición, en donde la separación en el tiempo de administración es mayor a 15 minutos). En algunas modalidades, la primera composición que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-3 y una segunda composición que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-2 se administran al mismo tiempo (es decir, el periodo de administración de la primera composición se superpone con la administración de la segunda composición). Por ejemplo, en algunas modalidades, la primera composición y/o la segunda composición se administran durante un periodo de al menos una, dos, tres o cuatro semanas o más. En una modalidad, al menos un agente inhibidor de MASP-3 y al menos un agente inhibidor de MASP- 2 se combinan en una forma de dosificación unitaria. En una modalidad, una primera composición que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-3 y una segunda composición que comprende al menos un agente inhibidor de MASP-2 son empaquetados juntos en un kit para su uso en el tratamiento de la HPN.

En algunas modalidades, el sujeto que padece de HPN se ha sometido previamente, o está sometido actualmente al tratamiento con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteina C5 del complemento. En algunas modalidades, el método comprende administrar al sujeto una composición de la invención que comprende un inhibidor de MASP-3 y opcionalmente un inhibidor de MASP-2 y además, la administración al sujeto de un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteina C5 del complemento. En algunas modalidades, el inhibidor del complemento terminal es un anticuerpo anti-C5 humanizado o fragmento de unión a antigeno del mismo. En algunas modalidades, el inhibidor del complemento terminal es eculizumab.

X. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos meramente ilustran el mejor modo hasta ahora contemplado para practicar la invención, pero no deberán considerarse como limitantes de la invención. Todas las menciones a literaturas en este documento se incorporan expresamente por referencia.

EJEMPLO 1 Este Ejemplo demuestra que Los ratones deficientes de MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por Neisseria meningitidis después de la infección ya sea con N. meningitidis serogrupo A o N. meningitidis serogrupo B.

Métodos: Los ratones golpeados ( knockout ) de MASP-2 (ratones KO de MASP-2) se generaron como se describe en el Ejemplo 1 de la patente estadounidense No. 7,919,094, incorporada aquí por referencia. Los ratones KO de MASP-2 de 10 semanas de edad, (n = 10) y ratones silvestres (WT) C57/BL6 (n = 10) se inocularon por vía de la inyección intraperitoneal (ip) con una dosis de 2.6 * 107 CFU de N. meningitidis serogrupo A Z2491 en un volumen de 100 ml. La dosis infecciosa se administró a ratones en combinación con dextrano ferroso a una concentración final de 400 mg/kg. La supervivencia de los ratones después de la infección se monitorizó durante un periodo de tiempo de 72 horas.

En un experimento separado, los ratones KO de MASP-2 de 10-semanas de eda, (n = 10) y los ratones WT C57/BL6 (n = 10) se inocularon mediante inyección ip con una dosis de 6 c 106 CFU de N. meningitidis serogrupo B cepa MC58 en un volumen de 100 ml. La dosis infecciosa se administró a ratones en combinación con dextrano ferroso a una dosis final de 400 mg/kg. La supervivencia de los ratones después de la infección se monitorizó durante un periodo de tiempo de 72 horas. Una puntuación de la enfermedad también se determinó para los ratones WT y KO de MASP-2 durante el periodo de tiempo de 72 horas después de la infección, en base a los parámetros de puntuación de enfermedad que se describen a continuación en la Tabla 4, que se basa en el esquema de Fransen et al. (2010) con ligeras modificaciones.

TABLA 4: Puntuación de Enfermedad Asociada con los Signos Clínicos en Ratones Infectados Las muestras de sangre fueron tomadas de los ratones a intervalos de una hora después de la infección y se analizaron para determinar el nivel de suero (registro de CFU/ml) de N. meningitidis con el fin de verificar la infección y determinar la tasa de depuración de las bacterias del suero.

Resultados: La fig. 8 es un gráfico de Kaplan-Mcyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones KO y WT de MASP-2 después de la administración de una dosis infecciosa de 2.6 * 107 CFU de N. meningitidis serogrupo A Z2491. Como se muestra en la fig. 8, 100% de los ratones KO de MASP-2 sobrevivió durante todo el período de 72 horas después de la infección. En contraste, sólo el 80% de los ratones WT (p = 0.012) seguían con vida 24 horas después de la infección, y sólo el 50% de los ratones WT seguían con vida a las 72 horas después de la infección. Estos resultados demuestran que los ratones deficientes de MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por N. meningitidis serogrupo A Z2491.

La fig. 9 es un gráfico de Kaplan-Mcyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de ratones KO y WT de MASP-2 después de la administración de una dosis infecciosa de 6 c 106 cfu de N. meningitidis serogrupo MC58 cepa B. Como se muestra en la fig.9.90% de los ratones KO de MASP-2 sobrevivió durante todo el período de 72 horas después de la infección. En contraste, sólo el 20% de los ratones WT (p = 0,0022) todavía estaban vivos 24 horas después de la infección. Estos resultados demuestran que los ratones Deficientes de MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por N. meningitidis serogrupo B cepa MC58.

La fig. 10 ilustra gráficamente el registro de CFU/ml de N. meningitidis serogrupo B cepa MC58 recuperado en diferentes puntos de tiempo en muestras de sangre tomadas de los ratones KO y WT de MASP-2 después de la infección ip con 6 c 106 cfu de N. meningitidis serogrupo B MC58 cepa (n = 3 en diferentes puntos de tiempo para ambos grupos de ratones). Los resultados se expresan como media ± SEM. Como se muestra en la fig. 10, el nivel de N. meningitidis en la sangre en ratones WT alcanzó un pico de aproximadamente 6.0 registro de CFU/ml a las 24 horas después de la infección y se redujo a aproximadamente 4.0 registro de CFU/ml a 36 horas después de la infección. En contraste, en los ratones KO de MASP-2, el nivel de N. meningitidis alcanzó un máximo de alrededor de 4.0 registro de CFU/ml a las 12 horas después de la infección y se redujo a alrededor de 1.0 registro de CFU/ml a las 36 horas después de la infección (el símbolo indica p <0.05; el símbolo "**" indica p = 0.0043). Estos resultados demuestran que aunque los ratones KO de MASP-2 se infectaron con la misma dosis de N. meningitidis serogrupo B cepa MC58 que los ratones WT, los ratones KO de MASP-2 han mejorado la depuración de bacteriemia en comparación con WT.

La fig.11 ilustra gráficamente la puntuación de la enfermedad media de ratones KO y WT de MASP-2 a las 3, 6, 12 y 24 horas después de la infección con 6 * 106 cfu de N. meningitidis serogrupo MC58 cepa B. Como se muestra en la fig.11, los ratones deficientes de MASP-2 mostraron una alta resistencia a la infección, con la puntuaciones de enfermedad muy inferiores a las 6 horas (el símbolo indica p = 0.0411), 12 horas (el símbolo "**" indica p = 0.0049) y 24 horas (el símbolo "***" indica p = 0.0049) después de la infección, en comparación con los ratones WT. Los resultados en la fig.11 se expresan como media ± SEM.

En resumen, los resultados en este ejemplo demuestran que los ratones deficientes de MASP-2 están protegidos de la mortalidad inducida por N. meningitidis después de la infección, ya sea con N. meningitidis serogrupo A o N. meningitidis serogrupo B.

EJEMPLO 2 Este ejemplo demuestra que la administración de anticuerpos de MPAS-2 después de la infección con N. meningitidis aumenta la supervicencia de ratones infectados con N. meningitidis .

Antecedentes/Fundamento: Como se ha descrito en el Ejemplo 24 de la patente estadounidense No. 7,919,094, incorporada aquí por referencia, proteina de rata MASP-2 se utilizó para desplazar una biblioteca de presentación de fagos Fab, de la que Fab2 # 11 se identificó como un anticuerpo funcionalmente activo. Los anticuerpos de longitud completa de los isotipos IgG2c rata y ratón IgG2a fueron generados a partir Fab2 # 11. Los anticuerpos de MASP-2 de longitud completa del isotipo de ratón IgG2a se caracterizan por parámetros farmacodinámicos (tal como se describe en el Ejemplo 38 de la patente estadounidense No.7,919,094).

En este Ejemplo, el anticuerpo de MASP-2 de ratón de longitud completa derivado de Fab2 # 11 se analizó en el modelo de ratón de infección por N. meningitidis .

Metodos: El isotipo de anticuerpo de MASP-2 de longitud completa de ratón IgG2a derivado de Fab2 # 11, generado como se describió anteriormente, se probó en el modelo de ratón con infección por N. meningitidis como sigue. 1. Administración de anticuerpos monoclonales de MASP-2 de ratón (MoAb) después de la infección Ratones C57/BL6 Charles River de 9 semanas de edad fueron tratados con anticuerpos inhibidores de MASP-s de ratón MASP-2 (1.0 mg/kg) (n = 12) o el anticuerpo de isotipo de control (n = 10) a las 3 horas después de la inyección ip con una dosis alta (4 x 106 CFU) de N. meningitidis serogrupo MC58 cepa B.

Resultados: La fig. 12 es un gráfico de Kaplan-Mcyer que ilustra gráficamente el porcentaje de supervivencia de los ratones después de la administración de una dosis infectiva de 4 x 106 cfu de N. meningitidis serogrupo B cepa MC58, seguido de la administración 3 horas después de la infección ya sea de anticuerpo inhibidor de MASP-2 (1.0 mg/kg) o un anticuerpo de isotipo de control. Como se muestra en la fig. 12.90% de los ratones tratados con anticuerpo de MASP-2 sobrevivieron durante todo el periodo de 72 horas después de la infección. En contraste, sólo el 50% de los ratones tratados con anticuerpo de isotipo de control sobrevivió durante todo el periodo de 72 horas después de la infección. El símbolo "*" indica p = 0.0301, según se determina por comparación de las dos curvas de supervivencia.

Estos resultados demuestran que la administración de un anticuerpo de MASP-2 es eficaz para tratar y mejorar la supervivencia en sujetos infectados con N. meningitidis.

Como se demuestra en el presente documento, el uso de anticuerpos de MASP-2 en el tratamiento de un sujeto infectado con N. meningitidis es eficaz cuando se administra a las 3 horas después de la infección, y se espera que sean efectivos dentro de 24 horas a 48 horas después de la infección. La enfermedad meningocócica (ya sea meningococcemia o meningitis) es una emergencia médica y la terapia normalmente se iniciará inmediatamente si se sospecha de enfermedad meningocócica (es decir, antes de que la N. meningitidis sea identificada positivamente como el agente etiológico).

En vista de los resultados en el ratón KO de MASP-2 mostrados en el Ejemplo 1, se cree que la administración de anticuerpos de MASP-2 antes de la infección con N. meningitidis también sería eficaz para prevenir o mejorar la gravedad de la infección.

EJEMPLO 3 Este Ejemplo demuestra que la eliminación dependiente del complemento de N. meningitidis en suero humano es dependiente de MASP-3.

Fundamentos: Los pacientes con niveles séricos disminuidos de MBL funcional muestran aumento de la susceptibilidad a las infecciones bacterianas y fúngicas recurrentes (Kilpatrick et al, Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002)). Se sabe que N. meningitidis es reconocida por MBL, y se ha demostrado que los sueros deficientes de MBL no lisan la N. meningitidis.

En vista de los resultados descritos en los Ejemplos 1 y 2, una serie de experimentos se llevaron a cabo para determinar la eficacia de la administración de anticuerpos de MASP-2 para tratar la infección por N. meningitidis deficiente en complemento y los sueros humanos de control. Los experimentos se llevaron a cabo en una alta concentración sérica (20%) a fin de preservar la vía del complemento.

Métodos: 2. Actividad bactericida del suero en varios sueros humanos deficientes de complemento y en suero humano tratado con anticuerpo de MASP-2 humano Los siguientes sueros humanos deficientes de complemento y sueros humanos de control se usaron en este experimento.

TABLA 5: Muestras probadas de suero humano (como se muestra en la Figura 13) Un anticuerpo recombinante contra MASP-2 humano se aisló de una biblioteca combinatoria de anticuerpos (Knappik, A., et al,. J. Mol Biol . 296: 57-86 (2000)), utilizando MASP-2A recombinante humano como antigeno (Chen, CB y Wallis, J. Biol Chem. 276: 25894-25.902 (2001)). Un fragmento de scFv anti-humano que inhibió potentemente la activación de C4 y C3 mediada por la vía de las lectinas en el plasma humano (IC50~20 nM) fue identificado y convertido a un anticuerpo de IgG4 humano de longitud completa.

N. meningitidís serogrupo B-MC58 se incubó con los diferentes sueros que se muestran en la TABLA 5, cada uno a una concentración en suero de 20%, con o sin la adición de un inhibidor de anticuerpos de MASP-2 humano (3 g en 100 ml de volumen total) a 37°C con agitación. Se tomaron muestras en los siguientes puntos de tiempo: intervalos de 0-, 30-, 60- y 90- minutos, emplacados y luego se determinaron los recuentos viables. Como control negativo se utilizó suero humano inactivado por calor.

Resultados: La fig. 13 ilustra gráficamente el registro de CFU/ml de recuentos viables de N. meningitidís serogrupo B-MC58 recuperado en diferentes puntos de tiempo en las muestras de suero humano que se muestran en la Tabla 5. La Tabla 6 proporciona los resultados de la prueba t de Student para la fig.13 TABLA 6: Resultados de la prueba t de Student para la Figura 13 (punto de tiempo 60 minutos) Como se muestra en la fig.13 y en la TABLA b, la eliminación dependiente del complemento de N. meningitidis en 20% de suero humano fue significativamente mejorada por la adición de anticuerpo inhibidor de MASP-2 humano. 2. Actividad bactericida del suero en varios sueros humanos deficientes de complemento Los siguientes sueros humanos y el control de sueros humanos-complemento deficiente se utilizaron en este experimento: TABLA 7: Muestras probadas de suero humano (como se muestra en la Figura 14) Nota: El suero de MASP-3 -/- (MASP-1 +) en suero en la muestra D fue tomado de un sujeto con síndrome de 3MC, que es un término unificador para los síndromes de solapamiento de Carnevale, Mingarelly, Malpuech y Michels. Como se describe adicionalmente en el Ejemplo 4, las mutaciones en el exón 12 del gen MASP-1/3 hacen al dominio de serina proteasa de MASP-3, pero no el de MASP-1, disfuncional. También se sabe que el factor D está intacto en el suero de 3MC.

N. meningitidis serogrupo B-MC58 se incubó con diferentes sueros humanos deficientes de complemento, cada uno a una concentración sérica de 20%, a 37°C con agitación. Las muestras fueron tomadas en los siguientes puntos de tiempo: intervalos de 0-, 15-, 30-, 45-, 60-, 90-y 120- minutos, emplacadas y luego se determinaron los recuentos viables. Como control negativo se utilizó suero humano inactivado por calor.

Resultados: La fig. 14 ilustra gráficamente el registro de CFü/ml de recuentos viables de N. meningitidis serogrupo B-MC58 recuperado en diferentes puntos de tiempo en las muestras de suero humano que se muestran en la TABLA 7. Como se muestra en la fig.1 , El suero WT (NHS) tiene el más alto nivel de actividad bactericida de N. meningitidis. En contraste, los sueros humanos de MBL -/- y MASP-3 -/-(que es suficiente de MASP-1) no tienen ninguna actividad bactericida. Estos resultados indican que la eliminación de N. meningitidis dependiente del complemento en 20% de suero humano (v/v) es dependiente de MASP-3 y MBL. La Tabla 8 proporciona los resultados de la prueba t de Student para la fig.14.

TABLA 8: Resultados de la prueba t de Student para la Figura 14 En resumen, los resultados mostrados en la fig. 14y la Tabla 8 demuestran que la eliminación de N. meningitidis dependiente del complemento en 20% de suero humano es dependiente de MASP-3 y MBL. 3. Eliminación de N . meningitidis dependiente del complemento en 20% (v/v) de suero de ratón deficiente de MASP-2, MASP-1/3 o MBL A/C.

Los siguientes sueros de ratón deficientes de complemento y sueros de ratón de control se usaron en este experimento.

TABLA 9: Muestras probadas de suero de ratón (como se muestra en la Figura 15) N. meningitidis serogrupo B-MC58 se incubó con diferentes sueros de ratón deficientes de complemento, cada uno a una concentración sérica de 20%, a 37°C con agitación. Las muestras fueron tomadas en los siguientes puntos de tiempo: intervalos de 0-, 15-, 30-, 60-, 90 y 120- minutos, se emplacaron y luego se determinaron los recuentos viables. Como control negativo se utilizó suero humano inactivado por calor.

Resultados: La fig. 15 ilustra gráficamente el registro de CFU/ml de recuentos viables de N. meningitidis serogrupo B-MC58 recuperado en diferentes puntos de tiempo en las muestras de suero de ratón que se muestran en la TABLA 9. Como se muestra en la fig.15, los sueros de ratón MASP-2 -/- tienen un mayor nivel de actividad bactericida de N. meningitidis que los sueros de ratón WT. En contraste, el suero de ratón MASP-1/3 -/- no tiene ninguna actividad bactericida. El símbolo "**" indica p = 0.0058, el símbolo "***" indica p = 0.001. La Tabla 10 proporciona los resultados de la prueba t de Student para la fig.15.

TABLA 10: Resultados de la prueba t de Student para la Figura 15 En resumen, los resultados en este ejemplo demuestran que el suero de MASP-2 -/- tiene un mayor nivel de actividad bactericida de N. meningitidis que el suero WT y que la eliminación de N. meningitidis dependiente del complemento en 20% de suero es dependiente de ASP-3 y MBL.

EJEMPLO 4 Este ejemplo describe una serie de experimentos fueron llevados a cabo para determinar el mecanismo de la resistencia dependiente de MASP-3 a la infección por N. menígitidís observada en los ratones KO de MASP-2, como se describe en los Ejemplos 1-3.

Fundamentos: Con el fin de determinar el mecanismo de resistencia a la infección por N. meningitidis dependiente de MASP-3 observada en ratones KO de MASP-2 (descrito en los Ejemplos 1-3 anteriores), una serie de experimentos se llevaron a cabo como sigue. 2. Los ratones deficientes en MASP-1/3 no son deficientes de la actividad funcional de la vía de las lectinas (tambien referida como "LEA-2") Métodos: Con el fin de determinar si los ratones deficientes de MASP-3 son deficientes de actividad funcional de la vía de la lectina (también referida como LEA-2), se llevó a cabo un ensayo para medir la cinética de la actividad de la C3 convertasa en el plasma de varias cepas de ratón deficientes de complemento probadas bajo condiciones de ensayo de activación especifica de la via de la lectina (1% de plasma), como se describe en Schwaeble W. et al, PNAS vol. 108 (18):7.523 - 7.528 (2011), que se incorpora aquí por referencia.

Se probó el plasma de ratones WT, C4 -/-, MASP-1/3 Factor B -/-, y MASP-2 -/- como sigue.

Para medir la activación de C3, placas de microtitulación fueron recubiertas con manano (1 mg/pocillo), zimosano (1 mg/pocillo) en tampón de recubrimiento (15 mM Na2C03, 35 mM NaHCC ), o complejos inmunes, generados in situ por recubrimiento con 1% de albúmina de suero humano (HSA) en tampón de recubrimiento después se añadió suero anti-HAS de oveja (2 mg/ml) en TBS (Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7.4) con 0.05% de Tween 20 y 5 mM de Ca++. Las placas se bloquearon con 0.1% de HSA en TBS y se lavaron tres veces con TBS/Tween 20/Ca++. Las muestras de plasma se diluyeron en 4 mM de barbital, 145 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, pH 7.4, se añadieron a las placas y se incubaron durante 1.5 horas a 37°C. Después de lavar, el C3b unido se detectó utilizando anti C3c-humano de conejo (Dako), seguido de fosfatasa alcalina conjugada con IgG de cabra anti-conejo y p-nitrofenil fosfato.

Resultados: La cinética de activación de C3 (medida por la deposición de C3b sobre placas recubiertas con manano con 1% de suero) en condiciones especificas de la via de la lectina se muestra en la fig.16. Ninguna escisión de C3 se observó en plasma de MASP-2 -/-. El plasma de factor B -/-(Factor B -/-) escindió C3 a la mitad de la tasa de plasma WT, probablemente debido a la pérdida del lazo de amplificación. Se observó un retraso significativo en la conversión dependiente de la via de la lectina de C3 a C3b en C4 -/- (T i/2 = 33 min), asi como en el plasma deficiente de MASP-1/3 -/- (T 1/2 = 49 min). Este retraso de la activación de C3 en plasma de MASP-1/3 -/- ha demostrado ser dependiente de MASP-1-en lugar de MASP-3-. (Véase Takahashi M. et al, J Immunol 180:6132 hasta 6138 (2008)). Estos resultados demuestran que los ratones deficientes de MASP-1/3- no son deficientes de la actividad funcional de la via de la lectina (también referida como "LEA-2"). 2. Efecto de la deficiencia hereditaria de MASP-3 en la activación de la vía alternativa Fundamentos: El efecto de la deficiencia hereditaria de MASP-3 en la activación de la via alternativa se determinó por análisis del suero de un paciente deficientes de MASP-3 con el síndrome de 3MC causado por una mutación de cambio de marco en el exón que codifica la serina proteasa de MASP-3. El síndrome de 3MC es un término unificador para los síndromes superpuestos Carneavale, Mingarelli, Malpuech y Michels. Estos trastornos autosómicos recesivos raros muestran una gama de características de desarrollo, incluyendo dismorfia facial característica, labio leporino y/o paladar hendido, craneosinostosis, problemas de aprendizaje y anomalías de extremidades, vesicorenales y genitales. Rooryck et al, Nature Genetics 43: 197-203 (2011) estudió a 11 familias con síndrome de 3MC e identificó dos genes mutados, COLEC11 y MASP-1. Las mutaciones en el gen MASP-1 convierten en disfuncional el exón que codifica el dominio de serina proteasa de MASP-3, pero no los exones que codifican la serina proteasa de MASP-1. Por lo tanto, los pacientes de 3MC con mutaciones en el exón que codifica la serina proteasa de MASP-3 son deficientes de MASP-3 pero suficientes en MASP-1.

Metodos: Suero deficientes de MASP-3 se obtuvieron de un paciente de 3MC, la madre y el padre del paciente de 3MC (ambos heterocigotos para el alelo que lleva una mutación que vuelve al exón que codifica el dominio de serina proteasa de MASP-3 disfuncional), así como de un paciente deficiente de C4 (deficiente en ambos genes C4 humanos) y un sujeto deficientes de MBL. Un ensayo de la vía alternativa se llevó a cabo bajo condiciones AP específicas tradicionales (BBS/mg++/EGTA, sin Ca++ en donde BBS solución salina tamponada con barbital que contiene sacarosa), como se describe en Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981)), en placas de microtitulación recubiertas con zimosano en concentraciones séricas que van de 0.5 a 25% y la deposición de C3b se midió con el tiempo.

Resultados: La fig. 17 ilustra gráficamente el nivel de la via alternativa impulsada por la deposición de C3b en placas de microtitulación recubiertas con zimosano como una función de la concentración en suero en muestras de suero obtenidas de los sujetos deficientes de MASP-3, deficientes de C4 y deficientes de MBL. Como se muestra en la fig.17, el suero de paciente deficiente de MASP-3 tiene actividad residual de la via alternativa (AP) a altas concentraciones de suero (concentraciones séricas de 25%, 12.5%, 6.25%), pero AP5o significativamente mayor (es decir, 9.8% de suero necesario para lograr 50% de deposición máxima de C3).

La fig. 18 ilustra gráficamente el nivel de la via alternativa impulsada por la deposición de C3b en placas de microtitulación recubiertas con zimosano en condiciones especificas de la via alternativa "tradicional" (AP-) (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) como una función de tiempo en 10% de las muestras de suero humano obtenidas de sujetos humanos deficientes de MASP-3, deficientes de C4 y deficientes de MBL.

La TABLA 11 a continuación resume los resultados de AP5o mostrados en la Figura 17 y los tiempos medios para la deposición de C3b mostrada en la Figura 18.

TABLA 11: Resumen de los Resultados mostrados en las Figuras 17 y 18 Nota: En el tampón de BBS/Mg++/EGTA, los efectos mediados por la via de la lectina son deficientes debido a la ausencia de Ca++ en este tampón.

Aungue no se desea estar ligado por ninguna teoría particular, se cree que la menor actividad de la vía alternativa observada en el suero Deficiente de MASP-3 es causada porque el paciente que tiene 3MC activa el factor D en su suero, y dado que este paciente aún expresa MASP-1 y HTRA1, la conversión de pro-factor de D todavía es capaz de ocurrir en ausencia de MASP-3, aunque a un nivel inferior. 3. Medición de la deposición de C3b en manano , zimosano y S. pneumonía D39 en sueros de ratón deficientes en MASP-2 o MASP-1/3.

Metodos: La deposición de C3b se midió placas de icrotitulación recubiertas de manano, zimosano y S. pneumonía D39 utilizando concentraciones de suero de ratón que van desde 0% a 20% obtenido a partir de ratones MASP-2 -/-, MASP-1/3 -/- y WT. Los ensayos de deposición de C3b se llevaron a cabo bajo condiciones ya sea vía específica de alternativas "tradicionas" (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++), o en condiciones fisiológicas que permiten que funcionen tanto la vía de las lectinas como la vía alternativa (es decir, BBS/Mg++/ Ca++).

Resultados: La fig. 19A ilustra gráficamente el nivel de la deposición de C3b en placas de microtitulación recubiertas con manano como una función de la concentración en suero en muestras de suero obtenidas de ratones WT, deficientes de MASP-2, y deficientes de MASP-1 /3 en condiciones específicas de la vía alternativa tradicionales (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++ o en condiciones fisiológicas que permiten que funcionen tanto la vía de las lectinas como la vía alternativa (BBS/Mg++/ Ca++).La fig. 19B ilustra gráficamente el nivel de la deposición de C3b en placas de microtitulación recubiertas con zimosano como una función de la concentración en suero en muestras de suero de ratones WT, deficientes de MASP-2, y MASP-1 /3 bajo condiciones deficientes AP-especificas tradicionales (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++, o bajo condiciones fisiológicas que permiten que funcionen tanto la vía de las lectinas como la vía alternativa (BBS/Mg++/ Ca++).La fig. 19C ilustra gráficamente el nivel de la deposición de C3b en placas de microtitulación recubiertas con S. pneumoniae D39 como una función de la concentración en suero en muestras de suero de ratones WT, deficientes de MASP-2, y MASP-1/3 bajo condiciones AP-especificas tradicionales (es decir, BBS/EGTA/mg++ sin Ca++), o en condiciones fisiológicas que permiten que funcionen tanto la via de las lectinas como la via alternativa (BBS/Mg ++/ Ca++).

La fig. 20A ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C3b en sueros altamente diluidos llevado a cabo en placas de microtitulación recubiertas con manano bajo condiciones AP-tradicionales especificas (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) o en condiciones fisiológicas que permiten que tanto la via de la lectina como la vía alternativa funcionen (BBS/Mg++/ Ca++), utilizando las concentraciones séricas de entre el 0% hasta el 1.25%. La fig. 20B ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C3b llevado a cabo en placas de microtitulación recubiertas con zimosano en condiciones AP-específicas tradicionales (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) o en condiciones fisiológicas que permiten que funcionen tanto la vía de la lectina como la vía alternativa (BBS/EGTA/Mg++/Ca++), utilizando las concentraciones en suero que van desde 0% hasta 1.25%. La fig. 20C ilustra gráficamente los resultados de un ensayo de deposición de C3b llevado a cabo en placas de microtitulación recubiertas con S. pneumoniae D39 en condiciones AP-específicas tradicionales (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++ o en condiciones fisiológicas que permiten que funcionen tanto la vía de las lectinas como la vía alternativa (BBS/EGTA/Mg++/Ca++), utilizando las concentraciones en suero que van desde 0% hasta 1.25%.

Como se muestra en las figuras 20A-C, también se llevaron a cabo ensayos de deposición de C3b en condiciones específicas de vía alternativas tradicionales (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) o en condiciones fisiológicas que permiten que tanto la vía de las lectinas como la vía alternativa funcionen (BBS/Mg++/Ca++) utilizando diluciones más altas que van desde 0% hasta 1.25% de suero en placas recubiertas con manano (fig. 20A); placas recubiertas de zimosano (fig. 20B) y placas recubiertas de S. pneumoniae D39 (fig. 20C). La vía alternativa se reduce bajo diluciones de suero más altas, por lo que la actividad observada en el suero deficiente de MASP-3 en presencia de Ca++ es la activación mediada por MASP-2, y la actividad en el suero deficiente de MASP-2 en la presencia de Ca++ es la activación residual de AP mediada por MASP-1/3.

Discusión: Los resultados descritos en este Ejemplo demuestran que un inhibidor de MASP-2 (o KO de MASP-2) proporciona una protección significativa contra la infección por N. meningitidis mediante la promoción de la activación de la via alternativa impulsada por MASP-3. Los resultados de los ensayos de bacteriolisis de suero de ratón y los ensayos de bacteriolisis de suero humano muestran además del seguimiento de la actividad bactericida del suero contra N. meningitidis , que la actividad bactericida contra N. meningitidis está ausente en sueros deficientes de MBL (sueros de ratón doble deficientes de MBL A y MBL C y suero humano deficiente de MBL).

La fig.1 ilustra la nueva comprensión de la via de la lectina y la via alternativa con base en los resultados proporcionados en este documento. La fig. 1 delinea el papel de LEA-2 tanto en la opsonización como en la lisis. Mientras que MASP-2 es el iniciador de la deposición "descendente" de C3b (y la opsonización resultante) en múltiples configuraciones dependientes de lectina fisiológicamente (figura.20A, 20B, 20C), también desempeña un papel en la lisis de bacterias sensibles al suero. Como se ilustra en la fig.1, el mecanismo molecular responsable de la propuesta de aumento de la actividad bactericida de suero/plasma deficiente de MASP-2 o agotado de MASP-2 para los patógenos sensibles al suero como N. meningitidis es, que para la lisis de las bacterias, los complejos de reconocimiento de la via de la lectina asociados con MASP-1 y MASP-3 tienen que unirse en estrecha proximidad entre si en la superficie bacteriana, permitiendo así que MASP-1 escinda MASP-3. En contraste con MASP-1 y MASP-2, MASP-3 no es una enzima de auto-activación, pero, en muchos casos, requiere la activación/escisión por MASP-1 para ser convertida a su forma enzimáticamente activa.

Como se muestra además en la fig. 1, MASP-3 activada puede entonces escindir C3b unido a factor B en la superficie de patógenos para iniciar la cascada de activación de la via alternativa por la formación de la C3 y C5 convertasa enzimáticamente activa de la via alternativa C3bBb y C3bBb(C3b)n, respectivamente. Los complejos de activación de la via de la lectina que ostentan MASP-2 no tienen parte en la activación de MASP-3 y, en la ausencia o después de la depleción de MASP-2, todos los complejos de de activación de la via de la lectina se puede cargar o bien con MASP-1 o con MASP-3. Por lo tanto, en ausencia de MASP-2, se aumenta marcadamente la probabilidad de que en la superficie microbiana los complejos de activación de la via de las lectinas que ostentan MASP-1 y MASP3 se establecerán en estrecha proximidad entre si, dando lugar a que MASP- 3 sea activado lo que conduce a una mayor tasa de división mediada por MASP-3 de C3b unido a factor B para formar las C3 y C5 convertasas de la via alternativa C3bBb y C3bBb(C3b)n en la superficie microbiana. Esto conduce a la activación de la cascada de activación de terminales C5b-C9 que forma el complejo de ataque de membrana, compuesto de C5b unido a la superficie asociado con C6, C5bC6 asociado con C7, C5bC6C7 asociado con C8, y C5bC6C7C8, lo que conduce a la polimerización de C9 que se inserta en la estructura de la superficie bacteriana y forma un poro en la pared bacteriana, lo que conducirá a la eliminación osmolitica de la bacteria dirigida al complemento.

El núcleo de este nuevo concepto es que los datos proporcionados en este documento demuestran claramente que los complejos de activación de la via de la lectina impulsan las siguientes dos vías de activación diferentes como se ilustra en la fig.1.

EJEMPLO 5 Este ejemplo demuestra el efecto inhibidor de la deficiencia de MASP-2 y/o la deficiencia de MASP-3 en la lisis de los glóbulos rojos de las muestras obtenidas de un modelo de ratón de hemoglobinuria paroxistica nocturna (HPN.

Antecedentes/Fundamentos: La hemoglobinuria paroxistica nocturna (HPN), también conocida como síndrome de Marchiafava-Micheli, es una enfermedad de la sangre adquirida, potencialmente peligrosa para la vida, que se caracteriza por anemia hemolítica intravascular inducida por el complemento. El sello distintivo de la HPN es la hemolisis intravascular crónica mediada por el complemento que es una consecuencia de la activación no regulada de la vía alternativa del complemento debido a la ausencia de los reguladores del complemento CD55 y CD59 en eritrocitos de HPN, con hemoglobinuria y anemia posteriores. Lindorfer, MA, et al, Blood 115 (11) (2010), Risitano, A. M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11: 528-535 (2011). La anemia en la HPN se debe a la destrucción de los glóbulos rojos en el torrente sanguíneo. Los síntomas de la HPN incluyen orina de color rojo, debido a la aparición de hemoglobina en la orina, dolor de espalda, fatiga, falta de aliento y trombosis. La HPN puede desarrollarse por sí misma, en lo sucesivo "HPN primaria" o en el contexto de otros trastornos de la médula ósea, como anemia aplásica, conocida como "HPN secundaria". El tratamiento para la HPN incluye la transfusión de sangre para la anemia, la anticoagulación para la trombosis y el uso de anticuerpo monoclonal eculizumab (Soliris®), que protege a las células de la sangre contra la destrucción inmune mediante la inhibición del sistema del complemento (Montañeses P. et al., N. Engl . J. Med 350 (6): 552-9 (2004)). Eculizumab (Soliris®) es un anticuerpo monoclonal humanizado que se dirige al componente del complemento C5, bloqueando su escisión por C5convertasa, evitando de este modo la producción de C5a y el montaje del MAC. El tratamiento de pacientes con HPN con eculizumab se ha traducido en una reducción de la hemolisis intravascular, medida por lactato deshidrogenasa (LDH), que conduce a la estabilización de la hemoglobina y la independencia de transfusión en aproximadamente la mitad de los pacientes (Montañeses P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11 (6) (2011)). Mientras que casi todos los pacientes sometidos a terapia con eculizumab alcanzan niveles normales o casi normales de LDH (debido al control de la hemolisis intravascular), sólo alrededor de un tercio de los pacientes alcanzan un valor de hemoglobina de 11 g/dl, y el resto de los pacientes con eculizumab siguen mostrando anemia moderada a grave (es decir, dependiente de transfusión), en proporciones aproximadamente iguales (Risitano AM et al, Blood 113: 4094-100 (2009)). Como se describe en Risitano et al, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11: 528-535 (2011), se demostró que los pacientes con HPN en eculizumab contenían fragmentos de C3 unidos a una parte sustancial de sus eritrocitos de HPN (mientras que los pacientes no tratados no lo hicieron), lo que lleva a la conclusión de que los fragmentos de C3 unidos a la membrana funcionan como opsoninas en eritrocitos de HPN, lo que resulta en su atrapamiento en las células reticuloendoteliales a través de receptores específicos de C3 y posterior hemolisis extravascular. Por lo tanto, se necesitan estrategias terapéuticas además de la utilización de eculizumab para aquellos pacientes que desarrollan la hemolisis extravascular mediada por fragmento de C3 porque siguen necesitando transfusiones de glóbulos rojos.

Este Ejemplo describe los métodos para evaluar el efecto del suero deficiente de MASP-2 y MASP-3- en la lisis de los glóbulos rojos a partir de muestras de sangre obtenidas de un modelo de ratón de HPN y demuestra la eficacia de la inhibición de MASP-2 y/o inhibición de MASP-3 para tratar sujetos que sufren de HPN, y también soporta el uso de inhibidores de MASP-2 y/o inhibidores de MASP-3 (incluyendo inhibidores duales o biespecificos de MASP-2/MASP-3) para mejorar los efectos de la hemolisis extravascular mediada por fragmentos de C3 en sujetos con HPN sometidos a terapia con un inhibidor de C5 como eculizumab.

Métodos: Modelo animal de HPN: Las muestras de sangre se obtuvieron de ratones con genes dirigidos con deficiencias de Crry y C3 (Crry/C3 -/-) y ratones deficientes de CD55/CD59. Estos ratones no tienen los respectivos reguladores del complemento de superficie sobre sus eritrocitos y estos eritrocitos son, por lo tanto, susceptibles a la autolisis espontánea del complemento como lo son las células sanguíneas humanas de HPN.

Con el fin de sensibilizar aún más a estos eritrocitos, estas células se utilizan con y sin recubrimiento de manano y después se prueban para hemolisis en el plasma de WT C56/BL6, plasma nulo de MBL, plasma de MASP-2 -/-, plasma de MASP-1/3/-, NHS humano, plasma de MBL -/- humano y NHS tratado con anticuerpos de MASP-2 humanos. 1. Ensayo de hemolisis de eritros de marino doble-deficientes de Crry/C3 y CD55/CD59 en sueros y controles deficientes /agotados de MASP-2 Materiales incluidos : sangre de ratón fresca, BBS/Mg++/Ca++ (4.4 mM de ácido barbitúrico, 1.8 mM de barbital sódico, 145 mM de NaCl, pH 7.4, 5 mM de Mg++, 5 M de Ca++), cloruro de cromo, CrCl3 6H20 (0.5 mg/ml en BBS/Mg++/Ca++) y manano, 100 mg/ml en BBS/Mg++/Ca++.

Toda la sangre (2 mi) se centrifugó durante 1-2 min a 2000 c g en una centrifuga refrigerada a 4°C. El plasma y la capa leucocitaria se aspiraron. A continuación, la muestra se lavó 3 c por re-suspensión de sedimentos de glóbulos rojos en 2 i de BBS/gelatina/Mg++/Ca++ enfriado con hielo y se repitió la etapa de centrifugación. Después del tercer lavado, el sedimento se resuspendió en 4 mi de BBS/Mg++/Ca++. Una alícuota de 2 mi de los glóbulos rojos se reservó como control sin revestir. Para los 2 mi restantes, se añadieron 2 mi de CrCl3 y 2 mi de manano y la muestra se incubó con un mezclado suave a temperatura ambiente durante 5 min. La reacción se terminó mediante la adición de 7.5 mi de BBS/gelatina/Mg++/Ca++. La muestra se centrifugó como anteriormente, se resuspendió en 2 mi de BBS/gelatina/Mg++/Ca++ y se lavó otras dos veces como anteriormente, después se almacenó a 4°C. Dia 2. Ensayo de hemolisis.

Materiales incluidos : BBS/gelatina/Mg++/Ca++ (como anteriormente), sueros de ensayo, placas de 96 pocilios de fondo redondo y de fondo plano y un espectrofotómetro que lee placas de 96 pocilios a 410-414 nm.

La concentración de los glóbulos rojos se determinó primero y las células se ajustaron a 109/ml, y se almacenaron a esta concentración. Antes de su uso, las células se diluyeron en tampón de ensayo a 108/ml, y luego se usaron 100 ul por pocilio. La hemolisis se midió a 410-414 nm (lo que permite una mayor sensibilidad que 541 nm). Las diluciones de los sueros de ensayo se prepararon en BBS/gelatina/Mg++/Ca++ helado. 100 ml de cada dilución de suero se pipetearon en la placa de fondo redondo. Se añadieron 100 ml de la preparación de glóbulos rojos adecuadamente diluida (es decir, 108/ml), se incubaron a 37°C durante aproximadamente 1 hora, y se observaron para la lisis. (Las placas pueden ser fotografiadas en este punto.) La placa se centrifugó a velocidad máxima durante 5 minutos. 100 m? de la fase fluida se aspiraron, se transfirieron a placas de fondo plano, y el OD se registró a 410-414 nm. Los gránulos de glóbulos rojos fueron retenidos (estos pueden ser posteriormente lisados con agua para obtener un resultado inverso).

Experimento 1 La sangre fresca se obtuvo de ratones doble deficientes de CD55/CD59 y sangre de ratones doble deficientes de Crry/C3 y los eritrocitos fueron preparados como se describe en detalle en el protocolo anterior. Las células se dividieron y la mitad de las células se recubrieron con manano y la otra mitad se dejó sin tratamiento, ajustando la concentración final a IOm/ml, de los cuales 100 ml se utilizaron en el ensayo de hemolisis, que se llevó a cabo como se describe anteriormente.

Resultados del Experimento # 1: La via de las lectinas está implicada en la lisis de eritrocitos en el modelo animal de HPN En un experimento inicial, se determinó que los eritrocitos de ratón WT no recubiertos no fueran lisados en ningún suero de ratón. Además se determino que los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos de manano fueran lisados lentamente (más de 3 horas a 37 grados) en suero de ratón WT, pero no fueron lisados en suero nulo de MBL. (Datos no mostrados).

Se determinó que los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos de manano se U saran rápidamente en el suero humano pero no en NHS inactivado por calor. Es importante destacar que, los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos de manano fueron U sados en NHS diluido a 1/640 (es decir, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640 diluciones todas U sadas). (Datos no mostrados). En esta dilución, la via alternativa no funciona (la actividad AP funcional se reduce significativamente por debajo de la concentración sérica de 8%).

Conclusiones del Experimento 1: Los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos de manano son muy bien U sados en suero humano altamente diluido con MBL pero no en el que no tiene MBL. La lisis eficiente en cada concentración sérica probada implica que la via alternativa no está involucrada o es necesaria para esta lisis. La incapacidad del suero de ratón deficiente en MBL y suero humano para lisar los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos de manano indica que la via clásica tampoco tiene nada que ver con la lisis observada. Debido a que se requieren moléculas de reconocimiento la via de la lectina (es decir, MBL), esta lisis es mediada por la via de la lectina.

Experimento #2 : La sangre fresca se obtuvo de los ratones doble deficientes de Crry/Cr y CD55/CD59 y los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos de manano se analizaron en el ensayo de hemolisis como se describió anteriormente en la presencia de los siguientes sueros humanos: MASP-3 NBL nulo; WT; NHS pretratado con anticuerpo MASP-2 humano; y NHS activado por calor como control.

Resultados del Experimento # 2; Los inhibidores de MASP-2 y la deficiencia de MASP-3 previene la lisis de eritrocitos en el modelo animal de HPN.

Con los eritrocitos de ratón Crry-/- recubiertos de manano, el NHS se incubó en las diluciones diluidas a 1/640 (es decir, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 y 1/640), suero humano de MBL-/-, suero humano deficiente de MASP-3 (de paciente de 3MC), y NHS pretratado con Ab de MASP-2 y NHS inactivado por calor como control.

La placa de microtitulación de ELISA se centrifugó y los eritrocitos no U sados se recolectaron en la parte inferior de la placa de pocilios redondos. El sobrenadante de cada pocilio se recolectó y la cantidad de hemoglobina liberada de los eritrocitos U sados se midió mediante la lectura de OD415 nm en un lector de ELISA.

Se observó que el suero de MASP-3 -/- no lisa los eritrocitos de ratón recubiertos de manano en absoluto. En el NHS inactivado por calor de control (control negativo), como se esperaba, no se observó lisis. EL NHS pretratado con anticuerpo de MASP-2 liso los eritrocitos de ratón recubiertos con manano a diluciones de 1/8 y 1/16 mientras que el suero humano WT liso los eritrocitos de ratón recubiertos de manano a diluciones de 1/32.

La fig.21 ilustra gráficamente la hemolisis (tal como se mide por la liberación de hemoglobina de los eritrocitos de ratón lisados (Crry/C3 -/-) en el sobrenadante medido por fotometría) de los eritrocitos murinos recubiertos de manano por el suero humano en un rango de diluciones de suero en el suero de MASP-3-/-, NHS inactivado por calor (HI por sus siglas en inglés), MBL-/-, NHS pretratado con anticuerpo de MASP-2 y control de NHS.

La fig.22 ilustra gráficamente la hemolisis (tal como se mide por la liberación de hemoglobina de los eritrocitos de ratón lisados (Crry/C3 -/-) en el sobrenadante medido por fotometría) de los eritrocitos murinos recubiertos de manano por el suero humano en un rango de concentración en suero en el suero de MASP-3-/-, NHS inactivado por calor (HI por sus siglas en inglés), MBL-/-, NHS pretratado con anticuerpo de MASP-2 y control de NHS.

En los resultados mostrados en las figuras 21 y 22, Se demuestra que la inhibición de MASP-3 evitará cualquier lisis mediada por el complemento de eritrocitos sensibilizados con protección deficiente de la activación autóloga del complemento. La inhibición de MASP-2 con anticuerpos de MASP-2 cambió significativamente el CH5o y fue protectora en cierta medida, pero la inhibición de MASP-3 fue más eficaz.

Experimento #3; Los eritrocitos de ratón Crry -/- no recubiertos obtenidos de sangre fresca de ratones doble deficientes de Crry/C3 y CD55/CD59 se analizaron en el ensayo de hemolisis como se ha descrito anteriormente, en presencia de los siguientes sueros: MASP-3 -/-; MBL -/-; WT; NHS pretratdo con anticuerpo MASP-2 humano, y NHS inactivado por calor como control.

Resultados: La fig.23 ilustra gráficamente la hemolisis (tal como se mide por la liberación de hemoglobina de los eritrocitos de ratón WT U sados en el sobrenadante medido por fotometría) de los eritrocitos murinos no recubiertos en un rango de concentraciones en suero de sueros humanos de un paciente de 3MC (MASP-3 -/-), NHS inactivado por calor (HI), MBL -/-, NHS pretratado con anticuerpos de MASP-2, y NHS de control. Como se muestra en la fig.23 y resumen en la Tabla 12, se demuestra que la inhibición de MASP-3 inhibe la lisis de los eritrocitos no sensibilizados de ratón WT mediada por el complemento.

La fig.24 ilustra gráficamente la hemolisis (tal como se mide por la liberación de hemoglobina de eritrocitos lisados de ratón (CD55/59 -/-) en el sobrenadante medida por fotometría) de los eritrocitos murinos no recubiertos por el suero humano en un rango de concentraciones en suero de sueros humanos de NHS inactivados por calor (HI), MBL-/-, NHS pretratado con anticuerpo de MASP-2 y NHS de control. Como se muestra en la fig.24 y se resume en la Tabla 12, se demuestra que la inhibición de MASP-2 fue protectora en cierta medida.

TABLA 12: Valores de CH50 expresados como concentraciones séricas Nota: "CH50" es el punto en el que la hemolisis mediada por complemento alcanza el 50%.

En resumen, los resultados en este ejemplo demuestran que la inhibición de MASP-3 impide cualquier lisis de complemento de eritrocitos sensibilizados y no sensibilizados con protección deficiente de la activación autóloga del complemento. La inhibición de MASP-2 es también protectora en cierta medida. Por lo tanto, los inhibidores de MASP-2 y de MASP-3 solos o en combinación (es decir, co-administrados, secuencialmente administrados) o inhibidores duales o biespecificos de MASP-2/MASP-3 pueden usarse para tratar sujetos que sufren de HPN, y también pueden ser utilizados para mejorar (es decir, inhibir, prevenir o reducir la gravedad de) la hemolisis extravascular en pacientes con HPN en tratamiento con un inhibidor de C5 como eculizumab (Soliris®).

EJEMPLO 6 Este ejemplo describe un ensayo de hemolisis que prueba eritrocitos de conejo recubiertos de manano para lisis en la presencia de suero de ratón WT o MASP-1/3-/-.

Métodos: 2. Ensayo de hemólisi de glóbulos rojos de conejo (recubiertos de manano) en suero de ratón deficiente de MASP-1/3- y suero de control WT.

Dia 1. Preparación de Glóbulos Rojos de Conejo Materiales Incluidos: sangre fresca de conejo, BBS/Mg++/Ca++ 4 nM de ácido barbitúrico, 1.8 mM de barbitona de sodio, 145 mM de NaCl, pH 7.4, 5 mM de Mg++, 5 mM de Ca++), BBS/Mg++/Ca++ con 0.1% de gelatina, cloruro de cromo contenido en tampón; es decir, CrCl3.6 ¾0 (0.5 mg/mL en BBS/Mg++/Ca++) y manano, 100 mg/mL en BBS/Mg++/Ca++. 1. Toda la sangre de conejo (2 mi) se dividió en dos tubos Eppendorf de 1.5 mi y se centrifugó durante 3 minutos a 8000 rpm (aproximadamente 5.9 RCF) en una centrifuga eppendorf refrigerada a 4°C. El sedimento de glóbulos rojos se lavó tres veces después de re suspender en BBS/Mg++/Ca++ helado. Después del tercer lavado, el sedimento se resuspendió en 4 mi de BBS/Mg++/Ca++.2 mi de esta alícuota se añadieron a un tubo Falcon de 15 mi para ser utilizados como el control sin recubrir. Los 2 mi restantes de la alícuota de glóbulos rojos se diluyeron en 2 mi de tampón de CrCl3, se añadieron 2 mi de la solución de manano y la suspensión se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos con mezclado suave. La reacción se terminó mediante la adición de 7.5 mi de BBS/O.1% de gelatina/ Mg++/Ca++ a la mezcla. Los eritrocitos se sedimentaron y los glóbulos rojos se lavaron dos veces con BBS/O.1% de gelatina/ Mg++/Ca++ como se describe anteriormente. La suspensión de glóbulos rojos se almacenó en BBS/O.1% de gelatina/ Mg++/Ca++ a 4°C. 2. 100 ml de glóbulos rojos suspendidos se diluyeron con 1.4 mi de agua y se centrifugaron a 8000 rpm (aproximadamente 5.9 RCF) durante 3 minutos y la densidad óptica del sobrenadante se ajustó a 0.7 a 541 nm (un OD de 0.7 a 541 nm corresponde a aproximadamente 109 eritrocitos/mL). 3. Los glóbulos rojos resuspendidos fueron diluidos con BBS/0.1% de gelatina/ Mg++/Ca++ a una concentración de 108/mL. 4. Las diluciones de los sueros de ensayo se prepararon en BBS/gelatina/ Mg++/Ca++ helado y 100 ml de cada dilución de suero se pipetearon en la placa de pocilios de fondo redondo correspondiente. 100 m? de glóbulos rojos apropiadamente diluidos (108/ml) se añadieron a cada pocilio. Como control para la lisis completa, agua purificada (100 m?) se mezcló con los glóbulos rojos diluidos (100 m?) para causar el 100% de la lisis, mientras que BBS/0.1% de gelatina/ Mg++/Ca++ sin suero (100 m?) fue utilizado como control negativo. La placa se incubó durante 1 hora a 37°C. 5. La placa de fondo redondo se centrifugó a 3250 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante de cada pocilio (100 ml) se transfirió a la placa de pocilios de fondo plano correspondiente y el OD fue leído en un lector de ELISA a 415 a 490 nm. Los resultados se presentan como la relación de OD a 415 nm a la de 490 nm.

Resultados; La fig.25 ilustra gráficamente la hemolisis (tal como se mide por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de conejo U sados en el sobrenadante medida por fotometría) de eritrocitos de conejo recubiertos manano por el suero del ratón sobre un rango de concentraciones séricas en el suero de MASP-1/3 -/- y control WT. Como se muestra en la fig.25, se demuestra que la inhibición de MASP-3 previene la lisis de eritrocitos de conejo WT recubiertos de manano mediada por el complemento. Estos resultados apoyan además el uso de inhibidores de MASP-3 para el tratamiento de uno o más aspectos de la HPN como se describe en el Ejemplo 5.

EJEMPLO 7 Este Ejemplo demuestra que la vía alternativa se activa en el suero deficiente de factor D en la presencia de Ca++.

Experimento # 1: Ensayo de deposición de C3b bajo condiciones específicas de la vía alternativa Metodos: Un ensayo de deposición de C3b sobre una placa de microtitulación recubierta con zimosano se llevó a cabo bajo condiciones especificas de vía alternativos (BBS/EGTA/ Mg++, sin Ca++) utilizando diluciones crecientes de los siguientes sueros de ratón: Factor D y WT.

Resultados: La fig. 26 ilustra gráficamente el nivel de la deposición de C3b (OD 405 nm) como una función de la concentración sérica en muestras de suero de ratón de factor de D -/-, MASP-2 y WT en un ensayo de deposición de C3 llevado a cabo bajo condiciones especificas de la via alternativa. Como se muestra en la fig. 26, En estas condiciones, el suero de ratón de factor D -/- no activa C3 en absoluto y la via alternativa no está funcionando. El suero de MASP-2 -/- muestra la activación de la via alternativa a un ritmo similar al suero WT. Estos resultados confirman que, en ausencia de Ca++, el factor D se requiere para la deposición de C3b. Esto es consistente con la evidencia de que MASP-3 no se puede convertir a su forma enzimáticamente activa en estas condiciones debido a que las interacciones de MASP-1, la activación de la enzima MASP-3, y MASP-3 con sus respectivos componentes de reconocimiento de hidratos de carbono son dependientes de Ca++.

Experimento # 2: Ensayo de deposición de C3b bajo condiciones fisiológicas Metodos: Un ensayo de deposición de C3b se realizó bajo condiciones fisiológicas (BBS/ Mg++/Ca++) (que permite que tanto PT como AP funcionen) con diluciones crecientes de los siguientes sueros de ratón: Factor D y WT.

Resultados: La fig. 27 ilustra gráficamente el nivel de la deposición de C3b (OD 405 nm) como una función de la concentración sérica utilizando muestras de sueros de ratón de factor D y WT en un ensayo de deposición de C3b llevado a cabo bajo condiciones fisiológicas (en presencia de Ca++ como se muestra en la fig. 27, el suero de ratón de factor D -/- activa C3 a través de tanto la vía de la lectina como la vía alternativa sin diferencia en comparación con suero WT a través de las diluciones de suero indicadas. El suero de MASP- -/- muestra el giro de C3 en diluciones de suero inferiores solamente por la vía alternativa (es decir, activación de la vía alternativa impulsada por MASP-3). Estos resultados indican que en presencia de Ca++ el factor D no es necesario dado que MASP-3 puede impulsar la actividad de la vía alternativa.

Experimento #3: Ensayo de Deposición de C3b Usando Sueros de Ratón deficientes de factor B o factor D en presencia o ausencia de MASP -2 mAb .

Métodos: Un ensayo de deposición de C3b se llevó a cabo bajo condiciones fisiológicas (BBS/Ca++/Mg++) en placas de microtitulación recubiertas con manano como sigue: 1. Las placas de microtitulación de ELISA se recubrieron durante la noche a 4°C con manano (1 mg/ml) en tampón de recubrimiento (15 mM de Na2C03, 35 mM de NaHC03, 0.02% de azida de sodio, pH 9.6). 2. Al día siguiente, los sitios de unión de proteínas residuales se bloquearon durante 2 horas a temperatura ambiente con 250 ml/pocillo con 0.1% de HSA en BBS (4 mM de barbital, 145 M de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, pH 7.4). 3. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado (TBS con 0.05% de Tween 20 y 5 mM de CaCl2). 4. Se añadieron muestras de suero 1:10 diluidas en BBS a los pocilios en los puntos de tiempo especificados. Los pocilios que sólo recibieron tampón se utilizaron como controles negativos. La placa se incubó a 37°C durante un máximo de 40 minutos. 5. A continuación las placas se lavaron 3 veces con el tampón de lavado. 6. Después, 100 ml de C3c de conejo anti-humano (Dako) diluido 1 5000 en tampón de lavado se añadieron a los pocilios y las placas se incubaron durante 90 minutos a 37°C. 7. Después de ser lavado por tres veces con tampón de lavado, 100 ml de anti-conejo conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1: 5000 en tampón de lavado se añadieron a los pocilios, seguido por incubación durante 90 minutos a temperatura ambiente. 8. Después del lavado, la fosfatasa alcalina se detectó mediante la adición de 100 m? de solución de sustrato. 9. Después de la incubación durante 15 minutos, la densidad óptica se midió a OD 405 nm.

Resultados: La fig. 28 ilustra gráficamente el nivel de la deposición de C3b (OD 405 nm) como una función del tiempo de incubación en suero (minutos) en muestras de suero de ratón obtenidas a partir ratones de factor D -/- o factor B -/- en la presencia o ausencia de MASP-2 mAb en un ensayo de deposición de C3b llevado a cabo bajo condiciones fisiológicas (en presencia de Ca++). Como se muestra en la fig. 28, No hay diferencia en la cantidad de deposición de C3b en el suero WT y de factor D -/-, proporcionando un fuerte apoyo a la conclusión de que MASP-3 puede iniciar la activación de la via alternativa, incluso en ausencia del factor D. La señal observada se cree que se debe a la activación de tanto la vía de la lectina y como la vía alternativa. Como se muestra además en la fig. 28, el factor D -/- más MASP-2 mAb muestra únicamente activación de la vía alternativa mediada por MASP-3. El factor B -/-más de MASP-2 mAb fue sólo de antecedente (datos no mostrados). El suero inactivado por calor se utiliza como el valor de control de fondo, que fue idéntico al factor D -/- y factor B -/- con MASP-2 (datos no mostrados).

En resumen, los resultados en este ejemplo demuestran que el factor D es sólo es esencial en condiciones no fisiológicas (es decir, cuando se prueba la activación de la vía alternativa en BBS/EGTA/Mg++ en ausencia de Ca++). En contraste, cuando las pruebas de activación de la vía alternativa en condiciones fisiológicas (en presencia de Ca++), que permiten que la vía alternativa se active a través de MASP-3, el suero deficiente de factor -D no es en absoluto deficiente en actividad de la vía alternativa en comparación con el control WT. Por lo tanto, en condiciones fisiológicas, el factor D es redundante, en que la iniciación de la activación de la vía alternativa es impulsada por MASP-3. Estos resultados apoyan la conclusión de que la via de la lectina dirige la activación de AP a través de un evento de activación dependiente de MASP-3.

EJEMPLO 8 Este ejemplo describe métodos ejemplares para la producción de anticuerpos monoclonales murinos contra polipéptidos de MASP-1, MASP-2 o MASP-3 humano, y para generar anticuerpos específicos duales o biespecífíeos de anticuerpos pan-específicos de MASP. 2. Métodos para generar anticuerpos de MASP Ratones macho A/J ( Harían, Houston, Texas) de 8 a 12 semanas de edad, se inyectan subcutáneamente con 100 pg de polipéptidos humanos de longitud completa: rASP-1 (SEQ ID NO:10), rMASP-2 (SEQ ID No: 5) o rMASP-3 (SEQ ID No:8) o fragmentos de antigenos de los mismos, por ejemplo como se establece en la Tabla 2, en adyuvante completo d eFreund ( Difeo Laboratories, Detroit, Mich.) en 200 ml de salina tamponada de fosfato (PBS) pH 7.4. Después de dos semanas, los ratones se inyectan subcutáneamente con 50 mg del mismo polipéptido humano en adyuvante incompleto de Freud. En la semana seis, los ratones son inyectados con 50 pg del mismo polipéptido humano en PBS y se fusionan 4 dias después.

Para cada fusión, las suspensiones unicelulares se preparan del bazo de un ratón inmunizado y se usan para fusión con células de mieloma Sp2/0.5xl08 de las células del bazo Sp2/0 y 5xl08 de las células del bazo se fusionan en un medio que contiene 50% de polietilen glicol (M.w: 1450) {Kodak, Rochester, N.Y.), y 5% de dimetilsulfóxido ( Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Las células después se ajustan a una concentración de 1.5xl05 células de bazo por 200 ml de la suspensión en medio de Iscove ( Gibco , Grand Island, N.Y.), complementado con 10% de suero fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 100 mg/ml de estreptomicina, 0.1 mM de hipoxantina, 0.4 pM de aminopterina y 16 pM de timidina. Doscientos microlitros de la suspensión celular se añaden a cada pocilio contenido en casi veinte placas de microcultivo de 96 pocilios. Después de aproximadamente diez dias, los sobrenadantes del cultivo son retirados para su proyección para reactividad con el antigeno purificado objetivo (MASP-1, MASP-2 o MASP-3 o el fragmento de antigeno de la Tabla 2) en un ensayo de ELISA.

Ensayo de ELISA (descrito con referencia a MASP-2) : Placas de microensayo de pocilios de Immulon 2 ( Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) se recubren mediante la adición de 50 ml de hMASP-2 purificado a 50 ng/ml durante la noche a temperatura ambiente. La baja concentración de MASP-2 utilizada para el recubrimiento permite la selección de anticuerpos de alta afinidad. Después de retirar la solución de recubrimiento con un movimiento rápido de la placa, 200 ml de BLOTTO (leche seca no grasa) en PBS se añadieron a cada pocilio durante una hora para bloquear los sitios no específicos. Una hora más tarde, los pocilios se lavaron a continuación con un tampón de PBST (PBS que contenia 0.05% de Tween 20). Los sobrenadantes de cultivo de cada pocilio de fusión (50 uL) se mezclan con 50 m? de BLOTTO y luego se añaden a pocilios individuales recubiertos de MASP-2 de las placas de microensayo. Después de una hora de incubación, los pocilios se lavaron con PBST y el anticuerpo de unión a MASP-2 se detecta mediante la adición de peroxidasa de rábano (HRP) conjugada con IgG de cabra anti-ratón (especifico de Fe) ( Jackson ImmunoR.es earch Laboratories, West Grove, PA.). La IgG anti-ratón conjugada con HRP se diluye apropiadamente en BLOTTO para proporcionar una señal apropiada de relación de ruido, y se añade a cada pocilio que contiene la muestra. Después del lavado, el limite de anticuerpo conjugado con HRP se detectó con la solución de sustrato de peroxidasa. La solución de sustrato de peroxidasa que contiene 0.1% de 3,3,5,5 tetrametil bencidina ( Sigma, St. Louis, MO) y 0.0003% de peróxido de hidrógeno { Sigma) se añadió a los pocilios para el desarrollo de color durante 30 minutos. La reacción se terminó por adición de 50 ml de 2M de H2SO4 por pocilio y la densidad óptica a 450 nm de la mezcla de reacción se mide con un lector ELISA de BioTek ( BioTek Instruments, Winooski, Vt.).

Ensayo de unión (descrito con referencia a MASP-2) : Los sobrenadantes de cultivo que dieron positivo en el ensayo de ELISA de MASP-2 descrito anteriormente se pueden probar en un ensayo de unión para determinar la afinidad de unión que los agentes inhibidores de MASP-2 tienen para MASP-2. Un ensayo similar se puede utilizar también para determinar si los agentes inhibidores se unen a otros antigenos en el sistema del complemento.

Los pocilios de las placas de microtitulación de poliestireno (placas de medio de unión de 96 pocilios, Corning Costar, Cambridge, Massachusetts.) se recubren con MASP-2 (20 ng/100 ml/pocillo, Advanced Technology Research, San Diego, Calif.) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7.4 durante la noche a 4°C. Después de aspirar la solución de MASP-2, los pocilios se bloquean con PBS que contenia 1% de albúmina de suero bovino (BSA; Sigma Chemical) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pocilios sin recubrimiento de MASP-2 sirven como controles de fondo. Las alícuotas de los sobrenadantes de hibridoma o MASP-2 MoAbs purificados, en concentraciones variables en la solución de bloqueo de BSA PBS, se añaden a los pocilios. Después de una incubación de dos horas a temperatura ambiente, los pocilios se enjuagan extensivamente con PBS. MASP-2 MoAb unido a MASP-2 se detecta por la adición de conjugado con peroxidasa de IgG de cabra anti-ratón ( Sigma Chemical) en solución de bloqueo, que se deja incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se enjuaga de nuevo a fondo con PBS, y se añaden 100 ml de 3,3'5,5'-tetrametíl bencidina (TMB) ( Kirkegaard and Perry Laboratories , Gaithersburg, MD). La reacción de TMB se interrumpe mediante la adición de 100 m? de ácido fosfórico 1M, y la placa se lee a 450 nm en un lector de microplacas ( SPECTRA MAX 250, Molecular Devices, Sunnyvale, Calif.).

Los sobrenadantes de cultivo de los pocilios positivos se ensayaron a continuación para la capacidad de inhibir la activación del complemento en un ensayo funcional tal como el ensayo de escisión de C4 como se describe en el presente documento (Ejemplo 9). Las células positivas en los pocilios se clonan luego por dilución limitante. Los MoAb se prueban de nuevo por reactividad con hMASP-2 en un ensayo de ELISA como se describe anteriormente. Los hibridomas seleccionados se cultivan en matraces de agitación y el sobrenadante de cultivo usado es recolectado para la purificación de anticuerpos por cromatografía de afinidad de proteína A.

Los anticuerpos de MASP-2 pueden ensayarse para la actividad inhibidora de LEA-2 en un ensayo de escisión de C4, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 9.

Mientras que los anteriores ensayos de ELISA y de unión se describen con referencia a MASP-2, se entenderá por los expertos en la téenica que los mismos ensayos de ELISA y de unión se pueden llevar a cabo utilizando polipéptidos de MASP-1 o MASP-3 y fragmentos de antígeno de los mismos (por ejemplo, como se describe en la Tabla 2). Los anticuerpos de MASP-3 se pueden ensayar para la inhibición de la escisión de la serina proteasa de MASP-3 de un sustrato de MASP-3 y para la actividad inhibidora de LEA-1 en un ensayo de deposición de C3b, por ejemplo como se describe en el Ejemplo 4, en un ensayo de hemolisis como se describe en el Ejemplo 5. Los anticuerpos de MASP-1 se pueden ensayar para la inhibición de la escisión de la serina proteasa de MASP-1 de un sustrato de MASP-1, para la inhibición de la activación de MASP-3, y para la actividad inhibidora de LEA-1 un ensayo de deposición de C3b, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 4, y en un ensayo de hemolisis como se describe en el Ejemplo 5. 2. Metodos para Generar Anticuerpos duales de MASP Anticuerpos inhibidores duales de MASP-2/3: Como se muestra en las figuras 4, 6 y 7C, hay regiones conservadas entre MASP-2 y MASP-3 en el dominio de serina proteasa, codificadas por la cadena beta de la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 8. Por lo tanto, un anticuerpo dual de MASP-2/3 se puede generar usando un antigeno que comprende o que consiste en el dominio de serina proteasa de MASP-2 (o MASP-3), tal como la cadena beta de la SEQ ID NO: 5 (o SEQ ID NO: 8) para generar un anticuerpo monoclonal como se describe anteriormente, o alternativamente, este antigeno se puede usar para cribar una biblioteca de fagos de clones que se unen especificamente a este antigeno, seguido por la detección de la unión dual para MASP- 3 (o MASP-1). El anticuerpo dual de MASP-2/3 se criba para la actividad inhibidora en un ensayo funcional, por ejemplo como se describe en la TABLA 2.

Anticuerpos inhibidores duales de MASP-1/3: Como se muestra en las figuras 3-5, MASP-1 y MASP-3 comparten una región conservada en el dominio idéntico CUBI-CCP2 (aa 25-432 de SEQ ID NO: 10), que también es compartido por MAp44. Como se muestra en la fig.3, MAp44 no contiene un dominio CCP2. Por lo tanto, un anticuerpo dual de MASP-1/3 incluye todos los MAp44 generados utilizando un antigeno que comprende o que consiste en el dominio CUBI-CCP-2 de MASP-1 (o MASP-3) para generar un anticuerpo monoclonal como se describe anteriormente, o alternativamente, este antigeno se utiliza para cribar una biblioteca de fagos de clones que se unen específicamente a este antígeno, seguido por la detección de la unión dual a MASP-3 (o MASP-1). Un anticuerpo dual de MASP-1/3 exclusivo de MAp44 se genera de una manera similar, utilizando un antígeno que comprende o que consiste en el dominio CCP2 de MASP-1 (o MASP-3). El tercer anticuerpo dual de MASP se criba para la actividad inhibidora en un ensayo funcional, por ejemplo como se describe en la TABLA 2.

Anticuerpos inhibidores duales de MASP-1/2: Como se muestra en las figura.4, 6 y 7A, el dominio de serina proteasa de MASP-1 y MASP-2 contiene regiones que se conservan. Por lo tanto, un anticuerpo dual de MASP-1/2 se genera utilizando un antigeno que comprende o que consiste en el dominio de serina proteasa de MASP-1 (o MASP-2) para generar un anticuerpo monoclonal como se describe anteriormente, o alternativamente, este antigeno se utiliza para seleccionar una biblioteca de fagos para los clones que se unen específicamente a este antígeno, seguido por la detección de la unión dual a MASP-2 (o MASP-1). El anticuerpo dual de MASP-1/2 se criba para la actividad inhibidora en un ensayo funcional, por ejemplo como se describe en la TABLA 2. 3. Metodos para generar anticuerpos de MASP pan-específicos Cadena Alfa: Numerosos parches de identidad entre MASP-2 y MASP-1/3 sugieren que puede ser posible generar anticuerpos monoclonales que se unen a MASP-1/3 y MASP-2. En particular, la mayor parte de la identidad se encuentra dentro de los dominios CUB1-EGF-CUB2, como se muestra en la fig. 5. Los diversos dominios ilustrados en la fig.5 se identificaron de acuerdo con Yongqing, et al,. Biochemica et Biophysica Acta 1824: 253-262 (2012); Teillet et al., J. Biol . Chem 283: 25.715 a 25.724 (2008); Marchler y-Bauer et al, Nucleic Acids Res . 39: D225-229 (2011).

Cadena beta: Numerosas manchas de identidad entre MASP-2 y MASP-1/3, como se muestra en la fig. 6, permitirían la generación de un inhibidor específico de MASP-1/2/3 pan-específico.

Metodos: Los anticuerpos inhibidores pan-específicos de MASP (es decir, los anticuerpos que inhiben la actividad de MASP-1, 2 y 3) se generan de la siguiente manera: 1. Cribar una biblioteca contra dominios CUB1-EGF-CUB2 de cadena alfa de MASP-1/3 y MASP-2 y seleccionar clones que reaccionan de forma cruzada a ambos MASP-1/3 y MASP-2. 2. Cribar los clones para la capacidad de inhibir la actividad funcional, por ejemplo como se describe en la TABLA 2. 3. Utilizar la teenología de maduración de afinidad/funcionalidad DTLacO (Yabuki et al, PLoS ONE, 7 (4): e36032 (2012)) para optimizar ambas uniones a las tres proteínas y la función inhibidora. 4. Como se describe en la Tabla 2, los inhibidores de pan-MASP se pueden utilizar para inhibir la activación del complemento mediada por LEA-1 y LEA-2. 4. Métodos para generar anticuerpos biespecíficos de MASP-2/3 Los anticuerpos biespecíficos inhibidores de MASP-2/3 se generan como sigue: 1. Anticuerpos inhibidores específicos de MASP-2 ejemplares que se unen al dominio CCPl e inhiben la activación del complemento dependiente de MASP-2 han sido identificados, como se describe en los Ejemplos 11-14. 2.-Un anticuerpo inhibidor especifico de MASP-3 se genera mediante el cribado de una biblioteca contra el polipéptido de MASP-3 y la identificación de anticuerpos de MASP-3, como se describe en el Ejemplo 15, seguido del análisis de los anticuerpos para la actividad inhibidora Lde EA-1 en un ensayo funcional, por ejemplo como se describe en la Tabla 2. Los anticuerpos ejemplares de MASP-3 se describen en el Ejemplo 15. 3. La región de unión específica para antígeno de MASP-2 y MASP-3 se clona en un marco para generar un anticuerpo biespecífico. Numerosos formatos de anticuerpos biespecífíeos se han descrito, incluyendo formatos de inmunoglobulina tipo G así como diversas proteínas de fusión y configuraciones de fragmento variable de cadena sencilla (Holmes, Nature Reviews, Drug Discovery 10:798-800 (2011), Müller y Kontermann, Biodrugs 24: 89-98 (2010)). En un ejemplo, los anticuerpos biespecífíeos se pueden generar mediante la fusión de dos hibridomas que expresan anticuerpos contra dos antígenos distintos, resultando en diversos emparejamientos de cadena pesada y ligera, un porcentaje de los cuales comprende una cadena pesada y ligera especifica para un antigeno que se combina con una cadena pesada y ligera especifica para el otro antigeno (Milstein y Cuello, Nature 305: 537-539 (1983)). Un anticuerpo biespecifico similar puede ser generado de forma recombinante, por dos pares de inmunoglobulina de coexpresión de cadena pesada/cadena ligera, donde las dos cadenas pesadas tienen dominios variables ede specificidades diferentes del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (combinación anticuerpo-antígeno) (por ejemplo, sitios de anticuerpos de MASP -2 como se describe en los Ejemplos 11-14, anticuerpos de MASP-3 como se describe en el Ejemplo 15) pueden fusionarse a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferiblemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo al menos parte de la bisagra, regiones CH2, y CH3. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado.

Además de las cadenas pesadas y ligeras emparejadas de inmunoglobulina, la vinculación de fragmentos variables de cadena sencilla especificas para dos objetivos diferentes se ejemplifica en Kipriyanov et al., J. Mol . Biol 293: 41 (1999)). En este ejemplo, un único constructo de expresión de polinucleótido está diseñado para codificar dos pares de regiones variables de cadena pesada y ligera separadas por péptidos conectores, con cada par imparte especificidad a una proteina objetivo distinta. Tras la expresión, el polipéptido se monta en una configuración en la que el par de cadena pesada y ligera especifica para un objetivo forma una superficie de unión al antígeno de la proteina, y el otro par forma una superficie de unión al antigeno por separado, creando una molécula de una sola cadena denominada diacuerpo. Dependiendo de la longitud del enlazador entre el par de la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, el polipéptido también puede ser forzado a dimerizar, dando como resultado la formación de un diacuerpo en tándem.

Por ejemplo, el ADN que codifica los siguientes polipéptidos de inmunoglobulina puede insertarse en uno o más vectores y expresarse en un organismo huésped adecuado para generar los siguientes ejemplos ilustrativos, no limitativos, de anticuerpos bi-especificos.

Anticuerpos biespecificos de MASP-2/3 En una modalidad, se proporciona un anticuerpo biespecifico que se une MASP-2 humano y MASP-3 humano y consta de: (I) una región de unión especifica a MASP-2 que comprende al menos uno o más de los siguientes: a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) un CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 31-35 de SEQ ID NO: 21 ; y ii) un CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 50-65 de SEQ ID NO: 21; y iii) un CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 95-102 de la SEQ ID NO: 21; y/o al menos uno o más de los siguientes: b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) un CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y ii) un CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y iii) un CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y (II) una región de unión especifica a MASP-3, opcionalmente una región de unión especifica a MASP-3 que comprende al menos uno de a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) un CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 31-35 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26; y ii) un CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 50-65 de SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26; y iii) un CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 95-102 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26; y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) un CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29; y ii) un CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29; y iii) un CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.

Anticuerpos biespecificos de MASP-1/2 En una modalidad, se proporciona un anticuerpo biespecifico que se une MASP-1 y humano MASP-2 humano y consta de: (I) una región de unión especifica a MASP-2 que comprende al menos uno o más de los siguientes: a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) un CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 31-35 de SEQ ID NO : 21; y ii) un CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 50-65 de SEQ ID NO: 21; y iii) un CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 95-102 de la SEQ ID NO: 21; y/o al menos uno o más de los siguientes: b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) un CDRl de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y ii) un CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y iii) un CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos 89-97 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y (II) una región de unión especifica de MASP-1 4. La prueba para la actividad inhibidora funcional contra MASP-2 y/o MASP-3 se lleva a cabo, por ejemplo como se describe en la Tabla 2, y como se describe adicionalmente en este documento.

EJEMPLO 9 Este ejemplo describe un ensayo de escisión de C4 in vitro usado como un cribado funcional para identificar los agentes inhibidores de MASP-2 capaces de bloquear la activación del complemento dependiente de MASP-2 via L-ficolina/P35, H-ficolina, M-ficolina o manano.

Ensayo de Escisión de C4; Un ensayo de escisión de C4 ha sido descrito por Petersen, SV, et al., J. Immunol Methods 257:107, 2001, que mide la activación de la via de la lectina resultante del ácido lipoteicoico (LTA) en S. aureus, que se une a L-ficolina.

Reactivos: S. aureus fijado en formalina (DSM20233) se prepara como sigue: Las bacterias se cultivan durante la noche a 37°C en medio tríptico de sangre de soya, se lavan tres veces con PBS, después se fijan durante 1 hora a temperatura ambiente en PBS/0.5% de formalina, y se lavan tres más veces con PBS, antes de ser resuspendidas en tampón de recubrimiento (15 mM de Na2CC>3, 35 mM de NaHCO3, pH 9.6).

Ensayo: Los pocilios de una placa de microtitulación Nunc MaxíSorb ( Nalgene Nunc International, Rochester, NY) son recubiertos con: 100 ml de S. aureus fijado en formalina DSM20233 (OD 550 = 0,5) en tampón de recubrimiento con 1 g de L-ficolina en tampón de recubrimiento. Después de la incubación durante la noche, los pozos se bloguean con albúmina de 0.1% de suero humano (HSA) en TBS (10 mm de Tris-HCl, 140 mM de NaCl, pH 7.4), a continuación, se lavan con TBS gue contiene 0.05% de Tween 20 y 5 mM de CaCl2 (tampón de lavado). Las muestras de suero humano se diluyeron en 20 mM de Tris-HCl, 1M de NaCl, 10 mM de CaCl2, 0.05% de Tritón X-100, 0.1% de HSA, pH 7.4, que impide la activación endógena de C4 y disocia el complejo C1 (compuesto de Clq, Clr y Cls). Los agentes inhibidores de MASP-2, incluyendo MASP-2 MoAbs, se añaden a las muestras de suero en concentraciones variables. Las muestras diluidas se añaden a la placa y se incuban durante la noche a 4°C. Después de 24 horas, las placas se lavan a fondo con tampón de lavado, a continuación, 0.1 g de C4 humana purificada (obtenida como se describe en Dodds, AW , Methods Enzymol . 223: 46, 1993) en 100 ml de 4 mM de barbital, 145 mM de NaCl, 2 mM de CaCl2, 1 M de MgCl2, pH 7.4 se añaden a cada pocilio. Después de 1.5 horas a 37°C, las placas se lavaron de nuevo y la deposición de C4b se detecta usando C4c anti-humano de pollo conjugado con fosfatasa alcalina (obtenido de Immunsystem, Uppsala, Suecia) y se mide usando el fosfato de p-nitrofenil de sustrato colorimétrico.

Ensayo de C4 en Manano : El ensayo descrito anteriormente está adaptado para medir la activación de la vía de la lectina a través de MBL mediante el recubrimiento de la placa con LSP y manano antes de añadir suero mezclado con varios agentes inhibidores de MASP-2.

Ensayo de C4 en H-ficolina (Hakata Ag): El ensayo descrito anteriormente está adaptado para medir la activación de la vía de la lectina a través de H-ficolina mediante el recubrimiento de la placa con LPS y H-ficolina antes de añadir suero mezclado con varios agentes inhibidores de MASP-2.

EJEMPLO 10 El siguiente ensayo se utiliza para probar si un agente inhibidor de MASP bloquea de la via clásica al analizar el efecto de un agente inhibidor de MASP bajo condiciones en las que la via clásica se inicia por los complejos inmunes.

Metodos: Para probar el efecto de un agente inhibidor de MASP en condiciones de activación del complemento donde la via clásica se inicia por los complejos inmunes, muestras de 50 ml por triplicado que contienen 90% de NHS se incuban a 37°C en presencia de 10 mg/ml de complejo inmune o PBS, y también se incluyen muestras por triplicado en paralelo (+/- complejos inmunes) que contienen 200 nM deanticuerpo monoclonal de anti-properdina a incubación de 37°C. Después de una incubación de dos horas a 37°C, 13 mM de EDTA se añaden a todas las muestras para detener la activación del complemento y las muestras se enfriaron inmediatamente a 5°C. Las muestras se almacenan a -70°C antes de ser ensayadas para los productos de activación del complemento (C3a y sC5b-9) usando kits de ELISA ( Quidel , números de catálogo. A015 y A009) siguiendo las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 11 Este ejemplo describe la identificación de fragmentos de anticuerpo Fab2 de MASP-2 de alta afinidad que bloquean la actividad de MASP-2.

Antecedentes/Fundamentos: MASP-2 es una proteina compleja con muchos dominios funcionales separados, incluyendo: sitio(s) de unión a MBL y ficolinas, un sitio catalítico de serina proteasa, un sitio de unión al sustrato proteolítico de C2, un sitio de unión al sustrato proteolítico de C4, un sitio de escisión de MASP-2 para la autoactivación de zimógeno de MASP-2, y dos sitios de unión a Ca++. Fragmentos de anticuerpos Fab2 fueron identificados que se unen con alta afinidad a MASP-2, y los fragmentos Fab2 identificados se ensayaron en un ensayo funcional para determinar si eran capaces de bloquear la actividad funcional de MASP-2.

Para bloquear la actividad funcional de MASP-2, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo Fab2 debe unirse e interferir con un epítopo estructural sobre MASP-2 que se requiere para la actividad funcional de MASP-2. Por lo tanto, muchos o la totalidad de Fab2s de alta afinidad de unión a MASP-2 no puede inhibir la actividad funcional de MASP-2 a menos que se unan a epítopos estructurales en MASP-2 que están directamente involucrados en la actividad funcional de MASP-2.

Un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de C3 convertasa de la vía de la lectina se utilizó para evaluar la "actividad de bloqueo" de Fab2s de MASP-2. Se sabe que el papel fisiológico principal de MASP-2 en la vía de la lectina es generar el siguiente componente funcional de la via del complemento mediada por lectina, a saber, la convertasa C3 de la via de la lectina. La C3 convertasa de la via de la lectina es un complejo enzimático critico (C4bC2a) que escinde proteoliticamente C3 en C3a y C3b. MASP-2 no es un componente estructural de la C3 convertasa de la via de la lectina (C4bC2a); Sin embargo, se requiere actividad funcional de MASP-2 con el fin de generar los dos componentes de la proteina (C4b, C2a) que comprenden la C3 convertasa de la via de la lectina. Además, todas las actividades funcionales separadas de MASP-2 en la lista anterior parecen ser necesarias para que MASP-2 genere la convertasa C3 de la via de la lectina. Por estas razones, un ensayo preferido para utilizar en la evaluación de la "actividad de bloqueo" de Fab2s de MASP-2 se cree que es un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de la C3 convertasa de la via de lectina.

Generación de Fab2s de alta afinidad: Se utilizó una biblioteca de presentación de fagos de secuencias ligeras y pesadas variable humanas de anticuerpo y la teenología automatizada de selección de anticuerpos para la identificación de Fab2s que reaccionan con ligandos de interés seleccionados para crear Fab2s de alta afinidad a proteínas de MASP-2 de rata (SEQ ID NO: 13). Una cantidad conocida de proteínas de MASP-2 de rata (aproximadamente 1 mg,> 85% de pureza) se utilizó para la detección de anticuerpos. Tres rondas de amplificación se utilizaron para la selección de los anticuerpos con la mejor afinidad. Aproximadamente 250 diferentes accesos que expresan fragmentos de anticuerpos fueron recolectados para la detección con ELISA. Los accesos de alta afinidad se secuenciaron posteriormente para determinar la singularidad de los diferentes anticuerpos.

Cincuenta anticuerpos únicos de MASP-2 se purificaron y 250 g de cada anticuerpo de Fab2 purificado se utilizó para la caracterización de pruebas funcionales de afinidad de unión a MASP-2 y de vía del complemento, como se describe a mayor detalle más adelante.

Ensayos utilizados para Evaluar la Actividad Inhibidora (de bloqueo) de Fab2s de MASP-2 1. Ensayo para medir la inhibición de la formación de la C3 convertasa de la vía de la lee tina Antecedentes: La C3 convertasa de la vía de la lectina es el complejo enzimático (C4bC2a) que escinde proteolíticamente C3 en dos fragmentos proinflamatorios potentes, C3a anafilotoxina y C3b opsónica. La formación de la C3 convertasa parece ser un paso clave en la via de la lectina en materia de mediación de la inflamación. MASP-2 no es un componente estructural de la C3 convertasa de la via de la lectina (C4bC2a); por lo tanto, los anticuerpos de MASP-2 (o Fab2) no inhiben directamente la actividad de la C3 convertasa preexistente. Sin embargo, se requiere la actividad de la serina proteasa de MASP-2 con el fin de generar los dos componentes de la proteina (C4b, C2a) que comprenden la C3 convertasa de la via de la lectina. Por lo tanto, Fab2 de MASP-2, que inhibe la actividad funcional de MASP-2 (es decir, el bloqueo de Fab2 de MASP-2) inhibirá la formación de novo de la C3 convertasa de la via de la lectina. C3 contiene un grupo tioéster inusual y altamente reactivo como parte de su estructura. Tras la escisión de C3 por ka C3 convertasa en este ensayo, el grupo tioéster de C3b puede formar un enlace covalente con los grupos hidroxilo o amino en macromoléculas inmovilizadas en la parte inferior de los pocilios de plástico a través de enlaces éster o amida, facilitando asi la detección de C3b en el ensayo de ELISA.

El manano de levadura es un activador conocido de la via de la lectina. En el siguiente método para medir la formación de la C3convertasa, pocilios de plástico recubiertos con manano se incubaron durante 30 minutos a 37°C con suero de rata diluido para activar la via de la lectina. Los pocilios a continuación se lavaron y se ensayaron para C3b inmovilizado en los pocilios utilizando métodos estándar de ELISA. La cantidad de C3b generado en este ensayo es un reflejo directo de la formación de novo de la C3 convertasa de la via de la lectina. Fab2s de MASP-2 en concentraciones seleccionadas se ensayaron en este ensayo para su capacidad de inhibir la formación de la C3 convertasa y la consiguiente generación de C3b.

Métodos: Placas de 96 pocilios de medio de unión de Costar se incubaron durante la noche a 5°C con manano diluido en 50 mM de tampón de carbonato, pH 9,5 a 1 mg/50 ml/pocillo. Después de la incubación durante la noche, cada pocilio se lavó tres veces con 200 ml de PBS. Los pocilios se bloquearon a continuación con 100 m?/pocillo de 1% de albúmina de suero bovino en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con mezclado suave. Cada pocilio se lavó tres veces con 200 m? de PBS. Las muestras de Fab2 de MASP-2 se diluyeron a concentraciones seleccionadas en Ca++ y Mg++ que contienen tampón de GVB (4.0 mM de barbital, 141 mM de NaCl, 1.0 mM de MgCl2, 2.0 mM de CaCl2, 0.1% de gelatina, pH 7.4) a 5°C.0.5% de suero de rata se añadió a las muestras anteriores a 5°C y 100 ml fueron trasladados a cada pocilio. Las placas se cubrieron y se incubaron durante 30 minutos en un baño de agua a 37°C. para permitir la activación del complemento. La reacción se detuvo mediante la transferencia de las placas en baño de agua de 37°C a un recipiente que contiene una mezcla de hielo-agua. Cada pocilio se lavó cinco veces con 200 ml con PBS-Tween 20 (0.05% de Tween 20 en PBS), después se lavó dos veces con 200 m? de PBS. Se añadieron 100 m?/pocillo de una dilución 1:10,000 del anticuerpo primario (C3c anti-humano de conejo, DAKO A0062) en PBS que contenía 2.0 mg/ml de albúmina de suero bovino y se incubó 1 hora a temperatura ambiente con mezclado suave. Cada pocilio se lavó 5 veces con 200 m? de PBS. Se añadió dilución 1:10,000 del anticuerpo secundario (conjugado con peroxidasa de IgG de cabra anti-conejo, American Qualex A102PU) en PBS que contenía 2.0 mg/ml de albúmina de suero bovino y se incubó durante una hora a temperatura ambiente en un agitador: con mezclado suave. Cada pocilio se lavó cinco veces con 200 m? de PBS. Se añadieron 100 m?/pocillo de sustrato de peroxidasa T B ( Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. La reacción de la peroxidasa se detuvo añadiendo 100 Tl/pocillo de 1.0 M de H3P04 y se midió el OD45o. 2. Ensayo para medir la Inhibición de la Escisión de C4 dependiente de MASP-2 Antecedentes: La actividad de la serina proteasa de MASP-2 es altamente especifica y sólo dos sustratos proteicos para MASP-2 han sido identificados; C2 y C4. La escisión de C4 genera C4a y C4b. Fab2 de MASP-2 puede unirse a epitopos estructurales sobre MASP-2 que están directamente involucrados en la escisión de C4 (por ejemplo, sitio de unión de MASP-2 a C4; sitio catalítico de serina proteasa de MASP-2) y por tanto, inhibe la actividad funcional de escisión de C4 de MASP- 2.

El manano de levadura es un activador conocido de la vía de la lectina. En el siguiente método para medir la actividad de escisión de C4 de MASP-2, pocilios de plástico recubiertos con manano se incubaron durante 30 minutos a 37°C con suero de rata diluido para activar la vía de la lectina. Debido a que el anticuerpo primario utilizado en este ensayo de ELISA sólo reconoce C4 humano, el suero de rata diluido también se complementó con C4 humano (1.0 mg/mL). Los pocilios a continuación se lavaron y se ensayaron para C4b humano inmovilizado sobre los pocilios de ELISA usando métodos estándar. La cantidad de C4b generado en este ensayo es una medida de la actividad de escisión de C4 dependiente de MASP-2. Se probó Fab2 de MASP-2 a concentraciones seleccionadas en este ensayo para la capacidad de inhibir la escisión de C4.

Metodos: Placas de 96 pocilios de medio de unión de Costar se incubaron durante la noche a 5°C con manano diluido en 50 M de tampón de carbonato, pH 9.5 a 1.0 Tg/50 ml/pocillo. Cada pocilio se lavó 3 veces con 200 ml de PBS. Los pocilios se bloquearon a continuación con 100 m?/pocillo de 1% de albúmina de suero bovino en PBS y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con mezclado suave. Cada pocilio se lavó 3 veces con 200 m? de PBS. Muestras de Fab2 de MASP-2 se diluyeron a concentraciones seleccionadas en Ca++ y Mg++ que contiene tampón de GVB (4.0 mM barbital, 141 mM de NaCl, 1.0 mM de MgCl2, 2.0 mM de CaCl2, 0.1% de gelatina, pH 7.4) a 5°C.1.0 g/ l C4 humano (Quidel) se incluyó también en estas muestras. 0.5% de suero de rata se añadió a las muestras anteriores a 5°C y 100 m? se transfirieron a cada pocilio. Las placas se cubrieron y se incubaron durante 30 minutos en un baño de agua a 37°C. para permitir la activación del complemento. La reacción se detuvo mediante la transferencia de las placas en baño de agua a 37°C. a un recipiente que contiene una mezcla de hielo-agua. Cada pocilio se lavó 5 veces con 200 m? de PBS-Tween 20 (0.05% de Tween 20 en PBS), a continuación, cada pocilio se lavó con 2 veces con 200 ml de PBS.100 ml/pocillo en dilución 1:700 se añadió a PBS que contenia 2.0 mg/ml de albúmina de suero bovino (BSA) conjugado con biotina de C4c anti-humano de pollo ( Immunsystem AB, Uppsala, Suecia) se incubó una hora a temperatura ambiente con mezcla suave. Cada pocilio se lavó 5 veces con 200 m? de PBS. Se añadieron 100 m?/pocillo de 0.1 mg/ml de estreptavidina conjugada con peroxidasa ( Pierce Chemical # 21126) en PBS que contenía 2.0 mg/ml de BSA y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente en un agitador con mezclado suave. Cada pocilio se lavó 5 veces con 200 m? de PBS. Se añadieron 100 m?/pocillo de sustrato de peroxidasa TMB ( Kirkegaard & Perry Laboratories) y se incubaron a temperatura ambiente durante 16 min. La reacción de la peroxidasa se detuvo añadiendo 100 m?/pocillo de 1.0 M H3PO4 y se midió el OD450. 3. Ensayo da A unión de Fab2 MASP-2 arxti-rata a MASP-2 de rata " Nativo " Antecedentes: MASP-2 por lo general está presente en el plasma como un complejo dímero de MASP-2, que también incluye moléculas específicas de lectina (proteína de unión a mañosa (MBL) y ficolinas). Por lo tanto, si uno está interesado en el estudio de la unión de Fab2 de MASP-2 a la forma fisiológicamente relevante de MASP-2, es importante desarrollar un ensayo de unión en el que para la interacción entre Fab2 y MASP-2 "nativo" en el plasma, en lugar de recombinante purificado, se utiliza MASP-2. En este ensayo de unión, el complejo de MBL de MASP-2 "nativo" de 10% de suero de rata se inmoviliza primero en pocilios recubiertos con manano. La afinidad de unión de diversos Fab2s de MASP-2 a MASP-2 inmovilizado 'nativo' fue después estudiada utilizando una metodología estándar de ELISA.

Métodos: Placas de 96 pocilios de medio de unión de Costar se incubaron durante la noche a 5°C con manano diluido en 50 mM de tampón de carbonato, pH 9.5 a 1.0 Tg/50 ml/pocillo. Cada pocilio se lavó 3 veces con 200 ml de PBS. Los pocilios se bloquearon con 100 m?/pocillo de 0.5% de leche seca no grasa en PBST (PBS con 0.05% de Tween 20) y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con mezclado suave. Cada pocilio se lavó 3 veces con 200 m? de TBS/Tween/Ca++. El tampón de lavado (salina tamponada de Tris, 0.05% de Tween 20, con contenido de 5.0 mM de CaCl2, pH 7.4). 10% de suero de rata en Tampón de Unión Alto en Sales (20 mM de Tris, 1.0 M de NaCl, 10 mM de CaC12, 0.05% de Triton-X100, 0.1% (p/v) de albúmina de suero bovino, pH 7.4) se prepararon en hielo.100 m?/pocillo se añadieron e incubaron durante la noche a 5!C. Los pocilios se lavaron 3 veces con 200 ml de tampón de lavado de TBS/Tween/Ca++. Los pocilios se lavaron después 2 veces con 200 ml de PBS.100 m?/pocillo de concentración seleccionada de Fab2 de MASP-2 diluidas en tampón de Gvb con contenido de Ca++ y Mg++ (4.0 mM barbital, 141 mM de NaCl, 1.0 mM de MgCl2, 2.0 mM de CaCl2, 0.1% de gelatina, pH 7.4) se añadieron y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con mezclado suave. Cada pocilio se lavó 5 veces con 200 m? de PBS. 100 m?/pocillo de anti-Fab2 de cabra conjugado con HRP ( Biog nesis Cat. No.0500-0099) diludio 1:5000 en 2.0 mg/mL de albúmina de suero bovino en PBS se añadieron e incubaron durante una hora a temperatura ambiente con mezclado suave. Cada pocilio se lavó 5 veces con 200 m? de PBS. 100 m?/pocillo del sustrato de peroxidasa TMB ( Kirkegaard & Perry Laboratories) se añadieron e incubaron a temperatura ambiente durante 70 minutos. La reacción de peroxidasa se detuvo añadiendo 100 m?/pocillo de 1.0 M de H3PO4 y se midió el OD50.

Resultados: Aproximadamente 250 diferentes Fab2s gue reaccionaron con alta afinidad a la proteina de MASP-2 de rata fueron recolectados para la detección en ELISA. Estos Fab2s de alta afinidad fueron secuenciados para determinar la singularidad de los diferentes anticuerpos, y 50 anticuerpos de MASP-2 únicos se purificaron para su posterior análisis. 250 ug de cada anticuerpo de Fab2 purificado se utilizaron para la caracterización de las pruebas de funcionalidad de afinidad de unión y vía del complemento de MASP-2. Los resultados de este análisis se muestran a continuación en la Tabla 13.

TABLA 13: FAB2 DE MASP2 QUE BLOQUEA LA ACTIVACION DEL COMPLEMENTO DE LA VÍA DE LAS LECTINAS Como se muestra anteriormente en la Tabla 13, de los 50 Fab2s de MASP-2 probados, 17 fueron identificados como Fab2s de bloqueo de MASP-2 que inhiben potentemente la formación de la C3 convertasa con IC50 igual o menor que 10 nM de Fab2s (una tasa de acierto positivo del 34%). Ocho de los 17 Fab2s identificados tienen IC50s en un rango subnanomolar. Por otra parte, diecisiete de los Fab2s de bloqueo de MASP-2 mostrados en la Tabla 13 dieron la inhibición esencialmente completa de la formación de la C3 convertasa en el ensayo de la C3 convertasa de la vía de las lectinas. Esta es una consideración importante, ya que es teóricamente posible que un Fab2 de "bloqueo" pueda sólo inhibir fraccionalmente la función de MASP-2 incluso cuando cada molécula de MASP-2 está unida por Fab2.

Aunque el manano es un activador conocido de la vía de la lectina, es teóricamente posible que la presencia de anticuerpos anti-manano en el suero de rata también pueda activar la vía clásica y generar C3b a través de la C3 convertasa de la vía clásica. Sin embargo, cada uno de los diecisiete Fab2s de bloqueo de MASP-2 enumerados en este ejemplo inhibe potentemente la generación de C3b (> 95%), demostrando así la especificidad de este ensayo para la C3 convertasa de la vía de la lectina.

Los ensayos de unión se realizaron también con todos los diecisiete Fab2s de bloqueo con el fin de calcular un Kd aparente para cada uno. Los resultados de los ensayos de unión de Fab2s de MASP-2 anti-rata a MASP-2 de rata nativa para seis de los Fab2s de bloqueo también se muestran en la tabla 13. Ensayos de unión similares también se realizaron para los otros Fab2s, cuyos resultados se muestran en la Tabla 13. En general, la Kd aparente obtenidos por la unión de cada uno de los seis Fab2s a MASP-2 'nativo' corresponde razonablemente bien con la IC5o para Fab2 en el ensayo funcional de C3 convertasa. Hay evidencia de que MASP-2 sufre un cambio conformacional de una forma "inactiva" a una forma "activa" tras la activación de la actividad de su proteasa (Feinberg et al,. EMBO J. 22: 2348-59 (2003); Gal et al., J. Biol Chem 280: 33435-44 (2005)). En el plasma de rata normal utilizado en el ensayo de formación de la C3convertasa, MASP-2 está presente principalmente en la conformación de zimógeno "inactivo". En cambio, en el ensayo de unión, MASP-2 está presente como parte de un complejo con MBL unido a manano inmovilizado; Por lo tanto, MASP-2 estarla en la conformación "activa" (Petersen et al,. J. Immunol Methods. 257: 107-16, 2001). En consecuencia, uno no necesariamente espera una correspondencia exacta entre el IC5o y Kd para cada uno de los diecisiete Fab2s de bloqueo a prueba en estos dos ensayos funcionales porque, en cada ensayo, el Fab2 seria vinculante de una forma conformacional diferente de MASP-2. Sin embargo, con la excepción de Fab2 # 88, no parece haber una estrecha correspondencia razonable entre el IC50 y Kd aparente para cada uno de los otros dieciséis Fab2 probados en los dos ensayos (véase la Tabla 13).

Varios de los Fab2s de bloqueo fueron evaluados para la inhibición de la escisión de C4 mediada por MASP-2. Como se muestra en la Tabla 13, todos los Fab2s probados resultaron inhibir la escisión de C4 con IC50S similares a las obtenidas en el ensayo de la C3 convertasa.

Aunque el manano es un activador conocido de la via de la lectina, es teóricamente posible que la presencia de anticuerpos anti-manano en el suero de rata también pueda activar la via clásica y de ese modo generar C4b por escisión mediada por Cls de C4. Sin embargo, varios Fab2s de MASP-2 han sido identificados que inhiben potentemente la generación de C4b (> 95%), demostrando asi la especificidad de este ensayo para la escisión de C4 mediada por MASP-2. C4, como C3, contiene un grupo tioéster inusual y altamente reactivo como parte de su estructura. Tras la escisión de C4 por MASP-2 en este ensayo, el grupo tioéster en C4b puede formar un enlace covalente con los grupos hidroxilo o amino en macromoléculas inmovilizadas en la parte inferior de los pocilios de plástico a través de enlaces éster o amida, facilitando asi la detección de C4b en el ensayo de ELISA.

Estos estudios demuestran claramente la creación de FAB2s alta afinidad a proteina de MASP-2 de rata que bloquea funcionalmente la actividad de la C4 y C3 convertasa, evitando asi la activación de la via de las lectinas.

EJEMPLO 12 Este ejemplo describe el mapeo de epitopos para varios de los anticuerpos de bloqueo de Fab2 de MASP-2 de rata que se generaron como se describe en el Ejemplo 11.

Metodos: Las siguientes proteínas, todas con etiquetas 6 c His de N-terminal se expresaron en células CHO utilizando el vector pED4: MASP-2A de rata, una proteína de longitud completa de MASP-2, inactivada mediante la alteración de la serina en el centro activo a alanina (S613A); MASP-2K de rata, un proteína de longitud completa de MASP-2 alterada para reducir la autoactivación (R424K); CUBI-II, un fragmento N-terminal de MASP-2 de rata que contiene los dominios tipo CUBI, EGF y CUBII; y Tipo CUBI/EGF, un fragmento N-terminal de MASP-2 de rata que contiene los dominios tipo CUBI y EGF únicamente.

Estas proteínas se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo por cromatografía de afinidad con níquel, como se describe previamente (Chen et al,. J. Biol Chem. 276: 25894-02 (2001)).

Un polipéptido C-terminal (CCPII-SP), que contiene CCPII y el dominio de serina proteasa de MASP-2 de rata, se expresó en E. coli como una proteína de fusión tiorredoxina utilizando pTrxFus ( Invitrogen) . La proteína se purificó a partir de lisados celulares usando resina de afinidad Thiobond. La pareja de fusión de tiorredoxina se expresó a partir pTrxFus vacío como control negativo.

Todas las proteínas recombinantes se dializaron en tampón TBS y sus concentraciones se determinaron midiendo el OD a 280 nm.

Análisis de Dot Blot: Las diluciones en serie de los cinco polipéptidos recombinantes de MASP-2 descritos anteriormente (y el polipéptido de tiorredoxina como un control negativo para el polipéptido de la serina proteasa de CCPII) fueron salpicados en una membrana de nitrocelulosa. La cantidad de proteína salpicada varió de 100 ng a 6.4 mg, en pasos de cinco veces. En experimentos posteriores, la cantidad de proteína salpicada varió de 50 ng a 16 pg, de nuevo en los pasos de cinco veces. Las membranas se bloquearon con 5% de leche desnatada en polvo en TBS (tampón de bloqueo) después se incubaron con 1.0 g/ml de Fab2s de MASP-2 en tampón de bloqueo (que contiene 5.0 mM de Ca++). Los Fab2s unidos se detectaron usando Fab anti-humano conjugado con HRP ( ABD/Serotec; diluido 1/10,000) y un kit de detección ECL ( Amersham). Una membrana se incubó con anticuerpo de MASP-2 Ab policlonal humano anti-conejo (descrito en Stover et al,. J Immunol 163: 6848-59 (1999)) como control positivo. En este caso, la unión a Ab se detectó utilizando IgG de cabra anti-conejo conjugado con HRP (Dako, diluido 1/2,000).

Ensayo de Unión a MASP-2: Las placas de ELISA se recubrieron con 1.0 mg/pocillo de MASP-2A recombinante o polipéptido de CUBI-II en tampón de carbonato (pH 9.0) durante la noche a 4°C. Los pocilios se bloquearon con 1% de BSA en TBS, después la diluciones seriadas de Fab2s de MASP-2 se añadieron en TBS que contiene 5.0 mM de Ca++. Las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces con TBS/Tween/Ca++, Fab anti-humano conjugado con HRP ( ABD/Serotec) diluido 1/10,000 en TBS/Ca++ se añadió y las placas se incubaron durante una hora más a temperatura ambiente. El anticuerpo unido se detectó usando un kit de sustrato de peroxidasa TMB ( Biorad).

Resultados: Los resultados del análisis dot blot que demuestran la reactividad de los Fab2s con diversos polipéptidos de MASP-2 se proporcionan a continuación en la Tabla 14. Los valores numéricos proporcionados en la Tabla 14 indican la cantidad de proteina salpicada requerida para dar la intensidad de señal a aproximadamente la mitad de la máxima. Como se muestra, todos los polipéptidos (con la excepción de la pareja de fusión de tiorredoxina sola) fueron reconocidos por el control positivo Ab (sueros de MASP-2 policlonal anti-humano, generado en conejos).

TABLA 14: REACTIVIDAD CON VARIOS POLIPÉPTIDOS DE MASP-2 RECOMBINANTES DE RATA EN DOT BLOTS NR= Sin reacción, El anticuerpo de control positivo es suero de MASP-2 policlonal anti-humano, generado en conejos.

Todos los Fab2s reaccionaron con MASP-2A asi como con MASP-2K (datos no mostrados). La mayoría de los Fab2s reconocieron el polipéptido de CCPII-SP, pero no los fragmentos N-terminal. Las dos excepciones son Fab2 #60 y Fab2 #57. Fab2 #60 reconoce MASP-2A y el fragmento de CUBI-II, pero no el polipéptido tipo CUBI/EGF o el polipéptido CCPII-SP, sugiriendo que se une a un epitopo en CUBII, o que abarca los dominios CUBII y tipo EGF. Fab2 #57 reconoce MASP-2A pero ninguno de los fragmentos de MASP-2 probados, tal vez indicando que este Fab2 reconoce un epitopo en CCP1. Fab2 #40 y #49 se unen a MASP-2A completo únicamente. En el ensayo de unión de ELISA, Fab2 #60 también se une al polipéptido de CUBI-II, aunque con una afinidad aparente ligeramente menor (datos no mostrados).

Estos descubrimientos demuestran la identificación de Fab2S de bloqueo únicos con múltiples regiones de la proteina de MASP-2.

EJEMPLO 13 Este ejemplo describe el análisis de la farmacodinámica de los anticuerpos de Fab2 de MASP-2 de alta afinidad representativos que se identificaron como se describe en el Ejemplo 11.

Antecedentes/Fundamentos: Como se ha descrito en el Ejemplo 11, con el fin de identificar los anticuerpos de alta afinidad que bloquean la vía de la lectina de rata, proteina MASP-2 de rata se utilizó para desplazar una biblioteca de presentación de fagos. Esta biblioteca fue diseñada para proporcionar alta diversidad inmunológica y se construyó utilizando secuencias de genes de inmunoglobulina totalmente humanos. Como se muestra en el Ejemplo 11, se identificaron aproximadamente 250 clones de fagos individuales que se unen con alta afinidad a la proteina de MASP-2 de rata por cribado de ELISA. La secuenciación de estos clones identificó 50 fagos únicos de codificación de anticuerpo de MASP-2. La proteina de Fab2 se expresó a partir de estos clones, se purificó y analizó para afinidad de unión a MASP-2 y la inhibición funcional de la via del complemento y de la lectina.

Como se muestra en la Tabla 13 del Ejemplo 11, se identificaron 17 Fab2s de MASP-2 con actividad de bloqueo funcional como resultado de este análisis (una tasa de éxito del 34% para el bloqueo de anticuerpos). La inhibición funcional de la via del complemento de lectina por Fab2s fue evidente en el nivel de la deposición de C4, que es una medida directa de la escisión de C4 por MASP-2. Es importante destacar que la inhibición fue igualmente evidente cuando se evaluó la actividad de la C3 convertasa, lo que demuestra el bloqueo funcional de la via del complemento de lectina. Los 17 Fab2s de bloqueo de MASP-2 identificados como se describe en el Ejemplo 11 inhiben potentemente la formación de la C3 convertasa con valores IC5o iguales o inferiores a 10 nM. Ocho de los 17 Fab2s identificados tienen valores IC50 en el rango sub-nanomolar. Por otra parte, los 17 Fab2s de bloqueo de MASP-2 arrojaron inhibición esencialmente completa de la formación de la C3 convertasa en el ensayo de la C3 convertasa de la vía de la lectina, que se resumen en la Tabla 13 del Ejemplo 11. Por otra parte, cada uno de los 17 Fab2s de bloqueo de MASP-2 mostrados en la TABLA 13 inhiben potentemente la generación de C3b (> 95%), demostrando asi la especificidad de este ensayo para la C3 convertasa de la vía de la lectina.

Variantes de isotipos de anticuerpos de longitud completa de IgG2a de ratón e IgG2c de rata se derivaron de Fab2 #11. Este ejemplo describe la caracterización in vivo de estos isotipos para los parámetros farmacodinámicos.

Metodos: Como se ha descrito en el Ejemplo 11, proteina de MASP-2 de rata se utilizó para desplazar una biblioteca de presentación de fagos Fab, de la que Fab2 # 11 fue identificado. Las variantes de isotipo de anticuerpos de longitud completa de IgG2a de ratón e IgG2c de rata se derivaron de Fab2 #11. Ambos isotipos de anticuerpos de longitud completa de IgG2c de rata e IgG2a de ratón se caracterizaron in vivo para los parámetros farmacodinámicos como sigue.

Estudio in vivo en ratones: Un estudio farmacodinámico se llevó a cabo en ratones para investigar el efecto de la dosificación de anticuerpos de MASP-2 en la actividad de la via de la lectina de plasma in vivo. En este estudio, la deposición de C4 se midió ex vivo en un ensayo de la via de la lectina en varios puntos de tiempo tras la administración subcutánea (se) y la administración intraperitoneal (ip) de 0.3 g/kg o 1.0 mg/kg del MoAb de MASP-2 de ratón (isotipo de anticuerpo de longitud completa de IgG2a de ratón derivado de Fab2 # 11).

La fig.29A ilustra gráficamente la deposición de C4b especifica de la via de la lectina en una placa de microtitulación recubierta con zimosano, medida ex vivo en muestras de suero sin diluir tomadas de ratones (n = 3 ratones/grupo) en varios puntos de tiempo después de la administración subcutánea de 0.3 mg/kg o 1.0 mg/kg del MoAb de MASP-2 de ratón. Las muestras de suero procedentes de ratones recolectadas antes de la dosificación de anticuerpos sirvieron como controles negativos (actividad 100%), mientras que el suero suplementado in vítro con 100 nM del mismo anticuerpo de bloqueo de MASP-2 se utilizó como control positivo (actividad 0%).

Los resultados mostrados en la fig. 29A demuestran una inhibición rápida y completa de la deposición de C4b después de la administración subcutánea de dosis de 1.0 mg/kg de MoAb de MASP-2 de ratón. Una inhibición parcial de la deposición de C4b se observó después de la administración subcutánea de una dosis de 0.3 mg/kg de MoAb de MASP-2 de ratón.

El curso de tiempo de la recuperación de la vía de la lectina fue seguido por tres semanas después de una sola administración ip de MoAb de MASP-2 de ratón a 0.6 mg/kg en ratones. Como se muestra en la fig. 29B, una precipitación de la actividad de la vía de la lectina se produjo después de la administración de anticuerpos seguida de la inhibición completa de la vía de la lectina que se prolongó durante cerca de 7 dias después de la administración ip. Se observó la restauración de la actividad lenta de la vía de las lectinas en la segunda y tercer semana, con la restauración completa de la vía de las lectinas en los ratones a los 17 días siguientes a la administración de MoAb de MASP-2.

Estos resultados demuestran que el MoAb de MASP-2 de ratón derivado Fab2 # 11 inhibe la vía de la lectina de los ratones de una manera sensible a la dosis cuando se administra sistémicamente.

EJEMPLO 14 Este ejemplo describe la identificación, utilizando visualización de fagos, de anticuerpos de scFv totalmente humanos que se unen a MASP-2 e inhiben la activación del complemento mediada por lectina (LEA-2) al mismo tiempo que dejan el componente de la vía clásica (dependiente de Clq) del sistema inmune intacto.

Información General: Anticuerpos de MASP-2 de alta afinidad, totalmente humanos, se identificaron mediante cribado de una biblioteca de presentación de fagos. Se aislaron los fragmentos de cadena ligera y pesada variables de los anticuerpos, tanto en un formato scFv como en un formato de IgG de longitud completa. Los anticuerpos de MASP-2 humanos son útiles para la inhibición de la lesión celular asociada con la activación de la via alternativa del complemento mediada por la via de la lectina, dejando intacto el componente de la via clásica (dependiente de Clq) del sistema inmune. En algunas modalidades, los anticuerpos inhibidores de MASP-2 del sujeto tienen las siguientes características: (a) alta afinidad para MASP-2 (por ejemplo, una Kd de 10 nM o menos), y (b) inhibir la actividad del complemento dependiente de MASP-2 en 90% de suero humano con una IC5o de 30 nM o menos.

Metodos: Expresión de MASP-2 catalíticamente inactivo de longitud completa La secuencia de ADNc de longitud completa de MASP-2 (SEQ ID NO: 4), que codifica el polipéptido de MASP-2 humano con la secuencia líder (SEQ ID NO: 5) se subclonó en el vector de expresión de pCI-Neo mamífero ( Promega) , que conduce la expresión eucariota bajo el control de la región potenciadora/promotora de CMV (que se describe en Kaufman RJ et al,. Nucleic Acids Research 19: 4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology, 185: 537-66 (1991)). Con el fin de generar la proteina de MASP-2A humano catalíticamente inactiva, la mutagénesis dirigida al sitio se llevó a cabo como se describe en US2007/0172483, que se incorpora aquí por referencia. Los productos de PCR se purificaron después de la electroforesis en gel de agarosa y la preparación en banda y los solapamientos de adenosina individuales se generaron utilizando un procedimiento estándar de reducción. El MASP-2A de adenosina reducido se clonó luego en el vector fácil de pGEM-T y se transformó en E. coli. El MASP-2A humano fue subclonado adicionalmente en cualquiera de los vectores de expresión de pED o pCI-Neo mamífero.

El constructo de expresión de MASP-2A descrito anteriormente se transfectó en células DXB1 utilizando el procedimiento estándar de transfección con fosfato de calcio (Maniatis et al., 1989). MASP-2A se produjo en medio libre de suero para asegurar que los preparativos no fueran contaminados con otras proteínas del suero. El medio se recolectó a partir de células confluentes cada segundo día (cuatro veces en total). El nivel de MASP-2A recombinante promedió aproximadamente 1.5 mg/litro de medio de cultivo. El MASP-2A (muíante de Ser-Ala descrito anteriormente) se purificó por cromatografía de afinidad en columnas de MBP-A-agarosa.

ELISA de MASP-2A en Clones Candidatos de ScFv identificados por paneo/ conversión de scíV y cribado de filtro Una biblioteca de presentación de fagos de inmunoglobulina humana de cadena ligera y pesada de secuencias de región variable de antígeno se sometió a paneo seguido por detección automatizada de anticuerpos y cribado para identificar anticuerpos de alta afinidad a la proteína scFv de MASP-2 humano. Tres rondas paneo de la biblioteca de fagos scFv contra MASP-2A etiquetado con HIS o biotina se llevaron a cabo. La tercera ronda de paneo se eluyó primero con MBL y luego con TEA (alcalino). Para supervisar el enriquecimiento especifico de fagos que presentan fragmentos scFv contra el MASP-2A objetivo, un fago policlonal de ELISA contra MASP-2A inmovilizado se llevó a cabo. Los genes de scFv de la ronda de paneo 3 se clonaron en un vector de expresión de pHOG y se ejecutaron en un cribado de filtro de pequeña escala para buscar clones específicos contra MASP-2A.

Las colonias bacterianas que contienen plás idos que codifican fragmentos de scFv de la tercera ronda de cribado fueron recolectadas, puestos en red sobre membranas de nitrocelulosa y se cultivaron durante la noche en medio de no inducción para producir placas maestras. Un total de 18,000 colonias fueron recolectadas y analizadas de la tercera ronda de paneo, la mitad de la elución competitiva y la mitad de la elución posterior de TEA. El paneo de la biblioteca fagémida de scFv contra MASP-2A seguido por la conversión de scFv y un cribado de filtro dio 137 clones positivos. 108/137 clones fueron positivos en un ensayo de ELISA para la unión de MASP-2 (datos no mostrados), de los que 45 clones se analizaron adicionalmente para la capacidad de bloquear la actividad de MASP-2 en el suero humano normal.

Ensayo para Medir la Inhibición de la Formación de la C3 Convertasa de la Vía de la Lectina Un ensayo funcional que mide la inhibición de la formación de la C3 convertasa de la via de la lectina se utilizó para evaluar la "actividad de bloqueo" de los clones candidatos de scFv de MASP-2. Se requiere actividad de la serina proteasa de MASP-2 con el fin de generar los dos componentes de la proteína (C4b, C2a) que comprenden la C3 convertasa de la vía de la lectina. Por lo tanto, un scFv de MASP-2 que inhibe la actividad funcional de MASP-2 (es decir, un scFv de bloqueo de MASP-2), inhibe la formación de novo de la C3 convertasa de la vía de la lectina. C3 contiene un grupo tioéster inusual y altamente reactivo como parte de su estructura. Tras la escisión de C3 por la C3 convertasa en este ensayo, el grupo tioéster en C3b puede formar un enlace covalente con los grupos hidroxilo o amino en macromoléculas inmovilizadas en la parte inferior de los pocilios de plástico a través de enlaces éster o amida, facilitando así la detección de C3b en el ensayo de ELISA.

El manano de levadura es un activador conocido de la vía de la lectina. En el siguiente método para medir la formación de la C3convertasa, pocilios de plástico recubiertos con manano se incubaron con suero humano diluido para activar la vía de la lectina. Los pocilios a continuación se lavaron y se ensayaron para C3b inmovilizado en los pocilios utilizando métodos estándar de ELISA. La cantidad de C3b generado en este ensayo es un reflejo directo de la formación de novo de la C3 convertasa de la vía de lectina. Los clones seleccionados de MASP-2 a concentraciones de scFv se ensayaron en este ensayo para su capacidad de inhibir la formación de la C3 convertasa y la consiguiente generación de C3b.

Métodos: Los 45 clones candidatos identificados como se describe anteriormente se expresaron, se purificaron y se diluyeron a la misma concentración, que se diluyó de nuevo en Ca++ y Mg++ que contiene tampón de GVB (4.0 mM de barbital, 141 mM de NaCl, 1.0 mM de MgCl2, 2.0 mM de CaCl2, 0.1% de gelatina, pH 7.4) para asegurar que todos los clones tengan la misma cantidad de tampón. Los clones de scFv se ensayaron por triplicado cada uno a una concentración de 2 mg/ml. El control positivo fue OMS100 Fab2 y se ensayó a 0.4 mg/ml. La formación de C3c se monitorizó en presencia y ausencia de los clones de scFv/IgG.

El manano se diluyó a una concentración de 20 mg/ml (1 mg/pocillo) en 50 mM de tampón de carbonato (15 mM de Na2C03, 35 mM de NaHC03, 1.5 mM de NaN3), pH 9.5 y se recubrió sobre una placa de ELISA durante la noche a 4°C. Al día siguiente, las placas recubiertas con manano se lavaron 3 veces con 200 ml de PBS.100 ml de 1% de solución de bloqueo HSA se añadieron a los pocilios y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con 200 m? de PBS, y se almacenaron en hielo con 200 m? de PBS hasta la adición de las muestras.

Suero humano normal se diluyó a 0.5% en tampón de CaMgGVB, y los clones de scFv o el control OMS100 Fab2 positivo se añadieron por triplicado a 0.01 g/ml; 1 mg/ml (sólo OMS100 de control) y 10 mg/ml de este tampón se preincubaron 45 minutos en hielo antes de la adición a la placa de ELISA bloqueada. La reacción se inició mediante incubación durante una hora a 37°C y se detuvo mediante la transferencia de las placas a un baño de hielo. La deposición de C3b se detectó con un anticuerpo de C3c a-Ratón de conejo seguido de HRP de cabra a-conejo. El control negativo fue tampón sin anticuerpo (sin anticuerpo = deposición máxima de C3b), y el control positivo fue tampón con EDTA (sin deposición de C3b). El fondo se determinó llevando a cabo el mismo ensayo excepto que los pocilios fueron libres de manano. La señal de fondo en contra de las placas sin manano se restó de las señales en los pozos que contienen manano. Un criterio de corte se fijó a la mitad de la actividad de un clon de scFv irrelevante (VZV) y tampón solo.

Resultados: Con base en el criterio de corte, se encontró que un total de 13 clones bloquean la actividad de MASP-2. Los 13 clones productores de> 50% de supresión de via se seleccionaron y secuenciaron, obteniéndose 10 clones únicos. Se encontró que los diez clones tuvieron la misma subclase de cadena ligera, X3, pero tres diferentes subclases de cadena pesada: VH2, VH3 y VH6. En el ensayo funcional, cinco de los diez candidatos clones de scFv dieron valores de IC5o nM inferiores a los criterios objetivos de 25 nm usando 0.5% de suero humano.

Para identificar los anticuerpos con potencia mejorada, los tres clones principales de scFv, identificados como se describió anteriormente, se sometieron a mezcla de cadena ligera. Este proceso implicó la generación de una biblioteca combinatoria que consiste en el VH de cada uno de los clones principales en pareja con una biblioteca de cadenas ligeras de lambda humano sin infectar (VL) derivadas de seis donantes sanos. A continuación, esta biblioteca se proyectó para clones de scFv con una mejor afinidad y/o funcionalidad de unión.

TABLA 15: Comparación de la potencia funcional en IC50 (nM) de los clones derivados principales y sus respectivos clones principales (todos en formato scFv) Enseguida se presentan las secuencias de región variable (VH) de cadena pesada para los clones principales y los clones derivados mostrados anteriormente en la Tabla 15, y enumerados más adelante en las Tablas 16 A-F.

Los CDRs de Kabat (31-35 (Jl), 50-65 (J2) y 95-102 (H3)) están en negritas; y los CDRs de Chothia (26-32 (Hl), 52-56 (H2) y 95-101 (H3)) están subrayados.

Región variable de cadena ligera (VH) 17D2035VH-21N11VL (SEQ ID NO: 15, codificada por SEQ ID NO: 14) QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSRGKMGVSWIRQPPGKALEWLAHIFSSDEK SYRTSLKSRLTISKDTSKNQWLTMTNMDPVDTATYYCARIRRGGIDYWGQGTLVTVSS Región variable de cadena pesada (VH) d!7No (SEQ ID NO: 16) QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKW YNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARDPFGVPFDIWGQGTMVT VSS Región Variable de Cadena Pesada TABLA 16A; Cadena Pesada (aa 1-20) TABLA 16B: Cadena pesada (aa 21-40) TABLA 16C: Cadena pesada (aa 41-60) TABLA 16D: Cadena pesada (aa 61-80) TABLA 16E: Cadena pesada (aa 81-100) TABLA 16F: Cadena pesada (aa 101-118) Enseguida se presentan las secuencias regiones variables de cadena ligera (VL) para los clones principales y los clones derivados ennumerados más adelante en las Tablas 17A-F.

Los CDRs de Kabat (24-34 (Ll); 50-56 (L2); y 89-97 (L3) están en negritas; y los Clothia CDRs (24-34 (Ll); 50-56 (L2) y 89-97 (L3) están subrayados. Estas regiones son las mismas ya sea que estén numeradas por el sistema de Kabat o de Chothia.

Región variable de cadena ligera (VL) 14D20m_d3521Nll (SEQ ID NO: 17) QPVLTQPPSLSVSPGQTASITCSGEKLGDKYAYWYQQKPGQSPVLVMYQDKQRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTAVFGGGTKLTVL Región variable de cadena ligera (VL) 17N16m d!7N9 (SEQ ID NO: 19 codificada por la SEQ ID NO: 18) SYELIQPPSVSVAPGQTATITCAGDNLGKKRVHWYQQRPGQAPVLVIYDDSDRPSGIPD RFSASNSGNTATLTITRGEAGDEADYYCQVWDIATDHW FGGGTKLTVLAAAGSEQKLI SE TABLA 17A: Cadena Ligera (aa 1-20) TABLA 17B: Cadena ligera (aa 21-40) TABLA 17C: Cadena Ligera (aa 41-60) TABLA 17D: Cadena ligera (aa 61-80) TABLA 17E: Cadena ligera (aa 81-100) TABLA 17F: Cadena ligera (aa 101-120) Los anticuerpos de MASP-2 OMS100 y MoAb_d3521NllVL, ambos han demostrado unirse a MASP-2 humano con alta afinidad y tienen la capacidad de bloquear la actividad del complemento funcional, se analizaron con respecto al epitopo de unión por análisis de transferencia de puntos. Los resultados muestran que los anticuerpos d3521Nll y OMSIOO son altamente específicos para MASP-2 y no se unen a MASP-1/3. Ni el anticuerpo unido a MApl9 ni los fragmentos de MASP-2 que no contenían el dominio CCP1 de MASP-2, lleva a la conclusión de que los sitios de unión abarcan CCP1.

Por consiguiente, en una modalidad, un agente inhibidor de MASP-2 para su uso en las composiciones y métodos de la invención reivindicada comprende un anticuerpo humano que se une a un polipéptido que consiste en MASP-2 (SEQ ID NO: 3), en el que el anticuerpo comprende: I) a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) un CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 31-35 de SEQ ID NO: 21; y ii) un CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 50-65 de SEQ ID NO: 21; y iii) un CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos 95-102 de la SEQ ID NO: 21; y b) una reqión variable de cadena liqera que comprende: i) un CDR1 de cadena liqera que comprende la secuencia de aminoácidos 24-34 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y ii) un CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos 50-56 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; y iii) un CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos·89-97 de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 27; o ii) una variante de la misma que es por lo demás idéntica a dichos dominios variables, excepto para un máximo de un total combinado de 6 sustituciones de aminoácidos dentro de dichas regiones CDR de dicha cadena pesada de región variable y hasta un total combinado de 6 sustituciones de aminoácidos dentro de dichas regiones CDR de dicha región variable de cadena ligera, donde el anticuerpo o variante del mismo inhibe la activación del complemento dependiente de MASP-2.

EJEMPLO 15 Este ejemplo describe la generación de anticuerpos monoclonales de MASP-1 y MASP-3 usando un sistema in vitro que comprende una linea celular modificada de DT40, DTLacO.

Antecedentes/Fundamentos: Los anticuerpos contra MASP-1 y MASP-3 humano se generaron usando un sistema in vitro que comprende una linea modificada celular DT40, DTLacO, que permite la inducción reversible de la diversificación de un polipéptido particular, tal como se describe con más detalle en W02009029315 y US2010093033. DT40 es una linea celular B de pollo que se sabe que muta constitutivamente sus genes en cultivo de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera (Ig). Al igual que otras células B, esta mutagénesis está dirigida a mutaciones constitutivas de la región V de genes Ig, y por lo tanto, a las CDR de las moléculas de anticuerpo expresadas. La mutagénesis constitutiva en las células DT40 se produce por la conversión de genes utilizando como secuencias donantes de una serie de segmentos no funcionales de genes V (genes pseudo-V; yn) situados ascendente de cada región funcional V. La deleción de la región yn fue demostrada previamente que causa un cambio en el mecanismo de la diversificación de la conversión de genes a la hipermutación somática, el mecanismo observado comúnmente en las células B humanas. La linea de linfoma celular B de pollo DT40 ha demostrado ser un punto de partida prometedor para la evolución de anticuerpos ex vivo (Cumbers, SJ et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005)). Las células DT40 proliferan con fuerza en el cultivo, con un tiempo de duplicación de 8-10 horas (en comparación con 20 a 24 h para lineas celulares B humanas), y apoyan eficientemente la focalización del gen homólogo (Buerstedde, JM et al. Embo J 9, 921- 927 (1990)). Las células DT40 comandan un enorme potencial de la diversidad de la secuencia de región V ya gue pueden acceder a dos vías fisiológicas distintas para la diversificación, la conversión génica y la hipermutación somática, gue crean mutaciones templadas y no templadas, respectivamente (Maizels, N. Annu Rev Genet. 39, 23-46 (2005)). Las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera diversificadas (Igs) se expresan en la forma de una superficie de la célula gue se muestra como IgM. La IgM de superficie tiene una forma bivalente, estructuralmente similar a una molécula de IgG. Las células que muestran IgM con especificidad para un antigeno particular se pueden aislar mediante la unión o bien versiones solubles o de membrana inmovilizadas del antigeno mostrado. Sin embargo, la utilidad de las células DT40 para la evolución del anticuerpo se ha limitado en la práctica porque - al igual que en otras lineas celulares B transformadas - la diversificación ocurre a menos de 1% de tasa fisiológica.

En el sistema usado en este ejemplo, como se describe en W02009029315 y US2010093033, las células DT40 fueron diseñadas para acelerar la velocidad de diversificación del gen Ig sin sacrificar la capacidad para seguir la modificación genética o el potencial tanto de la conversión génica como para la hipermutación somática para contribuir a la mutagénesis. Se hicieron dos modificaciones principales a DT40 para aumentar la tasa de diversificación y, en consecuencia, la complejidad de especificidades de unión en nuestra biblioteca de células. En primer lugar, la diversificación del gen Ig fue puesta bajo el control del potente operador de lactosa/represor red de regulación E. coli. Los multimeros que consisten en aproximadamente 100 repeticiones polimerizadas del potente operador de lactosa E. coli (PolyLacO) se insertaron ascendente de los genes reordenados y expresados IgA e IgH por focalización homologa del gen. Los factores reguladores fusionados a la proteina represora de lactosa (LAD) pueden entonces ser atados a los elementos reguladores de lactosa para regular la diversificación, aprovechando la alta afinidad (KD = 10 14 M) del represor de lactosa para el ADN del operador. Las células DT40 PolyLacO-l R, en donde se integró PolyLacO solamente en IgA, mostraron un aumento de 5 veces en la tasa de diversificación de genes Ig en relación a las células DT40 principales antes de cualquier ingeniería (Cummings, WJ et al. PLoS Biol 5, E246 ( 2007)). La diversificación se elevó aún más en las células diseñadas para llevar a PolyLacO a dirigirse tanto a la IgX como a los genes IgH ("DTLacO"). Las células DTLacO demostraron tener tasas de diversificación de 2.5 a 9.2 veces elevadas en relación con el característico 2.8% de la línea parental DT40 PolyLacO-AR LacI-HPl. Por lo tanto, la orientación de elementos de PolyLacO tanto a la diversificación de genes de la cadena pesada como ligera se aceleró 21.7 veces en relación con la línea celular parental DT40. El anclaje a factores reguladores de los loci de Ig no sólo altera la frecuencia de la mutagénesis, sino que también puede cambiar la vía de la mutagénesis creando de una colección más grande de cambios de secuencia únicos (Cummings et al 2007; Cummings et al 2008.). En segundo lugar, se generó una colección diversa de puntos de partida para la secuencia de diversificación acelerada del factor del gen Ig atado. Estos diversos puntos de secuencia de partida se añadieron a las regiones variables dirigidas a DTLacO dirigiendo las regiones variables de cadena pesada del Ig reconfigurado, aisladas de un polo de dos meses de edad, al locus de cadena pesada. La adición de estas regiones variables de cadena pesada creó un repertorio de 107 nuevos puntos de partida para la diversificación de anticuerpos. La construcción de estos nuevos puntos de partida en la linea celular DTLacO permite la identificación de clones que se unen a un objetivo particular, y luego una rápida maduración de la afinidad por los factores atados. Después de la maduración de afinidad, un IgG quimérico recombinante, de longitud completa, se realiza mediante la clonación secuencias variables de cadena pesada y ligera reconfiguradas, maduradas (VH y VA; que consisten de regiones marco de pollo y regiones determinantes de complementariedad o CDR) en vectores de expresión que contienen IgGl humano y regiones constantes de lambda. Estos mAbs recombinantes son adecuados para aplicaciones in vitro e in vivo, y sirven como punto de partida para la humanización.

Métodos: Selección de unión al antígeno de MASP-1 y MASP-3 Las selecciones iniciales se realizaron por unión poblaciones de DTLacO diversificadas por la orientación de genes a perlas complejadas con antigenode MASP-1 (SEQ ID NO: 10) y MASP-3 (SEQ ID NO: 8); y posteriores selecciones por FACS, utilizando antigeno soluble marcado con fluorescencia (Cumbers, SJ et al. Nat Biotechnol 20, 1129- 1134 (2002); Seo, H. et al Nat Biotechnol . 23, 731-735 (2005.) Debido a la secuencia de aminoácidos conservados en la cadena alfa que se comparte entre MASP-1 y MASP-3 (mostrado en la fig. 5), y las secuencias distintas de cadena beta (mostradas en la fig.6), pantallas paralelas, separadas, para aglutinantes de MASP-1 y MASP-3 se llevaron a cabo para identificar mAb específicos de MASP-1, mAb específicos de MASP-3 y también mAbs capaces de unirse tanto a MASP-1 como MASP-3 (dual específico). Dos formas de antígeno se usaron para seleccionar y cribar aglutinantes. En primer lugar, MASP-1 o MASP-3 recombinante, ya sea de longitud completa o fragmento, fusionado a un dominio Fe se unieron a perlas de Proteína G magnéticas de Dynal o se usaron en selecciones a base de FACS utilizando un anticuerpo secundario de IgG(Fc) anti-humano marcado con PECy5. Alternativamente, las versiones recombinantes de proteínas de MASP-1 o MASP-3 se marcaron directamente con harinas DyLight y se usaron para las selecciones y de cribado.

Unión y Afinidad Los anticuerpos recombinantes se generaron mediante la clonación de regiones V amplificadas por PCR en un vector que apoyó la expresión de IgGl humano en células 293F (Yabuki et al, PLoS ONE, 7 (4): E36032 (2012)). La cinética de unión de saturación se determinó mediante tinción de las células que expresan DTLacO unión a anticuerpo de MASP-1 o MASP-3 con varias concentraciones de antigeno soluble marcado fluorescente. Los ensayos funcionales para la actividad especifica de MASP-3 incluyendo la deposición de C3b dependiente de MASP-3 y la escisión del factor D dependiente de MASP-3-se llevaron a cabo como se describe en los Ejemplos 17 y 18, respectivamente. Un ensayo funcional para la actividad de MASP-1-especifica, a saber, la inhibición la deposición de C3b dependiente de MASP-1 se llevó a cabo como se describe a continuación.

Resultados: Numerosos anticuerpos de unión a MASP-1 y MASP-3 se generaron usando los métodos descritos anteriormente. La unión, como se ha demostrado por análisis FACS, se ha descrito para los clones representativos M3J5 y M3M1, que se aislaron en los cribados para unión de MASP-3.

La fig.30A es un histograma de FACS de unión a antigeno/anticuerpo de MASP-3 a DTLacO clon M3J5. La fig. 30B es un histograma de FACS de unión a antigeno/anticuerpo de MASP-3 a DTLacO clon M3M1. En las figuras 30A y 30B las curvas grises son control negativo con tinción de IgGl, y las curvas en negro son tinciones de MASP-3.

La fig. 31 ilustra gráficamente una curva de unión de saturación del clon M3J5 (clon 5) al antigeno de MASP-3. Como se muestra en la fig.31, la afinidad de unión aparente del anticuerpo de M3J5 a MASP-3 es de aproximadamente 31 nM.

Se realizó un análisis de secuencia de los clones identificados utilizando métodos estándar. Todos los clones se compararon con las secuencias (DT40) de VH y VL comunes entre si. Las secuencias para los dos clones mencionados, M3J5 y M3M1 se proporcionan en una alineación con dos clones representativos adicionales, D14 y 1E10, que fueron identificados en las pantallas de fragmentos CCP1-CCP2-SP de MASP-1 y MASP-3, respectivamente. D14 y 1E10 unen regiones comunes a ambos MASP-1 y MASP-3.

La fig. 32A es una alineación de secuencias de aminoácidos de las regiones VH de M3J5, M3M1, D14 y 1E10 a la secuencia DT40 VH de pollo.

La fig. 32B es una alineación de secuencias de aminoácidos de las regiones VL de M3J5, M3M1, D14 y 1E10 a la secuencia de DT40 VL de pollo.

A continuación se proporciona la secuencia de aminoácidos de VH y VL para cada clon.

Secuencias de Región Variable de Cadena Pesada (VH) La fig.32A muestra una alineación de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada (VH) para el DTLacO principal (SEQ ID NO: 24), los clones de unión a MASP-3 M3J5 (SEQ ID NO: 25), y M3M1 (SEQ ID NO : 26), y los clones de unión a MASP-l/MASP-3 duales D14 (SEQ ID NO: 30), y 1E10.

Los CDR de Kabat en las secuencias de VH a continuación se encuentran en las siguientes posiciones de aminoácidos: Hl: aa 31-35; H2: aa 50-62; y H3: aa 95-102.

Los CDR de Chothia en las secuencias de VH a continuación se encuentran en las siguientes posiciones de aminoácidos: Hl: aa 26-32; H2: aa 52-56; y H3: aa 95-101.

DTLacO VH Principal (SEQ ID NO:24) AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSNAMGWVRQAPGKGLEWVAGIDDDGSGTR YAPAVKGRATISRDNGQSTLRLQLNNLRAEDTGTYYCTKCAYSSGCDYEGGYIDAWGHG TEVIVSS Clon M3J5 VH (SEQ ID NO:25) AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFTFSSYAMGWMRQAPGKGLEYVAGIRSDGSFTL YATAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYFCTRSGNVGDIDAWGHGTEVIVSS Clon M3M1 VH (SEQ ID NO:26) AVTLDESGGGLQTPGGGLSLVCKASGFDFSSYQMNWIRQAPGKGLEFVAAINRFGNSTG HGAAVKGRVTISRDDGQSTVRLQLSNLRAEDTATYYCAKGVYGYCGSYSCCGVDTIDAW GHGTEVIVSS Clon D14 VH (SEQ ID NO:30) AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAGIYKSGAGTN YAPAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTGTYYCAKTTGSGCSSGYRAEYIDAWGH GTEVIVSS Clon 1E10 VH (SEQ ID NO:32) AVTLDESGGGLQTPGGALSLVCKASGFTFSSYDMVWVRQAPGKGLEFVAGISRNDGRYT EYGSAVKGRATISRDNGQSTVRLQLNNLRAEDTATYYCARDAGGSAYWFDAGQIDAWGH GTEVIVSS Secuencias de Región Variable de Cadena Ligera (VIO La Figura 32B muestra una alineación de aminoácidos de las secuencias de región variable de cadena ligera (VL) para el DTLacO principal (SEQ ID NO:27) y los clones de unión a MASP-3 M3J5 (SEQ ID NO: 28) y M3M1 (SEQ ID NO: 29), y los clones de unión dual a MASP-l/MASP-3 D14 (SEQ ID NO: 31) y 1E10 (SEQ ID NO: 33).

DTLacO VL Principal (SEQ ID NO:27): ALTQPASVSANLGGTVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKSPGSAPVTVIYDNDKRPSDIP SRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL Clon M3J5 VL (SEQ ID NO:28): ALTQPASVSANPGETVKITCSGGYSGYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDI PSRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL Clon M3M1 VL (SEQ ID NO:29): ALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIP SRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL Clon D14 VL: (SEQ ID NO:31) ALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIP SRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL Clon 1E10 VL: (SEQ ID NO:33) ALTQPASVSANPGETVKITCSGGGSYAGSYYYGWYQQKAPGSAPVTLIYYNNKRPSDIP SRFSGSLSGSTNTLTITGVRADDEAVYFCGSADNSGAAFGAGTTLTVL Ensayo Funcional de LEA- 2 (dependiente de MASP-2) MASP-1 contribuye a LEA-2 a través de su capacidad para activar MASP-2 (véase la fig.1). El ensayo del Cribado de MBL del Sistema de Complemento de Wieslab® ( Euro Diagnostica, Malmó, Suecia) mide la deposición de C5b-C9 en condiciones que aíslan la activación dependiente de LEA-2 (es decir, la actividad tradicional de la vía de las lectinas). El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante con clon representativo de 1E10 probado como una concentración final de 400 nM.

La fig.33 es un gráfico de barras que muestra la actividad inhibidora de mAb 1E10 en comparación con el suero positivo suministrado con el kit de ensayo, asi como un anticuerpo de control de isotipo. Como se muestra en la fig. 33, mAb 1E10 demuestra la inhibición parcial de la activación dependiente de LEA-2- (a través de la inhibición de la activación de MASP-2 dependiente de MASP-1), mientras que el anticuerpo de control de isotipo no lo hace. Una mayor inhibición puede conseguirse mediante una maduración continua de la afinidad de este anticuerpo para MASP-1 vinculante utilizando los factores atados en el sistema DTLacO.

Los Ensayos de Función dependientes de LEA-1 (dependiente de MASP-3) para los mAbs representativos se describen a continuación en los Ejemplos 17 y 18.

Resumen de los resultados: Los resultados anteriores mostraron que la plataforma DTLacO permitió un rápido descubrimiento ex vivo de anticuerpos monoclonales de MASP-1 y MASP-3con propiedades inhibidoras sobre LEA-1 (como se muestra a continuación en los Ejemplos 17 y 18) y en LEA-2 (como se muestra en este Ejemplo).

EJEMPLO 16 Este ejemplo describe la generación inhibidores polipeptídicos de MASP-1 y MASP 2.

Fundamentos: La generación de inhibidores específicos de MASP-1 y MASP-2, denominados SGMI-1 y SGMI-2, respectivamente, se describe en Heja et al,. J Biol Chem 287: 20290 (2012) y Heja et al, PNAS 109: 10498 (2012), cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia. SGMI-1 y SGMI-2 son cada uno de los 36 péptidos de aminoácidos que han sido seleccionados de una biblioteca de fagos de variantes del inhibidor de proteasa 2 Schistocerca gregaria en el que seis de las ocho posiciones del lazo de unión de la proteasa fueron completamente aleatorizados. La posterior evolución in vitro produjo inhibidores mono-específicos con valores nM Ki de un solo dígito (Heja et al,. J. Biol Chem. 287:20290, 2012). Los estudios estructurales revelaron que el lazo de unión optimizado de la proteasa forma el sitio de unión primario que define la especificidad de los dos inhibidores. Las secuencias de aminoácidos de las regiones de unión secundarias e internas extendidos son comunes a los dos inhibidores y contribuyen a la interfaz de contacto (Heja et al, 2012, J. Biol Chem. 287: 20290).

Mecánicamente, tanto SGMI-1 como 2-SGMI bloquean la vía de las lectinas de activación del complemento sin afectar a las vías clásicas o alternativas (Heja et al, 2012; Proc Nati Acad Sci.109: 10498).

Las secuencias de aminoácidos de los inhibidores de la SGMI-1 y SGMI-2 se exponen a continuación: SGMI-1-longitud total: LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYQ (SEQ ID NO:34) SGMI-2-longitud total: LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEQ ID NO:35) SGMI-1 y SGMI-2 son inhibidores altamente específicos de MASP-1 y MASP-2, respectivamente. Sin embargo, como péptidos tienen limitado el potencial para su uso en los estudios biológicos. Para hacer frente a estas limitaciones, injertamos estas secuencias de aminoácidos de péptidos bioactivos en el extremo amino terminal de la región Fe de IgGl humana para crear una proteina de fusión con Fe, Métodos: Para expresar las proteínas de fusión Fe de IgGl-SGMI, péptidos de polinucleótidos que codifican el SGMI-1 (SEQ ID NO: 34) y SGMI-2 (SEQ ID NO: 35) se sintetizaron (ADN 2.0) y se insertaron en el vector de expresión pFUSE-hlgGl- Fc2 ( InvivoGen ) entre las secuencias de nucleótidos que codifican la secuencia señal de IL-2 y la región Fe de IgGl humana (SEQ ID NO: 36). Un enlazador de polipéptido flexible (por ejemplo, SEQ ID NO: 37 o SEQ ID NO: 38) se incluyó entre el péptido SGMI y la región Fe de IgGl.

Secuencias de Enlazador de Polipétido Flexible: GTGGGSGSSSRS (SEQ ID NO:37) GTGGGSGSSS (SEQ ID NO:38) Las construcciones resultantes se describen como sigue: Un polinucleótido que codifica la fusión del polipéptido que comprende la secuencia señal de IL-2 humana, SGMI-1, enlazador e IgGl-Fc humano (pFUSE-SGMI-1FC), se expone como SEQ ID NO: 39, que codifica el polipéptido de fusión maduro que comprende SGMI-1 (subrayado), región enlazadora (en cursiva) e IgGl-Fc humano (denominados conjuntamente "SGMI-1FC"), que se muestra como SEQ ID NO: 40.

SEQ ID NO:40 LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYQGTGGGSGSSSRSDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Un polinucleótido que codifica el polipéptido de fusión que comprende la secuencia señal de IL-2 humana, SGMI-, enlazador e IgGl-Fc humano (pFUSE-SGMI-FC), se expone como SEQ ID NO: 39, que codifica el polipéptido de fusión maduro que comprende SGMI-1 (subrayado), región enlazadora (en cursiva) e IgGl-Fc humano (denominados conjuntamente "SGMI-FC"), que se muestra como SEQ ID NO: 40.

SEQ ID NO:42 LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQGrGGGSGSSSRSDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK Producción de Proteínas Recosabinantes : Células Freestyle 293 o Expi293F ( Invitrogen ) fueron transfectadas transitoriamente de acuerdo con el protocolo del proveedor con uno de los dos plásmidos de expresión (pFUSE-SGMI-lFC (SEQ ID NO: 39) y pFUSE-SGMI-2FC (SEQ ID NO: 41). Después de cuatro días de incubación a 37°C, los medios de cultivo se recolectaron. Las proteínas de fusión Fe se purificaron por cromatografía de afinidad de proteína A.

Ensayos que Miden la Activación de la vía de las lectinas: Las proteínas de fusión SGMI-1FC y SGMI-2FC se ensayaron para determinar la capacidad para inhibir la deposición de C3b de 1% de suero en una placa de 96 pocilios recubiertos con manano, que es una medida de la actividad de la vía de lectina. SGMI-1FC y SGMI-2FC se pre incubaron con 1% de suero humano normal durante una hora en hielo antes de su adición a los pocilios recubiertos con manano (2 mg/pocillo). La deposición de C3b se midió por ELISA como se describe en Schwaeble et al. PNAS 108:7523, 2011.

La fig. 34 ilustra gráficamente el nivel de la deposición de C3b para 1% de suero humano normal más isotipo de control, SGMI-1FC o SGMI-2FC lo largo de un rango de concentración de 0.15 a 1000 nM. Como se muestra en la fig.34, tanto SGMI-1FC como SGMI-2FC inhibieron la deposición de C3b del suero normal en pocilios de ELISA recubiertos con manano, con valores IC50 de aproximadamente 27 nM y 300 nM, respectivamente.

Estos resultados demuestran que las funciones inhibidoras de MASP-1 y MASP-2 de los péptidos de SGMI se retienen en las proteínas de fusión SGMI-1FC y SGMI-2FC.

EJEMPLO 17 Análisis de la vía del complemento en suero de 3MC con S. Aureus Antecedentes/Fundamentos: Se determinó que MASP-3 no se activa a través de la exposición a manano no inmovilizado en fase fluida, zimosano A o N-acetil cisteína, ya sea en la presencia o ausencia de suero humano normal. Sin embargo, se determinó que MASP-3 recombinante y nativo se activan en la superficie de S. aureus inactivado por calor en presencia y ausencia de suero humano normal (NHS) o suero humano inactivado con calor (HIS) (datos no mostrados). También se determinó que la deposición de C3b se produce en la superficie de S. aureus en presencia de suero humano normal, y que la deposición se puede monitorizar usando un citómetro de flujo. Por lo tanto, la respuesta de la vía alternativa (AP) para S. aureus se midió como se describe en este ejemplo como un medio para evaluar la contribución de MASP-3 a LEA-1.

Métodos: MASP-3_ Recombinante: Las secuencias de polinucleótidos que codifican MASP-3 recombinante humano de longitud completa, una versión activa de serina proteasa truncada (SP) de MASP-3 (CCP1-CCP2-SP), y una forma inactivada de SP-MASP-3 (S679A) se clonaron en el vector de expresión de mamífero pTriEx7 { Invivogen) . Las construcciones de expresión resultantes codifican el MASP-3 longitud completa o el fragmento de CCP1-CCP2-SP con una etiqueta de Strep amino-terminal y etiqueta de His6 carboxi-terminal. Las construcciones de expresión se transfectaron en células Freestyle 293 o Expi293F F ( Invitrogen ) de acuerdo con los protocolos proporcionados por el fabricante. Después de tres a cuatro días de cultivo en 5% de CO2 a 37°C, las proteínas recombinantes se purificaron utilizando cromatografía de afinidad de estreptacina.

MASP-1 Recombinante: la formas longitud completa o truncadas de CCP1-CCP2-SP de MASP-1 recombinante con o sin el estabilizador R504Q (de Dobó et al,. J. Immunol . 183: 1207, 2009) o la mutaciones de desactivación de SP (S646A) y con una etiqueta step amino-terminal y una etiqueta His6carboxi terminal se generaron como se describe para el MASP-3 recombinante anterior. 1. Deposición de C3b y escisión de factor B en S. áureas en suero de 3MC (humano) Un experimento inicial se llevó a cabo para demostrar que el ensayo de citometria de flujo es capaz de detectar la presencia o ausencia de AP impulsada por la deposición de C3b (AP-C3b) como sigue. Cinco por ciento de los siguientes sueros: suero humano normal, suero humano agotado de factor B (Factor B), suero humano agotado de factor D y suero humano agotado de properdina (Obtenido de Complement Technology, Tyler, Tex, EE.UU.) se mezclaron con anticuerpo de prueba, ya sea tampón de Mg++/EGTA o EDTA a 4°C durante la noche. El S. aureus inactivado por calor (108/reacción) se añadió a cada mezcla a un volumen total de 100 ml y se hizo girar a 37°C durante 40 minutos. Las bacterias se lavaron en tampón de lavado, el sedimento bacteriano se resuspendió en tampón de lavado y se analizó una alícuota de 80 ml de cada muestra para la deposición de C3b en la superficie bacteriana, que se detectó con C3c anti-humano (Dako, Reino Unido) usando citometria de flujo.

Los resultados de la detección de citometria de flujo de C3b se muestran en la fig.35A. Como se muestra en la fig. 35A, panel 1, en suero humano normal en presencia de EDTA, que es conocido por inactivar la AP, no se observó la deposición de C3b (control nsegativo). En el suero humano normal tratado con Mg++/EGTA, sólo las vías del complemento independiente de lectina pueden funcionar. En el panel 2, se utiliza el ta pón de, por lo tanto la AP está activo, y se observa la deposición de C3b impulsada por AP (control positivo). Como se muestra en el panel 3, 4 y 5, en el suero agotado de factor B, agotado de factor D y agotado de properdina, respectivamente, no se observa ninguna vía alternativa impulsada por la deposición de C3b, como se esperaba. Estos resultados demuestran que el ensayo es capaz de detectar la deposición de C3b dependiente de AP.

Una deposición de C3b en ensayo de S. aureus se llevó a cabo como se describe anteriormente para evaluar la capacidad de MASP-3 recombinante para reconstituir la AP (LEA-1) en suero humano de 3MC, que es deficiente en MASP-3 (Rooryck C, et al., Nat . Genet . 43 (3): 197-203 (2011)).

Las siguientes combinaciones de reactivos fueron probadas. 1. 5% de suero humano normal + EDTA 2. 5% de suero humano normal + Mg/EGTA 3. 5% de suero 3MC humano (MASP-3 _/~) + Mg++/EGTA 4. 5% de suero 3MC humano (MASP-3 _ + Mg++/EGTA más rMASP-3 activo de longitud completa 5. 5% de suero 3MC humano (MASP-3 -/~) + Mg++/EGTA más rMASP-3 activo truncado (CCP1/CCP2/SP) 6. 5% de suero 3MC humano (MASP-3 _/ ) + Mg++/EGTA más rMASP-3 inactivo (S679A) 7. 5% de suero 3MC humano (MASP-3 ~/_) + Mg++/EGTA más rMASP-3 de longitud completa Las diversas mezclas de 5% de suero y proteínas recombinantes (5 g de cada una) como se muestra anteriormente, se incubaron en las condiciones de tampón especificadas (ya sea tampón Mg++/EGTA o EDTA) a 4°C durante la noche. Despues de la incubación toda la noche, 10 S. aureus eliminados por calor- se añadieron a cada mezcla en un volumen total de 100 ml y se giraron a 37°C durante 40 minutos. Las bacterias se lavaron y se resuspendieron en tampón de lavado y una alícuota de 80 ml de cada muestra se analizó para la deposición de C3b por FACS. La alícuota de 20 m? restante de cada muestra se utilizó para medir la escisión del factor B por Western blot usando anticuerpo de anti-factor B como se describe a continuación.

Los resultados de la detección de citometría de flujo de C3b se muestran en la fig.35B. Los números de panel corresponden a los números designados para cada una de las combinaciones de reactivo descritas anteriormente. El control negativo (panel 1) y control positivo (panel 2) muestran la ausencia y presencia de la deposición de C3b, como se esperaba. El panel 3 muestra que la deposición de C3b impulsada por AP está ausente en el suero de 3MC. Los paneles 4 y 5 muestran que rMASP-3 integral activo (panel 4) y rMASP-3 activo (CCP1-CCP2-SP) (panel 5) ambos restauran la deposición de C3b impulsada por ?R en el suero de 3MC. El panel 6 muestra que rMASP-3 inactivo (S679A) no restaura la deposición de C3b impulsada por AP en suero de 3MC. El panel 7 muestra que rMASP-1 no restaura la deposición de C3b impulsada por AP en suero de 3MC.

Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que MASP-3 se requiere para la deposición de C3b impulsada por AP en S. aureus en suero humano. 2. Activación del factor B dependiente de MASP-3 Con el fin de analizar la activación del factor B dependiente de MASP-3, las diversas mezclas de 5% de suero (suero humano, ya sea normal o suero de 3MC del paciente) y las proteínas recombinantes como se muestran anteriormente se ensayaron como se describe anteriormente. De cada mezcla de reacción, se eliminaron 20 ml y se añadió a un tampón de carga de muestra de proteína. Las muestras se calentaron a 70°C durante 10 minutos y se cargaron en un gel de SDS-PAGE. Se realizó análisis de Western blot usando un anticuerpo policlonal de Factor B {R & D Systems) . La activación del Factor B fue evidente por la formación de dos productos de escisión de menor peso molecular (Bb y Ba) derivados de la proteína de mayor peso molecular pro-Factor B.

La fig.36 muestra los resultados de un análisis de Western blot para determinar la escisión del factor B en respuesta a S. aureus en suero de 3MC en presencia o ausencia de rMASP-3. Como se muestra en el carril 1, el suero humano normal en presencia de EDTA (control negativo) demuestra muy poca escisión de Factor B con relación al suero humano normal en presencia de Mg++/EGTA, que se muestra en el carril 2 (control positivo). Como se muestra en el carril 3, el suero de 3MC demuestra muy poca escisión del Factor B en presencia de Mg++/EGTA. Sin embargo, como se muestra en el carril 4, la escisión de Factor B se restaura mediante la adición y pre-incubación de la proteína recombinante MASP-3 de longitud completa (5 g) al suero de 3MC. 3. Ensayo para determinar el efecto de rMASP-3 en el Pro Factor D en la Escisión del Factor B/C3 (H20) El siguiente ensayo se llevó a cabo para determinar el requisito mínimo para la activación/escisión del Factor B dependiente de MASP-3 C3(H20) (200 ng), factor B de plasma purificado (20 g), pro factor D recombinante (200 ng) y MASP-3 recombinante humano (200 ng) se mezclaron juntos en varias combinaciones (como se muestra en la fig. 37), En un volumen total de 100 ml en BBS/Ca++/Mg++ y se incubaron a 30°C durante 30 minutos. La reacción se detuvo mediante la adición de 25 uL de colorante de carga SDS que contiene 5% de 2-mercaptoetanol. Después de hervir a 95°C durante 10 minutos bajo agitación (300 rpm), la mezcla se centrifugó a 1400 rpm durante 5 minutos y 20 uL del sobrenadante se cargaron y se separaron en 10% de gel SDS. El gel se tiñó con azul brillante de Coomassie.

Resultados: La fig.37 muestra un gel de SDS-PAGE teñido con Comassie en el que se analiza la escisión del factor B. Como se muestra en el carril 1, la escisión del factor B es más óptima en presencia de C3, MASP-3 y pro-factor de D. Como se muestra en el carril 2, C3 es absolutamente necesario; sin embargo, como se muestra en los carriles 4 y 5, ya sea MASP-3 o pro-factor D son capaces de mediar la escisión del factor B, siempre y cuando C3 esté presente. 4. Análisis de la capacidad de mAbs de MASP-3 para inhibir la deposición de C3b impulsada por AP dependiente de MASP-3 Como se describe en este ejemplo, se demostró que MASP-3 se requiere para la deposición de C3b impulsadam por AP en S. aureus en suero humano. Por lo tanto, se llevó a cabo el siguiente ensayo para determinar si un MASP-3 mAb representativo identificado como se describe en el Ejemplo 15, podría inhibir la actividad de MASP-3. Proteína de fragmento de MASP-3 recombinante activo (CCP1-CCP2-SP) (250 ng) se pre-incuba con un mAb de isotipo de control, mAblA5 (control obtenido de la plataforma DTLacO que no se une a MASP-3 o MASP-1), o mAbD14 (se une a MASP-3) a tres concentraciones diferentes (0.5, 2 y 4 mM) durante 1 hora en hielo. La mezcla de enzima-mAb se expuso a 5% de suero 3de MC (deficiente de MASP-3) y 5 c 107 de S. aureus inactivados por calor en un volumen final de reacción de 50 ml. Las reacciones se incubaron a 37°C durante 30 minutos, y luego se tiñeron para la detección de la deposición de C3b. Las células bacterianas teñidas se analizaron por un citómetro de flujo.

La fig.38 ilustra gráficamente las intensidades medias fluorescentes (MFI) de tinción de C3b obtenidas de los tres anticuerpos representados gráficamente como una función de la concentración en el suero mAb de 3MC con la presencia de rMASP-3. Como se muestra en la fig.38, MAbD14 demuestra la inhibición de la deposición de C3b en una manera dependiente de la concentración. En contraste, ninguno de los mAb de control inhibe la deposición de C3b. Estos resultados demuestran que mAbD14 es capaz de inhibir la deposición de C3b dependiente de MASP-3. Se espera que la mejora de la actividad inhibitoria para mAbD14 siguiente continúe la maduración de afinidad de este anticuerpo de unión a MASP-3 utilizando los factores atados en el sistema de DTLacO.

Resumen de los resultados: En resumen, los resultados en este ejemplo demuestran un defecto claro de la AP en el suero deficiente para MASP-3. Por lo tanto, MASP-3 ha demostrado hacer una contribución critica a la AP, utilizando la activación del factor B y la deposición de C3b como puntos finales funcionales. Además, la adición de MASP-3 recombinante funcional, incluyendo la porción catalíticamente activa-C-terminal de MASP-3, corrige el defecto en la activación de factor B y la deposición de C3b en el suero del paciente de 3MC. Por el contrario, como se demuestra más adelante en este ejemplo, la adición de un anticuerpo de MASP-3 (por ejemplo, mAbD14) en suero de 3MC con rMASP-3 inhibe la deposición de C3b impulsada por AP. Un papel directo de MASP-3 en la activación del factor B, y por lo tanto la AP, se demuestra por la observación de que MASP-3 recombinante, junto con C3, es suficiente para activar el factor B recombinante.

EJEMPLO 18 Este Ejemplo demuestra que MASP-1 y MASP-3 activan el factor D.

Metodos: MASP-1 y MASP-3 recombinantes fueron probados por su capacidad para escindir dos versiones de pro-factor D recombinantes diferentes. La primera versión (pro-factor D-His) carece de una etiqueta N-terminal, pero tiene una etiqueta His C-terminal. Por lo tanto, esta versión de pro factor D contiene los 5 pro-péptidos de aminoácidos que se eliminan por escisión durante la activación. La segunda versión (ST-pro-factor D-His) tiene una secuencia Strep-Tagll en el extremo N-terminal, aumentando asi el fragmento N-terminal escindido a 15 aminoácidos. ST-pro factor D también contiene una etiqueta His6 en el extremo C-terminal. El aumento de la longitud del propéptido de ST-pro-factor D-His mejora la resolución entre las formas escindidas y no escindidas por SDS-PAGE en comparación con la resolución posible con la forma pro-factor D-HIS.

Las proteínas recombinantes MASP-1 o MASP-3 (2 pg) se añadieron a cualquiera de los sustratos de pro factor D-His o ST-pro-factor D-His (100 ng) y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Las reacciones se sometieron a electroforesis en un gel de 12% de Bis-Trispara resolver pro-factor D y el producto de escisión del factor D activo.

Las proteínas resueltas se transfirieron a una membrana de PVDF y se analizaron por Western blot por la detección con un anticuerpo del factor D biotinilado (R & D Systems).

Resultados: La fig.39 muestra el análisis de Western blot de la escisión de sustrato del pro-factor D. Como se muestra en la fig. 39, sólo el fragmento de MASP-3 de longitud completa (carril 2) y MASP-1-CCP1 CCP2-SP) (carril 5) escinde ST-pro-factor de D-HÍS6. MASP-3 de longitud completa catalíticamente inactivo (S679A; carril 3) y MASP-1 (S646A; carril 3) no pudo escindir ningún sustrato. Resultados idénticos se obtuvieron con el polipéptido de pro-factor D-His6 (no mostrado). La comparación de un exceso molar de MASP-1 (CCP1-CCP2-SP) con respecto a MASP-3 sugiere que MASP-3 es un catalizador más eficaz de escisión de pro-factor D que MASP-1, como mínimo en las condiciones descritas en el presente documento.

Conclusiones: Tanto MASP-1 como MASP-3 son capaces de escindir y activar el factor D. Esta actividad conecta directamente LEA-1 con la activación de la AP. Más específicamente, la activación del factor D por MASP-1 o MASP-3 dará lugar a la activación del factor B, la deposición de C3b, y probablemente la opsonización y/o lisis. 1. Ensayo para la Inhibición de la Escisión de Pro- factor D dependiente de MASP-3 con anticuerpos de MASP-3 Se llevó a cabo un ensayo para determinar el efecto inhibidor de mAbs representativos de MASP-3 y MASP-1, identificados como se describe en el Ejemplo 15, en la escisión del factor D dependiente de MASP-3 como sigue. Proteina de MASP-3 recombinante, activa (80 ng), se preincubaron con lpg de mAbs representativos D14, M3M1 y anticuerpo de control (que se une específicamente a MASP-1, pero no a MASP-3) a temperatura ambiente durante 15 minutos. El profactor D con una etiqueta Strep N-terminal (ST-pro-factor D-His, 70 ng) se añadió y la mezcla se incubó a 37°C durante 75minutos. Las reacciones después se electroforaron, transfirieron y tiñieron con anti-factor D como se describe anteriormente.

La Figura 40 es un Western blot que muestra la actividad inhibidora parcial de los mAbs D14 y M3M1 en comparación con una reacción de control que contiene sólo MASP-3 y ST-pro-factor D-His (sin mAb, carril 1), asi como una reacción de control que contiene un mAb obtenido de la biblioteca de DTLacO que se une a MASP-1 pero no a MASP-3 (carril 4). Como se muestra en la Figura 40, en la ausencia de un anticuerpo inhibidor, MASP-3 escinde aproximadamente 50% del profactor D en factor D (carril 1). El anticuerpo de MASP-1 especifico de control (carril 4), no cambia la relación del pro-factor D a factor D. En contraste, como se muestra en los carriles 2 y 3, ambos mAb D14 y mAb M3M1 inhiben la escisión dependiente de MASP-3 del pro-factor D a factor D, resultando en una reducción en el factor D generado.

Conclusiones; Estos resultados demuestran que los mAbs de MASP-3 D14 y M3M1 son capaces de inhibir la escisión del factor D dependiente de MASP-3. La actividad inhibidora mejorada para mAbD14 y mAb M3M1 se espera después de la maduración de afinidad continua de estos anticuerpos para la unión a MASP-3 usando los factores atados en el sistema de DTLacO.

EJEMPLO 19 Este Ejemplo demuestra que la deficiencia de MASP-3 previene la lisis mediada por complemento de los eritrocitos WT de conejo recubiertos de manano.

Antecedentes/Fundamentos: Como se describe en los Ejemplos 5 y 6 del presente documento, el efecto del suero deficiente de MASP- 2 y MASP-3 sobre la lisis de los glóbulos rojos a partir de muestras de sangre obtenidas de un modelo de ratón de HPN demostró la eficacia de la inhibición de MASP-2 y/o inhibición de MASP-3 para tratar sujetos que sufren de HPN, y también apoyó el uso de inhibidores de MASP-2 y/o inhibidores de MASP-3 (incluyendo inhibidores duales o bi-específicos de MASP-2/MASP-3) para mejorar los efectos de la hemolisis extravascular mediada por fragmento de C3 en pacientes con HPN que se someten a terapia con un inhibidor de C5 como eculizumab.

Como se describe en este Ejemplo, los experimentos de deposición de C3b y los experimentos de hemolisis se llevaron a cabo en suero deficientes de MASP-3 de pacientes de 3MC adicionales, confirmando los resultados obtenidos en los Ejemplos 5 y 6. Además, los experimentos se llevaron a cabo, lo que demuestra que la adición de rMASP-3 a suero de 3MC fue capaz de reconstituir la deposición de C3b y la actividad hemolitica.

Métodos: El suero deficiente de MASP-3 se obtuvo de tres pacientes de 3MC diferentes como sigue: Paciente de 3MC 1: contiene un alelo que lleva una mutación que hace que el exón que codifica el dominio disfuncional de serina proteasa de MASP-3, suministrado junto con la madre y el padre del paciente de 3MC (ambos heterocigotos para el alelo que lleva una mutación que hace disfuncional al exón que codifica el dominio de serina proteasa de MASP-3).

Paciente de 3MC 2: Tiene mutación de C1489T (H497Y) en el exón 12 de MASP-1, el exón que codifica el dominio de serina proteasa de MASP-3, lo que resulta en MASP-3no funcional, pero proteínas de MASP-1 funcionales.

Paciente de 3MC 3: Tiene un defecto confirmado en el gen MASP-1, lo que resulta en MASP-3 no funcional, pero proteínas MASP-1 funcionales.

Experimento #1: Ensayo de Deposición de C3b Un ensayo AP se llevó a cabo bajo condiciones específicas AP tradicionales (BBS/Mg++/EGTA, sin Ca++ en donde BBS = solución salina tamponada con barbital que contiene sacarosa), como se describe en Bitter-Suermann et al., Eur. . J. Immunol 11: 291-295 (1981)), en placas de microtitulación recubiertas con zimosano en concentraciones séricas que van de 0.5 a 25% y la deposición de C3b se midió con el tiempo.

Resultados: La fig. 41 ilustra gráficamente el nivel deposición de C3b impulsada por AP sobre placas de microtitulación recubiertas con zimosano como una función de la concentración sérica en las muestras de suero obtenidas de sujetos deficientes de MASP-3s (3MC), sujetos deficientes de C4 y deficientes de MBL. Como se muestra en la fig.41, y se resume a continuación en la Tabla 18, loa sueros de pacientes deficientes de MASP-3, del paciente 2 y paciente 3 tienen actividad AP residual a altas concentraciones (concentraciones séricas de 25%, 12.5%, 6.25%), pero un AP50 significativamente superior (es decir, 8.2% y 12.3% de suero necesario para lograr 50% de la deposición máxima de C3).

La fig. 42 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b impulsada por AP sobre las placas de microtitulación recubiertas con zimosano en condiciones AP-específicas "tradicionales" (es decir, BBS/EGTA/Mg++ sin Ca++) como una función del tiempo en muestras de 10% de suero humano obtenidas de sujetos humanos con deficiencia de MASP-3, C4 y MBL.

La TABLA 18 a continuación resume los resultados de AP50 mostrados en la fig.41 y los tiempos medios para la deposición de C3b se muestran en la fig.42.

TABLA 18. Resumen de los Resultados Mostrados en las Figuras 41 y 42 Nota: En tampón de BBS/Mg++/EGTA, los efectos mediados por la vía de las lectinas son deficientes debido a la ausencia de Ca++ en este tampón.

Experimento #2: Ensayo de Hemolisis que prueba los eritrocitos de conejo recubiertos de manano para la lisis en presencia de suero humano normal o de 3MC (en la ausencia de Ca++) Métodos: Preparación de glóbulos rojos de conejo en la ausencia de Ca++ (es decir, usando E6TA) Toda la sangre de conejo (2 mi) se dividió en dos tubos Eppendorf de 1.5 mi y se centrifugó durante 3 minutos a 8000 rpm (aproximadamente 5.9 RCF) en una centrifuga eppendorf refrigerada a 4°C. El sedimento de glóbulos rojos se lavó tres veces después de re suspender en BBS/Mg++/Ca++ helado (4.4 mM de ácido barbitúrico, 1.8 mM de barbitona de sodio, 145 mM de NaCl, pH 7.4, 5 mM de Mg++, 5 mM de Ca++). Después del tercer lavado, el sedimento se resuspendió en 4 mi de BBS/Mg++/Ca++.Los eritrocitos se sedimentaron y los glóbulos rojos se lavaron con BBS/O.01% gelatina/Mg++/Ca++ como se describió anteriormente. La suspensión de glóbulos rojos se almacenó en BBS/O.1% de gelatina/ Mg++/Ca++ a 4°C. Después, 100 ml de glóbulos rojos suspendidos se diluyeron con 1.4 mi de agua y se centrifugaron a 8000 rpm (aproximadamente 5.9 RCF) durante 3 minutos y la OD del sobrenadante se ajustó a 0.7 a 541 nm (una OD de 0.7 a 541 nm corresponde a aproximadamente 109 eritrocitos/mL) . Después de esto, 1 mL de los glóbulos rojos resuspendidos a una OD de 0.7 se añadieron a 9 mi de BBS/Mg++/EGTA con el fin de lograr una concentración de 108/mL. Las diluciones de los sueros de ensayo se prepararon en BBS, Mg++, EGTA helado y 100 ml de cada dilución de suero o plasma se pipetearon en la placa de pocilios de fondo redondo correspondiente. 100 m? de glóbulos rojos apropiadamente diluidos (108/ml) se añadieron a cada pocilio. Se utilizó nano-agua para producir el control positivo (100% de lisis), mientras que una dilución de BBS/Mg++/EGTA sin suero o plasma se utilizó como control negativo. La placa se incubó durante 1 hora a 37°C. La placa de fondo redondo se centrifugó a 3250 rpm durante 5 minutos. Después, 100 ml del sobrenadante de cada pocilio se transfirieron a la placa de pocilios de fondo plano correspondiente y el OD fue leído en un lector de ELISA a 415 a 490 nm.

Resultados: La fig.43 ilustra gráficamente el porcentaje de hemolisis (tal como se mide por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de conejo U sados en el sobrenadante medido por fotometría) de eritrocitos de conejo recubiertos de manano sobre un rango de concentraciones séricas en el suero de sujetos normales y de dos pacientes de 3MC (paciente 2 y Paciente 3), medido en ausencia de Ca++. Como se muestra en la fig. 43, se demuestra que la deficiencia de MASP-3 reduce el porcentaje de lisis mediada por el complemento de eritrocitos recubiertos con manano en comparación con el suero humano normal. Las diferencias entre las dos curvas del suero humano normal y las dos curvas de los pacientes de 3MC es significativa (p = 0.013, prueba de Friedman).

La Tabla 19 enseguida resume los resultados de AP50 mostrados en la Figura 43.

TABLA 19: Resumen de los Resultados Mostrados en la Figura 43 Se observa que cuando se agruparon las muestras de suero que se muestran en la Tabla 19, el valor AP50 para el suero humano normal = 7.9 y el valor AP50 para el suero 3MC = 12.8 (p = 0.031, prueba de rango de señal de pares coincidentes de Wilcox).

Experimento # 3: La reconstitución de suero humano de 3MC por MASP-3 recombinante restaura la deposición de C3b impulsada por AP en las placas recubiertas de zimosano Metodos: Un ensayo de AP se llevó a cabo bajo condiciones especificas tradicionales de AP (BBS/mg++/EGTA, sin Ca++, en el que BBS = solución salina tamponada con barbital que contiene sacarosa), como se describe en Bitter-Suermann et al., Eur . J. Immunol 11: 291-295 (1981)), en placas de microtitulación recubiertas con zimosano en las siguientes muestras de suero: (1) 5% de suero humano de Paciente # 2 de 3MC de longitud completa con rMASP-3 activo añadido en un rango de 0 a 20 mg/ml; (2) 10% de suero humano de Paciente # 2 de 3MC de longitud completa con rMASP-3 activo añadido en un rango de 0 a 20 mg/ml; y (3) 5% de suero humano de Paciente # 2 de 3MC con rMASP-3A inactivo (S679A) añadido en un rango de 0 a 20 g/ml.

Resultados; La fig. 44 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b impulsado por AP sobre placas de microtitulación recubiertas con zimosano como una función de la concentración de proteina de rMASP-3 añadida a las muestras de suero obtenidas de Paciente # 2 de 3MC humano (deficiente de MASP-3). Como se muestra en la fig.44, la proteina de MASP-3 recombinante activo reconstituye la deposición de C3b impulsada por AP en placas recubieras de zimosano de una manera dependiente de la concentración. Como se muestra además en la fig. 44, no se observó la deposición de C3b en el suero de 3MC que contiene rMASP-3 inactivo (S679A).

Experimento # 4: La reconstitución de suero de 3MC humano recombinante por MASP-3 restaura la actividad hemolitica en el suero del paciente de 3MC Métodos: Un ensayo hemolítico se llevó a cabo usando glóbulos rojos de conejo utilizando los métodos descritos anteriormente en el Experimento # 2 con los siguientes sueros de prueba en un rango de 0 a 12% de suero: (1) suero humano normal; (2) suero de paciente de 3MC; (3) suero de paciente de 3MC más rMASP-3 de longitud completa activo (20 g/ml); y (4) suero humano inactivado por calor.

Resultados: La fig.45 ilustra gráficamente el porcentaje de hemolisis (tal como se mide por la liberación de hemoglobina de eritrocitos de conejo lisados en el sobrenadante medido por fotometría) de eritrocitos de conejo recubiertos de manano de más de un rango de concentraciones séricas en (1) suero humano normal; (2) suero de paciente de 3MC; (3) suero de paciente de 3MC más rMASP-3 de longitud completa activo (20 g/ml); y (4) suero humano inactivado por calor, medido en ausencia de Ca++. Como se muestra en la fig.45, el porcentaje de lisis de glóbulos rojos de conejo se incrementa significativamente en el suero de 3MC que incluye rMASP-3 en comparación con el porcentaje de lisis en el suero de 3MC sin rMASP-3 (p = 0.0006).

La fig.46 ilustra gráficamente el porcentaje de lisis de eritrocitos de conejo en 7% de suero humano de Paciente 2 de 3MC y del Paciente 3 de 3MC que contiene rMASP-3 activo en un rango de concentración de 0 a 110 g/ml en BBS/Mg++/EGTA. Como se muestra en la fig. 46, El porcentaje de lisis de los glóbulos rojos de conejo se restaura con la cantidad de rMASP-3 de una manera dependiente de la concentración hasta el 100% de actividad.

Experimento # 5: El suero de paciente con deficiencia de MASP-3 (CMC) tiene MASP-2 funcional si MBL está presente Metodos: Un ensayo de deposición de C3b se llevó a cabo usando placas de ELISA recubiertas con manano para examinar si el suero de 3MC es deficiente de LEA-2. Citrato de plasma se diluyó en tampón de BBS en diluciones seriadas (a partir de 1:80, 1:160, 1:320, 1:640, 1:1280, 1:2560) y se sembraron en placas recubiertas con manano. El C3b depositado se detectó utilizando un ensayo de C3b antihumano de pollo. La deposición de C3b impulsada por LEA-2 (las diluciones de plasma son altas para que AP y LEA-1 funcionen) en placas de ELISA recubiertas con manano se evaluó como una función de la concentración de suero humano en el suero de un sujeto humano normal (NHS), de pacientes dos de 3MC (Paciente 2 Paciente y 3), de los padres de Paciente 3 y de un sujeto deficiente de MBL.

Resultados: La fig. 47 ilustra gráficamente el nivel de deposición de C3b impulsado por LEA-2 (es decir, impulsado por MASP-2) sobre placas de ELISA recubiertas con manano como una función de la concentración de suero humano diluido en tampón de BBS, para el suero de un sujeto humano normal (NHS), de dos pacientes de 3MC (Paciente 2 Paciente y 3), de los padres del Paciente 3 y de un sujeto deficientes de MBL. Estos datos indican que el paciente 2 tiene suficiente MBL. Sin embargo, el Paciente 3 y la madre del paciente 3 son deficientes de MBL, y por lo tanto su suero no deposita C3b en manano través de LEA-2. La sustitución de MBL en estos sueros restaura la deposición de C3b mediada por LEA-2 en el suero del paciente 3 (que es homocigoto para el SNP que conduce a la deficiencia de MASP-3) y su madre (que es heterocigoto para el alelo utante de MASP-3) (datos no mostrados). Este hallazgo demuestra que el suero de 3MC no es deficiente en LEA-2, sino más bien parece tener MASP-2 funcional y MASP-1 funcional.

Sumario General y Conclusiones: Estos resultados demuestran que la deficiencia de MASP-3 en el suero humano resulta en la pérdida de actividad de la AP, como se manifiesta en la reducción de la deposición de C3b en pozos recubiertos de zimosano y la reducción de la lisis en eritrocitos de conejo. La AP (via alternativa) se puede restaurar en ambos ensayos completando el suero con MASP-3 recombinante, funcional, humano- Aunque la modalidad preferida de la invención ha sido ilustrada y descrita, se apreciará que varios cambios se pueden hacer en la misma sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para la inhibición de la activación del complemento dependiente de MASP-3 en un sujeto que sufre de hemoglobinuria paroxistica nocturna (HPN), que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de un agente inhibidor de MASP-3 eficaz para inhibir la activación del complemento dependiente DE MASP-3.

2 . El método de la reivindicación 1, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal de MASP-3, o un fragmento del mismo que se une específicamente a una porción de la SEQ ID NO: 8.

3. El método de la reivindicación 1, que comprende además administrar al sujeto una composición que comprende un agente inhibidor de MASP-1.

4. El método de la reivindicación 3, en donde el agente inhibidor de MASP-1 es un anticuerpo monoclonal de MASP-1, o fragmento del mismo, que se une específicamente a una porción de la SEQ ID NO: 10.

5. El método de la reivindicación 1, que comprende además administrar al sujeto una composición que comprende un agente inhibidor de MASP-2.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal de MASP-2, o fragmento del mismo que se une específicamente a una porción de la SEQ ID NO: 5.

7. El método de la reivindicación 1, que comprende además administrar al sujeto una composición que comprende un agente inhibidor de MASP-1 y un agente inhibidor de MASP-2.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la composición aumenta la supervivencia de los glóbulos rojos en el sujeto.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el sujeto presenta uno o más síntomas seleccionados del grupo que consiste de (i) niveles de hemoglobina inferiores a los normales, (ii) niveles de plaquetas inferiores a los normales; (iii) niveles de reticuloscitos superiores a los normales; y (iv) niveles de bilirrubina superiores a los normales.

10. El método de la reivindicación 1, en donde el sujeto ha experimentado previamente, o está actualmente en tratamiento con un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento.

11. El método de la reivindicación 1, donde el método comprende además la administración al sujeto de un inhibidor del complemento terminal que inhibe la escisión de la proteína C5 del complemento.

12. El método de la reivindicación 11, en donde el inhibidor del complemento terminal es un anticuerpo anti-C5 humanizado o fragmento de unión a antigeno del mismo.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el inhibidor del complemento terminal es eculizumab.

14. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inhibidor de MASP-3 inhibe la deposición de C3b impulsada por la via alternativa.

15. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inhibidor de MASP-3 inhibe la maduración del factor D.

16. El método de la reivindicación 3, en donde el agente inhibidor de MASP-1 se une específicamente a una porción de MASP-1 con una afinidad de al menos 10 veces mayor con la que se une a MASP-3 (SEQ ID NO: 8).

17. El método de la reivindicación 3, en donde el agente inhibidor de MASP-1 se une específicamente al dominio de serina proteasa de MASP-1 (aa 449-694 de SEQ ID NO: 10).

18. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inhibidor de MASP-3 también se une a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10).

19. El método de la reivindicación 18, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor dual de MASP- l/MASP-3 que se une a una región de consenso dentro de los dominios CUB1-CCP2.

20. El método de la reivindicación 18, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor dual de MASP-l/MASP-3 que se une a una región de consenso dentro del dominio CCP2.

21. El método de la reivindicación 18, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal biespecifico que se une al dominio de serina proteasa de MASP-1 (aa 449- 694 de SEQ ID NO: 10) y también se une al dominio de serina proteasa de MASP-3 (aa 450- 711 de SEQ ID NO: 8).

22. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inhibidor de MASP-3 también se une a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5).

23. El método de la reivindicación 22, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor dual de MASP-3/MASP-2 que se une a una región conservada dentro de los dominios de serina proteasa de MASP-3 y MASP-2.

24. El método de la reivindicación 22, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal biespecifico que se une al dominio de serina proteasa de MASP-3 (aa 450-711 de SEQ ID NO: 8) y también se une a al menos uno de el dominio de serina proteasa de MASP-2 (aa 445-682 de SEQ ID NO: 5) o el dominio de CCP1-CCP2 de MASP-2 (aa 300-431 de SEQ ID NO: 5).

25. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inhibidor de MASP-3 se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y no inhibe MASP-1 o MASP-2.

26. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente a una porción de MASP-3 con una afinidad de al menos 10 veces mayor de con la que se une a MASP-1 (SEQ ID NO: 10).

27. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente al dominio de serina proteasa de MASP-3 (aa 450 a 711 de SEQ ID NO: 8).

28. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor pan de MASP- 1, MASP-2 y MASP-3 y se une a una región conservada en los dominios CUB1 -EGF-CUB2.

29. El método de la reivindicación 1, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor triespecifico de MASP-1, MASP-2 y MASP-3.

30. El método de la reivindicación 2, en donde la composición comprende además un anticuerpo de MASP-2.

31. El método de la reivindicación 2, en donde la composición comprende además un anticuerpo de MASP-1.

32. El método de la reivindicación 7, en donde la composición comprende un anticuerpo de MASP-1 y un anticuerpo de MASP-2 y un anticuerpo de MASP-3.

33. El método de la reivindicación 7, en donde el método comprende la co-administración de una composición que comprende al menos uno de un anticuerpo de MASP-2, un anticuerpo de MASP-1, o un anticuerpo de MASP-3.

34. El método de la reivindicación 18, en donde la composición comprende además un anticuerpo de MASP-2.

35. El método de la reivindicación 22, en donde la composición comprende además un anticuerpo de MASP-1.

36. El método de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo recombinante, un anticuerpo que tiene reducción de función efectora, un anticuerpo quimérico, y un anticuerpo humanizado o humano.

37. El método de la reivindicación 1, en donde la composición se administra sistémicamente.

38. El método de la reivindicación 37, en donde la composición se administra por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial o como un inhalante.

39. Un método para aumentar la supervivencia de los glóbulos rojos en un sujeto que sufre de hemoglobinuria paroxistica nocturna (HPN), que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad de al menos uno de un agente inhibidor de MASP-1 y/o un agente inhibidor de MASP-3 eficaz para aumentar la supervivencia de los glóbulos rojos.

40. El método de la reivindicación 39, en donde la composición comprende un agente inhibidor de MASP-1.

41. El método de la reivindicación 39, en donde la composición comprende un agente inhibidor de MASP-3.

42. El método de la reivindicación 39, en donde la composición comprende un agente inhibidor de MASP-1 y un agente inhibidor de MASP-3.

43. El método de la reivindicación 39, que además comprende administrar al sujeto una composición que comprende un agente inhibidor de MASP-2.

44. El método de la reivindicación 40, en donde el agente inhibidor de MASP-1 es un anticuerpo monoclonal de MASP-1.

45. El método de la reivindicación 41, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal de MASP-3.

46. El método de la reivindicación 43, en donde el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo monoclonal de MASP-2.

47. Una composición farmacéutica que comprende al menos un agente inhibidor de la vía del complemento, en donde el al menos un agente inhibidor comprende un agente inhibidor de MASP-2 y al menos uno de un agente inhibidor de MASP-3 y/o un agente inhibidor de MASP-1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

48. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el al menos un agente inhibidor comprende una combinación de una primera molécula gue es un agente inhibidor de MASP-3 y una segunda molécula gue es un agente inhibidor de MASP-2.

49. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el al menos un agente inhibidor comprende una entidad molecular única que incluye actividad como un agente inhibidor de MASP-3 y la actividad como un agente inhibidor de MASP-2.

50. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal de MASP-3, o fragmento del mismo.

51. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-2 es un anticuerpo de MASP-2, o fragmento del mismo.

52. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 inhibe la escisión de factor B mediada por MASP-3.

53. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 inhibe la maduración del factor D.

54. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-1 es un anticuerpo de MASP-1, o un fragmento del mismo.

55. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-1 se une específicamente a una porción de MASP-1 con una afinidad de al menos 10 veces mayor que con la que se une a MASP-3 (SEQ ID NO: 8).

56. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-1 se une específicamente al dominio de serina proteasa de MASP-1 (aa 449-694 de SEQ ID NO: 10).

57. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-1 también se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8).

58. La composición farmacéutica de la reivindicación 57, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor dual de MASP-l/MASP-3 que se une a una región de consenso dentro de los dominios CUB1-CCP2.

59. La composición farmacéutica de la reivindicación 57, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor dual de MASP-l/MASP-3 que se une a una región de consenso dentro del dominio CCP2.

60. La composición farmacéutica de la reivindicación 57, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal biespecifico que se une al dominio de serina proteasa de MASP-1 (aa 449-694 de SEQ ID NO: 10) y también se une al dominio de serina proteasa de MASP-3 (aa 450 a 711 de SEQ ID NO: 8).

61. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-1 también se une a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5).

62. La composición farmacéutica de la reivindicación 61, en donde el agente inhibidor de MASP-1 es un inhibidor dual de MASP-l/MASP-2 que se une a una región conservada dentro de los dominios de serina proteasa de MASP-1 y MASP-2.

63. La composición farmacéutica de la reivindicación 61, en donde el agente inhibidor de MASP-1 es un anticuerpo monoclonal biespecifico que se une al dominio de serina proteasa de MASP-1 (aa 449-694 de SEQ ID NO: 10) y también se une a al menos uno del dominio de serina proteasa de MASP-2 (aa 445-682 de SEQ ID NO: 5) o el dominio CCP-1-CCP2 de MASP-2 (aa 300-431 de SEQ ID NO: 5).

64. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8 de longitud completa).

65. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente a una porción de MASP-3 con una afinidad de al menos 10 veces mayor que con la que se une a MASP-1 (SEQ ID NO: 10).

66. La composición farmacéutica de la reivindicación 64, en donde el agente inhibidor de MASP-3 se une específicamente al dominio de serina proteasa de MASP-3 (aa 450 a 711 de la SEQ ID NO: 8).

67. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 también se une a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5).

68. La composición farmacéutica de la reivindicación 67, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor dual de MASP-2/MASP-3 que se une a una región conservada dentro de los dominios de serina proteasa de MASP-2 y MASP-3.

69. La composición farmacéutica de la reivindicación 67, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal biespecífico que se une al dominio de serina proteasa de MASP-3 (aa 450-711 de SEQ ID NO: 8) y también se une a al menos uno del dominio de serina proteasa de MASP-2 (aa 445-682 de SEQ ID NO: 5) o el dominio CCP-1-CCP2 de MASP-2 (aa 300-431 de SEQ ID NO: 5).

70. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor pan de MASP-l, MASP-2 y MASP-3 y se une a una región conservada en los dominios CUB1-EGF-CUB2 de las tres proteínas .

71. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor de triespecífico de MASP-l, MASP-2 y MASP- 3.

72. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo de MASP-3, y en donde la composición comprende además un anticuerpo de MASP-2.

73. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo de dMASP-3, y en donde la composición comprende además un anticuerpo de MASP-l.

74. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo de MASP-3, y en donde la composición comprende además un anticuerpo de MASP-2.

75. La composición farmacéutica de la reivindicación 47,en donde la composición comprende un anticuerpo de MASP-1 y un anticuerpo de MASP-2 y un anticuerpo de MASP-3.

76. La composición farmacéutica de la reivindicación 57, en donde la composición comprende además un anticuerpo de MASP-2.

77. La composición farmacéutica de la reivindicación 61, en donde la composición comprende además un anticuerpo de MASP-3.

78. La composición farmacéutica de la reivindicación 67, en donde la composición comprende además un anticuerpo de MASP-1.

79. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo recombinante, un anticuerpo que tiene reducción de función efectora, un anticuerpo quimérico, y un anticuerpo humanizado o humano.

80. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde el agente inhibidor de MASP-1 inhibe la maduración del factor D.

81. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en donde la composición se formula para la administración sistémica.

82. La composición farmacéutica de la reivindicación 81, en donde la composición se formula para la administración por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraarterial o como un inhalante.

83. Una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor de MASP-3 que se une a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10 de longitud completa) y que también se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y un portador farmacéutico.

84. La composición de la reivindicación 83, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor dual de MASP-l/MASP-3.

85. La composición de la reivindicación 83, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo biespecifico.

86. La composición de la reivindicación 85, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo monoclonal biespecifico que se une al dominio de serina proteasa de MASP-1 (aa 449- 694 de SEQ ID NO: 10) y también se une al dominio de serina proteasa de MASP-3 (aa 450- 711 de SEQ ID NO: 8).

87. Una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor de MASP-3 que se une a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5 de longitud completa) y que también se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y un portador farmacéutico.

88. La composición de la reivindicación 87, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un inhibidor dual de MASP-2/MASP-3.

89. La composición de la reivindicación 87, en donde el agente inhibidor de MASP-3 es un anticuerpo biespecífico de MASP-2/MASP-3.

90. Una composición farmacéutica que comprende un agente inhibidor de MASP-3 que se une a una porción de MASP-1 (SEQ ID NO: 10 longitud completa), que se une a una porción de MASP-2 (SEQ ID NO: 5 longitud completa) y que también se une a una porción de MASP-3 (SEQ ID NO: 8) y un portador farmacéutico.

91. La composición de la reivindicación 90, en donde el agente inhibidor es un inhibidor pan de MASP.

92. La composición de la reivindicación 90, en donde el agente inhibidor es un anticuerpo triespecifico de MASP-1, MASP-2 y MASP-3.