MX2014011594A - Aglomerados de nanoparticulas que contienen osteopontina y particulas que contienen calcio y/o estroncio. - Google Patents
Aglomerados de nanoparticulas que contienen osteopontina y particulas que contienen calcio y/o estroncio.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a aglomerados de nanopartículas que comprenden osteopontina (OPN) y una o más partículas que contienen calcio y/o estroncio y a su uso para reducir o prevenir el crecimiento de una biopelícula o para eliminar una biopelícula. La invención asimismo se refiere al uso de aglomerados de nanopartículas para tratar, aliviar o prevenir enfermedades relacionadas con biopelículas.
Description
AGLOMERADOS DE NANOPARTICULAS QUE CONTIENEN OSTEOPONTINA Y PARTÍCULAS QUE CONTIENEN CALCIO Y/O ESTRONCIO
Campo téenico de la invención
La presente invención se refiere a aglomerados de nanoparticulas que comprenden osteopontina (OPN) y una o más partículas que contienen calcio y/o estroncio y a su uso para reducir o prevenir el crecimiento de una biopelícula microbiana o para eliminar una biopelícula microbiana. La invención asimismo se refiere al uso de aglomerados de nanoparticulas para tratar, aliviar o prevenir enfermedades relacionadas con biopelículas.
Antecedentes de la invención
Las biopelículas microbianas provocan mucho daño. Las biopelículas bacterianas y fúngicas están implicadas en numerosas enfermedades humanas, incluidas endocarditis bacteriana, infecciones de heridas crónicas, infecciones de implantes, otitis media, caries, periodontitis y fibrosis quística. Además, las biopelículas juegan un papel importante en la descomposición de los alimentos e incrustación biológica, los cuales provocan enormes pérdidas económicas alrededor del mundo. Aunque los abordajes anti-biopelícula convencionales apuntan a la eliminación mecánica de las biopelículas y/o la destrucción de bacterias en las biopelículas, las estrategias alternativas se dirigen a mecanismos que participan en la formación de biopelículas
microbianas (adhesión, co-aglomeración, maduración de biopeliculas). Aun asi, los efectos nocivos de las biopeliculas microbianas siguen siendo un gran problema. La caries dental, por ejemplo, continúa siendo la enfermedad humana más extendida.
El documento W02005053628 divulga el uso de OPN para reducir el crecimiento bacteriano de placa en el esmalte dental y formulaciones dentales que contiene osteopontina.
Jensen et al. (Journal of Biomedical Material Research A, Oct. 2011, Vol 99A. Ejemplar 1) divulgan nanoparticulas de hidroxiapatita recubiertas con OPN y su uso para recubrimientos de implantes.
Holt et al. (FEBS Journal 276 (2009), páginas 2308-2323) divulgan la producción de nanoagrupamientos de fosfato de calcio utilizando OPN o fragmentos de OPN para controlar el crecimiento de los núcleos de fosfato de calcio.
Compendio de la invención
Los inventores de la presente invención han encontrado que los aglomerados de nanoparticulas que comprenden OPN y una partícula que comprende calcio sorprendentemente proporcionan una gran reducción en el crecimiento de biopeliculas orales in vitro e ín vivo (ver, por ejemplo Ejemplos 6 y 8, y las Figuras 3 y 6). Los agregados de nanoparticulas son altamente eficientes para reducir la formación de biopeliculas, mucho más que la OPN sola, o
partículas que contienen calcio sin OPN, u otras partículas modelo. Por lo tanto, se obtiene una sinergia clara mediante la combinación de OPN y partículas que contienen calcio que conduce a efectos anti-biopelícula mejorados. Más aun, los inventores han demostrado que el calcio puede reemplazarse por estroncio.
Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a agregados de nanopartículas que comprenden a) OPN y b) una primera partícula que comprende calcio y/o estroncio, para su uso como un medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere a agregados de nanopartículas que comprenden a) OPN y b) una primera partícula que comprende calcio y/o estroncio para curar, aliviar y/o prevenir una enfermedad relacionada con biopelículas.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de agregados de nanopartículas que comprenden a) OPN y b) una primera partícula que comprende calcio y/o estroncio para reducir o prevenir el crecimiento de biopelícula microbiana o para eliminar la biopelícula microbiana. En algunas realizaciones de la invención, este uso no es un tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. La biopelícula puede ser, por ejemplo, una biopelícula que no está en contacto con un humano o animal vivo.
Un aspecto de la invención se refiere a agregados de nanoparticulas que tienen la fórmula estequiométrica
A'io-cAc(P04)6-gBg(OH)2-zCz-OPNm (H2O)n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H2O, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HS04), (HP04), (H2PO4), H2O, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H20, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (PO4) y (HPO4) es superior a 2.5.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de agregados de nanoparticulas que comprenden a) OPN y b) fosfato de estroncio, fosfato de calcio y mezclas de los mismos para reducir o prevenir el crecimiento de biopeliculas microbianas.
Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición de recubrimiento que comprende agregados de nanoparticulas que comprenden a) OPN y b) fosfato de estroncio, fosfato de calcio y mezclas de los mismos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a agregados de nanoparticulas que tienen la fórmula estequiométrica
A'io-cAc(R04)6-UBU(OH)2-ZOZOPNm·(H20)h; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H2O, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HP04), (H2P04), H20, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H20, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (P04) y (HP04) es superior a 2.5 para su uso como un medicamento.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a agregados de nanoparticulas que tienen la fórmula estequiornétrica
A'10-cAc(P04)6-gBg(OH)2-zCz OPNm (H20)n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H20, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HS04), (HPO4), (H2P04), H20, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H20, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (P04) y (HPO4) es superior a 2.5
para su uso como un medicamento para curar, aliviar o prevenir una infección bacteriana.
Otro aspecto adicional de la presente invención se refiere a una formulación dental que comprende agregados de nanopartículas, en donde los agregados de nanoparticulas tienen la fórmula estequiométrica
A'io-cAc(P04)6-gBg(OH)2-zCzOPNm'(H2O)n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H20, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HP04), (H2PO4), H20, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H2O, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (P04) y (HP04) es superior a 2.5.
Un aspecto se refiere a un método para producir agregados de nanoparticulas formados por OPN y fosfato de calcio que comprende:
a) Proporcionar una primera solución acuosa que comprende fosfato como P043-; en donde el pH se encuentra en el rango de 6-14;
b) Proporcionar una segunda solución acuosa que comprende Ca2+ y/o Sr2+; en donde el pH se encuentra en el rango de 6-14;
en donde la primera, segunda o ambas soluciones acuosas comprenden OPN;
c) Mezclar dichas primera y segunda soluciones, formando asi una suspensión que comprende agregados de nanoparticulas gue comprenden 1) OPN, 2) fosfato de estroncio, fosfato de calcio o mezclas de los mismos, y 3) electrolitos solubles en agua;
d) Opcionalmente, eliminar una cantidad sustancial de dichos electrolitos solubles en agua de la suspensión;
e) Opcionalmente, separar dichos agregados de nanoparticulas de la fase de agua.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 A muestra la unión de OPN a bacterias en biopeliculas modelo de caries. Después de la fase de crecimiento, una biopelicula se incubó con OPN etiquetada fluorescentemente durante 45 min a 35°C. Las bacterias, especialmente las cadenas de estreptococos, pueden reconocerse, aunque no se utilizó ninguna cepa bacteriana. La fuerte afinidad de OPN por las superficies bacterianas se dirige a los agregados de nanoparticulas hacia biopeliculas. Barra = 10 pm. La Figura 1 B muestra la unión de agregados de nanoparticulas de fosfato de calcio que contienen OPN a biopelicula dental cultivada in vivo. La biopelicula se incubó con agregados de nanoparticula de fosfato de calcio que contenían OPN durante 30 min a 35°C y se tiñó con C-
SNARF-4. Los agregados de nanopartículas de fosfato de calcio que contienen OPN se agrupan fuertemente alrededor de la biopelicula bacteriana. Barra = 20 pm;
la Figura 2 muestra que el crecimiento bacteriano no está influenciado por OPN. S. mitis y A. naeslundii se cultivaron en THB y THB que contenia 0.9 g/1 de OPN. El crecimiento bacteriano se monitoreó mediante espectrofotometria. Las barras de error indican desviaciones estándar. La OPN mostró que no tiene un efecto bactericida o bacteriostático;
la Figura 3 muestra el efecto de diferentes agentes en la formación de biopelicula en el modelo de caries, medido mediante tinción con violeta de genciana. Los agregados de nanopartículas de fosfato de calcio que contienen OPN (HAP-OPN) reducen fuertemente la cantidad de biopelicula formada en las células de flujo, en comparación con 1000 nm de partículas de poliestireno, partículas de sílice (150 nm, 500 nm y 2000 nm), agregados de partícula de fosfato de calcio libre de OPN y 0.9 g/1 de OPN. Las barras de error indican desviaciones estándar;
la Figura 4 muestra que los agregados de nanopartículas de fosfato de calcio que contienen OPN (HAP-OPN) se unen considerablemente más a violeta de genciana que las partículas de sílice, partículas de poliestireno, OPN en solución y agregados de nanopartículas de fosfato de calcio
(HAP) libres de OPN. La cuantificación de violeta de genciana de la cantidad de biopelicula formada en presencia de agregados de nanopartículas que contienen OPN (se muestra en la Figura 3) sobreestima la cantidad real de biopelicula formada en las células de flujo. Las barras de error indican desviaciones estándar;
la Figura 5 muestra que los agregados de nanopartículas de fosfato de calcio que contienen OPN reducen la cantidad de biopelicula cultivada en un modelo de célula de flujo de biopelicula de caries. Las biopelículas se tiñeron con C-SNARF-4 y se tomaron imágenes con un microscopio confocal. A Biopelicula cultivada sin agregados de nanopartículas. B: Biopelicula expuesta a agregados de nanopartículas durante el crecimiento. Barras = 20 pm;
la Figura 6 muestra que los agregados de nanopartículas de fosfato de calcio que contienen OPN reducen fuertemente el crecimiento de biopelicula oral in vivo. A: Biopelicula cultivada en una placa de vidrio mantenida intraoralmente durante 72 h. por día, se realizaron 5-6 baños de NaCl (30-60 minutos). B: Biopelicula cultivada en una placa de vidrio mantenida intraoralmente durante 72 h. por día, se realizaron 5-6 baños (30-60 min) con agregados de nanopartículas de fosfato de calcio que contenían OPN. Ambas placas de vidrio se utilizaron por el mismo sujeto de estudio al mismo tiempo. Barras = 20 pm;
las Figuras la-le muestran que los agregados de nanopartículas de fosfato de calcio que contienen OPN amortiguan el ácido producido por las cepas del modelo de caries cuando se cultivan en cultivo planctónico;
las Figuras 8a-8e muestran que los agregados de nanopartículas de fosfato de calcio que contienen OPN amortiguan el ácido producido por biopelículas en el modelo de caries de cinco especies. Las biopelículas sólo fueron incubadas con agregados de nanopartículas después de que terminó el crecimiento en THB que contenía glucosa. En biopelículas que se expusieron a agregados de nanopartículas, el pH nunca se redujo por debajo de 5.5, el valor crítico para la disolución del esmalte;
la Figura 9 muestra los patrones de difracción de rayos X registrados utilizando radiación CuKa. Los patrones de difracción para los materiales individuales se han cambiado verticalmente por razones de claridad. Los materiales de apatita nanocristalina se obtienen para una cantidad de OPN agregada de 15 mg/ml. Por encima de esta concentración se observan grandes cantidades de material amorfo; a 30 y 34 mg/ml se observan picos de difracción muy pequeños correspondientes a apatita nanocristalina sobre la dispersión de fondo amorfo grande;
la Figura 10 muestra los tamaños de cristalito promedio extraídos del refinamiento de Rietveld de los datos de
difracción de rayos X en la Figura 9. Se encontró que la forma de los nanocristales tenia aproximadamente la forma de una aguja con el eje morfológico largo que coincide con el eje c cristalográfico de apatita. El panel superior muestra los resultados para todos los datos mientras el panel inferior exhibe el gran efecto en el tamaño de cristalito observado a una concentración muy baja; el aumento en el tamaño de cristalito observado para 12.5 y 15 mg/ml de OPN es presumiblemente debido a la formación de un material nanocristalino/amorfo mezclado;
la Figura 11 muestra los datos del análisis termogravimétrico (TGA) de agregados de nanoparticulas en función de la cantidad de OPN agregada. Los datos se han cambiado a lo largo del eje de las ordenadas por razones de claridad. La pérdida de masa de 25-200°C se asigna a la pérdida de agua, mientras la pérdida de 200 a 550°C corresponde al material orgánico y la pérdida de 550 a 1200°C se asigna a la pérdida de carbonato;
la Figura 12 muestra las fracciones de masa de agua, orgánicas y de carbonato extraídas de los datos de TGA en la Figura 11. Las masas orgánicas y de carbonato se han normalizado a masa de material seco (la masa residual a 200°C);
la Figura 13 muestra los datos FTIR de agregados de nanopartículas en función de la cantidad de OPN agregada. Los
datos se han cambiado a lo largo del eje de las ordenadas por razones de claridad. Al aumentar las concentraciones de OPN, la intensidad de los picos de amida alrededor de 1300, 1550 y 1650 crrr1 aumenta, indicando que más proteina está asociada con las partículas en la síntesis de alta concentración. Se observan picos específicos para fosfato (900-1200 citr1), carbonato (840-890 enr1) y amida (1595-1720 crrr1); y
la Figura 14 muestra estimados de contenido orgánico y de carbonato de datos de IR obtenidos como las relaciones de áreas de pico para fosfato (900-1200 cirr1), carbonato (840-890 crn-1) y amida (1595-1720 crn-1). Se destaca la concordancia con los resultados obtenidos por TGA en la Figura 12.
La presente invención se describirá ahora en más detalle a continuación.
Descripción detallada de la invención
Como se estableció anteriormente, un aspecto de la invención se refiere a agregados de nanopartículas que comprenden a) OPN y b) una primera partícula que comprende calcio y/o estroncio, para su uso como un medicamento.
Por lo tanto, cada uno de los agregados de nanopartículas preferiblemente contiene OPN y una primera partícula que comprende calcio y/o estroncio.
El calcio está preferiblemente presente en su estado de oxidación +2 (Ca2+). De forma similar, el estroncio se utiliza preferiblemente en su estado de oxidación +2 (Sr2+).
En el contexto de la presente invención, la frase "Y y/o X" significa "Y" o "X" o "Y y X". En la misma linea de lógica, la frase "ni, n2, ..., ni-i y/o ni" significa "ni" o "n2" o ... o "ni-i" o "ni" o cualquier combinación de los componentes ni, n2,...ni-i y m .
Tal como se utiliza en la presente el término "osteopontina" u "OPN" significa osteopontina obtenida a partir de leche, incluyendo fragmentos o péptidos naturales derivados de OPN mediante escisión proteolitica en la leche, o variantes de división de genes, fosforilación o de glicosilación como se obtiene del método propuesto en el documento WO 01/49741. La leche puede ser leche de cualquier animal que produce leche, tal como vacas, humanos, camellos, cabras, ovejas, dromedarios y llamas. Sin embargo, la OPN de leche bovina se prefiere actualmente debido a su disponibilidad. La osteopontina de longitud completa (fOPN) es una proteina de unión a calcio ácida rica en ácido siálico altamente fosforilada. La fOPN se une a 28 moles de fosfato y aproximadamente 50 moles de Ca por mol. El punto isoeléctrico de fOPN es de aproximadamente 3.0. La proteina existe en varios tejidos en el cuerpo y juega un importante papel como una proteína de señalización y regulación. Es una proteína activa en procesos de biomineralización. La OPN se expresa mediante una cantidad de tipos de célula incluyendo células óseas, células de músculo liso y células epiteliales.
Todas las cantidades se basan en OPN de leche bovina nativa, pero pueden corregirse fácilmente según las cantidades correspondientes de una fracción activa de la misma u OPN de otras fuentes. La OPN o derivados de la misma también pueden prepararse recombinantemente.
LA OPN está presente en leche bovina, en la forma de una OPN bovina de longitud completa (por ejemplo la posición 17-278 de No. de acceso de Swiss-Prot P31096, o un péptido que tiene al menos 95% de identidad secuencial con la posición 17-278 de No. de acceso de Swiss-Prot P31096) y en la forma de un fragmento en el extremo N-terminal largo de OPN bovina de longitud completa (por ejemplo la posición 17-163 de No. de acceso de Swiss-Prot P31096, o un péptido que tiene al menos 95% de identidad secuencial con la posición 17-163 No. de acceso de Swiss-Prot P31096), ver por ejemplo Bissonnette et al., Journal of Dairy Science Vol.95 No.2, 2012.
En el contexto de la presente invención, la expresión "identidad secuencial" se refiere a una medición cuantitativa del grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de ácido nucleico, preferiblemente de la misma longitud. Si las dos secuencias a comparar no son de la misma longitud, deben estar alineadas al mejor ajuste posible La identidad secuencial puede calcularse como
(Nref Ndif ) * 100 ) / (Nref ) ,
en donde Ndif es el número total de residuos no idénticos en las dos secuencias cuando se alinean, y en donde Nref es el número de residuos de las secuencias de referencia. Por lo tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad secuencial de 75% con la secuencia AATCAATC (Ndif=2 y Nref=8). Una brecha se cuenta como no identidad de los residuos específicos, es decir la secuencia de ADN AGTGTC tendrá una identidad secuencial de 75% con la secuencia de ADN AGTCAGTC (Ndif=2 y Nref=8). La identidad secuencial puede calcularse, por ejemplo, utilizando programas BLAST apropiados, tales como el algoritmo BLASTp proporcionado por el Centro Nacional de Información de Bioteenología (NCBI), EE.UU.
Por ejemplo, la OPN utilizada en la presente invención puede ser OPN de longitud completa sustancialmente pura, puede ser un fragmento sustancialmente puro de OPN de longitud completa y puede ser una mezcla que comprende OPN de longitud completa y uno o más fragmentos de OPN.
La OPN utilizada en la presente invención puede ser OPN bovina de longitud completa sustancialmente pura, puede ser un fragmento del extremo N-terminal largo sustancialmente puro de OPN bovina de longitud completa, y puede ser una mezcla que comprende OPN bovina de longitud completa y el fragmento del extremo N-terminal largo de OPN bovina de longitud completa. Dicha mezcla puede contener, por ejemplo, OPN bovina de longitud completa en una cantidad de 5-40% (p/p)
con respecto a la cantidad total de OPN y el fragmento del extremo N-terminal largo de la OPN bovina de longitud completa en una cantidad de 60-95% (p/p) con respecto a la cantidad total de OPN.
La OPN bovina está típicamente disponible en una concentración de 20 mg de OPN por litro de leche bovina.
La OPN bovina puede aislarse mediante cromatografía de intercambio de aniones a partir de por ejemplo suero de leche ácido a pH 4.5 como se describe por las solicitudes de patente WO 01/497741 A2, WO 02/28413, WO 2012/117,119 o WO 2012/117,120. Puede obtenerse una pureza de OPN de hasta 90-95%.
Los agregados de nanopartículas pueden contener además otros péptidos que se unen a calcio además de OPN.
Los agregados de nanopartículas pueden contener, además de la OPN, uno o más fosfopéptidos seleccionados del grupo que consiste en fetuina A (FETUA) (No. de acceso de Swiss-Prot P02765), fosfoproteína 4 básica rica en prolina (PRB4) (No. de acceso de Swiss-Prot Pl 0163), proteína Gla matricial (MGP) (No. de acceso de Swiss-Prot P08493), fosfoproteína 24 secretada (SPP-24) (No. de acceso de Swiss-Prot Q13103), proteína de unión a riboflavina (No. de acceso de Swiss-Prot P02752), sialofosfoproteína de unión a integrina II (IBSP-II) (No. de acceso de Swiss-Prot P21815), fosfoglicoproteína ósea extracelular matricial (MEPE) (No. de acceso de Swiss-Prot
Q9NQ76), fosfoproteina 1 ácida matricial de dentina (0MP1) (No. de acceso de Swiss- Prot Q13316), beta-caseína humana, beta-caseína bovina, e isofor as o fragmentos fosfopeptídicos de los mismos.
Otro aspecto de la invención se refiere a agregados de nanopartículas que comprenden a) OPN y b) una primera partícula que comprende calcio y/o estroncio para curar, aliviar y/o prevenir una enfermedad relacionada con biopelículas.
Los agregados de nanopartículas pueden utilizarse para tratar sujetos humanos o sujetos animales.
En el contexto de la presente invención la expresión "enfermedad relacionada con biopelículas" se refiere a una enfermedad que es al menos causada parcialmente por el contacto de la biopelícula con el cuerpo humano o animal. Una enfermedad relacionada con biopelículas puede implicar, por ejemplo, una infección bacteriana.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la enfermedad relacionada con biopelículas es una enfermedad oral.
La enfermedad relacionada con biopelículas puede ser, por ejemplo, caries dental, gingivitis y/o periodontitis.
La enfermedad relacionada con biopelículas puede ser gingivitis. Alternativamente, la enfermedad relacionada con
biopelículas es periodontitis. La enfermedad relacionada también puede ser caries dental.
En algunas realizaciones de la invención, la enfermedad relacionada con biopelículas es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en endocarditis bacteriana, infecciones de heridas crónicas, infecciones de implantes, otitis media y fibrosis quística y una combinación de los mismos.
Los agregados de nanopartículas pueden ser, por ejemplo, para curar, aliviar y/o prevenir una infección bacteriana, por ejemplo, una infección de herida crónica.
Un aspecto de la invención puede referirse, por ejemplo a los agregados de nanopartículas para curar, aliviar y/o prevenir una infección bacteriana.
La infección bacteriana puede ser, por ejemplo, una infección bacteriana oral, tal como gingivitis. Por lo tanto, los agregados de nanopartículas pueden ser para curar, aliviar y/o prevenir gingivitis.
Los agregados de nanopartículas pueden ser para reducir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas.
Por ejemplo, los agregados de nanopartículas pueden ser para reducir o prevenir la formación de placa dental.
Además, o de manera alternativa, de reducir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas los agregados de
nanopartículas pueden ser para eliminar la biopelicula microbiana, tal como por ejemplo placa dental.
Un aspecto de la presente invención se refiere al uso de agregados de nanopartículas que comprenden OPN y fosfato de calcio para reducir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas.
Una biopelicula es una comunidad de microorganismos en la cual las células se adhieren entre si sobre una superficie. Estas células adherentes se fijan frecuentemente en una matriz auto-producida de sustancia polimérica extracelular.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de agregados de nanopartículas que comprenden OPN y fosfato de estroncio/calcio para reducir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas.
Otro aspecto se refiere al uso de agregados de nanopartículas que comprenden OPN y fosfato de estroncio para reducir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas.
Otro aspecto adicional se refiere al uso de agregados de nanopartículas que comprenden OPN y mezclas de fosfato de estroncio y fosfato de calcio para reducir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas.
Otro aspecto se refiere al uso de agregados de nanopartículas que comprenden a) OPN y b) fosfato de estroncio, fosfato de calcio y mezclas de los mismos, para reducir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas.
En el presente contexto, los agregados de nanopartículas significan colecciones de nanopartículas, en donde dichas nanopartículas no se separan fácilmente entre sí tras estímulo mecánico tal como agitación o ultrasonicación de bajo poder. Como ejemplo, las nanopartículas de OPN y nanopartículas de fosfato de calcio se combinan para formar agregados de nanopartículas.
En la presente invención pueden utilizarse varios tamaños de agregados de nanopartículas. En algunas realizaciones de la invención los agregados de nanopartículas tienen un radio hidrodinámico de a lo sumo 5 micrones. Por ejemplo, los agregados de nanopartículas pueden tener un radio hidrodinámico de a lo sumo 2 micrones. Los agregados de nanopartículas pueden tener, por ejemplo, un radio hidrodinámico de a lo sumo 1 micrón. Alternativamente, los agregados de nanopartículas pueden tener un radio hidrodinámico de a lo sumo 0.7 micrones.
Incluso pueden preferirse agregados de nanopartículas más pequeños. Por lo tanto, en algunas realizaciones preferidas de la invención los agregados de nanopartículas tienen un radio hidrodinámico de a lo sumo 0.5 micrones. Por ejemplo, los agregados de nanopartículas pueden tener un radio hidrodinámico de a lo sumo 0.4 micrones. Los agregados de nanopartículas pueden tener, por ejemplo, un radio hidrodinámico de a lo sumo 0.3 micrón. Alternativamente, los
agregados de nanoparticulas pueden tener un radio hidrodinámico de a lo sumo 0.2 micrones, tal como a lo sumo 0.1 micrón.
El radio hidrodinámico se determina preferiblemente utilizando un dispersor de luz dinámica (DLS).
Típicamente, los agregados de nanoparticulas tienen un radio hidrodinámico de al menos 5 nm, y preferiblemente al menos 10 nm.
Como se indicó, la primera partícula comprende calcio y/o estroncio.
En algunas realizaciones preferidas de la invención la primera partícula comprende calcio.
En algunas realizaciones preferidas de la invención la primera partícula comprende estroncio.
En algunas realizaciones preferidas de la invención la primera partícula comprende calcio y estroncio.
La primera partícula puede comprender, por ejemplo, o incluso consistir en, una sal que comprende calcio y/o estroncio.
La primera partícula puede comprender al menos 50% (p/p) de la sal de calcio y/o estroncio con respecto al peso total de la primera partícula. Por ejemplo, la primera partícula puede comprender al menos 70% (p/p) de la sal de calcio y/o estroncio. La primera partícula puede comprender, por ejemplo, al menos 80% (p/p) de la sal de calcio y/o estroncio.
Alternativamente, la primera partícula puede comprender al menos 90% (p/p) de la sal de calcio y/o estroncio, tal como al menos 95% (p/p).
La sal puede ser una sal orgánica que contiene calcio y/o estroncio y un anión orgánico apropiado, por ejemplo en la forma de un polímero orgánico aniónico.
Alternativamente, la sal puede ser una sal inorgánica que contiene calcio y/o estroncio y un anión inorgánico apropiado. Ejemplos no taxativos de dichos aniones inorgánicos son una especie de fosfato, un sulfato, un carbonato o una mezcla de los mismos. Por lo tanto, la sal inorgánica puede comprender una especie de fosfato, sulfato y/o carbonato.
La especie de fosfato puede ser por ejemplo fosfato (P043-), fosfato monohidrógeno (HPO42), un pirofosfato o difosfato (P2O74). Actualmente se prefiere que la especie de fosfato sea fosfato (PO43), o alternativamente una combinación de fosfato (PC>43_) y fosfato monohidrógeno (HPC>42~)
Por lo tanto, en algunas realizaciones preferidas de la invención, la primera partícula comprende o incluso consiste en, una sal inorgánica de calcio y/o estroncio.
Preferiblemente, la primera partícula comprende al menos 50% (p/p) de sal inorgánica de calcio y/o estroncio con respecto al peso total de la primera partícula. Por ejemplo, la primera partícula puede comprender al menos 70% (p/p) de
sal inorgánica de calcio y/o estroncio. La primera partícula puede comprender, por ejemplo, al menos 80% (p/p) de sal inorgánica de calcio y/o estroncio. Alternativamente, la primera partícula puede comprender al menos 90% (p/p) de sal inorgánica de calcio y/o estroncio, tal como al menos 95% (p/p)·
En algunas realizaciones preferidas de la invención la primera partícula es capaz de liberar calcio y/o estroncio. Esta liberación de calcio y/o estroncio preferiblemente ocurre cuando los agregados de nanopartículas están en contacto o cerca de la biopelícula. Por ejemplo, los agregados de nanopartículas son preferiblemente capaces de liberar calcio y/o estroncio cuando están presentes en una película líguida de la cavidad oral, tal como por ejemplo saliva o una biopelícula oral.
En algunas realizaciones actualmente preferidas de la invención, la primera partícula es una nanopartícula, es decir, tiene un radio hidrodinámico de a lo sumo 1 micrón. Por ejemplo, el radio hidrodinámico de la primera partícula puede ser a lo sumo 0.8 micrones. El radio hidrodinámico de la primera partícula puede ser, por ejemplo, a lo sumo 0.6 micrones. Alternativamente, el radio hidrodinámico de la primera partícula puede ser a lo sumo 0.4 micrones.
Incluso pueden preferirse partículas más pequeñas, de modo que la primera partícula puede tener un radio
hidrodinámico de a lo sumo 0.2 micrones. Por ejemplo, el radio hidrodinámico de la primera partícula puede ser a lo sumo 0.1 micrones. El radio hidrodinámico de la primera partícula puede ser, por ejemplo, a lo sumo 0.05 micrones. Alternativamente, el radio hidrodinámico de la primera partícula puede ser a lo sumo 0.01 micrones.
Típicamente, el radio hidrodinámico de la primera partícula es al menos 3 nm y preferiblemente al menos 5 nm.
En algunas realizaciones preferidas de la invención al menos algunos de los agregados de nanopartículas contienen una sola primera partícula a la cual está unida una o más moléculas de OPN. La primera partícula de los agregados de nanopartículas puede estar rodeada, por ejemplo, por una monocapa de OPN. Ejemplos de dichos agregados de nanopartículas pueden encontrarse en Holt et al. (FEBS Journal; vol.276; páginas 2308-2323; 2009).
En algunas realizaciones preferidas de la invención, al menos algunos de los agregados de nanopartículas comprenden una segunda partícula, y posiblemente incluso partículas adicionales, del mismo tipo que la primera partícula. Dichos agregados de nanopartículas son de este modo estructuras más complejas que contienen cada una múltiples partículas que contienen calcio y/o estroncio, además de múltiples moléculas de OPN.
En algunas realizaciones preferidas de la invención, la primera partícula comprende, o incluso consiste esencialmente en, fosfato de calcio. Por ejemplo, la primera partícula puede comprender una cantidad total de fosfato de calcio de al menos 50% (p/p) con respecto al peso de la primera partícula. La primera partícula puede comprender, por ejemplo, una cantidad total de fosfato de calcio de al menos 60% (p/p) con respecto al peso de la primera partícula, tal como al menos 70% (p/p) o incluso al menos 80% (p/p).
Alternativamente, la primera partícula puede comprender una cantidad total de fosfato de calcio de al menos 90% (p/p) con respecto al peso de la primera partícula. La parte restante de la primera partícula puede ser, por ejemplo, impurezas de las fuentes de calcio y fosfato utilizadas para preparar la primera partícula.
La primera partícula puede tener, por ejemplo, la fórmula estequiométrica:
A'10-cAc(P04)6-gBg(OH)2-zCz·(H2O)n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H2O, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HPO4), (H2PO4), H2O, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H20, vacante y mezclas
de los mismos, y Z=0-2; y en donde n=0-10; en donde la relación molar entre (P04) y (HR04) es superior a 2.5.
Otro aspecto de la invención se refiere a agregados de nanoparticulas que tienen la fórmula estequio étrica
A'10-xAx(PO4)6-YBY(OH)2-zCz-OPNm·(H2O)n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, ¾0, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HS04), (HP04), (H2P04), H2O, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H2O, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (PO4) y (HPO4) es superior a 2.5.
En el presente contexto, el término "vacante" debe entenderse como un tipo de defecto puntual en el mineral. Los cristales de mineral poseen inherentemente imperfecciones, a menudo denominadas "defectos cristalinos". Un defecto en donde un átomo falta de uno de los sitios de red se conoce como defecto 'vacante'.
En una realización, A' es Ca.
En otra realización, A' es Sr.
En otra realización adicional, A' es una mezcla de Ca y
Sr.
En una realización, A se selecciona del grupo que consiste en Na, K, Rb, Cs, Mg, Zn, Ba, vacante y mezclas de los mismos.
En otra realización, A se selecciona del grupo que consiste en Na, K, Mg, Zn, Ba, vacante y mezclas de los mismos.
En otra realización, A se selecciona del grupo que consiste en Na, K, vacante y mezclas de los mismos.
En otra realización, B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (HPO4), (H2PO4), H2O, vacante y mezclas de los mismos.
En otra realización adicional, C se selecciona del grupo que consiste en F, Cl, vacante y mezclas de los mismos.
En una realización, la relación molar entre (P04) y (HP04) es superior a 2.5, tal como por encima de 5, tal como por encima de 10, tal como por encima de 15, tal como por encima de 20, tal como por encima de 25, tal como por encima de 30, tal como por encima de 35, tal como por encima de 40, tal como por encima de 45, tal como por encima de 50, tal como por encima de 100, tal como por encima de 200, tal como por encima de 300, tal como por encima de 400, tal como por encima de 500, tal como por encima de 1000, tal como por encima de 10,000, tal como por encima de 20,000, tal como por encima de 50,000, tal como por encima de 100,000.
En otra realización, A' es una mezcla de Ca y Sr; en donde la relación entre Ca y Sr se encuentra en el rango de 1:1000 a 1000:1, tal como en el rango de 1:900 a 900:1, por ejemplo 1:850 o 850:1, tal como en el rango de 1:800 a 800:1, por ejemplo 1:750 o 750:1, tal como en el rango de 1:700 a 700:1, por ejemplo 1:650 o 650:1, tal como en el rango de 1:600 a 600:1, por ejemplo 1:550 o 550:1, tal como en el rango de 1:500 a 500:1, por ejemplo 1:450 o 450:1, tal como en el rango de 1:400 a 400:1, por ejemplo 1:350 o 350:1, tal como en el rango de 1:300 a 300:1, por ejemplo 1:250 o 250:1, tal como en el rango de 1:200 a 200:1, por ejemplo 1:150 o 150:1, tal como en el rango de 1:100 a 100:1, por ejemplo 1:75 o 75:1, tal como en el rango de 1:50 a 50:1, por ejemplo 1:25 o 25:1, tal como en el rango de 1:15 a 15:1, por ejemplo 1:10 o 10:1, tal como en el rango de 1:5 a 5:1, por ejemplo 1:5 o 5:1, tal como en el rango de 1:2.5 a 2.5:1, por ejemplo 1:2.5 o 2.5:1, por ejemplo 1:1.
En una realización, X se encuentra en el rango de 0-9, tal como en el rango de 0-8, tal como en el rango de 0-7, tal como en el rango de 0-6, tal como en el rango de 0-5, tal como en el rango de 0-4, tal como en el rango de 0-3, tal como en el rango de 0-2, tal como en el rango de 0-1.
En otra realización, X se encuentra en el rango de 0-9.5, tal como en el rango de 0.1- 9.0, por ejemplo 0.2, tal como en el rango de 0.3-8.5, por ejemplo 0.4, tal como en el rango
de 0.5-8.O, por ejemplo 0.6, tal como en el rango de 0.7-7.5, por ejemplo 0.8, tal como en el rango de 0.9-7.0, por ejemplo 1.0, tal como en el rango de 1.1-6.5, por ejemplo 1.2, tal como en el rango de 1.3-6.0, por ejemplo 1.4, tal como en el rango de 1.5-5.5, por ejemplo 1.6, tal como en el rango de
1.7-5.0, por ejemplo 1.8, tal como en el rango de 1.9-4.5, por ejemplo 2.0, tal como en el rango de 2.1-4.0, por ejemplo 2.2, tal como en el rango de 2.3-3.5, por ejemplo 2.4, tal como en el rango de 2.5-3.5, por ejemplo 3.0.
En una realización, Y se encuentra en el rango de 0-5, tal como en el rango de 0-4, tal como en el rango de 0-3, tal como en el rango de 0-2, tal como en el rango de 0-1.
En otra realización, Y se encuentra en el rango de 0-4.5, tal como en el rango de 0.1- 4.0, por ejemplo 0.2, tal como en el rango de 0.3-4.0, por ejemplo 0.4, tal como en el rango de 0.4-4.0, por ejemplo 0.5, tal como en el rango de 0.6-4.0, por ejemplo 0.7, tal como en el rango de 0.8-4.0, por ejemplo 0.9, tal como en el rango de 1.0-3.5, por ejemplo 1.2, tal como en el rango de 1.3-3.5, por ejemplo 1.4, tal como en el rango de 1.5-3.5, por ejemplo 1.6, tal como en el rango de
1.7-3.5, por ejemplo 1.8, tal como en el rango de 1.9-3.5, por ejemplo 2.0, tal como en el rango de 3.0, por ejemplo 2.2, tal como en el rango de 2.3-3.0, por ejemplo 2.4, tal como en el rango de 2.5-3.0.
En una realización, Z se encuentra en el rango de 0-2, tal como en el rango de 0-1.
En otra realización, Z se encuentra en el rango de 0-1.9, tal como en el rango de 0.1- 1.9, por ejemplo 0.2, tal como en el rango de 0.3-1.9, por ejemplo 0.4, tal como en el rango de 0.5-1.9, por ejemplo 0.6, tal como en el rango de 0.7-1.9, por ejemplo 0.8, tal como en el rango de 0.9-1.9, por ejemplo 1.0, tal como en el rango de 1.0-1.8, por ejemplo 1.1, tal como en el rango de 1.7, por ejemplo 1.3, tal como en el rango de 1.4-1.6, por ejemplo 1.5.
En una realización, B se selecciona del grupo que consiste en (C03), H2O, vacante y mezclas de los mismos.
En otra realización, A se selecciona del grupo que consiste en Na, H20, vacante y mezclas de los mismos.
En otra realización, B se selecciona del grupo que consiste en (C03), H20, vacante y mezclas de los mismos; y A se selecciona del grupo que consiste en Na, H20, vacante y mezclas de los mismos.
En otra realización, B se selecciona del grupo que consiste en (C03), H20, vacante y mezclas de los mismos; y A se selecciona del grupo que consiste en K, H20, vacante y mezclas de los mismos.
En una realización, m se encuentra en el rango de 1*10~10 a 0.25, tal como en el rango de 1*10-10 a 0.20, por ejemplo en el rango de 1*10~10 a 0.15, tal como en el rango de 1*10~10 a
0.10, por ejemplo en el rango de 1*1010 a 0.09, tal como en el rango de 1*10-10 a 0.08, por ejemplo en el rango de 1*10_1° a 0.07, tal como en el rango de 1*10~10 a 0.06, por ejemplo en el rango de 1*10-10 a 0.05, tal como en el rango de 1*10~10 a
0.04, por ejemplo en el rango de 1*10~10 a 0.03, tal como en el rango de 1*10~10 a 0.02, por ejemplo en el rango de 1*10~10 a 0.01.
En una realización, m se encuentra en el rango de 1*10-10 a 0.30, tal como en el rango de 1*10~9 a 0.20, por ejemplo en el rango de 1*10-8 a 0.15, tal como en el rango de 1*10~7 a 0.10, por ejemplo en el rango de 1*10~5 a 0.09, tal como en el rango de 1*10-5 a 0.08, por ejemplo en el rango de 1*10~4 a
0.07, tal como en el rango de 0.001 a 0.06, por ejemplo en el rango de 0.002 a 0.05, tal como en el rango de 0.003 a 0.04, por ejemplo en el rango de 0.005 a 0.03, tal como en el rango de 0.006 a 0.02, por ejemplo en el rango de 0.007 a 0.01.
En otra realización, m se encuentra en el rango de 0.00016 a 0.011, tal como 0.00016 a 0.009, tal como 0.0009 a 0.0035, tal como 0.0018 a 0.003.
En otra realización, n se encuentra en el rango de 0-100, tal como 0.01-100, por ejemplo 0.05, tal como en el rango de
0.1-90, por ejemplo 0.2, tal como en el rango de 0.3-85, por ejemplo 0.4, tal como en el rango de 0.5-80, por ejemplo 0.6, tal como en el rango de 0.7-75, por ejemplo 0.8, tal como en el rango de 0.9-70, por ejemplo 1.0, tal como en el rango de
1.2-65, por ejemplo 1.4, tal como en el rango de 1.6-60, por ejemplo 1.8, tal como en el rango de 2.0-55, por ejemplo 2.2, tal como en el rango de 2.4-50, por ejemplo 2.4, tal como en el rango de 2.6-45, por ejemplo 2.8, tal como en el rango de
3.0-40, por ejemplo 3.2, tal como en el rango de 3.4-35, por ejemplo 3.6, tal como en el rango de 3.8-30, por ejemplo 4.0, tal como en el rango de 4.2-25, por ejemplo 4.4, tal como en el rango de 4.6-20, por ejemplo 4.8, tal como en el rango de
5.0-15, por ejemplo 5.2, tal como en el rango de 5.4-14, por ejemplo 5.6, tal como en el rango de 5.8-13, por ejemplo 6.0, tal como en el rango de 6.2-12, por ejemplo 6.4, tal como en el rango de 6.6-11, por ejemplo 6.8, tal como en el rango de
7.0-10, por ejemplo 7.2, tal como en el rango de 7.4-9, por ejemplo 7.6, tal como en el rango de 7.8-8.8, por ejemplo 8.0.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a agregados de nanoparticulas que tienen la fórmula estequiométrica
A'10-cAc(P04)6-gBg(OH)2-zCz-OPNm·(H2O)n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H20, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HPO4), (H2PO4), H20, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H20, vacante y
mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (PO4) y (HPO4) es superior a 2.5 para su uso como un medicamento.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a agregados de nanoparticulas que tienen la fórmula estequiométrica
A'10-cAc(PO4)6-gBg(OH)2-zCzOPN (H2O)n en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H20, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HPO4), (H2P04), H2O, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H20, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (PO4) y (HPO4) es superior a 2.5 para su uso como un medicamento para curar, aliviar o prevenir una infección bacteriana.
En otra realización, A se selecciona del grupo que consiste en Zn, vacante y mezclas de los mismos.
En otra realización, B se selecciona del grupo que consiste en (C03), H20, vacante y mezclas de los mismos.
En otra realización adicional, C se selecciona del grupo que consiste en F, H20, vacante y mezclas de los mismos.
En otra realización, A se selecciona del grupo que consiste en Na, H2O, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B es (CO3) e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en H2O, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0- 10 y m>0.
En una realización, A se selecciona del grupo que consiste en Na, H20, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-2; en donde B es (CO3) e Y=0-1; en donde C se selecciona del grupo que consiste en H2O, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n = 0-10 y m>0.
En una realización, A se selecciona del grupo que consiste en Na, Zn, H2O, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (HPO4), (H2PO4), H20, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F,
(C03), H2O, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (PO4) y (HPO4) es superior a 2.5.
En otra realización, los agregados de nanoparticulas son amorfos. La primera partícula puede ser, por ejemplo, sustancialmente amorfa.
Alternativamente, la primera partícula puede ser sustancialmente cristalina.
En otra realización, los agregados de nanoparticulas contienen un material cristalino que coincide con el patrón de difracción de rayos X de hidroxilapatita.
En el presente contexto, el término "nanocristalino" debe comprenderse como un material cristalino, donde al menos una dimensión de los nanocristales es menor que 100 nm.
En otra realización adicional, los agregados de nanoparticulas contienen un material cristalino que coincide con el patrón de difracción de rayos X de hidroxilapatita y dicho material cristalino es nanocristalino.
En una realización, los agregados de nanoparticulas contienen material cristalino que coincide con el patrón de difracción de rayos X de hidroxilapatita, y dicho material cristalino es nanocristalino; en donde dichos nanocristales tienen tamaño de cristalito anisótropo con el eje c cristalográfico que coincide con el eje morfológico más grande de los cristalitos.
En otra realización, los agregados de nanoparticulas contienen material cristalino que coincide con el patrón de difracción de rayos X de hidroxilapatita y dicho material cristalino es nanocristalino en el sentido de que al menos una dimensión de los nanocristales es menor que 90 nm, tal como menor que 80 nm, por ejemplo menor que 70 nm, tal como menor que 60 nm, por ejemplo menor que 50 nm, tal como menor
que 40 nm, por ejemplo menor que 30 nm, tal como menor que 20 nm, por ejemplo menor que 10 nm.
Los inventores han observado indicios de que los presentes agregados de nanopartículas son particularmente adecuados para prevenir o desestabilizar la biopelícula que contiene una o más especies de bacterias de unión a OPN.
En algunas realizaciones de la invención la biopelicula contiene bacterias que tienen una capacidad de unión a OPN de al menos 50 moléculas de OPN por célula. Por ejemplo, la biopelicula puede contener bacterias que tienen una capacidad de unión a OPN de al menos 100 moléculas de OPN por célula. La biopelicula puede contener, por ejemplo, bacterias que tienen una capacidad de unión a OPN de al menos 200 moléculas de OPN por célula. Alternativamente, la biopelicula puede contener bacterias que tienen una capacidad de unión a OPN de al menos 400 moléculas de OPN por célula.
La capacidad de unión a OPN de una cepa bacteriana se mide de acuerdo con Rydén et al., Eur. J. Biochem., 184, 331-336 (1989) utilizando una OPN de longitud completa aislada de la leche bovina.
En algunas realizaciones preferidas de la invención la biopelicula contiene bacterias que tienen una capacidad de unión a OPN de al menos 800 moléculas de OPN por célula. Por ejemplo, la biopelicula puede contener bacterias que tienen una capacidad de unión a OPN de al menos 2,000 moléculas de
OPN por célula. La biopelicula puede contener, por ejemplo, bacterias que tienen una capacidad de unión a OPN de al menos 10,000 moléculas de OPN por célula. Alternativamente, la biopelicula puede contener bacterias que tienen una capacidad de unión a OPN de al menos 50,000 de moléculas de OPN por célula, tal como por ejemplo al menos 100,000 de moléculas de OPN por célula o incluso al menos 500,000 de moléculas de OPN por célula.
La biopelicula puede contener, por ejemplo, bacterias que tienen una capacidad de unión a OPN de al menos 1,000,000 de moléculas de OPN por célula.
Por ejemplo, la biopelicula puede contener, o incluso consistir en, una o más bacterias seleccionadas del grupo que consiste en Streptococcus spp. , Staphylococcus spp. , Pseudomonas spp. Actinomyces spp . , Lactobacillus spp. , Aggregatibacter spp. , Bacteroides spp. , Listeria spp. , Campylobacter spp. , Eikenella spp. , Porphyromonas spp. , Prevotella spp. , Treponema spp. y combinaciones de las mismas
En el caso de gingivitis, la biopelicula típicamente contiene una o más de las bacterias Aggregatibacter actinomycetemcomitans , Bacteroides forsythus , Campylobacter rectus, Eikenella corrodens , Porphyromonas gingivalis , Prevotella intermedia , Prevotella nigrescens y/o Treponema denticola .
En el caso de caries dental la biopelicula típicamente contiene una o más de las bacterias Streptococcus oralis, Streptococcus downei , Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis y Actinomyces naeslundii .
La biopelicula puede contener, además de las bacterias de unión a OPN, bacterias que no tienen o tienen poca unión a OPN.
Un aspecto se refiere al uso de agregados de nanopartículas que comprenden OPN y fosfato de calcio para reducir o prevenir las biopelículas bacterianas formadas por Streptococcus spp. y/o Actinomyces spp.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de agregados de nanopartículas que comprenden OPN y fosfato de estroncio/calcio para reducir o prevenir las biopelículas bacterianas formadas por Streptococcus spp. y/o Actinomyces spp.
Otro aspecto adicional se refiere al uso de agregados de nanopartículas que comprenden OPN y fosfato de estroncio para reducir o prevenir las biopelículas bacterianas formadas por Streptococcus spp. y/o Actinomyces spp.
Otro aspecto adicional se refiere al uso de agregados de nanopartículas que comprenden OPN y mezclas de fosfato de estroncio y fosfato de calcio para reducir o prevenir las biopelículas bacterianas formadas por Streptococcus spp. y/o Actinomyces spp.
Otro aspecto adicional se refiere al uso de agregados de nanoparticulas que comprenden a) OPN y b) fosfato de estroncio, fosfato de calcio y mezclas de los mismos, para reducir o prevenir las biopeliculas bacterianas formadas por Streptococcus spp. y/o Actinomyces spp.
Otro aspecto adicional se refiere al uso de agregados de nanoparticulas que comprenden OPN y fosfato de calcio para reducir o prevenir la adhesión bacteriana de Streptococcus spp. y/o Actinomyces spp.
Muchos problemas ocurren en conexión con el cuidado de los dientes, estéticamente asi como terapéuticamente, tal como la formación de biopelicula dental (placa), tinción de los dientes debido a productos bacterianos, formación de caries dentales de cálculo dental (sarro), infecciones del canal de la raiz y enfermedad periodontal.
La placa dental es una biopelicula compleja que se acumula en los tejidos duros (dientes) en la cavidad oral. Aunque las biopeliculas dentales albergan más de 500 especies bacterianas, la colonización sigue un patrón reglamentado con la adhesión de colonizadores iniciales a la película salival de esmalte seguido por la colonización secundaria a través de co-adhesión bacteriana. Se conoce bien que un rango de especies de Streptococcus y especies Actinomyces pertenecen a los colonizadores tempranos. Es importante por lo tanto controlar la adhesión y posterior formación de biopelicula de
estas bacterias. Una variedad de adhesinas y receptores participan en la adhesión bacteriana a superficies recubiertas por saliva, en co-agregación bacteriana, en interacciones de bacteria-matriz y contribuyen al desarrollo de biopelicula y finalmente a enfermedades tales como caries, infecciones endodónticas y enfermedad periodontal.
Un aspecto se refiere al uso de agregados de nanoparticulas que comprenden OPN y fosfato de calcio para reducir o prevenir el crecimiento de biopeliculas orales.
Cuando se utiliza para tratar, prevenir o reducir la biopelicula oral se prefiere que los agregados de nanoparticulas se administren oralmente. Más aun, se prefiere que los agregados de nanoparticulas estén presentes en una formulación adecuada para la administración oral.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de agregados de nanoparticulas que comprenden OPN y fosfato de estroncio/calcio para reducir o prevenir el crecimiento de biopeliculas orales.
Otro aspecto se refiere al uso de agregados de nanoparticulas que comprenden OPN y fosfato de estroncio para reducir o prevenir el crecimiento de biopeliculas orales.
Otro aspecto adicional se refiere al uso de agregados de nanoparticulas que comprenden OPN y mezclas de fosfato de estroncio y fosfato de calcio para reducir o prevenir el crecimiento de biopeliculas orales.
Otro aspecto se refiere al uso de agregados de nanoparticulas que comprenden a) OPN y b) fosfato de estroncio, fosfato de calcio y mezclas de los mismos, para reducir o prevenir el crecimiento de biopeliculas orales.
Otro aspecto se refiere al uso de agregados de nanoparticulas que comprenden a) OPN y b) fosfato de estroncio, fosfato de calcio y mezclas de los mismos, para reducir o prevenir la adhesión de biopeliculas orales.
En una realización, los agregados de nanoparticulas que comprenden OPN y fosfato de calcio tienen la fórmula estequiométrica
A'io-cAc(P04)6-gBg(OH)2-zCz-OPNm·(H20)n,' en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H2O, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HPO4), (H2PO4), H20, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H20, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (PO4) y (HPO4) es superior a 2.5. Otro aspecto de la invención se refiere a un método para curar, para aliviar y/o prevenir una enfermedad relacionada con biopeliculas de un sujeto animal o humano mediante la
administración al sujeto de agregados de nanoparticulas como se define en la presente.
Un aspecto de la presente invención se refiere al uso de agregados de nanoparticulas como se define en la presente para reducir, eliminar y/o prevenir el mal aliento.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para reducir o prevenir el crecimiento de biopelicula microbiana en o sobre un sujeto animal o humano mediante la administración al sujeto de agregados de nanoparticulas como se define en la presente.
Como se estableció anteriormente, la biopelicula a tratar, reducir o prevenir puede ser, por ejemplo una biopelicula oral, en cuyo caso se prefiere la administración oral de los agregados de nanoparticulas.
El sujeto animal puede ser, por ejemplo un animal domesticado tal como un mamífero domesticado, un pez domesticado o un pájaro domesticado.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un método para reducir, eliminar y/o prevenir el mal aliento de un sujeto animal o humano mediante la administración al sujeto de agregados de nanoparticulas como se define en la presente. Los agregados de nanoparticulas preferiblemente se administran oralmente.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso de agregados de nanoparticulas que comprenden a) OPN y b) una
primera partícula que comprende calcio y/o estroncio, para reducir o prevenir el crecimiento de biopelícula microbiana. En algunas realizaciones de la invención, se requiere que este uso no sea un tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.
La biopelícula puede ser en teoría cualquiera de las biopelículas mencionadas en la presente, y puede contener, por ejemplo, una más de las siguientes bacterias: Streptococcus spp. , Staphylococcus spp. , Pseudomonas spp. Actinomyces spp. , Lactobacillus spp. , Aggregatibacter spp. , Bacteroídes spp. , Listeria spp. , Campylobacter spp. , Eikenella spp. , Porphyromonas spp. , Prevotella spp. , Treponema spp.
Sin embargo, en algunas realizaciones de la invención, el uso anterior no es un tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. La biopelícula puede ser, por ejemplo, una biopelícula que no está en contacto con un humano vivo o animal vivo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a una formulación dental que comprende agregados de nanopartículas como se define en la presente.
La formulación dental puede comprender, por ejemplo, los agregados de nanopartículas que tienen la fórmula estequiométrica
A ' io-cAc ( P04 ) q-gBg (OH) 2-zCz -OPNm · (H2O) n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H20, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HP04), (H2PO4), H2O, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H20, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (P04) y (HPO4) es superior a 2.5.
Las formulaciones dentales pueden ser cualquier dentífrico o producto relacionado de relevancia en higiene oral, tal como por ejemplo polvo dental, gel dental, esmalte dental, enjuague bucal dental, spray bucal o goma de mascar.
En una realización, la formulación dental se encuentra en forma de pasta de dientes, gel dental, esmalte dental, enjuague bucal dental, spray bucal o goma de mascar.
Tal como se divulga en el documento WO 2005/053,628, la cantidad de osteopontina normalmente se encuentra entre aproximadamente 50 mg de OPN y aproximadamente 1500 mg de osteopontina por kg de formulación dental, y las cantidades más pequeñas tendrán también un efecto. Pueden utilizarse cantidades más altas, pero el efecto no se verá esencialmente aumentado. Una cantidad útil es 100-1000 mg OPN por kg, preferiblemente 200-500 mg, y más preferiblemente
aproximadamente 350 mg. Se supone que cantidades más altas no darán mejores resultados y por lo tanto no se recomiendan, porque la OPN es un ingrediente bastante costoso. Sorpresivamente, los inventores de la presente invención han demostrado que los aglomerados de nanoparticulas que comprenden OPN y fosfato de calcio tienen un efecto sinergistico ya que reducen o previenen el crecimiento de biopelicula microbiana. Por lo tanto, la presente invención reduce la cantidad efectiva de osteopontina por kg de formulación dental.
En el presente contexto, la expresión "crecimiento de biopelicula oral" significa crecimiento de biopelicula en tejidos duros y blandos orales (mucosa oral, lengua, superficies dentales) y crecimiento de biopelicula en los materiales insertados en la cavidad oral (implantes, aparatos de ortodoncia y materiales de restauración tales como empastes, coronas y dentaduras).
Composiciones preferidas de la presente invención son como se mencionó anteriormente en forma de pasta de dientes, esmalte dental, geles dentales y polvos dentales. Los componentes de dicha pasta de dientes y geles dentales incluyen uno o más de los siguientes: un abrasivo dental (de aproximadamente 10% a aproximadamente 50%), un tensioactivo (de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 10%), un agente espesante (de aproximadamente 0.04% a aproximadamente 0.5%),
un humectante (de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3%), un agente saborizante (de aproximadamente 0.04% a aproximadamente 2%), un agente edulcorante (de 0.1% a aproximadamente 3%), un agente colorante (de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.5%) y agua (de 2% a 45%).
A menos que se indique lo contario, los porcentajes de los componentes que forman parte de las composiciones o los productos de la presente invención son porcentajes en peso con respecto al peso total de la composición o producto.
Los agentes para el control de las caries pueden contener de 0.001% a aproximadamente 1% de aglomerados de nanoparticulas gue comprenden OPN y fosfato de calcio. Los agentes anticálculos contienen de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 13% de aglomerados de nanoparticulas que comprenden OPN y fosfato de calcio.
Los polvos dentales obviamente están básicamente libres de todos los componentes líquidos.
Otras composiciones preferidas de la presente invención son enjuagues bucales, incluidos sprays bucales. Los componentes de dichos enjuagues bucales y sprays bucales normalmente incluyen uno o más de los siguientes: agua (de aproximadamente 45% a aproximadamente 95%), etanol (de aproximadamente 0% a aproximadamente 25%), un humectante (de aproximadamente 0% a aproximadamente 50%), un tensioactivo (de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 7%), un agente
saborizante (de aproximadamente 0.04% a aproximadamente 2%), un agente edulcorante (de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3%) y un agente colorante (de aproximadamente 0.001% a aproximadamente 0.5% de agente anticaries que incluye aglomerados de nanoparticulas que comprenden OPN y fosfato de calcio, de aproximadamente 0.001% a 1% y un agente anticálculos (de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 13%).
Una tercera área de aplicación es en las formulaciones de goma de mascar de varias composiciones en términos generales.
Se ha reportado que el estroncio (Sr) promueve la formación ósea y es aprobado para el tratamiento de la osteoporosis.
Otro aspecto adicional se refiere a una composición de recubrimiento que comprende aglomerados de nanoparticulas tal como se definen en la presente.
La composición de recubrimiento puede contener por ejemplo aglomerados de nanoparticulas que tienen la fórmula estequiométrica
A'10-cAc(P04)6-yBy(OH)2-zCz-OPNm·(H2O)n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H2O, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HP04), (H2PO4), ¾0, vacante
y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H2O, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (P04) y (HPO4) está por encima
2.5.
La composición de recubrimiento puede, por ejemplo, comprender aglomerados de nanoparticulas que comprenden OPN y fosfato de calcio.
La composición de recubrimiento puede utilizarse en relación con enfermedad ósea, fractura ósea o implantes.
Un aspecto se refiere al uso de las composiciones de recubrimiento de acuerdo con la presente invención para recubrir dispositivos médicos.
Otro aspecto se refiere a un producto alimenticio o bebida que comprende aglomerados de nanoparticulas tal como se definen en la presente.
El producto alimenticio o bebida puede comprender, por ejemplo, aglomerados de nanoparticulas que tengan la fórmula estequiométrica
A'10-cAc(PO4)6-yBy(OH)2-zCz-OPNm (H2O)n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H20, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HPO4), (H2PO4), H20, vacante
y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H2O, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (P04) y (HR04) está por encima
2.5.
Un objeto de la presente invención es mejorar la reducción de biopelicula sobre las superficies.
Un aspecto se refiere a un producto que comprende una parte a granel y una región de superficie; en donde un primer recubrimiento de región de superficie está recubierto en al menos una primera parte de dicha región de superficie; comprendiendo dicho primer recubrimiento de región de superficie aglomerados de nanoparticulas tal como se define en la presente.
El primer recubrimiento de la región de superficie puede, por ejemplo, comprender aglomerados de nanoparticulas que tienen la fórmula estequiométrica
A110-cAc(PO4)6-gBg(OH)2-zCzOPNm‘(H20)n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, H2O, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HP04), (H2PO4), ¾0, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H20, vacante y
mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (P04) y (HR04) está por encima
2.5.
En una realización, la región de superficie comprende un material seleccionado del grupo que consiste en metales, óxidos metálicos, materiales inorgánicos, materiales orgánicos y polímeros.
En otra realización, la región de superficie tiene carga positiva.
En otra realización adicional, la región de superficie tiene carga negativa.
En otra realización adicional, la región de superficie no tiene carga.
En el presente contexto, se entiende al término 'agente antibiopelícula' como un agente que evita y/o reduce la adhesión microbiana a las superficies y/o evita y/o reduce la formación de biopelícula microbiana y/o altera y/o desestabiliza las biopelículas microbianas.
Un aspecto de la invención se refiere a un agente antibiopelícula que comprende a) OPN y b) una primera partícula que comprende calcio y/o estroncio.
El agente antibiopelícula puede por ejemplo comprender aglomerados de nanopartículas que comprenden a) OPN y b) fosfato de estroncio, fosfato de calcio o mezclas de los mismos.
El agente antibiopelicula puede, por ejemplo, comprender aglomerados de nanoparticulas que tienen la fórmula estequiométrica
A1io-cAc(PO4)6-gBg(OH)2-zCzOPNm·(H2O)n; en donde A' se selecciona del grupo que consiste en Ca, Sr y mezclas de los mismos; en donde A se selecciona del grupo que consiste en Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Zn, Ba, ¾0, vacante y mezclas de los mismos, y X=0-9; en donde B se selecciona del grupo que consiste en (CO3), (SO4), (HSO4), (HPO4), (H2PO4), H2O, vacante y mezclas de los mismos, e Y=0-5; en donde C se selecciona del grupo que consiste en F, CI, Br, I, (C03), H20, vacante y mezclas de los mismos, y Z=0-2; en donde n=0-10 y m>0; en donde la relación molar entre (PO4) y (HPO4) está por encima 2.5.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para producir aglomerados de nanoparticulas formados por OPN y fosfato de calcio que comprende:
a) proporcionar una primera solución acuosa que comprende fosfato como PO43·; en donde el pH está dentro del rango de 6-14;
b) proporcionar una segunda solución acuosa que comprende Ca2+ y/o Sr2+; en donde el pH está dentro del rango de 6-14;
en donde la primera, segunda solución acuosa o ambas comprenden OPN;
c) mezclar dicha primera y segunda solución, formando asi una suspensión que comprende aglomerados de nanopartículas que comprenden 1) OPN, 2) fosfato de estroncio, fosfato de calcio o mezclas de los mismos, y 3) electrolitos solubles en agua;
d) opcionalmente, eliminar una cantidad considerable de dichos electrolitos solubles en agua de la suspensión;
e) opcionalmente, separar dichos aglomerados de nanopartículas de la fase de agua.
En el presente contexto, la expresión 'solución acuosa' debe comprenderse como una materia líquida que comprende al menos 50% p/p de agua.
En el presente contexto, el término 'suspensión' debe comprenderse como fluido heterogéneo que contiene partículas sólidas que son lo suficientemente grandes para sedimentación.
En el presente contexto, el término 'electrolito' debe comprenderse como una sustancia que contiene iones libres que hacen la sustancia eléctricamente conductora. En la presente invención, el electrolito debe ser soluble en agua.
En una realización, el pH de la fase de agua de la suspensión está por encima de 7, tal como dentro del rango de 7.4-14.0, por ejemplo, por encima de 7.6, tal como dentro del rango de 7.8-13.5, por ejemplo, por encima de 8.0, tal como dentro del rango de 8.5-13.0, por ejemplo, encima de 9.0, tal como dentro del rango de 9.5-12.5, por ejemplo, encima de
10.0, tal como dentro del rango de 10.5-12.0, por ejemplo, encima de 11.0.
En una realización, el proceso comprende además la etapa d).
En otra realización, el proceso comprende además la etapa d), en donde la separación se realiza mediante diálisis.
En el presente contexto, el término 'diálisis' debe comprenderse como la separación de partículas coloidales suspendidas de iones disueltos o moléculas de pequeñas dimensiones (cristaloides) mediante sus tasas desiguales de difusión a través de los poros de membranas semipermeables.
En una realización, el proceso comprende además la etapa e).
En otra realización, la concentración total de osteopontina en la primera y la segunda solución acuosa está por encima de 2.5 mg/ml, tal como dentro del rango de 3-1000 mg/ml, por ejemplo, por encima de 5 mg/ml, tal como dentro del rango de 10-500 mg/ml, por ejemplo, por encima de 12 mg/ml, tal como dentro del rango de 15-100 mg/ml, por ejemplo, por encima de 18 mg/ml, tal como dentro del rango de 20-50 mg/ml, por ejemplo, por encima de 25 mg/ml, tal como dentro del rango de 30-45 mg/ml, por ejemplo, por encima de 35 mg/ml.
En una realización, el proceso comprende además la etapa f) esterilización de los aglomerados de nanopartículas.
En otra realización, el proceso comprende además la etapa f), en donde la esterilización se realiza mediante calentamiento.
En otra realización, el proceso comprende además la etapa f), en donde la etapa de esterilización se realiza calentando hasta 80°C y manteniendo la temperatura a este nivel durante 1 hora o más.
Los inventores han encontrado que hay un nivel superior de la concentración de osteopontina de aproximadamente 33%p de masa seca (es decir, con referencia a la masa obtenida mediante secado a 200°C), donde no parece estar incluida más osteopontina en los aglomerados de nanoparticulas. Esto se fija en una cantidad de OPN agregada de aproximadamente 20 mg/1. Por lo tanto, en una realización, la concentración total de osteopontina en la primera y la segunda solución acuosa está dentro del rango de 2.5-35 mg/ml. Sin embargo, este limite puede cambiar dependiendo de la concentración de diferentes electrolitos solubles en agua.
En una realización, la osteopontina está presente solo en la primera solución acuosa.
En otra realización, la osteopontina está presente solo en la segunda solución acuosa.
En otra realización adicional, la osteopontina está presente en la primera y la segunda solución acuosa.
En una realización, la etapa c) se realiza a una temperatura dentro del rango de 5-80 grados Celsius, tal como dentro del rango de 10-50°C, por ejemplo, dentro del rango de 20-40°C, tal como dentro del rango de 22-28°C.
En una realización, la primera, la segunda solución acuosa o ambas comprenden un tinte fluorescente de unión a Ca/Sr. Un tinte de unión a Ca/Sr adicional en las soluciones resultará en aglomerados de nanoparticulas fluorescentes (si se trata de un tinte fluorescente) o de color.
Cabe señalar que las realizaciones y características descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplican a los otros aspectos de la invención.
Todas las referencias de patentes y no patentes citadas en la presente solicitud se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.
La invención se describirá ahora en mayor detalle en los siguientes ejemplos no taxativos.
Ejemplos
Ejemplo 1: Síntesis de aglomerados de nanoparticulas
Para la síntesis de aglomerados de nanoparticulas se utilizó el siguiente método.
1) Se prepararon tres soluciones acuosas en volúmenes iguales. Una contenía 0.36 M de Na3PC>4 (realizada convenientemente al hacer una solución con NalhPCh 0.36 M y
NaOH 0.72 M). La segunda contenía CaCl20.6 M y la tercera contenía el triple de la cantidad final deseada de OPN.
2) Primero se mezclaron las soluciones de CaCl2 y OPN y luego se agregó la solución de Na3P04. Esta mezcla produjo una suspensión turbia similar a un gel. La estructura similar a un gel se desintegró al agitarla con un agitador magnético. La solución se agitó por 24 h a 25°C mediante el uso de un baño de agua de temperatura controlada diseñado específicamente con este propósito.
3) Luego de 24 h, se transfirió la solución a bolsas de diálisis para remover cualquier exceso de NaCl. Se llevó a cabo la diálisis por 24 h en un depósito que contenía 100 veces el volumen de solución de agua, que se agitó lentamente con un agitador magnético. El agua del depósito se cambió luego de 12 h de diálisis.
4) Luego de la diálisis, los aglomerados de nanopartículas se centrifugaron a 4800 rpm y se lavaron con agua dos veces.
5) Luego del lavado, los aglomerados de nanopartículas se secaron a 60°C antes del análisis.
Los resultados descritos más adelante se obtuvieron mediante reacción (paso 2 anterior) a 25°C; la reacción puede realizarse igualmente a otras temperaturas, tanto mayores como menores. A temperaturas mayores, la reacción es más rápida. La síntesis también se ha realizado utilizando K3PO4
como la fuente de fosfato. La reacción también se puede completar con menores (mayores) concentraciones de reactivos con los respectivos menores (mayores) rendimientos.
Se produjeron muestras con distintas cantidades de OPN. Se sintetizaron muestras que contenían 0, 0.001, 0.025, 0.01, 0.025, 0.1, 0.25, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 12.5, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0 y 34.0 mg/mL (17 concentraciones diferentes en total).
Se sintetizaron aglomerados de nanopartículas para experimentos de biopelículas con una cantidad de OPN agregada de 12.5 mg/ml, tal como se describe anteriormente, con el cambio de que el líquido del depósito de diálisis tenía pH y 0.9%p de NaCl. Luego de 24 h de diálisis, la suspensión resultante se esterilizó calentando la suspensión en un recipiente cerrado a 80°C durante 1 h. Los pasos 4) y 5) anteriores se omitieron en la producción de los aglomerados de nanopartículas para experimentos de biopelícula.
Los aglomerados de nanopartículas se caracterizaron por XRD, FTIR y TGA. Para mediciones de XRD y FTIR, las partículas secas se molieron hasta lograr un polvo fino antes de ser medidas. La XRD se midió en un Rigaku SmartLab con un equipo Bragg-Brentano. Los parámetros para la medición fueron los siguientes: 6-120° 2Q, ancho de paso 0.02, 4°/min. Se realizaron y promediaron dos exploraciones para cada muestra. La Figura 9 muestra un segmento seleccionado de los datos combinados. Los refinamientos de Rietveld se realizaron para
todas las muestras con cristalinidad suficiente. Las muestras con un contenido de OPN igual o mayor a 20 mg/mL no se refinaron, dado que estas muestras tenían un alto contenido amorfo, lo que complica los refinamientos de Rietveld. Para las muestras que se refinaron por el método de Rietveld, se extrajeron los parámetros seleccionados y se presentan en la Figura 10. El FTIR se realizó en un Nicolet 380 FT-IR, Smart Orbit (Thermo Electron Corporation). Las muestras se secaron a 60°C justo antes de la medición. Se ajustó y sustrajo un fondo para cada espectro individual. Los datos corregidos se pueden ver en la Figura 13. Se llevó a cabo la integración de picos específicos para la comparación entre el fosfato (1200-900 cm1), carbonato (890-840 cm-1) y contenido orgánico (1720-1595 cm-1) de las muestras. Las comparaciones entre las relaciones de picos de FTIR mineral:orgánico y mineral:carbonato se muestran en la Figura 14.
Los datos de TGA se registraron en un Netzsch STA 449 C (NETZSCHGeratebau GmbH, Selb, Alemania) mediante el uso de una atmósfera de Ar y 02. Los datos de TGA se muestran en la Figura 11, mientras que las pérdidas de masa extraída se muestran en la Figura 12.
Los datos de XRD revelaron que el material cristalino se formó para todas las muestras con menos de 20 mg/ml de OPN. Con 20 mg/ml y más, se observó una gran cantidad de materia amorfa. Con 30 y 34 mg/ml, se observó la presencia de picos
menores sobre la dispersión amorfa. Los picos de difracción para los materiales cristalinos fueron considerablemente mayores que la resolución experimental que refleja que los materiales cristalinos son nanocristalinos. Los datos de difracción de rayos-X hasta 15 mg/ml inclusive de OPN se modelaron mediante refinamiento de Rietveld para extraer la información sobre tamaños promedio de nanocristales. Los nanocristales son de tamaño anisotrópico y tienen forma de aguja, con un eje morfológico largo que coincide con el eje c cristalográfico. Los tamaños de los cristalitos extraídos se muestran en la Figura 10. En contenidos muy bajos de OPN, se vio una rápida caída en el tamaño del cristalito en ambas direcciones morfológicas (gráfica inferior de la Figura 10), luego de lo cual los tamaños se mantuvieron casi constantes hasta un contenido de OPN de ~1 mg/ml, luego del cual descendió de nuevo hasta un contenido de OPN de 10 mg/ml. Para 12.5 y 15 mg/ml, los aglomerados de partículas contenían nanocristales mayores que para 10 mg/ml pero la comparación entre las alturas de los fondos y los picos mostró que había una gran cantidad de material amorfo en estas muestras. El contenido de agua, componentes orgánicos y carbonato se evaluó por mediciones de TGA, tal como se muestra en la Figura 11. Las pérdidas de masa se muestran en la Figura 12; las pérdidas de masa que corresponden a contenidos orgánicos y de carbonato se corrigieron hasta masa seca (es decir, se
normalizaron por la masa que permaneció luego de la pérdida inicial de agua). El contenido de agua fue menor que 15%p en todos los casos. Fue considerablemente mayor para los compuestos amorfos (~10%p) que para los materiales no cristalinos. Para los materiales nanocristalinos, se observó un contenido de agua en aumento lineal con respecto al contenido de OPN, luego de 3.1+0.12-OPN, donde OPN es la OPN agregada en mg/ml. El contenido de carbonato fue de -2.4% en peso seco para los nanocristalinos y 4.8% en peso seco para los materiales amorfos, respectivamente. El contenido orgánico aumentó con OPN agregada hasta 10 mg/ml, demostrando con 12.5 y 15 mg/ml un menor contenido orgánico; a mayores concentraciones el contenido orgánico se saturó a ~33% en peso seco. Las observaciones realizadas anteriormente tal como se muestra en las Figuras 13 y 14 se confirmaron mediante FTIR.
Ejemplo 2: Crecimiento de biopelículas de modelo de caries dental
En los experimentos se utilizaron los aislados bacterianos orales humanos Streptococcus oralis SK248, Streptococcus downei HG594, Streptococcus mitis SK24, Streptococcus sanguinis SK150 y Actinomyces naesiundii AK6. Los organismos se cultivaron aeróbicamente en agar de sangre (SSI, Copenhague, Dinamarca) y se transfirieron a THB (Roth,
Karlsruhe, Alemania) a 35°C hasta la fase exponencial media a tardía previo al uso experimental.
Las células de flujo (ibiTreat, m-slide VI, Ibidi, Munich, Alemania) se preacondicionaron con 1/10 de THB (pH 7.0). Los cultivos bacterianos, ajustados a una densidad óptica de 0.4 a 550 nm (que corresponde a 2-5*109 células/ml), se inocularon secuencialmente a los canales de flujo en el orden siguiente: 1. S. oralis SK248; 2. A. naesiundii AK6; 3. S. mitis SK24; 4. S. downei HG594; 5. S. sanguinis SK150. Se inyectaron 0.4 mi de cada organismo a través del tubo de silicona en el puerto de entrada con agujas estériles (BD Microlance, 27G, Drogheda, Irlanda), y los orificios de inyección se sellaron con adhesivo de silicona (Dow Corning, Wiesbaden, Alemania). Luego de la inyección, el flujo se detuvo por 30 minutos para permitir la adhesión bacteriana. Los organismos que no se adhirieron se removieron con 10 minutos de flujo previo a la inyección del organismo siguiente. Luego del procedimiento de inoculación, se cultivaron las biopelículas durante 26 h a 35°C bajo flujo constante (250 ml/min; 28.3 mm/min) de 1/10 THB (pH 7.0) provisto por una bomba peristáltica (Watson Marlow 205 U, Wilmington, Massachusetts, EE.UU.).
Ejemplo 3: Unión de OPN a bacterias en biopelículas de modelo de caries
Se etiquetó OPN con fluoresceina de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Taastrup, Dinamarca). Luego de la fase de crecimiento, las biopeliculas se incubaron durante 45 minutos con 100 ml de la proteina etiquetada a 35°C y se registró mediante la linea láser de 488 nm y un filtro de paso de banda de 500-550 nm. Se reguló la resolución XY a 0.1 mm/pixel y la resolución Z correspondió a 1 unidad Airy (0.8 mm de grosor de corte óptico) (Figura 1A).
Ejemplo 4: Unión de aglomerados de nanoparticulas de fosfato de calcio que contienen OPN a una biopelicula dental cultivada in vivo
La biopelicula dental cultivada in vivo se extrajo de una superficie dental con una escofina esterilizada y se depositó en una placa de vidrio (4x4x1 mm). La placa de vidrio se dio vuelta, y la biopelicula se incubó con aglomerados de partículas de fosfato de calcio con contenido de OPN por 30 minutos a 35°C. Luego de lavarlos con NaCl al 0.9%, la biopelicula se tiñó con 30 mM C-SNARF-4 (Sigma-Aldrich, Br0ndby, Dinamarca) que se dirige tanto a las bacterias en las biopeliculas como a los aglomerados de nanoparticulas. Se utilizó un Zeiss LSM 510 META (Jena, Alemania) con un objetivo de inmersión en. aceite de 36x, apertura numérica de 1.4 (Plan-Aprochromat) para la obtención de imágenes. La sonda se retiró con una línea de láser de 543
nm (250-300 pW), y la emisión de fluorescencia se monitoreó dentro de un intervalo de 576-608 nm (detector META) con el agujero de aguja regulado a 2 unidades Airy (1.6 mm de espesor de corte óptico). Las imágenes fueron de un tamaño de 364x364 pixeles (143x143 pm2) y se adquirieron con un tiempo de toma de muestra de 18 ps, promedio de linea de 2, 0.4 pm/pixel (aumento 1), resolución de intensidad de 12 bits (Figura IB).
Ejemplo 5: Efecto del OPN sobre el crecimiento bacteriano en cultivos de plancton
Las bacterias se transfirieron al THB o al THB con 26.5 pmol/l de OPN. Las alícuotas de 100 ml se transfirieron a una placa de 96 pocilios (Sarstedt, Newton, Carolina del Norte, EE.UU.) se midió la OD a 550 nm con un espectrofotómetro (BioTek PowerWave XS2, Bad Friedrichshall, Alemania). Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado y se repitieron una vez (Figura 2).
Ejemplo 6: Efecto de los aglomerados de nanopartículas de fosfato de calcio con contenido de OPN en el crecimiento de biopelícula en el modelo de caries
Las biopelículas se cultivaron tal como se describió anteriormente y se trataron tres veces con aglomerados de nanopartículas de fosfato de calcio con contenido de OPN durante el crecimiento (3h, 9h y 24h luego del procedimiento de inoculación). Las suspensiones de aglomerados de
nanopartículas obtenidas del Ejemplo 1 se agitaron vigorosamente, se dejaron asentar por 10 minutos y 0.4 mi se aspiraron de la parte superior de las suspensiones. La suspensión aspirada tenia un contenido de aglomerados de nanopartículas de 3% (p/v) aproximadamente. Luego se detuvo el flujo y la suspensión aspirada, que contenía los aglomerados de nanopartículas, se inyectó a los canales tal como se describe para la inoculación de bacterias. Luego de una hora de inoculación se inició el flujo nuevamente. Los tratamientos de control se realizaron en la misma forma con aglomerados de nanopartículas de fosfato de calcio sin osteopontina, partículas de dióxido de silicio de distintos tamaños (110 nm, 500 nm y 2000 nm de diámetro; 3.5% (p/v) en NaCl al 0.9%; Sigma-Aldrich, Br0ndby, Dinamarca), partículas de poliestireno (1000 nm de diámetro; 3.5% (p/v) en agua destilada, Sigma-Aldrich) y OPN disuelta (0.9 g/1 en NaCl al 0.9%). Los canales incubados con 0.9% de NaCl sirvieron de testigos negativos. Se cultivaron seis biopelículas replicadas para cada situación experimental. Luego del crecimiento de la biopelícula, se extrajo el THB de los canales de flujo mediante aspiración con puntas de papel. Los canales se enjuagaron con agua destilada, se secaron de nuevo y se tiñeron con 100 mL de solución de violeta de genciana al 2% por 1 h. Luego los canales se enjuagaron nuevamente con agua destilada, se secaron y se les agregaron 120 pL de
etanol al 100% (Sigma-Aldrich, Br0ndby, Dinamarca) durante 30 minutos para desteñir las biopeliculas. Luego se transfirieron 100 mL de las soluciones de etanol teñidas, diluidas a 1:8, se transfirieron a una placa de 96 pocilios (Sarstedt, Newton, Carolina del Norte, EE.UÜ.) y se midió la densidad óptica a 585 nm con un espectrofotómetro (BioTek PowerWave XS2, Bad Friedrichshall, Alemania). Los canales de flujo vacíos se procesaron de la misma forma y se utilizaron para la extracción de fondo (Figura 3).
La Figura 3 muestra el efecto de los distintos agentes en la formación de biopelícula en el modelo de caries, medido por la tinción con violeta de genciana. Los aglomerados de nanopartículas de fosfato de calcio con contenido de OPN (HAP-OPN) reducen en gran medida la cantidad de biopelícula que se forma en las células de flujo, en comparación con 1000 nm de partículas de poliestireno, partículas de sílice (150 nm, 500 nm y 2000 n ), aglomerados de partículas de fosfato de calcio sin OPN y 0.9 g/1 de OPN.
Por lo tanto, el Ejemplo 6 ofrece evidencia estadísticamente significativa que demuestra que se obtiene un efecto antibiopelícula sinérgico al utilizar OPN unida a partículas con contenido de calcio.
Ejemplo 7: Unión por violeta de genciana de aglomerados de nanopartículas de fosfato de calcio con contenido de OPN
Se inyectaron 100 mL de aglomerados de nanoparticulas de fosfato de calcio con contenido de OPN a células de flujo (ibiTreat, p-slide VI, Ibidi, Munich, Alemania) y se dejaron secar durante la noche. Los canales de flujo se tiñeron con violeta de genciana por 15 minutos, se lavaron dos veces con PBS, se secaron y se llenaron con 120 pL de etanol al 100% durante 15 minutos. Se transfirieron 100 pL de soluciones de etanol teñidas, diluidas a 1:64, a una placa de 96 pocilios y se midió la densidad óptica a 585 nm. Los aglomerados de nanoparticulas de fosfato de calcio sin osteopontina, las partículas de dióxido de silicio (500 nm de diámetro; 3.5% (p/v) en NaCl al 0.9%), partículas de poliestireno (1000 nm de diámetro; 3.5% (p/m) en agua destilada), OPN disuelta (0.9 g/1 en NaCl al 0.9%) y 0.9 g/1 de NaCl sirvieron de testigos. Los experimentos se realizaron por triplicado (Figura 4).
Ejemplo 8: Efecto de los aglomerados de nanoparticulas de fosfato de calcio con contenido de OPN en_ la formación oral de biopelicula in vivo
Las biopelículas orales se formaron en placas de vidrio realizadas a medida (4x4x1 mm) (Menzel, Braunschweig, Alemania) con una rugosidad de superficie de 1200 grit. Las placas de vidrio se montaron empotradas en los bordes bucales de dispositivos intraorales diseñados individualmente. Dos voluntarios mantuvieron el dispositivo intraoral durante 72 h, excepto durante el lavado de dientes, la ingesta de comida o
líquidos que no fueran agua y durante los baños con aglomerados de nanopartículas. Una cara -del dispositivo se sumergió entre 5-6 veces (30-60 minutos) cada día en una suspensión con un contenido de NaCl al 0.9% y alrededor de 3% (p/v) de aglomerados de nanopartículas preparados en el Ejemplo 1. Al mismo tiempo, la otra cara del dispositivo se sumergió en NaCl al 0.9% y sirvió de control negativo. Luego de 72 h, se retiraron las placas de vidrio y las biopelículas se tiñeron con C-SNARF-4 previo al análisis microscópico confocal (Figura 6).
La Figura 6 muestra que los aglomerados de nanopartículas con contenido de calcio que contenían OPN reducen en gran medida el crecimiento in vivo de la biopelícula oral. A: La biopelícula cultivada en una placa de vidrio mantenida intraoralmente por 72 h. al día, se realizaron entre 5 y 6 baños de NaCl (30-60 minutos). B: Biopelícula cultivada en una placa de vidrio, mantenida intraoralmente durante 72 h.
De esta forma, el Ejemplo 8 confirma que el efecto antibiopelícula observado en el Ejemplo 6 también existe in vi vo .
Ejemplo 9: Efecto de los aglomerados de nanopartículas de fosfato de calcio con contenido de OPN en el pH de los cultivos bacterianos de plancton
Los cultivos bacterianos se cultivaron en THB hasta la fase exponencial media, se lavaron dos veces y se transfirieron a saliva estéril. La OD se ajustó a 1.0 (550 nm), se agregó glucosa al 0.4% (p/p) y se mezcló 1 mi de suspensión bacteriana con 1 mi de aglomerados de nanoparticulas de fosfato de calcio con contenido de OPN o 1 mi de NaCl al 0.9%. Se midió el pH durante 20 h. Los experimentos se llevaron a cabo por duplicado y se repitieron una vez (Figuras 7a-7e).
Ejemplo 10: Efecto de los aglomerados de nanoparticulas de fosfato de calcio con contenido de OPN en el pH de biopelículas de modelo de caries
El proceso de inoculación se llevó a cabo tal como se describió anteriormente. Luego se cultivaron las biopelículas en 1/10 de THB diluido durante 8 h a 35°C con una tasa de flujo de 250 ml/min. Para ese entonces, ya se habían formado biopelículas finas y estables. Luego se cambió el medio a un extracto de carne vacuna sin carbohidratos (Scharlau, Barcelona, España) y la tasa de flujo se redujo a 50 mL/min para minimizar los esfuerzos cortantes de la célula de flujo. 1 h, 12 h y 17 h después del cambio mínimo, las partículas de HAP-OPIM se inyectaron e incubaron con las biopelículas durante 1 h tal como se describió anteriormente. Los canales de control se incubaron con NaCl al 0.9%.
Calibración microscópica confocal de la sonda sensible a pH ratiométrica C-SNARF-4: Se capturaron imágenes en canales de flujo de soluciones amortiguadoras HEPES (50 mM; ajustado al pH 4.5-8.5 en fases de 0.1 unidades de pH), con un contenido de C-SNARF-4 con una concentración de 30 mM. Se utilizó un Zeiss LSM 510 META (Jena, Alemania) con un objetivo de inmersión en aceite de 63x apertura numérica de 1.4 (Plan-Aprochromat) para la obtención de imágenes. La sonda se retiró con una linea de láser de 543 nm (250-300 pW), y la emisión de fluorescencia se monitoreó simultáneamente dentro de intervalos de 576-608 nm (verde) y 629-661 nm (rojo) (detector META), con el agujero de aguja regulado a 2 unidades Airy (1.6 m de espesor de corte óptico). Las imágenes tenían un tamaño de 364x364 píxeles (143x143 pm2) y se adquirieron con un tiempo de toma de muestra de 18 ps, promedio de línea de 2, 0.4 mm/píxel (aumento 1), resolución de intensidad de 12 bits. Por cada tercer valor de pH, se realizó una medición sobre el amortiguador HEPES no teñido (50 mM, pH 8.5) para la extracción de fondo. Además, se capturaron imágenes de las soluciones de glucosa no teñidas (20% p/v) y lactato (20% p/v), 1/10 de THB diluido (pH 7), saliva esterilizada, PBS (pH 7.4, Sigma-Aldrich, Br0ndby, Dinamarca), biopelículas no tratadas y suspensiones de partículas HAP-OPN con configuraciones idénticas de microscopio y láser. Las señales no autofluorescentes se
emitieron por cualquiera de estos testigos en los rangos de longitud de onda de 576-608 nm y 629-661 nm.
Para el cálculo de la relación, las regiones de 100 x 100 pixeles se definieron dentro de cada imagen y las desviaciones promedio y estándar se determinaron mediante el uso del software de adquisición LSM. Luego, se calculó la relación R, la desviación estándar SR y el error estándar de la media, SR, para cada valor de pH de acuerdo con las ecuaciones (1), (2) y (3):
'
g, r, sg y sr son las desviaciones promedio y estándar dentro de la región de 100 x 100 pixeles definida en las imágenes verde y roja respectivas. bg, br, Sbg y sbr son los valores correspondientes para las imágenes de fondo. Los valores resultantes de R se representaron gráficamente en MATLAB (Math orks, Natick, Massachusetts, EE.UU.), y se ajustaron para la función:
(4) pH as-Itt 5.9799
Las medidas se realizaron dos veces y resultaron ser altamente reproducidles.
Captura de imágenes del pH de biopelícula: Se cultivaron tres biopeliculas en paralelo, una de las cuales se trató con aglomerados de nanoparticulas que contenían OPN tal como se describió anteriormente. Luego, las biopeliculas se lavaron dos veces con saliva esterilizada, y se agregó C-SNARF-4 a una concentración de 30 mM. La célula de flujo se transfirió al microscopio, que se mantuvo a 37°C dentro de una incubadora XL (PeCon, Erbach, Alemania), y las imágenes de pH de referencia se obtuvieron en la capa más baja de las biopeliculas. Luego, se sustituyó la saliva sin glucosa por una solución salival con 0.4% (p/v) de glucosa y 30 mM de C-SNARF-4 en dos de los tres canales. En cada una de las tres biopeliculas, las imágenes de pH se obtuvieron en 16 campos de visión microscópicos elegidos al azar. Las posiciones XY se marcaron en el software LSM y 60 minutos luego de la adición de glucosa, se capturaron nuevamente imágenes de campos microscópicos idénticos, en el mismo orden. Para la extracción de fondo se obtuvieron imágenes con el láser de 543 nm apagado. La configuración del microscopio y el láser era idéntica a la de las mediciones de calibración. Se realizaron cinco repeticiones independientes de los experimentos (Figuras 8a-8e).
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica
la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (24)
1. Agregados de nanoparticulas que comprenden a) osteopontina (OPN) y b) una primera partícula que comprende calcio y/o estroncio para curar, aliviar y/o prevenir una enfermedad relacionada con biopelículas.
2. Los agregados de nanoparticulas de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad relacionada con biopelículas implica una infección bacteriana.
3. Los agregados de nanoparticulas de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la enfermedad relacionada con biopelículas es una enfermedad oral.
4. Los agregados de nanoparticulas de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la enfermedad relacionada con biopelículas es caries dental.
5. Los agregados de nanoparticulas de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en donde la enfermedad relacionada con biopelículas es gingivitis.
6. Los agregados de nanoparticulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, en donde la enfermedad relacionada con biopelículas es periodontitis.
7. Los agregados de nanoparticulas de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la enfermedad relacionada con biopelículas es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en endocarditis bacteriana, infecciones de heridas crónicas, infecciones de implantes, otitis media, fibrosis quistica y una combinación de los mismos.
8. Los agregados de nanoparticulas de acuerdo con la reivindicación 1 para curar, aliviar y/o prevenir una infección bacteriana, por ejemplo una infección de herida bacteriana.
9. Agregados de nanoparticulas que comprenden a) OPN y b) una primera partícula que comprende calcio y/o estroncio para reducir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas o para eliminar la biopelícula microbiana.
10. Los agregados de nanoparticulas de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la biopelícula es placa dental.
11. Los agregados de nanoparticulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde la biopelícula contiene bacterias que tienen una capacidad de unión a OPN de al menos 50 moléculas de OPN por célula.
12. Los agregados de nanoparticulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la biopelícula contiene, o incluso consiste en, una o más bacterias seleccionadas del grupo que consiste en Streptococcus spp. , Staphylococcus spp. , Pseudomonas spp. Actinomyces spp. , Lactobacillus spp. , ñggregatibacter spp. , Bacteroides spp. , Listeria spp. , Campylobacter spp. , Eikenella spp. , Porphyromonas spp. , Prevotella spp. , Treponema spp. y combinaciones de las mismas.
13. Los agregados de nanopartículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera partícula comprende calcio.
14. Los agregados de nanopartículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera partícula comprende estroncio.
15. Los agregados de nanopartículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera partícula comprende calcio y estroncio.
16. Los agregados de nanopartículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera partícula comprende una sal inorgánica de calcio y/o estroncio.
17. Los agregados de nanopartículas de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la sal inorgánica comprende una especie de fosfato, sulfato y/o carbonato.
18. Los agregados de nanopartículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera partícula comprende al menos 50% (p/p) de fosfato de calcio.
19. Los agregados de nanopartículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera partícula es capaz de liberar calcio y/o estroncio.
20. Los agregados de nanopartículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la primera partícula es una nanoparticula.
21. Los agregados de nanopartículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprenden una segunda partícula del mismo tipo que la primera partícula.
22. Los agregados de nanopartículas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tienen un radio hidrodinámico de a lo sumo 5 micrones.
23. El uso de agregados de nanopartículas que comprenden a) OPN y b) una primera partícula que comprende calcio y/o estroncio para reducir o prevenir el crecimiento de biopelículas microbianas o para eliminar la biopelícula microbiana.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la biopelícula contiene, o incluso consiste en, una o más bacterias seleccionadas del grupo que consiste en Streptococcus spp. , Staphylococcus spp. , Pseudomonas spp. Actinomyces spp. r Lactobacillus spp. , Aggregatibacter spp. , Bacteroides spp. , Listeria spp. , Campylobacter spp. , Eikenella spp. , Porphyromonas spp. , Prevotella spp. , Treponema spp. y combinaciones de las mismas.
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