MX2014011305A - Vacuna de lipopolisacaridos. - Google Patents

Abstract

Una composición de vacuna para aves que comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-O derivado de bacterias Gram-negativas, siempre que dicha estructura no contenga una célula entera, y un procedimiento para preparar la misma se proporcionan; mediante el uso de una estructura que contiene el antígeno-O (por ejemplo, lipopolisacárido) derivado de bacterias Gram-negativas como un ingrediente activo de acuerdo con la presente invención, la mitigación de la reacción de inoculación y reducción en una cantidad de la inyección se alcanzan en comparación con la vacuna convencional de células enteras para permitir de este modo el incremento en el número de otros antígenos que se mezclará con la misma.

Description

VACUNA DE LIPOPOLISACÁRIDOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una novedosa vacuna útil para la prevención de enfermedades infecciosas causadas por bacterias Gram-negativas como Salmonella y E. coli. Específicamente, la presente invención se refiere a un método para inmunizar a los animales no humanos, en particular, aves utilizando como un antígeno protector una estructura que contiene el antígeno-0 (por ejemplo, lipopolisacárido) derivado de bacterias Gram-negativas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las bacterias tienen afinidad de tinte diferente dependiendo de diferentes composiciones de la pared celular cuando se prueban con tinción de Gram y se dividen en dos grupos principales de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas basados en las diferencias en su afinidad de tinte. En el caso de las bacterias Gram-negativas, la pared celular se compone de una membrana externa y una capa de peptidoglicano en el interior de la membrana externa. La membrana externa se compone de fosfolípidos, lipopolisacáridos (LPS), lipoproteínas y proteínas de la membrana. La estructura de la membrana unitaria de la membrana externa consta de fosfolípidos y lipopolisacáridos. Un lipopolisacárido se encuentra en una capa externa de la membrana y un fosfolípido en una capa interna de la misma. Un lipopolisacárido consiste en un lípido de alto peso molecular, denominado lípido A, y un polisacárido unido al mismo. El lípido A constituye una capa externa de la membrana externa mientras que un polisacárido se extiende desde la membrana externa. El tipo de sacáridos es diferente del otro entre la porción externa y la porción en la vecindad de lípido A. La porción externa se llama un polisacárido de cadena del lado-O (antígeno-O) y la porción interna se llama un polisacárido de núcleo. El sacárido formado por el antígeno-0 es principalmente una hexosa y una pentosa y una estructura básica que consta de 3 a 5 clases de estos sacáridos aparecen repetidamente. En el polisacárido de núcleo están presentes, además de estos sacáridos, sacáridos únicos a las respectivas bacterias tales como una octosa, por ejemplo, cetodeoxioctonato y una heptosa. El lípido A es un lípido único a las respectivas bacterias que comprende un sacárido, es decir, dos moléculas de glucosamina que son -1 ,6-unido uno al otro, y el ácido fosfórico y un ácido graso unido a dicho sacárido. El lípido A está unido a un polisacárido de núcleo en la posición-6' del sacárido.

Hay muchas clases de bacterias Gram-negativas. Salmonella y E. coli, pertenecientes a las Enterobacteriaceae y Haemophilus, pertenecientes a Pasteurella, también están incluidos en las bacterias Gram-negativas.

Salmonella, bacilo grande secundaria con flagelos peritricosos, se divide en grupos según el tipo de antígeno-0 y se subdividen además por los tipos de antígeno-H, resultando en más de 2,000 clases de serotipo. Un intervalo hospedero de Salmonella es bastante amplio y una gran variedad de mamíferos incluyendo humanos y aves son conocidos para ser infectado con o para sostener la Salmonella. Cuando se infectan los pollos, Salmonella puede causar enfermedades sépticas en los pollitos. En el caso de pollos adultos, sin embargo, los pollos portadores son asintomáticos al escapar del sacrificio y como resultado la carne de pollo y los huevos derivados de los pollos contaminados con Salmonella son distribuidos para inducir la intoxicación alimentaria en humanos a través de productos alimenticios fabricados de tal modo.

La intoxicación alimentaria por Salmonella se desarrolla después de un período latente de 12 a 48 horas después de la ingesta de alimentos contaminados. Un período latente puede variar dependiendo de una cantidad de consumo de las bacterias, la condición y la edad de los pacientes. Los síntomas son principalmente gastroenteritis aguda y síntomas cardinales son diarrea, dolor abdominal, vómitos y fiebre. Así, una vacuna contra la salmonella para pollos no impide a los pollos del inicio de la enfermedad pero es una importante vacuna utilizada para la salud pública.

Entre las vacunas convencionales contra la Salmonella es una vacuna de células enteras que se compone de células de Salmonella inactivada. Una vacuna de células enteras, sin embargo, puede provocar efectos secundarios ya que contiene porciones que no son de antigenicidad.

En el caso de pollos que se crían en bandadas, en vista del ahorro de trabajo de la vacunación, hay una fuerte demanda de una vacuna multivalente que puede prevenir muchas enfermedades con una sola inyección. Además, una vacuna multivalente puede contribuir a la reducción del estrés en pollos ya que reduce el número de inyecciones. Sin embargo, aunque una vacuna multivalente tiene tal conveniencia, es capaz de causar una reacción de vacunación en el sitio de inyección, en particular, cuando contiene bacterias como la Salmonella.

Dadas las circunstancias, se han realizado investigaciones de una vacuna componente contra la Salmonella, entre las que se estudia la aplicación de un lipopolisacárido (antígeno-O). Por ejemplo, hay un informe que un conjugado que consiste de un antígeno-0 derivado de Salmonella Typhimurium unido a una proteína portadora es administrada a los ratones para confirmar su eficacia (referencia no de patente 1 ). También hay un informe que un lipopolisacárido derivado de Salmonella Typhi es administrado a los ratones para confirmar su eficacia (referencia de patente 1). Aparte de la Salmonella, hay un informe que un lipopolisacárido derivado de Bur holderia thailandensis o Burkholdería pseudomallei es administrada a los ratones para confirmar su eficacia (referencia de patente 2, referencia no de patente 2).

Sin embargo, la contaminación de un lipopolisacárido se evita con cuidado meticuloso en un medicamento utilizado para el cuerpo vivo ya que un lipopolisacárido clínicamente puede causar una variedad de enfermedades altamente letales como el shock séptico, coagulación intravascular diseminada (DIC) y falla múltiple de órganos (MOF) y puede convertirse en un factor causal de la fiebre incluso en una cantidad de rastro (referencia no de patente 3). En la práctica, se reporta que más del 90% de los ratones mueren dentro de las 72 horas cuando se administra con un lipopolisacárido (referencia de patente 3). Dadas las circunstancias, una idea de utilizar un lipopolisacárido propiamente como un antígeno de vacuna no surgiría generalmente.

Referencias de patentes Referencia 1 de patente: WO2004/052394 Referencia 2 de patente: WO2010/082020 Referencia 3 de patente: Publicación de Patente Japonesa No. 2001-26602.

Referencias no de patentes Referencia no de patente 1 : Infect. Immun, 60, pp4679-4686, 1992 Referencia no de patente 2: Vaccine, 28, pp7551-7555, 2010 Referencia no de patente 3: Bull. Nati. Inst. Health Sci., 126, pp19-33, 2008 Referencia no de patente 4: AVIAN DISEASES, 53, pp281-286, 2009 BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Problema que se resolverá por medio de la invención La presente invención apunta a hacer posible producir una vacuna multivalente y una vacuna mixta para una vacuna contra las bacterias Gram-negativas como Salmonella y E. coli y al reducir la reacción de la inoculación.

Medios para resolver los problemas Los presentes inventores han estudiado con seriedad los problemas antes mencionados y como resultado han encontrado que la hinchazón en el sitio de la inyección es restringido inesperadamente cuando se administra una vacuna que comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-0 (por ejemplo, lipopolisacárido) derivado de bacterias Gram-negativas a las aves. Es decir, una estructura que contiene el antígeno-0 es liberado de las células contenidas en el cultivo de bacterias Gram-negativas (por ejemplo, Salmonella), por ejemplo, por sonicación o tratamiento de fenol y luego se recolecta con una columna a la que dicha estructura se adhiere. Una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo la estructura mencionada entonces se prepara mediante un paso de emulsionamiento, si es necesario. Los presentes inventores han encontrado que la composición de la vacuna así preparada puede conferir inmunización contra dichas bacterias Gram-negativas para las aves (por ejemplo, pollo) cuando se inmuniza con ésta sin efectos secundarios específicos para así completar la presente invención.

La presente invención incluye las siguientes invenciones. [1] Una composición de vacuna para aves que comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-O derivado de bacterias Gram-negativas, siempre que dicha estructura no contenga una célula entera. [2] La composición de la vacuna de acuerdo con [1 ] en donde la estructura que contiene el antígeno-0 es un lipopolisacárido. [3] La composición de la vacuna de acuerdo con [1] o [2] en donde las bacterias Gram-negativas son Enterobacteriaceae o Pasteurella. [4] La composición de la vacuna de acuerdo con [3] en donde Enterobacteriaceae es Salmonella o E. coli. [5] La composición de la vacuna de acuerdo con [4] en donde Salmonella es uno o más seleccionados del grupo formado por los grupos 04, 07 y 09. [6] La composición de la vacuna de acuerdo con [4] o [5] en donde la Salmonella es una o más seleccionada del grupo formado por Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Infantis. [7] La composición de la vacuna según [4] o [5] en donde la estructura que contiene el antígeno-O derivado de bacterias Gram-negativas es una mezcla de estructuras que contienen el antígeno-O derivado de Salmonella Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Infantis. [8] La composición de la vacuna según [4] en donde E. coli es E. coli teniendo un antígeno-0 de 078. [9] La composición de la vacuna según [3] en donde Pasteurella es Haemophilus. [10] La composición de la vacuna según [9] en donde Haemophilus es Haemophilus paragallinarum. [11] La composición de la vacuna según cualquiera de [1 ] a [10] en donde la estructura que contiene el antígeno-O es una estructura que contiene el antígeno-O contenido en por lo menos 5,400 UE/ml de cada Salmonella en la composición de la vacuna. [12] La composición de la vacuna según cualquiera de [1 ] a [1 1] en donde la composición de la vacuna además comprende un antígeno derivado de uno o más patógenos seleccionados del grupo formado por el virus de la enfermedad de Newcastle, virus de bronquitis infecciosa aviar, Mycoplasma gallisepticum, virus del síndrome de caída de huevo y Haemophilus paragallinarum. [13] Un procedimiento para preparar una composición de vacuna para aves que comprende como ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-O derivado de bacterias Gram-negativas, el procedimiento que comprende los pasos (1) a (4) como sigue: (1) un paso de cultivo de bacterias Gram-negativas (paso de cultivo); (2) un paso de liberación de la estructura mencionada arriba de las células contenidas en la solución después de dicho cultivo (paso de liberación); (3) un paso de la recolección de la estructura mencionada arriba de la solución después de dicha liberación (paso de recolección); y (4) un paso de preparación de la solución después de dicha recolección para obtener una composición de vacuna (paso de preparación). [14] El procedimiento según [13] en donde el paso de liberación de la estructura antes mencionada es un paso de sonicación o un paso de tratamiento con fenol. [15] El procedimiento según [13] o [14] en donde el procedimiento además comprende un paso de inactivar las células (paso de inactivación) y/o un paso de emulsionamiento de la estructura mencionada arriba (paso de emulsionamiento). [16] El procedimiento según [15] en donde se realiza el paso de inactivación tras el paso del cultivo y el paso de emulsionamiento se realiza después del paso de recolección. [17] El procedimiento según cualquiera de [13] a [16] en donde el procedimiento además comprende un paso de medir una cantidad de la estructura antes mencionada (paso de medición). [18] El procedimiento según [17] en donde el paso de medición se lleva a cabo después del paso de recolección. [19] El procedimiento según cualquiera de [13] a [18] en donde el procedimiento además comprende un paso de la eliminación del lípido A (paso de la eliminación del lípido A). [20] El procedimiento según [19] en donde el paso de la eliminación del lípido A es llevado a cabo después del paso de recolección.

Efectos de la invención Mediante el uso de una estructura que contiene el antígeno-0 (por ejemplo, lipopolisacárido) derivado de bacterias Gram-negativas como un ingrediente activo de una composición de la vacuna, se torna posible aliviar la hinchazón en el sitio de inyección en comparación con la vacuna convencional de células enteras. Además, mediante la preparación de una vacuna componente, se torna posible aumentar el número de otros antígenos que se mezclarán con la misma sin aumentar una cantidad de la inyección.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el número de células esparcidas cuando una prueba de desafío con Salmonella Typhimurium se lleva a cabo para la vacuna trivalente LPS en donde el asterisco * indica una diferencia significativa del grupo control (p<0.05).

La figura 2 muestra el número de células esparcidas cuando una prueba de desafío con Salmonella Enteritidis se lleva a cabo para la vacuna trivalente LPS en donde el asterisco * indica una diferencia significativa del grupo control (p<0.05).

La figura 3 muestra el número de células esparcidas cuando una prueba de desafío con Salmonella Infantis es llevada a cabo por la vacuna trivalente LPS en donde el asterisco * indica una diferencia significativa del grupo control (p<0.05).

La figura 4 muestra el número de células esparcidas cuando se realiza una prueba de desafío con Salmonella Enteritidis para la vacuna LPS mezclada 10-valente en donde el asterisco * indica una diferencia significativa del grupo control (p<0.05).

La figura 5 muestra el número de células esparcidas cuando se realiza una prueba de desafío con Salmonella Infantis para la vacuna LPS mezclada 10-valente en donde el asterisco * indica una diferencia significativa del grupo control (p<0.05).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. Composición de la vacuna La primera modalidad de la presente invención es una composición de la vacuna para aves que comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-0 derivado de bacterias Gram-negativas.

De acuerdo con la presente invención, en una composición de la vacuna que comprende como ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-0 (específicamente, lipopolisacáridos) de Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis o Salmonella Enteritidis, se reduce el esparcido de las células contra el desafío con las respectivas células. Se asume que es debido al mantenimiento de antigenicidad contra las respectivas estructuras derivadas de una pluralidad de bacterias Gram-negativas aunque si las respectivas estructuras se mezclan. Además, en la vacuna mezclada 10-valente que comprende la vacuna trivalente mezclada con antígenos diferentes a las estructuras antes mencionadas, la antigenicidad contra las células que proporcionan las estructuras antes mencionadas se mantiene. Se asume que es debido al mantenimiento de antigenicidad contra las estructuras antes mencionadas incluso si la vacuna mixta comprende antígenos que no sean las estructuras antes mencionadas.

Por lo tanto, la composición de la vacuna de la presente invención incluye: (A) una composición de vacuna que comprende como ingrediente activo la estructura antes mencionada derivada de una sola bacteria Gram-negativa (en adelante también denominada como "vacuna monovalente"); (B) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo la estructura antes mencionada derivada de una pluralidad de bacterias Gram-negativas (en adelante también denominada "vacuna polivalente"); y (C) una composición de la vacuna que comprende una vacuna monovalente o una vacuna polivalente junto con antígenos diferentes de la estructura antes mencionada (en adelante también denominada "vacuna mixta"). (1 ) Células bacterianas La composición de la vacuna de la presente invención comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-O. Por lo tanto, la composición de la vacuna de la presente invención puede aplicarse ampliamente a bacterias Gram-negativas, teniendo la estructura antes mencionada. Por ejemplo, las bacterias Gram-negativas como se utiliza en la presente invención pueden incluir un bacilo facultativamente anaerobio Gram-negativo, Anaplasmataceae, Arcobacter, Bartonellaceae, Brachyspira, Buchnera, Campylobacter, Chlamydiales, Chloroflexus, bacterias Gram-negativas aerobias, bacterias anaerobias Gram-negativas, bacterias fotosintéticas oxigénicas Gram-negativas, Helicobacter, Lawsonia bacteria, Methylosinus, Oceanospirillaceae, Ornithobacterium, Piscirickettsiaceae, Rhodobacter, Rhodomicrobium, Rhodovulum, Rickettsiaceae, Roseobacter, Spirillaceae, y Tenericutes, preferentemente el bacilo facultativamente anaerobio Gram-negativo.

El bacilo facultativamente anaerobio Gram-negativo puede incluir Enterobacteriaceae, Pasteurellaceae, Actinobacillus, Aeromonadaceae, Azoarcus, Capnocytophaga, Cardiobacteríaceae, Chromobacterium, Eikenella, Gardnerella, Moritella, Rahnella, Shewanella, Streptobacillus, Vibrionaceae, y Zymomonas, preferiblemente Enterobacteriaceae y Pasteurellaceae.

Enterobacteriaceae puede incluir Salmonella, Escherichia, Calymmatobacterium, Citrobacter, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Morganella, Pantoea, Pectobacterium, Photorhabdus, Plesiomonas, Proteus, Providencia, Serratia, Shigella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, y Yersinia, preferiblemente Salmonella y Escherichia.

La Salmonella se divide en grupos por los tipos de antígeno-O y se subdivide además por los tipos de antígeno-H, incluyendo los grupo 02 (A), grupo 04 (B), grupo 07 (C1 , C4), grupo 08 (C2, C3), grupo 09 (D1) y grupo O3/O10 (E1 , E2, E3) como se muestra en el cuadro 1 y cuadro 2 (la vieja designación se indica en paréntesis).

CUADRO 1 CUADRO 2 De acuerdo con la presente invención, en una vacuna trivalente que incluye como un ingrediente activo una estructura que contiene antígenos-0 derivados de Salmonella Typhimurium (Grupo 04), Salmonella Infantis (Grupo 07) y Salmonella Enteritidis (Grupo 09), se reduce el esparcido de las células contra el desafío con las respectivas células. Se asume que se debe al mantenimiento de la antigenicidad de las estructuras antes mencionadas preparadas por el procedimiento para la preparación de la presente invención independientemente de los tipos de antígeno-O. Por lo tanto, se asume que la composición de la vacuna de la presente invención puede ser aplicable a Salmonella como un todo pero no se limita a Salmonella perteneciente al grupo 04, grupo 07 y grupo 09.

En la referencia no de patente 4, en las aves inmunizadas con una vacuna formada por células de Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis y Salmonella Enteritidis, el esparcido de las células se reduce contra el desafío no sólo con las cepas de vacuna respectivas, sino también con Salmonella Heidelberg perteneciente al mismo grupo antígeno-0 (grupo 04) como Salmonella Typhimurium. Por lo tanto, se asume que la vacuna también puede ser eficaz para las células que tienen antígeno-O homólogo a aquella de las cepas de la vacuna pero que son de diferentes serotipos. Es decir, en caso de una vacuna contra la Salmonella, se asume que la vacuna también puede ser eficaz para células que tienen el antígeno-O homólogo a aquella de las cepas de la vacuna, en otras palabras, para las células de un mismo grupo de antígeno-O como aquellas de las cepas de la vacuna. Por lo tanto, la composición de la vacuna de la presente invención, cuando se aplica para Salmonella, también puede ser aplicable a las otras células de Salmonella pertenecientes al grupo 04, grupo 07 y grupo 09.

Por lo tanto, la composición de la vacuna de la presente invención incluye: (A) una vacuna monovalente que comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-O derivado de Salmonella] (B) una vacuna polivalente que comprende como una estructura de ingrediente activo que contiene el antígeno-O derivado de dos o más de Salmonella; (C) una vacuna monovalente que comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-O derivado de Salmonella perteneciente al grupo 04, grupo 07 o grupo 09; (D) una vacuna polivalente que comprende como una estructura de ingrediente activo que contiene el antígeno-O derivado de dos o más Salmonella seleccionada del grupo formado por grupo 04, grupo 07 y grupo 09; y (E) una vacuna mixta que comprende la anterior vacuna monovalente o la vacuna polivalente junto con antígenos diferentes de la estructura antes mencionada.

Salmonella ejemplar incluida en Salmonella, grupo 04, grupo 07 o grupo 09 pueden incluir las células que se muestran en el cuadro 1 y cuadro 2. Preferentemente, la Salmonella es aquella que pertenece al grupo 04, grupo 07 y grupo 09. También, preferiblemente, el grupo 04 es Salmonella Typhimurium, el grupo 07 es Salmonella Infantis y el grupo 09 es Salmonella Enteritidis.

E. coli se clasifica por una combinación de los tres antígenos, antígeno-O, K-antígeno y H-antígeno. Cerca de 160 tipos del antígeno-O, cerca de 100 tipos para antígeno-K y cerca de 56 tipos para el antígeno-H son conocidos. Tipos específicos de E. coli pueden desarrollar diarrea y gastroenteritis y pueden ser una causa de intoxicación alimentaria. Tal E. coli generalmente se clasifica en E. coli enterotoxigénico, E. coli enteroinvasivo, E. coli enterohemorrágico, E. coli enteropatogénico, E. coli enterotoagregativo y E. coli difusamente adinérente. Grupos que pertenecen a E. coli enterotoxigénico incluyen O18, O26, O44, O55, 086, 01 1 1 , 01 12, 01 14, 01 19, 0125, 0126, 0127, 0128a, y 0142. E. coli enteroxigénico incluye 04, 06, 07, 08, 09, 015, 018, O20, 025, 027, 063, 077, 078, O80, 085, 01 14, 01 15, 0126, 0128a, 0139, 0148, 0153, 0159, 0167, O168, y 0169. E. coli enteroinvasivo incluye O28c, 029, 0112a, O124, 0136, O143, 0144, 0152, 0164, y 0167. E. coli enterohemorrágico incluye 01018, 026, 091 , 01 11 , 01 13, 01 14, 01 15, 01 17, 01 19, 0121 , 0128, 0145, y O157. Tal E. coli es preferiblemente 078.

Pasteurellaceae incluye Haemophilus, Mannheimia y Pasteurella, preferiblemente Haemophilus.

Haemophilus incluye Haemophilus paragallinarum, Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus paraphrophilus, Haemophilus parasuis, y Haemophilus somnus, preferiblemente Haemophilus paragallinarum. (2) Estructura que contiene el antígeno-O La composición de la vacuna de la presente invención comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-O. Puesto que el antígeno-O es principalmente responsable de la antigenicidad, una estructura que contiene el antígeno-O puede ser cualquier estructura en cuanto a que contenga el antígeno-O siempre que sea una estructura que no contiene una célula entera. Por ejemplo, una estructura que contiene el antígeno-O incluye los lipopolisacáridos y una estructura que contiene los lipopolisacáridos de las cuales el lípido A es excluido (por ejemplo, una estructura compuesta por antígeno-0 o antígeno-O y un polisacárido de núcleo). En caso que no se utilice un paso de la eliminación de lípido A para lograr una producción eficiente, la composición de la vacuna de la presente invención preferentemente comprende como un ingrediente activo los lipopolisacáridos. Aunque no hay preocupación sobre los efectos secundarios para la composición de la vacuna de la presente invención, la composición de la vacuna de la presente invención preferentemente comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene lipopolisacáridos del cual el lípido A se excluye para mayor seguridad. (3) Vacuna monovalente La composición de la vacuna de la presente invención incluye una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo la estructura antes mencionada derivada de una sola clase de bacterias Gram-negativas (vacuna monovalente).

En el caso de una vacuna monovalente, las bacterias Gram-negativas convenientemente pueden ser seleccionadas de las células de las bacterias Gram-negativas como se describió anteriormente. Las bacterias Gram-negativas preferiblemente son Enterobacteriaceae o Pasteurella. Enterobacteriaceae preferiblemente es Salmonella o E. coli. Salmonella preferiblemente es Salmonella perteneciente a los grupos 04, 07 y 09. Salmonella perteneciente al grupo 04 preferiblemente es Salmonella Typhimurium, Salmonella perteneciente al grupo 07 preferiblemente es Salmonella Infantis, y Salmonella perteneciente al grupo 09 preferiblemente es Salmonella Enteritidis. E. coli preferiblemente es E. coli con antígeno-O de 078. Pasteurella preferiblemente es Haemophilus, en particular, Haemophilus paragallinarum.

Por lo tanto, una vacuna monovalente de la presente invención incluye: (A) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de una sola especie de bacterias Gram-negativas; (B) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de una sola especie de Enterobacteriaceae; (C) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de una sola especie de Pasteurella; (D) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de una sola especie de Salmonella; (E) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de una sola especie de E. coli; (F) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de una sola especie de Salmonella perteneciente al grupo O4; (G) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de una sola especie de Salmonella perteneciente al grupo 07; (H) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de una sola especie de Salmonella perteneciente al grupo 09; (I) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de Salmonella Typhimurium; (J) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de Salmonella Infantis; (K) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de Salmonella Enteritidis; (L) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de una sola especie de E. coli teniendo el antígeno-O de O78; (M) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo el antígeno-O derivado de una sola especie de Haemophilus; y (N) una composición de vacuna que comprende como una ingrediente activo el antígeno-O derivado de Haemophilus paragallinarum. (4) Vacuna polivalente La composición de la vacuna de la presente invención incluye una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo la estructura antes mencionada derivada de las clases plurales de bacterias Gram-negativas (vacuna polivalente).

En caso de una vacuna polivalente, el tipo de bacterias Gram-negativas de las cuales se deriva una estructura que contiene el antígeno-O es preferentemente 2 o más, 3 o más, 4 o más, o 5 o más. Es preferiblemente 2 (vacuna bivalente), 3 (vacuna trivalente), 4 (vacuna 4-valente) o 5 (vacuna 5-valente).

Una vacuna trivalente de Salmonella preferiblemente comprende las estructuras antes mencionadas derivadas de Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis y Salmonella Enteritidis.

Bacterias Gram-negativas pueden seleccionarse adecuadamente de las células de las bacterias Gram-negativas como se describió anteriormente. Las bacterias Gram-negativas preferiblemente son Enterobacteriaceae o Pasteurella. Enterobacteriaceae preferiblemente es Salmonella o E. coli. Salmonella preferiblemente es Salmonella perteneciente a los grupos 04, 07 y 09. Salmonella perteneciente al grupo 04 preferiblemente es Salmonella Typhimurium, Salmonella perteneciente al grupo O7 preferiblemente es Salmonella Infantis, y Salmonella perteneciente al grupo 09 preferiblemente es Salmonella Enteritidis. E. coli preferiblemente es E. coli con antígeno-O de 078. Pasteurella preferiblemente es Haemophilus, en particular, Haemophilus paragallinarum.

Por lo tanto, una vacuna polivalente de la presente invención incluye: (A) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-0 derivados de dos o más tipos de bacterias Gram-negativas; (B) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-0 derivados de dos o más clases de Enterobacteriaceae; (C) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de dos o más clases de Pasteurella; (D) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de dos o más tipos de Salmonella; (E) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo de antígenos-O derivados de dos o más clases de E. coli; (F) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de Salmonella perteneciente al grupo 04 y Salmonella perteneciente al grupo 07; (G) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de Salmonella perteneciente al grupo O4 y Salmonella perteneciente al grupo 09; (H) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de Salmonella perteneciente al grupo 07 y Salmonella perteneciente al grupo 09; (I) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de Salmonella perteneciente al grupo 04, Salmonella perteneciente al grupo 07 y Salmonella perteneciente al grupo 09; (J) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de Salmonella Typhimurium y Salmonella Infantis; (K) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de Salmonella Typhimurium y Salmonella Enteritidis; (L) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de Salmonella Infantis y Salmonella Enteritidis] (M) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis y Salmonella Enteritidis; (N) una composición de vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de dos o más clases de E. coli teniendo el antígeno-O de 078; y (O) una composición de la vacuna que comprende como un ingrediente activo los antígenos-O derivados de dos o más clases de Haemophilus. (5) Vacuna mixta La composición de la vacuna de la presente invención incluye una composición de la vacuna que comprende una vacuna monovalente o una vacuna polivalente junto con antígenos diferentes de la estructura antes mencionada (vacuna mixta).

Estos antígenos incluyen un patógeno atenuado, un patógeno inactivado, una proteína, un péptido, un ácido nucleico y una partícula tipo virus. La vacuna monovalente o la vacuna polivalente de la presente invención puede ser utilizada como una vacuna mixta en combinación con al menos una vacuna seleccionada del grupo formado por vacunas contra otros virus (por ejemplo, virus de bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de la bursa infecciosa, virus de la encefalomielitis aviar, virus del síndrome de caída de huevo, virus de la enfermedad de Newcastle, reovirus aviar, virus de la gripe aviar, virus de la enfermedad de Marek, virus laringotraqueitis infecciosa, neumovirus aviar y virus de la viruela aviar), bacterias (por ejemplo, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium septicum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni y Campylobacter fetus) y protozoos (por ejemplo, Leucocytozoon caulleryi, Eimeria tenella, Eimeria máxima y Eimeria necatrix). (6) Concentración y relación de ingrediente activo La composición de la vacuna de la presente invención comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-O. Una concentración de la estructura antes mencionada se determina mediante una unidad de endotoxina (=EU) como un índice. EU se mide en virtud del paso 2-(6) de medición como se describe a continuación. Una concentración de la estructura antes mencionada contenida en una composición de la vacuna, en caso de una vacuna polivalente, puede variar dependiendo del tipo de la estructura antes mencionada o puede ser la misma. Una concentración de la estructura antes mencionada es preferentemente al menos 5,400 UE/ml y más preferiblemente 54,000 UE/ml, para la respectiva estructura.

En el caso de una vacuna polivalente, una relación de la estructura antes mencionada (relación de EU) puede ser de una relación igual o diferente. En el caso de una vacuna trivalente que incluye como un ingrediente activo la estructura antes mencionada derivada de Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis o Salmonella Enteritidis, una relación de la estructura antes mencionada es preferentemente Salmonella Typhimurium: Salmonella Infantis : Salmonella Enteritidis (1 :1 :1). (7) Sujeto para la administración De acuerdo con la presente invención, el esparcido de las células en los excrementos cecales en pollos inmunizados con una vacuna trivalente se redujo como en el ejemplo 1. Por lo tanto, la composición de la vacuna de la presente invención puede usarse para las aves. Las aves incluyen las criadas para fines comerciales y no comerciales. Ejemplos de aves incluyen Galliformes (por ejemplo pollos, codornices y pavos), Anseriformes (por ejemplo, patos y gansos), Charadriiformes (por ejemplo, gaviotas, codorniz botón barrado y chorlito), Columbiformes (por ejemplo, paloma), Struthioniformes (por ejemplo, avestruz), Passeriformes (por ejemplo, cuervo, pinzón, gorrión, estornino y golondrina), Psitaciformes (por ejemplo, loro), Falconiformes (por ejemplo, águila y halcón), Strigiformes (por ejemplo, búho), Sphenisciformes (por ejemplo, pingüino) y Psittaciformes (por ejemplo, perico y loro), preferiblemente el pollo. (8) Ruta de administración La composición de la vacuna de la presente invención tiene hinchazón en el sitio de administración restringida a un nivel aceptable como una vacuna. Por lo tanto, una variedad de vías de administración puede ser concebida para la composición de la vacuna de la presente invención, como por ejemplo la pierna, el pecho, el cuello uterino, la administración oral, rectal, percutánea, entérica, inyección intramuscular, subcutánea, intramedular, inyección intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, intranasal e intraocular. La pierna es una vía de administración conveniente de una composición de la vacuna. Así, una mejor vía de administración es la pierna. (9) Portador La composición de la vacuna de la presente invención puede abarcar un portador farmacéuticamente aceptable. Para un portador farmacéuticamente aceptable, cualquier portador utilizado para la producción de una vacuna puede usarse sin limitaciones. En concreto, un portador incluye solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa, agua, glicerol, regulador de pH acuoso isotónico y una combinación de éstos. Además de esto, la composición de la vacuna de la presente invención además puede abarcar un agente emulsionante, un agente conservante (por ejemplo, timerosal), un agente isotónico, un ajustador de pH, un agente inactivador (por ejemplo, formalina) y un adyuvante. Un adyuvante es preferiblemente un coadyuvante de aceite. (10) Proteína portadora Una estructura que contiene el antígeno-0 opcionalmente puede unirse a una proteína portadora con el propósito de mejorar una reacción de inmunización cuando se administra. Dicha proteína portadora incluye toxoide diftérico (DT), toxoide tetánico (TT), toxina de cólera (CT) y CRM197. La unión a una proteína portadora puede hacerse mediante un enlazador (por ejemplo, SPDP o ADH) o la estructura puede unirse directamente a una proteína portadora. Como un ejemplo, la unión a una proteína portadora (DT/TT/TC) vía SPDP o ADH que usa bromuro de cianógeno se describe (referencia no de patente 1 ). 2. Procedimiento para la preparación de la composición de vacuna La segunda modalidad de la presente invención es un procedimiento para preparar una composición de vacuna para aves que comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-0 derivada de bacterias Gram-negativas.

El procedimiento de la presente invención comprende un paso de cultivo de bacterias Gram-negativas (paso de cultivo); un paso de liberación de la estructura mencionada anteriormente de las células contenidas en la solución después de dicho cultivo (paso de liberación); un paso de recolección de la estructura mencionada anteriormente de la solución después de dicha liberación (paso de recolección), y un paso para la preparación de la solución después de dicha recolección para obtener una composición de vacuna (paso de preparación). Además de los pasos anteriores, el procedimiento puede comprender además un paso de inactivar las células (paso de inactivación) y/o un paso de emulsionar la estructura mencionada anteriormente (paso de emulsionamiento). Preferiblemente, el paso de inactivación se lleva a cabo después del paso de cultivo y el paso de emulsionamiento se realiza después del paso de recolección. Además, el procedimiento preferiblemente comprende un paso de medir una cantidad de la estructura mencionada anteriormente (paso de medición) después del paso de recolección. En caso que la estructura mencionada anteriormente sea una que no contiene lípido A, el procedimiento preferiblemente comprende un paso de eliminación de lípido A (paso de eliminación de lípido A). El paso de eliminación de lípido A preferentemente se realiza después del paso de recolección.

Cada uno de los pasos respectivos se explica a continuación. Conforme la ocasión lo exija, los pasos respectivos no necesariamente se llevan a cabo en el orden indicado a continuación, algunos pasos pueden ser omitidos, o algunos pasos pueden llevarse a cabo en varias ocasiones. Por ejemplo, el paso de emulsionamiento necesita no llevarse a cabo cuando no se utiliza adyuvante de aceite. El paso de inactivación y el paso de liberación pueden llevar a cabo simultáneamente (por ejemplo, sonicación y tratamiento de formalina se realizan en dos pasos). (1) Paso de cultivo El paso de cultivo puede ser modificado adecuadamente para el tipo de medio de cultivo y condición del crecimiento (tiempo, temperatura, concentración de oxígeno, concentración de dióxido de carbono, pH y concentración de sal) dependiendo del tipo de bacterias Gram-negativas. En el caso de Salmonella, las células se cultivan en el cultivo TPB de 35° a 43°C (preferiblemente a 37°C) durante 8 a 24 horas (preferiblemente 16 horas). En el caso de E. coli, las células se cultivan en el cultivo LB de 30°C a 43°C (preferiblemente a 37°C) durante 8 a 24 horas (preferiblemente 16 horas). (2) Paso de inactivación El paso de inactivación adecuadamente puede modificarse dependiendo del tipo de bacterias Gram-negativas. Por ejemplo, se puede realizar con tratamiento físico (por ejemplo la radiación de rayos X, tratamiento térmico, o sonicación) o tratamiento químico (por ejemplo tratamiento de formalina, tratamiento de mercurio, tratamiento de alcohol, o tratamiento de hidrógeno). Cualquiera de estos tratamientos puede hacerse solo o en combinación de los mismos. El tratamiento de formalina es preferible. (3) Paso de liberación El paso de liberación puede ser cualquier procedimiento siempre que la antigenicidad de la estructura mencionada anteriormente sea retenida. Los procedimientos y las condiciones pueden seleccionarse adecuadamente dependiendo de las bacterias Gram-negativas o la propiedad de la estructura mencionada anteriormente. Por ejemplo, se incluye la sonicación, tratamiento de fenol, tratamiento mecánico, congelación y descongelación, compresión y descompresión, presión osmótica, descomposición de la pared celular (por ejemplo tratamiento de la lisozima descrito en la referencia de no patente 1 y referencia de no patente 2), y tratamiento de agente tensoactivo, ya sea solo o en combinación de los mismos, preferiblemente la descomposición de la pared celular, sonicación o tratamiento de fenol.

La sonicación puede realizarse bajo cualquier condición siempre que la antigenicidad de la estructura mencionada anteriormente sea retenida.

Por ejemplo, puede hacerse a 25°C o menos, preferentemente en agua con hielo, durante 5 a 30 minutos, preferiblemente durante 15 minutos. La solución después de la sonicación puede estar sujeta a centrifugación mediante la eliminación de impurezas.

El tratamiento de fenol puede realizarse bajo cualquier condición siempre que la antigenicidad de la estructura mencionada anteriormente sea retenida. Por ejemplo, se puede hacer con 45 a 100%, preferiblemente 100%, de fenol de 4 a 80°C, preferentemente a 68°C durante 5 a 30 minutos, preferiblemente durante 15 minutos. Durante el procedimiento, un contenedor puede agitarse en intervalos de tiempo regulares. La solución después de la reacción puede someterse a centrifugación para eliminar las impurezas. La solución después del tratamiento de fenol puede someterse a diálisis con un regulador de pH adecuado (por ejemplo, PBS).

El tratamiento nucleolítico (por ejemplo, tratamiento de DNasa o tratamiento RNasa) o tratamiento proteolítico (tratamiento de proteasa) puede realizarse después del paso de liberación, como se describe en la referencia no de patente 1 y referencia no de patente 2. Los ácidos nucleicos pueden eliminarse por el fraccionamiento de etanol. La eliminación de proteínas y la eliminación de la cadena lateral de ácido graso del lípido A pueden realizarse por tratamiento de ácido acético. (4) Paso de recolección El paso de recolección puede modificarse adecuadamente dependiendo de la propiedad de la estructura mencionada anteriormente. Por ejemplo, el lipopolisacárido se carga negativamente en su totalidad conforme comprende muchos grupos fosfato y así se adsorbe fácilmente a una sustancia cargada positivamente. Por lo tanto, la estructura mencionada anteriormente puede ser recolectada por adsorción utilizando dichas propiedades tales como cromatografía de afinidad y adsorción con una membrana cargada positivamente. Por ejemplo, polimixina B, histidina, histamina, lisina, perlas de poli(ácido ?-metil-L-glutámico) amidadas, y una membrana cargada positivamente con grupos de amonio introducidos pueden ser concebidos para una sustancia cargada positivamente.

Alternativamente, la estructura mencionada anteriormente se puede recolectar mediante la utilización de hidrofobicidad del lípido A. Una sustancia hidrófoba incluye polipropileno, polietileno, poliestireno, y la membrana de PTEE. Para la recolección de la estructura mencionada anteriormente, también se concibe que una unión de la sustancia al lipopolisacárido es utilizada que incluye un anticuerpo anti-LPS, un factor anti-LPS de Limulus polyphemus, la proteína BPI (que incrementa la permeabilidad bactericida), CAP18 (proteína antíbacteriana catiónica de 18 kDa) y LBP (proteína de unión a LPS). La cromatografía con un portador al cual dicha sustancia está unida puede utilizarse.

La recolección de la estructura mencionada anteriormente puede ser lograrse mediante el uso de productos comercialmente disponibles. Por ejemplo, ET-clean (marca registrada; Chisso Corporation) puede utilizarse. La recolección también puede hacerse por ultracentrifugación, como se describe en la referencia no de patente 1. (5) Paso de eliminación de lípido A Una estructura que contiene el antígeno-O puede ser una que contiene lípido A (por ejemplo, lipopolisacárido) o una que no contiene el lípido A (por ejemplo, antígeno-O, antígeno-O más el polisacárido de núcleo). En caso de una estructura que no contiene lípido A, preferiblemente se incorpora el paso de eliminación de lípido A.

El paso de eliminación de lípido A incluye, como un ejemplo, el tratamiento térmico con la adición de un ácido. Un procedimiento ejemplar incluye el tratamiento con ácido acético al 1 % a 100°C durante 90 minutos (referencia no de patente 1 ). Este procedimiento se combina con un procedimiento de aislamiento de lípido A conforme sea eliminado. Un procedimiento ejemplar para aislar el lípido A incluye ultracentrifugación (referencia de no patente 1 ). (6) Paso de medición Puede llevarse a cabo un procedimiento ejemplar para la medición de lipopolisacárido como se describe a continuación. Una solución de las estructuras mencionadas anteriormente diluida con agua destilada y el estándar de referencia del conjunto CSE-L (E. coli 01 13: endotoxina derivada de H10) se agrega a una microplaca. El reactivo LAL del equipo Endospecy ES-50M (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION) se añade. La placa está cubierta por la reacción a 37°C durante 30 minutos. Una mezcla de nitrito de sodio/ácido clorhídrico, una solución de sulfamato de amonio, y una mezcla de diclorhidrato de N-(1-naftil)etilendiamina/N-metil-2-pirrolidona en el equipo DIA sistema Toxicolor (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION) se agregan y la microplaca se agita bien. La absorbancia se mide en dos longitudes de onda 545nm y 630nm (Molecular Devices Japan, VersaMax) para determinar la endotoxina. (7) Paso de emulsionamiento El paso de emulsionamiento es un procedimiento de mezclado junto con una solución que contiene la estructura mencionada anteriormente, aceite y un agente emulsionante. Un agente emulsionante incluye Tween 80 (marca registrada), Tween 60 (marca registrada), Brij 721 (marca registrada), Eumulgin B2 (marca registrada), Arlacel 165 FL (marca registrada), Tefosa 1500 (marca registrada), Glucamato SSE20 (marca registrada), Surfhope C-1216 (marca registrada) Surfhope C-181 1 (marca registrada), Surhope SE Pharma D-1816 (marca registrada), Surfhope SE Pharma D-1616 (marca registrada), Span 60 (marca registrada), Olepal isostearique (marca registrada) Glucate SS (marca registrada) y Surfhope C-1205 (marca registrada), preferiblemente monooleato de sorbitán. El aceite incluye aceite vegetal, aceite mineral, aceite animal, aceite sintético y aceite de silicona, preferiblemente parafina líquida ligera. (8) Paso de preparación El paso de preparación es, en el caso de una vacuna polivalente, un procedimiento de mezclado de composiciones que comprende las estructuras mencionadas anteriormente respectivas derivadas de las células microbianas específicas como las obtenidas en los pasos anteriores. Por ejemplo, en caso de una vacuna trivalente que comprende un ingrediente activo, las estructuras mencionadas anteriormente derivadas de Salmonella Typhimurium, Salmonella Infantis y Salmonella Enteritidis, una composición que comprende la estructura mencionada anteriormente derivada de Salmonella Typhimurium, una composición que comprende la estructura mencionada anteriormente derivada de Salmonella Infantis y una composición que comprende la estructura mencionada anteriormente derivada de Salmonella Enteritidis se mezclan juntas.

La vacuna obtenida puede ser usada solo como una vacuna de salmonella para pájaros o usada como una vacuna mezclada en combinación con al menos una vacuna seleccionada del grupo que consiste de vacunas contra otros virus (por ejemplo, virus de bronquitis infecciosa, virus de la enfermedad de la bursa infecciosa, virus de encefalomielitis aviar, virus del síndrome de caída de la postura, virus de la enfermedad de Newcastle, reovirus aviar, virus de influenza aviar, virus de enfermedad de Marek, virus de laringotraqueitis infecciosa, pneumovirus aviar y virus de la viruela aviar), bacterias (por ejemplo Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Clostridium septicum, Clostridium períringens, Campylobacter jejuni, y Campylobacter fetus) y protozoos (por ejemplo, Leucocytozoon caulleryi, Eimeria tenella, Eimeria máxima y Eimeria necatrix).

En el caso de una vacuna polivalente y una vacuna mezclada, una relación de las composiciones respectivas que comprenden la estructura mencionada anteriormente (relación de EU) puede ser igual o una relación de una composición específica puede incrementarse o disminuirse.

La presente invención se explica más detalladamente por medio de los siguientes ejemplos pero no está limitada a estos.

EJEMPLO 1 (1) Preparación de antígeno 1 ) Paso de cultivo En cada 50 mi de medio LB (que comprende cloruro de sodio 10g, Triptona Bact 10g, Extracto de levadura Bact 5g en 1 ,000 mi de medio de cultivo), Salmonella Enteritidis (en lo sucesivo referido como "SE"), Salmonella Infantis (en lo sucesivo referido como "SI") y Salmonella Typhimurium (en lo sucesivo, referido como "ST") se cultivan (37°C, 16 a 24 horas, 4 X 108 a 4 X 109 CFU/ml). 2) Paso de inactivación La formalina se añade al respectivo cultivo en 0.4% de formalina para el tratamiento a 37°C durante 16 horas para desactivar las células. 3) Paso de liberación Las células desactivadas se someten a trituración ultrasónica o se trataron con fenol para liberar lipopolisacárido.

La trituración ultrasónica (Branson, Sonifier 350) de las células se lleva a cabo en agua con hielo durante 15 minutos. Entonces, la centrifugación (TOMY SEIKO Co, Ltd., 10,000 X g, 15 minutos) se realiza y el sobrenadante se utiliza en el paso de la recolección.

El tratamiento de fenol de las células se realiza al mezclar 20 mi de la solución de célula después de la desactivación con formalina con un volumen equivalente de una solución de fenol saturada y al calentar la mezcla a 68°C durante 15 minutos mientras se agita cada 3 minutos. Entonces, después de que la mezcla se deja reposar a 4°C durante 1 día, se realizó la centrifugación (TOMY SEIKO Co, Ltd., 10,000 X g, 15 minutos). Para eliminar impurezas adicionales, se centrifuga el sobrenadante (TOMY SEIKO Co., Ltd., 10,000 X g, 5 minutos). Posteriormente, el sobrenadante se dializa con PBS durante 3 días y se utiliza en el paso de recolección. 4) Paso de recolección Cada 30 mi del sobrenadante se agrega a la columna L ET-clean (Chisso Corporation, catálogo No. 20015). Después de lavar la columna con un regulador de pH de fosfato que contiene NaCI 0.15 M (NaCI 8.76 g en 1 ,000 mi de solución), el lipopolisacárido se eluye con un regulador de pH de fosfato que contiene NaCI 2M (NaCI 1 17.54 g en 1 ,000 mi de solución). (2) Determinación de endotoxina Una solución de los antígenos respectivos diluida con agua destilada y del estándar de referencia del conjunto CSE-L (E. coli 01 13: endotoxina derivada de H10) se agrega a una microplaca. El reactivo LAL del equipo Endospecy ES-50M (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION) se agrega. La placa se cubre por la reacción a 37°C durante 30 minutos. Una mezcla de nitrito de sodio/ácido clorhídrico, una solución de sulfamato de amonio, y una mezcla de diclorhidrato de N-(1 -naftil)etilendiamina/N-metil-2-pirrolidona en equipo DIA sistema Toxicolor (SEIKAGAKU BIOBUSINESS CORPORATION) se agregan y la microplaca también se agita. Se mide la absorbancia en dos longitudes de onda 545 nm y 630 nm (Molecular Devices Japan, VersaMax) para determinar la unidad de endotoxina. (3) Paso de emulsionamiento y paso de preparación Cada 3.6 mi de la solución de antígeno se mezcla y emulsiona con 14.4 mi del adyuvante de aceite (una mezcla de parafina líquida ligera, monooleato de sorbitán y polisorbato 80). Una cantidad equivalente de las vacunas respectivas se mezcla para preparar una vacuna de salmonella que comprende tres tipos de lipopolisacáridos (vacuna de LPS trivalente). Para dicha vacuna, una vacuna que comprende cada 54,000 EU/ml, una vacuna que comprende cada 5,400 EU/ml, y una vacuna que comprende cada 540 EU/ml, de lipopolisacáridos derivados de SE, ST o SI se prepara. (4) Prueba de inmunización Cada 0.5 mi de las vacunas respectivas se administra a pollos SPF de 5 semanas de edad en el músculo del muslo inferior. Como un control, una vacuna de células completas mezcladas trivalentes que comprende las células completas desactivadas de SE, ST y SI se usan. La vacuna trivalente de células completas mezcladas se prepara por el cultivo de las respectivas células, desactivación de las células, dilución de las células con PBS a 54,000 EU/ml de lipopolisacárido, y mezclado y emulsionamiento de las células desactivadas con adyuvante de aceite. También se proporcionó un grupo sin administración de la vacuna. El sitio de administración se observa hasta 10 semanas después de la administración y se evaluó la seguridad. Cuatro semanas después de la inmunización, el pollo se desafía por la ruta oral con Salmonella SE (9.1 X 109 CFU/pollo), SI (2.3 X 109 CFU/pollo), o ST (1.2 X 109 CFU/pollo) para investigar la efectividad. Para evaluar la efectividad, las heces se recolectaron en 1 , 4, 7, 10 y 14 días después del desafío y el número de células desprendidas en la caída cecal se mide por el método descrito a continuación. (5) Medición del número de células Las heces recolectadas se diluyen con medio HTT en 20% de emulsión y 50 µ? de la emulsión se aplica a la placa de agar DHL para el cultivo (37°C, 16 a 24 horas). Al día siguiente, se cuenta el número de las colonias surgidas para medir el número de células en las heces del intestino ciego (CFU/g). Para aquellas muestras que no dieron ninguna colonia después de este cultivo directo, el enriquecimiento de cultivo se realizó por 1 día y se determinó el número de células por la presencia de la colonia (aquellas muestras que proporcionan la colonia después de este cultivo tiene el número de células de 50 CFU/g). Para aquellas muestras que no proporcionan ninguna colonia después del enriquecimiento de cultivo por 1 día, el cultivo secundario retrasado se realiza y se determina el número de células por la presencia de la colonia (aquellas muestras que proporcionan la colonia después de que este cultivo tiene el número de células de 10 CFU/g y aquellas muestras que no proporcionan ninguna colonia incluso después de que este cultivo tiene el número de células de 0 CFU/g). (6) Método de evaluación para el edema en las piernas El sitio de administración se observa durante 10 semanas y se evalúa la seguridad con puntuación de hinchazón de piernas. Para la puntuación de hinchazón, la puntuación 1 es hinchazón ligera (hinchazón en una porción del muslo inferior) en el sitio de administración, la puntuación 2 es hinchazón moderada (hinchazón en su totalidad del muslo inferior) y la puntuación 3 es hinchazón severa (además de la hinchazón en su totalidad del muslo inferior, se detecta hidropesía por palpación). La puntuación se decide por la observación visual y palpación. (7) Resultados Los resultados de la observación de hinchazón en las piernas se muestran en el cuadro A. Los resultados obtenidos después de desafío con ST se muestran en la figura 1. Los resultados obtenidos después del desafío con SE se muestran en la figura 2. Los resultados obtenidos después del desafío con SI se muestran en la figura 3. Como se muestra en el cuadro A, el alivio en la hinchazón en las piernas se prueba para la vacuna trivalente LPS en comparación con la vacuna de células completas mixtas trivalente. La hinchazón en las piernas se alivia además por la vacuna trivalente LPS en la cual las impurezas tal como proteínas se eliminan además por el paso de la extracción de fenol. Con respecto a la efectividad, el desprendimiento de las células se reduce significativamente en todas las pruebas de desafío con ST, SE y SI para el grupo de administración de la vacuna trivalente LPS como se muestra en la figura 2, figura 3 y figura 4 para afirmar la efectividad de la vacuna trivalente LPS. El desprendimiento de las células también se reduce en el grupo de administración de la vacuna trivalente LPS con la extracción del fenol para probar que una estructura que contiene el antígeno-0 (específicamente, lipopolisacárido) es útil como un antígeno para una vacuna contra la salmonella.

CUADRO A Puntuación de hinchazón en el sitio de la invección de una vacuna mixta de lipopolisacáridos derivados de Salmonella Enteritidis, Salmonella Infantis and Salmonella Typhimurium (vacuna trivalente LPS) o una vacuna que comprende otros antígenos además de la vacuna trivalente LPS (vacuna LPS mezclada 10-valente).

EJEMPLO 2 (1) Preparación de antígeno La vacuna preparada en el ejemplo 1 que comprende cada 54,000 EU/ml de lipopolisacáridos derivados de SE, ST o SI se mezcla con OILVAX 7 (marca registrada; The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute; que comprende la cepa de virus de bronquitis infecciosa de Nerima, cepa TM, Mycoplasma gallisepticum, virus del síndrome de caída de la postura, y coriza infecciosa A y C (antígeno recombinante)). La mezcla resultante es la vacuna LPS mezclada 10-valente que comprende cada 7,200 EU/ml de lipopolisacáridos derivados de SE, ST, o SI, 108 4 EID50/ml o más de virus de la enfermedad de Newcastle, 106 EID50/ml o más de cepa de virus de bronquitis infecciosa de Nerima, 106 4 EID507ml o más de cepa TM, 107 4 EID50/ml o más de Mycoplasma gallisepticum, 106 7 EID50/ml o más del virus del síndrome de caída de la postura, y 2.4 pg/ml o más de coriza infecciosa A y C (antígeno recombinante). (2) Prueba de inmunización Cada 0.5 mi de la vacuna LPS mezclada 10-valente preparada anteriormente se administra a una gallina SPF de 5 semanas de edad en el músculo del muslo inferior. Como un control, el grupo de administración de OILVAX 7 o la vacuna trivalente LPS (cada 5,400 EU/ml de lipopolisacárido de SE, ST y SI) y un grupo sin administración de la vacuna se proporcionan. La hinchazón en las piernas se observa hasta 10 semanas después de la administración para evaluar la seguridad. Cuatro semanas después de la inmunización, el pollo se desafía por la ruta oral con Salmonella SE (9,1 X 109 CFU/pollo), o SI (2.3 X 109 CFU/pollo) para investigar la efectividad. Para evaluar la efectividad, las heces se recolectaron en 1 , 4, 7, 10 y 14 días después del desafío y el número de las células de desprendimiento en la caída cecal se mide por el método de medición del número de células descrito en el ejemplo 1. Una extensión de la hinchazón se evalúa como se describe en el ejemplo 1. (3) Resultados Los resultados de la observación de hinchazón en las piernas se muestran en el cuadro A. Los resultados obtenidos después del desafío con SE se muestran en la figura 4. Los resultados obtenidos después del desafío con SI se muestran en la figura 5. Como se muestra en el cuadro A, el alivio en la hinchazón en las piernas se prueba para la vacuna LPS mezclada 10-valente cuando el lipopolisacárido se purifica adicionalmente mediante la adición del paso de extracción del fenol. Como un resultado de la observación del sitio de inyección hasta 10 semanas después de la inmunización, no hay hinchazón problemática en el campo que causa distasia (puntuación 3) se observa para la vacuna LPS mezclada 10-valente que comprende el lipopolisacárido no tratado con fenol para afirmar la seguridad de la vacuna LPS mezclada 10-valente. Con respecto a la efectividad, la reducción en el desprendimiento de células equivalentes a la vacuna trivalente LPS se observa en las pruebas de desafío con SE o SI para afirmar la efectividad de la vacuna LPS mezclada 10-valente.

Aplicabilidad industrial Una vacuna que comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-O (por ejemplo, lipopolisacárido) derivada de bacterias Gram-negativas se permite para la reducción en efectos secundarios en el sitio de inyección. Además, al mezclar las estructuras antes mencionadas derivadas de una pluralidad de bacterias Gram-negativas, se torna posible fabricar una vacuna polivalente y una vacuna mixta sin aumentar una cantidad de la inyección.

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición de la vacuna contra la salmonella para aves que comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-0 derivado de Salmonella, siempre que dicha estructura no contenga una célula entera.

2 - La composición de la vacuna contra la salmonella de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la estructura que contiene el antígeno-0 es un lipopolisacárido.

3.- La composición de la vacuna contra la salmonella de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque Salmonella es una o más seleccionados del grupo formado por los grupos 04, 07 y 09.

4 - La composición de la vacuna contra la salmonella de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizada además porque la Salmonella es una o más seleccionada del grupo formado por Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Infantis.

5.- La composición de la vacuna contra la salmonella de conformidad con la reivindicación 1 o 3, caracterizada además porque la estructura que contiene el antígeno-0 derivado de Salmonella es una mezcla de estructuras que contiene el antígeno-0 derivado de Salmonella Enteritidis, Salmonella Typhimurium y Salmonella Infantis.

6. - La composición de la vacuna contra la salmonella de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, o 3 a 5, caracterizada además porque la estructura que contiene el antígeno-0 es una estructura que contiene el antígeno-O conteniendo por lo menos 5,400 UE/ml de cada Salmonella en la composición de la vacuna contra la salmonella.

7. - La composición de la vacuna contra la salmonella de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 3 a 5, o 6, caracterizada además porque la composición de la vacuna además comprende un antígeno derivado de uno o más patógenos seleccionados del grupo formado por el virus de la enfermedad de Newcastle, virus de bronquitis infecciosa aviar, Mycoplasma gallisepticum, virus del síndrome de caída de huevo y Haemophilus paragallinarum.

8. - Un procedimiento para preparar una composición de vacuna contra la salmonella para aves que comprende como un ingrediente activo una estructura que contiene el antígeno-O derivado de Salmonella, el procedimiento que comprende los pasos (1) a (4) como sigue: (1) un paso de cultivo de Salmonella (paso de cultivo); (2) un paso de liberación de la estructura mencionada arriba de las células contenidas en la solución después de dicho cultivo (paso de liberación); (3) un paso de la recolección de la estructura mencionada arriba de la solución después de dicha liberación (paso de recolección); y (4) un paso de preparación de la solución después de dicha recolección para obtener una composición de vacuna contra la salmonella (paso de preparación).

9. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el paso de liberación de la estructura antes mencionada es un paso de sonicación o un paso de tratamiento con fenol.

10. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizado además porque el procedimiento además comprende un paso de inactivar las células (paso de inactivación) y/o un paso de emulsionamiento de la estructura mencionada arriba (paso de emulsionamiento).

11. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque se realiza el paso de inactivación tras el paso del cultivo y el paso de emulsionamiento se realiza después del paso de recolección.

12. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 1 1 , caracterizado además porque el procedimiento además comprende un paso de medir una cantidad de la estructura antes mencionada (paso de medición).

13. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el paso de medición se lleva a cabo después del paso de recolección.

14. - El procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizado además porque el procedimiento además comprende un paso de la eliminación del lípido A (paso de la eliminación del lípido A).

15. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el paso de la eliminación del lípido A es llevado a cabo después del paso de recolección.