MX2014011388A - Virus de la enfermedad de marek modificado y vacunas elaboradas con el. - Google Patents

Abstract

Vacuna eficaz para combatir la enfermedad de Marek, que puede elaborarse usando un virus de la enfermedad de Marek (MDV) recombinante de la cepa CVI988, que ha sido transformado con una construcción de ADN exógeno que comprende la secuencia de la repetición terminal larga de un virus de la reticuloendoteliosis. Este agente viral seguro es útil para generar una respuesta inmune de protección importante ante un ataque con un MDV virulento en un pollo, aunque no se caracteriza por una patogenicidad significativa. Las formulaciones apropiadas de esta vacuna que puede usarse en pollos comprenden dosis de este agente viral novedoso que son eficaces para la inmunización, junto con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

Description

VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE MAREK MODIFICADO Y VACUNAS ELABORADAS CON ÉL INCORPORACIÓN A MODO DE REFERENCIA Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud de patente provisoria de los EEUU con el N° de Acta 61/614142, presentada el 22 de marzo de 2012, que se incorpora en la presente a modo de referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona en general con vacunas virales y con métodos para usarlas. Más particularmente, la presente invención se relaciona con nuevas vacunas que son útiles para proteger los pollos de las infecciones del virus de la enfermedad de Marek y que presentan una seguridad y una eficacia superiores a las de las vacunas existentes.

ANTECEDENTES La enfermedad de Marek (MD) es una enfermedad linfoproliferativa que presenta una prevalencia y una importancia elevadas entre los pollos. En el ámbito comercial, suele ser controlada con vacunas a base de virus vivos, es decir, con vacunas que consisten en virus del herpes relacionados con la MD que han sido atenuados o que son naturalmente avirulentos. Aunque los programas de vacunación han sido considerados eficaces en general, en la industria avícola siguen experimentándose pérdidas a causa de la MD. Debido a la tendencia que presenta el virus de la MD a tornarse más virulento con el correr del tiempo (por ejemplo, a través de una reversión a formas más virulentas), en combinación con las presiones económicas que existen sobre la industria avícola, puede concluirse que subsiste una necesidad importante de productos más seguros y más eficaces, que puedan proveer una protección superior durante las primeras etapas de los ataques de cepas de campo altamente virulentas, sin que provoquen efectos colaterales adversos (por ejemplo, distrofia en el timo).

En los pollos, pueden hallarse virus de la MD con tres serotipos diferentes: (1 ) el serotipo 1 , que es la forma oncogénica responsable de la enfermedad, que abarca virus de la MD que presentan virulencias altas o bajas, así como sus variantes atenuadas; (2) el serotipo 2, que abarca virus de la MD no oncOgénicos; y (3) el serotipo 3, que abarca los virus del herpes del pavo (HVT). Una de las primeras vacunas para combatir la MD consistió en un virus del serotipo 3, que fue aislado originalmente a partir de pavos, según se describe en Witter et al., Am. J. Vet. Res., 31 : 525-538 (1970), y en Okazaki et al., Patente de los EEUU N° 3642574. Su falta de oncogenicidad, su capacidad de infección autolimitativa, sus características de replicación in vivo e in vitro apropiadas, su disponibilidad en forma de preparaciones libres de células o asociadas a células y su eficacia elevada en la protección han convertido el HVT en una referencia para las vacunas contra la MD en el mundo. Una cepa del HVT de uso habitual es FC126.

Desde 1984, en los Estados Unidos se ha permitido el uso de vacunas que se producen a partir de la cepa naturalmente avirulenta SB-1 (véanse Schat et al., J. Nati. Cáncer Inst., 60: 1075-1082 (1978), y la Patente de los EEUU N° 41600241 , donde se describe un aislado de un virus de la MD del serotipo 2). La cepa SB-1 puede proveer una protección pobre contra las cepas altamente virulentas del MDV. Usualmente se la emplea en combinación con el HVT, en forma de una vacuna bivalente, ya que los dos virus pueden proveer una protección superior a la que podría obtenerse con cualquiera de ellos por separado (véanse Schat et al., Avian Pathol., 11 : 593-606 (1982), y Witter, Avian Pathol., 11 : 49-62 (1982), cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia). Este fenómeno se conoce como la "sinergia en la protección". Las vacunas bivalentes que comprenden la cepa SB-1 y el HVT representan más de 50% de las vacunas contra la MD que se comercializan en los Estados Unidos, y se considera que son los productos actualmente disponibles que resultan más eficaces para combatir la AD. Sin embargo, a pesar de su uso, ocurren pérdidas esporádicas.

En los Estados Unidos, también se ha permitido la comercialización de otra vacuna para combatir la MD, que en este caso se produce a partir del clon C de la cepa CVI988 (CVI988/C). Esta vacuna se obtuvo a partir de un virus de la MD del serotipo 1 que era levemente virulento, que fue atenuado a través de una serie de pasajes en un cultivo de tejido, y se la describe en De Boer et al., Avian Dis., 30: 276-283 (1986). En De Boer et al., Advances in Marek's Disease Research, pp. 405-403 (1988), se describe otro derivado de CVI988/C que fue sometido a una serie de pasajes más prolongada, que se conoce como CVI988/C/R6. Más recientemente, se determinó que la cepa original, CVI988/Rispens, que había sido sometida a una cantidad baja de pasajes y que había sido empelada en el ámbito comercial en otros países durante varios años, es altamente eficaz ante los ataques con cepas muy virulentas del virus de la MD (véase Witter et al., 4o simposio internacional sobre la enfermedad de Marek, pp. 315-319 (1992)).

Witter, supra, también describió una vacuna experimental derivada de Md 1 , que es un aislado de campo altamente virulento de un virus de la MD del serotipo 1. Md1 1 fue atenuado a través de una serie de 75 pasajes en un cultivo de células, y la vacuna resultante se denominó Md11/75C. Se demostró que esta vacuna puede conferir una protección apropiada ante un ataque con Md5 o con la mayor parte de los otros virus de la MD altamente virulentos que se analizaron, pero que también resulta menos eficaz ante un ataque con la cepa JM/102W, que es un prototipo de un virus de la MD que puede combatirse de manera eficaz con las vacunas a base de HVT y SB-1. Además, su eficacia fue consistentemente menor en aquellos pollos que comprendieron anticuerpos contra el HVT.

En la Patente de los EEUU N° 4895717, Witter describió un derivado que se originó a través de la reversión de Mdn/75C, que fue denominado Md11/75C/R2. Se ha demostrado que Md11/75C/R2 es superior a otras vacunas monovalentes, y que su eficacia es idéntica a la de una vacuna bivalente que comprende el HVT y la cepa SB-1 (Witter, Avian Dis., 31 : 752-765 (1987)). Sin embargo, la patogenicidad inherente de los virus del serotipo 1 y la probabilidad de que las cepas atenuadas experimenten una reversión y adquieran una patogenicidad más elevada (Witter et al., Avian Pathol., 13: 75-92 (1984)) son factores que no pueden ser obviados cuando se permite el uso de productos de los tipos mencionados. Witter et al., Avian Dis., 35: 877-891 (1991), determinaron que un clon que se obtuvo al someter la cepa Mdn/75C/R2 a una serie de pasajes más prolongada, que fue denominado Md11/75C/R2/23 (o R2/23), presentaba la capacidad de protección notable propia de la cepa progenitora, aunque carecía de su patogenicidad residual.

En la Patente de los EEUU N° 4895718, cuyo contenido se incorpora en la presente a modo de referencia, Witter también describió otra vacuna contra la MD que se obtuvo a partir de 301 B/1 , un aislado de un virus del serotipo 2 no patogénico. La cepa 301 B/1 presentó una capacidad de replicación superior a la de SB-1 , y también confirió una protección superior ante los ataques del virus.

También se ha descripto un virus de la enfermedad de Marek recombinante, que fue denominado RM1 , que comprende la repetición terminal larga de un virus de la reticuloendoteliosis integrada de manera estable en la región de la repetición corta (RS) de su genoma. Esta cepa fue generada en la USDA-ARS-ADOL, a partir de un virus de la enfermedad de Marek patogénico del serotipo 1 , más precisamente de la cepa JM (Witter et al., 1997, Avian Dis., 41: 407-421 ; Jones et al., 1996, J. Virology, 70(4): 2460-2467). Sin embargo, si bien se ha demostrado que la cepa RM1 puede conferir un nivel de protección similar o superior al que puede obtenerse con CVI988, también se le ha adjudicado patogenicidad residual, ya que podría provocar la atrofia del timo en las aves tratadas.

Por lo tanto, aunque las vacunas a base de las cepas existentes HVT, SB-1 , CVI988, CVI988/C, Md1 1/75C, Md1 1/75C/R2 y 301 B/1 pueden dar como resultado una respuesta inmune contra determinados virus de la MD, ninguna de ellas puede conferirles una protección óptima a los pollos ante ataques con cualquier virus de la MD. Adicionalmente, estas vacunas han presentado una eficacia menor sobre algunas de las cepas altamente virulentas del virus de la MD que se han aislado más recientemente. Para evitar el surgimiento de brotes a gran escala de la MD en el futuro, existe la necesidad de desarrollar vacunas más seguras, que resulten más eficaces sobre las cepas altamente virulentas del virus de la MD.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en parte en la producción y el uso de vacunas que comprenden los virus de la enfermedad de Marek (MDV) que fueron descriptos originalmente en la solicitud número USSN 10/623891 (que fue publicada como US2005/0019348A1 y que fue adjudicada a Reddy et al.), cuyo contenido y cuyo historial de presentación se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad. Específicamente, la presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente e inesperado de que el "virus" CVRM2 (del que se había indicado que era una cepa "CVI988" del MDV que había sido transformada con una construcción de ADN exógeno, según se describe, por ejemplo, en la tabla 1 de Reddy et al.) de hecho no era un virus de la enfermedad de Marek (MDV) recombinante individual, distinguible desde el punto de vista clonal. En lugar de esto, los solicitantes determinaron que CVRM2 abarcaba una población heterogénea de MDV recombinantes y progenitores, y cuando se aisló una línea clonal pura de CVRM2 (que se conocerá de aquí en adelante como RN1250) y se la administró en aves, se obtuvieron resultados relacionados con la seguridad y con la eficacia que fueron muy superiores a los que podrían haberse esperado sobre la base de la descripción de Reddy et al.

De acuerdo con este descubrimiento, un objetivo de la invención fue proveer una vacuna novedosa que pudiera conferirles a las aves, tales como los pollos, una protección importante contra la MD.

Otro objetivo de la invención fue proveer una vacuna que pudiera conferir una protección contra las cepas altamente virulentas del virus de la enfermedad de Marek que fuera superior a la que puede obtenerse con las vacunas que se comercializan en la actualidad.

Otro objetivo de la invención fue mejorar la viabilidad y la productividad de los pollos, particularmente de los pollos Broiler y de las gallinas ponedoras, y reducir las pérdidas económicas en la industria avícola que son provocadas por la enfermedad de Marek.

Estas y otras formas de realización se describen en la descripción detallada más adelante o han de resultar evidentes a partir de ellas, y en cualquier caso han de quedar dentro de su alcance.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS En la figura 1 se provee un esquema de la organización del genoma del MDV, que comprende una única región larga (UL) que está rodeada por una repetición terminal larga (TRL), una repetición interna larga (IRL), una única región corta (US) y dos repeticiones invertidas: una repetición interna corta (IRS) y una repetición terminal corta (TRS). También se provee una representación esquemática de los clones basados en cósmidos superpuestos que se generaron para rescatar un virus infeccioso a partir de una cepa altamente virulenta del MDV.

En la figura 2 se ilustra la generación del cósmido B40-Pac, que se usó para elaborar la vacuna a base del CVRM.

En la figura 3 se ilustra un diagnóstico basado en una PCR de un MDV recombinante. Se representan los cebadores que se emplearon en la PCR, se indica el tamaño que se esperó para el producto y se provee una imagen del gel de agarosa, donde puede observarse que CVRM2 no fue clonal, sino que de hecho fue una población mixta de MDV recombinantes y progenitores. Carriles: ) escala, 2) negativo, 3) Rispens, 4) GA 22, 5) Rismavac, 6) RB1 B, 7) RN1250, 8) positivo (población mixta original).

En la figura 4 se representa la confirmación basada en una PCR de los MSV RN1250, RN1250 X+5 y BP5. Carriles: (1) sin molde, (2) RN1250, (3) RN1250 X+5, (4) RN1250 BP5. A través de las PCR que se realizaron con todos los pares de cebadores, fue posible obtener los productos y los patrones de bandas esperados: no hubo evidencia alguna de la presencia del virus progenitor Rispens entre los aislados de los MSV RN1250, RN1250 X+5 y BP5.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Una "respuesta inmunológica" ante una composición o a una vacuna de interés hace referencia al desarrollo de una respuesta inmune mediada por células y/o por anticuerpos en el huésped. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye, sin limitaciones, la producción de anticuerpos, células B, células T auxiliares y/o células T citotóxicas dirigidas específicamente a uno o más antígenos presentes en la composición o la vacuna de interés. Preferiblemente, el huésped presentará una respuesta inmunológica terapéutica o de protección, de modo tal que se incrementara la resistencia a las nuevas infecciones y/o se reducirá la severidad clínica de la enfermedad. Dicha protección podrá demostrarse a través de una reducción en los síntomas que normalmente presentaría un huésped infectado, o de su ausencia completa, o por medio de una disminución en la duración de la recuperación y/o en la titulación del virus en el huésped infectado.

El término "animal" hace referencia a los mamíferos, a las aves y a animales semejantes. Los términos "animal" y "huésped", tal como se los emplea en la presente, hacen referencia a los mamíferos y a los seres humanos. El animal puede seleccionarse del grupo que consiste en los equinos (por ejemplo, los caballos), los caninos (por ejemplo, los perros, los lobos, los zorros, los coyotes o los chacales), los felinos (por ejemplo, los leones, los tigres, los gatos domésticos, los gatos salvajes, otros gatos grandes u otros felinos, tales como los guepardos y los linces), los ovinos (por ejemplo, las ovejas), los bovinos (por ejemplo, las vacas), los porcinos (por ejemplo, los cerdos), las aves (por ejemplo, los pollos, los patos, los gansos, los pavos, las codornices, los faisanes, los loros, los pinzones, los halcones, los cuervos, la avestruces, los emúes o los casuarios), los primates (por ejemplo, los prosimios, los tareeros, los monos, los gibones o los simios), los hurones, las focas y los peces. El término "animal" también abarca cualquiera de las etapas del desarrollo que puede presentar el organismo, incluyendo las etapas embrionaria y fetal.

A menos que se los defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se emplean en la presente tienen el mismo significado que comúnmente les dan aquellos versados en la técnica de la invención. Los términos singulares "uno/una" y "el/la" incluyen las referencias en plural, a menos que del contexto surja claramente lo contrario. De manera similar, el término "o" ha de incluir el término "y", a menos que del contexto surja claramente lo contrario.

Ha de tenerse en cuenta que en esta invención, y particularmente en las reivindicaciones y/o en los párrafos, el verbo "comprender" y sus conjugaciones pueden tener el significado que se les da de acuerdo con la Ley de Patentes de los EEUU. En un ejemplo, pueden tener la denotación propia del verbo "incluir" y de sus conjugaciones o la denotación propia del verbo "consistir" y de sus conjugaciones, en combinación con el adverbio "esencialmente", que por ejemplo, de acuerdo con la Ley de Patentes de los EEUU, permiten la presencia de elementos no enumerados de manera explícita, pero excluyen los elementos que provienen de los antecedentes técnicos o que afectan una característica básica o novedosa de la invención.

El término "clonación" hace referencia a la selección y la propagación (a) de un material genético a partir de un individuo, (b) de un vector que comprende un gen o un fragmento de un gen o (c) de un organismo individual que comprende un gen o un fragmento de un gen como el que se ha mencionado.

El término "vector de clonación" hace referencia a un plásmido, un virus, un retrovirus, un bacteriófago, un cósmido, un cromosoma artificial (para bacterias o para levaduras) o una secuencia de ácido nucleico que puede replicarse en una célula huésped, que comprende uno o unos pocos sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción donde la secuencia puede ser cortada de manera predeterminada, y que además puede comprender marcadores opcionales apropiados para identificar las células transformadas, tales como los marcadores que confieren resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina. Un vector de clonación podrá presentar o no las características que son imprescindibles para que opere como vector de expresión.

El término "expresión" hace referencia al proceso en el que se produce un polipéptido a partir de un gen estructural. Para que tenga lugar la expresión, es imprescindible que se transcriba el ADN, que el ARN transcripto sea sometido a modificaciones posteriores a la transcripción y que se traduzca el ARN.

El término "cásete de expresión" hace referencia a la secuencia de ácido nucleico en un vector que se desea transcribir, que puede comprender un promotor para dirigir la transcripción. Un cásete de expresión podrá comprender una o más secuencias de ADN que codifiquen uno o más péptidos de interés.

El término "secuencia para controlar la expresión" hace referencia a aquellas secuencias de ADN que participan en el control de la transcripción o de la traducción, que abarcan los promotores. Las secuencias apropiadas para controlar la expresión y los métodos para elaborarlas y usarlas son bien conocidos en la técnica.

El término "vector de expresión" hace referencia a un replicón, que puede ser un plásmido, un virus, un retrovirus, un bacteriófago, un cósmido, un cromosoma artificial (para bacterias o para levaduras) o una secuencia de ácido nucleico que puede replicarse en una célula huésped, que se caracteriza por la presencia de un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción donde la secuencia puede ser cortada de manera predeterminada, con el propósito de insertar una secuencia de ADN heteróloga. Un vector de expresión podrá comprender un promotor hacia el extremo 5' del sitio en el que pueda cortarse la secuencia para insertar la secuencia de ADN heteróloga que se ha mencionado, donde este sitio podrá seleccionarse de manera tal que el promotor quede unido operativamente a la secuencia de ADN heteróloga. Se dice que una secuencia de ADN heteróloga está unida operativamente a un promotor en una célula cuando una polimerasa de ARN puede unirse a dicho promotor para transcribir la secuencia codificante y obtener un ARNm, el cual posteriormente puede ser traducido para obtener una proteína, de la que se dice que está codificada por la secuencia codificante.

Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" hacen referencia al ARN, al ADN lineal o ramificado, de cadena simple o doble y a los híbridos de éstos. Estos términos también abarcan los híbridos de ARN y ADN. Los siguientes son ejemplos no limitativos de pollnucleótidos: un gen o un fragmento de un gen, los exones, los Intrones, el ARNm, el ARNt, el ARNr, las ribozimas, el ADNc, los polinucleótidos recombinantes, los polinucleótidos ramificados, los plásmidos, los vectores, el ADN aislado de cualquier secuencia, el ARN aislado de cualquier secuencia y los ácidos nucleicos que son útiles como sondas o como cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como los nucleótidos metilados y los análogos de nucleótidos, el uracilo, otros azúcares, otros grupos conectores, tales como la fluororibosa o el tiolato, o los nucleótidos ramificados. La secuencia de nucleótidos puede ser sometida a modificaciones adicionales después de la polimerización, por ejemplo, a una conjugación con un componente de marca. Otros tipos de modificaciones que se incluyen en esta definición son los extremos protectores, la sustitución de uno o más nucleótidos naturales por nucleótidos análogos y la introducción de medios para unir el polinucleótido a proteínas, a iones de metales, a componentes de marca, a otros polinucleótidos o a un soporte sólido. Los polinucleótidos pueden obtenerse por medio de una síntesis química o a partir de un microorganismo.

El término "gen" se usa en un sentido amplio para hacer referencia a cualquier segmento polinucleotídico que está asociado a una función biológica. Por consiguiente, los genes incluyen los intrones y los exones que pueden hallarse en las secuencias genómicas, las secuencias codificantes en el ADNc y las secuencias reguladoras que son necesarias para su expresión. A modo de ejemplo, el término "gen" también puede hacer referencia a un fragmento de ácido nucleico a partir del cual puede expresarse un ARNm o un ARN funcional, así como a un fragmento que puede codificar una proteína específica y que puede incluir secuencias reguladoras.

Un componente biológico "aislado" (tal como un ácido nucleico, una proteína o una organela) hace referencia a un componente que ha sido separado o purificado sustancialmente de los demás componentes biológicos en la célula del organismo en el cual aparece de manera natural, por ejemplo, de otras moléculas de ADN o ARN de origen cromosómico o extracromosómico, de otras proteínas o de otras organelas. Los ácidos nucleicos y las proteínas que fueron "aislados" incluyen aquellos ácidos nucleicos y aquellas proteínas que han sido purificados con métodos de purificación convencionales. El término también abarca aquellos ácidos nucleicos y aquellas proteínas que pueden prepararse por medios recombinantes o sobre la base de una síntesis química.

El término "purificado", tal como se lo emplea en la presente, no implica una pureza absoluta, sino que más bien se trata de un término relativo. De esta manera, por ejemplo, una preparación de polipéptidos purificados parcialmente es una donde hay una proporción de dichos polipéptidos que es mayor que la que se observa en el entorno natural. Es decir, el polipéptido está separado de los componentes celulares. El término "sustancialmente purificado" hace referencia a la eliminación de al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% de los componentes o los materiales celulares. Por otro lado, el polipéptido puede estar parcialmente purificado, donde el término "parcialmente purificado" hace referencia a la eliminación de menos de 60% de los componentes o los materiales celulares. Lo mismo puede aplicarse a los polinucleótidos. Los polipéptidos que se describen en la presente pueden purificarse por cualquier medio conocido en la técnica.

Las variantes incluyen las variantes alélicas. El término "variante alélica" hace referencia a un polinucleótido o un polipéptido que contiene polimorfismos que dan como resultado cambios en las secuencias de aminoácidos de una proteína y que existen dentro de una población natural (por ejemplo, una especie o una variedad de virus). Las modificaciones alélicas naturales típicamente pueden dar como resultado una variación de 1-5% en un polinucleótido o en un polipéptido. Las variantes alélicas pueden identificarse mediante la secuenciación de la secuencia de ácido nucleico de interés en diversas especies, lo cual puede efectuarse fácilmente usando sondas de hibridación para identificar el mismo locus genético del gen en dichas especies. Se considera que cualquiera y la totalidad de las variaciones de los ácidos nucleicos y los polimorfismos o las variaciones de los aminoácidos resultantes que son el resultado de una variación alélica natural y que no alteran la actividad funcional del gen de interés se encuentran dentro del alcance de la invención.

Tal como se los emplea en la presente, los términos "derivado" y "variante" hacen referencia a un polipéptido o un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una o más variaciones de aminoácidos conservativas u otras modificaciones menores, de manera tal que (1 ) el polipéptido correspondiente presenta una función sustancialmente equivalente a la del polipéptido salvaje o (2) un anticuerpo generado contra el polipéptido derivado presenta inmunorreactividad con el polipéptido salvaje. Estas variaciones pueden ser el resultado de modificaciones deliberadas, que pueden llevarse a cabo por medio de una mutagénesis dirigida a un sitio específico, o pueden ser espontáneas. El término "variante" también abarcará las secuencias que comprendan supresiones, adiciones o sustituciones, con la condición de que el polipéptido resultante sea apropiado para generar una respuesta inmunológica, tal como se la define en la presente.

El término "variación conservativa" hace referencia al reemplazo de un residuo de aminoácido por otro residuo similar desde el punto de vista biológico, o bien al reemplazo de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico, de modo que el residuo de aminoácido codificado no se modifique, o que, de haber una modificación, se trate de un cambio por otro residuo que sea similar desde el punto de vista biológico. En este sentido, las sustituciones particularmente preferidas en general serán de naturaleza conservativa, según se indicó con anterioridad.

El término "vector" hace referencia a un plásmido o un virus de ADN o ARN recombinante, que comprende un polinucleótido heterólogo que puede administrarse en una célula blanco, tanto in vitro como in vivo. El polinucleótido heterólogo puede comprender una secuencia de interés para propósitos preventivos o terapéuticos, y opcionalmente pueden tomar la forma de un cásete de expresión. En el contexto de la presente, no es imprescindible que un vector pueda replicarse en la célula o el sujeto blanco final. El término abarca los vectores de clonación y los vectores virales.

El término "recombinante" se aplica a un polinucleótido de origen semisintético o sintético, que no aparece en la naturaleza o que está unido a otro polinucleótido, en una disposición que no se observa en la naturaleza.

El término "heterólogo" se aplica a un componente que deriva de una entidad que es diferente desde el punto de vista genético del resto de la entidad con la cual se lo compara. A modo de ejemplo, un polinucleótido que puede introducirse en un plásmido o un vector derivado de una fuente diferente, por medio de procedimientos de ingeniería genética, es un polinucleótido heterólogo. Un promotor que ha sido separado de la secuencia codificante nativa y ha sido unido operativamente a una secuencia codificante diferente de la nativa es un promotor heterólogo.

Los polinucleótidos de acuerdo con la invención podrán comprender secuencias adicionales, que podrán ser secuencias codificantes adicionales, dentro de la misma unidad de transcripción, elementos de control, tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, UTR 5', UTR 3', terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, unidades de transcripción adicionales bajo el control del mismo promotor o de uno diferente, secuencias que posibiliten la clonación, la expresión, la recombinación homologa o la transformación de una célula huésped o cualquier construcción que pueda resultar deseable para proveer las formas de realización de esta invención.

El término "unión operativa" hace referencia a un enlace funcional entre un promotor y una secuencia de ácido nucleico, donde el promotor puede iniciar la transcripción del ARN que corresponde a la secuencia de ADN. Se dice que una secuencia de ADN heteróloga está unida operativamente a un promotor en una célula cuando una polimerasa de ARN puede unirse a dicho promotor para transcribir la secuencia codificante y obtener un ARNm, el cual posteriormente puede ser traducido para obtener una proteína, de la que se dice que está codificada por la secuencia codificante.

El término "promotor" hace referencia a una secuencia de ADN que se encuentra en una secuencia de ADN de mayor tamaño, que define el sitio al que puede unirse la polimerasa del ARN para inicial la transcripción. Un promotor puede comprender elementos potenciadores o represores distales. El promotor puede ser homólogo, es decir, puede ser el promotor que está asociado al ácido nucleico deseado en la naturaleza para dirigir su expresión, o bien puede ser heterólogo, lo que implica que en la naturaleza dirige la expresión de un ácido nucleico que corresponde a un gen que es diferente del deseado. Un promotor puede ser constitutivo o inducible.

El término "vacuna", tal como se lo emplea en la presente, hace referencia en general a cualquier tipo de agente biológico que, en una forma que puede administrarse, es útil para generar una respuesta inmune de protección en el animal en el que se lo inocula.

Formas de realización En la presente invención se proveen virus de la enfermedad de Marek (MDV) recombinantes en los que se ha insertado una repetición terminal larga (LTR) derivada de un virus de la reticuloendotellosis (REV) por medio de una recombinación homologa. Estos virus recombinantes son eficaces para provocar una respuesta inmune contra el virus de la enfermedad de Marek en un ave, aunque no se caracterizan por una patogenicidad significativa. Tal como se lo emplea en la presente, la frase "no se caracterizan por una patogenicidad significativa" denota que la administración de los virus no da como resultado lesiones propias de la MD que puedan observarse a ojo desnudo en el ave inoculada o tratada, incluso en las aves altamente susceptibles. En formas de realización particulares, las aves son pollos.

CVRM2 fue producido por los autores Reddy et al., según se describe en la publicación que se ha citado y se resume en las figuras 1 y 2 de la presente. Una vez que se recibió la muestra de CVRM2, los solicitantes llevaron a cabo un análisis detallado basado en una PCR para confirmar la identidad y la integridad del virus aislado (en la figura 3 se representa la resolución de los productos que se amplificaron en el gel de agarosa). Sorprendentemente, los solicitantes descubrieron que la muestra no era un aislado clonal, sino que de hecho era una población mixta de CVRM2 recombinantes y MDV de la cepa progenitora. Posteriormente, los solicitantes llevaron a cabo una purificación en una placa para obtener un aislado puro, que consistió exclusivamente en CVRM2 (es decir, un aislado en el que estuvo ausente la cepa del MDV progenitora, Rispens). En aras de la claridad, este nuevo aislado clonal se conoce como "RN1250" en la presente.

El MDV recombinante de acuerdo con esta invención puede producirse modificando la cepa del MDV del serotipo 1 CVI988, cualquiera de sus clones o cualquiera de las cepas que puedan obtenerse a partir de ella, un conjunto que en la presente se conoce como las cepas "CVI988/X", mediante la puesta en práctica de series de pasajes. Por lo tanto, tal como se lo emplea en la presente, el término "CVI988/X" abarca, sin limitaciones, la cepa original, que había sido sometida a una cantidad baja de pasajes, CVI988/Rispens (Rispens et al., 1972, Avian Dis., 16: 106-125 y 126-138), el clon C de la cepa CVI988 (CVI988/C; De Boer, Patente de los EEUU N° 4673572 y De Boer et al., 1986, Avian Dis., 30: 276-283) y CVI988/C/R6 (De Boer et al., 1988, Advances in Marek's Disease Research, pp. 405-413). El contenido de cada una de las publicaciones/patentes que se mencionaron con anterioridad se incorpora en la presente a modo de referencia.

En una forma de realización, en la invención se provee una cepa del MDV novedosa, atenuada y recombinante, que puede producirse reemplazando una porción de la secuencia nativa de CVI988/X por un ADN exógeno que comprende la secuencia de la repetición terminal larga (LTR) de un virus de la reticuloendoteliosis (REV).

En una forma de realización, la recombinación de la cepa CVI988 se llevó a cabo usando la cepa del MDV del serotipo 1 RM1 como fuente de las LTR exógenas (RM1 es un MDV recombinante en el que se han integrado las LTR del REV). En la figura 2 puede observarse que las LTR del REV se extrajeron del ADN del virus RM1 purificado sobre la base de una digestión con Pací, para luego insertarlas en el vector de transporte B40, que se preparó a partir de una cepa altamente virulenta del virus de la enfermedad de Marek, Md5. El vector recombinante resultante, B40-Pac, se usó para insertar las LTR en un virus de la enfermedad de Marek de la cepa CVI988. Para generar MDV recombinantes que comprendieran las LTR, se transfectó el ADN que se había purificado a partir de la cepa del MDV CVI988 en fibroblastos embrionarios de pollo o de pato (CEF o DEF), de manera simultánea con el vector digerido con Notl. El virus recombinante, que comprendió las LTR de RM1 integradas en su genoma, se replicó con mayor velocidad que la cepa progenitora CVI988. Sin que se desee limitar la invención a una teoría, se cree que este incremento en la velocidad de replicación es el resultado de la inserción de las LTR del virus de la reticuloendoteliosis hacia el extremo 5' del gen ICP4 en genoma del MDV.

En otra forma de realización, el MDV CVI988/X puede modificarse mediante la adición de LTR aisladas de virus de la reticuloendoteliosis diferentes de la cepa RM1. En este contexto, se ha comprobado que el sitio donde se insertan las LTR en la cepa del MDV RM1 se encuentra entre las regiones IRL e IRS del genoma (Jones et al., 1996, Retroviral insertional activation in a herpesvirus: transcriptional activation of US genes by an integrated long terminal repeat in a MDV clone, J. Virology, 70(4): 2460-2467). Esto corresponde aproximadamente a la posición 152745 de los virus de la enfermedad de Marek de la cepa Md5. Esta región está localizada en un fragmento con una longitud de 1704 pares de bases que puede escindirse con EcoRI (los nucleótidos 152, 198-153 y 902) de la cepa del MDV del serotipo 1 Md5 (Tulman et al., 2000, The genome of a very virulent Marek's disease virus, J. Virology, 74d7: 7980-7988), que podrá clonarse en un vector plasmídico que carezca de un sitio para la endonucleasa de restricción Dralll, el cual podrá usarse como vector de transferencia, es decir, para introducir cualquier LTR en el genoma del MDV. Este fragmento EcoRX comprende un único sitio para la endonucleasa de restricción Dralll que está localizado 10 pares de bases hacia el extremo 5' del sitio donde se hallan las LTR en RM1. Las LTR pueden insertarse en el sitio para Dralll del fragmento de 1704 pares de bases que puede escindirse con EcoRI, de manera tal de generar un vector apropiado para transferir las LTR, con el cual pueden generarse MDV recombinantes con LTR insertadas. Con este fin, el vector de transferencia debería ser linealizado con EcoRI, para luego extraerlo con fenol y cloroformo y precipitarlo con etanol. La transfección simultánea del vector de transferencia linealizado y el ADN de cualquier cepa del MDV del serotipo 1 en células susceptibles en un cultivo dará como resultado la introducción de las secuencias de las LTR en el genoma del MDV, que tendrá lugar a través de una recombinación homologa.

Reddy et al., supra, indicaron que el virus recombinante resultante (es decir, el MDV con una LTR de la reticuloendoteliosis) debería "desarrollarse más rápidamente que la cepa del MDV progenitora correspondiente, por lo que no debería ser necesario llevar a cabo una purificación en una placa". Sin embargo, sobre la base del descubrimiento inesperado de los solicitantes, es decir, que la muestra de CVRM2 de hecho comprendió una combinación de un MDV recombinante y el MDV progenitor correspondiente, se les sugiere enfáticamente a aquellos versados en la técnica que lleven a cabo una purificación en una placa para aislar el MDV recombinante de acuerdo con la presente invención. Esto resulta particularmente importante, ya que cabe la posibilidad de que se descarten MDV recombinantes potencialmente útiles una vez que se obtengan resultados que reflejen que la inmunización con el virus no confiere una protección suficiente ante un ataque ulterior con un MDV virulento (véase la tabla 1 de Reddy et al., donde CVRM2 parece conferir una protección inferior a 80%).

En otra forma de realización, los MDV recombinantes que comprenden las LTR de los REV podrán elaborarse a partir de cualquier MDV, incluyendo otras cepas CVI988/X, mediante el uso de la cepa depositada CVRM2, con la condición de que la cepa CVRM2 sea sometida a una purificación en una placa, con el propósito de asegurar que el virus sea RN1250 y no una combinación de RN1250 y la cepa del MDV progenitora.

En la presente, pueden usarse diversas LTR del REV. Se han aislado y descripto numerosas LTR del virus de la reticuloendoteliosis, que incluyen, sin limitaciones, las que fueron descriptas por Kost et al. (1993, Retrovirus insertion into herpesvirus: characterization of a Marek's disease virus harboring a solo LTR, Virology, 192: 161-169), Ridgway (1992, REV LTR elements are efficient promoters in cells of various species and tissue origin, ¡ncluding human lymphoid cells, Gene, 121 : 213-218), Boerkoel y Kung (1992, Transcriptional interaction between retroviral long terminal repeats (LTRs): mechanism of 5' LTR suppression and 3' LTR promoter activation of c-myc in avian B-cell lymphomas, J. Viral., 66: 4814-4823), Hippenmeyer y Krivi (1991 , Gene expression from heterologous promoters in a replication-defective avian retrovirus vector in quail cells, Poult. Sci., 70: 982-92), Ridgway et al. (1989, Transient expression analysis of the reticuloendotheliosis virus long terminal repeat element, Nucleic Acids Res., 17: 3199-3215), Embretson y Temin (1987, Transcription from a spleen necrosis virus 5' long terminal repeat is suppressed in mouse cells, J. Virol., 61 : 3454-3462), Notani y Sauerbier (1987, Sequence instability in the long terminal repeats of avian spleen necrosis virus and reticuloendotheliosis virus, J. Mol. Evol., 25: 241-247), Robinson y Gagnon (1986, Patterns of proviral insertion and deletion in avian leukosis virus-induced lymphomas, J. Virol., 57: 28-36) y Ridgway et al., (1985, In vitro transcription analysis of the viral promoter involved in c-myc activation in chicken B lymphomas: detection and mapping of two RNA initiation sites within reticuloendotheliosis virus long terminal repeat, J. Virol., 54: 161-170). El contenido de cada una de las publicaciones que se citaron con anterioridad se incorpora en la presente a modo de referencia. Por otra parte, hay numerosas secuencias de LTR disponibles en GenBank y en otras bases de datos genómicas, cuya síntesis puede llevarse a cabo con una PCR, mediante el uso de cebadores con especificidad por las LTR. Posteriormente, las secuencias que se amplifiquen con la PCR podrán insertarse en cualquiera de los dos vectores de transferencia que se describieron con anterioridad.

Las secuencias de ácidos nucleicos de las LTR del REV que se describen en la presente y sus equivalentes funcionales desde el punto de vista biológico pueden usarse de acuerdo con la presente invención. El término "equivalentes funcionales desde el punto de vista biológico", tal como se lo emplea en la presente, hace referencia a aquellas secuencias de ácidos nucleicos que presentan una actividad biológica o de inmunoproteccion que es idéntica a la de las secuencias de ácidos nucleicos de las LTR del virus de la reticuloendoteliosis que se describieron con anterioridad. Vale decir, cuando se las introduce en la cepa del MDV que se emplea como huésped, CVI988, de una manera operativa desde el punto de vista funcional, dan como resultado una respuesta inmune de protección, aunque no se caracterizan por una patogenicidad significativa en los pollos.

A modo de ejemplo, las secuencias de ácidos nucleicos que se describen en la presente podrán alterarse por medio de sustituciones, inserciones, adiciones o supresiones, de manera tal de producir ácidos nucleicos equivalentes desde los puntos de vista biológico y funcional, que retengan la actividad propia de los promotores o de los potenciadores.

Las variantes del ADN genómico o del ADNc (si se lo obtiene por medio de una RT-PCR a partir de ARN) que se contemplan en la presente se caracterizan por una homología superior a 75%, preferiblemente superior a 85% y más preferiblemente superior a 95% con las LTR de los REV de origen natural que se describen en la presente.

La vacuna basada en un virus de la enfermedad de Marek recombinante de acuerdo con la invención puede elaborarse como una preparación libre de células, o en una forma de realización preferida, como una preparación asociada a células. Una vacuna asociada a células pude elaborarse directamente a partir de un cultivo in vitro del agente viral vivo en un medio apropiado, por ejemplo, en fibroblastos embrionarios de pollo, de acuerdo con la descripción de Witter (US 4895718, cuyo contenido se incorpora en la presente a modo de referencia). Como alternativa, para elaborar un inoculo viral libre de células, las células provenientes de tejido del huésped infectado o de un cultivo se someten a una sonicación o se destruyen por otros medios, según se ha descripto con anterioridad. Los residuos celulares se eliminan por medio de una centrifugación, y la fracción centrifugada que se recupera se conoce como el inoculo. Más aun, con la condición de la vacuna comprenda virus viables, también podrá elaborársela a partir de virus muertos o a partir de componentes inmunogénicos que hayan sido separados de los virus, aunque los procesos necesarios para obtener estos productos podrán ser significativamente más costosos. Por ejemplo, una vacuna a base de subunidades podrá elaborarse purificando una o más proteínas virales que presenten propiedades inmunogénicas conocidas a partir de un lote de virus muertos.

El agente viral se prepara para la administración formulándolo en una dosis eficaz para la inmunización, en combinación con un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable, como es el caso de la solución salina fisiológica o los medios apropiados para cultivar tejidos. El término "dosis eficaz para la inmunización" hace referencia a una cantidad que es apropiada para inducir inmunidad ante un ataque con una cepa virulenta del virus de la enfermedad de Marek en un pollo. Se considera que se ha inducido inmunidad en una población de pollos cuando el nivel de protección en dicha población es significativamente mayor que el que podría determinarse en un grupo de control no vacunado (con un nivel de confianza de al menos 80%, preferiblemente de 95%). Una medida del nivel de protección es el índice de protección (Pl), que puede calcularse restándole la incidencia de la MD en los grupos vacunados que fueron atacados con el MDV a la incidencia de la MD en las aves de control no vacunadas que fueron atacadas con el MDV, para luego dividir el resultado por el porcentaje en el que se observa la enfermedad de Marek en las aves de control no vacunadas que fueron atacadas con el MDV y multiplicar el valor obtenido por 00.

Típicamente, la vacuna comprenderá al menos aproximadamente 200 pfu (unidades formadoras de placas) del virus, y preferiblemente comprenderá aproximadamente entre 2000 y 5000 pfu. La vacuna podrá administrarse de manera eficaz en cualquier momento, con la condición de que el pollo ya haya desarrollado inmunocompetencia, lo que suele ocurrir aproximadamente el 18° día de la incubación (3 días antes de la eclosión), aunque típicamente se la administra a través de una inoculación que se aplica 24-48 horas después de la eclosión. Como alternativa, el ADN viral recombinante puede administrarse como una vacuna a base de ADN, según lo han descripto Tischer et al. (2002, J. Gen. Virology, 83: 2367-2376, cuyo contenido se incorpora en la presente a modo de referencia).

En la formulación que ha de emplearse como vacuna también pueden incluirse coadyuvantes apropiados conocidos en la técnica. En muchos casos, la eficacia de la vacuna puede incrementarse combinando un virus de la enfermedad de arek recombinante de acuerdo con la invención con otros agentes virales, de manera tal de obtener vacunas bivalentes o polivalentes.

En otra forma de realización, el vehículo, el excipiente o el transporte aceptable para aplicaciones farmacéuticas o veterinarias puede ser una emulsión de agua en aceite. En aun otra forma de realización, la emulsión de agua en aceite puede ser una emulsión triple de agua en aceite en agua (W/O/W). En aun otra forma de realización, el vehículo, el excipiente o el transporte aceptable para aplicaciones farmacéuticas o veterinarias puede ser una emulsión de aceite en agua.

Métodos de uso v artículo de manufactura A continuación, se describen diversas formas de realización que están relacionadas con métodos. En una forma de realización, se provee un método con el que puede vacunarse un ave, que comprende administrarle una composición que comprende un virus de la enfermedad de Marek (MDV).

En una forma de realización de la invención, puede emplearse un régimen de sensibilización y refuerzo, que comprende al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo, donde se usa al menos un polipéptido, un antígeno, un epitope o un inmunógeno común. Típicamente, la composición inmunológica o la vacuna que se emplea en la administración primaria tiene propiedades diferentes de las que caracterizan a las composiciones que se usan como refuerzo. Sin embargo, vale destacar que es posible usar la misma composición en la administración primaria y en la administración de refuerzo. Este protocolo de administración se conoce como un protocolo de "sensibilización y refuerzo".

Un régimen de sensibilización y refuerzo comprende al menos una administración primaria y al menos una administración de refuerzo con al menos un polipéptido común y/o con variantes o fragmentos de éste. La vacuna que se usa en la administración primaria puede tener propiedades diferentes de las que se emplean en la vacunación de refuerzo posterior. La administración primaria puede comprender una o más aplicaciones. De manera similar, la administración de refuerzo puede comprender una o más aplicaciones.

Las composiciones suelen administrarse en un volumen de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 2,0 mi, de entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1 ,0 mi o de entre aproximadamente 0,5 mi y aproximadamente 1,0 mi.

Aquellos versados en la técnica han de comprender que la presente descripción se provee tan solo a modo de ejemplo, y que no tiene por objeto limitar la presente invención. A partir del contenido de la presente y de los antecedentes, aquellos versados en la técnica han de poder determinar, sin experimentación innecesaria, la cantidad de administraciones, la ruta de administración y las dosis más apropiadas para cada protocolo de inyección.

En el contexto de la presente, se contempla la posibilidad de administrarle a un animal una cantidad eficaz de una composición terapéutica que ha sido elaborada de acuerdo con la invención, en al menos una ocasión. El animal puede ser un macho, una hembra, una hembra preñada o un individuo neonato. Esta administración puede efectuarse por diversos medios, tales como, sin limitaciones, una inyección intramuscular (IM), intradérmica (ID) o subcutánea (SC) o una administración por vía intranasal u oral. Una composición terapéutica de acuerdo con la invención también puede administrarse mediante el uso de un aparato sin agujas (por ejemplo, un dispositivo Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (de Merial, GA, EEUU), un aparato Vetjet o Vitajet (de Bioject, Oregon, EEUU)). Otro abordaje para administrar composiciones de plásmidos está basado en el uso de una electroporación (véanse, por ejemplo Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; Solicitud PCT N° WO99/01158). En otra forma de realización, la composición terapéutica se le administrada al animal con un cañón de genes o a través de un bombardeo con partículas de oro. En una forma de realización ventajosa, el animal es un perro, un hurón o una foca.

Otra forma de realización de la invención es un conjunto de elementos que puede emplearse en un método para generar o inducir una respuesta inmunológica o de protección contra el MDV en un animal, que comprende una composición o una vacuna inmunológica basada en un MDV recombinante, así como también instrucciones para poner en práctica la administración de una cantidad eficaz para generar una respuesta inmune en el animal.

En una forma de realización, la presente invención está relacionada con un conjunto de elementos que puede emplearse en un método para generar o inducir una respuesta inmune, que puede comprender cualquiera de las composiciones o vacunas recombinantes a base de MDV que se describen en la presente, así como también instrucciones para su uso.

Otras citoquinas que pueden usarse en la presente invención incluyen, sin limitaciones, el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), el ¡nterferón a (IFNCa), el interferón ß (IFNp), el ¡nterferón ? (IFNv), la interleuquina 1a (IL-1a), la interleuquina 1 ß (IL-? ß), la interleuquina 2 (IL-2), la interleuquina 3 (IL-3), la interleuquina 4 (IL-4), la interleuquina 5 (IL-5), la interleuquina 6 (IL-6), la interleuquina 7 (IL-7), la interleuquina 8 (IL-8), la interleuquina 9 (IL-9), la interleuquina 10 (IL-10), la interleuquina 1 1 (IL-11 ), la interleuquina 12 (IL-12), el factor de necrosis tumoral a (TNFa), el factor de necrosis tumoral ß (???ß) y el factor de crecimiento transformante ß (?T?ß). Ha de comprenderse que las citoquinas pueden administrarse de manera simultánea o consecutiva con una composición inmunológica o una vacuna de acuerdo con la presente invención. En este contexto, por ejemplo, una vacuna de acuerdo con la presente invención también podrá comprender una molécula de ácido nucleico exógena a partir de la cual pueda expresarse una citoquina apropiada in vivo, por ejemplo, una citoquina que haya sido adaptada al huésped que se desee vacunar o en el que se desee generar una respuesta inmunológica (por ejemplo, una citoquina originada en un ave para las preparaciones que se desee administrar en aves).

A continuación, la presente invención se describirá a través de los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1. Eficacia de las cepas del virus de la enfermedad de Marek (MDV) SR-1 CVRM2 RN1250. RMI CN32399 v Rispens CN32553 Un aspecto fundamental de la presente invención es que, una vez que se completó el estudio que se describe en este ejemplo, los inventores pudieron determinar que el MDV CVRM2 no era un MDV recombinante clonal, sino que de hecho era una población mixta que comprendía el MDV recombinante RN1250 y el MDV progenitor Rispens. Como consecuencia, los inventores desarrollaron un MDV clonal RN1250 estable, que se caracteriza por una eficacia elevada como vacuna, según se demuestra en otros ejemplos, por lo que la capacidad de protección inaceptablemente reducida que se determinó para el MDV CVRM2 mixto en este estudio preliminar (de entre 37% y 86%) no ha de resultar sorprendente para aquellos versados en la técnica.

Objetivo El objetivo fue evaluar la eficacia de tres cepas experimentales del MDV SR-1 , que incluyeron la cepa Rispens, y compararla con la de una vacuna comercial (Rismavac®, de Intervet, Inc.) en pollos SPF, mediante la aplicación de un ataque temprano con el MDV T. King.

Materiales y métodos Se distribuyeron al azar ciento cincuenta pollos SPF (de la línea SPAFAS W-42) con una edad de un día en cinco grupos, cada uno de los cuales comprendió treinta aves (los grupos 1 a 5). Cada grupo de tratamiento fue colocado en unidades de aislamiento al azar. Los pollos del grupo 1 sirvieron como control no vacunado, por lo que se los colocó en primer lugar en unidades de aislamiento con una presión negativa, a razón de quince aves por unidad. Cada uno de los grupos remanentes (los grupos 2 a 5) fueron vacunados por medio de una aplicación subcutánea (SQ) de 0,2 mi por ave de la vacuna Rismavac®, que es una vacuna a base del MDV Rispens de Intervet, con el MDV SR-1 RMI CN32399 P4, con el MDV SR-1 CVRM2 RN1250 P4 o con el MDV Rispens CN32553 P4. Los pollos que fueron sometidos a la vacunación SQ en los grupos 2 a 5 también fueron colocados en unidades de aislamiento con una presión negativa, a razón de quince aves por unidad. Cuatro días más tarde, es decir, el día 4 del estudio, las aves en los grupos 1 a 5 fueron sometidas a un ataque individual con el MDV T. King, en una dilución de 1 :500 (de acuerdo con el protocolo 02-085, el 2 de Enero de 2003). En este contexto, el ataque de las aves se llevó a cabo mediante una aplicación intraperitoneal (IP) de 0,2 mi por ave. Los pollos fueron observados hasta 49 días después del ataque. Las aves que perecieron hasta el día 53 del estudio fueron sometidas a una necropsia para examinar las lesiones que provocó el MDV. El día 53, las aves sobrevivientes fueron sacrificadas y fueron sometidas a una necropsia para examinar las lesiones que provocó el MDV.

Resultados Las cepas experimentales del MDV SR-1 y Rispens dieron como resultado tasas de protección de entre 37% y 86% ante el ataque temprano con el MDV T. King. La vacuna Rismavac®, de Intervet, dio como resultado una protección de 83%. El ataque se convalidó con las aves de control que no fueron vacunadas, que presentaron una incidencia de la MD de 97%.

Ejemplo 2. Eficacia de una vacuna basada en el MDV SR-1 RN1250 en un modelo de ataque por dispersión Materiales y métodos Se distribuyeron al azar setenta y seis (76) pollos comerciales Broiler con una edad de un día, que habían sido obtenidos en la instalación avícola Harrison, donde pertenecían a la línea 1-1 , en tres alojamientos y cuatro grupos diferentes. El grupo 1 comprendió 13 aves, el grupo 2 comprendió 13 aves, el grupo 3 comprendió 25 aves y el grupo 4 comprendió 25 aves (uno de los alojamientos fue dividido en dos para crear los corrales para los grupos 1 y 2). Una vez completa la distribución al azar, se aplicó una marca sobre el cuello de las aves para poder identificarlas. Posteriormente, cada ave fue inoculada por vía intraperitoneal (IP) con 0,2 mi de vvMDV T. King, en una dilución de 1 :500. Después del ataque, las aves se colocaron en su alojamiento respectivo, donde cada alojamiento comprendió 25-26 aves. Las aves permanecieron en los alojamientos durante 14 días, antes de asignarlas a los grupos de tratamiento, es decir, el grupo que fue vacunado con el MDV, el grupo que no fue vacunado y el grupo que sirvió como control de contacto. Catorce días después de distribuir las aves que actuarían como agentes de dispersión entre los grupos, se distribuyeron al azar 304 pollos comerciales Broiler como se detalla a continuación. Los grupos vacunados fueron dos grupos que comprendieron 75 aves cada uno (los grupos 3 y 4), más otros dos grupos, uno de los cuales comprendió 38 aves, mientras que el otro comprendió 40 aves (los grupos 1 y 2). Como control no vacunado, se emplearon dos grupos de 25 aves y dos grupos de 13 aves, que se denominaron grupos 1 a 4 (el grupo 1 comprendió 13 aves, el grupo 2 comprendió 13 aves, el grupo 3 comprendió 25 aves y el grupo 4 comprendió 25 aves). Se aplicó una marca sobre el cuello de las aves que se emplearon como control de contacto para poder identificarlas. Posteriormente, estas aves fueron colocadas en los alojamientos. Los individuos vacunados fueron inoculados por vía subcutánea (SQ) con una dosis de 0,2 mi por ave, según se indica a continuación: el grupo 1 fue vacunado con RN1250 pre MSV P6 (el aislado I), el grupo 2 fue vacunado con RN1250 pre SV P7 (el aislado U), el grupo 3 fue vacunado con RN1250 pre MSV P7 (el aislado F), y al grupo 4 se le aplicó una vacuna Rismavac® con el número de serie 02760010, cuya fecha de expiración era el 15 de Abril de 2012. Una vez realizada la inoculación, los individuos vacunados fueron colocados en los mismos alojamientos en los que se hallaban las aves no vacunadas, las aves que se emplearon como control de contacto y las aves que se emplearon como agentes de dispersión. En las unidades de aislamiento, se colocaron otros cincuenta (50) pollos comerciales Broiler con una edad de un año, que no habían sido inoculados. Se los mantuvo allí durante 49 días, de manera tal que posteriormente sirvieran como un segundo grupo de control de contacto. Cuando las aves vacunadas cumplieron ocho días de edad, sobre su cuello se aplicaron marcas coloreadas y numeradas. Las aves que se emplearon como agentes de dispersión permanecieron en los alojamientos durante cincuenta días, momento en el cual se sacrificaron los sobrevivientes para someterlos a una necropsia.

Se monitorearon los signos clínicos de la enfermedad y la mortalidad diariamente, durante 49 días después de la vacunación. Se recolectaron los bazos de las aves del grupo de control de contacto que perecieron para aislar los virus. El día 53 del estudio, los cuarenta pollos comerciales Broiler no inoculados que habían sido colocados en las unidades de aislamiento para que sirvieran como segundo grupo de control de contacto fueron colocados en los alojamientos, donde se los distribuyó entre los grupos 1 a 4, cada uno de los cuales comprendió 10 aves, de acuerdo con un cronograma de distribución establecido. Estas aves fueron marcadas con bandas numeradas para poder identificarlas. Los bazos de las aves de este grupo que perecieron también fueron recolectados para aislar los virus. Los individuos vacunados, no vacunados y del grupo de control de contacto que sobrevivieron fueron sacrificados y fueron sometidos a una necropsia el 49° día del período de observación, es decir, el día 63 del estudio. Se recolectaron los bazos y al menos dos folículos de las plumas de 10 aves del grupo de control de contacto, con el fin de aislar los virus. Las aves de las que se tomaron las muestras se determinaron sobre la base de un cronograma de distribución establecido. El día 83 del estudio, se sacrificaron las aves sobrevivientes del grupo de control de contacto que habían sido distribuidas entre los otros grupos el día 53 (es decir, las aves del segundo grupo). Se recolectaron los bazos y al menos dos folículos de las plumas de cada una de las aves del grupo de control de contacto para aislar los virus.

Tabla 1. Cantidad de aves ue sobrevivieron hasta una edad de cinco días Tabla 2. índices de rotección contra los ata ues con vvMDV T. Kin titulación de la vacuna a base de N1250 (I): 3600 pf u/0,2 mi. 2 Titulación de la vacuna a base de RN1250 (U): 3144 pfu/0,2 mi. 3 Titulación de la vacuna a base de R 1250 (F): 3710 pfu/0,2 mi.

Titulación de la vacuna Rismavac®: 2328 pfu/0,2 mi. 5índice de protección: (porcentaje de aves de control no vacunadas en las que se observaron lesiones propias de la MD (control del ataque) - porcentaje de los pollos vacunados en los que se observaron lesiones propias de la MD)/porcentaje de aves de control no vacunadas en las que se observaron lesiones propias de la MD (control del ataque). 6Para calcular este índice de protección, solamente se consideró el porcentaje de individuos en los grupos de control no vacunados 1 y 2 que presentaron lesiones propias de la MD en el alojamiento 10 (28%, es decir, 7/25).

Conclusión Cuando se empleó un modelo de ataque por dispersión con el MDV T. King en pollos comerciales Broiler, las vacunas que estuvieron basadas en el virus de la enfermedad de Marek del serotipo 1 RN1250 que se obtuvieron antes de aplicar el MSV (I) y (F) fueron más eficaces que la vacuna Rismavac®, de Intervet.

Ejemplo 3. Seguridad del MDV RN1250 (X+5) en pollos SPF con una edad de un día Se distribuyeron al azar doscientos cincuenta pollos SPF con una edad de un día en cinco grupos de tratamiento, a razón de 50 pollos por grupo. Los pollos también fueron distribuidos al azar en los alojamientos, que fueron unidades de aislamiento con una presión negativa. La vacunación se aplicó en cien pollos, que se distribuyeron en los grupos 1 y 2. Por otro lado, los grupos de control de contacto para los grupos 1 y 2 (los grupos 4 y 5, respectivamente) comprendieron cien pollos cada uno, los cuales fueron sometidos a una vacunación simulada. Los (50) pollos remanentes, que fueron asignados al grupo 3, fueron sometidos a una vacunación simulada y sirvieron como controles negativos. Una vez completa la distribución al azar, sobre las alas de las aves que fueron sometidas a una vacunación simulada que sirvieron como control de contacto y de las aves que fueron sometidas a una vacunación simulada que sirvieron como control negativo se aplicaron marcas numeradas, de manera tal de poder identificarlas. Posteriormente, todas las aves fueron colocadas en las unidades correspondientes, a razón de 7-10 aves por unidad. Cada una de las aves que habían sido sometidas a una vacunación simulada fue inoculada con 0,2 mi del mismo diluyente que se empleó para la vacuna contra la enfermedad de Marek. A cada uno de los pollos vacunados se les aplicó una dosis de 0,2 mi, es decir, aproximadamente 5000-6500 unidades formadoras de placa (pfu), de RN1250 (X+5) (grupo 1 ) o de Rismavac® (grupo 2), por medio de una inoculación subcutánea (SQ). Después de la inoculación, las aves vacunadas fueron colocadas en las unidades correspondientes, a razón de 7-10 aves por unidad, junto con las aves del grupo de control de contacto, que habían sido sometidas a una vacunación simulada, de modo tal que en cada unidad se alojó un total de entre 15 y 20 pollos.

El día 7 del estudio, se tomaron muestras de diversos órganos (la bursa, el timo y el bazo) de cinco aves de los grupos 1 a 5 y se las fijó en formalina amortiguada al 10% para realizar un análisis histopatológico. Para otros procedimientos, se seleccionaron otras 2 ó 3 aves por unidad, de acuerdo con el cronograma de distribución. El día 14 del estudio, se determinó el peso corporal y el peso de diversos órganos (la bursa, el timo y el bazo) de 15 aves de los grupos 1 a 5. Se tomaron muestras de diversos órganos (la bursa, el timo y el bazo) de otras cinco aves de los grupos 1 a 5 y se las fijó en formalina amortiguada al 10%. Para determinar el peso y extraer los órganos, se seleccionaron dos o tres aves por unidad, de acuerdo con el cronograma de distribución. El procedimiento que se describió para el día 14 del estudio se repitió con las aves remanentes el día 28 y el día 49.

Resultados Atrofia de los órganos con RN1250 La proporción que representó la bursa en las aves que fueron vacunadas con el MDV SR-1 RN1250 y la proporción que representó la bursa en las aves del grupo de control de contacto, que fueron sometidas a una vacunación simulada, no difirieron significativamente de la que se determinó para las aves del grupo de control negativo, que también fueron sometidas a una vacunación simulada, excepto el día 28, donde la proporción que representó la bursa en el grupo de control de contacto para el MDV SR-1 RN1250 fue significativamente mayor que la del control negativo (p= 0,0111). La proporción que representó el timo en las aves que fueron vacunadas con el MDV SR-1 RN1250 y la proporción que representó el timo en las aves del grupo de control de contacto, que fueron sometidas a una vacunación simulada, no difirieron significativamente de la que se determinó para las aves del grupo de control negativo, que también fueron sometidas a una vacunación simulada (p= 0,7265). Finalmente, la proporción que representó el bazo en las aves que fueron vacunadas con el MDV SR-1 RN1250 y la proporción que representó el bazo en las aves del grupo de control de contacto, que fueron sometidas a una vacunación simulada, no difirieron significativamente de la que se determinó para las aves del grupo de control negativo, que también fueron sometidas a una vacunación simulada (p= 0,5286).

Atrofia de los órganos con Rismavac® La proporción que representó la bursa en las aves que fueron vacunadas con la vacuna a base del MDV SR-1 Rismavac® y la proporción que representó la bursa en las aves del grupo de control de contacto, que fueron sometidas a una vacunación simulada, no difirieron significativamente de la que se determinó para las aves del grupo de control negativo, que también fueron sometidas a una vacunación simulada (p= 0,0581). La proporción que representó el timo en las aves que fueron vacunadas con la vacuna a base del MDV SR-1 Rismavac® y la proporción que representó el timo en las aves del grupo de control de contacto, que fueron sometidas a una vacunación simulada, no difirieron significativamente de la que se determinó para las aves del grupo de control negativo, que también fueron sometidas a una vacunación simulada (p= 0,4004). El día 14, la proporción que representó el bazo en las aves que fueron vacunadas con la vacuna a base del MDV SR-1 Rismavac® fue significativamente mayor que la que se determinó en las aves del grupo de control de contacto, que fueron sometidas a una vacunación simulada, con un valor de p de 0,0141. El día 28, la proporción que representó el bazo en las aves del grupo de control de contacto, que fueron sometidas a una vacunación simulada, fue significativamente mayor que la que se determinó en las aves del grupo de control de contacto, que también fueron sometidas a una vacunación simulada, con un valor de p inferior a 0,000 . Las proporciones no difirieron de manera significativa ningún otro día (p= 0,5558).

Examen histológico En el examen histológico, no se hallaron evidencias de atrofia en la bursa, en el timo ni en el bazo de las aves que fueron inoculadas con el virus de la enfermedad de Marek SR-1 RN1250 o con Rismavac®.

Conclusión Sobre la base del resultado del análisis de la atrofia del timo, de la bursa y del bazo, puede concluirse que, bajo las condiciones de este análisis, el MDV SR-1 RN1250 X+5 resultó seguro cuando se lo administró por vía SQ.

Ejemplo 4. Diseminación del MDV SR-1 RN1250 en pollos SPF con una edad de un día Objetivo El objetivo fue evaluar la diseminación de una vacuna experimental a base del MDV SR-1 RN1250 (X+5) en pollos libres de patógenos específicos (SPF) con una edad de un día, con una administración por vía SQ, y determinar si podía dispersarse y alcanzar las aves de control no vacunadas.

Materiales y métodos Se distribuyeron al azar ciento veinte (120) pollos SPF con una edad de un día en tres grupos de tratamiento y seis unidades diferentes, cada una de las cuales comprendió 15 aves vacunadas y 5 controles de contacto. Sobre el cuello de las aves que fueron asignadas como controles de contacto, se aplicó una marca coloreada y numerada, de acuerdo con el cronograma de distribución. Estas aves fueron colocadas posteriormente en las unidades correspondientes. Las aves que fueron asignadas a los grupos que a los que se les aplicaría la vacunación fueron vacunadas con el MDV RN1250 X+5 o con el MDV Rispens. La vacuna experimental y la vacuna comercial fueron diluidas en el diluyente de Marek, de manera tal de obtener aproximadamente 100000 pfu por dosis (aproximadamente 17 veces la dosis que podría esperarse en el campo). La administración se llevó a cabo por vía SQ. Una vez aplicada la vacunación, las aves se colocaron en las unidades correspondientes, junto con las aves del grupo de control de contacto. Cuando cumplieron ocho días de edad, sobre el cuello de las aves vacunadas se aplicaron marcas coloreadas y numeradas, de acuerdo con el cronograma de distribución. El personal que participó en el análisis clínico durante el estudio no estuvo presente durante la marca de las aves del grupo de control de contacto ni de las aves del grupo vacunado, y tampoco realizó observaciones clínicas durante este período de tiempo, con el propósito de mantener el carácter ciego del experimento.

Tabla 4. Grupos del estudio Dos semanas después de la vacunación, se tomaron muestras de las tráqueas y las cloacas de todas las aves vacunadas y se combinaron las muestras de cada grupo. En cada tubo, se colocaron cinco muestras de las tráqueas o de las cloacas más 5 mi del estabilizador SPGA. Se recolectaron muestras de los folículos primarios de las plumas de dos aves vacunadas de cada grupo (para lo cual se tomaron dos o tres muestras de las plumas de cada ave) para determinar si era posible recuperar virus. Las dos aves de cada grupo de cuyos folículos se tomaron las muestras se seleccionaron en función del cronograma de distribución establecido, y no fueron sacrificadas después del procedimiento. Todas las muestras fueron llevadas al departamento de análisis de Merial Select para que fueran procesadas. Se repitió el mismo procedimiento de toma de muestras en dos ocasiones, separadas por un intervalo de siete días.

El día 21 del estudio, además de tomar muestras de las tráqueas, de las cloacas y de los folículos de las plumas, se sacrificaron cinco aves vacunadas y cinco aves del grupo de control no vacunado (que se seleccionaron de acuerdo con el cronograma de distribución establecido) para someterlas una necropsia, durante la cual se extrajeron los bazos. Solamente se intentó aislar los virus a partir de los bazos que se extrajeron de las aves de control no vacunadas (también se recolectaron aves vacunadas para mantener el carácter ciego del experimento). El último día del estudio (el día 49), se sacrificó la totalidad de las aves, se las sometió a una necropsia y se finalizó el estudio. Se extrajeron los bazos de cinco aves del grupo vacunado y de cinco aves del grupo de control no vacunado. Una vez más, solamente se intentó aislar los virus a partir de los bazos que se extrajeron de las aves de control no vacunadas (también se recolectaron aves vacunadas para mantener el carácter ciego del experimento).

Resultados La media aritmética de la titulación (AMT) del MDV SR-1 RN1250 X+5 en el grupo uno fue de 94160 pfu por dosis de 0,2 mi. La AMT del MDV SR-1 Rispens en el grupo dos fue de 51800 pfu por dosis de 0,2 mi. No fue posible recuperar virus de ninguna de las muestras que se tomaron de las tráqueas y de las cloacas.

Tampoco se recuperaron virus de las muestras de folículos de las plumas que se tomaron del grupo 1, que había sido tratado con el MDV SR-1 RN1250.

Se determinó que hubo un efecto citopático propio de la enfermedad de Marek en las muestras de folículos de las plumas que se tomaron del grupo 2, que había sido tratado con el MDV SR-1 Rispens. Los días 14 y 28, las muestras de los folículos de las plumas que se tomaron de todas las aves fueron negativas.

No fue posible recuperar virus de las muestras de folículos de las plumas que se tomaron del grupo 3, que fue el control negativo que había sido sometido a una vacunación simulada.

Tampoco se recuperaron virus de ninguno de los bazos que se extrajeron los días 21 y 49 de las aves del grupo control de contacto. Inicialmente, se determinó que las muestras del día 49 estaban contaminadas, pero al someterlas a un análisis ulterior basado en una PCR, se determinó que carecían de virus. Se sembró nuevamente material congelado proveniente de estas muestras para confirmar los resultados negativos.

Conclusión Bajo las condiciones de este estudio, las aves que fueron sometidas a la vacunación SQ con la vacuna experimental a base del MDV R-1 RN1250 presentaron un patrón de diseminación similar al que se observó entre las aves que fueron sometidas a la vacunación SQ con la vacuna disponible comercialmente a base del MDV SR-1 Rispens. No se recuperaron virus ni hubo evidencias clínicas de la enfermedad entre las aves no vacunadas que estuvieron en contacto con las aves a las que se les administró la vacuna experimental a base del MDV RN1250.

Ejemplo 5. Evaluación de la eficacia sobre el virus vvMDV RB1B de una vacuna basada en el MDV S1 RN1250 (X+5) en pollos con una edad de un día Materiales y métodos Se distribuyeron al azar doscientos ochenta (280) pollos SPF con una edad de un día en ocho grupos y 24 unidades de aislamiento diferentes, de acuerdo con un cronograma de distribución establecido (cada unidad comprendió 11-12 aves, y cada tratamiento comprendió 35 aves). Una vez completa la distribución al azar, las aves de los grupos 6 y 7, que fueron los grupos que fueron sometidos a una vacunación simulada o a una vacunación y un ataque simulados, es decir, los controles negativos, fueron sometidos a una vacunación simulada con el mismo diluyente que se empleó para la vacuna contra la enfermedad de Marek. Luego se los colocó en las unidades correspondientes, sobre la base del cronograma de distribución. Las aves restantes fueron vacunadas con el MDV SR-1 RN1250, en dosis de 287, 578, 736, 1085 ó 1392 unidades formadoras de placas (pfu) por ave, o bien con el MDV SR-3 HVT, a razón de 1728 pfu por ave. La vacunación se llevó a cabo por vía subcutánea (SQ), y a cada pollo se le aplicó un volumen de 0,2 mi. Una vez completa la vacunación, cada grupo vacunado fue colocado en la unidad correspondiente, de acuerdo con el cronograma de distribución. El día 4 del estudio, las aves del grupo 7 fueron sometidas a un ataque simulado con el mismo diluyente que se empleó para la vacuna contra la enfennedad de Marek, mientras que las aves de los grupos 1 a 6 y 8 fueron atacadas con vvMDV RB1 B, para lo cual a cada ave se le administró un volumen de 0,2 mi por vía intraperitoneal (IP). Las aves fueron observadas diariamente durante 45 días después del ataque para determinar si había reacciones desfavorables, como es el caso de la muerte o la depresión. El día 49 del estudio, se sacrificaron las aves y se las sometió a una necropsia para realizar un examen general de las lesiones asociadas a la enfermedad de Marek.

Resultados La frecuencia de la prevención del ataque con wwMDV RB1 B en los grupos 1 a 5 varió entre 0,84 y 0,94. La frecuencia de la prevención en el grupo 8, que fue vacunado con un HVT, fue de 0,73. La incidencia del MDV en el grupo de control que fue sometido a una vacunación simulada, es decir, el grupo 6, fue de 91 ,2%. Entre las aves del grupo 7, el grupo de control negativo, que fue sometido a una vacunación y un ataque simulados, no se observaron lesiones propias de la MD durante el estudio.

Conclusión La administración subcutánea (SQ) de una vacuna experimental a base de un MDV vivo del serotipo 1 RN1250 (X+5) en pollos SPF con una edad de un día fue eficaz, ya que se produjeron 287 unidades formadoras de placa por dosis cuando se realizó un ataque con un virus RB1 B.

Tabla 5. Resumen de la eficacia de la res uesta a la dosis Se han descripto en detalle formas de realización preferidas de la presente invención, pero ha de comprenderse que la invención, como se la definió en los párrafos anteriores, no se limita a los detalles particulares que se proveen en la descripción anterior, ya que es posible realizar diversas variaciones evidentes sin apartarse de su espíritu o de su alcance.

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un método para provocar una respuesta inmune segura que provea protección contra el virus de la enfermedad de Marek (MDV) en un ave, CARACTERIZADO PORQUE comprende administrarle a dicha ave una cantidad eficaz para el uso terapéutico de una composición que comprende un agente viral que comprende un virus de la enfermedad de Marek recombinante, que ha sido transformado de manera estable con una construcción de ADN exógeno que comprende la secuencia de la repetición terminal larga (LTR) de un virus de la reticuloendoteliosis, con lo que puede provocarse la respuesta inmune de protección deseada.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, CARACTERIZADO PORQUE la composición también comprende un vehículo o un diluyente aceptable para aplicaciones farmacéuticas o veterinarias.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE el MDV es el MDV CVI988/X.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, CARACTERIZADO PORQUE el MDV CVI988/X es CVI988.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE el ave es un pollo.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de la LTR es como la que se detalla en SEQ ID N° 2.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de la LTR comprende un segmento de ADN que ha sido escindido con Pací a partir de un MDV que presenta todas las características propias de la cepa que ha sido depositada en la ATCC bajo el número de acceso PTA-4945.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de la LTR está insertada hacia el extremo 5' del gen ICP4 de dicho MDV.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE el agente viral es eficaz para provocar una respuesta inmune contra el MDV en un ave, aunque no se caracteriza por una patogenicidad significativa.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, CARACTERIZADO PORQUE el agente viral está asociado a las células.

11. Un método para elaborar un agente viral que es eficaz para proteger un ave de la enfermedad de Marek, CARACTERIZADO PORQUE comprende transformar la cepa del MDV CVI988 con una construcción de ADN exógeno que comprende la secuencia de la LTR de un virus de la reticuloendoteliosis.

12. Un virus de la enfermedad de Marek (MDV) CARACTERIZADO PORQUE ha sido transformado de manera estable con una construcción de ADN exógeno que comprende la secuencia de la repetición terminal larga (LTR) de un virus de la reticuloendoteliosis.

13. El MDV de acuerdo con la reivindicación 12, CARACTERIZADO PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos que presenta una homología de al menos 90% con la secuencia que se detalla en SEQ ID N° 2.

14. El MDV de acuerdo con la reivindicación 13, CARACTERIZADO PORQUE la secuencia de nucleótidos es la que se detalla en SEQ ID N° 2.

15. Una composición inmunológica CARACTERIZADA PORQUE comprende un MDV de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12-14.

16. La composición de acuerdo con la reivindicación 15, CARACTERIZADA PORQUE el MDV es un virus clonal, por lo que no comprende una población mixta de virus progenitores recombinantes.

17. La composición de acuerdo con la reivindicación 16, CARACTERIZADA PORQUE es útil como una vacuna.

18. La composición de acuerdo con la reivindicación 17, CARACTERIZADA PORQUE confiere una tasa de protección de al menos 85%.

19. La composición de acuerdo con la reivindicación 18, CARACTERIZADA PORQUE confiere una tasa de protección de al menos 90%.

20. La composición de acuerdo con la reivindicación 19, CARACTERIZADA PORQUE confiere una tasa de protección de al menos 95%.

21. Una célula aislada CARACTERIZADA PORQUE ha sido transformada de manera estable con un MDV de acuerdo con la reivindicación 13 ó 14.

22. La célula aislada de acuerdo con la reivindicación 15, CARACTERIZADA PORQUE es un fibroblasto embrionario de pollo o de pato (un CEF o un DEF).