MX2014011290A - Lipopeptidos antimicrobianos cortos. - Google Patents

Abstract

Péptidos que presentan actividad biológica y terapéutica, que en particular, son dipéptidos o tripéptidos lipidados que son análogos de los péptidos KPV y KdPT y que presentan actividad antimicrobiana. Más precisamente, los péptidos de acuerdo con la presente invención presentan una actividad antimicrobiana que es superior a la de los tripéptidos originales lisina-prolina-valina y lisina-d-prolina-tirosina. Los péptidos que se describen presentan la fórmula general lípido C12-18-KXZ-NH2, donde K es lisina, X es prolina, d-prolina, histidina o arginina, Z es opcional, y si está presente, es valina, treonina, alanina o leucina, y el grupo COOH en el extremo está amidado con NH2. El lípido C12-18 preferiblemente es una unidad lipidica que se selecciona entre el ácido láurico (C12), el ácido mirístico (C14), el ácido pentadecanoico (C15), el ácido palmítico (C16) y el ácido esteárico (C18). Métodos para usar estos péptidos en el tratamiento de diversas lesiones, inflamaciones o infecciones que son provocadas por bacterias en la piel o en otras superficies mucosas del cuerpo, como es el caso de la cavidad oral.

Description

LIPOPÉP IDOS ANTIMICROBIA OS CORTOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con péptidos que presentan actividad biológica y terapéutica. En particular, la invención se relaciona con dipéptidos o tripéptidos lipidados que son análogos de los péptidos KPV y dPT y que presentan actividad antimicrobiana. Más precisamente, los péptidos de acuerdo con la presente invención presentan una actividad antimicrobiana que es superior a la de los tripéptidos originales lisina-prolina-valina y lisina-d-prolina-tirosina . La invención también se relaciona con métodos para usar estos péptidos en el tratamiento de diversas lesiones, inflamaciones o infecciones que son provocadas por bacterias en la piel o en otras superficies mucosas del cuerpo, como es el caso de la cavidad oral.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los investigadores han estado desarrollando tratamientos y agentes antimicrobianos durante décadas. Recientemente, ha surgido la necesidad de nuevos agentes antimicrobianos con los que pueda tratarse una cantidad cada vez mayor de infecciones que son provocadas por bacterias, virus u hongos resistentes a diversas drogas.

Se han descripto diversos péptidos bioactivos en la literatura científica y en las patentes publicadas. Históricamente, los péptidos han sido aislados a partir de fuentes naturales, y recientemente se los ha sometido a numerosos estudios para determinar la relación entre su estructura y su función. Adicionalmente, los péptidos naturales han servido como puntos de partida para el diseño de análogos peptídicos sintéticos.

En diversas patentes, se describen composiciones cosméticas que comprenden péptidos cortos. Por ejemplo, en la patente US 6492326, se describe la preparación y el uso de composiciones para el cuidado de la piel que comprenden pentapéptidos y otros ingredientes activos para el cuidado de la piel.

Strom et al., 2003 (Journal of Medicinal Chemistry, 46: 1567-1570), describieron péptidos antibacterianos cortos, particularmente péptidos muy cortos (dímeros y trímeros) que comprenden diversas modificaciones químicas. También describieron determinados hexapéptidos . Sin embargo, no han mencionado la actividad antimicrobiana de estos hexapéptidos, ni han descripto su análisis.

La hormona estimuladora de los melanocitos alfa (OÍ-MSH) es un neuropéptido de 13 aminoácidos que presenta una actividad antiinflamatoria potente. Se la produce a través del procesamiento posterior a la traducción de una molécula precursora de mayor tamaño, la pre-opiomelanocortina . Se ha demostrado que el tripéptido en el extremo carboxilo de la a-MSH, que abarca los residuos 11 a 13, KPV, presenta actividad antiinflamatoria in vivo e in vitro (Brzoska, T., Luger, TA., et al., o¡-melanocyte-stimulating hormone and related tripeptides: biochemistry, anti-inflammatory and protective effects in vitro and in vivo, and future perspectives for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases, Endocrine Reviews, 2009, 29 (5) : 581-602) . Se ha descripto un derivado que está relacionado con este tripéptido desde el punto de vista estructural, KdPT (KPT) , que es colineal con los residuos 193-195 de la IL-?ß y que parece poder interactuar con el receptor de la IL-1 del tipo I (Luger, T.A., y Brzoska, T., a-MSH related peptides: a new class of anti-inflammatory and immunomodulating drugs, Ann. Rheum. Dis., 2007; 66 (supl. III): iii52-iii55) . En una publicación, se sugirió que KPV podía presentar un efecto antimicrobiano sobre S. aureus y sobre C. albicans, pero no se indicó que se hubiera determinado su MIC (Cutuli, M., et al., 2000, antimicrobial effects of a-MSH peptides, J. Leukocyte Biology, 67:233-239). A diferencia de KPV, nunca se ha informado que el tripéptido KdPT presente efectos antimicrobianos .

Como consecuencia, existe la necesidad de desarrollar péptidos que presenten una actividad antimicrobiana potente y con un rango amplio, sobre numerosos microorganismos, incluyendo las bacterias Gram negativas y Gram positivas. El costo de la manufactura de los péptidos antimicrobianos también es una consideración fundamental en las aplicaciones farmacéuticas y cosméticas. En esta invención, se describen péptidos antimicrobianos económicos que pueden usarse en composiciones farmacéuticas o cosméticas, que pueden emplearse en el tratamiento o la gestión tópica de aquellas afecciones en la piel que están asociadas a las infecciones de bacterias o de hongos .

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con dipéptidos o tripéptidos lipidados, que son análogos de los péptidos KPV y KdPT y que presentan actividad antimicrobiana. En particular, los péptidos de acuerdo con la presente invención presentan una actividad antimicrobiana que es superior a la de los tripéptidos originales lisina-prolina-valina y lisina-d-prolina-tirosina . La actividad antibacteriana de los péptidos aislados está dirigida contra aquellas bacterias que atacan la piel y las superficies mucosas asociadas. Aunque no se desea limitar la invención a un mecanismo particular, se cree que los péptidos de la invención pueden promover la salud de la piel al inhibir el crecimiento de las bacterias y la inflamación asociada a las infecciones que provocan.

Una forma de realización de la presente invención está relacionada con dipéptidos o tripéptidos lipidados que tienen la fórmula general lipido C12-18- XZ-NH2 , donde K es lisina, X es prolina, D-prolina (el isómero D de la prolina) , histidina o arginina, Z es opcional, y si está presente, es valina, treonina, alanina o leucina, y el grupo COOH en el extremo está amidado con NH2. El péptido está lipidado con un lipido Ci2-i8f que preferiblemente es una unidad lipidica que se selecciona entre el ácido láurico (C12) , el ácido miristico (C14), el ácido pentadecanoico (C15) , el ácido palmitico (C16) y el ácido esteárico (C18). Los grupos lipidíeos más preferidos son el pentadecanoilo y el palmitoilo.

Los dipéptidos o tripéptidos lipidados preferidos incluyen los que se detallan a continuación: lipido Ci2-i8~lisina-prolina-valina-NH2 , lipido Ci2-i8_lisina-d-prolina-treonina-NH2, lipido Ci2-i8_lisina-prolina-alanina-NH2, lipido Ci2-i8-lisina-prolina-leucina-NH2, lipido Ci2-i8-lisina-prolina-NH2 , lipido Ci2-i8_lisina-d-prolina-NH2, lipido Ci2-i8~lisina-histidina-NH2 y lipido Ci2-i8-lisina-arginina-NH2.

Otra forma de realización de la presente invención está relacionada con composiciones que comprenden un vehículo aceptable para aplicaciones farmacéuticas o cosméticas y uno o más de los péptidos que se han descripto. Preferiblemente, el péptido está presente en las composiciones en una concentración de entre aproximadamente 0,1 ug/ml y aproximadamente 20 µ?/??? o de entre aproximadamente 0,1 µ?/p?? y aproximadamente 10% (p/v) . Las formas preferidas para la composición abarcan los aerosoles, las emulsiones, los líquidos, las soluciones acuosas, las lociones, las cremas, las pomadas, los ungüentos, los polvos y las espumas, todos los cuales son apropiados para una aplicación tópica.

La presente invención también está relacionada con métodos para usar las composiciones que se han descripto en el tratamiento o la prevención de las infecciones que son provocadas por las bacterias en la piel de los mamíferos. Típicamente, el método de tratamiento comprende administrar una cantidad eficaz de una composición que comprende un péptido como los que se han descripto sobre las áreas afectadas de la piel (la epidermis) y sobre los tejidos mucosos asociados, durante un periodo de tiempo apropiado. Los métodos de este tipo también pueden ser útiles cuando la infección es provocada por una bacteria que se selecciona del grupo que consiste en P. acnés, S. aureus y E. coli, o bien por C. albicans .

Adicionalmente, los péptidos de acuerdo con la presente invención y las composiciones que los comprenden pueden resultar útiles para incluirlos en formulaciones para el cuidado general de la piel o en formulaciones cosméticas, lo que abarca los diversos tipos de cosméticos para la piel, las cremas para la piel, las lociones, los protectores solares y las cremas o los ungüentos terapéuticos, tales como las formulaciones anti-acné.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Con el objeto de facilitar la comprensión de la invención que se describe en la presente, se provee la siguiente descripción detallada. En general, la invención está relacionada con composiciones y métodos que comprenden dipéptidos o tripéptidos lipidados antimicrobianos, que son análogos de los péptidos KPV y KdPT y que tienen la fórmula general lipido C12-18-KXZ-NH2, donde K es lisina, X es prolina, d-prolina, histidina o arginina, Z es opcional, y si está presente, es valina, treonina, alanina o leucina, y el grupo COOH en el extremo está amidado con NH2.

Ejemplos de ácidos grasos saturados o insaturados que pueden usarse para proveer el componente de los compuestos de acuerdo con la invención que es un lipido C12-18 La hormona estimuladora de los melanocitos alfa (a-MSH) es un neuropéptido de 13 aminoácidos que presenta una actividad antiinflamatoria potente. Se la produce a través del procesamiento posterior a la traducción de una molécula precursora de mayor tamaño, la pre-opiomelanocortina . Se ha demostrado que el tripéptido en el extremo carboxilo de la ot- MSH, que abarca los residuos 11 a 13, KPV, presenta actividad antiinflamatoria in vivo e in vitro (Brzoska, T., Luger, TA., et al., a-melanocyte-stimulating hormone and related tripeptides: biochemistry, anti-inflammatory and protective effects in vitro and in vivo, and future perspectives for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases, Endocrine Reviews, 2009, 29 (5) : 581-602) . Se ha descripto un derivado que está relacionado con este tripéptido desde el punto de vista estructural, KdPT (KPT) , que es colineal con los residuos 193-195 de la IL-?ß y que parece poder interactuar con el receptor de la IL-1 del tipo I (Luger T.A., y Brzoska . , a-MSH related peptides: a new class of anti-inflammatory and immunomodulating drugs, ???. Rheum. Dis., 2007; 66 (supl. III) : iii52-iii55) . En una publicación, se sugirió que KPV podía presentar un efecto antimicrobiano sobre S. aureus y sobre C. albicans, pero no se indicó que se hubiera determinado su MIC (Cutuli, M., et al., 2000, antimicrobial effects of -MSH peptides, J. Leukocyte Biology, 67:233-239). A diferencia de KPV, nunca se ha informado que el tripéptido KdPT presente efectos antimicrobianos.

La determinación de la concentración de inhibición mínima (MIC) se llevó a cabo usando el protocolo de referencia recomendado por el CLSI (Instituto de Referencias Clínicas y de Laboratorio) para los agentes antimicrobianos (Métodos para el análisis de la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos basado en la dilución, para bacterias que se desarrollan de manera aeróbica; Referencia aprobada - Novena edición) . Sorprendentemente, los péptidos KPV y KdPT no presentaron una MIC detectable sobre E. coli, sobre S. aureus o sobre las levaduras en concentraciones de hasta 2000 g/ml.

Este perfil antimicrobiano pobre torna a ambos tripéptidos mucho menos deseables para aquellas aplicaciones terapéuticas o cosméticas en las que es imprescindible la actividad antimicrobiana .

Los péptidos KPV y KdPT fueron modificados mediante una acilación con lípidos con diversas longitudes en el extremo N de su grupo amino alfa. Merced a esta modificación, se generaron moléculas que presentaron una actividad antimicrobiana novedosa, superior e inesperada sobre un amplio espectro de microorganismos. Los lipotripéptidos resultantes presentaron una actividad antimicrobiana sobre las bacterias Gram negativas, sobre las bacterias Gram positivas y sobre las levaduras que fue sorprendentemente superior a la de los péptidos originales. La longitud de los lípidos también afectó esta actividad, y se determinó que los lípidos que comprendieron entre 12 y 18 carbonos fueron los más eficaces. Una vez realizada la lipidación, la MIC sobre P. acnés, sobre S. aureus, sobre E. coli y sobre C. albicans en un caldo de Muller Hinton mejoró notablemente, y varió entre 1 y 64 g/ml. El reemplazo del tercer residuo en Pal-KPV-NH2 por A o L dio como resultado la conservación de la actividad antimicrobiana, lo que motivó la remoción del tercer residuo de aminoácido de KPV o de KdPT. Los lipodipéptidos resultantes, Pal-KP-NH2 y Pal-K-dP-NH2 , presentaron una actividad antimicrobiana novedosa. Además, tanto KP-NH2 como KdP-NH2 presentaron una actividad antiinflamatoria moderada sobre la expresión de la IL-6 inducida por la histamina en queratinocitos cutáneos humanos (datos no presentados) . También se sustituyó el segundo residuo, P o dP, por V, A, F, G, S, H, K, I, L, D, R, S, W o Y. De esta manera, se obtuvo un grupo de lipodipéptidos que nunca habían sido descriptos y que presentaron una actividad antimicrobiana novedosa. Esta actividad antimicrobiana puede ser útil en diversas aplicaciones terapéuticas donde pueden emplearse preparaciones farmacéuticas o cosméticas.

En resumen, la invención se basa en el descubrimiento de determinados lipodipéptidos y lipotripéptidos que derivan de los péptidos KPV, que tienen la fórmula lípido-KXZ, donde el lipido deseablemente se selecciona entre el palmitoílo, el laurilo, el miristrilo, el pentadecanoílo y el estearilo, x puede seleccionarse entre P, G, I, H y R, en una forma enantiomércia L o D, y Z es opcional, y si está presente, es V, T, A o L, y donde hay una amidación en el extremo carboxilo. Estos lipopéptidos cortos son agentes antimicrobianos novedosos que tienen efectos sobre las bacterias Gram positivas y Gram negativas, tales como Escherichia coli {E. coli) , Staphylococcus aureus (S. aureus) o Propionibacterium acnés (P. acnés), sobre dermatofitos como Trichophyton spp. y sobre levaduras como Candida spp., lo que abarca C. albicans, C. glabrata y C. tropicalis .

Los lípidos que se mencionaron con anterioridad, que están unidos al dipéptido o al tripéptido a través de un enlace de amida, es decir, a través de un enlace peptidico convencional, se abrevian como se detalla a continuación: mir representa el ácido miristico, pen representa el ácido pentadecanoico, pal representa el ácido palmitico, ste representa el ácido esteárico y lau representa el ácido láurico. La forma dextro de los aminoácidos se abrevia "d". Por ejemplo, la forma dextro de la prolina es la d-prolina. Las abreviaturas convencionales de los aminoácidos se detallan a continuación.

Pueden hallarse detalles sobre la formulación y la administración de los fármacos en la última edición de Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co, Easton, PA) . Aunque la administración tópica local resulta deseable, hay otros medios disponibles para efectuar la administración, que abarcan la administración oral, parenteral, en aerosol, intramuscular, subcutánea, transcutánea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal e intranasal. Las formulaciones de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse con numerosos vehículos, por ejemplo, en forma de atomizaciones, aerosoles, emulsiones de agua en aceite o de aceite en agua, cremas faciales o corporales, lociones bronceadoras o protectores solares. Adicionalmente, los péptidos de acuerdo con la presente invención y las composiciones que los comprenden pueden resultar útiles para incluirlos en formulaciones para el cuidado general de la piel o en formulaciones cosméticas, lo que abarca los diversos tipos de cosméticos para la piel, las cremas para la piel, las lociones, los protectores solares y las cremas o los ungüentos terapéuticos, tales como las formulaciones antiacné .

Tal como se lo emplea en la presente, el término "terapéutico" se aplica a aquellos agentes que son útiles para tratar, combatir, mejorar, prevenir o paliar una afección o una enfermedad en un paciente. Las afecciones que pueden tratarse de acuerdo con la presente invención abarcan las infecciones en la piel o en las regiones mucosas de los mamíferos, tales como los seres humanos, que son provocadas por diversas bacterias. Los métodos que se describen también pueden ser útiles cuando las infecciones son provocadas por bacterias u hongos que se seleccionan entre P. acnés, S. aureus, E. coli y C. albicans.

En función de la aplicación específica que se contemple, la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención podrá formularse como una solución, una suspensión, una preparación parenteral, un ungüento, una crema, una loción, una atomización, un polvo, una tableta o una cápsula. Las preparaciones parenterales pueden comprender vehículos como el agua destilada libre de pirógenos, los amortiguadores a base de fosfato o la solución salina normal. Los ungüentos, las cremas las lociones y las atomizaciones pueden comprender vehículos que pueden seleccionarse entre los aceites vegetales o minerales, la vaselina blanca o los alcoholes con pesos moleculares elevados, es decir, con más de 12 átomos de carbono. Las tabletas y las cápsulas pueden comprender diluyentes (tales como la lactosa) , aglutinantes, lubricantes (tales como el ácido esteárico) o desintegrantes (tales como el almidón de maíz) .

También es posible incluir uno o más péptidos lipidados de acuerdo con la presente invención en una atomización bucal que contiene una cantidad eficaz de otro agente activo. Este material puede atomizarse en el interior de la boca o sobre la superficie de las encías de cada cuadrante, entre 1 y 3 veces por día, en alícuotas de entre 0,25 y 0,5 mi, de manera tal que pueda actuar como agente antimicrobiano. En el caso de los pacientes que usen dentaduras postizas, la atomización podrá aplicarse diariamente, directamente en la superficie de la dentadura, antes de insertarla en la boca. Si se lo desea, podrá elaborarse una formulación que sea útil como enjuague bucal y que comprenda una cantidad eficaz de un agente antimicrobiano de acuerdo con la invención.

Las composiciones de acuerdo con la presente invención también pueden comprender vehículos aceptables para aplicaciones farmacéuticas o dermatológicas. Los ejemplos de vehículos de este tipo incluyen las emulsiones y los geles. Las emulsiones frecuentemente son mezclas de una fase oleosa y una fase acuosa. Las composiciones también pueden comprender materiales abrasivos exfoliantes, estabilizadores o compuestos para controlar la espuma.

Las composiciones también pueden comprender uno o más componentes activos para cuidar la piel. Los ejemplos de componentes activos para cuidar la piel incluyen los agentes activos para remover las escamas, los agentes activos antiacné, los compuestos que están basados en la vitamina B3, los retinoides (tales como el retinol, el retinal, los esteres de retinol, el propionato de retinilo, el ácido retinoico o el palmitato de retinilo) , los hidroxiácidos , los capturadores de radicales, los quelantes los agentes antiinflamatorios, los anestésicos tópicos, los agentes activos que son útiles para el bronceado, los agentes para aclarar la piel, los agentes anticelulíticos, los flavonoides, los agentes activos antimicrobianos, los agentes para curar la piel, los agentes activos antifúngicos, el farnesol, el fitantriol, la alantoina, el ácido salicilico, la niacinamida, el dexpantenol, el acetato de tocoferol y la glucosamina.

Las composiciones también pueden comprender compuestos bloqueadores solares. Los ejemplos de compuestos bloqueadores solares abarcan los compuestos bloqueadores solares inorgánicos y los compuestos bloqueadores solares orgánicos. Los compuestos bloqueadores solares inorgánicos abarcan los óxidos metálicos, tales como el óxido de cinc, el óxido de titanio o el óxido de hierro. Los compuestos bloqueadores solares orgánicos abarcan el metoxicinamato de octilo, el salicilato de octilo, el ácido tereftalideno dicanforsulfónico, la avobenzona y el octocrileno.

Materiales y métodos 1. Síntesis de los péptidos. Los péptidos que se han descripto se sintetizaron sobre la base de una reacción química en una fase sólida con Fmoc (9-fluorenulmetoxicarbonilo) convencional. Los péptidos se prepararon como secuencias amidadas o como aminoácidos libres, mediante el uso de aminoácidos convencionales. 2. Cepas de bacterias y condiciones del cultivo. Las cepas de bacterias que se emplearon en este estudio se detallan en la tabla 1. Las bacterias E. coli UB1005 y S. aureus SAP0017 (MRSA) y la levadura C. albicans 105 se cultivaron en placas con agar Mueller Hinton (MH, de Difco, BD Biosciences, MD) , en un caldo (que comprendió 2 g de extracto de carne, 17,5 g de caseína hidrolizada con ácido y 1,5 g de almidón por litro) a 37°C, a menos que se indique lo contrario. Las bacterias de las soluciones madre congeladas se subcultivaron en placas con agar MH fresco, antes de analizar su susceptibilidad. En el caso de P. acnés, el cultivo se realizó en una infusión de cerebro y corazón BBL™ (de Becton, Dickinson & Company, Sparks, MD) o en placas con agar a 37°C, bajo condición anaeróbicas, para lo cual se usó un recipiente anaeróbico y un dispositivo AnaeroGen™ (de Oxoid, Basingstoke, Hampshire, Inglaterra) . 3. Determinación de la actividad antimicrobiana . La concentración de inhibición mínima (MIC) de cada péptido se determinó usando un análisis basado en la microtitulación de caldo diluido del CLSI modificado (Métodos para el análisis de la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos basado en la dilución, para bacterias que se desarrollan de manera aeróbica; Referencia aprobada - Novena edición) . Para las levaduras, se usó un inoculo que comprendió 105-106 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml o 104 CFU/ml. El valor de la MIC se basó en la concentración más baja del péptido que dio como resultado una inhibición de más de 90% del crecimiento de los microbios, después de entre 15 y 20 horas de incubación a 37°C. Para P. acnés, la incubación se llevó a cabo bajo condiciones anaeróbicas, a 37°C durante 2 semanas, antes de determinar la MIC. La cinética de la exterminación se determinó con un microorganismo indicador, en presencia de una concentración determinada de cada péptido (aproximadamente entre 2 y 5 veces la MIC) . Después de realizar la dilución apropiada, las células se sembraron en placas con agar en intervalos de tiempo definidos, y se las incubó a 37 °C durante la noche. En el caso de P. acnés, fue necesario un periodo de incubación más prolongado. Se contaron las CFU y se representó el resultado como la supervivencia de las bacterias después del tratamiento con el péptido en función del tiempo, de manera tal de reflejar la efectividad de los péptidos en la exterminación de los microbios . 4. Determinación de la toxicidad sobre el tejido cutáneo. La toxicidad sobre la piel y la compatibilidad con ella se determinaron con tejido cutáneo EpiDerm (EPI-200) y el conjunto de elementos MTT (MTT-100, de MatTek, Ashland, MA) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como control positivo (tóxico), se usó Tritón X-100 al 1%, y como control negativo (no tóxico), se usó PBS. 5. Análisis del perfil de los genes. Los 84 genes que codificaban las moléculas que participan en la adhesión a la matriz extracelular en los fibroblastos dérmicos humanos se analizaron sobre la base de una serie de PCR, que se llevó a cabo en Sunny Biodiscovery, Inc. (Santa Paula, CA) . Los fibroblastos dérmicos humanos se obtuvieron en Zen-Bio, Research Triangle Park, NC (cat. N° DF-F, lote N° DFMF112410) . Las células (que habían sido sometidas a una cantidad baja de pasajes) fueron cultivadas en DMEM con 10% de FCS, sin rojo fenol, hasta que alcanzaron la etapa de la confluencia, después de lo cual se las incubó por duplicado con los compuestos de prueba, en una concentración de 3, 5 ó 10 pg/ml, o bien en agua, durante 24 horas. Una vez completa la incubación, las células se observaron bajo un microscopio invertido Nikon TS. Se determinó que ninguna de las condiciones experimentales produjo citotoxicidad. Mediante el análisis cualitativo, se determinó que más células experimentaron mitosis en presencia de los compuestos de prueba en una concentración de 5 pg/ml que en una concentración de 10 pg/ml, por lo que se seleccionó una concentración de 5 yg/ml para extraer el ARN.

Una vez terminado el periodo de incubación, las células se conservaron en una solución RNAlater (de Ambion, Austin, TX) durante 6 horas. El ARN se extrajo y se purificó con el conjunto de elementos NucleoSpin RNA II, de Machery-Nagel, Bethleem, PA. El ARN purificado total se analizó a 230 nm, a 260 nm y a 280 nm con un espectrofotómetro con una serie de diodos HP-8452A, de Agilent. La concentración del ARN fue idéntica en todas las muestras, y la expresión de los genes de interés se determinó por medio de una PCR cuantitativa en tiempo real, mediante el uso del sistema de detección iCycler iQ, de BioRad, con las series de PCR PAHS-013A (www. sabiosciences . corrí/rt_pcr_product/HTML/PAHS-013A. html) , el conjunto de elementos para sintetizar las primeras cadenas, la mezcla maestra SYBR y las condiciones para poner en práctica la PCR de Qiagen (que anteriormente era SA Biosciences) . Con el propósito de analizar los resultados, se empleó el método para analizar la eficiencia ACt, asi como el software de análisis de datos para series de PCR Profiler RT2, versión 3.5, después de normalizar la expresión de los genes en función de la expresión que presentaron cinco genes de mantenimiento.

Resultados y discusión Se sabe que los tripéptidos KPV y KdPT presentan actividad antiinflamatoria tanto in vitro como in vivo. También se había informado que el tripéptido KPV presenta actividad antimicrobiana sobre S. aureus y sobre C. albicans en un amortiguador de fosfato (Cutulis, M., et al., Antimicrobial effects of -MSH peptides, J. Leukocyte Bio., 2000, 67:233-239). Sin embargo, nunca se había determinado o informado el valor de la MIC para el tripéptido KPV. Por otro lado, se desconocía si KdPT presentaba efectos antimicrobianos .

Se analizó la actividad antimicrobiana de los péptidos KPV y KdPT en un medio de cultivo, mediante el uso del análisis de microdilución de caldo recomendado por el CLSI, que es un ensayo de referencia para determinar la MIC in vitro, tanto para antibióticos como para antifúngicos (Métodos para el análisis de la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos basado en la dilución, para bacterias que se desarrollan de manera aeróbica; Referencia aprobada - Novena edición) . Sorprendentemente, no se observó que los péptidos KPV (HB2067, HB2068) y KdPT (HB2089, HB2090) , con una amidación el extremo C o sin ella, presentaran una MIC detectable en una concentración de hasta 2000 pg/ml en el caldo MH (tabla 1) . Esto fue consistente con el descubrimiento de Rauch et al., que habían determinado que los péptidos KPV no daban como resultado la inhibición del crecimiento de levaduras C. albicans de la cepa SC5314 en una concentración de 100 µ , lo cual había sido determinado mediante un análisis de laboratorio de la susceptibilidad a los antifúngicos (Rauch, I., Holzmeister, S., y Kofler, B., Anti-Candida activity of alfa-melanocyte-stimulating hormone (alfa-MSK) peptides, J. Leukoc. Biol., 2009, 85 (3) : 371-372) .

Se modificaron los péptidos KPV y KdPT con lípidos con diversas longitudes, de manera tal de elaborar análogos que presentaran un perfil antimicrobiano superior. A través de la acilación del núcleo de los tripéptidos, fue posible obtener resultados sorprendentes. La longitud de los lípidos parece ser fundamental, y en la tabla 2 se proveen los resultados que se obtuvieron con el péptido KPV.

Los lípidos que comprenden entre 11 y 18 átomos de carbono parecen tener una influencia positiva sobre la actividad antimicrobiana de los péptidos KPV y KdPT (tablas 1 y 2) . Se determinó que la longitud óptima para los lípidos que se aplican a los péptidos KPV y KdPT es de entre 15 y 16 átomos de carbono (tablas 1 y 2) . Estos lípidos dan como resultado un incremento significativo en la actividad antimicrobiana de los dos péptidos sobre diversos microorganismos, tales como las bacterias Gram positivas, las bacterias Gram negativas o las levaduras (en las tablas 1 y 2, pueden observarse los resultados que se obtuvieron con SEQ ID N° 5 (HB2178), 7 ó 24 (HB2180 o HB2200) , 17 (HB2192) y 23 (HB2199) ) . De hecho, los lipopéptidos dieron como resultado una mejora en un factor de prácticamente 2000 en la MIC sobre P. acnés, sobre S. aureus, sobre E. coli y sobre C. albicans, que varió entre 1 y 64 g/ml, en comparación con los tripéptidos originales solos (KPV-NH2 y KdPT-NH2) , que no presentaron actividad en concentraciones de hasta 2000 pg/ml (tabla 1) . El incremento de la longitud de los lipidos hasta 18 átomos de carbono dio como resultado una anulación selectiva de la actividad sobre las bacterias Gram negativas, sin que se viera afectada la actividad sobre las bacterias Gram positivas y sobre las levaduras (tablas 1 y 2). Por otra parte, se sustituyó el tercer aminoácido en Pal-KPV-NH2 por A o L para obtener SEQ ID N° 30 (HB2208) o 31 (HB2209) , respectivamente. Vale destacar que SEQ ID N° 30 y 31 presentaron una actividad antimicrobiana con un espectro amplio, por lo que podría inferirse que el tercer residuo de Pal-KPV-NH2, V, podría no ser imprescindible para la actividad antimicrobiana que se observó. Además de la actividad con un espectro amplio que se observó, que se vio reflejada en la MIC, los análogos SEQ ID N° 5 (HB2178), 7 (2180), 30 (HB2208) y 31 (HB2209) presentaron una actividad de exterminación notable, ya que eliminaron 5-6 logaritmos de S. aureus en un período de 20 minutos en el análisis correspondiente (tabla 3) . En resumen, la unión de lípidos con entre 12 y 18 átomos de carbono a KPV-NH2 o KdPT-NH2 dio como resultado lipotripéptidos que presentaron una actividad antimicrobiana novedosa con un espectro amplio, que no había sido descripta con anterioridad. El tercer residuo en Pal-KPV-NH2 o en Pal-KdPT-NH2 podría no ser crucial para la actividad antimicrobiana novedosa que se observó. La amidación en el extremo C fue fundamental para la actividad antimicrobiana que se ha descripto, ya que los compuestos no amidados, por ejemplo, HB2184 y HB2182, presentaron una actividad mucho menor o nula.

Debido a que la sustitución del tercer residuo de Pal-KPV-NH2 por A o L no dio como resultado la anulación de la actividad, se llevaron a cabo otras modificaciones. De esta manera, se removió el tercer residuo de aminoácido de Pal-KPV-NH2 y de Pal-KdPT-NH2 , con el fin de obtener los lipodipéptidos SEQ ID N° 26 (HB2202) y SEQ ID N° 27 (HB2203) . Los dos derivados presentaron una actividad antimicrobiana novedosa, que fue similar a la de los lipotripéptidos originales, Pal-KPV-NH2 y Pal-KdPT-NH2 (tabla 1) . Esta actividad fue inesperada, y no habia sido descripta con anterioridad. Sobre la base de la cinética de la exterminación, puede inferirse que los dos lipodipéptidos derivados presentaron una actividad de exterminación similar, ya que dieron como resultado la eliminación de más de 5 logaritmos de microorganismos, incluyendo P. acnés, S. aureus, E. coli y la levadura C. albicans, 20 minutos después de un contacto directo en PBS (tabla 3) . La actividad antimicrobiana de los lipodipéptidos que se describen en esta invención también se reflejó en el hecho de que ambos pudieron exterminar una proporción significativa de S. aureus en presencia de 10% suero fetal bovino (tabla 3) , lo cual resulta particularmente significativo. Los antibióticos peptidicos frecuentemente resultan problemáticos, debido a que pueden interferir con las proteínas del huésped y pueden unirse a ellas, lo que da como resultado una disminución en la actividad antimicrobiana. Si se tiene en cuenta que los cortes en la piel y determinadas heridas, tales como las lesiones que son provocadas por el acné, frecuentemente están acompañadas por la infiltración de suero en el área afectada, puede concluirse que la actividad antimicrobiana en el suero es muy importante para los agentes terapéuticos candidatos.

Para asegurar que Pal-KP-NH2 presentara un diseño apropiado para obtener una actividad óptima, se cambió la posición de P y de , de manera tal de generar HB2251 (Pal-PK-NH2) y HB2255 (Pal-PK-OH) . Pal-PK-NH2 presentó 1/8 de la actividad de Pal-KP-NH2. Los derivados no amidados, Pal-PK-OH y Pal-KP-OH, fueron inactivos, por lo que podría inferirse que la amidación en el extremo C es crítica para la actividad antimicrobiana .

Se analizó el potencial de provocar irritaciones dérmicas de los lipodipéptidos mediante el uso del modelo de piel EpiDerm™ (de MatTek, Ashland, MA) , en combinación con un análisis de MTT modificado. El modelo de piel EpiDerm™ presenta características morfológicas y de crecimiento que son similares a las que se observan in vivo, que son uniformes y altamente reproducibles . EpiDerm™ consiste en capas básales, espinosas, granulares y cornificadas organizadas que son análogas a las que pueden observarse in vivo. Los tejidos fueron tratados con cada compuesto en la concentración deseada durante 20 horas. En la tabla 1, puede observarse que ninguno de los lipopéptidos seleccionados, HB2202, HB2203, HB2180, HB2208 y HB2209, presentó efectos negativos sobre la viabilidad de los tejidos, en una concentración de hasta 2000 g/ml.

Sobre la base de los resultados que se obtuvieron con los lipodipéptidos novedosos HB2202 y HB2203, se extendieron las modificaciones al sustituir el segundo residuo de Pal-KP-NH2 y de Pal-K-dP-NH2 por V, A, F, G, L, S, H, K, I, S, R, T, Y o W. En la tabla 1, puede observarse que, por medio de esta modificación, fue posible descubrir un grupo extendido de lipodipéptidos novedosos que presentan una actividad antimicrobiana con un espectro más amplio (Pal-KH-NH2, Pal-KR-NH2 y Pal- R-OH) o una actividad con una selectividad mayor por las bacterias Gram positivas (Pal-KG-NH2, Pal-KL-NH2 y Pal-KI-NH2; véase la tabla 1).

Se seleccionaron tres compuestos representativos, SEQ ID N° 26 (HB2202), SEQ ID N° 41 (HB2242) y SEQ ID N° 55 (HB2259), para llevar a cabo un análisis del perfil genético en fibroblastos dérmicos humanos. En la tabla 4, puede observarse que los tres compuestos presentaron tendencias/patrones similares en términos de la influencia sobre los fibroblastos dérmicos humanos. Los genes afectados fueron aquellos que estaban relacionados con la curación de las heridas y con las cascadas antifibróticas . Los compuestos tuvieron influencia sobre las integrinas, ya que se observó que HB2202 y HB2242 dieron como resultado una regulación positiva de la expresión de ITGA2 (la integrina alfa 2) , mientras que HB2259 indujo la expresión de ITGA6 (la integrina alfa 6; véase la tabla 4) . Las integrinas se unen al colágeno y tienen una participación importante en las interacciones entre las células y la matriz. Estas proteínas presentan una expresión abundante en los queratinocitos básales en la piel intacta, y son imprescindibles para el desarrollo del epitelio nuevo en las heridas en la piel humana. Los compuestos también modularon la expresión de ADAMTS (la metalopeptidasa de Adam con trombospondina del tipo 1) y THBS3 (la trombospondina; véase la tabla 4), que participan en la curación de las heridas. A través de estudios basados en modelos animales, se demostró que la regulación negativa de la trombospondina en ratones nulos para THBS dio como resultado un incremento en la arteriogénesis , en la angiogénesis y en la recuperación del flujo sanguíneo después de una isquemia, en comparación con los ratones de control (Kyriakides , T.R., y MacLauclan, S., The role of thrombospondins in wound healing, ischemia, and the foreign body reaction, J. Cell Commun. Signal, 2009. 3:215-225). En la tabla 4, también puede observarse que los tres compuestos dieron como resultado una regulación negativa significativa de la expresión del CTGF (el factor de crecimiento del tejido conectivo) y de CTNNDl (la catenina) . Tanto el CTGF como CTNNDl están asociados a la actividad fibroproliferativa, y se ha observado un nivel de expresión elevado de ambos en trastornos como los queloides y las cicatrices hipertróficas (HTS; Poon, R. , et al., Catenin driven neoplastic and reactive fibroproliferative disorders, PLoS One, 2012; 7:e37940). Las HTS son provocadas por aberraciones en los procesos fundamentales que tienen lugar durante la curación de las heridas, lo que da como resultado una producción excesiva de colágeno en los fibroblastos. Las quemaduras, las lesiones traumáticas y los procedimientos quirúrgicos frecuentemente dan como resultado HTS. Las infecciones en las heridas también pueden provocar HTS una vez que se eliminan los agentes infecciosos, tales como las bacterias y los hongos, con agentes antimicrobianos. Los lipodipéptidos también actúan sobre KALl (tabla 4). Esto resulta particularmente interesante, ya que se ha descubierto que las proteínas que son codificadas por el gen KALl participan en la modulación de la densidad de los nervios epidérmicos en la dermatitis atópica. La sobreexpresión de KALl inhibe el crecimiento de las neuritas, lo cual puede dar como resultado la inhibición de la hiperinervación y la percepción de picazones anormales en el contexto de la dermatitis atópica (Tengara, S., et al., Keratinocyte-derived anosmin-1, an extracellular glycoprotein encoded by the X- linked allmann syndrome gene, is involved in modulation of epidermal nerve density in atopic dermatitis, J. Dermatol. Sci., 2010. 58:64-71). En conclusión, además de la actividad antimicrobiana con un espectro amplio que se ha mencionado, los lipopéptidos cortos que se describen en la presente pueden activar las células dérmicas humanas para promover la curación de las heridas y la actividad antifibrótica, por lo que pueden resultar beneficiosos para potenciar la recuperación de las heridas después de un tratamiento antimicrobiano .

Tabla 1. Actividad antimicrobiana y toxicidad sobre el tejido cutáneo de los análo os de los péptidos KPV Tabla 2. Efecto de la longitud de los lipidos sobre la actividad antimicrobiana de PV-NH2 Tabla 3. Cinética de la exterminación de análogos seleccionados de los péptidos KPV Tabla 4. Análisis del perfil genético en fibroblastos dérmicos humanos Símbolo Nombre del gen Cambio en veces (péptido en comparación con el control con PBS) Regulación positiva (+) o negativa (-) HB2202 HB2242 HB2259 ADAMTS Metalopeptidasa de 3.8106 .7899 2.4284 Adam con Los ejemplos más adelante se proveen para demostrar determinadas formas de realización preferidas de la invención .

Las infecciones en las heridas son un problema significativo, que se exacerba al incrementarse la frecuencia de aparición de patógenos resistentes a múltiples drogas, tales como las cepas de MRSA. La presente invención puede ser útil, tanto desde el punto de vista terapéutico como desde el punto de vista cosmético, para tratar, mejorar o prevenir aquellas afecciones en la piel que están asociadas a las bacterias, que incluyen el acné, la dermatitis atópica o la rosácea, asi como aquellas que están asociadas a los hongos, que incluyen la caspa y el pie de atleta.

S. aureus es una causa importante de las infecciones que se contraen en los hospitales, que en la mayoría de los casos están asociadas al torrente sanguíneo, a la piel o a los tejidos blandos, así como de la neumonía que está asociada a los ventiladores o a los catéteres. El incremento en las infecciones que son provocadas por cepas de S. aureus que son resistentes a la meticilina (MRSA) resulta particularmente preocupante, especialmente en los Estados Unidos, donde la prevalencia de estos trastornos es superior a 55% en las unidades de terapia intensiva. Esto se traduce en una prolongación de las estadías en los hospitales, en un incremento del costo asociado y en un incremento en el riesgo de muerte. Las cepas de MRSA que se contraen de manera habitual (CA-MRSA) , cuyo genotipo es diferente del de las cepas de HA-MRSA, también son una amenaza establecida para los pacientes que no presentan factores de riesgo tradicionales. Además de S. aureus, la bacteria Gram positiva Streptococcus pyogenes es una causa importante de complicaciones en la piel y de infecciones en su estructura (SSTI) . La presente invención podría ser de utilidad en la prevención o el tratamiento de aquellas infecciones que están asociadas a las cepas de MRSA.

El acné vulgar es una enfermedad común en la piel humana, que se caracteriza por áreas de la piel que presentan seborrea, comedones, pápulas, pústulas, nodulos y posiblemente cicatrices. Las áreas que pueden ser afectadas por el acné vulgar incluyen la cara, la parte superior del pecho y la espalda. El acné severo es inflamatorio, pero el acné también puede manifestarse en formas no inflamatorias. La bacteria Propionibacterium acnés puede provocar inflamaciones que se manifiestan como lesiones en la dermis alrededor de los microcomedones o de los comedones, que dan como resultado el enrojecimiento y eventualmente la cicatrización o la hiperpigmentación de la piel. Los lipopéptidos antimicrobianos cortos de acuerdo con la invención podrían usarse para combatir estros trastornos, en cuyo caso podrían tomar la forma de lancetas, espumas, pañuelos, cremas, lociones, atomizaciones, cartuchos o artículos de limpieza. Otro uso potencial sería en combinación con otros compuestos de uso actual, tales como, sin limitaciones, el ácido salicílico o los retinoides.

El término "foliculitis" se emplea para hacer referencia a las inflamaciones que pueden ocurrir en uno o más folículos capilares en cualquier parte de la piel. Abarca la pseudofolliculitis barbae, que se manifiesta como protuberancias en la piel, y la foliculitis en el cuero cabelludo, que es especialmente prominente en los hombres afroamericanos. Los casos leves tienden a caracterizarse por picazón, mientras que los casos severos pueden dar como resultado cicatrices profundas. Esta enfermedad es causada por bacterias que ingresan en la piel a través de aberturas pequeñas en los folículos capilares. En la mayoría de los casos de foliculitis, los folículos dañados se encuentran infectados por bacterias del género Staphylococcus . La picazón en la barba puede deberse a una infección de estafilococos en los folículos capilares que se hallan en el área donde se desarrolla la barba, usualmente alrededor del labio superior. La tinea barbae es similar a la picazón en la barba, pero la infección es provocada por un hongo. Bajo determinadas condiciones, por ejemplo, mediante el uso de un jabón antibacteriano o un champú para combatir la foliculitis en el cuero cabelludo, puede reducirse la incidencia de esta afección. Por otro lado, para tratar las irritaciones y las protuberancias se ha usado la hidrocortisona, un antibiótico, o las cremas a base de tretinoína. Los lipodipéptidos antimicrobianos de amplio espectro que se describen en la presente podrían ser útiles en el combate de los trastornos que están asociados al daño en los folículos, al bloqueo de los folículos, al daño que se provoca durante la afeitada o a la fricción que se provoca contra la vestimenta en el cuerpo o contra los cascos o sus componentes, entre otros, que pueden ocurrir en el cuello, en la ingle o en el área genital .

La caspa es una afección frecuente en el cuero cabelludo, que se caracteriza por picazón y descamación en la piel afectada. Hay diversas especies conocidas de levaduras del género Malassezia que provocan enfermedades en la piel de los seres humanos, entre las cuales se encuentra la caspa, la pitiriasis versicolor, la dermatitis seborreica, la psoriasis y la dermatitis atópica. La tinea capitis, que también se conoce como el gusano redondo del pelo o del cuero cabelludo, es de hecho una infección superficial que es provocada por un hongo. Esta enfermedad es causada primariamente por dermatofitos de los géneros Trichophyton y Microsporum que invaden las vainas del cabello. Los casos de infecciones de Trichophyton predominan desde América Central hasta los Estados Unidos, así como en diversas partes de Europa occidental. La enfermedad es infecciosa y puede ser transmitida por los seres humanos, por diversos animales o por los objetos donde se aloja el hongo. Puede haber portadores no sintomáticos, es decir, individuos en cuyo cuero cabelludo se ha alojado el hongo sin provocar signos o síntomas clínicos. El pie de atleta, que también se conoce como el gusano redondo del pie o tinea pedís, también es una infección en la piel, en este caso la piel de los pies, que es provocada por un hongo del género Trichophyton y que se caracteriza por descamación y picazón en las áreas afectadas. En algunos casos, puede haber una infección bacteriana secundaria que acompaña a la infección fúngica. Los antifúngicos , tales como la terbinafina, el itraconazol o el fluconazol, están ganando aceptación para su tratamiento. Los lipodipéptidos que se describen en la presente, que se caracterizan por una actividad contra un espectro amplio de bacterias y de hongos, podrían ser útiles en el tratamiento, la prevención y la resolución por vía tópica de las afecciones que se han mencionado.

La dermatitis atópica (AD) es un trastorno prurítico inflamatorio, no contagioso, que afecta a la piel y que presenta una recurrencia crónica. Lo padecen 15-30% de los niños y 2-10% de los adultos. En ocasiones, se lo conoce como eccema o eccema atópico. La dermatitis atópica es más común en los bebés y en los niños. Se caracteriza por la presencia de prurito, lesiones eccematosas, xerosis (sequedad en la piel) y liquenificación (un engrosamiento de la piel y un incremento en la cantidad de marcas en ella) . Las bacterias más comunes que se hallan en la piel con AD son S. aureus. De hecho, más de 90% de los pacientes que padecen AD han sido colonizados por S. aureus en la piel lesionada y no lesionada, en comparación con la colonización de 5% que se observa en la piel saludable. La epidermis de la piel afectada por la AD presenta una función de barrera defectuosa, asi como una deficiencia en el sistema inmune innato, lo que puede manifestarse a través de una disminución en la expresión de los péptidos antimicrobianos. Los lipopéptidos que se describen en la presente presentan tanto actividad antimicrobiana como actividad antiinflamatoria, por lo que podrían ser una alternativa para combatir la AD.

El término "halitosis", que es sinónimo de "mal aliento", hace referencia a un olor notablemente desagradable que se percibe al exhalar. Se estima que la halitosis es la tercera razón más frecuente que motiva a buscar cuidado dental, después del deterioro de los dientes y la enfermedad periodontal. El mal aliento y la enfermedad de las encías son provocados por bacterias Gram negativas como Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actinomycetemcomitans o Bacteroides spp. Estas bacterias también provocan inflamaciones severas en el recubrimiento epitelial de la cavidad oral. Los péptidos antiinflamatorios con actividad selectiva sobre las bacterias Gram negativas resultarían ideales para mantener una boca saludable.

El triclosán es un compuesto aromático clorado que presenta propiedades antibacterianas, antifúngicas y antivirales. Se lo emplea en diversos productos hogareños de uso habitual, como es el caso de los jabones, los enjuagues bucales, los detergentes para la vajilla, las pastas dentales, los desodorantes o los enjuagues para las manos. Se ha sugerido que es posible combinar el triclosán con cloro en agua corriente para formar cloroformo, que es clasificado por la Agencia de Protección del Ambiente de los Estados Unidos como un carcinógeno humano potencial, lo que significa que puede provocar cáncer. Los lipodipéptidos antimicrobianos que se describen en la presente podrían usarse para reemplazar el triclosán, de manera tal de obtener los efectos antibacterianos y antifúngicos deseados, sin el riesgo de que se desarrolle un cáncer.

Por otro lado, el olor del cuerpo también se encuentra bajo la influencia de las acciones de diversos miembros del género Corynebacterium. En este contexto, los compuestos de acuerdo con la invención, que presentan propiedades antimicrobianas, pueden incorporarse en polvos, geles, semisólidos, cremas u otras formas cosméticas, por ejemplo, en desodorantes para las axilas o para los pies.

La vaginosis bacteriana (BV) es la causa más importante del conjunto de infecciones en la vagina que se conocen como vaginitis. Normalmente, no se la considera una infección de transmisión sexual. La vaginosis bacteriana afecta a entre 20% y 70% de las mujeres. Un olor fuerte y la presencia de una descarga anormal desde la vagina son los síntomas más comunes de la enfermedad, además de la percepción de picazón e irritación. La candidiasis vaginal es una infección en la vagina que se caracteriza por un crecimiento excesivo de una levadura (es decir, un hongo) que se conoce como Candida. Esta levadura normalmente está presente en la boca, en el intestino y en la vagina, al igual que numerosos organismos.

Si se altera el equilibrio entre los microorganismos, lo que puede ocurrir cuando se toman antibióticos de amplio espectro, en presencia de fluctuaciones hormonales o bajo otras condiciones, las levaduras pueden desarrollarse de manera excesiva. La candidiasis vaginal, que comúnmente se conoce como una "infección de levaduras", es un problema habitual, ya que afecta a 75% de las mujeres adultas durante su vida. A las inflamaciones vaginales también están asociadas otras especies de Candida que son diferentes de C. albicans, como es el caso de C. glabrata o C. tropicalis, asi como los estrecptococos del grupo B y los que son responsables del herpes. La gravedad de estos trastornos puede variar, y en particular, éstos pueden empeorar a causa de la pérdida de Lactobacillus spp, que es un comensal natural que opera como barrera protectora contra los patógenos oportunistas. En este contexto, los péptidos antimicrobianos que se describen en la presente podrían ser útiles para controlar los microbios que se han descripto, en cuyo caso podrían tomar la forma, por ejemplo, de lubricantes o productos para la higiene femenina.

Durante la manufactura de los cosméticos o las lociones, suelen agregarse conservantes para exterminar las bacterias y para prolongar la vida de almacenamiento. Sin embargo, algunos conservantes provocan irritación u otras reacciones alérgicas, y en algunos estudios, se han asociado estos agentes al cáncer y a otros problemas en la salud. Los conservantes basados en parabenos sintéticos, tales como el metilparabeno, el butilparabeno o el etilparabeno, pueden hallarse en más de 70 por ciento de los cosméticos, las lociones para la piel y los desodorantes. Los conservantes del tipo de los parabenos tienen efectos similares a los del estrógeno. Incluso en cantidades pequeñas, estas sustancias químicas potentes pueden desequilibrar el sistema hormonal del cuerpo. Un desequilibrio en el estrógeno desencadenado por medios artificiales puede dar como resultado un cáncer de mama en las mujeres o una deficiencia en la testosterona en los hombres jóvenes. En la industria de los cosméticos, también suele emplearse formaldehído como conservante. Aun cuando la cantidad de formaldehído que se agregue a un cosmético sea pequeña, es posible que dé como resultado una reacción alérgica en aquellos usuarios que sean sensibles a él. Por lo tanto, una de las aplicaciones potenciales de los lipodipéptidos antimicrobianos que se describen en la presente podría ser como conservantes en los cosméticos, en reemplazo de las sustancias químicas nocivas, particularmente a causa de su costo reducido.

Las composiciones que se emplean para administrar los péptidos en el método que se describió con anterioridad pueden tomar la forma de un aerosol, una emulsión, un líquido, una loción, una crema, una pomada, un ungüento, un polvo, una espuma o una formulación farmacéuticamente aceptable de otro tipo. Por otra parte, los péptidos pueden administrarse mediante el uso de formulaciones menos complejas, como es el caso de las composiciones que comprenden agua desionizada o destilada, PBS o soluciones salinas médicas convencionales. En general, una formulación farmacéuticamente aceptable comprenderá cualquier vehículo que sea apropiado para usarlo sobre la piel humana. Los vehículos farmacéuticamente aceptables de este tipo incluyen el etanol, el dimetil sulfóxido, el glicerol, la sílice, la alúmina, el almidón y los vehículos y los diluyentes equivalentes. Opcionalmente, la formulación puede comprender agentes útiles para aplicaciones cosméticas o de otra índole, como es el caso de los retinoides o los otros péptidos que pueden emplearse como coadyuvantes para la acción terapéutica de los péptidos de acuerdo con la invención. A la formulación también pueden agregársele antibióticos para impedir las infecciones, de manera tal de facilitar el desarrollo óptimo de los procesos de curación. La concentración del péptido en la composición puede ser de entre aproximadamente 0.1 pg/ml y aproximadamente 50 pg/ml o de entre aproximadamente 0.1% (p/v) y aproximadamente 10% (p/v) . Sin embargo, la concentración definitiva que se emplee también podrá estar fuera de estos rangos, lo cual dependerá de la naturaleza de la lesión en el tejido o de la afección, de la actividad biológica del péptido de acuerdo con la invención y del uso de coadyuvantes o procedimientos adicionales para incrementar la absorción de la composición.

Las composiciones de acuerdo con la presente invención podrán contener uno o más agentes adicionales que sean útiles para cuidar la piel.

En una forma de realización preferida de la presente invención, cuando la composición esté diseñada para que usarla en contacto con un tejido queratinoso humano, podrán incluirse otros componentes adicionales, que sean diferentes de los péptidos de acuerdo con la invención y que resulten apropiados para aplicarlos sobre dicho tejido queatinoso.

Vale decir, cuando se los incorpore en la composición, estos componentes adicionales no resultarán tóxicos, incompatibles, inestables, alergénicos o adversos de cualquier otra manera, lo cual podrá determinarse sobre la base del juicio médico reconocido. En el manual de ingredientes cosméticos de la CTFA (1992), se describen diversos ejemplos no limitativos de ingredientes cosméticos y farmacéuticos que suelen usarse en los productos para cuidar la piel, que pueden ser apropiados para emplearlos en las composiciones de acuerdo con la presente invención, entre los cuales se incluyen los abrasivos, los absorbentes, los componentes estéticos, tales como las fragancias, los pigmentos, los colorantes, los aceites esenciales, los productos para sensibilizar la piel, los astringentes (por ejemplo, el aceite de trébol, el mentol, el alcanfor, el aceite de eucalipto, el eugenol, el lactato de mentilo o los destilados de avellana) , los agentes anti-acné, los agentes para impedir la formación de tortas, los agentes para impedir la formación de espuma, los agentes antimicrobianos (por ejemplo, el butilcarbamato de iodopropilo) , los antioxidantes, los aglutinantes, los aditivos biológicos, los agentes amortiguadores, los agentes quelantes, los aditivos químicos, los biocidas cosméticos, los desnaturalizantes, los analgésicos externos, los agentes y los materiales para formar películas, los agentes opacantes, los agentes para ajustar el pH, los propelentes, los agentes reductores, los secuestrantes, los agentes para blanquear o aclarar la piel (por ejemplo, la hidroquinona, el ácido kójico, el ácido ascórbico, el ascorbil fosfato de magnesio o la ascorbil glucosamina) , los agentes para acondicionar la piel (por ejemplo, los humectantes) , los agentes para suavizar o curar la piel (por ejemplo, el pantenol y sus derivados, el aloe vera, el ácido pantoténico y sus derivados, la alantoína, el bisabolol o el glicirrizinato de dipotasio) , los agentes para tratar la piel, los espesantes, las vitaminas y sus derivados.

Los péptidos de acuerdo con la invención y las composiciones que los comprenden pueden administrárseles tanto a los seres humanos como a los animales, lo que abarca la totalidad de los mamíferos. La aplicación también puede llevarse a cabo en combinación con materiales típicos o experimentales, como es el caso de los injertos de tejido, los productos basados en tejidos cultivados, el oxígeno y los vendaj es .

Lista de venda es de uso habitual | Pharmaceuticals, Inc.) (*) Con asteriscos se indican las marcas registradas individuales de las compañías En general, la composición podrá administrarse por vía tópica, por vía oral, por vía transdérmica, de manera sistémica o a través de cualquier otra ruta conocida en la técnica que sea útil para introducir los péptidos de acuerdo con la invención en el sitio lesionado. Las composiciones también podrán aplicarse in vitro o ex vivo, por ejemplo, en células o injertos del paciente que se desarrollen en un cultivo.

Debido a su tamaño pequeño, se espera que los péptidos puedan atravesar la piel en un cierto grado. Sin embargo, será posible usar determinadas técnicas para amplificar este movimiento. A modo de ejemplo, podrán agregárseles grupos lipofílicos (no polares) a los péptidos. Como alternativa, los péptidos podrán administrarse sobre la piel con un excipiente lipofílico, con el propósito de mejorar su acceso al estrato córneo y permitir que lleguen a las capas epidérmicas inferiores. En este contexto, los péptidos con modificaciones lipofílicas pueden ser considerados prodrogas. En el excipiente, podrán emplearse agentes para incrementar la permeabilidad, de manera tal de mejorar la absorción de los péptidos. Se espera que determinadas técnicas sean útiles para mejorar el acceso de los péptidos al tejido o la lesión que se desee tratar, como es el caso de la iontoforesis, la electroforesis o el ultrasonido. Un dispositivo iontoforético consiste en dos electrodos que están sumergidos en una solución de electrolitos, que se colocan sobre la piel. Cuando se aplica una corriente eléctrica a través de los electrodos, se crea un campo eléctrico a través del estrato córneo, con el que pueden administrarse los péptidos. La electroporación se basa en la aplicación de pulsos eléctricos con voltajes elevados, cuyo propósito es incrementar la permeabilidad a través de las bicapas lipidicas. Difiere de la iontoforesis en la duración y la intensidad de la corriente eléctrica que se aplica (en la iontoforesis, se emplea un campo eléctrico con un voltaje constante relativamente bajo). Se cree que el pulso eléctrico con un voltaje elevado que se aplica durante la electroporación induce la formación reversible de poros hidrofilicos en las lámelas de la membrana lipidica, con lo cual puede incrementarse notablemente la permeabilidad. En la técnica de ultrasonido, se aplican ondas sonoras que tienen frecuencias superiores a 16 kHz sobre la piel, lo que da como resultado la compresión y la expansión del tejido que es atravesado por las ondas. Las variaciones resultantes en la presión desencadenan numerosos procesos (por ejemplo, la cavitación, la mezcla o el incremento de la temperatura) que pueden incrementar la permeabilidad ante los péptidos.

Las formulaciones que comprenden los péptidos y los usos que se han descripto con anterioridad son bien conocidos en la técnica. Se describen otros métodos con los que pueden elaborarse y usarse los péptidos de acuerdo con la invención, por ejemplo, en las Patentes de los EEUU N° 6492326 y 6974799, que se incorporan en la presente a modo de referencia en su totalidad.

Todas las composiciones y los métodos que se describen y se reivindican en la presente pueden elaborarse y ponerse en práctica sin experimentación innecesaria, sobre la base de la descripción que se provee. Si bien las composiciones y los métodos de acuerdo con la presente invención han sido descriptos en términos de formas de realización preferidas, para aquellos versados en la técnica ha de resultar evidente la posibilidad de realizar diversas modificaciones, tanto en las composiciones como en los métodos, en sus pasos o en la secuencia de sus pasos, sin apartarse del concepto, el espíritu y el alcance de la invención. Más específicamente, ha de resultar evidente la posibilidad de reemplazar los agentes que se describen en la presente por otros agentes que estén relacionados con ellos desde el punto de vista químico o fisiológico, de manera tal de obtener resultados idénticos o similares. Todas las sustituciones y las modificaciones que resulten evidentes para aquellos versados en la técnica han de quedar dentro del alcance de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido de la fórmula lipido Ci2-i8-KXZ-NH2, donde es lisina, X es prolina, d-prolina, histidina o arginina, Z es opcional, y si está presente, es valina, treonina, alanina o leucina, y el grupo COOH en el extremo está amidado con NH2.

2. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde el lipido Ci2-i8 es una unidad lipidica que se selecciona entre el ácido láurico (C12) , el ácido miristico (C14), el ácido pentadecanoico (C15) , el ácido palmitico (C16) y el ácido esteárico (C18) .

3. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido es lipido Cl2--18 -lisina--prolina-valina-NH2, lipido Cl2--18 -lisina--d-prolina-treonina-NH2, lipido Cl2--18 -lisina--prolina-alanina-NH2, lipido Cl2--18 -lisina--prolina-leucina-NH2, lipido Cl2--18 -lisina--prolina-NH2, lipido C12--18 -lisina--d-prolina-NH2, lipido Cl2--18 -lisina--histidina-NH2 o lipido Cl2--18 -lisina--arginina-NH2.

4. El péptido de acuerdo con la reivindicación donde el lipido Ci2-i8 es palmitoilo o pentadecanoilo.

5. El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, donde el péptido es palmito!1-lisina-prolina-valina-NH2, palmitoíl-lisina-d-prolina-treonina-NH2, pentadecanoil-lisina-prolina-valina-NH2, pentadecanoíl-lisina-d-prolina-treonina-NH2, estearil-lisina-prolina-valina-NH2, estearil-lisina-d-prolina-treonina-NH2, palmitoíl-lisina-prolina-alanina-NH2, palmito!l-lisina-prolina-leucina-NH2, palmitoil-lisina-prolina-NH2, palmitoíl-lisina-d-prolina-NH2, palmitoil-lisina-histidina-NH2 o palmito!l-lisina-arginina-NH2.

6. Una composición, que comprende al menos un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, donde el péptido está presente en una concentración que varia entre aproximadamente 0.1 g/ml y aproximadamente 10% (p/v) .

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, donde la composición está en la forma de un aerosol, una preparación cosmética, una atomización, un liquido, una loción, una crema, una pomada, un ungüento, un polvo o una espuma .

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, donde el péptido es palmitoíl-lisina-prolina-valina-NH2, palmito!l-lisina-d-prolina-treonina-NH2, pentadecanoíl-lisina-prolina-valina-NH2, pentadecanoil-lisina-d-prolina-treonina-NH2, estearil-lisina-prolina-valina-NH2, estearil-lisina-d-prolina-treonina-NH2, palmitoíl-lisina-prolina-alanina-NH2, palmitoíl-lisina-prolina-leucina-NH2, palmito!l-lisina-prolina-NH2, palmitoíl-lisina-d-prolina-NH2, palmito!l-lisina-histidina-NH2 o palmitoil-lisina-arginina-NH2.

10. La composición de acuerdo con la reivindicación 6, la cual es útil para prevenir o tratar afecciones en la piel como el acné, la dermatitis atópica, la rosácea, la vaginosis bacteriana, la caspa o el pie de atleta.

11. Un método para prevenir o tratar una infección de microbios en la piel o un tejido mucoso de un mamífero, el método comprendiendo administrar una cantidad eficaz para el uso terapéutico de una composición de acuerdo con la reivindicación 6 sobre el área infectada del mamífero, durante un período de tiempo apropiado.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde la cantidad eficaz para el uso terapéutico de la composición comprende una concentración del péptido que varía entre aproximadamente 0.1 g/ml y aproximadamente 10% (p/v) .

13. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde la infección es provocada por una bacteria que se selecciona del grupo que consiste en P. acnés, S. aureus y E. coli, o bien por C. albicans .

14. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde el péptido en la composición es palmito!l-lisina-prolina-valina-NH2, palmitoíl-lisina-d-prolina-treonina-NH2, pentadecanoíl-lisina-prolina-valina-NHí, pentadecanoíl-lisina-d-prolina-treonina-NH2, estearil-lisina-prolina-valina-NH2, estearil-lisina-d-prolina-treonina-NH2, palmitoíl-lisina-prolina-alanina-NH2, palmitoíl-lisina-prolina-leucina-NH2, palmitoíl-lisina-prolina-NH2, palmitoíl-lisina-d-prolina-NH2, palmitoíl-lisina-histidina-NH2 o palmitoíl-lisina-arginina-NH2.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 11, donde la infección provocada por los microbios en la piel es el acné, la dermatitis atópica, la rosácea, la vaginosis bacteriana, la caspa o el pie de atleta.