MX2014011284A - Plantas transgenicas que contienen un contenido de nitrato mas bajo en las hojas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a constructos genéticos, que se pueden utilizar en la preparación de plantas transgénicas. Los constructos pueden tener la capacidad de reducir la concentración de nitrato en la planta, en particular, las hojas de la planta, y para la inducción de un fenotipo similar a la senescencia. La invención se extiende a las células vegetales transformadas con tales constructos, y para las plantas transgénicas en sí. La invención también se refiere a métodos para producir plantas transgénicas, y a métodos para reducir el contenido de nitrato en plantas. La invención se refiere también a las hojas de planta cosechada, por ejemplo, hojas de tabaco, que han sido transformadas con los constructos genéticos, y para diversos artículos de tabaco, tales como artículos para fumar, que comprenden tales hojas de plantas cosechadas.

Description

PLANTAS TRANSGÉNICAS QUE TIENEN UN CONTENIDO DE NITRATO MÁS BAJO EN LAS HOJAS Campo teenico La presente invención se refiere a constructos genéticos, que se pueden utilizar en la preparación de plantas transgénicas. Los constructos pueden tener la capacidad de reducir la concentración de nitrato en la planta, en particular, las hojas de la planta. La invención se extiende a las células vegetales transformadas con tales constructos, y para las mismas plantas transgénicas. La invención también se refiere a métodos para producir plantas transgénicas, y a métodos para reducir el contenido de nitrato en las plantas. La invención también proporciona métodos para modificar los perfiles de aminoácidos de la planta. La invención se refiere también a hojas de planta cosechadas, por ejemplo, hojas de tabaco, que han sido transformadas con los constructos genéticos, y para diversos artículos de tabaco, tales como artículos para fumar, que comprenden tales hojas de plantas cosechadas.

Antecedentes La asimilación de nitrógeno es de importancia fundamental para el crecimiento de plantas. De todos los nutrientes minerales requeridos por las plantas, se requiere el nitrógeno en la mayor abundancia. Las principales formas de nitrógeno absorbido por las plantas en el campo son el nitrato y amoníaco, los principales componentes de los fertilizantes nitrogenados. Las plantas absorben ya sea el nitrato o iones de amonio de la suelo, dependiendo de la disponibilidad. El nitrato será más abundante en bien oxigenadas, suelos no ácidas, mientras que el amonio predominará en suelos ácidos o anegados. Los experimentos en los parámetros de crecimiento del tabaco demostraron claramente que la tasa de crecimiento relativo, contenido de clorofila, el área de la hoja y el área de la raíz aumentó dramáticamente en respuesta al aumento del suministro de nitrato.

Las plantas han desarrollado un sistema de absorción de nitrógeno eficiente con el fin de hacer frente a la gran variación en el contenido de nitrato en los suelos cultivados. Las raíces de las plantas absorben el nitrato y amoníaco por la acción de los transportadores de nitrato específicos (NTR), que se dividen en dos familias de genes, la familia de genes NRTl y la familia de genes NRT2. Ambas familias de genes coexisten en las plantas, y se cree que actúan cooperativamente para absorber el nitrato del suelo para ayudar con distribuirlo a las células que se encuentran en toda la planta. Sin embargo, una vez dentro de la célula, se conoce muy poco sobre los mecanismos que se emplean para el transporte del nitrato a diferentes compartimentos celulares.

Después de la entrada en la célula, se cree que el nitrato se acumula en las vacuolas que conducen a concentraciones tan altas como 50 mM, que es 25 veces mayor que la concentración de nitrato encontrado dentro del citoplasma. El nitrato vacuolar contribuye al mantenimiento de la homeostasis en el nitrato citosólico. AtCLC-a, un intercambiador de anión/protones, que pertenece a la familia de proteínas de Arabidopsis CLC que ha demostrado jugar un papel en la transportación del nitrato vacuolar. AtCLC-a es un intercambiador de nitrato-protones conocido, y es responsable de la carga de nitrato en las vacuolas. El desprendimiento de AtCLC-a en Arabidopsis causa una reducción del 50% en su capacidad de acumulación de nitrato en comparación con las plantas silvestres. Esto indica que existen genes adicionales que también pueden ser responsables de la carga de nitrato en las vacuolas de las plantas .

Siete homólogos de la familia de proteínas CLC se han identificado dentro de Arabidopsis, y se le refiere como AtCLC-a hasta AtCLC-g. Basado en la identidad de secuencia, AtCLC-a, -b, —c, -d y -g definen cada uno una rama filogenética separada con la más alta homología con la subfamilia de los mamíferos CLCs. Los AtCLCs son expresados ubicuamente en las plantas. Sin embargo, el papel funcional de estas proteínas está lejos de ser comprendido.

Además de AtCLC-a, AtCLC-c también se cree que es un componente principal de la acumulación del nitrato en las plantas. Los brotes de las plantas Arabidopsis, que contienen una inserción de transposones para AtCLC-c, poseen una concentración de nitrato inferior en comparación con las raíces de las plantas silvestres. Sin embargo, a diferencia de mutantes AtCLC-a, las raíces de mutantes AtCLC-C también poseen una concentración de cloruro alterada en comparación con plantas silvestres, lo que sugiere que AtCLC-c exhibe menos especificidad de aniones que AtCLC-a. Además, AtCLC-d, que se expresa en la red del trans-Golgi de las células vegetales y co-localiza con una V-tipo ATPasa se cree que juega un papel en el desarrollo de las raíces de las plantas. Esto es apoyado por el hallazgo de que la inserción de T-ADN de una no-funcional AtClC-d mutante en las plantas Arabidopsis altera el crecimiento de la raíz, con poco o ningún efecto sobre el contenido de iones de cloruro, contenido de nitrato o morfología celular.

Una vez en la célula, el nitrato se reduce en el citosol por la enzima citoplasmática del nitrato reductasa (NR) a nitrito. EL nitrito recién formado se transporta luego en el cloroplasto y se reduce rápidamente en amonio mediante nitrito reductasa (NiR). Después entra el amonio en el ciclo de la glutamina sintetasa/glutamato sintasa (GS/GOGAT), donde es incorporado en el grupo de aminoácidos. El mecanismo por el que el nitrito es transportado desde el citosol al cloroplasto no se conoce. Se ha postulado que la difusión pasiva puede explicar para su entrada en los cloroplastos, y que esto puede deberse en parte a la presencia de proteínas transportadoras que se expresan en la superficie de los cloroplastos, tales como: (i) CsNitri (transportador de nitrito Cucumis sativus) una proteína transportadora de nitrato que ha sido identificada en la membrana interna de las envolturas de cloroplasto del pepino; (ii) Atig68570 - un ortólogo de CsNitri. La sobreexpresión de una forma no funcional del polipéptido Atig68570 en Arabidopsis provoca la acumulación excesiva de nitrito en plantas transgénicas en comparación con plantas silvestres; y (iii) AtCLC-e - un Arabidopsis CLC miembro de la familia de proteínas que se expresa en la superficie de las membranas de los tilacoides dentro de los cloroplastos. El desprendimiento de clc-e de plantas Arabidopsis resulta en una reducción de la acumulación de nitrato, así como un aumento en la acumulación de nitrito dentro de las plantas Arabidopsis transgénicas en comparación con las células vegetales silvestres.

Sin embargo, la relativamente baja concentración de nitrito dentro del citosol de Arabidopsis hace poco probable que la difusión pasiva sea el mecanismo que es responsable de la entrada del nitrito en los cloroplastos. Además, es difícil concluir si AtCLC-e realmente juega un papel en la regulación de los flujos de nitrato intracelulares como el desprendimiento de AtCLC-e de Arabidopsis también influye la expresión de varios otros genes que también están implicados en la regulación de los niveles de nitrato intracelulares.

La regulación de las actividades de los transportadores de nitrato y nitrato y nitrito reductasas es crítico en el control de la asimilación de nitrógeno primaria en toda la planta, y tiene un impacto significativo en el crecimiento y desarrollo de la planta. Altos niveles de nitrato acumulados durante períodos de baja temperatura y/o irradiación solar (por ejemplo, en cultivos de invernadero durante el invierno), cuando hay menos capacidad fotosintética para asimilar el nitrato almacenado, o como un resultado de altos niveles de nitrato en el suelo. Un aumento en los niveles de nitrato puede tener un número de consecuencias perjudiciales, no sólo en términos de crecimiento de las plantas, sino también en términos de salud humana o animal donde se consume la planta, así como las consecuencias ambientales. Muchas de las consecuencias adversas de la acumulación de nitrato están mediadas a través de la producción de nitrito.

Por lo tanto, para evitar una acumulación excesiva de nitrato, una estrategia sería disminuir el almacenamiento de nitrato en las plantas. Esto podría llevarse a cabo modificando el almacenamiento de nitrato dentro de las vacuolas de las plantas, y sería útil en la industria del tabaco. Es bien sabido que el nitrógeno residual en las hojas de tabaco contribuye a la formación de nitrosaminas, como se ilustra en la Figura 1. En particular, el nitrato y el nitrito actúan como precursores a la formación de la nitrosamina específica del tabaco (TSNA) en una hoja curada.

En la industria del tabaco, el procesamiento de las hojas de tabaco implica la eliminación de pecíolos y nervaduras centrales de las hojas curadas que se cree que actúan como órganos de almacenamiento de nitrato, que están desprovistas de sabor y altas en TSNAs.

Además, la formación de nitrosaminas en el estómago es un resultado de nitrosación endógena. Las bacterias orales reducen químicamente el nitrato consumido en alimentos y bebidas a nitrito, que puede formar agentes nitrosantes en el ambiente ácido del estómago. Estas reaccionan con aminas para producir nitrosaminas y causar roturas de la cadena de ADN o entrecruzamiento de ADN. Otro problema asociado con un exceso de nitrato es la formación de metahemoglobina que da lugar al síndrome del bebé azul, donde la capacidad de transportar oxígeno de la hemoglobina es bloqueada por el nitrito, causando asfixia química en los infantes.

Como una consecuencia de estos problemas de salud, un número de autoridades reguladoras han establecido límites en la cantidad de nitrato permitido en vegetales de hojas verdes como la espinaca y la lechuga (por ejemplo el Reglamento de la Comisión Europea 653/2003), dependiendo del momento de la cosecha. Estos límites han resultado en que cualquier producto con un alto contenido de nitrato sean invendibles. En consecuencia, se han hecho esfuerzos para reducir el contenido de nitrato en las plantas manejando la aplicación de fertilizantes que contienen nitrógeno o sistemas mejorados en el manejo de los cultivos. Algunas autoridades también han establecido límites en las cantidades de nitrato en el agua potable.

Hay por lo tanto, una necesidad de medios para aliviar los efectos adversos asociados con la acumulación de nitrato en las plantas. Con esto en mente, los inventores han desarrollado una serie de constructos genéticos, que se pueden usar en la preparación de plantas transgénicas, lñas cuales exhiben sorprendentemente concentraciones de nitrato reducidas.

Sumario de la invención Por consiguiente, de acuerdo a un primer aspecto de la invención, se proporciona un constructo genético que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de codificación que codifica un polipéptido, que es un intercambiador de anión/protón que tiene actividad transportadora de nitrato, con la condición de que el promotor no es un promotor del virus de mosaico de la coliflor 35S.

Como se describe en los Ejemplos, los inventores han investigado la removilización de nitrógeno en una planta, con una vista para desarrollar plantas que muestran una disminución de las concentraciones de nitrato, especialmente en las hojas. Los inventores prepararon un número de constructos genéticos (véase la Figura 2), en el que un gen que codifica un anión/proteína intercambiadora de protones que tiene actividad transportadora de nitrato se colocó bajo el control de un promotor, que no era el promotor CaMV 35S. Sin embargo, el promotor puede ser un promotor constitutivo o un promotor específico de tejido.

En una modalidad, la secuencia que codifica en el constructo puede codificar el intercambiador de anión/protón Arabidopsis , CLC-b. La secuencia de ADNc que codifica una modalidad del intercambiador de anión/protón de Arabidopsis CLC-b se proporciona en el presente documento como SEQ ID No.i, como sigue: ATGGTGGAAGAAGAir:AAACCAGAIT{¾TGGTAArAGTAftTIACAA.lXGAC¾AGGAGGCGACCCAGA GAGCAACACACTTAACCAACCTCTAGT TAAGGC rAATCGAACAC?TTCT7CAACTC AC 'VGC7T I'CG TTGGTGCCAAAGTTTCCCATATCGAAAGCTTGGAeTATGAAAIAAACGftGAACGATCXGrT JAAGCAT CATTCCAGAAAAACATC AAAGCCACAAGTAC7TCAATACCTG G TCTTCAAA Tc GACGT rAGí TTGTCT TGTTGGTCTTTTCACTGGTTTAArCGCTACTCTCATCAACTTAOITGTTGAAAACArCGCCGGCTATA AGCXTTrA GCG'.TGGrCACGrCCrCACI'CAAGAAAGATArGI ÍACÁGGi'C iG.ATGGTGCrTGTXGüü GCGAATTTGGGACTGACGTTGGTGGCGTC-GIGCTTTGTGTGTGITTTGCTCCTACGGCGGCTGGACC H¾AATCCCI¾AGÁXCAAAGt riAl'CI XAATGÜ XG IASA TAC rCCCAACATGI ríGGTGCrACTAC XA IGATCGX rAAGATTGnCGAAGCAr XGGAGCCG X XGC ASCTGGAC XTGATC X AGGTAAAGA&GGTCCT CTAGlTCACArTCGAAGCTGCAIftGCTICrTTGCrrGGACAAGGrOGAACAGACAACCACCGIATCAA GTGGCGG tG'GCTTCG OACTTCAAC A¾CGATAGAGACCGCAGG'G.ATCIGA G ¡ACATGI'GGC ICAGCIG CACGAGrGrCXGCAGCCXXCAGGTCACCTGTTGGAaGrGrACTTrTCGCCCXCCAGSAAGrXGCTACI XlGqTGGAGAAGTGCCrTATXGTGaCGGACTTTCTTCASCACAGCGGTTGTrGriSGTrGrrCTAAGAGA CTTCATAGAGATCrGCAATrCAGCGAAGTGTGGGTTGTTTGCAAAAGGAGGGCTAArCATGTTTGATG XGAGTCA re TlLO ITL T AC77ACCA f GTAACTCA XATAATCCC TGTCAIG I TOA I.XC í'Gt AAICGG G G AAITCIT'GGGAGCCT'GTACAATCATCTTCTGCATAAAGTTCTCAGGCTTTACAArCXCATCAATGA GAAGGG7AAGATCGA?AACG?GCTrcrCAGTCT?ACAG?ATCACTCTTTACAXC7GVTTGCC ,'7TATG GCC riCC XI leiTAGCGAAATGCAAGC-CTXGIGACCCCTCGAIAGATGAGArAXGCCCGACGAAIGGA AGATCCCCTAAeTTCAAACACTrCCATTCCCCTAAACC TACTACAAtCATeXAGCTACTC'C-CTTCT CACCACCAACGATGATGCTGTCAGAAACCXTrrCTCTTCCAACACTCCCAATGAGTrXGGTA-GGGTT CGCTTTCGATAITCTTTGTCCTA rACTGCATC ; rCOCÜCTÍ'T l'CACAÍITCGXATTCCAACACCCrCT GGTCTCTTCeTCCCCATCATrCTCATGGGXGCTGCA7A7GGCCGAATGCTTGGCGCrGCAATGGGATC AXACACAAGIATTGACCAAÜGGCTrtAXGCXGXeerXGGTGCAGCTGCACXCAIÜGCIGGAICGÁXGA GAATGACIGIGTCACrCIGTGTXArA-ICCXXGAACrCACCAACAACCIXCIXTIGCTICCIATAACG ATG ATCGTGCTXC TGAT AGCC AAMCXG XGGGAGACAGG G X X AACCCGAG . AGA?AG CACA iCAIC G X GCATC TAAAGGGC7 XACC rTTCITAGAAGCAAA TCCAOAGCCG TGGATGAGCAACCi'CACCGTTGGTG AGCITGGrGATGCTAAGCCCCCGGrrGTAACCCTGCAAGGTGriGAAAAGGXrrCAAATArAGIlGAI 3T CTAAAGAACACGACGCA7AATGCAT7CCCTG777TAGArGAAGCAGAAGIACC7CAAG7GGGTCT AGCAACTGGiGGCXACAGAACTCCACGGGTTGATCTTGAGAGCGCACCTCGXXAAAGrXCrGAAAAAGA GATGGT XC T rGACAGAGAAAAGAAGAACAGAGGAG TGGGAGG ICAGAGAAAAG XTTCCA IGC¾ATGAA 7TGGC7GAAAGAGAAGACAACTTTGAC6ACG7GGCCATCACAA CGCTGAAA7GGAAA7GTA7GTCGA ICTICA ¡ C TCTCACCAACACAACACC TTACACAG i'CM'GGAÜAACA XGICAS XGGCC AAGCCTT I'AG XACTTTXCCOaCAAGrGGGACICCGGCATrXGCrXATXGXICCCAAGAIXCAAOCCXCAGGAAXGIGI CCTG roCTAGÍSGArCrTAACCACACACCACCTAAGGSCATACAAC ATTCTACAAGCCTTTCCTCTC GT GGAAAAATCCAAAGGXGGAAAGACACATXGA [SEQ ID No.i] La secuencia del polipéptido del intercambiador de anión/protón de Arabidopsis CLC-b se proporciona en el presente documento como SEQ ID No.2,como sigue: M V E E Ü L N Q G G N S ? N G E X G P F E S G L N Q P L V K A N R T L S S ? P L A LV G A K V S H 1 E S L ü ¥ E i EN DLF KHD rtF,KR3 KAQVLQYVr L WILACLVG LFTX L X ATL 1HL.AVEN IAG VKLLAVGHF L XOERYVTGLMVLyGAtfLGLGLVASVLCVCFAPrAAGPGIPEIKAYLHOVSTrHHF GAÍCMI VK ; V.7S i GAVAAGLDLGKEGPLVK XCGC ¡AG LI.GQGG IDKÍIB KWpllCFyf NNDADF CL ; TCGSAAGyXAAFtíSPVÍJGVl.í ALKEyAIVJWRaAXLWEIFt STAVVVVVLRKF 1 E i CN5GKÍ ;EE ?KO?C_HCCn3H C?ICHnCE: .Rn:·1E_?n:^3 cCC31.?HHECHKC''EE<C?L :NE 2K -HKVuLSL Xv'SLt XSVCLYCLrt -JAÁCKPC-:p£_ p¿ . CPI NGPSGNt K lr HCPKG Y'iNDLA .rLLXVNÜUAVPNU- SSNXPtUfc GHG SLfl-: t V ? C . xC Ur X t C - L X 3 GE : LPi .LMC AA XCFCIXC LLMC SI I S . XAV L C AAAL -1AC S FI-il V 5 XC V i F LE i TH SLL L LP i XM X VLL ¡Airxvciyi· jjixj ; YP : : i.iu .KC I.I?I.KLNRKR?L?HN I.IVCÍ: I. DAKI’I’VVTI.QC; VKKVSN : v'üVLK.Vi XF.NAr L* V .«13£LE V ¿O / G UA. GA ¿ LfeO L x L AHi. V K KUvtfr LX EKMUX KJ WÍE VRE!Kf FWDELAiREDMFDDVAi'í SAHMEMYVDLHFLTHTTP¥7VMEMMSVAKAL.''/Ll’RQVG L HLLI PKI QA5GMCP VVO I LIKQDLRA’ÍN 1 LQAF P L LE KS KGGKTtí ' [SEQ ID No.2j El * en la secuencia anterior se refiere al codón de parada en el extremo 3' de la secuencia, y es necesario para la terminación de la expresión. El polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos tal como se establece en SEQ ID No.2, o una variante funcional o fragmento u ortólogo de la misma. Por consiguiente, la secuencia de codificación, que codifica el polipéptido, que es un intercambiador de anión/protón que tiene la actividad transportadora de nitrato, puede comprender una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se establece en SEQ ID No.i, o una variante funcional o fragmento u ortólogo de la misma.

El promotor puede ser capaz de inducir la AKN polimerasa para unirse a, e iniciar la transcripción, la secuencia de codificación que codifica el polipéptido que tiene actividad transportadora de nitrato. El promotor en los constructos de la invención puede ser un constitutivo, no constitutivo, específico de tejido, promotor regulado desarrolladamente o inducible/represible.

Un promotor constitutivo dirige la expresión de un gen a través de las distintas partes de la planta de forma continua durante el desarrollo de la planta, aunque el gen no puede ser expresado en el mismo nivel en todos los tipos de células. Ejemplos de promotores constitutivos conocidos incluyen aquellos asociados con el gen actina 1 del arroz (Zhang et ah, 1991, Plant Cell, 3, 1155-1165) y el gen de la ubiquitina 1 de maíz (Cornejo et al, 1993, Plant Molec. Biol., 23 , 567-581). Los promotores constitutivos tales como el promotor del virus del anillo grabado del clavel (CERV) (Hull et ah, 1986, EMBO J., 5, 3083-3090) son particularmente preferidos en la presente invención.

Un promotor específico de tejido es uno que dirige la expresión de un gen en una (o unas pocas) parte de una planta, por lo general a través del tiempo de vida de esas partes de la planta. La categoría del promotor específico de tejido comúnmente también incluye promotores cuya especificidad no es absoluta, es decir, pueden también dirigir la expresión a un nivel inferior en tejidos distintos al tejido preferido. Ejemplos de promotores específicos de tejido conocidos en la téenica incluyen aquellos asociados con el gen de la patatina expresado en tubérculos de papa, y el gen de glutenina de alto peso molecular expresado en el trigo, la cebada o el endospermo del maíz.

Un promotor regulado por el desarrollob que dirige un cambio en la expresión de un gen en una o más partes de una planta en un momento específico durante el desarrollo de la planta, por ejemplo, durante la senescencia. El gen puede ser expresado en que parte de la planta en otros momentos a un nivel diferente (normalmente inferior), y también puede expresado en otras partes de la planta.

Un promotor inducible es capaz de dirigir la expresión de un gen en respuesta a un inductor. En la ausencia del inductor no se expresará el gen. El inductor puede actuar directamente sobre la secuencia del promotor, o puede actuar contrarrestando el efecto de una molécula represora. El inductor puede ser un agente químico tal como un metabolito, una proteína, un regulador de crecimiento, o un elemento tóxico, un estrés fisiológico tal como el calor, lesiones, o presión osmótica, o una consecuencia indirecta de la acción de un patógeno o plaga. Un promotor regulado por el desarrollo puede ser descrito como un tipo específico de promotor inducible que responde a un inductor endógeno producido por la planta o a un estímulo ambiental en un punto particular en el ciclo de vida de la planta. Ejemplos de promotores inducibles conocidos incluyen aquellos asociados con la respuesta de heridas, respuesta de la temperatura, e inducido químicamente.

El promotor puede ser obtenida de diferentes fuentes, incluyendo animales, plantas, hongos, bacterias y virus, y diferentes promotores puede trabajar con diferentes eficiencias en diferentes tejidos. Los promotores también pueden ser construidos sintéticamente. Por lo tanto, los ejemplos de promotores adecuados incluyen el promotor del Virus del anillo grabado del clavel (CERV), el promotor de plastocianina de chícharo, el promotor rubisco, el promotor de la nopalina sintasa, la clorofila a/b que une el promotor, el promotor de glutenina de alto peso molecular, el a, promotor b -gliadina, el promotor de hordeína, el promotor de patatina, o un promotor específico de senescencia. Por ejemplo, un promotor específico de la senescencia adecuado puede ser uno que se deriva de un gen asociado a la senescencia (SAG), y puede ser seleccionado de un grupo que consiste en SAG12, SAG13, SAG101, SAG21 y SAG18.

Preferiblemente, el promotor es el promotor CERV, como se muestra en el constructo ilustrado en la Figura 2. El Virus del anillo grabado del clavel (CERV), el promotor será conocido por el téenico experto, (Hull et al, EMBO J., 5, 3.083-3.090 ). La secuencia de ADN que codifica el promotor CERV es 232bp de largo, y se denomina aquí como SEQ ID NO.3, como sigue: AGC .UCCATGCCXCCAGGXCGACCiTTrAGGAXVí C Al AGXÜ AG'AAGA G Al' GTTC T TL'-'C XA AACAAAAAAGCAGCGTCGGCAAACCATACAGCTG: CCACAAAAAGGAAAGGCTGTAATAiiCA AGC3GACCCAGCrTCTCAGTGGAAC-ATACCTTAG :AGACACTGAATAA·GGATGGACCCOAG CAC3AG?AAAGAGACCGICTG7CTAAAGTAAAGL’AGAGCGTCTTT [SEQIDN0.3] Por lo tanto, el promotor en el constructo de la invención puede comprender una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se establece en la SEQ ID No.3, o una variante funcional o fragmento funcional de la misma. El promotor CERV se puede obtener de Cauliovirus o una especie de planta tales como Dianthus caryophyllus (es deir clavel) que muestran signos de la cauliovirus. En modalidades en las que el promotor es el promotor CERV, se apreciará que el promotor puede comprender cada una de las bases 1-232 de la SEQ ID No.3. Sin embargo, las variantes funcionales o fragmentos funcionales del promotor también se pueden usar en constructos genéticos de la invención.

Una "variante funcional o fragmento funcional de un promotor" puede ser un derivado o una porción del promotor que es funcionalmente suficiente para iniciar la expresión de cualquier región que codifica que está operativamente unido al mismo. Por ejemplo, en modalidades en las que el promotor se basa en el promotor CERV, el téenico experto apreciará que la SEQ ID No.3 puede ser modificada, o sólo se pueden requerir porciones del promotor CERV, de tal manera que todavía podría iniciar la expresión génica en el constructo.

Las variantes funcionales y fragmentos funcionales del promotor se pueden identificar fácilmente mediante la evaluación de si o no la transcriptasa se unirá a una región putativa promotora, y luego llevar a la transcripción de la región que codifica en el polipéptido que tiene actividad transportador de nitrato. Alternativamente, tales variantes funcionales y fragmentos pueden ser examinados mediante la realización de mutagénesis sobre el promotor, cuando se asocia con una región que codifica, y la evaluación de si o no se puede producir la expresión génica.

La secuencia de codificación, que codifica el polipéptido que es un intercambiador de anión/protón que tiene la actividad transportadora de nitrato, se puede derivar de cualquier fuente adecuada, tal como una planta. La secuencia de codificación puede derivarse de una fuente vegetal adecuada, por ejemplo de Arabidopsis spp. , Oryza spp. , Populus spp. o Nicotiana spp. La secuencia de codificación tal vez deriva de la Arabidopsis thaliana, Oryza saliva, Populus trémula o Nicotiana tabacum. Se apreciará que los ortólogos son genes o proteínas en diferentes especies que han evolucionado de un gen ancestral común por especiación, y que conservan la misma función.

Los inventores han creado un constructo en el que el promotor CERV se ha usado para conducir la expresión de la proteína intercambiadora de protones/anión Arabidopsis thaliana , CLC-b.

El constructo puede ser capaz de disminuir, en una planta transformada con un constructo de la invención, la concentración de nitrato en al menos un 5%, 10%, 15%, 18%, 20%, 32%, 35%, 38%, 40%, 50%, 60% ó 63% en comparación con la concentración de nitrato en el tipo de planta silvestre (es decir, que no ha sido transformada con un constructo de la invención), que se cultiva preferentemente bajo las mismas condiciones.

El constructo puede ser capaz de disminuir, en una planta transformada con el constructo, la concentración de 4- (Metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK) por al menos 10%, 20%, 30% , 40%, 50%, 60%, 61%, 62%, 65%, 69%, 71% ó 75% en comparación con la concentración de NNK en la planta silvestre, preferiblemente crecido en las mismas condiciones .

El constructo puede ser capaz de disminuir, en una planta transformada con el constructo, la concentración de N-Nitrosonornicotina (NNN) por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 71 %, 75%, 78%, 80%, 82%, 84%, 85%, 88%, 90% ó 94% en comparación con la concentración de NNN en la planta silvestre, preferiblemente crecida en las mismas condiciones.

El constructo puede ser capaz de disminuir, en una planta transformada con el constructo, la concentración de N-Nitrosoanatabina (NAT) en al menos un 5%, 6%, 10%, 20%, 23%, 24%, 30%, 40 %, 46%, 45%, 48%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 85% en comparación con la concentración de NAT en la planta silvestre, preferiblemente crecida en las mismas condiciones.

El constructo puede ser capaz de disminuir, en una planta transformada con el constructo, la concentración del total de nitrosaminas específicas del tabaco (TSNA) por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 56%, 60% , 64%, 65%, 70% ó 75% en comparación con la concentración de TSNA total en la planta silvestre, crecida preferiblemente en las mismas condiciones.

Preferiblemente, el constructo es capaz de disminuir la concentración de cualquiera de los compuestos seleccionados de entre un grupo de compuestos que incluyen nitrato, NNK, NNN, NAT y TSNA total en una hoja o tallo de una planta de una población de plantas T0, Ti y/o T2, crecida preferentemente bajo las mismas condiciones.

El constructo puede ser capaz de disminuir las concentraciones de cualquiera de estos compuestos (es decir, nitrato, aminoácidos implicados en la asimilación de nitrógeno, el total de TSNA, NNN, NK o NAT) en una hoja situada en una posición inferior, media o superior en la planta. La "Posición inferior" puede significar en el tercio inferior de la planta (por ejemplo la hoja número 4 ó 5 de la base de la planta), "posición superior" puede significar en el tercio superior de la planta (por ejemplo el número de hojas 14 ó 15 de la base de la planta), y "posición media" puede significar el tercio central de la planta entre las posiciones inferior y superior (por ejemplo, número de hojas 10 ó 11 desde la base de la planta). En el momento del muestreo, el número total de hojas es de aproximadamente 20.

Los constructos genéticos de la invención pueden ser en la forma de un casete de expresión, que puede ser adecuado para la expresión de la secuencia de codificación que codifica un intercambiador de anión/protón en una célula huésped. El constructo genético de la invención puede ser introducido en una célula huésped sin que sea incorporado en un vector. Por ejemplo, el constructo genético, que puede ser una molécula de ácido nucleico, puede ser incorporado dentro de un liposoma o una partícula de virus. Alternativamente, una molécula de ácido nucleico purificada (por ejemplo ADN libre de histonas o ADN desnudo) puede ser insertado directamente en una célula huésped por medios adecuados, por ejemplo, absorción endocitica directa. El constructo genético puede ser introducido directamente en células de un sujeto huésped (por ejemplo una planta) por transfección, infección, microinyección, fusión celular, fusión de protoplastos o bombardeo balístico. Alternativamente, los constructos genéticos de la invención se pueden introducir directamente en una célula huésped utilizando una pistola de partículas. Alternativamente, el constructo genético puede albergarse dentro de un vector recombinante, para la expresión en una célula huésped adecuada.

Por lo tanto, en un segundo aspecto, se proporciona un vector recombinante que comprende el constructo genético de acuerdo con el primer aspecto.

El vector recombinante puede ser un plásmido, cósmido o fago. Tales vectores recombinantes son altamente útiles para la transformación de células huésped con el constructo genético de la invención, y para replicar el casete de expresión en el mismo. El téenico experto apreciará que los constructos genéticos de la invención se pueden combinar con muchos tipos de estructura del vector para propósitos de expresión. La estrcutura del vector puede ser un vector binario, por ejemplo uno que puede replicarse tanto en E. coli y Agrobacterium tumefaciens . Por ejemplo, un vector adecuado puede ser un plásmido pBIN, tales como pBlNl9 (Bevan M., 1984, Nucleic Acids Research 12: 8711-21).

Los vectores recombinantes pueden incluir una variedad de otros elementos funcionales adicional al promotor (por ejemplo, un CERV), y la secuencia de codificación que codifica un intercambiador de anión/protón con la actividad transportadora de nitrato. Por ejemplo, el vector recombinante puede ser diseñado de tal manera que se replica de forma autónoma en el citosol de la célula huésped. En este caso, los elementos que inducen o regulan la replicación de ADN pueden ser requeridos en el vector recombinante. Alternativamente, el vector recombinante puede ser diseñado de tal manera que se integra en el genoma de una célula huésped. En este caso, se contemplan las secuencias de ADN que favorecen la integración dirigida (por ejemplo, por recombinación homologa).

El vector recombinante también puede comprender ADN que codifica un gen que puede ser utilizado como un marcador seleccionable en el proceso de clonación, es decir, para permitir la selección de células que han sido transfectadas o transformadas, y para permitir la selección de células que albergan vectores que incorporan ADN heterólogo. El vector también puede comprender ADN involucrado en la regulación de la expresión de la secuencia que codifica, o para dirigir el polipéptido expresado a una cierta parte de la célula huésped, por ejemplo, el cloroplasto. Por lo tanto, el vector del segundo aspecto puede comprender al menos un elemento adicional seleccionado de un grupo que consiste en: un gen marcador seleccionable (por ejemplo, un gen resistente a un antibiótico); una señal de terminación de un polipéptido; y una secuencia esperada de proteína (por ejemplo, un péptido de tránsito al cloroplasto).

Ejemplos de genes marcadores adecuados incluyen genes resistentes a los antibióticos tales como los que confieren resistencia a la kanamicina, geneticina (G418) e higromicina npt-II, hyg-B),- genes resistentes a herbicidas, tales como los que confieren resistencia a la fosfinotricina y los herbicidas basados en sulfonamidas (bar y sul respectivamente; EP-A-242246, EP-A-0249637); y marcadores cribados, tales como beta-glucuronidasa (GB2197653), luciferasa y proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés). El gen marcador puede ser controlado por un segundo promotor, que permite la expresión en las células, que puede o no puede estar en la semilla, lo que permite la selección de células o tejidos que contienen el marcador en cualquier etapa del desarrollo de la planta. Segundo promotores adecuados son el promotor del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium y el promotor derivado del gen que codifica la transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV, por sus siglas en inglés). Sin embargo, cualquier otro segundo promotor adecuado puede ser utilizado.

Las diferentes modalidades de los constructos genéticos de la invención pueden estar preparados usando el procedimiento de clonación descrito en los Ejemplos, que pueden sumarizarse como sigue. La versión de ADNc de los genes que codifican el intercambiador de anión/protón puede ser amplificado a partir de plantillas de ADNc por PCR utilizando primers adecuados, por ejemplo SEQ ID No.4 y 5. Los productos de PCR luego se pueden examinar usando electroforesis en gel de agarosa. Los productos de PCR pueden entonces estar ligados en un vector adecuado para fines de clonación, por ejemplo el que está disponible bajo el nombre comercial TOPO pCR8 de Invitrogen. Los vectores que albergan los productos de PCR se pueden cultivar en un huésped adecuado, tal como E. coli Colonias de E. coli y los insertos en los plásmidos que muestran la restricción correcta del patrón de digestión con enzimas tal vez secuenciados utilizando primers adecuados.

Las colonias de E. coli que llevan pCR8-T0P0-cADN para Atclc-b quizás cultivadas para producir una cantidad adecuada de cada plásmido, que puede entonces ser purificado. Los plásmidos pueden entonces ser digeridos para liberar un fragmento de ADN que codifica el gen Atele- b, que después puede ser clonado en un vector, tal como un plásmido pBNP (van Engelen et al., 1995, Transgenic Research, 4: 288-290), que alberga un promotor adecuado, por ejemplo el promotor CERV.

El constructo Atclc-b resultante, contenía el promotor CERV y fue nombrado CRVAtCLC-b. Las modalidades del vector de acuerdo con el segundo aspecto puede ser sustancialmente como se exponen en la Figura 2. Los inventores creen que son los primeros que han desarrollado un método para disminuir las concentraciones de nitrato en hojas de plantas mediante la expresión del gen exógeno del intercambiador de anión/protón de Atclc-b en una planta transgénica.

Por lo tanto, en un tercer aspecto, se proporciona un método para disminuir la concentración de nitrato en las hojas de una planta de prueba por debajo de la concentración de nitrato correspondiente en hojas de una planta de tipo silvestre cultivadas bajo las mismas condiciones, el método comprende: - (i) transformar una célula vegetal con el constructo genético de acuerdo con el primer aspecto, o el vector de acuerdo con el segundo aspecto; y (ii) regenerar una planta a partir de la célula transformada.

En un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para producir una planta transgénica que transporta nitrato fuera de una hoja a una velocidad más alta que una planta correspondiente de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones, el método comprende:- (i) transformar una célula vegetal con el constructo genético de acuerdo con el primer aspecto, o el vector de acuerdo con el segundo aspecto; y (ii) regenerar una planta a partir de la célula transformada.

En un quinto aspecto, se proporciona un método para producir una planta transgénica, el método comprende introducir, en una planta no modificada, un gen exógeno que codifica un polipéptido, que es un intercambiador de anión/protón que tiene un transportador de nitrato, en donde la expresión del intercambiador de anión/protón codificado por el gen exógeno reduce la concentración de nitrato en las hojas de la planta transgénica con respecto a la concentración de nitrato en las hojas de la planta no modificada.

La posición de una hoja en relación con el resto de la planta (es decir, si se considera como dentro de la posición "inferior", la posición "superior" o la posición "media") es importante para los cultivadores de tabaco. La fisiología, y por lo tanto, la calidad y el sabor de una hoja están fuertemente relacionados con su posición dentro de una planta. Mientras que la planta alcanza la floración, un proceso llamado removilización se produce, e implica el transporte de nutrientes, tales como aminoácidos y compuestos nitrogenados, desde la base de la planta hacia la parte superior de la planta. Los nutrientes removilizados serán utilizados como fuente de energía para la producción de semillas. En consecuencia, las hojas más bajas tendrán un contenido de nitrógeno diferente en comparación con las hojas superiores de la planta, que se ilustra por un perfil de aminoácidos diferente. Las hojas inferiores se llaman "hojas de origen" y las hojas superiores se llaman "hojas de hundimiento". Las hojas medias son hojas verdes maduras totalmente expandidas.

Con respecto a algunas plantas, como el tabaco, mediante la eliminación de la cabeza de la flor de la planta, se pueden generar cambios en el metabolismo de los nutrientes de la hoja. Estos cambios permiten que los nutrientes removilizados para ser utilizados en las hojas, y resultan en hojas engrosadas, el crecimiento general de las hojas y la producción de metabolitos secundarios ricos en nitrógeno, muchos de los cuales son los precursores de los sabores que son encontrados más tarde en las hojas curadas. Por lo tanto, los constructos de la invención pueden usarse para modificar el sabor de una planta transgénica.

Como se muestra en la Figura 3, los inventores se sorprendieron al observar que los constructos genéticos según la invención también pueden ser capaces de modular (es decir, aumentar y/o disminuir) la concentración de ciertos aminoácidos que se sabe que participan en el metabolismo del nitrato (por ejemplo, Gin, Asn, Asp, Glu y/o Pro), en las hojas de una planta transgénica, que se encuentran en la posición superior, media o inferior, en comparación con las hojas correspondientes que se encuentran en una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones.

Por consiguiente, en un sexto aspecto, se proporciona un método para modular el perfil de los aminoácidos implicados en la asimilación de nitrógeno de las hojas de una planta de prueba en comparación con el perfil de aminoácidos de las hojas correspondientes de una planta de tipo silvestre cultivadas bajo las mismas condiciones , el método comprende: - (i) transformar una célula vegetal con el constructo genético de acuerdo con el primer o segundo aspecto, o el vector de acuerdo con el tercer aspecto; y (ii) regenerar una planta a partir de la célula transformada .

En un séptimo aspecto, se proporciona un método para modular el perfil de aminoácidos implicados en la vía de asimilación de nitrógeno de una hoja cosechada tomada de una planta transgénica, en comparación con el perfil de aminoácidos de una hoja cosechada correspondiente tomada de una planta de tipo silvestre cultivadas en las mismas condiciones, en donde la hoja es cosechada de una planta transgénica producida por el método de acuerdo con cualquiera del cuarto o quinto aspecto.

Según la invención, los aminoácidos implicados en la vía de asimilación de nitrógeno de las plantas y sus hojas pueden comprender glutamina (Gln), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu) o prolina (Pro), y por lo que cualquier del perfil o cualquiera o todos de estos aminoácidos puede ser modulada.

El constructo puede ser capaz de disminuir o aumentar, en una planta transformada con el constructo, la concentración de al menos un aminoácido implicado en la vía de asimilación de nitrógeno en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 56%, 60%, 64%, 65%, 70% ó 75% en comparación con la concentración de al menos un aminoácido en una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones.

Preferiblemente, el constructo resulta en la disminución de la concentración del aminoácido. Preferiblemente, el constructo puede ser capaz de disminuir la concentración de los aminoácidos, Glu, Asp, Pro, Gin y/o Asn, en las hojas (preferiblemente las hojas medias) de una planta transgénica en comparación con las hojas correspondientes que se encuentran en una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones.

En un octavo aspecto, se proporciona una planta transgénica que comprende el constructo genético de acuerdo con el primer aspecto, o el vector de acuerdo con el segundo aspecto.

En un noveno aspecto, se proporciona una planta transgénica que comprende un gen exógeno que codifica un polipéptido, que es un intercambiador de anión/protón que tiene actividad transportadora de nitrato, en donde la concentración de nitrato en las hojas de la planta transgénica se reduce en comparación con la concentración de nitrato en las hojas de una planta no modificada.

En un décimo aspecto, se proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica un polipéptido, que es un intercambiador de anión/protón que tiene actividad transportadora de nitrato, para reducir la concentración de nitrato en hojas de plantas por la transformación de la planta con la secuencia de ácido nucleico exógeno.

El término "planta no modificada" puede significar una planta antes de la transformación con un gen exógeno o un constructo de la invención. La planta no modificada, por lo tanto puede ser una planta de tipo silvestre.

El término "gen exógeno" puede significar el gen que se transforma en la planta no modificada es de una fuente externa, es decir, de una especie diferente a la que se está transformado. El gen exógeno puede tener una secuencia de ácido nucleico sustancialmente la misma o diferente a un gen endógeno que codifica un intercambiador de anión/protón en la planta no modificada. El gen exógeno puede ser derivado de la secuencia de ADNc que codifica el gen Atclc-b o un ortólogo del mismo. El gen exógeno puede formar un gen quimérico, que puede constituir por sí mismo un constructo genético de acuerdo con el primer aspecto. El gen exógeno puede codificar un intercambiador de anión/protón que tiene la secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en SEQ ID No. 2, o una variante funcional o fragmento u ortólogo de la misma. El gen exógeno puede comprender la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se establece en SEQ ID No. 1, o una variante funcional o fragmento u ortólogo de la misma.

Los métodos y usos de la invención pueden comprender el transformar una célula vegetal de prueba o célula vegetal no modificada con un constructo genético de acuerdo con el primer aspecto, un vector de acuerdo con el segundo aspecto, o el gen exógeno descrito en el presente documento.

Así, en un undécimo aspecto, se proporciona una célula huésped que comprende el constructo genético de acuerdo con el primer aspecto, o el vector recombinante de acuerdo con el segundo aspecto.

La célula puede ser una célula vegetal. La célula puede ser transformada con un constructo genético, vector o gen exógeno de acuerdo con la invención, usando téenicas conocidas. Los medios adecuados para la introducción del constructo genético en la célula huésped puede incluir la utilización de un vector plásmido Ti desarmado llevado por Agrobacterium por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo como se describe en el documento EP-A-0116718 y EP-A-0270822. Un método adicional puede ser para transformar un protoplasto de la planta, que consiste en extraer primero la pared celular y la introducción del ácido nucleico, y luego reformar la pared celular. La célula transformada puede entonces ser cultivada en una planta.

Preferiblemente, y de manera ventajosa, los métodos y usos de acuerdo con la invención no comprometen la salud o capacidad de la prueba o planta transgénica que se genera.

Las plantas transgénicas o de prueba de acuerdo con la invención pueden incluir a la familia Brassicaceae, como Brassica spp.. La planta puede ser Brassica napus (colza). Otros ejemplos de plantas transgénicas o de prueba incluyen la familia Poales, tal como tri ticeae spp. La planta puede ser Triticum spp. (trigo). Aumentar el contenido de proteína del grano en el trigo puede resultar en el aumento de volumen de los productos alimenticios que comprenden el trigo, como el pan.

Otros ejemplos de plantas transgénicas o de prueba de acuerdo con la invención pueden incluir a la familia de las Solanáceas de plantas que incluyen, por ejemplo, estramonio, la berenjena, la mandrágora, la belladona (belladonna), pimiento (pimentón, chile), la papa y el tabaco. Un ejemplo de un género adecuado de Solanaceae es Nicotiana . Una especie de Nicotiana adecuada puede ser referido como planta de tabaco, o simplemente tabaco.

Otros ejemplos de plantas transgénicas o de prueba adecuadas de acuerdo con la invención pueden incluir cultivos de hoja como la familia Asteraceae de plantas que, por ejemplo, incluyen la lechuga (Lactuca sativa). Otro ejemplo puede incluir la familia Chenopodiaceae de las plantas, que incluye Spinacia olerácea y Beta vulgaris, es decir, espinacas y acelgas, respectivamente.

El tabaco puede ser transformado con constructos, vectores y genes exógenos de la invención como sigue.

Nicotiana tabacum es transformada utilizando el método de co cultivación de disco de hoja esencialmente como se describe por Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985). Las dos hojas expandidas más jóvenes pueden tomarse de plantas de tabaco de 7 semanas de edad y se pueden esterilizar en la superficie en 8% Domestos™ durante 10 minutos y lavadas (3 enjuages) veces con agua destilada estéril. Los discos de hojas se pueden cortar usando taladracorchos del número 6 y se colocan en la suspensión de Agrobacterium, que contiene los vectores binarios apropiados (según la invención), durante aproximadamente dos minutos. Los discos pueden ser transferidos suavemente entre dos hojas de papel de filtro estéril. Diez discos pueden ser colocados en MS 3% de sacarosa + placas 2.2mM BAP + o.27mM NAA, que después puede ser incubadas durante 2 días en la sala de crecimiento. Los discos pueden ser transferidos a placas de MS + 3% de sacarosa + 2.2mM BAP + 0,27 mM NAA suplementado con 500 g/1 Cefotaxima y 100 g/1 de kanamicina. Los discos pueden ser transferidos a placas frescas de medio anterior después de 2 semanas. Después de otras dos semanas, los discos de hoja se pueden transferir sobre placas que contienen LS + 3% de sacarosa + 0.5mM BAP suplementado con 500 mg/1 de cefotaxima y 100 mg/1 de kanamicina. Los discos de hoja pueden ser transferidos a medio fresco cada dos semanas. Como aparecen brotes, pueden ser extirpados y transferidos a frascos de LS + 3% de sacarosa + o.5mM BAP suplementado con 500 mg/1 claforan. Los brotes en los frascos pueden ser transferidos a LS + 3% de sacarosa + 250 mg/1 cefotaxima después de aproximadamente 3 semanas. Después de otras 3-4 semanas las plantas pueden ser transferidas a LS + 3% de sacarosa (sin antibióticos) y con raíces. Una vez que las plantas tienen sus raíces pueden ser transferidas al suelo en el invernadero.

En un duodécimo aspecto, se proporciona un producto de propagación de plantas obtenible a partir de la planta transgénica de acuerdo con cualquiera del sexto o noveno aspecto.

Un "producto de propagación de la planta" puede ser cualquier materia vegetal tomada de una planta de la que nuevas plantas pueden ser producidas. Adecuadamente, el producto de propagación de plantas puede ser una semilla. El producto de propagación de plantas puede comprender preferiblemente un constructo o vector de acuerdo con la invención o un gen exógeno.

En un decimotercero aspecto de la invención, se proporciona una hoja cosechada que contiene un nivel más bajo de nitrato que el nivel correspondiente de nitrato en una hoja cosechada tomada de una planta de tipo silvestre cultivadas bajo las mismas condiciones, en donde la hoja es cosechada de la planta transgénica de acuerdo con cualquiera del sexta o noveno aspecto, o producida por el método de acuerdo con cualquiera del cuarto o quinto aspecto.

En un decimocuarto aspecto de la invención, se proporciona un producto de tabaco que comprende tabaco reducido en nitrato obtenida a partir de una planta de tabaco mutante que comprende el constructo del primer aspecto o el vector del segundo aspecto, que el mutante es capaz de disminuir la concentración de nitrato en sus hojas.

Se prefiere que la planta de tabaco mutante a partir del cual se deriva el tabaco en el producto de tabaco comprende un constructo, vector o gen exógeno de acuerdo con la invención.

El producto del tabaco puede ser producto de tabaco sin humo, como el rapé. El producto del tabaco puede ser un producto de tabaco de uso oral que se puede entregar por la boca. El producto del tabaco puede ser húmedo, y puede ser mascado. Sin embargo, el producto de tabaco también puede ser un artículo para fumar.

Así, en un decimoquinto aspecto, se proporciona un artículo para fumar que comprende tabaco reducido en nitrato obtenido a partir de una planta de tabaco mutante que comprende el constructo del primer aspecto o el vector del segundo aspecto, que el mutante es capaz de disminuir la concentración de nitrato en sus hojas.

El tabaco reducido en nitrato puede incluir tabaco en el que la concentración de nitrato es menor que la concentración correspondiente en una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones. Tal artículo para fumar puede comprender tabaco obtenido de una planta de tabaco mutante, que puede haber sido transformada con un constructo genético de acuerdo con el primer aspecto de la invención, o un vector de acuerdo con el segundo aspecto, o un gen exógeno. Preferiblemente, la planta de tabaco mutante comprende el intercambiador de anión-protón AtCLC-b, que puede comprender la secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en SEQ ID No. 2, o una variante funcional o fragmento u ortólogo de la misma. ATCLC-b puede comprender la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se establece en SEQ ID No. 1, o una variante funcional o fragmento u ortólogo de la misma.

El término "artículo para fumar" puede incluir productos fumables, tal como el tabaco de liar, cigarros, puros y puritos que se base en el tabaco, los derivados del tabaco, tabaco expandido, tabaco reconstituido o sustitutos del tabaco y también productos de calor-no-quema.

Se apreciará que la invención se extiende a cualquier ácido nucleico o péptido o variante, derivado o análogo del mismo, que comprende sustancialmente la secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico de cualquiera de las secuencias que se refiere el presente documento, incluyendo las variantes funcionales o fragmentos funcionales de los mismos. Los términos ''sustancialmente el aminoácido/polinucleótido/secuencia de polipéptido ", "variante funcional" y "fragmento funcional", pueden ser una secuencia que tiene al menos 40% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácido/polinucleótido/polipéptido de cualquiera de las secuencias de las que se hace referencia en el presente documento, por ejemplo 40% de identidad con el gen identificado como SEQ ID No.1 (que codifica una modalidad de un intercambiador de anión/protón), o 40% de identidad con el polipéptido identificado como SEQ ID No. 2 (es decir, una modalidad de un intercambiador de un anión/protón).

Las secuencias de aminoácidos/polinucleótido/polipéptido con una identidad de secuencia que es mayor que 65%, más preferiblemente mayor que 70%, incluso más preferiblemente mayor que 75%, y aún más preferiblemente mayor que 80% de identidad de secuencia a cualquiera de las secuencias mencionadas que también se prevé. Preferiblemente, la secuencia de aminoácido/polinucleótido/polipéptido tiene al menos 85% de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas, más preferiblemente al menos 90% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 92% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 95% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 97% de identidad, incluso más preferiblemente al menos 98% de identidad y, más preferiblemente al menos 99% de identidad con cualquiera de las secuencias mencionadas en este documento.

El téenico experto apreciará cómo calcular el porcentaje de identidad entre las secuencias de dos aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos. Con el fin de calcular el porcentaje de identidad entre las secuencias de aminoácidos/polinucleótidos/polipéptidos, una alineación de las dos secuencias se debe preparar primero, seguido por el cálculo del valor de identidad de secuencia. El porcentaje de identidad de dos secuencias puede tomar diferentes valores dependiendo de: - (i) el método utilizado para alinear las secuencias, por ejemplo, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman (implementado en diferentes programas), o la alineación estructural de la comparación 3D ; y (ii) los parámetros utilizados por el método de alineación, por ejemplo, alineación local contra global, la matriz de puntos-par utilizada (por ejemplo BLOSUM62, PAM250, Gonnet, etc), y hueco-pena, por ejemplo, la forma funcional y constantes.

Después de haber realizado la alineación, hay muchas maneras diferentes de calcular el porcentaje de identidad entre las dos secuencias. Por ejemplo, una puede dividir el número de identidades por: (i) la longitud de la secuencia más corta; (ii) la longitud de la alineación; (iii) la duración media de la secuencia; (iv) el número de posiciones sin huecos; o (iv) el número de posiciones equiparadas excluyendo los salientes. Además, se apreciará que el porcentaje de identidad es también fuertemente dependiente de longitud. Por lo tanto, mientras más corto sea un par de secuencias, más alta será la identidad de la secuencia que se puede esperar que ocurra. Por lo tanto, se apreciará que la alineación precisa de proteínas o secuencias de ADN es un proceso complejo. El programa de alineación múltiple popular ClustalW (Thompson et al, 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al, 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4.876-4.882) es una forma preferida para la generación de alineaciones múltiples de proteínas o ADN de acuerdo con la invención. Parámetros adecuados para ClustalW pueden ser como sigue: Para alineaciones de ADN: Pena de abertura de hueco = 15.0, Pena de extensión de hueco= 6.66, y Matriz= Identidad. Para alineaciones de proteínas: Pena de abertura de hueco = 10.0, Pena de extensión de hueco = 0.2, y Matrix = Gonnet. Para alineaciones de ADN y proteínas: ENDGAP = -1, y GAPDIST = 4. Los expertos en la téenica serán conscientes de que puede ser necesario variar estos y otros parámetros para la alineación de la secuencia óptima.

Preferiblemente, el cálculo de las identidades porcentuales entre dos secuencias de aminoácido/polinucleótido/polipéptido se calcula entonces a partir de una alineación tal como (N/T)*100, donde N es el número de posiciones en las que las secuencias comparten un residuo idéntico, y T es el número total de posiciones en comparación incluidos los huecos, pero excluyendo los salientes. Por lo tanto, un método más preferido para calcular el porcentaje de identidad entre dos secuencias comprende (i) preparar una alineación de secuencia usando el programa ClustalW utilizando un conjunto adecuado de parámetros, por ejemplo, como se indica anteriormente; y (ii) insertar los valores de N y T en la fórmula siguiente: - La identidad de secuencia = (N/T)*100.

Los métodos alternativos para identificar secuencias similares serán conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos sustancialmente similar será codificado por una secuencia que se hibridiza con las secuencias mostradas en SEQ ID No.l, o sus complementos en condiciones rigurosas . Por condiciones rigurosas, nos referimos al nucleótido que se hibridiza para filtrar-unir un ADN o ARN en cloruro de sodio 3x/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C seguido por al menos un lavado en o.2x SSC/0.1% SDS a aproximadamente de 20-65°C. Alternativamente, un polipéptido sustancialmente similar puede diferir en al menos 1, pero menos de 5, 10, 20, 50 ó 100 aminoácidos de las secuencias mostradas en SEQ ID No.2.

Debido a la degeneración del código genético, es evidente que cualquier secuencia de ácido nucleico podría variarse o cambiarse sin afectar sustancialmente la secuencia de la proteína codificada por el mismo, para proporcionar una variante funcional del mismo. Variantes de nucleótidos adecuados son aquellos que tienen una secuencia alterada por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo aminoácido dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Otras variantes adecuadas son aquellas que tienen secuencias de nucleótidos homologas pero que comprende todas, o porciones de, la secuencia, que se alteran por la sustitución de diferentes codones que codifican un aminoácido con una cadena lateral de propiedades biofísicas similares al aminoácido que sustituye, para producir un cambio conservador. Por ejemplo los aminoácidos hidrofóbicos no polares pequeños incluyen glicina, alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina y metionina. Los aminoácidos hidrofóbicos no polares grandes incluyen fenilalanina, triptófano y tirosina. LOS aminoácidos polares neutros incluyen serina, treonina, cisterna, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen lisina, arginina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) amino incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Por lo tanto, se apreciará que los aminoácidos pueden ser sustituidos con un aminoácido que tiene propiedades biofísicas similares, y el téenico experto conocerá las secuencias de nucleótidos que codifican estos aminoácidos.

Con el fin de abordar diversas cuestiones y avanzar en la técnica, la totalidad de esta divulgación muestra a modo de ilustración varias modalidades en las que la invención(es) reclamada tal vez practicada y para proporcionada para un método superior para reducir la concentración de nitrato en las hojas de las plantas transgénicas. Las ventajas y características de la divulgación son de una muestra representativa de sólo modalidades, y no son exhaustivas y/o exclusivas. Se presentan sólo para ayudar en la comprensión y enseñar las características reivindicadas. Se ha de entender que las ventajas, modalidades, ejemplos, funciones, características, estructuras y/o en otros aspectos de la divulgación no deben ser consideradas limitaciones en la divulgación como se define por las reivindicaciones o limitaciones en equivalentes de las reivindicaciones, y que otras modalidades pueden ser utilizadas y las modificaciones pueden ser hechas sin apartarse del alcance y/o espíritu de la divulgación. Diversas modalidades pueden comprender de manera adecuada, consistir en, o consistir esencialmente en, varias combinaciones de los elementos divulgados, componentes, características, partes, etapas, medios, etc. Además, la divulgación incluye otras invenciones no reivindicadas actualmente, pero que pueden ser reclamadas en el futuro.

Todas las características descritas en el presente documento (incluyendo cualquier reivindicación adjunta, resumen y dibujos), y/o todas las etapas de cualquier método o proceso divulgados, se puede combinar con cualquiera de los aspectos anteriores en cualquier combinación, excepto combinaciones donde al menos algunas de tales características y/o etapas son mutuamente excluyentes. Para una mejor comprensión de la invención, y para mostrar cómo las modalidades de la misma puede ser llevada a efecto, se hará ahora referencia, a modo de ejemplo, a las figuras que se acompañan, en las cuales: - La figura 1 muestra las estructuras químicas de diversas nitrosaminas del humo del tabaco, 4- (Metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK), N-nitrosonornicotina (N N), N-Nitrosoanabasina (NAB) y N-Nitrosoanatabina (NAT); La Figura 2 es un mapa plásmido de una modalidad de un constructo de acuerdo con la invención, conocido como PGNP024 0140 001. El constructo incluye el gen intercambiador de anión/protón Atclc-b bajo el control del promotor del Virus del anillo grabado del clavel (CERV); La Figura 3 muestra el perfil de aminoácido en la hoja media de tres líneas Ti (es decir, 4, 7 y 8) que alberga la el promotor CERV::CLCb constructo (tipo silvestre [WT] Virginia40 actuó como control); y La 'Figura 4 muestra la concentración de nitrato en las hojas medias de tres líneas Ti (es decir, 4, 7 y 8) que albergan el promotor CERV::CLCb constructo (Tipo silvestre [WT] Virginia40 actuó como control).

Descripción y ejemplos detallados Los inventores han desarrollado un constructo, como se muestra en la Figura 2, y lo han usado para crear líneas de plantas transgénicas que sobre-expresan el gen intercambiador de anión/protón de Arabidopsis thaliana clc-b bajo el control del promotor constitutivo, promotor del Virus del anillo grabado del clavel (CERV), (Hull et al, 1986, EMBO J., 5, 3083 a 3090).

Ejemplo 1 - Aislamiento del gen intercambiador de anión/protón Arabidopsis thaliana El gen intercambiador de anión/protón Arabidopsis thaliana utilizado en estos experimentos fue Atclc-b.

Diseño de primers La secuencia genómica de longitud completa que codifica para el intercambiador de anión/protón de Arabidopsis thaliana CLC-b se identificó (Número de Acceso para las secuencias fue: AAD29679. Los primers para uso en PCR para aislar la secuencia genómica fueron diseñados, los cuales fueron de cola en el extremo 5' con un espaciador 4 pb y sitios de restricción adecuados. Los sitios de restricción attB se generaron en el extremo 5'y extremo 3' del fragmento para permitir la clonación de los fragmentos en vectores apropiados.

Se apreciará por la persona experta que otros primers de PCR pueden diseñarse incorporando las características requeridas de los primers y los sitios de enzimas de restricción alternativos.

Aislamiento de ADNc Arabidopsis que codifica CLC-b Arabidopsis thaliana var. Columbia ARN se extrajo de las hojas de roseta de plantas de 3 semanas de edad utilizando el equipo fácil de Qiagen KNA. Brevemente, el ARN fue extraído de muestras de hojas usando un equipo fácil QIAGEN fácil RNA (Qiagen Ltd, Crawlcy, Reino Unido), siguiendo las instrucciones del fabricante. Este método proporciona grandes cantidades de ARN muy limpio adecuado para estrategias de aislamiento de genes y clonación. ADNc se preparó a partir de las muestras de ARN utilizando el equipo RETROscript(Ambion) para la síntesis de primera hebra siguiendo las instrucciones del fabricante usando primers aleatorios.

Aislamiento de fragmentos de ADN del intercambiador de anión/protón clc-b La secuencia de Arabidopsis clc-b es 2355bp de largo (número de acceso ADD29679). ADNc que codifica Arabidopsis clc-b se amplificó con pares de primers SEQ ID No.4 y SEQ ID NO. 5, lo que generó sitios de restricción attB en el extremo 5' y sitios de restricción attB en el extremo 3' del fragmento.

Adelante hIGG7CCAAGAñ,GAT7iAAA€C [SEQ ID No.4] Inverso rCAATG'fGXC c rrc CACO [SEQ ID NO.5] Condiciones de PCR para Arabidopsis clc-b Programa de ciclo: 1 ciclo de 94°C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 2 minutos, esto fue seguido por 1 ciclo de 72°C durante 5 minutos, seguido por el mantenerlo a 4°C. Se aisló la banda usando Advantage 2 de la polimerasa (Clonetech) siguiendo las instrucciones del fabricante. Purificación en gel de los fragmentos se llevó a cabo mediante la ejecución de los fragmentos en un 1% de Tris acetato EDTA (TAE) gel de agarosa de cristal violeta utilizando un equipo libre de SWAT UV (Invitrogen). Una alícuota de las reacciones de PCR se analizaron a continuación mediante electroforesis en gel de agarosa. Las reacciones se precipitaron y luego almacenadas. Fragmentos de ADN de intercambiador /anión de Clc-b fueron clonados después en el vector pCR8 TOPO (disponible de Invitrogen), como se describe a continuación.

Las reacciones de ligación para Arabidopsis clc-b 1 ml pCR8 TOPO fue tomada con 1 m? de solución salina, y 4 m? reacción de PCR. La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 10 minutos. 4 m? de la mezcla de reacción de ligación fue tomada con células TOP10 de E. coli , y luego se dejó en hielo durante 5 minutos. Las células tuvieron un choque térmico a 42°C, y luego se dejaron en hielo durante 5 min. Las células fueron incubadas en 250m1 SOC durante 2 horas. Las células se pusieron en placas de agar que contienen espectinomicina (100qg/ml) y se dejó durante la noche a 37°C. Las células que contienen plásmidos crecieron en colonias. 10 colonias individuales se seleccionaron y se cultivaron en el medio LB y se observaron para cada secuencia génica. Se hicieron mini preparación (Qiagen) para cada colonia individual y una digestión de restricción utilizando EcoRI y Xhol se utilizó para determinar si el gen se había incorporado en el vector PCR8-TOPO.

Las colonias individuales fueron recogidas para cada secuencia que contiene el tamaño esperado del fragmento de PCR. Las colonias individuales se hicieron crecer y el ADN plasmídico se extrajo por análisis de la secuencia. Estos fueron enviados a Beckman Coulter para la secuenciación con los primers mostrados a continuación (es decir, SEQ ID No. 6 y SEQ ID No.7).

MI3F (Adelante) [SEQ ID NO.6] M13R (Inversa) AS ALL ZAS CIA IGA CCA ! [SEC ID No.7] El análisis de secuencia El análisis de la secuencia mostró que los clones contenían el anión/gen intercambiador de Atclc-b.

Ejemplo 2 - La construcción de vectores para la transformación del tabaco Clonación de ADNc que codifica Atclc-b en un vector binario Los pCR8 plásmidos que contienen el gen clc-b se recombinaron con el vector de destino pGBNPCERV Gateway (Invitrogen) junto con la mezcla de enzima II clonasa LR y tampón TE. Esto se incubó a 25°C durante la noche y luego Iml de proteinasa K se añadió para detener la reacción. El vector transformado se utilizó posteriormente para transformar células de electrocompetentes E . coli . El vector pBNP es un vector en-casa creado a partir del vector binario pBNP (van Engelen et al, 1995, Transgenic Research, 4: 288-290) que se hizo Gateway listo usando el equipo de conversión Gateway (Invitrogen), que contiene el promotor CERV y el terminador de la nopalina sintasa. Las células que contienen el plásmido se seleccionaron en placas de kanamicina. Los clones se aislaron y se extrajo el ADN y se analizó por digestión de restricción seguido por secuenciación.

El promotor CERV es un promotor constitutivo del grupo caulimovirus de virus de plantas. Se aisló y caracterizó en 1986 por Hull et al. y es característico de CaMV (Hull et al., 1986), pero tiene poca similitud de secuencia con el promotor CaMV 35S.

El siguiente vector binario se produjo: PGNP024 0140 001 (T1325) (véase la Figura 2): promotor del Virus del anillo grabado del clavel (CERV): Clc-b ADNc: terminador Nos. El vector binario se transformó en Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 por electroporación. Esto se realizó mediante la mezcla de 40 ml de células electrocompetentes A. tumefaciens y 0.5 mg de ADN plásmido, y colocando en una cubeta enfriada anteriormente. Las células fueron luego a electroporacionada en 1.5 voltios, 600 ohmios y 25 pFD. Se añadieron 1 mi de 2YT medio a la cubeta y la mezcla se decantó en un contenedor universal de 30 mi y se incubaron a 28°C durante 2 horas en una incubadora con agitación.100 ml de las células se pusieron en placas sobre kanamicina (50 mg/ml) y estreptomicina (100 pg/ml) placas de agar LB. Las placas se dejan incubar durante 2 días a 28°C.

Ejemplo 3 - Transformación de tabaco Las plantas PH2517 Burley se transformaron con PGNP024 0140 001 utilizando el método del co-cultivo de la hoja de disco, como se describe por Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985). Las dos hojas expandidas más jóvenes fueron tomadas de plantas de tabaco de 7-semanas de edad y estaban esterilizadas-en la superficie en 8% Domestos durante 10 minutos y lavadas 3 veces con agua destilada estéril. Los discos de hoja despúés se cortaron usando un taladracorcho del número 6 y colocada en la suspensión de Agrobacterium transformada durante aproximadamente dos minutos. Los discos se transfirieron gentilmente entre dos hojas de papel de filtro estéril.10 discos se colocaron en MS 3% de sacarosa + placas de 2.2mM BAP + o.27mM NAA, que luego se incubaron durante 2 días en la sala de crecimiento. Los discos se transfirieron a placas de MS + 3% de sacarosa + 2.2mM BAP + 0.27 mM NAA suplementadas con 500 g/1 de Cefotaxima y 100 g/1 de kanamicina.

Los discos se transfirieron a placas frescas del medio anterior después de 2 semanas. Después de otras dos semanas los discos de hoja se transfirieron a placas que contienen LS + 3% de sacarosa + 0.5mM BAP suplementado con 500 mg/1 de Cefotaxima y 100 mg/1 de kanamicina. Los discos de hojas se transfirieron a medio fresco cada dos semanas. Como aparecieron brotes, que se extirparon y se transfirieron a frascos de LS + 3% de sacarosa + o.5mM BAP suplementado con 500 mg/1 de Cefotaxima. Los brotes en frascos fueron transferidos a LS + 3% de sacarosa + 250 mg/1 de Cefotaxima después de aproximadamente 3 semanas. Después de otras 3-4 semanas, las plantas se transfirieron finalmente a LS + 3% de sacarosa (sin antibióticos) y con raíces. Una vez que las plantas con raíces se transfirieron al suelo en el invernadero.

Ejemplo 4 - Análisis de tabaco "medio" el contenido de nitrato en la hoja (plantas Ti) .La cuantificación de los niveles de nitrato y/o nitrito en plantas de tipo silvestre y transgénicas Virginia40 se realizó utilizando HPLC. Este método para determinar las concentraciones de nitrato en los tejidos vegetales se describe en Sharma et al., 2008 (Malaria Journal, 7: pp71). HPLC proporciona mediciones altamente precisas de los niveles de nitrato y/o nitrito a partir de muestras de plantas y también reduce las preocupaciones asociadas con el manejo de agentes peligrosos debido al aumento de nivel de automatización asociada con la metodología.

Los materiales son: Tampón de corrida:5mM K2HPO4, 25M KH2P04 en pH3 Tampón de extracción: 5mM K2HP04, 25mM KH2P04 en pH3 Método: En primer lugar, se añade 2 mi del tampón de fosfato a 250-300 mg de material de hojas de suelo y se homogeneizaron en un mortero con una mano de mortero. Estos índices se pueden modificar de acuerdo con el nivel esperado de nitrato. El homogeneizado se centrifuga a 16000 rpm a +4°C durante 10 minutos. 1 mi del sobrenadante se filtra a continuación a través de un filtro de jeringa (0.2 pm) en un vial de HPLC. Las curvas estándar de nitrato y nitrito fueron construidas con rangos de concentraciones de 0-1 mM de nitrato y 0 a 100 mM para el nitrito. El volumen de inyección es 20m1.

La identificación de pico se realiza de acuerdo a la sincronización de pico. La sincronización de pico es variable dependiendo de la columna de edad y un número de otros factores. Así, los estándares deben ser utilizados para evaluar la posición de pico y relacionar esto al pico sin tiempo en las muestras.

Los resultados de nitrato ilustrados en la Figura 3 muestran que hay una disminución de la concentración de nitrato en la hoja de las plantas transformadas que albergan el constructo CRV-AtClcb de la invención. A pesar de que no quieren imponer ninguna teoría, los inventores formulan la hipótesis de que la proteína AtClcb está actuando como un removilizador de nitrógeno. Estos resultados en las hojas están siendo agotados de nitrato.

Ejemplo 5 - Análisis del tabaco "medio" contenido de aminoácido en la hoja (plantas Ti) La fisiología de una hoja es dependiente de su posición en relación con el resto de la planta. Por lo tanto, los productores de tabaco deben tener en cuenta esta información cuando se considera lo que el sabor de una hoja puede poseer.

Durante la floración, un proceso llamado removilización se produce, lo que resulta en el transporte de nutrientes, tales como aminoácidos y compuestos nitrogenados, fuera de la base de la planta hacia la parte superior de la planta. Además, los nutrientes removilizados serán utilizados como fuente de energía para la producción de semillas. Por lo tanto, las hojas inferiores y superiores tendrán un contenido de nitrógeno diferente ilustrado por un perfil de aminoácidos diferente.

Los aminoácidos se analizan de forma rutinaria utilizando el EZ: equipo Faast LC / MS suministrado por Phenomenex. El equipo proporciona reactivos, consumibles para permitir la derivatización simultánea de aminoácidos a partir de una muestra de tejido de tal manera que se pueden separar y detectar dentro de un solo procedimiento de la QTrap LC/MS.

Los principios del método son: El procedimiento consiste en una etapa de extracción de fase sólida seguido de una derivatización y una extracción líquido/líquido; muestras derivatizadas se analizan luego por la cromatografía de líquidos-espectrometría de masas. La extracción en fase sólida se lleva a cabo a través de una punta llena de sorbente que une los aminoácidos mientras permite los compuestos de interferencia que fluyan a través. Los aminoácidos en sorbente se extruyen a continuación, en el vial de muestra y rápidamente son derivatizados con el reactivo a temperatura ambiente en una solución acuosa. Los aminoácidos derivatizados de forma concomitante migran a la capa orgánica para una -separación adicional de los compuestos de interferencia. Después se retira la capa orgánica, evaporada y se volvió a disolver en la fase móvil acuosa y se analizó en un sistema LC/MS.

Todos los reactivos y simunistros (incluyendo la columna de HPLC) son componentes del equipo. Todas las etapas del procedimiento se detallan en el manual del usuario KHO-7337 y KHo- 7338 que se utilizan como un protocolo.

La Figura 4 abrevia el efecto de la sobreexpresión de AtClcb en la concentración de Glu, Asp, Pro, Gin y Asn (es decir, aminoácidos que se cree que están implicados en la vía de asimilación del nitrógeno de las plantas) en tres líneas de plantas (es decir, 4, 7 y 8 ). Esta figura muestra claramente que las plantas que alberga el AtClcb un constructo intercambiador de anión/protón muestran una reducción significativa (en comparación con las hojas medias de su equivalente de tipo silvestre) en la concentración de todos los aminoácidos medidos.

En vista de la reducción del contenido de nitrato de las hojas de la planta de prueba, como se muestra en el Ejemplo 4, y el contenido de aminoácidos reducido de las hojas medias de las tres líneas de plantas analizadas, los inventores concluyeron que hay nitrato reducido disponible para la formación de TSNA en las hojas de las plantas que sobreexpresan CRV-AtClcb, lo cual claramente sería ventajoso para las plantas de tabaco. Además, la manipulación de los perfiles de aminoácidos se puede utilizar para modificar el sabor del tabaco. ??

Claims (34)

REIVINDICACIONES

1. Un constructo genético que comprende un promotor unido operativamente a una secuencia de codificación que codifica un polipéptido, que es un intercambiador de anión/protón que tiene actividad transportadora de nitrato, con la condición de que el promotor no es el virus del mosaico de la coliflor 35S.

2. Un constructo genético de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor es un promotor constitutivo, no-constitutivo, específico del tejido, de desarrollo regulado o inducible/represible.

3. Un constructo genético de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque el promotor es el promotor del Virus del anillo grabado del clavel (CERV), el promotor de plastocianina de chícharo, el promotor de la rubisco, el promotor de la nopalina sintasa, promotor de unión la clorofila a/b, el promotor de glutenina de alto peso molecular, el promotor de a, b-gliadina, el promotor de hordeína, el promotor de patatina, o un promotor específico de la senescencia.

4. Un constructo genético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el promotor es el promotor del Virus del anillo grabado del clavel (CERV), opcionalmente en donde el promotor comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente como se establece en la SEQ ID No.3, o una variante funcional o fragmento funcional de la misma.

5. Un constructo genético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en SEQ ID No. 2, o una variante funcional o fragmento u ortólogo de la misma.

6. Un constructo genético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia de codificación comprende una secuencia de ácido nucleico sustancialmente como se establece en SEQ ID No.l, o una variante funcional o fragmento u ortólogo de la misma.

7. Un constructo genético de conformidad cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia de codificación se deriva de Arabidopsis sp . , Oryza spp. , Populus spp. o Nicotiana spp. .

8. Un constructo genético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia de codificación se deriva de Arabidopsis thaliana, Oryza saliva, Populus trémula o Nicotiana tabacum.

9. Un vector recombinante que comprende el constructo genético de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Un método para disminuir la concentración de nitrato en las hojas de una planta de prueba por debajo de la concentración de nitrato correspondiente en hojas de una planta de tipo silvestre cultivadas bajo las mismas condiciones, el método comprende: - (i) transformar una célula vegetal con el constructo genético de acuerdo con el constructo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o el vector de acuerdo con la reivindicación 9; y (ii) regenerar una planta a partir de la célula transformada.

11. Un método para producir una planta transgénica que transporta nitrato fuera de una hoja a una velocidad más alta que una planta de tipo silvestre correspondiente cultivada bajo las mismas condiciones, el método comprende: (i) transformar una célula vegetal con el constructo genético de acuerdo con el constructo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o el vector de acuerdo con la reivindicación 9; y (ii) regenerar una planta a partir de la célula transformada.

12. Un método para producir una planta transgénica, el método comprende en introducir, en una planta no modificada, un gen exógeno que codifica un polipéptido, que es un intercambiador de anión/protón que tienen una actividad transportadora de nitrato, en donde la expresión del transportador de nitrato codificada por el gen exógeno reduce la concentración de nitrato en las hojas de la planta transgénica con respecto a la concentración de nitrato en las hojas de la planta no modificada.

13. Una planta transgénica que comprende el constructo genético de acurdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o el vector de acurdo con la reivindicación 9.

14. Una planta transgénica que comprende un gen exógeno que codifica un polipéptido, que es un intercambiador de anión/protón que tiene actividad transportadora de nitrato, y en donde la concentración de nitrato en las hojas de la planta transgénica se reduce en comparación con la concentración de nitrato en las hojas de una planta no modificada.

15. El uso de una secuencia de ácido nucleico exógeno que codifica un polipéptido, que es un intercambiador de anión/protón que tiene actividad transportadora de nitrato, para reducir la concentración de nitrato en hojas de plantas por la transformación de la planta con la secuencia de ácido nucleico exógena.

16. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 14, o un uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos sustancialmente como se establece en SEQ ID No. 2, o una variante funcional o fragmento u ortólogo de la misma.

17. Un método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 14, o un uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el gen exógeno comprende la secuencia de nucleótidos sustancialmente como se establece en SEQ ID No.1, o una variante funcional o fragmento u ortólogo de la misma.

18. Una célula huésped que comprende el constructo genético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o el vector de acuerdo con la reivindicación 9.

19. Una célula huésped de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la célula es una célula vegetal.

20. Un método de conformidad con la reivindicación 12, una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 14, o un uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la planta es de la familia Brasicáceas, tales como Brassica spp. , y es preferiblemente Brassica napus (colza) .

21. Un método de conformidad con la reivindicación 12, una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 14, o un uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la planta es de la familia poales, tales como Tri ticeae spp. , y es preferiblemente Tri ticum spp. (Trigo).

22. Un método de conformidad con la reivindicación 12, una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 14, o un uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la planta es de la familia Solanáceas, por ejemplo estramonio, la berenjena, la mandrágora, la belladona (belladonna), pimiento (pimentón, chile), la papa y el tabaco.

23. Un método de conformidad con la reivindicación 12, una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 14, o un uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la planta es del género Nicotiana, preferiblemente tabaco.

24. Un método de conformidad con la reivindicación 12, una planta transgénica de conformidad con la reivindicación 14, o un uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la planta es de la familia Asteráceas de las plantas que, por ejemplo, lechuga (Lactuca sativa), o de la familia Chenopodiaceae de las plantas, que incluye Spinacia olerácea y Beta vulgaris.

25. Un producto de propagación de plantas obtenibles a partir de la planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14.

26. Una hoja cosechada que contiene un nivel más bajo de nitrato de que el nivel correspondiente de nitrato en una hoja cosechada tomada de una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones, en donde la hoja es cosechada de la planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 13 o la reivindicación 14, o producido por el método de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12.

27. Un producto de tabaco que comprende un tabaco reducido en nitrato obtenido a partir de una planta de tabaco mutante que comprende el constructo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o el vector de acuerdo con la reivindicación 9, que el mutante es capaz de disminuir la concentración de nitrato en sus hojas .

28. Un producto de tabaco de conformiadad con la reivindicación 27, caracterizado porque el producto de tabaco es un producto de tabaco sin humo, tales como rapé, o un producto de tabaco oral entregable en la boca, como mascado, o un artículo para fumar.

29. Un artículo para fumar que comprende tabaco reducido en nitrato obtenido a partir de una planta de tabaco mutante que comprende el constructo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o el vector de acuerdo con la reivindicación 9, que el mutante es capaz de disminuir la concentración de nitrato en sus hojas .

30. Un método para modular el perfil de aminoácidos implicados en la asimilación de nitrógeno de hojas de una planta de prueba en comparación con el perfil de aminoácidos de hojas correspondientes de una planta de tipo silvestre cultivadas bajo las mismas condiciones, el método comprende: - (i) transformar una célula vegetal con el constructo genético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o el vector de acuerdo con la reivindicación 9; y (ii) regenerar una planta a partir de la célula transformada.

31. un método para modular el perfil de aminoácidos implicados en la vía de asimilación de nitrógeno de una hoja cosechada tomada de una planta transgénica, en comparación con el perfil de aminoácidos de una hoja cosechada correspondiente tomada de una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones, en donde la hoja es cosechada de una planta transgénica producida por el método de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12

32. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30 ó 31, caracterizado porque los aminoácidos implicados en la vía de asimilación de nitrógeno de las plantas y sus hojas pueden comprender glutamina (Gln), asparagina (Asn), ácido aspártico (Asp), ácido glutámico (Glu) o prolina (Pro).

33. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-32, caracterizado porque el constructo es capaz de disminuir o aumentar, en una planta transformada con el constructo, la concentración de al menos un aminoácido implicado en la vía de asimilación de nitrógeno por al menos 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 56%, 60%, 64%, 65%, 70% ó 75% en comparación con la concentración de al menos un aminoácido en una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones.

34. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-33, caracterizado porque el constructo es capaz de disminuir la concentración de aminoácidos, Glu, Asp, Pro, Gin y/o Asn, en las hojas medias de una planta transgénica en comparación con las hojas correspondientes que se encuentran en una planta de tipo silvestre cultivada bajo las mismas condiciones.