MX2014011136A - Peptidos cancerigenos universales derivados de telomerasa. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un péptido de 15 a 20 aminoácidos que se derivan de la proteína TERT, el péptido que es capaz de (i) ligarse a la HLA clase II y (ii) estimular una respuesta Th CD4. Estos péptidos cancerígenos universales son especialmente útiles en la inmunoterapia anti-tumor e inmunomonitoreo.

Description

PÉPTIDOS CANCERÍGENOS UNIVERSALES DERIVADOS DE TELOMERASA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a péptidos epitópicos que se derivan de telomerasa. Estos péptidos son péptidos cancerígenos universales (UCPs) que se ligan a los alelos MHC clase II (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) más comúnmente encontrados. Los péptidos de la invención son capaces de estimular una respuesta Th CD4. Estos péptidos cancerígenos universales son especialmente útiles en la inmunoterapia anti-tumor e inmunomonitoreo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La reciente introducción de la inmunoterapia en la práctica clínica (Kantoff y colaboradores, Robert y colaboradores) enfatizó la influencia de respuestas inmunitarias en la prognosis de cáncer y efectividad de la quimioterapia. Entre las células inmunitarias adaptativas implicadas en las respuestas anti-tumor, se ha considerado que las células T CD8 (CTL) son los protagonistas principales debido a que muestran actividad citotóxica hacia células tumorales que expresan antígenos asociados a tumor (TAAs). Sin embargo, ahora es claro que los linfocitos T auxiliares 1 (Thl) CD4 también desempeñan una función crítica en organizar la respuesta anti-tumor. Estas células, caracterizadas principalmente por la producción de INF-g, son criticas para la inducción y mantenimiento de células T CD8 contra tumores al proporcionar ayuda a través de múltiples interacciones (Shedlock y colaboradores). Las células Thl CD4 también pueden ejercer actividad anti-tumor que es independiente de las células T CD8 al reclutar y al activar la célula inmune innata tal como exterminadores naturales y macrófagos (Kennedy y colaboradores, Perez-Diez y colaboradores). La IFN-g secretada por las células Thl CD4 también media el efecto anti-tumor o anti-angiogénico directo (Street y colaboradores). Una nueva dirección de la función de las células Thl CD4 durante el cáncer también se reporta. Se ha mostrado que las células T CD4 deben facilitar el camino para la entrada de células T exterminadoras en el sitio del tumor (Bos y colaboradores) o la mucosa infectada (Nakanishi y colaboradores). Adicionalmente, las células Thl CD4 son requeridas para la inducción de senescencia celular e inhibición de angiogénesis dando por resultado una regresión de tumor sostenida en activación del oncogén MYC o BCR-ABL en un modelo de tumor de ratón (Rakhra y colaboradores). En un humano, la alta densidad de células Thl CD4 se han mostrado como buenos marcadores de pronóstico en el cáncer colorectal (Tosolini y colaboradores). De esta manera, la estimulación de células Thl CD4 es significativa para mejorar las respuestas anti-tumor. A pesar del reciente progreso que indica que los parámetros inmunitarios pre-terapéuticos afectan la eficacia de las quimioterapias convencionales (Fridman y colaboradores, Zitvogel y colaboradores), poco se sabe a cerca de la relación entre la inmunidad de Thl CD4 especifica de tumor y la eficacia de la quimioterapia.

Las células Th CD4 reconocen péptidos de 15 a 20 aminoácidos presentados por las moléculas MHC clase II. Las moléculas MHC en humanos son formalmente referidas como moléculas HLA (antigeno Asociado al Leucocitos Humanos). Existen dos clases principales de moléculas HLA, HLA clase I y HLA clase II. Las moléculas HLA clase I activan principalmente las células T citotóxicas CD8+ mientras que las moléculas HLA clase II activan principalmente las células T CD . Las moléculas HLA clase II se codifican por 3 sitios diferentes que son: HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Sin embargo, las respuestas de células T CD4 descritas frecuentemente en la investigación del cáncer se restringen a la molécula HLA clase II codificada por el sub-sitio HLA-DR. La identificación de los péptidos degenerados de los TAAs relevantes capaces de ligarse a múltiples moléculas HLA clase II puede conducir a la mejora de la vacuna de cáncer y a monitorear la inmunidad de células T CD4. Durante los años anteriores, diferentes grupos se han enfocado en la identificación de epitopos de células T CD4 de los TAAs que se pueden utilizar para mejorar la inmunoterapia anti-cáncer. (Kobayashi y colaboradores, 2008, Campi y colaboradores, 2003, Kobayashi y colaboradores, 2000). Sin embargo, la identificación de los epitopos HLA clase II de los TAAs se limita debido a su heterogeneidad importante. De hecho, el sitio HLA clase II es muy polimórfico y tiene muchas variantes, de esta manera, encontrando que los péptidos capaces de ligación a múltiples variantes alélicas de HLA-DR es un trabajo muy difícil.

La proteína telomerasa ha sido recientemente el punto de atención para su función supuesta en la prevención de envejecimiento celular. La telomerasa mantiene la longitud del telómero en las células que se dividen y su sobreexpresión es el mecanismo predominante desarrollado por las células malignas para escapar de la muerte celular dependiente de telómero (Martínez y colaboradores). Por lo tanto, la actividad de telomerasa se ha observado en todas las formas de cáncer estudiadas, incluyendo células tumorales similares a células madre (Artandi y colaboradores) y es por lo tanto una característica distintiva de las células cancerosas (Hanahan y colaboradores). De esta manera, la telomerasa parece que es un buen prototipo para los TAAs universales. En este punto de vista, los péptidos CD4 derivados de telomerasa podrían ser herramientas muy útiles para desarrollar inmunoterapia en cánceres.

La solicitud de patente internacional WO 98/14593 describe la secuencia de aminoácidos de la proteína telomerasa humana y también sugiere el uso de esta proteína y ciertos fragmentos de la misma en la inmunoterapia activa.

Schroers y colaboradores han descrito previamente péptidos restringidos HLA-DR promiscuos derivados de TERT (Schroers y colaboradores, 2002 y 2003). Sin embargo su función en la inmunidad tumoral mediada por células no se trató completamente en los modelos preclínicos ni en una instalación clínica. Recientemente, una vacuna de cáncer que utiliza un péptido auxiliar CD4 derivado de TERT fue capaz de estimular la inmunidad T CD4 inmunitaria específica que se podría relacionar con una supervivencia incrementada de pacientes con cáncer cuando se combinó con quimioterapia (Kyte y colaboradores, 2011; Schlapbach y colaboradores, 2011). No obstante, la vacuna GV1001 tampoco logra inducir respuestas inmunitarias específicas y beneficio clínico en otros cánceres (Scardino y colaboradores, 2002). Aunque este péptido se cree que se congrega cerca de los epítopos CTL, todavía no se ha investigado el impacto de la ayuda de la célula CD4 específica de GV1001 en la respuesta CTL anti-tumor. b SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención se basa en el descubrimiento de nuevos fragmentos TERT (transcriptasa inversa de telomerasa) humanos capaces de ligarse a una amplia gama de moléculas HLA clase II, y el uso de estos fragmentos hTERT para el tratamientos de enfermedades gue reguieren la estimulación de respuesta de células T CD4 o CD8 T, tales como tumores.

La invención proporciona nuevos péptidos HLA clase II universales derivados de hTERT y referidos como péptidos cancerígenos universales (UCPs). Estos UCPs son capaces de ligarse a los alelos HLA-DR más comúnmente encontrados, pero también a los alelos HLA-DQ y HLA-DP, y para estimular una respuesta Th ("auxiliar") CD4.

Un primer aspecto de la invención es de esta manera un péptido de 15 a 20 aminoácidos derivados de la transcriptasa inversa de telomerasa humana, el péptido que es capaz de (i) ligarse al HLA clase II y (ii) estimular una respuesta Th CD4.

En una modalidad más preferida, el péptido comprende, o consiste de, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: KSVWSKLQSIGIRQH (SEQ ID NO: 1); GTAFVQ PAHGLFPW (SEQ ID NO: 2); SLCYSILKAKNAGMS (SEQ ID NO: 3); PAAFRALVAQCLVCV (SEQ ID NO: 4); péptido que se deriva de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 por cualquiera de las modificaciones químicas que mejoran su resistencia a la proteólisis; y un péptido sustancialmente homólogo que se deriva de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 por las sustituciones de no o más aminoácidos, de manera preferente una sustitución conservadora, o una sustitución que mejora la inmunogenicidad del péptido.

La invención también se refiere a un polipéptido de menor de 160, de manera preferente menor que 120 aminoácidos, la secuencia de la cual comprende por lo menos dos, de manera preferente tres, aún de manera preferente por lo menos cuatro secuencias de péptido diferentes como se define previamente, en donde las secuencias de péptido se separan opcionalmente por un espaciador de aminoácidos. De manera preferente se proporciona un polipéptido que comprende SEQ ID NO:l, NO:2, NO:3, y NO: , en cualquier orden.

La invención se refiere adicionalmente a un polipéptido de menos que 300, de manera preferente menor que 200 aminoácidos, que comprende i) por lo menos un péptido como se describe en lo anterior, o que comprende la secuencia de polipéptido de menos que 160 o 120 aminoácidos como se describe previamente, y ii) un péptido epitópico CD8.

La invención proporciona además un ácido nucleico que codifica un péptido o un polipéptido como se define en lo anterior.

La invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende un péptido, un polipéptido o un ácido nucleico como se define en lo anterior, en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende una combinación de los péptidos definidos en lo anterior, de manera preferente una combinación de los cuatro péptidos de SEQ ID N0:1, 2, 3 y 4 o ácidos nucleicos que codifican los péptidos.

En una modalidad particular, la composición es una composición de vacuna que comprende además un antigeno antitumoral inmunogénico o un antígeno viral, bacteriano o parasítico inmunogénico.

La invención también se refiere a una composición farmacéutica como se define en lo anterior, para el uso en la estimulación de una respuesta de células T CD4 o CD8 en un paciente, o para el uso en el tratamiento de un tumor o una infección en un paciente, de manera preferente un paciente humano.

En una modalidad particular, el tumor es un cáncer, tal como un cáncer seleccionado del grupo que consiste de leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, mieloma múltiple, mieloma maligno, enfermedad de Hodgkin, melanoma, tumor cerebral tal como glioblastoma, neuroblastoma y astrocitoitoma y carcinomas de la vejiga, mama, cerviz, colon, pulmón, páncreas, próstata, cabeza y cuello, o estómago. En una modalidad preferida, de manera preferente en donde el tumor es un cáncer inducido por un virus, tal como un cáncer de cerviz.

Otro aspecto de la invención es un conjugado que comprende por lo menos un péptido como se define en lo anterior, ligado a por lo menos una molécula HLA clase II, de manera preferente una molécula HLA clase II biotinilada.

Aún otro aspecto de la invención es un conjugado como se define en lo anterior, que comprende por lo menos cuatro moléculas HLA clase II biotiniladas a las cuales por lo menos cuatro péptidos como se define en lo anterior se ligan, en donde los por las por lo menos cuatro moléculas HLA clase II biotiniladas se ligan entre si a través de una molécula de avidina que es opcionalmente etiquetada de manera detectable.

Tales péptidos o conjugados son adicionalmente útiles para la evaluación in vivo, ex vivo e in vitro de una respuesta de células T especifica de tumor en un paciente con un tumor.

La invención también abarca un método in vitro para detectar o monitorear una respuesta de células T CD4 anti-telomerasa en una paciente, el método que comprende poner en contacto una muestra biológica del paciente con un péptido, un polipéptido o un conjugado como se define en lo anterior.

En una modalidad preferida, el paciente está en necesidad de una terapia de refuerzo de células T CD4 o CD8, de manera preferente el paciente tiene un tumor o está infectado con un virus que infecta las células que expresan telomerasa.

En otra modalidad preferida, el método descrito en lo anterior es útil para determinar o monitorear si un paciente está en necesidad de una terapia o de una terapia ajustada, predecir el resultado de un paciente, o para monitorear una respuesta a una terapia.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figuras 1A, IB y 1C: Lineas de células T especificas de UCP obtenidas de donadores sanos.

Líneas de células T CD4 se obtuvieron de PBMCs de donadores sanos después de tres rondas de estimulación con una mezcla de las cuatro células T CD4 productoras de UCP e IFN-g se evaluaron por ELISPOT. (FIGURA 1A) Las respuestas contra los UCPs individuales se muestran para seis donadores sanos. (FIGURA IB) líneas de células T específicas de UCP se estimularon con el péptido relevante en presencia de anticuerpos de bloqueo anti-HLA clase I (W6.32), HLA-DR (L243) o HLA-DP (B7/21) (FIGURA 1C) Respuestas contra los UCPs individuales para tres donadores sanos con varios genotipos HLA-DR.

Figuras 2A, 2B, 2C, 2D y 2E: Caracterización funcional de clones de células T CD4 especificas de UCP.

Los clones de células T se obtuvieron al limitar la dilución de líneas de células T de pacientes con cáncer estimuladas una vez con la agrupación de UCPs. (FIGURA 2A y FIGURA 2C) Porcentaje de células T productoras de TNF y de clones de células aisladas de pacientes GE001 en respuesta a IOmM de UCP; 105 de células T se incubaron durante 5 horas en presencia de Brefeldin A, teñidas con anticuerpo CD4, fijadas y teñidas con anticuerpo anti-TNF en una solución amortiguadora de permeabilización; 104 células T luego se analizaron en la citometria de flujo. (FIGURA 2B y FIGURA 2D) Reactividad de clones de células T CD4 en respuesta al UCP relevante. Clones de células T CD4 se cultivaron con un intervalo de concentración de péptido indicada. La secreción de TNF se evaluó 5 h en presencia de Brefeldina A, por citometria de flujo. (FIGURA 2E) Detección de las citocinas producidas por clon de células T GE001.36 en respuesta a IOmM de UCP4 utilizando el ensayo de citocinas ten-plex humano.

Figuras 3A, 3B, 3C y 3D: Respuesta especifica de UCPs de origen natural en pacientes NSCLC metastásicos.

(FIGURA 3A) Las respuestas de células T específicas de UCP espontáneo se evaluaron en 84 pacientes NSCLC y 22 donadores sanos como control. Después de una estimulación de tiempo corto (una semana) con una mezcla de los cuatro UCPs la presencia de las células T específicas es detectaron utilizando el ensayo IFN-g ELISPOT. Los resultados representaron los puntos IFN-g específicos después de la resta del fondo. Las respuestas fueron positivas cuando los puntos de IFN-g fueron >10 y más de dos veces el fondo.

(FIGURA 3B) Se mostró la frecuencia de células T específicas de UCP individuales en 12 pacientes NSCLC.

(FIGURA 3C) Ilustración de los UCPs versus respuestas inmunitarias específicas virales en ocho pacientes NSCLC después de una semana de estimulación in vitro.

(FIGURA 3D) Relación de Neutrófilos en Linfocitos (NLR) de línea base y frecuencia de células T CD4+ Foxp3+ en pacientes de acuerdo con el estado inmune específico de UCP.

Figuras 4A, 4B, 4C, 4D y 4E: Impacto de la respuesta de células T CD4 UCPs espontáneas en pacientes NSCLC metastásicos.

(FIGURA 4A) Las frecuencias respondedoras y no respondedoras de UCPs en pacientes con enfermedad progresiva (PD) o enfermedad de control (CD).

(FIGURA 4B) Estimaciones de Kaplan-Meier de la supervivencia total (OS) y (FIGURA 4C) Supervivencia sin progresión (PFS) de pacientes CD.

(FIGURA 4D) OS y (FIGURA 4E) PFS de pacientes CD tratados con quimioterapia de primera linea basada en platino.

Figuras 5A, 5B, 5C, 5D y 5E: Las vacunaciones de UCPs estimulan la respuesta de células T CD4 polarizadas con Thl de alta avidez.

(FIGURAS 5A y 5B), ratones A2/DR1 (n = 8) se inmunizaron dos veces con un ADN que codifica TERT.

(FIGURA 5A), Proliferación de linfocitos del bazo en presencia de UCPs.

(FIGURA 5B), Linfocitos de bazo agotados de CD8 de ratones inmunizados con ADN se evaluaron en IFN-g ELISPOT ex vivo. Las columnas significan el triplicado de 4 ratones; barras, SD.

(FIGURAS 5C y 5D), Ratones (3-4/grupo) se inmunizaron una vez con cada UCP en IFA.

(FIGURA 5C), Diez dias después, las células T CD4 aisladas del bazo se cultivaron durante la noche en presencia de DC cargado con un UCP. La producción de citoquinas se midió en el sobrenadante por el ensayo Luminex. Columnas, media de niveles de citoquina; barras, SD.

(FIGURA 5D), Células T CD4 aisladas se cultivaron ex vivo con concentraciones de incremento de péptido como se indica. La producción de IFN-g se midió por ELISPOT. Curvas, respuestas medias de 2 ratones, barras, SD.

(FIGURA 5E), Los ratones se vacunaron una vez con una dosis baja de UCP como se indica. Las respuestas de células T especificas de UCP se evaluaron en el bazo por el IFN-g ELISPOT ex vivo.

Figuras 6A, 6B, 6C y 6D: Función auxiliar CD4 de las vacunaciones UCPs en las respuestas de CTL especificas de auto/TERT Ratones (3/grupo) se inmunizaron ya se con pY988 más cada UCP en IFA o con pY988/IFA solo y las respuestas inmunitarias se monitorearon diez dias después en el bazo.

* FIGURA 6A. Células T CD8 recientemente aisladas se tiñeron con pentámero TERT pY988/A2+. Gráficas de puntos de citometria de flujo representativas (panel superior) y porcentajes medios de células T pY988/A2+ CD8 (panel inferior) se muestran.

FIGURA 6B, Detección ex vivo de células T anti-pY988 CD8 por IFN-g ELISPOT.

FIGURAS 6C y 6D, las respuestas de células T CD4 específicas de UCP simultáneas se evaluaron en la fracción agotada de CD8 por ensayos ELISPOT IFN-g (FIGURA 6C) e interleucina-2 (FIGURA 6D). Columnas, media de los puntos de 3 ratones; barras, SD.

Los datos son representativos de los tres experimentos independientes.

Figuras 7A, 7B, 7C, 7D y 7E: Inmunización en presencia de UCP2 mejora la calidad de las respuestas CTL especificas de pY988 solas.

FIGURAS 7A, 7B y 7C, Ratones (3-4/grupo) se inmunizaron una vez ya sea con pY988 más UCP2 (UCP2 + pY988/IFA) o con pY988/IFA solo.

FIGURA 7A, Diez días después, las células T CD8 del bazo recientemente aisladas se cultivaron con concentración de péptido pY988 de incremento y las células T CD8 secretoras de IFN-g se detectaron por ELISPOT ex vivo.

FIGURA 7B, Ensayo citotóxico in vivo. Se muestran histogramas de citometría de flujo representativos que muestran la lisis de células objetivo cargadas con pY988 etiquetadas co CFSE comparadas a no pulsadas (UP) y la media del porcentaje de lisis in vivo.

FIGURAS 7C y 7D, Respuestas de células T a largo plazo se evaluaron 30 días después de la inmunización.

FIGURA 7C, Frecuencias de células T CD9 pentámero+ pY988/A2 en células CD44hiCD6210 (derecho) y por el ensayo de secreción de IFN-g (derecho).

FIGURA 7D, Respuesta de células T CD4 específicas de UCP2 medidas en la fracción agotada de CD8 por el ELISPOT IFN-g ex vivo.

FIGURA 7E, Ratones (4/grupo) se trataron con ya sea anti-CD4 mAb (GK1.5) (agotado de CD4, barras blancas) o con solución salina (no agotada, barra negra) 3 días antes de la inmunización con DNA/TERT.

Las CTLs específicas de auto/TERT (izquierda) y las respuestas de células T CD4 específicas de UCP (derecha) se midieron en el bazo por el ELISPOT IFN-g ex vivo.

Los datos son representativos de los tres experimentos independientes.

Figuras 8A, 8B, 8C, 8D y 8E: Células Thl CD4 especificas de UCP2 activan las células dendríticas.

FIGURA 8A, Ratones (3/grupo) se inmunizaron una vez ya sea UCP2 + pY988/IFA o pY988/IFA solo. Diez días después, la expresión de los marcadores de activación CD80, CD86 y HLA-DR se analizaron en los nodos linfáticos CDllc+ DC por citometría de flujo. Se muestran los histogramas de citometría de flujo representativos (paneles superiores) y la media de MFI (paneles inferiores). Las colmas, media de MFI; barras, SD. B-E: Análisis de la diafonia de las células T DC y CD4 T.

FIGURA 8B, Esquema del co-cultivo de células T DC-CD4 in vitro.

FIGURA 8C, Producción de IFN-g y GM-CSF medida por el ELISA en el sobrenadante.

FIGURA 8D, Expresión de CD86 y HLA-DR en CDllc+ DC.

FIGURA 8E, Producción de interleucina-12 medida en el sobrenadante por el ELISA.

Los datos son representativos de dos experimentos independientes.

Figuras 9A, 9B, 9C, 9D y 9E: Efecto anti-tumor terapéutico de la vacunación basada en UCP.

FIGURA 9A, Expresión TERT por el análisis de western-blot (izquierda) y la actividad por el ensayo TRAP-ELISA (derecho) en el melanoma B16-A2.

FIGURAS 9B, 9C, 9D y 9E. Ratones que llevan tumor (6-8 ratones/grupo) se vacunaron terapéuticamente con péptidos como se describe (materiales y métodos).

FIGURA 9B, Seguimiento del tamaño del tumor. Los números en paréntesis indican ratones con regresión de tumor por grupo.

FIGURA 9C, Curvas de supervivencia registradas hasta 50 dias.

FIGURA 9D, Detección de respuestas inmunitarias anti TERT en el bazo de ratones sin tumor del grupo vacunado con UCP2 por IFN-g ELISPOT.

FIGURA 9E, En este experimento, los ratones que llevan tumor (n= 4/grupo) se vacunaron como lo anterior y las células inmunitarias infiltrantes de tumor se analizaron en el día 25 por citometria de flujo. Columnas, media de los porcentajes de las células; barras, SD.

Los datos son representativos de dos experimentos independientes.

Figuras 10A, 10B, 10C y 10D: Análisis de las respuestas de células de células T especificas de UCP en humanos.

FIGURA 10A, Linfocitos de sangre de pacientes con cáncer se cultivaron directamente con la agrupación de UCPs durante cinco cías y la proliferación especifica se midió por la incorporación de timidina 3H. Se muestran los datos representativos de nueve pacientes que responden.

FIGURAS 10B, 10C y 10D, Los linfocitos se cultivaron in vitro con la agrupación de UCPs durante una semana.

FIGURA 10B, Detección de células T especificas de UCP por IFN-g ELISPOT. Se muestran los datos representativos de nueve pacientes que responden. Columnas, media de triplicado; barras, SD.

FIGURA 10C, Detección de la producción de citoquinas por el ensayo DIAplex en el sobrenadante después de 15h del cultivo en presencia de UCPs. Columnas, niveles de citoquina medios de tres pacientes; barras, SD.

FIGURA 10D, Respuestas de células T contra UCP individual para seis pacientes que responden.

Figuras 11A, 11B y 11C: Aislamiento del clon de células Thl CD4 especificas de UCP4 de un paciente con cáncer.

FIGURA 11A, El clon de células CD4 específicos de UCP4 que producen IFN-g se aisló de un paciente con cáncer colorectal.

FIGURA 11B, Evaluación de la expresión de ARNm del clon T CD4 específico de UCP4 por RT-PCR de tiempo real. Los valores del cambio de plegamiento positivos y negativos indican la regulación por incremento o decremento de la expresión del ARNm comparado con las células T CD4 de un voluntario sano.

FIGURA 11C, Análisis de la producción de citoquinas por tinción intracelular.| DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los inventores han mostrado que la respuesta de células T CD4 específicas de UCP impacta positivamente la supervivencia general en los pacientes con cáncer que responden a la quimioterapia. De hecho, los inventores descubrieron que los pacientes quienes están respondiendo a la quimioterapia se benefician de la respuesta inmunitaria anti-tumor natural que fija como objetivo los UCPs. En contraste, cuando la quimioterapia no es eficaz, la lisis tumoral es baja y en consecuencia la liberación de antigeno TERT es menor disponible para la activación de la respuesta T CD4 especifica de UCP ín vivo.

Los inventores ahora han identificado péptidos HLA clase II derivados de hTERT, también llamados Péptidos Cancerígenos Universales (UCPs). Estos UCPs son sorprendentemente capaces de ligarse a la mayoría de alelos HLA-DR humanos, pero también a los alelos HLA-DQ y HLA-DP. Se procesan y se presentan endógenamente a las células T CD4. En consecuencia, estimulan las respuestas de células Th CD4, de manera preferente la respuesta de células Thl CD4, contra la telomerasa y tienen un efecto auxiliar en la actividad citotóxica de las células T CD8.

Estos péptidos son útiles para reforzar una respuesta de células T CD4 o CD8 en cualquier paciente en necesidad del mismo, en particular en la terapia de cánceres, especialmente como adyuvantes, y en el monitoreo de una respuesta de células T CD4 anti-telomerasa.

Características del péptido: Los péptidos de la invención se derivan de la proteína telomerasa.

La proteína telomerasa es un "antígeno asociado a tumor" o "TAA". Los TAAs fabrican células tumorales inmunológicamente distintas de las células normales y proporcionan objetivos de diagnóstico y terapéuticos para cánceres humanos. Los TAAs son muy heterogéneos. Los péptidos de la invención son péptidos de la invención son capaces de ligarse a las moléculas HLA clase II y ser presentadas a las células T CD4. Los péptidos identificados en la invención son referidos como " UCPs" o " Péptido universales", que significa que se expresan en la mayoría de tumores. Los UCPs de la invención son capaces de ligarse a una amplia gama de alelos HLA clase II, más particularmente al alelo HLA-DR pero también a los alelos HLA-DQ y HLA-DP. En la presente invención, los péptidos también son referidos como "péptidos HLA clase II" .

El término " telomerasa", como se utiliza en la presente, se refiere a una encima, una ribonucleoproteína polimerasa, que mantiene los extremos del telómero. La telomerasa no se expresa en la mayoría de células normales en el cuerpo. Sin embargo, la actividad de telomerasa es detectadle en las células que están en la división activa. Particularmente, la telomerasa se sobreexpresa en las células malignas y la actividad de la telomerasa se ha observado en todas las formas de cáncer estudiadas. En la presente invención, la telomerasa está particularmente refiriéndose a la subunidad hTERT (transcriptasa inversa de telomerasa humana) del complejo de telomerasa. La subunidad hTERT es la subunidad de proteina catalítica de la telomerasa humana. Es una proteína de 127 kDa que consiste de 1132 aminoácidos y fabricada de diferentes dominios necesarios para su actividad. La hTERT presenta varias ventajas que son: i) su expresión en la mayoría de cánceres humanos, ii) su función oncogénica esencial para la inmortalidad celular y el crecimiento celular que es prevenir el mecanismo de escape de tumor de pérdida antigénica, iii) su expresión constitutivamente alta en las células cancerosas y en las células madre cancerosas, y iv) su inmunogenicidad (Martínez y colaboradores, Hanahan y colaboradores).

Los péptidos de la invención son péptidos de 15 a 20 aminoácidos que se derivan de hTERT. De manera preferente, los péptidos de la invención son péptidos de 15 a 17, de manera preferente 15 aminoácidos que se derivan de hTERT.

Los péptidos como se define en la presente son capaces de ser presentados como un complejo con una pluralidad de moléculas HLA clase II sobre la superficie de las células tumorales o las células que presentan antígeno, siendo de esta manera útiles en una mayoría de pacientes.

Los péptidos son capaces de generar una respuesta de células Th CD4, de manera preferente una respuesta de células Thl, dirigidas contra la proteina telomerasa.

Los péptidos también son capaces de tener un efecto auxiliar en la actividad citotóxica de las células T CD8.

Más particularmente, se han identificado cuatro péptidos por los inventores: UCP1 (p44), UCP2(p578), UCP3 (p916) y UCP4 (pl041). Las secuencias de aminoácido se presentan en la tabla 1 a continuación.

Tabla 1. Secuencias UCPs Otros péptidos de la invención son péptidos sustancialmente homólogos que se derivan de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 por una, o más sustituciones. De manera preferente las sustituciones son conservadoras y/o mejoran la inmunogenicidad del péptido.

Se puede mejorar la inmunogenicidad de los péptidos al mejorar la afinidad de ligación de los péptidos a los receptores de células T (TCR) presentes en las células T CD4 o/y al incrementar el tiempo de vida del complejo de péptido TCR.

Dos secuencias de aminoácidos son "homologas", "sustancialmente homologas" o "sustancialmente similares" cuando uno o más residuos de aminoácidos se reemplazan por un residuos biológicamente similar o cuando mayor que 80% de los aminoácidos son idénticos, o mayor que aproximadamente 90%, de manera preferente mayor que aproximadamente 95%, son similares (funcionalmente idénticos). De manera preferente, las secuencias similares u homologas se identifican por la alineación utilizando, por ejemplo, el programa de acumulación GCG (Genetics Computer Grupo, Program Manual for the GCG Package, Versi n 7, Madison, Wisconsin) o cualquiera de los programas conocidos en la téenica (BLAST, FASTA, etc.). De manera preferente, estos péptidos homólogos no incluyen dos residuos de cisteina, de modo que se previene la cielización.

El término " sustitución conservadora" como se utiliza en la presente indica el reemplazo de un residuo de aminoácido por otro, sin alterar la conformación total y la función del péptido, incluyendo, pero no limitado a, el reemplazo de un aminoácido con uno que tiene propiedades similares (tal como, por ejemplo, polaridad, potencial de ligación a hidrógeno, forma acida, básica, hidrofóbica, aromática, y similares). Los aminoácidos con propiedades similares son bien conocidos en el campo. Por ejemplo, la arginina, histidina y U sina son aminoácidos hidrofilíeos-básicos y pueden ser intercambiables. Similarmente, la isoleucina, un aminoácido hidrofóbico se puede reemplazar con leucina, metionina o valina. Los aminoácidos hidrofilicos neutros, que se pueden sustituir por otros, incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina.

Por " sustituido " o " modificado " la presente invención incluye aquellos aminoácidos que se han alterado o modificado de aminoácidos de origen natural.

Como tal, se debe entender que en el contexto de la presente invención, una sustitución conservadora se reconoce en la téenica como una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. Ejemplos de sustituciones conservadoras se exponen en la Tabla 2 a continuación: Tabla 2. Sustituciones Conservadoras I Alternativamente, los aminoácidos conservadores se pueden agrupar como se describe en Lehninger, 1975, como se expone en la Tabla 3, inmediatamente a continuación.

Tabla 3. Sustituciones Conservadoras II Cono aún otra alternativa, las sustituciones conservadoras ejemplare se exponen en la Tabla 4, inmediatamente a continuación.

Tabla 4. Sustituciones Conservadoras III Preparación del Peptido: Los péptidos descritos en la presente se pueden sintetizar utilizando métodos sintéticos estándares conocidos por aquellas personas expertas en el campo, por ejemplo síntesis química o recombinación genética. En una modalidad preferida, los péptidos se obtienen por condensación escalonada de residuos de aminoácidos, ya sea por condensación de un fragmento preformado que ya contiene una secuencia de aminoácidos en orden apropiado, o por condensación de varios fragmentos previamente preparados, mientras que se protegen los grupos funcionales de aminoácido excepto aquellos implicados en validación de péptido durante la condensación. En particular, los péptidos se pueden sintetizar de acuerdo con el método descrito oracionalmente por Merrifield.

Ejemplos de teenologías de síntesis química son síntesis de fase sólida y síntesis de fase líquida. Como una síntesis de fase sólida, por ejemplo, el aminoácido que corresponde a la C del péptido a ser sintetizado se liga a un soporte que es insoluble en solventes orgánicos, y por repetición alterna de reacciones, una en donde los aminoácidos con sus grupos amino y los grupos funcionales de cadena lateral protegidos con los grupos protectores apropiados se condensan uno por uno en el orden de la C-terminal a la N-terminal, y uno donde los aminoácidos ligados a la resina o al grupo protector de los grupos amino de los péptidos se liberan, la cadena de péptido se extiende de esta manera en esta forma. Los métodos de síntesis de fase sólida se clasifican en gran medida por el método tBoc y el método Fmoc, dependiendo del tipo del grupo protector utilizados. Los grupos protectores típicamente utilizados incluyen tBoc (t-butoxicarbonilo), Cl-Z (2-clorobencfiloxicarbonilo), Br-Z (2-bromobenciloiicarbonilo), Bzl (bencilo), Fmoc (9-fluorenílmctoxicarbonilo), Mbh (4,4'-dimetoxidibenzhidrilo), Mtr (4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonil), Trt (tritil), Tos (tosilo), Z (benciloxicarbonilo) y Clz-Bzl (2,6— diclorobencilo) para los grupos amino; N02 (nitro) y Pmc (2,2, 5,7, 8-pentametilcromano-6-sulfonil) para los grupos guanidinio); y tBu (t-butilo) para los grupos hidroxilo). Después de la síntesis del péptido deseado, se somete a la reacción de desprotección y se corta del soporte sólido. Tal reacción del corte de péptido se puede llevar a cabo con cloruro de hidrógeno o ácido tri-fluorometano-sulfónico para el método Boc, y con TFA para el método Fmoc.

Alternativamente, el péptido se puede sintetizar utilizando téenicas recombinantes. En este caso, un ácido nucleico y/o un constructo genético, que comprende o que consiste de una secuencia nucleotídica que codifica un péptido de acuerdo con la invención, los polinucleótidos con secuencias nucleotidicas complementarias a una de las secuencias anteriores y las secuencias que se hibridan a los polinucleótidos bajo condiciones severas.

La invención se refiere adicionalmente a un constructo genético que consiste de o que comprende una secuencia de polinucleótidos como se define en la presente, las secuencias reguladoras (tal como un promotor(s), potenciador(es), terminador(es), adecuado etc.) que permite la expresión (por ejemplo transcripción y traducción) de un péptido de acuerdo con la invención es una célula hospedera.

De esta manera, en otro aspecto, la invención se refiere a un hospedero o célula hospedera que expresa (o que bajo circunstancias adecuadas es capaz de expresar) un péptido o polipéptido de la invención; y/o que contiene un ácido nucleico de la invención o constructo genético de la invención.

El método para producir el péptido puede comprender opcionalmente las etapas de purificar el péptido y/o modificar químicamente el péptido.

Protección adicional contra la proteólisis : Los péptidos de la invención incluyen péptidos que se derivan de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 por cualquier modificación química que mejora su resistencia a la proteólisis.

En particular, la N- y/o C-terminal de los péptidos descritos en la presente se pueden proteger opcionalmente contra la proteólisis. Por ejemplo, la N-terminal puede estar en la forma de un grupo acetilo, y/o loa C-terminal puede estar en la forma de un grupo amida. Las modificaciones internas de los péptidos a ser resistentes a la proteólisis también se prevén, por ejemplo, en donde por lo menos una ligación de péptido -CONH- se modifica y se reemplaza por una ligación reducida (CH2NH), una ligación retroinversa (NHCO), una ligación de metileno-oxi (CH2-0), una ligación de tiometileno (CH2-S, un ligación carba (CH2CH2), una ligación de cetometileno (CO-CH2), una ligación de hidroxietileno (CHOH-CH2)), una ligación (N-N), una ligación de E-alceno o también una ligación -CH=CH-.

Por ejemplo, el péptido se puede modificar para acetilación, acilación, amidación, reticulación, cielización, formación de ligación disulfuro, formación de reticulaciones covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, gam a-carboxilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodinación, metilación, miristoilación, oxidación, fosforilación, y similares.

Los péptidos de la invención se pueden componer de aminoácido(s) en la configuración D, que hace los péptidos resistentes a la proteólisis. También se pueden estabilizar por reticulación intramolecular, por ejemplo al modificar por lo menos dos residuos de aminoácido con cadena laterales olefínicas, de manera preferente cadenas de alquenilo C3-C8, de manera preferente cadenas de penten-2-ilo, seguido por reticulación química de las cadenas, de acuerdo con la así llamada teenología de "primera necesidad". Por ejemplo, los aminoácidos en la posición i e i+4 a i+7 se pueden sustituir por aminoácidos no naturales que muestran residuos olefínicos reactivos. Todos estos péptidos químicamente modificados resistentes a la proteólisis se abarcan en la presente invención.

En otro aspecto de la invención, los péptidos se ligan covalentemente a una molécula de polietilenglicol (PEG) por su C-terminal o un residuo de lisina, notablemente un PEG de 1500 o 4000 MW, para una disminución en la eliminación de urinaria y en la dosis terapéutica utilizada y para un incremento de la vida media en el plasma sanguíneo. En todavía otra modalidad, la vida media del péptido se incrementa al incluir el péptido en un material de polímero biodegradable y biocompatible para el sistema de administración de fármacos que forman microesferas. Los polímeros y copolímeros son, por ejemplo, poli(D,L-lacturo-co-glicólido) (PLGA) (como se ilustra en US2007/0184015). Polipéptidos La invención también se refiere a un polipéptido de menos que 160, de manera preferente menor que 120 aminoácidos que comprenden por lo menos, de manera preferente tres, de manera aún preferente por lo menos cuatro secuencias de péptido diferentes como se define en lo anterior.

Los péptidos pueden estar en cualquier orden, de la N-terminal a la C-terminal de la secuencia de polipéptidos.

Opcionalmente, los péptidos se separan por un espaciador de aminoácido. De acuerdo con la invención, es espaciador puede comprender generalmente entre 1 y 10 aminoácidos, de manera preferente entre 3 y 6 aminoácidos. Se selecciona la secuencia espad adora de modo que no crea nuevos sitios de antígeno con los péptidos contiguos.

La invención se refiere adicionalmente a un polipéptido de menor de 300, de manera preferente menor que 200 aminoácidos que comprenden i) por lo menos un péptido como se define en lo anterior, y ii) un péptido epitópico CD8.

Opcionalmente, el polipéptido puede comprender por lo menos un espaciador de aminoácidos que comprende entre 1 y 10 aminoácidos, de manera preferente entre 3 y 6 aminoácidos.

El péptido epitópico CD8 es un péptido que es capaz de activar una respuesta de células T CD8 contra un antigeno. De Manera preferente, el epitopo CD8 es capaz de activar una respuesta antitumoral CD8 o una respuesta CD8 contra un antigeno viral, bacteriano o parasítico. Ejemplos de antígenos tumorales que comprenden los péptidos epitópicos CD8 incluyen, pero no se limitan a: tirosinasa, alfafetoproteína, antígeno carcinoembriónico (CEA), CA-125, MUC-1, antígeno tumoral epitelial, antígeno asociado a melanoma, PIA, MARTI/MELAN-1 y gp 100/pMell7 así como proteína relacionada a tirosinasa pg75 y MUM-1, HER2/neu, proteínas de virus de papiloma humano E6 y E7, GnT-V, beta-catenina, CDK4, pl5, MAGE1, MAGE3, BAGE, GAGE, PSMA, TARP, STEAP, HTLV-1 Tax y WT1.

Ejemplos de péptidos epitópicos CD8 incluyen, pero no se limitan a: gpl00.154, NA17-A.nt38, y MelanA/MART-1.27, CEA.571, Tirosinasa.368-N, p53.65, Her2/neu.369-377, gpl00.209, gpl00.280, gpl00.476, Tirosinasa.368-D, MAGE-3.271, y Her2/neu.654, gplOO.457, Melan-A/MART-1.32, Tirosinasa.1, p53.149, p53.264, y HPV E7.86. Los péptidos epitópicos CD8 de telomerasa son pY988, pY572, ml, p4, p68, p277, p342, p351, p444, p464, p540, p865, p966, pll07 pll23, (ver la solicitud de patente de E.U.A. US2009/175892A). Ácidos nucleicos La invención también se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende o que consiste de una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido o polipéptido de acuerdo con la invención.

La invención se refiere adicionalmente a un constructo genético que consiste de o que comprende una secuencia de polinucleótidos como se define en la presente, y secuencias reguladoras (tal como un promotor (s), potenciador(s) terminador(es) adecuado, etc.) permitiendo la expresión (por ejemplo transcripción y traducción) de un péptido de acuerdo con la invención en una célula hospedera.

Los constructos genéticos de la invención pueden ser ADN o ARN, y son de manera preferente ADN de doble hebra. Los constructos genéticos de la invención también pueden estar en una forma adecuada para la transformación de la célula hospedera propuesta u organismo hospedero, en una forma adecuada para la integración en el ADN genómico de la célula hospedera propuesta o en una forma adecuada para la replicación independiente, mantenimiento y/o herencia en el organismo hospedero propuesto, por ejemplo, los constructos genéticos de la invención pueden estar en la forma de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido, YAC, un vector viral o transposon. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir un vector que puede proporcionar la expresión in vitro y/o in vivo (Por ejemplo en una célula hospedera adecuada, organismo hospedero y/o sistema de expresión).

En un aspecto preferido pero no limitante, un constructo genético de la invención comprende i) por lo menos un ácido nucleico de la invención; conectado operablemente a ii) uno o más elementos reguladores, tal como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado; y opcionalmente también iii) uno o más elementos adicionales de constructos genéticos tales como secuencias 3'- o 5'-UTR, secuencias lideres, marcadores de selección, genes marcadores/reporteros de expresión, y/o elementos que pueden facilitar o incrementar (la eficiencia de) transformación o integración.

En una modalidad particular, se proporciona un ácido nucleico que codifica el polipéptido menor que 160 o 120 aminoácidos como se define en lo anterior.

Aún otro aspecto de la invención incluye un ácido nucleico que codifica un polipéptido de menos que 300 o 200 aminoácidos que comprende i) por lo menos un péptido como se define en lo anterior, y ii) un péptido epitópico CD8, como se define en lo anterior.

Conj ugados El péptido(s) de la invención se puede ligar a una molécula HLA clase II para formar un conjugado.

Un conjugado comprende por lo menos un péptido de la invención ligado a por lo menos una molécula HLA clase II.

En una modalidad preferida, la molécula HLA clase II se biotinila.

De manera preferente, por lo menos cuatro péptidos ligados a cuatro moléculas HLA clase II biotiniladas se acoplan con una molécula de avidina y forman un multimero, por ejemplo un tetrámero o un pentámero. Estos conjugados ligan eficientemente una gran cantidad de receptores de células T (TCR) presentes en las células T CD4.

Las células T CD4 se pueden detectar fácilmente, por ejemplo por citometría de flujo, si la molécula de avidina se conjuga a una etiqueta. Por ejemplo, la etiqueta puede ser un fluorocromo.

De esta manera, los conjugados descritos en la presente son herramientas muy potentes para determinar el nivel de células T CD4 que son especifica para el péptido(s) ligado a la molécula (s) HLA clase II. En otras palabras, los conjugados de la presente invención permiten la cuantificación de la respuesta inmunitaria de células T CD4 especificas de TERT en un paciente.

Por lo tanto, se describe un conjugado que comprende por menos cuatro moléculas HLA clase II biotiniladas a las cuales por lo menos cuatro péptidos de acuerdo con la invención se ligan, en donde las por lo menos cuatro moléculas HLA clase II biotinilada se ligan entre si a través de una molécula de avidina que es opcionalmente etiquetada detectablemente. En una modalidad particular, el conjugado tiene cuatro moléculas HLA clase II biotinilada a las cuales cuatro péptidos de acuerdo con la invención se ligan, en donde las cuatro moléculas HLA clase II biotiniladas se ligan entre si a través de una molécula de avidina que es opcionalmente etiquetada detectablemente.

Estimulación de una respuesta de células T CD4 y/o CD8 Los inventores han mostrado que la inmunidad Thl CD4 anti-telomerasa incrementa la supervivencia total y la progresión sin supervivencia en pacientes con un tumor, especialmente en pacientes que respondieron a la terapia, especialmente quimioterapia.

Los inventores han identificado adicionalmente péptidos HLA clase II capaces de desencadenar una respuesta de células T CD4 especificas de TERT, y han mostrado que mejoran significativamente los efectos de una vacunación anti-tumoral.

Los péptidos de la invención (UCPs) son útiles para estimular (o reforzar) una respuesta de células CD4 y/o CD8. Los inventores han mostrado que las vacunaciones de UCPs indujeron células T CD4 de alta avidez que produjeron en gran medida IFN-g asi como interleucina-2. Las células T CD4 especificas de UCP también indujeron activación y producción de interleucina-12 por células dendriticas. Los inventores han descubierto adicionalmente que la presencia de los UCPs de la invención en la formulación de vacuna mejoró drásticamente las respuestas de CD8 anti-tumor de memoria y primarias. Esto se explica por el "efecto auxiliar" de las células Th CD4 activadas. En particular, las células T auxiliares 1 (Thl) CD4+ produjeron varias citoquinas (tales como IFN-g, TNF-a e IL-2) esencial para la inducción de inmunidad mediada por células contra tumores (Kennedy y colaboradores, 2008). Un modelo ampliamente aceptado muestra la capacidad de las células T CD4+ para recular y/o activar células dendriticas (DCs) para el cebado de células T CD8+ eficiente a través de la interacción de receptores coestimuladores (Bennett y colaboradores, 1998; Smith y colaboradores, 2004).

Los péptidos HLA clase II de la invención son agentes terapéuticos útiles, en particular en la inmunoterapia de tumores en un paciente, o para tratar infecciones.

De manera preferente, los péptidos de la invención se pueden utilizar en combinación, mediante la administración de los cuatro péptidos de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4, ya sea simultánea o secuencialmente.

El término "paciente" , como se utiliza en la presente, se refiere a un mamífero, de manera preferente un humano, incluyendo hombre, mujer, adulto y niño. El paciente es generalmente un sujeto cuyas células T CD4 o CD8 necesitan estimulación. En una modalidad particular, el paciente es afectado con un tumor, especialmente un cáncer. El tumor es de manera preferente un cáncer, tal como un cáncer seleccionado del grupo que consiste de leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, mieloma múltiple, mieloma maligno, enfermedad de Hodgkin, melanoma, tumor cerebral tal como glioblastoma, neuroblastoma y astrocitoitoma y carcinomas de la vejiga, mama, cerviz, colón, pulmón, páncreas, próstata, cáncer de cabeza y cuello, o cáncer de estómago. El cáncer de estómago, especialmente cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), es preferido.

En otra modalidad preferida, el tumor es un cáncer inducido por un virus o un oncovirus. Tales oncovirus incluyen virus de papiloma humano (HPV), virus de herpes asociado a sarcoma de Kaposi (KSHV o HHV-8), virus de Epstein-Barr (EBV o HHV-4), virus de polioma de células de Merkel, o citomegalovirus humano (CMV o HHV-5), asi como virus de hepatitis C o virus o T-linfotrópico humano (HTLV-1)· El cáncer puede estar en cualquier etapa de desarrollo, incluyendo la etapa metastásica.

En otra modalidad, el paciente se puede infectar con un virus, un parásito o una bacteria. Ejemplos de virus incluyen virus de papiloma, virus de herpes simple, virus de hepatitis, adenovirus, mixovirus tal como influenza, paramixovirus, poxvirus tal como Vaccinia, lentivirus tal como V1H.

De manera preferente el paciente a tratar se ha sometido o está a punto de someterse a una terapia convencional de manera más preferente una terapia convencional de primera linea.

La inmunoterapia basada en UCP de la invención se podría utilizar en combinación con la terapia convencional.

El término "terapia convencional" significa que la terapia se aplica o, si no se aplica rutinariamente, es apropiada y por lo menos recomendada por las autoridades de la salud. En el caso del cáncer, el tratamiento "convencional" se selecciona por el médico dependiendo del cáncer especifico a tratar. Esto incluye más particularmente quimioterapia, radioterapia, o monoterapia, inmunoterapia, terapia basada en inhibidor de cinasa especifico y terapia basada en anticuerpos. La quimioterapia incluye cualquier compuesto tal como cualquier agente citotóxico o inductor de muerte celular, en particular un agente citotóxico, solo o en combinación. La radioterapia incluye cualquier tratamiento de radiación seleccionado por ejemplo de rayos X, irradiación gamma y/o irradiación UVC. La hormonoterapia, es decir, una terapia que conduce la apoptosis o ligandos Fas o TRAIL soluble/ligado a membrana o TNF alfa soluble/ligado a membrana (TNFa), incluye un compuesto tal como una anti-aromatasa por ejemplo. La incluye una citoquina o un interferón, o una vacuna. La terapia basada en inhibidor de cinasa especifico incluye un compuesto seleccionado por ejemplo de un inhibidor de tirosina cinasa, inhibidor de cerina cinasa y un inhibidor de treonina cinasa.

En una modalidad preferida, el péptido(s) o el ácido nucleico que codifica el péptido(s) es una terapia adyuvante, por ejemplo se utilizan en combinación con la quimioterapia o una vacunación antitumoral.

Los péptidos de la invención, o ácidos nucleicos que codifican los péptidos, se pueden utilizar para el tratamiento de un tumor o una infección en un paciente, al generar una respuesta de células T CD4, de manera preferente una respuesta de células Thl CD , contra la telomerasa y al tener un efecto auxiliar en la actividad antitumoral de las células T CD8. Los efectos secundarios de tal tratamiento se reducen. De hecho las células mucho más sanas en el cuerpo de un organismo no expresan la proteina telomerasa, mientras que las células cancerosas sobreexpresan la proteina telomerasa. Por lo tanto, las células sanas permanecen no afectadas en tratamiento con el péptido(s) de la invención.

La eficacia de los péptidos de la invención se incrementa por el efecto auxiliar en las células T CD8. Los péptidos de la invención, al estimular las células T CD4, tienen un efecto auxiliar en la actividad antitumoral de las células T CD8. De hecho, las células T CD4 son criticas para la inducción y mantenimiento de las células T CD8 contra las células tumorales. Los péptidos descritos en la presente se pueden congregar cerca de los epitopos CD8 y promover la actividad citotóxica de las células T CD8.

Como se utiliza en la presente, el término " tratamiento" o " terapia" incluye tratamiento curativo y/o preventivo. De manera más particular, el tratamiento curativo se refiere a cualquiera del alivio, mejora y/o eliminación, reducción/estabilización (por ejemplo, falla de progresar a etapas más avanzadas), de un síntoma, así como retraso en la progresión de un síntoma de un trastorno particular. El tratamiento preventivo se refiere a cualquiera de: detección del inicio, reducción del riesgo de desarrollo, reducción de la incidencia, retardo del inicio, reducción del desarrollo, asi como incremento del tiempo al inicio de los síntomas de un trastorno particular. La prevención es particularmente interesante para prevenir lesiones pre-neoplásicas.

De esta manera, la invención también se refiere a una vacuna útil en la prevención de un tumor.

De esta manera se describe un método para tratar un tumor o una infección en un paciente en necesidad del mismo, el método que comprende administrar al paciente con uno o más péptido(s), o un ácido nucleico que codifica el péptido(s).

Los inventores han mostrado que algunos pacientes con un cáncer no muestran o no tienen una respuesta de células Thl CD4 reducida contra la telomerasa. La supervivencia en los pacientes quienes no desarrollan espontáneamente una respuesta de células Thl CD4 específicas de telomerasa es inferior a aquellos quienes desarrollan tal respuesta de células Thl CD4 específicas de telomerasa espontánea.

De esta manera, la invención se dirige más particularmente a péptidos como se describe en la presente (o ácidos nucleicos que codifican los péptidos) particularmente útiles cuando el paciente no es capaz espontáneamente de producir una respuesta inmunitaria anti-telomerasa. En estos grupos de pacientes, el tratamiento de la invención desencadena una respuesta de células T CD4, especialmente Thl CD4 especificas de telomerasa que mejora la supervivencia general de los pacientes. En estos pacientes, los péptidos de la invención (o ácidos nucleicos que codifican los péptidos) se utilizan de manera preferente como una terapia adyuvante, es decir de manera preferente en combinación con una vacuna quimioterapéutica o antitumoral.

El tratamiento de la invención también es útil en pacientes quienes desarrollan espontáneamente una respuesta de células CD4, especialmente Thl CD4 especificas de telomerasa, al reforzar la respuesta y al mejorar adicionalmente la supervivencia general de los pacientes. En esos pacientes, los péptidos de la invención (o ácidos nucleicos que codifican los péptidos) se utilizan ya sea solos o como una terapia adyuvante, es decir de manera preferente en combinación con una vacuna quimioterapéutica o antitumoral.

Composiciones farmacéuticas Se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden un péptido o polipéptido como se define en la presente, o un ácido nucleico que codifica el péptido polipéptido, en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. De manera preferente la composición puede comprender una combinación de péptidos, de manera aún preferente una combinación de los cuatro péptidos de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4.

El agente terapéutico, tal como el péptido, el polipéptido, o el ácido nucleico, se formula en asociación con un portador farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica también puede incluir cualquier otro principio activo, tal como en particular un agente anti-cáncer, por ejemplo quimioterapia citotóxicas convencionales con inhibidores de replicación de ADN tales como agentes de ligación a ADN en particular fármacos de alquilación o intercalación, agentes anti-metabolitos tales como inhibidores de ADN polimerasa, o inhibidores de topoisomerasa I o II, con agentes anti-mitogénicos tales como alcaloides o con agente de bloqueo de crecimiento de cáncer tales como inhibidor de tirosinasa o anticuerpos monoclonales.

En una modalidad particular, el péptido, el polipéptido o el ácido nucleico de la invención, se utiliza en una composición de vacuna. La composición de vacuna comprende de manera preferente un antigeno tumoral inmunogénico adicional, de manera preferente un antigeno tumoral de péptido, cuyo antigeno tumoral fija como objetivo de manera diferente una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas.

Ejemplos de tales antigenos tumorales se describen en lo anterior.

La composición de vacuna comprende de manera preferente un antígeno viral, bacteriano o parasítico in unogénico, de manera preferente un antígeno viral, bacteriano parasítico de péptido, el antígeno viral, bacteriano o parasítico fija como objetivo de manera diferente una respuesta inmunitaria contra una infección.

En otra modalidad, los péptidos o polipéptidos de la invención se combinan con péptidos epitópicos CD8 que se derivan de telomerasa.

Los péptidos o los polipéptidos de la invención (o ácido nucleico que codifica el péptido(s) o polipéptido(s)) se puede administrar mediante cualquier vía conveniente incluyendo intravenosa, oral, transdérmica, subcutánea, por la mucosa, intramuscular, intrapulmonar, intranasal, parenteral, rectal, vaginal y tópica. La vía intranasal es de interés particular.

Ventajosamente, también se contempla la administración intratumoral.

En una modalidad preferida, el agente terapéutico, de manera preferente el ácido nucleico, se puede administrar por electroporación, en los músculos o a través de la piel.

La preparación de una composición farmacológica que contiene ingredientes activos disueltos o dispersados en la misma es bien entendida en la téenica y no necesita ser limitada basada en la formulación. Típicamente tales composiciones se preparan como inyectables ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; sin embargo, las formas sólidas adecuadas para solución, o suspensiones, el líquido ante del usos también se pueden preparar. La preparación también se puede emulsionar. En particular, las composiciones farmacéuticas se pueden formular en forma de dosificación sólida, por ejemplo cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos, grageas o gránulos.

La elección del vehículo y el contenido de la sustancia activa en el vehículo se determinan generalmente de acuerdo con la solubilidad y las propiedades químicas del compuesto activo, el modo particular de administración y las condiciones que se observan en la práctica farmacéutica. Por ejemplo, los excipientes tales como lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de dicalcio y agentes desintegrantes tales como almidón, ácidos algínicos y ciertos silicatos complejos combinados con lubricantes tal como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco se pueden utilizar para preparar tabletas. Para preparar una cápsula, es ventajoso utilizar lactosa y polietilenglicoles de peso molecular alto. Cuando la suspensión es acuosa se utilizan pueden contener agentes emulsificantes o agentes que facilitan la suspensión. Los diluyentes tales como sacarosa, etanol, polietilenglicol, propilenglicol, glicerol y cloroformo o mezclas de los mismos también se pueden utilizar.

Se pueden agregar adyuvantes, tales como sales de aluminio, tal como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, sustancias activas superficiales tales como lisolecitina; polioles plurónicos; polianiones; péptidos; y emulsiones de aceite, adyuvantes completos e incompletos de Freund, adyuvante MPL-TDM (monofosforilo Lipido A, dicorinomicoiato de trehalosa sintético), tirosina, alúmina, adyuvantes de saponina tal como StimulonMR, citoquinas, para mejorar la eficacia de la composición.

La preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tales como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tal como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), cuentas o liposomas, que pueden proporcionar liberación controlada o sostenida del producto.

Los péptidos de la invención (o los ácidos nucleicos que codifican los péptidos) se pueden administrar como una combinación de péptidos (o ácidos nucleicos que codifican los péptidos).

La dosificación se selecciona por la persona experta de modo que se logra una estimulación de la respuesta de células T CD4, y depende de la vía de administración y la forma de dosificación que se utiliza, la dosis diaria total de la partícula administrada a un sujeto en una sola dosis o dosis dividida puede estar en cantidades, por ejemplo, de aproximadamente lpg a lOmg diaria, de manera preferente de 100pg a 5 mg diaria. Las composiciones unitarias de dosificación pueden contener tales cantidades de tales submúltiples de los mismos como se puede utilizar para constituir la dosis diaria. Se entenderá, sin embargo, que un nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores incluyendo el peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo y vía de administración, velocidad de absorción y excreción, combinación, otros fármacos y la gravedad de la enfermedad particular que se trata.

Diagnóstico , pronóstico e inmunomoni toreo El péptido, el polipéptido o el conjugado de la invención se pueden utilizar para evaluación de una respuesta de células T CD4 específicas de telo erasa, en particular en un paciente con un tumor o una infección, en una muestra biológica.

El término "muestra biológica" se refiere a cualquier muestra biológica que se origina de un paciente. Ejemplos de muestras incluyen fluidos biológicos y biopsias de tejido. De manera preferente, la muestra puede ser sangre, suero, saliva, orina o esperma. De manera más preferente, la muestra biológica es una muestra de sangre.

El péptido, el polipéptido o el conjugado de la invención se pueden utilizar especialmente para la evaluación de una respuesta de células T CD4 específicas de tumor en un paciente con un tumor, ya sea antes, durante o después de una terapia convencional, De acuerdo con la invención, los UCPs se pueden utilizar para detectar o monitorear una respuesta de células T CD4 anti-telomerasa en un paciente. Particularmente, los péptidos de la invención permiten el monitoreo de la respuesta de células T CD4 anti-telomerasa después de una vacunación.

En un aspecto de la invención, el paciente está en necesidad de una terapia de refuerzo de células T CD4 o CD8.

De acuerdo con un aspecto particular de la invención, esta respuesta inmunes especifica de UCP se cuantifica antes, durante y después de una terapia convencional, para determinar si el paciente está en necesidad de una terapia adyuvante, tal como los péptidos descritos en la presente invención, y para adaptar y ajustar la terapia adyuvante.

Esto es particularmente útil para determinar si el paciente es "respondedor" o probablemente responde al tratamiento convencional, especialmente quimioterapia.

Dentro del contexto de esta invención, un paciente se considera "respondedor" si por lo menos uno de sus síntomas se espera que se alivie, o el desarrollo de la enfermedad se detiene, o se desacelera. Los respondedores completos, respondedores parciales, o pacientes estables con cánceres se pueden definir de acuerdo con los criterios RECIST (Eisenhauer y colaboradores, European Journal of Cáncer, 2009, 45:228-247). En los tumores sólidos, los criterios RECIST son una norma internacional basada en la presencia de por lo menos una lesión medible. "Respuesta completa" significa la desaparición de toda las lesiones objetivo; "respuesta parcial" significa 30% de disminución en la suma del diámetro más largo de las lesiones objetivo, "enfermedad progresiva" significa 20% de incremente en la suma del diámetro más largo de las lesiones objetivo, "enfermedad estable significa cambios que no cumplen con los criterios anteriores. De esta manera, los péptidos o los conjugados de la invención se pueden utilizar para determinar si un paciente que tiene un tumor está en necesidad de una terapia adyuvante, que puede de manera preferente ser una composición farmacéutica que comprende el péptido(s) o un ácido nucleico que codifica el péptido(s), o si el régimen de dosificación de tal terapia o composición se debe ajustar (es decir incrementar, continuar, disminuir o detener).

Los péptidos de la invención permiten determinar la respuesta de células Th CD4 anti-telomerasa después de un tratamiento o una vacunación, especialmente una terapia antitumoral que implica lisis de las células tumorales o terapia anti-infecciosa que implica la lisis de las células que expresan anti-telomerasa infectadas. Tales terapias pueden depender de los péptidos o polipéptidos de la invención, pero no se limitan a los péptidos o polipéptidos.

Las modalidades posteriores se ejemplifican basados en los péptidos o polipéptidos de la invención, pero podrían ser similarmente aplicados a otras terapias, siempre y cuando, los péptidos, polipéptidos o conjugados de la invención se utilicen para detectar una respuesta de células T anti-telomerasa.

En una primera modalidad particular, se proporciona un método para determinar o monitorear si un paciente que tiene un tumor o una infección está en necesidad de una terapia adyuvante o de una terapia adyuvante ajustada, el método comprende estimular las Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) obtenidas de una muestra biológica del paciente con un péptido, un polipéptido, o un conjugado como se define en la presente, y determinar el nivel de células Th CD4 que son especificas para el péptida o conjugado, en donde el nivel de las células Th CD4 inferior a un valor de controles indicativo de un paciente en necesidad de una terapia adyuvante o de una terapia adyuvante ajustada.

De manera más particular, se proporciona un método in vitro para determinar si un paciente que tiene un tumor o una infección está en necesidad de una terapia adyuvante, es decir de manera preferente una composición farmacéutica que comprende el péptido(s) de la invención o un ácido nucleico que codifica el péptido(s), el método que comprende estimular Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) obtenidas de una muestra biológica del paciente con un péptida, polipéptido, o un conjugado como se define en la presente, y determinar el nivel de células Th CD4 que son especificas para el péptido o el conjugado, en donde un nivel de células Th CD4 inferior a un valor de control es indicativo de un paciente en necesidad de una terapia adyuvante.

De acuerdo con este aspecto de la invención, el "valor de control" puede establecerse del nivel de las células Th CD4 anti-TERT en una muestra biológica de uno o más individuos capaces de producir una respuesta inmunitaria de Th CD4 anti-TERT espontánea. Puede ser un valor de referencia estadístico.

En una modalidad particular, el método puede implicar aislar y opcionalmente cultivar las células T CD4+ ya sea antes o después de la estimulación por el péptido, polipéptido o el conjugado de la invención. El subconjunto de células que son especifica de los péptidos de la invención luego se cuantifica, por ejemplo por IFN-g ELISPOT. Los detalles de un protocolo ejemplar se proporcionan en la sección Experimental. La citometria de flujo también se puede utilizar, por ejemplo al seguir un protocolo estándar de tinción de citoquinas intracitoplásmica (ver por ejemplo Prussin and Metcalfe, Journal of Immunological Methods, 1995, 188:117-128).

Además, el inmunomonitoreo basado en UCP de la invención se puede utilizar para proporcionar mediciones compensatorias para restaurar y/o mejorar las respuestas inmunitarias anti cáncer. Los péptidos de la invención pueden ser herramientas efectivas para monitorear una respuesta inmunitaria Th CD4, especialmente Thl CD4. De manera más particular, el péptido(s) o el conjugado(s) de la invención se puede utilizar para determinar el nivel de la célula Th CD4 anti-telomerasa y para adaptar consecuentemente la terapia adyuvante, de manera preferente el tratamiento anti-tumoral descrito en la presente (es decir la administración de la composición farmacéutica que comprende el péptido(s) de la invención o un ácido nucleico que codifica el péptido(s), o un conjugado que comprende el péptido(s)). De manera más precisa, la composición farmacéutica de la invención se puede utilizar siempre para establecer una respuesta Th CD4 anti-telomerasa no existente o para reforzar una respuesta Th CD4 anti-telomerasa preexistente en un paciente.

De esta manera se describe un método para monitorear si un paciente está en necesidad de una terapia o una terapia adyuvante ajustada, es decir de manera preferente una composición farmacéutica que comprende el péptido(s) de la invención o un ácido nucleico que codifica el péptido(s), el método que comprende estimular Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) obtenidas de una muestra biológica del paciente con un péptido, polipéptido o un conjugado de la invención, y determinar el nivel de las células Th CD4 que son especificas para el péptido, polipéptido o el conjugado, en donde un nivel de células Th CD4 inferior a un valor de controles indicativo de un paciente en necesidad de ajuste de tratamiento.

De acuerdo con este aspecto de la invención, el "valor de control" se establece del nivel de las células Thl CD4 anti-TERT de una muestra biológica del paciente. De manera más precisa, el nivel de la células Thl CD4 anti-TERT en un paciente que tiene un tumor se determina en diferentes tiempos de su tratamiento (por ejemplo antes, durante y/o después de la quimioterapia) y el valor(es) previo se considera que es el "valor (es) de control" para adaptar el tratamiento.

Los péptidos o polipéptidos de la invención se pueden utilizar adicionalmente como marcadores para establecer una prognosis y predecir la supervivencia de un paciente que tiene un tumor.

En una modalidad particular, se describe adicionalmente un método in vi tro para predecir el resultado de un paciente que tiene un tumor, el método que comprende estimular Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) obtenidas de una muestra biológica del paciente con un péptido, polipéptido, o un conjugado de la invención, y determinar el nivel de células Th CD4 que son específicas para el péptido del conjugado, en donde un nivel de células Th CD4 inferior a un valor de control es indicativo de un paciente que probablemente recaiga.

De acuerdo con este aspecto de la invención, el paciente puede estar sometiéndose a una terapia convencional, como se describe en lo anterior, o siendo tratado con una composición farmacéutica que comprende el péptido(s) de la invención o un ácido nucleico que codifica el péptido(s) o una combinación de la terapia convencional y la composición farmacéutica.

De acuerdo con este aspecto de la invención, el " valor de control" se puede establecer del nivel de las células Th CD4 anti-TERT en una muestra biológica de uno o más paciente(s) que tienen un tumor por el cual se ha predicho un pronóstico favorable por cualquiera de otros métodos conocidos en la téenica. Puede ser un valor de referencia estadístico.

Los péptidos de la invención se pueden utilizar adicionalmente como marcadores para determinar la capacidad de respuesta de un paciente, especialmente un paciente que tiene un tumor, a una terapia convencional. De acuerdo con este aspecto de la invención, la respuesta de inmunidad específica UCP se cuantifica antes, durante y después de una terapia convencional, para determinar si el paciente es un respondedor o no respondedor al tratamiento convencional.

De esta manera se describe un método in vitro para monitorear una respuesta a una terapia convencional en un paciente, el método que comprende estimular Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) obtenidas de una muestra biológica del paciente con un péptido, polipéptido, o un conjugado de la invención, y determinar el nivel de células Th CD4 que con específicas para el péptido, polipéptido, o el conjugado, donde un nivel de células Th CD4 inferior a un valor de control es indicativo de una respuesta deficiente a la terapia convencional.

De acuerdo con este aspecto de la invención, el "valor de control" se establece de la media del nivel de las células Thl CD4 anti-TERT de una muestra biológica de un grupo de pacientes que tienen un tumor que no responden a la terapia convencional y de un grupo de pacientes que responden a la terapia convencional.

Aspectos y ventaja adicionales de la presente invención se describirán en la siguiente sección experimental, que se debe considerar como ilustrativa y no limitante del alcance de la presente solicitud.

EJEMPLOS EJEMPLO 1: Identificación de los epitopos derivados de telomerasa HLA-DR promiscuos y análisis de la inmunidad de células T CD4 especificas de tumor espontánea en pacientes con cáncer de pulmón 1.1 Materiales y Métodos Pacientes Los pacientes se enrolaron en el hospital universitario Georges Pompidou (París, Francia) y Hospital universitario Jean Minjoz (Besangon, Francia) desde Enero 2009 hasta Febrero de 2011. La etapa y clasificación del tumor se determinaron de acuerdo con la clasificación de la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC). Después del consentimiento informado, los pacientes con NSCLC histológicamente probados se incluyeron prospectivamente en el ensayo clínico. Este estudio se condujo de acuerdo con las lcyes francesas y después de la aprobación por el comité étnico local. Las células de sangre se recolectaron de donadores sanos anónimos en el Etablissement Frangais du Sang (EFS, Besangon, Francia) como preparaciones de kit de aféresis después del consentimiento informado y siguiendo las directrices EFS. La genotipificación HLA-DR se llevó a cabo al utilizar el kit de tipificación Olerup SSP DRB1 (Olerup, Suecia).

Ensayo de selección y ligación de epí topos T CD4 derivados de telomerasa Los cuatro péptidos derivados de TERT referidos como Péptido Cancerígeno Universal (UCP1 (PAAFRALVAQCLVCV, SEQ ID NO:4), UCP2 (KSVWSKLQSIGIRQH, SEQ ID NO:l), UCP3 (GTAFVQMPAHGLFPW, SEQ ID NO: 2) y UCP4 (SLCYSILKAKNAGMS, SEQ ID NO:3)) se predijeron a fin de ligar múltiples moléculas HLA-DR al utilizar software SIFPETHI (www.syfpeithi.de), NetMHCpan 2.1 (http://www.cbs.dtu.dk/-services/NetMHCIIpan/) y NetMHCII 2.2 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/) (Kobayashi y colaboradores, 2008). Péptidos sintéticos (> 80% de pureza) se adquirieron de Activotec (Cambridge, Reino Unido). La capacidad de ligación a las moléculas HLA-DR se evaluó por el ELISA competitivo como se reporta previamente (Wang y colaboradores).

Generación de líneas de celulas T específicas de UCP de donadores sanos Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) se aislaron por centrifugación de densidad en gradientes de Ficoll-Hyperpaque (Sigma-Aldrich, Francia) y se colocaron en placas a 4.106 células por pocilio en una placa de 24 pocilios en suero humano a 5% RPMI con IOmM de acumulación de los cuatros UCPs. Los recombinantes interleucinas 7 (5ng/mL) (Peprotech, Francia) e interleucina 2 (20 UI/mL) (Novartis, Suiza) se agregaron en el día 1 y en el día 3 respectivamente. En el día 7 y 14, las células se estimularon con PBMC autólogas g-irradiadas con IOmM de UCPs y 20UI/mL IL-2 se agregaron en día 8 y 15 como se reportó previamente (Wang y colaboradores, Adotevi y colaboradores, 2006). En el día 21, las células T CD4 se purificaron (Miltenyi, Francia) y la especificidad de las líneas de la célula T se investigó por IFN-g ELISPOT. Brevemente, las células T CD4 (105/pocillos) se cultivaron en una placa ELISPOT recubierta con IFN-g mAb anti-humano con cada UCP (5mM) en medio AIM V (Invitrogen, Reino Unido) durante 18 h a 37°C. Las células cultivadas con medio solo o PMA (100 ng/ml) (Sigma-Aldrich) e ionomicina (10 mM) (Sigma-Aldrich) se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente. Los puntos IFN-g se revelaron siguiendo las instrucciones del fabricante (Gene Probe, Francia). El número de células T especificas expresado como células formadoras de puntos/105 células se calculó después de restar los valores del control negativo (fondo). Las células formadoras de puntos se contaron utilizando el sistema de punto inmunitario C.T.L. (Cellular Technology Ltd., USA). Para la restricción de HLA-DR, los siguientes anticuerpos de bloqueo anti-HLA-clase I (clon W6.32), HLA-DR (clon L243) y HLA-DP (clon B7/21) (10 mg/ml) se agregaron en el cultivo celular durante el ELISPOT. Todos los experimentos se llevaron a cabo en triplicado.

Aislamiento y amplificación de clones de células T CD4 Los clones de células T se aislaron al limitar la dilución y al amplificar después de la estimulación por el PHA en presencia de PBMC alogénicas y radiadas, linea de células B-EBV y 150 UI de interleucina 2 de acuerdo con el procedimiento previamente descrito (Godet y colaboradores). Los análisis funcionales de clones de células T CD4 especificas de UCP se llevaron a cabo al utilizar la tinción de TNF-OÍ intracitoplásmica y el ensayo de citoquinas Ten-plex humana (Human Thl/Th2/Inflammation Diaplex, Diaclone, France).

Evaluación de las respuestas de células T CD4 específicas de UCP espontaneas PBMC aisladas con Ficoll de pacientes con cáncer o voluntarios sanos se cultivaron con IOmM de acumulación de UCPs en una placa de 24 pocilios (4.106 de células por pocilio] en suero humano a 5% RPMI y la interleucina 7 (5ng/mL¡ e interleucina 2 (20 UI/mL) se agregaron en el día 1 y en el día 3 respectivamente. Para la respuesta de recordatorio contra los virus, las células se cultivaron similarmente con la mezcla de 32 péptidos de citomegalovirus, virus de influenza y virus de Epstein-Barr (CTL, Alemania). Después de una semana del cultivo celular, la presencia de células T especificas de UCP se midió por el IFN-g ELISPOT como se detalla en lo anterior.

Citometria de flujo Para la tinción de citosinas intracitoplásmicas, después de un periodo de estimulación de 5h con o sin IOmM de péptido, las células T se etiquetaron con anti-CD4 (BD Bioscience, USA) y anti-TNF-cx (ebioscience, USA) utilizando el Kit Citofix/Citoperm (BD Bioscience). Para el análisis Treg de citometria de flujo, las PBMC primero se tiñeron con anticuerpos superficiales (anti-CD4, anti-CD25), se fijaron, se permeabilizaron, y luego se tiñeron con anti-hFoxp3 (PCH101; eBioscience). Las muestras se adquirieron en un FACS Canto II (BD Biosciences) y se analizaron con el software DIVA. El NLR se definió como el conteo de neutrófilos absoluto dividido por el conteo de linfocitos absoluto (Suzuki y colaboradores).

Estadísticas Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con el software NCSS 2007 (Number Cruncher Statistical Systems, Kaysville, USA). El nivel de significancia se ajustó a p<0. 05 para todas las pruebas. Las variables se expresaron como una media ± SD o media, y se sometieron a prueba con la prueba de Rank-Sun Wilcoxon cuando fue adecuado. Las curvas de supervivencia se calcularon con el método de Klapan-Meier y se compararon con la prueba de Log-rango. 1.2. Resultados Identificación de los epi topos de células T CD4 restringidos de HLA-DR universales de TERT Para predecir la existencia de epitopos CD4 dentro de la secuencia de aminoácidos de TERT capaz de ligarse a múltiples moléculas HLA-DR, los inventores han combinado los resultados de tres algoritmos Syfpeithi, NetMHCpan-2.1 y NetMHC2.2. Han seleccionado cuatro secuencias de péptido de 15-mers preferidas como UCP1 a UCP4 gue se clasificaron alto en la escala de probabilidad por su capacidad de ligación a los alelos HLA-DR humanos comúnmente encontrados (Tabla 1). Para confirmar este resultado, los inventores han llevado a cabo un ensayo de ligación in vitro basado en el ELISA competitivo como se reporta previamente. Los datos se han presentado como afinidades relativas (RA) para comparar fácilmente sus propiedades de ligación a los péptidos ligadores altos que los inventores han utilizado como referencias y los ligadores potentes tienen una afinidad relativa < 100. Los resultados confirman la capacidad de todos los péptidos para ligarse efectivamente a los alelos más comunes codificados por el HLA-DR (Tabla 5). Los datos se expresan como RA de actividad relativa (relación de la IC50 de UCPs a la IC50 del péptido de referencia) y son las medias de tres experimentos. Los buenos ligadores tienen una RA <100 y el ligador débil es RA > 50.

Tabla 5. Afinidades relativas de los péptidos hacia los alelos más comunes codificados por el sitio HLA-DR - Los cuatro péptidos mostraron una capacidad potente para ligar siete diferentes moléculas HLA-DR incluyendo DR1, DR4, DR7, DR11, DR15, DRB3 y DRB5. Particularmente, UCPl y UCP2 fueron capaces de ligar cada una de las moléculas HLA-DR sometidas a prueba con RA de la RA intermedia (100-500) a baja (< 100). De esta manera, de acuerdo con las frecuencias fenotipicas de 10 antigenos HLA-DR prevalentes, estos péptidos podrían cubrir más de 90% de la población (Wang y colaboradores). Adicionalmente, las respuestas de células T CD4 contra los UCPs se han inducido en el modelo de ratón transgénico HLA-DR1*0101/HLA-A2 humanizado después de la inmunización con un plásmido de ADN que codifica la proteína TERT de longitud completa (Adotevi y colaboradores, 2006, Pajot y colaboradores) y que indica que se procesan endógenamente y se presentan a las células T CD4 in vivo.

Después, la capacidad del UCP para estimular las células T CD4 humanas se han sometido a prueba. Para este propósito, los linfocitos aislados de la sangre periférica de voluntarios sanos se han estimulado in vitro utilizando una acumulación de UCP y la generación de líneas de células T CD4 específicas de UCP se ha clasificado utilizando el ensayo ELISPOT. Como se muestra en la Figura 1A, las células T CD4 fueron capaces de reconocer por lo menos un UCP. La restricción HLA-DR de la respuesta de células T CD4 específicas de UCPs se ha confirmado con la inhibición de la secreción de IFN-g en presencia del anticuerpo de bloqueo pan HLA-DR (Figura IB). La tipificación de espectros HLA-DR revela que los alelos HLA-DR de individuos normales no se compartieron soportando la naturaleza promiscua de los (Figura 1C). De esta manera, estos resultados implican que las células T CD4 precursoras contra los UCPs están presentes en el repertorio T periférico humano y reconocen estos péptidos en múltiples contextos HLA-DR. Para caracterizar adicionalmente estas respuestas los inventores han aislado clones de células T CD4 especificas para UCP2 y UCP4 de paciente con cáncer. Todos los clones de células T CD4 especificas de UCP4 fueron potentemente reactivas en presencia del péptido cognado, y mostraron una secreción de TNF semi-máxima observada en concentración de péptido baja (< 0.ImM) (Figuras 2A, 2B). Se han obtenido resultados similares para los clones específicos de UCP2 con una secreción de TNF semi-máxima observada a ~4mM (Figuras 2C, 2D). Además, los inventores han mostrado después de la estimulación del péptido que los clones produjeron principalmente IFN-g y TNF-a pero no IL-4 tampoco IL-17A en acuerdo con una paralización de Thl (Figura 2E). La reactividad de estos clones de células T CD4 se inhibe por el anticuerpo de bloqueo HLA-DR indicando su restricción HLA-DR.

De esta manera, estos resultados mostraron que los clones de células T CD4 específicas de UCP de alta avidez se pueden generar de pacientes con cáncer y se polarizaron Thl.

También mostraron que estos UCPs se procesan y presentan naturalmente a la célula T CD4 en el contexto de malignidades.

Presencia de células T CD4 de origen natural contra los UCPs en pacientes NSCLC Los polimorfismos del gen de telomerasas se han asociado con la susceptibilidad de cáncer de pulmón y la expresión TERT se encuentra en todos los tipos de NSCLC (Carcinoma de Pulmón No pequeño) (Lantuejoul y colaboradores, Rafnar y colaboradores). Por lo tanto los inventores han llevado a cabo un análisis compresivo de respuestas de células T CD4 especificas de UCP espontaneas en un NSCLC. Linfocitos de sangre aislados con Ficoll de ochenta y cuatro pacientes NSCLC avanzado se han recolectado antes de la quimioterapia de primera linea y se cultivaron poco tiempo después (una semana) con la acumulación de UCPs y las células T especificas se han medido por IFN-g ELISPOT. Los linfocitos de sangre de 22 voluntarios sanos se han utilizado como control. Las respuestas se han considerado positivas cuando el número de células secretoras de INF-g fue por lo menos dos veces por arriba del control negativo. Este diseño experimental permite que los inventores midan las respuestas de memoria de células T CD4 especificas. Como se muestra en la Figura 3A, las respuestas inmunitarias de memorias especificas de UCP se han descubierto en 32 de los 84 pacientes (38 %) mientras que no se han detectado respuestas de IFN-g especificas contra UCPs en individuos sanos. El análisis del perfil de secreción de citoquinas de estas respuestas revela la alta producción de TNF-a e IFN-y en ausencia de IL-4, IL-17 e IL-10 indicando una polarización de Thl (datos no mostrados). Analizados individualmente, cada uno de los cuatro UCPs es capaz de generar una respuesta de células T CD4 en pacientes. Sin embargo, la frecuencia de las respuestas en las células T a o UCP-2 y UCP-4 sugiere que estos péptidos son más inmunogénicos (Figura 3B). La ausencia de las respuestas inmunitarias especificas de UCPs en pacientes no se podría relacionar con una energía de células T global como se ilustra por la presencia de respuestas de recordatorio antivirales eficaces en pacientes con respuesta específica de UCPs (Figura 3C). Para excluir la influencia de una variedad de parámetros inmunitarios que se han reportado por disminuir la respuesta anti-tumor en NSCLC (Suzuki y colaboradores), los inventores han medido células T reguladoras CD4+ Foxp3+ circulantes (Tregs) y la IL-10 plasmática en los pacientes con o sin respuesta inmunitaria especifica de UCP. Los inventores han mostrado un nivel similar de Tregs circulantes en los dos grupos (Figura 3D) y la ausencia de la detección de IL-10 plasmática por el ELISA se ha observado sin considerar el estado inmune del UCP (datos no mostrados). Además de los conteos de linfocitos totales y la relación de neutrófilos-linfocitos (NLR) son muy similares en estos dos grupos (Figura 3D).

Los resultados indican que los pacientes con NSCLC son capaces de montar espontáneamente respuestas de células T CD4 específicas de T?? y los UCPs son péptidos prototipicos para monitorear la respuesta inmunitaria anti-tumor en NSCLC.

La respuesta inmunitaria de células T específicas de UCP espontanea incrementa la supervivencia total de los pacientes que responden a la quimioterapia El impacto de la respuesta inmunitaria CD4 específica de UCP en el resultado clínico se analizó en pacientes que respondieron o progresaron después de la quimioterapia de primera línea (CT). Para este propósito, los inventores se han enfocado en 55 de 84 pacientes con NSCLC avanzado con un seguimiento medio de diez meses.

Todos los pacientes incluidos se habían clasificado como etapa IV metastásica. Las respuestas de células T contra TERT no se correlacionaron con las variables clínicas o de pronostico tales como edad, tabaco, estado ECOG PS o subtipo histológico. Excepto seis pacientes quienes recibieron terapia Erlotinib, todos los pacientes se trataron con un doblete de platino. Después de la primera linea, la enfermedad de control (CD) basada en los criterios RECIST se había logrado en 36 de 55 (65%), 25% de ellos lograron una respuesta parcial (PR) (14 de 55) y 40% una enfermedad estable (SD) (22 de 55). La enfermedad progresivas (PD) se había observado en 19 de 55 (35%). La frecuencia de la respuestas inmune CD4 específica de TERT espontanea fue similar en pacientes con CD o PD después de CT (Figura 4A). En contraste los pacientes que muestran una inmunidad específica de TERT antes de la CT tuvieron una supervivencia total incrementada (OS) en el grupo CD comparado con los pacientes sin inmunidad específica de TERT (OS Media: semanas 53 vs 40, p = 0.034, HR = 0.54, 95% CI [0.3-1]). La pre existencia de la respuesta inmunitaria específica de UCP no incrementó significativamente la supervivencia sin progresión (PFS) de pacientes CD (PFS Media: semanas 33 vs 24, p =0.391, HR= 0.76, 95% CI [0.4-0.7]) (Figura 4B). Se habían observado resultados similares cuando los inventores se enfocaron en pacientes quienes recibieron CT basado en platino, después de la exclusión de los pacientes tratados con Erlotinib (OS Media: semanas 53 vs 40, p = 0.049, HR = 0.52 95% CI [0.3- 0.9]) (Figuras 4C, 4D). En contraste, en pacientes con PD después de la CT de primera línea, los inventores habían descubierto ninguna diferencia de supervivencia sin considerar el estado inmune específico de UCP (datos no mostrados). De esta manera, la presencia de las respuestas Thl CD4 específicas de TERT naturales en pacientes cuyos tumores son sensibles a la quimioterapia se correlaciona con una OS más alta.

EJEMPLO 2: Actividad auxiliar CD4 potente de UCPs novedosos derivados de telomerasa en respuestas de células T CD8 antitumor propias. 2.1. Materiales y Métodos Péptidos sintéticos Los cuatro péptidos derivados de TERT llamados péptidos cancerígenos universales (UCPs): UCP1 (TERT44-58: PAAFRALVAQCLVCV, SEQ ID NO:4), UCP2 (TERT578-592: KSVWSKLQSIGIRQH, SEQ ID NO: 1), UCP3 (TERT916-930: GTAFVQ PAHGLFPW, SEQ ID NO:2) y UCP4 (TERT1041-1055: SLCYSILKAKNAGMS, SEQ ID NO:3) y los péptidos pY998 (YLQVNSLQTV, SEQ ID NO: 5) y pY572 (YLFFYRKSV, SEQ ID NO: 6) restringidos de HLA-2 derivados de TERT se han utilizado por los inventores. Las formas nativas de los dos péptidos HLA-A2 TERT crípticos se conservan completamente en la TERT humana y de ratón (Hernández y colaboradores, 2002). Los péptidos sintéticos (> 80% de pureza) se adquirieron de Activotec (UK).

Ra tón .

Los ratones transgénicos HLA-DRB1*0101/HLA-A*0201- (ratón A2/DR1) se han descrito previamente (Pajot y colaboradores, 2004). Estos ratones son genéticamente inactivados H-2 clase I e IA clase II, y sus células T CD8 y T CD4 se restringen por las únicas moléculas HLA-A*0201 y HLA-DR1*0101 respectivamente.

Inmunizaciones .

Para estudiar el procesamiento del UCP, los ratones A2/DR1 se inmunizaron con un pTrip-TERT ADN (100 pg) en los dias 0 y 14 como se reporta previamente (Adotevi y colaboradores, 2010). En algunos experimentos las células T CD4 se agotaron con el tratamiento anti-CD4 mAb (clon GK1.5) antes de la inmunización de ADN. Para la inmunización de UCP, los ratones se inyectaron con 100 pg de cada UCP emulsionado en adyuvante de Freund completo (IFA, Sigma-Aldrich, Francia). En algunos experimentos, 50 pg del péptido pY988 se co-inyectaron con 100 mg de cada UCP en IFA. Todas las vacunaciones de péptidos se hicieron subcutáneamente (s.c) en el flanco abdominal derecho. Ratones de ocho a diez semanas de edad se reprodujeron y se mantuvieron en las instalaciones animales de los inventores. Todos los experimentos se hicieron de acuerdo con las buenas prácticas del laboratorio definidas por las reglas de experimentación animales en Francia.

Ensayo de proliferación de ra tón .

Los ensayos de proliferación se llevaron a cabo diez dias después de la última inmunización de ADN como se describe previamente (Pajot y colaboradores, 2004). Los resultados se dan como índice de estimulación = (cpm con péptido especifico) / (cpm con péptido irrelevante).

Tinción de pentámero y ensayos ELISPOT .

La tinción de pentámero ex vivo se llevó a cabo como se describe previamente (Adotevi y colaboradores, 2010; Adotevi y colaboradores, 2006). Las células se tiñeron con pentámero pY988 y pY572 HLA-A2.1 conjugado con PE (Prolmmune, UK). Después de la tinción de las células, las muestras se analizaron por citometría de flujo en un FACS Canto II (BD Biosciences, Francia) y utilizando el software Diva. El ELISPOT ex vivo se llevó a cabo como se describe previamente y siguiendo las instrucciones del fabricante (GenProbe, France) (Adotevi y colaboradores, 2010; Adotevi y colaboradores, 2006) Activación de las células dendrí ticas .

DCs CDllcf del bazo o nudos linfáticos de ratones inmunizados con péptidos se analizaron directamente para la expresión del receptor co-estimulador. En algunas modalidades, las DCs derivadas de médula ósea inmadura (iDC) de ratones A2/DR1 se cultivaron 15-h con células T CD4 de ratones inmunizados con UCP o IFA solo y luego se tiñeron para expresión de superficie celular de los receptores co estimuladores y la producción de citoquinas.

Estimulación del tumor.

Líneas de células tumorales de murino B16F10 positivas de HLA-A2.1 (referidas como B16-A2) se mostraron previamente para expresar altas cantidades de TF.RT (Adotevi y colaboradores, 2010). Ratones A2/DR1 se inyectaron s.c. con células 2.105 B16-A2 en IOOmI de solución amortiguadora salina en el flanco abdominal. En el día 5, los ratones se inmunizaron con ya sea la mezcla de péptidos pY988 y pY572 (100 pg) con o sin UCP2 (100pg). Una inyección de refuerzo se hizo en el día 17. Los ratones de control se trataron con el adyuvante IFA en solución amortiguadora salina. El crecimiento del tumor se monitoreó cada 2-3 días utilizando un calibrador y los ratones se sacrificaron cuando la masa tumoral alcanzó una superficie de > 200 mm2. La supervivencia de los ratones se evaluó utilizando el modelo de Kaplan-Meier.

Detección de respuestas de células T específicas de UCP en pacientes con cáncer.

La sangre se recolectó con pacientes con cáncer en el hospital universitario de Besangon (Francia) después del consentimiento informado. El estudio se condujo de acuerdo con las lcyes Francesas y después de la aprobación por el comité ético local. Los linfocitos aislados con Ficoll se analizaron por incorporación de timidina 3H como se describe previamente (Pajot y colaboradores, 2004). Después de una estimulación in vitro corta de linfocitos con UCPs, la respuesta inmunitaria específica de un UCP se analizó por el ensayo ELISPOT humano (GenProbe). Concomitantemente, la producción de citoquinas se midió después de un cultivo de 15H con o sin UCPs, utilizando el kit DIAplex Human Thl/Th2 (GenProbe) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estadísticas .

Los datos se presentan como medía ± SD. La comparación estadística entre los grupos se basó en la prueba de Student t utilizando el software Prism 4 GraphPad. El tiempo de supervivencia del ratón se estimó utilizando el método de Kaplan-Meier, y se utilizó la prueba de log-rango. Los valores P menores que 0.05 (*) se consideraron significativos. 2.2. Resultados La inmunización con UCP induce respuestas de células T CD4 poralizadas con Thl de alta avidez in vivo.

Los inventores y otros han reportado previamente que el uso de modelos de ratones transgénicos HLA humanizados para clasificar antigenos tumorales humanos representa una alternativa potente para utilizar los procedimientos de "inmunología inversa" para la identificación de epítopos (Adotevi y colaboradores, 2006; Osen y colaboradores, 2010). En este punto los inventores han utilizado ratones A2/DR1 para estudiar la inmunogenicidad in vivo de los UCPs, basado en su capacidad de ligación a las moléculas HLA-DRB1*0101. Para evaluar si los UCPs se pueden procesar endógenamente de la proteína TERT, los inventores llevaron a cabo inmunizaciones con un ADN plásmido que codifica la secuencia TERT de longitud completa y los esplenocitos CD4 específicos de UCP se monitorearon por un ensayo de incorporación de 3H-timidina de cinco días. Como se muestra en la Figura 5A, todos los UCPs estimulan de manera diferente la proliferación de linfocitos del bazo de ratones inmunizados con ADN. Especialmente, la proliferación de células T alta se midió en respuesta al UCP2 y 3 como es comparado con UCP1 o UCP4. Los inventores han confirmado estos resultados al utilizar el ensayo IFN-g ELISPOT ex vivo y descubrieron respuestas de células T CD4 específicas de UCP potentes (Figura 5B). Contrario al UCPl, las respuestas de células T CD4 específicas se detectaron contra UCP2, 3 y 4 en todos los ratones inmunizados (Figura 5B). Estos datos indican claramente que los UCPs se procesan y se presentan de manera eficiente a las células T CD4 ir vivo en el contexto de la restricción de DRB1*0101. Diferentes poblaciones de células T auxiliares CD4 controlan las respuestas inmunitarias antitumor (Pardoll y colaboradores, 1998), de esta manera los inventores han estudiado la polarización de las respuestas de células T CD4 especificas de UCP in vivo. Para este fin, células T CD4 recientemente aisladas de ratones vacunados con UCP se cultivaron en presencia de iDC singénica pulsadas o no con UCP y se midió la producción de citoquinas. En todos los casos, los inventores hablan mostrado que las células T CD4 especificas de UCP producen altos niveles de IFN-g e IL-2 pero no IL-4, IL-5, IL-10 tampoco IL-17 indicando que la inmunización de UCP induce de manera preferente una respuesta inmunitaria Thl polarizada in vivo (Figura 5C).

Después, para evaluar la avidez de la célula T CD4 especifica de UCP, las células T CD4 recientemente purificadas de ratones inmunizados con UCP se cultivaron en presencia de concentraciones de incremento de péptido y el número de células T CD4 productoras de IFN-g especificas se midió por el ELISPOT. Los resultados en la Figura 5D mostraron que los ratones inmunizados con UCP2, UCP3 y UCP4 indujeron células T CD4 especificas de alta avidez (< 10-7 mM). Por comparación las células T CD4 de ratones vacunados con UCP1 o UCP4 respondieron a 10-1 y 10-3 mM de concentración de péptido respectivamente. Basado en este, los inventores han concluido que las dosis bajas de péptidos UCP2 o UCP3 (~lpg) estimularon las células T IFN-Y+ CD4 T potentes in vivo (Figura 5E). Colectivamente, los UCPs se procesan de manera eficiente in vivo y estimulan las células T CD4 polarizadas con Thl de alta avidez en ratones A2/DR1.

La células CD4 específicas de UCP proporcionan ayuda para las respuestas de células T CD8 anti -auto/TERT óptimas in vivo Las funciones auxiliares de las células T CD4 se cree que son importantes para la generación de respuestas de CTL potentes y sostenidas (Shedlock y colaboradores, 2003). Para enfrentar esta cuestión con respecto a las células T CD4 especificas de UCP, los inventores co-inmunizaron ratones con el péptido pY988 auto/TERT en presencia de UCP. Este péptido se conserva completamente en las secuencias TERT humanas y de ratón. La respuesta de CTL especifica de pY988 se midió ex vivo por la tinción de pentámero y los ensayos ELISPOT. Como se muestra en la Figura 6A, una frecuencia más alta de células T CD8 especificas de pY988 funcionales se detectó en los ratones inmunizados con pY988 más UCP comparados con los ratones vacunados con pY988 solo. Aunque la vacunación de UCP1 tuvo poco impacto en la frecuencia de la respuesta especifica de pentámero pY988/A2 + células T CD8 T, los cuatro CJCPs fueron capaces de incrementar significativamente el número de células T VD8 secretadas de IFN-g contra el péptido auto/TERT (Figura 6B). La magnitud de la respuesta de las células T CD8 especificas de pY988 se correlacionó en gran medida con la intensidad de las respuestas inmunitarias especificas de UCP inducidas concomitantemente en los ratones (Figuras 6C, 6D). Adicionalmente, estos UCPs ejercieron un efecto auxiliar similar en las respuestas de CTL especificas de pY572 auto/TERT in vivo. De esta manera, la adición de los UCPs como péptidos auxiliares rompe de manera eficiente la tolerancia inmune contra los epitopos CD8 auto/ in vivo.

Los inventores después han buscado estudiar el impacto de los péptidos auxiliares UCPs en la avidez de CTL y memoria, dos funciones criticas para la erradicación del tumor. Para este fin, los inventores enfocaron en el UCP2 que induce respuestas inmunitarias Thl potentes in vivo. Como se muestra en la Figura 7A, las células T CD8 recientemente aisladas de ratones inmunizados con pY988 + UCP2 aún fueron reactivos contra concentraciones muy bajas de péptido pY988 (< 10-3 mM) . Estas células también reconocieron la contraparte nativa críptica p988, dando énfasis a su ata avidez (datos no mostrados). Por consiguiente, los ratones vacunados con pY988 + UCP2 mostraron citotoxicidad in vivo más potente contra las células objetivo etiquetadas con CFSE que el grupo pY988 (Figura 7B). De esta manera, las respuestas inmunitarias auxiliares UCP2 mejoran la calidad de la respuesta CTL in vivo. Este resultado soporta un reporte previo que muestra que la estimulación de células T CD4+ de alta avidez incrementa la avidez de CTL anti-tumor y la actividad citolitica (Bandmaier y colaboradores, 2009). Adicionalmente, las respuestas CTL anti-auto/TERT sostenidas se detectaron en los ratones co-inyectados con UCP2 (Figura 7C). Esta respuesta se correlacionó con la respuesta de células T CD4 especificas de UCP2 de larga duración in vivo (Figura 7D). Para confirmar la función de la ayuda de las células T CD4 especificas de UCP, los inventores han mostrado que la respuesta de células T CD8 anti-auto/TERT se redujo en gran medida en los ratones agotados de células T CD4 antes de la inmunización de TERT-ADN como son comparados con los ratones no agotados (Figura 7E). Se obtuvieron resultados similares en otro modelo de antigeno utilizando péptidos de HPV-16 E7 y NA-17 (datos no mostrados). De esta manera, la estimulación simultánea de células T CD4 especificas de UCP es requerida para el cebado óptimo de la CTL especifica de tumor in vivo.

Las células T CD4 específicas de UCP promueven la activación de cél ulas dendrí ticas in vivo La inducción de la activación de células dendríticas representa un mecanismo auxiliar principal utilizado por las células Thl CD4+ para sostener la presentación de antígeno y proporcionar señales co-estimuladoras a las CTLs. Esto es referido como el modelo "ménage á trois" (Ridge y colaboradores, 1998). Para probar este mecanismo, los inventores han analizado la expresión de los receptores de co-estimulación en las DCs de ratones inmunizados con la mezcla de pY988 +/- UCP2. Como se muestra en la Figura 8A, las CDllc+ DCs de nodos linfáticos de ratones inmunizados con UCP2/pY988 expresaron un nivel más alto de CD86, CD80, asi como moléculas HLA clase II como es comparado con los ratones inmunizados con pY988. En un segundo conjunto de experimentos, las células T CD4 aisladas de ratones inyectados con UCP2/IFA o IFA se co-cultivaron con iDCs singénicas como se muestra en la Figura 8B. Como se espera, las células T CD4 especificas de UCP2 produjeron cantidades significativas de citoquinas Thl tales como IFN-g y GM-CSF (Figura 8C). Los inventores han mostrado que la presencia de células T CD4 especificas de UCP2 indujeron la activación de DCs potentes y mejoraron su capacidad para producir altas cantidades de interleucina-12 (Figuras 8D, 8E). Conjuntamente, estos resultados mostraron que la estimulación de las células T especificas de UCP2 forma el fenotipo y función de las DCs in vivo .

El péptido auxiliar UCP2 potencia la eficacia de la vacunación de peptido CD8 auto/TERT contra melanoma B16-A2 establecido Para investigar la función auxiliar de UCP en un protocolo de vacunación terapéutica, los inventores se han enfocado en el péptido auxiliar UCP2 que muestra una función auxiliar CTL potente in vivo. El modelo de melanoma B16F10-HLA-A*0201 agresivo e in unogénico eficiente se utilizó en los ratones A2/DR1. Como se reportó previamente esta linea de células se expresa en gran medida en la TERT de murino funcional (Figura 9A) se reconoce por la CTLs especificas de auto/TERT (Adotevi y colaboradores, 2010). Los ratones que llevan tumor se vacunaron dos veces ya sea con dos péptidos auto/TERT CTL (pY572 + pY988/IFA) solos en presencia del péptido auxiliar UCP2. Como se muestra en la Figura 9B, el crecimiento tumoral alcanzó una área > 200mm2 en el día 25 en el grupo de control inyectado con el IFA solo. En este experimento representativo, la regresión tumoral se observó en 1/8 ratones vacunados con pY572 + pY988/IFA mientras que dos ratones lograron un retraso en el crecimiento tumoral. En el grupo vacunado con pY988 + pY572/IFA combinado con UCP2, se logró una regresión tumoral completa en 5/8 ratones. Por consiguiente, el análisis de supervivencia al día 50 después de la inyección de células tumorales mostró que 63% de ratones vacunados en presencia de UCP2 aún estuvieron vivos como es comparado con 13% en el grupo de ratones inyectados con pY988 + pY572/IFA (p < 0.05) (Figura 9C). Dos meses después, la respuesta CRL efectora anti-pY988 se detectó en ratones si tumor y esto se correlacionó con la respuesta de células T CD4 especificas de UCP2T de largo plazo in vivo (Figura 9D). Esta inmunidad de células T sostenida proporciona protección contra una segunda dosis letal de tumores B16/A2.

La densidad de las células T CD8 infiltrantes de tumor mostró que es critica para el control de tumor (Galón y colaboradores, 2006). Por lo tanto, los inventores han analizado la infiltración de células inmunitarias dentro del tumor en ratones tratados con los mismos protocolos de vacunación. La infiltración de células T CD3+CD8+ total más alta se observó en ratones que recibieron vacuna más péptido auxiliar UCP2 como es comparado con el grupo pY988 + pY572/IFA (67% vs 40%, p < 0.05) (Figura 9E). En contraste, la vacunación de UCP no incluyó en las células NK o la infiltración de tumor de células T reguladoras (Figura 9E), sugiriendo que la respuesta inmunitaria especifica de UCP2 conduce principalmente CTLs efectoras del microentorno tumoral.

Conjuntamente, los resultados de los inventores mostraron claramente que las células CD4 especificas de UCP2 ejercen una actividad auxiliar potente en las repuestas de CTL especificas de tumor in vivo . Por otra parte la adición del UCP2 influye en la adquisición de células T CD8 al sitio tumoral. Todos estos datos soportan el uso de UCP para la vacunación terapéutica anti-tumor.

Respuestas de células T CD4 específicas de UCP de origen na tural en cánceres humanos Basado en la amplia expresión de la TERT en cánceres, los inventores han buscado respuestas de células T especificas de UCP en pacientes con cáncer de diferentes orígenes citológicos. Para este propósito, los inventores han medido la incorporación de 3H-timidina de linfocitos de sangre obtenidos de pacientes con cáncer estimulados directamente con UCPs durante 6 días. Como se muestra en la Figura 10A, la proliferación de células T específicas se indujo en la estimulación de un UCP. Después, las células T específicas de UCP se midieron por el IFN-g ELISPOT después de la estimulación in vi tro de corto plazo de las PBMCs. Los inventores han descubierto altos número de células T productoras de IFN-g dirigidas contra el UCP en varios cánceres tales como colon, renal, pulmón, estómago, y leucemia soportando la respuesta de proliferación de células T (Figura 10B). Las células T específicas de UCP reducen principalmente citoquinas Thl pero no IL-4, IL-10 o IL-17 de acuerdo con los estudios in vivo de los inventores (Figura 10C). Como se muestra previamente, las respuestas de células T contra el UCP individual también se encontraron en las PBMCs de pacientes que presentan varios cánceres, soportando la idea de que los epitopos UCP son promiscuos (Figura 10D). Para estudiar con más precisión la polarización de las células T CD4 especificas de UCP, los inventores han generado clones de células T CD4 específicos para UCP4 derivado de un paciente con cáncer colorectal respondedor (Figura. 11A). Comparados con las células T CD4 de donadores sanos, estos clones expresaron un nivel incrementado de dos veces de expresiones de ARN T-bet y GATA-3 más bajo, RORyc, y ARNm Foxp3 (Figura 11B). Además estos clones produjeron altas cantidades de IFN-g, TNF-a y alguna IL-10, pero no IL-13 tampoco IL-17, un patrón de citoquina relacionado con Thl (Figura 11C). De esta manera, estos resultados indican que el repertorio de células T específicas de UCP se estimula espontáneamente en pacientes con cáncer y que estas respuestas inmunitarias específicas de UCP son polarizadas con Thl.

REFERENCIAS Adotevi 0, Mollier K, Neuveut C, y colaboradores.

Immunogenic HLA-B*0702-restricted epitopes derived from human telomerase reverse transcriptase that elicit antitumor cytotoxic T-cell responses. Clin Cáncer Res 2006; 12:3158-67.

Adotevi O, Mollier K, Neuveut C, y colaboradores. Targeting human telomerase reverse transcriptase with recombinant lentivector is highly effective to stimulate antitumor CD8 T-cell immunity in vivo. Blood 2010; 115: 3025-32.

Artandi SE, DePinho RA. Telomeres and telomerase in cáncer. Carcinogenesis; 31:9-18.

Bevan MJ. Helping the CD8(+) T-cell response. Nat Rev Immunol 2004; 4:595-602.

Bennett SR, Carbone FR, Karamalis F, Flavell RA, Miller JF, Heath WR. Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signalling. Nature 1998; 393: 478-80.

Boni A, Cogdill AP, Dang P, y colaboradores. Selective BRAFV600E inhibition enhances T-cell recognition of melanoma without affecting lymphocyte function. Cáncer Res; 70:5213-9.

Bos R, Sherman LA. CD4+ T-cell help in the tumor milieu is required for recruitment and cytolytic function of CD8+ T lymphocytes. Cáncer Res; 70:8368-77.

Brandmaier AG, Leitner WW, Ha SP, Sidncy J, Restifo NP, Touloukian CE. High-avidity autoreactive CD4+ T cells induce host CTL, overeóme T(regs) and medíate tumor destruction. J Immunother 2009; 32: 677-88.

Brunsvig PF, Kyte JA, Kersten C, y colaboradores. Telomerase Péptido Vaccination in NSCLC: A Phase II Trial in Stage III Patients Vaccinated after Chemoradiotherapy and an 8-Year Update on a Phase I/II Trial. Clin Cáncer Res; 17:6847-57.

Campi G, Crosti M, Consogno G, y colaboradores. CD4(+) T cells from healthy subjects and colon cáncer patients recognize a carcinoembryonic antigen-specific im unodominant epitope. Cáncer Res 2003; 63:8481-6.

Fridman WH, Galón J, Pages F, Tartour E, Sautes-Fridman C, Kroemer G. Prognostic and predictive impact of intra- and peritumoral ímmune infiltrates. Cáncer Res; 71:5601-5.

Galón J, Costes A, Sanchez-Cabo F, y colaboradores. Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome. Science 2006; 313: 1960-4.

Godet Y, Desfrancois J, Vignard V, y colaboradores. Frequent occurrence of high affinity T cells against MELOE-1 makes this antigen an attractive target for melanoma immunotherapy. Eur J Immunol; 40:1786-94.

Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cáncer: the next generation. Cell; 144:646-74.

Hernández J, Garcia-Pons F, Lone YC, y colaboradores.

Identification of a human telomerase reverse transcriptase peptide of low affinity for HLA A2.1 that induces cytotoxic T lymphocytes and mediates lysis of tumor cells. Proc Nati Acad Sci U SA 2002; 99: 12275-80.

Kantoff PW, Higano CS, Shore ND, y colaboradores. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cáncer. N Engl J Med; 363:411-22.

Kennedy R, Celis E. Múltiple roles for CD4+ T cells in anti-tumor immune responses. Im unol Rev 2008; 222:129-44.

Kobayashi H, Celis E. Péptido epitope Identification for tumor-reactive CD4 T cells. Curr Opin Immunol 2008; 20:221-7.

Kobayashi H, Wood M, Song Y, Appella E, Celis E. Defining promiscuous MHC clase II helper T-cell epitopes for the HER2/neu tumor antigen. Cáncer Res 2000; 60:5228-36.

Kono M, Dunn IS, Durda PJ, y colaboradores. Role of the mitogen-activated protein kinase signaling pathway in the regulation of human melanocytic antigen expression. Mol Cáncer Res 2006; 4:779-92.

Kyte JA, Gaudernack G, Dueland S, Trachsel S, Julsrud L, Aamdal S. Telomerase peptide vaccination combined with temozolomide: a clinical trial in stage IV melanoma patients. Clin Cáncer Res 2011; 17:4568-80.

Lantuejoul S, Salón C, Soria JC, Brambilla E. Telomerase expression in lung preneoplasia and neoplasia. Int J Cáncer 2007; 120:1835-41.

Martínez P, Blasco M?. Telomeric and extra-telomeric roles for telomerase and the telomere-binding proteins. Nat Rev Cáncer; 11:161-76.

Nakanishi Y, Lu B, Gerard C, Iwasaki A. CD8(+) T lymphocyte mobilization to virus-infected tissue requires CD4(+) T-cell help. Nature 2009; 462:510-3.

Osen W, Soltek S, Song M, y colaboradores. Screening of human tumor antigens for CD4 T cell epitopes by combination of HLA-transgenic mice, recombinant adenovirus and antígen péptido librarles. PLoS One 2010; 5: el4137.

Pajot A, Michel ML, Fazilleau N, y colaboradores. A mouse model of human adaptive immune functions: HLA-A2.1- /HLA-DRl-transgenic H-2 clase I-/clase II-knockout ice. Eur J Immunol 2004; 34:3060-9.

Pardoll DM, Topalian SL. The role of CD4+ T cell responses in antitumor immunity. Curr Opin Immunol 1998; 10: 588-94.

Perez-Diez A, Joncker NT, Choi K, y colaboradores. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood 2007; 109:5346-54.

Rafnar T, Sulem P, Staccy SN, y colaboradores. Sequence variants at the TERT-CLPTM1L locus associate with any cáncer types. Nat Genet 2009; 41:221-7.

Rakhra K, Bachireddy P, Zabuawala T, y colaboradores.

CD4(+) T cells contribute to the remodeling of the mícroenvironment required for sustained tumor regression upon oncogene inactivation. Cáncer Cell; 18:485-98.

Ridge JP, Di Rosa F, Matzinger P. A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-killer cell. Nature 1998; 393: 474-8.

Robert C, Thomas L, Bondarenko I, y colaboradores. Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma. N Engl J Med; 364:2517-26.

Scardino A, Gross DA, Alves P, y colaboradores. HER-2/neu and hTERT cryptic epitopes as novel targets for broad spectrum tumor immunotherapy. J Immunol 2002; 168: 5900-6.

Schlapbach C, Yerly D, Daubner B, Yawalkar N, Hunger RE. Telomerase-specific GV1001 péptido vaccination fails to induce objective tumor response in patients with cutaneous T cell lymphoma. J Dermatol Sci 2011; 62: 75-83.

Schroers R, Huang XF, Ham er J, Zhang J, Chen SY. Identification of HLA DR7-restricted epitopes fro human telomerase reverse transcriptase recognized by CD4+ T-helper cells. Cáncer Res 2002; 62:2600-5.

Schroers R, Shen L, Rollins L, y colaboradores. Human telomerase reverse transcriptase-specific T-helper responses induced by promiscuous major histocompatibility complex clase II-restricted epitopes. Clin Cáncer Res 2003; 9:4743-55.

Shedlock DJ, Shen H. Requirement for CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science 2003; 300:337-9.

Smith CM, Wilson NS, Waithman J, y colaboradores. Cognate CD (+) T cell licensing of dendritic cells in CD8(+) T cell immunity. Nat Immunol 2004; 5: 1143-8.

Street SE, Cretncy E, Smyth MJ. Perforin and interferon-gairuna activities independently control tumor initiation, growth, and metástasis. Blood 2001; 97:192-7.

Suzuki K, Kachala SS, Kadota K, y colaboradores.

Prognostic immune markers in non-small cell lung cáncer. Clin Cáncer Res; 17:5247-56.

Tosolini M, Kirilovsky A, Mleenik B, y colaboradores. Clinical impact of different clasees of infiltrating T cytotoxic and helper cells (Thl, th2, treg, thl7) in patients with colorectal cáncer. Cáncer Res; 71:1263-71.

Wang XF, Kerzerho J, Adotevi O, y colaboradores. Comprehensive analysis of HLA-DR- and HLA-DP4-restricted CD4+ T cell response specific for the tumor-shared antigen survivin in healthy donors and cáncer patients. J Immunol 2008; 181:431-9.

Zitvogel L, Kepp O, Kroemer G. Immune parameters affecting the efficacy of chemotherapeutic regimens. Nat Rev Clin Oncol; 8:151-60.

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un péptido de 15 a 20 aminoácidos que se deriva de transcriptasa inversa de telomerasa humana, caracterizado porque el péptido es capaz de (i) ligarse a HLA clase II y (ii) estimular una respuesta Th CD4.

2. El péptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende, o consiste de, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: - KSVWSKLQSIGIRQH (SEQ ID NO: 1); - GTAFVQMPAHGLFPW (SEQ ID NO: 2); - SLCYSILKAKNAGMS (SEQ ID NO: 3); - PAAFRALVAQCLVCV (SEQ ID NO: 4); - el péptido derivado de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 por cualquier modificación química que mejora su resistencia a la proteólisis; - y un péptido sustancialmente homólogo que se deriva de SEQ ID NO: 1, 2, 3 o 4 por la sustitución de un uno o más aminoácidos, de manera preferente una sustitución conservadora, o una sustitución que mejora la inmunogenicidad del péptido.

3. Un polipéptido de menos que 160, de manera preferente menor que 120 aminoácidos, caracterizado porque la secuencia de la cual comprende por lo menos dos, de manera preferente tres, de manera aún más preferente por lo menos cuatro diferentes secuencias de péptido como se define en la reivindicación 2, en donde las secuencias de péptido se separan opcionalmente por un espaciador de aminoácidos.

4. Un polipéptido de menos que 300, de manera preferente menor que 200 aminoácidos, caracterizado porque comprende i) por lo menos un péptido definido en la reivindicación 1 o 2, o que comprende la secuencia de polipéptido definido en la reivindicación 3, y ii) un péptido epitópico CD8.

5. Un ácido nucleico, caracterizado porque codifica un péptido o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un péptido o polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un ácido nucleico de la reivindicación 5, en asociación con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque comprende una combinación de los péptidos de la reivindicación 2, de manera preferente una combinación de los cuatro péptidos de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID N0:4, o ácidos nucleicos que codifican los péptidos.

8. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, caracterizada porque es una composición de vacuna que comprende además un antígeno antitumoral inmunogénico o un antigeno viral, bacteriano o parasítico inmunogénico.

9. La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque es para el uso en estimular una respuesta de células T CD4 o CD8 en un paciente, o para el uso en el tratamiento de un tumor o una infección en un paciente, de manera preferente un paciente humano.

10. La composición farmacéutica para el uso en el tratamiento de un tumor de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el tumor es un cáncer, tal como un cáncer seleccionado del grupo que consiste de leucemia, linfocitica crónica, leucemia mieloide crónica, mieloma múltiple, mieloma maligno, enfermedad de Hodgkin, melanoma, tumor cerebral tal a como glioblastoma, neuroblastoma y astrocitoitoma y carcinomas de la vejiga, mama, cerviz, colon, pulmón, páncreas, próstata, cabeza y cuello, o estómago, de manera preferente en donde el tumor es un cáncer inducido por un virus.

11. Un conjugado, caracterizado porque comprende por lo menos un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, ligado a por lo menos una molécula HLA clase II, que se biotinila de manera preferente.

12. El conjugado de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende por lo menos cuatro moléculas HLA clase II biotiniladas a las cuales por lo menos cuatro péptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 se ligan, en donde las por lo menos cuatro moléculas HLA clase II biotiniladas se ligan entre si a través de una molécula de avidina que es opcionalmente etiquetada de manera detectadle.

13. Un método in vi tro para detectar y monitorear una respuesta de células T CD4 anti-telomerasa en un paciente, el método caracterizado porque comprende poner en contacto una muestra bilógica del paciente con un péptido o polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o con el conjugado de la reivindicación 11 o 12.

14. El método in vi tro de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el paciente está en necesidad de una terapia de refuerzo de células T CD4 o CD8, de manera preferente en donde el paciente tiene un tumor o está infectado con un virus que infecta las células que expresan telomerasa.

15. El método in vitro de conformidad con la reivindicación 13 o 14, caracterizado porque es para determinar o monitorear si el paciente está en necesidad de una terapia o de una terapia ajustada, predecir el resultado de un paciente, o para monitorear una respuesta a una terapia.