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MX2014010447A - Anticuerpos contra la metaloproteinasa de matriz 9. - Google Patents

Anticuerpos contra la metaloproteinasa de matriz 9.

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Publication number
MX2014010447A
MX2014010447A MX2014010447A MX2014010447A MX2014010447A MX 2014010447 A MX2014010447 A MX 2014010447A MX 2014010447 A MX2014010447 A MX 2014010447A MX 2014010447 A MX2014010447 A MX 2014010447A MX 2014010447 A MX2014010447 A MX 2014010447A
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MX
Mexico
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antibody
amino acid
mmp9
region
acid sequence
Prior art date
Application number
MX2014010447A
Other languages
English (en)
Inventor
Victoria Smith
Joanne I Adamkewicz
Zung Thai
Michael J Hawkins
Original Assignee
Gilead Biologics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/US2012/027160 external-priority patent/WO2013130078A1/en
Application filed by Gilead Biologics Inc filed Critical Gilead Biologics Inc
Publication of MX2014010447A publication Critical patent/MX2014010447A/es

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Abstract

La presente descripción proporciona composiciones y métodos de uso que implican proteínas de unión, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unió al antígeno de los mismos, que unen a la proteína metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9), (MMP9 también se conoce como la gelatinasa-B) por ejemplo donde las proteínas de unión comprenden una cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) ( o fragmento funcional de la misma) y una cadena ligera de Ig (o fragmento funcional de la misma).

Description

ANTICUERPOS CONTRA LA METALOPROTEINASA DE MATRIZ 9 Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama la prioridad de la Solicitud Provisional Americana 61 /605, 181 , presentada el 29 de febrero de 2012, de la Solicitud Provisional Americana 61 /755,444, presentada el 22 de enero de 2013, y el Número de solicitud PCT PCT/US2012/027160, presentado el 29 de febrero de 2012. El contenido de estos documentos se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Cam po de la Invención Esta descripción está en el campo de enzimas extracelulares, enzimas de matriz extracelular, proteasas e inmunolog ía.
Antecedentes de la Invención Las metaloproteinasas de matriz (M M P , por sus siglas en ingles) pertenecen a una familia de enzimas extracelulares implicadas en la formación y el remodelado de la matriz extracelular. Estas enzimas contienen un dominio catalítico conservado en el cual un átomo de zinc es coordinado por tres residuos de histidina. Más de 20 miembros de esta familia se conocen , organizados en un número de grupos incluyendo colagenasas, gelatinasas, estromelisinas, matrilisinas, enamelisinas y MMP de membrana.
Las MMP2 y MM P9 pertenecen al grupo de gelatinasa de metaloproteinasas de matriz. Además de contener el peptido de señal, el propéptido, dominios unidos a zinc y similares a heamopexina catalítica comunes a la mayoría de las M M P, las gelatinasas también contienen una pluralidad de dominios similares a fibronectina y un dominio O-glicosilado.
Las MM P están implicadas en un número de enfermedades. Los inhibidores de MMP no han sido enteramente satisfactorios, en parte relacionados a especificidad y eficacia. Así, hay una necesidad de inhibidores de M M P específicos y eficaces. El tratamiento de cánceres y enfermedades inflamatorias y autommunes, como cáncer colorrectal, I BD (incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa (UC, por sus siglas en inglés), y colitis indeterminada), artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), y otras, no ha sido enteramente satisfactorio. Así, hay una necesidad de tratamientos eficaces en tales enfermedades, particularmente para sujetos en los cuales la terapéutica disponible ha sido ineficaz.
Breve Descripción de la invención La presente descripción proporciona composiciones y métodos de uso que implican proteínas de unión , por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que unen a la proteína de metaloproteinasa de matriz 9 (M MP9, por sus siglas en inglés) (también conocida como gelatinasa-B). Las proteínas de unión son comúnmente anticuerpos o fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) de los mismos y contienen comúnmente una cadena pesada de inmunoglobulina (Ig, por sus siglas en ingles) (o fragmento funcional de la misma) y una cadena ligera de Ig (o fragmento funcional de la misma). La cadena pesada es comúnmente una IgG , como una I g G 1 o una lgG4, o versión modificada de las mismas. La cadena ligera es comúnmente una cadena kappa.
Entre las proteínas de unión a MM P9, por ejemplo, los anticuerpos, son los que unen específicamente a MMP9 y no a otro, metaloproteinasas de matriz relacionada . Tales proteínas de unión a M M P9 encuentran uso en aplicaciones en las cuales es necesario o deseable obtener la modulación específica (por ejemplo, inhibición) de M M P9, por ejemplo, sin directamente afectar la actividad de otras metaloproteinasas de matriz. Así, en ciertas modalidades de la presente descripción un anticuerpo anti-M MP9 o fragmentos del mismo es un inhibidor específico de la actividad de M M P9. En algunos aspectos, las proteínas de unión a MMP9 descritas en la presente serán útiles para la inhibición de MM P9 mientras que permiten la función normal de otras, metaloproteinasas de matriz relacionada .
Los anticuerpos y los fragmentos pueden describirse con referencia a sus secuencias de aminoácido o porciones de los mismos, y/o varias funciones como especificidad de unión a M M P9 o epítopos particulares de los mismos o la capacidad de competir para unirse con anticuerpos particulares, y/o la actividad , como la capacidad de inhibir M MP9, por ejemplo, no competitivo.
Los anticuerpos y los fragmentos pueden ser parte de una composición farmaceutica, donde los anticuerpos y los fragmentos de los mismos que unen a la metaloproteinasa de matriz 9 5 comprenden una región variable de cadena pesada (VH, por sus siglas en inglés) tienen una región determinante complementaria de cadena pesada con una secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 15 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La región de VH puede además comprender CDR con la secuencia de ío aminoácido de las SEC ID NOs: 13 y/o 14. La región de VH puede también comprender la secuencia de aminoácido como se indica en las SEC I D NOs: 3, 5, 6, 7, u 8. La región de VH puede también comprender la secuencia de aminoácido tiene un 95% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido como se 15 indica en las SEC I D NOs: 3, 5, 6, 7, u 8.
En otra modalidad , la composición farmacéutica descrita comprende anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno de los mismos que unen a la metaloproteinasa de matriz 9 que comprende una región variable de cadena ligera (VL, por sus 20 siglas en inglés) tienen una región determinante complementaria de cadena ligera (CDR, por sus siglas en inglés) con una secuencia de aminoácido de SEC I D NO: 18 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La región de VL puede además comprende con la secuencia de aminoácido de las SEC ID NOs: 25 16 y/o 17. La región de VL puede también comprender la secuencia de aminoácido como se indica en las SEC ID NOs: 4, 9, 10, 1 1 , o 12. La región de VL puede tambien comprender la secuencia de aminoácido tiene un 95% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido como se indica en las SEC ID NOs: 5 4, 9, 10, 1 1 , o 12. En una modalidad, la región de VH tiene la secuencia de aminoácido indicada en la SEC ID NO : 7 y la región de VL tiene la secuencia de aminoácido indicada en la SEC ID NO: 12.
En otra modalidad, la proteína de unión a M MP9 comprende ío una región de VH que comprende una CDR con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NOs: 13, 14, 1 5, 34, 35, 36 y 47; y una región de VL tiene una CDR con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC I D NOs: 16, 17, 1 8 , 37, 38, 39, 42 , 43, 15 44, y 48. También, la proteína de unión a MM P9 puede comprender una región de VH tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC I D NOs: 1 , 3, 5, 6, 7, 8, 34, 35, 36, y 46; y una región de VL tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID 20 NOs: 2 , 4, 9, 10, 1 1 , 12 , 37, 38, 39, 42, 43, 44, y 45. Además, la proteína de unión a M M P9 puede comprender una región de VH tiene un 95% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NOs: 30, 32, 46, y 47; y la región de VL tiene un 95% de 25 identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC I D NOs: 31 , 33, 41 , 45, y 48. Por otra parte, la proteína de unión a MM P9 puede comprender una región de VH tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC I D NOs: 30, 32, 5 46, y 47; y la región de VL tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC I D NOs: 31 , 33, 41 , 45, y 48.
Otra modalidad de la invención se relaciona con una composición farmaceutica, que comprende un anticuerpo aislado io o fragmento del mismo que une específicamente a un epítopo de M MP9, donde el epítopo comprende un residuo de aminoácido dentro de una región de MMP9, la región consiste en 104-1 19 residuos, 159-166 residuos, o 191 -202 residuos de la SEC I D NO : 27; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto, 15 el epítopo comprende E 1 1 1 , D 1 13, R162, o 1 198 de la SEC ID NO : 27.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas descritas además comprenden uno o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste en un agente 0 antiinflamatorio, un agente inmunoterapéutico, un agente quimioterapéutico, un agente anticáncer, un agente anti-fibrótico, o una combinación de los mismos. Los ejemplos de un agente terapéutico incluyen pero no se limitan a nab-paclitaxel, mFOLFOX6, FOLFI RI , carboplatino, paclitaxel, pemetrexed, 5 bevacizumab, anticuerpos similares a anti-lisil-oxidasa tipo 2 (L0XL2 , por sus siglas en ingles) , anticuerpos de receptor del dominio anti-discoidina 1 (DDR1 , por sus siglas en inglés), o una combinación de los mismos.
También se proporcionan métodos para inhibir la actividad de MMP9 en un sujeto y/o tratar una enfermedad o una condición en el sujeto, por ejemplo, al usar un agente que inhibe no competitivamente MMP9, y agentes (como cualquiera de los anticuerpos anti-MM P9 descritos antes y otras proteínas de unión a M M P9) para el uso en tales métodos. Los métodos son realizados generalmente administrando al sujeto una proteína de unión a M MP9, como un anticuerpo de unión a M MP9 o fragmento del mismo como se proporciona en la presente, como cualquiera de los descritos antes, por ejemplo, en una cantidad eficaz. El anticuerpo o fragmento se une generalmente de manera específica a e inhibe no competitivamente MM P9, comúnmente de tal manera que la actividad de M MP9 es inhibida en el sujeto. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento es uno que une M M P9 fuera del dominio catalítico, como en uno de los epítopos descritos antes. En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento no une sustancialmente a una proteína de MM P con excepción de M MP9 y/o no une sustancialmente a M M P2. Se proporcionan además métodos para detectar o supervisar la actividad de MM P9 que comprende poner en contacto una muestra con la proteína de unión a MM P9, y evaluar la presencia o la ausencia de la proteína de unión a MMP9 - complejo de M MP9; donde la ausencia de la proteína de unión a MMP9 - complejo de MMP9 indica que la muestra no tiene actividad de M MP9, y la presencia de la proteína de unión a M MP9 - complejo de MMP9 indica que la muestra tiene la actividad de MMP9. La actividad de M M P9 puede detectarse al usar la proteína de unión a M MP9 descrita en la presente.
Tambien se proporcionan métodos y usos de las composiciones farmacéuticas descritas aquí, donde un sujeto en la necesidad de los mismos que tiene una enfermedad o condición asociada a M MP-9 se administra una cantidad eficaz de los anticuerpos o los fragmentos descritos de los mismos o la composición farmacéutica que comprende los anticuerpos o los fragmentos descritos de los mismos que es eficaz para inhibir la actividad de MM P9 en el sujeto. Los ejemplos de las enfermedades o las condiciones asociadas a M M P9 incluyen pero no se limitan a cánceres, enfermedades o condiciones autommunes, inflamatorias, o fibróticas. Los ejemplos de cánceres asociados a MM P9 incluyen pero no se limitan a cáncer pancreático, adenocarcinoma esofagogástrico, cáncer de pulmón de célula no pequeña , carcinoma de célula escamosa de pulmón , adenocarcinoma de pulmón , adenocarcinoma gástrico, carcinoma colorrectal, adenocarcinoma pancreático, carcinoma de célula escamosa de cabeza y cuello, cáncer carcinomacolorectal hepatocelular, adenocarcinoma colorrectal, o carcinoma hepatocelular. Los ejemplos de enfermedad o condición autoinmune o inflamatoria asociada a MM P9 son artritis reumatoide, una enfermedad de intestino inflamatorio (I BD, por sus siglas en ingles), septicemia, esclerosis múltiple, distrofia muscular, lupus, alergia, o asma. Los ejemplos de IBD incluyen pero no se limitan a colitis ulcerosa (UC, por sus siglas en inglés), enfermedad de Crohn (CD, por sus siglas en inglés) , o colitis indeterminada.
En algunos ejemplos, el anticuerpo o la composición farmacéutica de los mismos se administra en una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 28 mg/kg. En algunos ejemplos, el anticuerpo o la composición farmacéutica de los mismos se administra en una dosificación de entre o aproximadamente 100 y a o aproximadamente 1800 mg/kg de peso corporal.
En algunos ejemplos, el anticuerpo o la composición farmacéutica de los mismos se administra a una dosificación a o aproximadamente 100, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1 100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, o 1800 mg/kg de peso corporal. En algunos ejemplos, el anticuerpo se administra al intervalo de una , dos o tres semanas, o una vez uno, dos, o tres semanas. En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de los mismos se administra intravenosa o subcutáneamente.
En algunas modalidades, el anticuerpo o la composición farmacéutica de las mismas se administra sola, como una monoterapia . En otras modalidades, el anticuerpo o la composición farmacéutica de los mismos se administra como parte de una terapia de combinación con uno o más otros agentes terapeuticos. Los agentes terapéuticos incluyen pero no limitados a agente antiinflamatorio, un agente inmunoterapéutico, un agente quimioterapéutico, un agente anticáncer, a un agente anti-fibrótico, o a una combinación de los mismos. Uno o más otros agentes terapéuticos pueden administrarse concurrentemente o secuencialmente con el anticuerpo o los fragmentos de los mismos.
Breve Descripción de los Dibujos El Figura 1 muestra la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-MM P9 monoclonal de ratón (AB0041 ) , junto con las secuencias de aminoácido de variantes humanizadas de cadena pesada (VH 1 -VH4), alineadas para mostrar diferencias en secuencia de aminoácido de marco que resultan de la humanización . Las CDR se muestran en itálicas, y los aminoácidos que son diferentes en las variantes humanizadas, comparadas al monoclonal de ratón madre, están subrayadas.
La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácido de la región variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-MM P9 monoclonal de ratón (AB0041 ) , junto con las secuencias de aminoácidos de variantes humanizadas de esta cadena ligera (VH 1 -VH4), alineadas para mostrar diferencias en secuencia de aminoácido de marco que resultan de la humanización. Las CDR se muestran en itálicas, y los aminoácidos que son diferentes en las variantes humanizadas, comparadas a los monoclonales de ratón madre, están subrayadas.
La Figura 3 muestra un diagrama esquemático de la proteína M P9. 5 La Figura 4 muestra una comparación entre las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos designados AB0041 , M4, y M 12.
La Figura 5 muestra los resultados de la inmunohistoquímica (I HC, por sus siglas en ingles) realizados en ío secciones en serie congeladas de dos colones de ratones tratados con Veh ículo (A) y tratados con AB0046 (B) como se describe en el Ejemplo 4, destacando inflamación y destrucción de tejido observadas en colitis inducida por DSS. La expresión de MMP9 se observó en los neutrófilos infiltrantes (indicados por 15 la señal de MPO) y macrófagos y co-localizados con colágeno IV de membrana basal (etiquetado "CollV" en la figura) , y el sustrato de M M P9. Los dos colones enfermos (A) exhiben destrucción del epitelio de la mucosa y las criptas submucosas y un infiltrado de células inflamatorias resistentes. Poca evidencia de la expresión 0 de M M P2 se observó en el tejido enfermo (A).
La Figura 6 muestra imágenes representativas de la inmunohistoqu ímica (I HC, por sus siglas en inglés) de M MP9 en secciones incrustadas en parafina, fijadas en formalina, tomadas de dos colones como se describe en el Ejemplo 4. Como se 5 muestra, la expresión de la célula epitelial de MMP9 (flechas) fue mínima en colones normales (- DSS) e inducida altamente despues de la administración de DSS (+ DSS).
La Figura 7 muestra los resultados de la evaluación endoscópica, realizados en todos los grupos de animales en estudio los días 10 y 14 (día de terminación) en el estudio descrito en el Ejemplo 4. El panel A muestra el conteo de endoscopia promedio ( + /-SEM) en los días 6-14, con las flechas indican los días de AB0046 (u otro tratamiento) de administración. El panel B muestra el conteo de endoscopia promedio ( + /-SEM) en el día 14 para cada grupo, con los asteriscos que indican la reducción importante en la enfermedad (que se observó para los grupos de tratamiento de AB0046 y de EN BREL® en el Día 14) . El conteo endoscópico refleja la lesión más severa observada para cada animal.
La Figura 8 muestra los resultados del análisis histopatológico, realizados en los colones eliminados en la terminación del estudio descrito en el Ejemplo 4. El grado de inflamación, edema , y necrosis se evaluó y un conteo de suma se calculó agregando el conteo de colon promedio de cada animal para cada parámetro evaluado. El tratamiento anti-MM P9 (AB0046) redujo perceptiblemente la enfermedad histopatológica a un grado similar a EN BREL®.
La Figura 9 muestra imágenes representativas de I HC M MP9 en las secciones FFPE de los colones del estudio descrito en el Ejemplo 4. La expresión de M MP9 fue mínima en los colones normales (sin DSS) y se indujo altamente despues de la administración de DSS (Vehículo). La reducción de la expresión de M M P9 en los grupos de tratamiento de AB0046 y de ENBREL® correlacionada con la reducción en enfermedad total.
La Figura 10 muestra los resultados del peso corporal y la diarrea para el estudio descrito en el Ejemplo 4. El área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) se calculó para los cambios del peso corporal y la incidencia de diarrea mediante el método de regla trapezoidal. El tratamiento con el anticuerpo anti-MMP9 (AB0046) fue protector contra la pérdida de peso corporal debido a la colitis inducida por DSS y comparable al efecto del tratamiento de EN BREL®. La incidencia de la diarrea fue reducida similarmente con el tratamiento de AB0046 y de ENBREL®.
La Figura 1 1 A muestra los resultados de un análisis de multi-analito ELISA realizado como se describe en el Ejemplo 4 en muestras de suero terminales en un modelo de colitis DSS después del tratamiento con el anticuerpo anti-M MP9 (AB0046) y otros tratamientos. Los resultados revelaron una infrarregulación sistémica amplia de citocinas inflamatorias inducidas por enfermedad y factores de crecimiento con el tratamiento de AB0046.
La Figura 11 B muestra los datos del marcador de suero adicionales del mismo estudio.
La Figura 12A muestra una reducción de enfermedad endoscópica por el tratamiento del anticuerpo anti-MMP9 (AB0047) en el modelo de colitis DSS en el estudio describió en el Ejemplo 4.
La Figura 12B muestra una Reducción en enfermedad histológica por el tratamiento del anticuerpo anti-M MP9 (AB0047) en el modelo de colitis DSS en el estudio describió en el Ejemplo 4.
La Figura 13 muestra los resultados de la evaluación endoscópica, realizados en todos los grupos de animales en días indicados en el estudio de tratamiento profiláctico descrito en el Ejemplo 5. El panel A muestra el conteo de endoscopia promedio (+/- SEM) en los días 6-14, con las flechas que indican los días de la administración de AB0046 (u otro tratamiento). El panel B muestra el conteo de endoscopia promedio ( + /- SEM) en el día 10 para cada grupo, con los asteriscos que indican la reducción importante en la enfermedad (que se observó para los grupos del tratamiento de AB0046 y de ENBREL® en el día 14) . El conteo endoscópico refleja la lesión más severa observada para cada animal .
La Figura 14 muestra los resultados del análisis histopatológico, realizados en los colones eliminados en la terminación del estudio descrito en el Ejemplo 5. Se evaluó el grado de inflamación , de edema, y de necrosis y se calculó el conteo de suma agregando el conteo de colon promedio de cada animal para cada parámetro evaluado.
La Figura 15 muestra los resultados del peso corporal y la diarrea para el estudio descrito en el Ejemplo 5. El área bajo la curva (AUC, por sus siglas en ingles) se calculó para los cambios del peso corporal y la incidencia de diarrea mediante el método 5 de regla trapezoidal. El tratamiento profiláctico con anticuerpo anti-M MP9 (AB0046) fue protector contra la incidencia de diarrea.
La Figura 16 muestra la disminución en crecimiento del tumor primario en un modelo de tumorigénesis colorrectal establecido (HCT1 16) en el estudio descrito en el Ejemplo 6. El ío panel izquierdo muestra el cambio disminuido en volumen de tumor; el panel derecho muestra el peso de tumor disminuido final en el día 32 después de la iniciación del tratamiento (con los valores p derivados de la prueba de Mann-Whitncy y las barras representan el grupo promedio ± SEM) . 15 La Figura 17A muestra los resultados clínicos y conteo de pierna del estudio descrito en el Ejemplo 7, que muestra la eficacia de los anticuerpos anti-MMP9 sustituto murino (AB0046) y anti-humano MMP9 (AB0041 ) en modelos de ratón y de rata CIA de artritis reumatoide. 20 La Figura 17B muestra los títulos del anticuerpo anti-MM P9 del mismo estudio. MTX = metotrexato; Sin S I D. = no-enfermo.
La Figura 18A muestra los niveles en suero fin-de-estudio de citocinas inflamatorias en el estudio de CIA de rata descrito en el Ejemplo 7; 25 La Figura 18B muestra los niveles de fin-de-estudio de citocinas inflamatoria en suero en el estudio de CIA de ratón descrito en el Ejemplo 7. MTX = metotrexato; Sin SI D. = no-enfermo.
La Figura 19A muestra los marcadores adicionales en el estudio de CIA de rata en suero descrito en el Ejemplo 7; La Figura 19B muestra los marcadores de suero adicional en el estudio de CIA de ratón describió en el Ejemplo 7. MTX = metotrexato; Sin SI D. = no enfermo.
La Figura 20 muestra la protección contra muerte y perdida de temperatura corporal que sigue la administración de anti-M MP9 en un modelo de rata de septicemia de LPS como se describe en el Ejemplo 8. La línea inferior en cada gráfica representa el grupo tratado con CA-1 y las dos líneas superiores representan el grupo que no recibe LPS (diamantes en el panel izquierdo; círculos en el panel derecho) y el grupo tratado con anti-MMP9 (cuadrados en el panel izquierdo y triángulos en el panel derecho) .
La Figura 21 muestra los conteos ± desviación estándar del síndrome musculoesquelético diario promedio (MSS, por sus siglas en inglés) para ratas tratadas con AB0041 , Marimastat, y control .
La Figura 22 muestra los niveles en suero de AB0041 (títulos en suero) como se midió mediante ELISA en ratas tratadas conAB0041 a los días 1 , 7, 10, 14, 1 7, 21 , 24, y 28. Los datos se presentan como el valor promedio ± desviación estándar.
La Figura 23 muestra cambia en el volumen tumoral (Figuras 23A, 23C, 23E) y el peso (Figuras 23B, 23D, 23F) siguiendo los tratamientos indicados en un modelo de xenomjerto de ratón de cáncer colorrectal.
La Figura 24 muestra el cambio en el volumen tumoral (Figura 24A) y el peso (Figura 24B) que sigue los tratamientos indicados en un modelo de xenoinjerto de ratón de cáncer colorrectal.
La Figura 25 muestra los niveles de proteínas en suero despues del control y del tratamiento anti-M M P9 en un modelo de xenoinjerto de ratón de cáncer colorrectal .
La Figura 26 muestra los cambios en espesor de pata , diámetro de tobillo, y peso corporal en un modelo de CIA de rata de artritis reumatoide después del tratamiento indicado.
La Figura 27 los conteos de TN F-alfa y de CD68 que siguen el tratamiento indicado en un modelo de C IA de rata de artritis reumatoide, como se midió mediante inmunohistoquímica .
La Figura 28 muestra los niveles en suero de fin-de-estudio de citocinas inflamatorias en un estudio de CIA de rata.
La Figura 29 muestra los cambios en espesor de pata, diámetro de tobillo, y peso corporal en un modelo de CIA de ratón de artritis reumatoide después del tratamiento indicado.
La Figura 30 muestra los resultados del análisis de I HC de la proteína M M P9 asociada a tumor epitelial.
La Figura 31 muestra los resultados del análisis de CISH de ARNm de MMP9 asociado a tumor epitelial: Descripción Detallada de la Invención La práctica de la presente descripción emplea, a menos que se indique lo contrario, metodos estándar y téenicas convencionales en los campos de la biolog ía celular, toxicología, biología molecular, bioquímica , cultivo celular, inmunología, oncolog ía , ADN recombinante y campos relacionados como están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas se describen en la literatura y de tal modo disponible para los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Alberts, B. et al. , "Molecular Biology of the Ce 11 , " 5a edición , Garland Science, New York, NY, 2008; Voet, D. et al. "Fundamentáis of Biochemistry: Life at the Molecular Level," 3a edición , John Wilcy & Sons, Hoboken, NJ , 2008; Sambrook, J . et al. , "Molecular Cloning : A Laboratory Manual," 3a edición , Coid Spring Harbor Laboratory Press, 2001 ; Ausubel, F. et al, "Current Protocols in Molecular Biology," John Wiley & Sons, New York, 1987 y actualizaciones periódicas; Freshney, R. I . , "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique," 4a edición , John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000; y las series "Methods in Enzymology ," Academic Press, San Diego, CA. Ver también , por ejemplo, "Current Protocols in I mmunology," (R. Coico, editor de series), Wiley, última actualización agosto de 2010.
La actividad anormal de ciertas MM P desempeña un papel en el crecimiento tumoral , metástasis, inflamación , autommunidad , y la enfermedad vascular. Ver, por ejemplo, Hu et al. (2007) Nature Reviews: Drug Discovery 6:480-498. Una fuente notable de MMP9 es los macrófagos asociados a tumores (TAMs, por sus siglas en inglés), que soportan la metástasis y la invasión 5 en un bucle de co-activación de complejo a través de la interacción de paracrina con las células tumorales primarias. Esta combinación de la descomposición proteolítica de barreras físicas a la invasión de las células además de la liberación de factores que activan el crecimiento y la angiogénesis allana la ío manera para la extensión tumoral, con el desarrollo de acompañamiento de la neovascularización para soportar la excrecencia tumoral.
La MMP9 es un objetivo de trayectorias de señalización oncogénica como RAS/RAF, PI3K/AKT/N FkB, y WNT/beta-15 catenina y funciones como un regulador corriente arriba de estas trayectorias a través de la modulación de integrina y la función de tirosina cinasa receptora. La MMP9 se eleva en una gran variedad de tipos de tumor y los niveles de MMP9 se correlacionan con pronóstico pobre en muchos cánceres, 20 incluyendo cáncer gástrico, de pulmón, y colorrectal. La M P9 también se implica en quimioresitencia y sobrerregulada sobre la pérdida de varios supresores tumorales. La MM P9 está sobrerregulada en muchos diferentes tipos de tumor y puede promover el crecimiento primario y la invasión distal de células 25 cancerosas.
Puede ser deseable inhibir la actividad de una o más M MP en ciertos ajustes terapeuticos. Sin embargo, la actividad de ciertas otras M MP, por ejemplo, M MP2, se requiere a menudo para la función normal y/o es protectora contra enfermedad. Puesto que la mayoría de los inhibidores de MMP se dirigen al dominio catalítico conservado y, como un resultado, inhiben un número de diferente MMPS, el uso de inhibidores de MMP disponibles ha causado efectos secundarios debido a la inhibición de M M P no relacionada patogenéticamente esencial .
Los desafíos asociados con inhibidores de desarrollo específicos a una MM P particular o unas MMP selectas se relacionan con el hecho de que la inhibición de la actividad enzimática requiere generalmente que el inhibidor esté dirigido al dominio catalítico. Las homolog ías en dominios catalíticos de M M P pueden hacer que los inhibidores reaccionen con más de una MM P. Entre las modalidades proporcionadas están los agentes, incluyendo reactivo terapéuticos, como anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que inhiben específicamente la actividad catalítica de una sola MM P o una pluralidad selecta de las M MP, como M MP9 y que no reaccionan con o inhiben ciertas otras MMP o cualquier otras M MP. También entre las modalidades proporcionadas están los métodos y los usos de los mismos para el tratamiento de varias enfermedades, incluyendo cánceres y enfermedades autommunes e inflamatorias. Proteínas de Unión a Mmp9 La M MP9 degrada el colágeno de membrana basal y otros componentes de matriz extracelular (ECM, por sus siglas en ingles). Kessenbrock K, et al. , "Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment." Cell 2010 ; 141 ( 1 ) : 52-67. La degradación de matriz contribuye a la patología en múltiples enfermedades, incluyendo artritis, cáncer, y colitis ulcerosa . Roy R, et al. , "Matrix metalloproteinases as novel biomarkers and potential therapeutic targets in human cáncer." J Clin Oncol 2009;27 (31 ) :5287-97. Los inhibidores de metaloproteinasa de matriz de amplio espectro como Marimastat son eficaces en modelos animales de la inflamación y cáncer (Watson SA, et al. , "I nhibition of tumour growth by marimastat in a human xenograft model of gastric cáncer: relationship with levels of circulating CEA." Br J Cáncer 1999;81 ( 1 ): 19-23; Sykes AP, et a/. , "The effect of an inhibitor of matrix metalloproteinases on colonic inflammation in a trinitrobenzenesulphonic acid rat model of inflammatory bowel disease." Aliment Pharmacol Ther 1999; 13 ( 1 1 ): 1535-42.) . Tales paninhibidores, sin embargo, pueden causar efectos secundarios musculoesqueléticos incluyendo rigidez en articulaciones, inflamación , y dolor en las manos, brazos, y hombros, referidos colectivamente como síndrome musculoesquelético (MSS, por sus siglas en inglés) , comúnmente en o ceca de niveles de dosis eficaces de Marimastat en humanos. Peterson JT. "The importance of estimating the therapeutic Índex in the development of matrix metalloproteinase inhibitors." Cardiovasc Res 2006;69 (3):677-87; Tierncy GM , et al. "A pilot study of the safety and effects of the matrix metalloproteinase inhibitor marimastat ¡n gastric cáncer." Eur J Cáncer 1999;35 (4):563-8; Wojtowicz-Praga S, et al. "Phase I trial of Marimastat, a novel matrix metalloproteinase inhibitor, administered orally to patients with advanced lung cáncer." J Clin Oncol 1998; 16 (6):2150-6. Los síntomas son dependientes de la dosis y del tiempo, y son reversibles poco despues de la cese del tratamiento con el inhibidor de pan-M M P . Wojtowicz-Praga S, 1 998; Nemunaitis J , et al. , "Combined analysis of studies of the effects of the matrix metalloproteinase inhibitor marimastat on serum tumor markers in advanced cáncer: selection of a biologically active and tolerable dose for longer-term studies." Clin Cáncer Res 1998;4 (5): 1 101 -9; H utchinson JW et al. , "Dupuytren's disease and frozen shoulder induced by treatment with a matrix metalloproteinase inhibitor." The Journal of bone and jomt surgery. British volume 1998;80 (5) :907-8. El Marimastat y otros inhibidores de pan-MM P de la misma clase son quelantes de zinc. Peterson JT, 2006. El ratón nuligén ico homocigótico M MP9 exhibe síntomas no similares a MSS o cambios similares de tejido a MSS. Vu TH , et al. , "M MP- 9/gelatinase B is a key regulator of growth píate angiogenesis and apoptosis of hypertrophic chondrocytes." Cell 1998;93 (3);41 1 -22.
La presente descripción proporciona proteínas de unión , por ejemplo, anticuerpos y fragmentos (por ejemplo, fragmentos de unión al antígeno) de los mismos, que unen a la proteína de metaloproteinasa de matriz-9 (MM P9, por sus siglas en ingles) (MMP9 también se conoce como gelatinasa-B), por ejemplo, M MP9 humana, como la MMP9 humana que tiene una secuencia de aminoácido indicada en la SEC ID NO : 27 o SEC ID NO: 28. Las proteínas de unión de la presente descripción comprenden generalmente una cadena pesada de inmunoglobulina (Ig) (o fragmento funcional de la misma) y una cadena ligera de Ig (o fragmento funcional de la misma) .
La descripción además proporciona proteínas de unión a MM P9 que unen específicamente a M M P9 y no a otras metaloproteinasas de matriz como MM P 1 , M MP2, MMP3, M M P7, MM P9, M MP10, MM P 1 2, y M M P13. Tales proteínas de unión a MM P9 específica son así generalmente no reacciona de manera cruzada a un grado importe o detectable con las metaloproteinasas diferentes a la matriz MMP9. Las proteínas de unión a MM P9 que unen específicamente MM P9 encuentran uso en aplicaciones las cuales es necesario o deseable obtener la modulación específica (por ejemplo, inhibición) de M MP9, por ejemplo, sin afectar directamente la actividad de otras metaloproteinasas de matriz.
En ciertas modalidades de la presente descripción un anticuerpo anti-MMP9 es un inhibidor de la actividad de MMP9, y puede ser un inhibidor específico de M M P9. En particular, las proteínas de unión a MMP9 descritas en la presente serán útiles para la inhibición de MMP9 mientras que permiten la función normal de otras, metaloproteinasas de matriz relacionadas. "Un inhibidor de MMP" o "inhibidor de actividad de M MP9" puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que directa o indirectamente inhibe la actividad de M M P9, incluyendo pero sin limitarse al proceso enzimático, que inhibe la acción de MMP9 en su sustrato (por ejemplo, inhibiendo la unión del sustrato, división del sustrato, y semejantes) , y similares.
En algunas modalidades, como se demostrado en ejemplos en la presente, mientras que el tratamiento con inhibidores de pan-M MP, como inhibidores de pan de molecula pequeña como Marimastat, da lugar a síntomas de la enfermedad musculoesquelética, como síndrome musculoesquelético (MSS, por sus siglas en inglés), incluyendo efectos sustanciales sobre la marcha, postura y voluntad para moverse, inhibición específica de M M P9 como los anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos en la presente aplicación , no causa tales síntomas y no induce MSS.
La presente descripción también proporciona proteínas de unión a M MP9 que unen específicamente al MMP9 diferente de ratón, como MMP9 humana, MMP9 de macaco, y MMP9 de rata.
La presente descripción también proporciona proteínas de unión a MM P9 (por ejemplo, anticuerpos anti-MM P9 y fragmentos funcionales de los mismos) que actúan como inhibidores no competitivos. Un "inhibidor no competitivo" se refiere a un inhibidor unido al sitio lejos del sito de unión al sustrato de una enzima, y así puede unir la enzima y efectuar la actividad inhibidora sin importar si o no la enzima está unida a su sustrato. Tales inhibidores no competitivos pueden , por ejemplo, proporcionar un nivel de inhibición que pueda ser sustancialmente independiente de la concentración de sustrato.
Las proteínas de unión a M M P9 (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas) de la presente descripción incluyen las que unen M MP9, particularmente MM P9 humana , y que tienen un polipeptido de cadena pesada (o fragmento funcional del mismo) que tienen por lo menos aproximadamente 80% , 85%, 90%, 95% o más identidad de secuencia de aminoácido a un polipéptido de cadena pesada descrita en la presente. En un cierto ejemplo, las proteínas de unión a MM P9 (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas) de la presente descripción incluyen las que unen M MP9, particularmente M M P9 humana , y que tienen un polipéptido de cadena pesada (o fragmento funcional del mismo) que tiene por lo menos aproximadamente 90% , 95% , 97% , 98% , 99% o más identidad de secuencia de aminoácido a un polipéptido de cadena pesada descrita en la presente.
Las proteínas de unión a M MP9 (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas) de la presente descripción incluyen las que unen M MP9, particularmente MMP9 humana, y que tienen un polipeptido de cadena ligera (o fragmento funcional del mismo) que tie-ne por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90% , 95% o más identidad de secuencia de aminoácido a un polipéptido de cadena pesada descrita en la presente.
Las proteínas de unión a M M P9 (por ejemplo, anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas) de la presente descripción incluyen las que unen M M P9, particularmente MM P9 humana, y tienen un polipéptido de cadena pesada (o fragmento funcional del mismo) que tiene las regiones determinantes de complementariedad ("CDR") de polipéptido de cadena pesada y las C DR de un polipéptido de cadena ligera (o fragmento funcional del mismo) como se describe en la presente.
La "homolog ía" o "identidad" o "similitud" como se usa en la presente en el contexto de ácidos nucleicos y polipéptidos se refiere a la relación entre dos polipéptidos o dos moléculas de ácido nucleico basados en una alineación de secuencias de aminoácidos o de secuencias de ácido nucleico, respectivamente. La homolog ía y la identidad pueden cada una ser determinadas comparando una posición en cada secuencia que pueda alinearse para los propósitos de comparación. Cuando una posición equivalente en las secuencias comparadas es ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición ; cuando el sitio equivalente ocupado por la misma o un residuo de aminoácido similar (por ejemplo, similar en naturaleza esterica y/o electrónica), entonces las moléculas pueden referirse como homologas (similar) en esa posición . La expresión como un porcentaje de homología/similitud o identidad se refiere a una función del número de aminoácidos idénticos o similares en las posiciones compartidas por las secuencias comparadas. En comparar dos secuencias, la ausencia de residuos (aminoácidos o ácidos nucleicos) o la presencia de residuos extras también disminuye la identidad y homología/similitud.
Como se usa en la presente, "identidad" significa el porcentaje de nucleótido idéntico o residuos de aminoácido en las posiciones correspondientes en dos o más secuencias cuando las secuencias se alinean para maximizar la igualación de secuencia , es decir, considerando las separaciones e inserciones. Las secuencias se alinean generalmente para la correspondencia máxima sobre una región designada , por ejemplo, una región de por lo menos aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más aminoácidos o nucleótidos en longitud , y pueden ser de hasta la longitud completa del aminoácido o del nucleótido de referencia . Para la comparación de secuencia, comúnmente una secuencia actúa como secuencia de referencia, a la cual se comparan las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y de referencia se introducen en un programa de computadora, se designan las coordenadas de subsecuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencia. El algoritmo de comparación de secuencia entonces calcula el porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias de prueba con relación a la secuencia de referencia , basada en los 5 parámetros de programas designados.
Los ejemplos de algoritmos que son adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia son los algoritmos de PLAST y de PLAST 2.0, que se describen en Altschul et al. (1990) J . Mol. Biol . 215: 403-410 y Altschul et al. ío (1977) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 , respectivamente. El software para realizar el análisis de PLAST está disponible públicamente a traves del Centro Nacional para la I nformación de Bioteenología (www. ncbi.nlm. nih.gov). Algoritmos ejemplares adicionales incluyen ClustalW (Higgins D. , et al. ( 1994) Nucleic 15 Acids Res 22 : 4673-4680) , disponible en www.ebi.ac.uk/T ools/clustalw/ index. html.
Las posiciones del residuo que no son idénticas pueden diferenciarse por las sustituciones conservadoras de aminoácido. Las sustituciones conservadoras de aminoácido se refieren a la 20 intercambiabilidad de los residuos que tienen cadenas laterales similares . Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina , valina, leucina, e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales de hidróxido alifático es serina y treonina; un grupo de 25 aminoácidos que tiene cadenas laterales que contiene amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contiene sulfuro es cisteína y metionina .
La identidad de secuencia entre dos ácidos nucleicos puede tambien describirse en términos de hibridación de dos moléculas entre sí bajo condiciones rigurosas. Las condiciones de hibridación se seleccionan después de métodos estándar en la téenica (ver, por ejemplo, Sambrook, et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, ( 1989) Coid Spring Harbor, N .Y.). Un ejemplo de las condiciones rigurosas de hibridación es hibridación a 50°C o mayor y 0.1 x SSC (15 mM de cloruro de sodio/1 .5 nM de citrato de sodio) . Otro ejemplo de condiciones rigurosas de hibridación es incubación durante la noche a 42°C en una solución : 50% de formamida , 5 x SSC (150 mM de NaCI, 1 5 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5 x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 0.1 x SSC a aproximadamente 65°C. Las condiciones rigurosas de hibridación son las condiciones de hibridación que son por lo menos tan rigurosas como las condiciones representativas anteriores, donde las condiciones se consideran ser por lo menos tan rigurosas si son por lo menos aproximadamente 80% tan rigurosas, comúnmente por lo menos 90% como rigurosas como las condiciones rigurosas específicas anteriores.
Por consiguiente, la presente descripción proporciona, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que comprenden un polipéptido de región variable de cadena pesada que tiene por lo menos 80%, 85%, 90% , 95% , 96% , 97%, 98% , 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácido a una secuencia de aminoácido de una región variable de cadena pesada descrita en la presente (por ejemplo, SEC ID NOs: 1 o 5-8), y un polipéptido de cadena ligera variable que tiene por lo menos 80% , 85%, 90% , 95% , 96%, 97% , 98% , 99% o mayor identidad de secuencia de aminoácido a una secuencia de aminoácido de un polipéptido de cadena ligera como se indica en la presente (por ejemplo, SEC I D NOs: 2 o 9-12).
Los ejemplos de los anticuerpos anti-MMP9 de la presente descripción se describen en mayor detalle a continuación.
Anticuerpos Las proteínas de unión a MM P9 incluyen anticuerpos y fragmentos funcionales de las mismas, como las que unen específicamente a M MP9. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" significa un agente de unión al polipéptido aislado o recombinante que comprende las secuencias de péptido (por ejemplo, secuencias de región variable) que específicamente une un epítopo antigénico. El término se usa en su sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales se longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quimericos, nanocuerpos, diacuerpos, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecífico), y fragmentos de anticuerpos que incluyen pero no se limitan a Fv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 y Fab2, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada . El término "anticuerpo humano" se refiere a anticuerpos que contienen secuencias de origen humano, a excepción de regiones de CDR no humanas posibles, y no implica que la estructura completa de una molécula de inmunoglobulina esté presente, sólo que el anticuerpo tenga efecto inmunogenético mínimo en un humano (es decir, no induzca la producción de anticuerpos a sí mismo).
Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo de longitud completa, por ejemplo, la región de unión al antígeno o variable de un anticuerpo de longitud completa . Tales fragmentos de anticuerpos pueden también referirse en la presente como "fragmentos funcionales: o "fragmentos de unión al antígeno". Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab', F(ab')2, y fragmentos de Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057-1062); moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecífico formados de fragmentos de anticuerpos. La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno identicos, llamados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de unión al antígeno, y un fragmento de "Fe" residual, una designación que refleja la capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento de pepsina rinde un fragmento de F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígenos y es todavía capaz de reticular el antígeno.
"Fv" es un fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de reconocimiento de y de unión al antígeno completo. Esta región consiste en un d ímero de un dominio variable de cadena pesada y ligera en asociación estrecha, no covalente. Es en esta configuración que las tres regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de unión al antígeno en la superficie del d ímero de VH-VL. Colectivamente, las seis CDR confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o una región de VH o de VL aislada que comprende solamente tres de las seis CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y de unir el antígeno, aunque generalmente a una afinidad menor que el fragmento de Fv entero.
El fragmento de "Fab" también contiene, además de las regiones variables de cadena pesada y ligera, el dominio constante de cadena ligera y el primer dominio constante (CH-i) de la cadena pesada. Los fragmentos de Fab se observaron originalmente después de la digestión de papaína de un anticuerpo. Los fragmentos de Fab' difieren de fragmentos de Fab en que los fragmentos de F(ab') contienen varios residuos adicionales en el termino carboxi del dominio C H T de cadena pesada, incluyendo una o más cisteínas de la región de bisagra de anticuerpo. Los fragmentos de F(ab')2 contienen dos fragmentos de Fab unidos, cerca de la región de bisagra, mediante los enlaces de disulfuro, y se observaron originalmente después de la digestión de pepsina de un anticuerpo. El Fab'-SH es la designación en la presente para los fragmentos de Fab' en los cuales los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Otros acoplamientos qu ímicos de los fragmentos de anticuerpos también se conocen .
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, llamado kappa y lambda, basadas en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácido del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases importantes: IgA, I g D , I E , IgG , e IgM , y varias de éstas pueden dividirse además en subclases (isotipos) , por ejemplo, I g G 1 , lgG2 , lgG3, lgG4, I g A 1 , e lgA2.
Los fragmentos de anticuerpos de "cadena sencilla Fv" o de "sFv" o de "scFv" comprenden los dominios de VH y de VL del anticuerpo, donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. En algunas modalidades, el polipéptido de Fv además comprende un enlazador de polipeptido entre los dominios de VH y de VL, que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión del sFv, ver Pluckthun, en la The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 5 1 13 (Rosenburg y Moore eds.) Springer-Verlag , New York, pp. 269-315 (1994).
El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) ío conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH-VL). Al usar un enlazador que es demasiado corto permitir la combinación entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan para combinarse con los dominios complementarios de otra cadena, de 15 tal modo creando dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describe adicionalmente, por ejemplo, en los documentos EP 404,097; WO 93/1 1 161 y Hollinger et al. ( 1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
U n anticuerpo "aislado" es uno que se ha identificado y se 0 ha separado y/o se ha recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes de su ambiente natural pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas modalidades, un anticuerpo aislado se purifica (1 ) a mayor del 95% en peso del anticuerpo como se 5 determina por el método de Lowry, por ejemplo, más del 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de N terminal o de secuencia de aminoácido interna, por ejemplo, mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) a homogeneidad mediante electroforesis en gel (por ejemplo, SDS-PAGE) bajo reducción o condiciones no reductoras, con detección mediante mancha azul o plata de Coomassie. El termino "anticuerpo aislado" incluye un anticuerpo in situ dentro de las células recombinantes, puesto que por lo menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. En ciertas modalidades, el anticuerpo aislado es preparado por lo menos en una etapa de purificación .
Como se usa en la presente, "inmunorreactivo" se refiere a anticuerpos o a fragmentos de los mismos que son específicos a una secuencia de residuos de aminoácidos ("sitio de unión" o "epítopo") , sin embargo, si son de reacción cruzada a otros péptidos/proteínas, no son tóxicos a los niveles en los cuales se formulan para la administración al uso humano. El "epítopo" se refiere a esa porción de un antígeno capaz de formar una interacción de unión con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. Un epítopo puede ser una secuencia de péptido lineal (es decir, "continuo") o puede componerse de secuencias de aminoácidos no continuos (es decir, "conformacional" o "discontinuo"). El término "unidos preferencialmente" significa que el agente de unión une al sitio de unión con mayor afinidad que une secuencias de aminoácidos no relacionadas.
Los anticuerpos anti-MMP9 pueden describirse en terminos de las CDR de las cadenas pesadas y ligeras. Como se usa en la presente, el término "CDR" o "región determinante de complementariedad" se propone para entender los sitios de combinación del antígeno no continuo encontrados dentro de la región variable de polipéptidos de cadena pesada y ligera . Estas regiones particulares han sido descritas por Kabat et al. , J . Biol. Chem . 252:6609-6616 (1977); Kabat et al. , U .S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991 ) ; por Chothia et al. , J . Mol. Biol. 196:901 -917 ( 1987); y MacCallum et al. , J . Mol. Biol. 262:732-745 ( 1996), donde las definiciones incluyen el traslapo o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. Sin embargo, la aplicación de cualquier definición para referir a una CDR de un anticuerpo o anticuerpos injertados o variantes de los mismos se propone para estar dentro del alcance del término como se define y se usa en la presente. Los residuos de aminoácidos que comprenden las CDR como se define para cada una de las referencias antes citadas se indica a continuación en la Tabla 1 A como una comparación .
Tabla 1 A: definiciones de CDR Kabat1 Chothia2 MacCallum3 CDR1 de VH 31 -35 26-32 30-35 CDR2 de VH 50-65 53-55 47-58 Kabat1 Chothia2 MacCallum3 CDR3 de VH 95-102 96-101 93-101 CDR1 de VL 24-34 26-32 30-36 CDR2 de VL 50-56 50-52 46-55 CDR3 de VL 89-97 91 -96 89-96 1 La enumeración del residuo sigue la nomenclatura de Kabat et al. , supra 2La enumeración del residuo sigue la nomenclatura de Chothia et al. , supra 3La enumeración del residuo sigue la nomenclatura de MacCallum et al. , supra Como se usa en la presente, el termino "marco" cuando se usa en referencia a una región variable de anticuerpo se propone para entender todos los residuos de aminoácidos fuera de las regiones de CDR dentro de la región variable de un anticuerpo. U n marco de región variable es generalmente una secuencia de aminoácido discontinua entre aproximadamente 100-120 aminoácidos en longitud pero se propone para referirse solamente a los aminoácidos fuera de las CDR. Como se usa en la presente, el término "región de marco" se propone para entender cada dominio del marco que es separado por las CDR.
En algunas modalidades, un anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región determinante de complementariedad (CDRs, por sus siglas en ingles) del receptor son sustituidos por los residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón , rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. Así , las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murina) son inmunoglobulinas quiméricas que contienen la secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. Las secuencias no humanas se localizan principalmente en las regiones variables, particularmente en las regiones determinantes de complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés). En algunas modalidades, los residuos del marco de Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados pueden también comprender residuos que ni se encuentran en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o las secuencias de marco. En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente todos de por lo menos uno, y comúnmente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las C DR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones de marco son las de una secuencia de consenso de inmunoglobulina humana. Para los propósitos de la presente descripción, los anticuerpos humanizados pueden también incluir fragmentos de inmunoglobulina, como Fv, Fab, Fab', F(ab’)2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de anticuerpos.
El anticuerpo humanizado puede también comprender por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), comúnmente de que de una inmunoglobulina humana. Ver, 5 por ejemplo, Jones et al. (1986) Nature 321 :522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.
Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen en la téenica. Generalmente, un anticuerpo humanizado ío tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en él de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se refieren a menudo como residuos de "importación" o "donantes", que se obtienen comúnmente de un dominio variable de "importación" o "donante". Por ejemplo, la humanización 15 puede realizarse esencialmente de acuerdo con el método de Winter y colaboradores, sustituyendo las CDR de roedor o las secuencias de CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Ver, por ejemplo, Jones et al. , supra; Riechmann et al. , supra y Verhocyen et al. (1988) Science 20 239: 1534-1536. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" incluyen anticuerpos quiméricos (Número de Patente de Estados Unidos 4,816,567), donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En 25 ciertas modalidades, los anticuerpos humanizados son anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y opcionalmente algunos residuos de región de marco son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor (por ejemplo, anticuerpos monoclonales murinos).
Los anticuerpos humanos pueden tambien producirse, por ejemplo, al usar biblioteca de expresión en bacteriófagos. Hoogenboom et al. (1991 ) J. Mol. Biol, 227:381 ; Marks et al. (1991 ) J. Mol. Biol. 222:581 . Otros métodos para preparar anticuerpos monoclonales humanos son descritos por Colé et al. ( 1985) "Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy," Alan R. Liss, p. 77 y Boerner et al. (1991 ) J. Immunol. 147:86-95.
Los anticuerpos humanos pueden hacerse introduciendo lugares de inmunoglobulina humana en animales transgénicos (por ejemplo, ratones) en los cuales los genes de inmunoglobulina endógena han estado parcialmente o totalmente inactivados.
Tras el desafío inmunológico, se observó la producción del anticuerpo humano, que se asemeja cercanamente a la vista en humanos en todos los aspectos, incluyendo la reorganización de gen , unión , y repertorio de anticuerpo. Este proceso se describe, por ejemplo, en los N úmeros de Patentes de Estados Unidos 5, 545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625, 126; 5,633,425; 5,661 ,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al. ( 1992) Bio/Technology 10:779-783 (1992); Lonberg et al. (1994) Nature 368: 856-859; Morrison (1994) Nature 368:812-813; Fishwald et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851 ; Neuberger (1996) Nature Biotechnology 14:826; y Lonberg et al. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93.
Los anticuerpos pueden ser de afinidad madurada al usar metodos de selección y/o de mutagénesis conocidos como se 5 describe antes. En algunas modalidades, los anticuerpos de afinidad madurada tienen una afinidad que es cinco veces o más, diez veces o más, veinte veces o más, o treinta veces o más que la del anticuerpo inicial (generalmente murino, conejo, pollo, humanizado o humano) del cual se prepara el anticuerpo ío madurado.
Un anticuerpo puede también ser un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales, y pueden ser anticuerpos humanos o humanizados que tienen especificidades de u nión por lo menos dos diferentes antígenos. En el presente i5 caso, las dos diferentes especificidades de unión pueden dirigirse a dos diferentes MM P, o a dos diferentes epítopos en una sola M MP (por ejemplo, M MP9).
Un anticuerpo como se describe en la presente puede también ser un inmunoconjugado. Tales inmunoconjugados 20 comprenden un anticuerpo (por ejemplo, una M MP9) conjugados a una segunda molécula, como un reportero. Un inmunoconjugado puede también comprender un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico como un agente quimioterapéutico, una toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, 25 fungicida , de planta, o animal , o fragmentos del mismo) , o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado) .
Un anticuerpo que "une específicamente a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo se refiere a la unión selectiva del anticuerpo al antígeno o al epítopo objetivo; estos términos, y los métodos para determinar la unión específica, se entienden bien en la téenica. Un anticuerpo exhibe la "unión específica" para un antígeno o un epítopo objetivo particular si se une con mayor afinidad , avidez, más fácilmente, y/o con mayor duración al antígeno o epítopo objetivo lo que lo hace con otras sustancias. En algunas modalidades, el anticuerpo que une específicamente al polipéptido o al epítopo que es uno que une a este polipéptido o epítopo particular sin unir sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epítopo del polipéptido. En algunas modalidades, los anticuerpos proporcionados unen específicamente a MM P9 humana con una constante de la disociación (Kd) igual a o menor de 100 nM , opcionalmente menor de 10 nM , opcionalmente menor de 1 n M , opcionalmente menor de 0.5 nM , opcionalmente menor de 0.1 n M , opcionalmente menor de 0.01 n M , u opcionalmente menor de 0.005 nM , en ciertos ejemplos, entre 0.1 y 0.2 nM , o entre 0.1 y 10 pM , por ejemplo, entre 0.4 y 9 pM , por ejemplo entre 0.4 y 8.8 pM , en la forma de anticuerpo monoclonal , scFv, Fab, u otra forma de anticuerpo medida a una temperatura de aproximadamente 4°C , 25°C , 37°C o 42°C .
En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente descripción une a uno o más sitios de procesamiento (por ejemplo, sitios de división proteolítíca) en M MP9, de ese modo bloqueando efectivamente el procesamiento de la proenzima o la preproenzima a la enzima catalíticamente activa, y así reduciendo la actividad proteolítíca de la MMP9.
En ciertas modalidades, un anticuerpo de acuerdo con la presente descripción une a M MP9 con una afinidad por lo menos 2 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces, por lo menos 25 veces, por lo menos 50 veces, por lo menos 100 veces, por lo menos 500 veces, o por lo menos 1000 veces mayor que su afinidad de unión para otra MM P . La afinidad de unión puede medirse por cualquier metodo conocido en la téenica y puede expresarse como, por ejemplo, asociada , disociada, constante de disociación (Kd) , constante de equilibrio (Keq) o cualquier término en la técnica .
En ciertas modalidades, un anticuerpo de acuerdo con la presente descripción es uno que inhibe la actividad enzimática (es decir, catalítica) de M MP9, como un inhibidor no competitivo de la actividad catalítica de MM P9. En ciertas modalidades, un anticuerpo de acuerdo con la presente descripción se une dentro del dominio catalítico de MMP9. En modalidades adicionales, un anticuerpo de acuerdo con la presente descripción se une fuera del dominio catalítico de MMP9.
También se proporcionan anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que compiten con cualquiera o más de los anticuerpos anti-MMP9 o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos descritos en la presente para unir a M MP9. Así, la presente descripción contempla anticuerpos anti-M MP9, y fragmentos funcionales de los mismos, que compiten para unirse 5 con , por ejemplo, un anticuerpo que tiene un polipeptido de cadena pesada de cualquiera de las SEC ID NOs: 1 o 5-8, un polipéptido de cadena ligera de las SEC ID NOs: 2 o 9-12, o combinaciones de los mismos. En una modalidad, el anticuerpo anti-MMP9, o el fragmento funcional del mismo, compite para unir ío a M MP9 humana con el anticuerpo descrito en la presente como AB0041 .
También se proporcionan anticuerpos y fragmentos de los mismos que unen al mismo epítopo, por ejemplo, el epítopo de MM P9 como cualquiera o más de los anticuerpos descritos en ia 15 presente. También se proporcionan anticuerpos y fragmentos que unen específicamente a un epítopo de MM P9, donde el epítopo incluye un residuo de aminoácido dentro de una región particular de M MP9 o múltiples regiones de MMP9. Tales regiones pueden incluir, por ejemplo, bucles estructurales y/u otros dominios 20 estructurales de MMP9, como los mostrados para ser importantes para unir a los anticuerpos ejemplares descritos en la presente. Comúnmente, las regiones se definen de acuerdo con las posiciones del residuo de aminoácido en la secuencia de MM P9 de longitud completa, por ejemplo, la SEC ID NO: 27. En cierto 25 ejemplo, el epítopo contiene los residuos de aminoácidos 104-202 de la SEC ID NO: 27. En un ejemplo, el epítopo contiene un residuo de aminoácido (es decir, uno o más residuos de aminoácidos) dentro de una región que es de 104-1 19 residuos, 159-166 residuos, o 191 -202 residuos de la SEC I D NO: 27. En algunos aspectos, el epítopo incluye un residuo de aminoácido (es decir, uno o más residuos de aminoácidos) dentro de una región de M MP9 que es de 104-1 19 residuos de la SEC I D NO: 27, un residuo de aminoácido dentro de una región de M MP9 que es de 1 59-166 residuos de la SEC I D NO : 27, y un residuo de aminoácido dentro de una región de M M P9 que es de 191 -202 residuos de la SEC ID NO: 27. En algunos casos, el epítopo incluye E 1 1 1 , D1 13, R162 , o 1 198 de la SEC I D NO: 27. En algunos casos, incluye R 162 de la SEC I D NO: 27. En algunos casos, incluye E 1 1 1 , D 1 13, R162, y 1 198 de la SEC I D NO : 27.
Secuencia de MMP9 La secuencia de aminoácido de la proteína M M P9 humana es como sigue: MSLWQPLVLV LLVLGCCFAA PRQRQSTLVL FPGDLRTNLT DRQLAEEYLY 50 RYGYTRVAEM RGESKSLGPA LLLLQKQLSL PETGELDSAT LKAMRTPRCG 100 VPDLGRFQTF EGDLKWHHHN ITYWIQNYSE DLPRAVIDDA FARAFALWSA 150 VTPLTFTRVY SRDADIVIQF GVAEHGDGYP FDGKDGLLAH AFPPGPGIQG 200 DAHFDDDELW SLGKGVVVPT RFGNADGAAC HFPFIFEGRS YSACTTDGRS 250 DÜLPWCSTTA NYDTDDRFGF CPSERLYTRD GNADGKPCQF PFIFQGQSYS 300 ACTTDGRSDG YRWCATTANY DRDKLFGFCP TRADSTVMGG NSAGELCVFP 350 FTFLGKEYST CTSEGRGDGR LWCATTSNFD SDKKWGFCPD QGYSLFLVAA 400 HEFGHALGLD HSSVPEALMY PMYRFTEGPP LHKDDVNGIR HLYGPRPEPE 450 PRPPTTTTPQ PTAPPTVCPT GPPTVHPSER PTAGPTGPPS AGPTGPPTAG 500 PSTATTVPLS PVDDACNVNI FDAIAEIGNQ LYLFKDGKYW RFSEGRGSRP 550 QGPFLIADKW PALPRKLDSV FEEPLSKKLF FFSGRQVWVY TGASVLGPRR 600 LDKLGLGADV AQVTGALRSG RGKMLLFSGR RLWRFDVKAQ MVDPRSASEV 650 DRMFPGVPLD THDVFQYREK AYFCQDRFYW RVSSRSELNQ VDQVGYVTYD 700 I LQCPED (SEC I D NO:27) Los dominios de proteína se muestran esquemáticamente en la Figura 3 y se indican a continuación: # de aminoácido Característica 1 -19 peptido de señal 38-98 dominio de unión a peptidoglicano R98/C99 Bolsillo activo de interruptor de cisteína 1 12-445 Dominio de metaloproteinasa dependiente de Zn 223-271 Dominio tipo I I de fibronectina (dominio de unión a gelatina) 281 -329 Dominio tipo I I de fibronectina (dominio de unión a gelatina) 340-388 Dominio tipo I I de fibronectina (dominio de unión a gelatina) 400-41 1 Región de unión a Zn 521 -565 Dominio similar a hemopexina 567-608 Dominio similar a hemopexina 613-659 Dominio similar a hemopexina 661 -704 Dominio similar a hemopexina La secuencia de aminoácido de MMP9 humana de longitud completa madura (que es la secuencia de aminoácido del propolipéptido de la SEC I D NO:27 sin el péptido de señal) es: APRQRQSTLVL FPGDLRTNLT DRQLAEEYLY RYGYTRVAEM RGESKSLGPA LLLLQKQLSL PETGELDSAT LKAMRTPRCG YPDLGRFQTF EGDLKWHHHN ITYWIQNYSE DLPRAVIDDA FARAFALWSA VTPLTFTRVY SRDADIVIQF GVAEHGDGYP FDGKDGLLAH AFPPGPGIQG DAHFDDDELW SLGKGVVVPT RFGNADGAAC HFPFIFEGRS YSACTTDGRS DGLPWCSTTA NYDTDDRFGF CPSERLYTRD GNADGKPCQF PFIFQGQSYS ACTTDGRSDG YRWCATTANY DRDKLFGFCP TRADSTVMGG NSAGELCVFP FTFLGKEYST CTSEGRGDGR LWCATTSNFD SDKKWGFCPD QGYSLFLVAA HEFGHALGLD HSSVPEALMY PMYRFTEGPP LHKDDVNGIR HLYGPRPEPE PRPPTTTTPQ PTAPPTVCPT GPPTVHPSER PTAGPTGPPS AGPTGPPTAG PSTATTVPLS PVDDACNVNI FDAIAEIGNQ LYLFKDGKYW RFSEGRGSRP QGPFLIADKW PALPRKLDSV FEEPLSKKLF FFSGRQVWYY TGASVLGPRR LDKLGLGADV AQVTGALRSG RGKMLLFSGR RLWRFDVKAQ MVDPRSASEV DRMFPGVPLD THDVFQYREK A YFCQDRFYW RVSSRSELNQ VDQVGYVTYD ILQCPED (SEC ID NO:28) La secuencia de aminoácido del peptido de señal es MSLWQP LVLVLLVLGCCFA (SEC ID NO:29).
También se proporcionan los polipéptidos de MM P9, incluyendo polipéptidos de M M P9 mutante. Tales péptidos son útiles, por ejemplo, en la generación y la selección de anticuerpos y de fragmentos como se proporcionan en la presente. Los polipéptidos ejemplares incluyen los que tienen una secuencia de aminoácido que contiene 1 1 1 -1 98 residuos de la SEC I D NO : 27, y los que tienen una secuencia de aminoácido que contiene 1 1 1 -198 residuos de la SEC I D NO:27 con una sustitución de aminoácido en 1 1 1 , 1 13, 162 , o 198 residuos de la SEC I D NO: 27 o con una sustitución de aminoácido en todos tales residuos. Tales polipéptidos pueden usarse, por ejemplo, en la selección de anticuerpos que unen a los epítopos que contienen tales residuos y/o para cuáles son importantes tales residuos de MMP9 para unir, como los descritos en la presente.
La presente descripción contempla las proteínas de unión a MMP9 que unen cualquier porción de MMP9, por ejemplo, MMP9 humana, con las proteínas de unión a M P9 que unen preferencial MMP9 con relación a otras M M P que son de interés particular.
Los anticuerpos anti-MMP9, y los fragmentos funcionales de los mismos, pueden generarse por consiguiente a los métodos bien conocidos en la téenica. Los anticuerpos anti-MMP9 ejemplares se proporcionan a continuación .
Anticuerpos anti-MMP9 monoclonales de ratón U n anticuerpo monoclonal de ratón a M MP9 humana se obtuvo tal como está . Este anticuerpo contiene una cadena pesada de lgG2b de ratón y una cadena ligera de kappa de ratón , y es indicado AB0041 .
La secuencia de aminoácido de cadena pesada AB0041 es como sigue: MAVLVLFLCLVAFPSCVLSOVQLKESGPGLVAPSOSLSITCTVSGFSLLSYGV HWVRQPPGKGLEWLGVIWTGGTTNYNSALMSRLSISKDDSKSQVFLKMNSLQTDDT AIYYCARYYYGMDYWGQGYSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDITGSSVTLGCLVKGYF PESVTVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKK LEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSED DPDVRISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRWSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDL PSPIERTISKIKGLVRA PQ VYILPPPA EQLSRKDVSLTCL WGFNPGDISVEWTSNGHTEENY KDTAPVLDSDGSYFIYSKLD1KTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK (S EC I D NO : 1 ) Se subraya la secuencia de señal, y la secuencia de la región constante de lgG2b se presenta en cursivas.
La secuencia de aminoácido de la cadena ligera AB0041 es como sigue: MESOIOVFVFVFLWLSGVDGDIVMTOSHKFMSTSVGDRVSrrCKASODVRNT VAWYQQKTGQSPKLLIYSSSYRNTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYFCQ QHYTTPYYFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKI DGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNR NEC (SEC I D NO :2) Se subraya la secuencia de señal, y la secuencia de la región constante de kappa se presenta en cursivas.
La siguiente secuencia de aminoácido comprende las regiones de marco y las regiones determinantes de complementariedad (CDRs, por sus siglas en ingles) de la región variable de cadena pesada de lgG2b de AB0041 (con las CDR subrayadas) : OV OLKESGPGL V APS OSLS ITCT VSGFS LLS Y G VHWVROPPGKGLE WLG VIWTGGTT NYNSALMSRLSISKDDSKSOVFLKMNSLOTDDTAIYYCARYYYGMDYWGOGTSVT VSS (SEC I D NO:3) La siguiente secuencia de aminoácido comprende las regiones de marco y las regiones determinantes de complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) de la región variable de cadena ligera de kappa de AB0041 (con las C DR subrayadas): DIVMTOSHKFMSTSVGDRVSITCKASODVRNTVAWYOQKTGOSPKLLIYSSSYRNT GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVOAEDLAVYFCOOHYITPYTFGGGTKLEIK (SEC I D NO:4) Otros anticuerpos de MMP9 anti-humanos de ratón ejemplares (por ejemplo, M4 y M 12) se describen en la presente.
Un anticuerpo de MMP9 anti-ratón ejemplar (AB0046) se describe en la presente. En algunas modalidades, se proporcionan los usos de tales anticuerpos anti-ratón como anticuerpos sustitutos para probar y determinar los metodos de inhibición de M M P9, por ejemplo, métodos terapéuticos, como se proporciona en la presente.
Variantes de cadena pesada Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de AB0041 se modificaron separadamente, alterando las secuencias de región de marco en las regiones variables de cadena pesada y ligera. El efecto de estas alteraciones de secuencia fue agotar el anticuerpo de los epítopos de célula T humana , de tal modo reduciendo o suprimiendo su inmunogenicidad en humanos (Antitope, Babraham, Reino Unido).
Cuatro variantes de cadena pesada se construyeron , en un antecedente de cadena pesada de lgG4 humana que conten ía un cambio de aminoácido de S241 P que estabiliza el dominio de bisagra (Angal et al. (1993) Motee. Immunol. 30: 105-108), y se indica VH 1 , VH2 , VH3 y VH4. Las secuencias de aminoácidos de sus regiones de marco y las CDR son como sigue: VH1 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIW TGGTTNYNSALMSRLTISKDDSKSTVYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQ GTSVTVSS (SEC ID NO: 5) VH2 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIW TGGTTNYNSALMSRLTISKDDSKNTVYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQ GTLVTVSS (SEC ID NO:6) YH3 QV QLQESGPGLVKPS ETLS LTCT V SGFSLLS YG VHWVRQPPGKGLEWLG VIW TGGTTNYNSALMSRFTISKDDSKNTVYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQ GTLVTVSS (SEC ID NO:7) VH4 QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKGLEWLGVIW TGGTTNYNSALMSRFTISKDDSKNTLYLKMNSLKTEDTAIYYCARYYYGMDYWGQ GTLVTVSS (SEC ID NO:8) La Figura 1 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas humanizadas e indica las diferencias en secuencias de aminoácidos en las regiones de marco entre las cuatro variantes.
Variantes de cadena ligera Cuatro variantes de cadena ligera se construyeron , en un antecedente humano de cadena de kappa, y son indicadas Vk1 , Vk2 , Vk3 y Vk4. Las secuencias de aminoácidos de sus regiones de marco y las C DR son como sigue: Vkl DIVMTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKTGKAPKLLIYSSS YRNTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO:9) Vk2 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPKLLIYSSSY RNTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPYTFGGGTKVEIK (SEC ID NO:10) Vk3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPKLLIYSSSY RNTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYFCQQHYITPYTFGGGTKVEIK 5 (SEC ID NO: 11) Vk4 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPKLLIYSSSY RNTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYITPYTFGGGTKVEIK (SEC ID NO:12) La Figura 2 muestra una alineación de las secuencias de ío aminoácidos de las regiones variables de las cadenas ligeras humanizadas e indica las diferencias en secuencias de aminoácidos en las regiones de marco entre las cuatro variantes.
Las cadenas pesadas y ligeras humanizadas se combinan en todas las combinaciones en parejas posibles para generar un 15 número de anticuerpos anti-MMP9 humanizados funcionales. Por ejemplo, se proporcionan anticuerpos con una región variable de cadena pesada (VH , por sus siglas en ingles) que tienen la secuencia de aminoácido indicada en cualquiera de las SEC ID NOs: 3, 5, 6, 7 , y 8; anticuerpos que tienen una región variable de 20 cadena ligera (VL, por sus siglas en inglés) que tiene la secuencia de aminoácido indicada en cualquiera de las SEC I D NOs : 4, 9, 10, 1 1 , y 12; y anticuerpos con una región variable de cadena pesada (VH , por sus siglas en inglés) que tiene la secuencia de aminoácido indicada en cualquiera de las SEC I D 25 NOs: 3, 5, 6, 7, y 8 y una región variable de cadena ligera (VL, por sus siglas en ingles) que tiene la secuencia de aminoácido indicada en cualquiera de las SEC I D NOs: 4, 9, 10, 1 1 , y 12, así como los anticuerpos que compiten para unir a M MP9 con tales anticuerpos y anticuerpos que tienen por lo menos o aproximadamente 75, 80, 85, 90, 91 , 92 , 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más identidad de secuencia con tales anticuerpos. En un ejemplo, el anticuerpo tiene una región de VH con una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos en o aproximadamente 75 % , 80 % , 85 % , 90 % , 91 % , 92 %, 93 % , 94 % , 95 % , 96 %, 97 % , 98 % , 99 % o más identidad de secuencia con la SEC ID NO : 7 y una región de VL con una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos en o aproximadamente 75 % , 80 % , 85 %, 90 %, 91 % , 92 % , 93 %, 94 % , 95 % , 96 % , 97 % , 98 % , 99 % o más identidad de secuencia con la SEC ID NO: 12, o una región de VH de la SEC I D NO: 7 y una región de VL de la SEC ID NO: 12.
Las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada adicionales que tienen 75% o más, 80% o más, 90% o más, 95% o más, o 99% o más homología a las secuencias de región variable de cadena pesada descritas en la presente también se proporcionan. Además, las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena ligera adicionales que tienen 75% o más, 80% o más, 90% o más, 95% o más, o 99% o más homología a las secuencias de región variable de cadena ligera descritas en la presente también se proporcionan .
Las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena pesada adicionales que tienen 75% o más, 80% o más, 90% o más, 95% o más, o 99% o más identidad de secuencia a las secuencias de región variable de cadena pesada descritas en la presente tambien se proporcionan. Además, las secuencias de aminoácidos de región variable de cadena ligera adicionales que tienen 75% o más, 80% o más, 90% o más, 95% o más, o 99% o más identidad de secuencia a las secuencias de región variable de cadena ligera descritas en la presente también se proporcionan .
Regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) En algunas modalidades, las CDR de la cadena pesada de los anticuerpos antí-M MP9 proporcionados ejemplares como se describe en la presente tiene las siguientes secuencias de aminoácidos: CDR1 : GFSLLSYGVH (SEC ID NO: 13) CDR2: VI WTGGTTNYNSALMS (SEC ID NO: 14) C DR3: YYYGM DY (SEC I D NO: 15) Así , entre los anticuerpos anti-MM P9 proporcionados están los anticuerpos que tienen una región de CDR 1 de cadena pesada con una secuencia de aminoácido como se indica en la SEC ID NO: 13, anticuerpos que tienen una región de CDR2 de cadena pesada con una secuencia de aminoácido indicada en la SEC ID NO: 14, y anticuerpos que tienen una región de CDR3 de cadena pesada con una secuencia de aminoácido como se indica en la SEC I D NO: 15, y anticuerpos que compiten para unirse con o unen al mismo epítopo en M MP9 como tales anticuerpos. En algunos casos, los anticuerpos contienen las CDR de VH que tiene las secuencias indicadas en la SEC I D NO: 1 5. En algunos casos, los anticuerpos tienen las CDR de VH que tienen las secuencias indicadas en las SEC I D NOs: 13 y 14. En algunos casos, los anticuerpos contienen las CDR de VH que tienen las secuencias indicadas en las SEC ID NOs: 13 y 15. En algunos casos, los anticuerpos contienen las CDR de VH que tienen las secuencias indicadas en las SEC ID NOs: 14 y 15. En algunos casos, los anticuerpos contienen las CDR de VH que tienen las secuencias indicadas en las SEC I D NOs: 1 3, 14, y 1 5.
En alg unas modalidades, las CDR de la cadena ligera de anticuerpos anti-MM P9 ejemplares como se describe en la presente tienen las siguientes secuencias de aminoácidos: CDR 1 : KASQ DVRNTVA (SEC I D NO: 16) CDR2; SSSYRNT (SEC I D NO : 17) CDR3: QQHYITPYT (SEC I D NO: 18) Así, entre anti-MMP9 los anticuerpos proporcionados están los anticuerpos que tienen una región de CDR 1 de cadena ligera con una secuencia de aminoácido como se indica en la SEC I D NO: 16, anticuerpos que tienen una región de CDR2 de cadena ligera con una secuencia de aminoácido indicada en la SEC I D NO: 17, y anticuerpos que tienen una región de CDR3 de cadena ligera con una secuencia de aminoácido como se indica en la SEC I D NO: 18, y anticuerpos que compiten para unirse con o unen al mismo epítopo en M M P9 como tales anticuerpos. En algunos casos, los anticuerpos contienen las CDR de VL que tienen las secuencias indicada en la SEC I D NO: 18. En algunos casos, los anticuerpos contienen las CDR de VL que tienen las secuencias indicadas en las SEC I D NOs: 16 y 17. En algunos casos, los anticuerpos contienen las CDR de VL que tienen las secuencias indicadas en las SEC ID NOs: 16 y 18. En algunos casos, los anticuerpos contienen las CDR de VL que tienen las secuencias indicadas en las SEC I D NOs: 1 7 y 18. En algunos casos, los anticuerpos contienen las CDR de VL que tienen las secuencias indicadas en las SEC I D NOs: 16, 17, y 18.
El anticuerpo anti-MM P9 de variante humanizada ejemplar, AB0045 (lgG4 humanizado, modificado (S241 P)) contiene la variante VH3 de cadena pesada AB0041 humanizada (que tiene la secuencia indicada en la SEC ID NO: 7 (QVQLQ ESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWVRQPPGKG L EWLGVIWTGGTTNYNSALMSRFTISKDDSKNTVYLKM NSLKTEDTAI YYCARYYYGMDYWGQGTLV TVSS) y la variante VH4 de cadena ligera AB0041 humanizada (que tiene la secuencia de cadena ligera indicada en Vk4 (que tiene la secuencia indicada en la SEC I D NO : 12 (DIQNTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRNTVAWYQQKPGKAPKL Ll YSSSYRNTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQH YIT PYTFGGGTKVEIK)).
El anticuerpo AB0045 contiene 1312 aminoácidos en longitud , se compone de dos cadenas pesadas y de dos cadenas ligeras, y tiene un ml teórico de aproximadamente 7.90, coeficiente de extinción de aproximadamente 1 .50 AU/cm a 280 nm para 1 g/l, un peso molecular de aproximadamente 144 kDa, y densidad de aproximadamente 1 g/ml en el amortiguador de formulación (50-100 mg/ml de concentración de producto) .
La cadena pesada del anticuerpo AB0045 tiene la secuencia indicada en la SEC I D NO: 49 ÍMGWSLILLFLVAVATRVHSOVOLOESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLLSYGVHWV RQPPGKGLEWLGVTWTGGTTNYNSALMSRFTISKDDSKNTVYLKMNSLKTEDTAIY YCARYYYGMDYWGQGTLVYVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPV SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYT QKSLSLSLGK (la secuencia de señal subrayada; la secuencia de región constante presentada en cursivas)); la cadena ligera del anticuerpo AB0045 tiene la secuencia indicada en la SEC I D NO: (MRVPAOLLGLLLLWLPGARCDIOMTOSPSSLSASVGDRVTrTCKASODVRNTVAWY QQKPGKAPKLLIYSSSYRNTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYIT PYTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPRFAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (la secuencia de señal subrayada; la secuencia de la región constante presentada en cursivas).
Los anticuerpos además incluyen los producidos por el hibridoma designado M4, es decir, un anticuerpo que contiene de la secuencia de cadena pesada (lgG2b): MAVLVLFLCLVAFPSCVLSOVOLKESGPGLV APSOST^STTGTVSGFST J„SYGVHWVR QPPGKGLEWLGVIWTGGSTNYNSALMSRLSISKDDSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYY CARYYYAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESV TVTWNSGSLSSSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPS GPISTfNPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVWDVSEDDPDV RISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRWSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIE RTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLWGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTA PVLDSDGSYFIYSKLDIKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK (S EC I D NO: 30) (el peptido de señal indicado en texto subrayado, la región variable indicada en el texto sin formato, y la región constante indicada en cursivas), y la secuencia de cadena ligera (kappa) : QQKTGQSPKLLIYSASYRNTGVPDRFTGSISGTDFTFTISSVQAEDLALYYCQQHYST PYTFGGGTKLEVKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSER QNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (el péptido de señal indicado en el texto subrayado , la región variable indicada en el texto sin formato, y la región constante indicada en cursivas) (SEC I D NO : 31 ). El anticuerpo M4 tiene una cadena pesada variable con una secuencia de aminoácido: OVOLKESGPGLVAPSOSLSITCTVSGFSLLSYGVHWVROPPGKGLEWLGVrWTGGST NYNSALMSRLSISKDDSKSOVFLKMNSLOTDDTAMYYCARYYYAMDYWGOGTSV TVSS (las CDR 1 , 2, y 3 (SEC I D NOs: 34, 35, y 36,) subrayadas respectivamente) (SEC I D NO: 32) y una cadena ligera variable con la secuencia de aminoácido DIVMTOSHKFMFTSVGDRVSITCKASODVRNTVAWYOOKTGOSPKLLIYSASYRNT GVPDRFTGSISGTDFTFTISSVOAEDLALYYCOOHYSTPYTFGGGTKLEVK (las CDR 1 , 2, y 3 (SEC I D NOs: 37, 38, y 39,) subrayadas respectivamente) (SEC I D NO: 33).
Los anticuerpos además incluyen los producidos por el hibridoma designado M 12, es decir, uno con solamente una 5 cadena de kappa, que tienen la secuencia: OVFVYMLLWLSGVDGDIVMTOSOKFMSTSVGDRVSVTCKASONVGTNVAWYOOK PGQSPKALIYSASYRFSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTF GGGTYLLEIYLRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (el peptido de señal indicado en el texto subrayado, la región ío variable indicada en el texto sin formato, y la región constante indicada en cursivas) (SEC I D NO : 40) . El anticuerpo M 12 tiene una cadena ligera variable con la secuencia de aminoácido DIVNTQSQKFMSTSVGDRVSVTCKASONVGTNVAWYQQKPGQSPK ALIYSASYRFSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYN 15 SYPYTFGGGTKLEI K (las CDR 1 , 2 , y 3 (SEC I D NOs: 42, 43, y 44,) subrayadas respectivamente) (SEC I D NO: 41 ).
Los anticuerpos además incluyen el anticuerpo de ratón designado AB0046, que tienen una cadena ligera de kappa con una secuencia de aminoácido 20 MSSAOFLGLLLLCFOGTRCDIOMTOTTSSLSASLGDRVTISCSASOGISNYLNWYOOK PDGTFKLLIYYTSILHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYGWLPRTF GGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGV LNS WTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEA THKTSTSPIVKSFNRNEC (S EC I D NO: 45) (el péptido de señal indicado en el texto subrayado, la región variable indicada en el texto sin formato, y la 25 región constante indicada en cursivas) y una cadena pesada de IgG 1 con una secuencia de aminoácido MGWSSIILFLVATATGVHSOVOLOOPGSVLVRPGASVKLSCTASGYTFTSYWMNWV KQRPGQGLEWIGEIYPISGRTNYNEKFKVKATLTVDTSSSTAYMDLNSLTSEDSAVY YCARSRAN DDYWGQGTTLTYSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPE PVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIV PRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCWVDISKDDPEVQFSWFVDDV EVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRP KAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDG SYFVYSKLNVQKSNWFAGNTFTCSVLHEGl.HNHHTEKSLSHSPGK ( S E C ID NO : 46) (el peptido de señal indicado en el texto subrayado, la región variable indicada en el texto sin formato, y la región constante indicada en cursivas).
La siguiente secuencia de aminoácido comprende las regiones de marco y las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de la región variable de la cadena pesada de lgG 1 de AB0046 (con las CDR subrayadas) : OVOLOOPGSVLVRPGASVKLSCTASGYTFTSYWMNWVKORPGOGLE WIGEIYPISGRTNYNEKFKVKATLTVDTSSSTAYMDLNSLTSEDSAVYYCARSRANW DDYWGOGTTLTVSS ( S E C I D NO : 47) La siguiente secuencia de aminoácido comprende las regiones de marco y las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de la región variable de la cadena ligera de kappa de AB0046 (con las CDR subrayadas):
[0134] DIQMTOTTSSLSASLGDRVTISCSASOGISNYLNWYOOKPDGTFKLL1Y YTSILHSG VPSRFSGSGSGTD YSLTISNLEPEDIATYYCOOY GWLPRTFGGGTKLEIK (SEC I D NO: 48).
Los anticuerpos para el uso con los metodos, las composiciones, y las combinaciones actualmente proporcionados pueden incluir cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente, incluyendo anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, incluyendo los que contienen cualquier combinación de las varias regiones variables de cadenas pesadas y ligeras y cadena pesada y ligera y las CDR ejemplificadas. Ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-MMP9 La presente descripción proporciona ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-MM P9 y fragmentos funcionales de los mismos. Por consiguiente, la presente descripción proporciona un polinucleótido aislado (ácido nucleico) que codifica un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno como se describe en la presente, los vectores que contienen tales polinucleótidos, y las células hospedadoras y sistemas de expresión para transcribir y traducir tales polinucleótidos en los polipéptidos.
La presente descripción también contempla constructos en la forma de plásmidos , vectores, casetes de transcripción o expresión que comprenden por lo menos un polinucleótido como antes.
La presente descripción también proporciona una célula hospedadora recombinante que comprende uno o más constructos como antes, así como métodos de producción del anticuerpo o de los fragmentos de unión al antígeno de los mismos descritos en la presente cuyo metodo comprende la expresión del ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena pesada y un polipéptido de cadena ligera (en la misma o diferentes células hospedadoras, y de los mismos o diferentes constructos) en una célula hospedadora de recombinación . La expresión puede lograrse cultivando células hospedadoras recombinantes en condiciones apropiadas que contienen el ácido nucleico. Después de la producción mediante expresión, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno puede aislarse y/o purificarse al usar cualquier téenica adecuada , después de usar como sea apropiado.
Los sistemas de clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células hospedadoras son bien conocidos. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células mamíferas, levadura y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares mamíferas disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células del riñón de hámster bebé, células del melanoma de ratón de NSO y muchas otras. Un huésped bacteriano común es E. coli.
Los vectores adecuados pueden elegirse o construirse, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras operablemente ligadas, secuencias finalizadoras, secuencias de poliadenilación , secuencias potenciadoras, genes marcadores y/u otras secuencias como sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, por ejemplo, fago, o fagemido, como se apropiado. Para otros detalles ver, por ejemplo, Molecular Cloning : a Laboratory Manual: 2a edición, Sambrook et al. , 1989, Coid Spring Harbor Laboratory Press. Muchas téenicas y protocolos conocidos para la manipulación del ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de constructos del ácido nucleico, mutagénesis, secuenciado, introducción de ADN en células y expresión de gen , y análisis de proteínas, se describen en detalle en Short Protocols in Molecular Biology, Segunda Edición , Ausubel et al. eds. , John Wilcy & Sons, 1992. Las descripciones de Sambrook et al. y Ausubel et al. Se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.
El ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés está integrado en el genoma de la célula hospedadora o puede mantenerse como un elemento episomal estable o transitorio.
Cualquiera de u na gran variedad de secuencias de control de expresión - secuencias que controlan la expresión de una secuencia de ADN ligada operativamente a ella - pueden usarse en estos vectores para expresar las secuencias de ADN. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés puede operablemente ligarse a un promotor, y proporcionado en un constructo de expresión para el uso en métodos de producción de proteínas recombinantes M MP9 o porciones de las mismas.
Los expertos en la técnica están conscientes que los ácidos nucleicos que codifican las cadenas de anticuerpo descritas en la presente pueden sintetizarse al usar el conocimiento y procedimientos estándar en biolog ía molecular.
Los ejemplos de secuencias de nucleótido que codifican las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera descritos en la presente, son como sigue: VH1 : CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC ACTGTCCCTG ACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGGAAGG GCCTGGAAT G GCTGGGCGTG ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA T GTCCCGGCT GACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGTCCAC CGTGTACCTG AAGATGAACT CCCTGAAAAC CGAGGACACC GCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCTCC GTGACCGT GT CCTCA (SEC ID NO: 19) VH2: CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC ACTGTCCCTG ACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGCAAAG GCCTGGAAT G GCTGGGCGTG ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA T GTCCCGGCT GACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGAACAC CGTGTACCTG AAGATGAACT CCCTGAAAAC CGAGGACACC GCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCCT G GTCACCGTGT CCTCA (SEC ID NO:20) VH3: CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC ACTGTCCCTG ACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGCAAAG GCCTGGAAT G GCTGGGCGTG ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA T GTCCCGGTT CACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGAACAC CGTGTACCTG AAGATGAACT CCCT GAAAAC CGAGGACACC GCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCCTG GTCACCGTGT CCTCA (SEC I D NO :21 ) VH4: CAGGTGCAGC TGCAGGAATC CGGCCCTGGC CTGGTCAAGC CCTCCGAGAC ACTGTCCCTG ACCTGCACCG TGTCCGGCTT CTCCCTGCTG TCCTACGGCG TGCACTGGGT CCGACAGCCT CCAGGCAAAG GCCTGGAAT G GCTGGGCGTG ATCTGGACCG GCGGCACCAC CAACTACAAC TCCGCCCTGA TGTCCCGGTT CACCATCTCC AAGGACGACT CCAAGAACAC CCTGTACCTG AAGATGAACT CCCTGAAAAC CGAGGACACC GCCATCTACT ACTGCGCCCG GTACTACTAC GGCATGGACT ACTGGGGCCA GGGCACCCTG GTCACCGTGT CCTCA (SEC I D N O :22) Vk1 : GAC ATCGTGA T GACCCAGT C CCCCAGCTTC CTGTCCGCCT CCGTGGGCGA CAGAGTGACC ATCACATGCA AGGCCTCTCA GGACGTGCGG AACACCGTGG CCTGGTATCA GCAGAAAACC GGCAAGGCCC CCAAGCTGCT GATCTACTCC TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTTACCG GCTCTGGCTC CGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG CCGTGTACTT CTGCCAGCAG CACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA GGCACCAAGG TGGAAATAAA A (SEC I D NO :23) Vk2: GACATCGTGA TGACCCAGTC CCCCTCCAGC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA CAGAGT GACC ATCACATGCA AGGCCTCTCA GGACGTGCGG AACACCGTGG CCTGGTATCA GCAGAAGCCC GGCAAGGCCC CCAAGCTGCT GATCTACTCC TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTTACCG GCTCTGGCTC CGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG CCGTGTACTT CTGCCAGCAG CACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA GGCACCAAGG TGGAAATAAA A (SEC I D NO:24) Vk3: GACATCCAG A TGACCCAGTC CCCCTCCAGC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA CAGAGTGACC ATCACATGCA AGGCCTCCCA GGACGTGCGG AACACCGTGG CCTGGTATCA GCAGAAGCCC GGCAAGGCCC CCAAGCTGCT GATCTACTCC TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTCTCTG GCT CTGGAAG CGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG CCGTGTACTT CTGCCAGCAG CACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA GGCACCAAGG TGGAAATAAA A (SEC I D NO:25) Vk4: GACATCCAGA TGACCCAGTC CCCCTCCAGC CTGTCCGCCT CTGTGGGCGA CAGAGTGACC ATCACATGCA AGGCCTCTCA GGACGTGCGG AACACCGTGG CCTGGTATCA GCAGAAGCCC GGCAAGGCCC CCAAGCTGCT GATCTACTCC TCCTCCTACC GGAACACCGG CGTGCCCGAC CGGTTCTCTG GCTCTGGAAG CGGCACCGAC TTTACCCTGA CCATCAGCTC CCTGCAGGCC GAGGACGTGG CCGTGTACTA CTGCCAGCAG CACTACATCA CCCCCTACAC CTTCGGCGGA GGCACCAAGG TGGAAATAAA A (SEC I D NO :26) Debido a que la estructura de anticuerpos, incluyendo la yuxtaposición de las CDR y las regiones de marco en la región variable, la estructura de las regiones de marco y la estructura de las regiones constantes de cadena pesada y ligera, es bien conocida en la téenica; está en conformidad con el experto en la técnica para obtener los ácidos nucleicos relacionados que codifican anticuerpos anti-MM P-9. Por consiguiente, los polinucleótidos que comprenden secuencias del ácido nucleico que tienen por lo menos 75% , por lo menos 80%, por lo menos 85% , por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 98% y por lo menos 99% de homolog ía cualq uiera de las secuencias de nucleótido descritas en la presente también se proporcionan . Por consiguiente, los polinucleótidos que comprenden secuencias del ácido nucleico que tienen por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90% , por lo menos 95% , por lo menos 98% y por lo menos 99% de identidad a cualquiera de las secuencias de nucleótido descritas en la presente también se proporcionan . En un ejemplo, el polinucleótido contiene por lo menos o aproximadamente 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92% , 93%, 94% , 95% , 96% , 97% , 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEC I D NO: 21 o incluye o es la SEC I D NO: 21 y/o contiene por lo menos o aproximadamente 75%, 80%, 85% , 90%, 91 % , 92% , 93% , 94%, 95%, 96% , 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con la SEC I D NO: 26 o incluye o es la SEC I D NO: 26.
COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Las proteínas de unión a MMP9, así como el ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que codifica proteínas de unión a M MP9 del, pueden proporcionarse como una composición farmaceutica, por ejemplo, combinada con un portador o un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas son útiles para, por ejemplo, la administración a un sujeto in vivo o ex vivo, y para diagnosticar y/o tratar un sujeto con proteínas de unión a MMP9, como en cualquiera de los métodos terapéuticos o de diagnóstico proporcionados en la presente.
Los portadores o los excipientes farmacéuticamente aceptables son fisiológicamente aceptables por el paciente administrado y conservan las propiedades terapéuticas de los anticuerpos o de los péptidos con los cuales se administra. Los portadores o los excipientes farmacéuticamente aceptables y sus formulaciones son y se describen generalmente en, por ejemplo, Remington' pharmaceutical Sciences (18a edición, ed . A. Gennaro, Mack Publishing Co. , Easton , PA 1990). U n portador farmacéutico ejemplar es solución salina fisiológica. Cada portador o excipiente es "farmacéuticamente aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación y no sustancialmente perjudicial al paciente.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para ser compatibles con una ruta particular de administración, sistémicas o locales. Así, las composiciones farmacéuticas incluyen portadores, diluyentes, o excipientes adecuados para la administración por varias rutas.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir aditivos farmacéuticamente aceptables. Los ejemplos de aditivos incluyen, pero no se limitan a , un azúcar como manitol, sorbitol, glucosa, xilitol , trehalosa, sorbosa , sucrosa, galactosa, dextrano, dextrosa, fructosa, lactosa y mezclas de los mismos. Los aditivos farmacéuticamente aceptables pueden combinarse con portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables como dextrosa. Los aditivos también incluyen tensioactivos como polisorbato 20 o polisorbato 80.
Los métodos de formulación y de suministro serán adaptados generalmente de acuerdo con el sitio y la enfermedad que se tratarán . Las formulaciones ejemplares incluyen , pero no se limitan a, las adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, intrarterial, intramuscular, o subcutánea, o la administración oral.
Las composiciones farmacéuticas para el suministro parenteral incluyen , por ejemplo, agua, solución salina amortiguada con fosfato, solución de Hank, solución de Ringer, soluciones de dextrosa/solución salina, y glucosa. Las formulaciones pueden contener sustancias auxiliares para condiciones fisiológicas aproximadas, como agentes amortiguadores, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes, detergentes y similares. Los aditivos pueden tambien incluir ingredientes activos adicionales como agentes bactericidas, o estabilizadores. Por ejemplo, la solución puede contener acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán u oleato de trietanolamina. Las formulaciones y los métodos parenterales adicionales se describen en Bai (1997) J .
Neuroimmunol. 80:65 75; Warren ( 1997) J . Neuroi. Sci. 152:31 38; y Tonegawa (1997) J . Exp . Med . 186:507 515. La preparación parenteral puede incluirse en ampollas, jeringas disponibles o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas para administración intravenosa, intradérmica o subcutánea pueden incluir un diluyente estéril, como agua, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como alcohol bencílico o parabenos metílicos; antioxidantes como ácido ascórbico, glutatión o bisulfito de sodio; agentes quelantes como ácido etilendiaminotetracético; amortiguadores como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad como cloruro sódico o dextrosa.
Las composiciones farmacéuticas para inyección incluyen soluciones acuosas (cuando sean solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o de dispersión inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacterioestática , Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, New Jerscy) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés). El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol , poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol , y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Los agentes antibacterianos y antihongos incluyen , por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico y timerosal. Los agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol , sorbitol, y cloruro de sodio pueden incluirse en la composición. Las soluciones resultantes pueden empaquetarse para el uso tal como está, o liofilizadas; la preparación liofilizada puede combinarse más adelante con una solución estéril antes de la administración .
Los portadores farmaceuticamente aceptables pueden contener un compuesto que estabilice, aumente o retrase la absorción o la separación. Tales compuestos incluyen , por ejemplo, carbohidratos, como glucosa, sucrosa, o dextranos; proteínas de bajo peso molecular; composiciones que reducen la separación o la hidrólisis de péptidos; o excipientes u otros estabilizadores y/o amortiguadores. Los agentes que retrasan la absorción incluyen , por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina . Los detergentes pueden también usarse para estabilizar o para aumentar o para disminuir la absorción de la composición farmacéutica , incluyendo portadores liposomales. Para proteger contra la digestión el compuesto puede formar un complejo con una composición hacerla resistente a hidrólisis ácida y enzimática, o el compuesto puede formar un complejo en un portador apropiadamente resistente como un liposoma . Los medios para proteger compuestos contra la digestión se conocen en la téenica (ver, por ejemplo, Fix (1996) Pharm Res. 1 3: 1760 1 764; Samanen ( 1996) J . Pharm. Pharmacol. 48: 1 19 135; y Número de Patente de Estados Unidos 5,391 ,377 , que describe composiciones lipídicas para el suministro oral de agentes terapéuticos) .
Las composiciones de la presente invención pueden combinarse con otras fracciones terapéutica o fracciones de imagenología/diagnóstico como se proporciona en la presente. Las fracciones terapéuticas y/o fracciones de representación pueden proporcionarse como composición separada, o como una fracción conjugada presente en una proteína de unión a M MP9.
Las formulaciones para la administración in vivo son generalmente esteriles. En una modalidad, las composiciones farmacéuticas se formulan para estar libres de pirógenos de tal manera que son aceptables para la administración a pacientes humanos.
Varias otras composiciones y téenicas farmacéuticas para su preparación y uso serán conocidas por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción . Para un listado detallado de composiciones farmacológicas adecuadas y técnicas administrativas asociadas uno puede referirse a las enseñanzas detalladas en la presente, que pueden complementarse además por los textos como Remington : The Science and Practice of Pharmacy 20a Ed . (Lippincott, Williams & Wilkins 2003) .
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse basadas en las características físicas del paciente/sujeto que necesita el tratamiento, la ruta de administración , y similares. Tales pueden empaquetarse en un paquete farmacéutico adecuado con etiquetas apropiadas para la distribución a hospitales y clínicas donde la etiqueta está para la indicación de tratamiento un trastorno como se describe en la presente en un sujeto. Los medicamentos pueden empaquetarse como unidades sencillas o múltiples. Las instrucciones para la dosificación y la administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluirse con los paquetes y los kits farmaceuticos descritos más adelante.
Métodos de Uso Las proteínas de unión a M MP9, incluyendo anticuerpos anti-M MP9 y fragmentos de las mismas, de la presente descripción pueden usarse, por ejemplo, en métodos terapéuticos y de diagnóstico, como métodos de detección de MM P9 en una muestra , métodos de tratamiento (por ejemplo, como en métodos de inhibición de angiogénesis), y métodos de diagnosis y de pronóstico. Así, se proporcionan métodos de diagnóstico y terapéuticos y usos de anticuerpos anti-M M P9. Los ejemplos de métodos de uso se describen más adelante.
Métodos de Tratamiento Se proporcionan en la presente métodos de tratamiento, incluyendo métodos para tratar enfermedades y trastornos asociados con expresión y/o actividad de MM P9, así como usos de los anticuerpos y de las composiciones proporcionados en tales métodos. Las enfermedades y los trastornos incluyen, pero no se limitan a cáncer, por ejemplo, tumores (por ejemplo, tumores primarios o metastáticos), como los que se expresan o se colocan en un tejido que expresa MM P9, como cánceres colorrectales y otros, como adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma colorrectal, carcinoma hepatocelular, y otros tipos de tumor, y enfermedades inflamatorias y autommunes y condiciones, como I BD, incluyendo UC , enfermedad de Crohn, colitis colagenosa, artritis reumatoide, y otros trastornos asociados con inflamación y destrucción de tejido mediado con MMP9.
En algunos casos, la enfermedad o la condición es adenocarcinoma pancreático o esofagogástrico avanzado, cáncer de pulmón de celula no pequeña , carcinoma de célula escamosa de pulmón , adenocarcinoma de pulmón , adenocarcinoma gástrico, carcinoma colorrectal, adenocarcinoma pancreático, carcinoma de célula escamosa de cabeza y de cuello, o carcinoma hepatocelular.
Como se demuestra en los Ejemplos, la expresión de las metaloproteinasas de matriz (M M P, por sus siglas en inglés) y M M P9 en particular se asocia con una variedad de patologías de enfermedad , incluyendo enfermedades inflamatorias y oncolog ía. M MP9 puede promover la enfermedad a través de su remodelado destructivo de membrana basal y otras proteínas estructurales, y/o aumentando la permeabilidad y la biodisponibilidad vasculares de los factores de crecimiento y las citocinas como TGF , VEGF, TNFa , I L-6, e I L- 1 b . M MP9 regula la biodisponibilidad de VEG F y de FGF-2 secuestrados por ECM , así como EGF unido a membrana . Como se describe en los Ejemplos, la inhibición específica de MMP9, al usar anticuerpos como se describe en la presente, fue eficaz en modelos de los modelos de ratón aceptados del cáncer y enfermedades inflamatorias, como artritis reumatoide, cáncer colorrectal primario y metastático, y colitis ulcerosa (UC, por sus siglas en ingles) .
Como se usa en la presente, "tratar" o "tratamiento" se entiende como la estasis o un aplazamiento de desarrollo de uno o más síntomas asociados con una enfermedad o trastorno descrito en la presente, o mejoramiento de síntomas incontrolados o indeseados existentes, prevención de síntomas adicionales, o mejoramiento o prevención de las causas metabólicas subyacentes de síntomas. Así, los términos indican que un resultado beneficioso se ha conferido a un sujeto mamífero con una enfermedad o un síntoma, o con el potencial para desarrollar tal enfermedad o síntoma. Se consigue una respuesta cuando el paciente experimenta alivio parcial o total, o reducción de signos o síntomas de enfermedad, e incluye específicamente, sin limitación, prolongación de supervivencia. Los tiempos de supervivencia libres de progresión previstos pueden medirse en meses a años, dependiendo de factores pronósticos incluyendo el número de recaídas, etapa de enfermedad , y otros factores.
También se proporcionan composiciones farmacéuticas para el uso en relación con tales métodos, como los que contienen cualquiera de los anticuerpos o los fragmentos de los mismos descritos en la presente. Las composiciones pueden ser adecuados para la administración localmente o sistémicamente por cualquier ruta adecuada.
En general , las proteínas de unión a MMP9 se administran en una cantidad terapeuticamente eficaz, por ejemplo, en una cantidad para efectuar la inhibición del crecimiento tumoral en un sujeto, para inhibir la metástasis, para inhibir la actividad de M P9, o para tratar la enfermedad o la condición particular, como cáncer, enfermedad o condición inflamatoria, o enfermedad o condición autommune.
Como se usa en la presente, a menos que se especifique lo contrario, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de un agente o un compuesto o una composición que cuando se administra (ya sea sola o en combinación con otro agente terapéutico, como puede especificarse) a un sujeto es eficaz para prevenir o mejorar la condición de enfermedad o la progresión de la enfermedad , o resulta en el mejoramiento de los síntomas, por ejemplo, tratamiento, curación , prevención o mejoramiento de la condición médica relevante, o un aumento en el índice de tratamiento, curación, prevención o mejoramiento de tales condiciones. Cuando se aplica a un ingrediente activo individual administrado solo, una dosis terapéuticamente efectiva se refiere al ingrediente solo. Cuando se aplica a una combinación , una dosis terapéuticamente efectiva se refiere a cantidades combinadas de los ingredientes activos que dan lugar al efecto terapéutico, si se administra en combinación, en serie o simultáneamente. En un ejemplo, cuando la administración in vivo de un anticuerpo anti-M MP9 se emplea , las cantidades de dosificación normal pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg a hasta 100 mg/kg de peso corporal o más del mamífero por d ía, preferiblemente de manera aproximada 1 mg/kg/día a 50 mg/kg/día, opcionalmente de manera aproximada 100 pg/kg/día a 20 mg/kg/día, 500 pg/kg/día a 10 5 mg/kg/d ía , o 1 mg/kg/día a 10 mg/kg/d ía, dependiendo de la ruta de administración .
En algunos ejemplos, el anticuerpo o fragmentos de los mismos se administra intravenosamente, por ejemplo, en una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a en o de aproximadamente io 30 mg/kg . En algunos ejemplos, el anticuerpo o el fragmento se administra intravenosamente, por ejemplo, en una dosis de aproximadamente 2 mg/kg a aproximadamente 28 mg/kg. En algunos ejemplos, el anticuerpo o el fragmento se administra intravenosamente, por ejemplo, en una dosis de aproximadamente i5 4 mg/kg a aproximadamente 28 mg/kg . En otro ejemplo, el anticuerpo o el fragmento se administra intravenosamente a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a en o aproximadamente 14 mg/kg, como de en o aproximadamente 2 mg/kg a en o aproximadamente 14 mg/kg, q 14d, una vez cada 14 d ías. En 20 algunas modalidades, la cantidad eficaz de dosificación se administra una vez cada 7 a 28 días. En una modalidad , la cantidad eficaz de dosificación se administra una vez cada 7 días. En otra modalidad, la cantidad eficaz de dosificación se administra una vez cada 28 días. 25 En una modalidad , el anticuerpo o fragmentos de las misma se administra subcutáneamente, por ejemplo, a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a en o aproximadamente 30 mg/kg . En otras modalidades, las dosificaciones subcutáneas oscilan de en o aproximadamente 1 mg/kg a en o aproximadamente 28 mg/kg, como de en o aproximadamente 2 mg/kg a en o aproximadamente 28 mg/kg , una vez cada 14 días. En el otro ejemplo, el anticuerpo o el fragmento se administra subcutáneamente a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a en o aproximadamente 14 mg/kg, como de en o aproximadamente 2 mg/kg a en o aproximadamente 14 mg/kg , una vez cada 14 días. En algunas modalidades, la cantidad eficaz de dosificación se administra una vez cada 7 a 28 días. En una modalidad , la cantidad eficaz de dosificación se administra una vez cada 7 días. En otra modalidad , la cantidad eficaz de dosificación se administra una vez cada 28 días.
En algunos ejemplos, el anticuerpo se administra, por ejemplo, intravenosamente, a una dosis de 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 570, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, o 1000 mg/kg de peso corporal. En otros ejemplos, el anticuerpo se administra, por ejemplo, intravenosamente, a una dosificación de 1 100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, o 1800 mg/kg. En algunos ejemplos, el anticuerpo se administra, por ejemplo, intravenosamente, a una dosis de 100, 200, 400, 600, 1200, o 1800 mg/kg de peso corporal, y en algunos ejemplos a una dosificación de 133, 267, 400, 600 o 1200 mg/kg. En algunos ejemplos, el anticuerpo se administra el intervalo de una, dos o tres semanas, o una vez una, dos, o tres semanas. En algunos ejemplos, la dosificación apropiada se hace con 0.9% de cloruro sódico.
El regimen de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad de la proteína de unión a M MP9, la ruta de la administración , el tiempo de administración, el índice de excreción del compuesto particular que es empleado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con la composición particular empleada, la edad , sexo, peso, condición , salud general e historial méd ico anterior del paciente que es tratado, y factores similares bien conocidos en las téenicas médicas.
En algunas modalidades, la dosificación es determinada basada en un modelo farmacocinético para anticuerpos que exhiben la disposición mediada por objetivo. En contraste con la farmacocinética relativamente lineal observada para los anticuerpos dirigidos a los objetivos del receptor soluble, anticuerpos dirigidos hacia los receptores objetivo basados en tejido frecuentemente demuestran farmacocinética no lineal. Mager, D. E. (2006), Adv Drug Deliv Rev 58(12-13): 1326-1356. La base para la disposición no lineal se relaciona con el alta unión de afinidad del anticuerpo al objetivo y el grado de unión (con relación a dosis), de tal manera que la interacción se refleja en las características farmacocineticas del anticuerpo. Mager, D. E. and W. J. Jusko (2001 ), J Pharmacokinet Pharmacodyn 28(6): 5 507-532. I ncluida dentro de la disposición de fármaco mediada por objetivo está la endocitosis mediada por receptor (internalización) del complejo anticuerpo-receptor. Wang , W. , E. Q . Wang , et al. (2008), Clin Pharmacol Ther 84(5) : 548-558.
En un modelo farmacocinético para un anticuerpo que tiene ío la la disposición media por objetivo, en ausencia de fármaco (anticuerpo), el receptor objetivo se sintetiza a un índice constante y eliminado por un proceso de primer orden. Como un resultado, el receptor objetivo existe a una concentración de estado estacionario en ausencia de fármaco (anticuerpo). 15 Cuando el fármaco se agrega al cuerpo que puede interactuar con el receptor objetivo en una reacción bimolecular, distribuida en menos tejido bien perfundido, o eliminarse a través de procesos de primer orden . A bajas concentraciones de fármaco el movimiento predominante del fármaco está sobre el receptor 20 debido a alta unión de afinidad . Mientras que la cantidad de fármaco que incorpora el cuerpo llega a ser suficiente para unir la masa disponible de receptor el fármaco distribuye en y fuera de tejido y se elimina. Mientras que las concentraciones de fármaco caen y el fármaco se equilibra a partir del tejido que proporciona 25 un depósito adicional para unir el nuevamente el receptor sintetizado.
Un doctor que tiene experiencia en la teenica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz (ED50) de la composición farmacéutica requerida . Por ejemplo, el médico o el veterinario puede iniciar las dosis de los compuestos de la invención empleada en la composición farmacéutica a niveles inferiores que los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se alcance el efecto deseado.
En algunos casos, los métodos de tratamiento incluyen administración parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, intrarterial, intradérmica, intramuscular, o subcutánea, o administración oral del agente, por ejemplo, anticuerpo anti-MM P9 o composición que contiene la misma .
Como se usa en la presente, el término "objetivo" se entiende un sujeto mamífero. Los sujetos ejemplares incluyen , pero no se limitan a humanos, monos, perros, gatos, ratones, ratas, vacas, caballos, cabras y ovejas. En algunas modalidades, el sujeto tiene cáncer, una enfermedad inflamatoria o una condición , o una enfermedad autommune o una condición , y puede tratarse con el agente de la presente invención como describe más adelante. En ciertas modalidades, el sujeto es un humano que tiene cáncer, una enfermedad inflamatoria o una condición , o una enfermedad autoinmune o una condición , y puede tratarse con el agente de la presente invención como se describe más adelante.
Si es necesario, para tratamientos, los metodos pueden incluir además terapias adicionales, como en el caso de cáncer, retiro quirúrgico del cáncer y/o administración de un agente anticáncer o tratamiento además de una proteína de unión a M MP9. La administración de tal agente o tratamiento anticáncer puede ser concurrente o secuencial con la administración de las composiciones descritas en la presente.
En algunas modalidades, el anticuerpo se administra solo, como una monoterapia. En otras modalidades, el anticuerpo se administra como parte de una terapia de combinación con uno o más otros agentes terapéuticos. Los agentes terapéuticos incluyen pero no se limitan a los agentes que son adecuados para tratar inflamación , enfermedades autommunes, enfermedades fibróticas, o cánceres. Los agentes terapéuticos pueden ser agentes quimioterapéuticos, inmunoterapéuticos, anticáncer, antiinflamatorios, o antifibróticos. En la terapia de combinación, el anticuerpo de la presente solicitud puede usarse como el agente primario o de línea frontal o el agente secundario o adicional en tratar pacientes en necesidad del mismo. En algunos aspectos, para tratar una enfermedad inflamatoria, fibrótica o autoinmune, como I BD, UC, enfermedad de Crohn , cáncer, o artritis reumatoide, el anticuerpo se administra solo o con otros agentes terapéuticos que inhiban o modulen las actividades de cinasas, como cinasa reguladoras de señal de apoptosis, tirosina cinasa de bazo, fosfat id i I i nos it i d a 3-cinasas, o Janus cinasa, u lisil-oxidasa, proteína similar a lisil-oxidasa como LOXL2 y/o receptor del dominio de discoidina (DDR, por sus siglas en inglés) como DDR1 . A modo de ejemplo, el agente terapéutico que inhibe o que modula las actividades de LOXL2 y de DDR1 , son anticuerpos que unen específicamente a LOXL2 y/o a DDR 1 . En un aspecto, los anticuerpos anti-LOXL2 descritos en los documentos US2009/01 04201 , US2009/0053224 y US201 1 - 0200606 y los anticuerpos anti-DDR1 descritos en el Número de solicitud provisional de Estados Unidos 61 /705,044 se usan en la terapia de combinación ; todos estos documentos se incorporan en la presente por referencia . En otros aspectos, para tratar pacientes que tienen cáncer, el anticuerpo se administra solo o en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos o antineoplásticos, como gemcitabina, nab-paclitaxel, mFOLFOX6 mFOLFOX6 que consiste de ácido folínico, fluorouracilo (5-FU) y oxaliplatina, FOLFI RI que consiste en ácido folínico, fluorouracilo (5-FU) e irinotecan, carboplatino, paclitaxel , pemetrexed y/o bevacizumab. En un adenocarcinoma pancreático, el anticuerpo se administra solo en un intervalo de dos semanas o con una quimioterapia de ciclo de 28 días de gemcitabina y/o nab-paclitaxel . En un ejemplo, para el adenocarcinoma esofagogástrico, el anticuerpo se administra solo en un intervalo de dos semanas o con una quimioterapia de ciclo de 28 días de mFOLFOX6 que se administra en un ciclo de 28 días. En un ejemplo, para el cáncer de pulmón de celula no pequeña, el anticuerpo se administra solo en un intervalo de tres semanas o con una quimioterapia de ciclo de 21 días de carboplatino y paclitaxel o con pemetrexed y/o bevacizumab. En un ejemplo, para cáncer colorrectal, el anticuerpo se administra solo en un intervalo de dos semanas o con una quimioterapia de ciclo de 14 días de FOLFI RI . En los tratamientos de combinación, la quimioterapia puede administrarse con la dosificación y el procedimiento conocidos.
En algunas modalidades, el anticuerpo, por ejemplo, AB0045, se usa en tratar pacientes que tienen adenocarcinoma pancreático o esofagogástrico avanzado, cáncer de pulmón de célula no pequeña , colitis ulcerosa, cáncer colorrectal, enfermedad de Crohn , o artritis reumatoide. En algunos aspectos de tales modalidades, se administra a los pacientes el anticuerpo intravenosamente a una dosificación de 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1 100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, o 1 800 mg/kg de peso corporal, al intervalo de una , dos o tres semanas. En algunos aspectos, la dosificación apropiada se hace con 0.9% de cloruro sódico. En algu nos aspectos, los pacientes reciben el anticuerpo, por ejemplo, AB0045, como monoterapia o como parte de una terapia de combinación con otros agentes terapéuticos.
En algunas modalidades, para tratar el UC , los cánceres como cánceres colorrectales, cánceres pancreáticos, cánceres gástricos, enfermedad de Crohn, enfermedades o trastornos inflamatorios o fibróticos, o artritis reumatoide, el anticuerpo, por ejemplo, AB0045, se administran solos o con otros agentes inmunoterapeutico, incluyendo anticuerpos contra LOXL2 (lisil 5 oxidasa tipo 2) y/o DDR1 (receptor de dominio discoidina 1 ).
En algunas modalidades, para el adenocarcinoma pancreático, el anticuerpo se administra solo en el intervalo de dos semanas o con la quimioterapia de ciclo de 28 días del gemcitabina y/o nab-paclitaxel. ío En algunas modalidades, para el adenocarcinoma esofagogástrico, el anticuerpo se administra solo en el intervalo de dos semanas o con la q uimioterapia de ciclo de 28 d ías de mFOLFOX6 que se administra en un ciclo de 28 días.
En algunas modalidades, para el cáncer de pulmón de célula 15 no pequeña, el anticuerpo se administra solo en el intervalo de tres semanas o con la quimioterapia de ciclo de 21 días de carboplatino y paclitaxel o con pemetrexed y/o bevacizumab.
En un ejemplo, para el cáncer colorrectal, el anticuerpo se administra solo en un intervalo de dos semanas o con una 20 quimioterapia de ciclo de 14 días de FOLFI RI . En algunos aspectos de los tratamientos de combinación , la quimioterapia o el agente de inmunoterapia se administra con la dosificación y el procedimiento conocidos.
En algunos aspectos, la dosificación del anticuerpo M M P9 25 puede ajustarse y administrarse a 133, 267, 400, 600 o 1200 mg/kg de peso corporal. Después de cada ciclo terapéutico, se monitorean los pacientes para los niveles de anticuerpos M MP9, M MP9, u otros biomarcadores adecuados.
Los agentes en una terapia de combinación pueden administrarse, a través de una ruta adecuada descrita antes, simultáneamente (en la misma composición o por separado) , o secuencialmente, en cualquier orden.
En algunas modalidades, los métodos de tratamiento incluyen las etapas para el tratamiento de monitoreo, incluyendo para eficacia de monitoreo o actividad , como actividad farmacodinámica. En algunos ejemplos, tales métodos incluyen la detección o la medición de la presencia, la ausencia, los niveles, y/o la expresión de marcadores, como citocinas y otros marcadores inflamatorios que sean indicativos de la eficacia del tratamiento, en muestras de prueba biológica obtenidas de sujetos que son tratados al usar los métodos y las composiciones . Las muestras comúnmente son muestras de sangre o muestras de suero pero pueden incluir otras muestras biológicas como se describe en la presente. Entre los marcadores para el uso en tales métodos está el I nhibidor de Tejido de Metaloproteinasas 1 (TIMP-1 , por sus siglas en inglés), Factor de Necrosis Tumoral Alfa (TNF-alfa) , Proteína Inflamatoria de Macrófago-2 (M I P-2, por sus siglas en inglés), l nterleucina-17A ( I L- 1 7a , por sus siglas en inglés), CXCL10, Linfotactina, Proteína inflamatoria de macrófago-1 beta (M I P-1 beta, por sus siglas en inglés), Oncostatina-M (OSM , por sus siglas en ingles), lnterleucina-6 (I L-6, por sus siglas en inglés), Proteína Quimiotáctica de Monocito-3 (MCP-3, por sus siglas en inglés), Factor de Crecimiento Endotelial Vascular A (VEGF-A, por sus siglas en inglés), Proteína Quimiotáctica de Monocito-5 (MCP-5), lnterleucina-1 alfa (I L-1 alfa, por sus siglas en inglés), Factor Estimulante de Colonia de Macrófago-1 (M-CSF-1 , por sus siglas en inglés), M ieloperoxidasa (M PO, por sus siglas en inglés) , Proteína Alfa Regulada por Crecimiento (KC/G RO, por sus siglas en inglés), I nterleucina-7 (I L-7, por sus siglas en inglés) , Factores I nhibidor de Leucemia (LIF, por sus siglas en inglés), Apolipoproteína A-I (Apo A-I) , Proteína C-Reactiva (CRP, por sus siglas en inglés) , Proteína Quimiotáctica de Granulocitos-2 (GCP-2 , por sus siglas en inglés) , lnterleucina-1 1 (IL-1 1 , por sus siglas en inglés) , Proteína Quimiotáctica de Monocitos-1 (MCP-1 , por sus siglas en inglés), factor de von Willebrand (vWF, por sus siglas en inglés) , y productos de gen del Factor de Célula de Vástago (SCF, por sus siglas en inglés) . En algunas modalidades, los marcadores se seleccionan de entre productos de gen KC/GRO, LI F, CXCL10, M PO, M I P-2, y MCP-5, por ejemplo, cuando las enfermedades son I BD, como UC.
En algunas modalidades, después de cada ciclo terapéutico, se monitorean los pacientes para los niveles de anticuerpos M M P9, MMP9, u otros biomarcadores adecuados.
Entre los métodos proporcionados están los que proporcionan perfiles de seguridad mejorados comparados a los tratamientos disponibles y los regímenes terapeuticos y/o eficacia de largo plazo continuo en tratar tales enfermedades y condiciones.
Enfermedades inflamatorias y autommunes y condiciones En algunas modalidades, los métodos y las composiciones, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de los mismos, se usan en el tratamiento de enfermedad inflamatoria y autoinmune, por ejemplo, inhibiendo M MP9 en sujetos que tienen tales enfermedades o condiciones. Entre las enfermedades inflamatorias y autoinmunes están enfermedad intestinal inflamatoria (I BD , por sus siglas en inglés) (enfermedad de Crohn incluyendo, colitis ulcerosa (UC , por sus siglas en inglés), y colitis indeterminada) , colitis colagenosa, artritis reumatoide, septicemia, esclerosis múltiple, distrofia muscular, lupus, alergia, septicemia, y asma.
Como se describe en los Ejemplos, las MMP9 y las otras M MP están implicados en enfermedades inflamatorias y autoinmunes.
La metaloproteínasa de matriz-9 (M M P9) se induce en el suero, el fluido sinovial, y la sinovia de los pacientes de RA, y la relación MMP9/TI M P-1 se altera a favor de actividad proteolítica creciente. MMP9 es secretada mediante osteoclastos mediadores de enfermedad y células activadas del linaje de monocito/macrófago. La resistencia a fenotipos de enfermedad de artritis inducida por anticuerpos se observa en una cepa de ratón nuligenico M MP9. M MP9 degrada el colágeno I I desenrollado creado por la actividad de división de colagenasas, como MMP8, y de tal modo contribuye a la destrucción del cartílago articular.
Dadas las importantes funciones de otras MMP, sin embargo, los inhibidores de M MP9 específicos son necesaria para tratar tales enfermedades. Como se muestra en los Ejemplos en la presente, los anticuerpos de la invención se demostraron como eficaces en varias enfermedades inflamatorias y autommunes, incluyendo I BD, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) , y septicemia , al usar modelos animales aceptados. Así, en algunas modalidades, los métodos, las composiciones, y los usos para tratar sujetos que tienen enfermedades inflamatorias y autoinmunes. En alg unas modalidades, los inhibidores, los métodos, y los usos inhiben M M P9 sin inhibir otras M M P, por ejemplo sin inhibir la MM P2, o sin inhibir tal otras M M P a un grado sustancial. En una modalidad , los métodos protegen contra o reducen lesión de tejido, inflamación sistémica , y/o inflamación local en un sujeto que tiene tal enfermedad o condición ; en algunos ejemplos, ya sea lesión e inflamación de tejido se tratan mediante los métodos. En otra modalidad , los métodos se asocian con toxicidad reducida y/o inducción reducida del síndrome musculoesquelético (MSS, por sus siglas en inglés) o síntomas similares, comparados a los observados con inhibidores de pan-MMP, como Marimastat. En algunos ejemplos, el sujeto ha tenido una respuesta inadecuada a otra terapia para la enfermedad inflamatoria , como un antagonista de TN F, como un anticuerpo anti-TN F, por ejemplo, infliximab, es decir, tiene enfermedad refractiva antagónica de TN F. Así, entre los metodos proporcionados están los eficaces en tratar la inflamación en tales sujetos.
Enfermedad intestinal inflamatoria Las enfermedades intestinales inflamatorias (I BD, por sus siglas en inglés) incluyen enfermedad de Crohn , colitis ulcerosa (UC , por sus siglas en inglés) , y colitis indeterminada). La colitis ulcerosa (UC, por sus siglas en inglés) es uno de dos I BD importantes, caracterizada por inflamación mucosa difusa, y ulceración asociada, del colon . El curso crónico de la UC incluye exacerbaciones de enfermedad intermitente seguida por periodos de remisión . Muchos pacientes experimentan respuesta escasa a agentes como terapéutica dirigida anti-TNFa y continúan sufriendo de síntomas relacionados a enfermedad . Los pacientes con UC tienen un riesgo se significativamente elevado de cáncer de colon después de 8 - 10 años de actividad de enfermedad .
La terapéutica de enfermedad intestinal inflamatoria (I BD , por sus siglas en inglés) puede modular la enfermedad previniendo la selección y el acceso de células inflamatorias al sitio de enfermedad , previniendo la activación de células en el sitio de enfermedad, e inhibiendo los efectos corriente abajo de la activación celular.
El tratamiento farmacológico de UC procede generalmente "por línea" basado en la severidad de enfermedad y la localización o el grado de la enfermedad. La severidad de la enfermedad se caracteriza como media, moderada o severa basada en síntomas de pacientes, hallazgos endoscópicos, y resultados de laboratorio y en el ajuste de ensayo clínico a menudo definido por el Conteo de Mayo, como se muestra en la Tabla I B.
Tabla I B: Conteo de Mayo de UC Como se describe en los Ejemplos, la evidencia soporta una función para M M P9 en la patolog ía de la colitis ulcerosa (UC, por sus siglas en inglés) y otras enfermedades intestinales inflamatorias (IBD, por sus siglas en inglés). Los inhibidores de M M P de amplio espectro son eficaces en modelos de TNBS y de DSS de la colitis (Naito y Yoshikawa 2005; Medina y Radomski 2006). Mientras que MMP9 y MM P2 son las dos M MP más estrechamente vinculadas, con especificidades de sustrato similares, la proteína M M P9 y la actividad se inducen en mayor medida en I BD y los modelos animales de colitis preclínica y se inducen más fuertemente y se asocian con la enfermedad progresiva en UC humana; M MP2 se expresa más ubicuamente y los desempeños son importantes para la homeostasis del tejido no enfermo. La carencia de M M P9 protege contra colitis en el modelo inducido con sulfato de sodio de dextrano de ratón (DSS, por sus siglas en ingles), mientras que MMP2 sirve como una función protectora para el colon . La acumulación de neutrófilos y de linfocitos en el modelo de DSS es dependiente de M M P9; hay evidencia de la contribución de M MP9 derivada de células epiteliales al daño de tejido.
La MMP9 se detectó en tejidos de UC humana, no en las criptas colónicas sanas (en las cuáles el anillo distinto de membranas básales intactas marcadas con tinción de colágeno IV), pero en áreas de colágeno IV desorganizado, que indica la pérdida de integridad de membrana basal. La MM P9 degrada el colágeno IV y otros componentes de ECM , permitiendo la infiltración de células inflamatorias. En colitis , la actividad de M MP9 en la mucosa puede llevar a la degradación de las criptas subyacentes de membranas básales, y daño y exposición de la mucosa de la submucosa a bacterias luminales. La degradación de M M P9 de la membrana basal alrededor de los vasos sanguíneos puede promover la extravasación de leucocitos al sitio de enfermedad . La actividad de MMP9 en la matriz extracelular puede activar y liberar citocinas inflamatorias como TNFa, I L-6, e I L1 -B que contribuyan a la progresión de enfermedades.
Las terapias de UC disponibles no han sido enteramente satisfactorias. Por ejemplo, diferentes tratamientos generalmente se dan basados en severidad, localización y/o grado de la enfermedad . Para enfermedad menos severa, los tratamientos incluyen enemas de 5'-aminosalicilato (5'-ASA, por sus siglas en ingles), enemas de corticoesteroide y preparaciones de 5'-ASA orales. Los pacientes con una enfermedad más severa , y/o los que no pueden responder a las primeras terapias de línea se tratan generalmente con un curso de corticoesteroides orales. Los Inmunomod uladores como azatioprina y 6-mercaptopurina (6-MP, por sus siglas en inglés) se usan para ayudar a los sujetos a deshabituarse de los esteroides y a mantener la remisión . La terapia anti-TN Fa, por ejemplo, el anticuerpo quimérico Remicade® (infliximab) se usa generalmente en pacientes con una enfermedad más severa y para pacientes quienes son refractarios a o dependientes de corticoesteroides. El tratamiento de I nfliximab generalmente falla para inducir y mantener la remisión libre de esteroides a largo plazo. Solamente 20% de pacientes consiguen una remisión durante la semana 8 y permanecen en remisión a través de 54 semanas, con la mayoría de pacientes que recaen durante la semana 30. Solamente 26% de pacientes fueron capaces de lograr una remisión a largo plazo totalmente libre de corticoesteroides. Cuando el punto final menos riguroso de respuesta se evalúa en vez de la remisión (que indica una reducción incompleta en síntomas), aproximadamente 60% de pacientes fracasan en mantener este grado de relevación 5 durante 30 o 54 semanas.
La ciclosporina ha ayudado a retrasar la necesidad de cirug ía en pacientes hospitalizados para la UC fulminante, pero su eficacia como una terapia de mantenimiento no ha sido establecida. La cirugía , consiste de una colectomía total de dos ío etapas con anastomosis anal de bolsa ileica (IAPP, por sus siglas en inglés) es curativa. Una colectomía total es, sin embargo, un resultado indeseable para muchos pacientes, consignándolos a defecaciones frecuentes de por vida, un mayor riesgo de disfunción sexual, y un riesgo del 50% de desarrollar reservoritis 15 - una cavidad en J inflamada la cual da lugar a diarrea con o sin sangrado rectal, tenesmo, urgencia, dolor, incontinencia y fiebres. Además, el riesgo de infertilidad femenina se aumenta altamente después de la cirugía de IPAA.
Como se demuestra en los Ejemplos en la presente, los 20 anticuerpos anti-MM P9 específicos de la invención se demostraron como eficaces en un modelo animal de UC aceptado, eficazmente protegiendo contra la destrucción de tejido y remodelación de tejido aberrante, así como bajaregulación local y sistémica de factores pro-inflamatorios. Los anticuerpos tenían 25 eficacia consistente en puntos finales múltiples en el tratamiento de colitis inducida por DSS en ratones, un modelo preclínico bien establecido usado para la evaluación de agentes que se consideraron para el tratamiento de UC. Así, en algunas modalidades, los metodos y las composiciones se usan para tratar un sujeto con una enfermedad intestinal inflamatoria, como colitis ulcerosa (UC, por sus siglas en inglés), enfermedad de Crohn , o colitis indeterminada. En algunas modalidades, los métodos y los anticuerpos inhiben la MM P9 sin inhibir otras MMP, como MMP2.
En algunos ejemplos, los métodos y las composiciones protegen contra la destrucción de la membrana basal, daño de mucosa , exposición de submucosa a bacterias luminales, inflamación, activación de citocina y extravasación de leucocitos. En algunas modalidades, el sujeto tiene UC moderada a severa, por ejemplo, tiene UC severa. En algunas modalidades, el sujeto tiene UC dependiente de esteroides. En algunos aspectos, los métodos de tratamiento sustituyen o se administran como un tratamiento alternativo a corticoesteroide.
En algunas modalidades, el sujeto ha sido no sensible a otras terapias de UC , como antagonistas de TNF (por ejemplo, TNF-alfa) , como anticuerpos anti-TN F (como infliximab y/o adalimumab) , es decir, pacientes refractarios al antagonista TN F . Por ejemplo, en algunas modalidades, el sujeto es un paciente que ha fracasado en lograr la remisión a largo plazo en terapia de infliximab u otro tratamiento dirigido a TNF-alfa. En otros casos, el sujeto ha sido no sensible a otra terapia de UC como tratamientos de aplicación oral o rectal como enemas, supositorios y espuma) , ácido 5-aminosalicílico (5-ASAs, por sus siglas en ingles) , corticoesteroides de aplicación oral y rectal, inmunosupresores como 6-mercaptopurina, azatioprina, metotrexato, y/o ciclosporina. En algunos aspectos, los métodos proporcionan el tratamiento con un protocolo de seguridad mejorado con respecto a tales tratamientos, o proporcionan el tratamiento con eficacia más sostenida a largo plazo.
En algunos casos, los métodos inhiben M M P9 sin afectar otras MMP o en particular otras MM P como MM P2.
En algunas modalidades, en el contexto de UC, "respuesta" al tratamiento se logar si hay por lo menos 3 puntos y una reducción del 30% en la Conteo de Mayo con por lo menos a 1 punto de reducción en el subconteo de sangrado rectal o un subconteo de sangrado rectal absoluto de 0-1 . En algunas modalidades, "remisión" se define como un conteo de Mayo < 2 , sin subconteo individual > 1 . En algunas modalidades, "curación de la mucosa" se define como un subconteo endoscópico de £ 1 . En algunas modalidades, "preservación de esteroides" se define como remisión en la ausencia de uso de esteroide en curso para aquellos pacientes que comenzaron con esteroides. En algunas modalidades, la calidad de vida es un punto final y se evaluó al usar métodos conocidos, como una calidad de vida medida validada como el IBD-QoL o el SF-36.
La enfermedad de Crohn (CD, por sus siglas en inglés) es un trastorno inflamatorio crónico del tracto gastromtestinal definido por episodios de recaída y remisión , con progresión a complicaciones como formación, abscesos, o restricciones de fístula. Las manifestaciones extraintestinales como uveitis, artritis, lesiones de piel, y piedras de riñón ocurren en más del 40% de pacientes. El paradigma de tratamiento para la enfermedad de Crohn leve-a-moderada han sido los antibióticos como ciprofloxacino y flagilo, 5-ASAs, budesonida , o corticoesteroides sistemicos, sin embargo, los efectos secundarios a largo plazo de esteroides sistémicos amortigua en gran medida su utilidad. Los pacientes con enfermedad leve-a-moderada que fracasan estas primeras terapias de línea se colocan a menudo en la azatioprina en permanecer en remisión en un año. Para los pacientes que fracasan en azatioprina o aquéllos con una enfermedad más severa , el bloqueo de TNF-a con agentes como infliximab sigue siendo la última opción. A diferencia de UC donde es curativa la resección quirúrgica, tal terapia es más difícil para pacientes de Crohn por dos razones: 1 ) la enfermedad es difusa a través del tracto G l y en casos de la enfermedad aislada (por ejemplo, íleo terminal), la resección se asocia frecuentemente con enfermedad recurrente en el sitio de la resección 2) puesto que la enfermedad es transmural, la resección quirúrgica coloca pacientes con riesgo de estenosis futura y/o desarrollo de fístula.
Mientras que la terapia de combinación al usar azatioprina e infliximab puede ser superior a cualquier terapia solamente para inducción de remisión y curación de mucosa a 26 semanas, el uso concurrente de tales agentes aumenta el riesgo de infección y malignidad (linfoma de celula T hepatoesplénica) , que limita su utilidad. Como con UC , la respuesta, remisión , curación de mucosa , ahorro de esteroides y calidad de vida todos serán puntos finales importantes, pero en CD el índice de Actividad de Enfermedad de Crohn (CDAI , por sus siglas en inglés) es generalmente el instrumento de resultado validado de elección y se describe en la Tabla 1 C : Tabla 1 C : índice de Actividad de Enfermedad de Crohn: Conteo < 150 = remisión Enfermedad Moderada > 220 Enfermedad severa > 450 Respuesta a terapia = disminución de mayor de 70 o Iternativamente 100 puntos disminuidos pueden usarse para efinir la respuesta .
En algunas modalidades, el sujeto tiene CD moderada a evera, por ejemplo, tiene CD severa. En algunas modalidades, I sujeto tiene C D dependiente de esteroides. En algunos spectos, los metodos de tratamiento sustituyen o se administran o una alternativa al tratamiento de corticoesteroide.
En algunas modalidades, el sujeto ha sido no sensible a otras terapias de CD, como antagonistas de TNF, como anticuerpos anti-TNF (como infliximab y/o adalimumab), es decir, pacientes antagonista-refractarios de TNF. Por ejemplo, en algunas modalidades, el sujeto es un paciente que no fallado en lograr la remisión a largo plazo en terapia de infliximab u otro tratamiento dirigido a TNF-alfa. En otros casos, el sujeto ha sido no sensible a otra terapia de CD. En algunos aspectos, los metodos proporcionan tratamiento con un protocolo de seguridad mejorado con respecto a tales tratamientos, o proporcionan el tratamiento con eficacia más sostenida a largo plazo.
Cáncer En algunas modalidades, los métodos y las composiciones, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de los mismos, se usan en el tratamiento de cánceres y tumores y enfermedades y condiciones asociadas. Los cánceres ejemplares incluyen cánceres colorrectales, adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma colorrectal, y carcinoma hepatocelular. TN F-a desempeña una función importante en la vigilancia de malignidad y por lo tanto existe u n riesgo de formación de tumor aumentado con agentes anti-TNF-a. La protección contra tumorigénesis colorrectal , como se demostrado en la presente en los Ejemplos en la aplicación , además distingue terapia de anticuerpo monoclonal anti-MMP9 a partir de terapia de anti-TN F-alfa. La MMP9 desempeña una función en invasión celular, metástasis, angiogénesis, y vasculogénesis. Similarmente a las observaciones en enfermedad inflamatoria, el análisis de I HC muestra que MMP9 y MMP2 tienen patrones de tinción distintos en tejidos tumorales humanos, incluyendo cáncer colorrectal, con positividad asociada a tumor más constante observada para M MP-9.
Metodos de Detección de MMP9 La presente descripción también contempla métodos para detectar MM P9 en un sujeto, por ejemplo, para detectar M M P9 que expresa tejido tumoral o asociado a tumor, o tejido o fluido u otra muestra biológica asociada con una enfermedad como se describe en la presente, como enfermedad autommune o inflamatoria. Así, se proporcionan métodos para diagnosticar, monitorear, clasificar o detectar un tumor que tienen actividad de MMP9.
Las muestras (por ejemplo, muestras biológicas de prueba) de un sujeto (por ejemplo, individuo sospechoso de tener o conocido de tener un tumor asociado con la expresión de MMP9, o ser sospechoso de tener o conocido de tener otra enfermedad o condición , como enfermedad inflamatoria o autoinmune como se describe en la presente) , pueden analizarse para la presencia, la ausencia, la expresión, y/o los niveles de M M P9. Por ejemplo, tales muestras pueden ser recolectarse y analizarse detectando la presencia o la ausencia de unión de una proteína de unión a M MP9, como un anticuerpo o un fragmento como se describe en la presente, a la sustancia (por ejemplo, proteína) en la muestra.
En algunos ejemplos, los metodos además incluyen comparar la cantidad de unión detectada a una cantidad de unir a una muestra de control, o de comparar el nivel detectado de MMP9 a un nivel de control de MMP9. En algunos casos, los métodos indican la presencia, la ausencia, o la severidad de una enfermedad o una condición como se describe en la presente.
Este análisis puede realizarse antes de la iniciación del tratamiento al usar una proteína de unión a MMP9 como se describe en la presente, o puede hacerse como parte del monitoreo del progreso del tratamiento contra el cáncer. En algunas modalidades, se proporcionan métodos de tratamiento, llevados a cabo realizando los ensayos de detección y el tratamiento de iniciación , alteración, o descontinuación del sujeto, por ejemplo, basado en los resultados del ensayo de diagnóstico. Tal análisis de diagnóstico puede realizarse al usar cualquier muestra, incluyendo pero sin limitarse a tejido, células aisladas de tales tejidos, y similares. En algunos casos, los métodos se realizan en muestras líquidas, como sangre, plasma, suero, sangre entera, saliva, orina, o semen. Las muestras de tejido incluyen , por ejemplo, secciones de tejido fijado en formalina o congelado.
Cualquier método adecuado para la detección y el análisis de MMP9 pueden emplearse. Varias téenicas de ensayo de diagnóstico conocidas en la técnica pueden adaptarse para tal propósito, como ensayo de unión competitivo, ensayos de directos o indirectos de sándwich y ensayo de inmunoprecipitación conducidos en fases heterogeneas u homogéneas.
Las proteínas de unión a MMP9 para el uso en métodos de detección pueden etiquetarse con una fracción detectable. La fracción detectable directa o indirectamente produce una señal detectable. Por ejemplo, la fracción detectable puede ser cualquiera de las descritas en la presente como, por ejemplo, un radioisótopo, como 3H, 14C , 32P, 35S, o 1251 , un compuesto fluorescente o quimiolumimscente, como isotiocianato de fluoresceína (F ITC , por sus siglas en inglés), rojo de Tejas, cianina , fotocián , rodamina, o luciferina , o una enzima , como fosfatasa alcalina, b-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.
La detección puede lograrse poniendo en contacto una muestra bajo condiciones adecuadas para la proteína de unión a M M P9 que une a M M P9, y evaluando la presencia (por ejemplo, nivel) o la ausencia de complejos de proteína-M M P9M MP9 de unión a M M P9. Un nivel de M MP9 en la muestra en comparación con un nivel de una muestra de referencia puede indicar la presencia de un tumor o de tejidos asociados a tumores que tienen actividad de M M P9. La muestra de referencia puede ser una muestra tomada del sujeto en un punto de tiempo anterior o una muestra de otro individuo.
En algunos aspectos, el ARNm de MMP9 es detectado, como mediante hibridación, como mediante hibridación in situ cromogenica (CISH, por sus siglas en inglés). En algunos aspectos, se usan tales métodos de detección cuando altos niveles de MMP9 derivada de células inflamatorias obscurecen la señal en un tipo de célula deseada mediante otro método de detección , por ejemplo, mediante IHC, por ejemplo, en epitelio tumoral.
Varios aspectos de la invención se describen y se ilustran además por medio de varios ejemplos que siguen , ninguno de los cuales se proponen para limitar el alcance de la invención . EJEM PLOS Ejemplo 1. Inmunogenicidad Los resultados confirmaron que AB0045 y AB0041 tienen la un ión al equivalente y propiedades inhibidoras y que AB0046 puede servir como u n anticuerpo de ratón sustituto relevante, por ejemplo, en modelos de ratón de enfermedad humana .
Se evaluó la inmunogenicidad clínica potencial del anticuerpo quimérico AB0041 de MMP9 y del anticuerpo AB0045 humanizado de MMP9. Un ensayo de activación de célula T humana ex vivo, se usó el EpiScreen (Antitope, Ltd . , Cambridge, Reino Unido). La activación de la célula T en el ensayo de EpiScreen se ha correlacionado a las respuestas terapéuticas de anticuerpo/proteína en pacientes. Se examinó la respuesta de la célula T de CD4+ en 20 donantes sanos, que representa una variedad de haplotipos de HLA. Los resultados mostraron que el anticuerpo AB0045 no indujo respuesta en cualquiera de los donantes y que AB0041 induce una respuesta en 20% de los donantes, con una magnitud de 2.29 +/- 0.36 (desviación media +/- estándar). Un control positivo de KLH indujo una respuesta en 95% de los donantes, con una magnitud de 6.34 +/- 2.77 (desviación media +/- estándar). Los resultados mostraron que el anticuerpo AB0045 es poco probable sea inmunogenetico.
Ejemplo 2: Expresión de MMP9 en m uestras de clon enfermo y sano Se examinaron las muestras de biopsia de pacientes humanos con colitis ulcerosa (UC , por sus siglas en inglés) e individuos sanos inmunohistoquímica (I HC , por sus siglas en inglés) al usar los anticuerpos de M MP9-específica . Se usaron anticuerpos contra mieloperoxidasa (M PO , un marcador neutrófilo; Wirtz 2007), colágeno IV (COLIV, membranas básales) y CD31 (células endoteliales) para evaluar la severidad de enfermedad e infraestructura de tejido. Se examinaron los patrones de tinción de TI M P 1 y de M MP2 también . PMK2 (un marcador de macrófago) también se evaluó.
En las muestras sanas, la inmunoreactividad de MP9 se detectó solamente en un pequeño subconjunto de histiocitos, neutrófilos y linfocitos de migración dentro de la lámina propia y las regiones submucósicas. En contraste, en todas las siete muestras de UC, se detectó una señal más intensa y asociada a enfermedad . Entre las muestras, 5 se prepararon mediante el método de congelado instantáneamente y 2 se fijaron en formalina e incrustaron en parafina.
Se detectó la señal de M MP9 aumentada en regiones de enfermedad aguda, incluyendo criptas con absceso y necróticas y regiones de criptitis que contienen infiltrados neutrofílicos. Una señal de MMP9 más dispersa fue evidente en el infiltrado inflamatorio extenso (en gran parte histiocitos) dentro de la lámina propia. Se localizó la proteína M MP9 a histiocitos, neutrófilos, y granulocitos, y tambien se detectó en la matriz extracelular (ECM , por sus siglas en inglés) asociada con las membranas básales de criptas enfermas y estructuras vasculares. Además, se observó la inmunoreactividad de MM P9 en abscesos de cripta , regiones de ulceración, y en células epiteliales luminales y de cripta. La proteína TI MP1 , que a menudo se co expresa con MMP9, también se asoció con las criptas enfermas e infiltrados inflamatorios, pero en un grado inferior que M MP9. A excepción de algunos linfocitos, la proteína MM P2 no se detectó en las muestras de UC .
Se observó la expresión de MMP9 intensa en regiones de enfermedad aguda, incluyendo criptas de absceso y necróticas y regiones de criptitis que contienen infiltrados neutrofílicos y en células epiteliales en regiones de enfermedad . La expresión de MMP9 también fue evidente en el infiltrado inflamatorio extenso dentro de la lámina propia y se localizó principalmente a histiocitos y neutrófilos. Un anillo distinto de tinción de colágeno IV marca membranas básales intactas de criptas sanas, mientras que el colágeno IV desorganizado indica la perdida de integridad de la membrana basal en criptas enfermas; tinción de MMP9 co localizada con regiones de interrupción de membrana basal. La proteína TI MP1 también se asoció con las criptas enfermas e infiltrados inflamatorios, pero en un grado inferior de MMP9. En las muestras de enfermedad de Crohn , la señal de MM P9 también se asoció con regiones enfermas. Se detectó M MP9 en granulomas, histiocitos intersticiales, y colocalizados con la membrana basal vascular y colágeno IV de ECM . Adicionalmente, M MP se detectó en linfocitos y células epiteliales luminales. Alguna reactividad de MM P2 se observó pero fue menos prominente.
La señal MMP9 no se detectó en criptas colónicas sanas pero fue fuerte en áreas con el colágeno IV desorganizado que indicó la pérdida de integridad de la membrana basal. Esto indica una función de MMP9 en la patología de la colitis ulcerosa .
Se evaluó la expresión de M MP9 en tejido de colon de un paciente de UC que se trató activamente con Remicade® (infliximab) , un anticuerpo anti-TNF-alfa terapéutico, que demuestra un patrón de tinción similar a otro tejido de colon paciente de UC evaluado. Esta observación es constante con una conclusión que en este estudio, la terapia de anti-TNF-alfa no previno la inducción de MMP9 en UC.
El análisis de IHC confirmó que el anticuerpo anti-M MP9 AB0045 de variante humanizada une a MMP9 en tejido de colon l io de paciente de UC con un patrón de tinción similar al observado con un anticuerpo anti-MMP9 de IHC validado Ejemplo 3: Expresión de MMP9 en tejidos normales Se analizaron los niveles de la proteína M MP9 en tejidos sanos normales de humano, rata, y macaco mediante IHC. Veintidós tejidos congelados instantáneamente humanos de tipos de celulas de nodulo linfático, músculo esquelético, próstata, riñón, hígado, pulmón , estómago, esófago, corazón, colon, intestino delgado, cerebro, ovario, páncreas, placenta, piel, médula espinal, bazo, músculo esquelético, testículo, glándula tiroides, y útero se obtuvieron a partir de 3 individuos. Se condujo I HC con dos diferentes anticuerpos anti-M MP9 que se realizaron bien en I HC : un anticuerpo monoclonal de conejo (Abeam, catálogo #ab76003) y un anticuerpo policlonal de conejo (Sigma, catálogo #HPA001238). Los patrones de tinción similares se detectaron al usar ambos anticuerpos. M MP9 también se detectó en timo, amígdala, y médula humanos. Se condujeron las caracterizaciones adicionales en algu nos tejidos congelados instantáneamente a partir de macaco sanos ( Macaca fascicularis, 1 animal individual) y de ratas (cepa de Sprague-Dawlcy, 2 animales individuales).
M MP9 no se detectó en corazón , músculo esquelético, próstata , riñón , nervio periférico, cerebelo, cerebro, glándulas salivales, uréter, y cerviz. En el resto de los órganos probados, MMP9 se detectó en tinción citoplásmica de células inmunes m como macrófagos, histiocitos, linfocitos, mastocitos, y neutrófilos. Los patrones similares de la expresión de proteína MM P9 se detectaron en todos los tejidos humanos, de macaco, y de rata examinados. Se detectaron pocas celulas inflamatorias positivas de M MP9 en nodulo linfático de macaco, timo y amígdala en el tejido analizado. En toda la especie, la tinción de MM P9 fue intracelular en lugar de secretada o localizada en la matriz extracelular.
Ejemplo 4: Anticuerpo anti-MMP9 en un modelo murino de UC El modelo inducido con sulfato de sodio de dextrano (DSS, por sus siglas en inglés) de colitis es un modelo aceptado para la evaluación de la terapéutica de enfermedad intestinal inflamatoria. En este modelo, la administración oral de DSS a ratones o ratas da lugar a daño a la mucosa colónica. Los animales que reciben DSS desarrollan diarrea con sangre y pérdida de peso. La inflamación y la degradación de tejido observada en este modelo se restringen a la mucosa y afecta generalmente el colon entero. La colitis inducida por DSS ofrece la misma progresión de la enfermedad de inflamación-displasia-adenocarcinoma como se ve en UC humana . La localización de la enfermedad y de la patología observada en este modelo se considera que es una reminiscencia de la colitis ulcerosa humana (UC, por sus siglas en inglés), incluyendo infiltrado celular inflamatorio similar, ulceración , y abscesos de cripta. Los fármacos que son aprobados para el tratamiento de UC, como esteroides, metronidazol, 5-aminocalicilatos, ciclosporina, y inmunoterapia anti-TNFa han demostrado eficacia en reducir la severidad de enfermedad en el modelo de DSS.
AB0046 se usó en el modelo de colitis de DSS (en un modelo de tratamiento de 14 días) . El tratamiento comenzó despues de 5 días de exposición oral a 3% de DSS en agua potable, de acuerdo con el siguiente diseño experimental: la inducción de enfermedad con 3% de DSS se realizó comenzando el día 0 al día 5, con tratamiento comenzando el día 6 (los detalles del tratamiento para los animales en grupos 1 -5 se dan en la Tabla 2, más adelante); los animales se sacrificaron en el día 14. Se usó etanercept (comercializado bajo nombre comercial EN BREL®) como un compuesto de referencia para el efecto terapéutico de la terapia anti-TNFa en este modelo. AC-1 , un anticuerpo irrelevante del isotipo comcidente ( I g G 1 ) , se usó como un control .
Tabla 2: Detalles de tratamiento para animales en los grupos 1 -5 N = número de animales; ROA = ruta de administración; I P = inyección intraperitoneal Se evaluó el curso de la enfermedad mediante endoscopia de video (en los días 6, 10, y 14), mediciones de peso del animal, observación de consistencia de heces, y análisis de histopatolog ía despues de estudio de colon .
Se realizó la inmunohistoqu ímica en secciones de tejido congeladas instantáneamente de colones tratados con DSS para evaluar el grado de enfermedad 14 días después de la iniciación del estudio (9 días después del cese de DSS) y para confirmar la expresión de M MP9 en este modelo. Los resultados se muestran en la Figura 5. Como se muestra, las regiones enfermas muestran la destrucción de tejido, el límite epitelial colónico y la arquitectura de cripta, e infiltración de células inflamatorias. La tinción fuerte para MMP9 se observó en la lámina propia de colones enfermos y se asoció con neutrófilos de infiltración (M PO I HC) y macrófagos. La inmunoreactividad de M MP9 también colocalizada con áreas de tinción de colágeno IV de membrana basal alrededor de criptas y estructuras vasculares, sugiriendo la degradación activa de este sustrato de proteína ECM conocido fue contribuir a la progresión de enfermedad . La expresión de M MP2 no fue inducida fuertemente. Como se muestra en la Figura 6, la expresión de M MP9 en células epiteliales colónicas de animales expuestos a DSS también se observó.
La endoscopia de video del colon inferior se realizó en una manera cegadora al usar un pequeño endoscopio animal; la colitis se contó visualmente en una escala de 1 - 4 basada en el grado de ulceración, friabilidad, y vascularidad presentes en el tejido. Cada ratón se le asignó un solo conteo que correspondía al daño más severo observado a traves de la longitud entera del colon examinado. Los resultados se muestran en la Figura 7. Como se muestra, en la terminación de estudio (Día 14), los animales tratados con AB0046 mostraron una mejora Importante en conteos de endoscopia promedio con respecto a grupos de control de vehículo y de isotipo AC-1 . El tratamiento de EN BREL® también dio lugar a la mejora significativa en los conteos de endoscopia, más pronunciada en el Día 10 y de menor magnitud en el día 14.
En la terminación de estudio, se eliminó la mayoría del colon distal, se fijó en formalina, después se incrustó en parafina y se seccionó para histología. Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina y se examinaron por un patólogo veterinario certificado por la junta sin conocimiento en cuanto a los grupos de tratamiento. Los tejidos se contaron para inflamación , edema, y necrosis de mucosa de acuerdo con la escala de conteo de 1 - 4 para cada parámetro. Los conteos de patología de suma se calcularon sumando los tres medios de conteo de parámetro del individuo (inflamación, edema y necrosis). Los resultados se muestran en la Figura 8.
Como se muestra en la Figura 8, la evaluación histológica determinó que la administración de DSS indujo la infiltración de celula inflamatoria sustancial (principalmente compuesta de neutrófilos, con pocos números de macrófagos), edema, y necrosis de tejido de mucosa cuando se compara a los animales de control no tratados. La necrosis de mucosa estuvo variablemente presente y caracterizada por pérdida parcial o completa del epitelio y criptas superficiales, a menudo afectando aproximadamente 25% de la superficie de mucosa circunferencial. El tratamiento terapéutico con AB0046 o ENBREL® redujo significativamente todos los tres aspectos de la patolog ía de enfermedad, comparados al tratamiento de vehículo. La eficacia del anticuerpo anti-M M P9 (AB0046) fue Importante cuando se comparó al veh ículo y fue similar a la lograda por EN BREL®.
El análisis inmunohistológico de tres colones de cada grupo de estudio, elegido para reflejar la histopatología promedio y conteos de endoscopia , revelaron una reducción en la expresión de MM P9 después del tratamiento del anticuerpo anti-MM P9 (AB0046) que se correlacionó con la enfermedad reducida evidente en estos tejidos (ver Figura 9), indicando que la inhibición de MM P9 no había dado lugar a la inducción compensatoria. En general, la presencia de la proteína M MP9 se correlaciona bien con las regiones enfermas. La reducción de M MP9 también se asoció con el tratamiento de ENBREL®, aunque una cantidad Importante de la proteína M M P9 no obstante fue detectada . Los resultados demuestran que la reducción de M MP9 correlacionada con la reducción en la enfermedad total.
El peso corporal y la incidencia de diarrea se registraron diario durante el curso del estudio. La evaluación de los cambios del peso corporal se realizó calculando el área bajo la curva (AUC , por sus siglas en ingles) con el método de regla trapezoidal; un cálculo similar de AUC para la consistencia de heces se realizó asignando la incidencia de diarrea un conteo de 100 y la carencia de la diarrea un conteo de 0. Los resultados se muestran en la Figura 10. Como se muestra, el tratamiento del anticuerpo anti-M M P9 (AB0046) dio lugar a la protección Importante contra pérdida de peso corporal cuando se compara con el control o el vehículo del isotipo AC-1 . El tratamiento de AB0046 también redujo la incidencia de diarrea por aproximadamente 30% , que fue similar al efecto del tratamiento de EN BREL®, aunque el efecto no alcanzó importancia estadístico para cualquier terapia.
En el modelo de DSS, la administración del compuesto de referencia reduce raramente la enfermedad endoscópica e histológica por mayor del 50% , con las respuestas comunes que caen en el intervalo de 25-30%. El grado de eficacia con AB0046 se consideró en este contexto. La eficacia de AB0046 en alcanzar el importancia estad ístico para la reducción de la enfermedad histológica, y la correlación entre todos los parámetros evaluados, fue de nota particular en este estudio. Aunque (dado la dosificación y la evidencia limitada de un efecto disipador de tejido sobre la dosificación inicial) el régimen de dosificación de anticuerpo pudo no haber alcanzar los niveles terapeuticos óptimos, se observó la eficacia.
Consistente con la eficacia observada con los puntos finales endoscópicos, histopatológicos, y peso corporal, el análisis del ensayo inmunosorbente ligado a enzima de multianalito (ELISA, por sus siglas en inglés) de muestras de suero terminal del modelo de tratamiento en enfermedad establecida reveló que el tratamiento de anti-MMP9 (AB0046) dio lugar a una reducción sistémica de muchos mediadores y marcadores conocidos del proceso inflamatorio en UC, que se sobrerreguló en el modelo de DSS . Como se muestra en la Figura 1 1 A , estos mediadores incluyen el factor quimioatrayente de neutrófilos KC/GRO, monocito y molécula quimioatrayente de célula T activada CXCL10 (un objetivo terapéutico en UC), marcador de neutrófilo M PO , citocina inflamatoria LI F de clase I L-6, quimioatrayente de neutrófilo M IP-2, y molécula quimioatrayente de monocito MCP-5 (factor de ratón que comparte la homología con MC P-1 humano). Se observó una tendencia para la reducción de citocinas asociadas a enfermedad sistémica por AB0046. Como se muestra en la Figura 1 1 B , algunas citocinas estaban cerca o en el nivel inferior de la cuantificación o de detección , incluyendo IL-17A (se observó la tendencia para una reducción en el medio del grupo tratado con AB0046) y TN F-a (señal demasiado baja para evaluar las diferencias entre grupos). Una reducción de IL-6 también se observó con el tratamiento de AB0046, pero no se distinguió del control de ¡sotipo AC-1 , un anticuerpo que ha demostrado actividad no específica. Los niveles de MMP-9 en suero no se indujeron (es decir, no hay ninguna diferencia entre los grupos sin DSS y de vehículo; las interferencias por anticuerpos de fármaco no pueden descartarse para mediciones de nivel en suero de M M P9). Además de la reducción de los niveles de MCP-5 observados en animales tratados con anticuerpo anti-M P9 (AB0046) , los aumentos asociados a enfermedades en MCP-1 y MCP-3 tambien se redujeron con este tratamiento, al igual que eotaxina.
U n estudio de tratamiento de colitis de DSS de ratón adicional se condujo al usar AB0047, que fue el anticuerpo anti-MMP9 generado por un hibridoma independiente. Como se muestra en la Figura 12A, los resultados mostraron tendencias similares para una reducción de la enfermedad endoscópica con anti-M M P9 AB0047 y EN BREL®. También , como se muestra en la Figura 12B, el tratamiento de AB0047 dio lugar a tendencias similares en hallazgos histopatológicos como con el estudio con AB0046.
Ejem plo 5: Anticuerpo anti-MMP9 en el modelo de DSS murino de colitis La eficacia de AB0046 en un ajuste profiláctico se evaluó y comparó con el agente de referencia prednisolona. Los grupos de tratamiento se muestran en la Figura 3. El tratamiento indicado se dio en el día -1 , con los horarios de dosificación indicados. La inducción de la enfermedad con 3% de DSS se inició en el día 0 y fue como se describe antes. Los animales se sacrificaron en el día 14.
Tabla 3: Detalles de tratamiento para animales en los grupos 1 -5 en estudio profiláctico N = número de animales; ROA = ruta de administración; I P = inyección intraperitoneal Como se muestra en la Figura 13, la eficacia del tratamiento profiláctico AB0046 se observó en el día 10 de evaluación endoscópica.
Como se muestra en la Figura 14, en la terminación del estudio, la inflamación reducida del tratamiento anti-MMP9 profiláctico (AB0046) , edema , y necrosis, y así el conteo de suma de patolog ía. Como se muestra en la Figura 15, la administración profiláctica de AB0046 redujo la incidencia de diarrea.
Ejemplo 6: Anticuerpo anti-MMP9 en modelo ortotópico de cáncer colorrectal La eficacia de la inhibición de MMP9 específica fue además mostrada al usar un cóctel de AB0046 y de AB0041 en un modelo de ratón de xenomjerto de cáncer colorrectal. Los fragmentos de los tumores subcutáneos derivados de una línea celular de cáncer colorrectal humana (HCT-1 16; muíante KRAS G 13D) se implantó quirúrgicamente en el colon en ratones desnudos y se dejó crecer 5 hasta ~ 100 mm3 antes de la iniciación del tratamiento. Como se muestra en la Figura 16, el cóctel de anticuerpos disminuyó el cambio en volumen tumoral y peso tumoral final disminuido en el d ía 32 después de la iniciación del tratamiento (Figura 16). También , el cóctel de anticuerpos redujo la frecuencia de ío metástasis (datos no mostrados) . Los resultados muestran que la inhibición de M MP9 al usar el cóctel de anticuerpos disminuyó significativamente el crecimiento tumoral primario.
Ejemplo 7: Anticuerpo anti-MM P9 en modelos de artritis reumatoide 15 El anticuerpo anti-M MP9, AB0041 , fue eficaz en tratar la inflamación y el daño articular en modelos de artritis inducida por coadyuvante y colágeno (AIA, CIA), artritis reumatoide de rata de enfermedad establecida. Los resultados se muestran en la Figura 1 7A. El tratamiento al usar el anticuerpo monoclonal anti-M M P9 20 AB0041 redujo los conteos clínicos de artritis a un grado similar como sé observa con terapias establecidas EN BREL® y metotrexato (NTX, por sus siglas en inglés) en un modelo terapéutico (tratamiento en enfermedad establecida). Los hallazgos similares se observaron para las mediciones de 25 articulación objetiva y evaluación histopatológico de enfermedad (conteo de suma de múltiples parámetros de inflamación y destrucción articular, grupo de 50 mg/kg). Como se muestra en la Figura 17A, la reducción de los conteos clínicos de artritis se observó con dosis de AB0041 de 50, de 10 y 2 mg/kg , dos veces por semana (4 dosis juntas) .
Como se muestra en la Figura 17B, los títulos de anticuerpos se tomaron al final del estudio (EOS, por sus siglas en ingles) para confirmar la exposición, y también en el día 10 de tratamiento, en CIA de rata . AB0046 no fue detectable en suero en el nivel de dosis de 2 mg/kg.
El tratamiento de AB0041 también fue eficaz en la reducción de los niveles de suero de citocinas inflamatorios clave como TNFa, I L-6 , e I L-1 7A, que son también conductores de enfermedad caracterizados en enfermedad intestinal inflamatoria humana. Los resultados se muestran en la Figura 18A. La figura 19A muestra los marcadores de suero adicionales observados en este estudio.
Los resultados similares para la reducción de la enfermedad clínica e histopatológica y el efecto antiinflamatorio sistémico del tratamiento anti-MMP-9 se observaron en un modelo de ratón de C IA de artritis reumatoide al usar el anticuerpo sustituto murino, AB0046. Los resultados de citocina se muestran en la Figura 18B; La figura 19B muestra los marcadores de suero adicionales observados en este estudio.
Ejemplo 8: Anticuerpo anti-MMP9 en modelo de septicemia inducida por LPS En otro modelo de enfermedad inflamatoria sistemica, tratamiento de anticuerpo anti-MM P9 AB0041 protegido contra muerte animal inducida por lipopolisacárido (LPS, por sus siglas en inglés) en un modelo de septicemia de rata (Aragen Biosciences, Gilroy, CA), con 70% de animales tratados con AB0041 que sobreviven después de cuatro días comparados con 20% que sobrevive en el grupo tratado con control de isotipo. Los resultados se muestran en la Figura 20.
Ejemplo 9: Estudio de síndrome musculoesquelético (MSS, por sus siglas en inglés) Se evaluó AB0041 para la seguridad en ratas de Lewis en comparación al inhibidor de pan-M MP, Marimastat, en un estudio de 28 días.
La administración clínica de inhibidores de pan-MMP de molécula pequeña, como Marimastat, se ha mostrado para dar lugar al síndrome musculoesquelético (MSS, por sus siglas en inglés) , un trastorno caracterizado por el dolor e inmovilidad en las articulaciones de hombro, artralgias, contracciones en las manos, y calidad de vida reducida para los pacientes. Las ratas tratadas con inhibidores de pan-MMP también exhiben MSS (con síntomas incluyendo capacidad comprometida para apoyarse en las patas traseras, inhabilidad de moverse, y marcha equma) y se usan como un sistema modelo para este trastorno. Las articulaciones de estos animales exhiben hiperplasia sinovial y celularidad amentada similares a la histopatología observada en enfermedad humana. Al usar este modelo de rata de síndrome musculoesqueletico (MSS, por sus siglas en inglés) (descrito en Renkiewicz R, et al. , "Broad spectrum matrix metalloproteinase inhibitor marimastat-induced musculoskeletal side effects in rats." Arthritis Rheum 2003;48 (6): 1742-9), se usó el tratamiento de Marimastat como control positivo para la inducción de MSS.
Seis ratas por grupo se administraron intravenosamente dos veces por semana con AB0041 a 50 mg/kg o Vehículo-A (10 mM de fosfato de sodio, pH 6.5, 140 mM de cloruro sódico, 0.01 de Tween20) . Además, seis ratas por grupo se trataron con Marimastat o Veh ículo-M (50% de DMSO/50% de agua) a través de u na bomba de Alzet subcutánea implantada quirúrgicamente (Alzet, Cupertino, CA), que suministró un índice de 2.5 mI/hora por un período de 28 días. El índice de liberación de Marimastat estaba entre 6.8 a 5.7 mg/kg/d ía .
Los animales se observaron y contaron diariamente para determinar los signos de MSS, como renuencia a moverse y evitar el uso de las patas traseras. El siguiente sistema se usó para contar la postura de descanso, marcha y voluntad de moverse: la postura de descanso se contó como 0 (normal), 1 (que descansa sobre un pie) o 2 (que no descansa en un pie ni dos patas). La marcha se contó como 0 (normal), 1 (evita el uso de una pata trasera) o 2 (evita el uso de ambas patas traseras). La disposición a moverse sobre el estímulo se anotó como 0 (movimiento normal), 1 (algo renuente a moverse), 2 (moderado renuente a moverse) o 3 (muy renuente a moverse). Además, los pesos corporales se registraron dos veces semanalmente.
Los conteos totales se calcularon como la suma del conteo de marcha, conteo de postura de descanso y conteo de disposición a moverse para cada animal. Los conteos totales promedio por grupo se calcularon como el promedio de los conteos totales de todos los animales individuales por grupo por día.
El suero se recolectó de todas las ratas en un día antes y los días 1 , 7, 10, 14, 17, 21 , 24, 28 despues de la administración . El suero se centrifugó a 10,000 x g por 10 minutos y se recolectaron para el almacenamiento a -20°C . El suero se sometió al análisis de proteína en suero de multianalito (RodentM APv2.0, I DEXX Laboratories) .
Los tejidos y las extremidades de las ratas se cosecharon y se fijaron en 10% de formalina amortiguada neutral para análisis histopatológico al usar hematoxilina y eosina (H&E) .
Un sistema de clasificación estándar se usó para comparar el cambio microscópico al grupo de vehículo: 0 (ningún cambio), 1 (cambio mínimo), 2 (cambio leve) , 3 (cambio moderado) , y 4 (cambio severo).
Los niveles de AB0041 en suero de rata se midieron por ELISA de unión indirecta. Las placas de ELISA se cubrieron con 2 g/ml de AB0041 en 50 mM de borato de sodio durante la noche a 4°C. Las placas se bloquearon con 5% de albúmina de suero bovino (BSA, por sus siglas en ingles) en solución salina amortiguada con fosfato, pH 7.4 (PBS) y se lavaron con 0.05% de Tween 20 en PBS (PBST). Una curva estándar se preparó 5 diluyendo en serie AB0041 en PBST para generar una serie que oscila de 3,000 ng/ml a 1 .5 ng/ml. Las muestras de suero se diluyeron por lo menos 1 : 100 en PBST después se agregó a la placa de ELISA previamente cubierta. Después de una hora de incubación , se lavaron las placas y el anticuerpo de detección de ío IgG-HRP de cabra-anti ratón policlonal (Thermo Scientific, Fair Lawn , NJ) se agregó a la placa a 1 : 10,000 de dilución en 0.5% de BSA/PBS. Se lavaron las placas y se detectó la señal por la adición de 3,3' ,5,5'-tetrametilbenzidina (TM B , por sus siglas en inglés) (Sigma Aldrich , St. Louis, MO) durante 2 minutos. La 15 reacción de detuvo por la adición de ácido clorh ídrico 1 M (HCI, por sus siglas en inglés) y se midió la absorbencia a 450 nm. Los niveles AB0041 en suero se volvieron a calcular al usar un ajuste de curva de cuatro parámetros en el paquete de software de SoftMax (Molecular Devices). 0 Resultados No se observaron signos de pérdida de peso en cualquiera de los grupos de tratamiento; todos los animales continuaron ganando peso a través del estudio.
Los conteos de MSS diario promedio ± desviación estándar 5 para cada grupo se resumieron en la Figura 21 . N inguno de los signos de MSS se contaron en las ratas tratadas con AB0041 a traves del estudio. En el día 12 del estudio, cinco ratas tratadas con Marimastat mostraron cojeo leve con evitación del uso de una pata trasera (conteo de marcha = 1 ) . No se detectó ninguno de 5 los síntomas en ninguno de los animales tratados con AB0041 , Veh ículo A, o Vehículo M . En el día 13, cuatro animales en el grupo de Vehículo M mostraron cojeo leve (conteo de marcha = 1 ) , que fue probablemente debido al peso de la bomba incrustada . En el día 18, las ratas tratadas con Marimastat exhibieron ío conteos totales diarios promedio de aproximadamente 4.0, mientras que las ratas tratadas con vehículo-M tenía bajos conteos. Por el Día 25, el conteo promedio para el grupo de Marimastat fue 5.8, y el conteo promedio para el grupo AB0041 segu ía siendo cero. La diferencia en los conteos totales 15 promedio por d ía entre los grupos de Marimastat y de Vehículo-M fue estadísticamente Importante a partir del d ía 14 después de la implantación de la bomba Alzet en adelante (p<0.05) , con p- valores < 0.0001 a partir del día 20 para la terminación de estudio en el Día 28. Ni las ratas trataron con AB0041 ni las ratas 20 tratadas con Veh ículo-A mostraron cualquier síntoma de la enfermedad musculoesquelética durante el curso del estudio.
La Figura 22 muestra los niveles de suero AB0041 (títulos de suero) como se midió por ELISA en ratas tratadas con AB0041 en los días 1 , 7, 10, 14, 17, 21 , 24, y 28. Los niveles de estado 25 estacionario promedio oscilaron de 2-4 mg/ml a partir del Día 0 al Día 28, indicando que las ratas se expusieron al anticuerpo durante el curso del estudio.
Los efectos del tratamiento de AB0041 comparados al tratamiento de Vehículo-A se evaluaron mediante un panel de 5 química en suero y un análisis histopatológico. El panel de química en suero contuvo fosfatasa alcalina, aminotransferasas glutámico-pirúvicas y oxalaceticas en suero, creatina-fosfocinasa, albúmina, proteína total, globulina , bilirrubina total , nitrógeno de urea en sangre, creatinina, colesterol, glucosa , calcio, fósforo, ío bicarbonato, cloruro, potasio, y sodio. En ambos grupos, los niveles del panel de qu ímica en suero fueron similares y dentro de los intervalos normales y similar (datos no mostrados). Esto indica que el tratamiento de AB0041 no dio lugar a ningunas perturbaciones sustanciales a homeostasis normal. 15 Además, el análisis histopatológico se realizó en órganos primarios de los grupos de AB0041 y de Vehículo-A. Los tejidos del corazón , pulmón , hígado, bazo, riñón , nodulo linfático, estómago, intestino, piel , músculo, y esternón se recolectaron y tiñeron con H&E y se examinaron microscópicamente. No se 0 observaron ningunas anormalidades relacionadas al tratamiento en el grupo de AB0041 o el grupo de Veh ículo-A (datos no mostrados) .
Además, las extremidades de las ratas tratadas con AB0041 y las tratadas con Marimastat se evaluaron para los cambios de 5 tejido suave y para los cambios de hueso y de articulación. La fibrosis y la sinovitis se observaron en el grupo de Marimastat pero no en el grupo de AB0041 . En las ratas tratadas con Marimastat, la fibrosis osciló de leve a severo y se observó comúnmente en tobillos y muñecas. Tambien , la sinovitis se encontró en la mayoría de las articulaciones en las ratas tratadas con Marimastat y fue leve y caracterizado por la proliferación de célula sinovial, fluido sinovial aumentado, e infiltración de célula inflamatoria.
Los resultados similares se observaron en la tinción de H&E de articulaciones de rodilla trasera de las ratas de ambos grupos. No se observó ninguna sinovitis o fibrosis en las ratas tratadas con AB0041 mientras que la evidencia histopatológica de fibroplasia se vio en las ratas tratadas con Marimastat. Esto hallazgo es constante con la carencia de síntomas clínicos de MSS en ratas en el grupo tratado con AB0041.
Así, el tratamiento de ratas de Lewis dio lugar a múltiples síntomas de enfermedad musculoesquelética en todos los animales que comenzaron en el Día 12 después del tratamiento inicial, incluyendo signos característicos de MSS , incluyendo efectos sustanciales en marcha, postura y disposición a moverse. En contraste, el tratamiento de las ratas de Lewis con AB0041 o con veh ículos solos no indujo ninguno de los síntomas clínicos, físicos, o histológicos de MSS. No se detectó ninguna de las diferencias o anormalidades notables en química en suero o parámetros histológicos en el grupo de AB0041 o el grupo de vehículo. La carencia de los síntomas de MSS en el grupo tratado con AB0041 no fue debido a la biodisponibilidad pobre en fármaco, puesto que el análisis de título en suero mostró que la exposición a AB0041 seguía siendo alta a traves de la duración del estudio. Contrario a la inhibición de pan-MMP mediante Marimastat, la inhibición específica de MM P9 por AB0041 no indujo MSS.
Ejem plo 10: Anticuerpo anti-MMP9 en un Modelo de Xenomjerto Ortotópico Las actividades de AB0041 y de AB0046 se examinaron en el modelo de CRC de ratón de xenoinjerto ortotópico como se describe en el Ejemplo 6. El análisis inmunohistoquímico del modelo de xenoinjerto mostró que M M P9 estaba presente en células inflamatorias estromales y células de tumor epitelial.
Los tumores se hicieron crecer a ~ 70 mm3 antes de tratamiento en los Estudios I ( 17 d ías después de la implantación), I I (14 días después de la implantación), e I I I (14 días después de la implantación) . En el Estudio I , qumce ratones por grupo se trataron con vehículo, IgG de control AC-1 (AC-1 ), AB0041 (h), o una mezcla 1 : 1 de AB0041 y de AB0046 (m + h) . En los grupos de AC-1 , h , y m+h , los ratones se administraron intraperitonealmente con cada anticuerpo a 15 mg/kg dos veces por semana. En el grupo de m + h, los ratones se administrados previamente con AB0046 a 50 mg/kg en el primer día del tratamiento. En el grupo de vehículo, los ratones se administraron intraperitonealmente con vehículo dos veces por semana.
En el Estudio II, qumce ratones por grupo se trataron con vehículo, AC-1, AB0041 (h), una mezcla 1:1 de AB0041 y AB0046 (m + h), 5-fluorouracllo (5-FU, por sus siglas en ingles), o una combinación de 5-FU y una mezcla 1:1 de AB0041 y de AB0046 (5-FU + m + h). En los grupos de AC-1, h, m + h, y 5-FU + m + h, los ratones se administraron intraperitonealmente con cada anticuerpo a 15 mg/kg dos veces por semana. En los grupos de m + h y de 5-FU + m + h, los ratones se administraron previamente con AB0046 a 50 mg/kg en el primer día del tratamiento. En los grupos de 5-FU y de 5-FU + m + h, los ratones se administraron intraperitonealmente con 5-FU a 20 mg/kg dos veces por semana. En el grupo de vehículo, los ratones se administraron intraperitonealmente con vehículo dos veces por semana.
En el Estudio III, cinco ratones por grupo con un promedio de peso de 20% más pesado comparado al del Estudio II se trataron con vehículo o una mezcla 1:1 de AB0041 y de AB0046 (m + h). Los ratones se administraron como se describe en el Estudio II.
El título de AB0041 y AB0046 se midió durante los estudios. Los tamaños de tumor y los pesos corporales primarios se midieron una vez por semana al usar un calibrador y una escala electrónica, respectivamente. Las estimaciones de tamaño basadas en el calibrador se obtuvieron midiendo la dimensión menor perpendicular (W) y la dimensión mayor (L) del tumor palpado. El volumen de tumor aproximado (mm3) se calculó mediante la fórmula (W2x L)/2. La prueba de suma de clasificación de ann-Whitncy no parametrica se uso para determinar los valores p (* = 0.05 a 0.01 , ** = 0.01 a 0.001 , *** = < 0.001 ). Para el análisis de RodentMAP, el análisis de índice de descubrimiento falso también se usó para determinar los valores q ; el índice de descubrimiento falso aceptable máximo se ajustó a 0.05. El volumen de tumor normalizado se calculó como sigue: un volumen tumoral de ratón individual en cada punto de tiempo de medición se normalizado a su volumen tumoral del "día 0" (es decir volumen tumoral al momento de la iniciación de tratamiento), y estos valores normalizados de cada ratón en el g rupo entonces se promediaron para producir a un grupo de volumen normalizado promedio para cada punto de tiempo.
Al final del estudio cuando la carga máxima de tumor se observó, el suero, el tumor de colon primario y cualquier órgano con metástasis se recolectaron y examinaron .
El tratamiento con mezcla 1 : 1 de anticuerpos que dirigen M M P9 humana y M M P9 de ratón dio lugar a la eficacia similar a aquella en el Ejemplo 6 (Figuras 16 y 23). En el Estudio I I , la eficacia de tratamiento en el grupo de m + h fue comparable a ésta en el grupo de 5-FU (Figuras 23C , 23D). 5-FU es un análogo de pirimidina que funciona como un antimetabolito y tiene actividad antineoplástica.
En el Estudio I , los efectos de la inhibición de hMM P9 solamente fueron similares a la inhibición de inhibir MM P9 (m + h) en limitar el crecimiento tumoral (Figura 24). Las Figuras 4 y 5 resumen los valores p de Mann-Whitncy para el volumen y peso tumoral como se midieron para los Estudios I e I I .
Figura 4: Valores p de Mann-Whitney para los datos del estudio II * = 0.05 a 0.01 , ** = 0.01 a 0.001 , *** = < 0.001 Tabla 5: Valores p de Mann-Whitney para los datos del Estudio I * = 0.05 a 0.01 , ** = 0.01 a 0.001 , *** = < 0.001 , - = > 0.05 Comparado a los grupos de control, la inhibición de articulación de hM MP9 y mMMP9 redujo la incidencia de metástasis en el Estudio I . También , la inhibición solamente de M M P9 derivada de tumor fue menos eficaz. Este resultado es constante con una mayor función de M MP9 estromal (contra M M P9 derivada de tumor) en los procesos de invasión que dan lugar a metástasis distales.
En el Estudio I I I, la diferencia entre los volúmenes tumorales normalizados en los dos grupos fue Importante (Figuras 23E y 23F). El valor p del grupo de veh ículo contra los grupos de m + h fue 0.0362 a 36 días después de la implantación o 21 días después del tratamiento.
El análisis I nmunohistoquímica (I HC, por sus siglas en ingles) de tumores de ratones tratados con vehículo en el Estudio I demostró la producción de M MP9 mediante células de tumor a un nivel inferior que MMP9 de fuentes estromales como macrófagos residentes, fibroblastos y células endoteliales. El patrón de expresión de MMP9 en los tumores del modelo de xenomjerto fue similar al del CRC humano; la expresión celular de tumor de MMP9 fue heterogénea , y los niveles de expresión podrían variar ampliamente dentro de una región dada de masa tumoral .
En el Estudio I , la tinción de H&E de secciones tumorales y la evaluación visual para el porcentaje del tejido necrótico no revelaron ninguna diferencias Importantes en el grado de la necrosis en control contra animales tratados con anti-M MP9. Si los tumores se categorizaron por el peso final en grupos separados y después se analizaron , existía una tendencia ligera hacia necrosis aumentada en el grupo tratado con anti-MMP9 (contra el grupo de control) para tumores con un peso final de menos de o igual a 0.4 g (aproximadamente 1 1 % de todos los tumores de control y 7% de todos los tumores tratados con anticuerpo MM P9), pero la diferencia no alcanzó importancia estadística (p = 0.146; Ensayo de Mann-Whitncy).
El análisis de suero adicional se realizó para el estudio descrito en el Ejemplo 6. Las proteínas en suero en un panel de 58 analitos se evaluaron por RodentMAP. La importancia se evaluó mediante la prueba de Mann-Whltncy, seguido por el análisis de índice descubrimiento falso para proporcionar valores q . Como se muestra en la Figura 25, la proteína C reactiva (un marcador de inflamación), CXCL2/M IP-2 (un atrayente y activador de neutrófilo), VEGF-A, y CCL7/MCP-3 (un quimiocina que activa la mayoría de los tipos de leucocito y estimula la liberación de M MP9 de los monocitos), linfocitos T, y celulas N K se redujeron significativamente en el grupo anti-MMP9 (m + h) cuando se compara al grupo de vehículo.
Los títulos AB0041 (anticuerpo anti-hM MP9) y AB0046 (anticuerpo anti-mMM P9) se midieron en el suero recolectado al final de los Estudios I e I I. En concentraciones de suero promedio, terminales de AB0041 y AB0046 oscila de 100 a 300 pg/ml (datos no mostrados) .
Los resultados de estos estudios demuestran que dirigir M M P9 con un cóctel de anticuerpos monoclonales específicos a humanos y específicos a ratón en un modelo de xenomjerto de ratón reduce el crecimiento del tumor primario en cuatro estudios independientes, y también reduce la incidencia de metástasis.
El tratamiento con anticuerpo anti-human-M M P9 solo produce una reducción de crecimiento tumoral similar al tratamiento con ambos anticuerpos anti-human-M MP9 y anti-mouse-MMP9. Esto sugiere que en este modelo de xenoinjerto, M M P9 humana derivada de tumor (en lugar de M MP9 de ratón derivado de estroma) es el conductor más predominante de la proliferación celular del tumor. Los cambios en los niveles de proteína en suero de ratón en ratones trataron con un cóctel de MMP9 anti-humano y MMP9 anti-ratón (con respecto a ratones tratados con vehículo) demostró que el factor ángiogenico VEGF y la proteína C-reactiva de factores inflamatorios, CXC L2, y CCL7 se redujeron significativamente en ratones tratado con anti-MMP9 con respecto a ratones tratados con vehículo, constantes con un función de MM P9 en inflamación y angiogénesis. También , la M MP9 derivado de tumor epitelial está implicado en excrecencia de tumor primario y que dirige la MM P9 estromal aumenta la eficacia a la incidencia de metástasis.
Ejem plo 1 1 : Tratamientos terapéuticos al usar anticuerpos anti-MMP9 AB0045 se usa en tratar pacientes que tienen adenocarcinoma pancreático o esofagogástrico avanzado, cáncer de pulmón de célula no pequeña , colitis ulcerosa , enfermedad de Crohn , o artritis reumatoide. Se administra a pacientes el anticuerpo intravenosamente a una dosificación de 100, 200, 400, 600, 1200, o 1800 mg/kg de peso corporal, en el intervalo de una, dos o tres semanas. La dosificación apropiada se hace con 0.9% de cloruro sódicos . Los pacientes reciben AB0045 como monoterapia o como parte de una terapia de combinación con otros agentes terapéuticos.
Para tratar la UC, la enfermedad de Crohn , o la artritis reumatoide, se administra AB0045 solo o con otros agentes inmunoterapeutico, incluyendo anticuerpos contra LOXL2 (lisil-oxidasa tipo 2) y/o DDR1 (receptor del dominio de discoidina 1 ).
Para el adenocarcinoma pancreático, el anticuerpo se administra solo al intervalo de dos semanas o con la quimioterapia de ciclo de 28 d ías de gemcitabina y/o nab-paclitaxel.
Para el adenocarcinoma esofagogástrico, el anticuerpo se administra solo en el intervalo de dos semanas o con la quimioterapia del ciclo de 28 días de mFOLFOX6 que se administra en un ciclo de 28 d ías.
Para el cáncer de pulmón de célula no pequeña, el anticuerpo se administra solo en el intervalo de tres semanas o con la quimioterapia de ciclo de 21 d ías de carboplatino y paclitaxel o con pemetrexed y/o bevacizumab.
En los tratamientos de combinación , la quimioterapia se administra con la dosificación y el procedimiento conocidos.
La dosificación del anticuerpo M MP9 puede ajustarse y administrarse a 133, 267, 400, 600 o 1200 mg/kg de peso corporal. Después de cada ciclo terapéutico, se monitorean los pacientes para los n iveles de anticuerpos M M P9, MMP9, u otros biomarcador adecuados.
Ejem plo 12: Anticuerpo anti-MMP9 en modelo de artritis reumatoide El ejemplo 7 demostró las eficacias de AB0041 en tratar la artritis reumatoide en ratas y ratones. Este ejemplo proporciona las caracterizaciones adicionales de los animales en el Ejemplo 7 que se trataron con el vehículo, AB0041 (en el modelo de rata) o AB0046 (en el modelo de ratón) a 2, 10, o 50 mg/kg, Enbrel a 10 mg/kg , o metotrexato (NTX, por sus siglas en ingles) a 0.5 mg/kg.
Además del conteo clínico en la Tabla 6 que se condujo en el Ejemplo 7, la hinchazón de la pata, el diámetro del tobillo y los pesos corporales de los animales tratados se midieron. Las mediciones se condujeron una vez por semana antes de la selección de manera aleatoria y tres veces una semana a partir de entonces. Como se muestra en las Figuras 26 (ratas) y 29 (ratones), la administración de AB0041 en ratas y AB0046 en ratones en todas las dosis dio lugar a la reversión/mitigación I mportante de mediciones cualitativas y cuantitativas de la enfermedad clínica. Los resultados también mostraron que el tratamiento con AB0041 o AB0046, a 50 mg/kg , redujo todas las mediciones de enfermedades de tejido leves, daño y destrucción de articulación . La eficacia de los anticuerpos anti- MP9 fue comparable a la observada con Enbrel y metotrexato (NTX, por sus siglas en inglés) .
Tabla 6: Escala y criterio para conteo clínico de patas a Cada pata recibió su propia conteo y estos valores fueron sumados para cada animal para un máximo teórico de 16 Además, las extremidades traseros se examinaron microscópicamente para cambios de tejido blando (edema, necrosis de tejido/bazo, infiltración de célula inflamatoria, y fibroplasias) y los cambios de cartílago y hueso (erosión de cartílago, erosión de hueso, formación ósea perióstica, sinovitis, formación de paño, y destrucción de articulación). Un conteo de severidad estándar se usó: 0 = ningún cambio significativo, 1 = mínimo, 2 = leve, 3 = moderado y 4 - severo. Los conteos de severidad se basaron en cambios globales en cada extremidad .
El análisis de I nmunohistoqu ímica (IHC, por sus siglas en inglés) se realizó para evaluar los niveles de MMP9, TNF-alfa, CD68, y Catepsina K. El conteo de tinción de anti-TN F-alfa y de ant¡-CD68 se hizo en una escala cualitativa que oscila de 0-4, donde 0 fue el nivel en articulaciones no-enfermas y 4 fue la expresión más alta observada en las extremidades tratadas con vehículo. Para el conteo de anti-TNF-alfa, se contó la región entera de la extremidad anterior a la articulación del tarso-metatarso. La tinción de anti-CD68 se evaluó al usar 3-4 imágenes por extremidad de membranas sinoviales en las articulaciones formadas por el hueso de talud, con los conteos de cada membrana promediada y el valor asignado como el conteo de inflamación total. Los resultados de la expresión MM P9 muestran I HC en regiones de áreas enfermas activas incluyendo frentes de daño de cartílago y erosión de hueso así como en tejido de paño. También , las células que expresan MMP9 fueron identificadas como osteoclastos y células del linaje de monocito/macrófago.
En ratas tratadas con 50 mg/kg de AB0041 , CD68 y TNF-alfa se cuantificaron . Los resultados mediante I HC revelaron una reducción significativa en CD68 y TNF-alfa en este grupo comparado al grupo tratado con vehículo (Figura 27). Los resultados indican una reducción en tipos de célula que degradan el hueso y el cartílago (osteoclastos y células de linaje de monocito/macrófago) y un mediador sistémico de inflamación y artritis (TN F-alfa).
Además, los análisis del panel en suero de las muestras de suero terminal se caracterizaron al usar ELISA. Los resultados resumidos en las Figuras 18A y 28 (ratas) y 18B y 19B (ratones) mostraron una reducción constante en mediadores de progresión de inflamación y de enfermedad. Como se muestra en la Figura 28, el tratamiento de AB0041 en ratas dio lugar a una reducción estadísticamente significativa del inhibidor de tejido inhibidor de MMP9 endógeno de metaloproteinasa (TI MP)-1 , el factor estimulante de colonia de granulocito-macrófago de leucocito-mitógeno (GM-CSF, por sus siglas en inglés), atrayente de neutrófilo y proteína inflamatoria de macrófago activador (M IP)-2 , célula asesina natural y quimioatrayente de monocito M IR-1 b, factor estimulante de colonia de macrófago diferenciador de célula de vastago hematopoyética (M-CSF, por sus siglas en i n g I é s ) - 1 , citocina oncostatina M de familia de IL-6 (OSM , por sus siglas en inglés), quimiocina de motivo de quimioatrayentes C-X-C (CXCL) 10 y proteína quimioatrayente de monocito (MCP)-5, activador I L-12p70 de célula T y asesina natural, e interferón de moduladores del sistema inmune (IN F)-y, I L-12 , e I L-7. No se observó ninguna reducción de los marcadores de suero en las ratas tratadas con Enbrel, mientras que el tratamiento de metotrexato dio lugar a un aumento constante en estos marcadores. Como se muestra en la Figura 19B, el tratamiento de AB0046 en ratones dio lugar a una reducción estad ísticamente significativa de atrayentes y/o activadores de KC/GRO, MI P-2, y GCP-2 de neutrófilos; NK y linfotactina atrayente de célula T; quimioatrayentes MCP-1 y MCP-3 de monocito; quimioatrayente CXCL-10 de linfocito y celula dendrítica; citocina OSM similar a I L-6; activadores MI R-1 b y M IP-1 y de granulocito; y apolipoproteína (Apo) A-1 . Los títulos de AB0046 se midieron en muestras de suero terminal. Adicionalmente, los regímenes de dosificación de 10 y 50 mg/kg dieron lugar a niveles de fármaco medibles.
Estos datos muestran que el tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-MM P9 inhibidor en un modelo de tratamiento de CIA de rata dio lugar a la mitigación y a la reversión de observaciones clínicas y mediciones objetivas de inflamación articular, reducción de las manifestaciones histopatológicas de inflamación articular y destrucción , y dismin ución en tipos y factores de célula de mediación de enfermedad . El efecto terapéutico fue comparable a los compuestos de Enbrel de referencia y al metotrexato. Un efecto antiinflamatorio sistémico amplio se observó con el tratamiento de anti-M MP9 pero no con la administración de Enbrel o de metotrexato.
Ejemplo 1 3: Expresión de MMP9 en Tumores Humanos Los niveles de proteína y ARNm de M MP9 y de M MP2 se examinaron mediante inmunohistoquímica (I HC, por sus siglas en inglés) y mediante hibridación in situ cromogénica. Los tejidos del carcinoma de célula escamosa de pulmón humano, adenocarcinoma de pulmón , adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma pancreático, carcinoma hepatocelular, y carcinoma de célula escamosa de cabeza y cuello se caracterizaron.
En análisis de I HC, las muestras se tiñeron al usar dos distintos anticuerpos específicos a MMP9: el anticuerpo policlonal Sigma HPA001238 y el anticuerpo monoclonal Abeam (ab76003). El porcentaje del epitelio tumoral de MMP9-positiva para una muestra de tumor dada se contó mediante evaluación visual. La especificidad de los anticuerpos anti-MMP9 usados para el análisis de IHC se evaluó probando contra un panel de MM P en una inmunotransferencia. Ninguno de los dos anticuerpos exhibió cualquier reactividad cruzada notable contra cualquier M MP probada con excepción de MMP9.
En todos los tumores examinados, la inmunoreactividad de M M P9 se vio en subconjuntos de histiocitos (macrófagos residentes en tejido) , neutrófilos, celulas endoteliales, y fibroblastos, así como en epitelios no-neoplásticos y epitelios tumorales. La proteína de MMP9 secretada también se encontró en la matriz extracelular, y fue asociada generalmente con infiltrados inflamatorios dentro de los tumores. La detección de la expresión de MM P9 se asoció a menudo con regiones necróticas a través de todas las muestras de cáncer.
La señal de MMP2 se detectó en subconjuntos de histiocitos dispersos a través de los tumores y presente en el músculo liso reactivo del microambiente de tumor, células endoteliales, músculo liso de las arteriolas, y epitelios no-neoplásticos. La mayoría del epitelio tumoral fue positivo para M MP2 pero con patrones tinción más difundidos que los observados para MMP9. La expresión de MMP2 fue más generalizada a traves del tejido (neoplástico y no-neoplástico) comparada con la expresión más heterogénea de MM P9.
La Figura 30 resume el porcentaje del epitelio tumoral de M M P9-positiva observado en este estudio. La positividad de M M P9 estromal está también presente en todas las muestras pero no se contó. El porcentaje de las muestras para un tipo de tumor dado que cae en cada categoría de "positividad" se muestra en el eje x de la Figura 30. La expresión mostrada en el análisis a través de todos los tipos de tumor y los patrones característicos de cada tipo de cáncer con respecto al grado y la fuente de positividad de MMP9.
El análisis de C ISH detectó que el ARNm de M MP9 en células epiteliales de tumor mediante subconjuntos de células inmunes (particularmente macrófagos y neutrófilos) y otros componentes del estroma como células endoteliales. Los resultados del análisis de C ISH mostraron que el ARNm de M M P9 estaba presente en macrófagos/histiocitos, neutrófilos, y células de epitelio tumoral . También , la expresión de ARNm de M M P9 varió dentro y de entre tipos de tumores. En todos los tumores analizados, los tipos de células que expresan ARNm de MM P9 incluyen subconjuntos de histiocitos, neutrófilos, y células de tumor. Similar a la heterogeneidad en el análisis de I HC , el nivel de expresión de ARNm de M MP9 varió.
La Figura 31 resume el análisis de CISH del ARNm de MMP9 asociado a tumor epitelial. El porcentaje de muestras de tejido para un tipo de tumor dado que calló en cada categoría de "positividad" se muestra en el eje x. El análisis reveló la expresión a traves de todos los tipos de tumor y los patrones característicos de cada tipo de cáncer con respecto al grado y fuente de positividad de MMP9.
Los resultados del análisis de CISH y de IHC muestran la expresión de MMP9 en epitelio tumoral. En algunas muestras, C ISH detectó ARNm de MMP9 donde no se detectó ninguna señal de proteína. Pues MM P9 derivado de tumor es frecuentemente menos abundante que la MM P9 derivada de célula inflamatoria , el análisis de C ISH es adecuado para detectar la expresión de M MP9 en las muestras que tienen altos niveles de MMP9 derivada de célula inflamatoria que obscurece la señal de I HC de la MMP9 derivada de tumor epitelial.

Claims (30)

REIVINDICACIONES
1 . Una composición farmaceutica, que comprende: un anticuerpo o un fragmento aislado de la misma que unen a la metaloproteinasa de matriz 9 (M M P9, por sus siglas en inglés), que comprende: una región variable de cadena pesada (VH , por sus siglas en inglés) que tiene una región determinante complementaria (CDR, por sus siglas en inglés) con una secuencia de aminoácido de la SEC I D NO : 15; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 , donde la región de VH además comprende una CDR con la secuencia de aminoácido de las SEC I D NOs: 13 y/o 14.
3. U na composición farmacéutica, que comprende: un anticuerpo o un fragmento aislado del misma que unen a la metaloproteinasa de matriz 9 (MMP9, por sus siglas en inglés), que comprende: una región variable de cadena ligera (VL, por sus siglas en inglés) que tiene una región determinante complementaria (CDR, por sus siglas en inglés) con una secuencia de aminoácido de la SEC I D NO: 18; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
4. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, donde la región de VL además comprende la secuencia de aminoácido de las SEC ID NOs: 16 y/o 17.
5. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 , 2, y 4, donde la región de VH tiene la secuencia de aminoácido indicada en las SEC I D NOs: 3, 5, 6, 7, u 8.
6. La composición farmaceutica de cualquiera de las 5 reivindicaciones 1 -5, donde la región de VL tiene la secuencia de aminoácido indicada en las SEC I D NOs: 4, 9, 10, 1 1 , o 12.
7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, donde la región de VH tiene la secuencia de aminoácido indicada en la SEC ID NO: 7 y la región de VL tiene la secuencia de ío aminoácido indicada en la SEC I D NO: 12.
8. Una composición farmacéutica, que comprende: un anticuerpo o un fragmento aislado de la misma que unen específicamente a un epítopo de MMP9, donde el epítopo comprende un residuo del aminoácido dentro de una región de 15 M MP9, la región que consiste en 104-1 19 residuos, 159-166 residuos, o 191 -202 residuos de la SEC I D NO : 27; y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 , donde el epítopo comprende E 1 1 1 , D 1 13, R162, o 1 198 de la SEC 20 I D NO : 27.
10. La composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, donde el anticuerpo o el fragmento inhibe la actividad enzimática de MMP9.
1 1 . La composición farmacéutica de la reivindicación 10, 25 donde la inhibición de la actividad enzimática es no competitiva .
12. La composición farmaceutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 1 , además comprende uno o más agentes terapéuticos seleccionados del grupo que consiste en un agente antiinflamatorio, un agente inmunoterapéutico, un agente quimioterapéutico, un agente anticáncer, un agente anti-fibrótico, o una combinación de los mismos.
1 3. La composición farmacéutica de la reivindicación 12 , donde uno o más agente terapéutico se seleccionan del grupo consistir en nab-paclitaxel, mFOLFOX6, FOLFI RI , carboplatino, paclitaxel , pemetrexed , bevacizumab, anticuerpo anti-lisil-oxidasa tipo 2 (LOXL2), un anticuerpo del receptor de dominio anti-discoidina 1 (DDR1 ), o una combinación de los mismos.
14. U n método para inhibir la actividad de M M P9 en un sujeto, que comprende administrando ai sujeto la composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones 1 -13 en una cantidad eficaz para inhibir la actividad de M MP9 en el sujeto que sufre de una enfermedad o condición asociada a MM P9.
15. El método de la reivindicación 14, donde la enfermedad o la condición asociada a M M P9 es un cáncer, enfermedad o condición autommune, inflamatoria o fibrótica.
16. El método de la reivindicación 15, donde el cáncer asociada a MMP9 es cáncer pancreático, adenocarcinoma esofagogástrico, cáncer de pulmón de célula no pequeña, carcinoma de célula escamosa de pulmón, adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma gástrico, carcinoma colorrectal, adenocarcinoma pancreático, carcinoma de celula escamosa de cabeza y de cuello, cáncer carcinomacolorectal hepatocelular, adenocarcinoma colorrectal, o carcinoma hepatocelular.
17. El método de la reivindicación 16, donde la 5 enfermedad o condición autommune o inflamatoria asociada a M M P9, artritis reumatoide, una enfermedad intestinal inflamatoria (I BD) , septicemia, esclerosis múltiple, distrofia muscular, lupus, alergia, o asma.
18. El método de la reivindicación 1 7, donde la I BD es ío colitis ulcerosa , enfermedad de Crohn, o colitis indeterminada.
19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 15-18, donde el anticuerpo o el fragmento se administra en una dosis de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 28 mg/kg.
20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 15-18, 15 donde el anticuerpo o el fragmento se administra en una dosificación de entre a o aproximadamente 100 y a o aproximadamente 1800 mg/kg de peso corporal.
21 . El método de la reivindicación 20, donde la dosificación es a o aproximadamente 100, 200, 300, 400, 500, 20 600, 700, 800, 900, 1000, 1 100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, o 1800 mg/kg de peso corporal.
22. El método de cualquiera de las reivindicaciones 15-21 , donde el anticuerpo o el fragmento se administra una vez cada semana, una vez cada dos semanas, o una vez cada tres 25 semanas.
23. El método de cualquiera de las reivindicaciones 15-22, donde el anticuerpo o el fragmento se administra intravenosa, intradérmica, o subcutáneamente.
24. El método de reivindicaciones 12-23, donde el 5 anticuerpo o el fragmento se administra concurrentemente o secuencialmente con uno o más agentes terapéuticos.
25. Un método para detectar o monitorear la actividad de M M P9, comprende: poner en contacto una muestra con la proteína de unión a ío M MP9, evaluar la presencia o la ausencia de la proteína de unión a MM P9 - complejo de M M P9; donde la proteína de unión a MMP9 comprende una región de VH que comprende una CDR con una secuencia de aminoácido 15 seleccionada del grupo que consiste en las SEC I D NOs: 13, 14, 15, 34, 35, 36 y 47; y una región de VL que tiene una CDR con una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC I D NOs: 16, 1 7, 18, 37, 38, 39, 42, 43, 44, y 48; 20 por lo que la ausencia de la proteína de unión a MM P9- complejo de MMP9 indica que la muestra no tiene la actividad de M M P9, por lo que la presencia de la proteína de unión a MMP9- complejo de M MP9 indica que la muestra tiene la actividad de M MP9. 25
26. El método de la reivindicación 25, donde la proteína de unión a MMP9 comprende una región de VH tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NOs: 1 , 3, 5, 6, 7, 8, 34, 35, 36, y 46; y una región de VL tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en 5 las SEC ID NOs: 2, 4, 9, 10, 1 1 , 12, 37, 38, 39, 42, 43, 44, y 45.
27. U na proteína de unión a MMP9 comprende una región de VH que comprende una CDR con una secuencia de aminoácido de las SEC I D NOs: 34, 35, 36 y 47; y una región de VL que tiene una CDR con una secuencia de aminoácido seleccionada del ío grupo que consiste en las SEC I D NOs: 37, 38, 39, 42, 43, 44, y 48.
28. La proteína de unión a MM P9 de la reivindicación 27, donde la reglón de VH tiene un 95% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste 15 en las SEC ID NOs: 30, 32, 46, y 47; y la región de VL tiene un 95% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC I D NOs: 31 , 33, 41 , 45, y 48.
29. La proteína de unión a MMP9 de cualquiera de las 20 reivindicaciones 27-28, donde la región de VH tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NOs: 30, 32, 46, y 47; y la región de VL tiene la secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID NOs: 31 , 33, 41 , 45, y 48. 25
30. Un método para inhibir la actividad de MMP9 comprende: poner en contacto una muestra con la proteína de unión a MMP9 de cualquiera de las reivindicaciones 27-29.
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