MX2014009209A - Desactivacion microbiana de composicion explosivas. - Google Patents
Desactivacion microbiana de composicion explosivas.Info
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Abstract
Un método de desactivación de una composición de explosivo que está usándose en una operación de voladura, método que comprende exponer la composición de explosivo a un microorganismo que es autóctono con respecto al entorno en el que está usándose la composición de explosivo y que puede producir una enzima que degrada la composición de explosivo, en el que la composición de explosivo tiene asociado con la misma un agente de inducción química que promueve la producción de la enzima por el microorganismo.
Description
DESACTIVACIÓN MICROBIANA DE COMPOSICIÓN EXPLOSIVAS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método de desactivación de una composición de explosivo que está usándose en una operación de voladura con el fin de hacer que la composición de explosivo sea segura. La invención se basa en provocar o acelerar el metabolismo de una composición de explosivo mediante microorganismos que se producen de manera natural (prevalentes medioambientalmente) para producir sustancias que no son detonables. De este modo, la composición de explosivo se vuelve segura. Preferiblemente, las sustancias producidas son también menos dañinas desde una perspectiva medioambiental que la propia composición de explosivo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Se usan explosivos en un número significativo de operaciones de voladura comerciales, tales como minería, explotación de canteras y exploración sísmica. En minería y explotación de canteras, se usa normalmente un detonador para iniciar una carga iniciadora en cartucho que a su vez detona un explosivo a granel. En exploración sísmica, se inicia una carga explosiva en cartucho relativamente pequeña usando un detonador y las ondas de choque que se generan se monitorizan y analizan.
Cuando una carga explosiva no detona tal como se pretende, hay problemas de seguridad obvios. En ese caso, puede ser posible recuperar la carga, aunque esto no siempre es posible por una variedad de motivos. Por ejemplo, en aplicaciones de minería y exploración sísmica en las que se colocan y detonan cargas o trenes de cargas, la recuperación de cargas no detonadas
puede ser difícil, especialmente cuando la(s) carga(s) está(n) colocada(s) en un orificio de perforación subterráneo y el orificio de perforación se ha rellenado, como en la práctica común. Hay por tanto casos en los que las cargas no detonadas quedan sin recuperar en el campo. En tales casos, y como punto general, sería por tanto deseable hacer que cualquier carga explosiva no detonada y sin recuperar fuese segura. Existen ya una variedad de enfoques para abordar esta necesidad.
A modo de ejemplo, el documento US 3.948.177 describe un cartucho explosivo para voladura subacuática que se dice que es autodesarmante en el caso de un fallo subacuático. El cartucho comprende una cubierta cerrada que incluye un conducto interno. Se impide que el agua externa al cartucho fluya al interior del conducto mediante un sello estanco al agua. Sin embargo, la fuerza de una iniciación por impacto de percusión puede romper el sello estanco al agua permitiendo de ese modo que fluya agua al interior del conducto y entre en contacto con la composición de explosivo contenida. A su vez, el agua puede disolver el explosivo (nitrocarbonato) provocando también posiblemente que fluya fuera del cuerpo del cartucho. El resultado es una desensibilización. Aunque generalmente útil, un problema con este enfoque es que la desensibilización depende de alguna forma de fuerza específica asociada con un fallo para romper el sello estanco al agua. Si no hay fuerza aplicada resultante de un fallo, el cartucho no se desarmaría por la acción del agua.
Otros enfoques, tales como los descritos en el documento WO 97/19253 y WO 98/55822, se basan en el uso de microorganismos para efectuar biorremediación de una composición de explosivo en el caso de que la composición no detone tal como se pretende. Según estas descripciones se
incluyen microorganismos adecuados dentro de una composición de explosivo contenida en un dispositivo explosivo. En otras palabras, los microorganismos son intrínsecos al dispositivo. Sin embargo, tales enfoques no están libres de complejidades prácticas. Al ser de naturaleza biológica, es necesario tener cuidado para proporcionar el microorganismos en una forma que sea activa o que tenga potencial para ser activa, y es necesario tener cuidado para no destruir el microorganismo haciendo de ese modo que carezca de utilidad. También será necesario suministrar a los microorganismos nutrientes/metabolitos adecuados con el fin de sostenerlos cuando se requiera que sean activos. Los enfoques que usan microorganismos contenidos mediante diseño dentro de dispositivos explosivos también pueden conducir a una introducción no deseada o fuga de productos y/o microorganismos posiblemente exóticos en el medio ambiente. Por tanto, el uso de microorganismos en este contexto no está libre de problemas.
La presente invención busca proporcionar un enfoque alternativo para hacer que composiciones de explosivos sean seguras que no padezca las desventajas descritas anteriormente.
LA INVENCIÓN
Por consiguiente, en una realización, la presente invención proporciona un método de desactivación de una composición de explosivo que está usándose en una operación de voladura, método que comprende exponer la composición de explosivo a un microorganismo que es autóctono con respecto al entorno en el que está usándose la composición de explosivo y que puede producir una enzima que degrada la composición de explosivo, en el que la composición de explosivo tiene asociado con el mismo un agente de inducción química que promueve la producción de la enzima por el microorganismo.
La presente invención puede tener utilidad particular en relación con composiciones de explosivo proporcionadas en forma en cartucho. Por consiguiente, en una realización relacionada, la presente invención proporciona un método de desactivación de una composición de explosivo proporcionada en un cartucho explosivo, método que comprende exponer la composición de explosivo a un microorganismo que es autóctono con respecto al entorno en el que el cartucho explosivo está usándose y que puede producir una enzima que degrada la composición de explosivo, en el que el cartucho tiene asociado con el mismo un agente de inducción química que promueve la producción de la enzima por el microorganismo.
En la presente memoria descriptiva el agente de inducción química también se denomina "inductor".
La presente invención se basa en microorganismos para metabolizar composiciones de explosivo, haciendo de ese modo que las composiciones no sean detonables. Sin embargo, para que quede claro, la presente invención no implica la fabricación de un cartucho o composición de explosivo en el que se incluye un microorganismo activo adecuadamente en el cartucho o la composición de explosivo como parte del procedimiento de fabricación. Más bien, la presente invención se basa en un microorganismo que es autóctono (que se produce de manera natural) con respecto al entorno en el que está usándose la composición de explosivo y que puede estimularse para producir una enzima que degrada la composición de explosivo. El punto crucial de la invención es la asociación (provisión) con la composición de explosivo de un agente de inducción química que provoca que el microorganismo (autóctono) produzca esa enzima cuando el agente de inducción química y el microorganismo
entran en contacto entre sí. Al basarse en un microorganismo que se produce de manera natural en vez de un microorganismo "fabricado", pueden evitarse los problemas prácticos indicados anteriormente en relación con los documentos WO 97/19253 y WO 98/55822.
Es posible que la composición de explosivo, o un componente de la misma, puedan provocar que el microorganismo produzca la enzima relevante. Sin embargo, también para que quede claro, en la presente invención el agente de inducción química es una entidad distinta de la propia composición de explosivo.
En otra realización, la presente invención proporciona una composición de explosivo que comprende asociado con la misma un agente de inducción química que puede promover la producción de una enzima que degrada la composición de explosivo mediante un microorganismo que es autóctono con respecto al entorno en el que va a usarse la composición de explosivo.
En otra realización, la presente invención proporciona un cartucho explosivo que comprende una composición de explosivo, en la que el cartucho explosivo tiene asociado con el mismo un agente de inducción química que puede promover la producción de una enzima que degrada la composición de explosivo mediante un microorganismo que es autóctono con respecto al entorno en el que va a usarse el cartucho explosivo.
La presente invención puede implicar uno o más microorganismos autóctonos para producir una o más enzimas activas adecuadamente. Por simplicidad, a continuación, se hará referencia en singular al microorganismo y a la enzima.
La referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, ni debe considerarse como, un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que la técnica anterior forma parte del conocimiento general común en Australia.
A lo largo de toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderá que implican la inclusión de un número entero o etapa establecido o grupo de número enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Según la presente invención, la acción sobre la composición de explosivo de una enzima producida por un microorganismo autóctono es responsable de hacer que la composición de explosivo sea insensible a la detonación, es decir, segura. En el presente documento, a menos que resulte evidente otra cosa, cuando se indica que una composición de explosivo se vuelve insensible a la detonación significa que la composición de explosivo, mediante la acción de la enzima, se ha desensibilizado al menos hasta el grado que el método de iniciación normal (predeterminado) de la composición de explosivo ya no es eficaz. Por tanto, para una composición de explosivo que se sabe que va a detonarse usando un tipo particular de dispositivo de iniciación, según la presente invención la composición de explosivo (carga) se vuelve insensible a la detonación si ya no es posible que se inicie de ese modo. El hecho de que una composición de explosivo se haya vuelto insensible a la detonación no significa que la carga explosiva sea completamente no detonable (aunque esto es por
supuesto una posibilidad). Como mínimo, el grado de desensibilización efectuado por la enzima según la invención da como resultado que la composición de explosivo sea insensible al medio de iniciación que se pretendía por lo demás y originalmente que provocase la detonación de la composición de explosivo. En una realización de la presente invención, así como desactivar la composición de explosivo, la enzima convierte la composición de explosivo (o componentes de la misma) en uno o más compuestos que son más aceptables medioambientalmente.
Para que quede claro, la presente invención se refiere a la desactivación de una composición de explosivo que está usándose en una operación de voladura pero que no ha detonado tal como se pretendía, por cualquier motivo. Se apreciará que este contexto de desactivación de una composición de explosivo es diferente fundamentalmente de la remediación de una composición de explosivo que está presente en el entorno como contaminante, por ejemplo cuando ha habido una fuga o derrame no intencionado de una composición de explosivo. Tales composiciones de explosivo tienden a estar algo diluidas, mientras que las composiciones de explosivo que se usan en el contexto de voladura están más concentradas. Normalmente, cuando se usa en una operación de voladura, la composición de explosivo se proporcionará en un orificio de voladura. En este caso, la composición de explosivo puede estar presente como un producto a granel o envasado, o en forma de cartucho tal como se mencionó. Se usan comúnmente explosivos en cartucho en operaciones de voladura sísmicas.
Según la presente invención el inductor estimula a un microorganismo autóctono para producir una enzima que puede degradar la
composición de explosivo, por ejemplo presente en un cartucho explosivo. El inductor puede provocar que el organismo produzca la enzima y en este caso la enzima no se producirá en ausencia del inductor. En una realización alternativa el microorganismo ya produce la enzima y el inductor estimula la producción aumentada y/o prolongada de la enzima con el fin de lograr la degradación de la composición de explosivo.
Fundamental para la presente invención es el uso de una combinación adecuada de inductor(es) y microorganismo (autóctono). Puede ser necesario seleccionar el/los inductor(es) que se usa(n) basándose en el microorganismo que existe en el entorno en la ubicación en la que va a implementarse la invención, y basándose en la actividad de ese microorganismo con respecto a su capacidad para producir una enzima degradante de explosivos. Alternativamente, la invención puede implementarse usando un inductor de amplio espectro, o combinación de inductores, que tendrán la utilidad requerida con respecto a microorganismos que se encuentran en un entorno particular. Este último enfoque puede ser más sencillo de implementar y evita la necesidad de adaptar el inductor cada vez basándose en el sitio de uso previsto de la invención.
Es probable que un experto en la técnica esté familiarizado con el tipo de microorganismos encontrados comúnmente en el entorno y con su potencial para expresar enzimas relevantes. Dicho esto, un experto en la técnica también sería capaz de identificar microorganismos que existen en una ubicación particular y evaluar su utilidad en el contexto de la presente invención.
Los ejemplos de microorganismos que tienden a encontrarse en el entorno y que producen enzimas que son potencialmente útiles en la degradación
de explosivos incluyen Pseudomonas spp., Escherichia coli, Morganella morganii, Rhodococcus spp., Comamanos spp., Agrobacterium radiobacter, Enterobacter cloacae, Agrobacterium tumifaciens, Klebsiella pneumonía, Gibberella moniliformis y bacterias desnitrificantes. Los microorganismos de Pseudomonas spp. adecuados incluyen microorganismos en el grupo aeruginosa, fluorescens, acidovorans, mendocina y cepacia.
Por supuesto, diferentes microorganismos serán propensos a producir diferentes enzimas degradantes de explosivos. Sin embargo, a modo de ejemplo, las enzimas adecuadas pueden incluir antigua enzima amarilla (OYE), oxidoreductasas, GTN reductasas, nitroreductasas (tales como NfsA) y N-etilmaleimida (NEM) reductasas.
El inductor puede ser cualquier compuesto que promueva que el microorganismo relevante produzca (exprese), o aumente su producción (regulación) de, una enzima degradante de explosivos. El inductor también debe ser uno que puede asociarse de manera conveniente y útil con un cartucho explosivo según la invención.
En una realización de la invención el inductor es un aceptor de Michael. La reacción de Michael implica la adición de un nucleófilo (donador de Michael) a un compuesto a,ß -insaturado (aceptor de Michael). Se sabe que este último da como resultado el agotamiento de grupos sulfhidrilo celulares, y esto puede desencadenar un aumento en la expresión génica de enzimas relevantes. Por ejemplo, se sabe que aceptores de la reacción de Michael tales como menadiona (precursor de vitamina K) y maleato de dimetilo regulan por incremento la expresión de NEM reductasa en E. coli (Miura et al., 1997). Los ejemplos adicionales incluyen N-etilmaleimida, fumarato de dimetilo, maleato de
dietilo y terc-butil-hidroquinona.
También se sabe que los aceptores de la reacción de Michael inducen enzimas de detoxificación de mamíferos, tales como quinona reductasa, posiblemente mediante el mismo mecanismo de agotamiento de los depósitos de sulfhidrilo celular (Dinkova-Kostova et al., 1998; Dinkova-Kostova et al., 2001). Estos compuestos (por ejemplo 3-hidroxicumarina, ácido o-cumárico y trans-4-fenil-3-buten-2-ona) también pueden ser posibles inductores de enzimas de tipo OYE que pueden degradar explosivos. La enzima de E. coli NADH-quinona reductasa también se induce por aceptores de la reacción de Michael, que pueden tener potencialmente reactividad cruzada con explosivos (Unemoto et al., 1992). Los ejemplos también identifican combinaciones de inductor y microorganismo que pueden ser adecuadas para su uso en la práctica de la presente invención.
En una realización preferida el inductor es un aceptor de Michael (es decir un compuesto de carbonilo a,ß -insaturado) y esto provoca que el microorganismo exprese una enzima oxidorreductasa que puede degradar explosivos.
Deben tenerse en cuenta una variedad de factores cuando se selecciona el inductor que va a usarse y la cantidad de ese inductor. Por ejemplo, el inductor debe ser adecuadamente estable (y por tanto activo con respecto a un microorganismo correspondiente) en las condiciones prevalentes de uso previsto.
Además, el inductor debe ser estable con respecto a otros reactivos con los que en el uso se requerirá que entre en contacto, por ejemplo agua y/o la propia composición de explosivo.
La cantidad (tasa de dosificación) del inductor debe ser lo
suficientemente alta como para provocar la respuesta deseada en el microorganismo relevante, pero no tan alta que el inductor inhiba el crecimiento del microorganismo. Si el inductor se transporta por el agua, también es necesario tener en cuenta los efectos de la dilución.
También puede ser necesario considerar la duración de la eficacia del inductor. Si el inductor es eficaz durante sólo un corto periodo, esto puede ser inadecuado para lograr el grado de degradación del explosivo que es necesario. El régimen de dosificación y/o la manera en la que el inductor se proporciona puede ser relevante para esta cuestión.
También puede ser necesaria en asociación con el cartucho explosivo una fuente de nutrientes adecuada para apoyar el crecimiento del microorganismo y la expresión de la enzima degradante de explosivos. Puede(n) incluirse nutriente(s) adecuado(s) en las paredes del cartucho explosivo. Por ejemplo, el cartucho puede estar formado por un polímero a base de almidón que promueve el crecimiento del microorganismo. Adicional o alternativamente, podría incluirse una fuente de hidratos de carbono (por ejemplo glucosa) u otros nutrientes (por ejemplo extracto de levadura) dentro de la composición de explosivo (por ejemplo Pentolite). Sin embargo tales especies pueden ser fácilmente solubles, y son propensas a lixiviarse, y puede ser necesario tener esto en cuenta.
Es deseable apoyar el crecimiento del microorganismo ya que aumentará la población y conducirá a un aumento de la tasa de expresión de la enzima relevante. Esto puede proporcionar además una liberación controlada de la enzima proporcional a la actividad del microorganismo.
Puede ser particularmente deseable fomentar el crecimiento del
microorganismo en o inmediatamente adyacente a la composición de explosivo.
Según la presente invención en el caso en el que una composición de explosivo de la invención no detone tal como se pretendía, el inductor asociado con la composición de explosivo estimula a un microorganismo autóctono para producir, o aumentar su producción de, una enzima que degradará la composición de explosivo. Para realizar esto, la enzima debe entrar en contacto con la composición de explosivo. Esto puede producirse simplemente en virtud de que la composición de explosivo está presente en una ubicación en la que el microorganismo está presente. Por ejemplo, cuando la composición de explosivo es un explosivo a granel cargado en un orificio de voladura, el/los microorganismo(s) relevante(s) también puede(n) estar presente(s) en el orificio de voladura, tal como en el agua presente en el orificio de voladura o en el suelo a través de que se extiende el orificio de voladura. Cuando la composición de explosivo está presente en un cartucho este requisito puede tener implicaciones con respecto al diseño del cartucho explosivo y la manera en la que el inductor está asociado con el cartucho explosivo.
En una realización de la invención el inductor puede proporcionarse en la composición de explosivo como un componente distinto, por ejemplo en forma de partículas, aglomerados, gránulos, o similares. Sin embargo es importante que cuando se proporciona en la composición de explosivo de esta manera el inductor no interfiera con la función prevista y el rendimiento de la composición de explosivo. El inductor puede encapsularse para impedir tal interacción adversa.
Para que la invención sea eficaz, un microorganismo autóctono debe entrar en contacto con el inductor presente en la composición de explosivo.
En el caso de un explosivo a granel proporcionado en un orificio de voladura esto puede producirse inevitablemente. En el caso de un cartucho explosivo, de manera conveniente, el microorganismo puede transportarse al cartucho explosivo mediante el agua presente en el entorno. En este caso el cartucho se diseñará para permitir el ingreso de agua. Diversas posibilidades de diseño pueden permitir esto, tal como se explicará a continuación.
El cartucho explosivo puede incluir una o más entradas (aberturas) y/o rutas degradables con agua para permitir que el agua del entorno fluya al interior del cartucho y entre en contacto directamente con la composición de explosivo y el inductor proporcionado en la composición de explosivo. La composición de explosivo puede incluir por sí misma canales para permitir que el agua se desplace a su través y entre en contacto con el inductor. Los canales pueden formarse artificialmente en la composición de explosivo y/o pueden producirse de manera natural dada la naturaleza de la composición de explosivo y la manera en la que la composición de explosivo se carga en el cartucho explosivo. Con respecto a este último caso, si la composición de explosivo se carga en un cartucho vacío por encima del punto de fusión de la composición y entonces se permite que se solidifique posteriormente, puede formarse una red de grietas y fisuras en la composición de explosivo solidificada. El agua puede migrar a través de estas grietas y fisuras.
En una realización el cartucho puede incluir una cubierta externa (membrana) permeable al agua o degradable con agua que rodea la composición de explosivo, posiblemente con canales o pasos que se extienden en la composición de explosivo. En el uso, el agua permea o degrada la cubierta (y canales/pasos cuando están presentes) permitiendo de ese modo que el agua y
el microorganismo entren en contacto con el inductor en la composición de explosivo.
En otra realización relacionada el cartucho puede incluir una cubierta y opcionalmente canales/pasos formados por un material que se disolverá mediante el agua y/o se consumirá por microorganismos presentes en el entorno en el que se usa el cartucho.
En estas realizaciones el tiempo que le lleva al microorganismo entrar en contacto con el inductor y la velocidad a la que el microorganismo actúa sobre la composición de explosivo tal como se desea (en condiciones de uso prevalentes) es tal que la desactivación del cartucho no se logrará hasta que haya pasado una cantidad de tiempo predeterminada, antes del cual, el cartucho se habría detonado normalmente.
Adicional o alternativamente, el inductor puede proporcionarse en o sobre (como un recubrimiento, por ejemplo) una o más paredes externas del cartucho. En este caso la pared estará habitualmente en contacto directo con la composición de explosivo y será necesario que sea permeable al agua, degradable con agua o soluble en agua. En esta realización el agua que contiene un microorganismo abrirá una brecha en la/las pared(es) del cartucho y al hacer eso el microorganismo y el inductor se pondrán en contacto entre sí. En esta realización la composición de explosivo puede estar alojada en una cámara (cubierta) cuyas paredes externas están formadas por un cartón permeable al agua o material a base de plástico degradable con agua o soluble en agua. En este caso el agua también puede transportar el microorganismo para que entre en contacto con la composición de explosivo, y la composición puede estar adaptada para permitir que el agua penetre fácilmente, tal como se describió.
En otra realización, el inductor puede proporcionarse en una cámara (compartimento) separado de la composición de explosivo. En el uso, se pretende que el agua penetre en la cámara poniendo de ese modo un microorganismo autóctono en contacto con el inductor. El microorganismo activado se drena entonces fuera de la cámara y entra en contacto con la composición de explosivo. El microorganismo activado también puede hacerse salir de la cámara mediante agua adicional que ha entrado en el cartucho. El cartucho explosivo y sus componentes están diseñados para facilitar esta realización.
El cartucho puede estar constituido por componentes independientes que están adaptados para estar unidos entre sí cuando el cartucho está cargándose con los componentes respectivos y cuando se usa en el campo. A modo de ejemplo, la composición de explosivo puede proporcionarse en una cámara que está adaptada para sujetarse a otro componente que comprende una cámara para el inductor. La cámara para el inductor puede ser de construcción de una única pieza, por ejemplo formada por moldeo por inyección de un material plástico adecuado, e incluye al menos un canal que recibe el detonador como parte de la construcción. La cámara para el inductor puede proporcionarse como parte de un cabezal o pieza de cierre para la cámara que aloja la composición de explosivo. Los componentes individuales pueden unirse entre sí mediante cualquier mecanismo adecuado, tal como ajuste entre piezas (fricción), roscado de rosca macho-hembra o ajuste mediante abrazaderas. En este caso la composición de explosivo puede cargarse en la cámara respectiva y sujetarse el cierre a la parte superior de la cámara de composición de explosivo. Si la composición de explosivo es un fluido, la unión debe ser tal que se evite la
pérdida de composición de explosivo. Sin embargo, si la composición de explosivo es de naturaleza sólida, por ejemplo cuando la composición de explosivo se cuela en caliente y se permite que solidifique, la unión debe ser de un ajuste holgado, y esto puede ser beneficioso en cuanto a permitir que entre agua en el cartucho, tal como se explicará. El cabezal (pieza de cierre) también incluirá generalmente un cierre/sello sobre su extremo abierto, y esto también puede permitir que entre agua en el cartucho.
Como alternativa adicional, en vez de basarse en cámaras separadas que están formadas integralmente como partes de la estructura del cartucho, el inductor y/o la composición de explosivo pueden proporcionarse en recipientes independientes que se insertan en un cuerpo de cartucho rígido. En este caso se apreciará que el cartucho está constituido por al menos dos partes independientes y que en el uso el cartucho se ensambla a partir de estas partes.
De nuevo, sin embargo, el ingreso de agua es importante para que el microorganismo relevante entre en contacto con el inductor.
Pueden usarse combinaciones de estos diversos enfoques.
La composición de explosivo usada en el cartucho explosivo de la invención es de naturaleza convencional y se seleccionará basándose en su capacidad para desensibilizarse por el agente o agentes de desactivación que van a usarse. Los ejemplos de materiales explosivos que pueden considerarse para su uso en la presente invención incluyen nitroglicerina (NG), trinitrotolueno (TNT), tetranitrato de pentaeritritol (PETN), ciclotrimetilentrinitramina (RDX) y ciclotetrametilentetranitramina (HMX). La composición de explosivo puede ser un explosivo en emulsión, un explosivo en gel acuoso o un ANFO u otra composición a base de nitrato. También pueden usarse otros explosivos menos
convencionales tales como composiciones líquidas o en gel que son acuosas o no acuosas y que contienen posiblemente otros componentes explosivos tales como percloratos. También pueden usarse combinaciones de materiales explosivos. Por ejemplo, la composición de explosivo puede ser Pentolite, una mezcla de PETN y TNT. La composición de explosivo también puede contener otros explosivos y/o componentes reactivos, tales como RDX y partículas metálicas (por ejemplo aluminio).
En una realización de la presente invención la composición de explosivo puede ser una emulsión de agua en aceite. Las composiciones de explosivo en emulsión incluyen normalmente una fase discontinua que comprende una disolución acuosa supersaturada de una sal oxidante (habitualmente nitrato de amonio) dispersada en una fase de aceite (combustible) continua. Tales emulsiones se forman habitualmente mezclando los componentes en presencia de un emulsionante adecuado. En el contexto de composiciones de explosivo en emulsión, la enzima puede ser capaz de romper o volver inestable la emulsión, provocando de ese modo que sea insensible a la detonación. La enzima puede tener el efecto de provocar la cristalización del componente de emulsión supersaturada (la sal oxidante en el tipo de emulsiones descritas). Por consiguiente, un experto en la técnica puede seleccionar reactivos adecuados para su uso como inductor/microorganismo/enzima, al menos para el examen inicial, basándose en un conocimiento general de la química de emulsión y de reactivos que se sabe que provocan cristalización no deseada de composiciones de explosivo en emulsión (supersaturadas).
Él/los material(es) usado(s) para formar el cartucho de la invención no debe(n) corroerse por o ser reactivo(s) hacia la formulación de inductor
empleada y la composición de explosivo que va a contenerse. Por tanto, el cartucho conservará su integridad estructural.
Con respecto al uso de un detonador, el cartucho se adapta habitualmente para recibir el detonador en un paso conformado adecuadamente que se extiende axialmente en el interior del cuerpo del cartucho. El cartucho puede adaptarse para recibir un único detonador o más de un detonador en pasos conformados adecuadamente, respectivos. A este respecto debe entenderse que los cartuchos explosivos para su uso en exploración sísmica, por ejemplo, permiten generalmente la inclusión de dos detonadores, un detonador principal y un detonador secundario (de apoyo) en caso de que el detonador principal no detone como se pretendía.
En determinadas realizaciones descritas, el inductor y el microorganismo autóctono entrarán en contacto entre sí en seguida. En este caso el microorganismo puede producir una enzima que comenzará a actuar sobre la composición de explosivo inmediatamente. Sin embargo, en tales realizaciones, para que la composición de explosivo tenga un periodo de utilidad, es importante que la enzima no vuelva la composición de explosivo insensible a la detonación, o reduzca significativamente el rendimiento energético de la composición de explosivo, inmediatamente. Si lo hace, la composición de explosivo carecería de utilidad, o sería de poco uso práctico. En su lugar se pretende que la enzima desensibilice la composición de explosivo tras un periodo de tiempo adecuado y por esto quiere decirse un periodo de tiempo tras el que la detonación debe de haberse producido por lo demás. Por tanto, incluso tras la producción de la enzima, puede ser necesario que la composición de explosivo permanezca completamente detonable (sin verse afectado el rendimiento energético de la
composición de explosivo o sin verse afectado sustancialmente) durante un periodo predeterminado. Ese periodo puede variar de aplicación a aplicación. Por ejemplo, cuando la composición de explosivo es un explosivo a granel, tal como un explosivo en emulsión, el periodo puede ser desde dos semanas hasta un mes. Sin embargo, cuando la composición de explosivo se proporciona en un cartucho explosivo (tal como es el caso para aplicaciones sísmicas) el periodo puede ser sustancialmente más largo, por ejemplo de al menos aproximadamente tres meses y posiblemente tan largo como un año, dependiendo de consideraciones prácticas en relación con ese contexto de uso.
La cinética de reacción asociada con la enzima y la composición de explosivo dictará la velocidad a la que se desensibiliza la composición de explosivo. En tales realizaciones para lograr un producto útil la reacción es relativamente lenta de modo que la transición entre que la composición de explosivo pueda detonarse y no pueda detonarse será relativamente larga.
La presente invención tiene utilidad particular en aplicaciones de prospección sísmica y en este caso el cartucho explosivo toma la forma de una carga sísmica. Un experto en la técnica estará familiarizado con el tipo de explosivos en este contexto.
En una realización de la invención la composición de explosivo también puede tener asociado con la misma un reactivo (por ejemplo un tensioactivo) que desestabiliza o solubiliza al menos parte de la composición de explosivo. Se cree que esto puede potenciar la actividad de desactivación de la enzima. El tensioactivo puede proporcionarse en la composición de explosivo o puede proporcionarse por separado, por ejemplo en un recipiente separado liberándose el tensioactivo a un tiempo apropiado. En esta realización
obviamente es importante que el tensioactivo no interfiera con la funcionalidad prevista de la composición como explosivo. De nuevo, se pretende que la composición de explosivo mantenga la funcionalidad durante un periodo de tiempo en el que el uso normal debe haber tenido lugar en el transcurso normal de los acontecimientos. El tensioactivo puede ser no iónico, iónico o zwitteriónico (anfótero). La eficacia de un tensioactivo dado puede evaluarse mediante experimentos. Los ejemplos de tensioactivos que pueden usarse incluyen Brij-35 (o Brij L23), Tween 20/Tween 80, Tritón X100, Nonidet P-40 e IGEPAL CA-630 (octilfenoxipolietoxietanol), Genapol X-080, Petro® AG (alquilnaftalenosulfonato de sodio), SDS (dodecilsulfato de sodio), estearato de sodio, CHAPS (3-[(3-colamidopropil)dimetilammonio]-1-propanosulfonato), CAPB (cocamidopropilbetaína)/cocamidopropilhidrox¡sultaína (CAHS) y lecitina (L-D-fosfatidilcolina).
Las realizaciones de la presente invención se ilustran en las figuras no limitativas adjuntas, en las que:
La figura 1 muestra una sección transversal de un cartucho explosivo según la presente invención;
Las figuras 2 y 3 son vistas en perspectiva de cartuchos explosivos según la presente invención;
La figura 4 es una sección transversal de un cartucho de explosivos según la presente invención; y
Las figuras 5 y 6 son vistas en perspectiva que muestran un componente del cartucho de explosivos representado en la figura 3.
Las figuras 7 a 21 ilustran los resultados obtenidos en los ejemplos. La figura 1 ilustra un cartucho (A) explosivo que podría usarse como iniciador de
Pentolite degradable. El cartucho incluye una composición (B) de explosivo tal como Pentolite rodeada por una carcasa (C) de cubierta formada por un polímero degradable. La carcasa (C) puede incluir un inductor adecuado basándose en los microorganismos que estarán presentes en el entorno en el que el cartucho (A) va a usarse. El cartucho (A) también incluye una cavidad (D) que se extiende dentro de la composición (B) de explosivos. La composición (B) de explosivo puede incluir hidratos de carbonos u otros nutrientes para promover el crecimiento de microorganismos relevantes. Existe una variedad de posibilidades en relación a cómo se proporciona el inductor.
1. El inductor podría proporcionarse dentro de la composición (B) de explosivos, por ejemplo como perlas o gránulos. En este caso normalmente el agua transportará un microorganismo autóctono para que entre en contacto con el inductor/la composición de explosivo. A este respecto, la carcasa (C) puede estar provista de aberturas y/o puede estar formada por material permeable al agua, degradable con agua o soluble en agua. El agua también puede penetrar en la cavidad (D) y entrar en contacto con el inductor/la composición de explosivo por esa vía. Las paredes y el suelo de la cavidad pueden incluir una o más aberturas y/o estar formados por un material permeable al agua, degradable con agua o soluble en agua. La composición (B) de explosivo también puede incluir fisuras y/o estructuras permeables al agua para permitir un acceso fácil del agua a través de toda la composición.
2. El inductor podría proporcionarse en la cavidad (D). El agua puede entrar en la cavidad (D) a través de aberturas en el cierre del cartucho (no mostrado). La cavidad (D) puede tener las características de diseño indicadas en 1 anterior.
3. El inductor puede proporcionarse en y/o sobre (como recubrimiento sobre) la carcasa (C), o una parte de la carcasa (C). La carcasa(C) puede degradarse con o ser permeable al agua. Alternativamente, la carcasa (C) puede digerirse por un microorganismo autóctono. En cualquier realización el microorganismo entrará en contacto con el inductor y hará una brecha en la carcasa (C) permitiendo de ese modo que la enzima degradante de explosivos producida por el microorganismo entre en contacto con la composición de explosivo.
También puede emplearse una combinación de las realizaciones , 2 y 3.
La figura 2 muestra un cartucho (1) explosivo útil en la implementación de la invención. El cartucho (1) incluye la composición (11) de explosivo que normalmente está en una forma sólida (colada), tal como Pentolite (normalmente una mezcla de PETN/TNT y/o RDX). La composición (11) de explosivo incluye canales (6) que reciben el detonador que permiten que el cartucho se inicie por detonadores de diferentes tamaños (diámetro). El cartucho (1) incluye una cubierta (12) externa que está compuesta por un material permeable al agua, soluble en agua o degradable con agua. En el campo, el agua del entorno permeará o degradará por tanto la cubierta. La cubierta (12) también define pasos (13) que se extienden en el interior de la composición (11) de explosivo. El uso de esta configuración y el tipo de cubierta permite que el agua del entorno entre en contacto con la composición (11) de explosivo, y por tanto es útil en realizaciones de la invención en las que esto se pretende/requiere. El inductor puede proporcionarse en la composición (11) de explosivo y/o en o sobre la cubierta (12).
La figura 3 muestra otra forma de un cartucho (1 ) explosivo útil en la implementación de la invención. El cartucho (1) incluye una composición (1 1 ) de explosivo, tal como un explosivo de Pentolite colado, rodeado por una cubierta (12). La cubierta (12) es permeable al agua, soluble en agua o degradable con agua, tal como para la cubierta indicada en la figura 2. En la figura 3, la cubierta (12) incluye elementos (14) radiales que se extienden en el interior de la masa de la composición de explosivo. La intención en este caso es que cuando el cartucho (1) entre en contacto con el agua, se abra una brecha en la cubierta (12) de manera que se transporte el agua para que entre en contacto con y a través de la composición de explosivo, tal como requieren determinadas realizaciones de la invención descritas en el presente documento. La velocidad a la que se abre brecha en la cubierta (12) puede controlarse mediante la selección adecuada del material usado para formar la cubierta (12). De nuevo, el inductor puede proporcionarse en la composición (11) de explosivo y/o en o sobre la cubierta (12) y/o en o sobre los elementos (14) radiales.
La figura 4 muestra un cartucho (1 ) explosivo que es una variante del mostrado en la figura 1. En la figura 4 el cartucho (1) explosivo es adecuado para su uso en exploración sísmica. El cartucho (1 ) incluye una composición (a) de explosivo y un inductor (b) en cámaras (2, 3) respectivas. La cámara para la composición (a) de explosivo está en forma de una cubierta cilindrica que comprende partes (2') de pared selladas por una base (2"). La composición (a) de explosivo puede ser Pentolite, posiblemente en mezcla con RDX y/o partículas de aluminio.
La composición (a) de explosivo y el inductor (b) están separados en sus cámaras respectivas por una placa (14) de base que se ajusta de manera
holgada en el extremo inferior de la cámara (3) para el inductor (b). La placa (14) puede estar formada por cualquier material adecuado tal como un poliéster o un policarbonato. Dicho esto, dependiendo de la naturaleza del inductor y la composición de explosivo puede ser posible dispensarlos con la placa (14) todo junto.
El cartucho (1) también incluye dos canales (5') que reciben el detonador que se extienden en el interior de la composición (a) de explosivo. El cartucho (1) también incluye una tapa (15) en un extremo. Esta tapa (15) está dimensionada y conformada para ajustarse, por ejemplo mediante ajuste entre piezas, en la cubierta que aloja la composición de explosivo.
En la práctica el cartucho (1) puede proporcionarse como componentes separados que se ensamblan durante la carga de los componentes respectivos y cuando se usa en el campo. Con respecto a la figura 4, un componente puede estar formado integralmente (mediante moldeo por inyección de un material plástico) para incluir y definir la tapa (15), los canales (5') que reciben el detonador y la cámara (3) para el inductor (b) tal como se ¡lustra en las figuras 5 y 6. La placa (14) de base y la cámara/cubierta (2) para la composición (a) de explosivo son componentes separados. La cámara (2) está constituida por un tubo cilindrico que comprende partes (2') de pared y una base (2") que está unida a un extremo inferior del tubo sellándolo de ese modo.
Las figuras 5 y 6 ilustran determinados componentes mostrados en la figura 4. Por tanto, las figuras 5 y 6 muestran la tapa (15), los canales (5') que reciben el detonador y la cámara (3) para el inductor formado como una construcción de una pieza, por ejemplo mediante moldeo por inyección de un material de plástico adecuado. La cámara (3) para el inductor se sella mediante
una placa (14) separada. La tapa (15) comprende una parte (15a) de pared circular con un borde (15b) que permite que la tapa (15) se sujete (mediante ajuste entre piezas) para dar una cámara dimensionada y conformada adecuadamente en la que se proporciona una composición de explosivo (no mostrado en las figuras 5 y 6). La tapa (15) se inserta normalmente en el interior de una formación de tubo. Las partes (2' en la figura 4) de pared se extienden por encima y por debajo de la tapa (15) una vez insertada y están adaptadas para permitir la unión de otros cartuchos o un cono de morro, por ejemplo mediante ajuste por rosca. La superficie interna de la parte (2') de pared puede incluir un saliente o pestaña para enganchar el borde (15b) de modo que se mantenga la tapa (15) en posición. El extremo superior de la tapa (15) está abierto para permitir la inserción de al menos un detonador en el interior de los canales (5') que reciben el detonador respectivos. El extremo abierto de la tapa (15c) puede sellarse con un borde (no mostrado) dimensionado y conformado adecuadamente o formarse en un procedimiento de moldeo por inyección. La tapa (15) y/o las partes (2' en la figura 4) de pared pueden incluir aberturas para permitir que el agua entre en el cartucho explosivo. Tal como se indica la parte (2' en la figura 4) de pared que se extiende por encima de la posición de la tapa (15) puede recibir el extremo inferior de otro cartucho explosivo para formar un tren de cartuchos. A este respecto puede enroscarse una superficie de la parte (2' en la figura 4) de pared para encajar con las roscas correspondientes dispuestas sobre la superficie externa y en la base de otro cartucho. Los cartuchos también pueden acoplarse mediante ajuste entre piezas o mediante abrazaderas de pinza. La tapa (15) puede incluir aberturas o ranuras (no mostrado) en la pared lateral de la misma que se extienden a través de la parte (15a) de pared circular y el borde
(15b) a través del cual pueden pasarse los cables del detonador tras una carga del detonador.
La realización ilustrada en las figuras 4-6 puede implementarse tal como sigue. En la orientación mostrada en la figura 6 se retira la placa (14) y se inserta el inductor en la cámara (3). Entonces vuelve a colocarse la placa (14) sellando de ese modo la cámara (3). El sello es holgado en el sentido de que la cámara (3) no es estanca a los líquidos. Todavía en la orientación mostrada en la figura 6, se inserta un tubo cilindrico que define las partes (2') de pared de la cámara (2) para la composición (a) de explosivo sobre la tapa (15) manteniéndose la tapa (15) en su lugar mediante ajuste entre piezas entre la parte (2') de pared y el borde (15b) de tapa.
Entonces puede verterse una composición de explosivo, tal como Pentolite, en el interior del extremo abierto del tubo, rodeando de ese modo la cámara (3) y los canales (5') que reciben el detonador. Si se usa Pentolite se cuela por encima de su punto de fusión y se permite que solidifique. La solidificación puede dar como resultado la formación de grietas y fisuras que se extienden a través de la masa de la composición de explosivo. Esto puede ser deseable ya que tales grietas y fisuras permiten que el agua se desplace a través de la composición de explosivo, tal como puede desearse. Una vez se ha llenado el tubo adecuadamente con composición de explosivo, y la composición se ha solidificado tal como puede ser necesario, se une una base (2") al extremo abierto del tubo. La base (2") y las partes (2') de pared pueden formar un sello mediante ajuste entre piezas, roscado de rosca macho-hembra o mediante sujeción con abrazaderas.
En el uso el componente así formado se carga con uno o más
detonadores con haciéndose pasar los cables del detonador fuera de la tapa (15) o la parte superior de las partes (2') de pared tal como se indica. El extremo superior de la tapa (15) puede sellarse por sí mismo usando un cierre compuesto por material degradable con agua (no mostrado).
En la realización descrita se pretende que el inductor (b) entre en contacto con microorganismos que se transportan por el agua que entra en la cámara (3) alrededor de los límites de la placa (14). La placa puede incluir adicional o alternativamente aberturas para permitir la entrada de agua en la cámara (3). Adicional o alternativamente, las partes de pared de la cámara (3) también pueden incluir estructuras para permitir que el agua entre en la cámara (3) (la propia cámara (3) puede estar compuesta por material degradable con agua para facilitar el ingreso de agua). El inductor promueve la producción de enzima degradante de explosivos y entonces ésta entra en contacto con la composición de explosivo mediante la misma (u otra) vía a través de la cual entró el agua en la cámara (3).
El agua puede encontrar su camino al interior de la cámara (3) en una o una combinación de más de una manera, tal como sigue.
Cuando los componentes respectivos se unen entre sí, por ejemplo las partes (2') de pared que forman la cámara (2) y la tapa (15) o las partes (2') de pared y la base (2"), la unión puede permitir el ingreso de agua. En este caso el agua entraría en la cámara (3) alrededor de la placa (14) por migración a través de la masa de la composición de explosivo. Por tanto, la composición debe permitir el transporte de agua mediante la presencia de estructuras de transporte de agua artificial y/o intrínseca.
Adicional o alternativamente, el agua puede entrar en la
composición de explosivo a través de las paredes (2') y/o la base (2") de la cámara (2). Uno o ambos de estos componentes pueden incluir canales/aberturas para permitir la entrada de agua y/o uno o ambos pueden ser permeables al agua o degradables con agua. La configuración exacta dependerá de la forma de, y por tanto de las necesidades de contención, de la composición de explosivo.
Adicional o alternativamente, el agua puede entrar en la cámara (3) por medio de la tapa (15). Por tanto, la tapa (15) puede incluir canales/aberturas que se extiende a través de la tapa (15) y en el interior de la cámara (3), por ejemplo a través de una abertura entre la superficie (15c) interior y la cámara (3). La propia abertura puede estar sellada por un material soluble en agua, permeable al agua o degradable con agua. El agua puede entrar en la tapa (15) a través de sellos de ajuste holgado (entre la capa (15) y el cierre de tapa o entre la parte (2') de pared y un cartucho adyacente cuando se ensambla un tren de múltiples cartuchos). Las aberturas/ranuras para los cables del detonador también pueden permitir que el agua entre en la tapa. Las aberturas/ranuras en la parte superior de las partes (2') de pared también pueden permitir el ingreso de agua.
Uno o más componentes del cartucho pueden degradarse con agua, y la capacidad de degradación puede ser selectiva con el fin de proporcionar un control potenciado con respecto a la desactivación pretendida de la composición de explosivo.
Se ilustran realizaciones de la presente invención en los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1
Inducción de actividad degradante de nitroglicerina en Escherichia coli DH5a
Se inoculó al 10% v/v (1 mi en 9 mi) un cultivo durante la noche de Escherichia coli DH5a hecho crecer a 30°C con agitación a 200 rpm en caldo Luria en el mismo medio que contenía diversos compuestos de prueba y se incubó durante 24 h adicionales. Los compuestos inductores sometidos a prueba fueron N-etilmaleimida (NEM) 0.25 mM, menadiona (MD) 0.25 mM, fumarato de dimetilo (DMFU) 1 mM, maleato de dietilo (DEME) 4 mM, malonato de dietilo (DEMO) 4 mM, malonato de dimetilo (DMMO) 4 mM, trinitrato de glicerol (GTN) 0.5 mM, tetranitrato de pentaeritritol (PETN) 0.5 mM y trinitrotolueno (TNT) 0.5 mM. Se incluyeron controles sin compuesto de prueba y los medios también contenían hasta un 1% v/v de etanol a partir de las disoluciones madre de inductor, que no afectó al crecimiento o a la expresión enzimática (o acetona en el caso de PETN y TNT). Se recogieron las células mediante centrifugación (3220 x g, 15 min, 4°C), se lavaron en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Se resuspendieron los sedimentos en 1.5 mi de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, Tritón X-100 al 0.5%) y se sonicaron durante 3 pulsos de 15 s a un 35% de potencia con un descanso de 30 s entre pulsos usando un sonificador digital Branson. Tras la incubación en hielo durante al menos 1 h, se clarificaron los lisados mediante centrifugación (16.100 x g, 5 min, 22°C) y se usó el sobrenadante para ensayos enzimáticos.
Se determinó la actividad enzimática de extractos libres de células midiendo la formación de nitrito a partir de nitroglicerina 0.2 mM y NADPH 0.2 mM en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 a temperatura ambiente. Se terminaron
los ensayos a diversos puntos de tiempo mediante la adición de metosulfato de fenazina 0.2 mM y ferricianuro 0.5 mM. Se determinó la concentración de nitrito mezclando 100 µ? de muestra con 900 µ? de reactivo de nitrito 10 mg/ml (Sigma, n.° de cat. 37410) y midiendo la absorbencia a 530 nm tras 10 minutos. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 µ?t??? de nitrito por min a partir de nitroglicerina a temperatura ambiente (~22°C) y se expresó por gramo de proteína. Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se muestran los resultados en la figura 7 y la tabla a continuación, que muestra claramente un aumento en la actividad degradante de nitroglicerina cuando se expone E. coli DH5 a a MD, DMFU y DEME con aumentos de 3.5, 12 y 22 veces respectivamente en relación con el control. Los aceptores distintos de Michael similares estructu raímente DEMO y DMMO no provocaron ninguna respuesta significativa ni los compuestos explosivos GTN o PETN. Se indujo actividad ligeramente por TNT, sin embargo este resultado no es concluyente ya que la actividad específica del control en la segunda preparación era significativamente menor que para la primera preparación, lo que indica un grado de variación natural entre muestras.
Compuesto químico U/g Inducción en veces
control 3~ i
NEM 3.7 1.1
MD 11 3.5
DMFU 38 12
DEME 72 22
DEMO 4.5 1.4
DMMO 1.0
control 1.0
GTN 0.5
PETN 0.3
TNT 4.2
Ejemplo 2
Inducción de actividad degradante de nitroglicerina en Agrobacteríum tumifaciens AGL-1
Se inoculó al 10% v/v (1 mi en 9 mi) un cultivo durante la noche de Agrobacteríum tumifaciens AGL-1 hecho crecer a 30°C con agitación a 200 rpm en caldo Luria en el mismo medio que contenía diversos compuestos de prueba y se incubó durante 24 h adicionales. Los compuestos inductores sometidos a prueba fueron N-etilmaleimida (NEM) 0.25 mM, menadiona (MD) 0.125 mM, fumarato de dimetilo (DMFU) 1 mM, maleato de dietilo (DEME) 4 mM, malonato de dietilo (DEMO) 4 mM, malonato de dimetilo (DMMO) 4 mM, trinitrato de glicerol (GTN) 0.5 mM, tetranitrato de pentaeritritol (PETN) 0.5 mM y trinitrotolueno (TNT) 0.5 mM. Se incluyeron controles sin compuesto de prueba y los medios también contenían hasta un 1 % v/v de etanol a partir de las disoluciones madre de inductor, que no afectó al crecimiento o a la expresión enzimática (o acetona en el caso de PETN y TNT). Se recogieron las células mediante centrifugación (3220 x g, 15 min, 4°C), se lavaron en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Se resuspendieron los sedimentos en 1.5 mi de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, Tritón X-100 al 0.5%) y se sonicaron durante 3 pulsos de 15 s a un 35% de potencia con un descanso de 30 s entre pulsos usando un sonificador digital Branson. Tras
la incubación en hielo durante al menos 1 h, se clarificaron los lisados mediante centrifugación (16.100 x g, 5 min, 22°C) y se usó el sobrenadante para ensayos enzimáticos.
Se determinó la actividad enzimática de extractos libres de células midiendo la formación de nitrito a partir de nitroglicerina 0.2 mM y NADH 0.2 mM en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 a temperatura ambiente. Se terminaron los ensayos a diversos puntos de tiempo mediante la adición de metosulfato de fenazina 0.2 mM y ferricianuro 0.5 mM. Se determinó la concentración de nitrito mezclando 100 µ? de muestra con 900 µ? de reactivo de nitrito 10 mg/ml (Sigma, n.° de cat. 37410) y midiendo la absorbencia a 530 nm tras 0 minutos. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 µ?t??? de nitrito por min a partir de nitroglicerina a temperatura ambiente (~22°C) y se expresó por gramo de proteína. Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se muestran los resultados en la figura 8 y la tabla a continuación, que muestra claramente un aumento en actividad degradante de nitroglicerina cuando se expone A. tumifaciens AGL-1 a DMFU y DEME con aumentos de 4.0 y 9.9 veces respectivamente en relación con el control. Los aceptores distintos de Michael similares estructuralmente DEMO y DMMO no provocaron ninguna respuesta significativa ni los compuestos explosivos GTN o PETN. Sin embargo, el compuesto explosivo TNT aumentó significativamente la actividad enzimática en esta cepa. Esto puede deberse a la toxicidad de TNT que da como resultado una respuesta de estrés que implica regulación por incremento de reductasas degradantes de nitroglicerina. Esta fuerte respuesta parece ser una característica
única de esta cepa.
Compuesto químico U/g Inducción en veces
control 0.60 1.0
NEM 0.72 1.2
MD 1.0 1.7
DMFU 2.4 4.0
DEME 5.9 9.9
DEMO 0.60 1.0
DMMO 1.1 1.9
control 1.1 1.0
GTN 0.10 0.07
PETN 0.14 0.14
TNT 3.8 3.5
Ejemplo 3
Inducción de actividad degradante de nitroglicerina en Agrobacterium tumifaciens PD31
Se inoculó al 10% v/v (1 mi en 9 mi) un cultivo durante la noche de Agrobacterium tumifaciens PD31 hecho crecer a 30°C con agitación a 200 rpm en caldo Luria en el mismo medio que contenía diversos compuestos de prueba y se incubó durante 24 h adicionales. Los compuestos inductores sometidos a prueba fueron N-etilmaleimida (NEM) 0.5 mM, menadiona (MD) 0.25 mM, fumarato de dimetilo (DMFU) 1 mM, maleato de dietilo (DEME) 4 mM, malonato de dietilo (DEMO) 4 mM, malonato de dimetilo (DMMO) 4 mM, trinitrato de glicerol (GTN) 0.5 mM, tetranitrato de pentaeritritol (PETN) 0.5 mM y trinitrotolueno (TNT) 0.5 mM. Se incluyeron controles sin compuesto de prueba y los medios también contenían hasta un 1% v/v de etanol a partir de las disoluciones madre de
inductor, que no afectó al crecimiento o a la expresión enzimática (o acetona en el caso de PETN y TNT). Se recogieron las células mediante centrifugación (3220 x g, 15 min, 4°C), se lavaron en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Se resuspendieron los sedimentos en 1 ,5 mi de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, Tritón X-100 al 0.5%) y se sonicaron durante 3 pulsos de 15 s a un 35% de potencia con un descanso de 30 s entre pulsos usando un sonificador digital Branson. Tras la incubación en hielo durante al menos 1 h, se clarificaron los lisados mediante centrifugación (16.100 x g, 5 min, 22°C) y se usó el sobrenadante para ensayos enzimáticos.
Se determinó la actividad enzimática de extractos libres de células midiendo la formación de nitrito a partir de nitroglicerina 0.2 mM y NADH 0.2 mM en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 a temperatura ambiente. Se terminaron los ensayos a diversos puntos de tiempo mediante la adición de metosulfato de fenazina 0.2 mM y ferricianuro 0.5 mM. Se determinó la concentración de nitrito mezclando 100 µ? de muestra con 900 µ? de reactivo de nitrito 10 mg/ml (Sigma, n.° de cat. 37410) y midiendo la absorbencia a 530 nm tras 0 minutos. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 pmol de nitrito por min a partir de nitroglicerina a temperatura ambiente (~22°C) y se expresó por gramo de proteína. Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se muestran los resultados en la figura 9 y la tabla a continuación, que muestra un ligero aumento en la actividad degradante de nitroglicerina cuando se expone A. tumifaciens PD31 a NEM, DEME y TNT, pero sólo hasta ,6 veces superior en relación con el control. Los resultados indican que la expresión
enzimática no está tan altamente regulada en esta cepa en comparación con otras y de ese modo la adición de un compuesto de carbonilo a,ß-insaturado no da como resultado un aumento pronunciado en la actividad degradante de nitroglicerina. Esta cepa es también un degradador conocido de PETN y TNT, que se aisló del suelo usando PETN como única fuente de nitrógeno. La desregulación de esta enzima acompañada con niveles de expresión basal relativamente altos puede explicar por qué este aislado se convirtió en la cepa predominante en un consorcio de suelo mixto tras varios pases con PETN como única fuente de nitrógeno.
Compuesto químico U/g Inducción en veces
control 18 1.0
NEM 27 1.5
MD 24 1.3
DMFU 24 1.3
DEME 29 1.6
DEMO 22 1.2
DMMO 21 1.1
control 19 1.0
GTN 19 1.0
PETN 12 0.64
TNT 27 1.4
Ejemplo 4
Inducción de actividad degradante de nitroglicerina en Klebsiella pneumoniae BB6
Se inoculó al 10% v/v (1 mi en 9 mi) un cultivo durante la noche de Klebsiella pneumoniae BB6 hecho crecer a 30°C con agitación a 200 rpm en
caldo Luria en el mismo medio que contenía diversos compuestos de prueba y se incubó durante 24 h adicionales. Los compuestos inductores sometidos a prueba fueron N-etilmaleimida (NEM) 0.5 mM, menadiona (MD) 0.5 mM, fumarato de dimetilo (DMFU) 1 mM, maleato de dietilo (DEME) 4 mM, malonato de dietilo (DEMO) 4 mM, malonato de dimetilo (DMMO) 4 mM, trinitrato de glicerol (GTN) 0.5 mM, tetranitrato de pentaeritritol (PETN) 0.5 mM y trinitrotolueno (TNT) 0.5 mM. Se incluyeron controles sin compuesto de prueba y los medios también contenían hasta un 1% v/v de etanol a partir de las disoluciones madre de inductor, que no afectó al crecimiento o a la expresión enzimática (o acetona en el caso de PETN y TNT). Se recogieron las células mediante centrifugación (3220 x g, 15 min, 4°C), se lavaron en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Se resuspendieron los sedimentos en 1.5 mi de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, Tritón X- 00 al 0.5%) y se sonicaron durante 3 pulsos de 15 s a un 35% de potencia con un descanso de 30 s entre pulsos usando un sonificador digital Branson. Tras la incubación en hielo durante al menos 1 h, se clarificaron los lisados mediante centrifugación (16.100 x g, 5 min, 22°C) y se usó el sobrenadante para ensayos enzimáticos.
Se determinó la actividad enzimática de extractos libres de células midiendo la formación de nitrito a partir de nitroglicerina 0.2 mM y NADPH 0.2 mM en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 a temperatura ambiente. Se terminaron los ensayos a diversos puntos de tiempo mediante la adición de metosulfato de fenazina 0.2 mM y ferricianuro 0.5 mM. Se determinó la concentración de nitrito mezclando 100 µ? de muestra con 900 µ? de reactivo de nitrito 10 mg/ml (Sigma, n.° de cat. 37410) y midiendo la absorbencia a 530 nm tras 10 minutos. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para liberar 1
µ?t??? de nitrito por min a partir de nitroglicerina a temperatura ambiente (~22°C) y se expresó por gramo de proteína. Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se muestran los resultados en la figura 10 y la tabla a continuación, que muestra claramente un aumento en la actividad degradante de nitroglicerina cuando se expone K. pneumoniae BB6 a MD, DMFU y DEME con aumentos de 8,8, 106 y 58 veces respectivamente en relación con el control. Los aumentos muy grandes en la actividad enzimática sugieren que la expresión génica está altamente regulada en esta cepa. El aceptor distinto de Michael similar estructuralmente DEMO también dio como resultado un aumento de 5.1 veces en la actividad indicando que la estructura química así como la funcionalidad pueden desempeñar un papel en la inducción enzimática en esta cepa. Los compuestos explosivos GTN, PETN o TNT no provocaron ninguna respuesta significativa.
Compuesto químico U/g Inducción en veces
control 2.9 1.0
NEM 4.5 1.6
MD 25 8.8
DMFU 303 106
DEME 165 58
DEMO 15 5.1
DMMO 4,6 1.6
control < 0.10 1.0
GTN < 0.10 1.0
PETN < 0.10 1.0
TNT 0.22 2.2
Ejemplo 5
Inducción de actividad degradante de nitroglicerina en Pseudomonas sp. BB13
Se inoculó al 10% v/v (1 mi en 9 mi) un cultivo durante la noche de Pseudomonas sp. BB13 hecho crecer a 30°C con agitación a 200 rpm en caldo Luria en el mismo medio que contenía diversos compuestos de prueba y se incubó durante 24 h adicionales. Los compuestos inductores sometidos a prueba fueron N-etilmaleimida (NEM) 0.25 mM, menadiona (MD) 0.5 mM, fumarato de dimetilo (DMFU) 1 mM, maleato de dietilo (DEME) 4 mM, malonato de dietilo (DEMO) 4 mM, malonato de dimetilo (DMMO) 4 mM, trinitrato de glicerol (GTN) 0.5 mM, tetranitrato de pentaeritritol (PETN) 0.5 mM y trinitrotolueno (TNT) 0.5 mM. Se incluyeron controles sin compuesto de prueba y los medios también contenían hasta un 1 % v/v de etanol a partir de las disoluciones madre de inductor, que no afectó al crecimiento o a la expresión enzimática (o acetona en el caso de PETN y TNT). Se recogieron las células mediante centrifugación (3220 x g, 15 min, 4°C), se lavaron en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Se resuspendieron los sedimentos en 1.5 mi de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, Tritón X-100 al 0.5%) y se sonicaron durante 3 pulsos de 15 s a un 35% de potencia con un descanso de 30 s entre pulsos usando un sonificador digital Branson. Tras la incubación en hielo durante al menos 1 h, se clarificaron los lisados mediante centrifugación (16.100 x g, 5 min, 22°C) y se usó el sobrenadante para ensayos enzimáticos.
Se determinó la actividad enzimática de extractos libres de células midiendo la formación de nitrito a partir de nitroglicerina 0.2 mM y NADPH 0.2 nnM en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 a temperatura ambiente. Se terminaron
los ensayos a diversos puntos de tiempo mediante la adición de metosulfato de fenazina 0.2 mM y ferricianuro 0.5 mM. Se determinó la concentración de nitrito mezclando 100 µ? de muestra con 900 µ? de reactivo de nitrito 10 mg/ml (Sigma, n.° de cat. 37410) y midiendo la absorbencia a 530 nm tras 10 minutos. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 µ???? de nitrito por min a partir de nitroglicerina a temperatura ambiente (~22°C) y se expresó por gramo de proteína. Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se muestran los resultados en la figura 11 y la tabla a continuación, que muestra claramente un aumento en la actividad degradante de nitroglicerina cuando se expone Pseudomonas sp. BB13 a NEM, MD, DMFU y DEME con aumentos de 2.7, 25, 10 y 13 veces respectivamente en relación con el control. Los aceptores distintos de Michael similares estructuralmente DEMO y DMMO no provocaron ninguna respuesta significativa ni los compuestos explosivos GTN, PETN o TNT.
Compuesto químico U/g Inducción en veces
control < 0.10 1.0
NEM 0.27 2.7
MD 2.5 25
DMFU 1.0 10
DEME 1.3 13
DEMO 0.1 1 1.1
DMMO 0.15 1.5
control 0.15 1.0
GTN < 0.10 0.68
PETN < 0.10 0.68
TNT < 0.10 0.68
Ejemplo 6
Inducción de actividad degradante de nitroglicerina en Gibberella moniliformis CD611
Se inoculó al 10% v/v (1 mi en 9 mi) un cultivo de tres días de Gibberella moniliformis CD6 1 hecho crecer a 30°C con agitación a 200 rpm en caldo Luria en el mismo medio que contenía diversos compuestos de prueba y se incubó durante 29 h adicionales. Los compuestos inductores sometidos a prueba fueron trinitrato de glicerol (GTN) 0.5 mM, tetranitrato de pentaeritritol (PETN) 0.5 mM, trinitrotolueno (TNT) 0.5 mM, N-etilmaleimida (NEM) 0.5 mM, menadiona (MD) 0.25 mM, fumarato de dimetilo (DMFU) 1 mM, maleato de dietilo (DEME) 4 mM, 3-hidroxicumarina (3HC) 1 mM, trans-4-fenil-3-buten-2-ona (TPBO) 1 mM, terc-butil-hídroquinona (TBHQ) 1 mM y maleato de dimetilo (DMME) 1 mM. Se incluyeron controles sin compuesto de prueba y los medios también contenían hasta un 1% v/v de etanol a partir de las disoluciones madre de inductor, que no afectó al crecimiento o a la expresión enzimática (o acetona en el caso de PETN y TNT). Se recogieron las células mediante filtración a vacío a través de un papel de filtro Whatman n.° 1 , se lavaron dos veces con 10 mi de fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 y se almacenó la biomasa a -20°C. Se resuspendieron los sedimentos en 1.5 mi de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, Tritón X-100 al 0.5%) y se sonicaron durante 3 pulsos de 15 s a un 35% de potencia con un descanso de 30 s entre pulsos usando un sonificador digital Branson. Tras la incubación en hielo durante 20 min, se repitió el procedimiento de sonicación.
Tras otra incubación en hielo durante al menos 1 h, se clarificaron
los lisados mediante centrifugación (16.100 x g, 5 min, 22°C) y se usó el sobrenadante para ensayos enzimáticos.
Se determinó la actividad enzimática de extractos libres de células midiendo la formación de nitrito a partir de nitroglicerina 0.2 mM y NADPH 0.2 mM en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 a temperatura ambiente. Se terminaron los ensayos a diversos puntos de tiempo mediante la adición de metosulfato de fenazina 0.2 mM y ferricianuro 0.5 mM. Se determinó la concentración de nitrito mezclando 100 µ? de muestra con 900 µ? de reactivo de nitrito 10 mg/ml (Sigma, n.° de cat. 37410) y midiendo la absorbancia a 530 nm tras 10 minutos. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 pmol de nitrito por min a partir de nitroglicerina a temperatura ambiente (~22°C) y se expresó por gramo de proteína. Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se muestran los resultados en la figura 12 y la tabla a continuación, que muestra claramente un aumento en la actividad degradante de nitroglicerina cuando se expone G. moniliformis CD6 1 a DMFU, DEME, TBHQ y DMME con aumentos de 11 , 27, 2.5 y 25 veces respectivamente en relación con el control. Se inhibió el crecimiento en presencia de TNT, NEM, MD y 3HC, por tanto no estaba disponible biomasa suficiente para medir la actividad enzimática para estas muestras. Los compuestos explosivos GTN o PETN no provocaron ninguna respuesta significativa. La inducción enzimática en esta cepa fúngica es una prueba adicional de que este mecanismo de inducción no está limitado únicamente a bacterias.
Compuesto químico U/g Inducción en veces
control < 0.10 1.0
GTN < 0.10 1.0
PETN < 0.10 1.0
TNT - - NEM - - MD - - DMFU 1.1 11
DEME 2.7 27
3HC - - TPBO < 0.10 1.0
TBHQ 0.25 2.5
DMME 2.5 25
Ejemplo 7
Inducción de actividad degradante de nitroglicerina en un cultivo de suelo mixto
Se generó un cultivo de suelo mixto inoculando 10 g de suelo en 100 mi de caldo Luria. Se obtuvo el suelo localmente (Bundoora, VIC, Australia) y hasta donde conocían los autores no había estado expuesto anteriormente a ninguna contaminación. Se incubó la suspensión de suelo durante la noche a 30°C con agitación a 200 rpm y entonces se inoculó al 10% v/v (1 mi en 9 mi) en caldo Luria nuevo que contenía diversos compuestos de prueba y se incubó durante 24 h adicionales. Los compuestos inductores sometidos a prueba fueron trinitrato de glicerol (GTN) 0.5 mM, tetranitrato de pentaeritritol (PETN) 0.5 mM, trinitrotolueno (TNT) 0.5 mM, N-etilmaleimida (NEM) 0.5 mM, menadiona (MD) 0.25 mM, fumarato de dimetilo (DMFU) 1 mM, maleato de dietilo (DEME) 4 mM, 3-hidroxicumarina (3HC) 1 mM, trans-4-fenil-3-buten-2-ona (TPBO) 1 mM, tere-
butil-hidroquinona (TBHQ) 1 mM y maleato de dimetilo (DMME) 1 mM. Se incluyeron controles sin compuesto de prueba y los medios también contenían hasta un 1 % v/v de etanol a partir de las disoluciones madre de inductor, que no afectó al crecimiento o a la expresión enzimática (o acetona en el caso de PETN y TNT). Se recogieron las células mediante centrifugación (3220 x g, 15 min, 4°C), se lavaron en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Se resuspendieron los sedimentos en 1.5 mi de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, Tritón X-100 al 0.5%) y se sonicaron durante 3 pulsos de 15 s a un 35% de potencia con un descanso de 30 s entre pulsos usando un sonificador digital Branson. Tras la incubación en hielo durante al menos 1 h, se clarificaron los lisados mediante centrifugación (16.100 x g, 5 min, 22°C) y se usó el sobrenadante para ensayos enzimáticos.
Se determinó la actividad enzimática de extractos libres de células midiendo la formación de nitrito a partir de nitroglicerina 0.2 mM y NADPH 0,2 mM en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 a temperatura ambiente. Se terminaron los ensayos a diversos puntos de tiempo mediante la adición de metosulfato de fenazina 0.2 mM y ferricianuro 0.5 mM. Se determinó la concentración de nitrito mezclando 100 µ? de muestra con 900 µ? de reactivo de nitrito 10 mg/ml (Sigma, n.° de cat. 37410) y midiendo la absorbencia a 530 nm tras 10 minutos. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 µ?-nol de nitrito por min a partir de nitroglicerina a temperatura ambiente (~22°C) y se expresó por gramo de proteína. Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se muestran los resultados en la figura 13 y la tabla a continuación,
que muestra claramente un aumento en la actividad degradante de nitroglicerina cuando se exponen microbios del suelo a NEM, MD, DMFU, DEME y TPBO con aumentos de 2.0, 2.0, 2.4, 2.1 y 3.0 veces respectivamente en relación con el control. Este es un resultado importante ya que demuestra un aumento medible en la actividad degradante de explosivos de microbios del suelo sin tratamiento previo en condiciones no selectivas y también indica que los compuestos inductores conservan su actividad en presencia de una suspensión de suelo al 1% p/v.
Compuesto químico U/g Inducción en veces
control 0.61 1.0
GTN 0.68 1.1
PETN 0.38 0.63
TNT 0.49 0.81
NEM 1.2 2.0
MD 1.2 2.0
DMFU 1.5 2.4
DEME 1.3 2.1
DEMO 0.49 0.81
DMMO 0.33 0.55
3HC 0.27 0.44
TPBO 1.8 3.0
TBHQ 0.49 0.8
DMME 0.82 1.4
Ejemplo 8
Inducción de actividad degradante de nitroglicerina en Escherichia coli DH5a con diferentes tasas de dosis de fumarato de dimetilo y maleato de dietilo
Se inoculó al 10% v/v (1 mi en 9 mi) un cultivo durante la noche de Escherichia coli DH5a hecho crecer a 30°C con agitación a 200 rpm en caldo Luria en el mismo medio que contenía diversas concentraciones de fumarato de dimetilo (DMFU) o maleato de dietilo (DEME) y se incubó durante 24 h adicionales. Las concentraciones usadas fueron 0.01 , 0.05, 0.1 , 0.5, 0.75 y 1 mM para DMFU y 0.1 , 0.25, 0.5, 0.75, 1 , 2 y 4 mM para DEME. Se incluyeron controles sin compuesto de prueba y los medios también contenían hasta un 1 % v/v de etanol a partir de las disoluciones madre de inductor, que no afectó al crecimiento o a la expresión enzimática. Se recogieron las células mediante centrifugación (3220 x g, 15 min, 4°C), se lavaron en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Se resuspendieron los sedimentos en 1.5 mi de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, Tritón X-100 al 0.5%) y se sonicaron durante 3 pulsos de 15 s a un 35% de potencia con un descanso de 30 s entre pulsos usando un sonificador digital Branson. Tras la incubación en hielo durante al menos 1 h, se clarificaron los lisados mediante centrifugación (16.100 x g, 5 min, 22°C) y se usó el sobrenadante para ensayos enzimáticos.
Se determinó la actividad enzimática de extractos libres de células midiendo la formación de nitrito a partir de nitroglicerina 0.2 mM y NADPH 0.2 mM en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 a temperatura ambiente. Se terminaron los ensayos a diversos puntos de tiempo mediante la adición de metosulfato de fenazina 0.2 mM y ferricianuro 0.5 mM. Se determinó la concentración de nitrito mezclando 100 µ? de muestra con 900 µ? de reactivo de nitrito 10 mg/ml (Sigma, n.° de cat. 37410) y midiendo la absorbencia a 530 nm tras 10 minutos. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para liberar 1
µ?t??? de nitrito por min a partir de nitroglicerina a temperatura ambiente (~22°C) y se expresó por gramo de proteína. Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se muestran los resultados en la figura 14, que muestra claramente un aumento en la actividad degradante de nitroglicerina con concentraciones crecientes de DMFU y DEME. A las concentraciones más altas sometidas a prueba, la actividad enzimática aumentó 13 veces para DMFU y 1 1 veces para DEME en relación con el control. Sin embargo, incluso tan sólo DMFU 0.01 mM era suficiente para aumentar la actividad enzimática en 2.2 veces en relación con el control y DEME 0.1 mM dio como resultado un aumento de 2.8 veces.
Ejemplo 9
Inducción de actividad degradante de nitroglicerina en Escherichia coli DH5a con diferentes tasas de dosis de 3-hidroxicumarina, terc-butil-hidroquinona y maleato de dimetilo
Se inoculó al 10% v/v (1 mi en 9 mi) un cultivo durante la noche de Escherichia coli DH5a hecho crecer a 30°C con agitación a 200 rpm en caldo Luria en el mismo medio que contenía diversas concentraciones de 3-hidroxicumarina (3HC), terc-butil-hidroquinona (TBHQ) y maleato de dimetilo (DMME) y se incubó durante 24 h adicionales. Las concentraciones usadas fueron 0.25, 0.5, 2 y 4 mM para 3HC, 0.5, 1 , 2 y 4 mM para TBHQ y 0.5, 1 , 2 y 4 mM para DMME. Se incluyeron controles sin compuesto de prueba y los medios también contenían hasta un 1 % v/v de etanol a partir de las disoluciones madre de inductor, que no afectó al crecimiento o a la expresión enzimática. Se recogieron las células mediante centrifugación (3220 x g, 15 min, 4°C), se lavaron
en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Se resuspendieron los sedimentos en 1.5 mi de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, Tritón X-100 al 0.5%) y se sonicaron durante 3 pulsos de 15 s a un 35% de potencia con un descanso de 30 s entre pulsos usando un sonificador digital Branson. Tras la incubación en hielo durante al menos 1 h, se clarificaron los Usados mediante centrifugación (16.100 x g, 5 min, 22°C) y se usó el sobrenadante para ensayos enzimáticos.
Se determinó la actividad enzimática de extractos libres de células midiendo la formación de nitrito a partir de nitroglicerina 0.2 mM y NADPH 0.2 mM en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 a temperatura ambiente. Se terminaron los ensayos a diversos puntos de tiempo mediante la adición de metosulfato de fenazina 0.2 mM y ferricianuro 0.5 mM. Se determinó la concentración de nitrito mezclando 100 µ? de muestra con 900 µ? de reactivo de nitrito 10 mg/ml (Sigma, n.° de cat. 37410) y midiendo la absorbencia a 530 nm tras 10 minutos. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 pmol de nitrito por min a partir de nitroglicerina a temperatura ambiente (~22°C) y se expresó por gramo de proteína. Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se muestran los resultados en la figura 15, que muestra claramente un aumento en la actividad degradante de nitroglicerina con concentraciones crecientes de DMME, pero 3HC y TBHQ dieron como resultado una elevación y una caída en la actividad a medida que aumentaban las concentraciones. Ambos inductores eran ligeramente tóxicos para E. coli DH5a dando como resultado concentraciones superiores a rendimientos de proteína reducidos, lo que puede
explicar los niveles de expresión menores. Para 3HC, la actividad aumentó desde 1 hasta 2 mM debido posiblemente al aumento en los niveles de expresión enzimática que son mayores que la reducción en el rendimiento de proteína. Sin embargo, TBHQ alcanzó un máximo a 2 mM y luego descendió hasta niveles indetectables a 4 mM. Estos resultados destacan la importancia de mantener un equilibrio entre toxicidad y potencia de inductor con el fin de lograr un buen nivel de inducción enzimática sin afectar de manera adversa a la población microbiana. También indica que una liberación sostenida gradual de compuesto inductor puede ser un medio más apropiado de presentar el inductor para impedir que se produzcan altas concentraciones locales.
Ejemplo 10
Inducción de actividad degradante de nitroglicerina en Escherichia coli DH5a con diferentes tasas de dosis de trans-4-fenil-buten-2-ona
Se inoculó al 10% v/v (1 mi en 9 mi) un cultivo durante la noche de Escherichia coli DH5a hecho crecer a 30°C con agitación a 200 rpm en caldo Luria en el mismo medio que contenía trans-4-fenil-3-buten-2-ona (TPBO) 0.5, 2 ó 4 mM y se incubó durante 24 h adicionales. Se incluyeron controles sin compuesto de prueba y los medios también contenían hasta un 1 % v/v de etanol a partir de las disoluciones madre de inductor, que no afectó al crecimiento o a la expresión enzimática. Se recogieron las células mediante centrifugación (3220 x g, 15 min, 4°C), se lavaron en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 y se almacenaron los sedimentos a -20°C. Se resuspendieron los sedimentos en 1.5 mi de tampón de lisis (Tris 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, Tritón X-100 al 0.5%) y se sonicaron durante 3 pulsos de 15 s a un 35% de potencia con un descanso de 30 s entre pulsos usando un sonificador digital Branson. Tras la incubación en hielo durante
al menos 1 h, se clarificaron los lisados mediante centrifugación (16.100 x g, 5 min, 22°C) y se usó el sobrenadante para ensayos enzimáticos.
Se determinó la actividad enzimática de extractos libres de células midiendo la formación de nitrito a partir de nitroglicerina 0.2 mM y NADPH 0.2 mM en fosfato de potasio 50 mM pH 7.2 a temperatura ambiente. Se terminaron los ensayos a diversos puntos de tiempo mediante la adición de metosulfato de fenazina 0.2 mM y ferricianuro 0.5 mM. Se determinó la concentración de nitrito mezclando 100 µ? de muestra con 900 µ? de reactivo de nitrito 10 mg/ml (Sigma, n.° de cat. 37410) y midiendo la absorbencia a 530 nm tras 10 minutos. Se definió una unidad de actividad como la cantidad de enzima requerida para liberar 1 pinol de nitrito por min a partir de nitroglicerina a temperatura ambiente (~22°C) y se expresó por gramo de proteína. Se determinaron las concentraciones de proteína usando reactivo Bradford (Bio-Rad) según las instrucciones del fabricante.
Se muestran los resultados en la figura 16, que muestra claramente un aumento en la actividad degradante de nitroglicerina con concentraciones crecientes de TPBO. Este inductor era muy potente con un aumento de 97 veces en la actividad enzimática observada a una tasa de dosis de 4 mM, sin embargo, esta concentración también dio como resultado una disminución del 87% en el rendimiento de proteína debido a inhibición del crecimiento. Estos resultados destacan la importancia de mantener un equilibrio entre toxicidad y potencia de inductor con el fin de lograr un buen nivel de inducción enzimática sin afectar de manera adversa a la población microbiana.
Ejemplo 11
Inducción de degradación de Pentolite en microcosmos de suelo mediante
mezclas de inductores que contienen maleato de dietilo, fumarato de dimetilo o terc-butil-hidroquinona
Se prepararon microcosmos en viales de vidrio de 40 mi inoculando 1 g de suelo tamizado en 5 mi de agua natural reconstituida (RNW, Reconstituted Natural Water. KHC03 1 mM, CaCI2 0.5 mM, MgS04 0.206 mM, FeS04 8.95 µ?, HCI 0.25 mM, pH -7.8) que contenía Pentolite 100 mg/l y 5 g/l de diversas mezclas de inductores. Se obtuvo el suelo localmente (Bundoora, VIC, Australia) y hasta donde conocían los autores no había estado expuesto anteriormente a ninguna contaminación. Las mezclas de inductores contenían (en peso) el 94% de sacarosa, el 5% fosfato de monosodio y el 1 % de o bien maleato de dietilo (DEME), fumarato de dimetilo (DMFU) o bien terc-butil-hidroquinona (TBHQ). Se incluyeron microcosmos control sin mezcla de inductores y eran o bien no estériles o bien estériles (suelo sometido a tratamiento en autoclave a 121°C durante 100 min y RNW esterilizada por filtración a través de un filtro de 0.2 pm). Comenzaron las reacciones mediante la adición de 50 µ? de disolución de Pentolite al 1% p/v (trinitrotolueno/tetranitrato de pentaerirtritol 50/50) en acetona para una concentración final de 100 mg/l. Se incubaron los viales en la oscuridad a temperatura ambiente (~22°C) y tras 24 h o 7 días, se añadieron 15 mi de acetonitrilo para solubilizar el TNT y PETN. Se analizaron las muestras usando HPLC-UV con un límite de detección de 0.1 mg/l. Antes de la adición de acetonitrilo, se inocularon muestras de 10 µ? de los controles estériles en 5 mi de medio 2YTG y se dejaron a temperatura ambiente durante 7 días para confirmar la esterilidad de las muestras. No se observó crecimiento en estas pruebas de esterilidad.
Se muestran los resultados en las figuras 17 y 18, que muestran
claramente una tasa aumentada de degradación de Pentolite en presencia de mezclas de inductores. La degradación de TNT era rápida con un 92% de descomposición de TNT observada para el tratamiento con DEME a lo largo de las primeras 24 h a una tasa de eliminación de 1.83 mg/l/h. Esto corresponde a un aumento de la tasa del 59% en comparación con la tasa de eliminación del control no estéril de 1.15 mg/l/h. Las tasas de eliminación aumentaron un 57% para mezclas de inductores de DMFU y un 33% para TBHQ. Se observó más de un 98% de degradación de TNT para todas las muestras tras 7 días excepto para el control estéril.
La degradación de PETN era más lenta con un 19% de descomposición de PETN observada para los tratamientos con DEME y DMFU a lo largo de las primeras 24 h a una tasa de eliminación de 0.367 mg/l/h. Esto corresponde a un aumento de la tasa del 38% en comparación con la tasa de eliminación del control no estéril de 0.267 mg/l/h. Las tasas de eliminación aumentaron un 31% para TBHQ. Tras 7 días, se había producido >92% de degradación de PETN para todos los tratamientos con inductor en comparación con el 57% para el control no estéril. Las tasas de eliminación habían descendido ligeramente tras 7 días con una tasa promedio de 0.257 mg/l/h observada para el tratamiento con DMFU, que era un 71 % más alta que para el control no estéril a 0.150 mg/l/h.
Ejemplo 12
Inducción de degradación de Pentolite en microcosmos de suelo mediante diferentes concentraciones de mezclas de inductores que contienen fumarato de dimetilo
Se prepararon microcosmos en viales de vidrio de 40 mi inoculando
1 g de suelo tamizado en 5 mi de agua natural reconstituida (RNW: KHCO3 1 mM, CaCI2 0.5 mM, MgS04 0.206 mM, FeSO4 8.95 µ?, HCI 0.25 mM, pH -7.8) que contenía Pentolite 2000 mg/l y 0.5, 2 ó 5 g/L de mezcla de inductor que contenía fumarato de dimetilo (DMFU). Se obtuvo el suelo localmente (Bundoora, VIC, Australia) y hasta donde conocían los autores no había estado expuesto anteriormente a ninguna contaminación. La mezcla de inductor contenía (en peso) el 94% de sacarosa, el 5% fosfato de monosodio y el 1% de DMFU. Se incluyeron microcosmos control sin mezcla de inductor y eran o bien no estériles o bien estériles (suelo sometido a tratamiento en autoclave a 121°C durante 100 min y RNW esterilizado por filtración a través de un filtro de 0.2 µ??). Se añadió Pentolite a viales vacíos como 1 mi de disolución de Pentolite al 1% p/v (trinitrotolueno/tetranitrato de pentaerirtritol 50/50) en acetona, que entonces se evaporó durante la noche dejando 10 mg de Pentolite sólido. Se añadieron cinco mililitros de disolución apropiada mediante agitación con vórtex dando una concentración de Pentolite final de 2000 mg/l (en su mayoría insoluble). Comenzaron las reacciones mediante la adición de 1 g de suelo dando como resultado una razón de Pentolite/suelo de 10.000 mg/kg. Se incubaron los viales en la oscuridad a temperatura ambiente (~22°C) y tras 24 h, 7 días o 28 días, se añadieron 15 mi de acetonitrilo para solubilizar el TNT y PETN. Se analizaron las muestras usando HPLC-UV con un límite de detección de 0.1 mg/l. Antes de la adición de acetonitrilo, se inocularon muestras de 10 µ? de los controles estériles en 5 mi de medio 2YTG y se dejaron a temperatura ambiente durante 7 días para confirmar la esterilidad de las muestras. No se observó crecimiento en estas pruebas de esterilidad.
Se muestran los resultados en las figuras 19, 20 y 21 , que muestran
claramente un aumento de la tasa de degradación de Pentolite en presencia de mezclas de inductores. La degradación de TNT era rápida con un 74% de descomposición de TNT observada para el tratamiento con mezcla de inductor de 2 g/l a lo largo de 7 días a una tasa de eliminación de 4.55 mg/l/h. Esto corresponde a un aumento de la tasa de 9.6 veces en comparación con la tasa de eliminación del control no estéril de 0.467 mg/l/h y sólo un 8% de degradación. Se observó hasta un 98% de degradación de TNT tras 28 días con inductor 5 g/l en comparación con un 27% para el control no estéril.
La concentración de PETN para todas las muestras, incluyendo el control estéril, había descendido el 17-25% a una tasa de 1.2-1.8 mg/l/h a lo largo de 7 días debido posiblemente a la fuerte unión del PETN al suelo. Tras 28 días, las concentraciones eran similares para todas las muestras (880-1000 mg/l) indicando que no estaba produciéndose degradación de PETN en estas condiciones. Esto puede deberse a las altas concentraciones iniciales de TNT que se usarían preferentemente por microbios como fuente de nitrógeno, ya que es más fácilmente soluble y se biodegrada más fácilmente. Pueden ser necesarios tiempos de incubación más largos antes de que pueda observarse una degradación de PETN significativa.
Claims (15)
1. - Método de voladura usando un cartucho explosivo que es autodesactivante si la detonación del cartucho explosivo no tiene lugar tal como se pretende, método que comprende: proporcionar un cartucho explosivo que comprende una composición de explosivo y un agente de inducción química, en el que el agente de inducción química puede promover la producción de una enzima que degrada la composición de explosivo por un microorganismo que es autóctono con respecto a y que está presente en el entorno en el que va a usarse el cartucho explosivo, en el que el cartucho explosivo está adaptado para permitir que el agua presente en el entorno entre en el cartucho explosivo y en el que tal como se proporcionan ni el cartucho explosivo ni la composición de explosivo comprenden un microorganismo que pueda producir una enzima que degrada la composición de explosivo; colocar el cartucho explosivo en un orificio de perforación; y permitir que el agua presente en el entorno entre en el cartucho explosivo transportando de ese modo el microorganismo para que entre en contacto con la composición de explosivo, en el que la composición de explosivo sigue siendo detonable durante un periodo de tiempo tras haberse colocado el cartucho explosivo en el orificio de perforación y en el que el agente de inducción química promueve la producción de la enzima por el microorganismo degradando entonces la enzima la composición de explosivo de modo que la composición de explosivo se vuelve insensible a la detonación tras un periodo de tiempo predeterminado tras el que la detonación del cartucho explosivo debe haberse producido pero no se ha producido.
2. - Cartucho explosivo que es autodesactivante si la detonación no tiene lugar tal como se pretende, comprendiendo el cartucho explosivo: una composición de explosivo; y un agente de inducción química que puede promover la producción de una enzima que degrada la composición de explosivo por un microorganismo que es autóctono para y que está presente en el entorno en el que va a usarse el cartucho, estando adaptado el cartucho explosivo para permitir que el agua en el entorno en el que está usándose el cartucho explosivo entre en el cartucho explosivo transportando de ese modo el microorganismo para que entre en contacto con la composición de explosivo y en el que ni el cartucho explosivo ni la composición de explosivo comprenden un microorganismo que pueda producir una enzima que degrada la composición de explosivo.
3. - Método de conformidad con la reivindicación 1 o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Pseudomonas spp., Escherichia coli, Morganella morganii, Rhodococcus spp., Comamanos spp., Agrobacterium radiobacter, Enterobacter cloacae, Agrobacterium tumifaciens, Klebsiella pneumonía, Gibberella moniliformis y bacterias desnitrificantes.
4. - Método de conformidad con la reivindicación 1 o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la enzima que degrada la composición de explosivo se selecciona del grupo que consiste en antigua enzima amarilla (OYE), oxidorreductasas, GTN reductasas, nitrorreductasas y N-etilmaleimida (NEM) reductasas.
5. - Método de conformidad con la reivindicación 1 o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente de inducción química es un aceptor de Michael.
6. - Método o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el agente de inducción química es un aceptor de Michael que provoca que el microorganismo exprese una enzima oxidorreductasa que puede degradar explosivos.
7. - Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el aceptor de Michael se selecciona de menadiona (precursor de vitamina K), maleato de dimetilo, 3-hidroxicumarina, ácido o-cumárico, trans-4-fenil-3-buten-2-ona), N-etilmaleimida, fumarato de dimetilo, maleato de dietilo y terc-butil-hidroquinona.
8. - Método de conformidad con la reivindicación 1 o composición de explosivo conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente de inducción química se proporciona en la composición de explosivo.
9. - Método de conformidad con la reivindicación 1 o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el cartucho comprende una o más entradas y/o rutas degradables con agua para permitir que el agua del entorno fluya al interior del cartucho y entre en contacto directamente con la composición de explosivo y el agente de inducción química proporcionado en la composición de explosivo.
10. - Método de conformidad con la reivindicación 1 o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la composición de explosivo comprende canales para permitir que el agua se desplace a través de la misma y entre en contacto con el agente de inducción química.
11. - Método de conformidad con la reivindicación 1 o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el cartucho explosivo comprende una cubierta externa permeable al agua o degradable con agua que rodea la composición de explosivo.
12. - Método de conformidad con la reivindicación 1 o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente de inducción química se proporciona en o sobre una o más paredes externas del cartucho explosivo.
13. - Método o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la una o más paredes externas están en contacto directo con la composición de explosivo y son permeables al agua, degradables con agua o solubles en agua.
14. - Método de conformidad con la reivindicación 1 o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente de inducción química se proporciona en una cámara separada de la composición de explosivo y en el que en el uso entra agua en la cámara poniendo de ese modo un microorganismo autóctono en contacto con el agente de inducción química.
15. - Método de conformidad con la reivindicación 1 o cartucho explosivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la composición de explosivo comprende una fuente de nutrientes para apoyar el crecimiento del microorganismo y la expresión de la enzima degradante de explosivos.
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