MX2014009113A - Composiciones citricas resistentes a patogeno, organismos, sistemas y metodos. - Google Patents
Composiciones citricas resistentes a patogeno, organismos, sistemas y metodos.Info
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Abstract
La presente invención se refiere, de acuerdo con algunas modalidades, a composiciones cítricas resistentes a patógeno, organismos, sistemas y métodos. Por ejemplo, una composición puede comprender un péptido (por ejemplo, un péptido defensina) y/o un ácido nucleico (por ejemplo, un acido nucleico de defensina). Una planta cítrica resistente a patógeno puede comprender, en algunas modalidades, un péptido defensina y/o un ácido nucleico expresable que codifica un péptido defensina.
Description
COMPOSICIONES CÍTRICAS RESISTENTES A PATÓGENO,
ORGANISMOS. SISTEMAS Y MÉTODOS
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reclama prioridad a la Solicitud de Patente de E.U.A. provisional 61/591,680, presentada el 27 de enero de 2012 y Solicitud de Patente de E.U.A. provisional 61/641,641, presentada el 2 de mayo de 2010, ambas de las cuales solicitudes se incorporan a la presente por referencia.
CAMPO DE LA INVENCION
La presente descripción se refiere, en algunas modalidades, a composiciones cítricas resistentes a patógeno, organismos, sistemas y métodos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
En el presente, no hay cultivos cítricos resistentes a úlcera bacteriana (Xanthomonas axonopodis pv. Citri), y/o Huanglongbing (ex verdor) causado por Candidatus Liberibacter asiaticus (Las). De hecho, no se ha encontrado resistencia genética a estos patógenos microbianos dentro del género cítrico. Esfuerzos convencionales
mestizos para producir cultivos resistentes han sido impedidos por la biología reproductiva compleja y ciclo de vida larga de Citrus spp.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION
Por consiguiente, ha surgido una necesidad por plantas (por ejemplo, cítrico) con resistencia mejorada a enfermedad. Otra necesidad ha surgido por métodos mejorados, composiciones y sistemas para preparar plantas genéticamente modificadas (por ejemplo, cítrico).
La presente descripción se refiere, de acuerdo con algunas modalidades, a composiciones cítricas resistentes a patógeno, organismos, sistemas y métodos. Por ejemplo, una composición puede comprender un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico de defensina). En algunas modalidades, un ácido nucleico puede comprender una secuencia de ácido nucleico (a) teniendo de alrededor de 75% a aproximadamente 100% identidad (por ejemplo, aproximadamente 98% identidad) a una secuencia de defensina (por ejemplo, SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12 y/o 29) y/o (b) codificando una secuencia de aminoácido teniendo de 95% a aproximadamente 100% identidad (por ejemplo, 98% identidad) a SEC ID NOS: 1, 2, 7, 8 y/o 28. Un ácido nucleico puede comprender, en algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico teniendo aproximadamente 98% identidad a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 5 y
codificando un péptido que tiene una secuencia de aminoácido teniendo por lo menos aproximadamente 99% identidad a SEC ID NO: 1. Un ácido nucleico puede comprender, en algunas modalidades, una secuencia de ácido nucleico que tiene aproximadamente 98% identidad a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 6 y codificando un péptido que tiene una secuencia de aminoácido teniendo por lo menos aproximadamente 99% identidad a SEC ID NO: 2. De acuerdo con algunas modalidades, un ácido nucleico puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene aproximadamente 98% identidad a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 11 y codificando un péptido que tiene una secuencia de aminoácido teniendo al menos aproximadamente 99% identidad a SEC ID NO: 7. Un ácido nucleico puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene aproximadamente 98% identidad a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 12 y codificando un péptido que tiene una secuencia de aminoácido teniendo por lo menos aproximadamente 99% identidad a SEC ID NO: 8, en algunas modalidades.
La presente descripción se refiere, en algunas modalidades, a vectores de expresión de defensina operables en cítrico. Por ejemplo, un vector de expresión puede comprender, en una dirección 5' a 3', (a) una secuencia de control de expresión; (b) un ácido nucleico expresable (por ejemplo, un ácido nucleico codificando un
polipéptido exógeno) operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión; y (c) una secuencia de terminación 3' enlazada operativamente al ácido nucleico expresable. En algunas modalidades, un ácido nucleico exógeno puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos aproximadamente 75% identidad (por ejemplo, al menos aproximadamente 98% identidad) a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 29. Un vector de expresión se puede ubicar en una célula bacteriana o una célula vegetal de acuerdo con algunas modalidades. Un vector de expresión puede comprender, en algunas modalidades, la secuencia de nucleótido AACAATGG en posiciones -4 a 4 relativo a una secuencia codificadora (por ejemplo, codificado por una secuencia de ácido nucleico exógeno). De acuerdo con algunas modalidades, un vector de expresión puede comprender un enlazador (por ejemplo, 3' de la secuencia de control de expresión y/o 5' del ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico codificando un polipéptido exógeno) teniendo una longitud de alrededor de 1 a aproximadamente 200 nucleótidos.
La presente descripción se refiere, en algunas modalidades, a una célula bacteriana que comprende un vector de expresión. Por ejemplo, una célula bacteriana puede comprender un vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3', (a) una
secuencia de control de expresión; (b) un ácido nucleico expresable (por ejemplo, un ácido nucleico codificando un polipéptido exógeno) operativamente enlazado a una secuencia de control de expresión; y (c) una secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al ácido nucleico expresable. Una célula bacteriana puede comprender, por ejemplo, un vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3', (a) una secuencia de control de expresión; (b) un ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión; y/o (c) una secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al ácido nucleico exógeno, en donde el ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico teniendo por lo menos aproximadamente 98% identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionado a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12.
La presente descripción se refiere, en algunas modalidades, a una célula vegetal (por ejemplo, una célula vegetal cítrica) que comprende un vector de expresión. Por ejemplo, una célula vegetal (por ejemplo, una célula vegetal cítrica) puede comprender un vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3', (a) una secuencia de control de expresión; (b) un ácido nucleico expresable (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido exógeno) operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión; y (c) una secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al ácido nucleico expresable. Una célula vegetal (por ejemplo, una
célula vegetal cítrica) puede comprender, por ejemplo, un vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3'*, (a) una secuencia de control de expresión; (b) un ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión; y/o (c) una secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al ácido nucleico exógeno, en donde el ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos aproximadamente 98% identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionado a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 29. Una célula vegetal (por ejemplo, una célula vegetal cítrica) se puede ubicar en una planta (por ejemplo, una planta cítrica) de acuerdo con algunas modalidades. Ejemplos de plantas cítricas incluyen, sin limitación, naranja y toronja. Una célula vegetal puede comprender un péptido defensina. Un péptido defensina puede tener, en algunas modalidades, una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos aproximadamente 99% Identidad a SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO:7, SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 28 (por ejemplo, codificado por y/o expresado a partir de un ácido nucleico de vector de expresión) de acuerdo con algunas modalidades.
En algunas modalidades, la presente descripción se refiere a una planta cítrica (por ejemplo, naranja y/o toronja) que comprende un vector de expresión. Una planta cítrica puede comprender un vector de expresión en una célula individual, una pluralidad de
células (por ejemplo, mosaico) o en todas las células. Una planta de mosaico puede surgir de un injerto en algunas modalidades. Por ejemplo, una planta cítrica puede comprender un injerto de una planta transgénica que tiene un vector de expresión en todas las células (por ejemplo, vástago) y una planta que tiene un vector de expresión diferente o ningún vector de expresión en sus células (por ejemplo, rizoma). Una planta cítrica puede comprender, en algunas modalidades, en una célula individual, una pluralidad de células (por ejemplo, mosaico), o en todas las células un primer vector de expresión (por ejemplo, codificando un primer péptido defensina) en una célula individual, una pluralidad de células (por ejemplo, mosaico), o en todas las células un segundo vector de expresión (por ejemplo, codificando un segundo péptido defensina). Por ejemplo, una célula vegetal cítrica puede comprender (a) un primer vector de expresión, el primer vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3', (i) una primera secuencia de control de expresión; (ii) un primer ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la primera secuencia de control de expresión; y (iii) una primera secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al primer ácido nucleico exógeno, en donde el primer ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos aproximadamente 98% identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 11; y (b) un segundo vector de expresión, el segundo vector de expresión que comprende, en una
dirección 5' a 3', (iv) una segunda secuencia de control de expresión; (v) un segundo ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la segunda secuencia de control de expresión; y (vi) una segunda secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al segundo ácido nucleico exógeno, en donde el segundo ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos aproximadamente 98% identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 12. De acuerdo con algunas modalidades, una planta cítrica puede comprender en una célula individual, una pluralidad de células (por ejemplo, mosaico), o en todas las células un vector de expresión que comprende una primera secuencia de ácido nucleico codificando un primer péptido defensina (por ejemplo, SoD2) y una segunda secuencia de ácido nucleico codificando un segundo péptido defensina (por ejemplo, SoD7). En algunas modalidades, una planta cítrica puede comprender un péptido defensina en una célula individual, una pluralidad de células (por ejemplo, mosaico) o en todas las células. Una planta cítrica puede comprender en una célula individual, una pluralidad de células (por ejemplo, mosaico), o en todas las células un primer péptido defensina (por ejemplo, un péptido que tiene por lo menos aproximadamente 99% identidad a SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 7) y una célula individual, una pluralidad de células (por ejemplo, mosaico), o en todas las células un segundo péptido
defensina (por ejemplo, un péptido que tiene por lo menos aproximadamente 99% identidad a SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 8).
La presente descripción se refiere, en algunas modalidades, a métodos de expresar en una planta cítrica un ácido nucleico exogeno que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando un péptido expresado (por ejemplo, un péptido defensina). Por ejemplo, un método puede comprender contactar un cásete de expresión que comprende un ácido nucleico exogeno o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico exogeno con el citosol de una célula de una planta cítrica bajo condiciones que permiten expresión del ácido nucleico exogeno y formación del péptido expresado. En algunas modalidades, un ácido nucleico exogeno puede comprender una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 98% identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionado a partir de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12 y/o SEC ID NO: 29. En algunas modalidades, un vector de expresión y/o un cásete de expresión puede comprender, en una dirección 5' a 3', una secuencia de control de expresión, el ácido nucleico exogeno operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión, y una secuencia de terminación 3' operati amente enlazada al ácido nucleico exogeno. Un péptido expresado puede comprender una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 99% identidad a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8 y/o SEC ID NO: 28 de acuerdo con
algunas modalidades. Contactar un vector o cásete de expresión puede comprender además, en algunas modalidades, co-cultivar la célula con una célula Agrobacterium que comprende el vector de expresión o cásete de expresión para formar una célula vegetal co-cultivada. De acuerdo con algunas modalidades, se puede regenerar una planta de una célula vegetal co-cultivada.
La presente descripción se refiere, en algunas modalidades, a métodos para tratar una planta cítrica que tiene y/o en riesgo de tener una infección microbiana (por ejemplo, úlcera bacteriana (Xanthomonas axonopodis pv. Citri) (Xac), y/o Huanglongbing cítrico (ex verdor) causado por Candidatus Liberibacter asiaticus (Las)). Por ejemplo, un método puede comprender formar en la planta cítrica por lo menos un péptido defensina. Formar en la planta cítrica por lo menos un péptido defensina puede comprender, en algunas modalidades, injertar la planta cítrica a cortar (por ejemplo, un vastago o un rizoma) de una segunda planta cítrica, la segunda planta cítrica que comprende un vector de expresión y/o un cásete de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3', una secuencia de control de expresión, un ácido nucleico de defensina operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión, un ácido nucleico de defensina operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión, y una secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al ácido nucleico de defensina, en donde el ácido nucleico de defensina comprende una secuencia de ácido nucleico codificando una secuencia de aminoácido que tiene al
menos 99% identidad a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8 y/o SEC ID NO: 28 bajo condiciones que permiten expresión del ácido nucleico de defensina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
El archivo de esta patente contiene por lo menos un dibujo ejecutado en color. Se proveerán copias de esta patente con dibujo(s) a color por la Oficina de Patentes y Marcas sobre petición y pago de la tarifa necesaria.
Algunas modalidades de la descripción pueden ser entendidas al referir, en parte, a la presente descripción y los dibujos acompañantes, en donde:
La figura 1 ilustra una construcción de transformación
Agrobacterium que comprende un ácido nucleico que codifica SoD2 de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 2 ilustra una construcción de transformación Agrobacterium que comprende un ácido nucleico que codifica SoD7 de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 3 es una representación de un Southern blot que muestra número de inserción entre hechos transgénicos en Hamlin y Rohde Rojo transformados con un ácido nucleico SoD2 (07) que
comprende una secuencia optimizada con GenScript para expresión en Citrus, de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
La figura 4 es una representación de un Southern blot que muestra número de inserción entre hechos transgénicos en Hamlin y Rohde Rojo transformado con ácidos nucleicos SoD2 (09) o SoD7 (10), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada con CODA para expresión en Citrus, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 5 es una representación de un northern blot que muestra transcripciones de ARN entre hechos transgénicos en Marrs, transformados con SoD2 (07) o SoD7 (08), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada con Gen-Script para expresión en Citrus, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 6 es una representación de un northern blot que muestra transcripciones de ARN entre hechos transgénicos en Hamlin y Rohde Rojo transformado con ácidos nucleicos SoD2 (09) o SoD7 (10), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada con CODA para expresión en Citrus, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 7 es una representación de un northern blot que muestra transcripciones de ARN entre hechos transgénicos en Hamlin y Rohde Rojo transformado con ácidos nucleicos SoD2 (07) o SoD7 (08), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada con
Gen-Script para expresión en Citrus, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 8 es una representación de un Southern blot que confirma inserción de SoD2 o SoD7 en plantas Hamlin, transformados con ácidos nucleicos con SoD2 (11) o SoD7 (12), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada con ADN 2.0 para expresión en Citrus, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 9 es una representación de un Southern blot que confirma inserción de defensinas en Ruby Red (01) o Hamlin (04) transformadas con ácidos nucleicos SoD2 (09, 11), SoD7 (08, 12), o ambos SoD2 y SoD7 (13), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada para expresión en Citrus usando un algoritmo de optimización de secuencia (GenScript para 08 y 13; Coda para 09, y ADN 2.0 para 11 y 12), de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 10 es una representación de un northern blot que muestra transcripciones de ARN entre hechos transgénicos en Ruby Red (01) o Hamlin (04), transformadas con ácidos nucleicos SoD2 (11), SoD7 (08, 12), o ambos SoD2 y SoD7 (13), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada con GenScript (08 y 13) o secuencia optimizada con ADN 2.0 (11 y 12), de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 11 es una representación de un Southern blot que confirma inserción de defensinas en Carrizo Citrange (CC)
transformadas con ácidos nucleicos SoD2 (07) o SoD7 (08), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada con GenScript para expresión en Citrus, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 12 es una representación de un northern blot que confirma transcripciones de ARN entre hechos transgénicos en Carrizo Citrange (CC) transformadas con ácidos nucleicos SoD2 (07) o SoD7 (08), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada con GenScript para expresión en Citrus, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 13A es una fotografía de una hoja extirpada de un árbol de toronja no transgenico inoculado con un patógeno de úlcera cítrica de acuerdo con modalidades de ejemplo específicos de la descripción;
La figura 13B es una fotografía de una hoja extirpada de un árbol de toronja transgénico SoD2 inoculado con un patógeno de úlcera cítrica de acuerdo con modalidades de ejemplo específicos de la descripción;
La figura 14 es una fotografía de árboles de toronja quiméricos que resultan del injerto de vástagos no transgénicos no infectados en rizomas no transgénicos infectados verdes cítricos (izquierda y centro) del injerto de vástagos transgénicos SoD2 no infectados en rizomas no transgénicos infectados verdes cítricos (derecha), de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 15A ilustra el porcentaje de plantas cítricas de Generación 2 infectadas sobre la primera, segunda y tercera muestra de material probado, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 15B es una continuación de la gráfica de barras de la figura 15A que ilustra el porcentaje de plantas cítricas de Generación 2 infectadas en la primera, segunda y tercera muestra de material probado, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 15C es una continuación de la gráfica de barras de la figura 15A que ilustra el porcentaje de plantas cítricas de Generación 2 infectadas en la primera, segunda y tercera muestra de material probado, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 16A ilustra el porcentaje de plantas cítricas de
Generación 2 y 3 infectadas en las primeras, segundas y terceras muestras de material probado, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 16B es una continuación en parte de la figura 16A que ilustra el porcentaje de plantas cítricas de Generación 2 y 3 infectadas en las primeras, segundas y terceras muestras de material probado, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción;
La figura 16C es una continuación en parte de la figura 16A que ilustra el porcentaje de plantas cítricas de Generación 2 y 3
infectadas en las primeras, segundas y terceras muestras de material probado, de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción; y
La figura 17 es una representación de un Southern blot que confirma inserción de defensinas en Rio Red (01) transformadas con ácidos nucleicos SoD2 y SoD7 (13), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada con GenScript para expresión en Citrus, de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
La figura 18 es una representación de un northern blot que muestra transcripciones de ARN entre hechos transgénicos en Rio Red (01) o Hamlin (04), transformados con ácidos nucleicos SoD2 y SoD7 (13), cada uno comprendiendo una secuencia optimizada con GenScript para expresión en Citrus, de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción; y
La figura 19 es un Western blot que ¡lustra unión de un anti- SoD7 de acuerdo con modalidades de ejemplo específicas de la descripción a muestras que contienen SoD7.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA LISTA DE SECUENCIAS
Algunas modalidades de la descripción se pueden entender al hacer referencia, en parte, a la presente descripción y la lista de secuencias acompañante, en donde:
SEC ID NO: 1 ilustra una secuencia de aminoácido de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 2 ilustra una secuencia de aminoácido de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD7) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 3 ilustra una secuencia de ácido nucleico optimizada con GenScript para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 4 ilustra una secuencia de ácido nucleico optimizada con GenScript para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD7) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 5 ilustra una secuencia de ácido nucleico optimizada con CODA para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 6 ¡lustra una secuencia de ácido nucleico optimizada con CODA para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD7) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 7 ilustra una secuencia de aminoácido de un péptido quimérico que comprende un péptido de señal PR-1b y una
defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 8 ilustra una secuencia de aminoácido de un péptido quimérico que comprende un péptido de señal PR-1b y una defensina de espinaca {Spinacia olerácea) {SoD7) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 9 ilustra una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal PR-1b y una secuencia de ácido nucleico optimizada con GenScript para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 10 ilustra una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal PR-1b y una secuencia de ácido nucleico optimizada con GenScript para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD7) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 11 ilustra una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal PR-1b y una secuencia de ácido nucleico optimizada con CODA para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 12 ilustra una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal PR-1b y una secuencia de ácido nucleico optimizada con CODA para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) {SoD7) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 13 ilustra un cásete de expresión que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un péptido de señal PR-1b y una secuencia de ácido nucleico optimizada con GenScript para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 14 ilustra un cásete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal PR-1b y una secuencia de ácido nucleico optimizada con GenScript para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD7) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 15 ¡lustra un cásete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal PR-1b y una secuencia de ácido nucleico optimizada con CODA para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 16 ilustra un cásete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal PR-1b y una secuencia de ácido nucleico optimizada con CODA para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD7) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 17 ilustra una secuencia de cásete de expresión (CaMV 35S promotor) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 18 ¡lustra una región no traducida (TEV 5'UTR) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 19 ilustra una secuencia de control de expresión (CaMV 35S promotor) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 20 ilustra una secuencia de ácido nucleico de un cebador designado Zn5 de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 21 ilustra una secuencia de un cebador designado Zn6 de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 22 ilustra una secuencia de ácido nucleico de un cebador designado Fcp de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 23 ilustra una secuencia de ácido nucleico de un cebador designado Rcp de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 24 ¡lustra una secuencia de ácido nucleico de un cebador designado GUSF de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 25 ilustra una secuencia de ácido nucleico de un cebador designado GUSR de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 26 ilustra una secuencia de aminoácido de un péptido quimérico que comprende un péptido de señal PR-1b modificado y una secuencia de ácido nucleico optimizado con GenScript teniendo una omisión individual para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 27 ilustra una secuencia de ácido nucleico quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando un péptido de señal PR-1b modificado y una secuencia de ácido nucleico optimizado con GenScript teniendo una omisión individual para expresión de una defensina de espinaca {Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 28 ilustra una secuencia de aminoácido de núcleo de una defensina de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 29 ilustra una secuencia de ácido nucleico para expresión de una defensina de núcleo de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción;
SEC ID NO: 30 ilustra una secuencia de ácido nucleico optimizada con ADN 2.0 para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD2) de acuerdo con una modalidad de ejemplo especifica de la descripción; y
SEC ID NO: 31 ¡lustra una secuencia de ácido nucleico optimizada con ADN 2.0 para expresión de una defensina de espinaca (Spinacia olerácea) (SoD7) de acuerdo con una modalidad de ejemplo específica de la descripción.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La presente descripción se refiere, en algunas modalidades, a composiciones, organismos, sistemas y métodos para mejorar una habilidad innata de la planta, si alguna, para responder al contacto (por ejemplo, infección) con un patógeno (por ejemplo, bacteria, levadura, hongo, virus). En algunas modalidades, la presente descripción se refiere a composiciones, organismos, sistemas y métodos para expresar un producto genético (por ejemplo, un péptido antimicrobiano) en una planta (por ejemplo, un cítrico). Por ejemplo, la presente descripción se refiere a secuencias de control de expresión (por ejemplo, promotores), casetes de expresión, vectores de expresión, microorganismos y/o plantas que comprenden uno o
más péptidos antimicrobianos y/o uno o m ácidos nucleicos codificando uno o más péptidos antimicrobianos
I. COMPOSICIONES
A. PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS
La presente descripción se refiere, de acuerdo con algunas modalidades, a péptidos y/o proteínas que tienen actividad insecticida, actividad antimicrobiana y/o actividad antiviral, que puede incluir, sin limitación, avidina, proteínas insecticidas vegetativas (por ejemplo, Vip3A), proteínas de cristal insecticida de Bacillus thuringiensis (por ejemplo, Cry1, CryIAb, Cry2, Cry9), albúmina de chícharo (por ejemplo, PA1b), hirsutelina A, lectinas (por ejemplo, lectina de lily de gota de nieve, lectina de ajo, lectina de cebolla), inhibidores de amilasa (por ejemplo, inhibidor de alfa amilasa), arcelinas (por ejemplo, arcelinas de frijoles), inhibidores de proteinasa, lisozimas (por ejemplo, lisozima bovina, lisozima humana, lisozima de molusco), defensina (por ejemplo, SoD2 y/o SoD7), quitinasa, ß-1.3-glucanasa, variantes de los mismos, y/o combinaciones de los mismos. Un péptido antimicrobiano puede comprender, por ejemplo, uno o más péptidos antimicrobianos pertenecientes a la familia de defensinas vegetales. Estos polipéptidos originalmente se aislaron de hojas de espinaca (Spinacia olerácea) . En algunas modalidades, una defensina puede ser pequeña (aproximadamente 5 kDa), puede ser básica y/o puede
ser rica en cisterna. En algunas modalidades, una defensina puede comprender un péptido que tiene una secuencia de aminoácido compartiendo por lo menos aproximadamente 95% de identidad, por lo menos aproximadamente 96% de identidad, por lo menos aproximadamente 97% de identidad, por lo menos aproximadamente 98% de identidad, por lo menos aproximadamente 99% de identidad, y/o aproximadamente 100% de identidad con SEC ID NO: 1 y/o SEC ID NO: 2. En algunas modalidades, un péptido antimicrobiano además puede comprender uno o más aminoácidos que son independiente y/o colectivamente neutrales (por ejemplo, no ¡mpactan adversamente funcionalidad antibacteriana) y/o aumentan funcionalidad antibacteriana (por ejemplo, al dirigir el péptido a una ubicación deseada (por ejemplo, celular y/o extracelular). Por ejemplo, una defensina puede comprender un péptido de señal derivado de la proteína de tabaco relacionada con patogénesis (PR)-1b que permite el transporte de los péptidos en el apoplasto de células vegetales (por ejemplo, vía el camino secretor) y/o acumulación en los espacios intercelulares de hojas, tallos, flores, frutas, semillas y/o raíces. Una defensina puede comprender, de acuerdo con algunas modalidades, un péptido que tiene una secuencia de aminoácido compartiendo al menos aproximadamente 95% de identidad, al menos aproximadamente 96% de identidad, al menos aproximadamente 97% de identidad, al menos aproximadamente 98% de identidad, al menos aproximadamente 99%
de identidad, y/o aproximadamente 100% de identidad con SEC ID NO: 7 y/o SEC ID NO: 8.
B. ÁCIDOS NUCLEICOS
La presente descripción se refieren, en algunas modalidades, a ácidos nucleicos (por ejemplo, casetes, vectores) comprendiendo una o más secuencias codificando uno o más péptidos antimicrobianos. Por ejemplo, un ácido nucleico puede comprender un cásete que comprende una secuencia de ácido nucleico sintético de genes SoD2 y/o SoD7. Los codones específicos de SoD2 y/o SoD7 pueden especificar las mismas secuencias de aminoácido como espinaca nativa, teniendo sus codones optimizados para uso de codón cítrico. Un ácido nucleico que comprende una secuencia codificadora de SoD2 y/o SoD7 puede comprender una. secuencia que codifica un péptido de señal (por ejemplo, PR-1b). En algunas modalidades, la expresión de un ácido nucleico que comprende una secuencia codificando un péptido antimicrobiano se puede optimizar al colocar un codón de iniciación en un contexto 5' favorable (por ejemplo, óptimo). De acuerdo con algunas modalidades, un ácido nucleico puede comprender una secuencia de control de expresión (por ejemplo, operativamente enlazado a una secuencia codificadora). Por ejemplo, un ácido nucleico puede comprender una secuencia de genes codificadora bajo el control de un promotor CaMV 35S dual mejorado con una 5' UTR de potivirus de planta TEV (por ejemplo,
para proveer una actividad mejoradora de traducción a los genes de defensina).
De acuerdo con algunas modalidades, un ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótido que tiene al menos aproximadamente 75% de identidad a SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31, al menos aproximadamente 80% de identidad a SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 29, al menos aproximadamente 85% de identidad a SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31, al menos aproximadamente 90% de identidad a SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31, al menos aproximadamente 95% de identidad a SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31, al menos aproximadamente 97% de identidad a SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31, al menos aproximadamente 98% de identidad a SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31, al menos aproximadamente 99% de identidad a SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31, y/o aproximadamente 100% de identidad a SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31. Una secuencia de nucleótido puede codificar, en algunas modalidades, una secuencia de aminoácido teniendo por lo menos aproximadamente 98% de identidad a SEC ID NOS: 1, 2, 7, 8 y/o 28, al menos aproximadamente 99% de identidad a SEC ID NOS: 1, 2, 7, 8 y/o 28, y/o aproximadamente 100% de identidad a SEC ID NOS: 1, 2, 7, 8 y/o 28. De acuerdo con algunas modalidades, un ácido nucleico puede tener una primera medida de identidad de secuencia a una secuencia de ácido nucleico de referencia y puede
codificar una secuencia de aminoácido teniendo una segunda medida de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácido de referencia. Por ejemplo, un ácido nucleico puede tener aproximadamente 85% de identidad de SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31 y codifica una secuencia de aminoácido teniendo aproximadamente 100% de identidad con SEC ID NOS: 1, 2, 7, 8 y/o 28, de acuerdo con algunas modalidades.
Una secuencia de ácido nucleico, de conformidad con algunas modalidades, puede hibridar a un ácido nucleico teniendo la secuencia de nucleótido de SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31 bajo condiciones rigurosas. Las condiciones rigurosas pueden incluir, por ejemplo, (a) 4X SSC a 65°C seguido por 0.1X SSC a 65° durante 60 minutos y/o (b) 50% de formamida, 4X SSC a 65°C. Un ácido nucleico puede comprender un fragmento de omisión (por ejemplo, una omisión de alrededor de 1 a aproximadamente 12 bases) de un ácido nucleico que tiene una secuencia de SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31 que retiene actividad antimicrobiana contra por lo menos un microorganismo capaz de infectar una planta cítrica. Un experto en la técnica teniendo el beneficio de la presente descripción puede preparar uno o más fragmentos de omisión de un ácido nucleico teniendo una secuencia de SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 29, 30 y/o 31 y explorar los fragmentos resultantes para actividad antimicrobiana contra por lo menos un microorganismo capaz de infecta una planta cítrica.
Una secuencia de ácido nucleico teniendo una secuencia como SEC ID NOS: 3, 4, 5, 6, 30 y/o 31 se puede identificar por búsquedas de base de datos usando la secuencia o elementos de la misma como la secuencia de búsqueda usando el algoritmo Gapped BLAST (Altschul y otros, 1997 Nucí. Acids Res. 25:3389-3402) con la matriz BLOSUM62, un costo de intervalo de 11 y costo de persistencia de 1 por residuo y un valor E de 10. Se puede evaluar la identidad de secuencia por cualquier método disponible de acuerdo con algunas modalidades. Por ejemplo, se pueden comparar dos secuencias con ALIGN (alineación Global) o LALIGN (alineación de homología local) en la suite de aplicaciones FASTA (Pearson y Lipman, 1988 Proc. Nat. Acad. Sci. 85:2444-2448; Pearson, 1990 Methods in Enzymology 183:63-98) con la matriz BLOSUM50 y penalidades de intervalo de -16, -4. Se puede evaluar la similitud de secuencia de acuerdo con Clustal W (Larkin y otros, 2007, Bioinformatics 23(21): 2947-2948), BLAST, FASTA o algoritmo similar.
C. CASETES Y VECTORES DE EXPRESIÓN
La descripción se refiere, en algunas modalidades, a vectores de expresión y/o casetes de expresión para expresar una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia codificadora) en una célula y comprendiendo una secuencia de control de expresión y la secuencia de ácido nucleico operativamente enlazada a la secuencia de control de expresión. De esta manera, por ejemplo, un cásete de
expresión puede comprender una secuencia codificadora heteróloga, la expresión de la cual se puede desear en una planta.
1. VECTORES DE EXPRESIÓN
La descripción se refiere, en algunas modalidades, a un vector de expresión que puede comprender, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene una secuencia de control de expresión y una secuencia codificadora operativamente enlazada a la secuencia de control de expresión. En algunas modalidades, una secuencia de control de expresión puede comprender uno o más promotores, uno o más operadores, uno o más potenciadores, uno o más sitios de unión a ribosoma y/o combinaciones de los mismos. Una secuencia de control de expresión puede comprender, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene actividad promotora. Una secuencia de control de expresión, de conformidad con algunas modalidades, puede ser constitutivamente activa o condicionalmente activa en (a) un órgano seleccionado a partir de raíz, hoja, tallo, flor, semilla y/o fruto, y/o (b) activo en un tejido seleccionado a partir de epidermis, peridermo, parénquima, colénquima, esclerénquima, xilema, floema, y/o estructuras secretoras. Una secuencia de control de expresión, de conformidad con algunas modalidades, puede ser operables para impulsar la expresión de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia codificadora) en una célula. La métrica para expresión puede incluir, por ejemplo, calificación de apariencia y/o
acumulación de un producto de genes (por ejemplo, ARN y/o proteína) y/o acumulación total de un producto de genes como de uno o más puntos de tiempo (por ejemplo, tiempo transcurrido después de un punto de partida y/o una etapa de desarrollo). Los ensayos comparativos para productos de genes pueden ser cualitativos, semi-cuantitativos y/o cuantitativos en algunas modalidades. Los ensayos comparativos pueden evaluar indirecta y/o directamente la presencia y/o cantidad de producto de genes. En algunas modalidades, una secuencia de control de expresión puede ser sensible a uno o más estímulos (por ejemplo una o más moléculas pequeñas, uno o más agentes inductores de defensa de planta, daño mecánico, temperatura, presión). Por ejemplo, la actividad de una secuencia de control de expresión se puede mejorar o suprimir al infectar con un microorganismo (por ejemplo, una bacteria o un virus).
Un vector de expresión se puede contactar con una célula (por ejemplo, una célula vegetal) bajo condiciones que permiten expresión (por ejemplo, transcripción) de la secuencia codificadora. Ejemplos de vectores de expresión pueden incluir las construcciones de transformación de Agrobacterium mostradas en la FIGURA 1 y FIGURA 2. Una secuencia de control de expresión se puede contactar con una célula vegetal (por ejemplo, una célula embriónica, una célula madre, una célula callosa) bajo condiciones que permiten expresión de la secuencia codificadora en la célula y/o células derivadas de la célula vegetal de conformidad con algunas
modalidades. Un vector de expresión se puede contactar con una célula (por ejemplo, una célula vegetal), en algunas modalidades, bajo condiciones que permiten herencia de por lo menos una porción del vector de expresión en la progenie de la célula. De acuerdo con algunas modalidades, un vector de expresión puede incluir uno o más marcadores seleccionables. Por ejemplo, un vector de expresión puede incluir un marcador para selección cuando el vector está en un huésped bacteriano, un huésped de levadura y/o un huésped vegetal.
2. CASETES DE EXPRESIÓN
De acuerdo con algunas modalidades, la descripción se refiere a un cásete de expresión que puede comprender, por ejemplo, un ácido nucleico que tiene una secuencia de control de expresión y una secuencia codificadora operativamente enlazada a la secuencia de control de expresión. Un cásete de expresión puede estar comprendido en un vector de expresión. Una secuencia codificadora, en algunas modalidades, puede comprender cualquier secuencia codificadora que se puede expresar en al menos una célula vegetal. Por ejemplo, una secuencia codificadora puede comprender una secuencia de planta, una secuencia de levadura, una secuencia bacteriana, una secuencia viral (por ejemplo, virus de planta), una secuencia artificial, una secuencia antisentido de la misma, un fragmento de la misma, un variante de la misma, y/o combinaciones de las mismas. Una secuencia codificadora puede comprender, en
algunas modalidades, una secuencia codificando uno o más productos de genes con actividad insecticida, antibacteriana, antifúngica-, antimicrobiana y/o antiviral. Una secuencia codificadora puede comprender, en algunas modalidades, un codón de inicio, un intrón, y/o una secuencia de terminación de traducción. De acuerdo con algunas modalidades, una secuencia codificadora puede comprender una o más secuencias codificadoras naturales o artificiales (por ejemplo, codificando una sola proteína o quimera). De acuerdo con algunas modalidades, un cásete de expresión puede comprender opcionalmente una secuencia de terminación. Una secuencia codificadora, en algunas modalidades, puede comprender una secuencia al menos parcialmente optimizada de codón para expresión en un organismo de interés (por ejemplo, una planta cítrica).
Una secuencia de control de expresión se puede usar, en algunas modalidades, para construir un cásete de expresión que comprende, en la dirección 5' a 3', (a) la secuencia de control de expresión, (b) un gen heterólogo o una secuencia codificadora, o secuencia complementaria a un gen de planta nativa bajo control de la secuencia de control de expresión, y/o (c) una secuencia de terminación 3' (por ejemplo, una secuencia de terminación que comprende un sitio de poliadenilación). Ejemplos de casetes de expresión pueden incluir, en algunas modalidades, los casetes mostrados en SEC ID NOS: 13-16. Un cásete de expresión se puede incorporar en una variedad de vectores autónomamente replicadores
a fin de construir un vector de expresión. Un cásete de expresión se puede construir, por ejemplo, al ligar una secuencia de control de expresión a una secuencia a expresarse (por ejemplo, una secuencia codificadora).
Algunas técnicas para construcción de casetes de expresión son bien conocidas a aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, una variedad de estrategias está disponible para ligar fragmentos de ADN, la elección de lo cual depende de la naturaleza de la terminal de los fragmentos de ADN. Un experto en la técnica teniendo el beneficio de la presente descripción, una secuencia codificadora (por ejemplo, teniendo actividad antimicrobiana) y/o porciones de la misma se puede proveer por otros medios, por ejemplo, síntesis química o enzimática. Un ácido nucleico puede comprender, en una dirección 5' a 3', una secuencia de control de expresión, un enlazador (opcional), y una secuencia codificadora de conformidad con algunas modalidades. Un ácido nucleico puede comprender, en algunas modalidades, uno o más sitios de restricción y/o sitios de unión entre una secuencia de control de expresión, un enlazador y/o una secuencia codificadora.
II. MICROORGANISMOS
La presente descripción se refiere, en algunas modalidades, a un microorganismo que comprende un péptido antimicrobiano (por ejemplo, un péptido antimicrobiano heterologo) y/o un ácido nucleico
(por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo y/o expresable) que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando un péptido antimicrobiano. Por ejemplo, un microorganismo puede comprender una bacteria, una levadura y/o un virus. Ejemplos de microorganismos pueden incluir, sin limitación, Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, una línea celular de lepidopteran , un virus Rice tungro bacilliform, un virus Commelina yellow mosaic, un virus Banana streak, un virus Taro bacilliform y/o baculovirus. De conformidad con algunas modalidades, un péptido antimicrobiano se puede tolerar por y/o inocuo a su microorganismo huésped. Un microorganismo puede comprender una secuencia de control de expresión y un péptido antimicrobiano codificando secuencia operativamente enlazada a la secuencia de control de expresión. Un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo y/o expresable) comprendiendo de una secuencia de ácido nucleico codificando un péptido antimicrobiano puede estar presente, en algunas modalidades, en un ácido nucleico genómico y/o un ácido nucleico extra-genóm ico.
III. PLANTAS
La presente descripción se refiere, en algunas modalidades, a una célula vegetal (por ejemplo, una célula embriónica, una célula madre, una célula callosa), un tejido y/o una planta que comprende un péptido antimicrobiano (por ejemplo, un péptido antimicrobiano
heterólogo) y/o un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo y/o expresable) que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando un péptido antimicrobiano. Una planta y/o célula vegetal puede ser un dicoto en algunas modalidades. Ejemplos de un dicoto pueden incluir, sin limitación, café, jitomate, pimienta, tabaco, frijol de lima, Arabidopsis, hule, naranja, toronja, limón, lima, tangerina, mandarina, pumelo, papa, calabaza, chícharos y/o betabel. Una célula vegetal se puede incluir en un tejido vegetal, un órgano vegetal, y/o una planta entera en algunas modalidades. Una célula vegetal en un tejido, órgano y/o planta entera puede estar adyacente, de conformidad con algunas modalidades, a una o más células isogénicas y/o una o más células heterogénicas. En algunas modalidades, una planta puede incluir transformadores primarios y/o progenie de los mismos. Una planta que comprende un ácido nucleico (por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo y/o expresable) que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando un péptido antimicrobiano puede comprender además una secuencia de control de expresión operativamente enlazada al ácido nucleico, en algunas modalidades. Una secuencia de ácido nucleico codificando un péptido antimicrobiano se puede expresar, de conformidad con algunas modalidades, en una planta en uno o más de todos (por ejemplo, sustancialmente todos) los órganos, tejidos y/o tipos celulares incluyendo, sin limitación, tallos, hojas, raíces, semillas, flores, fruto, meristemo, parénquima, parénquima de almacenamiento, colénquima, esclerénquima, epidermis, mesofilo,
cubierta de haz, células de guardia, protoxilemo, metaxilemo, floema, acompañante de floema, y/o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, un ácido nucleico y/o su producto de genes (por ejemplo, un péptido antimicrobiano) se puede ubicar en y/o transubicar a uno o más organelos (por ejemplo, vacuolos, cloroplastos, mitocondria, plástidos).
IV. MÉTODOS
A. PLANTA TRANSFORMADORA
La presente descripción se refiere, de conformidad con algunas modalidades, a métodos para transformación independiente de cítrico (por ejemplo, un genoma nativo de una planta cítrica). Por ejemplo, un método puede comprender transformación independiente, usando Agrobacterium tumefaciens (At), del genoma nativo de los cultivos de naranja (Citrus sinensis) "Rhode Red", "Hamlin", y/o "Marrs". Un método de transformación puede comprender contactar un ácido nucleico que comprende una secuencia SoD2/SoD7 (por ejemplo, secuencia de gen sintético SoD2 y/o SoD7) con una planta cítrica de conformidad con algunas modalidades. Una planta transformada (por ejemplo, un genoma transformado de un cultivo de naranja nuevo) puede contener independientemente, en algunas modalidades, una secuencia de un gen SoD2 y/o un gen SoD7 codificando resistencia microbiana no encontrada dentro del acervo genético nativo del género Citrus. De conformidad con algunas modalidades, una planta
de cultivo de naranja transformada puede comprender un péptido codificado por un gen SoD2 y/o un gen SoD7. Una planta transformada que comprende una secuencia de un gen SoD2 y/o un gen SoD7 y/o comprendiendo un péptido codificado por un gen SoD2 y/o un gen SoD7 puede mostrar resistencia a un rango (por ejemplo, un rango amplio) de patógenos bacterianos y/o fúngicos en algunas modalidades. Por ejemplo, una planta transformada que comprende una secuencia de un gen SoD2 y/o un gen SoD7 y/o que comprende un péptido codificado por un gen SoD2 y/o un gen SoD7 puede exhibir resistencia a úlcera bacteriana (Xanthomonas axonopod is pv. Citri) (Xac), y/o Huanglongbing cítrico (ex verdor) causado por Candidatus Liberibacter asiaticus (Las). Ver sección de EJEMPLOS más adelante.
B. INJERTO
La presente descripción se refiere a injertar al menos una porción de una primera planta (por ejemplo, una planta cítrica) con al menos una porción de una segunda planta (por ejemplo, una planta cítrica), de conformidad con algunas modalidades. Una primera planta puede estar en cualquier condición deseada incluyendo, sin limitación, una condición sana, una condición enferma, una condición dañada, una condición estresada (por ejemplo, calor, frío, agua, y similares) y/o combinaciones de los mismos. Una primera planta puede tener cualquier genotipo deseado incluyendo, sin limitación,
tipo silvestre, transgénico, muíante y/o similares con respecto a un gen y/o rasgo de interés.
Una segunda planta puede estar en cualquier condición deseada incluyendo, sin limitación, una condición sana, una condición enferma, una condición dañada, una condición estresada (por ejemplo, calor, frío, agua y similares) y/o combinaciones de los mismos. Una segunda planta puede tener cualquier genotipo deseado incluyendo, sin limitación, tipo silvestre, transgénico, mutante y/o similares con respecto a un gen y/o rasgo de interés. Una primera y/o segunda planta puede comprender al menos un péptido antimicrobiano y/o al menos un ácido nucleico que comprende una secuencia codificando al menos un péptido antimicrobiano. En donde tanto una primera planta comprende por lo menos un péptido antimicrobiano y/o al menos un ácido nucleico comprendiendo una secuencia que codifica al menos un péptido antimicrobiano como una segunda planta comprende al menos un péptido antimicrobiano y/o al menos un ácido nucleico que comprende una secuencia codificando al menos un péptido antimicrobiano, puede ser deseable para las primeras y segundas plantas para tener los mismos y/o diferentes péptidos antimicrobianos y/o ácidos nucleicos codificando péptidos antimicrobianos. El injerto puede comprender cortar una porción de una primera planta para formar un sitio de corte fresco, cortar una porción de una segunda planta para crear un segundo sitio de corte y/o contactar un primer sitio de corte con un segundo sitio de corte. Un sitio de corte puede comprender al menos un haz vascular. El
injerto puede comprender formar una unión de injerto y/o, opcionalmente, sellar la unión de injerto (por ejemplo, al revestir la periferia de la unión de injerto con uno o más materiales de barrera).
C. TRATAR ENFERMEDAD DE PLANTA
La presente descripción se refiere, en algunas modalidades, a composiciones, organismos, sistemas y métodos para prevenir, mejorar y/o tratar una enfermedad de planta (por ejemplo, una enfermedad cítrica) y/o al menos un síntoma de una enfermedad de planta. Por ejemplo, un método puede comprender injertar al menos una porción de una planta (por ejemplo, una planta cítrica) teniendo una enfermedad de planta y/o expresar al menos un síntoma de una enfermedad de planta con al menos una porción de una planta (por ejemplo, una planta cítrica) que comprende un péptido antimicrobiano. Ejemplos de una enfermedad de planta incluyen, sin limitación, úlcera bacteriana (Xanthomonas axonopodis pv. Citri) (Xac) y/o citrus Huanglongbing (ex verdor) causado por Candidatus Liberibacter asiaticus (Las). De conformidad con algunas modalidades, prevenir, mejorar y/o tratar una enfermedad de planta (por ejemplo, una enfermedad de cítrico) y/o al menos un síntoma de una enfermedad de planta puede comprender tratar y/o curar una o más enfermedades bacterianas devastadoras de cítrico. Por ejemplo, las plantas que comprenden transgenes SoD2 y SoD7 establemente integrados en forma expresable pueden exhibir resistencia a, sin
limitación, úlcera bacteriana {Xanthomonas axonopodis pv. Citri) (Xac) y/o citrus Huanglongbing (ex verdor) causado por Candidatus Liberibacter asiaticus (Las). Dichas resistencia ha sido observada como se describe en los ejemplos más adelante.
De conformidad con algunas modalidades, la presente descripción se refiere a composiciones, organismos, sistemas y métodos para aumentar la resistencia nativa de una planta y/o conferir en una planta resistencia a una enfermedad de planta (por ejemplo, una enfermedad de cítrico). Por ejemplo, un método puede comprender contactar una planta con un péptido antimicrobiano y/o un ácido nucleico expresable que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando un péptido antimicrobiano. Un ácido nucleico expresable que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando un péptido antimicrobiano puede ser y/o comprender un cásete de expresión en algunas modalidades. Contactar puede comprender, de conformidad con algunas modalidades, injertar al menos una porción de una planta diana con una planta que comprende un péptido antimicrobiano y/o un ácido nucleico expresable que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando un péptido antimicrobiano. En algunas modalidades, contactar puede comprender contactar al menos una porción de una planta diana con un vector (por ejemplo, vía transformación mediada por Agrobacterium) que comprende un péptido antimicrobiano y/o un ácido nucleico expresable que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido antimicrobiano. Ejemplos de una
enfermedad de planta incluyen, sin limitación, úlcera bacteriana (Xanthomonas axonopodis pv. Citri) (Xac) y/o citrus Huanglongbing (ex verdor) causado por Candidatus Liberibacter asiaticus (Las).
D. HACER UN PEPTIDO ANTIMICROBIANO EXPRESABLE
CITRICO
En algunas modalidades, la presente descripción se refiere a composiciones, organismos, sistemas y métodos para formar un ácido nucleico expresable cítrico que comprende una secuencia de ácido nucleico codificando al menos un péptido antimicrobiano derivado de espinaca. Por ejemplo, un método puede comprender identificar una secuencia de aminoácido de un péptido antimicrobiano de interés, traducir en reversa la secuencia de aminoácido para producir una primera secuencia de ácido nucleico; optimizar con codón la primera secuencia de ácido nucleico para expresión en cítrico para producir una segunda secuencia de ácido nucleico, y/o sintetizar un ácido nucleico que tiene la segunda secuencia de ácido nucleico. Un método puede comprender, en algunas modalidades, unir covalentemente un ácido nucleico que tiene la segunda secuencia de ácido nucleico con uno o más ácidos nucleicos teniendo secuencias de control de expresión que son operables en cítrico en una orientación operable y/o posición relativa al ácido nucleico que tiene la segunda secuencia de ácido nucleico.
Como lo entenderán aquellos expertos en la técnica que tienen el beneficio de la presente descripción, otras composiciones cítricas resistentes a patógeno equivalentes o alternativas, organismos, sistemas y métodos se pueden concebir sin alejarse de la descripción contenida en la presente. Por consiguiente, la manera de llevar a cabo la descripción como se muestra y describe sólo debe ser considerada como ilustrativa.
Aquellos expertos en la técnica pueden hacer varios cambios en la forma, tamaño, número y/o distribución de partes sin alejarse del alcance de la presente descripción. Por ejemplo, la posición y numero de secuencias de control de expresión, secuencias codificadoras, enlazadores y/o secuencias terminadoras se pueden variar. Cada método descrito y paso de método se puede realizar en asociación con cualquier otro método descrito o paso de método y en cualquier orden de conformidad con algunas modalidades. En donde aparece el verbo "puede", debe transportar una condición opcional y/o permisiva, pero su uso no debe sugerir ninguna falta de habilidad de operar a menos que se indique lo contrario. Aquellos expertos en la técnica pueden hacer varios cambios en métodos para preparar y usar una composición, dispositivo y/o sistema de la descripción. Por ejemplo, una composición, dispositivo y/o sistema se puede preparar y/o usar según sea apropiado para microbio y/o planta (por ejemplo, con respecto a salubridad, infectividad , seguridad, toxicidad, consideraciones biométricas y otras). En donde se desee, algunas modalidades de la descripción se pueden practicar a la exclusión de
otras modalidades. Por ejemplo, algunas modalidades de polipéptido se pueden practicar a la exclusión de una secuencia de aminoácido particular (por ejemplo, SEC ID NO: 26) y/o algunas modalidades de ácido nucleico se pueden practicar a la exclusión de una secuencia de ácido nucleico particular (por ejemplo, SEC ID NO: 27).
También, donde se han provisto rangos, los puntos finales descritos se pueden tratar como exactos y/o aproximaciones según se desee o demande por la modalidad particular. En donde los puntos finales son aproximados, el grado de flexibilidad pueden variar en proporción a la orden de magnitud del rango. Por ejemplo, por un lado, un punto final de rango de aproximadamente 50 en el contexto de un rango de alrededor de 5 a aproximadamente 50 puede incluir 50.5, pero no 52.5 o 55 y, por el otro lado, un punto final de rango de aproximadamente 50 en el contexto de un rango de alrededor de 0.5 a aproximadamente 50 puede incluir 55, pero no 60 o 75. Además, se puede desear, en algunas modalidades, mezclar e igualar los puntos finales de rango. También, en algunas modalidades, cada figura descrita (por ejemplo, valor ilustrado +/-aproximadamente 10%, valor ilustrado +/- aproximadamente 50%, valor ilustrado +/- aproximadamente 100%) y/o un punto final de rango. Con respecto a lo anterior, un valor de 50 ilustrado en un ejemplo, tabla y/o dibujo puede formar la base de un rango de, por ejemplo, alrededor de 45 a aproximadamente 55, de alrededor de 25 a aproximadamente 100 y/o de alrededor de 0 a aproximadamente 100.
Estos equivalentes y alternativas junto con cambios y modificaciones obvias se deben incluir dentro del alcance de la presente descripción. Por consiguiente, la descripción anterior debe ser ilustrativa, pero no limitante, del alcance de la descripción como se ilustra por las reivindicaciones anexas.
EJEMPLOS
Algunas modalidades de ejemplo específicas de la descripción se pueden ilustrar por uno o más de los ejemplos provistos en la presente.
EJEMPLO 1: Material de planta
Los materiales de planta (por ejemplo, Citrus sinensis) en general fueron preparados para transformación como se describe por Yang y otros, Plant Cell Reports (2000) 19:1203 y siguientes.
EJEMPLO 2: Construcción de plásmido y cepas bacterianas
Construcción de plásmido y cepas bacterianas en general se realizaron como se describe por Yang y otros, Plant Cell Reports (2000) 19:1203 y siguientes.
EJEMPLO 3: Co-cultivo de Aprobacterium y transformación de planta
El co-cultivo de Agrobacterium y transformación de planta en general se realizaron como se describe por Yang y otros, Plant Cell Reports (2000) 19:1203 y siguientes.
EJEMPLO 4: Selección y regeneración de brotes transgénicos
La selección y regeneración de brotes transgénicos en general se realizaron como se describe por Yang y otros, Plant Cell Reports (2000) 19:1203 y siguientes.
EJEMPLO 5: Injerto de brotes transgénicos
El injerto de brotes transgénicos en general se realizó como se describe por Yang y otros, Plant Cell Reports (2000) 19:1203 y siguientes.
EJEMPLO 6: Análisis Southern y Northern
Análisis Southern y northern en general se realizaron como se describe por Yang y otros, Plant Cell Reports (2000) 19:1203 y siguientes.
EJEMPLO 7: Expresión en árboles cítricos
La tabla 1 ¡lustra modalidades de ejemplo específicas de secuencias de ácido nucleico optimizadas con cítrico para cítrico. Péptidos de señal y secuencias codificadoras de genes estructurales mostrados se flanquean en cualquier lado por sitios de enzima de restricción específicos. Estas secuencias se usaron para construir casetes de expresión, vectores y transformaron Agrobacterium para preparación de plantas transgénicas.
Tabla 1. Modalidades de ejemplo de secuencias de nucleótido específicas de genes antimicrobianos. Las secuencias de nucleótido se optimizaron para uso de codón en Citrus.
Los siguientes cultivos se seleccionaron para transformación:
Naranja: Hamlin ("04"), Rohde Red ("05") y Marrs ("06") (FIGURAS 3-7);
Toronja: Ruby Red ("01") (FIGURAS 8-11) y Rio Red (Ejemplo 14 más adelante);
Carrizo Citrange ("CC") (FIGURAS 12-13);
Rizoma Flying Dragón (13" y "16");
Rizoma Swingle (13" y "16"); y
Rizoma C22.
Se muestran en la tabla 2 construcciones usadas para cada cultivo
Tabla 2: Cultivos de rizoma de naranja, toronja, lima y cítrico transformados (epicotilos de semillero) con tres secuencias sintéticas diferentes de cada gen SoD2 y SoD7 codificando péptidos antimicrobianos de espinaca (Spinacia olerácea) (al menos 521 hechos en total).
A. Transformación de naranja
Se transformaron planas de naranja con una construcción individual que comprende SoD2 optimizado con GenScript con péptido de señal ("07"), SoD7 optimizado con GenScript con péptido de señal ("08"), SoD2 optimizado con CODA con péptido de señal ("09"), o SoD2 optimizado con CODA con péptido de señal ("10"). La FIGURA 3 es una representación de un Southern blot que muestra número de inserción entre hechos transgénicos en Hamlin transformado con
SoD2 optimizado con GenScript (0407) y Rhode Red transformado con SoD2 optimizado con GenScript (0507). La FIGURA 4 es una representación de un Southern blot que muestra número de inserción entre hechos transgénicos en Hamlin transformado con SoD2 optimizado con CODA (0409) o SoD7 optimizado con CODA (0410) Y Rohde Red transformado con SoD2 optimizado con CODA (0509) o SoD7 optimizado con CODA (0510). Se muestran hechos de transformación adicionales para SoD7 optimizado con GenScript ("08") y SoD2 optimizado con CODA ("09") en Hamlin en la FIGURA 9.
Las plantas transgénicas de los cultivos de naranja Hamlin,
Rohde Red, y Marrs (n = 82) producen niveles altos de transcripciones de estos genes antimicrobianos (Tabla 2 y FIGURAS 5-7). La FIGURA 5 es una representación de un northern blot que muestra transcripciones de ARN entre hechos transgénicos en Marrs, transformados con genes SoD2 (0607) o SoD7 (0608) optimizado con GenScript para uso de codón en Citrus. La FIGURA 6 es una representación de un northern blot que muestra transcripciones de ARN entre hechos transgénicos en Hamlin transformado con SoD2 optimizado con CODA (0409) o SoD7 optimizado con CODA (0410) y Rohde Red transformado con SoD2 optimizado con CODA (0509) o SoD7 optimizado con CODA (0510). La FIGURA 7 es una representación de un northern blot que muestra transcripciones de ARN entre hechos transgénicos en Hamlin transformado con SoD2 optimizado con GenScript (0407) o SoD7 optimizado con GenScript (0408) y Rohde Red transformado con SoD2 optimizado con GenScript
(0507) o SoD7 optimizado con GenScript (0508). Para identificación, la tabla 2 contiene los códigos de hecho transgénico para combinación de cultivo y gen.
También se transformaron plantas de naranja (Hamlin) con una construcción individual que comprende SoD2 optimizado con ADN 2.0 sin péptido de señal ("11") o SoD7 optimizado con ADN 2.0 sin péptido de señal ("12"). La FIGURA 8 es una representación de un Southern blot que confirma la inserción de SoD2 o SoD7 en estas plantas de naranja. Se muestran hechos de transformación adicionales para SoD7 (12) en Hamlin en la FIGURA 9.
B. Transformación de toronja
Plantas Ruby Red ("01") se transformaron con una construcción individual que comprende SoD2 optimizado con ADN 2.0 sin péptido de señal ("11") o SoD7 optimizado con ADN 2.0 sin péptido de señal ("12"). La FIGURA 9 es una representación de un Southern blot (la membrana fue expuesta a sondas para SoD2 y SoD7) confirmando inserción de SoD2 o SoD7 en estas plantas de toronja. La FIGURA 10 es una representación de un northern blot (la membrana fue expuesta a sondas para SoD2 y SoD7) mostrando transcripciones de ARN entre hechos transgénicos en Ruby Red transformado con SoD2 (0111) o SoD7 (0112). Para identificación, la tabla 2 contiene los códigos de hecho transgénico para combinación de cultivo y gen.
C. Transformación de Carrizo Citrange y C22
Rizomas Carrizo Citrange y C22 han sido transformados con una construcción que comprende uidA y SoD2 o SoD7 o SoD2+SoD7. La FIGURA 11 es una representación de un Southern blot que confirma inserción de SoD2 (líneas marcadas "07") y SoD7 (líneas marcadas "08") en estas plantas Carrizo Citrange. La FIGURA 12 es una representación de un northern blot que muestra transcripciones de ARN aisladas de estas plantas Carrizo Citrange (marcadas "CC") transformadas con SoD2 (secuencia optimizada con GenScript con péptido de señal) y SoD7 (secuencia optimizada con GenScript con péptido de señal). Para identificación, la tabla 2 contiene los códigos de hecho transgénico para combinación de cultivo y gen. Un número de hechos de transformación C22 se han confirmado en cada uno por manchado de GUS positivo.
Se transformaron plantas Swingle y FIying Dragón (rizoma cítrico) con varias construcciones que incluyen una construcción individual que comprende SoD2 y SoD7 optimizado con GenScript con péptido de señal. La transformación exitosa de plantas C22, FIying Dragón y Swingle al menos ha sido confirmada por manchado GUS positivo.
D. Transformación de lima
Se transformaron plantas Frost Lisbon y Frost Eureka (lima) con varias construcciones incluyendo una construcción individual que comprende SoD2 y SoD7 optimizado con GenScript con péptido de señal. La transformación exitosa de plantas C22, Flying Dragón y Swingle al menos se ha confirmado por manchado GUS positivo.
EJEMPLO 8: Ensayo de resistencia a enfermedad de úlcera
Se evaluó la resistencia a enfermedad de úlcera usando un ensayo de hoja desprendida en general como se describe por Francis MI y otros, 2010, Eur J Plant Pathol 127:571-578. En breve, las hojas inmaduras desprendidas (~75% expandidas) se enjuagaron tres veces en agua estéril para eliminar desechos, se desinfectaron por inmersión breve en 70% de etanol seguido por 0.5% hipocloruro de sodio, y una vez más se enjuagaron tres veces en agua estéril. Las hojas desinfectadas (3-4 por copias x 3 copias) se infiltraron en su superficie abaxial con una suspensión acuosa de una cepa Xcc aislada en Dade County Florida. Se prensaron hojas inoculadas en la superficie de placas agar de agua blanda, selladas con parafina e incubadas en una cámara de crecimiento controlado ambientalmente.
La figura 13A muestra el resultado de inocular una hoja "Rio Red" no transgénica con el patógeno de úlcera cítrico, como se describió antes, y la figura 13B muestra el resultado de inocular una
hoja transgénica de una planta de 'Rio Red' expresando SoD2 con el patógeno de úlcera cítrico, como se describió antes. Se puede observar una reducción grande en el tamaño y número de lesión en el transgénico.
EJEMPLO 9: Ensayo de resistencia a enfermedad de verdor cítrico (HLB) por injerto
La figura 14 muestra el resultado de inocular injerto 'Rio Red' no transgénico (dos árboles a la izquierda) o 'Rio Red' transgénico expresando SoD2 un árbol a la derecha) con el patógeno de verdor cítrico. Se usa un rizoma no transgénico (mandarina Cleopatra) infectado con HLB. En este rizoma se injertan varios capullos de 'Rio Red' transgénico y eso se repite. El mismo protocolo es seguido para capullos no transgénicos de 'Rio Red'. Después de 8 semanas, se puede observar crecimiento vigoroso del injerto transgénico, en donde no hay crecimiento en los controles.
EJEMPLO 10: Ensayo de resistencia a enfermedad de verdor cítrico (HLB) por inoculación de psílido
Se evaluó la resistencia a infección bacteriana y crecimiento por dos métricos. Primero, se evaluó la resistencia por el porcentaje de infección, a saber el número de plantas expuestas que se infectaron. Segundo, se usó un método a base de PCR para
amplificar secuencias bacterianas. En este método, el grado relativo de infección influye en el número de ciclos de PCR requeridos para producir señal detectable. Por ejemplo, una planta pesadamente infestada sólo puede requerir pocos ciclos mientras que una planta con un título bajo bacteriano puede requerir más ciclos. En general, una planta que requiere 30 o más ciclos para observar señal detectable es vista como no infectada. Ya que algunas infecciones de cítrico avanzan lentamente, se recolectaron muestras para probar a 5 a 11 meses después del tiempo de la primera exposición y después sobre un periodo de 6-9 meses. La frecuencia de la recolección de muestra puede variar cada aproximadamente 45 días a aproximadamente cada 120 días. Diez a 15 copias de cada hecho transgénico más controles no transgénicos se colocan al azar en un invernadero a prueba de insectos que contiene miles de psilidos portando el patógeno de verdor cítrico. La primera prueba de PCR se realiza aproximadamente cinco meses después de exposición continua a psilidos. La extracción de ADN y PCR para detectar el patógeno es en esencia como se describe por Irey MS y otros, 2006, Proc. Fia. State Hort. Soc. 119:89-93.
EJEMPLO 11: Propagación v resistencia de generación 1
Se transformaron Red Grapefruit (toronja roja) (2 variedades) y Sweet Orange (naranja dulce) (3 variedades) con Agrobacterium comprendiendo un vector de expresión que tiene una construcción de
gen de defensina artificial que incluyó una inserción de 2-aminoácido en el péptido de señal y una sola omisión de aminoácido en la secuencia codificadora (SEC ID NOS: 26 y 27). Un total de 6 hechos de transformación fueron probados además con base en tener niveles altos de SoD2 ARN expresado. Se cultivaron plantas como se describe en la presente y se evaluó la resistencia bacteriana como se describe. Una primera serie de muestras fue recolectada después de 11 meses en el campo (DO). Se recolectaron muestras posteriores el número indicado de días (42-471) después de la primera muestra (por ejemplo, D42 = 11 meses + 42 días). Los resultados son mostrados en la tabla 3.
Tabla 3: Datos de infección de generación 1
EJEMPLO 12: Propagación y resistencia de generación 2
Se transformaron Sweet Orange (2 variedades) con Agrobacterium comprendiendo una de las siguientes construcciones de genes de defensina:
(a) SoD2 optimizado con GenScript con péptido de señal PR-1b de tabaco (SEC ID NO: 9),
(b) SoD2 optimizado con CODA con péptido de señal PR-1b de tabaco (SEC ID NO: 11),
(c) SoD7 optimizado con GenScript con péptido de señal PR-1b de tabaco (SEC ID NO: 10), o
(d) SoD7 optimizado con CODA con péptido de señal PR-1b de tabaco (SEC ID NO: 12).
Se observó un total de 71 hechos de transformación. Se cultivaron plantas como se describe en la presente y se evaluó la resistencia bacteriana como se describe. Una primera serie de muestras fue recolectada después de 5 meses en la casa de psílido (día 0). Se recolectaron muestras posteriores el número indicado de días después de la primera muestra (por ejemplo, día 73 = 5 meses + 73 días). Se muestran resultados en las FIGURAS 15A a 15B, FIGURAS 16A a 16B, Tabla 4 y Tabla 5.
EJEMPLO 13: Propagación y resistencia de generación 3
Una variedad de Sweet Orange y una variedad de toronja se transformaron con Agrobacterium comprendiendo una de las siguientes construcciones de gen de defensina:
(a) SoD2 optimizado con GenScript sin péptido de señal (SEC ID NO: 3), o
(b) SoD7 optimizado con GenScript sin péptido de señal (SEC ID NO: 4).
Se observó un total de 36 transformaciones. Se cultivaron plantas como se describe en la presente y se evaluó la resistencia bacteriana como se describe. Una primera serie de muestras fue recolectada después de 5 meses en la cada de psílido (Día 0). Se recolectaron muestras posteriores el número indicado de días después de la primera muestra (por ejemplo, Día 103 = 5 meses + 103 días). Se muestran resultados en las FIGURAS 16A y 16B y tabla 5.
EJEMPLO 14: Propagación y resistencia de generación 4
Una primera línea de Sweet Orange (2 variedades), una toronja, y dos rizomas se prepararon para co-expresar (i) GenScript SoD2 con péptido de señal PR-1b de tabaco (SEC ID NO: 9) y (ii) GenScript SoD7 con péptido de señal PR-1b de tabaco (SEC ID NO: 10). Más específicamente, se transformaron plantas con una construcción doble de defensina comprendiendo, en una dirección 5' a 3' SoD2, uidA, y SoD7 (13). Se observó un total de 29 hechos de transformación con otros 28 candidatos GUS-positivos en cultivo de tejido o justo fuera del cultivo de tejido. Las plantas confirmadas para co-expresar SoD2 y SoD7 serán cultivadas y evaluadas en ensayos de infección para determinar el grado al cual la coexpresión previene, mejora y/o trata la infección.
La FIGURA 9 es una representación de un Southern blot
(membrana fue expuesta a sondas para SoD2 y SoD7) mostrando número de inserción entre hechos transgénicos en Hamlin transformado con una doble construcción de defensina comprendiendo SoD2 y SoD7 (0413). La FIGURA 10 también muestra número de inserción entre hechos transgénicos en Hamlin transformado con una doble construcción de defensina comprendiendo SoD2 y SoD7 (0413).
Se transformaron plantas Rio Red (02) con una doble construcción de defensina (13). La FIGURA 17 es una representación de un Southern blot que confirma la inserción de SoD2 y SoD7 en
estas plantas Rio Red. Se cortó ADN con una sola enzima de restricción que corta dentro de SoD2, uidA y SoD7 y se mancha con sondas SoD2 y SoD7 simultáneamente. La FIGURA 18 es una representación de un northern blot que muestra transcripciones de ARN aisladas de plantas Rio Red (marcadas "02") transformadas con SoD2 (secuencia optimizada con GenScript con péptido de señal) y SoD7 (secuencia optimizada con GenScript con péptido de señal). También se muestran transcripciones de ARN aisladas de plantas Hamlin (marcadas "04").
EJEMPLO 15: Propagación y resistencia a generación 5
La evaluación de co-expresión de SoD2 y SoD7 está en proceso. Una línea de Sweet Orange (una variedad) fue preparada para co-expresar (i) ADN 2.0 SoD2 sin péptido de señal (SEC ID NO: 30) y (ii) ADN 2.0 SoD7 sin péptido de señal (SEC ID NO: 31). Se puede confirmar transformación y expresión por análisis Southern y northern blot. Se pueden cultivar plantas descritas en la presente y resistencia bacteriana evaluada como se describe. Las plantas confirmadas para co-expresar SoD2 y SoD7 se pueden cultivar y evaluar en ensayos de infección para determinar el grado al cual la co-expresión previene, mejora y/o trata infección.
EJEMPLO 16: Expresión de construcciones de defensina en varias plantas
Se ha confirmado la expresión estable de construcciones de defensina comprendiendo secuencias de ácido nucleico optimizadas con codón para cítrico en lo siguiente:
Cultivo Código de gen # Hechos
Toronja Rio Red 13 ?~8
Toronja Ruby Red 11 y 12 12
Naranja Hamlin Sweet 07, 08, 09, 10, 11 , Más de 86
12, 13 y 16
Naranja Marrs Sweet 07 y 08 13
Naranja Rohde Red Valencia 07, 08, 09, 10, 13 Más de 48
Lima Frost Eureka 13 y 16 Más de 30
Lima Frost Lisbon 13 y 16 Más de 33
Rizomas C22 y Carrizo Citrange 07, 08, 13 42
Rizomas Flying dragón y Swingle 13 Múltiples GUS +
Para todas las construcciones, se han descubierto hechos de transformación individuales abarcando un rango de niveles de expresión de ninguna expresión (por ejemplo, ya que los resultados de Southern demuestran el gen está presente, a menudo en múltiples copias, puede ser que el transgen ha sido silenciado) a expresión baja a expresión alta.
EJEMPLO 17: Anticuerpos a SoD2 y SoD7
Anticuerpos fueron cultivados a SoD2 y SoD7. Se sintetizó péptido SoD7 de longitud completa por GenScript. Se inyectaron alícuotas de SoD7 sintético (200 µg cada vez) en cada uno de 2 conejos diferentes cada tres semanas durante un total de 4 inyecciones. Se recolectó suero 2 semanas después de las terceras y 2 semanas después de las cuartas inyecciones. Se purificó IgG usando columna de proteína A. Se purificó IgG específico de SoD7 al pasar la preparación de IgG sobre una columna de SoD7 sintético conjugado a cuentas de agarosa y después eluyendo con un regulador de pH bajo. El eluado fue explorado para unión a una serie de dilución de 1 ng a 100 ng de SoD7 sintético. La FIGURA 19 es un Western blot qu ilustra unión de los anticuerpos IgG específicos de SoD7 purificado a aproximadamente 20 ng de péptido SoD7 en plantas transgénicas (líneas 3, 4 y 6-9), plantas no transgénicas picadas con péptido SoD7 sintético (línea 5) o SoD7 sintético puro (línea 10).
Claims (23)
1. - Un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico teniendo aproximadamente 98% de identidad a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 5 y codificando un péptido que tiene una secuencia de aminoácido teniendo por lo menos aproximadamente 99% de identidad a SEC ID NO: 1.
2. - Un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico teniendo aproximadamente 98% de identidad a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 31 y SEC ID NO: 6 y codificando un péptido que tiene una secuencia de aminoácido teniendo por menos aproximadamente 99% de identidad a SEC ID NO: 2.
3.- Un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico teniendo aproximadamente 98% de identidad a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 11 y codificando un péptido que tiene una secuencia de aminoácido teniendo por menos aproximadamente 99% de identidad a SEC ID NO: 7.
4.- Un ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico teniendo aproximadamente 98% de identidad a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 12 y codificando un péptido que tiene una secuencia de aminoácido teniendo por menos aproximadamente 99% de identidad a SEC ID NO: 8.
5.- Un vector de expresión que comprende, en una dirección 3' a 3': una secuencia de control de expresión; un ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión; y una secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al ácido nucleico exógeno, en donde el ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico teniendo al menos 98% de identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 31.
6 - Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 5, en donde el vector de expresión se ubica en una célula bacteria na .
7 - Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 5, en donde el vector de expresión se ubica en una célula vegetal.
8.- Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 5, en donde la secuencia de nucleótido de posiciones -4 a +4 es AACAA.TGG.
9.- Un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 5 que comprende además un enlazador 3' de la secuencia de control de expresión, 5' del ácido nucleico exógeno, y teniendo una longitud de alrededor de 1 a aproximadamente 200 nucleótidos.
10 - Una célula bacteriana que comprende un vector de expresión, el vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3': una secuencia de control de expresión; un ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión; y una secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al ácido nucleico exógeno, en donde el ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 98% de identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 31.
11.- Una célula vegetal cítrica que comprende un vector de expresión, el vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3': una secuencia de control de expresión; un ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión; y una secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al ácido nucleico exógeno, en donde el ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 98% de identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 31.
12. - Una célula vegetal cítrica de conformidad con la reivindicación 11, en donde la célula vegetal cítrica se ubica en una planta cítrica.
13. - Una célula vegetal cítrica de conformidad con la reivindicación 11, en donde la planta se selecciona a partir del grupo que consiste de naranja y toronja.
14.- Una célula vegetal cítrica de conformidad con la reivindicación 11 que comprende además un péptido que tiene una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos aproximadamente 99% de identidad a SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 8.
15 - Una planta cítrica que comprende un vector de expresión, el vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3': una secuencia de control de expresión; un ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión; y una secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al ácido nucleico exógeno, en donde el ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 98% de identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 31.
16. - Una planta cítrica de conformidad con la reivindicación 15, en donde la planta se selecciona a partir del grupo que consiste de naranja y toronja.
17. - Una planta cítrica de conformidad con la reivindicación 15 que comprende además un péptido que tiene una secuencia de aminoácido teniendo al menos aproximadamente 99% de identidad a SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 7 o SEC ID NO: 8.
18.- Una célula vegetal cítrica que comprende (a) un primer vector de expresión, el primer vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3': una primera secuencia de control de expresión; un primer ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la primera secuencia de control de expresión; una primera secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al primer ácido nucleico exógeno, en donde el primer ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 98% de identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 30; y (b) un segundo vector de expresión, el segundo vector de expresión que comprende, en una dirección 5' a 3': una segunda secuencia de control de expresión; un segundo ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la segunda secuencia de control de expresión; y una segunda secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al segundo ácido nucleico exógeno, en donde el segundo ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 98% de identidad a una secuencia de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 6, SEC ID NO:16, SEC ID NO: 12 y SEC ID NO: 31.
19. - Una planta cítrica de conformidad con la reivindicación 18, en donde la planta se selecciona a partir del grupo que consiste de naranja y toronja.
20. - Una planta cítrica de conformidad con la reivindicación 18 que comprende además: un primer péptido que tiene una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos aproximadamente 99% de identidad a SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 7; y un segundo péptido que tiene una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos aproximadamente 99% de identidad a SEC ID NO: 2 o SEC ID NO: 8.
21.- Un método de expresar en una planta cítrica un ácido nucleico exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de expresión, el método que comprende: contactar un cásete de expresión que comprende el ácido nucleico exógeno o un vector de expresión que comprende el ácido nucleico exógeno con el citosol de una célula de la planta cítrica bajo condiciones que permiten expresión del ácido nucleico exógeno y formación del péptido expresado, en donde el ácido nucleico exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene por lo menos 98% de identidad a una secuencia de acido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 30 y SEC ID NO: 31, el cásete de expresión o vector de expresión comprende, en una dirección 3' a 5', una secuencia de control de expresión, el ácido nucleico exógeno operativamente enlazado a la secuencia de control de expresión, y una secuencia de terminación 3' operativamente enlazada al ácido nucleico exógeno, y el péptido expresado comprende una secuencia de aminoácido teniendo por lo menos 99% de identidad a una secuencia de aminoácido seleccionada a partir del grupo que consiste de SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 8.
22. - Un método de conformidad con la reivindicación 21, en donde el contacto comprende además co-cultivar la célula con una célula de Agrobacterium que comprende el vector de expresión o cásete de expresión para formar una célula co-cultivada.
23. - Un método de conformidad con la reivindicación 21 que comprende además regenerar una planta de la célula co-cultivada.
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