MX2014008728A

MX2014008728A - Anticuerpos anti-cxcr3.

Info

Publication number: MX2014008728A
Application number: MX2014008728A
Authority: MX
Inventors: Michele Youd; Jennifer Tedstone; Tracey Lodie; Karen B Carter; Timothy D Connors; Jason Robert Pinckney; Elizabeth Masterjohn; Ruiyin Chu
Original assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2012-01-20
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2015-07-06
Also published as: BR112014017814A8; RS58141B1; KR20200014441A; US9765144B2; PL2804878T3; TWI596112B; JP6352812B2; ES2698606T3; US20130251733A1; DK2804878T3; SG10201700735PA; MX359854B; US20190119391A1; WO2013109974A3; SI2804878T1; US20140377806A1; RU2663141C2; KR20140116525A; JP6646100B2; HRP20181874T1

Abstract

La presente descripción proporciona anticuerpos anti-CXCR3 y métodos para utilizar los anticuerpos para diagnosticar y/o tratar trastornos asociados con CXCR3, tales como diabetes mellitus tipo I (TID), particularmente TID de nuevo inicio. En ciertas modalidades, la presente describe anticuerpos neutralizantes de CXCR3.

Description

ANTICUERPOS ANTI-CXCR3 Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad bajo 35 U.S.C. § 1 19 de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61/588.936, presentada el 20 de enero, 2012, que se incorpora en la presente descripción por referencia en su totalidad.

La invención se refiere a anticuerpos y a métodos para usar los anticuerpos para tratar trastornos asociados con la señalización de CXCR3 tales como diabetes mellitus de tipo 1 (diabetes de tipo I; T1 D).

La diabetes se caracteriza por hiperglucemia crónica que resulta de una ausencia de acción de la insulina, junto con varias anormalidades metabólicas características. La diabetes puede dividirse ampliamente en tipo I y tipo II. T1 D se caracteriza por la pérdida de las células b pancreáticas de los islotes de Langerhans, mientras la diabetes de tipo II se caracteriza por reducciones tanto en la secreción de insulina como en la sensibilidad a la insulina (resistencia a la insulina). En los Estados Unidos, la predominancia de la diabetes es aproximadamente 2 a 4 por ciento de la población, con la diabetes de tipo I (también conocida como dependiente de insulina o IDDM) representando aproximadamente 7 a 10 por ciento de todos los casos.

La diabetes de tipo I se caracteriza por la incapacidad de producir suficiente insulina para mantener la homeostasis de la glucosa. Se cree que este trastorno está causado por la destrucción mediada por autommunidad de las células b pancreáticas. La autoinmunidad asociada con la diabetes de tipo I implica la participación de linfocitos tanto B como T autorreactivos. De hecho, hasta el 98% de los pacientes con diabetes de tipo I tienen anticuerpos frente a uno o más de sus antígenos de célula b propios, incluyendo insulina, ácido glutámico descarboxilasa (GAD), antígeno 2 de insulinoma y antígeno 2b de insulinoma (IA-2 e IA-2-b) y antígenos citoplásmicos de células de islote heterogéneos (ICA). Aunque no siempre puede ser determinante, el nivel de uno o más autoanticuerpos se correlaciona generalmente con el estado de la destrucción de las células b. Irvine et al., Diabetes, 26: 138-47 (1997); Rilcy, et al., N. Engl. J. Med. , 323: 1 167-72 (1990). De acuerdo con esto, los autoanticuerpos pueden servir como indicadores del desarrollo de diabetes autommunes y junto con cambios metabólicos pueden predecir el riesgo de desarrollar diabetes en familiares de pacientes T1 D.

El desarrollo de la diabetes de tipo I puede estar mediado por células T autorreactivas, como se pone de manifiesto por biopsias de tejidos obtenidas cerca del momento del diagnóstico de T1 D que muestran los islotes infiltrados con células T activadas. Bottazo et al., N. Engl. J. Med., 313:353-60 (1985); Hanninen et al., J. Clin. Invest. , 90: 1901 -10 (1992); Itoh et al. , J. Clin. Invest., 92:2313-22 (1993); Imagawa, et al. , Diabetes 50: 1269-73 (2001 ).

El receptor 3 de quimiocina (resto C-X-C) (CXCR3), también conocido como receptor 9 acoplado a proteína G (GPR9), CD183, receptor IP-10 y receptor Mig, es un receptor de quimiocina expresado en células T autorreactivas que se han implicado en un rango de procesos fisiológicos y trastornos relacionados, tales como T1 D. CXCR3 está en gran medida ausente de celulas T sin activar pero está regulado al alza después de la activación con antígeno y recluta células activadas a los sitios de inflamación tisular en respuesta a sus ligandos primarios: CXCL9, CXCL10 y CXCL1 1. Se ha mostrado que las células b expresan predominantemente CXCL10, con niveles menores de CXCL9, en modelos de ratón de T1 D (Christen et al. The Journal of Immunology, 2003, 171 : 6838-6845; Morimoto et al. J Immunol 2004; 173; 7017-7024; Sarkar et al. Diabetes. 2012 Feb; 61 (2): 436-46); y en islotes de pacientes con T1 D que tienen insulitis (Uno et al 2010; Roep et al Clinical and Experimental Immunology. 2003, 159: 338-343; Sarkar et al. Diabetes. 2012 Feb; 61 (2): 436-46). Además, se ha mostrado que las células T que se han infiltrado en el páncreas expresan CXCR3 en modelos de ratón de T1 D y muestras de páncreas de pacientes con diabetes de tipo 1 (Christen et al, The Journal of Immunology, 2003, 171 : 6838-6845; Van Halteren et al. , Diabetologla 48: 75-82 (2005); Uno et al 2010; Roep et al., Clinical and Experimental Immunology, 2003, 159: 338-343; Sarkar et al., Diabetes. 2012 Feb; 61 (2): 436-46). Además, ratones con inactivación génica deficientes en CXCR3 demuestran un retraso significativo en el inicio y una reducción en la incidencia de T1 D (Frigerio et al., Nature Medicine 8: 1414-1420 (2002)), mientras la sobreexpresión de CXCL10 en los islotes de ratones transgénicos estimula la infiltración de células T y acelera el inicio de T1 D (Rhode et al. , J. Immunol. 175(6): 3516-24 (2005)). Se ha mostrado que la neutralización de CXCL10 por tratamiento con anticuerpos es protectora (Christen et al., The Journal of Immunology, 2003, 171 : 6838- 6845).

Existen tres isoformas de CXCR3, denominadas A, B y Alt., que se han identificado en los seres humanos (Lasagni et al. J. Exp. Med. 2003 197: 1537; Ehlert et al J. Immunol. 2004; 173; 6234-6240). CXCR3-A se une a las quimiocinas CXC CXCL9 (MIG), CXCL10 (IP-10) y CXCL1 1 (I-TAC); CXCR3-B también se une a estos objetivos pero también se une a CXCL4; CXCR3-AU parece interaccionar con CXCL11. Aunque el corte y empalme alternativo da lugar a la generación de varias isoformas de la proteína de CXCR3, CXCR3-A es la forma predominante in vivo ya que CXCR3-B y CXCR3-AU se expresan en niveles mucho más bajos a nivel de proteína. Lasagni et al. J. Exp. Med. 2003 197: 1537; Ehlert et al J. Immunol. 2004; 173; 6234-6240.

Los esfuerzos para alterar la ruta de CXCR3 usando pequeñas moléculas inhibidoras de CXCR3 no se ha probado totalmente eficaz. Christen et al., Clin Exp. Immunol. 165: 318-328 (201 1 ). De acuerdo con esto, la investigación se ha centrado en anticuerpos y otros métodos para alterar CXCL10, principalmente antes del inicio de la diabetes. Morimoto et al., J. Immun. 173: 7017-7024 (2004); Oikawa et al., Rev. Dlabet. Stud. 7: 209-224 (2010).

A la vista de la predominancia de T1 D y otros trastornos en los que se ha implicado a CXCR3, existe una necesidad de métodos adicionales que tienen como objetivo la señalización de CXCR3, por ejemplo, para tratar o reducir la progresión de un trastorno tal como T1 D en un paciente.

En la presente descripción se describen anticuerpos y métodos para usar los anticuerpos que son capaces de unirse a CXCR3. En algunas modalidades, los anticuerpos pueden usarse para prevenir, tratar o reducir la progresión temprana de T1 D en un sujeto tomando como objetivo la ruta de CXCR3. Los anticuerpos y métodos se basan, al menos en parte, en el resultado sorprendente de que anticuerpos neutralizantes dirigidos a CXCR3 pueden prevenir el inicio de T1 D en ratones NOD cuando se administran antes del inicio de la enfermedad, o pueden revertir el curso de la enfermedad cuando se administran en el estadio de inicio reciente de T1 D en ratones NOD. Además, la neutralización de la actividad de CXCR3 no está asociada con una alteración significativa de la operación normal del sistema inmune del paciente, reduciendo de esta manera los efectos secundarios no deseados de la terapia con anticuerpos.

De acuerdo con esto, en un aspecto, en la presente descripción se describen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno capaces de neutralizar la actividad de CXCR3. En determinadas modalidades, los anticuerpos neutralizantes de CXCR3 pueden caracterizarse por la capacidad de unirse a un péptido seleccionado de los residuos 1 -58, 1-16 ó 1-37 de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, los anticuerpos comprenden todo o partes de clones de anticuerpo (Cl) designados Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 y/o Cl 4. En determinadas modalidades, se proporcionan variantes de los anticuerpos Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 y/o Cl 4, incluyendo variantes injertadas con CDR, humanizadas, retro mutadas y completamente humanas de los anticuerpos descritos. En modalidades particulares, el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes complementarias (CDR), por ejemplo, una o más de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada y/o una o más de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de los clones Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 y/o Cl 4 o cualquiera de las variantes de los clones 4, 12, 53, 82 y 135 descritas en la presente descripción. En algunas modalidades, los anticuerpos de Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 y/o Cl 4, o las versiones quimericas y humanizadas de éstos, presentan determinadas propiedades beneficiosas, comparado con los clones anti-CXCR3 5H7, 7H5, V44D7, 1 C6 y/o 49801. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden presentar una afinidad de unión incrementada comparada con los clones anti-hCXCR3 5H7, 7H5, V44D7, 1 C6 y 49801. Por ejemplo, el anticuerpo puede presentar una afinidad 1 , 2, 3, 4, 5 o más veces mejor (o cualquier valor intermedio) sobre los anticuerpos anti-CXCR3 tales como 1 C6, por ejemplo, según se mide por resonancia de plasmón superficial (por ejemplo, usando un ensayo BIACORE™). Los anticuerpos humanizados descritos en la presente descripción también tienen una reducción predicha en inmunogenicidad comparado con los clones anti-hCXCR3 de ratón 5H7, 7H5, V44D7, 1 C6 y 49801. Además, los clones de cadena pesada 4.7-4.11 descritos en la presente descripción se han optimizado para eliminar un sitio de desamidación en las posiciones 58 y 59 (usando numeración IMGT) y aumentar de esta manera la estabilidad sobre la secuencia CDR2 del dominio variable de cadena pesada (VH) del anti-hCXCR3 de ratón inicial.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona métodos de profilaxis antes del inicio de T1 D, así como métodos para tratar o reducir la progresión de T1 D de inicio reciente en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de un anticuerpo neutralizante de CXCR3. En modalidades particulares, el sujeto es un mamífero, tal como un ser humano.

En determinadas modalidades, el sujeto que tiene T1 D de inicio reciente se trata por los métodos descritos en la presente descripción en los 6 meses del diagnóstico clínico. En otras modalidades, el sujeto se trata más de 6 meses después del diagnóstico clínico, en el que el sujeto retiene niveles de péptido C sérico integrados en ayunas residuales de al menos aproximadamente 0,2 nmoles/L: En algunas modalidades, los sujetos pueden caracterizarse por niveles elevados de glucosa sanguínea en ayunas en ausencia de insulina exógena por encima de 120 mg/dL o un nivel de péptido C integrado en ayunas anormalmente bajo de aproximadamente 0,033 a 1 ,0 nmoles/L x min durante la estimulación de péptido C. En modalidades particulares, el anticuerpo neutralizante de CXCR3 se administra a una dosis de aproximadamente 0,03-3,7 mg/kg/dosis. En algunas modalidades, se administra al sujeto al menos una dosis de anticuerpo. En determinadas modalidades, se administran al sujeto dosis repetidas de anticuerpo (por ejemplo, al menos anualmente, trimestralmente, bimensualmente, mensualmente, bisemanalmente, semanalmente o diariamente). En modalidades adicionales, los métodos descritos anteriormente pueden comprender además la etapa de administrar un inmunosupresor y/o agente estimulante de células b simultáneamente o secuencialmente (antes o después) de la administración del anticuerpo neutralizante de CXCR3.

En varias modalidades, los anticuerpos anti-CXCR3 descritos en la presente descripción se administran para tratar una afección caracterizada por la expresión anormal de CXCR3. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CXCR3 se administran para tratar cualquier afección que puede beneficiarse de la regulación a la baja y/o neutralización de la actividad de CXCR3. En algunas modalidades, los anticuerpos anti-CXCR3 descritos en la presente descripción se administran para tratar T1 D.

Las modalidades y ventajas adicionales de la invención se mostrarán en parte en la descripción que sigue y en parte serán obvias a partir de la descripción o pueden aprenderse por la práctica de la invención. Las modalidades y ventajas de la invención se lograrán y conseguirán mediante los elementos y combinaciones indicadas particularmente en las reivindicaciones adjuntas.

Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son sólo ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, según se reclama.

Los dibujos adjuntos, que se incorporan en y constituyen una parte de esta especificación, ilustran (una (varias) modalidad (modalidades) de la invención y junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.

Descripción breve de los dibujos La Figura 1 muestra la expresión de insulina (panel izquierdo), CXCL10 (panel central) y CD3 (panel derecho) en secciones de páncreas de ratones NOD hembra de 6 semanas de edad (primera fila), ratones NOD hembra de 10 semanas de edad (segunda fila) y ratones NOD hembra diabéticos de inicio reciente (tercera fila).

La Figura 2 es un análisis de citometría de flujo de la expresión de CXCR3 en células T del páncreas de ratones NOD hembra con diabetes de inicio reciente. Las células T CD4+ y CD8+ se identificaron y tiñeron para la expresión de CXCR3, como se muestra por la línea sólida en los dos gráficos inferiores. La tinción del isotipo control se muestra por la curva sombreada en los mismos dos gráficos.

Las Figuras 3A-B muestran el porcentaje de ratones NOD hembra no diabéticos con el tiempo para animales tratados con PBS, anti-CXCR3 e IgG control empezando a las 10 semanas de edad, antes del inicio de la diabetes. Los resultados de dos estudios independientes se muestran en la Fig. 3A y 3B.

La Figura 4 muestra secciones de páncreas de ratones NOD hembra no diabéticos de 26 semanas de edad tratados con anticuerpo anti-CXCR3 profilácticamente empezando a las 10 semanas de edad y teñidas para insulina (panel izquierdo) o CD3/Foxp3 (paneles central y derecho). El panel derecho es una imagen con aumento incrementado de la sección mostrada en el panel central.

La Figura 5 muestra los valores de glucosa sanguínea matinales diarios para ratones NOD hembra tratados con PBS, anticuerpo anti-CXCR3, IgG control y anticuerpo globulina anti-timocito murino (timoglobulina murina, mATG), empezando en los 3-4 días posteriores a que el ratón se consideró diabetico. Cada línea representa un ratón individual. Las flechas indican los días en los que se proporcionó el tratamiento.

La Figura 6A es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de células T de ratones NOD hembra tratados con PBS, anticuerpo anti-CXCR3, IgG control y anticuerpo mATG que eran CD4+ (gráfico izquierdo) y CD8+ (gráfico derecho). El páncreas se recogió de los ratones durante el curso del tratamiento después de la qumta inyección del artículo de ensayo y de ratones tratados con mATG con edad equivalente. La Figura 6B es una representación de la expresión de CD44 (eje vertical) frente a la expresión de CD62L (eje horizontal) en células T CD4+ del páncreas de ratones tratados con PBS, anticuerpo control o anticuerpo anti-CXCR3. G1 y G2 se refieren a células T seleccionadas CD44 alto/CD62L bajo y CD44 bajo/CD62L bajo, respectivamente. La Figura 6C muestra la expresión de CXCR3 en células T CD4+ en G1 y G2, comparado con la expresión de CXCR3 en células teñidas con anticuerpo de isotipo control y seleccionadas para linfocitos.

La Figura 7 muestra secciones de páncreas de ratones NOD hembra tratados con IgG control (paneles izquierdos), anticuerpo anti-CXCR3 (paneles centrales) y mATG (paneles derechos) y teñidas para insulina (fila superior) o CD3/Foxp3 (fila inferior).

Las Figuras 8A-D son una representación de los niveles de glucosa sanguínea después de un reto de glucosa en ratones NOD hembra no diabéticos con edad equivalente (Fig. 8A), ratones NOD diabéticos tratados con PBS (Fig. 8B), ratones NOD en remisión de la enfermedad después de tratamiento con anticuerpo anti-CXCR3 (Fig.. 8C) y ratones NOD diabéticos tratados con anticuerpo IgG control (Fig. 8D). El reto con glucosa se realizó en los ratones 100 días después del diagnóstico inicial de diabetes e inclusión en el estudio. Cada línea representa los datos de un animal individual.

Las Figuras 9A-B muestran el porcentaje de ratones no diabéticos con el tiempo para receptores NOD.Scid que reciben células T CD4+ y CD8+ donantes combinadas aisladas de ratones NOD hembra tratados con PBS, anti-CXCR3, IgG control o anticuerpos mATG. Las células T se aislaron de ratones NOD hembra diabéticos alrededor de 80-90 días después de tratamiento con PBS o IgG control, o de ratones NOD hembra en remisión de la enfermedad alrededor de 80-90 días después de tratamiento con anticuerpos anti-CXCR3 o mATG. Los resultados de dos estudios independientes se muestran en la Fig. 9A y 9B.

La Figura 10A muestra el porcentaje de células T CD4+ y CD8+ donantes aisladas de ratones NOD hembra tratados con PBS, anti-CXCR3, IgG control o anticuerpos ' mATG (panel izquierdo) como se describe en las Figuras 9A-B. El porcentaje de células efectoras y de memoria central en los conjuntos donantes de células T CD4+ y CD8+ para grupo de tratamiento se muestran en los paneles derechos de la Fig. 10A. La Figura 10B muestra el porcentaje de células T reguladoras en los conjuntos de células T donantes, identificado por la expresión de CD4 y CD25 o por la expresión de CD4, CD25 y Foxp3. La Figura 10C muestra el porcentaje de CD8+ (panel izquierdo) y CD4+ (panel derecho) en los conjuntos de células T donantes que también expresan CXCR3.

Las Figuras 11A-B muestran el porcentaje de ratones no diabéticos con el tiempo después de una transferencia adoptiva de células T de ratones transgénicos TCR específico de OVA donantes en ratones receptores RIP-OVA que se dejaron sin tratar o se trataron con anticuerpo anti-CXCR3 o IgG control. Los resultados de dos estudios se muestran en la Fig. 11A y 1 1 B.

La Figura 12A muestra la expresión de CXCR3 en células T donantes analizada por citometría de flujo antes de la transferencia adoptiva en ratones receptores RIP-OVA (curva sólida). La tinción con anticuerpo con isotipo control se muestra en la curva sombreada. La Figura 12B muestra el porcentaje de células donantes en la sangre, bazo y ganglios linfáticos pancreáticos de ratones receptores tratados con anticuerpo anti-CXCR3 o IgG control en los días 2, 4, 7, 9 y 15 después de la transferencia adoptiva. La Figura 12C muestra el porcentaje de célula donantes proliferativas en la sangre, bazo y ganglios linfáticos pancreáticos de ratones receptores tratados con anticuerpo anti-CXCR3 o IgG control después de la transferencia adoptiva. La Figura 12D muestra el porcentaje de células donantes CXCR3+ en la sangre, bazo y ganglios linfáticos pancreáticos de ratones receptores tratados con anticuerpo anti-CXCR3 o IgG control después de la transferencia adoptiva.

Las Figuras 13A-D muestran secciones de páncreas de ratones receptores RIP-OVA que se dejaron sin tratar y se tiñeron para insulina (Figura 13A) o CD3 (Figura 13B) o tratados con anticuerpo anti-CXCR3 y teñidos para insulina (Figura 13C) o CD3 (Figura 13D). El páncreas se recogió 60 días después de la transferencia adoptiva de células T donantes.

Las Figuras 14A-C muestran el nivel de inhibición de quimiotaxis mediada por CXCR3 para CXCL1 1 mediada por los clones Cl 4, 12, 53, 82 y 135. Los datos se muestran como unidades de fluorescencia relativa (RFU) media de las células que migran en el ensayo de quimiotaxis. La Figura 14D muestra la concentración de anticuerpo necesaria para inhibir la movilización de calcio un 50% para los clones de anticuerpo Cl 4, 12, 53 y 135.

Las Figuras 15A-C muestran el nivel de inhibición de quimiotaxis mediada por CXCR3 para CXCL9 (Fig. 15A), CXCL10 (Fig. 15B) y CXCL1 1 (Fig. 15C) mediada por los clones Cl 4, 12, 53, 82 y 135. Los datos se muestran como unidades de fluorescencia relativa (RFU) media de las células que migran en el ensayo de quimiotaxis.

La Fig. 16 muestra representaciones de histograma de la unión del anticuerpo a células que expresan varios receptores diferentes de quimiocina. La concentración de anticuerpo unido se incrementa a lo largo del eje horizontal para cada representación de histograma.

La Fig. 17A muestra un alineamiento de los dominios variables de cadena pesada (VH) y ligera (VK) para el clon 4.0 (marcado "parental") y determinadas variantes humanizadas (marcadas VH1-3 y 7-11 y VK 1-3). La Fig. 17B muestra un alineamiento de los dominios variables de cadena pesada (VH) y ligera (VK) para el clon 12.0 (marcado "parental") y determinadas variantes humanizadas (marcadas VH1-3 y VK 1 -3). La Fig. 17C muestra un alineamiento de los dominios variables de cadena pesada (VH) y ligera (VK) para el clon 53.0 (marcado "parental") y determinadas variantes humanizadas (marcadas VH1 -6 y VK 1 -9). La Fig. 17D muestra un alineamiento de los dominios variables de cadena pesada (VH) y ligera (VK) para el clon 82.0 (marcado "parental") y determinadas variantes humanizadas (marcadas VH1 -3 y VK 1 -3). La Fig. 17E muestra un alineamiento de los dominios variables de cadena pesada (VH) y ligera (VK) para el clon 135.0 (marcado "parental") y determinadas variantes humanizadas (marcadas VH1 -3 y VK 1 -3). La Fig. 17F muestra un alineamiento de los dominios variables de cadena pesada (VH) y ligera (VK) para el clon 4.0 (marcado "parental") y determinadas variantes humanizadas 4D (marcadas VH4-6 y VK4-7). La Fig. 17G muestra un alineamiento de los dominios variables de cadena pesada (VH) y ligera (VK) para el clon 53.0 (marcado "parental") y determinadas variantes humanizadas 4D (marcadas VH7-10 y VK10-13). La secuencia inferior en cada alineamiento en las Fig. 17A-G representa las secuencias de línea germinal humana más cercanas. Las cajas negras indican dominios CDR, los residuos sombreados varían en secuencia del residuo de línea germinal correspondiente (Fig. 17A-E) o el residuo parental correspondiente (Fig. 17F-G), se usa la numeración IMGT y delimitación de CDR. La Fig. 17H muestra un alineamiento de los dominios variables de cadena pesada (VH) y ligera (VK) para los clones 4.0, 12.0, 82.0 y 135, así como los clones de anticuerpo 5H7 y 7H5. Las cajas negras indican dominios CDR, los residuos sombreados varían en secuencia de la secuencia previa en el alineamiento, se usa la numeración IMGT.

La Fig. 18 muestra los límites de los residuos de epítopo mínimo para los clones de anticuerpo 4, 12, 53, 82 y 135. Los residuos importantes para la actividad de unión se indican con una X.

La Fig. 19 es una representación de histograma que muestra la unión de anticuerpo en células 300.19 transfectadas con CXCR3 humano para los clones quiméricos 4, 12, 53, 82 y 135, así como las variantes humanizadas Hu1 , Hu2, Hu3. El anticuerpo se administró a 5 mg/ml (línea negra), 0,5 pg/ml (línea gris oscuro) ó 0, 1 mg/ml (línea negra punteada) ó 5 pg/ml anticuerpo secundario solo (histograma gris lleno) y los datos se representan como número de células (eje horizontal) frente al porcentaje de fluorescencia máxima.

Las Figs. 20A-C muestran el porcentaje de inhibición de migración (eje vertical) de células transfectadas con CXCR3 humano para CXCL9 (Fig. 20A), CXCL10 (Fig. 20B) y CXCL1 1 (Fig. 20C) en presencia o ausencia de 10 pg/ml de variantes de anticuerpo quiméricas (Chim) o humanizadas (Hu1 , Hu2 o Hu3) de los clones 4, 12, 53, 82 y 135 o el clon comercial 1 C6.

La Fig. 21 es una representación que muestra la capacidad de las variantes de anticuerpo quiméricas (Chim) y humanizadas (Hu1 , Hu2 o Hu3) de los clones 4, 12, 53, 82 y 135 y el clon comercial 1 C6 para inhibir la movilización de calcio en células CHO transfectadas con CXCR3 humano-Gp14q¡4. La concentración de anticuerpo (eje horizontal) se representa frente al porcentaje de inhibición máxima (eje vertical).

Las Fig. 22A-D muestran los efectos del tratamiento con anticuerpo anti-CXCR3 en el porcentaje de células T CD3+/CD4+ (Fig. 22A), células T CD3+/CD8+ (Fig 22B), células T CXCR3+/CD3+/CD4 + (Fig. 22C) y células T CXCR3+/CD3+/CD8+ (Fig. 22D) en ratones NOD-scid IL2rynu" (NSG). HulgGI indica I g G 1 humana (Herceptina), clones 4, 12, 53, 82 y 135 se refieren a los clones de anticuerpo quimérico.

La Fig. 23A muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 12.0. La Fig. 23B muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 12.1. La Fig. 23C muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 12.2. La Fig. 23D muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 12.3.

La Fig. 24A muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 135.0. La Fig. 24B muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 135.1. La Fig. 24C muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 135.2. La Fig. 24D muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 135.3.

La Fig. 25A muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 4.0. La Fig. 25B muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 4.1. La Fig. 25C muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 4.2. La Fig. 25D muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 4.3. La Fig. 25E muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 4.4. La Fig. 25F muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 4.5. La Fig. 25G muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 4.6. La Fig. 25H muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 4.7. La Fig. 251 muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 4.8. La Fig. 25J muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 4.9. La Fig. 25K muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 4.10. La Fig. 25L muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 4.1 1. La Fig. 25M muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 4.4. La Fig. 25N muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 4.5. La Fig. 250 muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 4.6. La Fig. 25P muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 4.7.

La Fig. 26A muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 53.0. La Fig. 26B muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 53.1. La Fig. 26C muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 53.2. La Fig. 26D muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 53.3. La Fig. 26E muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 53.4. La Fig. 26F muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 53.5. La Fig. 26G muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 53.6. La Fig. 26H muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 53.4. La Fig. 261 muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 53.5. La Fig. 26J muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 53.6. La Fig. 26K muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 53.7. La Fig. 26L muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 53.8. La Fig. 26M muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 53.9. La Fig. 26N muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 53.7. La Fig. 260 muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 53.8. La Fig. 26P muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 53.9. La Fig. 26Q muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena pesada 53.10. La Fig. 26R muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 53.10. La Fig. 26S muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 53.1 1. La Fig. 26T muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 53.12. La Fig. 26U muestra las secuencias de aminoácidos para el clon de cadena ligera 53.13.

La Fig. 27A muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 82.0. La Fig. 27B muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 82.1. La Fig. 27C muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 82.2. La Fig. 27D muestra las secuencias de aminoácidos para clones de cadena pesada y ligera 82.3.

La Fig. 28A-P muestra las secuencias de ácido nucleico para clones de cadena pesada 12.0-12.3 y clones de cadena ligera 12.0-12.3, clones de cadena pesada 135.0-135.3 y clones de cadena ligera 135.0-135.3, clones de cadena pesada 4,0-4, 11 y clones de cadena ligera 4.0-4,7, clones de cadena pesada 53.0-53.6 y clones de cadena ligera 53.0-53.9 y clones de cadena pesada 82.0-82.3 y clones de cadena ligera 82.0-82.3.

Modalidades ejemplares .Ahora se hará referencia con detalle a determinadas modalidades ejemplares según la presente descripción, determinados ejemplos de las cuales se ilustran en los dibujos adjuntos.

CXCR3 CXCR3 (MIM: 300574, GenID humano: 2833, receptor 3 de quimiocina (resto C-X-C); también conocido como CD182, CD183, CKR-L2, CMKAR3, GPR9, IP10-R, Mig-R, MigR, receptor 9 acoplado a proteínas G, receptor IP-10, receptor I P 10, receptor Mig, receptor 3 de quimiocina (C-X-C), receptor 10 de proteína inducible por interferón) es un receptor de quimiocina que está ausente en gran medida de células T sin activar pero que se regula al alza después de la activación con antígeno y recluta estas células a sitios de inflamación tisular en respuesta a sus ligandos primarios: CXCL9 (GenID humano: 4283), CXCL10 (GenID humano: 3627), y CXCL1 1 (GenID humano: 6373). Las células b en el islote de Langerhans expresan CXCL9 y CXCL10 (Frigerio et al., Nature Medicine 8: 1414-1420 (2002) y las células T que se han infiltrado en el páncreas expresan CXCR3 (Christen et al, The 10urnal of Immunology, 2003, 171 : 6838-6845; Van Halteren et al., Diabetologia 48: 75-82 (2005); Uno et al 2010; Roep et al., Clinical and Experimental Immunology, 2003, 159: 338-343; Tanaka et al., Diabetes 58: 2285-2291 (2009); Sarkar et al., Diabetes. 2012 Feb; 61 (2): 436-46).

CXCR3 se expresa en una variedad de organismos, incluyendo, por ejemplo, seres humanos, ratón, rata, vaca, chimpancé, macaco, perro, rana, ornitorrinco, cerdo y pez cebra. La Tabla 1 lista el GenID del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de EEUU y la secuencia de proteína de referencia para CXCR3 de una variedad de organismos. La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de CXCR3 humano de longitud completa (variante de corte y empalme A). La secuencia peptídica de la variante de corte y empalme B se proporciona por la secuencia de referencia NP_001 136269.1. Los dominios extracelulares predichos de la variante de corte y empalme A de CXCR3 humano se describen en Colvin et al., Mol. Cell. Bio. , 26: 5838-49 (2006) e incluyen los residuos 1 -58, 1 -16, 11 1-126, 190-223, 278-301 de la SEQ ID NO: 1 , como se muestra a continuación.

SEQ ID NO: 1 NP_001495 CXCR3 Humano, isoforma A 1 mvtevsdhqv Indaevaalt enísssydyg enesdsocts ppcpqdfein fdraílpaly 61 slfftlgllg ngavaavils rrtatsstdt fllhlavadt Uvttipl a vdaavqwvfg 121 sglckvagal fninfyagal Hacisfdry ínivhatqly rrgpparvtl ídavwglcl 181 tfaipdfífl sahhderlna thcqynfpqv grtalTvIql vagflpliv maycyahila 241 vliysrgqrr ira rlvwv wafaícwtp yhfwlvdit mdlgalarnc gresrvdvak 301 svtsg!gymh cdnplfyaf vgvkfrernriw mirlgcpn qrg!qrgpss srrdsswset 361 s©asysgl Tabla 1 i ¡ i i 1 _ ¡ .

. ' ! · . . I CXCR3 y CXCL10 se expresan en pacientes humanos con T1 D. Uno et al., Endocrine J. 57: 991 -996 (2010); Roep et al. , Clin and Exp. Immun. 159: 338-343 (2009); Tanaka et al., Diabetes 58: 2285-2291 (2009). En estos pacientes, CXCL10 se expresa en las células beta productoras de insulina remanentes en los islotes. CXCR3 se expresa en las células T invasoras que rodean los islotes. Se han reproducido patrones de expresión similares en ratones diabéticos no obesos (NOD), un modelo de diabetes en ratón. Morimoto et al., J. Immun. 173: 7017-7024 (2004); Li et al., World J Gastroenterol. 11 (30): 4750-4752 (2005); Sarkar et al. Diabetes. 2012 Feb; 61 (2): 436-46).

CXCR3 también se expresa en células T presentes en determinados tipos de tejidos inflamados, mientras CXCL9, CXCL10 y CXCL1 1 son producidos frecuentemente por celulas locales en lesiones inflamatorias. De acuerdo con esto, en algunas modalidades, se describen terapias para alterar CXCR3 para tratar T1 D.

Anticuerpos El término "anticuerpo", tal y como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier polipéptido que comprende un sitio de unión a antígeno independientemente de la fuente, especie de origen, método de producción y/o características y engloba inmunoglobulinas o partes de unión a antígeno o fragmentos de éstas. Como un ejemplo no limitativo, el término "anticuerpo" incluye anticuerpos humanos, de orangután, ratón, rata, cabra, oveja y pollo. El término incluye pero no está limitado a anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespecíficos, poliespecíficos, no específicos, humanizados, completamente humanos, camelizados, de cadena única, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, retro-mutados e injertados con CDR. Para los propósitos de la presente invención, también incluye, a no ser que se indique otra cosa, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, VHH (también referidos como nanocuerpos) y otros fragmentos de anticuerpo que retienen la función de unión a antígeno, incluyendo anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos. El término "anticuerpo" también se refiere a moléculas de unión a antígeno que no están basadas en inmunoglobulinas. Por ejemplo, soportes distintos de inmunoglobulina conocidos en la téenica incluyen inmunofarmaceuticos modulares pequeños (véase, por ejemplo, las Publicaciones de Solicitud de Patente U.S. Nos. 20080181892 y 20080227958 publicadas el 31 de julio, 2008 y 18 de septiembre, 2008, respectivamente), tetranectinas, dominios de fibronectina (por ejemplo, AdNectinas, véase la Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. 2007/0082365, publicada el 12 de abril, 2007), proteína A, lipocalinas (véase, por ejemplo, la Patente U.S. No. 7.1 18.915), repeticiones de anquirina y tioredoxina.

El término "dominio de unión a antígeno" se refiere a la parte de una molécula de anticuerpo que comprende el área que se une específicamente a o que es complementaria a una parte de o todo un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo puede unirse sólo a una parte particular del antígeno. En determinadas modalidades, un anticuerpo de CXCR3 o fragmento de unión a antígeno comprende al menos un dominio de unión a antígeno. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento es multiespecífico y comprende dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) dominios de unión a antígeno, de manera que el anticuerpo o fragmento es capaz de unirse a dos o más moléculas de CXCR3 en el mismo o diferentes epítopos o es capaz de unirse a CXCR3 y al menos a un antígeno diferente con alta afinidad. La parte de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Estos fragmentos pueden comprender la región variables de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo parental o de una variante de un anticuerpo parental.

El "epítopo" o "determinante antigénico" es una parte de una molécula de antígeno que es responsable de interacciones específicas con el dominio de unión a antígeno de un anticuerpo. Un dominio de unión a antígeno puede proporcionarse por uno o más dominios variables de anticuerpo. Un dominio de unión a antígeno puede comprender al menos una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y al menos una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH). Un dominio de unión a antígeno también puede comprender sólo regiones VH o sólo regiones VL. Por ejemplo, los anticuerpos de camellos y llamas (Camelidae, camélidos) incluyen una única clase de anticuerpo, que está formado sólo por cadena pesadas y carece de cadenas ligeras. El sitio de unión a antígeno de dichos anticuerpos es un único dominio, referido como VHH. Éstos se han denominado "anticuerpos camelizados" o "nanocuerpos". Véanse, por ejemplo, las Patentes U.S. Nos. 5.800.988 y 6.005.079 y las Publicaciones de Solicitud Internacional Nos. WO 94/04678 y WO 94/25591 , que se incorporan por referencia.

Los anticuerpos anti-CXCR3 descritos en la presente descripción pueden generarse por cualquier método adecuado conocido en la téenica. Por ejemplo, los anticuerpos pueden comprender anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Los métodos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos para el experto en la técnica (Harlow et al. , Antibodies: a Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988)). Para generar los anticuerpos anti-CXCR3 pueden usarse inmunógenos que comprenden polipéptidos de CXCR3, fragmentos de éstos (por ejemplo, uno o más dominios extracelulares, o los 58 aminoácidos N terminales, o los 37 aminoácidos N terminales, o los 20 aminoácidos N terminales, o los 16 aminoácidos N terminales, etc.), proteínas de fusión, o variantes de éstos.

El inmunógeno puede producirse por una célula que produce o sobreproduce CXCR3, que puede ser una célula natural, una célula mutante natural o una célula preparada por ingeniería genética. Dependiendo de la naturaleza de los polipéptidos (por ejemplo, porcentaje de hídrofobicidad, porcentaje de hídrofilicidad, estabilidad, carga neta, punto isoeléctrico etc.), el inmunógeno puede modificarse o conjugarse para alterar su inmunogenicidad. Por ejemplo, CXCR3 o una parte de éste puede conjugarse con un vehículo. La conjugación puede incluir bien conjugación química mediante la derivación con grupos químicos funcionales activos, o mediante metodología basada en proteínas de fusión u otros métodos conocidos para el experto en la téenica. Los ejemplos de vehículos y/o otras proteínas que alteran la inmunogenicidad incluyen, pero no están limitados a, KLH, ovoalbúmina, albúmina sérica, tiroglobulina bovina, inhibidor de tripsina de soja y péptidos de T auxiliar promiscuos.

También pueden usarse varios adyuvantes con el inmunógeno de CXCR3 para incrementar la respuesta inmunológica. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no están limitados a, adyuvante de Freund (completo e incompleto), aceites minerales, geles, alúmina (hidróxido de aluminio), sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite, hemocianinas de lapa (KLH), dinitrofenol y adyuvantes humanos, tales como BCG (Bacilo Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Los ejemplos adicionales de adyuvantes que pueden emplearse incluyen el adyuvante MPL-TDM (monofosforil lípido A, trehalosa dicorinomicolato sintetica). Los protocolos de inmunización son muy conocidos en la téenica y pueden realizarse por cualquier método que incite una respuesta inmune en el huésped animal elegido. Así, pueden usarse varias rutas de administración durante varios periodos de tiempo como una elección de diseño.

Por ejemplo, un inmunógeno, como se ejemplifica en la presente descripción, puede administrarse a varios animales huéspedes incluyendo, pero no limitado a, conejos, ratones, camélidos, ratas, etc. , para inducir la producción de suero que contiene anticuerpos policlonales específicos para CXCR3. La administración del inmunógeno puede implicar una o más inyecciones de un agente inmunizante y, opcionalmente, un adyuvante. En algunas modalidades, el inmunógeno (con o sin adyuvante) se inyecta en el mamífero por múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales, o intramuscularmente o intravenosamente. En algunas modalidades, una vez que se obtiene una preparación policlonal adecuada, pueden aislarse anticuerpos particulares por técnicas de separación conocidas, tales como cromatografía de afinidad, reconocimiento y selección, absorción, etc. , de manera que puede obtenerse una especie de anticuerpo individual. En algunas modalidades, la especie de anticuerpo individual se somete a un estudio adicional, por ejemplo, secuenciación para obtener las secuencias de aminoácidos de una o más CDR.

En algunas modalidades, los anticuerpos de CXCR3 son monoclonales. Un anticuerpo monoclonal incluye cualquier anticuerpo derivado de un único clon eucariota, de fago o procariota que expresa en anticuerpo. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse, por ejemplo, mediante las téenicas de hibridoma tradicionales (Kohler y Milstein, Nature 256: 495-499 (1975) y Pat. U.S. No. 4.376.110, incorporada en la presente descripción por referencia), métodos de DNA recombinante (Patente U.S. No. 4.816.567, incorporada en la presente descripción por referencia) o técnicas de exposición en fago usando bibliotecas de anticuerpos (Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991 ); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581 -597 (1991 )). Para varias técnicas de producción de anticuerpos diferentes, véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Coid Spring Harbor Laboratory, 1988. Otros ejemplos de métodos que pueden emplearse para producir anticuerpos monoclonales incluyen, pero no están limitados a, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al. , Immunology Today 4: 72 (1983); y Colé et al., Proc Nati Acad Sel USA 80: 2026 (1983)) y la técnica de hibridoma EBV (colé et al. , Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, p. 77-96, Alan R. Liss (1985)). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo I g G , IgM, IgE, IgA e IgD y cualquier subclase o variante de éstos. El hibridoma que produce el mAb de la invención puede cultivarse in vitro o in vivo.

En algunas modalidades, puede usarse un inmunógeno que comprende polipéptidos de CXCR3, fragmentos de éstos (por ejemplo, uno o más dominios extracelulares, o los 58 aminoácidos N terminales, o los 37 aminoácidos N terminales, o los 20 aminoácidos N terminales, o los 16 aminoácidos N terminales, etc.), proteínas de fusión, o variantes de éstos para inmunizar un animal huésped (por ejemplo, conejos, ratones, camélidos, ratas, etc.) para generar los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales. Los linfocitos que producen o que son capaces de producir anticuerpos que se unen específicamente a CXCR3 pueden recogerse del huésped inmunizado y fusionarse con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilen glicol, para formar células de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, p. 59-103 (1986)).

Pueden generarse múltiples hibridomas que producen anticuerpos monoclonales y pueden seleccionarse aquellos que presentan propiedades beneficiosas o sugieren un potencial terapéutico, por ejemplo, evitando la unión del ligando de CXCR3 a su receptor. Los anticuerpos seleccionados pueden modificarse adicionalmente para obtener o aumentar propiedades beneficiosas, tales como tener una estabilidad aumentada in vivo. Por ejemplo, después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse usando procedimientos de dilución y crecerse por métodos de cultivo estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, p. 59-103 (1986)). Los medios de cultivo adecuados incluyen, por ejemplo, Medio de Eagle modificado por Dulbecco (D-MEM) o medio RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecerse in vivo como tumores en un animal. Los subclones pueden ensayarse para especificidad, afinidad y/o actividad y los subclones que presentan las propiedades más beneficiosas pueden seleccionarse para una caracterización adicional.

En la teenica existe una variedad de métodos alternativos para la producción de anticuerpos monoclonales, pudiendo usarse cualquiera de éstas para producir los anticuerpos anti-CXCR3 descritos en la presente descripción. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden prepararse por métodos de DNA recombinante, tales como los descritos en la Pat. U.S. No. 4.816.567, que se incorpora por referencia en su totalidad.

El DNA que codifica anticuerpos monoclonales puede aislarse y secuenciarse usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas oligonucleotídicas que son capaces de unirse a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos, o las cadenas de anticuerpos humanos, humanizados u otros anticuerpos) (Innis et al. PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic (1990) y Sanger et al. , Proc Nati Acad Sci USA 74: 5463 (1977)). Las células de hibridoma pueden servir como una fuente de dicho DNA. Una vez aislado, el DNA puede ponerse en vectores de expresión, que pueden transfectarse en células huésped tales como células de E. coli, células NSO, células COS, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otra manera no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en células huésped recombinantes. El DNA también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora para los dominios constantes de cadena pesada y ligera humanos en lugar de las secuencias murinas homologas (Pat. U.S. No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Nati Acad Sci USA 81 : 6851 (1984)) o uniendo covalentemente a la secuencia codificadora de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia codificadora de un polipéptido que no es una inmunoglobulina. En algunas modalidades, un polipéptido que no es una inmunoglobulina puede sustituirse por los dominios constantes de un anticuerpo o puede sustituirse por los dominios variables de un sitio de combinación de CXCR3 de un anticuerpo para crear un anticuerpo quimérico bivalente.

En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden modificarse para generar anticuerpos injertados con CDR y/o humanizados de otra manera. El injerto de CDR es una forma de humanización, pero también pueden usarse otras téenicas de humanización conocidas en la técnica. Los procedimientos de injerto de CDR son conocidos para el experto en la técnica y pueden basarse en designaciones de numeración de CDR incluyendo IMGT (el sistema internacional de información ImMunoGeneTics®. Montpellier, Francia), Kabat, Chothia y esquemas de numeración Chothia modificados. Véase, por ejemplo, imgt.org (que resume el uso del sistema de numeración continuo IMGT, que tiene en cuenta y combina la definición del marco y las regiones determinantes de la complementariedad, datos estructurales de estudios de difracción de rayos X y la caracterización de los bucles hipervariables, para proporcionar una numeración única para todas las regiones V IG y TR de todas las especies); Abhinandan y Martin, Mol Immunol., 45: 3832-9 (2008); véase también Abhinandan y Martin, J. Mol. Biol., 369(3): 852-62 (2007) (que describe métodos para evaluar la "humanidad" de un anticuerpo quimérico); Retter et al., Nucleic Acids Res. 33 (Database issue): D671-4 (2005) (que describe la base de datos VBASE2 de genes de dominio variable); y Johnson y Wu, Int. Immunol. 10(12): 1801-5 (1998) (que describe la distribución de longitudes de CDRH3).

Por ejemplo, usando el sistema de numeración IMGT, los aminoácidos conservados siempre tienen la misma posición. Los aminoácidos hidrofóbicos de las regiones marco también se numeran en posiciones conservadas, permitiendo que los aminoácidos marco (y codones) localizados en las mismas posiciones en diferentes secuencias se comparen sin requerir alineamientos de secuencia. En otro ejemplo, el sistema de numeración Kabat es como sigue, CDR-HI empieza aproximadamente en el aminoácido 31 (es decir, aproximadamente 9 residuos después del primer residuo de cisteína), incluye aproximadamente 5-7 aminoácidos, y termina en el siguiente residuo de tirosina. CDR-H2 empieza en el décimo qumto residuo después del fin de CDR-HI, incluye aproximadamente 16-19 aminoácidos y termina en el siguiente residuo de arginina o lisina. CDR-H3 empieza aproximadamente en el trigésimo tercer residuo de aminoácido después del fin de CDR-H2; incluye 3-25 aminoácidos; y termina en la secuencia W-G-X-G, en la que X es cualquier aminoácido. CDRLI empieza aproximadamente en el residuo 24 (es decir, después de un residuo de cisteína); incluye aproximadamente 10-17 residuos; y termina en el siguiente residuo de tirosina. CDR-L2 empieza aproximadamente en el décimo sexto residuo después del fin de CDR-LI e incluye aproximadamente 7 residuos. CDR-L3 empieza aproximadamente en el trigésimo tercer residuo después del fin de CDR-L2; incluye aproximadamente 7-11 residuos y termina en la secuencia F-G-X-G, en la que X es cualquier aminoácido. Los anticuerpos que contienen al menos una de estas CDR pueden usarse en los métodos de la presente descripción.

Los anticuerpos injertados con CDR pueden comprender secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano, en el que una o más de las regiones CDR de VH y/o VL se reemplazan por secuencias de CDR de los anticuerpos donantes, por ejemplo, de los anticuerpos murinos descritos más adelante que se unen a CXCR3. Una secuencia marco de cualquier anticuerpo humano puede servir como el molde para injerto de CDR. Sin embargo, el reemplazo de la cadena de CDR lineal en dicho marco puede dar lugar a alguna pérdida de afinidad de unión al antígeno. Cuanto más homólogo es un anticuerpo humano con el original, por ejemplo, anticuerpo murino, menor es la posibilidad de que la combinación de las CDR donantes en el marco humano introduzca distorsiones en las CDR que podrían reducir la afinidad. Por lo tanto, en algunas modalidades, los anticuerpos de CXCR3 injertados con CDR de la presente descripción comprenden un marco variable humano que tiene al menos un 65% de identidad de secuencia con el marco de región variable del anticuerpo murino donante neutralizante de CXCR3. Los métodos para producir dichos anticuerpos se conocen en la téenica (véase EP 239.400; Publicación PCT No. WO 91/09967; y Patentes U.S. Nos. 5.225.539; 5.530.101 ; y 5.585.089) e incluyen recubrimiento o modificación en superficie (EP 592.106; EP 519.596; Padlan (1991 ) Mol. Immunol. 28(4/5): 489-498; Studnicka et al. (1994) Prot. Engineer. 7(6): 805-814; y Roguska et al. (1994) Proc. Acad. Sci. USA 91 : 969-973), intercambio de cadenas (Patente U.S. No. 5.565.352) y anticuerpos anti-idiotípicos. [001] En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden humanizarse. Los "anticuerpos humanizados" son moléculas de anticuerpo que se unen al antígeno deseado, que tienen una o mas CDR de una especie no humana y que tienen regiones marco y/o dominios constantes de una molécula de inmunoglobulina humana. Las secuencias de Ig humanas conocidas se describen, por ejemplo, en www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; y Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Las secuencias humanas importadas pueden usarse para reducir la inmunogenicidad o reducir, aumentar o modificar la unión, afinidad, velocidad de asociación, velocidad de disociación, avidez, especificidad, vida media o cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la técnica. Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, tales como, pero no limitadas a, las descritas en Jones et al. (1986) Nature 321 : 522; Verhocyen et al. (1988) Science 239: 1534; Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 : 2296; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 ; Cárter et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151 : 2623; Patentes U.S. Nos. 5.589.205; 565.332; 6.180.370; 6.632.927; 7.241.877; 7.244.615; 7.244.832; 7.262.0505; y Publicación de Patente U.S. No. 2004/0236078 (presentada el 30 de abril, 2004), que se incorporan en la presente descripción por referencia en su totalidad.

En determinadas modalidades, los residuos marco en anticuerpos humanizados o injertados con CDR pueden sustituirse con el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR, por ejemplo, sustituirse con residuos marco de un anticuerpo neutralizante anti-CXCR3 de ratón, con el fin de alterar, por ejemplo, mejorar, la unión a antígeno. Vease Queen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-33 (diciembre 1989). Estas sustituciones de marco se identifican por métodos muy conocidos en la téenica, por ejemplo, por modelado de las interacciones de los residuos de CDR y marco para identificar los residuos marco importantes para la unión a antígeno y comparación de secuencia para identificar residuos marco inusuales en posiciones particulares. Véase, por ejemplo, la Patente U.S. No. 5.585.089; y Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323, que se incorporan en la presente descripción por referencia en su totalidad. Los modelos de de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son familiares para los expertos en la técnica. Están disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructurales conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas.

La inspección de estas exposiciones permite el análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse residuos marco a partir de secuencias consenso e importadas de manera que se consigue la característica deseada del anticuerpo, tal como afinidad incrementada para CXCR3.

Los anticuerpos pueden humanizarse o injertarse con CDR y los residuos marco de donantes de CDR que son útiles para mejorar la unión a antígeno pueden identificarse, usando una variedad de téenicas conocidas en la técnica, tales como pero no limitadas a las descritas en Jones et al. (1986) Nature 321 : 522; Verhocyen et al. (1988) Science 239: 1534; Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 : 2296; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 ; Cárter et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 4285; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151 : 2623; y Patentes U.S. Nos. 5.565.332; 5.723.323; 5.976.862; 5.824.514; 5.817.483; 5.814.476; 5.763.192; 5.723.323; 5.766.886; 5.714.352; 6.204.023; 6.180.370; 5.693.762; 5.530.101 ; 5.585.089; 5.225.539; y 4.816.567. En algunas modalidades, se usa la humanización 4D para preparar variantes de anticuerpo de la presente descripción (por ejemplo, para preparar las variantes humanizadas 4D del clon 4, que comprenden una cualquiera de las cadenas pesadas 4.4-4.6 y una cualquiera de las cadenas ligeras 4.4-4.7). Véase WO 2009/032661 (que se incorpora en la presente descripción por referencia en su totalidad), por ejemplo, en los párrafos

[0037]-

[0044] para métodos usados en la humanización 4D. Brevemente, la humanización 4D puede comprender: a) construir un modelo 3-D del dominio variable que se va a humanizar; b) identificar los residuos flexibles en el dominio variable usando una simulación de dinámica molecular del modelo 3-D del dominio; c) identificar la línea germinal humana más cercana comparando la trayectoria de dinámica molecular del modelo 3-D con las trayectorias de dinámica molecular de 49 líneas germinales humanas; y d) mutando los residuos flexibles, que no son parte de la CDR, en su equivalente de línea germinal humana (como se identifica en la etapa c).

En algunas modalidades, los anticuerpos injertados con CDR y/o humanizados de otra manera pueden comprender variantes injertadas con CDR y/o humanizadas de los clones 4, 12, 53, 82 y 135. Por ejemplo, las regiones de cadena pesada y ligera correspondientes de uno cualquiera de los clones 4, 12, 53, 82 y 135 (por ejemplo, cadena pesada del clon 4 y cadena ligera del clon 4) pueden unirse a dominios constantes humanos para formar anticuerpos quiméricos. Los anticuerpos quiméricos pueden humanizarse adicionalmente cambiando uno o más aminoácidos marco o de CDR al residuo humano correspondiente. Asimismo, en algunas modalidades, las seis regiones CDR de cadena pesada y ligera de uno cualquiera de los clones 4, 12, 53, 82 y 135 (por ejemplo, CDR1 , CDR2, y CDR3 de cadena pesada del clon 4 y CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera del clon 4) o de cualquiera de las variantes de los clones 4, 12, 53, 82 y 135 puede subclonarse en dominios marco y/o constantes humanos para formar anticuerpos humanizados. La humanización puede incluir el uso de dominios variables humanos, excluyendo los aminoácidos de las CDR y/o cualquier residuo en posición Vernier. Los anticuerpos humanizados también pueden incluir cambios retromutados adicionales en los residuos situados en cuatro aminoácidos de las CDR y/o en posiciones identificadas como "muy distintas" entre la secuencia del anticuerpo original y secuencias humanas, por ejemplo, usando modelado basado en IMGT. Pueden introducirse mutaciones adicionales en las regiones marco o CDR para aumentar la estabilidad o eficacia terapéutica del anticuerpo, por ejemplo introduciendo mutaciones para eliminar un sitio de desamidación en las posiciones 58 y 59 (numeración IMGT) de la CDR2 de VH del clon 4.

Por ejemplo, los anticuerpos, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados descritos en la presente descripción pueden comprender las seis CDR y/o los dominios variables de cadena pesada y ligera de cualquiera de los clones 4, 12, 53, 82 y 135 y sus variantes quiméricas o humanizadas. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento capaz de unirse a CXCR3 puede comprender las tres CDR de una cualquiera de cadenas pesadas 4.0-4.11 , cadenas pesadas 12.0-12.3, cadenas pesadas 53.0-53.10, cadenas pesadas 82.0-82.3 y cadenas pesadas 135.0-135.3. De manera similar, el anticuerpo o fragmento puede comprender las tres CDR de una cualquiera de cadenas ligeras 4.0-4.7, cadenas ligeras 12.0-12.3, cadenas ligeras 53.0-53.13, cadenas ligeras 82.0-82.3 y cadenas ligeras 135.0-135.3. En algunas modalidades, las CDR de cadena pesada y ligera son del mismo clon, pero pueden ser de diferentes variantes de ese clon (por ejemplo, las tres CDR de cadena pesada 4.1 emparejadas con las tres CDR de cadena ligera 4.2). Las cadenas pesadas y ligeras 4.0, 12.0, 82.0 y 135.0 se refieren al dominio variable en los clones de anticuerpo de ratón y los anticuerpos quiméricos (en el que los anticuerpos comprenden dominios variables de ratón y regiones marco humanas). Las cadenas pesadas y ligeras remanentes se refieren a las cadenas humanizadas como se muestra en la Tabla 1 1.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento capaz de unirse a CXCR3 puede comprender una cualquiera de cadenas pesadas 4.0-4.11 , cadenas pesadas 12.0-12.3, cadenas pesadas 53.0-53.10, cadenas pesadas 82.0-82.3 y cadenas pesadas 135.0-135.3. De manera similar, el anticuerpo o fragmento puede comprender una cualquiera de cadenas ligeras 4.0-4.7, cadenas ligeras 12.0-12.3, cadenas ligeras 53.0-53.13, cadenas ligeras 82.0-82.3 y cadenas ligeras 135.0-135.3.

En algunas modalidades, las cadenas pesada y ligera se seleccionan de manera que las tres CDR de una cadena pesada de un clon particular (por ejemplo, las CDR de una cadena pesada del clon 4) se emparejan con las tres CDR de cualquiera de las cadenas ligeras para ese clon (por ejemplo, las CDR de una cadena ligera del clon 4). En algunas modalidades, las cadenas pesada y ligera se seleccionan de manera que una cadena pesada de un clon particular (por ejemplo, una cadena pesada del clon 4) se empareja con cualquiera de las cadenas ligeras para ese clon (por ejemplo, una cadena ligera del clon 4).

En algunas modalidades, las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 4.0-4.1 1 pueden emparejarse con las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 4.0-4.7; las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 12.0-12.3 pueden emparejarse con las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 12.0-12.3; las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 53.0-53.10 pueden emparejarse con las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 53.0-53.13; las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 82.0-82.3 pueden emparejarse con las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 82.0-82.3; o las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 135.0-135.3 pueden emparejarse con las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 135.0-135.3.

En algunas modalidades, uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 4.0-4.11 puede emparejarse con uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 4.0-4.7, uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 12.0-12.3 puede emparejarse con uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 12.0-12.3, uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 53.0-53.10 puede emparejarse con uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 53.0-53.13, uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 82.0-82.3 puede emparejarse con uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 82.0-82.3; o uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 135.0-135.3 puede emparejarse con uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 135.0- 135.3.

Un alineamiento de determinados dominios variables de cadena pesada y ligera se muestra en las Figs. 17A-H. En algunas modalidades un anticuerpo como se describe en la presente descripción puede comprender los dominios variables de cadena pesada y ligera emparejados como se muestra en la Tabla 2 (Ch= quimerico, Hu = humanizado, VH= cadena pesada, VK= cadena ligera). Por ejemplo, la primera entrada en la Tabla 2 indica una variante del clon 4 que comprende la cadena pesada 4.0 y la cadena ligera 4.0. La segunda entrada indica una variante del clon 4 que comprende la cadena pesada 4.1 y la cadena ligera 4.1. A cada anticuerpo, que comprende la secuencia de cadena pesada y cadena ligera indicada, también se le asignó un identificador del anticuerpo en la segunda columna de la Tabla 2. Por ejemplo, a la primera entrada en la tabla (que comprende la cadena pesada 4.0 y la cadena ligera 4.0) se le asignó el identificador de anticuerpo 4Ch, mientras al segundo anticuerpo en la tabla (que comprende la cadena pesada 4.1 y la cadena ligera 4.1 ) se le asignó el identificador 4Hu1.

Tabla 2 El termino "interacción específica" o "se une específicamente" o semejantes, significa que dos moléculas forman un complejo que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una alta afinidad y una capacidad baja a moderada. La unión no específica tiene habitualmente una baja afinidad con una capacidad moderada a alta. Típicamente, la unión se considera específica cuando la constante de afinidad Ka es mayor de 106 M 1 , o preferiblemente mayor de 108 M 1. En algunas modalidades, los anticuerpos, variantes y fragmentos de éstos se unen a su(s) antígeno(s), con constantes de asociación de al menos 106, 107 , 10®, 109 M 1 o mayor. En algunas modalidades, los anticuerpos, variantes y fragmentos de éstos se unen a CXCR3 con al menos las cinéticas de unión mostradas en una cualquiera de las Tablas 7A-B, 8-10 y/o 12. Si es necesario, la unión no específica puede reducirse sin afectar sustancialmente la unión específica variando las condiciones de la unión. Dichas condiciones son conocidas en la téenica y un experto en la técnica, usando técnicas rutinarias, puede seleccionar las condiciones apropiadas. Las condiciones se definen habitualmente en términos de concentración de anticuerpos, fuerza iónica de la disolución, temperatura, tiempo que se permite para la unión, concentración de moléculas bloqueantes, tales como albúmina de suero y caseína de la leche.

En la presente descripción se describen anticuerpos anti-CXCR3 que, en algunas modalidades, pueden neutralizar CXCR3. Un "anticuerpo neutralizante de CXCR3" se une a CXCR3 y bloquea la actividad del receptor, tal como las respuestas fisiológicas y genéticas típicas que resultan de la unión de los ligandos de CXCR3 a CXCR3. La actividad neutralizante puede ser completa (100% de neutralización) o parcial, por ejemplo, aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 (o cualquier porcentaje intermedio) o más neutralización y dependerá de varios factores conocidos para el experto en la téenica, tales como concentración de anticuerpo, afinidad y epltopo así como el ensayo particular usado para evaluar la actividad neutralizante. La actividad neutralizante de un anticuerpo neutralizante de CXCR3 puede mostrarse por ensayos para medir la inhibición, por ejemplo, de la unión del ligando, unión de GTP, movilización de calcio, quimiotaxis celular y/o internalización del receptor. El experto en la técnica conoce numerosos ensayos para determinar la actividad de los anticuerpos neutralizantes y, particularmente, el anticuerpo neutralizante de CXCR3 y pueden adaptarse fácilmente para verificar que un anticuerpo particular es neutralizante.

Por ejemplo, en algunas modalidades, la actividad neutralizante de un anticuerpo para uso en los métodos de la invención puede evaluarse por un ensayo de quimiotaxis, sustancialmente como se muestra en el prospecto del anticuerpo producido por el clon 49801 y comercializado por R&D Systems® (No. de Cat. MAB160). La Dosis Neutralizante-50 (ND50) se define como la concentración de anticuerpo requerida para rendir la mitad de la inhibición máxima de la respuesta rhl-TAC mediada por CXCR3 de la superficie celular en una línea celular que responde, a una concentración específica de rhl-TAC. Para medir la capacidad del anticuerpo para bloquear la quimiotaxis inducida por rhl-TAC de células BaF/3 transfectadas con hCXCR3, se añade rhl-TAC a 7 ng/ml al compartimento inferior de una cámara de quimiotaxis de 96 pocilios (NeuroProbe, Cabin John, MD). La cámara de quimiotaxis se ensambla usando un filtro de policarbonato sin PVP (tamaño de poro 5m). Se añaden diluciones seriadas del anticuerpo (por ejemplo, de 0,001 a 10.000 pg/mL) y 0,25 x 106 células/pocillo a los pocilios superiores de la cámara. Después de incubar durante 3 horas a 37°C en un incubador humidificado con 5% CO2, la cámara se desensambla y las células que migran a través hacia la cámara inferior se transfieren a una placa de trabajo y se cuantifican usando, por ejemplo, Fluorescencia de Resazurina.

Colvin et al., Mol. Cell. Bio., 26: 5838-49 (2006) describen ensayos adicionales que pueden usarse, en determinadas modalidades, para determinar la actividad neutralizante de los anticuerpos de CXCR3 para uso en la invención. Brevemente, pueden usarse células 300-19, una línea celular de leucemia de células pre-B murina, que expresa funcionalmente CXCR4. Después de la transfección, esta línea puede expresar funcionalmente otros receptores de quimiocina, por ejemplo, CXCR3 humano (véase, por ejemplo, los párrafos 201 -209 de la Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. 2010/0061983, que se incorpora por referencia). Las células 300-19 que expresan CXCR3 humano pueden crecerse en medio RPMI completo que contiene 10% suero fetal bovino (FBS). Para evaluar la unión de los ligandos de CXCR3 a CXCR3 en presencia de los anticuerpos neutralizantes de CXCR3 candidatos, se ponen 400.000 celulas CXCR3/300-19 en placas de cultivo tisular de 96 pocilios en un volumen total de 150 mI_ de amortiguador de unión (0,5% BSA, 5 mM MgCI2, 1 mM CaCI2, 50 mM HEPES, pH 7,4). Puede añadirse un total de 0,04 nM de CXCL10 marcado con 125l (New England Nuclear, Boston, MA) o CXCL1 1 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) y 5 x 106 nM a 500 nM de CXCL10 o CXCL1 1 no marcado (Peprotech, Rocky Hill, NJ) a las células e incubarse durante 90 min a temperatura ambiente con agitación. Las células se transfieren a placas de filtro de 96 pocilios (Millipore, Billerica, MA) que están prehumedecidas en 0,3% polietilenimina y se lavan tres veces con 200 mI de amortiguador de unión suplementado con 0,5 M NaCI. Las placas se secan y la radiactividad se mide después de la adición de fluido de centelleo en un contador de centelleo Wallac Microbeta (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA). La unión de CXCL9 puede evaluarse de manera análoga a CXCL10 y 11. [002] En determinadas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente descripción pueden evitar o reducir el flujo de calcio en las células que expresan CXCR3. En algunas modalidades, el flujo de calcio puede detectarse en células tales como células CXCR3/300-19. Aproximadamente 5 x 106 células se suspenden en 2 mi de medio RPMI con 1 % BSA. Se añaden qumce microgramos de Fura-2 (Molecular Probes, Eugene, OR) y las células se incuban a 37°C durante 20 min.

Las células se lavan dos veces en PBS y se resuspenden en 2 mi de amortiguador de flujo de calcio (145 mM NaCI, 4 mM KCI, 1 mM NaHP04, 1 ,8 mM CaCI2, 25 mM HEPES, 0,8 mM MgCI2 y 22 mM glucosa). Las lecturas de fluorescencia se miden a 37°C en un fluorímetro DeltaRAM (Photon Technology International, Lawrenceville, NJ). Antes y después de la adición de quimiocinas (por ejemplo, CXCL9, 10 u 11 ), las concentraciones de calcio intracelular se registran como la intensidad de fluorescencia de excitación emitida a 510 nm en respuesta a la excitación secuencial a 340 nm y 380 nm y se presentan como la proporción relativa de fluorescencia a 340 nm respecto a la de a 380 nm.

En determinadas modalidades, la neutralización de CXCR3 puede evaluarse midiendo una reducción en la internalización del receptor. En algunas modalidades, los ensayos de internalización del receptor pueden realizarse incubando aproximadamente 2,5 x 105 células, tales como células CXCR3/300-19 en medio RPMI con 1 % BSA con varias concentraciones de CXCL10, CXCL11 o CXCL9 durante 30 min a 37°C. Las células pueden lavarse con amortiguador de separación celular activada por fluorescencia enfriado en hielo y analizarse posteriormente para la expresión superficial de CXCR3 usando un anticuerpo de CXCR3 conjugado con PE.

Los ensayos adicionales para evaluar la actividad neutralizante se describen, por ejemplo, en los Ejemplos 2-4 de la Patente U.S. No. 7.405.275, que se incorporan por referencia.

Como se evalúa por cualquiera de los ensayos anteriores, un anticuerpo neutralizante de CXCR3 puede tener, en determinadas modalidades, una ND50 de aproximadamente 0,01 , 0,02, 0,05, 0, 1 , 0,2, 0,5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 40, 50 ó 100 pg/mL. En modalidades particulares, la ND50 puede ser 0,5-12 m9/piI_ y en modalidades más particulares, 1 -6 mV/hiI..

Los anticuerpos de CXCR3 aislados descritos en la presente descripción pueden incluir aquellos que se unen a epítopos específicos de CXCR3. Por ejemplo, los anticuerpos para uso en la invención pueden unirse a un péptido que comprende todo o parte (por ejemplo, un fragmento de al menos 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18 ó 20 residuos) de una secuencia seleccionada de los residuos 1 -58, 1 -16 ó 1 -37 de SEQ ID NO: 1. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente descripción incluyen aquellos que se unen a uno o más de los epítopos identificados en la Fig. 18. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-CXCR3 puede comprender un anticuerpo que se une a un epítopo de CXCR3 que comprende SDHQVLNDAE (SEQ ID NO: ). En algunas modalidades, el epítopo comprende SDHQVLND (SEQ ID NO: ), DHQVLND (SEQ ID NO: ) y/o VLNDAE (SEQ ID NO: ). En algunas modalidades, el epítopo comprende la secuencia VLND (SEQ ID NO: ). En algunas modalidades, el epítopo comprende XDXXVXNDXX (SEQ ID NO: ), en la que X indica cualquier aminoácido. En algunas modalidades, el epítopo comprende XDXXVXND (SEQ ID NO: ), DXXVXND (SEQ ID NO: ) y/o VXNDXX (SEQ ID NO: ), en la que X indica cualquier aminoácido. En algunas modalidades, el epítopo comprende la secuencia VXND (SEQ ID NO: ), en la que X indica cualquier aminoácido.

Los anticuerpos anti-CXCR3 pueden ser específicos en general para las secuencias de CXCR3 de diferentes especies o selectivos para secuencias de CXCR3 de una especie particular o un isotipo particular de CXCR3. En modalidades particulares, el anticuerpo de CXCR3 es específico para la especie sujeto a la que se administra. De acuerdo con esto, en algunas modalidades, un anticuerpo de CXCR3 puede ser específico para una secuencia de CXCR3 humano (por ejemplo, capaz de unirse a un péptido que comprende una secuencia homologa a cualquiera de las subsecuencias de SEQ ID NO: 1 listadas anteriormente). La secuencia homologa será identificada fácilmente por un experto en la téenica por medios tales como alineamientos de secuencia de proteínas (por ejemplo, BLASTp, ClustaW, etcétera). En modalidades particulares, un anticuerpo para uso en la invención se une a un péptido que comprende una secuencia al menos 90, 95 ó 99% (o cualquier porcentaje intermedio) similar o idéntica a SEQ ID NO: 1 sobre la longitud completa de la secuencia o una ventana de al menos 10, 15, 20, 25, 30, 35 40, 45, 50, 55, 60, 65 ó 70 residuos (o cualquier valor intermedio). En algunas modalidades, el anticuerpo es capaz de unirse a un epítopo de al menos 80, 85, 90, 95 ó 99% (o cualquier porcentaje intermedio) similar o idéntico a uno de los epítopos descritos anteriormente (véase también la Fig. 18).

Los anticuerpos particulares descritos en la presente descripción incluyen, por ejemplo, los clones de anticuerpo (Cl) 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 y Cl 4, así como sus variantes quiméricas y humanizadas. [003] En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente descripción presentan determinadas propiedades mejoradas sobre los anticuerpos conocidos en la téenica, incluyendo los anticuerpos 5H7 y 7H5 (descritos, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 7.405.275; las CDR para los anticuerpos se describen en las Tablas 1 y 2 y en los listados de secuencias referenciados, que se incorporan por referencia); V44D7 (descrito en la Publicación Internacional WO 2008/094942), 1 C6 (descrito en la Patente U.S. No. 7.407.655; con mapeo de epítopos descrito en los Ejemplos 8 y 9, que se incorporan por referencia) y 49801 , comercializado por R&D Systems como no. de catálogo MAB160. [004] En algunas modalidades, los clones de anticuerpo descritos en la presente descripción (clones 4, 12, 53, 82 y 135 y sus equivalentes quiméricos y humanizados) presentan determinados beneficios sorprendentes sobre los anticuerpos conocidos 5H7, 7H5, V44D7, 1 C6 y 49801. Por ejemplo, los clones descritos en la presente descripción presentan una afinidad de unión incrementada comparada con los clones anti-hCXCR3 5H7, 7H5, V44D7, 1 C6 y 49801. Los clones humanizados descritos en la presente descripción también pueden tener una in unogenicidad reducida comparada con los clones anti-hCXCR3 de ratón 5H7, 7H5, V44D7, 1 C6 y 49801. Además, los anticuerpos descritos en la presente descripción, tales como aquellos que comprenden los clones de cadena pesada 4.7-4.11 se han optimizado por modificación en las posiciones 58 y 59 (usando la numeración IMGT) para eliminar un sitio de desamidación para aumentar la estabilidad. En algunas modalidades, los anticuerpos descritos en la presente descripción retienen la actividad neutralizante de CXCR3.

En determinadas modalidades, los anticuerpos o fragmentos descritos en la presente descripción pueden comprender secuencias de CDR de VH y/o VL que son aproximadamente 80% a aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%) idénticas a las secuencias de CDR de VH y/o VL en uno cualquiera de los anticuerpos Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 y Cl 4 o en la variantes quiméricas o humanizadas de estos clones (por ejemplo, 80-100% idénticos a las seis CDR en Cl 12 o a las seis CDR en Cl 12.1 , etc). En algunas modalidades, los anticuerpos o fragmentos pueden comprender secuencias de CDR de VH y VL que contienen 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 sustituciones de aminoácidos (incluyendo adiciones, supresiones y sustituciones, tales como sustituciones conservadoras) respecto a las secuencias de CDR de VH y/o VL en uno cualquiera de los anticuerpos Cl 12, Cl 135, Cl 82, Cl 53 y Cl 4.

Tal y como se usan en la presente descripción, los términos "porcentaje (%) de identidad de secuencia" u "homología" se definen como el porcentaje de residuos de aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las secuencias de referencia después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia y excluyendo sustituciones de ácido nucleico conservadoras. El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación puede producirse, además de manualmente, mediante algoritmos de homología local conocidos en la téenica o mediante programas informáticos que usan estos algoritmos (por ejemplo, BLAST P).

En algunas modalidades, un anticuerpo aislado de CXCR3 o fragmento de unión a antígeno como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos de VH que comprende al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ó 100% (o cualquier porcentaje intermedio) de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las cadenas pesadas 4.0-4.11 , cadenas pesadas 12.0-12.3, cadenas pesadas 53.0-53.10, cadenas pesadas 82.0-82.3 y cadenas pesadas 135.0-135.3. En determinadas modalidades, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos de VH que tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 mutaciones (incluyendo adiciones, supresiones y sustituciones, tales como sustituciones conservadoras) en la secuencia de aminoácidos de SEQ una cualquiera de las cadenas pesadas 4.0-4.11 , cadenas pesadas 12.0-12.3, cadenas pesadas 53.0-53.10, cadenas pesadas 82.0-82.3 y cadenas pesadas 135.0-135.3. Tal y como se usa en la presente descripción, una "sustitución conservadora" se refiere al reemplazo de un primer aminoácido con un segundo aminoácido que no altera sustancialmente las propiedades químicas, físicas y/o funcionales del anticuerpo o fragmento (por ejemplo, el anticuerpo o fragmento retiene la misma carga, estructura, polaridad, hidrofobicidad/hidrofilicidad, y/o conserva funciones tales como la capacidad de reconocer, unirse a y/o neutralizar la actividad de CXCR3).

En determinadas modalidades, un anticuerpo aislado de CXCR3 o fragmento de unión a antígeno como se describe en la presente descripción comprende una secuencia de aminoácidos de VL que comprende al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% (o cualquier porcentaje intermedio) de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las cadenas ligeras 4.0-4.7, cadenas ligeras 12.0-12.3, cadenas ligeras 53.0-53.13, cadenas ligeras 82.0-82.3 y cadenas ligeras 135.0-135.3. En varias modalidades, el anticuerpo o fragmento comprende una secuencia de aminoácidos de VL que tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ó 10 mutaciones (incluyendo adiciones, supresiones y sustituciones, tales como sustituciones conservadoras) en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las cadenas ligeras 4.0-4.7, cadenas ligeras 12.0-12.3, cadenas ligeras 53.0-53.13, cadenas ligeras 82.0-82.3 y cadenas ligeras 135.0-135.3.

En determinadas modalidades, un anticuerpo aislado de CXCR3 o fragmento de unión a antígeno como se describe en la presente descripción comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende al menos 80% de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las cadenas pesadas 4.0-4.11 , cadenas pesadas 12.0-12.3, cadenas pesadas 53.0-53.10, cadenas pesadas 82.0-82.3 y cadenas pesadas 135.0-135.3 y comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende al menos 80% de identidad respecto a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las cadenas ligeras 4.0-4.7, cadenas ligeras 12.0-12.3, cadenas ligeras 53.0-53.13, cadenas ligeras 82.0-82.3 y cadenas ligeras 135.0-135.3. En algunas modalidades, las cadenas pesada y ligera se seleccionan de manera que una cadena pesada de un clon particular (por ejemplo, una cadena pesada del clon 4) se empareja con cualquiera de las cadenas ligeras para ese clon (por ejemplo, una cadena ligera del clon 4). En algunas modalidades, las cadenas pesada y ligera se emparejan como se muestra en la Tabla 2. En modalidades adicionales, el anticuerpo o fragmento que comprende las secuencias de VH y/o VL descritas retiene la capacidad de neutralizar la actividad de CXCR3.

En algunas modalidades, el anticuerpo descrito en la presente descripción es una variante humanizada de Cl 12, 135, 82, 53 y/o 4. En otras modalidades, el anticuerpo es completamente humano. En determinadas modalidades, el anticuerpo es un derivado humanizado o completamente humano de un anticuerpo seleccionado de los clones 12, 135, 82, 53 y 4. En algunas modalidades, el anticuerpo tiene una constante de afinidad de al menos 108 M 1 (por ejemplo, al menos 108 M 1 , al menos 109 M 1 , al menos 101° M 1 , o al menos 1011 M 1 , o cualquier valor intermedio). En algunas modalidades, el anticuerpo es capaz de unirse a todas las isoformas de CXCR3. En determinadas modalidades, el anticuerpo es capaz de unirse tanto a la isoforma A como B de CXCR3. En algunas modalidades, el anticuerpo no se une a la isoforma B de CXCR3.

En algunas modalidades, un anticuerpo aislado de CXCR3 o fragmento de unión a antígeno comprende CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y/o CDR3 de VL que comprenden secuencias de aminoácidos aproximadamente 90% a aproximadamente 100% (por ejemplo, aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100%) idénticas a las secuencias de CDR de VH y VL de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En algunas modalidades, un anticuerpo aislado de CXCR3 o fragmento de unión a antígeno comprende CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y/o CDR3 de VL que comprenden secuencias de aminoácidos idénticas a, o que comprenden 1 , 2, 3, 4 ó 5 mutaciones en residuos de aminoácidos (incluyendo adiciones, supresiones y sustituciones, tales como sustituciones conservadoras) respecto a las secuencias de CDR de VH y VL de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CXCR3 o fragmento comprende una cadena pesada que tiene tres CDR (CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada) y una cadena ligera que tiene tres CDR (CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera). En algunas modalidades, la CDR1 de VH tiene 1 , 2 ó 3 mutaciones de aminoácidos respecto a la secuencia CDR1 de VH de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En algunas modalidades, la CDR2 de VH tiene 1 , 2 ó 3 mutaciones de aminoácidos respecto a la secuencia CDR2 de VH de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En algunas modalidades, la CDR3 de VH tiene 1 , 2 ó 3 mutaciones de aminoácidos respecto a la secuencia CDR3 de VH de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En algunas modalidades, la CDR1 de VL tiene 1 , 2 ó 3 mutaciones de aminoácidos respecto a la secuencia CDR1 de VL de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quimericas y humanizadas. En algunas modalidades, la CDR2 de VL tiene 1 ó 2 mutaciones de aminoácidos respecto a la secuencia CDR2 de VL de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En algunas modalidades, la CDR3 de VL tiene 1 , 2 ó 3 mutaciones de aminoácidos respecto a la secuencia CDR3 de VL de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En determinadas modalidades, las CDR 1 , CD2 y CDR3 de la cadena pesada y ligera son las CDR de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas o comprenden 1 -3 mutaciones de aminoácidos respecto al conjunto de CDR en el seleccionado de uno cualquiera de los clones de anticuerpo o sus variantes quiméricas/humanizadas. En algunas modalidades, las mutaciones están en las posiciones resaltadas mostradas en los alineamientos en la Fig. 17A-H. En algunas modalidades, la mutación está en una o más de las posiciones 58 y 59 en CDR2 de VH de uno cualquiera de los clones 4.0-4.11.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-CXCR3 o fragmento comprende una cadena pesada y una cadena ligera. En algunas modalidades, la cadena pesada es al menos aproximadamente 90% idéntica (por ejemplo, al menos aproximadamente 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 idéntica, o cualquier porcentaje intermedio) o tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mutaciones de aminoácidos respecto a, una cualquiera de las cadenas pesadas 4.0-4.11 , cadenas pesadas 12.0- 12.3, cadenas pesadas 53.0-53.10, cadenas pesadas 82.0-82.3 y cadenas pesadas 135.0-135.3. En algunas modalidades, la cadena ligera es al menos aproximadamente 90% idéntica (por ejemplo, al menos aproximadamente 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 idéntica, o cualquier porcentaje intermedio) o tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mutaciones de aminoácidos respecto a, una cualquiera de las cadenas ligeras 4.0-4.7, cadenas ligeras 12.0-12.3, cadenas ligeras 53.0-53.13, cadenas ligeras 82.0-82.3 y cadenas ligeras 135.0-135.3. En algunas modalidades, la cadena pesada es al menos aproximadamente 90% idéntica (por ejemplo, al menos aproximadamente 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 idéntica, o cualquier porcentaje intermedio) o tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mutaciones de aminoácidos respecto a, una cualquiera de las cadenas pesadas 4.0-4.11 , cadenas pesadas 12.0-12.3, cadenas pesadas 53.0-53.10, cadenas pesadas 82.0-82.3 y cadenas pesadas 135.0-135.3 y/o la cadena ligera es al menos aproximadamente 90% idéntica (por ejemplo, al menos aproximadamente 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99 idéntica, o cualquier porcentaje intermedio) o tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mutaciones de aminoácidos respecto a, una cualquiera de las cadenas ligeras 4.0-4.7, cadenas ligeras 12.0-12.3, cadenas ligeras 53.0-53.13, cadenas ligeras 82.0-82.3 y cadenas ligeras 135.0-135.3. En algunas modalidades, las mutaciones están en posiciones mostradas en los alineamientos en la Fig. 17A-H.

En determinadas modalidades, un anticuerpo aislado de CXCR3 o fragmento de unión a antígeno que comprende las secuencias de CDR de VH y/o VL descritas anteriormente retiene la actividad neutralizante de CXCR3.

En varias modalidades, los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo de CXCR3 o fragmento pueden comprender al menos una región marco (por ejemplo, al menos una de FR1 , FR2, FR3 y FR4). Las regiones marco de la cadena pesada se designan FR de VH, mientras las regiones marco de la cadena ligera se designan aquí FR de VL. En determinadas modalidades, las regiones marco pueden contener sustituciones, inserciones u otras alteraciones. En determinadas modalidades, estas alteraciones resultan en una mejora u optimización en la afinidad de unión del anticuerpo. Los ejemplos no limitativos de residuos de la región marco que pueden modificarse incluyen aquellos que se unen no covalentemente a CXCR3 directamente, interaccionar con o influyen en la conformación de una CDR y/o participan en la interfase VL-VH.

En determinadas modalidades, la cadena pesada (VH) de un anticuerpo de CXCR3 o fragmento puede comprender FR1 , FR2, FR3 y/o FR4 que tienen secuencias de aminoácidos que son aproximadamente 80% a aproximadamente 100% idénticas (por ejemplo, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% o cualquier porcentaje intermedio) respecto a las regiones marco de VH correspondientes en uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En determinadas modalidades, un anticuerpo de CXCR3 o fragmento puede comprender al menos una FR de VH (FR1 , FR2, FR3 y/o FR4) que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que tiene 1 , 2, 3, 4 ó 5 mutaciones de de aminoácidos (incluyendo adiciones, supresiones y sustituciones, tales como sustituciones conservadoras) respecto a, las regiones FR de VH correspondientes en uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas.

En determinadas modalidades, la cadena ligera (VL) de un anticuerpo de CXCR3 o fragmento puede comprender FR1 , FR2, FR3 y/o FR4 que tienen secuencias de aminoácidos que son aproximadamente 80% a aproximadamente 100% idénticas (por ejemplo, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% o cualquier porcentaje intermedio) respecto a las regiones marco de VL correspondientes en uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En determinadas modalidades, un anticuerpo de CXCR3 o fragmento puede comprender al menos una FR de VL (FR1 , FR2, FR3 y/o FR4) que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a, o que tiene 1 , 2, 3, 4 ó 5 mutaciones de aminoácidos (incluyendo adiciones, supresiones y sustituciones, tales como sustituciones conservadoras) respecto a, las regiones FR de VL correspondientes en uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas.

En determinadas modalidades, un anticuerpo de CXCR3 o fragmento comprende regiones FR de VH (FR1 , FR2, FR3 y/o FR4) que tienen secuencias de aminoácidos idénticas a, o que comprenden 1 , 2, 3, 4 ó 5 mutaciones de aminoácidos respecto a las regiones FR de VH correspondientes en uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas y comprende regiones FR de VL (FR1 , FR2, FR3 y/o FR4) que tienen secuencias de aminoácidos idénticas a, o que comprenden 1 , 2, 3, 4 ó 5 mutaciones de aminoácidos respecto a las regiones FR de VL correspondientes en uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En determinadas modalidades, un anticuerpo de CXCR3 o fragmento comprende regiones FR de VH (FR1 , FR2, FR3 y/o FR4) que tienen secuencias de aminoácidos aproximadamente 80-100% idénticas a las regiones FR de VH correspondientes en uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas y comprende regiones FR de VL (FR1 , FR2, FR3 y/o FR4) que tienen una secuencia de aminoácidos aproximadamente 80-100% idénticas a las FR de VL correspondientes en uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas.

Las regiones CDR y FR descritas en la presente descripción pueden combinarse en una variedad de combinaciones, ya que cada una de las regiones CDR y FR puede seleccionarse independientemente y combinarse con cualquier otra región CDR o FR para un anticuerpo dado. En determinadas modalidades, las secuencias CDR y FR de VH y/o VL pueden estar presentes en cualquier combinación en un anticuerpo o fragmento que retiene la capacidad fe neutralizar la actividad de CXCR3.

Los anticuerpos y fragmentos, como se describe en la presente descripción, pueden comprender una o más secuencias de aminoácidos que no alteran sustancialmente las secuencias de aminoácidos descritas en la presente descripción. Las secuencias de aminoácidos que son sustancialmente las mismas incluyen secuencias que comprenden sustituciones de aminoácidos conservadoras, así como supresiones y/o inserciones de aminoácidos que no alteran la capacidad del anticuerpo o fragmento para neutralizar la actividad de CXCR3.

Los anticuerpos y fragmentos descritos en la presente descripción pueden conjugarse además con una o más moléculas adicionales. Por ejemplo, un conjugado puede comprender un anticuerpo unido directamente o a través de un conector a uno o más agentes terapéuticos, agentes de solubilización, agentes estabilizadores, inmunosupresores, receptores y fragmentos de éstos, péptidos de unión a antígeno y/o otros restos dirigidos a ligandos. En algunas modalidades, el agente terapéutico es un agente útil para tratar T1 D y/o otros trastornos asociados con CXCR3. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento se conjuga con un agente estimulador de células b o insulina.

Secuencias de nucleótidos Además de las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente, en la presente descripción se describen, en determinadas modalidades, secuencias de nucleótidos correspondientes a esas secuencias de aminoácidos. En algunas modalidades, una secuencia de nucleótidos codifica un anticuerpo o fragmento capaz de neutralizar la actividad de CXCR3. En determinadas modalidades, las secuencias de nucleótidos pueden usarse para preparar vectores de expresión para la expresión de anticuerpos anti-CXCR3 en células (por ejemplo, expresión en células de mamífero).

En la presente descripción también se describen, en determinadas modalidades, polinucleótidos sustancialmente idénticos a aquellos que codifican las secuencias de aminoácidos descritas en la presente descripción. Las secuencias sustancialmente idénticas pueden ser secuencias polimórficas, es decir, secuencias alternativas o alelos en una población. Las secuencias sustancialmente idénticas también pueden comprender secuencias mutagenizadas, incluyendo secuencias que comprenden mutaciones silenciosas. Una mutación puede comprender uno o más cambios en residuos de nucleótidos, una supresión de uno o más residuos de nucleótidos o una inserción de uno o más residuos de nucleótidos adicionales. Las secuencias sustancialmente idénticas también pueden comprender varias secuencias de nucleótidos que codifican el mismo aminoácido en cualquier posición de aminoácido dada en una secuencia de aminoácidos descrita en la presente descripción, debido a la degeneración del código de ácido nucleico. También incluidas en secuencias sustancialmente idénticas están las secuencias que codifican una cadena o cadenas de un anticuerpo que retienen la capacidad de neutralizar CXCR3.

En la presente descripción también se describen, en determinadas modalidades, polinucleótidos que hibridan en condiciones de hibridación de alta astringencia o de baja astringencia a polinucleótidos que codifican un anticuerpo neutralizante de CXCR3 o fragmento. El término "astringencia" tal y como se usa en la presente descripción se refiere a las condiciones experimentales (por ejemplo, temperatura y concentración de sal) de un experimento de hibridación realizado para evaluar el grado de homología entre dos ácidos nucleicos; cuanto mayor es la astringencia, mayor es el porcentaje de homología entre los dos ácidos nucleicos. Tal y como se usa en la presente descripción, la expresión "que híbrida", o las variaciones gramaticales de ésta, se refiere a la unión de una primera molécula de ácido nucleico a una segunda molécula de ácido nucleico en condiciones de astringencia baja media o alta o en condiciones de síntesis de ácidos nucleicos. La hibridación puede incluir casos en los que una primera molécula de ácido nucleico se une a una segunda molécula de ácido nucleico y en los que la primera y segunda moléculas de ácido nucleico son complementarias.

Las condiciones de hibridación astringentes incluyen, pero no están limitadas a, hibridación a DNA unido a filtro en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 grados Celsius, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC/0, 1 % SDS a aproximadamente 50-65 grados Celsius. Otras condiciones astringentes incluyen la hibridación a DNA unido a filtro en 6X SSC a aproximadamente 45 grados Celsius, seguido de uno o más lavados en 0.1 X SSC/0,2% SDS a aproximadamente 65 grados Celsius. Otras condiciones de hibridación de astringencia conocida son familiares para un experto en la téenica y se incluyen en la presente descripción.

En determinadas modalidades, un ácido nucleico descrito en la presente descripción puede codificar la secuencia de aminoácidos de una cadena o cadenas en un anticuerpo o fragmento capaz de neutralizar la actividad de CXCR3, o el ácido nucleico puede hibridar en condiciones astringentes con un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una cadena o cadenas en el anticuerpo o fragmento.

En determinadas modalidades, se describe en la presente descripción una secuencia de polinucleótido, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de un dominio VH de un anticuerpo neutralizante de CXCR3 o fragmento, y que es al menos aproximadamente 80-100% (por ejemplo, aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%) identica (o cualquier porcentaje intermedio) a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En determinadas modalidades, la secuencia de polinucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mutaciones (incluyendo adiciones, supresiones y sustituciones, tales como sustituciones conservadoras) respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas.

En determinadas modalidades, en la presente descripción se describe una secuencia de polinucleótido, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos de un dominio VL de un anticuerpo neutralizante de CXCR3 o fragmento, y que es al menos aproximadamente 80-100% (por ejemplo, aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, O 100%) idéntica (o cualquier porcentaje intermedio) a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. En determinadas modalidades, la secuencia de polinucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos que tiene 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 mutaciones (incluyendo adiciones, supresiones y sustituciones, tales como sustituciones conservadoras) respecto a la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas. [005] En modalidades particulares, en la presente descripción se describe una secuencia de polinucleótido, que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica (o cualquier porcentaje intermedio) a una secuencia de aminoácidos de VH y al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% idéntica (o cualquier porcentaje intermedio) a una secuencia de aminoácidos de VL, en la que las secuencias de nucleótidos codifican las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de uno cualquiera de los clones 12, 135, 82, 53 y 4 y sus variantes quiméricas y humanizadas.

Los polinucleótidos descritos pueden obtenerse por cualquier método conocido en la téenica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleótidos de un anticuerpo, puede ensamblarse un polinucleótido que codifica el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente. Esto implicaría, por ejemplo, la síntesis de oligonucleótidos superpuestos que contienen parte de la secuencia que codifica el anticuerpo, hibridar y ligar estos oligonucleótidos y amplificar los oligonucleótidos ligados por PCR. Los polinucleótidos descritos también pueden generarse a partir de cualquier otra fuente adecuada de ácidos nucleicos, tales como una biblioteca de cDNA de anticuerpos o una biblioteca de cDNA aislada de cualquier ejido o células que expresan el anticuerpo (por ejemplo, a partir de células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo).

En algunas modalidades, cualquiera de los polinucleótidos descritos puede incorporarse en un vector de expresión. Los vectores adecuados para la expresión en varios tipos de células humanas y animales son conocidos en la téenica. En algunas modalidades, se proporcionan células huésped que comprenden los vectores. Las células huésped adecuadas incluyen, por ejemplo, líneas celulares CHO, COS, Sf9 y/o tras humanas o no humanas. En algunas modalidades, las células huésped expresan de forma transitoria o estable el ácido nucleico en el vector cuando se cultivan en medio de cultivo, proporcionando de esta manera un método para producir los anticuerpos o fragmentos descritos en la presente descripción.

Composiciones farmacéuticas Una composición farmacéutica puede comprender cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, o fragmentos de estos. También se describen composiciones farmacéuticas que comprenden ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o fragmentos de éstos, por ejemplo, para uso en aplicaciones de terapia génica y/o para la expresión transitoria o estable en células huésped (por ejemplo, líneas celulares CHO, COS, Sf9 y/o tras humanas o no humanas) para producir las proteínas o fragmentos de éstas.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o al menos un aditivo tal como un disolvente, relleno, agente de volumen, disgregante, amortiguador o estabilizador. Las téenicas de formulación farmacéutica estándar son muy conocidas para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, 2005 Physicians' Desk Reference®, Thomson Healthcare: Montvale, NJ, 2004; Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed., Gennado et al., Eds. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000). Los aditivos farmacéuticos adecuados incluyen, por ejemplo, manitol, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de g I ¡cero I , talco, cloruro de sodio, leche desnatada seca, glicerol, propilen glicol, agua, etanol y semejantes. En determinadas modalidades, las composiciones farmacéuticas también pueden contener reactivos amortiguadores del pH y agentes humectantes o emulsificantes (por ejemplo, disolución salina amortiguada con fosfato, disolución salina estéril para inyección, etc.). En modalidades adicionales, las composiciones pueden contener conservadores u otros estabilizadores.

En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, o fragmento de éstos, o ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o fragmentos, pueden comprender además uno o más de los siguientes: manitol, polisorbato 80, fosfato de sodio dibásico heptahidrato, y fosfato de sodio monobásico monohidrato. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas pueden contener 10 mM Histidina pH 6,5 con hasta 2% glicina, hasta 2% manitol y hasta 0,01 % polisorbato 80.

La formulación de las composiciones farmacéuticas puede variar dependiendo de la ruta pretendida de administración y otros parámetros (véase, por ejemplo, Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a ed., APhA Publications, 2003.). En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede ser una torta liofilizada o polvo. La composición liofilizada puede reconstituirse para administración por inyección intravenosa, por ejemplo con Agua Estéril para Inyección, USP. En otras modalidades, la composición puede ser una disolución estéril, no pirógena.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden comprender un anticuerpo como se describe en la presente descripción, o un fragmento de éste, o ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o fragmentos, como el único compuesto activo, o la composición farmacéutica puede comprender una combinación con otro compuesto, composición o material biológico. Por ejemplo, la composición farmacéutica también puede comprender una o más moléculas pequeñas u otros agentes útiles para el tratamiento de una enfermedad o trastorno asociado con CXCR3, tal como T1 D. En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede comprender un agente estimulante de las células b, insulina y/o una célula productora de insulina. En algunas modalidades, la composición farmacéutica también puede comprender uno o más inmunosupresores, inhibidores de mTOR o inhibidores de autofagia. Los ejemplos de inmunosupresores incluyen rapamicina y velcade. La rapamicina también es un inhibidor de mTOR.

Administración y dosificación En algunas modalidades, se proporciona un método para tratar a un paciente que padece una enfermedad o trastorno asociado con CXCR3 que comprende administrar al paciente uno o más de los anticuerpos anti-CXCR3 descritos en la presente descripción, y/o un fragmento de éstos. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento es capaz de neutralizar CXCR3. En algunas modalidades, la enfermedad o trastorno es un trastorno inflamatorio. En algunas modalidades, el trastorno es T1 D. En algunas modalidades, la administración de una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que comprende el anticuerpo o fragmento previene, trata, reduce la gravedad y/o mejora de otra manera los síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con CXCR3. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento se administra a una dosis y frecuencia suficientes para prevenir, tratar, reducir la gravedad y/o mejorar de otra manera los síntomas de una enfermedad o trastorno asociado con CXCR3.

En determinadas modalidades, se proporciona una composición para uso en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno, en el que el medicamento comprende cualquiera de los anticuerpos descritos en la presente descripción, o fragmentos de éstos. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento puede comprender las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 4.0-4.11 emparejadas con las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 4.0-4.7; las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 12.0-12.3 emparejadas con las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 12.0-12.3; las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 53.0-53.10 emparejadas con las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 53.0-53.13; las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 82.0-82.3 emparejadas con las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 82.0-82.3; o las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 135.0-135.3 emparejadas con las tres CDR de uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 135.0-135.3.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento en el medicamento puede comprender uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 4.0-4.1 1 emparejado con uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 4.0-4.7, uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 12.0-12.3 emparejados con uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 12.0-12.3, uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 53.0-53.10 emparejados con uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 53.0-53.13, uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 82.0-82.3 emparejados con uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 82.0-82.3, o uno cualquiera de los dominios variables de cadena pesada 135.0-135.3 emparejados con uno cualquiera de los dominios variables de cadena ligera 135.0-135.3.

Las dosis del anticuerpo de CXCR3 para uso en los metodos descritos en la presente descripción variará tomando como base numerosos parámetros familiares para el experto en la téenica, tales como la fisiología del paciente (tamaño o área superficial, peso, edad y metabolismo) y estadio de la enfermedad, así como parámetros farmacológicos, tales como el mecanismo de administración, formulación y cualquier terapia simultánea o secuencial. Una "cantidad eficaz" de anticuerpo de CXCR3 puede producir un efecto deseado in vivo tal como uno o más de mantenimiento o disminución de los niveles de HA1 bc (hemoglobina A1 c) (menos de aproximadamente 7%, por ejemplo, menos de 7,5, 7,4, 7,3, 7,2, 7, 1 , 7,0, 6,9, 6,8, 6,7, 6,6 ó 6,5%, o cualquier porcentaje intermedio), producción incrementada de insulina endógena y/o niveles circulantes de insulina, mantenimiento o incremento de los niveles de péptido C en ayunas, tolerancia mejorada a la glucosa, niveles de glucosa sanguínea en ayunas reducidos en ausencia de insulina exógena, reducción en el uso de insulina exógena, reducción en la inflamación de células b y/o población y/o crecimiento incrementado de células b. También pueden usarse los ensayos celulares directos para la inhibición de CXCR3, tales como una reducción en la sangre de células CXCR3+ (incluyendo pero no limitado a células T), inhibición de unión del ligando a CXCR3, unión de GTP, influjo y/o movilización de calcio, quimiotaxis celular y/o internalización del receptor.

En determinadas modalidades, una cantidad eficaz de anticuerpo de CXCR3 resulta en aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% (o cualquier porcentaje intermedio) ó 1 , 2, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ó 100 veces (o cualquier número de veces intermedio), o más, de mejoras en cualquiera de los parámetros anteriores in vivo, respecto a los controles. En determinadas modalidades, una mejora puede caracterizarse por un nivel de glucosa sanguíneo en ayunas en ausencia de insulina exógena que se reduce por debajo de 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 300 ó 350 mg/dL (o cualquier valor intermedio). En determinadas modalidades, una mejora puede caracterizarse por un incremento en los niveles básales de péptido C sérico a más de 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,8 ó 1 ,0 nmoles/L (o cualquier valor intermedio). En algunas modalidades, una mejora puede caracterizarse por un incremento en los niveles integrados de péptido C sérico en ayunas durante un reto con péptido C (ensayo de tolerancia a la glucosa post-oral) a más de aproximadamente 0,03, 0,033, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0, 1 , 0,2, 0,4, 0,5, 0,6, 0,8 ó 1 ,0 nmoles/L x min (o cualquier valor intermedio). En determinadas modalidades, la dosis eficaz de anticuerpo de CXCR3 puede caracterizarse además por reducir la concentración de células CD4+ y/o CD8+ en el páncreas al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ó 90% (o cualquier porcentaje intermedio) o al menos 1 , 2, 3, 4, ó 5 veces (o cualquier valor intermedio), respecto a los sujetos control.

En varias modalidades, una dosis eficaz de anticuerpo también se selecciona para ser una dosis segura para administración a un sujeto humano. En determinadas modalidades, una dosis segura de anticuerpo anti-CXCR3 puede caracterizarse como una que resulta en ausencia sustancial de agotamiento importante de células T o actividad de células T (distinta de actividad CXCR3) en el sujeto (por ejemplo, según se mide por la concentración o actividad de las células T en la sangre del sujeto). En modalidades particulares, "ausencia sustancial de agotamiento importante de células T o actividad de células T" significa una reducción de 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% (o cualquier porcentaje intermedio) o una reducción más baja en la concentración y/o actividad (distinta de actividad CXCR3) de células CD4+ y/o CD8+en el sujeto tratado con anticuerpo neutralizante de CXCR3, respecto a los sujetos control tratados con placebo y/o respecto a los sujetos con tratamiento antes del tratamiento. En algunas modalidades, la dosis segura se caracteriza además por una reducción de 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% (o cualquier porcentaje intermedio) o una reducción más baja en la concentración de uno o más tipos celulares seleccionados de T regs, células B, células mieloides, células dendríticas y/o granulocitos, respecto a sujetos control.

Las dosis ejemplares, no limitantes para un sujeto, tal como un ser humano, incluyen aproximadamente 0,03, 0,06, 0, 12, 0,24, 0,5, 1 ,0, 1 ,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 ó 3,7 mg/kg/dosis (o cualquier valor intermedio) para un anticuerpo con una ND50 de aproximadamente 1 -6 mr/hh?- en un ensayo de quimiotaxis in vitro. En determinadas modalidades, el anticuerpo puede administrarse en un intervalo de aproximadamente 0,03-3,7 mg/kg/dosis, 0, 15-0,7 mg/kg/dosis ó 0,25-0,5 mg/kg/dosis.

Un anticuerpo anti-CXCR3 puede administrarse en una única administración o en administraciones repetidas durante diferentes periodos de tiempo, tal como diariamente, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente, bimensualmente, trimestralmente o anualmente. De acuerdo con esto, en un ejemplo no limitante basado en los intervalos de dosificación discutidos anteriormente, un paciente puede recibir una dosis total aproximada de 0, 16-18 mg/kg de anticuerpo de CXCR3 durante el curso de un régimen de tratamiento.

Los anticuerpos anti-CXCR3 pueden administrarse por cualquier medio adecuado conocido para el experto en la téenica, incluyendo, por ejemplo, intravenosamente, intraperitonealmente, nasalmente, ocularmente, oralmente, parenteralmente, subcutáneamente o transdérmicamente. En modalidades particulares, el anticuerpo puede administrarse directamente en el páncreas del sujeto o próximo al páncreas o en regiones específicas del páncreas, tal como las células de los islotes del páncreas.

Las dosificaciones eficaces conseguidas en un animal pueden convertirse para uso en otro animal, incluyendo los seres humanos, usando factores de conversión conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Reagan-Shaw et al. , FASEB J. 22: 659-61 (2008); Schein et al., Clin. Pharmacol. Ther. 1 1 : 3-40 (1970); y Freireich et al., Cáncer Chemother. Reports 50(4): 219-244 (1966). Por ejemplo, la dosificación humana equivalente (HED) en mg/kg basada en la dosificación en animales puede proporcionarse por la ecuación siguiente: HED (mg/kg) = dosis animal (mg/kg) X (Krnammal/Krnhumana), en la que Km= peso/área superficial (kg/m2).

Los factores de conversión ejemplares basados en la ecuación anterior se muestran en la tabla siguiente. Las dosis ejemplares proporcionadas anteriormente para los seres humanos pueden ajustarse para otras especies u otros pacientes humanos tomando como base estos coeficientes u otros medios conocidos para el experto en la teenica.

Tabla 3 Sujetos Los sujetos que se van a tratar por los métodos proporcionados por la invención pueden incluir seres humanos o animales, tales como ganado, animales domésticos y salvajes. En algunas modalidades, los animales con aviares, bovinos, caninos, cetáceos, equmos, felinos, ovinos, peces, porcinos, primates, roedores o ungulados. Los sujetos pueden estar en cualquier estadio de desarrollo, incluyendo adulto, joven, fetal o embrión. En modalidades particulares, el paciente es un mamífero y, en modalidades más particulares, un ser humano.

En varias modalidades, un sujeto puede tratarse profilácticamente o después del inicio de cualquier afección asociada con la actividad aberrante de CXCR3 o cualquier afección en la que la disrupción de la señalización de CXCR3 podría ser terapéuticamente beneficiosa. En algunas modalidades, un sujeto puede tratarse profilácticamente o después del inicio de T1 D. En algunas modalidades, un sujeto puede tratarse profilácticamente antes del inicio de T1 D usando los métodos proporcionados en la presente descripción, o un sujeto que tiene T1 D de inicio reciente puede tratarse usando los métodos proporcionados en la presente descripción.

"Un sujeto que tiene T1 D de inicio reciente" es cualquier sujeto que tiene una capacidad de producir insulina disminuida, pero aún detectable, de las células b del páncreas, independientemente de la edad del sujeto cuando la diabetes se diagnostica clínicamente (por ejemplo, incluyendo sujetos adultos, jóvenes, fetales o embrionarios). En determinadas modalidades, un sujeto que tiene T1 D de inicio reciente recibirá tratamiento preferiblemente en los aproximadamente seis meses (por ejemplo, en aproximadamente 1 día, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 1 mes, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o cualquier momento intermedio) del diagnóstico clínico más temprano de T1 D. En otras modalidades, el sujeto puede recibir tratamiento más de seis meses después del diagnóstico clínico más temprano de T1 D, en el que el sujeto retiene unos niveles de péptido C sérico basal mínimos pero mensurables de más de o iguales a aproximadamente 0,2 nmoles/L (por ejemplo, aproximadamente 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,8 ó 1 ,0 nmoles/L). En algunas modalidades, el tratamiento comprende la administración de una o más dosis que comprenden uno o más anticuerpos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante de CXCR3.

En algunas modalidades, un sujeto que tiene T1 D de inicio reciente retiene un nivel integrado de péptido C sérico en ayunas de al menos aproximadamente 0,03, 0,033, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0, 1 , 0,2, 0,4, 0,5, 0,6, 0,8 ó 1 ,0 nmoles/L x min, por ejemplo, aproximadamente 0,03 a 1 ,0 ó 0,033 a 1 ,0 nmoles/L x min durante la estimulación de péptido C. En modalidades particulares, el sujeto tiene un nivel integrado de péptido C sérico en ayunas de 0,033 a 1 ,0 nmoles/L x min durante la estimulación de péptido C. En determinadas modalidades, la estimulación de péptido C es un ensayo de glucosa post-oral y puede comprender medir los niveles integrados de péptido C sérico durante 60-150 minutos después de la administración de 10,0-13,9 mmoles/L de glucosa. Véase Keymeulen et al., Diabetologia 53: 614-623 (2010). En modalidades más particulares, el incremento en nivel integrado de péptido C sérico en el ensayo de tolerancia a la glucosa post-oral mensurable es menos de 0,8, 0,7, 0,6, 0,54, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ó 0,1 nmoles/L x min. En modalidades aún más particulares, el sujeto tiene un incremento de 0,54 nmoles/L x min, o menos, en el nivel integrado de péptido C sérico en el ensayo de tolerancia a la glucosa post-oral. El péptido C corresponde a los residuos 57-87 del péptido precursor de la insulina (secuencia humana de referencia NP_000198), con los residuos 90-110 y 25-54 correspondiendo a las cadenas A y B de la insulina, respectivamente.

En algunas modalidades, un sujeto que tiene T1 D de inicio reciente tiene un nivel elevado de glucosa sanguínea en ayunas en ausencia de insulina exógena de más de aproximadamente 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 300, 350 mg/dL (o cualquier valor intermedio), o más. En determinadas modalidades, el sujeto puede tener tanto un nivel elevado de glucosa sanguínea en ayunas como se ha descrito anteriormente como un nivel reducido de péptido C sérico integrado en ayunas, como se ha descrito anteriormente.

En determinadas modalidades, un sujeto se trata por los métodos descritos en la presente descripción poco después de ser diagnosticado con T1 D de inicio reciente. En modalidades más particulares, el sujeto se trata en primer lugar por los métodos de la invención en los 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 días, ó 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 semanas ó 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. 10, 11 ó 12 meses desde el diagnóstico clínico de T1 D de inicio reciente (o en cualquier momento intermedio). En modalidades más específicas, un sujeto se trata en primer lugar por los metodos de la invención en los 6 meses desde el diagnóstico clínico de T1 D de inicio reciente. En otras modalidades, un sujeto que tiene T1 D se trata por los métodos descritos en la presente descripción en cualquier momento, independientemente del tiempo desde el diagnóstico clínico, en el que el sujeto retiene niveles residuales de péptido C sérico de al menos aproximadamente 0,2 nmoles/L.

Métodos adicionales Los métodos proporcionados en la presente descripción pueden, en determinadas modalidades, comprender tratamientos adicionales que pueden administrarse simultáneamente o secuencialmente (antes o después) con la administración de un anticuerpo anti-CXCR3 descrito en la presente descripción. Por ejemplo, en algunas modalidades, se describen métodos que comprenden la etapa adicional de administrar un inmunosupresor al sujeto además de un anticuerpo anti-CXCR3. Los inmunosupresores pueden incluir, pero no están limitados a, uno o más de Azatioprina (Imuran), interferón b 1a, interferón b 1 b, basiliximab, corticosteroides, Ciclosporina (Sandimmune), ciclofosfamida, clorambucil, declizumab, desoxiespergualina, Etanercept, acetato de glatiramer, infliximab, leflunomida, Mercaptopurina (6-MP), metotrexato, mitoxantrona, Muromonab-CD3, Micofenolato (MFM o CelICept), natalizumab, anakinra, canaqumumab, rituximab, belimumab, abatacept, aldesleuquina, prednisona, rapamicina, sirolimus, tacrolimus y Ustekinumab.

En algunas modalidades, los métodos descritos en la presente descripción pueden comprender, además de administrar un anticuerpo anti-CXCR3, la etapa de administrar un agente estimulante de células b al sujeto. La etapa de administrar un agente estimulante de células b puede ser simultánea o secuencial (antes o después) con la administración de un anticuerpo anti-CXCR3. Los agentes estimulantes de células b ejemplares incluyen, pero no están limitados a, uno o más de células b trasplantadas (autólogas, alogénicas o singénicas), células productoras de insulina trasplantadas (alogénicas o singénicas), inhibidores de DDP4 (secuencia de referencia de proteína humana NP_001926.2), péptidos TM4SF20 (secuencia de referencia de proteína humana NP_079071 ), péptidos TMEM27 (secuencia de referencia de proteína humana NP_065716), análogos de exendina 1 o GLP-1 (secuencia de referencia de proteína humana NP_002045), gp130 y ligandos del receptor de EGF, como los descritos en los párrafos 8-11 de la Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. 20100130476. Un agente estimulante de células b puede administrarse junto con un inmunosupresor en los métodos de la invención, bien simultáneamente o secuencialmente (antes o después). En determinadas modalidades, un agente estimulante de células b, célula productora de insulina y/o inmunosupresor puede administrarse implantando un dispositivo capaz de administrar el agente estimulante de células b, célula productora de insulina y/o inmunosupresor al tejido u órgano objetivo. [006] En la presente descripción también se describen métodos para detectar y/o cuantificar CXCR3 y/o células que expresan CXCR3 (por ejemplo, células T CXCR3+). En algunas modalidades, los métodos comprenden usar uno o más anticuerpos anti-CXCR3 descritos en la presente descripción para detectar y/o cuantificar CXCR3 y/o células que expresan CXCR3. Por ejemplo, pueden añadirse uno o más anticuerpos a la muestra de un paciente (por ejemplo, una muestra de sangre) y detectarse usando un mareaje detectable tal como un anticuerpo secundario conjugado con una señal detectable (por ejemplo, un anticuerpo secundario de detección fluorescente). Por ejemplo, puede usarse separación FACS para cuantificar el nivel de células que expresan CXCR3 en una muestra después de la unión de anticuerpo primario y secundario fluorescente.

En algunas modalidades, los métodos de diagnóstico pueden usarse para diagnosticar un trastorno de CXCR3 o un trastorno asociado con CXCR3 (por ejemplo, diabetes, T1 D). Por ejemplo, un trastorno puede diagnosticarse detectando la presencia o ausencia de CXCR3 en la muestra de un paciente o comparando la concentración de CXCR3 en una muestra con el nivel en uno o más estándares de referencia, en el que una desviación del nivel en el estándar indica la presencia de un trastorno.

En varias modalidades, también se proporcionan kits que comprenden al menos un anticuerpo anti-CXCR3 o fragmento. Los kits son útiles para varios propósitos de investigación, diagnóstico y terapéuticos. Por ejemplo, los kits pueden usarse para detectar células T CXCR3+ o para tratar diabetes de tipo I mediante la administración del anticuerpo anti-CXCR3 o fragmento contenido en el kit a un sujeto. Para propósitos de aislamiento y purificación, el kit puede contener un anticuerpo o fragmento acoplado con un lecho (por ejemplo, lechos de sefarosa). En determinadas modalidades, el kit también comprende instrucciones para usar el anticuerpo anti-CXCR3 o fragmento para el propósito de investigación, diagnostico y/o terapéutico deseado. [007] En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a no ser que se indique específicamente otra cosa. También en esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a no ser que se indique otra cosa. Además, el uso del término "incluyendo ", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no son limitantes. Se entenderá que cualquier intervalo descrito en la presente descripción incluye los extremos y todos los valores entre los extremos.

Los encabezamientos de las secciones usados en la presente descripción son sólo para propósitos organizativos y no deben considerarse limitantes del contenido descrito. Todos los documentos, o partes de documentos, citados en esta solicitud, incluyendo pero no limitado a patentes, solicitudes de patente, artículos, libros y tratados, se incorporan expresamente en la presente descripción por referencia en su totalidad para cualquier propósito. En el grado en el que las publicaciones y patentes o solicitudes de patente incorporadas por referencia contradigan la invención contenida en esta especificación, la especificación prevalecerá sobre cualquier material contradictorio.

Toda la información asociada con secuencias génicas de referencia descrita en esta solicitud, tal como GenID o números de registro, incluyendo, por ejemplo, loci genómicos, secuencias genómicas, anotaciones funcionales, variantes alelicas y mRNA (incluyendo, por ejemplo, límites de exones) y secuencias de proteínas (tales como estructuras de dominios conservados) de referencia se incorporan en la presente descripción por referencia en su totalidad.

Ejemplos Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar, y de ninguna manera limitar, la presente descripción.

Ejemplo 1 : Materiales y Métodos Generación de inmunógeno. Se transformaron células CHO con DNA que codifica CXCR3 humano de longitud completa y CXCR3 se expresó en la superficie celular ("células r-CXCR3-CHO"). Se obtuvo la secuencia de CXCR3 usada para transformar las células y el marco de lectura abierto de CXCR3 se puso en un vector de expresión pcDNA3.1 neo_DEST, y se transfectó en células 300-19 (Immunogen). Se conjugó un fragmento de péptido N terminal del dominio extracelular de CXCR3 (dominio EC), con la secuencia de aminoácidos, MVLEVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDSC (SEQ ID NO: XXX) con kLH por la cisteína C terminal y se usó como un inmunógeno. Las células que expresan CXCR3 se mantuvieron a 37°C, bajo 5% C02 en RPMI (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) suplementado con 10% suero bovino fetal dializado (FBS) (Invitrogen). Las células se prepararon para inyección sustituyendo el medio de cultivo anterior por disolución salina amortiguada con fosfato (CMF-PBS) (sin Ca/Mg) suple entada con 5 mM EDTA y recogiendo las celulas en ese amortiguador. Las células recogidas se sedimentaron por centrifugación a 500xg durante aproximadamente 5 minutos, se lavaron una vez resuspendiendo el sedimento en CMF-PBS y centrifugando como anteriormente, se contaron y se ajustaron hasta el volumen apropiado (tal como 5x106 células en 0,2 mi) para inyección resuspendiendo el sedimento celular en CMF-PBS.

Preparación de anticuerpos. Los 37 aminoácidos N terminales de CXCR3 humano se usaron para generar hibridomas monoclonales de ratón para anti-CXCR3 humano y se seleccionaron cinco clones de anticuerpo (4, 12, 53, 82 y 135) para caracterización adicional. El extremo N terminal de 37 aminoácidos de CXCR3 humano es 65% homólogo a la región alineada en CXCR3 de ratón y contiene residuos importantes para la unión de CXCL9, CXCL10 y CXCL1 1. Se inmunizaron ratones BALB/c, de aproximadamente 6-8 semanas de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) con las células que expresan CXCR3 o un péptido extracelular de CXCR3. Un grupo de ratones se estimuló subcutáneamente (SC) en el día 0 con una emulsión 1 : 1 de péptido conjugado con KLH mezclado con adyuvante (TiterMax Gold, Sigma Aldrich, #T2685-1 ML), se reforzó SC 3-5 veces a intervalos de 2-3 semanas con una emulsión 1 : 1 de péptido a adyuvante o intraperitoneal (IP) con células en PBS sin adyuvante y se reforzó dos días consecutivos antes del sacrificio vía IP con péptido y/o células en PBS todos sin adyuvante. Otro grupo de ratones se estimuló I P 3-5 veces a intervalos de 2-3 semanas y se reforzó vía IP con células en PBS dos días consecutivos antes del sacrificio. Para ambos grupos de ratones, cada inyección contenía aproximadamente 2x106 células en un volumen de aproximadamente 100 mI.

El día posterior a la última inyección, los ratones se sacrificaron y el bazo se retiró y se puso en aproximadamente 10 mi de DMEM sin suero (Gibco) en una placa Petri. Se fusionaron células de mieloma Sp2/0 de ratón (ATCC CRL-1581 ) con las células del bazo de los ratones inmunizados usando 50% (p/p) PEG basado en el método de Kohler y Milstein ( Nature , 256: 495-7, (1975)). Al final del procedimiento, las células se resuspendieron en 50 mi de medio de Recuperación de Hibridoma ClonaCell-Hy (StemCell Technologies), se transfirieron a un matraz T75cm2 y se incubaron durante 16-24 horas a 37°C. Después de esta incubación, las células se recogieron y se añadieron a 100 mi de medio de selección de metilcelulosa ClonaCell-HY (StemCell Technologies). Esta mezcla se alicuotó en diez placas de cultivo tisular de 100 mm2 y se incubó durante 10-14 días. Los hibridomas clónales se transfirieron desde la metilcelulosa a medio líquido y se crecieron en placas de 96 pocilios para ensayos para identificar anticuerpos monoclonales específicos para CXCR3.

A no ser que se indique otra cosa, la referencia en estos ejemplos a una variante de anticuerpo, tal como Hu4.1 , se refiere a un anticuerpo que contiene una variante de cadena pesada y variante de cadena ligera del mismo número (por ejemplo, Hu4.1 contendrá la cadena pesada 4.1 y cadena ligera 4.1 ). Todas las referencias a anticuerpos son consistentes con la numeración de anticuerpos y el emparejamiento de cadenas VH/VK mostrado en la Tabla 2.

Animales. Los ratones hembra NOD/LtJ se adquirieron en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en condiciones sin patógenos. Los ratones se cribaron para glucosuria usando un Medidor de Glucosa Sanguínea Compacto ACCU-CHEK® (Roche, Indianápolis, IN) por punción en la vena de la cola dos veces a la semana empezando a las 10 semanas de edad. Se consideró que los ratones eran diabeticos cuando la medición de glucosa sanguínea estaba por encima de 250 mg/dL durante tres días consecutivos. Se observó a los ratones durante un mínimo de 100 días después del inicio del tratamiento. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por IACUC propio.

Inyecciones de anticuerpo. Para los estudios de prevención, se inyectaron a ratones NOD pre-diabéticos 100 mg de anticuerpo intraperitonealmente (i.p.) una vez a la semana durante 6 semanas empezando a las 10 semanas de edad. Para estudios de reversión, se incluyó aleatoriamente a los animales en grupos de tratamiento en 1 semana después de que los ratones fueron considerados diabéticos, se midió la glucosa sanguínea dos veces al día, al menos seis horas entre lecturas, y se administró insulina por inyección i.p. a aquellos ratones con una glucosa sanguínea por encima de 250 mg/dL durante la duración del estudio. Se consideró que habían revertido los ratones en los grupos de tratamiento que mantuvieron independencia de insulina durante 30 días consecutivos. Cinco ratones de cada grupo se recogieron entre el qumto y sexto tratamiento y los órganos linfoides, sangre, médula ósea y páncreas se recogieron para análisis celular. Al final del estudio, el páncreas se recogió y se procesó para análisis histológico e inmunohistoquímico. El anticuerpo anti-CXCR3 de ratón, clon CXCR3-173 (Uppaluri et al. 2008) y el anticuerpo IgG control de hámster se adquirieron en BioLegend (San Diego, CA).

Análisis FACS. Se prepararon suspensiones de células únicas de bazo, ganglios linfáticos inguinales, ganglios linfáticos pancreáticos y médula ósea. El páncreas se cortó en partes pequeñas y se incubó en 2 mg/ml de colagenasa D (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) durante 30 minutos a 37°C, se filtró a través de un filtro celular de 70 micrómetros (BD Biosciences, San José, CA) y los linfocitos se separaron del tejido pancreático usando centrifugación con gradiente de densidad. Las células se tiñeron con anti-CD25 de ratón marcado con APC, anti-CD4 de ratón marcado con FITC y antí-Foxp3 de ratón marcado con PE (eBiosciences, San Diego, CA) para células T reguladoras (T regs), anti-CD8 a de ratón marcado con PerCP, anti-CD44 de ratón marcado con PE, anti-CD62L de ratón marcado con APC y anti-CXCR3 de ratón marcado con PeCy7 para células T activadas/de memoria y anti-CD94 de ratón marcado con FITC, anti-CD4 de ratón marcado con PerCP, anti-B220 de ratón marcado con APC, anti-CD1 1 c de ratón marcado con PeCy7, anti-CD11 b de ratón marcado con azul pacífico y anti-NKp46 de ratón marcado con PE para células B, células mieloides, células dendríticas, células NK y células NKT. Las células se incubaron durante 30 min a 4°C después de bloquear con anti-CD16/32 de ratón durante 20 min en hielo. Para la tinción de T reg, se realizó tinción de la superficie, las células se lavaron, se fijaron y se permeabilizaron en amortiguador Cytofix/Perm (eBiosciences) y se tiñeron con el anticuerpo anti-Foxp3 de ratón durante 30 min en hielo. Después de la tinción, las células se lavaron dos veces, se fijaron en paraformaldehído y se adquirieron en el citómetro LSRII y los datos se analizaron usando software Flow Jo (Treestar, Ashland, OR). Todos los anticuerpos se adquirieron en BD Biosciences a no ser que se indique otra cosa.

Ensayo de quimiotaxis. El ensayo para quimiotaxis se realizó en placas de 24 pocilios (Costar) que portaban soportes permeables transpocillo con una membrana de 5 pm. Las células 300.19 transfectadas con CXCR3 se pusieron en los insertos transpocillo a 1 x 106 células en 2,5% suero bovino fetal inactivado con calor en RP I1640 (volumen total de 0,2 mi). Se puso medio solo o suplementado con quimiocina recombinante 300 ng/ml CXCL9 (MIG), 100 ng/ml CXCL10 (IP-10) ó 100 ng/ml CXCL1 1 (l-TAC) en el compartimento inferior (0,6 mi) y los insertos de transpocillo que contienen las células se cargaron en el compartimento inferior. Las placas se incubaron entre 4-5 horas en un incubador humidificado con 5% CO2 a 37°C. Después del periodo de incubación, los insertos transpocillo se retiraron y el medio total en el compartimento inferior se juntó y las células se sedimentaron por centrifugación durante 5 min a 1.200 RPM. El medio se aspiró y las células se tiñeron con Calceína AM (10 m9/itiI final) durante 30 minutos a 37°C. Las células se sedimentaron y se lavaron, se añadió medio (0, 1 mi) y la suspensión se transfirió a placas de fondo claro con pared negra de 96 pocilios. Las placas se pulsaron a 1.200 RPM para sedimentar las celulas y la fluorescencia se midió a 490/520 nm en una Flexstation. Todas las condiciones se ensayaron en triplicado. Los datos resultantes se expresan como unidades de fluorescencia relativa (RFU) media de las células migradas. Véase la Fig. 14 A-C y Fig. 15A-C.

Para la quimiotaxis con bloqueo de CXCR3, las células 300.19 transfectadas con CXCR3 se pre-trataron con varias cantidades de anticuerpo bloqueante o IgG control durante 20-30 minutos a 37°C antes de usarse en el ensayo de quimiotaxis. El anticuerpo no se lavó sino que estuvo presente durante la incubación del ensayo.

Ensayo de movilización de calcio usando FLIPR. Las células de Riñón Embrionarias Humanas 293 (HEK) que expresan hCXCR3 se recogieron a 80% de confluencia tratando con PBS + 2 mM EDTA. Las células se suspendieron en medio HEK-.SFM sin suero a una densidad de 1 x 106 células/mL. Se dispensaron 15 pL (15.000 células) de la suspensión en cada pocilio de una placa de 384 pocilios. Las células se cargaron con agente de tinción durante 30 minutos a temperatura ambiente añadiendo 15 mI de Agente de Tinción de FLIPR Calcio 4 reconstituido. Los clones de anticuerpo anti-CXCR3 humano y los controles de isotipo se diluyeron de forma seriada (3 veces) en HBSS + 20 mM HEPES + 1 % BSA para generar 10 concentraciones de ensayo por clon. Cada concentración de ensayo se ensayó en duplicado (n= 2) en la misma placa. Se añadieron 15 mI de la concentración de ensayo a las células en cada pocilio y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió una concentración fija de CXCL11 (R&D Systems) que representa CE80 para incitar la movilización de calcio intracelular en el FLIPR en cada pocilio y el cambio en fluorescencia se monitorizó con el tiempo. La respuesta máxima de cada pocilio se normalizó respecto a la línea base y los datos se ajustaron después de promediar a una ecuación de cuatro parámetros usando GraphPad Prism y se determinó la CI50 para cada clon. Véase la Fig. 14D y Fig. 21.

Análisis Biacore para afinidad. Preparación de superficie Biacore. Las afinidades de unión de los clones de anticuerpo de hibridoma de anti-CXCR3 humano de ratón 4, 12, 53, 82 y 135 frente al péptido CXCR3 humano se calcularon usando un ensayo de cinética/afinidad Biacore T100. Se inmovilizó un chip sensor Biacore CM5 Serie S (GE #BR-1006-68) con anticuerpo de captura anti-Fc de ratón de conejo (RAM-Fc) (GE #BR-1008-38) usando el programa de acoplamiento estándar de amina. La superficie de carboximetil dextrano del chip se activó usando una mezcla 1 : 1 de 0, 1 M N-hidroxisuccinimida (NHS) y 0,4M de hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilam¡nopropil)carbodiimida (EDC), lo que permite que la superficie se una a grupos amino reactivos en el anticuerpo de captura. Después de la inmovilización del anticuerpo, la superficie reactiva del chip sensor se inactivó usando 1 M hidrocloruro de etanolamina/NaOH pH 8,5. La inmovilización resultó en 8.000 RU del anticuerpo de captura RAM-Fc en una célula de flujo. Se usó otra célula de flujo blanco como una superficie para la resta de la referencia durante el análisis de los datos.

Condiciones del ensayo Biacore. Las temperaturas de la cámara de la muestra y ensayo del instrumento Biacore T100 se ajustaron a 4°C y 25°C, respectivamente. Los anticuerpos anti-hCXCR3 de ratón se diluyeron hasta 500 nM en amortiguador de ensayo HBS-EP+ (10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 0,05% surfactante P20, 3 mM EDTA, pH 7,4) y se capturaron usando una inyección de treinta segundos a 10 mI/min. Estas condiciones resultaron en -1.200 RU de captura estable de cada clon anti-hCXCR3 de ratón ensayado. Los péptidos de hCXCR3 se diluyeron hasta las concentraciones 200, 100, 50, 25, 12,5 y 0 nM en HBS-EP+. Cada ciclo de ensayo, el péptido se inyectó durante cinco minutos a un caudal de 50 mI/min para medir la asociación, se lavó en HBS-EP+ durante diez minutos a un caudal de 50 mI/min para medir la disociación. La superficie de captura (RAM-Fc) se regeneró entre ciclos de ensayo usando 10 mM glicina-HCI pH 1 ,7 a 50 mI/min durante tres minutos. El análisis se realizó en software v2.0 de evaluación de cinética Biacore T100 (GE Healthcare). Los sensogramas se ajustan a un modelo de unión 1 : 1 con la resta de la célula de flujo de referencia y concentración 0 nM (resta de doble referencia).

Ensayo de receptor completo Biacore. La proteína receptora CXCR3 humana de longitud completa con 6xHis C terminal y etiqueta HPC4 se expresó en células de insecto Sf9 con un vector baculovirus. La proteína receptora se purificó mediante purificaciones de afinidad Ni-NTA y HPC4. Al producto final se le intercambió el amortiguador a 10 mM HEPES, 300 mM NaCI, 0,5% n-dodecil b-D-maltopiranósido y 5% glicerol. La proteína receptora se capturó en chips NTA mediante quelación de Ni y se estabilizaron adicionalmente por acoplamiento amina usando una mezcla diluida 1 : 10 de la mezcla 1 : 1 de 0, 1 M N-hidroxisuccinimida (NHS) y 0,4M de hidrocloruro de N-eti l-N '-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). La superficie estabilizada del receptor se ensayó para actividad de unión a ligando inyectando 20 nM de los ligandos hCXCLI O y hCXCL1 1. Para los análisis de cinética, los ligandos de CXCR3 humano (hCXCL9, hCXCLI O y hCXCL1 1 ) se diluyeron hasta concentraciones de 20, 10, 5, 2,5, 1 ,25, 0,6125, 0,3125 y 0 nM en HBS-EP+. Los anticuerpos anti-CXCR3 se diluyeron hasta concentraciones de 80, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1 ,25 y 0 nM en HBS-EP+. El analito se inyectó durante cinco minutos a un caudal de 50 mI/min para medir la asociación y se lavó en HBS-EP+ durante diez minutos a un caudal de 50 mI/min para medir la disociación. La superficie del receptor se regeneró entre los ciclos de ensayo usando 10 mM glicina-HCI pH 1 ,7 a 50 mI/min durante 1 minuto. El análisis se realizó en software v2.0 de evaluación de cinética Biacore T100 (GE Healthcare). Los sensogramas se ajustan a un modelo de unión 1 : 1 con la resta de la célula de flujo de referencia y concentración 0 nM (resta de doble referencia).

Ensayo de tolerancia a la glucosa. La tarde anterior al reto de glucosa, se monitorizó la glucosa sanguínea no en ayunas, y se paró el tratamiento de insulina de los animales diabéticos. Los ratones estuvieron en ayunas 12 horas antes de inyectar i.p. D-glucosa (20%; Sigma) a 2 mg/g de peso corporal. La glucosa sanguínea se midió antes y 15, 30, 60 y 120 minutos después de la inyección.

Ejemplo 2: Caracterización de los ratones NOD Se tiñeron secciones representativas de páncreas de ratones NOD hembra pre-diabeticos de 6 a 10 semanas de edad y ratones NOD hembra con diabetes de inicio reciente incluidas en parafina para insulina, CXCL10 y el marcador de células T CD3. Fig .1. La expresión de CXCL10 se detectó en el páncreas de ratones NOD en islotes rodeados de células infiltrantes (flechas en la columna central de la Fig. 1 ). Los ratones más mayores pre-diabéticos y diabéticos de inicio reciente tenían un incremento marcado en la infiltración de células T de los islotes (Fig. 1 , columna derecha) y una disminución en la producción de insulina en los islotes (Fig. 1 , columna izquierda).

Para evaluar adicionalmente si las células T CXCR3+ estaban presentes en el páncreas de ratones NOD, se realizó un análisis de citometría de flujo en tejido del páncreas recogido de ratones NOD hembra con diabetes de inicio reciente. Fig. 2. Se evaluó la expresión de CXCR3 en células T CD4+/TCR+ y CD8+/TCR+. La tinción con anticuerpo de isotipo control se representa por la curva sombreada. La citometría de flujo se realizó en suspensiones de célula única de tejido de páncreas combinado recogido de varios ratones. Los datos indican que en el páncreas de ratones NOD estaban presentes células T CXCR3+ citotóxicas y auxiliares.

Ejemplo 3: Tratamiento profiláctico de ratones NOD con anticuerpo anti-CXCR3 Se trataron ratones NOD hembra pre-diabéticos una vez a la semana durante seis semanas con 100 mg de un anticuerpo anti-CXCR3 de ratón de hámster (clon CXCR3-173, adquirido en BioLegend, San Diego, CA) o con una IgG control de hámster o PBS, empezando a las 10 semanas de edad. La glucosa sanguínea se monitorizó dos veces a la semana y un animal se consideró diabético y se sacrificó después de presentar tres lecturas consecutivas de glucosa sanguínea por encima de 250 mg/dL. Las Figs. 3A-B muestran el porcentaje de ratones que desarrollaron diabetes con el tiempo para cada grupo de tratamiento. Cada línea representa los resultados combinados de diez ratones por grupo. Se muestran los resultados de dos estudios independientes (Fig. 3A y 3B). Los gráficos ilustran que el tratamiento profiláctico con un anticuerpo anti-CXCR3 previno el desarrollo de diabetes en ratones NOD hembra pre-diabéticos.

Para evaluar adicionalmente los efectos de la administración profiláctica de anticuerpo anti-CXCR3, se tiñeron secciones representativas de páncreas de ratones NOD hembra tratados con anticuerpo anti-CXCR3 para insulina (Fig. 4, panel izquierdo), CD3 y Foxp3 (Fig. 4, paneles central y derecho). El panel de la derecha en la Fig. 4 es una imagen con aumento incrementado de la sección mostrada en el panel central. El tejido del páncreas se recogió de los ratones al final del periodo de estudio (26 semanas de edad). La Fig. 4 demuestra que los islotes positivos para insulina estaban presentes en ratones NOD tratados con un anticuerpo anti-CXCR3, mientras la mayoría de las células T estaban alrededor y no habían invadido los islotes.

Ejemplo 4: Reversión de la diabetes de inicio reciente en ratones NOD Se consideraron diabéticos los ratones hembra con tres lecturas consecutivas de glucosa sanguínea por encima de 250 mg/dL y se incluyeron aleatoriamente en grupos de tratamiento. El tratamiento se empezó en una semana de la inclusión. Los ratones se trataron con PBS, anticuerpo anti-CXCR3 de ratón (100 pg administrados intraperitonealmente, clon CXCR3-173) o IgG control (100 pg administrados i.p.) una vez a la semana durante seis semanas o globulina anti-timocito murina (mATG; 500 pg administrados i.p.) en los días 0 y 4. Una vez incluidos, la glucosa sanguínea se midió por la mañana y por la tarde (con un intervalo de al menos seis horas) y se administró insulina por inyección i.p. sólo a aquellos ratones cuya glucosa sanguínea estuviera por encima de 250 mg/dL. Se muestran los valores diarios matutinos de glucosa sanguínea para ratones individuales (Fig. 5). Se combinan los datos de cuatro estudios de reversión independientes con 8-10 ratones por grupo por estudio. Los datos demuestran la reversión de la diabetes de inicio reciente en ratones NOD después de tratamiento con anticuerpo anti-CXCR3.

Para evaluar los cambios en los subconjuntos de células T en el páncreas de los ratones tratados con anticuerpo anti-CXCR3, las suspensiones de célula única de páncreas de cuatro ratones por grupo de tratamiento (ratones tratados con PBS, anti-CXCR3 de ratón, IgG control o mATG) se combinaron, se tiñeron para células T y se analizaron por citometría de flujo. El tejido del páncreas se recogió unos pocos días después de la qumta dosis de tratamiento de PBS, anti-CXCR3 de ratón o IgG control y de ratones tratados con mATG de edad equivalente. El porcentaje de células T CD4+ y CD8+ en las suspensiones se muestra en la Fig. 6A. La Fig. 6B muestra la expresión de CD44 y CD62L en células T CD4+ en el páncreas de ratones tratados con PBS (izquierda), IgG control (medio) y anticuerpo anti-CXCR3 de ratón (derecha). El porcentaje de células en la ventana 1 (G1 ; CD44hlCD62L'°) se indica para cada grupo de tratamiento (67,3% para PBS, 67, 1 % para IgG control y 30,4% para tratamiento anti-CXCR3). La Fig. 6C es una representación de la expresión de CXCR3 en células T CD4+ en la ventana 1 (G1 ) o ventana 2 (G2) como se ha definido en la Fig. 6B, comparado con células teñidas con anticuerpo de isotipo control y seleccionadas para linfocitos.

Para evaluar si están presentes islotes positivos para insulina en ratones NOD revertidos con tratamiento anti-CXCR3, se prepararon secciones de páncreas incluidas en parafina de ratones NOD hembra tratados con IgG control (paneles izquierdos), anticuerpo anti-CXCR3 de ratón (paneles medios) o ATG murina (paneles derechos) y se tiñeron para insulina (fila superior) o se co-tiñeron para CD3 y Foxp3 (fila inferior). Véase la Fig. 7. El tejido de páncreas se recogió de ratones al final del estudio (alrededor de 100 días después de la inclusión). Las secciones teñidas demostraron que estaban presentes islotes positivos para insulina en ratones NOD revertidos con tratamiento anti-CXCR3 y que las células T rodeaban los islotes pero pocas invadieron los islotes. [008] Para evaluar la respuesta a reto de glucosa, se realizó un ensayo de tolerancia a la glucosa. Figs. 8A-D. Ratones NOD hembra no diabéticos de edad equivalente (Fig. 8A), ratones NOD diabéticos que se habían tratado con PBS (Fig. 8B), ratones NOD diabéticos revertidos con tratamiento anti-CXCR3 de ratón (Fig. 8C) y ratones NOD diabéticos que se habían tratado con IgG (Fig. 8D) se pusieron en ayunas toda la noche y se pulsaron con glucosa por inyección i.p. La glucosa sanguínea se midió antes (tiempo 0) y después del reto en los tiempos indicados. Se muestran datos representativos de 4-5 ratones por grupo de tratamiento. Los datos ilustran que el tratamiento con anticuerpo anti-CXCR3 mejoró la tolerancia a la glucosa en ayunas 100 días después de la inclusión.

Ejemplo 5: Transferencia adoptiva de células T Para evaluar la capacidad de las células T de ratones NOD tratados con anticuerpo-CXCR3 (clon CXCR3-173) y que presentan una remisión de la enfermedad para inducir diabetes en animales receptores, se transfirieron de forma adoptiva células T CD4+ y CD8+ aisladas a ratones receptores NOD.scid (diabéticos no obesos - inmunodeficiencia combinada grave) por inyección intravenosa. Las Figs. 9A-B muestran el porcentaje de ratones no diabéticos con el tiempo después de la transferencia adoptiva de células T CD4+ y CD8+ aisladas de ratones diabéticos tratados con PBS o IgG control o ratones con remisión de la enfermedad después de tratamiento con ATG murino o anticuerpo anti-CXCR3 de ratón. Las células T CD4+ y CD8+ se aislaron del bazo, ganglios linfáticos pancreáticos y ganglios linfáticos ingumales recogidos 80-90 días después de la inclusión de ratones NOD hembra en los diferentes grupos de tratamiento. Las células T CD4+ y CD8+ se combinaron y se transfirieron de forma adoptiva 8 millones de células totales a receptores NOD.Scid y se monitorizó el desarrollo de diabetes por medidas bisemanales de glucosa sanguínea. Cada línea en las Figs. 9A-B representan los datos combinados de cinco ratones por grupo. Se muestran dos estudios representativos (Fig. 9A y 9B). Las células T aisladas de ratones tratados con anticuerpo anti-CXCR3 presentan un retraso en la transferencia de la enfermedad.

Las células T donantes aisladas se caracterizaron adicionalmente. La Fig. 10A muestra el porcentaje de células T CD4+ y CD8+ totales (panel izquierdo) en las células T donantes aisladas de ratones tratados con PBS, anticuerpo anti-CXCR3 de ratón, IgG control o ATG murino como se describe en el párrafo anterior. Los paneles derechos de la Fig. 10A muestran el porcentaje de células T efectoras y de memoria central en el subconjunto de células T que eran CD4+ (panel superior) y CD8+ (panel inferior) para cada suspensión celular donante, como se define por la expresión de CD44 y CD62L. Las células T CD4+ y CD8+ aisladas combinadas se tiñeron para la expresión de CD44 y CD62L antes de la transferencia, se adquirieron en un citómetro de flujo y se analizaron. También se evaluó el porcentaje de células T reguladoras en los combinados de células T aisladas donantes. La Fig. 10B muestra el porcentaje de células T reguladoras para cada grupo de tratamiento, como se define por la expresión de CD4 y CD25 o por la expresión de CD4. CD25 y Foxp3 intracelular. La Fig. 10C muestra el porcentaje de células T CD8+ (panel izquierdo) y CD4+ (panel derecho) en las células donantes que también expresan CXCR3. Los datos demuestran que había un porcentaje reducido de células T CXCR3+ en las células donantes de ratones que habían revertido con el tratamiento de anticuerpo anti-CXCR3.

La eficacia del tratamiento de CXCR3 después de la transferencia adoptiva de células T donantes OT-1 CD8+ se evaluó usando el modelo RIP-OVA de diabetes de tipo 1. Los ratones RIP-OVA son ratones transgénicos en los que se ha introducido un transgén que codifica la proteína ovoalbúmina (OVA) dirigido por el promotor de insulina de rata (RIP) en el genoma del ratón y resulta en la expresión de una forma de membrana de ovoalbúmina en las células b de los islotes. La cepa basal de ratones es C57BL/6 y los ratones RIP-OVA no desarrollan espontáneamente diabetes. Los ratones RIP-OVA, también denominados C57BL/6-Tg(lns2-TRFC/OVA)296Wehi/WehiJ, se adquirieron en Jackson Laboratory. En estos ratones la diabetes se desarrolla después de la transferencia adoptiva de células T CD8+ específicas de ovoalbúmina de ratones transgénicos OT-1 TCR (receptor de células T) (Kurts et al. J Exp Med 184: 923-930) adquiridos en Jackson Laboratory. Los ratones OT-1 contienen insertos transgénicos para los genes de ratón TCRa-V2 y TCRb-V5 (Hogquist et al. Cell 76: 17-27). El TCR transgénico reconoce residuos de ovoalbúmina en el contexto de proteínas MHCI H2Kb. Más del 95% de células T CD8+ en los ratones OT-1 expresan el TCR transgénico y reconocen y son activadas por el péptido ovoalbúmina.

Las Figs. 1 1A-B muestran el porcentaje de ratones no diabéticos con el tiempo después de la transferencia adoptiva de células T OT-1 CD8+ en ratones receptores RIP-OVA que se dejaron sin tratar, se trataron con anticuerpo anti-CXCR3 de ratón o se trataron con IgG control. El tratamiento (100 pg i.p.) empezó 1 día (estudio 1 y estudio 2) ó 7 días (estudio 2) después de la transferencia adoptiva y se proporcionó dos veces a la semana durante 3 semanas. Cada línea representa los datos combinados de cinco ratones por grupo. Los resultados de dos estudios se muestran en la Fig. 11A y 11 B. Los datos demuestran que el tratamiento con anticuerpo anti-CXCR3 protegió a los ratones de desarrollar diabetes en el modelo RIP-OVA.

Las Figs. 12A-D proporcionan datos adicionales que caracterizan la eficacia de diferentes tratamientos después de la transferencia adoptiva de células T OT-1 en ratones receptores RIP-OVA. La Fig. 12A muestra la expresión de CXCR3 en células T donantes analizadas por citometría de flujo antes de la transferencia adoptiva en receptores RIP-OVA. La tinción con anticuerpo de isotipo control se representa por la curva sombreada. La Fig. 12B muestra el porcentaje de células donantes en la sangre, bazo y ganglios linfáticos pancreáticos (pLN) a los tiempos indicados después de la transferencia adoptiva de células T OT-1 en ratones receptores RIP-OVA tratados con anticuerpo anti-CXCR3 de ratón o IgG control. El tratamiento con anticuerpo (100 m9 i.p.) empezó un día después de la transferencia de células T y se proporcionó dos veces a la semana durante dos semanas. Cada punto representa datos de un ratón individual. La Fig. 12C indica el número de células donantes en la sangre, bazo y ganglios linfáticos pancreáticos (pLN) que proliferaban en respuesta a la estimulación con auto-antígeno (OVA) en ratones receptores RIP-OVA tratados con anticuerpo anti-CXCR3 de ratón o IgG control a los tiempos indicados después de la transferencia adoptiva. El tratamiento con anticuerpo (100 pg i.p.) empezó un día después de la transferencia de células T OT-1 y se proporcionó dos veces a la semana durante dos semanas. Cada punto representa datos de un ratón individual. La Fig. 12D muestra el porcentaje de células donantes que expresan CXCR3 en la sangre, bazo y ganglios linfáticos pancreáticos (pLN) a los tiempos indicados después de la transferencia adoptiva de células T OT-1 en ratones receptores RIP-OVA tratados con anticuerpo anti-CXCR3 de ratón o IgG control. El tratamiento con anticuerpo (100 pg i.p.) empezó un día después de la transferencia de células T OT-1 y se proporcionó dos veces a la semana durante dos semanas. Cada punto representa datos de un ratón individual. El tratamiento con anticuerpo anti-CXCR3 dio lugar a un porcentaje reducido de células T CXCR3+ en los ratones RIP-OVA.

Las Figs. 13A-D muestran secciones de páncreas incluidas en parafina representativas de ratones receptores RIP-OVA que se dejaron sin tratar y teñidas para insulina (Fig. 13A) o CD3 (Fig. 13B) o tratados con anticuerpo anti-CXCR3 de ratón y teñidas para insulina (Fig. 13C) o CD3 (Fig. 13D). El tratamiento con anti-CXCR3 (100 pg i.p.) empezó un día después de la transferencia de células T OT-1 y se proporcionó dos veces a la semana durante 3 semanas. El tejido del páncreas se recogió al final del estudio (alrededor de 60 días después de la transferencia de células T). Las secciones mostraron una ausencia de infiltración de células T en ratones RIP-OVA tratados con anticuerpo anti-CXCR3 de ratón.

Ejemplo 6: Evaluación de los clones de anticuerpo anti-CXCR3 humano Los clones de anticuerpo anti-CXCR3 humano Cl 4, 12, 53, 82 y 135 se evaluaron para su efecto en la quimiotaxis y movilización de calcio por CXCR3, usando los metodos descritos anteriormente en la sección de materiales y métodos (Ejemplo 1 ). Para el ensayo de quimiotaxis, las células 300.19 transfectadas con CXCR3 humano se pre-incubaron en medio solo o con varias concentraciones de anticuerpo, como se indica en las Figuras 14 A-C, antes de ser añadidas al ensayo de quimiotaxis. Las Figuras 14A-C muestran que la quimiotaxis mediada por CXCR3 para CXCL 11 se inhibe por los clones Cl 4, 12, 53, 82 y 135. El clon 2 en las Figuras 14A-D es idéntico al clon 4.

Para el ensayo de flujo de calcio, las células HEK transfectadas con CXCR3 humano se pre-incubaron en varias concentraciones de anticuerpo antes de ser añadidas al FLIPR según los métodos descritos anteriormente en la sección de materiales y métodos (Ejemplo 1 ). La concentración de anticuerpo necesaria para inhibir la movilización de calcio un 50% para cada anticuerpo se muestra en la Fig. 14D. La Figura 14D muestra que la movilización de calcio mediada por CXCR3 para CXCL1 1 se inhibe por los clones Cl 4, 12, 53 y 135.

Para evaluar adicionalmente el efecto de los clones 4, 12, 53, 82 y 135 en la quimiotaxis, las células 300.19 transfectadas con hCXCR3 se pre-incubaron en medio solo o con 50 pg/ml de anticuerpo antes de ser añadidas al ensayo de quimiotaxis y se evaluaron para migración para CXCL9 (Fig. 15A), CXCL10 (Fig. 15B) y CXCL1 1 (Fig. 15C). Los datos demuestran que los clones 4, 12, 53, 82 y 135 inhiben la migración para CXCL10 y CXCL1 1 e inhiben parcialmente la migración para CXCL9.

Para evaluar la especificidad de los clones 4, 12, 53, 82 y 135, los anticuerpos se ensayaron para unión a otros receptores de quimiocina. Las celulas 300.19 se transfectaron con CXCR1 , CXCR5, CXCR2, CXCR4 o CCR5 humanos y la unión de anticuerpo se analizó por incubación con los clones de anticuerpo anti-CXCR3 humano, seguido de tinción con anticuerpo secundario y citometría de flujo. La administración del anticuerpo secundario solo sirvió como el control negativo. Las células 300.19 transfectadas con CXCR3 humano sirvieron como un control positivo para la tinción por los clones. La Fig. 16 muestra representaciones de histograma de la unión de anticuerpo a las células que expresan los diferentes receptores de quimiocina, demostrando que los clones 4, 12, 53, 82 y 135 no se unen a otros receptores de quimiocina y que son específicos para CXCR3.

Se emplearon procedimientos estándar de citometría de flujo en el ensayo de unión del receptor de quimiocina. Brevemente, las líneas celulares se recogieron por tratamiento con Versene y cada línea celular se dividió en siete muestras. Cada muestra se incubó en hielo con un anticuerpo primario (5 mg/ml) seguido de tinción con un anticuerpo secundario conjugado con FITC para detectar el anticuerpo primario unido. Como un control negativo, las células se tiñeron con anticuerpo secundario solo (sin incubación con anticuerpo primario). El anticuerpo primario fue un clon de anticuerpo anti-CXCR3 humano o el clon 1 C6 de anticuerpo control anti-CXCR3 humano. Después de la tinción, las células se adquirieron en un citómetro de flujo y los datos se analizaron usando software FlowJo. Cada línea en la Fig. 16 representa una muestra individual de células teñidas con un anticuerpo primario y el anticuerpo secundario, o con el anticuerpo secundario solo.

La afinidad (Ka) y velocidad de disociación (Kd) para los clones 4, 12, 53, 82 y 135 se analizaron usando un ensayo Biacore según los métodos descritos anteriormente (Ejemplo 1 ). Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 4.

Tabla 4 Ejemplo 7: Mapeo de epítopos Los péptidos de CXCR3 humano truncados, biotinilados (fragmentos de 16 aminoácidos N terminales) del dominio extracelular N terminal de CXCR3 se usaron para determinar los epítopos para los clones 4, 12, 53, 82 y 135. Se generó una serie de fragmentos sustituidos con alanina (véase la tabla 5 a continuación, sustitución de alanina en negrita) y se biotinilaron. El mapeo de epítopos se evaluó por análisis Octet® (ForteBio, Menlo Park, CA) y Biacore™ (GE Healthcare).

Para el análisis Octet, los péptidos se resuspendieron en 80% DMSO y se diluyeron hasta 10 pg/ml en PBS. Los clones de anticuerpo 4, 12, 53, 82, 135 y el clon comercial 1 C6 (BD Biosciences) se diluyeron hasta 120 nM en PBS. El ensayo de cinetica se realizó en formato de placa de 96 pocilios con 300 mI/pocillo en un sistema Octet QK (ForteBio). Cada placa de ensayo incluyó péptido WT hCXCR3 ECD de longitud completa biotinilado en el N terminal (Abgent) como un control positivo, así como blanco de amortiguador PBS para la resta de referencia. Se pre-humedecieron biosensores de Estreptavidina Octet (ForteBio) en PBS durante al menos cinco minutos antes de realizar el ensayo. Los biosensores se sumergieron en primer lugar en PBS durante cinco minutos sin agitación para una línea base. Para todas las demás etapas, la velocidad de agitación fue 1.000 rpm. Los biosensores se metieron en las disoluciones de péptidos durante cinco minutos para cargar los péptidos. Se realizó otra etapa de línea base en PBS durante cinco minutos. Los biosensores se metieron en las disoluciones de anticuerpo durante diez minutos para medir la asociación. Finalmente, los biosensores se transfirieron a PBS durante qumce minutos para disociación. Los sensogramas se analizaron usando Octet Data Analysis v7.0. La actividad de unión se expresó como un porcentaje de cada nivel de respuesta máxima de anticuerpo comparado con el péptido WT hCXCR3 de longitud completa.

Los niveles de respuesta relativa se registraron en un mapa de calor de epítopos. Las respuestas máximas de los sensogramas para el péptido ECD hCXCR3 de tipo salvaje variaron entre 4-8 nm. Cada clon cribado tenía un único epítopo. Ninguno de los mutantes ensayados suprimió completamente la unión del clon 1 C6. El residuo de valina en la posición 10 y aspartato en la posición 13 jugaron un papel en la unión de todos los anticuerpos cribados. Los anticuerpos 12 y 1 C6 tuvieron los epítopos más N terminales con las mutaciones de valina en la posición 5 influyendo en la actividad de ambos. El anticuerpo 82 tuvo el epítopo más C terminal y una reducción en la actividad de unión empezó con la glutamina de la posición 9. Tomando como base estos datos, los límites de aminoácidos de los epítopos en la secuencia de CXCR3 fueron como sigue para cada anticuerpo: Cl 4: aminoácidos 7-13; Cl 12: aminoácidos 5-13; Cl 53: aminoácidos 7-13; Cl 82: aminoácidos 9-15; Cl 135: aminoácidos 7-13; y clon 1 C6: aminoácidos 5-13.

Para el análisis Biacore, los péptidos se diluyeron hasta 10 ng/ml en amortiguador de ensayo HBS-EP+ (10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0,005% Polisorbato 20). Usando un Biacore T100™, los péptidos se inyectaron sobre chips CM5-SA (GE #BR-1005-31) a una velocidad de 5 mI/min hasta que se obtuvo una captura estable de 20 unidades de respuesta (RU) por célula de flujo. La célula de flujo 1 permaneció como blanco para la resta de referencia en cada chip. El péptido hCXCR3 de 37 AA de tipo salvaje se incluyó en una célula de flujo de cada chip como un control positivo. Los anticuerpos anti-hCXCR3 de ratón 4, 12, 53, 82 y 135 se diluyeron hasta 50, 25, 12,5, 6,25 y 3, 125 nM en HBS-EP+. Cada ciclo, los anticuerpos se inyectaron durante tres minutos a un caudal de 50 m/min para medir la asociación, seguido de tres minutos de amortiguador a 50 mI/min para medir la disociación. La superficie del péptido se regeneró entre ciclos usando 10 mM glicina-HCI pH 2,0 a 50 mI/min durante sesenta segundos. Los sensogramas se ajustaron a un modelo de unión 1 : 1 y se analizaron usando una resta de doble referencia en BiaEvaluation v2.0.1 y se capturaron en biosensores de estreptavidina. Los niveles típicos de respuesta variaron entre 0-500 RU y se determinaron los puntos de corte para respuestas de unión "Fuerte", "Moderada" y "Débil". Los niveles de respuesta relativa se registraron para generar un mapa de epítopos. Las velocidades de disociación se clasificaron y también se registraron los péptidos que resultaron en valores de Kd rápidos (mayores de 0,001 s 1).

Tabla 5 ; i : j : i i Todos los anticuerpos se unieron a hCXCR3 de tipo salvaje y en los primeros 16AA de la secuencia de hCXCR3. Los datos de unión se muestran en la Tabla 6 para los clones 4, 12, 53, 82 y 135 y el mapa correspondiente que muestra los límites del epítopo mínimo requerido para la actividad de unión para cada clon de anticuerpo se muestra en la Fig. 18, con los residuos importantes marcados con una X. Todos los epítopos de anticuerpo se mapearon en los residuos 6-15 de la secuencia de CXCR3 humano, la región implicada en la unión de CXCL10 y CXCL11. Los aminoácidos en el epítopo se determinaron detectando una reducción en la respuesta de unión despues de una sustitución de alanina en una posición dada en el fragmento del péptido de CXCR3. Los clones 53 y 135 tenían los epítopos más similares. Los clones 4 y 12 tenían el epítopo más N terminal (la fuerza de unión se afectó empezando con la valina en la posición cinco). El clon 82 tenía el epítopo más C terminal, con una reducción en la actividad de unión empezando con la glutamina en la posición 9. El aspartato en la posición 7 en CXCR3 se requiere para todos los clones excepto 82. La valina en la posición diez y el aspartato en la posición trece en CXCR3 juegan ambos un papel en la unión de todos los clones. No hubo diferencia en los epítopos entre las versiones de ratón, quimérica y humanizada de los cinco clones.

Tabla 6 Clave +++ Respuesta de unión fuerte (>300 RU) ++ Respuesta de unión moderada (150-300 RU) + Respuesta de unión débil (10-150 RU) - Sin unión (<10 RU) * Velocidad de disociación rápida (Kd > 0,001 ) a pesar de respuesta de unión más fuerte (>10RU).

Ejemplo 8: Humanización de clones de anti-CXCR3 humano Se generaron cuatro variantes (quimérica, humanizada 1 (Hu1 ), Hu2 y Hu3) para cada uno de los cinco clones anti-CXCR3 (clones 4, 12, 53, 82 y 135). Las 20. Todas las variantes quiméricas se produjeron por "expresión combinada ("pool")" para estudios en modelo animal in vivo. Las células CHO-DXB11 (Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci., 77: 4216-20, (1980)) que se adaptaron a cultivo en suspensión se electroporaron con vectores de expresión que contienen las cadenas pesada y ligera de los clones de anticuerpo de CXCR3 4, 12, 53, 82 y 135 quiméricos. Estos vectores de expresión también contienen el gene de la dihidrofolato reductasa para seleccionar transfectantes CHO estables. Después de selección en 100 nM metotrexato, los combinados de CHO transfectados de manera estable se usaron para completar ciclos de bioproducción en matraces agitados con medio OptiCHO. El anticuerpo quimérico recombinante se purificó del medio condicionado usando cromatografía de proteína A estándar. Los clones Hu1 se injertaron con CDR en regiones marco humanas y se humanizaron completamente, excluyendo los aminoácidos de las CDR de ratón y cualquier residuo en posición Vernier. Los clones Hu2 fueron clones "CDR expandidos", con cambios de retromutación de las secuencias Hu1 en residuos localizados en cuatro aminoácidos de las CDR de ratón. Los clones Hu3 incluyeron más retromutaciones de las secuencias Hu2 en las posiciones identificadas como "muy distintas" entre ratón y humano usando modelado basado en IMGT. Las veinte variantes totales se expresaron de forma transitoria en celulas CHO-NRC y se purificaron para ensayos in vitro.

Se realizó una humanización adicional para los clones 4 y 53. Las cadenas pesadas 4.7-4.11 incluyeron más retromutaciones humanizadas fuera de las CDR, así como modificaciones para eliminar un sitio de desamidación en las posiciones 58 y 59 (numeración IMGT) en CDR2 de VH en un intento de mejorar la estabilidad del clon. En particular, el sitio de desamidación en VH 4.2 se reemplazó con varios residuos alternativos. Los clones VH 53.4-53.6 y VL 53.4-53.9 incluyeron más retromutaciones humanizadas fuera de las CDR, particularmente en un intento de hacer las cadenas más similares a VH 4.1 y VL 4.1.

Ejemplo 9: Cinética de unión del receptor completo La cinética de unión de las veinte variantes anti-CXCR3 se evaluó usando Octet® y Biacore™ con péptidos CXCR3 intactos. El análisis Octet se realizó como se ha descrito anteriormente. Para el análisis Biacore, péptidos CXCR3 de tipo salvaje humanos purificados por tres etapas de columna se etiquetaron con His C terminal y HPC4 y se capturaron en chips de NTA mediante quelación de níquel y acoplamiento amina. Se usaron chips con RU medio (aproximadamente 1.200 RU) para una mejor calidad de los datos y para minimizar el efecto de unión bivalente. Se inyectaron 0-80 nM de las muestras de anticuerpo sobre el receptor. Se realizó un análisis de evaluación estándar de Biacore™ usando representaciones de sensograma con ajuste Rmax local para un mejor ajuste de la curva. Se evaluaron las curvas de unión para las cuatro variantes (quimerica (Ch) y humanizada (Hu) 1-3) para los cinco clones (4, 12, 53, 82 y 135). Para propósitos de comparación, también se evaluó la cinética de unión de los ligandos de CXCR3 humano CXCL9, CXCL10 y CXCL1 1 y CXCL1 1 de ratón (mCXCL11). Los resultados se muestran a continuación en las Tablas 7A (clasificada por KD) y 7B (clasificada por Kd). Las cuatro variantes superiores por KD y Kd se resaltan en las tablas. Cuando las variantes de mAb anti-hCXCR3 humanizadas se clasificaron por velocidades de disociación (Kd), la mayor parte de las variantes mostró velocidades de disociación al menos 1 dígito más lentas que el ligando de CXCR3 humano más potente, hCXCL1 1.

Tabla 7A 5 Tabla 7B Como se indica en la Tabla 7A, las cuatro variantes superiores por KD son el clon 4 quimérico (velocidad de asociación rápida, velocidad de disociación lenta), clon 4 Hu 3 (velocidad de asociación rápida, velocidad de disociación lenta), clon 82 Hu 3 (velocidad de asociación rápida, velocidad de disociación media) y clon 53 quimérico (velocidad de asociación media, velocidad de disociación lenta).

La unión de anticuerpo se evaluó adicionalmente en células que expresan CXCR3. Las células 300.19 transfectadas con CXCR3 humano se pusieron en contacto con las variantes de anticuerpo anti-hCXCR3 humanizadas purificadas Hu1 , Hu2, Hu3 y el anticuerpo quimérico. Como se muestra en la Fig. 19 para cada uno de los clones 4, 12, 53, 82 y 135, a 5 pg/ml (línea negra), 0,5 mg/ml (línea gris oscura), ó 0, 1 mg/ml (línea negra punteada) ó 5 mg/ml anticuerpo secundario solo (histograma gris relleno). Las células se tiñeron con los clones de anticuerpo no marcados durante 30 min en hielo seguido de dos lavados con PBS-1 %FBS y el anticuerpo unido se detectó usando un anticuerpo secundario específico anti-lgG 1 humana conjugado con FITC incubando en hielo durante 30 min en oscuridad. Las muestras se lavaron dos veces, se fijaron en una disolución de 2% paraformaldehído PBS, se almacenaron en la oscuridad a 4°C y se adquirieron en un citómetro de flujo. Los histogramas de positividad de CXCR3 seleccionado en células viables se muestran en la Fig. 19.

Ejemplo 10: Comparación con el anticuerpo 1 C6 El clon 1 C6 de mAb anti-hCXCR3 (Becton, Dickinson catálogo #557183, el mismo clon indicado en la Patente U.S. No. 6.184.358) se comparó con el clon 4 de mAb anti-hCXCR3 de ratón y sus variantes humanizadas Hu2 y Hu3 usando el método de ensayo de receptor completo Biacore. El clon 4 presentó una afinidad aproximadamente 2 veces mejor (KD). Las variantes humanizadas presentaron una afinidad más mejorada (afinidad aproximadamente 4 veces mejor para las dos variantes Hu2 y Hu3). La Tabla 8 lista las cinéticas de unión y afinidad para el clon 1 C6 y para el clon 4 y sus variantes humanizadas Hu2 y Hu3.

Tabla 8 Ejemplo 11 : Ensayos funcionales Se evaluaron los efectos funcionales de los veinte anticuerpos variantes. Los anticuerpos se evaluaron para su efecto en la quimiotaxis celular en respuesta a CXCL9, CXCL10 y CXCL1 1 y la inhibición de la movilización de calcio por el ensayo de calcio FLIPR®.

La quimiotaxis de las celulas 300.19 transfectadas con CXCR3 humano para los ligandos de CXCR3 CXCL9, CXCL10 y CXCL11 se evaluó en presencia o ausencia de 10 pg/ml de las variantes de anticuerpo anti-CXCR3 humano humanizadas de los clones 4, 12, 53, 82 y 135. Las células transfectadas se pre-trataron durante 20 min a 37°C con 10 pg/ml de las variantes de anticuerpo anti-CXCR3 humano humanizadas o el anticuerpo comercial 1 C6. Las células con anticuerpo se transfirieron a transpocillos de 5 micrómetros y los insertos se pusieron en el pocilio receptor que contiene 100 ó 300 ng/ml de CXCL10 y CXCL1 1 o CXCL9 de ratón recombinante, respectivamente. Las placas de quimiotaxis se incubaron a 37°C, 5% CO2, durante 4 h. Los insertos transpocillo se retiraron y las células que migraban a los pocilios receptores se transfirieron a placas de 96 pocilios de fondo en U, se sedimentaron y se resuspendieron en agente de tinción calceína AM. Las células se incubaron durante 30 min a 37°C, 5% C02, se lavaron una vez, se transfirieron a una placa negra/clara y se lcyeron inmediatamente en la FlexStation a 490/520 nm. Los datos se presentan como porcentaje de inhibición de quimiotaxis. La Fig. 20 proporciona datos representativos que muestran la capacidad de las diferentes variantes para cada uno de los cinco clones para inhibir la quimiotaxis para CXCL9, CXCL10 y CXCI11.

Para evaluar la inhibición de la movilización de calcio intracelular, se midió el flujo de calcio en células CHO transfectadas con CXCR3 humano-Gpi4q¡4 en respuesta a CXCL10 en presencia o ausencia de varias concentraciones de las variantes de anticuerpo anti-CXCR3 o el anticuerpo control positivo 1 C6. Las células se sembraron (12.000/pocillo) en placas negras de 384 y se dejó que se adhirieran toda la noche. Al día siguiente, las células se cargaron con agente de tinción sensible a calcio, agente de tinción Fluo-4NW, durante 40 min antes de la adición de anticuerpo y se incubó a 37°C. Se añadió el anticuerpo y se dejó incubando durante 20 min antes de la adición del ligando de CXCR3, CXCL10 humano recombinante, a la concentración CE so p re ~d et e rm i n a d a de CXCL10. La adición de agente de tinción se realizó manualmente usando una pipeta multicanal electrónica pero la adición de anticuerpo y agonista se automatizó en el FLIPR Tetra® y la placa se lcyó inmediatamente a 470-495 nm después de la adición de CXCL10. Las muestras se ensayaron en duplicado y se representó el porcentaje medio de inhibición (± Desviación Estándar) a cada concentración de anticuerpo. El clon 4 Hu1 no inhibió la movilización de calcio y se usó como un control negativo en estos experimentos. La Fig. 21 muestra la capacidad de las diferentes variantes para cada uno de los cinco clones para inhibir la movilización de calcio y los compara con el clon comercial 1 C6. Los valores de CI50 representativos (M) de anticuerpos frente a CXCL10 en el ensayo de movilización de calcio se muestran en la Tabla 9 siguiente.

Tabla 9 . .

. .. . .. . I . j (*) en la Tabla 9 indica que el anticuerpo 1C6 no es un anticuerpo quimérico sino un anticuerpo I g G 1 completamente de ratón frente a CXCR3 humano.

Como se muestra en la Tabla 10, los datos de cinética de unión (véase el Ejemplo 9), se correlacionan bien con los resultados del ensayo funcional. Tomando como base los datos de cinética de unión y los resultados del ensayo funcional, los clones 4 y 53 se seleccionaron para evaluación adicional y humanización 4D.

Tabla 10 l i i l i i i . . . . . . . . . . . - . - - i . . . .

. . ' , - . . . . . - . . . Ejemplo 12: Humanización 4D La humanización 4D de los clones de anticuerpo anti-hCXCR3 se hace como se describe en WO 2009/032661 (por ejemplo, en los párrafos

[0037]-

[0044]). Brevemente, la humanización 4D comprende: a) construir un modelo 3D del dominio variable que se va a humanizar; b) identificar los residuos flexibles en el dominio variable usando una simulación de dinámica molecular del modelo 3D del dominio; c) identificar la línea germinal humana más cercana comparando la trayectoria de dinámica molecular del modelo 3D con las trayectorias de dinámica molecular de 49 líneas germinales humanas (en lugar de una comparación de secuencias de anticuerpo, como se hace en la humanización tradicional); y d) mutar los residuos flexibles, que no forman parte de la CDR, en su equivalente de línea germinal humana (identificado en la etapa c). Las cadenas pesadas 4.4-4.6 y las cadenas ligeras 4.4-4.7 se diseñaron usando este método. En particular, se diseñó una construcción humanizada 4D inicial (VH 4.4 y VL 4.4) y se diseñaron modificaciones adicionales para la cadena pesada y ligera (VH 4.5-4.6 y VL 4.5-4.7) para introducir mutaciones estabilizadoras y anti-agregación y para eliminar otros restos no deseados. También se usaron métodos similares para diseñar las construcciones humanizadas 4D VH 53.7-53.10 y VL 53.10-53.13.

La Tabla 1 1 indica la estrategia de humanización (y las modificaciones adicionales, cuando es aplicable) usadas para preparar las variantes de cadena pesada y ligera para los clones 4, 12, 53, 82 y 135, incluyendo las cadenas humanizadas y humanizadas 4D (VH= cadena pesada; VK= cadena ligera).

Se evaluaron varias variantes 4D del clon 4 (4Hu6, 4Hu7, 4Hu8, 4Hu9, 4Hu10) por ensayo de receptor completo Biacore para evaluar las cinéticas de unión y afinidad de CXCR3 y se comparó con el anticuerpo quimérico clon 4. Como se muestra en la Tabla 2, el clon 4Hu6 contenía la cadena pesada 4.4 y la cadena ligera 4.4. El clon 4Hu7 contenía la cadena pesada 4.4 y la cadena ligera 4.7. El clon 4Hu8 contenía la cadena pesada 4.5 y la cadena ligera 4.5. El clon 4Hu9 contenía la cadena pesada 4.5 y la cadena ligera 4.6. Y el clon 4Hu10 contenía la cadena pesada 4.6 y la cadena ligera 4.4.

Como se muestra en la Tabla 12, cuando las variantes de modelado 4D del clon 4 se compararon con la variante quimérica (4Ch), cuatro de cinco variantes mostraron una afinidad mejorada (KD). La variante 4D 4Hu10, sin embargo, mostró una afinidad disminuida cerca de 1 orden de magnitud.

Tabla 1 1 Tabla 12 .

Ejemplo 13: Modelo de ratón NSG-PBL Se inyectó a ratones OD-scid /Z_2ry nul! (NSG) celulas mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas primarias frescas 2E7 aisladas por ficoll en el día 0. Los animales se trataron (n= 8/grupo) con 5 mg/kg de anticuerpos quiméricos anti-CXCR3 humano o I g G 1 humana control (Herceptina) dos veces a la semana durante el estudio completo empezando en el día 3 después de la transferencia celular. La sangre tomada en el día 14 después del inicio se procesó para citometría de flujo y se tiñó usando procedimientos estándar con anticuerpos frente a CD45 humano (hCD45), CD3 humano (hCD3), CD4 humano (hCD4), CD8 humano (hCD8) y CXCR3 humano. Las células en la selección de linfocitos se seleccionaron en células hCD45+ seguido de selección en células hCD3+. La expresión de hCD4 y hCD8 en las células T hCD45+hCD3+ se evaluaron y se determinó el porcentaje de células T humanas CD4+CD45+CD3+ y células T humanas CD8+CD45+CD3+. Se determinó el porcentaje de células T CD4+ y células T CD8+ humanas que expresan CXCR3. Cada punto en las Flgs. 22A-D representan un único ratón, mostrando los datos representativos de tres experimentos. Los datos muestran que el tratamiento con anticuerpo anti-CXCR3 en el modelo de ratón NSG-PBL de GvHD xenogénico (enfermedad de injerto frente a huésped) resultó en la modulación de células T que expresan CXCR3, pero revela diferencias funcionales entre los cinco clones.

La Tabla 12 muestra la supervivencia media de los ratones NSG-PBL con GvHD xenogénico después de tratamiento con los anticuerpos candidatos anti-CXCR3 humano quiméricos.

Tabla 13 *, p= 0.043; **p= 0.016; ***p= 0.010 tratamiento con anticuerpo anti-CXCR3 frente a tratamiento con hulgGI usando ensayo de rango logarítmico.

Se pretende que los ejemplos anteriores ilustren y no limiten de ninguna manera la presente descripción. Otras modalidades de los dispositivos y métodos descritos serán evidentes para los expertos en la téenica a partir de la consideración de la especificación y la práctica de los dispositivos y métodos descritos en la presente descripción.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno capaz de unirse a CXCR3, en el que el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), y en el que: a) la región variable de cadena pesada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8; y/o la región variable de cadena ligera comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, y 9, b) la región variable de cadena pesada comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 16; y/o la región variable de cadena ligera comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 11 , 13, 15 y 17, c) la región variable de cadena pesada comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24 y 26-33; y/o la región variable de cadena ligera comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 19, 21 , 23, 25 y 34-37, d) la región variable de cadena pesada comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% identicas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46-48 y 63-66; y/o la región variable de cadena ligera comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 39, 41 , 43, 45, 49-54 y 67-70, o e) la región variable de cadena pesada comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 55, 57, 59 y 61 ; y/o la región variable de cadena ligera comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 56, 58, 60 y 62.

2. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 , en el que el anticuerpo o fragmento es quimérico, injertado con CDR, mutado, mutado para eliminar uno o más sitios de desamidación, humano, humanizado, humanizado y retromutado, sintético o recombinante.

3. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo o fragmento es un Fab, Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv de cadena única (scFv), un fragmento divalente (Fd) , un anticuerpo lineal, un fragmento monovalente (VHH), un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico.

4. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el anticuerpo o fragmento es capaz de unirse a un péptido seleccionado de a) un péptido que comprende los residuos 1-58 de SEQ ID NO: 1 ; b) un péptido que comprende los residuos 1-16 de SEQ ID NO: 1 ; y/o c) un péptido que comprende los residuos 1-37 de SEQ ID NO: 1.

5. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el anticuerpo o fragmento es capaz de unirse a un péptido seleccionado de a) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos SDHQVLNDAE; b) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos SDHQVLND; c) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos DHQVLND; d) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos VLNDAE; e) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos VLND; f) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos XDXXVXNDXX; g) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos XDXXVXND; h) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos DXXVXND; i) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos VXNDXX; y/o j) un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos VXND, en las que X indica cualquier aminoácido.

6. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que: a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% identica a una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8; b) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 16; c) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24 y 26-33; d) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46-48 y 63-66; o e) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 55, 57, 59 y 61.

7. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que: a) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, y 9, b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% identica a una cualquiera de SEQ ID NO: 11 , 13, 15 y 17, c) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 19, 21 , 23, 25 y 34-37, d) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 39, 41 , 43, 45, 49-54 y 67-70, o e) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 56, 58, 60 y 62.

8. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que: a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8; y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, y 9, b) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 16; y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 11 , 13, 15 y 17, c) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24 y 26-33; y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 19, 21 , 23, 25 y 34-37, d) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46-48 y 63-66; y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 39, 41 , 43, 45, 49-54 y 67-70, o e) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 55, 57, 59 y 61 ; y la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 56, 58, 60 y 62.

9. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que: a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8; b) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia identica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 16; c) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24 y 26-33; d) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46-48 y 63-66; o e) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 55, 57, 59 y 61.

10. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que: a) la reglón variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, y 9, b) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 11 , 13, 15 y 17, c) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 19, 21 , 23, 25 y 34-37, d) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 39, 41 , 43, 45, 49-54 y 67-70, o e) la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 56, 58, 60 y 62.

11. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que: a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, y 9, b) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia identica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 16; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 11 , 13, 15 y 17, c) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24 y 26-33; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 19, 21 , 23, 25 y 34-37, d) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46-48 y 63-66; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 39, 41 , 43, 45, 49-54 y 67-70, o e) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 55, 57, 59 y 61 ; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia identica o que comprende 1 , 2 ó 3 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a las tres CDR en una cualquiera de SEQ ID NO: 56, 58, 60 y 62.

12. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno capaz de unirse a CXCR3, en el que el anticuerpo o fragmento comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), y en el que: a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, y 9, b) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 16; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 11 , 13, 15 y 17, c) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24 y 26-33; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 19, 21 , 23, 25 y 34-37, d) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46-48 y 63-66; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 39, 41 , 43, 45, 49-54 y 67-70, o e) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 55, 57, 59 y 61 ; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia al menos aproximadamente 85%, 90%, 95% ó 99% idéntica a una cualquiera de SEQ ID NO: 56, 58, 60 y 62.

13. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 12, en el que: a) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1-10 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1-10 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, y 9, b) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1-10 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 16; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1-10 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 11 , 13, 15 y 17, c) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1-10 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24 y 26-33; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia Idéntica o que comprende 1-10 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 19, 21 , 23, 25 y 34-37, d) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1-10 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46-48 y 63-66; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1-10 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 39, 41 , 43, 45, 49-54 y 67-70, o e) la región variable de cadena pesada comprende una secuencia idéntica o que comprende 1-10 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 55, 57, 59 y 61 ; y/o la región variable de cadena ligera comprende una secuencia idéntica o que comprende 1-10 mutaciones en residuos de aminoácidos respecto a una cualquiera de SEQ ID NO: 56, 58, 60 y 62.

14. El anticuerpo o fragmento de la reivindicación 12 ó 13, en el que: a) la región variable de cadena pesada comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8; y/o la región variable de cadena ligera comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 3, 5, 7, y 9, b) la región variable de cadena pesada comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 10, 12, 14 y 16; y/o la región variable de cadena ligera comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 11 , 13, 15 y 17, c) la región variable de cadena pesada comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 18, 20, 22, 24 y 26-33; y/o la región variable de cadena ligera comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 19, 21 , 23, 25 y 34-37, d) la región variable de cadena pesada comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46-48 y 63-66; y/o la región variable de cadena ligera comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 39, 41 , 43, 45, 49-54 y 67-70, O e) la región variable de cadena pesada comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 55, 57, 59 y 61 ; y/o la región variable de cadena ligera comprende tres CDR que son al menos aproximadamente 95% idénticas a las tres CDR de una cualquiera de SEQ ID NO: 56, 58, 60 y 62.

15. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en el que el anticuerpo o fragmento comprende cualquiera de las combinaciones de regiones variables de cadena pesada y cadena ligera en la Tabla 2.

16. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en el que el anticuerpo es capaz de unirse a CXCR3 con una constante de afinidad de al menos aproximadamente 108 M 1.

17. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en el que el anticuerpo o fragmento es capaz de unirse tanto a la isoforma A como B de CXCR3.

18. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en el que el anticuerpo o fragmento es capaz de unirse preferentemente a la isoforma A de CXCR3.

19. El anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en el que el anticuerpo o fragmento es capaz de neutralizar la actividad de CXCR3.

20. Un ácido nucleico aislado que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19.

21. Un vector que comprende el ácido nucleico aislado de la reivindicación 20.

22. Una célula huésped aislada que comprende el vector de la reivindicación 21.

23. Un metodo para producir el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 19 en medio de cultivo en condiciones adecuadas para producir el anticuerpo o fragmento.

24. Un kit que comprende el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 o el ácido nucleico de la reivindicación 20 e instrucciones para usar el anticuerpo o fragmento para propósitos de investigación, diagnóstico o terapéuticos.

25. Un método para prevenir, tratar o reducir la progresión de diabetes de tipo 1 (T1 D) de inicio reciente que comprende: a) identificar a un sujeto que presenta riesgo de desarrollar T1D o que tiene T1D de inicio reciente; y b) administrar una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 al sujeto, de esta manera previniendo profilácticamente el desarrollo de T1 D o tratando o reduciendo la progresión de T1D de inicio reciente.

26. El método de la reivindicación 25, en el que el sujeto es un mamífero.

27. El método de la reivindicación 25 ó 26, en el que el sujeto es un ser humano.

28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en el que el sujeto tiene un nivel de péptido C sérico basal de más de o igual a aproximadamente 0,2 nmoles/L y/o en el que el paciente tiene un nivel integrado de péptido C sérico en ayunas durante la estimulación de péptido C de entre aproximadamente 0,033 y 1 ,0 nmol/L x min.

29. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 25-28, en el que el paciente tiene un nivel de glucosa sanguínea en ayunas de más de aproximadamente 120 mg/dL en ausencia de Insulina exógena.

30. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 25-29, en el que el anticuerpo o fragmento de éste es humanizado.

31. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 25-30, en el que el anticuerpo o fragmento de éste se administra a una dosis de aproximadamente 0,03-3,7 mg/kg/dosis.

32. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 25-31 , en el que el anticuerpo o fragmento de éste se administra al menos diariamente, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente, bimensualmente, trimestralmente o anualmente.

33. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 25-32, en el que el anticuerpo o fragmento de éste se administra a una dosis total sobre todas las administraciones de aproximadamente 0,16-18 mg/kg.

34. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 25-33, en el que el anticuerpo o fragmento de éste se administra intravenosamente, intraperitonealmente, nasalmente, ocularmente, oralmente, parenteralmente, subcutáneamente o transdérmicamente.

35. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 25-34, en el que el anticuerpo o fragmento de éste se administra directamente en el páncreas.

36. El método de la reivindicación 35, en el que el anticuerpo o fragmento de éste se administra cerca de las células de los islotes en el páncreas.

37. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 25-36, en el que el método comprende además administrar un agente estimulante de células b, insulina o una célula productora de insulina.

38. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 25-37, en el que el método comprende además administrar un inmunosupresor.

39. Un método para tratar o reducir la progresión de diabetes de tipo 1 (T1 D) de inicio reciente que comprende: a) identificar a un sujeto humano que tiene T1 D de inicio reciente y que tiene un nivel de péptido C sérico basal de más de o igual a 0,2 nmoles/L y/o que tiene un nivel integrado de péptido C sérico en ayunas durante estimulación de péptido C de entre aproximadamente 0,033 y 1 ,0 nmol/L x min; y b) administrar aproximadamente 0,03-3,7 mg/kg/dosis de un anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, de esta manera tratando o reduciendo la progresión de T1 D de inicio reciente.

40. Un anticuerpo neutralizante de CXCR3 o fragmento de éste para prevenir, tratar o reducir la progresión de diabetes de tipo 1 (T1 D) de inicio reciente en un sujeto, en el que el anticuerpo o fragmento de éste comprende el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19.

41. Uso de un anticuerpo de CXCR3 o fragmento de éste seleccionado de los anticuerpos o fragmentos de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 en la preparación de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno.

42. El uso de la reivindicación 41 , en el que la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno asociado con CXCR3.

43. El uso de la reivindicación 41 ó 42, en el que la enfermedad o trastorno es diabetes de tipo 1 (T1D) de inicio reciente.

44. Un conjugado que comprende el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 y al menos un agente adicional.

45. El conjugado de la reivindicación 44, en el que el agente adicional es un agente terapeutico, un agente solubilizante, un agente estabilizador, un inmunosupresor, un receptor o un péptido de unión a antígeno.

46. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, o el ácido nucleico de la reivindicación 20, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

47. La composición farmacéutica de la reivindicación 46, en la que la composición comprende además al menos un agente terapéutico adicional.

48. La composición farmacéutica de la reivindicación 47, en la que el al menos un agente terapéutico adicional comprende un agente para tratar una enfermedad o trastorno asociado con CXCR3.

49. La composición farmacéutica de la reivindicación 47 ó 48, en la que el al menos un agente terapéutico adicional comprende un agente estimulante de células b, insulina o una célula productora de insulina.

50. Un método in vitro para detectar la presencia o concentración de CXCR3 en una muestra de ensayo, que comprende poner en contacto la muestra de ensayo con el anticuerpo o fragmento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-19 y un mareaje detectable, en el que la presencia o concentración de CXCR3 se correlaciona directamente o indirectamente con una señal generada por el mareaje detectable.

51. El metodo de la reivindicación 50, en el que el método se usa para diagnosticar una afección asociada con CXCR3.

52. El método de la reivindicación 50, en el que la afección es T1 D.