MX2014008797A

MX2014008797A - Metodos para la produccion gangliosidos.

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Publication number: MX2014008797A
Application number: MX2014008797A
Authority: MX
Inventors: Vanessa Ragaglia; Vandana Madanlal Sharma
Original assignee: Garnet Biotherapeutics Inc
Priority date: 2012-01-20
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2014-10-30
Also published as: US20130261067A1; US9556467B2; EP2804871A1; SG11201404236SA; ES2634387T3; KR20150035485A; US20170101657A1; EP2804871B1; CA2862157A1; HK1203967A1; US20130190257A1; US20220073959A1; KR102039204B1; IL233664A0; US9051592B2; WO2013109929A1; EP2804871A4; JP2015511120A; ZA201405321B; DK2804871T3

Abstract

La invención proporciona métodos para la producción de gangliósidos, por ejemplo, GM1, provenientes de células en cultivo utilizando, por ejemplo, células de médula ósea y células de neuroblastoma. Los métodos incluyen el tratamiento de ls células con un medio de inducción neural y cloroquina, o cloroquina sola en el caso de, por ejemplo, células humanas de médula ósea, neuraminidasa o glucosamina, para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en las células. También se proporcionan los métodos para cultivo de células de alta densidad a largo plazo, sin subcultivo para producir gangliósidos, por ejemplo, GM1. También se proporcionan métdos para cuantificar los gangliósidos, por ejemplo GM1 en un cultivo celular.

Description

MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN GANGLIÓSIDOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención, se relaciona con métodos para producir gangliósidos, por ejemplo, GMl, provenientes de células hechas crecer en cultivo. En particular, las células se tratan químicamente y se manipulan bioquímicamente para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GMl, y/o las células se cultivan a largo plazo a alta densidad, sin subcultivos, para acumular gangliósidos, por ejemplo, GMl.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Estructura y Función del gangliosido GMl GMl es una monosialogangliósido que tiene la siguiente estructura: GMl es un constituyente de las membranas las células nerviosas , se sabe que modula una se de actividades de la superficie celular y receptoras, y desempeña funciones importantes en la diferenciación y desarrollo neuronal, la fosforilación de proteínas y la función sináptica. Por lo tanto, GM1 impacta en la plasticidad neuronal y mecanismos de reparación, y la liberación de neurotrofinas en el cerebro, además de su función en el sistema nervioso, GM1 está implicado en la internalización de patógenos, la señalización celular, proliferación, supervivencia y diferenciación. Es un componente de las balsas de lípidos, un microdominio dentro de la membrana plasmática que está enriquecido en colesterol y esfingolípidos . Además, GM1 está implicado en la activación de un intercambiador de sodio-calcio en la membrana interna de la envoltura nuclear. Su interacción con el intercambiador de calcio modula el calcio nuclear y celular. Además de su función en la fisiología celular, GM1 actúa como el sitio de unión de la toxina de cólera.

GM1 ha mostrado ser efectivo para el tratamiento de diferentes tipos de lesiones del sistema nervioso central en animales experimentales, dando por resultado en una recuperación bioquímica y de comportamiento significativa. Además, el pretratamiento con GM1 inhibe el daño que resulta de una variedad de exposiciones a neurotoxinas .

GM1 también ha mostrado ser efectivo en el tratamiento a corto plazo de sujetos con enfermedad de Parkinson, dando por resultado en una reducción significativa de los síntomas. Schneider et al, Neurology 50:1630-1636 (1998) . Un estudio de cinco años más recientes indica que el uso de GM1 a largo plazo por sujetos con enfermedad de Parkinson es seguro y puede proporcionar algún beneficio clínico en estos sujetos. Schneider et al., J. Neurol . Sci. 232:45-51 (2010), incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Es dudosa la forma en que GM1 ejerce efectos potenciales neuroprotectores, neurorestaurativos o de neurorescate sobre el sistema de dopamina. Id. en 50. Sin embargo, se especula que GM1 incorporado en las membranas plasmáticas neuronales puede alterar la estabilidad de las balsas de lípidos y por lo tanto estimula una variedad de procesos celulares benéficos. Id.

Gangliósidos Los gangliósidos son un glicoesfingolípido principal en mamíferos, que contienen cadenas de azúcar con diferentes números de residuos de ácido siálico. En los gangliósidos existen muchas diferentes subespecies de azúcares. Los gangliósidos están implicados en una serie de enfermedades y trastornos, entre los que se incluyen la enfermedad de Tay-Sachs, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de zheimer y cáncer, entre otras.

Las biosintesis de gangliósidos están interconectadas estrechamente a través del uso de enzimas y sustratos biosintéticos comunes. Por ejemplo, la producción de GM1 depende la enzima galactosiltransferasa II, utilizada comúnmente para producir otros gangliósidos, por ejemplo, GA1, GDlb y GTlc. Xu et al., J. Lipid Res. 51:1643-1675 (2010) , incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Debido a sus características y componentes estructurales comunes, con frecuencia se sintetizan gangliósidos novedosos provenientes de los componentes reciclados de gangliósidos degradados, en particular, ceramida y esfingosina. Id. Por ejemplo, para la síntesis de gangliósidos se requieren moléculas núcleo tales como ceramida, galactosa, GalNAc, ácido siálico. Id. Como resultado, los factores que influyen en la producción o degradación de un miembro de la familia de gangliósidos con frecuencia alteran la producción y degradación de otros gangliósidos. Por ejemplo, debido a que GMl es el precursor para GDla, los aumentos en GMl favorecerán la producción de GDla para que la célula mantenga una proporción normal o equilibrada de gangliósidos. Masón et al . , Biochem. J. 388:537-544 (2005); Miller-Podraza et al., Biochem, 22:3260-3265 (1982); Nishio et al., J. Biol. Chem. 279:33368-33378 (2004) , cada una de las mismas se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

Producción de GMl En el pasado se ha utilizado clínicamente GMl derivado del cerebro de bovino. Véase, por ejemplo, Schneider et al., J. Neurol. Sci . 292:45-51, 46 (2010) ("Patients self-administered... bovine brain-derived [GMl] sodium salt..."), incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Sin embargo, el rendimiento limitado de GMl por cerebro de bovino y el costo para producir GMl de esta forma ha restringido la cantidad de GMl disponible para uso clínico comercial. Además, enfermedades tales como encefalopatía espongiforme bovina, es decir, enfermedad de las vacas locas, han despertado preocupación con respecto a la seguridad de esta fuente de GMl. Mientras que se ha descrito la extracción de GMl proveniente de cerebros de ovejas afligidas con gangliosidosis por GMl (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5,532,141), incorporada en la presente como referencia en su totalidad, este método despierta preocupaciones similares con relación al rendimiento, costo y seguridad.

Por lo tanto, existe una necesidad clara, no cumplida, por una alternativa de costo redituable, de alto rendimiento y segura para elaborar GM1 para uso clínico comercial .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método para producir un gangliósido en una célula, que comprende tratar la célula con cloroquina ("CLQ") para acumular el gangliósido; aislar el gangliósido; cuantificar el gangliósido, o ambos, provenientes de la célula tratada con CLQ; en donde la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula inmortalizada, una célula estromal, y un fibroblasto; en donde la célula no es una célula PC12, una célula HT22, una célula del cerebro proveniente de una oveja afligida con gangliosidosis, y una célula de fibroblasto proveniente de una oveja afligida con gangliosidosis.

La invención proporciona además los métodos para producir el gangliósido GM1 que comprende aislar células de médula ósea de oveja; cultivar las células de médula ósea de ovejas en medio para inducción neuronal ("NIM") para producir células de médula ósea de oveja similares a neuronas; tratar las células de médula ósea de oveja similares a neuronas con CLQ para acumular el GM1; y cuantificar el GM1, aislar el GM1, o ambos, proveniente de las células de médula ósea de ovejas similares a neuronas tratadas con CLQ.

La invención proporciona además un método para producir el gangliósido de GM1 que comprende tratar células de médula ósea humanas con CLQ para acumular el GM1 ; y aislar el GM1, cuantificar el GM1, o ambos, proveniente de las células de médula ósea humanas tratadas con CLQ.

La invención se relaciona además con el tratamiento de células, por ejemplo, células de médula ósea, con neuraminidasa para acumular gangliósidos, por ejemplo, GM1, en las células y aislar los gangliósidos, cuantificar los gangliósidos, o ambos, provenientes de las células tratadas con neuraminidasa.

La invención además se relaciona con el tratamiento de células, por ejemplo, células de médula ósea, con glucosamina para acumular gangliósidos, por ejemplo, GM1, en las células, y aislar los gangliósidos, cuantificar los gangliósidos, o ambos, provenientes de las células tratadas con glucosamina.

La invención además se relaciona con la manipulación bioquímica de células, por ejemplo, células primarias o líneas celulares, para acumular gangliósidos, por ejemplo, GM1, en las células, y aislar los gangliósidos, cuantificar los gangliósidos, o ambos, provenientes de las células modificadas químicamente.

También se proporcionan por la invención los métodos para producir gangliósidos, por ejemplo, GM1, mediante el cultivo de células sin sub-cultivo y a alta densidad para acumular el gangliósido.

La invención también se relaciona con métodos para cuantificar una cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en una población de células adherentes, que comprende poner en contacto las células adherentes con la toxina B de cólera conjugada con un tinte o con una enzima que genera un producto final de color con la puesta en contacto en su sustrato; y medir la luz emitida o absorbida por el tinte o el producto final de color, en donde la luz emitida o absorbida se utiliza para cuantificar la cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en la población de células adherentes .

La invención proporciona además un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la invención.

La invención también se relaciona con métodos para tratar enfermedades o trastornos que comprenden administrar los gangliósidos, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la invención a un sujeto que necesite del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS/FIGURAS Figura 1A, las células se obtuvieron de la médula ósea de oveja con gangliosidosis por GM1 ("células de médula ósea de oveja afectada") y se expandieron en cultivo. Las células control se mantuvieron en medio de cultivo estándar (paneles superiores). Las células inducidas marcadas "48h CLQ en NIM" (paneles inferiores) se cultivaron en NIM y luego se trataron durante 48 horas con CLQ. Las células se tiñeron con la toxina B de cólera conjugada con Alexa488 ("CTB-Alexa488") . Se muestran imágenes representativas para demostrar el grado de inducción. La tinción indica la presencia de GM1. Las células en los paneles inferiores que se trataron mostraron inducción de G 1; la tinción es más prevalente e intensa. Obsérvese la tinción perinuclear en muchas células.

Figura IB, las células obtenidas de la médula ósea de una oveja normal se expandieron en cultivo. Las células control se mantuvieron en medio de cultivo estándar (paneles superiores) . Las células inducidas marcadas "CLQ 48h en NIM" (paneles inferiores) se cultivaron en NIM y luego se trataron durante 48 horas (h) con CLQ. Las células se tiñeron con CTB-Alexa488. Se muestran imágenes provenientes de diferentes áreas del cultivo o diferentes pocilios que exhiben el grado de inducción. La tinción indica la presencia de GM1. Las células en los paneles inferiores que se trataron muestran inducción de GM1; la tinción es más prevalente e intensa. Obsérvese la tinción perinuclear en muchas células.

Figura 2, se colocaron en placa células estromales derivadas de médula ósea de adultos humanos normales en tejido estándar y matraces de cultivo. Las células control se mantuvieron en el medio de cultivo estándar (paneles superiores) . Las células tratadas, marcadas "CLQ", se trataron con CLQ en alfa-MEM durante 48h (paneles inferiores) . Se muestran imágenes representativas para demostrar el grado de inducción. Las células se tiñeron con CTB-Alexa 88. La tinción indica la presencia de GM1. La señal GM1 en las células tratadas (paneles inferiores) es abundante e intensa en comparación con las condiciones de control.

Figura 3, una linea celular de neuroblastoma humano, SHSY-5Y, células de médula ósea de oveja ("SBM") y células de médula ósea humana ("HBM") cada una se sometieron a tres diferentes regímenes de tratamiento: (a) medio libre de suero ("SFM") , (b) NIM, o (c) CLQ. La cantidad de GM1 en cada cultivo se determinó utilizando peroxidasa de rábano picante ("HRP") conjugada con la toxina B de cólera ("CTB-HRP") . Se midió la cantidad del producto generado por CTB-HRP que permaneció unido después de la incubación y lavado. También se determinó la señal proveniente de la tinción con Alamar Blue para cada cultivo. La señal GM1 (según se midió por CTB-HRP) se normalizó al número de células en el pocilio (según se midió mediante Alamar Blue) . El eje y de la gráfica de barras indica el grado de tinción utilizando CTB-HRP normalizado para el número de células, lo cual indica la cantidad de GM1 producido por cada línea celular para cada régimen de tratamiento. Las células control se dejaron sin tratar y se mantuvieron en medio de cultivo estándar. Los tratamientos con NIM y CLQ mostraron la inducción más robusta de GM1.

Figura 4, inducción de GM1 en células de neuroblastoma neuro 2A en ratones tratadas con neuraminidasa . Las células neuro 2A ya sea se mantuvieron en medio de cultivo estándar (Ctrl) o se trataron durante 3 horas con neuraminidasa. Las células tratadas mostraron mayor tinción (véase el panel D) , indicando una mayor acumulación de GM1 por las células tratadas.

Figura 5, inducción de G 1 en células estromales de médula ósea de adultos humanos (hABM-SC) con neuraminidasa. hABM-SC ya sea se mantuvieron en medio de cultivo estándar (control) o se trataron durante 3 horas con neuraminidasa (tratada) . Las células tratadas mostraron mayor intensidad de tinción, indicando una mayor producción de GM1 por las células tratadas.

Figura 6, inducción de GM1 en células de neuroblastoma neuro 2A de ratón mediante condiciones de cultivo a largo plazo a alta densidad. Las células neuro 2A de ratón se colocaron en placas a una alta densidad. Un subconjunto de pocilios se fijaron y se tiñeron para GMl después de 3 días en cultivo, mientras que otros se mantuvieron durante 9 días antes de la fijación y tinción para GMl . La mayor tinción de células mantenidas durante 9 días indica mayor producción de GMl.

Figura 7, inducción de GMl en células derivadas de cerebro de oveja mediante condiciones de cultivo a largo plazo a alta densidad. Las células derivadas de cerebro de ovejas se colocaron en placas a una alta densidad. Un subconjunto de pocilios se fijaron y se tiñeron para GMl después de 3 días en cultivo, mientras que otros se mantuvieron durante 9 dias antes de la fijación y tinción para GMl. La tinción más brillante de las células mantenidas durante 9 dias indica una mayor producción de GMl .

Figura 8, curva estándar para la cuantificación de GMl de ovejas basadas en placa, utilizando CTB-HRP . Se recubrió una placa a base de ELISA con diversas cantidades de GMl de ovejas. Las placas se lavaron, se bloquearon y se incubaron con toxina B de cólera conjugada con HRP. Se agregó sustrato para generar un producto color que se midió utilizando un lector de placas. La intensidad de señal se correlacionó con la cantidad de GMl agregado por pocilio. Esta gráfica representa una curva estándar generada mediante este método. Los niveles de GMl se pueden cuantificar utilizando esta curva estándar.

Figura 9, curva estándar para la cuantificación de GMl de oveja con base en placa utilizando CTB-Alexa488. Se recubrió una placa a base de ELISA con diversas cantidades de GMl de ovejas. Las placas se lavaron, se bloquearon, y se incubaron con CTB-A1 exa488. La intensidad de señal se correlacionó con la cantidad de GMl agregado por pocilio. Esta gráfica representa una curva estándar generada mediante este método. Los niveles de GMl se cuantificaron utilizando esta curva estándar.

Figura 10, inducción de GMl en lineas celulares inmortalizadas con CLQ. Células de SHSY-5Y, SHSY-S, SK-N-AS, ovario de hámster chino (CHO-K1), y riñon embrionario humano (HEK293) se colocaron en placas para cultivo de 24 pocilios. Las células control se mantuvieron en sus medios de cultivo estándar respectivos (Figura 10, paneles A, C, E, G, I) .Las células tratadas, marcadas "CLQ", se trataron con CLQ agregado al medio de cultivo estándar durante 48-120 horas (Figura 10, paneles B, D, F, H, J) . Se muestran imágenes representativas para demostrar el grado de inducción. Las células se tiñeron con CTB-Alexa488. La tinción indica la presencia de GMl. La señal de GMl en las células tratadas es más abundante e intensa en comparación con las condiciones control para todos los tipos celulares, aunque varió la magnitud y distribución.

Figura 11, inducción de GM1 en lineas celulares primarias con CLQ. Se colocaron en placas, células estromales derivadas de médula ósea de adulto de Garnet BioTherapeutics' (GBT-ABMSC) , estromales derivadas de médula ósea (Lonza BMSC) , estromales derivadas de tejido adiposo (ADSC Lonza), de fibroblastos dérmicos (fb) y fibroblastos provenientes de sujetos con gangliosidosis por GM1 (GM1 fb) en placas para para cultivo de 24 pocilios. Las células control se mantuvieron en sus medios de cultivo estándar respectivos (Figura 11, paneles A, C, E, G, I) . Las células tratadas, marcadas "CLQ", se trataron con CLQ agregada al medio de cultivo estándar durante 48-120 horas (Figura 11, paneles B, D, F, H, I) . Se muestran imágenes representativas para demostrar el grado de inducción. Las células se tiñeron con. CTB-Alexa488. La tinción indica la presencia de GM1. La señal de G 1 en las células tratadas es más abundante e intensa en comparación con las condiciones control para todos los tipos celulares, aunque varió la magnitud y distribución.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Introducción La presente invención proporciona métodos para producir gangliósidos , por ejemplo, GM1, provenientes de células en cultivo. Por consiguiente, los métodos de la invención proporcionan procesos para mejorar, o inducir, la producción de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en cultivo celular utilizando diversas manipulaciones. Los siguientes métodos de la presente invención se describirán con mayor detalle más adelante: (a) cultivo de células con medios de inducción neuronal ("NIM") , seguido por tratamiento con cloroquina ("CLQ") ; (b) tratamiento de células cultivadas con cloroquina sola, es decir, sin tratamiento inicial con NIM; (c) tratamiento de células cultivadas con neuraminidasa; (d) tratamiento de células cultivadas con glucosamina; (e) modificación bioquímica de células; (f) cultivo de células a largo plazo a alta densidad, sin subcultivo para permitir que se acumulen en las células los gangliósidos, por ejemplo, GM1. También se analizarán los tipos de células adecuadas para cada método, así como los métodos para aislar las células antes del tratamiento con NIM/CLQ o CLQ. En ciertas modalidades no exclusivas, los métodos (a) y/o (c) y/o (d) y/o (e) y/o (f), y los métodos (b) y/o (c) y/o (d) y/o (e) y/o (f), se combinan para mejorar adicionalmente la producción de gangliósidos en células cultivadas. Por ejemplo, las células se cultivan primero con NIM/CLQ, posteriormente se cultivan con neuraminidasa, o las células tratadas con CLQ, y sin NIM, posteriormente se cultivan con neuraminidasa . En algunas modalidades, después del tratamiento químico, por ejemplo, con NIM y/o CLQ y/o neuraminidasa, las células se someten cultivo a largo plazo a alta densidad, sin subcultivos para permitir que se acumulen en las células tratadas químicamente los gangliósidos, por ejemplo, GM1. En otras modalidades, en esta solicitud es posible cualquier combinación de tratamientos según se describe .

La presente invención también proporciona métodos para cuantificar la cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en cultivo celular, también descrito con mayor detalle más adelante.

El término "gangliósidos", en una modalidad de la invención, abarca todos los gangliósidos. En otra modalidad de la invención, el gangliósido es GM1. En otra modalidad de la invención, el gangliósido es GM2. En otra modalidad de la invención, el gangliósido es GM3. En otra modalidad de la invención, el gangliósido es GDla. En otra modalidad de la invención, el gangliósido es GDlb. En otra modalidad de la invención, el gangliósido es GD3. En otra modalidad de la invención, el gangliósido es GTl.

Producción de gangliosido mediante cultivo en medios para inducción neuronal, seguido por tratamiento con CLQ En modalidades, se induce a las células para acumular gangliósidos, por ejemplo, GM1, mediante cultivo en medio para inducción neuronal seguido por tratamiento con cloroquina. Este tratamiento de combinación se abrevia en la presente como "NIM/CLQ." En modalidades, las células adecuadas para utilizarse en este método se identifican por su fuente, por ejemplo, provenientes del tipo de animal y en la fuente de tejido celular del animal. Las fuentes animales para utilizarse en los métodos NIM/CLQ de la invención incluyen de manera enunciativa, humanas, de oveja, conejo, ratón, cobaya, caballo, cerdo, gato y perro. En modalidades de la invención, las células estromales, por ejemplo, células derivadas de médula ósea y de tejido adiposo; y fibroblastos, por ejemplo, fibroblastos provenientes de humanos con gangliosidosis por GM1 ("fibroblastos GM1") y fibroblastos dérmicos, provenientes de fuentes animales, incluyendo, de manera enunciativa las fuentes animales mencionadas anteriormente, se pueden utilizar en los métodos NIM/CLQ de la presente invención. En el sentido en el que se utiliza en la presente, los términos "células de médula ósea" y "células derivadas de médula ósea" se utilizan indistintamente. En modalidades, los métodos NIM/CLQ de la invención utilizan las células derivadas de la médula ósea producidas por los métodos para cultivo a baja densidad/con bajo contenido de oxigeno para aislar la médula ósea de las fuentes animales, se describirán con mayor detalle más adelante.

Los tipos celulares adicionales para utilizarse en los métodos NIM/CLQ de la invención incluyen células inmortalizadas. Otros tipos celulares incluyen células de neuroblastoma aisladas de fuentes animales, incluyendo de manera enunciativa las fuentes animales mencionadas anteriormente, e incluyendo las lineas celulares humanas, y de neuroblastoma (incluyendo de manera enunciativa SHSY-5Y, SHSY-S, y SK-N-AS) . Los neuroblastomas son ventajosos, al menos, debido a que estas células tienen una alta velocidad de crecimiento.

En modalidades, cada tipo celular utilizado en los métodos NIM/CLQ de la invención se cultiva bajo los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de 0¿ descritos en mayor detalle más adelante antes y/o durante y/o después del tratamiento.

En modalidades, las fuentes de células animales de la presente invención están afligidas con gangliosidosis por GM1, gangliosidosis por GM2, o ambas, el cual es un trastorno de almacenamiento lisosómico caracterizado por la acumulación generalizada de gangliósidos . En modalidades, las células de médula ósea y fibroblastos provenientes de humano, oveja, gatos o perros afligidos con gangliosidosis se utilizan en los métodos NIM/CLQ de la presente invención. En modalidades, el fibroblasto es un fibroblasto GM1. En modalidades adicionales, las células inmortalizadas se utilizan en los métodos NIM/CLQ de la presente invención, por ejemplo, células de CHO y células renales embrionarias humanas, por ejemplo, células de CH0-K1 y células HEK293. En otras modalidades, las células de neuroblastoma provenientes de lineas celulares de ratón, oveja o humanas y de neuroblastoma (incluyendo de manera enunciativa SHSY-5Y, 3HSY-S, y SK-N-AS) se utilizan en los métodos NIM/CLQ de la presente invención.

En modalidades, células PC12, células HT22, células cerebrales provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis, y células de fibroblastos provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis no se utilizan en los métodos NIM/CLQ de la invención.

El término "medios para inducción neuronal" se refiere a una solución para crecimiento de células la cual, bajo condiciones correctas, produce células gue asumen una o más características fenotípicas de una neurona. El grado del fenotipo neuronal inducido por NIM depende de diversos factores, entre los que se incluyen de manera enunciativa, el tipo de célula de partida, los componentes de los medios, la concentración de los componentes NIM, y la cantidad de tiempo en que las células están en contacto con el NIM. En modalidades de la presente invención, los medios para inducción neuronal adecuados inducen la expresión de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en las células cultivadas más allá de los niveles expresados por las células en medio de cultivo estándar.

En modalidades, NIM comprende medio neurobasal, suplemento B27 con ácido retinoico, factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento de fibroblastos. Estos componentes NIM son ilustrativos y se conocen en la técnica componentes NIM adicionales.

En modalidades, después del aislamiento de su fuente animal, las células para utilizarse en los métodos NIM/CLQ de la invención primero se cultivan en medios de cultivo estándar, por ejemplo, medio de crecimiento alfa-MEM suplementado con 10% de suero fetal de bovino ("FBS") MEM/F-12 suplementado con 10% de FBS; EMEM/F-12 suplementado con 1% de aminoácidos no esenciales ("NEAA"), L-glutamina 2mM y 15% de FBS; DMEM suplementado con NEAA 0.1 mM y 10% de FBS; F-12K suplementado con 10% de FBS; EMEM suplementado con 10?, de FBS; medio basal Lonza MSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza ADSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza de fibroblastos con suplementos; o EMEM suplementado con 15% de FBS, durante 2 hasta 24 horas, y de preferencia durante 4 hasta 14 horas, y de preferencia durante 12 horas. En modalidades, las células se hacen crecer a una densidad estándar para sembrado de células, por ejemplo, 2,000 hasta 20,000 células/cm', y de preferencia 8,000 células/cm2, a aproximadamente 37°C en una incubadora humidificada bajo condiciones estándar atmosféricas (5% de C02) . Después del cultivo en medios de cultivo estándar, los medios se reemplazan con NIM y las células se cultivan en NIM durante entre 2 y 24 horas, de preferencia entre 6 y 18 horas, o de preferencia entre 8 y 14 horas. Después del tratamiento con NIM, se agrega CLQ al matraz para inducir que las células cultivadas con NIM produzcan más GM1. Se ha utilizado CLQ para inducir la acumulación en células PC12 (tumor de médula adrenal de rata). Yuyama et al., FEBS Lett. 550: 691'2-6916 (2006). Sin embargo, CLQ sólo aumenta moderadamente los niveles de GM1 en células HT22 (ratón hipocampo). Hirata et al., J. Neurochem. 119:839-847 (2011). En modalidades, mientras que las células se cultivan en NIM, se agrega al cultivo entre 5 y 100 micromolar de CLQ, entre 20 y 60 micromolar de CLQ, o entre 40 y 50 micromolar de CLQ. En modalidades, se agrega al cultivo 50 micromolar de CLQ. En otras modalidades, se agrega al cultivo 30 micromolar de CLQ. En otras modalidades, se agrega al cultivo 25 micromolar de CLQ. La CLQ se pone en contacto con células cultivadas durante entre 4 hasta 72 horas, de preferencia entre 20 hasta 60 horas, y de preferencia entre 48 hasta 60 horas. En modalidades, la CLQ se pone en contacto con las células cultivadas durante 48 horas .

Para tipos celulares particulares, tales como células de médula ósea, de ovejas, una muerte significativa de células da por resultado después del tratamiento con NIM/CLQ. En estas modalidades, las células muertas en el matraz se eliminaron, y las células supervivientes restantes se volvieron a suspender en medio de crecimiento recién preparado, por ejemplo, alfa-MEM suplementado con 10% de FBS, MEM/F-12 suplementado con 10% de FBS; EMEM/F-12 suplementado con 1¾ de aminoácidos no esenciales ("NEAA") , L-glutamina 2mM y 15¾ de FBS; DMEM suplementado con NEAA 0.1 mM y 10% de FBS; F-12K suplementado con 10% de FBS; EMEM suplementado con 10% de FBS; medio basal Lonza MSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza ADSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza de fibroblastos con suplementos; o EMEM suplementado con 15% de FBS, y se cultivaron aproximadamente 37 °C en una incubadora humidificada bajo densidades celulares estándar y una atmósfera con 5% de C02. En modalidades de la invención, después de la resuspensión en medio de crecimiento recién preparado, por ejemplo, alfa-MEM suplementado con 10% de FBS, MEM/F-12 suplementado con 10% de FBS; EMEM/F-12 suplementado con 1% de aminoácidos no esenciales ("NEAA") , L-glutamina 2mM y 15% de FBS; DMEM suplementado con NEAA 0.1 niM y 10% de FBS; F-12K suplementado con 10% de FBS; EMEM suplementado con 10% de FBS; medio basal Lonza MSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza ADSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza de fibroblastos con suplementos; o EMEM suplementado con 15% de FBS. Las células supervivientes restantes se trataron nuevamente con CLQ para inducir adicionalmente la producción de gangliósidos bajo las condiciones descritas anteriormente. Si es necesario, las células muertas flotantes se eliminaron del matraz, y las células supervivientes restantes se recolectaron. En modalidades adicionales, no se condujo un segundo tratamiento, y se recolectaron las células. Los métodos de la invención también establecerán que la cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en el cultivo celular se cuantifica utilizando los métodos de la presente invención ya sea después del tratamiento con NIM solo o después del tratamiento con NIM y CLQ (antes y después del tratamiento) . En modalidades, los gangliósidos, por ejemplo, GM1, se aisla y purifica utilizando métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos descritos en la presente.

En modalidades adicionales de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ aumenta la acumulación de todos los gangliósidos . En modalidades de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ aumenta la acumulación de GM1. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GM2. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GM3. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GDla. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GDlb. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GD3. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GT1.

En otra modalidad, el tratamiento con NIM/CLQ aumenta la acumulación de dos o más gangliósidos. En una modalidad adicional, el tratamiento con NIM/CLQ aumenta la acumulación de tres o más gangliósidos. En una modalidad adicional, el tratamiento con NIM/CLQ aumenta la acumulación de cuatro o más gangliósidos. En una modalidad adicional, el tratamiento con NIM/CLQ aumenta la acumulación de cinco o más gangliósidos .

En modalidades adicionales de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ da por resultado en 10 hasta 200 por ciento o aproximadamente 10 hasta 200 por ciento o más acumulación de gangliósidos en una célula en comparación con una célula que no se haya tratado con NIM/CLQ. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ da por resultado en 15 hasta 125 por ciento o aproximadamente 15 hasta 125 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con NIM/CLQ. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ da por resultado en 30 hasta 100 por ciento o aproximadamente 30 hasta 100 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con NIM/CLQ. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ da por resultado en 60 hasta 80 por ciento o aproximadamente 60 hasta 80 por ciento más acumulación de gangliósido que una célula que no se haya tratado con NIM/CLQ. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ da por resultado en 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento o aproximadamente 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con NIM/CLQ. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con NIM/CLQ da por resultado en 65 por ciento más de la acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con NIM/CLQ.

La invención proporciona además un gangliósido producido mediante los métodos NIM/CLQ de la invención.

La invención proporciona además los métodos para tratar a un sujeto que necesita del tratamiento, al administrar el gangliósido, por ejemplo, GMl, producido mediante los métodos NIM/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga lesión neuronal se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GMl, producido mediante los métodos NIM/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Parkinson se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GMl, producido mediante los métodos NIM/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Alzheimer se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GMl, producido mediante los métodos NIM/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que haya tenido o esté teniendo una apoplejía se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GMl, producido mediante los métodos NIM/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga el síndrome de Guillain-Barré se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GMl, producido mediante los métodos NIM/CLQ de la invención.

En modalidades, un sujeto que tenga cáncer se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos NIM/CLQ de la invención.

En una modalidad ilustrativa, los gangliósidos , por ejemplo, GM1, se acumulan en células derivadas de médula ósea de oveja normal y células derivadas de médula ósea de una oveja afectada con gangliosidosis . En modalidades ilustrativas, las células derivadas de médula ósea de ovejas se obtienen mediante los métodos de baja densidad, con bajo contenido de oxigeno descritos más adelante. Estas células luego se cultivan en medio de crecimiento alfa-MEM, con 10% de FBS, a una densidad de 8000 células/cm2. Después de aproximadamente 12 horas, el medio se reemplaza con 30 mi de NIM, que comprende medio neurobasal, suplemento B27 con ácido retinoico, EGF (25 microgramos/ml ) y FGF (10 nanogramos/ml ) . Después de aproximadamente 10 horas, se agrega al matraz CLQ 50 micromolar. Al tercer día se observó una muerte celular de aproximadamente el 70%. Las células flotantes se eliminaron mediante enjuague con PBS . Las células supervivientes se recolectaron mediante tratamiento con tripsina, se centrifugan, se vuelven a suspender en medio de crecimiento recién preparado y se siembran en un nuevo matraz a 8,000 células/cm2. Se retira una alícuota y se coloca en una placa de 24 pocilios para confirmar el gangliósido, por ejemplo, GM1, la inducción mediante tinción con tintes adecuados, por ejemplo, CTB-Alexa488. Las células supervivientes se dejaron expandir en el matraz durante 2 días y luego las células se recolectaron. En modalidades, las células supervivientes se pueden tratar por una segunda vez con CLQ 50 micromolar durante 24 horas antes de la recolección. Después de la recolección celular, los gangliósidos, por ejemplo, GM1, se pueden aislar y purificar utilizando los métodos descritos más adelante.

Producción de gangliósidos mediante el tratamiento con cloroquina En modalidades adicionales, la acumulación de gangliósidos, por ejemplo, GM1, se induce en células que utilizan el tratamiento con cloroquina sin cultivar primero con medios de inducción neuronal. Este método también se denomina "método de tratamiento con CLQ" o "tra amiento con CLQ" en la presente. En modalidades, las fuentes animales de células para utilizarse en el método de tratamiento con CLQ incluyen, de manera enunciativa, de humano, conejo, ratón, cobaya, caballo, cerdo, gato y perro. En modalidades de la invención, los fibroblastos y células estromales, por ejemplo, células de médula ósea y derivados de tejido adiposo; y fibroblastos, por ejemplo, fibroblasto GM1 y fibroblastos dérmicos, provenientes de fuentes animales, y que incluyen de manera enunciativa las fuentes animales mencionadas anteriormente se pueden utilizar en los métodos CLQ de la presente invención. Los métodos ilustrativos para aislar células de fuentes animales se describirán con mayor detalle más adelante. En modalidades, las células producidas mediante los métodos para cultivo de baja densidad/b jo contenido de oxigeno descritos más adelante se tratan con CLQ para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GMl . En modalidades, las células de médula ósea humana producidas mediante los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de oxigeno descritos más adelante se tratan con CLQ para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GMl.

En modalidades adicionales de los métodos para tratamiento con CLQ de la invención, las células inmortalizadas, por ejemplo, células de CHO y células renales embrionarias humanas, por ejemplo, células de CH0-K1 y células HEK293, se utilizan en los métodos CLQ de esta invención. En modalidades adicionales, células de neuroblastoma aisladas de fuentes animales, que incluyen de manera enunciativa, las fuentes animales mencionadas anteriormente, incluyendo lineas celulares humanas, y de neuroblastomas (incluyendo de manera enunciativa SHSY-5Y, SHSY-S, y SK-N-AS) se utilizan en los métodos CLQ de la invención. En modalidades adicionales, las células para utilizarse en los métodos CLQ de la presente invención se derivan de animales afligidos con gangliosidosis, por ejemplo, humanos, gatos o perros afligidos con gangliosidosis por GM1, gangliosidosis por GM2, o ambas. En modalidades adicionales, las células de médula ósea y fibroblastos provenientes de humano, oveja, gatos o perros afligidos con gangliosidosis se utilizan en los métodos CLQ de la presente invención. En modalidades, el fibroblasto es un fibroblasto GM1.

En modalidades, cada tipo celular utilizado en los métodos CLQ de la invención se cultiva bajo los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de O2 descritos con mayor detalle más adelante antes y/o durante y/o después del tratamiento.

En modalidades, las células PC12, las células HT22, células cerebrales provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis, y células de fibroblastos provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis no se utilizan en los métodos CLQ de la invención.

En modalidades, las células provenientes de la fuente deseada se cultivan en medio de crecimiento estándar, por ejemplo, alfa-MEM suplementado con 10% de FBS, MEM/F-12 suplementado con 10% de FBS; EMEM/F-12 suplementado con 1% de aminoácidos no esenciales ("NEAA") , L-glutamina 2mM y 15% de FBS; DMEM suplementado con NEAA 0.1 mM y 10% de FBS; F-12K suplementado con 10% de FBS; EMEM suplementado con 10% de FBS; medio basal Lonza MSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza ADSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza de fibroblastos con suplementos; o EMEM suplementado con 15% de FBS, bajo una densidad de sembrado estándar, por ejemplo, 2,000 hasta 20,000 células/cm2, y preferencia 8,000 células/cnr, a 37°C bajo condiciones atmosféricas con 5% de CO2. En modalidades, las células se cultivaron durante 2 hasta 48 horas, y de preferencia durante 8 hasta 36 horas, y de preferencia durante 24 horas. Después de cultivar, el medio de cultivo se remplaza opcionalmente con medio estándar suplementado con suero; en modalidades, la cantidad de suero es menos de la cantidad de suero en el medio de cultivo anterior. Se agrega CLQ al medio de cultivo. En modalidades, se agrega al maLraz de cultivo CLQ entre 5 y 100 micromolar, CLQ entre 25 y 75 micromolar, o CLQ entre 40 y 50 micromolar. En modalidades, se agrega al matraz de cultivo CLQ 50 micromolar. En modalidades adicionales, se agrega al matraz de cultivo CLQ 30 micromolar. En modalidades adicionales, se agrega al matraz de cultivo CLQ 25 micromolar. La CLQ se pone en contacto con las células cultivadas durante entre 2 hasta 72 horas, de preferencia entre 20 hasta 60 horas, y de preferencia entre 30 hasta 50 horas. En modalidades, las células se incuban con CLQ durante 48 horas y se recolectan. En una modalidad adicional, la cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en el cultivo celular se cuantifica utilizando los métodos de la presente invención. Los gangliósidos, por ejemplo, GMl, posteriormente se pueden aislar y purificar a partir del cultivo celular utilizando métodos estándar, tales como aquellos descritos más adelante.

En una modalidad ilustrativa, células derivadas de médula ósea humana cultivadas en medio de crecimiento alfa-MEM (con 10% de FBS) se sembraron a una densidad de 8 , 000 células/cm'; . Después de aproximadamente 24 horas, el medio se reemplaza con alfa-MEM con suero reducido (con 1% de FBS) y se agrega CLQ 50 micromolar. Las células se incuban durante 48 horas antes de la recolección. En modalidades adicionales de la cantidad de gangliósidos por ejemplo, GMl, posteriormente se pueden aislar y purificar del cultivo celular utilizando métodos estándar tales como aquellos descritos más adelante.

En modalidades ilustrativas, las células derivadas de médula ósea humana cultivadas en medio de crecimiento Alfa-MEM ( con 1 0 % de FBS) se sembraron a una densidad de 8 , 000 células/cirr . Después de aproximadamente 24 horas, el medio se reemplaza con suero reducido de alfa-MEM (con 1¾ de FBS) y se agrega CLQ 50 micromolar. Las células se incuban durante 48 horas antes de la recolección.

En modalidades adicionales de la invención, el tratamiento con CLQ aumenta la acumulación de todos los gangliósidos . En una modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ aumenta la acumulación de GM1. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ de la invención aumenta la acumulación de GM2. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ de la invención aumenta la acumulación de GM3. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ de la invención aumenta la acumulación de GDla. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ de la invención aumenta la acumulación de GDlb. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ de la invención aumenta la acumulación de GD3. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ de la invención aumenta la acumulación de GT1.

En otra modalidad, el tratamiento con CLQ aumenta la acumulación de dos o más gangliósidos. En una modalidad adicional, el tratamiento con CLQ aumenta la acumulación de tres o más gangliósidos. En una modalidad adicional, el tratamiento con CLQ aumenta la acumulación de cuatro o más gangliósidos. En una modalidad adicional, el tratamiento con CLQ aumenta la acumulación de cinco o más gangliósidos .

En modalidades adicionales de la invención, el tratamiento con CLQ da por resultado en 10 hasta 200 por ciento o aproximadamente 10 hasta 200 por ciento más acumulación de gangliósidos en una célula en comparación con una célula que no se haya tratado con cloroquina. En otra modalidad de la invención, El tratamiento con CLQ da por resultado en 15 hasta 125 por ciento o aproximadamente 15 hasta 125 por ciento más acumulación de gangliósido que una célula que no se haya tratado con cloroquina. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ da por resultado en 30 hasta 100 por ciento o aproximadamente 30 hasta 100 por ciento más acumulación de gangliósido que una célula que no se haya tratado con cloroquina. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ da- por resultado en 60 hasta 80 por ciento o aproximadamente 60 hasta 80 por ciento más acumulación de gangliósido que una célula que no se haya tratado con cloroquina. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ da por resultado en 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento o aproximadamente 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con cloroquina. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con CLQ da por resultado en 65 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con cloroquina.

La invención proporciona además un gangliósido producido mediante los métodos de tratamiento con CLQ de la invención .

La invención proporciona además los métodos para tratar a un sujeto que tenga una enfermedad o trastorno que necesite de este tratamiento mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de tratamiento con CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga una lesión neuronal se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de tratamiento con CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Parkinson se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de tratamiento CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Alzheimer se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de tratamiento con CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que haya tenido o esté teniendo una apoplejía se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de tratamiento con CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga el síndrome de Guillain-Barré se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de tratamiento con CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga cáncer se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de tratamiento con CLQ de la invención.

Producción de gangliósidos mediante tratamiento con neuraminidasa En modalidades adicionales, se induce la producción de glanglósidos en exceso, por ejemplo, GM1, en células utilizando neuraminidasa, ya sea sola o con CLQ. La combinación del tratamiento con neuraminidasa y cloroquina se abrevia en la presente como "neuraminidasa/CLQ" . La neuraminidasa es una enzima sialidasa que convierte los gangliósidos del complejo principal del cerebro, por ejemplo, GDla, GDlb y GTlb, hasta GM1 en células intactas. En modalidades, las fuentes de células para utilizarse en el método de tratamiento con neuraminidasa incluyen, de manera enunciativa, humanas, de oveja, conejo, ratón, cobaya, caballo, cerdo, perro y gato. En modalidades de la invención, las células aisladas de fuentes animales, que incluyen de manera enunciativa las fuentes animales mencionadas anteriormente, tales como células estromales, por ejemplo, células derivadas de médula ósea y tejido adiposo; y fibroblastos, por ejemplo, fibroblastos GM1 y fibroblastos dérmicos, se pueden utilizar en los métodos de neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ de la presente invención. En otras modalidades de la invención, las células de médula ósea aisladas de cada una de estas fuentes animales se pueden utilizar en los métodos de neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ de la presente invención. Los métodos ilustrativos para aislar la médula ósea de las fuentes animales se describen con mayor detalle más adelante. En modalidades, las células producidas mediante los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de oxigeno descritos más adelante se tratan con neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GM1. En modalidades, las células de médula ósea humana producidas mediante los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de oxigeno descritos más adelante se tratan con neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GMl .

En modalidades adicionales de la invención, las células inmortalizadas, por ejemplo, las células de CHO y células renales embrionarias humanas, por ejemplo, células de CH0-K1 y células 293, se utilizan en los métodos de neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ de la invención. En modalidades adicionales, las células de neuroblastoma aisladas de fuentes animales, que incluyen de manera enunciativa las fuentes animales mencionadas anteriormente, incluyendo lineas celulares humanas, y de neuroblastoma (incluyendo de manera enunciativa SHSY-5Y, SHSY-S, y SK-N-AS) se utilizan en los métodos de neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ de la invención. En modalidades adicionales, las células para utilizarse en los métodos de neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ de la presente invención se derivan de animales afligidos con gangliosidosis por ejemplo, humanos, gatos o perros afligidos con gangliosidosis por GMl, gangliosidosis por GM2, o ambas. En modalidades adicionales, las células de médula ósea y fibroblastos provenientes de humanos, ovejas, gatos o perros afligidos con gangliosidosis se utilizan en los métodos de neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ de la presente invención. En modalidades, el fibroblasto es un fibroblasto GMl.

En modalidades, cada tipo celular utilizado en los métodos de neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ de la invención se cultiva bajo los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de 02 descritos con mayor detalle más adelante antes y/o durante y/o después del tratamiento.

En modalidades, las células PC12, células HT22, células cerebrales provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis, y células de fibroblastos provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis no se utilizan en los métodos de neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ de la invención.

En modalidades, las células derivadas de la fuente deseada se cultivan en medio de crecimiento estándar, por ejemplo, alfa-MEM suplementado con suero, por ejemplo, 10?, de FBS, suplementado adicionalmente con glutamina 1 hasta 4 mm bajo una densidad estándar de sembrado, MEM/F-12 suplementado con 10% de FBS; EMEM/F-12 suplementado con 1% de aminoácidos no esenciales ("NEAA"), L-glutamina 2mM y 15% de FBS; DMEM suplementado con NEAA. 0.1 mM y 10% de FBS; F-12K suplementado con 10¾ de FBS; EMEM suplementado con 10% de FBS; medio basal Lonza MSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza ADSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza de fibroblastos con suplementos; o EMEM suplementado con 15% de FBS, por ejemplo, 2,000 hasta 20,000 células/cm2, y de preferencia de 8,000 células/cnr, a 37°C en una incubadora humidificada bajo condiciones atmosféricas estándar (5% de C02) . Se agrega neuraminidasa al medio de cultivo y las células se tratan con neuraminidasa durante 1 hasta 5 horas, de preferencia de 2 hasta 4 horas, y de preferencia 3 horas. En modalidades, se agregan entre 1 y 5 unidades/ml de neuraminidasa al medio de cultivo, y de preferencia 1 unidad/ml. En una modalidad adicional, la cantidad de ganglio-sidos, por ejemplo, GM1, en el cultivo celular se cuantifica utilizando los métodos de la presente invención. Los gangliósidos, por ejemplo, GMl, también se pueden aislar y purificar a partir del cultivo celular utilizando métodos estándar, tales como aquellos descritos más adelante.

En modalidades adicionales de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ aumentan la acumulación de todos los gangliósidos. En una modalidad de la invención, los métodos de neuraminidasa/neuraminidasa CLQ aumentan la acumulación de GMl. En otra modalidad de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención aumentan la acumulación de GM2. En otra modalidad de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención aumentan la acumulación de GM3. En otra modalidad de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención aumentan la acumulación de GDla. En otra modalidad de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención aumentan la acumulación de GDlb. En otra modalidad de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención aumentan la acumulación de GD3. En otra modalidad de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención aumentan la acumulación de GT1.

En otra modalidad, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ aumentan la acumulación de dos o más gangliósidos . En una modalidad adicional, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ aumentan la acumulación de tres o más gangliósidos. En una modalidad adicional, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ aumentan la acumulación de cuatro o más gangliósidos. En una modalidad adicional, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ aumentan la acumulación de cinco o más gangliósidos.

En modalidades adicionales de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ dan por resultado en 10 hasta 200 por ciento o aproximadamente 10 hasta 200 por ciento más acumulación de gangliósidos en una célula en comparación con una célula que no se haya tratado con la neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ . En otra modalidad de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ dan por resultado en 15 hasta 125 por ciento o aproximadamente 15 hasta 125 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con la neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ. En otra modalidad de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ dan por resultado en 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento o aproximadamente 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento más de la acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ. En otra modalidad de la invención, los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ dan por resultado en 65 por ciento más la acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ.

La invención proporciona además un gangliósido producido mediante los métodos de tratamiento con neuraminidasa y neuraminidasa/CLQ de la invención.

La invención proporciona además métodos para tratar a un sujeto que tenga una enfermedad o trastorno que necesite de este tratamiento mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga una lesión neuronal se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Parkinson se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Alzheimer se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que haya tenido o esté teniendo una apoplejía se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga el síndrome de Guillain-Barré se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga cáncer se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la neuraminidasa/neuraminidasa CLQ de la invención.

Producción de gangliósido mediante el tratamiento con glucosamina En modalidades adicionales, la producción en exceso de gangliósidos, por ejemplo, G 1, se induce en células utilizando glucosamina, ya sea sola o con CLQ. La combinación del tratamiento con glucosamina con cloroquina se abrevia en la presente como "glucosamina/CLQ". Bajo ciertas condiciones, el tratamiento con glucosamina aumenta los niveles de gangliósidos, por ejemplo, GM1 y GM2, como se describe por Masson et ai. Biochem. J. 388:537-544 (2005), incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Las fuentes de células para utilizarse en el método de los métodos de glucosamina y glucosamina/CLQ incluyen, de manera enunciativa, humanas, de oveja, conejo, ratón, cobaya, caballo, cerdo, gato y perro. En modalidades de la invención, los fibroblastos y células estromales, por ejemplo, células derivadas de médula ósea y de tejido adiposo; y fibroblastos, por ejemplo, fibroblastos GM1 y fibroblastos dérmicos, provenientes de fuentes animales, que incluyen de manera enunciativa las fuentes animales mencionadas anteriormente, se pueden utilizar en los métodos de glucosamina y glucosamina/CLQ de la presente invención. Los métodos ilustrativos para aislar células de fuentes animales se describen con mayor detalle más adelante. En modalidades, las células producidas mediante los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de oxigeno descritos más adelante se tratan con glucosamina y glucosamina/CLQ para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GM1. En modalidades, las células de médula ósea humanas producidas mediante los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de oxigeno descritos más adelante se tratan con glucosamina y glucosamina/CLQ para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GM1.

En modalidades adicionales de la invención, las células inmortalizadas, por ejemplo, células de CHO y células renales embrionarias humanas, por ejemplo, células de CHO-K1 y células HEK293, se utilizan en los métodos de glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención. En modalidades adicionales, las células de neuroblastoma aisladas de fuentes animales, que incluyen de manera enunciativa, las fuentes animales mencionadas anteriormente, incluyendo líneas celulares humanas, y de neuroblastoma (que incluyen de manera enunciativa SHSY-5Y, SHSY-S, y SK-N-AS) se utilizan en los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención. En modalidades adicionales, las células para utilizarse en los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ de la presente invención se derivan de animales afligidos con gangliosidosis por ejemplo, humanos, gatos o perros afligidos con gangliosidosis por GM1, gangliosidosis por GM2, o ambas. En modalidades adicionales, las células de médula ósea y fibroblastos provenientes de humanos, ovejas, gatos o perros afligidos con gangliosidosis se utilizan en los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ de la presente invención. En modalidades, el fibroblasto es un fibroblasto GM1.

En modalidades, cada tipo celular utilizado en los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención se cultiva con los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de O2 descritos con mayor detalle más adelante y/o durante y/o después del tratamiento.

En modalidades, las células PC12, las células HT22, células cerebrales provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis, y células de fibroblastos provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis no se utilizan en los métodos de glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención.

En modalidades, las células derivadas de la fuente deseada se cultivan en medio de crecimiento estándar, por ejemplo, alfa-MEM suplementado con suero, por ejemplo, 10% de FBS, suplementado adicionalmente con glutamina de 1 hasta 4 mm bajo densidad estándar de sembrado, MEM/F-12 suplementado con 10% de FBS; EMEM/F-12 suplementado con 1% de aminoácidos no esenciales ("NEAA"), L-glutamina 2mM y 15% de FBS; DMEM suplementado con NEAA 0.1 mM y 10% de FBS; F-12K suplementado con 10?, de FBS; EMEM suplementado con 10% de FBS; medio basal Lonza MSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza ADSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza de fibroblastos con suplementos; o EMEM suplementado con 15% de FBS, por ejemplo, 2,000 hasta 20,000 células/cnr, y de preferencia 8,000 células/cm", a 37°C en una incubadora humidificado bajo condiciones atmosféricas estándar (5% de C0¿) . Se agrega al medio glucosamina y se cultiva como se describe por Masson et al. Biochem. J. 388:537-544 (2005). En una modalidad adicional, la cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en el cultivo celular se cuantifica utilizando los métodos de la presente invención. Los gangliósidos, por ejemplo, GM1, también se pueden aislar y purificar a partir del cultivo celular utilizando métodos estándar, tales como aquellos descritos más adelante.

En modalidades adicionales de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ aumenta la acumulación de todos los gangliósidos. En una modalidad de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ aumenta la acumulación de GM1. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GM2. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GM3. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GDla. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GDlb. En otra modalidad de la invención, el tratmaiento con la glucosamina y glucosamina/CLQ invención aumenta la acumulación de GD3. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención aumenta la acumulación de GTl.

En otra modalidad, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ aumenta la acumulación de dos o más gangliósidos. En una modalidad adicional, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ aumenta la acumulación de tres o más gangliósidos. En una modalidad adicional, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ aumenta la acumulación de cuatro o más gangliósidos. En una modalidad adicional, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ aumenta la acumulación de cinco o más gangliósidos.

En modalidades adicionales de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ da por resultado en 10 hasta 200 por ciento o aproximadamente 10 hasta 200 por ciento más acumulación de gangliósidos en una célula en comparación con una célula que no se haya tratado con glucosamina y glucosamina/CLQ. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ da por resultado en 15 hasta 125 por ciento o aproximadamente 15 hasta 125 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con glucosamina y gluccsamina/CLQ. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ da por resultado en 30 hasta 100 por ciento o aproximadamente 30 hasta 100 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con glucosamina y glucosamina/CLQ. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ da por resultado en 60 hasta 80 por ciento o aproximadamente 60 hasta 80 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con glucosamina y glucosamina/CLQ. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con la glucosamina y glucosamina/CLQ da por resultado en 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento o aproximadamente 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con glucosamina y glucosamina/CLQ. En otra modalidad de la invención, el tratamiento con glucosamina y glucosamina/CLQ da por resultado en 65 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya tratado con glucosamina y glucosamina/CLQ.

La invención proporciona además un gangliósido producido mediante los métodos de glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención.

La invención proporciona además los métodos para tratar a un sujeto que tenga una enfermedad o trastorno que necesite de este tratamiento mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga lesión neuronal se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Parkinson se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Alzheimer se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que haya tenido o esté teniendo una apoplejía se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga el síndrome de Guillain-Barré se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga cáncer se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de la glucosamina y glucosamina/CLQ la invención.

Producción de gangliósidos mediante manipulación bioquímica En modalidades adicionales, la producción de gangliósidos en exceso, por ejemplo, GM1, se induce en células mediante manipulación bioquímica ya sea sola o en combinación con CLQ. La combinación de la manipulación bioquímica con el tratamiento con cloroquina se abrevia en la presente como "manipulación bioquímica/CLQ" . Bajo ciertas condiciones, la alteración de ciertos niveles enzimáticos aumenta los niveles de gangliósidos, que provocan la enfermedad. Las gangliosidosis por GM1 se provoca por un nivel elevado de GM1 provocado por una deficiencia de la enzima ß-galactosidasa lisosómica, que hidroliza los residuos terminales de ß-galactosilo provenientes del- gangliósido GM1, las glucoproteínas y glucosaminoglicanos . Christie, "Ganglioside", The AOCS Lipid Library, actualizado por última vez el 23 de julio de 2012. Adicionalmente, la gangliosidosis por GM2 se provoca por una actividad insuficiente de una enzima específica, ß-nacetilhexosaminidasa, que cataliza la degradación de gangliósidos. Id. Además, se conocen muchas de las enzimas que convierten los gangliósidos de una forma en otra. De esta forma, alterar la expresión y/o actividad de estas enzimas puede aumentar la producción de un gangliósido particular. Para los métodos de la invención se pueden utilizar métodos conocidos tales como, de manera enunciativa supresión, por ejemplo, supresión, trans fección, por ejemplo, transitoria o estable, inhibición química, por ejemplo, pequeña molécula o biológica, y anticuerpos. Las fuentes de células para utilizarse en el método de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ incluyen, de manera enunciativa, humanos, ovejas, conejos, ratones, cobayas, caballos, cerdos, gatos y perros. En modalidades de la invención, los fibroblastos y células estromales, por ejemplo, células derivadas de médula ósea y células derivadas de tejido adiposo; y fibroblastos, por ejemplo, fibroblastos por GM1 y fibroblastos dérmicos, provenientes de fuentes animales, que incluyen de manera enunciativa las fuentes animales mencionadas anteriormente se pueden utilizar en los métodos de manipulación bioquímica y los métodos de manipulación bioquímica/CLQ de la presente invención. Los métodos ilustrativos para aislar células de fuentes animales se describen con mayor detalle más adelante. En modalidades, las células producidas por los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de oxígeno descritos más adelante se utilizan en los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GM1. En modalidades, las células de médula ósea humana producida mediante los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de oxigeno descritos más adelante se utilizan en los métodos de manipulación bioquímica y métodos de manipulación bioquímica/CLQ para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GM1.

En modalidades adicionales de la invención, células inmortalizadas, por ejemplo, células de CHO y células renales embrionarias humanas, por ejemplo, células de CH0-K1 y células HEK293, se utilizan en los métodos de manipulación bioquímica y de manipulación bioquímica/CLQ de esta invención. En modalidades adicionales, células de neuroblastoma aisladas de fuentes animales, que incluyen de manera enunciativa las fuentes animales mencionadas anteriormente, que incluyen líneas celulares humanas y de neuroblastoma (incluyendo de manera enunciativa SHSY-5Y, SHSY-S, y SK-N-AS) se utilizan en los métodos de manipulación bioquímica y de manipulación bioquímica/CLQ de la invención. En modalidades adicionales, las células para utilizarse en los métodos de manipulación bioquímica y de manipulación bioquímica/CLQ de la presente invención se derivan de animales afligidos con gangliosidosis, por ejemplo, humanos, gatos o perros afligidos con gangliosidosis por GM1, gangliosidosis por GM2, o ambas. En modalidades adicionales, las células de médula ósea y fibroblastos provenientes de humanos, ovejas, gatos o perros afligidos con gangliosidosis se utilizan en los métodos de manipulación bioquímica y de manipulación bioquímica/CLQ de la presente invención. En modalidades, el fibroblasto es un fibroblasto GM1.

En modalidades, cada tipo celular utilizado en los métodos de manipulación bioquímica y de manipulación bioquímica/CLQ de la invención se cultivan bajo los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de 02 descritos con mayor detalle más adelante antes y/o durante y/o después de la manipulación bioquímica.

En ciertas modalidades, las células PC12, células HT22, células cerebrales provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis, y células de fibroblastos provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis no se utilizan en los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ de la invención.

En ciertas modalidades, las células derivadas de la fuente deseada se cultivan en medio de crecimiento estándar, por ejemplo, alfa-MEM suplementado con suero, por ejemplo, 10¾ de FBS, adicionalmente suplementado con 1 hasta 4 mM de glutamina bajo condiciones de sembrado estándar, MEM/F-12 suplementado con 10% de FBS; EMEM/F-12 suplementado con 1¾ de aminoácidos no esenciales ("NEAA") , L-glutamina 2mM y 15% de FBS; DMEM suplementado con NEAA 0.1 m y 10¾ de FBS; F-12K suplementado con 10% de FBS; EMEM suplementado con 10¾ de FBS; medio basal Lonza MSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza ADSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza de fibroblastos con suplementos; o EMEM suplementado con 15% de FBS, por ejemplo, 2, 000 hasta 20, 000 células/crrr, y de preferencia 8,000 células/cm2, a 37°C en una incubadora humidificada bajo condiciones atmosféricas estándar (5% de CO ) . En una modalidad adicional, la cantidad de gangliósidos , por ejemplo, GM1 , en el cultivo celular se cuantifica utilizando los métodos de la presente invención. Los gangliósidos, por ejemplo, GM1, también se pueden aislar y purificar del cultivo celular utilizando métodos estándar, tales como aquellos descritos más adelante.

En modalidades adicionales de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de todos los gangliósidos. En una modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de GM1. En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de GM2.

En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de GM3. En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de GDla. En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de GDlb. En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de GD3. En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y de manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de GT1.

En otra modalidad, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de dos o más gangliósidos . En una modalidad adicional, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de tres o más gangliósidos. En una modalidad adicional, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de cuatro o más gangliósidos. En una modalidad adicional, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ aumentan la acumulación de cinco o más gangliósidos.

En una modalidad adicional de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ dan por resultado en 10 hasta 200 por ciento o aproximadamente 10 hasta 200 por ciento más acumulación de gangliósidos en una célula en comparación con una célula que no se haya manipulado bioquímicamente y manipulado bioquímicamente/ tratado con CLQ. En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ dan por resultado en 15 hasta 125 por ciento o aproximadamente 15 hasta 125 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya manipulado bioquímicamente y manipulado bioquímicamente/ tratado con CLQ. En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ dan por resultado en 30 hasta 100 por ciento o aproximadamente 30 hasta 100 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya manipulado bioquímicamente y manipulado bioquímicamente/tratado con CLQ. En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ dan por resultado en 60 hasta 80 por ciento o aproximadamente 60 hasta 80 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya manipulado bioquímicamente y manipulado bioquímicamente/tratado con CLQ. En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquimica/CLQ dan por resultado en 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento o aproximadamente 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya manipulado bioquímicamente y manipulado bioquímicamente/tratado con CLQ. En otra modalidad de la invención, los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquimica/CLQ dan por resultado en 65 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya manipulado bioquímicamente y manipulado bioquímicamente/tratado con CLQ.

La invención proporciona además un gangliósido producido mediante los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquimica/CLQ de la invención.

La invención proporciona además los métodos para tratar a un sujeto que tenga una enfermedad o trastorno que necesite de este tratamiento al administrar un gangliósido, por ejemplo, GMl, producido mediante los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquimica/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga una lesión neuronal se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GMl, producido mediante los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquimica/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Parkinson se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Alzheimer se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, G 1, producido mediante los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ de la invención. En modalidades, en un sujeto que haya tenido o esté teniendo una apoplejía se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga el síndrome de Guillain-Barré se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga cáncer se trata mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ de la invención.

Cultivo celular a largo plazo sin tratamiento químico y sin subcultivo La invención proporciona además los métodos para producir gangliósidos, por ejemplo, GM1, mediante el cultivo de células sin subcultivo y sin medios de inducción neuronal, cloroquina, o tratamiento con neuraminidasa. Se ha encontrado, sorprendentemente, que las células cultivadas a alta densidad, por ejemplo, a 60-90% de confluencia en el momento del sembrado, o de preferencia 70-80% de confluencia en el momento del sembrado, por largo plazo permanecen viables y acumulan gangliósidos, por ejemplo, GM1, en cantidades significativas. En modalidades adicionales, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención se combinan con los tratamientos químicos y/o bioquímicos descritos anteriormente. Por ejemplo, las células cultivadas con NIM/CLQ luego se someten a cultivo de alta densidad-largo plazo sin subcultivo, o las células tratadas con CLQ y/o neuraminidasa y/o glucosamina se cultivan a alta densidad durante largo plazo sin subcultivo o las células se cultivan a alta densidad a largo plazo y sin subcultivo y luego se tratan con NIM/CLQ, CLQ, neuraminidasa y/o glucosamina .

Las fuentes de células para utilizarse en los métodos de cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención incluyen, de manera enunciativa, humanas, de oveja, conejo, ratón, cobaya, caballo, cerdo, gato y perro. En modalidades de la invención, los fibroblastos y células estromales , por ejemplo, células derivadas de médula ósea y tejido adiposo; y fibroblastos, por ejemplo, fibroblastos GM1 y fibroblastos dérmicos, provenientes de fuentes animales, que incluyen de manera enunciativa las fuentes animales mencionadas anteriormente se pueden utilizar en los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención. Los métodos ilustrativos para aislar células de fuentes animales se describen con mayor detalle más adelante. En modalidades, las células de médula ósea humana, producidas mediante los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de oxigeno descritos más adelante se utilizan en los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención para inducir la producción de gangliósidos, por ejemplo, GM1.

En modalidades adicionales, las células de neuroblastoma provenientes de fuentes animales, que incluyen de manera enunciativa las fuentes animales mencionadas anteriormente, que incluye lineas celulares humanas y de neuroblastoma (que incluyen de manera enunciativa SHSY-5Y, SHSY-S, y SK-N-AS) se utilizan en los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención.

En modalidades adicionales de la invención, las células inmortalizadas, por ejemplo, células de CHO y células renales embrionarias humanas, por ejemplo, células de CH0-K1 y células HEK293, se utilizan en los métodos de manipulación bioquímica y manipulación bioquímica/CLQ de esta invención. En modalidades adicionales, las células de neurob] astoma aisladas a parti r de fuentes animales, que incluyen de manera enunciativa las fuentes animales citadas anteriormente, que incluyen líneas celulares humanas y de neuroblastoma (que incluyen de manera enunciativa SHSY-5Y, SHSY-S, y SK-N-AS) se utilizan en los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención. En modalidades adicionales, las células para utilizarse en los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención se derivan de animales afligidos con gangliosidosis, por ejemplo, humanos, gatos o perros afligidos con gangliosidosis por GM1, gangliosidosis por GM2, o ambas. En modalidades adicionales, las células de médula ósea y fibroblastos provenientes de humanos, ovejas, gatos o perros afligidos con gangliosidosis se utilizan en los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención. En modalidades, el fibroblasto es un fibroblasto GM1.

En modalidades, cada tipo celular utilizado en los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención se cultiva bajo los métodos para cultivo de baja densidad/bajo contenido de 02 descritos con mayor detalle más adelante antes y/o durante y/o después del cultivo en los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención .

En modalidades, las células PC12, las células HT22, células cerebrales provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis, y células de fibroblastos provenientes de una oveja afligida con gangliosidosis no se utilizan en los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención .

En estos métodos, las células se mantienen para acumular gangliósidos, por ejemplo, GM1, y el medio de cultivo se reemplaza, o se agrega medio de cultivo adicional, según sea necesario para mantener la viabilidad celular. En modalidades, las células se cultivan en medio de crecimiento estándar, tal como alfa-MEM suplementado con 10¾ de FBS, MEM/F-12 suplementado con 10% de FBS; EMEM/F-12 suplementado con 1% de aminoácidos no esenciales ("NEAA") , L-glutamina 2mM y 15a FBS.; DMEM suplementado con NEAA 0.1 mM y 10% de FBS; F-12 suplementado con 10% de FBS: EMEM suplementado con 10¾ de FBS; medio basal Lonza MSG suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza ADSC suplementado con suplementos de crecimiento; medio basal Lonza de fibroblastos con suplementos; o EMEM complementado con FBS al 15%, durante 4 dias a 4 semanas, 6 días a 2 semanas, o 9 días y 12 días a aproximadamente 37 °C en una incubadora humidificado bajo condiciones atmosféricas con 5% de CO?. En una modalidad ilustrativa, el medio se cambia cada 3 días para mantener la viabilidad celular.

Las células preferidas para utilizarse en esta modalidad de la invención incluyen células derivados de médula ósea y cerebro. Las células derivadas de médula ósea y cerebro preferidas incluyen células aisladas de oveja y humano utilizando las condiciones de baja densidad/bajo contenido de oxígeno descritas más adelante. De preferencia, las células se derivan de ovejas o humanos afligidos con gangliosidosis . Los tipos celulares adicionales para utilizarse en esta modalidad de la invención incluyen células inmortalizadas, células estromales, y fibroblastos. Los tipos celulares adicionales incluyen células de neuroblastomas , por ejemplo, células primarias o líneas celulares, que incluyen de manera enunciativa SHSY-5Y, SHSY-S, y S-N-AS. En modalidades, después del cultivo a alta densidad, a largo plazo, las células se recolectan y los gangliósidos, por ejemplo, GM1, se aislan y purifican de las células. En modalidades, la cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en las células se cuantifica utilizando los métodos de la invención .

En modalidades adicionales de la invención, los métodos para cultivo a alta densidad, a largo plazo aumentan la acumulación de todos los gangliósidos . En una modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de GM1. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de GM2. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de GM3. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de GDla. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de GDlb. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de GD3. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de GT1.

En otra modalidad, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de dos o más gangliósidos. En una modalidad adicional, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de tres o más gangliósidos . En una modalidad adicional, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de cuatro o más gangliósidos. En una modalidad adicional, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo de la invención aumentan la acumulación de cinco o más gangliósidos.

En modalidades adicionales de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo dan por resultado en 10 hasta 200 por ciento o aproximadamente 10 hasta 200 por ciento más acumulación de gangliósidos en una célula en comparación con una célula que no se haya cultivado bajo condiciones para cultivo a alta densidad, a largo plazo. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo dan por resultado en 15 hasta 125 por ciento o aproximadamente 15 hasta 125 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya cultivado bajo condiciones para cultivo a alta densidad, a largo plazo. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo dan por resultado en 30 hasta 100 por ciento o aproximadamente 30 hasta 100 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya cultivado bajo condiciones para cultivo a alta densidad, a largo plazo. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo dan por resultado en 60 hasta 80 por ciento o aproximadamente 60 hasta 80 por ciento más acumulación de gangliósidos gue una célula que no se haya cultivado bajo condiciones para cultivo a alta densidad, a largo plazo. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo dan por resultado en 15, 19, 28, 63,- 65, 83, 104, y 119 por ciento o aproximadamente 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya cultivado bajo condiciones para cultivo a alta densidad, a largo plazo. En otra modalidad de la invención, los métodos para cultivo de alta densidad, a largo plazo dan por resultado en 65 por ciento más acumulación de gangliósidos que una célula que no se haya cultivado bajo condiciones para cultivo a alta densidad, a largo plazo.

La invención proporciona además un gangliósido producido mediante los métodos para cultivo a largo plazo de la invención.

La invención proporciona además los métodos para tratar de un sujeto que tenga una enfermedad o un trastorno que necesite tratamiento mediante la administración de un gangliósido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos para cultivo a largo plazo de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga lesión neuronal se trata mediante la administración de un gangliosido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos para cultivo a largo plazo de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Parkinson se trata mediante la administración de un gangliosido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos para cultivo a largo plazo de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga la enfermedad de Alzheimer se trata mediante la administración de un gangliosido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos para cultivo a largo plazo de la invención. En modalidades, un sujeto que ha tenido o tiene apoplejía se trata mediante la administración de un gangliosido, por ejemplo, GM1, producido mediante los métodos para cultivo a largo plazo de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga el síndrome de Guillain-Barré se trata mediante la administración de un gangliosido, por ejemplo, GMl, producido mediante los métodos para cultivo a largo plazo de la invención. En modalidades, un sujeto que tenga cáncer se trata mediante la administración de un gangliosido, por ejemplo, GMl, producido mediante los métodos para cultivo a largo plazo de la invención.

Gangliósidos producidos mediante los métodos de la invención y sus métodos de uso La invención proporciona gangliósidos producidos mediante los métodos de la invención. Estos gangliósidos incluyen, de manera enunciativa GM1, GM2, GM3, GDla, GDlb, GD3, y GTl. Los gangliósidos producidos mediante la invención difieren de los gangliósidos producidos mediante métodos anteriores .

Los gangliósidos existen como una mezcla muy compleja de especies que difieren tanto en las porciones hidrofilicas como hidrofóbicas . Sonnino and Chigorno, Biochim Biophys Acta 1469:63-77 (2000), incorporada como referencia en su totalidad. Los gangliósidos consisten de una porción de lipidos ligada a una familia muy grande de estructuras de oligosacáridos que difieren en la posición de ligadura glucosidica, la confirmación azúcares, el contenido de azúcares neutros y ácido siálico. Por ejemplo, los gangliósidos GM1 disponibles comercialmente exhiben variaciones en la base de cadena larga. Véanse el Ejemplo 13 y la Tabla 5. Por consiguiente, existen variaciones en la estructura incluso entre los gangliósidos caracterizados como el mismo gangliósido, por ejemplo, "GM1". Además, la composición de gangliósidos difiere entre especies y cambia con la edad. Ikeda, et al . r J Lipid Res. 49:2678-2689 (2008); Masserini and Freiré, Biochem. 25:1043-1049 (1986); Taketomi et al., Acta Biochim. Pol. 45:987-999, cada una de las mismas se incorpora como referencia en su totalidad. Por ejemplo, el GM1 natural es una mezcla heterogénea que contiene principalmente bases de cadena larga C18:l y C20:l. Id. En seres humanos, la composición de GM1 cambia a través del tiempo. Taketomi et al., Acta Biochim. Pol. 45:987-999, incorporada como referencia en su totalidad. Más específicamente, la proporción de d20:l (icosasfingosina) y d20 ( icosasfinganina) de las bases totales de esfingosina aumenta rápidamente hasta la edad adolescente o adulta y luego permanece constante a aproximadamente 50%; este valor fue mayor que la proporción de d20:l y d20 de GM1 en diversos cerebros de mamíferos adultos. Id.

En modalidades, la invención proporciona un gangliósido producido mediante los métodos de la invención.

En modalidades adicionales, la invención proporciona los métodos para tratamiento de un sujeto que necesita del tratamiento que tenga una enfermedad o trastorno mediante la administración de un gangliósido producido mediante los métodos de la presente invención. La enfermedad o trastornos ilustrativos incluyen, de manera enunciativa lesión neuronal, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, síndrome de Guillain-Barre, y cáncer.

Estas composiciones se pueden administrar mediante un modo parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, o intramuscular) . Las frases "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" en el sentido en el que se utiliza en la presente, significan los modos de administración distintos a la administración enteral y tópica, por lo general mediante inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal , subcutánea, subcuticula , intra-articular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal , epidural y intrasternal .

Los términos "tratar" o "tratamiento" cuando se utiliza en el contexto del uso de los gangliósidos producidos por la invención, incluye de manera enunciativa tratamiento terapéutico y mediciones profilácticas y preventivas, en donde el objetivo es prevenir o disminuir (aminorar) un cambio fisiológico no deseado o trastorno, tal como el desarrollo de la enfermedad de Parkinson. Los resultado clínicos benéficos o deseados incluyen, de manera enunciativa, alivio de los síntomas, disminución del grado de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeorar) de la enfermedad, retraso o disminución del progreso de la enfermedad, mejora o paliación del estado de enfermedad, y remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o indetectable . "Tratamiento" en este contexto también puede significar la prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos con necesidad de tratamiento incluyen aquellos que ya tengan la condición trastorno asi como aquellos que estén propensos a tener la condición o trastorno o aquellos en los cuales será prevenida la manifestación de la condición o trastorno .

Adicionalmente, el término "tratamiento" cuando se utiliza en el contexto del cultivo celular, incluye de manera enunciativa la administración o aplicación de células cultivadas a un fármaco, productos químicos, técnica, terapia y/o método específicos.

Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero", se debe entender cualquier sujeto, en particular un sujeto mamífero, por ejemplo, un paciente humano, para quien se desea un diagnóstico, pronóstico, prevención, o terapia.

Métodos para producir las células para utilizarse en los métodos de la invención Como se observó anteriormente, en modalidades, las células se utilizan en los métodos de la invención. En estas modalidades, las células se pueden obtener mediante cultivo bajo condiciones de bajo contenido de oxigeno, baja densidad. Estos métodos se conocen en la técnica, y se describen en, por ejemplo, las publicaciones de los Estados Unidos Nos. 2003/0059414, 2007/0224177 y 2009/0053183 (patentada como la patente de los Estados Unidos No. 8,354,370 B2), cada una de las mismas se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. En una modalidad, las células derivadas de médula ósea se utilizan en los métodos de la invención. En esta modalidad, las células derivadas de médula ósea se pueden obtener mediante cultivo bajo condiciones de bajo contenido de oxigeno, baja densidad.

En una modalidad ilustrativa, los aspirados de médula ósea entera se obtienen de ovejas o un ser humano y se cultivan en contacto con una fase sólida. Por ejemplo, las células de médula ósea humana se obtienen de donadores humanos sanos mediante aspiraciones de la cresta iliaca y las poblaciones de células estromales de médula ósea obtenidas empleando técnicas bien establecidas. Si se desea, el aspirado de médula ósea se puede procesar para producir una fracción de células mononucleares que luego se cultiva en contacto con una fase sólida. La fase sólida puede ser, por ejemplo, plástico (por ejemplo, plásticos tratados con cultivo de tejidos).

La fracción de células mononucleares se puede obtener a partir de un aspirado de médula ósea entera o en un gradiente de densidad mediante procedimientos establecidos. Alternativamente, la fracción de células mononucleares se obtiene mediante la lisis de los glóbulos rojos contenidos en el aspirado de médula ósea. La lisis se lleva a cabo mediante el mezclando del aspirado de médula ósea con cloruro de amonio .

El aspirado de médula ósea, o una fracción celular del aspirado de médula ósea, se cultiva en contacto con una fase sólida y una población celular intermedia se aisla del cultivo celular resultante con base de su propensión a adherirse a la fase sólida. Los aspirados de médula ósea, o una fracción celular del aspirado, se cultivan a una concentración de oxigeno disuelto menor de aproximadamente 20¾, de preferencia entre aproximadamente 1% hasta aproximadamente 10%, y de mayor preferencia entre aproximadamente 2% de oxigeno hasta aproximadamente 7¾ de oxigeno. En una modalidad preferida, la concentración de oxigeno disuelto es aproximadamente 5% de oxigeno. La población de células adherentes resultantes se expande para proporcionar una población de células sustancialmente homogénea gue co-expresan CD49c y CD90.

La expansión de células de médula ósea se cnduce con una densidad de sembrado de menor de aproximadamente 2500 células/cnr, de preferencia menor de aproximadamente 1000 células/cnr, y de mayor preferencia menor de aproximadamente 100 células/cnr. En una modalidad particular, la densidad celular inicial en la etapa de expansión es entre aproximadamente 30 células/cm2 hasta aproximadamente 50 células/cnr, una densidad de sembrado podría ser el número de células adherentes por cm2 obtenidas de las células mononucleares de médula ósea.

Se pueden utilizar preparaciones de medios estándar para cultivar las células de la médula ósea. Por ejemplo, los medios pueden ser modificación de alfa-MEM suplementario con L-glutamina 4 mM y 0 hasta 10% de lote seleccionado de FBS, de preferencia aproximadamente 10% de FBS. El paso de cultivo se puede conducir durante cualquier período razonable, por ejemplo, entre aproximadamente 3 hasta aproximadamente 25 días y de mayor preferencia entre aproximadamente 3 hasta aproximadamente 15 días.

Una población de células intermedias se aisla del cultivo celular descrito anteriormente con base en su propensión a adherirse a la fase sólida. La población de células intermedias se hace crecer a una concentración celular que favorezca virtualmente sólo las células auto- renovadoras, denominadas en la presente como células similares a fibroblastos de la unidad formador de colonias (CFU-F), para proliferar. Las células derivadas de CFU-F se sub-cultivan bajo condiciones definidas para producir una población de células sustancialmente homogénea. De acuerdo con la invención, los rendimientos de la expansión proporciona una población de células sustancialmente homogénea que co-expresan CD49c y CD90.

Métodos para aislar células derivadas de cerebro de oveja para utilizarse en los métodos de la invención Como se analizó anteriormente, en modalidades, las células derivadas de cerebro de oveja se utilizan en los métodos de la invención. Por ejemplo, en algunas modalidades, las células obtenidas de cerebro de oveja se cultivan utilizando los métodos para cultivo a largo plazo, a alta densidad de la presente invención. Como se observó anteriormente, en algunas modalidades, las células obtenidas de cerebro de oveja se aislan de ovejas afligidas con gangliosidosis . Se han descrito anteriormente ovejas afligidas con gangliosidosis, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 5,532,141, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Los métodos de aislamiento y cultivo de las células obtenida de cerebro de oveja se describen en la técnica, por ejemplo, en la solicitud internacional No. PCT/US2010/047522, publicada como la WO 2011/028795, que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.

En una modalidad ilustrativa, las células se aislan de las siguientes fuentes de tejidos de cerebro de oveja: centro semioval, corteza cerebelosa, hipocampo, núcleo caudado, corteza cerebral (por ejemplo, frontal, parietal) , y paredes ventriculares . Cada tipo de tejido se enjuaga con tampón PIPES, y se digiere en papaina/DNasa I/Dispasa (proteasa neutra) con antibióticos/antimicóticos. Las enzimas se neutralizan y las células disociadas se hacen pasar a través de un tamiz celular. Las células se sometieron a centrifugaron y se re-suspendieron en DMEM/F12/N2 suplementado con 5% de FBS y antibióticos/antimicóticos. Las células se numeraron y sembraron en matraces recubiertos con fibronectina en DMEM/F12/N2 suplementado con 5% de SFB y antibióticos/antimicóticos y, adicionaluiente, suplementados con 10 ng/ml de bFGF y EGF 20 ng/ml o medio de proli feración-A Neurocult. Las células en cada tipo de medio se hicieron crecer en una incubadora humidificada a 37°C. En modalidades, las células se hicieron crecer en condiciones de bajo contenido de oxigeno, por ejemplo, 20% o menos, 15% o menos, 10", o menos, y de preferencia 4% o 5% de oxigeno, antes de utilizar los métodos de la invención.

Métodos para aislar gangliósidos de las células La extracción y purificación de gangliósidos provenientes de los cultivos celulares de la presente invención se lleva a cabo mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, someter a ultrasonido el sedimento celular en una cantidad mínima de agua durante 30 minutos para homogeneizar . Diluir la muestra a 20 volúmenes en 2:1 cloroformo : metanol . Someter a ultrasonido durante 30 minutos. Centrifugar a 2000 rpm durante 15 minutos para sedimentar el material celular. Decantar y guardar el sobrenadante. Suspender el sedimento en 10 volúmenes de 2:1 cloroformo : metanol gue contiene 5% de agua. Someter a ultrasonido durante 30 minutos. Centrifugar y decantar como anteriormente. Combinar los sobrenadantes. La adición repetida de cloroformo ¡metanol, ultrasonido y centrifugación 2-3 veces adicionales para extraer totalmente todos los gangliósidos. La basta mayoría de los gangliósidos se debe extraer en los primeros dos ciclos de extracción. A los sobrenadantes combinados agregar 0.2 volúmenes de KC1 o NaCl 0.1 N. Mezclar bien. Someter a centrifugación a 2000 rpm durante 15 minutos para separar las capas. Guardar la capa superior. A la capa (inferior) orgánica restante, agregar 0.2 volúmenes de 1:1: metanol de KCl o NaCl 0.1 N. Mezclar bien. Repetir los pasos de adición de KCl o NaCl, centrifugación, y extracción. A la capa (inferior) orgánica restante, agregar 0.2 volúmenes de 1:1 metano: agua. Combinar las capas superiores guardadas y concentrar. El extracto resultante contiene una mezcla de gangliósidos . La especie de interés luego se puede aislar adicionalmentc utilizando cromatografía en columna, por ejemplo, sefarosa o toxina B de cólera.

Cuantificar la cantidad de gangliósidos en el cultivo celular La invención también proporciona los métodos para cuantificar la cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en el cultivo celular después de practicar los métodos para producción de gangliósidos de la presente invención. Por consiguiente, la invención proporciona los métodos para producir una curva estándar para gangliósidos a base de placas, por ejemplo, GM1, la cuantificación contra la cual comparar las muestras.

En algunas modalidades, la curva estándar se genera al preparar diluciones de gangliósidos, por ejemplo, GMl, tal como GMl de ovejas o humano y agregar las diluciones a una placa ELISA, tal como una placa Nunc MaxiSorp®. Las placas se incuban para permitir la adsorción de los gangliósidos, por ejemplo, GM1, a las placas, por ejemplo, durante 8 hasta 24 horas, y de preferencia 12 hasta 16 horas a 4°C. Después de la incubación, las placas se lavan y se bloquean, y los gangliósidos, por ejemplo, GM1, se ponen en contacto con CTB, que se conjuga con un tinte o a una enzima que genera un producto final de color con la puesta en contacto de su sustrato. Después de la puesta en contacto con el conjugado CTB, se mide la luz emitida o absorbida por el tinte o el producto final de color, en donde las lecturas indican la cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, en el gangliósido purificado, por ejemplo, GM1, que recubre la placa. En una modalidad, la absorbancia se lee en un lector de placas estándar. Se genera una curva estándar a partir de los datos de absorbancia, contra los cuales se compararon los datos de prueba.

Posteriormente la curva estándar se utiliza para comparar las lecturas de los pocilios de prueba para cuantificar la cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, acumulados en las células o, en modalidades, la cantidad de gangliósidos, por ejemplo, GM1, después de la solubili zación . En una modalidad ilustrativa, los pocilios de prueba contienen células que contienen gangliósidos adherentes, que se lavan y bloquean de la misma forma que la placa de muestra anterior. Las células adherentes se ponen en contacto con CTB, que está conjugado con un tinte o una enzima que genera un producto final de color en contacto con su sustrato. Se mide y se compara la luz emitida o absorbida por el tinte o el producto final de color con la curva estándar para determinar la cantidad de acumulación de gangliósidos en las células adherentes. Después de que se completa esta lectura, los gangliósidos se pueden solubilizar utilizando, por ejemplo, 1% de SDS en PBS, y las placas se vuelven a leer sobre el lector de placas. Los gangliósidos se pueden unir a otras moléculas en las células, haciendo que el sitio de unión a CTB sea inaccesible a los agentes de detección, CTB-HRP o CTB-Alexa488, por ejemplo. La solubilización libera el gangliósido unido o agregado para proporcionar un valor adicional de cuantificación .

En modalidades, los tintes preferidos son tintes fluorescentes, tales como tintes fluorescentes verdes, en modalidades, el tinte es FITC o Alexa488. En modalidades adicionales, la enzima que se conjugó con CTB es peroxidasa de rábano picante ("HRB") . En el caso de un conjugado CTB-HRP, el reactivo ABTS se pone en contacto con las células adherentes para crear un producto de color y se mide la absorbancia del producto de color.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Un matraz para cultivo de tejidos T-225 (Corning, Cat #431081) se sembró con las células derivadas de medula óseas de oveja (subcultivo 1 ó 2) en medio de crecimiento alfa-MEM (con 10% de FBS) a una densidad de 8000 células/cm'.

A la mañana siguiente, el medio se reemplazó con 30 mi de medio de inducción neuronal (NIM) : medio neurobasal + suplemento B27 con ácido retinoico, EGF (25 ug/ml) y FGF (10 ng/ml ) .

Durante la noche, se agregó al matraz cloroquina 50 uM. Se observó una muerte celular de aproximadamente el 70¾ al 3'': día. Las células flotantes se retiraron del matraz mediante enjuague con PBS . Las células se trataron con tripsina y se recolectaron las células supervivientes. Las células se centrifugaron y re-suspendieron en medio de crecimiento recién preparado. Un matraz nuevo se sembró a 8, 000 células/cm2. Se retiró una alícuota y se colocó en placas en una placa de 24 pocilios para confirmar la inducción de GM1 mediante tinción con la toxina de cólera conjugada con Alexa488. En comparación con las células no tratadas (control), SB tratados con NIM/CLQ (48h CQ en NIM) tuvieron una tinción mucho más fuerte para GM1, como se muestra en las figura 1A y IB.

Se dejaron expandir las células supervivientes en el matraz durante 2 días, y las células luego se recolectaron .

Alternativamente, las células supervivientes se pueden tratar por segunda vez con CLQ 50 um durante 24 h antes de la recolección.

Ejemplo 2 Se sembraron células de médula ósea humanas de adulto en matraces para cultivo de tejidos estándar a una densidad de sembrado de 8000 células/cm: en medio de crecimiento alfa-MEM (con 10% de FBS) .

Al siguiente día, el medio se reemplazó, si es necesario, y se agregó al matraz CLQ 50 um. Las células se recolectaron después de 48 h. Se observó una muerte celular de aproximadamente el 10-20%. Las células fijadas se tiñeron con CTB-Alexa488 para visualizar los niveles de GMl. En comparación con el panel superior (control) , las células tratadas con CLQ (panel inferior) mostraron una acumulación significativamente superior de GMl.

Ejemplo 3 El objetivo de este ejemplo fue sobre-regular la expresión de GMl en la linea celular de neuroblastomas humanos, SHSY-5Y, las células derivadas de médula ósea de oveja (SBM) y células derivadas de médula ósea humana (HBM) .

En un estudio, las células SHSY-5Y, SBM y HBM se sembraron en medios de crecimiento con 10% de suero en placas de 24 pocilios. El siguiente día, las células se sometieron a 3 diferentes regímenes de tratamiento o se dejaron en los medio de crecimiento (AMEM con 10% de FBS) : medio libre de suero (SFM) ; medio de inducción neuronal (NIM) ; cloroquina (CLQ) 50 uM.

Después de 48 horas, se agregaron 10 ul de tinte Alamar Blue a los pocilios y se incubaron durante 1 hora. Utilizando un lector de placas se midió la absorbancia de Alamar Blue. Las placas luego se lavaron, se fijaron y procesaron para tinción de GM1 utilizando CTB-HRP. Los valores de CTB-HRP se normalizaron a los valores de Alamar Blue, que son indicativos de las células supervivientes.

Como se muestra en la figura 3, los 3 tipos celulares mostraron alguna sobre-regulación de la expresión de GM1 en el NIM (comparar el control con NIM) . Las células SHSY-5Y mostraron aproximadamente una inducción doble en NIM, mientras que las SBMC mostraron una inducción de aproximadamente 4 veces. La sobre-regulación más dramática de la expresión de GM1, aproximadamente 8 veces, se observó con el tratamiento con CLQ de las HBMC (comparar el control con C1Q para HBM) (véase la figura 3) .

En una serie de estudios SHSY-5Y, las células derivadas de médula ósea de ovejas y derivadas de médula ósea humana, se trataron con los compuestos que se sabe afectan los ciclos de los gangliósidos . La cloroquina es un agente acidotrópico que perturba el tráfico membranoso desde los endosomas hacia los lisosomas. A23187 es un ionóforo de calcio que estimula la secreción de exosomas después del tratamiento con CLQ. La N-acetilglucosamina activa el ciclo de hexosamina, lo que proporciona los intermediarios para la síntesis de glucoconjugados . El cambio a galactosa como una fuente de carbohidratos puede modificar la composición de los gangliósidos. Debido a que las neuronas expresan mayores niveles de GM1 en comparación con otros tipos celulares, las células se impulsaron hacia un fenotipo neuronal mediante el tratamiento con compuestos y medios que se sabe inducen diferenciación neuronal (NIM) .

Las células SHSY-5Y se sembradas a 10,000 células/pocilio en placas de 24 pocilios y se trataron de acuerdo con las condiciones listadas en la Tabla 1 más adelante. Después del tratamiento, las células se fijaron y tiñeron con CTB-Alexa 488 para detectar el GM1. Se observaron y resumieron la intensidad de la tinción, la cantidad de muerte celular y otras observaciones. Los resultados se presentan en la Tabla 1. El tratamiento de SHSY-5Y con medio NIM2 produjo la tinción más intensa (cinco signos "mas") y ninguna muerte celular (un signo "menos") . Los tratamientos con glucosamina y CLQ más A23187, un ionóforo de calcio, también dieron por resultado en una fuerte inducción de GM1 (cuatro signos "mas") con algo de muerte celular en el grupo CLQ más A23187. La CLQ sola mostró más tinción que las células tratadas con control.

Tabla 1: Inducción de GM1 en células SHSY-5Y mediante diferentes condiciones de tratamiento Las células de médula ósea de ovejas (SBM) afectadas se sembraron a 20, 000 células/pocilio en placas de 24 pocilios y se trataron de acuerdo a las condiciones listadas en la Tabla 2 más adelante. Después del tratamiento, las células se fijaron y se tiñeron con CTB-Alexa488 para detectar el GM1. Se observaron y resumieron la intensidad de la tinción, la cantidad de muerte celular y otras observaciones. En la Tabla 2 se presentan los resultados. El tratamiento de las células de SBM con CLQ en medio NIM produjo la tinción más intensa (cuatro signos "mas") y la mayoría de células murieron (tres signos "mas") . La CLQ sola también indujo GM1, aunque no tanto como CLQ/NIM. Otras condiciones, medios libres de suero, medios NIM (1), glucosamina y PDGF también indujeron GM1, aunque a un menor grado .

Tabla 2: Inducción de GM1 en células de médula ósea de ovejas afectadas por diferentes tratamientos Las células de médula ósea humana (HBM) se sembraron a 20,000 células/pocilio en placas de 24 pocilios y se trataron de acuerdo a las condiciones listadas en la Tabla 3 más adelante. Después del tratamiento, las células se fijaron y se tiñeron con CTB-Alexa488 para detectar el GM1. Se observaron y resumieron la intensidad de la tinción, la cantidad de muerte celular y otras observaciones. En la Tabla 3 se presentan los resultados. El tratamiento de las células de HBM con CLQ produjo la tinción más intensa (cinco signos "mas") y algo de muerte celular (dos signos "mas") . A diferencia de la SBM, el tratamiento con NIM-CLQ da por resultado en la muerte de la mayoría de las células. Los medio libres de suero también indujeron GMl, aunque no tanto como CLQ.

Tabla 3: Inducción de GMl en células derivadas de médula ósea humana mediante diferentes tratamientos Ejemplo 4 Células de neuroblastoma Neuro2A de ratón se cultivaron en medio de crecimiento estándar (DMEM F12 con alto contenido de glucosa, glutamina 2 mM, HEPES 25 mM más 10¾ de SFB) . Las células se mantuvieron en medios de cultivo estándar (Ctrl) o se trataron durante 3 horas con neuraminidasa, 1 unidad/ml (tratadas). Las células se fijaron con 2¾ de paraformaldehído y se tiñeron con CTB-Alexa488 para detectar el gangliósido GM1. En los paneles A y C de la figura 4, se muestran las imágenes de campo claro de cultivos celulares antes de la fijación. En los paneles B y D de la figura 4 se muestran las imágenes fluorescentes que muestran una tinción GM1 positiva. La tinción de GM1 es dramáticamente más fuerte en células Neuro-2A de ratón después del tratamiento con neuraminidasa (comparar el panel B hasta D) .

Ejemplo 5 Se cultivaron hABM-SC en medios de crecimiento estándar (AMEM, 10% de FBS, glutamina 2 mM) . Las células se mantuvieron en medio de cultivo estándar (control) o se trataron durante 3 horas con neuraminidasa, 1 unidad/ml (tratadas). Las células se fijaron con 2% de paraformaldehido y se tiñeron con CTB-Alexa488 para detectar el gangliósido GM1. En la figura 5 se muestran las imágenes fluorescentes que muestran la tinción GM1 positiva. GM1 es más abundante en hABM-SC después del tratamiento con neuraminidasa y, con frecuencia se observa como agregados grandes.

Ejemplo 6 Se colocaron en placas células de neuroblastoma Neuro2A de ratón a una alta densidad, mayor de 40, 000/cm', y se cultivaron en medios de crecimiento estándar (DMEM F12 con alto contenido de glucosa, glutamina 2 mM, HEPES 25 mM, más 10% de FBS) . Las células se mantuvieron en medio de cultivo estándar (Ctrl) durante 3 ó 9 días. El medio se cambió cada 3 días. Las células se fijaron con paraformaldehido al 2% y se tiñeron con CTB-Alexa488 para detectar el gangliósido GM1. En los paneles A y C se muestran imágenes de campo claro de cultivos celulares antes de la fijación. En los paneles B y D de la figura 6 se muestran imágenes fluorescentes que muestran la tinción GM1 positiva. La acumulación de GM1 extensiva es evidente en células Neuro2A de ratón mantenidas en cultivo a alta densidad durante largo plazo en comparación con niveles básales de GMl en células mantenidas en cultivo a una densidad menor durante 3 días o menos (comparar el panel B a D de la figura 6) .

Ejemplo 7 Se cultivaron células derivadas de cerebro de oveja en medios de crecimiento estándar (AMEM, 10¾ de FBS, glutamina 2 mM) . Las células se mantuvieron en medio de cultivo estándar durante 3 ó 9 días. El medio se cambió cada 3 días. Las células se fijaron con paraformaldehido al 2¾ y se tiñeron con CTB-Alexa488 para detectar el gangliósido GMl.

En los paneles B y D de la figura 7 se muestran imágenes fluorescentes que muestran la tinción GM1 positiva. La acumulación de GM1 extensiva es evidente en células derivadas de cerebro de oveja mantenidas en cultivo a alta densidad durante largo plazo en comparación con los niveles básales de GM1 en células mantenidas en cultivo a una densidad menor durante 3 días o menos (comparar el panel B a D en la figura 7) .

Ejemplo 8 Se prepararon y agregaron diluciones de GM1 ovino purificado (100 µ? de cada dilución) a placas Nunc maxisorp. Las placas se incubaron durante la noche a 4°C. Al siguiente día las placas se lavaron y se bloquearon. Se agregó CTB-HRP (75 ul por pocilio, 1:4000) y las placas se incubaron durante 1 hora a RT en la oscuridad. Las placas se lavaron y luego se agregó un reactivo 7ABTS (100 µ? por pocilio) . Se dejó desarrollar un color verde. La reacción se detuvo con 66 ul de solución de paro (SDS al 0.1% en PBS) . La señal se leyó en un lector de placas estándar. Los datos se graficaron y en la figura 8 se muestra la curva estándar, la variación de sensibilidad es de 3 ng-0 ng.

Ejemplo 9 Se prepararon y agregaron diluciones de GM1 ovina purificado (100 µ? de cada dilución) a placas Nunc maxisorp. Las placas se incubaron durante la noche a 4°C. Al siguiente día las placas se lavaron y se bloquearon. Se agregó CTB-Alexa488 (1: 200) y las placas se incubaron durante 1 hora a RT en la oscuridad. Las placas se lavaron y la señal se leyó en un lector de placas estándar. Después, se agregó 1% de SDS en PBS para solubilizar el GM1 durante 10-15 min. Las placas se leyeron nuevamente en el lector de placas, los datos se graficaron y en la figura 9 se muestra una curva estándar. La variación de sensibilidad es 500 ug-30 ug.

Ejemplo 10 Se utilizó un aspirado de médula ósea proveniente de un donador humano individual para producir el Banco de Células Maestras, MCB 105. La recolección de médula ósea se realizó mediante Cambrex (Gaithersburg, MD) de acuerdo con los Procedimientos de Cambrex Bioscience. Se obtuvo un volumen total de 124 inL de médula ósea de aspiraciones bilaterales provenientes del hueso pélvico posterior del donador utilizando procedimientos médicos estándar. El aspirado se colocó en una bolsa estéril para sangre que contuvo heparina y se colocó en un recipiente para transporte con un registrador de temperatura y un paquete frío. El procesamiento se inició a las 4 horas de la donación de la médula ósea.

Procesamiento de médula ósea Todos los procesamientos asépticos del aspirado de médula ósea se presentaron dentro de un gabinete de seguridad biológica Clase 100. El aspirado se transfirió de la bolsa para sangre a un recipiente estéril de 250 mi. Se midió el volumen del contenido de la bolsa para sangre y se retiró una muestra del aspirado. Se agregaron diez volúmenes de solución ACK-Lys (BioSource International: NH4C1 [8.29 g/L], KHC03 [1.0 g/L], EDTA [0,037 g/L]) al aspirado para lisar los glóbulos rojos. La suspensión se sometió a centrifugación para aislar las células nucleadas. El sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron con medio de crecimiento AFG104 (alfa-MEM con 10% (v/v) de suero fetal bovino y L-glutamina 4 mM) y se lavó dos veces adicionales con medio de crecimiento mediante dilución y centrifugación. Después del paso de lavado final, las células se resuspendieron en medio de crecimiento AFG104. Se retiró una muestra de la suspensión después del lisado/ lavado y las células nucleadas se numeraron y se determinó la viabilidad. Las células mononucleares se aislaron del aspirado de médula ósea y se utilizaron para sembrar cinco recipientes de cultivo, producción de células Nunc, con 60, 000 ± 2,000 células/ciir (3.79 x 108 fabricación celular) . Cada fabricación se suplemento con un litro de medio de crecimiento AFG104. Las fabricaciones celulares se incubaron en una incubadora a 37 °C y los cultivos se airearon con 5% de C02 y 4% de 02. Los cultivos se monitorearon dos veces al día para señales de contaminación y para asegurar que las condiciones de cultivo de la incubadora estuvieron dentro de las especificaciones (37° ± 2°C, 4.0% ± 0.5% 02 5.0% ± 0.5% C02) . Después de siete días de crecimiento, el medio se retiró de cada fabricación y se intercambió con medio recién preparado.

Las duplicaciones de poblaciones durante la primera expansión, que resultaron en MCB105, se determinaron para ser 9.4 duplicaciones de poblaciones. MCB105 se rellenó como alícuotas de 2 mi en crioviales, conservados criogénicamente y se almacenó a ± -130°C en la fase de vapor de nitrógeno líquido. Se produjo el Banco de Células de Trabajo 1 ( CB1) a partir de la expansión de MCB105. WCB1 se expandió para 7.5 hasta 9.5 duplicaciones de poblaciones, dando por resultado en una duplicación acumulativa de poblaciones de 16.9 hasta 18.9. Las células recolectadas se dividieron en alícuotas como 0.8 hasta 1 mL alícuotas (10 hasta 20 millones de células viables por vial) en crioviales conservados criogénicamente y almacenados a ± -130°C en la fase de vapor del nitrógeno liquido.

Los procesos de expansión, crio-congelación y prueba se repitieron para WCB2 y WCB3. WCB2 y WCB3 cada uno se expandieron 7.5 hasta 9.5 duplicaciones de poblaciones. Esta expansión dio por resultado en una duplicación acumulativa de poblaciones de 24.4 hasta 20,4 para WCB2 y una duplicación acumulativa de poblaciones de 31.9 hasta 37.9 para WCB3.

Los bancos de células maestras, los bancos de células de trabajo (WCB1, WCB2, CB3) , y GBT009 se dividieron en alícuotas crioviales, se conservaron criogénicamente, y se almacenaron a -130°C en la fase de vapor de nitrógeno liquido.

Sistema de Banco de Células El sistema de banco de células consistió de en cinco diferentes procedimientos bancarios : MCB105, WCB1, WCB2, WCB3 y GBT009. MCB105 fue de 9.4 duplicaciones. Cada WCB se expandió para 7.5 hasta 9.5 duplicaciones de poblaciones dando por resultado en tres WCB sucesivos utilizados para alcanzar el número blanco de duplicaciones de poblaciones para GBT009. Por lo tanto, MCB105 se expandió a 37.5 hasta 47.5 duplicaciones acumulativas de poblaciones.

Este sistema de banco celular permite la generación de nuevos lotes de WCB1, WCB2, WCB3 y GBT009 provenientes de MCB105 cuando se redujo un banco. Por ejemplo, un WCB2 reducido, lote #S1, se puede regenerar como el lote #S2 mediante la expansión de un vial del mismo lote de WCB1, lote #Fl-5, utilizado para producir SI. El banco se descongeló y se siguió el mismo procedimiento de expansión y duplicaciones de poblaciones. Este proceso de expansión es el mismo para el establecimiento de todos los bancos de células de trabajo. El banco WCB3 actual, lote #T2, después de la reducción se reproducirá como el lote #T3 utilizando el mismo WCB2 gue se utilizó para producir el lote #T2. Esta metodología permite la producción repetida de WCB1, WCB2, WCB3 y los viales del producto final, GBT009, números de lote P5, ?ß, P7, etc. Este procedimiento permite un mayor grado de reproducibilidad, consistencia y calidad en el proceso de elaboración y el producto celular. Todos los bancos celulares se almacenaron en la fase de vapor de nitrógeno liguido (= -130°C) .

Después de cinco días de incubación adicional (12 días después del sembrado) , la recolección de colonias adherentes se llevó a cabo mediante tratamiento con tripsina. El medio acondicionado se retiró de los cultivos y se probó mediante cultivo de fluido microbiano (sin crecimiento) y para micoplasma (ninguno detectado) . Mientras que las células se unieron a las fabricaciones celulares, las mismas se lavaron con 500 mi de dPBS (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco sin calcio o magnesio) . La solución se retiró y se desechó como desperdicio. Se agregó tripsina-EDTA para disociar las células de las fabricaciones. Las células se transfirieron a un recipiente estéril y la tripsina-EDTA se neutralizó al agregar un volumen de medio de crecimiento AFG104 igual al volumen de las células tratadas con tripsina. La suspensión celular se sometió a centrifugación y los sedimentos celulares se resuspendieron en medio de crecimiento.

Cada suspensión celular resuspendida se muestreó y se probó para conteo celular, viabilidad y pureza. Con la aceptación de los resultados de pruebas en proceso, las suspensiones celulares se concentraron. La suspensión concentrada se muestreó y se probó para el número de células, viabilidad, pureza y identidad. La suspensión luego se sometió a centrifugación y el sobrenadante se decantó y desechó. El sedimento celular se resuspendió en tampón de crioconservación, CSM-55 (medio de almacenamiento criogénico compuesto de solución salina eguilibrada, 4.5% en p/v de dextrosa, USP con 5% en v/v de sulfóxido de dimetilo, USP y 5", en v/v de albúmina de suero humano, USP) . El volumen de CSM-55 se condujo mediante el conteo de células de la suspensión. Se agregó CSM-55 para alcanzar una concentración de un millón de células por mi. Después de que las células se resuspendieron en CSM-55, la suspensión se muestreó para confirmar el número de células, viabilidad, pureza y identidad antes de la crioconservación .

Dentro del gabinete de seguridad biológica Clase 100, se rellenaron manualmente 259 viales de MCB105 utilizando técnicas asépticas. Cada vial de 5 mi contuvo 2 mi de la suspensión de células CSM-55. Durante la operación de llenado, se realizaron verificaciones de peso cada día 30 del relleno de vial para rastrear la consistencia de la operación de relleno de viales, y no se observaron discrepancias del volumen blanco (1.8 hasta 2.2 mi) . Con la terminación de las operaciones de colocación en viales, los viales se congelaron utilizando un congelador de velocidad controlada. La suspensión celular se enfrió de la temperatura ambiente hasta 4°C. Una vez que se equilibraron los viales a 4°C, a los mismos se les disminuyó la temperatura a -120°C y se mantuvieron a esta temperatura hasta el retiro del almacenamiento permanente. Los viales de MCB105 se almacenaron en la fase de vapor de almacenamiento con nitrógeno liquido (-130°C) . Los tanques de almacenamiento tuvieron acceso restringido.

Preparación de bancos de células de trabajo (WCB1, WCB2, WCB3) El proceso de fabricación implica la producción secuencial de tres WCB. Cada banco de células sucesivas se derivó de una alícuota de células almacenadas criogénicamente proveniente del banco anterior, es decir MCB105 ? CB1 ? WCB2 ? WCB3. Todas las manipulaciones del cultivo se realizaron en un gabinete de seguridad biológica Clase 100 con un programa de monitoreo ambiental activo. La producción de cada banco celular se inició mediante la descongelación de células del banco celular anterior adecuado. Una alícuota de células proveniente de MCB105 se retiró del almacenamiento criogénico, se descongeló y se resuspendió en medio de crecimiento AFG104 creando una suspensión de células de reserva. Una muestra proveniente de la solución de reserva se retiró y se probó para número de células y viabilidad. Los recipientes de cultivo, las fabricaciones de células Nunc, utilizados para cada banco de células de trabajo se sembraron a 30 ± 5 células por cm2 y se cultivaron utilizando medio de crecimiento AFG104. Las fabricaciones celulares se incubaron en una incubadora a 37 °C y los cultivos se airearon con 5% de CO;: y 4% de O?. Después de siete días de crecimiento, los medios se retiraron de cada fabricación y se intercambiaron con medio recién preparado. El medio condicionado se probó para cultivo de fluido microbiano. Las fabricaciones se incubaron durante un periodo de tiempo adicional hasta alcanzar una duplicación de poblaciones de 7.5 hasta 9.5 duplicaciones .

El aislamiento (recolección) de colonias adherentes se llevó a cabo mediante tratamiento con tripsina. El medio acondicionado se retira del cultivo y se probó para esterilidad mediante cultivo de fluido microbiano y para micoplasma. Mientras que las células se unieron al recipiente del cultivo, las células se lavaron con DPBS . La solución se retiró y se desechó como un desperdicio. El retiro de células se llevó a cabo al agregar tripsina-EDTA al cultivo y permitir la disociación de células del recipiente de cultivo. Las células se transfirieron a un recipiente estéril y la tripsina-EDTA se neutralizó al agregar medio de crecimiento AFG104 a las células tratadas con tripsina. La suspensión celular se sometió a centrifugación y se resuspendió en medio de crecimiento. Las muestras de la suspensión de células resuspendidas se extrajo de cada fabricación de células y se sometió a una prueba en proceso (conteo de células, viabilidad y pureza) . Las suspensiones celulares provenientes de las fabricaciones individuales cumplen con los criterios de aceptación antes de la combinación en una suspensión concentrada de células. Cuando se combinaron las suspensiones celulares, la suspensión concentrada se muestreó para confirmar el número de células, viabilidad, pureza e identidad. La suspensión luego se sometió a centrifugación. Después de la centrifugación, el sobrenadante se decantó y el sedimento celular se resuspendió en tampón de crioconservación, CSM-55, hasta alcanzar una concentración de hasta 20 millones de células por mi. La suspensión se muestreó nuevamente para confirmar el número celular, viabilidad, pureza e identidad. Los viales se rellenaron aséptica y manualmente en un gabinete de seguridad biológica Clase 100 en alícuotas de 1.0 ± 0.2 mL en crioviales Corning de polipropileno de 2 mL. Se realizaron verificaciones de peso cada día 25 al vial para rastrear la consistencia en la operación de llenado de viales. Al término de las operaciones de llenado de viales, los viales se congelaron utilizando un congelador con control de velocidad. La suspensión celular se enfrió de la temperatura ambiente a 4°C y luego la temperatura se disminuyó a ± -120°C y se mantuvo hasta que se retiró para almacenamiento en la fase de vapor de nitrógeno líquido (± -130°C) .

Ejemplo 11 Las células estromales derivadas de médula ósea humana, las células estromales derivadas de tejido adiposo, los fibroblastos dérmicos y los fibroblastos provenientes de sujetos diagnosticados con gangliosidosis por GMl, asi como células inmortalizadas de neuroblastoma (SHSY-5Y, SHSY-S y SK-N-AS), células de ovario de hámster chino (CH0-K1), y células renales embrionarias humanas (HEK293) se adquirieron de fuentes comerciales. Las células se cultivaron en placas de 24 pocilios en medio de cultivo estándar, a una densidad de 2,000-20,000 células/pocilio durante la noche y, ya sea se mantuvieron en medio de cultivo estándar (CONTROL) o se trataron con cloroquina (CLQ) de acuerdo con las condiciones listadas en la Tabla 4 más adelante. Las células se mantuvieron en una incubadora para cultivo de tejidos a aproximadamente 37 °C en una atmósfera humidificada que comprende aproximadamente 5% de CO? y aproximadamente 21% de O equilibrado con N2. Después del tratamiento durante 48-120 horas, las células se fijaron con 4% de paraformaldehido y se tiñeron con CTB-Alexa488 para detectar el gangliósido GMl. En las figuras 10 y 11 se muestran las imágenes fluorescentes que muestran la tinción GMl positiva. La acumulación de GMl extensiva es evidente en la mayoría de tipos celulares en comparación con los controles mantenidos en medio de cultivo estándar solo. (Figuras 10 y 11 y Tabla 4) .

Tabla 4. Inducción de GM1 en diferentes tipos celulares mediante tratamiento con CLQ Ejemplo 12 Se sacrificaron una oveja normal y una afectada (gangliosidosis por GM1 ovina) , aproximadamente 4 meses de edad, en la granja Holler granja en el Sur de Dakota. Se recolectó una cucharada de 5-10 mi de médula ósea proveniente del fémur de cada animal y se colocó en tubos cónicos de 50 mi estériles marcados por separado. Los tubos se rellenaron con solución para transporte (Hibernate A de Brain Bits, IX Penicilin/Streptomycin en Invitrogen) . Las muestras se prepararon para transporte en hielo para Malvern, Pensilvania, en menos de 24 horas. Al recibir, las partes externas de los tubos se limpiaron y se transfirieron a un gabinete de bio-seguridad estéril. La solución de transporte se decantó y se agregaron 25 mi de solución amortiguada con fosfato de Dulbecco (DPBS) a cada médula ósea. Para crear un suspensión celular se trituraron suave y repetidamente la médula ósea/solución de DPBS. Cada suspensión celular se dividió en 2 tubos para centrifuga estériles de 500 mi (Corning Life Sciences) . A cada tubo para centrifuga, se agregaron 150 mi de solución de lisis ACK (Invitrogen). Las soluciones se mezclaron al pipetear las suspensiones celulares hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces. Cada tubo se tapó y se agitó rotacionalmente durante 2 segundos. Las suspensiones celulares se sometieron a centrifugación durante 10 minutos a 1350 ± 50 RP en bajo freno utilizando una centrifuga Allegra 6R y botes giratorios. El sobrenadante de cada muestra se extrajo por aspiración y se desechó. Cada sedimento celular restante se resuspendió en 10 mi del medio de crecimiento AFG104 (AMEM, de suero fetal de bovino al 10¾, glutamax 4 mM, IX penicilina/estreptomicina, IX gentamicina) .

Las 2 suspensiones celulares provenientes de la médula ósea de ovejas normal se combinaron en un cónico de 50 mi estéril. Las 2 suspensiones celulares provenientes de la médula ósea de ovejas afectada se combinaron en un cónico de 50 mi estéril por separado. Se agregó medio de crecimiento AFG104 a cada suspensión celular hasta un volumen final de 40 mi. Las muestras se sometieron a centrifugación durante 10 minutos a 1350 ± 50 RPM en bajo freno utilizando una centrifuga Allegra 6R y botes giratorios. Los sobrenadantes se desecharon. Los sedimentos celulares se resuspendieron por separado en 20 mi de medio de crecimiento AFG104. El volumen se ajustó a 40 mi con más medio de crecimiento AFG104. Las muestras se sometieron a centrifugación durante 10 minutos a 1350 ± 50 RPM en bajo freno utilizando una centrifuga Allegra 6R y botes giratorios. El sobrenadante se desechó y cada sedimento se resuspendió en un volumen final de 30 mi de medio de crecimiento AFG104. Para cada muestra se determinó el número total de células y la viabilidad. Las células se sembraron a 60,000 células/cm' en matraces T225 en medio de crecimiento AFG104. Las células se cultivaron en una incubadora humidificada ajustada a 4% de 2, 5% de CO^ y 37°C. Los cultivos se alimentaron con medio de crecimiento AFG104 recién preparado en el día 5 y se recolectaron en el día 8 (células derivadas de médula ósea de oveja normal) en el día 9 (células derivadas de médula ósea de oveja afectada) . Esta primera recolección se definió como el subcultivo 1 (PI) en el Banco de Células Maestras (MCB) . Se crioconservó una porción de las células. Las células restantes se sembraron a 60 células/cirr y se cultivaron durante 5 días en medio de crecimiento AFG104 en una incubadora humidificada ajustada a 4% de O-, 5% de C02 y 37°C. Las mismas se alimentaron en el dia 5 con medio de crecimiento AFG104 y se recolectaron en el día 9 (células derivadas de médula ósea de oveja normal) en el dia 8 (células derivadas de médula ósea de oveja afectada) . Esta próxima recolección se definió como el subcultivo 2 (P2) en el Banco de Células Trabajo 1 (WCB1) . Se crioconservó una porción de las células. Las células restantes se sembraron a 60 células/cir y se cultivaron durante 5 días en medio de crecimiento AFG104 en una incubadora humidificada ajustada a 4% de O-, 5% de C02 y 3 °C. Las mismas se alimentaron en el dia 5 con medio de crecimiento AFG104 y se recolectaron en el dia 10 (células derivadas de médula ósea de oveja normal y afectada) . Esta siguiente recolección se definió como el subcultivo 3 (P2) en el Banco de Células de Trabajo (WCB2) . El tiempo de duplicación para las células derivadas de médula ósea de oveja normal fue 22.14, 23.03 y 26.71 horas para MCB, WCB1 y CB2 respectivamente. El tiempo de duplicación para las células derivadas de médula ósea de oveja afectada fue 22.19, 22.77 y 26.31 horas para MCB, WCB1 y CB2 respectivamente. Las duplicaciones de cultivos del subcultivo fueron 8.67, 9.38 y 8.09 para células derivadas de médula ósea de oveja normal a MCB, WCB1 y WCB2 respectivamente. Las duplicaciones de cultivos por subcultivo fueron 89.73, 8.43 y 8.21 para las células derivadas médula ósea de ovejas afectada en MCB, WCB1 y WCB2 respectivamente.

Se debe apreciar que la sección de la Descripción Detallada, ni el Sumario ni las secciones de Extracto, se utilizará para interpretar las reivindicaciones. El Sumario y secciones Extracto, se pueden establecer en uno o en más aunque no en todas las modalidades ilustrativas de la presente invención según se contempla por los inventores, y do esta forma, no se pretende limitar la presente invención y las reivindicaciones anexas de ninguna forma.

La presente invención se ha descrito anteriormente con la ayuda de bloques de construcción funcionales que ilustran la implementación de las funciones especificas y relaciones de las mismas. Los limites de estos bloques de construcción funcional se han definido arbitrariamente en la presente para conveniencia de la descripción. Se pueden definir limites alternativos siempre y cuando se realicen adecuadamente las funciones especificadas y relaciones de las mismas .

La descripción anterior de las modalidades especificas de esta forma revelarán la naturaleza general de la invención, distintas de otra, al aplicar el conocimiento que quede dentro de la experiencia de la técnica, modificar fácilmente y/o adaptar las diversas aplicaciones de estas modalidades especificas, sin experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, se pretende que estas adaptaciones y modificaciones queden dentro del significado y variación equivalentes de las modalidades descritas, con base en la enseñanza y guia presentadas en la presente. Se debe entender que la fraseología o terminología en la presente tiene el propósito de descripción y no de limitación, de tal forma que la terminología o fraseología de la presente especificación se deberá interpretar por el experto a luz de las enseñanzas y guía .

La amplitud y el alcance de la presente invención no deberá limitar a ninguna de las modalidades ilustrativas descritas anteriormente, sino que se deberá definir únicamente de acuerdo con las siguientes reivindicaciones y sus equivalentes .

Ejemplo 13 Los siguientes datos de comparación entre GMl Bovino y Ovino se generaron al probar los materiales de investigación de GMl disponibles comercialmente (Avanti y Matreya) y el material de GMl fabricados por Fidia. Fidia fabricó el mismo material que se utilizó en los ensayos clínicos anteriores. Todas las pruebas se realizaron en un ambiente R&D (Métodos de prueba sin equipo GMP/no validados) . El trabajo analítico hasta la fecha se realizó durante el desarrollo de un producto farmacéutico GMl derivado de ovino.

Se desarrolló un método HPLC para determinar las cantidades relativas de las variantes individuales de las moléculas GMl . Los resultado indican que las moléculas GMl difieren en la longitud de las cadenas de alquilo que comprenden el grupo con prolongación no polar de cada molécula de GMl. En la Tabla 5 más adelante se presentan los resultados del perfil de variantes GMl. También se observó que en todos los lotes probados dos variantes fueron los dominantes y constituyeron más del 80% de las variantes GMl totales presentes. Estas son las variantes dl8:l C18:0 y la d20: 1 C18: 0.

Tabla 4: Distribución de especies individuales de GM1 10 Valores del ensayo = Área mediante HPLC TBD = será determinado ND = No detectado 15

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Un método para producir un gangliósido en una célula, caracterizado porque comprende: (a) tratar la célula con cloroquina para acumular el gangliósido; (b) aislar el gangliósido, cuantificar el gangliósido, o ambos, a partir de la célula tratada con cloroquina; en donde la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula inmortalizada, una célula estromal, y un fibroblasto; en donde la célula no es una célula PC12, una célula HT22, una célula cerebral proveniente de una oveja afligida con gangliosidosis , y la célula de fibroblasto proveniente de una oveja afligida con gangliosidosis.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las célula se selecciona del grupo que consiste en una célula de neuroblastoma, una células de ovario de un hámster chino (CHO) , una célula renal embrionaria humana (HEK) , una célula estromal, y una célula de fibroblastos.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la célula es una célula de CHO, en donde la célula de CHO es una célula de CH0-K1. 5

4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la célula es una célula HEK, en donde la célula HEK es una célula HEK293.

5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la célula es una célula de "10 fibroblastos.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la célula de fibroblastos es una célula de fibroblasto dérmico.

7. El método de conformidad con la reivindicación 15 5, caracterizado porque la célula de fibroblastos es un fibroblasto proveniente de un ser humano con gangliosidosis por GM1.

8. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracte izado porque la célula es una célula de 20 neuroblastoma .

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la célula de neuroblastoma se selecciona del grupo que consiste de SHSY-5Y, SHSY-S, y SK-N- AS .

10. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la célula es una célula estromal.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la célula estromal se deriva de médula ósea.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la célula estromal se deriva de la médula ósea humana.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la célula de la médula ósea humana se produce mediante métodos para cultivo de baja densidad y bajo contenido de oxigeno.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gangliósido se selecciona del grupo que consiste de GM1 , GM2, GM3, GDla, GDlb, GD3, y GTl.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el gangliósido es GM1.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende tratar la célula con neuraminidasa .

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende tratar la célula con glucosamina .

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende manipular bioquímicamente la célula para aumentar la producción gangliósidos .

19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula produce una cantidad de 10 hasta 200 por ciento o aproximadamente 10 hasta 200 por ciento más gangliósido que una célula que no se haya tratado con cloroquina.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la cantidad es 15 hasta 125 por ciento o aproximadamente 15 hasta 125 por ciento.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la cantidad se selecciona del grupo que consiste de 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento o aproximadamente 15, 19, 28, 63, 65, 83, 104, y 119 por ciento .

22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la cantidad es 65 o aproximadamente 65.

23 Un método para producir gangliósido GM1, caracterizado porque comprende: (a) aislar células de médula ósea provenientes de una oveja; (b) cultivar las células de médula ósea de ovejas en medio para inducción neural ("NIM") para producir células de médula ósea de oveja similares a neuronas; (c) tratar las células de médula ósea de oveja similares a neuronas con cloroquina para acumular GMl; y (d) aislar GMl, cuantificar el GMl, o ambos, a partir de las células de médula ósea de oveja similares a neuronas, tratadas con cloroquina.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque (c) el tratamiento de las células de la médula ósea de ovejas similares a neuronas con cloroquina comprende poner en contacto las células de médula ósea de ovejas similares a neuronas con cloroquina entre 5 y 100 micromolar .

25. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque (c) el tratamiento de las células de la médula ósea de ovejas similares a neuronas con cloroquina comprende poner en contacto las células de médula ósea de ovejas similares a neuronas con cloroquina durante entre 2 hasta 72 horas.

26. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque las ovejas están afliqidas con gangliosidosis .

27. Un método para producir un gangliósido GMl, caracterizado porque comprende: (a) tratar células de médula ósea humana con cloroquina para acumular GMl; y (b) aislar el GMl, cuantificar el GMl, o ambos, de las células de médula ósea humana tratadas con cloroquina.

28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque (a) tratar las células de médula ósea humana con cloroquina comprende poner en contacto las células de médula ósea humana con cloroquina entre 5 y 100 micromolar .

29. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque (a) tratar las células de médula ósea humana con cloroquina comprende poner en contacto las células de médula ósea humana con cloroquina durante entre 2 hasta 72 horas.

30. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el humano está afligido con gangliosidosis por GMl.

31. Un método para cuantificar una cantidad del gangliósido GMl en una población de células adherentes, caracterizado porque comprende: (a) poner en contacto las células adherentes con toxina B de cólera conjugada con un tinte o una enzima que genere un producto final de color al ponerlo en contacto con su sustrato; (b) medir la luz emitida o absorbida por el tinte o el producto final de color, en donde la luz emitida o absorbida por el tinte o el producto final de color se utiliza para cuantificar la cantidad de gangliósido GMl en la población de células adherentes.

32. Un gangliósido producido mediante el método de conformidad con la reivindicación 1.

33. El gangliósido de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el gangliósido es GMl.

34. Un método para tratar una enfermedad o trastorno que comprende administrar el gangliósido de conformidad con la reivindicación 32, a un sujeto que necesite del mismo, caracterizado porque se trata la enfermedad o trastorno.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste de lesión neuronal, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, apoplejía, síndrome de Guillain-Barré y cáncer.