MX2014008699A - Metodos para utilizar moduladores de fgf19. - Google Patents

Abstract

Aquí se proporcionan métodos para utilizar moduladores FGF19 y/o biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares.

Description

MÉTODOS PARA UTILIZAR MODULADORES DE FGF19 REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad bajo 35 USC 119(e) de la solicitud de patente provisional de los E.U.A. Número de Serie 61/587,885 presentada en enero 18, 2012, los contenidos de la cual se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias presentado por EFS-Web y aquí incorporado por referencia en su totalidad. La copia ASCII, creada en enero 17, 2013, tiene como nombre P4854RlWO_PCTSequenceListing.txt y tiene 13,975 bytes en tamaño.

CAMPO Aquí se proporcionan métodos para utilizar moduladores de FGF19 y/o biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares.

ANTECEDENTES Los ácidos biliares son detergentes fisiológicos sintetizados del colesterol en el hígado, almacenados en la vesícula biliar y liberados al intestino delgado para la absorción de grasas y nutrientes solubles en grasas . Chiang JY. 2004. J Hepatol 40 (3) : 539-51; Russell DW. 2003. Annu Rev Biochem 72:137 -74. Más de 90% de los ácidos biliares son reabsorbidos en el íleo, que se logra primordialmente por mecanismos mediados por transportador que consisten de captación apical del lumen, tráfico intracelular a la membrana basolateral, y subsecuente flujo a la circulación portal para retorno al hígado. El colesterol se convierte en dos ácidos biliares primarios en el hígado humano, ácido cólico (CA) y ácido quenodeoxicólico (CDCA) , cuya síntesis es regulada por enzimas clave incluyendo, Cyp7al, ???dß?, Cyp27oíl, y Cy 7 i. Los ácidos biliares primarios secretados en la bilis se conjugan a glicina y taurina, que después se hidrolizan o deshidroxilan en el intestino para formar ácidos biliares secundarios, ácido deoxicólico (DCA) y ácido litocólico (LCA) , respectivamente que se absorben por difusión pasiva a través del epitelio. Chiang JY. 2009. J Lipid Res 50 (10) : 1955-66. Aunque diferencias en síntesis de ácidos biliares primarios y metabolismo se han identificado en humanos (CA y CDCA) y roedores (ácido a- y ß-muricólico) (Russell DW. 2003. Annu Rev Biochem 72:137-74), monos cynomolgus y humanos son similares respecto a recambio de colesterol y síntesis de ácidos biliares (Dietschy JM and Turley SD. 2002. J Biol Chem 277 (6) : 3801-4 ; Hayes KC. 1988. Nutr Res Rev 1 (1) : 99-113 ; Rudel LL et al. 2002. J Biol Chem 277 (35) : 31401-6) , pero difieren en su ruta de desintoxicación (Alnouti Y. 2009. Toxicol Sci 108 (2) : 225-46) .

El receptor farnesoide X (FXR, NR1H4) , un miembro de la familia de receptores de hormonas tiroides/esteroides, es un factor de transcripción activado por ácidos biliares. Makishima M. et al. 1999. Science 284 (5418) : 1362-5; Parks DJ et al. 1999. Science 284 (5418) : 1365-8. En el hígado, transportadores de cásete de enlace ATP iniciados FXR (ABC) , bomba de exportación de sales biliares (BSEP, ABCB11) y proteína resistente a múltiples fármacos 2 (MRP2, ABCC2) son esenciales en transportar ácidos biliares y constituyentes biliares de los hepatocitos en la bilis. Ananthanarayanan M. et al. 2001. J Biol Chem 276 (31) : 28857-65 ; Kast HR et al. 2002. J Biol Chem 277 (4) : 2908-15 ; Plass JR et al. 2002. Hepatology 35 (3 ): 589-96. El polipéptido de cotransporte taurocolato de sodio (NTCP, SlclOal) y la familia de proteínas polipéptido de transportador de anión orgánico (OAT) juegan papeles importantes en captación de sales biliares en la membrana basolateral de los hepatocitos. Eloranta JJ and Kullak-Ublick GA. 2008. Physiology (Bethesda) 23:286-95. En el íleo, transportadores incluyendo NTCP y transportador de ácidos biliares dependiente de sodio apical (ASBT, Slcl0a2) median la captación de ácidos biliares a través de la membrana borde en cepillo apical, y la proteína de enlace de ácidos biliares ileal (IBABP) media el transporte intracelula . Subsecuentemente, transportadores de solutos orgánicos a-ß (OST-a, OST-ß) ubicados en los ácidos ileares de flujo de membrana basolateral en la circulación portal. Ballatori N. et al. 2005. Hepatology 42 (6) : 1270-9; Dawson PA et al. 2005. J Biol Chem 280 (8) : 6960-8. De esta manera, además de los ácidos biliares y metabolismo de lipoproteinas, transportadores regulados por FXR juegan un papel importante en el transporte de ácidos biliares y ciclado enterohepático y homeóstasis. Ballatori N. et al. 2008. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 295(1) :G179-G186; Dawson PA et al. 2003. J Biol Chem 278 (36) : 33920-7 ; Nakahara M. et al. 2005. J Biol Chem 280 (51) : 42283-9.

El factor de crecimiento de fibroblastos 19 (FGF19) es un miembro atípico de la familia de factor de crecimiento de fibroblastos que puede regular, entre otras dianas, metabolismo de glucosa y metabolismo de ácidos biliares hepáticos a través de represión del gen que codifica Cyp7oíl, la primera etapa limitante de velocidad en la síntesis de ácidos biliares. Inagaki T. et al. 2005. Cell Metalo 2(4):217-25. FGF15 de ratón se ha identificado como un homólogo estructural y funcional de FGF19 de humano y pollos con algunos elementos promotores/mej oradores conservados. Wright TJ et al. 2004. Dev Biol 269 (1) : 264-75. FGF15/ FGF19 puede enlazar al receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 4 (FGFR4) y evita activación de Cyp7al, de esta manera evitan<2 síntesis de ácidos biliares. FGF19 secretado por el intestino actúa como~~¾ntt--jaQÜ5 na endocrina al ligar a FGFR4 en hepatocitos para iniciar la ruta a ^sj¾ializ ción N -terminal quinasa c-jun (JNK) y subsecuentemente suprime- a.-. síntesis de ácidos ileares hepáticos. Jones S. 2008. Mol. Pharma. 5(l):42-48. Ratones FGFR4 KO tienen un mayor acumulado de ácidos biliares, incrementada excreción de ácidos biliares y vesículas biliares agotadas en ácidos biliares, indicando regulación negativa de colesterol y síntesis de ácidos biliares. Xie H et al. 1999. Cytokine 11(10) :729-35; Yu C. et al. 2000. J Biol Chem 275 (20) : 15482-9. FXR se ha mostrado que regula directamente FGF19, que señala a través del receptor FGFR4 tirosina quinasa, y que FGF19 reprime fuertemente la expresión de Cyp7o¡l en hepatocitos primarios y en hígado de ratón. Holt JA et al. 2003. Genes Dev 17 (13 ): 1581-91. Recientemente, ß-klotho, una proteína de transmembrana sin actividad quinasa pronosticada, se ha identificado como un cofactor requerido para actividades específicos del hígado de FGF19 (Lin BC et al. 2007. J Biol Chem 282 (37) : 27277-84) y supresión de retroalimentación negativa deteriorada de síntesis de ácidos biliares se ha descrito en ratones deficientes en ß-klotho. Ito S. et al. 2005. J Clin Invest 115 (8) :2202-8.

Trabajo previo mostró que neutralización FGF19 terapéutica utilizando anticuerpos anti-FGF19 inhibe crecimiento de tumor en modelos de roedor de carcinoma de colon y hepatocelular (Desnoyers LR et al. 2008. Oncogene 27(l):85-97) sin ninguna toxicidad significante. Sin embargo, en monos cynomolgus, que tienen una ruta de síntesis de ácidos biliares similar que comprende CA y CDCA y FGF19 con mayor homología a FGF19 humano, resulta toxicidad relacionada a dosis. En particular, un estudio de seguridad de dosis repetida en monos cynomolgus que aquí se describe, resulta en una toxicidad de hígado relacionada a dosis acompañada por severa diarrea y bajo consumo de alimentos. El mecanismo de toxicidad asociado con el tratamiento de modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19, por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) requiere ser adicionalmente comprendido a fin de desarrollar terapias que mitigan cualquier toxicidad asociada con modulador FGF19 (por ejemplo antagonista FGF19, por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) .

COMPENDIO La invención proporciona métodos para tratar una enfermedad o desorden en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un modulador FGF19 y evaluar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo (por ejemplo, comparado con una referencia) durante tratamiento con el modulador FGF19.

En otro aspecto, aquí se proporcionan métodos para tratar una enfermedad o desorden en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un modulador FGF19, en donde el tratamiento se basa en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo (por ejemplo, en comparación con una referencia) .

Además aquí se proporcionan métodos para tratar una enfermedad o desorden en un individuo, el método comprende: determinar que una muestra del individuo comprende niveles sustancialmente normales o niveles reducidos de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, comparados con una referencia) y administrar una cantidad efectiva de un modulador FGF19 al individuo, con lo que la enfermedad o desorden se trata.

Además, aquí se proporcionan métodos para tratar una enfermedad o desorden, que comprenden: (a) seleccionar a un individuo que tiene la enfermedad o desorden, en donde el individuo comprende niveles sustancialmente normales o niveles reducidos de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo (por ejemplo comparado con una referencia) ; y (b) administrar al individuo así selecto, una cantidad efectiva de un modulador FGF19, con lo que la enfermedad o desorden se trata.

Aquí se proporcionan métodos para identificar a un individuo que es más o menos probable que exhiba beneficio por tratamiento que comprende un modulador FGF19 , el método comprende : determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo, en donde niveles reducidos y/o niveles sustancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) en la muestra, indican que el individuo es más probable que exhiba beneficio del tratamiento que comprende el modulador FGF19 o niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) indica que el individuo es menos probable que exhiba beneficio del tratamiento que comprende el modulador FGF19.

Además aquí se proporcionan métodos para pronosticar si un individuo con una enfermedad o desorden es más o menos probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende un modulador FGF19, el método comprende determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo, con lo que niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo en comparación con una referencia) indican que el individuo es más probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende el modulador FGF19 y reducidos niveles y/o niveles sustancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) indican que el individuo es menos probable que desarrolle toxicidad al tratamiento que comprende el modulador FGF19. En algunas modalidades, la toxicidad es diarrea (por ejemplo, diarrea severa) , deshidratación, bajo consumo de alimentos, disminuido peso corporal y/o morbilidad.

Aquí se proporcionan métodos para determinar si un individuo con una enfermedad o desorden deberá continuar o interrumpir el tratamiento que comprende un modulador FGF19, el método comprende medir en una muestra que se obtiene del individuo, niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo, en donde niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) determinan que el individuo deberá interrumpir el tratamiento que comprende el modulador FGF19 y reducidos niveles y/o niveles sustancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) determina que el individuo deberá continuar el tratamiento que comprende el modulador FGF19.

Aquí se proporcionan también métodos para identificar un individuo que es más probablemente conveniente o menos probable conveniente que continúe el tratamiento, en donde el tratamiento comprende un modulador FGF19, con base en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo, en donde niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo en comparación con una referencia) identifica al individuo menos probable adecuado para continuar con el tratamiento que comprende el modulador FGF19 y niveles reducidos y/o niveles sustancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) identifican al individuo que es más probable sea conveniente que continúe el tratamiento que comprende el modulador FGF19.

Aquí se proporcionan métodos para optimizar eficacia terapéutica y/o reducir la toxicidad asociadas con un tratamiento de una enfermedad o desorden en un individuo que tiene la enfermedad o desorden que se somete a tratamiento, que comprende: determinar los niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo, en donde niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares indican una necesidad por disminuir la cantidad y/o frecuencia del subsecuentemente administrado modulador FGF19 al individuo.

Además aquí se proporcionan métodos para identificar a un individuo que tiene una enfermedad o desorden como más probablemente conveniente o menos probablemente conveniente que continúe una dosis y/o un programa de dosis de tratamiento, en donde el tratamiento comprende un modulador FGF19, con base en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo, en donde niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) identifica al individuo menos probable adecuado para que continúe la dosis y/o programa de dosis de trata»¿<=irco que comprende el modulador FGF19 y niveles reducidos y/o niveles sustancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) identifica al individuo más probable conveniente que continúe con la dosis y/o programa de dosis del tratamiento que comprende el modulador FGF19.

Aqui se proporcionan métodos ensayo para optimizar eficacia de dosis en un individuo que recibe un modulador FGF19, el método comprende: (a) determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo; (b) recomendar una dosis subsecuente del modulador FGF19 con base en el nivel de biomarcador de metabolismo de ácidos biliares .

En otro aspecto, aqui se proporcionan métodos de ensayo para evaluar el riesgo de que un individuo desarrolle toxicidad a un modulador FGF19, el método comprende: (a) determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo; (b) evaluar el riesgo de que el individuo desarrolle toxicidad al modulador FGF19 con base en los niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el método además comprende administrar una cantidad efectiva del modulador FGF19 (por ejemplo, al individuo que tiene niveles reducidos y/o niveles substancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, comparado con una referencia) ) .

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es una enzima del hígado. En algunas modalidades, la enzima del hígado son enzimas de hígado-suero.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es un ácido biliar. En algunas modalidades, el ácido biliar es ácido biliar total. En algunas modalidades, el ácido biliar es un ácido biliar hidrofóbico. En algunas modalidades, el ácido biliar es un ácido biliar secundario. En algunas modalidades, el ácido biliar secundario es ácido litocólico. En algunas modalidades, el ácido biliar secundario es ácido deoxicólico .

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácido biliar es aspartato aminotransferasa (AST) , alanina transaminasa (ALT) , gamma glutamil transpeptidasa (GGT) , alfa-L-fucosidasa (AFU) , adenosina deaminasa (ADA) , actividad de colinesterasa (CHE) , alfa-fetoproteína (AFP) y/o niveles de bilirrubina total (TBIL) .

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácido biliar es Cyp7al, BSEP, MRP2, MRP3, Ost- , Ost-ß, y/o IBABP.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares se incrementa en más de aproximadamente 1.1-veces, aproximadamente 1.5-veces, aproximadamente 2 -veces, aproximadamente 2.5-veces , aproximadamente 3 -veces , aproximadamente 4 -veces, aproximadamente 5 -veces, aproximadamente 10 -veces, aproximadamente 15-veces, y/o aproximadamente 20-veces.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la referencia es un nivel promedio del uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares de un individuo sano y/o población sana de individuos (por ejemplo, en donde el nivel es una medida por un método similar y/o igual) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la referencia es un nivel promedio del uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares de un segundo individuo que tiene la enfermedad o desorden y/o populación de individuos que tiene la enfermedad o desorden (por ejemplo, en donde el nivel se mide por un método similar y/o igual) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la referencia es el nivel de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliar antes de empezar el tratamiento y/o al tiempo de empezar el tratamiento con el modulador FGF19.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la muestra es una muestra de suero. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la muestra es una muestra fecal. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la muestra es una muestra de orina. En algunas modalidades, la muestra es una muestra de tejido (por ejemplo, muestra de tejido de hígado y/o muestra de tejido íleo) .

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el modulador FGF19 es un antagonista FGF19. En algunas modalidades, el antagonista FGF19 inhibe y/o enlaza FGF19, FGFR4, y/o klotho (por ejemplo, KLB) . En algunas modalidades, el antagonista FGF19 es un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña y/o polinucleótido. En algunas modalidades, el antagonista FGF19 es un anticuerpo anti-FGF19. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FGF19 comprende: (i) una cadena ligera que comprende (a) región hipervariable (HVR) -Ll que comprende la secuencia de aminoácidos KASQDINSFLA (SEQ ID N0:1) o KASQDINSFLS (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVD (SEQ ID NO: 2) , RANRLVS (SEQ ID NO: 8), o RANRLVE (SEQ ID NO: 9); y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 3); y (ii) una cadena pesada que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 4) ; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos es GVIWPGGGTDYNAAFIS (SEQ ID NO: 5) ; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos VRKEYANLYAMDY (SEQ ID NO: 6) .

En algunas modalidades, HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVD (SEQ ID NO: 2) . En algunas modalidades, HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos KASQDINSFLS (SEQ ID NO: 7) .

En algunas modalidades, HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVS (SEQ ID NO: 8) . En algunas modalidades, HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVE (SEQ ID NO: 9) . En algunas modalidades, HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos KASQDINSFLA (SEQ ID NO: 1) .

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende (i) secuencia marco consenso subgrupo humano ? 1 o (ii) secuencia marco consenso de subgrupo humano de cadena pesada III.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la dosis del modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19, por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) es mayor que o igual a 3 mg/kg (por ejemplo, mayor que o igual a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, y/o aproximadamente 100 mg/kg y/o aproximadamente 10-100 mg/kg) .

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la enfermedad o desorden es una enfermedad o desorden proliferativo . En algunas modalidades, la enfermedad o desorden proliferativo es cáncer. En algunas modalidades, el cáncer es carcinoma hepatocelular.

El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el recipiente, en donde el recipiente comprende un modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19) y la etiqueta en el recipiente indica que la composición puede emplearse para tratar y/o continuar tratamiento de un individuo que tiene una enfermedad o desorden con base en niveles de uno o varios ácidos biliares. En algunas modalidades, el modulador FGF19 es un anticuerpo anti-FGF19 aquí descrito. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la enfermedad o desorden es una enfermedad o desorden proliferativo. En algunas modalidades, la enfermedad o desorden proliferativo es cáncer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1A-D: Tratamiento de anticuerpo anti-FGF19 de monos macacos cangrejeros provocando aumento en suero fig.lA aspartato aminotransferasa (AST) , fig.lB alanina transaminasa (ALT), fig.lC toral de ácidos biliares (TBA) , y fig.lD total de niveles de bilirrubina (TBIL) a través de todas las dosis. Sin embargo, 3 mg/kg de animales tratados indicaron cierta tolerancia con dosis subsecuentes. Valores son Promedio ± SD U/L para AST y ALT, µ????/L para TBA y mg/dL para TBIL (n =5 ± SD) .

Figura 2A-D: Tratamiento de anticuerpo anti-FGF19 provoca incrementada excreción fecal de ácidos biliares y sus derivados. Cantidades totales de ácidos biliares y caracterización de ácidos biliares secundarios en excreciones de monos de vehículo y 100 mg/kg se analizaron utilizando el método GC-MS. La concentración de ácidos biliares se normalizó a g/g peso húmedo. Valores son Promedio ± SD (Control, n = 4, Tratado, n = 5) .

Figura 3A-G: Tratamiento de anticuerpo anti-FGF19 modula el Cyp7al y niveles de expresión de genes relacionados con ácidos biliares en hígados de monos ciño. Total de RNAs se aislaron de los hígados de monos ciño tratados ya sea con anticuerpos anti-FGF19 (100 mg/kg) o vehículo. Niveles de expresión relativos de Cyp7al, BSEP, RP2, MRP3, MRP4, NTCP y 0AT2 se analizaron por análisis PCR en tiempo real cuantitativo y los resultados se normalizaron a RPL19. Valores son Promedio ± SD (Control, n = 4, Tratado, n = 6) .

Figura 4A-G: Tratamiento de anticuerpo anti-FGF19 modula Cyp7o¡l y niveles de expresión de genes relacionados con ácidos biliares en hepatocitos primarios de monos ciño (macacos cangrejeros) . Hapatocitos primarios ciño crioconcervados se trataron con cualquiera de anticuerpo de control de isotipo o anticuerpo anti-FGF19 (100 g/ mL) por 24 h. Niveles de expresión relativa de Cyp7al, BSEP, RP2, MRP3 , MRP4, NTCP y OAT2 se analizaron por análisis PCR en tiempo real cuantitativo y los resultados se normalizan a RPL19. Valores son Promedio + SD de tres experimentos separados realizados en duplicado.

Figura 5A-D: Tratamiento de anticuerpo anti-FGF19 modula niveles de expresión de gen transportador de ácidos biliares en ileo de monos macacos cangrejeros. RNAs total se aislan del tejido ileal de monos ciño tratados ya sea con anticuerpo anti-FGF19 (100 mg/kg) o vehículo. Niveles de expresión relativos de Ost-a, Ost-ß, IBABP y ASBT se analizan por análisis PCR tiempo real cuantitativo y los resultados se normalizan a RPL19. Valores son Promedio ± SD (Control, n = 4 , Tratado, n = 6 ) .

Figura 6A-D: Efecto de anticuerpo anti-FGF19 y ácido deoxicólico (DCA) en niveles de expresión de gen transportador de ácidos biliares en células epiteliales intestinales (Caco-2) . Mono-capas Caco-2 se trataron ya sea con: a) anticuerpo de control de isotipo, b) anticuerpo anti-FGF19 (ambos 100 g/mL) , o c) DCA, 50 µ? por 24 h. RNAs total se aisla y niveles de expresión relativos de Ost-a, Ost-ß, IBABP y ASBT se analizan por análisis de PCR tiempo real cuantitativo y los resultados se normalizan a RPL19. Los valores son Promedio + SD de tres experimentos separados realizados en duplicado.

Figura 7A DCA aumenta la expresión de FGF19 mRNA en células epiteliales intestinales. Total RNA se aisló de monocapas Caco-2 tratadas con y sin DCA (50 µ?) por 24 h. Nivel de expresión relativa de FGF19 se analiza por análisis PCR en tiempo real cuantitativo y los resultados se normalizan a RPL19. Los valores son Promedio ± SD de dos experimentos separados realizados en triplicado. Figura 7B Tratamiento con anticuerpo anti-FGF19 reduce resistencia eléctrica transepitelial sin alterar la integridad de la membrana. Células Caco-2 se siembran en los insertos transpared y tratan ya sea con anticuerpo de control de isotipo (100 g/mL) , FGF19 (500 ng/mL) , anticuerpo anti-FGF19 (100 pg/mL) , DCA (50 µ?) o DCA (50 µ?) más anticuerpo anti-FGF19 (100 g/mL) por 24 h y la permeabilidad de LY, atenolol, y taurocolato se evalúan en la dirección apical a (A-B) . Valores son Promedio ± SD (n = 6) .

Figura 8: Inhibición de FGF19 con anticuerpo aumenta Cyp7o¡l y eleva la síntesis de ácidos biliares resultando en mejorado flujo de ácidos biliares y reducida captación en los hepatocitos. Incrementados ácidos biliares alteran los transportadores de solutos enterocitos e interrumpen la recirculación entero hepática de ácidos biliares subsecuentemente provocando diarrea y toxicidad al hígado .

Figura 9A Secuencias de cadena ligera variable de anticuerpos anti-FGF19s (SEQ ID NOS 11-15, respectivamente, en orden de aparición) , figura 9B Secuencias de cadena pesada variable de anticuerpos anti-FGF19s (SEQ ID NOS 16-20, respectivamente, en orden de aparición) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA I. DEFINICIONES Los términos "FGF19" y "factor de crecimiento de fibroblastos 19" aquí se refieren a un FGF19 nativo de cualquier fuente de vertebrados, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , a menos que se indique de otra forma. El término abarca "longitud íntegra", FGF19 sin procesar así como cualquier forma de FGF19 que resulta de procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de origen natural de FGF19, por ejemplo variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de una secuencia de ácido nucleico FGF19 humano ejemplar es la secuencia Genebank AB018122, AF110400, AY358302, BC017664, y/o BT006729 O una secuencia de aminoácidos FGF19 humano ejemplar es la secuencia Genebank NP_005108.1.

"Variante FGF19", "variante de factor de crecimiento de fibroblastos 19" o sus variaciones, significan un polipéptido FGF19 o polinucleótido, generalmente que es o codifica un polipéptido FGF19 activo, como se define aquí que tiene al menos aproximadamente 80% identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de los FGF19 aquí descritos. Estas variantes FGF19 incluyen por ejemplo FGF19 en donde uno o más residuos de ácido nucleico o aminoácido se agregan o eliminan. Ordinariamente, una variante FGF19 tendrá al menos aproximadamente 80% identidad de secuencia, en forma alterna al menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% identidad de secuencia, a FGF19 como se describe aquí. De manera ordinaria, la variante FGF19 tiene al menos aproximadamente 10 residuos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600 de longitud, o más. Opcionalmente, la variante FGF19 tendrá o codificará una secuencia que no tiene más de una substitución de aminoácido conservadora en comparación con FGF19, en forma alterna no mayor a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 substituciones de aminoácidos conservadores en comparación con FGF19.

Los términos "FGFR4" y "receptor de factor de crecimiento de fibroblastos 4" se refieren aquí a un FGFR4 nativo de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , a menos que se indique de otra forma. El término abarca "longitud íntegra", de FGFR4 no procesado así como cualquier forma de FGFR4 que resulta de procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de origen natural de FGF19, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de una secuencia de ácido nucleico FGFR4 humano ejemplar es la secuencia Genebank AB209631, AF202063, AF359241, AF359246, AF487555, AK301169, BC011847, EF571596, EU826602, EU826603, L03840, M59373, X57205, y/o Y13901 o una secuencia de aminoácidos FGFR4 ejemplar humano es la secuencia Genebank NP_998812.1.

Los términos "KLB" y " ß-Klotho" se refieren aquí a un KLB nativo de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ejemplo, humanos) y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) , a menos que se indique de otra forma. El término abarca "longitud íntegra", de KLB no procesado así como cualquier forma de KLB que resulta de procesamiento en la célula. El término también abarca variantes de origen natural de KLB, por ejemplo, variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de un ácido nucleico KLB humano ejemplar en esta secuencia Genebank AB079373, AK302436, BC033021, BC104871, y/o BC113653 o una secuencia de aminoácidos de KLB humano ejemplar es la secuencia Genebank NP_783864.1.

La expresión "antagonista FGF19" como se define aquí es cualquiera molécula que bloquea en forma parcial o completa, inhibe o neutraliza una actividad biológica mediada por FGF19 (por ejemplo, polipéptido FGF19) . En algunas modalidades, este antagonista FGF19 inhibe y/o liga al polipéptido FGF19. En algunas modalidades, este antagonista FGF19 inhibe y/o liga al polipéptido FGFR . En algunas modalidades, este antagonista FGF19 inhibe y/o liga al polipéptido klotho (por ejemplo, KLB) . De acuerdo con una modalidad, el antagonista es un polipéptido. De acuerdo con otra modalidad, el antagonista es un anticuerpo. De acuerdo con otra modalidad, el antagonista es un antagonista de molécula pequeña. De acuerdo con otra modalidad, el antagonista es un antagonista polinucleótido.

"Polinucleótido" o "ácido nucleico" como se emplean aquí en forma intercambiable, se refieren a polímeros de nucleotidos de cualquier longitud, e incluyen DNA y RNA. Los nucleotidos pueden ser deoxiribonucleótidos, ribonucleótidos , nucleotidos o bases modificadas, y/o sus análogos, o cualquier sustrato que pueda ser incorporado en un polímero por DNA o RNA polimerasa o por una reacción sintética. Un polinucleótido puede comprender nucleotidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. Una secuencia de nucleótidos puede ser interrumpida por componentes no nucleótido. Un polinucleótido puede comprender modificación (es) hecha(s) después de síntesis, tal como conjugación a una etiqueta. Otros tipos de modificaciones incluyen por ejemplo "tapas", sustitución de uno o más nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleótido tales como por ejemplo aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo metil fosfonatos formatos, fosfotriésteres , fosfoamidatos, carbonatos, etc.) y con enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos , fosforoditioatos , etc.), aquellas que contienen porciones laterales, tales como por ejemplo proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, pli-L-lisina, etc.), aquellas con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellas que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellas con enlaces modificados (por ejemplo ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.) así como formas no modificadas del o de los polinucleótidos . Además, cualquiera de los grupos hidroxilo ordinariamente presentes en los azúcares pueden ser reemplazados por ejemplo por grupos fosfonato, grupos fosfato protegidos por grupos de protección estándar o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden conjugarse a soportes sólidos o semisólidos . El OH 5' y 3' terminal puede ser fosforilado o sustituido con aminas o porciones del grupo de de terminación de extremo orgánico de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivatizarse a grupos protectores estándar. Polinucleótidos también pueden contener formas análogas de azúcares ribosa o deoxiribosa que en general se conocen en la técnica, incluyendo por ejemplo 2'-0-metil-, 2'-0-alil-, 2'-fluoro- o 2 ' -azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares -anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos, y análogos nucleósido básicos tales como metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos de enlace alternos. Estos grupos de enlace alternos incluyen pero no están limitados a modalidades en donde fosfato se reemplaza por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato") , (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)0R', CO, o CH2 ( "formacetal" ) , en donde cada R o R' es independientemente es H o alquilo sustituido o sin sustituir (1-20 C) opcionalmente que contiene un enlace éter (-O-), alquilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido requieren ser idénticos . La descripción precedente aplica a todos los polinucleótidos aquí referidos, incluyendo RNA y DNA.

"Oligonucleótido" , como se emplea aquí, se refiere en general a polinucleótidos sintéticos de una sola hebra, que en general pero no necesariamente tienen menos de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente excluyentes. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y completamente aplicable a oligonucleótidos .

El término "cebador" se refiere a un polinucleótido de una sola hebra que es capaz de hibridizar a un ácido nucleico y seguir polimerización de un ácido nucleico complementario, generalmente al proporcionar un grupo 3 '-OH libre .

La expresión "molécula pequeña" se refiere a cualquier molécula con un peso molecular de aproximadamente 2000 Daltons o menos, de preferencia de aproximadamente 500 Daltons o menos .

Las expresiones "célula huésped" , "línea de células huésped" y "cultivo de célula huésped" se emplean en forma intercambiable y se refieren a células en donde ácido nucleico exógeno se ha introducido, incluyendo la progenie de estas células. Células huésped incluyen "transformantes" y "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie de ahí derivada sin consideración al número de pasajes. Progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula precursora, pero puede contener mutaciones. Progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica como se criba o selecciona en la célula transformada originalmente, se incluye aquí.

El término "vector" , como se emplea aquí , se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al cual se enlaza. El término incluye el vector como una estructura de ácido nucleico a otro replicante así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la cual se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los cuales se enlazan operativamente. Estos vectores se refieren aquí como "vectores de expresión" .

Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha separado de un componente de su ambiente natural . En algunas modalidades, un anticuerpo se purifica a más de 95% o 99% de pureza como se determina por ejemplo por medios electroforáticos (por ejemplo, SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF) , electroforesis capilar) o cromatográficos (por ejemplo, HPLC de intercambio de iones o de fase inversa) . Para revisar métodos para evaluar pureza de anticuerpos, ver, por ejemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) .

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que se ha separado de un componente de su ambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que ordinariamente contienen la molécula de ácido nucleico, pero la molécula de ácido nucleico está presente en forma exacromosomal o en un sitio cromosomal que es diferente de su ubicación cromosomal natural .

El término "anticuerpo" aquí se emplea en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo pero no limitadas a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpo siempre que exhiban la actividad de enlace de antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente a un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que enlaza al antígeno al cual enlaza el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen pero no están limitados a Fv, Fab, Fab1 , Fab' -SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, scFv) ; y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo .

Un "anticuerpo que liga al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia, se refiere a un anticuerpo que bloquea el enlace del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia en 50% o más, y por el contrario, el anticuerpo de referencia bloquea el enlace del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia en 50% o más. Un ensayo de competencia ejemplar se proporciona aquí.

Las expresiones "anticuerpo de longitud íntegra" , "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se emplean aquí en forma intercambiable para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe como se define aquí.

La expresión "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o ligan al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ejemplo que contienen mutaciones de origen natural o que surgen durante producción de una preparación de anticuerpo monoclonal, tales como variantes generalmente presentes en cantidades menores . En contraste a preparaciones de anticuerpo policlonal, que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en un antígeno. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no habrá de interpretarse que requiera producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por una variedad de técnicas, incluyendo pero no limitadas al método de hibridoma, métodos de DNA recombinante , métodos de expresión en fago y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen todo o parte de los sitios de inmunoglobulina humana, estos métodos y otros métodos ejemplares para producir anticuerpos monoclonales aquí se describen.

"Anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina de origen natural con estructuras variantes . Por ejemplo, anticuerpos IgG nativos son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 Daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están unidas por disulfuro . De extremo N- a C-, cada cadena pesada tiene una región variable (VH) , también denominada un dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguidos por tres dominios constantes (CH1, CH2, y CH3) . Similarmente, de extremo N- a C-, cada cadena ligera tiene una región variable (VL) , también denominada un dominio ligero variable o un dominio variable de cadena ligera seguido por un dominio ligero constante (CL) . La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos denominados kappa ( ) y lambda (?) , con base en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante .

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que una porción de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especies particulares, mientras que el resto de la cadena pesada y/o ligera se deriva de una fuente o especie diferente.

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias se codifican anticuerpo humano. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno no humanos.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos aminoácidos de HVRs no humanos y residuos aminoácidos de FRs humanos . En ciertas modalidades, un anticuerpo humanizado comprenderé sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en donde todo o sustancialmente todo de HVRs (por ejemplo, CDRs) corresponde a aquellos de un anticuerpo no humano y todo o sustancialmente todo de FRs corresponde a aquellos de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender al menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo no humano se refiere a un anticuerpo que se ha sometido a humanización.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante que posee su cadena pesada. Hay cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de estas pueden ser divididos en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3/ IgG , y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente.

"Funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas que se atribuyen a la región Fe de un anticuerpo, que varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen: enlace Clq y citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) ; enlace a receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación a la baja de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) ; y activación de célula B.

El término "región Fe" aquí se emplea para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes. En una modalidad, una región Fe de cadena pesada IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, al extremo carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C-terminal (Lys447) de la región Fe puede o no estar presente. A menos que se especifique de otra forma aquí, la numeración de residuos aminoácidos en la región Fe o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado el índice EU, como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Marco" o "FR" se refieren a residuos de dominio variable diferentes a residuos de región hipervariable (HVR) . FR de un dominio variable en general consiste de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 , y FR4. De acuerdo con esto, las secuencias HVR y FR en general aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL) : FR1-H1 (Ll) -FR2-H2 (L2) -FR3-H3 (L3) -FR .

Un "marco consenso humano" es un marco que representa los residuos aminoácidos de origen más común en una selección de secuencias marco VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. En una modalidad, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., arriba. En una modalidad, para VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Un "marco humano aceptor" para los presentes propósitos es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco de dominio variable de cadena ligera (VL) o un marco de dominio variable de cadena pesada (VH) derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano, como se define a continuación. Un marco humano aceptor "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o un marco consenso humano, puede comprender su misma secuencia de aminoácidos, o puede contener cambios en secuencia de aminoácidos. En algunas modalidades, el número de cambios de aminoácidos son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas modalidades, el marco humano aceptor VL es idéntico en secuencia a la secuencia marco de inmunoglobulina humana VL o secuencia de marco consenso humano .

La expresión "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena ligera o pesada de anticuerpo que está involucrado en enlace del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo, en general tienen estructuras similares, con cada dominio que comprende cuatro regiones marco conservadas (FRs) y tres regiones hipervariables (HVRs) . {Ver, por ejemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed. , W.H. Freeman and Co., página 91 (2007).) Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de enlace de antígeno. Además, anticuerpos que enlazan un antígeno particular pueden ser aislados utilizando un dominio VH o VL de un anticuerpo que enlaza el antígeno para cribar una biblioteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Ver, por ejemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

La expresión "región hipervariable" o "HVR" , como se emplea aquí, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos ("bucles hipervariables"). En general, anticuerpos de cuatro cadenas nativos comprenden seis HVRs; tres en VH (Hl, H2, H3) , y tres en VL (Ll, L2, L3) . HVRs en general comprenden residuos aminoácidos de los bucles hipervariables y/o de las "regiones de determinación de complementariedad" (CDRs) , estas últimas son de la más alta variabilidad de secuencia y/o involucradas en reconocimiento de antígeno. Bucles hipervariable ejemplares ocurren en residuos de aminoácidos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) , y 96-101 (H3) . (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Ejemplares CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 , CDR-H1, CDR-H2 , y CDR-H3) ocurren en los residuos aminoácidos 24-34 de Ll, 50-56 de L2, 89-97 de L3 , 31-35B de Hl, 50-65 de H2 , y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Excepto por CDR1 en VH, CDRs en general comprenden los residuos aminoácidos que forman los bucles hipervariables . CDRs también comprenden "residuos de determinación de especificidad" o "SDRs" , que son residuos que hacen contacto al antígeno. SDRs están contenidos en regiones de CDRs denominadas CDRs- abreviadas, o a-CDRs. Ejemplares a-CDRs (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-Hl, a-CDR-H2, y a-CDR-H3) ocurren en residuos aminoácidos 31-34 de Ll, 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de Hl, 50-58 de H2, y 95-102 de H3. {Ver Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008). A menos que se indique de otra forma, residuos HVR y otros residuos en el dominio variable (por ejemplo, residuos FR) se enumeran aquí de acuerdo con Kabat et al., supra .

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sólo sitio de enlace de molécula (por ejemplo un anticuerpo) y su socio de enlace (por ejemplo un antígeno) . A menos que se indique de otra forma como se emplea aquí "afinidad de enlace" se refiere a afinidad de enlace intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de enlace (por ejemplo, anticuerpo y antígeno) . La afinidad de una molécula X por su socio Y puede ser en general representada por la constante de disociación (Kd) . La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo aquellos aquí descritos. Modalidades ilustrativas y ejemplares específicas para medir afinidad de enlace se describen a continuación.

Un anticuerpo "madurado de afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVRs) , en comparación con un anticuerpo precursor que no posee estas alteraciones, estas alteraciones resultan en una mejora en la afinidad del anticuerpo para antígeno.

Las expresiones "anticuerpo anti-FGF19" y "un anticuerpo que enlaza a polipéptido FGF19" se refieren a un anticuerpo que es capaz de enlazar polipéptido FGF19 con afinidad suficiente tal que el anticuerpo es útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico para hacer diana en FGF19. En una modalidad, la extensión de enlace de un anticuerpo anti-FGF19 a un polipéptido no-FGF19 no relacionado es menos que aproximadamente 10% del enlace del anticuerpo a polipéptidos FGF19 medidos, por ejemplo por radioinmunoensayo (RIA) . En ciertas modalidades, un anticuerpo que enlaza a polipéptido FGF19 tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ?, = 100 nM, = 10 nM, < 1 nM, = 0.1 nM, = 0.01 nM, o = 0.001 nM (por ejemplo, 10"8 M o menos, por ejemplo, de 10"8 M a 10"13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10~13 M) . En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-FGF19 enlaza a un epxtopo de FGF19 que es único entre FGF19.

Un anticuerpo "bloqueador" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce actividad biológica del antígeno que enlaza. Preferidos anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas sustancial o completamente inhiben la actividad biológica del antígeno.

Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no se conjuga a una porción heteróloga (por ejemplo, una porción citotóxica) o radioetiqueta. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más moléculas heterólogas, incluyendo pero no limitado a un agente citotóxico.

"Por ciento (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de polipéptidos de referencia se define como el por ciento de residuos aminoácido en una secuencia candidato que es idéntico con los residuos aminoácidos en la secuencia de polipéptido de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, de ser necesario, para lograr el máximo por ciento de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustituciones conservadoras como parte de la identidad de secuencia. Alineamiento para propósitos de determinar por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos puede lograrse en diversas formas que están dentro de la destreza en la especialidad, por ejemplo utilizando programas de computadora disponible al público tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAR) . Aquellos con destreza en la especialidad pueden determinar parámetros apropiados para secuencias de alineación, incluyendo cualesquiera algoritmos requeridos para lograr alineamiento máximo sobre toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los presentes propósitos sin embargo, valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos se generan utilizando el programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computadora para comparación de secuencias ALIGN-2 tiene como autor Genentech, Inc., y el código fuente se ha presentado con la documentación de usuario en la Oficina de Derechos de Autor de los E.U.A. , Washington D.C., 20559, en donde está registrado bajo el Registro de Derechos de Autor de los E.U.A. Número TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible al público de Genentech, Inc., South San Francisco, California, o puede compilarse del código fuente. El programa ALIGN-2 deberá ser compilado para uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX digital V4.0D. Todos los parámetros de comparación de secuencia se ajustan por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones en donde ALIGN-2 se emplea para comparaciones de secuencia de aminoácidos, el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos determinada A, a, con o contra una secuencia de aminoácidos determinada B (que en forma alterna puede redactarse como una secuencia de aminoácidos determinada A que tiene o comprende un cierto por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos a, con o contra una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos aminoácidos calificados como correspondencias idénticas por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en ese alineamiento del programa de A y B, y en donde Y es el número total de residuos aminoácidos en B. Se apreciará que cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de A a B no será igual al por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos de B a A. A menos de que se establezca específicamente de otra forma, todos los valores de por ciento de identidad de secuencia de aminoácidos aquí empleados se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente utilizando el programa de computadora ALIGN-2.

El término "detección" incluye cualesquiera medios para detectar, incluyendo detección directa e indirecta.

El término "biomarcador" como se emplea aquí, se refiere a un indicador, por ejemplo predictivo, de diagnóstico, toxicidad y/o pronóstico, que pueda ser detectado en una muestra. El biomarcador puede servir como un indicador de un subtipo particular de enfermedad o desorden (por ejemplo cáncer) , distinguido por ciertas características moleculares, patológicas, histológicas y/o clínicas. En algunas modalidades, el biomarcador es un gen. En algunas modalidades, el biomarcador es una variación (por ejemplo, mutación y/o polimorfismo) de un gen. En algunas modalidades, el biomarcador es un producto metabólico. Biomarcadores incluyen pero no están limitados a polinucleótidos (por ejemplo , DNA, y/o R A) , polipéptidos , modificaciones polipéptido y polinucleótido (por ejemplo, modificaciones post-traducción) , carbohidratos y/o marcadores moleculares de base glicolípido.

La "presencia" , "cantidad" o "nivel" de un biomarcador asociado con un beneficio clínico incrementado a un individuo, es un nivel detectable en una muestra biológica. Esto se puede medir por métodos conocidos por una persona con destreza en la técnica y también aquí se describen. El nivel o cantidad de expresión de un biomarcador estimado pueden utilizarse para determinar la respuesta al tratamiento .

La expresión "nivel de expresión" en general se refiere a la cantidad de un biomarcador en una muestra biológica. "Expresión" en general se refiere al proceso por el cual la información (por ejemplo codificada en genes y/o epigenética) se convierte en estructuras presentes y que operan en la célula. Por lo tanto, como se emplea aquí "expresión" puede referirse a transcripción en un polinucleótido, traducción en un polipéptido, o incluso modificaciones polinucleótido y/o polipéptido (por ejemplo modificación post traducción de un polipéptido) . Fragmentos de polinucleótido transcrito, el polipéptido traducido o modificaciones polinucleótido y/o polipéptido (por ejemplo modificación post-traducción de un polipéptido) también habrán de considerarse como expresadas ya sea si se originan de una transcripción generada por corte y empalme alterno o una transcripción degradada, o de un procesamiento post-traducción del polipéptido, por ejemplo por proteólisis. "Genes expresados" incluyen aquellos que se transcriben en un polinucleótido como mRNA y después traducen en un polipéptido, y también aquellos que se transcriben en RNA pero no traducen en un polipéptido (por ejemplo, RNAs de transferencia o ribosomal) .

"Expresión elevada" , "niveles de expresión elevados" o "niveles elevados" se refieren a un expresión incrementada o niveles incrementados de un biomarcador en un individuo respecto a un control, tal como un individuo o individuos que no sufren de la enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) o un control interno (por ejemplo, biomarcador de mantenimiento) .

La expresión "biomarcador de mantenimiento" se refiere a un biomarcador o grupo de biomarcadores (por ejemplo, polinucleótidos y/o polipéptidos) que típicamente están presentes de manera similar en todos los tipos de células. En algunas modalidades, el biomarcador de mantenimiento es un "gen de mantenimiento" . Un "gen de mantenimiento" se refiere aquí a un gen o grupo de genes que codifican proteínas cuyas actividades son esenciales para el mantenimiento de función celular y que típicamente están presentes de manera similar en todos los tipos de células.

"Amplificación", como se emplea aquí en general se refiere al proceso de producir múltiples copias de una secuencia deseada. "Múltiples copias" significan al menos dos copias. Una "copia" no necesariamente significa perfecta complementariedad o identidad de secuencia a la secuencia plantilla. Por ejemplo, copias pueden incluir análogos nucleótido tales como deoxiinosina, alteraciones de secuencia intencionales (tales como alteraciones de secuencia introducidas a través de un cebador que comprende una secuencia que es hibridizable pero no complementaria a la plantilla) y/o errores de secuencia que ocurren durante amplificación.

La expresión "multiplex-PCR" se refiere a una sola reacción PCR que se lleva a cabo en un ácido nucleico que se obtiene de una sola fuente (por ejemplo, un individuo) utilizando más de un conjunto cebador para el propósito de amplificar dos o más secuencias de DNA en una sola reacción.

"Rigor" de reacciones de hibridización se determina fácilmente por una persona con destreza en la especialidad, y en general es un cálculo empírico que depende de la longitud de sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, sondas más largas requieren superiores temperaturas para adecuado alineamiento, mientras que sondas más cortas requieren menores temperaturas . Hibridización en general depende de la capacidad del DNA desnaturalizado para realinear cuando hebras complementarias están presentes en un ambiente por debajo de su temperatura de fusión. Entre más alto sea el grado de homología deseado entre la sonda de la secuencia hibridizable, superior será la temperatura relativa que pueden emplearse. Como resultado, se concluye que superiores temperaturas relativas tenderán a hacer más severas las condiciones de reacción, mientras que menores temperaturas menos. Para detalles adicionales y explicación de rigor de reacciones de hibridización ver, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley InterScience Publishers, (1995) .

"Condiciones severas" o "condiciones de alto rigor", como se define aquí, pueden ser identificadas por aquellas que: (1) emplean baja concentración iónica y alta temperatura para lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M /citrato de sodio 0.0015 M / dodecil sulfato de sodio 0.1% a 50°C; (2) emplean durante hibridización un agente de desnaturalización tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0.1% / Ficoll al 0.1% / polivinilpirrolidona al 0.1% / amortiguador fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) hibridización durante la noche en una solución que emplea formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml) , SDS al 0.1%, y dextran sulfato al 10% a 42°C, con un lavado de 10 minutos a 42°C en 0.2 x SSC (cloruro de sodio/citrato de sodio) seguido por lavado de alto rigor por 10 minutos que consiste de SSC 0.1 x que contiene EDTA a 55°C.

"Condiciones moderadamente severas" pueden ser identificadas como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluye el uso de solución de lavado y condiciones de hibridización (por ejemplo temperatura, concentración iónica y %SDS) menos severas que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas es incubación durante la noche a 37°C en una solución que comprende: formamida al 20%, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), solución de Denhardt 5 x, dextran sulfato al 10%, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón cizallado Desnaturalizado, seguido por lavar los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50°C. La persona con destreza reconocerá como ajustar la temperatura, concentración iónica, etc., según sea necesario para acomodar factores tales como longitud de sonda y semejantes.

El término "diagnóstico" se emplea aquí para referirse a la identificación o clasificación de un estado, enfermedad o condición molecular patológico (por ejemplo, cáncer) . Por ejemplo "diagnóstico" puede referirse a la identificación de un tipo particular de cáncer. "Diagnóstico" también puede referirse a la clasificación de un subtipo particular de cáncer, por ejemplo por criterios histopatológicos , o por características moleculares (por ejemplo, un subtipo caracterizado por expresión de uno o una combinación de biomarcadores (por ejemplo, genes particulares o proteínas codificadas por los genes) ) .

La expresión "ayuda de diagnóstico" se emplea aquí para referirse a métodos que ayudan en hacer una determinación clínica respecto a la presencia o naturaleza, de un tipo particular de síntoma o condición de una enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) . Por ejemplo, un método de ayuda de diagnóstico de una enfermedad o condición (por ejemplo, cáncer) puede comprender medir ciertos biomarcadores en una muestra biológica de un individuo.

El término "muestra" como se emplea aquí, se refiere a una composición que se obtiene o deriva de un sujeto y/o individuo de interés que contiene una entidad celular y/u otra molecular que se va a caracterizar y/o identificar, por ejemplo con base en características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. Por ejemplo, la frase "muestra enferma" y sus variaciones, se refiere a cualquier muestra que se obtiene de un sujeto de interés que se esperará o se conoce que contenga la entidad celular y/o molecular que se va a caracterizar. Muestras incluyen pero no están limitadas a células o líneas celulares primarias o cultivadas, sobrenadantes celulares, lisados celulares, plaquetas, suero, plasma, fluido vitreo, fluido linfático, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniótico, leche, sangre entera, células derivadas de sangre, orina, fluido cerebroespinal, saliva, esputo, lágrimas, transpiración, moco, lisados de tumor y medio de cultivo de tejido, extractos de tejido tales como tejido homogeneizado, tejido de tumor, extractos celulares y sus combinaciones.

Por "muestra de tej ido" o "muestra celular" se entiende una colección de células similares que se obtienen de un tejido de un sujeto o individuo. La fuente de la muestra de tejido o celular puede ser un tejido sólido tal como de órgano, tejido, muestra, biopsia y/o aspirado fresco, congelado y/o conservado; sangre o cualesquiera constituyentes de la sangre tales como plasma; fluidos corporales tales como fluido cerebroespinal, fluido amniótico, fluido peritoneal y fluido intersticial; células de cualquier tiempo de gestación o de desarrollo del sujeto. La muestra de tejido también puede ser células primarias o cultivadas o líneas celulares. Opcionalmente, la muestra de tejido o celular se obtiene de un órgano/tej ido enfermo. La muestra de tej ido puede contener compuestos que no se entremezclan naturalmente con el tej ido en la naturaleza tales como conservadores, anticoagulantes, amortiguadores, fijadores, nutrientes, antibióticos o semejantes.

Una "muestra de referencia" , "célula de referencia", "tejido de referencia", "muestra de control", "célula de control", o "tejido de control", como se emplea aquí, se refiere a una muestra, célula o tejido estándar o nivel que se utiliza para propósitos de comparación. En una modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, o tej ido de control se obtiene de una parte sana y/o parte no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejidos o células) del mismo sujeto o individuo. Por ejemplo, células sanas y/o no enfermas de tejido adyacente a las células o tejido enfermo (por ejemplo, células o tejidos adyacentes a un tumor) . En otra modalidad, una muestra de referencia se obtiene de un tejido y/o célula no tratado del cuerpo del mismo sujeto o individuo. Todavía en otra modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, o tejido de control se obtiene de una parte sana y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejidos o células) de un individuo que no es el sujeto o individuo. Todavía en otra modalidad, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control se obtiene de un tejido y/o célula sin tratar del cuerpo de un individuo que no es el sujeto o individuo.

Para los presentes propósitos una "sección" de una muestra de tejido se entiende una sola parte o pieza de una muestra de tejido, por ejemplo una rebanada delgada de tejido o células que se cortan de una muestra de tejido. Se entiende que múltiples secciones de muestras de tej ido pueden tomarse y someterse a análisis, siempre que se entienda que la misma sección de muestra de tejido puede ser analizada tanto a niveles morfológicos como moleculares o analizada con respecto tanto a polipéptidos como polinucleótidos .

Por "correlaciona" o "correlacionar" se entiende comparar en cualquier forma el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo segundos protocolos y/o se pueden utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si un segundo análisis o protocolo deberá ser realizado. Con respecto a la modalidad de análisis o protocolo de polinucleótidos, se pueden utilizar los resultados del análisis o protocolo de expresión de polinucleótidos para determinar si un régimen terapéutico específico deberá ser realizado.

"Respuesta individual" o "respuesta" pueden estimarse utilizando cualquier punto extremo que indica un beneficio al individuo, incluyendo sin limitación, (1) inhibición, en cierta medida del progreso de la enfermedad (por ejemplo, progreso de cáncer) , incluyendo frenado o suspensión completa; (2) una reducción en tamaño de tumor,- (3) inhibición (es decir, reducción, frenado o suspensión completa) de infiltración de células de cáncer en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (4) inhibición (es decir, reducción, frenado o suspensión completa) de metástasis; (5) alivio, en cierta medida de uno o más síntomas asociados con la enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) ; (6) aumento en longitud de supervivencia libre de progreso; y/o (9) disminuida mortalidad en un punto determinado de tiempo después de tratamiento.

La frase " sustancialmente similar", como se emplea aquí, se refiere a un grado de similaridad suficientemente elevado entre los valores numéricos (en general uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparador) tal que una persona con destreza en la técnica considere la diferencia entre los dos valores que no son de significancia estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre los dos valores puede ser por ejemplo menor que aproximadamente 20%, menor que aproximadamente 10%, y/o menor que aproximadamente 5% con una función del valor de referencia/comparador. La frase "sustancialmente normal" se refiere a sustancialmente similar a una referencia (por ejemplo, referencia normal) .

La frase "sustancialmente diferente" se refiere a un grado suficientemente elevado de diferencia entre dos valores numéricos (en general uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/comparador) tal que una persona con destreza en la técnica considere la diferencia entre los dos valores que son de significancia estadística dentro del contexto de la característica biológica medida por los valores (por ejemplo, valores Kd) . La diferencia entre los dos valores puede ser por ejemplo mayor que aproximadamente 10%, mayor que aproximadamente 20%, mayor que aproximadamente 30%, mayor que aproximadamente 40%, y/o mayor que aproximadamente 50% como una función del valor de la molécula de referencia/comparador .

La palabra "etiqueta" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o composición detectable. La etiqueta típicamente se conjuga o fusiona directa o indirectamente con un reactivo, tal como una sonda polinucleótido o un anticuerpo, y facilita la detección del reactivo al cual se conjuga o fusiona. La etiqueta misma puede ser detectable (por ejemplo etiqueta de radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o en el caso de un etiqueta enzimática, puede catalizar alteración química de un subcompuesto o composición sustrato que resulta en un producto detectable.

Una "cantidad efectiva" de un agente se refiere a una cantidad efectiva a dosis y por periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención, antagonista o agonista puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad de la sustancia/molécula, agonista o antagonista para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es aquella en la que cualesquiera efectos tóxicos o nocivos de la sustancia/molécula, agonista o antagonista son superados por los efectos benéficos terapéuticos. Una "cantidad profiláctica efectiva" se refiere a una cantidad efectiva a dosis y por periodos de tiempo necesarios para lograr el resultado profiláctico deseado. En forma típica pero no necesaria, ya que se emplea una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa previa de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

La expresión "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en forma tal que permita la actividad biológica de un ingrediente activo ahí contenido a ser efectivo y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual se le administrará la formulación.

Un "portador farmacéutico aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica diferente a un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéutico aceptable incluye pero no está limitado a un amortiguador, excipiente, estabilizante o conservador.

Como se emplea aquí, "tratamiento" (y sus variaciones gramaticales tales como "tratar" o "someter a tratamiento" ) se refieren a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo que se trata, y pueden realizarse ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Efectos deseables de tratamiento incluyen pero no están limitados a evitar ocurrencia o recurrencia de la enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, evitar metástasis, disminuir la velocidad de progreso de la enfermedad, mejora o paliado del estado de la enfermedad y remisión o pronostico mejorado. En algunas modalidades, se emplean anticuerpos para retardar desarrollo de una enfermedad o para frenar el progreso de una enfermedad.

Las expresiones "desorden proliferativo celular" y "desorden proliferativo" se refieren a desórdenes que se asocian con cierto grado de proliferación de células anormales. En una modalidad, el desorden proliferativo celular es cáncer.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por proliferación/crecimiento celular no regulado. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a carcinoma, linfoma (por ejemplo, linfoma de Hodgkin y no-Hodgkin) , blastoma, sarcoma, y leucemia.

Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cáncer pulmonar, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mamá, cáncer de colon, cáncer colorectal, cáncer de células renales, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salivales, cáncer de riñon, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, leucemia y otros desórdenes linfoproliferativos y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello .

La expresión "terapia anti-cáncer" se refiere a una terapia útil para tratar cáncer. Ejemplos de agentes terapéuticos anti-cáncer incluyen pero están limitados a por ejemplo agentes quimioterapéuticos , agentes inhibidores de crecimiento, agentes citotóxicos, agentes empleados en terapia de radiación, agentes anti-angiogénesis , agentes apoptósicos, agentes anti-tubulina, y otros agentes para tratar cáncer, anticuerpos anti-CD20, inhibidores de factor de crecimiento derivados de plaquetas (por ejemplo, Gleevec (Imatinib Mesylate) ) , un inhibidor COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferonas, citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que ligan a uno o más de las siguientes dianas PDGFR-beta, BlyS, APRIL, receptor (es) de BC A, TRAIL/Apo2 , y otros agentes químicos y bioactivos y orgánicos, etc. Sus combinaciones también se incluyen en la invención.

La expresión "agente citotóxico" como se emplea aquí, se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o provoca muerte o destrucción celular. Agentes citotóxicos incluyen pero no están limitados a isótopos radiactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu) ; agentes quimioterapéuticos o fármacos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes de intercalado) ; agentes inhibidores de crecimiento; enzimas y sus fragmentos tales como enzimas nucleolíticas ; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales, incluyendo sus fragmentos y/o variantes, y los diversos agentes antitumor o anti-cáncer descritos a continuación.

Un "agente quimioterapéutico" se refiere a un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CITOXA ®) ; alquil sulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilomelamina; acetogeninas (en especial bulatacina y bulatacinona) ; delta- 9-tetrahidrocannabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapachona,-lapachol; colchicinas ; ácido betullnico; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan (HICAMTIN®) , CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina, y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilínico; tenipósido; criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8) dolastatina; duocarraicina (incluyendo los análogos sintéticos, K -2189 y CB1-TM1) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, en especial calicheamicina gammall y calicheamicina omegall (ver, por ejemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed.

Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, un inhibidor de integrina alfa-4 oral; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; así como neocarzinostatina cromóforo y cromóforos antibióticos de cromoproteína enediina relacionados) ,- aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo ADRIAMICIN®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposomas HC1 doxorubicina (DOXIL®) , doxorubicina liposomal TLC D-99 (MIOCET®) , doxorubicina liposomal pegilada (CAELIX®) , y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®) , tegafur (UFTORAL®) , capecitabina (XELODA®) , una epotilona, y 5-fluorouracil (5-FU) ; análogo de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6- azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostañolona propionato, epitiostanol, mepitiostana, testolactona anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolinico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina,-losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2, 2' , 2' -triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®) , formulación de nanopartículas de ingeniería de albúmina de paclitaxel (ABRAXANE™) , y docetaxel (TAXOTERE®) ; cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatina, oxaliplatina (por ejemplo, ELOXATIN®) , y carboplatina; vincas, que evitan polimerización de tubulina que forme microtúbulos, incluyendo vinblastina (VELBA ®) , vincristina (ONCOVIN®) , vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) , y vinorelbina (NAVELBINE®) ; etopósido (VP-16) ; ifosfamida,-mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterin ; ibandronato ; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinóico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®) ; bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®) , NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®) , alendronato (FOSAMAX®) , pamidronato (AREDIA®) , tiludronato (SKELID®) , o risedronato (ACTONEL®) ; troxacitabina (un análogo 1, 3-dioxolano nucleósido citosina) ; oligonucleótidos anti sentido, en particular aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de células aberrantes tales como por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, y un receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; vacunas tales como la vacuna TERATOPE® y vacunas de terapia de genes, por ejemplo, la vacuna ALLOVECTIN®, la vacuna LEUVECTIN®, y la vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LÜRTOTECAN®) ; rmRH (por ejemplo, ABARELIX®) ; BAI439006 (sorafenib; Bayer) ; SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer) ; perifosina, inhibidor COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib) , inhibidor de proteasoma (por ejemplo, PS341) ; bortezomib (VELCADE®) ; CCI-779; tipifarnib (R11577) ; orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sodio (GENASENSE®) ; pixantrona; inhibidores EGFR (ver definición a continuación) ; inhibidores de tirosina quinasa (ver definición a continuación) ; inhibidores de serina-treonina quinasa tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®) ; inhibidores de farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASAR™) ; y sales farmacéuticamente aceptables, ácidos o derivados de cualquiera de los anteriores; así como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, y prednisolona; y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovorina.

Agentes quimioterapéuticos se definen aquí que incluyen "agentes anti-hormonales" o "terapéuticos endocrinos" que actúan para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer. Estas pueden ser hormonas mismas, incluyendo pero no limitadas a: anti-estrógenos con perfil agonista/antagonista mixto, incluyendo tamoxifen (NOLVADEX®) , 4-hidroxitamoxifen, toremifen (FARESTON®) , idoxifen, droloxifen, raloxifen (EVISTA®) , trioxifen, keoxifen, y moduladores de receptor de estrogeno selectivos (SERMs) tales como SERM3; anti-estrógenos puros con propiedades agonistas tales como fulvestrant (FASLODEX®) , y E 800 (tales agentes pueden bloquear dimerización de receptor de estrogeno (ER) , inhibir enlace de DNA, incrementar recambio de ER, y/o suprimir niveles de ER) ; inhibidores de aromatasa, incluyendo inhibidores de aromatasa esteroidal tales como formestano y exemestano (AROMASIN®) , e inhibidores de aromatasa no esteroidal tales como anastrazol (ARIMIDEX®) , letrozol (FEMARA®) y aminoglutetimida, y otros inhibidores de aromatasa incluyen vorozol (RIVISOR®) , megestrol acetato (MEGASE®) , fadrozol, y 4 (5) -imidazoles ; agonistas de hormona de liberación de hormona luteinizante, incluyendo leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®) , goserelina, buserelina, y tripterelina; esteroides de sexo, incluyendo progestinas tales como megestrol acetato y medroxiprogesterona acetato, estrógenos tales como dietilstilbestrol y premarina, y andrógenos/retinoides tales como fluoximesterona, todo ácido transretiónico y fenretinida; onapristona; anti-progesteronas; reguladores a la baja de receptor de estrogeno (ERDs) ; anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida y bicalutamida; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores, así como combinaciones de dos o más de los anteriores .

El término "profármaco" como se emplea en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica a células de tumor en comparación con un fármaco precursor y es capaz de ser activado o convertido enzimáticamente en la forma precursora más activa. Ver, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615t Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los profármacos de esta invención incluyen pero no están limitados a profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que contienen péptido, profármacos modificados de D-aminoácido, profármacos glicosilados , profármacos que contienen ß-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivarse en una forma de profármaco para uso en esta invención incluyen pero no están limitados a aquellos agentes quimioterapéuticos anteriormente descritos.

Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o composición que inhibe crecimiento de una célula (por ejemplo, la célula cuyo crecimiento depende de FGF19, FGFR4 , y/o gen klotho (por ejemplo, KLB) y/o expresión de FGF19, FGFR4 , y/o klotho (por ejemplo, KLB) ya sea in vitro o in vivo) . Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el progreso del ciclo celular (en un sitio diferente a fase S) , tales como agentes que inducen freno Gl y freno fase M. Bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que frenan Gl también derraman sobre el freno de fase S, por ejemplo agentes alquilantes de DNA tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluorouracilo, y ara-C. Mayor información puede encontrarse en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn and Israel, eds . , Capítulo 1, con título "Cell cicle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami yet al. (WB Saunders : Philadelphia, 1995), en especial p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer ambos derivados del árbol del tejo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamblado de microtúbulos de dímero de tubulina y estabiliza microtúbulos al evitar despolimerización que resulta en la inhibición de mitosis en células.

Por "terapia de radiación" se entiende el uso de rayos gamma dirigidos o rayos beta para inducir suficiente daño a una célula para limitar su capacidad para funcionar normalmente o destruir por completo la célula. Se apreciará que hay muchas formas conocidas en la técnica para determinar la dosis y duración de tratamiento. Tratamientos típicos se dan como una administración única a intervalos de dosis típicos desde 10 a 200 unidades (Grays) por día.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Mamíferos incluyen pero no están limitados a animales domesticados (por ejemplo, vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ejemplo, humanos y primates no humanos tales como monos) conejos y roedores (por ejemplo, ratones y ratas) . En ciertas modalidades, el individuo o sujeto es un humano.

El término "concurrentemente" se emplea aquí para referirse a administración de dos o más agentes terapéuticos, en donde al menos parte de la administración se superpone en tiempo. De acuerdo con esto, administración concurrente incluye un régimen de dosis cuando la administración de uno o más agentes continúa después de interrumpir la administración de uno o más otros agentes .

Por "reducir" o "inhibir" se entiende la capacidad por provocar una disminución total de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o mayor. Reducir o inhibir puede referirse a los síntomas del desorden que se trata, la presencia o tamaño de metástasis, o el tamaño del tumor primario .

La expresión "inserto de empaque" se emplea para referirse a instrucciones usualmente incluidas en empaques comerciales de productos terapéuticos, que contienen información respecto a las indicaciones, uso, dosis, administración, terapia de combinación, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos .

Un "artículo de manufactura" es cualquier manufactura (por ejemplo, un empaque o recipiente) o equipo que comprende al menos un reactivo, por ejemplo un medicamento para tratamiento de una enfermedad o desorden (por ejemplo cáncer) , o una sonda para detectar específicamente un biomarcador aquí descrito. En ciertas modalidades, la manufactura o equipo se promueve, distribuye o vende como una unidad para desempeñar los métodos aquí descritos .

Un "auditorio diana" es un grupo de personas o una institución con quienes o a los cuales se promueve o pretende promover un medicamento particular, tal como por mercadotecnia o publicidad, en especial para particulares usos, tratamientos o indicaciones tales como individuos, poblaciones, lectores de periódicos, literatura médica y revistas, observadores de televisión o internet, oyentes de radio o internet, médicos, compañías farmacéuticas, etc.

Como se entiende por una persona con destreza en la técnica, referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro aquí, incluye (y describe) modalidades que se dirigen a un valor o parámetro per se. Por ejemplo, descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye descripción de "X" .

Se entiende que aspectos y modalidades aquí descritos incluyen "consiste" y/o "consiste esencialmente de" aspectos y modalidades. Como se emplea aquí, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos de que se indique de otra forma.

II. Métodos y Usos Aquí se proporcionan métodos para evaluar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra de un individuo (por ejemplo, en comparación con una referencia) y/o tratar una enfermedad o desorden en el individuo con un modulador FGF19. Específicamente, aquí se proporcionan métodos para tratar una enfermedad o desorden en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un modulador FGF19 y evaluar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) en el individuo durante el tratamiento con el modulador FGF19. Por ejemplo, aquí se proporcionan métodos para tratar cáncer en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) y evaluar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) en el individuo durante tratamiento con el antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) .

Además aquí se proporcionan métodos para tratar una enfermedad o desorden en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un modulador FGF19, en donde el tratamiento se basa en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) . Por ejemplo, aquí se proporcionan métodos para tratar cáncer en un individuo, que comprenden administrar al individuo una cantidad efectiva de un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) , en donde el tratamiento se basa en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) .

Además, aquí se proporcionan métodos para tratar una enfermedad o desorden en un individuo, el método comprende : determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo (por ejemplo, en comparación con una referencia) , y administrar una cantidad efectiva de un modulador FGF19 al individuo, con lo que la enfermedad o desorden se trata. Por ejemplo, aquí se proporcionan métodos para tratar cáncer en un individuo, el método comprende: determinar los niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo (por ejemplo, en comparación con una referencia) , y administrar una cantidad efectiva de un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) al individuo, con lo que se trata la enfermedad o desorden.

Aquí se proporcionan métodos para tratar una enfermedad o desorden, que comprenden: (a) seleccionar a un individuo que tiene la enfermedad o desorden, en donde el individuo comprende niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) ; y (b) administrar al individuo de esta manera selecto una cantidad efectiva de un modulador FGF19, con lo que la enfermedad o desorden se trata. Por ejemplo, aquí se proporcionan métodos para tratar cáncer, que comprenden: (a) seleccionar un individuo que tiene cáncer, en donde el individuo comprende niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) ; y (b) administrar al individuo así selecto una cantidad efectiva de un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) , con lo que se trata la enfermedad o desorden.

También aquí se proporcionan métodos para identificar a un individuo que es más o menos probable que exhiba beneficio de tratamiento que comprende un modulador FGF19, el método comprende: determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra que se obtiene del individuo. Por ejemplo, aquí se proporcionan métodos para identificar a un individuo que es más o menos probable que exhiba beneficio del tratamiento que comprende un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) , el método comprende: determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra que se obtiene del individuo. En algunas modalidades, el método además comprende administrar una cantidad efectiva del modulador FGF19.

Se proporcionan aquí métodos para pronosticar si un individuo con una enfermedad o desorden es más o menos probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende un modulador FGF19, el método comprende determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares. Por ejemplo, aquí se proporcionan métodos para pronosticar si un individuo con cáncer es más o menos probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) , el método comprende determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares. En algunas modalidades, la toxicidad es diarrea (por ejemplo, diarrea severa) , deshidratación, bajo consumo de alimentos, disminuido peso corporal, y/o morbilidad. En algunas modalidades, el método además comprende administrar una cantidad efectiva del modulador FGF19.

También se proporcionan aquí métodos para determinar si un individuo con una enfermedad o desorden deberá continuar o interrumpir el tratamiento que comprende un modulador FGF19, el método comprende medir una muestra que se obtiene de los niveles del individuo de uno o más biomarcadores de ácidos biliares, en donde niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) determina que el individuo deberá continuar o interrumpir el tratamiento que comprende el modulador FGF19. Por ejemplo, aquí se proporcionan métodos para determinar si un individuo con cáncer deberá continuar o interrumpir el tratamiento que comprende un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) , el método comprende medir en una muestra que se obtiene del individuo, niveles de uno o más biomarcadores de metabolismos de ácidos biliares, en donde niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos (es decir, en comparación con una referencia) determinan que el individuo deberá continuar o interrumpir tratamiento que comprende el modulador FGF19. En algunas modalidades, el método además comprende administrar una cantidad efectiva del modulador FGF19.

Además, aquí se proporcionan métodos para identificar a un individuo que más probable es conveniente o menos probable conveniente que continúe un tratamiento, en donde el tratamiento comprende un modulador FGF19, con base en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra. Por ejemplo, aquí se proporcionan métodos para identificar a un individuo como más probable conveniente o menos probable conveniente que continúe un tratamiento, en donde el tratamiento comprende un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) , con base en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra. En algunas modalidades, el método además comprende administrar una cantidad efectiva del modulador FGF19.

Aquí se proporcionan métodos para optimizar eficacia terapéutica y/o reducir toxicidad asociadas con un tratamiento de una enfermedad o desorden en un individuo que tiene la enfermedad o desorden que se somete a tratamiento, que comprende: determinar los niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en el individuo. Por ejemplo, aquí se proporcionan métodos para optimizar eficacia terapéutica y/o reducir toxicidad asociadas con un tratamiento de cáncer en un individuo que tiene la enfermedad o desorden que se somete a tratamiento, que comprende: determinar los niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en el individuo. En algunas modalidades, el método además comprende administrar una cantidad efectiva del modulador FGF19.

Además se proporcionan aquí métodos para identificar a un individuo que tiene una enfermedad o desorden que es más probablemente conveniente o menos probablemente conveniente que continúe una dosis y/o programa de dosis de un tratamiento, en donde el tratamiento comprende un modulador FGF19, con base en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra. Por ejemplo, aquí se proporcionan métodos para identificar a un individuo que tiene cáncer como más probablemente conveniente o menos probablemente conveniente que continúe una dosis y/o programa -de dosis de un tratamiento, en donde el tratamiento comprende un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) , con base en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra. En algunas modalidades, el método además comprende administrar una cantidad efectiva del modulador FGF19.

Aquí se proporcionan métodos de ensayo para optimizar eficacia de dosis en un individuo que recibe un modulador FGF19, el método comprende: (a) determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo; (b) recomendar una dosis subsecuente del modulador FGF19 con base en el nivel del biomarcador de metabolismo de ácidos biliares. Por ejemplo, se proporcionan métodos de ensayo para optimizar eficacia de dosis en un individuo que recibe un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) , el método comprende: (a) determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo; (b) recomendar una dosis subsecuente del antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) con base en el nivel del biomarcador de metabolismo de ácidos biliares. En algunas modalidades, el método además comprende administrar una cantidad efectiva del modulador FGF19.

En otro aspecto, se proporcionan métodos de ensayo para evaluar el riesgo de que un individuo desarrolle toxicidad a un modulador FGF19 , el método comprende: (a) determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo; (b) evaluar el riesgo de que el individuo desarrolle toxicidad al modulador FGF19 con base en los niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares. Por ejemplo, se proporcionan métodos de ensayo para evaluar el riesgo de que un individuo desarrolle toxicidad a un antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) , el método comprende: (a) determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo; (b) evaluar el riesgo de que el individuo desarrolle toxicidad al antagonista FGF19 (por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) con base en los niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares. En algunas modalidades, el método además comprende administrar una cantidad efectiva del modulador FGF19.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles reducidos y/o niveles substancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) en la muestra del individuo indican y/o determinan que el individuo es más o menos probable que exhiba beneficio de tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo es menos probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo deberá continuar el tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo como más probablemente conveniente que continúe el tratamiento que comprende el modulador FGF19, y/o el individuo es más probablemente conveniente que continúe la dosis y/o programa de dosis del tratamiento que comprende el modulador FGF19.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) indican y/o que el individuo es menos probable que exhiba beneficio del tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo es más probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo deberá interrumpir el tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo es menos probablemente conveniente que continúe el tratamiento que comprende el modulador FGF19, una necesidad por disminuir la cantidad y/o frecuencia del modulador FGF19 subsecuentemente administrado al individuo, y/o el individuo es menos probable que sea conveniente que continúe la dosis y/o programa de dosis del tratamiento que comprende el modulador FGF19.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es una enzima del hígado. En algunas modalidades, la enzima del hígado es una enzima de hígado-suero.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de los ácidos biliares es un ácido biliar. En algunas modalidades, el ácido biliar es ácido biliar total. En algunas modalidades, el ácido biliar es ácido biliar hidrofóbico. En algunas modalidades, el ácido biliar es un ácido biliar primario. En algunas modalidades, el ácido biliar primario es ácido cólico (ácido 3a-7a, 12 - ^????G???-5ß colánico) , ácido quenodeoxicólico (ácido 3a, 7a-dihidroxi-5 -colánico) , y/o formas conjugadas de los mismos. En algunas modalidades, el ácido biliar primario es ácido glicocólico, y/o ácido taurocólico. En algunas modalidades, el ácido biliar es un ácido biliar secundario. En algunas modalidades, el ácido biliar secundario es ácido deoxicólico (ácido 3ß, 12a-^????G? ?-5ß-colánico) , ácido litocólico (ácido 3a-hidroxi-5p-colánico, y/o formas conjugadas de los mismos (por ejemplo, glicina y/o taurina) . En algunas modalidades, el ácido biliar secundario es ácido 3a, 12a-hidroxi-5 -colánico, ácido iso-litocólico, y/o ácido 12-oxo-3a-hidroxi-5 -colánico. En algunas modalidades, el ácido biliar secundario es ácido litocólico. En algunas modalidades, el ácido biliar secundario es ácido deoxicólico. En algunas modalidades, el ácido biliar es un ácido biliar terciario. En algunas modalidades, el ácido biliar terciario es ácido ursodeoxicólico (ácido 3a, 7ß-dioxicolánico) y/o formas conjugadas de los mismos (por ejemplo, glicina y/o taurina) .

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es aspartato aminotransferasa (AST) , alanina transaminasa (ALT) , gamma glutamil transpeptidasa (GGT) , alfa-L-fucosidasa (AFU) , adenosina deaminasa (ADA) , actividad de colinesterasa (CHE) , alfa-fetoproteína (AFP) , y/o niveles de bilirubina total (TBIL) .

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es citócromo P450, subfamilia VIIA (colesterol 7 alfa-monooxigenasa) , polipéptido 1 (Cyp7o¡l), bomba de exportación de sales biliares (BSEP) , proteína asociada a resistencia de múltiples fármacos 2 (MRP2/ABCC2) , proteína asociada a resistencia de múltiples fármacos 3 (MRP3/ABCC3 ) , transportador alfa de soluto orgánico (Ost- ) , transportador alfa de soluto orgánico (Ost-ß) , y/o proteína de enlace de ácidos biliares ileal (IBABP) . En algunas modalidades, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es Cyp7al .

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es lesión hepatocelular y/o disfunción. En alguna modalidad de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es necrosis celular sencilla hepatocelular.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles substancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares son niveles entre aproximadamente cualquiera de 36-38% para ácido cólico, 32-34% para ácido quenodeoxicólico, 26-28% para ácido deoxicólico, y/o 1-2% para ácido litocólico y/o menos que 1% para ácido ursodeoxicólico de ácido biliar total. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles reducidos de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares son niveles menos (por ejemplo, significativamente menos) que aproximadamente cualquiera de 36% para ácido cólico, 32% para ácido quenodeoxicólico, 26% para ácido deoxicólico, y/o 1% para ácido litocólico de ácidos biliares totales. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares son niveles mayores (por ejemplo, significativamente mayores) que aproximadamente cualquiera de 38% para ácido cólico, 34% para ácido quenodeoxicólico, 28% para ácido deoxicólico, 2% para ácido litocólico, y/o 1% para ácido ursodeoxicólico de total de ácidos biliares.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles sustancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares están entre aproximadamente de ácidos biliares en suero 2-10 pmol/L (por ejemplo, suelo periférico), 0.2-0.5 g/d de ácidos biliares en heces y/o 8 µp???/Li de ácidos biliares en orina. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares son mayores que aproximadamente 12, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 o 300 µt???/L de ácidos biliares en suero (por ejemplo, suero periférico) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares están entre aproximadamente 12 a aproximadamente 300 µp???/L y/o aproximadamente 100 a aproximadamente 300 pmol/L de ácidos biliares en suero (por ejemplo, suero periférico) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares son mayores que aproximadamente cualquiera de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, o 120 µp???/L de ácidos biliares en orina. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares son aproximadamente de 120 µp???/L. En algunas modalidades, los niveles se miden como niveles de ayuno. En algunas modalidades, los niveles se miden como niveles postprandiales .

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) en la muestra del individuo, indican y/o determinan que el individuo es más probable que exhiba beneficio por tratamiento que comprende modulador FGF19, el individuo es menos probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo deberá continuar tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo como más probablemente conveniente que continúe el tratamiento que comprende el modulador FGF19, y/o el individuo como más probablemente conveniente que continúe la dosis y/o programa de dosis del tratamiento que comprende el modulador FGF19.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles reducidos y/o niveles sustancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) indican y/o que el individuo es menos probable que exhiba beneficio por tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo es más probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo deberá interrumpir tratamiento que comprende el modulador FGF19, el individuo es menos probable conveniente que continúe el tratamiento que comprende el modulador FGF19, una necesidad por disminuir la cantidad y/o frecuencia del modulador FGF19 subsecuentemente administrado al individuo y/o el individuo es menos probable que sea conveniente que continúe la dosis y/o programa de dosis del tratamiento que comprende el modulador FGF19.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es polipéptido que cotransporta taurocolato de sodio (NTCP) , un polipéptido de transporte de anión orgánico, transportador de anión orgánico 2 (0AT2) y proteína asociada a resistencia de múltiples fármacos 4 (MRP4/ABCC4 ) , índice de excreción biliar (BEI) , transportador de ácidos biliares dependiente de sodio apical (ASBT/SLC10A2) , absorción de ácidos biliares y/o captación de taurocolato.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles de expresión elevados y/o niveles se refieren a un aumento total mayor a aproximadamente y/o aproximadamente cualquiera de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor en el nivel de biomarcador de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, metabolito, proteína y/o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mR A) ) , detectado por métodos conocidos en la técnica estándar, tales como aquellos aquí descritos, en comparación con una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. En ciertas modalidades, los niveles de expresión elevados y/o niveles se refieren al aumento en el nivel de expresión y/o niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en la muestra, en donde el incremento es al menos aproximadamente cualquiera de 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, o 100X el nivel de expresión y/o nivel del biomarcador de metabolismo de ácidos biliares respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. En algunas modalidades, niveles de expresión elevados y/o niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares se refieren a un aumento total mayor a aproximadamente 1.1-veces, 1.5-veces, 2-veces, 2.5-veces, 3-veces, 4-veces, 5-veces, 10-veces, 12-veces, 15-veces, 17- veces, aproximadamente cualquiera de 20-veces, 25-veces, y/o 30-veces en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, tejido de control, o control interno (por ejemplo, gen de mantenimiento) .

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, niveles de expresión reducidos y/o niveles se refieren a una reducción total mayor a aproximadamente y/o aproximadamente cualquiera de 5%, 8%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35% 40%, 50%, 60%, 64% 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel de biomarcador de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, metabolito, proteína y/o ácido nucleico (por ejemplo, gen o mRNA) ) , detectado por los métodos conocidos en la técnica estándar tales como aquellos aquí descritos, en comparación con una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. En ciertas modalidades, los niveles de expresión reducidos y/o niveles se refieren a la disminución en nivel de expresión y/o niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en la muestra en donde la disminución es al menos aproximadamente cualquiera de 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, o 100X el nivel de expresión y/o nivel del biomarcador de metabolismo de ácidos biliares respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. En ciertas modalidades, niveles de expresión reducidos y/o niveles se refieren a la disminución en el nivel de expresión y/o niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en la muestra, en donde la disminución es al menos aproximadamente y/o aproximadamente cualquiera de 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X, o 0.01X el nivel de expresión/nivel de biomarcador respectivo en una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la referencia es un nivel promedio del uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares de individuo sano y/o población sana de individuos (por ejemplo, en donde el nivel se mide por un método similar y/o igual) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la referencia es un nivel promedio de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares de un segundo individuo que tiene la enfermedad o desorden y/o población de individuos que tienen la enfermedad o desorden (por ejemplo, en donde el nivel se mide por un método similar y/o igual) . En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la referencia es el nivel de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares del individuo que tiene la enfermedad o desorden antes de iniciar el tratamiento y/o al tiempo de iniciar el tratamiento que comprende el modulador FGF19. En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la referencia es el nivel de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares del individuo que tiene la enfermedad o desorden en un punto en tiempo durante tratamiento que comprende el modulador FGF19.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, la enfermedad o desórdenes en una enfermedad o desorden proliferativo . En algunas modalidades, la enfermedad o desorden proliferativo es cáncer. Ejemplos de cánceres y células de cáncer incluyen pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma (incluyendo meduloblastoma y retinoblastoma) , sarcoma (incluyendo liposarcoma y sarcoma de células sinoviales) , tumores neuroendócrinos (incluyendo tumores carcinoides, gastrinoma, y cáncer de células de isletas) , mesotelioma, schwannoma (incluyendo neuroma acústico) , meningioma, adenocarcinoma, melanoma, y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epitelial) , cáncer pulmonar incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas (SCLC) , cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) , adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o del estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblas oma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama (incluyendo cáncer de mama metastásico) , cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, carcinoma testicular, cáncer esofágico, tumores del tracto biliar, así como cáncer de cabeza y cuello. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer colorectal. En algunas modalidades, el cáncer es carcinoma de células renales. En algunas modalidades, el cáncer es carcinoma hepatocelular. En algunas modalidades, el cáncer es cáncer metastásico.

Presencia y/o niveles de expresión/niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares pueden determinarse en forma cualitativa y/o cuantitativa con base en cualquier criterio conveniente conocido en la especialidad, incluyendo pero no limitado a metabolito, DNA, mPJSTA, cDNA, proteínas, fragmentos de proteínas y/o número de copia de genes. En ciertas modalidades, presencia y/o exprésión/cantidad de un biomarcador de metabolismo de ácidos biliares en una primera muestra se incrementa en comparación con presencia y/o expresión/cantidad en una segunda muestra. En ciertas modalidades, presencia y/o expresión/cantidad de un biomarcador de metabolismo de ácidos biliares en una primera muestra se disminuye en comparación con presencia y/o expresión de una cantidad en una sola muestra. En ciertas modalidades, la segunda muestra es una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control o tejido de control. Descripciones adicionales para determinar presencia y/o nivel de expresión/nivel de un gen, aquí se describen.

Presencia y/o nivel de expresión y/o niveles de diversos biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra pueden ser analizados por una cantidad de metodologías, muchas de las cuales se conocen en la técnica y comprenden por la persona con destreza, incluyendo pero no limitadas a inmunohistoquímica, ("IHC"), análisis de transferencia Western, inmunoprecipitación, ensayos de enlace molecular, ELISA, ELIFA, clasificación celular activada por florescencia ("FACS"), MassARRAY, proteómica, ensayos cuantitativos basados en sangre (tal como por ejemplo ELISA de Suero) , ensayos de actividad enzimática bioquímica, hibridización in situ, análisis Northern, reacción de cadena polimerasa ( "PCR" ) incluyendo PCR en tiempo real cuantitativa ( "qRT-PCR" ) y otros métodos de detección de amplificación tales como por ejemplo de DNA ramificado, SISBA, T A y semejantes) , R A-Seq, FISH, análisis de microhilera, perfilado de expresión de genes y/o análisis serial de expresión de genes ("SAGE"), cromatografía de gas-líquido, cromatografía de líquido de alto desempeño, espectrometría de masas, ensayos enzimáticos así como cualquiera de una amplia variedad de ensayos que pueden realizarse por análisis de matriz de proteína de genes y/o tejido. Protocolos típicos para evaluar el estado de genes y productos de genes se encuentran por ejemplo en Ausubel et al. eds . , 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting) , 15 (Immunoblotting) y 18 (PCR Analysis) . Inmunoensayos multiplejados tales como aquellos disponibles de Medicina Basada en Reglas o Descubrimiento de Escala Meso ("MSD") también pueden emplearse. En algunas modalidades, la expresión se mide por cromatografía de gas-líquido, cromatografía de líquido de alto desempeño, espectrometría de masas (por ejemplo, GS-MS) y/o ensayos enzimáticos .

Métodos para evaluar ácidos biliares y/o captación de ácidos biliares y eflujo son bien conocidos en la técnica y describen en los ejemplos. Captación y eflujo de ácidos biliares pueden ser evaluados utilizando d8-taurocolato como un sustrato sonda utilizando B-Clear Technology™ (Qualyst Inc. , NC) . La masa total de ácidos biliares endógenos (taurocolato, TCA: glicolato, GCA; tauroquenodeoxicolato, TCDCA, glicoquenodeoxicolato, GCDCA) puede determinarse en amortiguador libre de calcio y la masa total del compuesto que se absorbe y excreta puede determinarse en amortiguador que contiene calcio utilizando LC/MS/MS y cuantifica contra curvas estándar preparadas por equivalente de isótopo estables (d8-TCA, d4-GCA, d4-TCDCA, o d4-GCDCA) . índice de excreción de ácidos biliares y eliminación biliar in vitro pueden calcularse como se describió previamente en Liu X. et al. 1999. Drug Metab Dispos 27 (6) : 637-44.

El método de ensayo TBA enzimático utiliza 3-a-hidroxiesteroide dehidrogenasa para catalizar la reacción de oxidación convirtiendo grupo 3 -a hidroxilo de todos los ácidos biliares a grupo 3-ceto con formación concomitante de una co-enzima NADH de NAD+. NADH además se reacciona con azul de nitrotetrazolio, que puede supervisarse por absorbancia medida a 540 nm, que es proporcional a la concentración de ácidos biliares en el suero. En el ensayo TBA basado en ciclado de enzimas, moléculas de ácidos biliares en suero se oxidan repetidamente y reducen por 3 - -hidroxiesteroide dehidrogenasa con una acumulación concomitante de co-enzima tio-NADH reducida que se detecta a 405 nm.

Métodos para evaluar mRNAs en células son bien conocidos e incluyen por ejemplo ensayos de hibridización utilizando sondas DNA complementarias (tales como hibridización in situ utilizando ribosondas etiquetadas específicas para el uno o más genes. Técnicas de transferencia Northern y relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos para uno o más de los genes y otros métodos de detección tipo amplificación, tales como por ejemplo DNA ramificado, SISBA, TMA y semejantes) .

Muestras de mamíferos pueden ensayarse convenientemente para mRNAs utilizando Northern, transferencia punto o análisis PCR. Además, estos métodos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de mRNA diana en una muestra biológica (por ejemplo, por examen simultáneo de los niveles de una secuencia mRNA de control comparativa de un gen de "mantenimiento" tal como un miembro de la familia actina) . Opcionalmente, la secuencia del cDNA diana amplificado puede ser determinada.

Métodos opcionales incluyen protocolos que examinan o detectan mRNAs, tales como mRNAs diana, en una muestra de tejido o células por tecnologías de micromatriz. Utilizando micromatrices de ácido nucleico, muestras de mRNA de prueba y control de muestras de tejido de prueba y control se someten a transcripción inversa y etiquetan para generar sondas cDNA. Las sondas después se hibridizan a una matriz de ácidos nucleicos inmovilizada en un soporte sólido. La matriz se configura tal que la secuencia y posición de cada miembro de la matriz se conozcan. Por ejemplo, una selección de genes cuya expresión se correlaciona con beneficio clínico incrementado reducido de terapia anti-angiogénica puede disponerse en un soporte sólido. Hibridización de una sonda etiquetada con un miembro de matriz particular indica que la muestra de la cual se deriva la sonda expresa ese gen.

De acuerdo con algunas modalidades, nivel de presencia y/o o expresión/nivel se miden al observar niveles de expresión de proteína de un gen anteriormente mencionado. En ciertas modalidades, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con anticuerpos con un biomarcador de metabolismo de ácidos biliares descrito aquí bajo condiciones que permiten enlazar el biomarcador, y detectar si se forma un complejo entre los anticuerpos y biomarcador. Este método puede ser un método in vitro o in vivo. En una modalidad, se emplea un anticuerpo para seleccionar sujetos elegibles para terapia con un modulador FGF19, en particular un anticuerpo anti-FGF19, por ejemplo, un biomarcador de metabolismo de ácidos biliares para selección de pacientes.

En ciertas modalidades, el nivel de presencia y/o expresión/nivel de proteínas biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra se examina utilizando protocolos IHC y de tinción. Tinción IHC de secciones de tejido se ha mostrado que es un método confiable para determinar o detectar la presencia de proteínas en una muestra. En un aspecto, nivel de expresión y/o niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares se determinan utilizando un método que comprende: (a) realizar análisis IHC de una muestra (tal como una muestra de cáncer de paciente) con un anticuerpo; y b) determinar niveles de expresión de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en la muestra. En algunas modalidades, la intensidad de tinción IHC se determina respecto a un valor de referencia .

IHC puede realizarse en combinación con técnicas adicionales tales como tinción morfológica y/o hibridización in-situ fluorescencia. Dos métodos generales de IHC están disponibles; ensayos directos e indirectos. De acuerdo con el primer ensayo, el enlace del anticuerpo al antígeno diana se determina directamente. Este ensayo directo utiliza un reactivo etiquetado, tal como una etiqueta fluorescente o un anticuerpo primario etiquetado con enzima, que puede ser visualizado sin mayor interacción de anticuerpo. En un ensayo indirecto típico, anticuerpos primarios no conjugados enlazan al antígeno y después un anticuerpo secundario etiquetado enlaza al anticuerpo primario. Cuando el anticuerpo secundario se conjuga con una etiqueta enzimática, un substrato cromogénico o fluorogénico se agrega para proporcionar visualización del antígeno. Amplificación de señal ocurre debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopos en el anticuerpo primario.

El anticuerpo primario y/o secundario utilizado para IHC típicamente se etiquetará con una porción detectable . Numerosas etiquetas están disponibles, que en general pueden agruparse en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 12I, 3H, y 131I; (b) partículas de oro coloidal; (c) etiquetas fluorescentes incluyendo, pero no limitadas a, quelatos de tierras raras (quelatos de europio) , Rojo Texas, rodamina, fluoresceína, dansil, Lissamina, umbelliferona, ficocriterina, ficocianina, o fluoróforos comercialmente disponibles tales como SPECTRUM ORANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de cualquiera de uno o más de los anteriores; (d) diversas etiquetas de enzima-substrato están disponibles y la Patente de los E.U.A. No. 4,275,149 proporciona una revisión de algunas de estas. Ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; Patente de los E.U.A. No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas, malato dehidrogenasa, ureasa, peroxidasa tales como peroxidasa de rábano picante (HRPO) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfatasa dehidrogenasa) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa, y semejantes.

Ejemplos de combinaciones enzima- substrato incluyen por ejemplo peroxidasa de rábano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como un substrato; fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenil fosfato como substrato cromogénico ,-y ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un substrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil- ß-D-galactosidasa) o substrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbelliferil-ß-?-galactosidasa) . Para una revisión general de estos, ver las patentes de los E.U.A. Nos. 4,275,149 y 4,318,980.

Especímenes así preparados pueden montarse y cubrirse con cubre-obj etos . Evaluación de porta-objetos después se determina, por ejemplo, utilizando un microscopio, y criterios de intensidad de tinción, empleados rutinariamente en la especialidad, pueden ser empleados. En algunas modalidades, una calificación de patrón de tinción de aproximadamente 1+ o superior se diagnostica y/o pronostica. En ciertas modalidades, una calificación de patrón de tinción de aproximadamente 2+ o superior en un ensayo de IHC es diagnóstico y/o pronóstico. En otras modalidades, una calificación de patrón de tinción de aproximadamente 3 o superior es diagnóstico y/o pronóstico. En una modalidad, se entiende que cuando células y/o tejido de un tumor o adenoma de colon se examinan utilizando IHC, la tinción en general se determina o evalúa en células de tumor y/o tejido (en oposición a tejido estromal o circundante que puede estar presente en la muestra) .

En métodos alternos, la muestra puede ponerse en contacto con un anticuerpo específico para el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo anticuerpo-biomarcador y después detectar el complejo. La presencia del biomarcador de metabolismo de ácidos biliares puede ser detectada en una cantidad de formas, tal como procedimientos de transferencia Western y ELISA para ensayar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Un amplio intervalo de técnicas de inmuno-ensayo utilizando este formato de ensayo están disponibles, ver, por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. Nos. 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estas incluyen tanto ensayos de un solo lado y dos lados o "emparedados" de los tipos no-competitivos, así como en los ensayos de enlace competitivo tradicional. Estos ensayos también incluyen enlace directo de un anticuerpo etiquetado a un biomarcador de metabolismo de ácidos biliares diana.

Nivel de presencia y/o expresión/nivel de un biomarcador de metabolismo de ácidos biliares selecto en una muestra también puede ser examinado por ensayos basados en actividad o funcionales. Por ejemplo, si el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es una enzima, se pueden realizar ensayos conocidos en la técnica para determinar o detectar la presencia de una actividad enzimática determinada en una muestra.

En ciertas modalidades, las muestras se normalizan tanto para diferencias en la cantidad del biomarcador ensayado como la variabilidad en la calidad de las muestras empleadas, y variabilidad entre las corridas de ensayo. Esta normalización puede lograrse al medir e incorporar la expresión de ciertos biomarcadores normalizantes, incluyendo genes de mantenimiento bien conocidos tales como ACTB. En forma alterna, la normalización puede basarse en la señal promedio o mediana de todos los genes ensayados o un gran sub-conjunto de los mismos (enfoque de normalización global) . En una base de gen-por-gen, la cantidad normalizada medida de un mRNA o proteína de tumor de paciente se compara con la cantidad que se encuentra en un conjunto de referencia. Niveles de expresión normalizados por cada mRNA o proteína por tumor probado por paciente, pueden ser expresados como un porcentaje del nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. El nivel de presencia y/o expresión/nivel medido en una muestra de paciente particular a analizar caerá en algún percentil dentro de este intervalo, que puede ser determinado por métodos bien conocidos en la especialidad.

En ciertas modalidades, niveles de expresión relativa de un gen se determinan como sigue: Gen de expresión relativa 1 muestra 1: = 2 exp (gen de mantenimiento Ct - gen Ct 1) con Ct que se determina en una muestra.

Gen de expresión relativa 1 ARN de referencia: = 2 exp (gen de mantenimiento Ct - gen Ct 1) con Ct se determina en la muestra de referencia.

Gen de expresión relativo normalizado 1 muestra 1 = (gen de expresión relativa 1 muestra 1 / gen de expresión relativa 1 referencia RNA) x 100 Ct es el ciclo umbral. Ct es el número de ciclo en el cual fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la línea umbral .

Todos los experimentos se normalizan a un RNA de referencia, que es una mezcla completa de RNA de diversas fuentes de tejido (por ejemplo, referencia RNA #636538 de Clontech, ountain View, CA) . RNA de referencia idénticos se incluyeN en cada corrida de qRT-PCR, permitiendo comparación de resultados entre diferentes corridas experimentales .

En una modalidad, la muestra es una muestra clínica. En otra modalidad, la muestra se emplea en un ensayo de diagnóstico. En algunas modalidades, la muestra se obtiene de un tumor primario o metastásico. Biopsia de tejido a menudo se emplea para obtener una pieza representativa de tejido de tumor. En forma alterna, células de tumor pueden obtenerse indirectamente en la forma de tejidos o fluidos que se conocen o se considera contienen las células de tumor de interés. Por ejemplo, muestras de lesiones de cáncer pulmonar pueden obtenerse por resección, broncoscopía, aspiración de aguja fina, cepillados bronquiales, o de esputo, fluido pleural o sangre. Genes o productos de genes pueden ser detectados de tejido de cáncer o tumor o de otras muestras de cuerpo tales como orina, muestras fecales, tejido de íleo, tejido de hígado, esputo, suero o plasma. En algunas modalidades, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares se detecta de una muestra fecal. En algunas modalidades, el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares se detecta de una muestra de suero. En algunas modalidades, la muestra es una muestra de tejido (por ejemplo, muestra de tejido de hígado y/o muestra de tejido de íleo) . Las mismas técnicas discutidas anteriormente para detección de genes diana o productos de genes en muestras cancerosas pueden aplicarse a otras muestras corporales . Células de cáncer pueden ser desprendidas de lesiones de cáncer y aparecen en estas muestras del cuerpo. Al cribar estas muestras de cuerpo, un simple diagnóstico temprano puede lograrse para estos cánceres. Además, el progreso de terapia puede supervisarse en forma más fácil al probar estas muestras de cuerpo para genes diana y/o productos de genes.

En ciertas modalidades, una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, o tejido de control es una muestra sencilla o múltiples muestras combinadas del mismo sujeto o individuo que se obtienen en uno o más punto sen tiempos diferentes que cuando se obtiene la muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de referencia, células de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, o tejido de control se obtiene en un punto en tiempo previo del mismo sujeto o individuo que cuando la muestra de prueba se obtuvo. Esta muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, o tejido de control puede ser útil si la muestra de referencia se obtiene durante diagnóstico inicial de cáncer y la muestra de prueba posteriormente se obtiene cuando el cáncer se vuelve metastásico.

En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, o tejido de control son múltiples muestras combinadas de uno o más individuos sanos que no son del sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, o tejido de control son múltiples muestras combinadas de uno o más individuos con una enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra de control, célula de control, o tejido de control son muestras de RNA acumuladas de tejidos normales o muestras de plasma o suero acumuladas de uno o más individuos que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, te ido de referencia, muestra de control, célula de control, o tejido de control son muestras de RNA acumuladas de tej idos de tumor o muestras de plasma o suero acumuladas de uno o más individuos con una enfermedad o desorden (por ejemplo, cáncer) que no son el sujeto o paciente.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el modulador FGF19 es un antagonista FGF19. En algunas modalidades, el antagonista FGF19 es un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña de enlace, o polinucleótido . En algunas modalidades, el antagonista FGF19 es un anticuerpo. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas modalidades, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y el fragmento de anticuerpo enlaza a FGF19.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el individuo de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede ser un humano. En algunas modalidades, el humano es femenino. En algunas modalidades, el humano es masculino.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos, el método comprende administrar a un individuo que tiene este cáncer, una cantidad efectiva de un modulador FGF19 en particular antagonista FGF19. En una modalidad semejante, el método además comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de al menos un agente terapéutico adicional como se describe a continuación. En algunas modalidades, el individuo puede ser un humano.

El modulador FGF19, en particular antagonista FGF19 descrito aquí, puede emplearse ya sea sólo o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un modulador FGF19, en particular antagonista FGF19 aquí descrito puede ser co-administrado con al menos un agente terapéutico adicional incluyendo otro modulador FGF19. En ciertas modalidades, un agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico .

Estas terapias de combinación anteriormente anotadas abarcan administración combinada (en donde dos o más agentes terapéuticos se incluyen en las mismas o separadas formulaciones) , y separada administración, en cuyo caso, la administración del modulador FGF19, en particular antagonista FGF19 puede ocurrir antes de, en forma simultánea y/o después de administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante. El modulador FGF19 en particular antagonista FGF19 también puede emplearse en combinación con terapia de radiación.

Un modulador FGF19, en particular un antagonista FGF19 (por ejemplo, un anticuerpo, polipéptido de enlace, y/o molécula pequeña) aquí descrito (y cualquier agente terapéutico adicional) puede ser administrado por cualesquiera medios convenientes, incluyendo administración parenteral, intrapulmonar e intranasal y si se desea para tratamiento local, intralesión. Infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal o subcutánea. Dosis pueden ser por cualquier tipo de ruta conveniente, por ejemplo por inyecciones, tales como inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Diversos programas de dosis incluyen pero no están limitados a administraciones sencillas o múltiples sobre diversos puntos en tiempo, administración de bolo, infusión de pulso se contemplan aquí.

El modulador FGF19, en particular el antagonista FGF19 (por ejemplo un anticuerpo, un polipéptido de enlace y/o una molécula pequeña) aquí descrito puede ser formulado, dosificado y administrado en una forma consistente con la buena práctica médica. Factores para consideración en este contexto incluyen el desorden particular que se trata, el mamífero particular que se trata, la condición clínica del paciente individual, la causa del desorden, el sitio de suministro del agente, el método de administración, la programación de administración y otros factores conocidos para los practicantes médicos. El modulador FGF19, en particular el antagonista FGF19 no requiere ser, pero opcionalmente se formula con uno o más agentes actualmente empleados para evitar o tratar el desorden en cuestión. La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad del modulador FGF19, en particular antagonista FGF19 presente en la formulación, el tipo de desorden o tratamiento y otros factores anteriormente discutidos . Éstos en general se emplean en las mismas dosis y con rutas de administración como se describe aquí, o aproximadamente 1 a 99% de las dosis aquí descritas o en cualquier dosis y por cualquier otra que se determine en forma empírica/clínica como apropiado.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosis apropiada de un modulador FGF19, en particular antagonista FGF19 aquí descrita (cuando se emplea sola o en combinación con uno o más otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de la enfermedad a tratar, la severidad o rigor y curso de la enfermedad, si el modulador FGF19, en particular el antagonista FGF19 se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al modulador FGF19 y la discreción del médico a cargo. El modulador FGF19 en particular el antagonista FGF19 se administra convenientemente al paciente en un momento o sobre una serie de tratamientos. Una dosis diaria típica puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 pg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En algunas modalidades, la dosis del modulador FGF19 (por ejemplo antagonista FGF19, por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) es mayor que y/o mayor que o igual a aproximadamente cualquiera de 3, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, y/o 100 mg/kg. En algunas modalidades, la dosis del modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19, por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) está entre aproximadamente cualquiera de 3-100 mg/kg, 10-100 mg/kg, 10-30 mg/kg, 30-100 mg/kg, y/o 3-30 mg/kg. En algunas modalidades, la dosis del modulador FGF19 (por ejemplo antagonista FGF19, por ejemplo anticuerpo anti-FGF19) es aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, y/o aproximadamente 100 mg/kg. En algunas modalidades, la dosis del modulador FGF19 (por ejemplo antagonista FGF19, por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) es mayor que y/o mayor que o igual a aproximadamente cualquiera de 0.5, 1, 1.5, 5, 10, 25, 50, 75, y/o 100 g/mL. En algunas modalidades, la dosis del modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19, por ejemplo, anticuerpo anti-FGF19) está entre aproximadamente cualquiera de 1.56 - 100 g/mL y/o 500 ng/ml-100 g/mL.

Para administraciones repetidas sobre varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento en general será sostenido hasta que ocurra una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Estas dosis pueden ser administradas en forma intermitente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, tal que un paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte, o por ejemplo, aproximadamente seis dosis del modulador FGF19) . Una dosis de carga superior inicial, seguida por una o más dosis menores pueden ser administradas . Un régimen de dosis ejemplar comprende administrar. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosis . El progreso de esta terapia se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales .

Se entiende que cualquiera de las formulaciones o métodos terapéuticos anteriores pueden llevarse a cabo utilizando un inmunoconjugado en lugar de o además del modulador FGF19, en particular antagonista FGF19.

III. Composiciones Terapéuticas Aquí se proporcionan moduladores FGF19 útiles en los métodos aquí descritos. En algunas modalidades, los moduladores FGF19 son un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña de enlace y/o polinucleótido . En algunas modalidades, los moduladores FGF19 son antagonistas FGF19. A. Anticuerpos En un aspecto, aquí se proporcionan anticuerpos aislados que enlazan a polipéptido FGF19, klotho (por ejemplo, LB) , y/o FGFR4 para utilizar en los métodos aquí descritos. En cualquiera de las modalidades anteriores, un anticuerpo es humanizado. En un aspecto adicional de la invención, el anticuerpo anti-FGF19, anticuerpo anti-klotho (por ejemplo, anticuerpo anti-KLB) , y/o anticuerpo anti-FGFR4 de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico humanizado o humano. En una modalidad, un anticuerpo anti-FGF19, anticuerpo anti-klotho (por ejemplo, anticuerpo anti-KLB) , y/o anticuerpo anti-FGFR4 es un fragmento de anticuerpo, por ejemplo un Fv, Fab, Fab' , scFv, diacuerpo, o fragmento F(ab')2. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud íntegra, por ejemplo, un anticuerpo IgGl intacto u otra clase o isotipo de anticuerpo como se define aquí .

En algunas modalidades, los anticuerpos anti-FGF19 para utilizar en cualquiera de los métodos aquí descritos son anticuerpo anti-FGF19 descrito en la Solicitud de Patente de los E.U.A. Número 11/673,411, presentada en febrero 9, 2007, y/o la Solicitud de Patente de los E.U.A. Número de Serie 12/671,974, presentada en diciembre 6, 2011, que se incorpora por referencia en su totalidad.

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FGF19 comprende: (i) una cadena ligera que comprende (a) una región hipervariable (HVR) -Ll que comprende secuencia de aminoácidos KASQDINSFLA (SEQ ID NO:l) o KASQDINSFLS (SEQ ID N0:7); (b) HVR-L2 que comprende secuencia de aminoácidos RANRLVD (SEQ ID NO:2), RANRLVS (SEQ ID NO:8), o RANRLVE (SEQ ID NO:9); y (c) HVR-L3 que comprende secuencia de aminoácidos LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 3); y (ii) una cadena pesada que comprende (a) HVR-H1 que comprende secuencia de aminoácidos GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 4) ; (b) HVR-H2 que comprende secuencia de aminoácidos es GVIWPGGGTDYNAAFIS (SEQ ID NO: 5); y (c) HVR-H3 que comprende secuencia de aminoácidos VRKEYANLYAMDY (SEQ ID NO: 6).

En algunas modalidades, HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVD (SEQ ID NO: 2). En algunas modalidades, HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos KASQDINSFLS (SEQ ID NO: 7).

En algunas modalidades, HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVS (SEQ ID NO: 8). En algunas modalidades, HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVE (SEQ ID NO: 9). En algunas modalidades, HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos KASQDINSFLA (SEQ ID NO:l) .

En algunas modalidades, el anticuerpo comprende secuencia marco consenso subgrupo ? humano 1. En algunas modalidades, el anticuerpo comprende secuencia marco consenso III subgrupo de cadena humana pesada. En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado inhibe el enlace de FGF19 humano a FGFR4 humano, o inhibe activación de FGFR4 humano, con una IC50 que es sustancialmente la misma que la del anticuerpo de referencia. En algunas modalidades, IC50 se determina a través de un intervalo de concentración de anticuerpo desde aproximadamente 0.01 nm a alrededor de 1000 nM.

En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FGF19 compite para enlace con el anticuerpo descrito anteriormente. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FGF19 enlaza los mismos epítopos que el anticuerpo descrito anteriormente. En algunas modalidades, un anticuerpo anti-FGF19 que enlaza números de aminoácido G133-R155 con base en la secuencia de aminoácidos FGF19 humanos maduros en FGF19 humano. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-FGF19 que liga a un péptido que consiste de GFLPLSHFLPMLPMVPEEPEDLR (SEQ ID NO: 10).

En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-FGF19, anticuerpo anti-klotho (por ejemplo, anticuerpo anti-KLB) , y/o anticuerpo anti-FGFR4, de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriores puede incorporar cualquiera de las características, en forma individual o en combinación como se describe en las siguientes Secciones: 1. Afinidad de Anticuerpo En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona tiene una constante de disociación (Kd) de = ?µ?. En una modalidad, Kd se mide por ensayo de enlace de antígeno radioetiquetado (RIA) que se realiza con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe por el siguiente ensayo. Afinidad de enlace en solución de Fabs para antígeno se mide por Fab de equilibrio con una concentración mínima de antígeno etiquetado con (125I) en la presencia de una serie de titulación de antígeno no etiquetado, después capturar el antígeno enlazado con una placa revestida con anticuerpo anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer condiciones para el ensayo, placa de múltiples pozos ICROTITER* (Thermo Scientific) se revisten durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (pH 9.6), y subsecuentemente se bloquean con albúmina de suero bovino 2% (p/v) en PBS por dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23 °C) . En una placa no adsorbente (Nunc #269620) , antígeno [125I] 100 pM o 26 pM se mezclan con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consistente con evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al.. Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés después se incuba durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar por un más largo periodo (por ejemplo aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcance equilibrio. Posteriormente, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, por una hora) . La solución después se retira y la placa se lava ocho veces con polisorbato 20 0.1% (T EEN-20®) en PBS. Cuando las placas se secan, 150 µ?/???? de agente de destelleo (MICROSCINT-20 ™; Packard) se agregan, y las placas se cuentan en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) por diez minutos. Concentración de cada Fab queda menos que o igual a 20% de máximo enlace se elige para utilizar en los ensayos de enlace competitivos.

De acuerdo con otra modalidad, Kd se mide utilizando ensayos de resonancia plasmón de superficie empleando un BIACORE<S-2000 o un BIACORE *-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU) . Brevemente, chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con hidrocloruro de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4.8, a 5 g/ml (-0.2 µ?) antes de inyección a un gasto de flujo de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de inyección de antígeno, etanolamina 1 M se inyecta para bloquear los grupos sin reaccionar. Para mediciones cinéticas, diluciones en serie dobles de Fab (0.78 nM a 500 nM) se inyectan en PBS con surfactante polisorbato 20 0.05% (TWEEN-20™) (PBST) a 25°C a un gasto de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Velocidades de asociación (kon) y velocidades de disociación (k0ff) se calculan utilizando un modelo de enlace Langmuir 1-a-l simple (BIACORE Evaluation Software versión 3.2) por ajuste simultáneo de los sensorgramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la proporción k0ff/kon. Ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la constante de afinidad excede 106 M"1 s"1 por el ensayo de resonancia plasmón de superficie anterior, entonces la constante de afinidad puede determinarse utilizando una técnica de neutralización fluorescente que mide el aumento o disminución en intensidad de medición de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, paso de banda 16 nm) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en la presencia de concentraciones crecientes de antígeno como se mide en un espectrómetro, tal como espectrofotómetro equipado con flujo tapón (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-AMINCO ™ serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada. 1. Fragmentos de Anticuerpo En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona es un fragmento de anticuerpo. Fragmentos de anticuerpo incluyen pero no están limitados a Fab, Fab' , Fab' -SH, F(ab')2, Fv, y fragmentos scFv, y otros fragmentos descritos a continuación. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpo, ver Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003) . Para una revisión de fragmentos scFv, ver, por ejemplo, Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds . , (Springer-Verlag, New York) , p. 269-315 (1994) ; ver también WO 93/16185; y las Patentes de los E.U.A. Números 5,571,894 y 5,587,458. Para discusión de fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos epítopo de enlace de receptor de recuperación y que tienen incrementada vida media in vivo, ver la Patente de los E.U.A. Número 5,869,046.

Diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace de antígeno que pueden ser divalentes o biespecíficos. Ver, por ejemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden todo o una porción del dominio variable de cadena pesada o todo o una porción del dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo de dominio sencillo es un anticuerpo de dominio sencillo humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. Número 6,248,516 Bl) .

Fragmentos de anticuerpo pueden elaborarse por diversas técnicas, incluyendo pero no limitadas a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como producción por células huésped recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago) , como se describe aquí . 3. Anticuerpos Quiméricos y Humanizados En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos se describen por ejemplo en la Patente de los E.U.A. Número 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ejemplo, una región variable derivada de ratón, rata, hámster, conejo o primate no humano, tal como un mono) , y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "conmutado de clase" en donde la clase o subclase se ha cambiado de aquella del anticuerpo precursor. Anticuerpos quiméricos incluyen sus fragmentos de enlace de antígeno.

En ciertas modalidades, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano se humaniza para reducir inmunogenicidad a humanos, mientras que retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano precursor. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en donde HVRs, por ejemplo, CDRs, (o sus porciones) se derivan de un anticuerpo no humano, y FRs (o sus porciones) se derivan de secuencias de anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá cuando menos una porción de una región constante humana. En algunas modalidades, algunos residuos FR en un anticuerpo humanizado se sustituyen con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ejemplo, el anticuerpo del cual los residuos HVR se derivan) , por ejemplo para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad de anticuerpo.

Anticuerpos humanizados y métodos para producirlos se revisan, por ejemplo en Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y además se describen, por ejemplo en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); Patente de los E.U.A. Números 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321, y 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describe injerto de SDR (a-CDR) ) ; Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe "recubrimiento de superficie"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe "entremezclado FR" ) ; y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (que describe el enfoque "selección guiada" a entremezclado de FR) .

Regiones marco humanas que pueden emplearse para humanización incluyen pero no están limitadas a: regiones marco seleccionadas utilizando el método de "mejor ajuste" (ver, por ejemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiones marco derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada (ver, por ejemplo, C rter et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiones marco maduras humanas (somáticamente mutadas) o regiones marco de línea germinal humana (ver, por ejemplo, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)),- y regiones marco derivadas de criba de bibliotecas FR (ver, por ejemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)). 4. Anticuerpos Humanos En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona es un anticuerpo humano. Anticuerpos humanos pueden producirse utilizando diversas técnicas conocidas en la especialidad. Anticuerpos humanos se describen en general por van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin . Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) .

Anticuerpos humanos pueden ser preparados al administrar un inmunógeno a un animal transgénico que se ha modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos humanos con regiones variables humanas en respuesta a prueba antigénica. Estos animales típicamente contienen todo o una porción de los sitios de inmunoglobulina humana, que reemplazan los sitios de inmunoglobulina endógenos, o que están presentes en forma extracromosomal o integrados aleatoriamente en los cromosomas del animal . En estos ratones transgénicos, los sitios de inmunoglobulina endógenos en general se han inactivado. Para revisar métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, ver Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Ver también, por ejemplo, Patentes de los E.U.A. Números 6,075,181 y 6,150,584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; Patentes de los E.U.A. Número 5,770,429 que describen la tecnología HuMab®; Patente de los E.U.A. Número 7,041,870 que describe la tecnología K-M MOUSE®, y la Publicación de la Solicitud de Patentes de los E.U.A. Número US 2007/0061900, que describe la tecnología VelociMouse®) . Regiones variables humanas de anticuerpos intactos generadas por estos animales además pueden ser modificadas, por ejemplo al combinar con una región constante humana diferente.

Anticuerpos humanos también pueden elaborarse por métodos basados en hibridoma. Líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma humano-ratón para la producción de anticuerpos monoclonales humanos se han descrito. {Ver, por ejemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)). Anticuerpos humanos generados por la tecnología de hibridoma de células B humanas también se describen en Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci.

USA, 103:3557-3562 (2006). Métodos adicionales incluyen aquellos descritos por ejemplo en la Patente de los E.U.A. Número 7,189,826 (que describe producción de anticuerpos IgM humanos monoclonales de las líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (4) : 265-268 (2006) (que describen hibridomas humano-humano) . Tecnología de hibridoma humana (tecnología Trioma) también se describe en Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20 (3) : 927-937 (2005) y vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Exp. & Clin. Phar a., 27(3):185-91 (2005).

Anticuerpos humanos también pueden ser generados al aislar secuencias de dominio variable clon Fv seleccionadas de bibliotecas de expresión en fago derivadas de humano. Estas secuencias de dominio variable pueden entonces ser combinadas con una región constante humana deseada. Técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de bibliotecas de anticuerpos se describen a continuación. 5. Anticuerpos Derivados de Biblioteca Anticuerpos pueden ser aislados al cribar bibliotecas combinatorias de anticuerpos con la o las actividades deseadas. Por ejemplo, una variedad de métodos se conocen en la técnica para generar bibliotecas de expresión en fago y cribar estas bibliotecas para anticuerpos que poseen las características de enlace deseadas. Estos métodos se revisan por ejemplo en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2001) y además se describen, por ejemplo en McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed. , Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

En ciertos métodos de expresión en fago, repertorios de genes VH y VL se clonan por separado mediante reacción de cadena polimerasa (PCRzz) y recombinan aleatoriamente en bibliotecas fago, que pueden entonces cribarse por fago de enlace de antígeno como se describe en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Fago típicamente exhibe fragmentos de anticuerpo ya sea como fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) o como fragmentos Fab. Bibliotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de alta afinidad al inmunógeno sin el requerimiento de construir hibridomas . En forma alterna, el repertorio sin tratamiento previo puede ser clonado (por ejemplo, de humano) para proporcionar una sola fuente de anticuerpos a un amplio intervalo de antígenos no propios y también propios sin ninguna inmunización como se describe por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas sin tratamiento previo también pueden hacerse sintéticamente al clonar segmentos de gen V sin rearreglar células madre, y utilizar cebadores PCR que contiene secuencia aleatoria para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr rearreglo in vitro, como se describe por Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) . Publicaciones de patente que describen bibliotecas fago de anticuerpo humano incluyen por ejemplo: la Patente de los E.U.A. Número 5,750,373, y las Publicaciones de Patente de los E.U.A. Números 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.

Anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aislados de bibliotecas de anticuerpo humano se consideran anticuerpos humanos o los fragmentos de anticuerpo humanos aquí. 6. Anticuerpos Multiespecíficos En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona es un anticuerpo multiespecífico, por ejemplo un anticuerpo biespecífico . Anticuerpos multiespecíficos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de enlace por al menos dos sitios diferentes. En ciertas modalidades, una de las especificidades de enlace es para FGF19, klotho (por ejemplo, KLB) , y/o FGFR4 y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas modalidades, anticuerpos biespecíficos pueden enlazar a dos diferentes epítopos de polipéptido FGF19, klotho (por ejemplo, KLB) , y/o FGFR . Anticuerpos biespecíficos también pueden emplearse para localizar agentes citotóxicos en células que expresan polipéptido tales como FGF19, klotho (por ejemplo, KLB) , y/o polipéptido FGFR4. Anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados como anticuerpos de longitud íntegra o fragmentos de anticuerpos .

Técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos incluyen pero están limitadas a co-expresión recombinante de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (ver, Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), O 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), e ingeniería de "perilla-en-orificio (knob-in-hole) " (ver, por ejemplo, la Patente de los E.U.A. Número 5,731,168). Anticuerpos multiespecíficos también pueden elaborarse por efectos de ingeniería de dirección electroestática para producir moléculas heterodiméricas-Fc de anticuerpo (WO 2009/089004A1) ; entrelazamiento de dos o más anticuerpos o fragmentos (ver, por ejemplo, la patente de los E.U.A. Número 4,676,980, y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); utilizando cremalleras leucina para producir anticuerpos biespecíficos (ver, por ejemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5) :1547-1553 (1992) ) ; utilizando tecnología "diacuerpo" para producir fragmentos de anticuerpo biespecificos (ver, por ejemplo, Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ); y utilizando dímeros Fv de cadena sencilla (sFv) (ver, por ejemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) ); y preparando anticuerpos triespecíficos como se describe por ejemplo en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) .

Anticuerpos de ingeniería con tres o más sitios de enlace de antígeno funcionales, incluyendo "anticuerpos pulpo", también se incluyen aquí (ver, por ejemplo, US 2006/0025576A1) .

El anticuerpo o fragmento presente también incluye un "FAb de Acción Dual" o "DAF" que comprende un sitio de enlace de antígeno que liga a polipéptido FGF19, klotho (por ejemplo, KLB) , y/o FGFR4 así como otro antígeno diferente (ver, US 2008/0069820, por ejemplo) . 7. Variantes de Anticuerpo a) Variantes de glicosilación En ciertas modalidades, un anticuerpo que aquí se proporciona se altera para incrementar o disminuir la extensión en la cual el anticuerpo se glicosila. Adición o deleción de sitios de glicosilación a un anticuerpo puede lograrse convenientemente al agregar la secuencia de aminoácidos tal que uno o más sitios de glicosilación se crean o retiran.

Cuando el anticuerpo comprende una región Fe, el carbohidrato enlazado puede ser alterado. Anticuerpos nativos que se producen por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido biantenario ramificado que en general se conecta por un enlace N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, por ejemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ejemplo mañosa, N-acetil glucosamina (GlcNAc) , galactosa, y ácido siálico, así como una fucosa conectada a un GlcNAc en el "tronco" de la estructura oligosacárido biantenario. En algunas modalidades, modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo pueden realizarse para crear variantes de anticuerpo con ciertas propiedades mejoradas.

En una modalidad, variantes de anticuerpo se proporcionan que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa conectada (directa o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en este anticuerpo puede ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% o de 20% a 40%. La cantidad de fucosa se determina al calcular la cantidad promedio de fucosa con una cadena de azúcar en Asn297, respecto a la suma de todas las glicoestructuras conectadas a Asn 297 (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y de alto contenido de mañosa) como se mide por espectrometría de masas MALDI-TOF, como se describe en O 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere a un residuo asparagina situado en aproximadamente la posición 297 en la región Fe (numeración Eu de residuos de región Fe) ; sin embargo, Asn297 también puede ubicarse aproximadamente + 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a menores variaciones de secuencia en anticuerpos. Estas variantes de fucosilación pueden tener función ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Patente de los E.U.A. Números US 2003/0157108 (Presta, L . ) ; US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) . Ejemplos de publicaciones relacionadas a variantes de anticuerpo "desfucosilado" o "deficiente en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742 ; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) . Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lecl3 CHO deficientes en fucosilación de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys . 249:533-545 (1986); Solicitud de Patente de los E.U.A. Número US 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams et al., en especial en el Ejemplo 11), y líneas celulares de eliminación tales como el gen alfa-1, 6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO de eliminación (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotech. Bioeng., 94 (4) : 680-688 (2006); y WO2003/085107) .

Variantes de anticuerpos además se proporcionan con oligosacáridos bisectados, por ejemplo, en donde un oligosacarido biantenario conectado a la región Fe del anticuerpo se bisecta por GlcNAc. Estas variantes de anticuerpo pueden tener reducida fucosilación y/o mejorada función ADCC. Ejemplos de estas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo, en WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente de los E.U.A. No. 6,602,684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al.). Variantes de anticuerpo con al menos un residuo galactosa en el oligosacárido conectado a la región Fe también se proporcionan. Estas variantes de anticuerpo pueden tener función CDC mejorada. Estas variantes de anticuerpo se describen, por ejemplo en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); and WO 1999/22764 (Raju, S.). b) Variantes de región Fe En ciertas modalidades, una o más modificaciones de aminoácidos pueden introducirse en la región Fe de un anticuerpo que aqui se proporciona, de esta manera generando una variante de región Fe . La variante de región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por ejemplo, una región humana IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4 Fe) que comprende una modificación de aminoácido (por ejemplo, una substitución) en una o más posiciones de aminoácido.

En ciertas modalidades, la invención contempla una variante de anticuerpo que posee algunas pero no todas las funciones efectoras, que hacen un candidato deseable para aplicaciones en donde la vida media del anticuerpo in vivo es importante, sin embargo ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o nocivas. Ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo pueden realizarse para confirmar la reducción/agotamiento de actividades CDC y/o ADCC. Por ejemplo, ensayos de enlace receptor Fe (FcR) pueden realizarse para asegurar que el anticuerpo carece de enlace FcyR (aquí por lo tanto probablemente carece de actividad ADCC) , pero retiene habilidad de enlace FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan Fc(RIII solamente, mientras que los monocitos expresan Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Ejemplos no limitantes de ensayos in vitro para estimar actividad ADCC de una molécula de interés se describen en la Patente de los E.U.A. No. 5,500,362 (ver, e.g., Hellstrom, I. et al. Proc. Nat' 1 Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (ver Bruggemann, M. et al . , J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). En forma alterna, métodos de ensayo no-radioactivos pueden ser empleados (ver, por ejemplo, ensayo de citotoxicidad no radioactiva ACTI™ para citometría de flujo (Cell Technology, Inc. Mountain View, CA; y ensayo de citotoxicidad no radioactiva CytoTox 96* (Promega, Madison, WI) . Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células Destructoras Naturales (NK) . En forma alterna o adicional, la actividad ADCC de la molécula de interés puede estimarse in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como aquel descrito en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) . Ensayos de enlace Clq también pueden llevarse a cabo para confirmar que el anticuerpo es incapaz de ligar Clq y por lo tanto carece de actividad CDC. Ver, por ejemplo ELISA de enlace Clq y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para estimar activación de complemento, puede realizarse un ensayo CDC (ver, por ejemplo Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Enlace FcRn y determinaciones de eliminación in vivo/vida media también puede realizarse utilizando métodos conocidos en la especialidad (ver, por ejemplo Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18 (12) -.1759- 1769 (2006) ) .

Anticuerpos con reducida función efectora incluyen aquellos con substitución de uno o más residuos de región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Patente de los E.U.A. No. 6,737,056) . Estos imitantes Fe incluyen imitantes Fe con substituciones en dos o más de posiciones aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el así denominado mutante Fe "DANA" con substitución de residuos 265 y 297 en alanina (Patente de los E.U.A. No. 7,332,581).

Ciertas variantes de anticuerpo con enlace mejorado o disminuido a FcRs se describen. {Ver, e.g., Patente de los E.U.A. No. 6,737,056; WO 2004/056312, y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)). En ciertas modalidades, una variante de anticuerpo comprenden una región Fe con uno o más substituciones de aminoácido que mejoran ADCC, por ejemplo, substituciones en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración EU de residuos) . En algunas modalidades, se hacen alteraciones en la región Fe que resultan en enlace Clq alterado (es decir, ya sea mejorado o disminuido) y/o Citotoxicidad Dependiente de Complemento (CDC) , por ejemplo, como se describe en la Patente de los E.U.A. No. 6,194,551, WO 99/51642, e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

Anticuerpos con incrementadas vidas medias y mejorado enlace al receptor Fe neonatal (FcRn) , que es responsable por la transferencia de IgGs maternos al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), se describen en US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Aquellos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más substituciones que mejoran el enlace de la región Fe a FcRn. Estas variantes Fe incluyen aquellas con substituciones en uno o más de residuos de región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ejemplo, substitución de residuo de región Fe 434 (Patente de los E.U.A. No. 7,371,826). Ver también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente de los E.U.A. No. 5,648,260; Patente de los E.U.A. No. 5,624,821; y WO 94/29351 referente a otros ejemplos de variantes de región Fe. c) Variantes de anticuerpo con ingeniería de cisteína En ciertas modalidades, puede ser conveniente el crear anticuerpos con ingeniería de cisteína, por ejemplo "thio Abs" , en donde uno o más residuos de un anticuerpo se substituyen con residuos cisteína. En modalidades particulares, los residuos substituidos ocurren en sitios accesibles del anticuerpo. Al substituir estos residuos con cisteína, grupos tiol reactivos de esta manera se ubican en sitios accesibles del anticuerpo y pueden ser empleados para conjugar el anticuerpo con otras porciones, tales como porciones de fármaco o porciones de enlazador- fármaco, para crear un inmunoconjugado, como se describe adicionalmente aquí. En ciertas modalidades, cualquiera uno o más de los siguientes residuos puede ser substituido con cisteína: V205 (numeración Kabat) de cadena ligera; A118 (numeración EU) de cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región Fe de cadena pesada. Anticuerpos con ingeniería de cisteína pueden ser generados como se describe, por ejemplo, en la Patente de los E.U.A. No. 7,521,541.

B. Inmunoconjugados Además aquí se proporcionan inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-FGF19, anticuerpo anti-klotho (por ejemplo, anticuerpo anti-KLB) , y/o anticuerpo anti-FGFR4 aquí conjugados con uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes quimioterapéuticos o fármacos, agentes inhibidores de crecimiento, toxinas (por ejemplo, proteína toxinas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas o animales o sus fragmentos) , o isótopos radioactivos .

En una modalidad, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo- fármaco (ADC) en donde un anticuerpo se conjuga con uno o más fármacos, incluyendo pero no limitados a un maytansinoide (ver Patentes de los E.U.A. Nos. 5,208,020, 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 Bl) ; una auristatina tal como porciones de fármaco DE y DF de monometilauristatina (MMAE y MMAF) (ver Patentes de los E.U.A. Nos. 5,635,483 y 5,780,588, y 7,498,298); una dolastatina; una calicheamicina o derivado de la misma (ver Patentes de los E.U.A. Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, y 5,877,296; Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina al como daunomicina o doxorubicina (ver Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj . Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y Patente de los E.U.A. No. 6,630,579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otra modalidad, un inmunoconj gado comprende un anticuerpo como se describe aquí, conjugado con una toxina enzimáticamente activa o su fragmento, incluyendo pero no limitado a cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Fitolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, neomicina y tricotecenos .

En otra modalidad, un inmunoconjugado comprende un anticuerpo como se describe aquí, conjugado con un átomo radioactivo para formar un radioconjugado . Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de radioconjugados. Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el radiocon ugado se emplea para detección, puede comprender un átomo radioactivo para estudios de gammagrafía, por ejemplo Te" o I123, o una etiqueta espín para formación de imagen por resonancia magnética nuclear ( MR) (también conocido como formación de imagen por resonancia magnética, MRI) , tal como yodo-123 de nuevo, yodo-131, indio-111, flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HC1) , ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehido) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como toluen 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2, 4-dinitrobenzeno) . Por ejemplo, una inmunotoxina ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobenzil-3 -metildietilen triaminapentaacético etiquetado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador disociable" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un enlazador ácido lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador fotolábil, enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); Patente de los E.U.A. No. 5,208,020) puede emplearse .

Los inmunuoconj ugados de ADCs aquí expresamente contemplan, pero no están limitados a estos conjugados preparados con reactivos entrelazadores incluyendo pero no limitados a BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, SUlfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfO-SMPB, y SVSB (succinimidil- (4-vinilsulfona) benzoato) que están comercialmente disponibles (por ejemplo, de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL. , U.S.A).

C. Polipéptidos de Enlace Aquí se proporcionan polipéptidos FGF19, klotho (e.g., KLB) , y/o FGFR4 para utilizar como un modulador FGF19 , por ejemplo antagonista FGF19, en cualquiera de los métodos aquí descritos. En algunas modalidades, el polipéptido de enlace FGF19, klotho (e.g., KLB), y/o FGFR4 es un antagonista polipéptido de enlace FGF19, klotho (e.g., KLB), y/o FGFR4. Antagonistas polipéptidos de enlace FGF19, klotho (e.g., KLB) , y/o FGFR4 son polipéptidos que ligan de preferencia específicamente a polipéptido FGF19, klotho (e.g., KLB), y/o FGFR4.

Polipéptidos de enlace pueden ser sintetizados químicamente utilizando metodología de síntesis de polipéptidos conocida o pueden prepararse y purificarse utilizando tecnología recombinante . Polipéptidos de enlace usualmente tienen al menos aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, en forma alterna al menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 aminoácidos de longitud o más, cuando estos polipéptidos de enlace que son capaces de enlace, de preferencia específicamente, a una diana, polipéptido FGF19, klotho (e.g., KLB) , y/o FGFR4 , como se describe aquí. Polipéptidos de enlace pueden ser identificados sin indebida experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para cribar bibliotecas polipéptido para polipéptidos de enlace que son capaces de enlazar específicamente a una diana polipéptido son bien conocidas en la especialidad (ver, por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. NOS. 5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; Publicaciones de PCT Nos. WO 84/03506 y WO84/03564; Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 82:178-182 (1985); Geysen et al., en Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth. , 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol . , 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363, y Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol . , 2:668) .

En este aspecto, expresión de bacteriófago (fago) es una técnica bien conocida que permite el cribar grandes bibliotecas polipéptido para identificar uno o varios miembros de esas bibliotecas que son capaces de enlazar específicamente un polipéptido diana, por ejemplo polipéptido FGF19, klotho (e.g., KLB) , y/o FGFR4. Expresión en fago es una técnica por la cual variantes polipéptido se expresan como proteínas de fusión a la proteína de revestimiento en la superficie de partículas de bacteriófago (Scott, J.K. and Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386). La utilidad de expresión en fago se encuentra en el hecho de que grandes bibliotecas de variantes de proteínas aleatorizadas selectivamente (o cDNAs clonados en forma aleatoria) pueden ser clasificadas en forma rápida y eficiente por aquellas secuencias que ligan a una molécula diana con alta afinidad. La expresión de bibliotecas péptido (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 87:6378) o proteína (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8363) en el fago se ha utilizado para criba de millones de polipéptidos u oligopépidos por aquellos con propiedades de enlace específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). Clasificar bibliotecas fago de mutantes aleatorios requiere una estrategia para construir y propagar una gran cantidad de variantes, un procedimiento para purificación de afinidad utilizando el receptor diana, y medios para evaluar los resultados de enriquecimientos de enlace. Patentes de los E.U.A. Nos. 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, y 5,663,143.

Aunque la mayoría de los métodos de expresión en fago ha empleado fago filamentoso, sistemas de expresión en fago lambdoide (WO 95/34683; patente de los E.U.A. No .5 , 627, 024 ) , sistemas de expresión en fago T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Cáncer Research, 58(15): 3209-3214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 4770-4777 (1997); Ren et al., Gene, 195 (2) : 303-311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) y sistemas de expresión en fago T7 (Smith and Scott, Methods in Enzymology, 217: 228-257 (1993); Patente de los E.U.A. No. 5,766,905) también se conocen.

Mejoras adicionales incrementan la capacidad de sistemas de expresión en cribar bibliotecas péptido para enlace de moléculas dianas selectas y para exhibir proteínas funcionales con el potencial por criba de estas proteínas por propiedades deseadas. Dispositivos de reacción combinatoria para reacciones de expresión en fago se han desarrollado (WO 98/14277) y bibliotecas de expresión en fago se han empleado para analizar y controlar interacciones biomoleculares (WO 98/20169; WO 98/20159) y propiedades de péptidos helicoidales restringidos (WO 98/20036) . WO 97/35196 describe un método para aislar un ligando de afinidad en donde una biblioteca de expresión en fago se pone en contacto con una solución en donde el ligando enlazará con una molécula diana y una segunda solución en la que el ligando de afinidad no enlazará con una molécula diana, para aislar selectivamente ligandos de enlace. WO 97/46251 describe un método de biocribado de una biblioteca de expresión en fago aleatoria con un anticuerpo purificado de afinidad y después aislar el fago de enlace, seguido por un proceso de microcribado utilizando pozos de microplaca para aislar fago de enlace de alta afinidad. El uso de proteina A de Staphylococcus aureus como una etiqueta de afinidad también se ha reportado (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). WO 97/47314 describe el uso de bibliotecas de sustracción de sustrato para distinguir especificidades de enzima utilizando una biblioteca combinatoria que puede ser una biblioteca de expresión en fago. Un método para seleccionar enzimas adecuadas para utilizar en detergentes utilizando expresión en fago se describe en WO 97/09446. Métodos adicionales para seleccionar proteínas de enlace específicas se describen en las Patentes de los E.U.A. Número 5,498,538, 5,432,018, y WO 98/15833.

Métodos para generar bibliotecas péptido y cribar estas bibliotecas también se describen en las Patentes de los E.U.A. Números 5,723,286, 5,432,018, 5,580,717, 5,427,908, 5,498,530, 5,770,434, 5,734,018, 5,698,426, 5,763,192, y 5,723,323.

D. Enlace de Moléculas Pequeñas Aquí se proporcionan moléculas pequeñas FGF19, klotho (por ejemplo, KLB) , y/o FGFR4 para uso como un modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19) en cualquiera de los métodos aquí descritos . En algunas modalidades, la molécula pequeña FGF19, klotho (por ejemplo, KLB) , y/o FGFR4 es un antagonista de molécula pequeña FGF19, klotho (por ejemplo, KLB), y/o FGFR4.

En algunas modalidades de cualquiera de las moléculas pequeñas, el antagonista FGF19 es un antagonista de molécula pequeña FGF19. En algunas modalidades, el antagonista FGF19 es un antagonista de molécula pequeña klotho (por ejemplo, KLB) . En alguna modalidad, el antagonista FGF19 es un antagonista de molécula pequeña FGFR4.

En algunas modalidades de cualquiera de las moléculas pequeñas, la molécula pequeña enlaza a un polipéptido FGF19. En algunas modalidades, la molécula pequeña enlaza polipéptido klotho (por ejemplo, KLB) . En algunas modalidades, la molécula pequeña enlaza FGFR4.

Moléculas pequeñas de preferencia son moléculas orgánicas diferentes a polipéptidos de enlace o anticuerpos como se define aquí que ligan, de preferencia específicamente a un polipéptido FGF19, FGFR4 , y/o klotho [por ejemplo, KLB) como se describe aquí . Moléculas orgánicas pequeñas pueden ser identificadas y químicamente sintetizadas utilizando metodología conocida (ver, por ejemplo, las Publicaciones de PCT Números WO00/00823 y WO00/39585) . Moléculas pequeñas orgánicas usualmente tienen menos de aproximadamente 2000 Daltons en tamaño, en forma alterna menos de aproximadamente 1500, 750, 500, 250 o 200 Daltons en tamaño, en donde estas moléculas orgánicas pequeñas son capaces de ligar de preferencia específicamente a un polipéptido como se describe aquí, pueden ser identificadas sin indebida experimentación utilizando técnicas bien conocidas. En este aspecto, se nota que técnicas para cribar bibliotecas de moléculas pequeñas orgánicas por moléculas que son capaces de ligar a una diana polipéptido son bien conocidas en la especialidad (ver, por ejemplo, las Publicaciones de PCT Números O00/00823 y O00/39585) . Moléculas orgánicas pequeñas por ejemplo pueden ser aldehidos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, hidrazinas N-sustituidas , hidrazidas, alcoholes, éteres, tioles, tioéteres, disulfuros, ácidos carboxílieos , ésteres, amidas, ureas, carbamatos, carbonatos, cetales, tiocetales, acétales, tioacetales, aril haluros, arilo sulfonatos, alquil haluros, alquil sulfonatos, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos , anilinas, alquenos, alquinos, dioles, amino alcoholes, oxazolidinas , oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas , epóxidos, aziridinas, isocianatos, cloruros de sulfonilo, compuestos diazo, cloruros de ácido o semejantes.

E. Polin cleótidos Antagonistas Aquí se proporcionan polinucleótidos FGF19, klotho (por ejemplo, KLB) , y/o FGFR4 para utilizar como un modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19) en cualquiera de los métodos aquí descritos. En algunas modalidades, el polinucleótido FGF19, klotho (por ejemplo, KLB) , y/o FGFR4 es un antagonista polinucleótido FGF19, klotho (por ejemplo, KLB), y/o FGFR4. El polinucleótido puede ser un ácido nucleico antisentido y/o una ribosima. Los ácidos nucleico antisentido comprenden una secuencia complementaria a cuando menos una porción de una transcripción RNA de un gen FGF19, klotho (por ejemplo, KLB), y/o FGFR4. Sin embargo, no se requiere complementariedad absoluta, aunque se prefiere.

En algunas modalidades de cualquiera de los polinucleótidos, el polinucleótido enlaza a un polinucleótido FGF19. En algunas modalidades, polinucleótido enlaza específicamente a un polinucleótido klotho (por ejemplo, KLB) . En algunas modalidades, el polinucleótido específicamente enlaza a un polinucleótido FGFR4.

Una secuencia "complementaria a cuando menos una porción", aquí referida, significa una secuencia que tiene suficiente complementariedad para ser capaz de hibridizar con el RNA, formando un dúplex estable; en el caso de ácidos nucleicos antisentido de doble hebra, una sola hebra del DNA dúplex puede de esta manera ser probada o puede ensayarse en formación triplex. La capacidad en hibridizar dependerá tanto el grado de complementariedad como la longitud del ácido nucleico antisentido. En general, entre más grande sea el ácido nucleico hibridízante, más mal apareamientos base con RNA puede contener y todavía formar un dúplex estable (o triplex según sea el caso) . Una persona con destreza en la técnica puede evaluar un grado tolerable de mal apareamiento por el uso de procedimientos estándar para determinar el punto de fusión del complejo hibridizado.

Polinucleótidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje, por ejemplo, la secuencia no traducida 5' hasta e incluyendo el codón de inicio AUG, deberán trabajar en forma más eficiente para inhibir traducción. Sin embargo, secuencias complementarias a las secuencias sin traducción 31 de mRNAs se ha mostrado que son efectivas para inhibir traducción de mRNAs por igual. Ver en general, Wagner, R. , 1994, Na ture 372:333-335. De esta manera, oligonucleótidos complementarios a cualquiera de las regiones sin codificación no traducidas 5'- o 3'- del gen, pueden utilizarse en un enfoque antisentido para inhibir la traducción del mRNA endógeno. Polinucleótidos complementarios a la región sin traducción 5' de mRNA deberán incluir el complemento del codón de inicio AUG. Polinucleótidos antisentido complementarios a las regiones de codificación mRNA son menos eficientes inhibidores de traducción pero pueden emplearse de acuerdo con la invención. Ya sea diseñados para hibridizar a la región 5'-, 3'- o de codificación de mRNA, ácidos nucleicos antisentido deberán ser al menos de seis nucleótidos de longitud, y de preferencia son oligonucleótidos en el intervalo de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos el oligonucleótido tiene al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos o al menos 50 nucleótidos .

En una modalidad, el ácido nucleico antisentido se produce en forma intracelular por transcripción de una secuencia exógena. Por ejemplo, un vector o una porción del mismo se transcribe, produciendo un ácido nucleico antisentido (RNA) del gen. Este vector contendrá una secuencia que codifica el ácido nucleico antisentido. Este vector puede permanecer episomal o volverse cromosomalmente integrado, siempre que pueda transcribirse para producir el RNA antisentido deseado. Estos vectores pueden ser construidos por métodos de tecnología de DNA recombinante estándar en la técnica. Los vectores pueden ser plásmidos, virales u otros conocidos en la especialidad, utilizados para replicación y expresión en células de vertebrados. Expresión de la secuencia que codifica FGF19, FGFR4, y/o klotho (por ejemplo, KLB) , o sus fragmentos puede ser mediante cualquier promotor conocido en la especialidad para actuar en células de vertebrados de preferencia en humanos. Estos promotores pueden ser inducibles o constitutivos. Estos promotores incluyen pero no están limitados a la región promotora temprana SV40 (Bernoist and Chambón, Nature 29:304-310 (1981), el promotor contenido en la repetición terminal 3' larga del virus Rous sarcoma (Yamamoto et al., Cell 22:787-797 (1980), el promotor de timidina herpes (Wagner et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981), las secuencias regulatorias del gen metalotioneína (Brinster, et al., Nature 296:39-42 (1982)), etc.

F. Variantes Polipéptido de Enlace y Anticuerpo En ciertas modalidades, se contemplan variantes de secuencia de aminoácidos de los anticuerpos y/o los polipéptidos de enlace que aquí se proporcionan. Por ejemplo, puede ser conveniente el mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo y/o polipéptido de enlace. Variantes de secuencia de aminoácidos de un anticuerpo y/o polipéptidos de enlace pueden prepararse al introducir apropiadas modificaciones en la secuencia de nucleótidos que codifican el anticuerpo y/o polipéptido de enlace o por síntesis de péptido. Estas modificaciones incluyen por ejemplo deleciones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo y/o polipéptido de enlace. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución puede realizarse para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas por ejemplo enlace de diana.

En ciertas modalidades, variantes de anticuerpo y/o variantes de polipéptido de enlace que tienen una o más sustituciones de aminoácidos se proporcionan. Sitios de interés para mutagénesis de sustitución incluyen HVRs y FRs. Sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones conservadoras" . Cambios más sustanciales se proporcionan en la Tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones ejemplares" y como se describe adicionalmente a continuación con referencia a las clases de cadena lateral de aminoácidos. Sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en un anticuerpo y/o polipéptido de enlace de interés y los productos cribarse por una actividad deseada, por ejemplo enlace de antígeno retenido/mejorado, disminuida inmunogenicidad o mejorada ADCC o CDC.

TABLA 1 Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Ala; Leu Norleucina Aminoácidos pueden agruparse de acuerdo con propiedades de cadena lateral común: (1) hidrofóbicos : Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílieos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg,- (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Sustituciones no conservadoras involucran intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase .

Un tipo de variante de sustitución involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo precursor (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano) . En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para mayor estudio tendrán modificaciones (por ejemplo, mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ejemplo, incrementada afinidad, reducida inmunogenicidad) respecto a un anticuerpo precursor y/o habrán retenido sustancialmente ciertas propiedades biológicas del anticuerpo precursor. Una variante de sustitución ejemplar es un anticuerpo madurado de afinidad que puede generarse convenientemente, por ejemplo, utilizando técnicas de maduración de afinidad basadas en expresión en fago tales como aquellas aquí descritas. Brevemente, uno o más residuos HVR se mutan y los anticuerpos variantes exhiben en fago y criban para una actividad biológica particular (por ejemplo, afinidad de enlace) .

Alteraciones (por ejemplo, sustituciones) pueden realizarse en HVRs, por ejemplo, para mejorar la afinidad de anticuerpo. Estas alteraciones pueden realizarse en "puntos calientes" HVR, es decir, residuos codificados por codones que se someten a mutación con alta frecuencia durante el proceso de maduración somática (ver, por ejemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDRs (a-CDRs) , con la variante resultante VH o VL que se prueba para afinidad de enlace. Maduración de afinidad al construir y volver a seleccionar de bibliotecas secundarias se ha descrito por ejemplo en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed. , Human Press, Totowa, NJ, (2001) ) . En algunas modalidades de maduración de afinidad, se introduce diversidad en los genes variables seleccionados para maduración por cualquiera de una variedad de métodos (por ejemplo, PCR tendiente a error, entremezclado de cadena o mutagénesis dirigida por oligonucleótido) . Se crea entonces una biblioteca secundaria. La biblioteca después se criba para identificar cualesquiera variantes de anticuerpo con una afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra enfoques dirigidos a HVR, en donde varios residuos HVR (por ejemplo, 4-6 residuos a la vez) se aleatorizan. Residuos HVR involucrados en enlace de antígeno pueden ser identificados específicamente, por ejemplo, utilizando mutagénesis mediante alanina o modelado, CDR-H3 y CDR-L3 en particular a menudo son dianas.

En ciertas modalidades, sustituciones, inserciones o deleciones pueden ocurrir dentro de uno o más HVRs siempre que dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo para enlazar antígeno. Por ejemplo, alteraciones conservadoras (por ejemplo, sustituciones conservadoras como aquí se proporciona) que no reducen sustancialmente la afinidad de enlace, pueden realizarse en HVRs. Estas alteraciones pueden estar fuera de "puntos calientes" HVR o SDRs . En ciertas modalidades de las secuencias VH y VL variantes que se proporcionan anteriormente, cada HVR ya sea no es alterada, o no contiene más de una, dos o tres sustituciones aminoácido.

Un método útil para identificación de residuos o regiones del anticuerpo y/o el polipéptido de enlace que pueden dirigirse por mutagénesis, se denomina "mutagénesis mediante alanina" como se describe por Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos diana (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) se identifican y reemplazan por un aminoácido neutro o de carga negativa (por ejemplo, alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con antígeno es afectada. Mayores sustituciones pueden introducirse en las ubicaciones de aminoácido demostrando sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. En forma alterna o adicional, una estructura de cristal de un complejo antígeno -anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y antígeno. Estos residuos de contacto y residuos vecinos pueden ser dirigidos o eliminados como candidatos para sustitución. Variantes pueden cribarse para determinar si contienen las propiedades deseadas .

Inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxilo terminales en el intervalo en longitudes de un residuo a polipéptidos que contiene cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácidos sencillos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal . Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo -N o -C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo.

G. Anticuerpo ? Derivados de Polipéptido de Enlace En ciertas modalidades, un anticuerpo y/o polipéptido de enlace que aquí se proporciona puede ser además modificado para contener porciones no proteináceas adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles. Las porciones convenientes para derivatización del anticuerpo y/o polipéptido de enlace incluyen pero no están limitadas a polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitantes de polímeros solubles en agua incluyen pero no están limitados a, polietilen glicol (PEG) , copolímeros de etilen glicol/propilen glicol, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinil alcohol, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímero de anhídrido etilen/maléico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n-vinil pirrolidona) polietilen glicol, homopolímeros de propropilen glicol, copolímeros de polipropilen óxido/etilen óxido, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , polivinil alcohol y sus mezclas. Polietilen glicol propionaldehído puede tener ventajas en fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros agregados al anticuerpo y/o polipéptido de enlace puede variar y si más de un polímero se agrega, pueden entonces ser iguales o diferentes moléculas. En general, el número y/o tipo de polímeros empleados para derivatización puede determinarse con base en consideraciones incluyendo pero no limitadas a las propiedades particulares o funciones del anticuerpo y/o polipéptido de enlace a mejorar, ya sea que el derivado de anticuerpo y/o derivado de polipéptido de enlace se utilizará en una terapia bajo condiciones definidas, etc.

En otra modalidad, conjugados de un anticuerpo y/o polipéptido de enlace con porción no proteinácea que puede calentarse selectivamente por exposición a radiación, se proporcionan. En una modalidad, la porción no proteinácea es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye pero no está limitada a longitudes de onda que no dañan células ordinarias, pero que calientan la porción no proteinácea a una temperatura en la cual se exterminan células próximas al anticuerpo y/o porción no proteinacea-polipéptido de enlace.

H. Métodos y Composiciones Recombinantes Anticuerpos y/o polipéptidos de enlace pueden ser producidos utilizando métodos y composiciones recombinantes, por ejemplo como se describe en la Patente de los E.U.A. Número 4,816,567. En una modalidad, ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-FGF19, anticuerpo anti-FGFR4, y/o anticuerpo anti-klotho (por ejemplo, anticuerpo anti-KLB) . Este ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácidos que comprende VL y/o una secuencia de aminoácidos que comprende VH del anticuerpo (por ejemplo, las cadenas ligera y/o pesada del anticuerpo) . En una modalidad adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ejemplo, vectores de expresión) que comprenden este ácido nucleico que codifica el anticuerpo y/o polipéptido de enlace. En una modalidad adicional, se proporciona una célula huésped que comprende este ácido nucleico. En una modalidad tal, una célula huésped comprende (por ejemplo, se ha transformado con) : (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende VH del anticuerpo. En una modalidad, la célula huésped es eucariótica, por ejemplo, una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO) o célula linfoide (por ejemplo, célula YO, NSO, Sp20) . En una modalidad, un método para producir un anticuerpo tal como un anticuerpo anti-FGF19, anticuerpo anti-FGFR4, y/o anticuerpo anti-klotho (por ejemplo, anticuerpo anti-KLB) y/o polipéptido de enlace se proporciona, en donde el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo y/o polipéptido de enlace como aquí se proporciona, bajo condiciones adecuadas para expresión del anticuerpo y/o polipéptido de enlace, y opcionalmente recuperar el anticuerpo y/o polipéptido de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped) .

Para producción recombinante de un anticuerpo tal como un anticuerpo anti-FGF19, anticuerpo anti-klotho (por ejemplo, anticuerpo anti-KLB) , anticuerpo anti-FGFR4 y/o polipéptido de enlace, ácido nucleico que codifica el anticuerpo y/o polipéptido de enlace, por ejemplo como se describió anteriormente, se aisla e inserta en uno o más vectores para mayor clonación y/o expresión en una célula huésped. Este ácido nucleico puede aislarse fácilmente y secuenciarse utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de enlazar específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo) .

Células huésped convenientes para clonación o expresión de vectores incluyen células procarióticas o eucarióticas aquí descritas. Por ejemplo, anticuerpos pueden ser producidos en bacterias, en particular cuando no se requieren glicosilación y función efectora Fe. Para expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. Números 5,648,237, 5,789,199, y 5,840,523. (Ver también Charlton, Methods in Mol. Bio., Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed.. Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describen expresión de fragmentos de anticuerpo en E. coli.) Después de expresión, el anticuerpo puede ser aislado de la pasta celular bacteriana en una fracción soluble y puede ser adicionalmente purificado .

Además de procarióticas , microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levadura son huéspedes convenientes de clonación de expresión para vectores, incluyendo cepas de levadura y hongos cuyas rutas de glicosilación se han "humanizado", resultando en la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación humana parcial o completo. Ver Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) .

Células huésped convenientes para la expresión de anticuerpo glicosilado y/o polipéptidos de enlace glicosilados también se derivan de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados) . Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos . Numerosas cepas de baculovirus se han identificado que pueden ser empleadas en conjunto con células de insecto, en particular para transfección de células de Spodoptera frugiperda .

Cultivos de células de plantas también pueden emplearse como huéspedes. Ver, por ejemplo, las Patentes de los E.U.A. Números 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, y 6,417,429 (que describen tecnología PLA TIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas) .

Células de vertebrados también pueden emplearse como huéspedes. Por ejemplo, líneas celulares de mamífero que se adaptan para crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7) ; líneas de riñon embriónico humano (293 o células 293 como se describe, por ejemplo en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) ) ; células de riñon de hámster bebé (BHK) ; células sertoli de ratón (células TM4 como se describe como por ejemplo en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76) ; células de carcinoma cervical humano (HELA) ; células de riñon canino (MDCK) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A) ; células de pulmón humano (W138) ; células de hígado humano (Hep G2) ; tumor mamario de ratón (MMT 060562) ; células TRI, como se describe por ejemplo en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas celulares huéspedes de mamífero incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) , incluyendo células DHFR" CHO (Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma tales como YO, NSO y Sp2/0. Para una revisión de ciertas líneas celulares huéspedes de mamífero adecuadas para producción de anticuerpo y/o producción de polipéptido de enlace, ver, por ejemplo, Yazaki and Wu, ethods in Mol. Bio., Vol . 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ) , pp. 255-268 (2003).

Mientras que la descripción se refiere primordialmente a producción de anticuerpos y/o polipéptidos de enlace al cultivar células transformadas o transíectadas con un vector que contiene anticuerpo - y polipéptido de enlace - que codifica ácido nucleico. Por supuesto se contempla que métodos alternos, que son bien conocidos en la técnica pueden ser empleados para preparar anticuerpos y/o polipéptidos de enlace. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos apropiada o sus porciones puede producirse por síntesis de péptido directa utilizando técnicas en fase sólida [ver, por ejemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154 (1963)]. Síntesis de proteínas in vitro puede realizarse utilizando técnicas manuales o por automatización. Síntesis automatizada puede lograrse por ejemplo utilizando un Sintetizador Applied Biosystems Peptide (Foster City, CA) utilizando las instrucciones del fabricante. Diversas porciones del anticuerpo y/o polipéptido de enlace pueden ser químicamente sintetizadas por separado y combinadas utilizando métodos químicos o enzimáticos para producir el anticuerpo deseado y/o polipéptido de enlace .

VI. Métodos Para Criba y/o Identificación de Moduladores FGF19 con Función Deseada Técnicas para generar moduladores FGF19, por ejemplo antagonistas FGF19, tales como anticuerpos, polipéptidos de enlace y/o moléculas pequeñas, se han descrito anteriormente. Moduladores FGF19 adicionales, por ejemplo antagonistas FGF19, tales como anticuerpos, polipéptidos de enlace, moléculas pequeñas y/o polinucleótidos que aquí se proporcionan pueden ser identificados, cribados o caracterizados por sus propiedades físicas/químicas y/o actividades biológicas por diversos ensayos conocidos en la técnica.

Aquí se proporcionan métodos para cribar y/o identificar un modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19, que (A) inhibe señalización FGF19, induce freno de ciclo celular, inhibe proliferación celular y/o promueve muerte celular y (B) tiene aceptable toxicidad (por ejemplo, clínicamente tolerable y/o aceptable), el método comprende: (a) poner en contacto (i) una célula, tejido y/o muestra en donde la célula, tejido y/o muestra comprende uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares y (ii) una célula de referencia, tejido de referencia y/o muestra de referencia con moduladores FGF19 candidatos, por ejemplo antagonistas FGF19, (b) determinar (i) nivel de señalización FGF19, distribución de etapa de ciclo celular, nivel de proliferación celular y/o nivel de muerte celular, y (ii) nivel de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares, con lo que nivel disminuido de señalización FGF19, una diferencia en distribución de la etapa del ciclo celular, nivel disminuido de proliferación celular y/o nivel incrementado de muerte celular y niveles disminuidos y/o sustancialmente similares de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares entre una célula, tejido y/o muestra, en donde una célula, tejido y/o muestra comprenden uno o más biomarcadores y célula de referencia, tejido de referencia y/o muestra de referencia identifican los moduladores FGF19 candidato, por ejemplo, antagonistas FGF19, como un modulador FGF19 que inhibe señalización FGF19, induce freno del ciclo de células de cáncer, e inhibe proliferación celular, y/o promueve muerte celular y toxicidad aceptable (por ejemplo, clínicamente tolerable y/o aceptable) . En algunas modalidades, el modulador FGF19 es un antagonista FGF19. En algunas modalidades, la célula, tejido y/o muestra es una célula de cáncer, tejido de cáncer y/o muestra de cáncer .

Métodos para determinar el nivel de señalización FGF19 se conocen en la técnica y se describen en los presentes Ejemplos. En algunas modalidades, el nivel de señalización FGF19 se determina utilizando un ensayo reportero luciferasa como se describe en los Ejemplos. En algunas modalidades, el modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19, inhibe señalización FGF19 al reducir el nivel de señalización FGF19 en aproximadamente cualquiera de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100%.

Los efectos inhibitorios de crecimiento de un modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19, aquí descrito pueden estimarse por métodos conocidos en la especialidad, por ejemplo utilizando células que expresan FGF19, FGFR4 , y klotho (por ejemplo, KLB) ya sea en forma endógena o después de transfección con el o los genes respectivos. Por ejemplo, líneas de células apropiadas y células transfectadas con polipéptido FGF19, FGFR4, y/o klotho (por ejemplo, KLB) pueden ser tratadas con un modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19, aquí descrito en diversas concentraciones por unos cuantos días (por ejemplo, 2-7 días) y tiñen con violeta cristal o TT o analizan por algún otro ensayo colorimétrico . Otro método para medir proliferación sería al comparar captación de 3H-timidina por las células tratadas en la presencia o ausencia de un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña y/o polinucleótidos de la invención. Después de tratamiento, las células se cosechan y la cantidad de radioactividad incorporada en el DNA se cuantifica en un contador de centelleo. Controles positivos apropiados incluyen tratamiento de una línea celular selecta con un anticuerpo inhibidor de crecimiento que se conoce inhibe crecimiento de esa línea celular. La inhibición de crecimiento de células de tumor in vivo puede determinarse en diversas formas conocidas en la especialidad.

Métodos para determinar la distribución de la etapa de ciclo celular, nivel de proliferación celular y/o nivel de muerte celular, se conocen en la especialidad. En algunas modalidades, detención del ciclo de células de cáncer se logra en Gl .

En algunas modalidades, el modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19, inhibirá proliferación de células de cáncer de las células de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer in vitro o in vivo en aproximadamente 25-100% en comparación con las células de cáncer, tejido de cáncer o muestra de cáncer sin tratar, más preferible en aproximadamente 30-100%, y aún más preferible en aproximadamente 50-100% o aproximadamente 70-100%. Por ejemplo, inhibición de crecimiento puede medirse a una concentración de modulador FGF19 de aproximadamente 0.5 g/ml a aproximadamente 30 g/ml o aproximadamente 0.5 nM a aproximadamente 200 nM en cultivo celular, en donde la inhibición de crecimiento se determina 1-10 días después de exposición de las células de tumor al antagonista candidato FGF19. El modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19, es inhibitorio de crecimiento in vivo si la administración del modulador FGF19 candidato, por ejemplo, antagonista FGF19 candidato a aproximadamente 1 pg/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso resulta en reducción en tamaño de tumor o reducción de proliferación de células de tumor dentro de aproximadamente 5 días a 3 meses desde la primera administración del modulador FGF19 candidato, por ejemplo, antagonista FGF19 candidato, de preferencia dentro de aproximadamente 5 a 30 días.

Para seleccionar un modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19, que induce muerte de células de cáncer, pérdida de integridad de membrana como se indica por ejemplo por captación de yoduro propidio (PI) , azul triptan o 7AAD puede evaluarse respecto a una referencia. Un ensayo de captación PI puede realizarse en la ausencia de complemento y células efectoras inmunes . Células de tumor que expresan FGF19, FGFR4, y/o klotho {por ejemplo, KLB) se incuban con medio solo o medio que contiene el modulador FGF19 apropiado. Las células se incuban por un periodo de 3 días . Después de cada tratamiento, las células se lavan y toman alícuotas en tubos de 12 x 75 tapados con colador de 35 mm (1 mi por tubo, 3 tttb e por grupo de tratamiento) para retirar grumos celulares. Los tubos después reciben PI (10 pg/ml) . Las muestras pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo FACSCAN® y el programa FACSCO VERT® CellQuest (Becton Dickinson) . Aquellos moduladores FGF19 que inducen niveles estadísticamente insignificantes de muerte celular como se determina por captación de PI pueden seleccionarse como anticuerpos que inducen muerte celular, polipéptidos de enlace, moléculas pequeñas y/o polinucleótidos .

Para cribar modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19 que enlaza a un epítopo en o interactúa con un polipéptido enlazado por un anticuerpo de interés, un ensayo de bloqueo cruzado rutinario tal como el descrito en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lañe (1988) , puede realizarse. Este ensayo puede emplearse para determinar si un modulador FGF19 candidato enlaza el mismo sitio o epítopo con un anticuerpo conocido. En forma alterna o adicional, mapeo de epítopo puede realizarse por métodos conocidos en la especialidad. Por ejemplo, el anticuerpo y/o secuencia de polipéptido de enlace puede mutagenizarse tal como por mediante alanina para identificar residuos de contacto. El anticuerpo mutante inicialmente se prueba por enlace con anticuerpo policlonal y/o polipéptido de enlace para asegurar adecuado plegado. En un método diferente, péptidos que corresponden a regiones diferentes de un polipéptido pueden emplearse en ensayos de competencia con los anticuerpos y/o polipéptidos candidato o con un anticuerpo candidato y/o polipéptido de enlace y un anticuerpo con un epítopo caracterizado o conocido.

En algunas modalidades de cualquiera de los métodos de criba y/o identificación, el modulador FGF19 candidato, por ejemplo, antagonista FGF19, es un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña o polinucleótido . En algunas modalidades, el modulador FGF19 candidato, por ejemplo, antagonista FGF19 , es un anticuerpo. En algunas modalidades, el modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19) es una molécula pequeña.

En un aspecto, un modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19, se prueba por su actividad de enlace de antígeno, por ejemplo por métodos conocidos tales como ELISA, transferencia Western, etc.

V. Formulaciones Farmacéuticas Formulaciones farmacéuticas de un modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19, como se describe aquí, se preparan al mezclar este anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. En algunas modalidades, el modulador FGF19 es una molécula pequeña, un anticuerpo, un polipéptido de enlace y/o polinucleótido . Portadores farmacéuticamente aceptables en general no son tóxicos a los recipientes a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen pero no están limitados a: amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, butil o bencil alcohol; alquil parabenos tales como metilo o propilo parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (con menos de aproximadamente 10 residuos) ,· proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, aspatagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de proteína Zn) ,· y/o surfactantes no iónicos tales como polietilen glicol (PEG) . Portadores farmacéuticamente aceptables ejemplares aquí además incluyen agentes de dispersión de fármaco intersticiales tales como glicoproteínas hialuronidasa neutras activas solubles (salep) , por ejemplo, glicoproteínas PH-20 hialuronidasa solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)- Ciertas sHASEGPs ejemplares y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, se describen en las Publicaciones de Patentes de los E.U.A. Números 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, una sHASEGP se combina con uno o más glicosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas .

Formulaciones liofilizadas ejemplares se describen en la Patente de los E.U.A. Número 6,267,958. Formulaciones de anticuerpo acuosas incluyen aquellas descritas en la Patente de los E.U.A. Número 6,171,586 y WO2006/044908 , estas últimas formulaciones incluyen un amortiguador histidina-acetato.

La formulación presente también puede contener más de un ingrediente activo según sea necesario para la indicación particular que se trata, de preferencia aquellas con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí.

Estos ingredientes activos están convenientemente presentes en combinación, en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido.

Ingredientes activos pueden estar atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo hidroxibutil celulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, el sistema de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) , o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) .

Preparaciones de liberación sostenida pueden ser elaboradas. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el modulador FGF19, por ejemplo, antagonista FGF19, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas .

Las formulaciones a utilizarse para administración in vivo en general son estériles. La esterilidad puede ser lograda fácilmente, por ejemplo por filtración a través de membranas de filtración estériles.

VI . Artículos de Manufactura En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los desórdenes aquí descritos . El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque en o asociado con el recipiente. Recipientes convenientes incluyen por ejemplo botellas, ampolletas, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que por sí misma o combinada con otra composición es efectiva para tratar, evitar y/o diagnosticar la condición y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o una ampolleta que tiene un tapón de perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Cuando menos un agente activo en la composición es un modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19) aquí descrito. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición se emplea para tratar la condición de selección. Aún más, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer recipiente con una composición ahí contenida, en donde la composición comprende un modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19) ; y (b) un segundo recipiente con una composición ahí contenida, en donde la composición comprende un agente terapéutico adicional citotóxico o de otra forma. En algunas modalidades, la etiqueta del recipiente indica que la composición puede ser empleada para tratar a un individuo con base en niveles de uno o varios ácidos biliares.

En algunas modalidades, el artículo de manufactura comprende un recipiente, una etiqueta en el recipiente y una composición contenida dentro del recipiente; en donde la composición incluye uno o más reactivos (por ejemplo/ anticuerpos primarios que ligan a uno o más b<?marcadores de metabolismo de ácidos biliares o tridas y/o cebadores a uno o más de los biomarqa<*ores del metabolismo de ácidos biliares aquí descri os) , la etiqueta en el recipiente indica que la composición puede emplearse para evaluar la presencia de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra, e instrucciones para utilizar los reactivos para evaluar la presencia de uno o más biomarcadores del metabolismo de ácidos biliares en una muestra. El artículo de manufactura además puede comprender un conjunto de instrucciones y materiales para preparar la muestra y utilizar los reactivos. En algunas modalidades, el artículo de manufactura puede incluir reactivos tales como tanto un anticuerpo primario como secundario, en donde el anticuerpo secundario se conjuga a una etiqueta, por ejemplo una etiqueta enzimática. En algunas modalidades, el artículo de manufactura es una o más sondas y/o cebadores con uno o más de los biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares aquí descritos.

En algunas modalidades de cualquiera de los artículos de manufactura, el modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19) es un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña o polinucleótido. En algunas modalidades, el anticuerpo e» ^un anticuerpo monoclonal. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

El artículo de manufactura en esta modalidad además puede comprender un inserto de empaque que indica que las composiciones pueden emplearse para tratar una condición particular. En forma alterna o adicional, el artículo de manufactura además puede comprender un segundo (o tercer) recipiente que comprende un amortiguador farmacéutico aceptable tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , salino amortiguado con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede incluir otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial y de usuario incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Otros componentes opcionales en el artículo de manufactura incluyen uno o más amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de bloque, amortiguador de lavado, amortiguador de sustrato, etc.), otros reactivos tales como sustrato (por ejemplo, cromógeno) que se altera químicamente por una etiqueta enzimática, solución de recuperación de epítopo, muestras de control (controles positivo y/o negativo) portaobjeto (s) de control etc.

Se entiende que cualquiera de los artículos de manufactura anteriores puede incluir un inmunoconjugado aquí descrito en lugar de o además de un modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19) .

VII. EJEMPLOS Los siguientes son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que diversas otras modalidades pueden practicarse, dada la descripción general proporcionada anteriormente .

Materiales y Métodos Estudio In vivo en Monos macaco cangrejeros .

Se empleó anticuerpo anti-FGFl9 totalmente humanizado que mostró enlace a huFGF19 con alta afinidad (Kd = 118 pM) y efectivamente bloquea el enlace de FGF19 a FGFR4. Monos macacos cangrejeros se consideran el modelo de animal más apropiado para evaluar la seguridad debido a afinidad de enlace similar de anti-FGF19 a humano y FGF19 mono macaco cangrejero (datos no mostrados) , y debido a que los ratones sólo expresan FGF15, un ortólogo de FGF19. Un estudio de toxicología se realizó en monos macacos cangrejeros sin tratamiento previo, sanos, con edades 2 - 3 años, y que pesan ~3 kg. Los animales se distribuyeron al azar en cinco grupos (3/sexo/grupo) y dosificaron con vehículo (histidina acetato 20 mM, trehalosa dihidrato 8%, polisorbato 20 al 0.02%, pH 5.5) o 3, 10, 30 y 100 mg/kg de anti-FGF19 por animal como un bolo IV administrado una vez cada dos semanas por 8 semanas (total de 5 dosis) . Observaciones clínicas estándar, peso corporal, análisis químico/hematología clínicos y parámetros de patología anatómicos (incluyendo pesos de órganos, patología macroscópica e histopatología) se estimaron. Muestras de tejido biliar y de hígado se recolectaron en todos los animales a necropsias programadas y no programadas y congelan en forma instantánea en nitrógeno líquido para análisis RNA. Muestras fecales se recolectaron el Día del Estudio 14 de dos animales en cada grupo y almacenaron a -20° C. Ácidos biliares fecales se midieron por análisis GC-MS después de un procedimiento previamente descrito. Daggy BP et al. 1997. J Lipid Res 38 (3) : 491-502. Espectrometría de masas se empleó para identificar todos los ácidos biliares detectados en el análisis GC-MS. La salida total de ácidos biliares se determina de la suma de todos los ácidos individuales, y de éstas concentraciones, la contribución a las rutas de ácido cólico y quenodeoxicólico se determina como se describió previamente (Setchell KD et al. 1987. Clin Chivo. Acta 162:257-75). Ácidos biliares identificados positivamente además se cuantificaron y las concentraciones de ácidos biliares normalizaron a g/g de peso húmedo como se describió previamente en Setchell KDR et al. 1983. J Lipid Res. 24:1085-100.

Ensayo de Toxicidad de Hepatocitos .

Hepatocitos de macacos cangrejeros primarios crioconservados se adquirieron de CellzDirect (Durham, NC) y revistieron a 0.6 x 106 células/pozo en 0.1 mL en placas revestidas con colágeno I de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Las células se incubaron durante la noche antes de agregar los materiales de prueba en triplicado e incubaron por 48 horas adicionales. Ya que ese anticuerpo no enlaza en roedores, concentraciones de dosis (1.6 - 100 pg/mL) se seleccionaron con base en silico modelado utilizando datos PK de administración de anticuerpos quiméricos en ratón. Tamoxifen (100 µ?) servido como un control positivo y un anticuerpo de control de isotipo (gpl20, Genentech Inc., CA) (100 pg/mL) se emplean como un control negativo. Al final de la incubación, se estima la viabilidad celular al medir niveles ATP utilizando el Equipo de Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CellTiter-Glo™ y protocolo asociado (Promega; Madison, WI) .

Estudios de Transporte de Ácidos Biliares Hepatocitos Utilizando Cultivos Emparedados de Hepatocitos de Macaco Cangrejero .

Hepatocitos de mono recientemente aislados revestidos en placas de 6 pozos con revestimiento Matrigel™ se obtienen de CellzDirect Inc. (Durham, NC) . Captación y eflujo de ácidos biliares se evalúan utilizando d8-taurocolato como un sustrato sonda en hepatocitos de mono macaco cangrejero utilizando B-Clear Technology™ (Qualyst Inc., NC) . Los cultivos celulares se trataban ya sea con anticuerpo anti-FGFl9 o anticuerpo de control de isotipo (100 pg/mL) por 6 y 24 h. La masa total de ácidos biliares endógenos (taurocolato, TCA: glicolato, GCA; tauroquenodeoxicolato, TCDCA, glicoquenodeoxicolato, GCDCA) al final del periodo de incubación se determina en amortiguador libre de calcio y la masa total del compuesto que se absorbe y excreta, se determina en amortiguador que contiene calcio utilizando LC/MS/ S y cuantifica contra curvas estándar preparadas con equivalentes de isótopo estable (d8-TCA, d4-GCA, d4-TCDCA, o d4-GCDCA) . Todos los valores de masa para d8-taurocolato se normalizaron a miligramo de proteína. índice de excreción biliar y eliminación biliar in vitro se calculan como se describe previamente en Liu X. et al. 1999. Drug Metab Dispos 27 (6) : 637-44.

Estudios de Permeabilidad de Células Epiteliales Intestinales (Caco-2) Utilizando el Sistema Transwell .

La línea celular de adenocarcinoma humano Caco-2 y Medio Esencial Mínimo Eagle (EMEM) se adquieren de ATCC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) . Células Caco-2 se siembran en insertos transwell (0.4 µt? de tamaño de poro, Corning, NY) a una densidad de 1.5xl05 células/mL y cultivan por 23 días con cambios de medio 3 veces por semana. El día 23, las células se trataron ya sea con anticuerpo de control de isotipo (100 pg/ mL) , FGF19 (gpl20, Genentech Inc., CA) (500 ng/ mL) , anti-FGF19 (100 pg/ mL) , DCA (Sigma- Aldrich, St . Louis, MO) (50 µ?) o DCA (50 µ?) plus anti-FGF19 (100 pg/mL) por 24 horas antes de experimentos de permeabilidad. Las monocapas se equilibraron por 30 min en amortiguador de transporte (HBSS con HEPES lOmM, pH 7.4) a 37°C y la resistencia eléctrica transepxtelial [TEER (O cm2), área de membrana 1.12 cm2] de cada pozo se midieron utilizando el multímetro y electrodo STX-2. Las permeabilidades de amarillo lucifer (LY) , y taurocolato se evaluaron en la dirección apical a basolateral (A-B) . Las soluciones de dosis de transporte consisten de amortiguador de transporte, compuesto de prueba y 100 ? de marcador de integridad de monocapa LY. Los pozos receptores consisten de amortiguador de transporte. La permeabilidad aparente para taurocolato y LY (Papp) se calcula utilizando la siguiente ecuación: P dQ 1 rapp = x dt CoA en donde dQ/dt es la velocidad de aparición de compuesto en el compartimiento receptor, C0 es la concentración en el compartimiento donador y A es el área superficial del inserto. LY se cuantificó utilizando un lector de placas de múlti >ples modos SpectraMaxf M5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) , Ex = 425 nm, Em= 515 nm. Las muestras se analizaron para el compuesto en API4000 (Applied Biosystems, Foster City, CA) con una bomba serie 1200 y desgasificador (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) , un Aria LX2 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) y un Automuestreador Leap HTS PAL. Las fases móviles consisten de agua con ácido fórmico al 0.1% (fase móvil A) y acetonitrilo con ácido fórmico al 0.1% (fase móvil B) . Todas las muestra se inyectaron en una columna Synergi Hydro-RP (Phenomenex, Torrance, CA) y analizaron utilizando el modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) . Datos de espectrómetro de masas se procesaron utilizando el programa Analyst versión 1.4.2. Análisis de expresión de genes.

AR total se aisló de muestras de hígado e íleo de monos tratados con vehículo o anti-FGF19, cultivos de hepatocitos de monos macacos cangrejeros primarios y cultivo de células Caco-2 utilizando el RNeasy kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) y DNasa tratada en columna (Qiagen Inc., Valencia, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración de R A se determinó utilizando espectrofotómetro ND-1000 (Nanodrop Products, Wilmington, DE) . RT-PCR cuantitativa se realiza para determinar la abundancia de mRNAs de gen regulado con ácidos biliares y -FGF19. Cebadores específicos de humano y sondas fluorogénicas para Cyp7al, BSEP, NTCP, 0AT2, MRP2, PR3, ASBT, IBABP, OSTa, OSTP, FGF19 y 60s proteína ribosomal L 19, (RPL19, control interno) se obtienen de Applied Biosystems (Foster City, CA) . Reacciones de amplificación se realizan utilizando la mezcla maestra RT-PCR de una etapa Taqman (ABI) en termociclador Mx-3000Xp en tiempo real (Stratagene, La Jolla, CA) . Cada muestra se corre en triplicado y los resultados para regiones de interés se normalizan al gen de mantenimiento RPL19.

Análisis estadístico .

Prueba t de Student de dos colas con corrección de elch se utiliza para comparar datos entre dos grupos. Valores P <0.05 se consideraron estadísticamente significantes .

Ejemplo 1 - Hallazgos de Estudio en Monos Macacos Cangrejeros In Vivo Las toxicidades observadas clínicamente mayores asociadas con administración en una sola dosis de anti-FGF19 en los grupos de 10-100 mg/kg fueron severa diarrea, bajo consumo de alimentos y disminuido peso corporal, que resultan en eutanasia no programada de dos animales (Tabla 1) . Finalmente, todos los animales en los grupos 10-100 mg/kg se sometieron a eutanasia después de una dosis debido a deficientes condiciones clínicas. Los animales a los que se da 3 mg/kg sólo tuvieron ligeros signos clínicos y mínimos efectos en parámetros de patología clínica durante las primeras dos semanas del estudio, por lo tanto el programa de dosis de cinco dosis total, permaneció intacto para todos los animales en este grupo. Los únicos signos clínicos relacionados al artículo de prueba en los animales de baja dosis fueron heces no formadas o líquidas periódicas y disminuido consumo de alimentos sin cambio significante en peso corporal (Tabla 1) .

Tabla 1: incidencia de heces líquidas/no formadas, consumo de alimento (Días 1-16) y cambio en peso corporal en monos macacos cangrejeros tratados con vehículo (0) o 3-100 mg/kg anticuerpo de anti-FGF19; (*reportado como deshidratado; M: macho, F: hembra) . (continúa) Aumentos relacionados a dosis sustanciales en aspartato aminotransferasa (AST) , alanina transaminasa (ALT) , total de ácidos biliares (TBA) y niveles totales de bilirrubina (TBIL) se observaron a través de grupos tratados con 10, 30 y 100 mg/kg de anti-FGF19 (Figura 1A-1D, respectivamente) . En sus más altos niveles, actividades promedio de AST, ALT, y TBA se incrementaron 21 - 30- veces, 13 - 27- veces, y 2 - 4- veces, respectivamente, contra animales de control. El grupo de tratamiento de 3 mg/kg mostró aumentos mínimos-a- leves en suero AST (2 - 3- veces) y suero TBA (1- vez) , y aumentos ligeros-a-moderados en suero ALT (3 -6 -veces) , que no empeoran progresivamente con dosis subsecuentes (Figura 1A-1C) . Aunque actividades incrementadas de ALT y TBA fueron consistentes con lesión y/o disfunción hepatocelular, cambios histopatológicos correspondientes no se observan en la mayoría de los animales . Sólo dos animales que se someten a eutanasia no programada tuvieron necrosis de una sola célula hepatocelular leve-a-marcada (datos no mostrados) . Secciones de estómago, duodeno e íleo de todos los animales de estudio se examinaron en forma histopatológica y se considera que están dentro de los límites normales, indicando que diarrea y deshidratación fueron las causas primarias probables de muerte y morbilidad en estos animales. Con base en los datos colectivos, dosis sencillas de 10, 30 y 100 mg/kg se consideraron no tolerables. Por lo tanto, para propósitos del presente estudio, analizamos muestras de tejido de sólo grupos de vehículo y alta dosis (100 mg/kg) en un intento para comprender mejor los mecanismos de toxicidad de anti-FGF19. Además, con base en la severidad de signos clínicos y grado de elevación de enzimas de hígado, anti-FGF19 parece ser más tóxico en hembras que en machos. De manera interesante, una observación similar en efectos de género se reportan en la incidencia de carcinoma hepatocelular en ratones transgénicos FGF19. Sin embargo, la razón para esto no es clara. Nicholes K. et al. 2002. Am J Pathol 160 (6) : 2295-307.

Ejemplo 2 — Análisis de Ácidos Biliares Fecales de Monos Macacos Cangrejeros Tratados con anti-FGF19 Altas concentraciones de ácidos biliares (>0.5 g/ 24 h) que entran al intestino grueso pueden estimular secreción de agua y movilidad intestinal y provocar diarrea acuosa crónica. Hofmann AF. 1967. Gastroenterology 52(4) :752-7. Ya que los animales tratados con anti-FGF19 mostraron elevados niveles de ácidos biliares en suero acompañado por severa diarrea, a continuación se evaluó si ácidos biliares en exceso están presentes en las heces debido a mala absorción. Ante análisis GC-MS de todos los ácidos biliares fecales como se describe en Setchell KDR et al. 1983. J Lipid Res. 24:1085-100, un aumento sustancial en concentraciones de ácidos biliares fecales absolutos se observa en el grupo tratado con anti-FGF19 de alta dosis cuando se compara con el grupo de control (valor p < 0.0001) . Mayor caracterización de los perfiles de ácidos biliares positivamente identificados mostró una tendencia creciente en la presencia de ácidos biliares secundarios, LCA (derivada de CDCA) y DCA, y notablemente un gran incremento en ácido 3a, 12a-hidroxi-5 -colanóico (ambos derivados de CA, todo valor p < 0.05) (Fig. 2A - 2D) .

Ejemplo 3 - El efecto de tratamiento de anti-FGF19 en hepatocitos de monos macacos cangrejeros primarios Ya que los hallazgos químicos clínicos indican incrementados niveles de AST y ALT, en suero, primero se determinó si anti-FGF19 puede provocar citotoxicidad de hepatocitos directa al tratar hepatocitos de monos primarios con anti-FGF19 en concentraciones variantes (1.56 - 100 µ9/p?:?_?) por hasta 48 h. No se observaron cambios significantes en niveles de ATP entre las células tratadas y no tratadas a todos los estudios de concentraciones (datos no mostrados) . Estos hallazgos sugieren que anti-FGF19 no tiene citotoxicidad directa en hepatocxtos de monos primarios.

Ejemplo 4 - El Efecto de Tratamiento de anti-FGF19 en FGF19 y Expresión de Genes Regulados por Ácidos Biliares en Hígado de Monos Macacos Cangrejeros y en Cultivos de Hepatocitos Primarios Aumentos significantes en niveles de expresión de genes Cyp7al (>4-veces) , BSEP (>2-veces) , MRP2 (>1.6-veces) , y RP3 (>1.3-veces) (todo valor p < 0.05) se observaron en el tejido de hígado de monos tratados con anti-FGF19 a 100 mg/kg en comparación con controles tratados con vehículo (Figuras. 3A - 3D) . En contraste, niveles de expresión de NTCP (8% de disminución), OAT2 (35% de disminución) y MRP4 (64.9% de disminución, valor p < 0.04) se redujeron moderadamente (Figuras 3E - 3G) . En cultivos de hepatocitos de monos primarios, anti-FGF19 (100 g/ml, 24 h) provoca aumentos similares en niveles de expresión de genes CYP7OÍ1 (>11-veces) , BSEP (>9-veces) (ambos valores p < 0.05), MRP2 (>1.1-veces) , MRP3 (>1.5- veces, valor p < 0.05) (Figuras 4A - 4D) y una pequeña disminución sólo en expresión NTCP contra control (Figura 4F) .

Ejemplo 5 - El Efecto de Tratamiento anti-FGF19 en Fusión de Transporte de Ácidos Biliares en Hepatocitos Tratamiento de hepatocitos de monos con anti-FGF19 por 6 y 24 horas provocó cambios mínimos en captación y eflujo de ácidos biliares como se determina por masa total de ácidos biliares endógenos (taurocolato, TCA; glicocolato, GCA; tauroquenodeoxicolato, TCDCA; glicoquenodeoxicolato, GCDCA) en la presencia y ausencia de calcio cuando se comparan con control de isotipo (Tabla 2) . Alguna disminución en BEI se observa a 24 h pero no fue estadísticamente significante debido a alta variabilidad (Tabla 3) .

Tabla 2: Efecto de Anti-FGF19 (100 pg/mL) en captación y eflujo de ácidos biliares en hepatocitos de mono B-CLEAR*- . Ácidos biliares endógenos (TCA, GCA, TCDCA, y GCDCA) se acumulan en la presencia y ausencia de calcio fueron cuantificados utilizando LS/MS/MS. Todos los datos son promedio del % de control de isotipo + STDEV; n=3. (continúa) Tabla 3: índice de Excreción Biliar (BEI) de ácidos biliares endógenos (TCA, GCA, TCDCA, y GCDCA) después de incubación con anti-FGF19 (100 9/p?:[_) en hepatocitos de mono B-CLEAR5-(detallado en Materiales y Métodos) . Todos los datos son promedio de por ciento de control de isotipo ± STDEV; n=3.

Ejemplo 6 - El efecto de tratami nto anti-FGF19 en expresiones de genes de transporte de ácidos biliares en íleo de mono macaco cangrejero y células epiteliales intestinales humanas (Caco-2) Muestras de tejido ileal de 100 mg/kg de animales tratados con anti-FGF19 mostraron incrementados niveles de expresión de mRNA Ost-a (>2.7 -veces) , Ost-ß (>2.3-veces) , y IBABP (>2.7-veces) mRNA en comparación con controles, pero los cambios no fueron estadísticamente significantes debido a elevada variabilidad en el grupo de control (Figuras 5A -5C) . Para evaluar adicionalmente si estas elevaciones se debieron a un efecto directo de anti-FGF19 o un efecto indirecto de ácidos biliares inducidos por anti-FGF19, estimamos la expresión de genes transportadores de solutos selectos en cultivos de células Caco-2 después de tratamiento ya sea con anti-FGF19 (100 pg/mL, 24 h) o DCA (50 µ?, 24 h) . En células Caco-2, tratamiento con anticuerpo anti-FGF19 no provoca ningún cambio significante en expresión mRNA de estos transportadores de soluto, mientras que tratamiento con DCA aumenta significativamente expresión de IBABP (>30-veces, valor p < 0.0001), Ost-a (2-veces, valor p < 0.0015), y Ost-ß (1.3 -veces, valor p < 0.05) similar a la observada in vivo (Figura 6A - 6C) , indicando los cambios observados en los tejidos ileales probablemente son dirigidos por los ácidos biliares elevados y puede no ser un efecto directo de anticuerpo anti-FGF19. Además, tratamiento anti-FGFl9 provoca una reducción modesta en niveles de expresión ASBT mRNA in vivo e in vitro (Figuras 5D & 6D) .

Ejemplo 7 - El efecto de tratamiento anti-FGFl9 en permeabilidad de membrana en células epiteliales intestinales (Caco-2) y función de transporte Pretratamiento de monocapas Caco-2 con proteína FGF19 (500 ng/ml, 24 h) no altera la captación o permeabilidad de membrana de taurocolato. Sin embargo, tratamiento con anti-FGF19 (100 pg/mL, 24 h) compromete enormemente la captación de taurocolato (reducción de ~64% contra control, valor p < 0.002) in vitro, y un efecto similar se observa con tratamiento con DCA (50 µ , 24 h) (reducción ~80% contra control, valor p < 0.001). Ya que los ácidos biliares se ha mostrado que inducen expresión de FGF19 en células epiteliales intestinales (LS174T) (Wistuba W. et al. 2007. World J Gastroenterol 13 (31) : 4230-5) , determinamos si DCA influenció la función de transporte Caco-2 indirectamente a través de la inducción de FGF19 o si este efecto puede ser atenuado por pretratamiento de células con anti-FGF19. Tratamiento de células Caco-2 con DCA (50 pM, 24 h) induce significativamente expresión de FGF19 mR A (Figura 7A, valor p < 0.001); sin embargo pretratamiento con anti-FGF19 (100 pg/ml, 24 h) sólo rescató parcialmente DCA-disminución mediada en captación de taurocolato (-30% recuperación contra DCA) (Figura 7B) . En total, DCA inhibió captación de ácidos biliares conjugados de células epiteliales ileales (taurocolato) imparte a través de inducción de expresión de células epiteliales ileales FGF19.

Factor de crecimiento de fibroblastos 19 (FGF19) reprime 7a-hidroxilasa (Cyp7o¡l) e inhibe síntesis de ácidos biliares in vitro e in vivo. Estudios previos han mostrado que tratamiento con anticuerpo anti-FGF19 reduce crecimiento de xenoinjertos de tumor de colon y evita carcinomas hepatocelulares en ratones transgénicos FGF19 y de esta manera puede ser una diana de cáncer útil. En un estudio de seguridad de dosis repetida en monos macacos cangrejeros, tratamiento con anti-FGF19 (3-100 mg/kg) demostró toxicidad de hígado relacionada a dosis acompañada por severa diarrea y bajo consumo de alimento. El mecanismo de toxicidad anti-FGF19 se investigó utilizando los enfoques in vitro e in vivo. Los resultados muestran que el anticuerpo anti-FGF19 no tiene efectos citotóxico directo en hepatocitos de mono. Anti-FGF19 incrementó Cyp7al como se esperó, pero también incrementó la expresión de gen de transportador de eflujo de ácidos biliares (BSEP, MRP2, MRP3) y reduce la expresión de NTCP y OAT2 en tej idos de hígado de monos tratados y en hepatocitos primarios. Además, el tratamiento con anti-FGF19 aumenta la expresión de gen transportador de soluto (IBABP, OST-a, OST-ß) en tejidos ileales de monos tratados pero no en células Caco-2. Sin embargo, ácido deoxicólico (DCA: un ácido biliar secundario) aumenta la expresión de FGF19 y estos genes transportadores de soluto en células Caco-2. Análisis GC-MS de heces de mono mostró un aumento en total de ácidos biliares y derivados de ácido cólico. Estos hallazgos sugieren que altas dosis de anti-FGF19 aumenta la expresión de Cyp7al y síntesis de ácidos biliares y altera la expresión de transportadores biliares en el hígado resultando en eflujo de ácidos biliares mejorado y reducida captación. Incrementados ácidos biliares alteran la expresión de transportador de soluto en el íleo provocando diarrea y la recirculación enterohepática mejorada de ácidos biliares que lleva a toxicidad del hígado.

Múltiples procesos incluyendo absorción, distribución, metabolismo y excreción se conoce que influencia las farmacocinéticas, farmacodinámicas y toxicidad de fármacos. En el presente estudio, tratamiento con anticuerpo anti-FGF19 a dosis >3mg/kg provoca toxicidad del hígado en monos macacos cangrejeros como se evidencia por elevadas enzimas de hígado-suero y bilirrubina. Otros efectos adversos de tratamiento incluyen diarrea aguda, bajo consumo de alimentos y morbilidad. Los estudios sugieren que estos efectos se relacionan a desregulación del metabolismo de ácidos biliares y deteriorada reabsorción de ácidos biliares en el íleo.

Ratones de eliminación FGF15 y ß-klotho mostraron elevada excreción Cyp7al mRNA hepática y ácidos biliares fecales (Inagaki T. et al. 2005. Cell Metab 2 (4) : 217-25; Ito S. et al. 2005. J Clin Invest 115 (8) : 2202-8 ; Wu X. et al. 2007. J Biol Chem 282 (40) : 29069-7) , y mutaciones en gen Cyp7ocl se han identificado en pacientes con hipercolesterolemia, enfermedades de cálculos biliares prematuras y ateroesclerosis prematura (Pullinger CR et al. 2002. J Clin Invest 110 (1) : 109-17) sugiriendo la represión de retroalimentación negativa de transcripción Cyp7 l por ácidos biliares es crucial para mantener homeostasis de ácidos biliares y colesterol. Los datos presentes muestran incrementada expresión hepática de Cyp7o¡l en grupos tratados con anti-FGF19 y elevados ácidos biliares en suero y heces de monos. Además, incrementada expresión de Cyp7 l en hepatocitos de monos primarios después de tratamiento anti-FGF19 muestra además que anti-FGF19 afecta directamente Cyp7o¡l y resulta en incrementada síntesis de ácidos biliares en estos animales .

Circulación enterohepática de ácidos biliares es dirigida primordialmente por el funcionamiento de transportadores específicos expresados en el hígado e intestino y alteraciones pueden contribuir a elevaciones en ácidos biliares de suero. Perfiles de expresión de 50 genes transportadores principales a través de humanos y monos macacos cangrejeros no mostraron variabilidad en expresión específica de órgano y conservación de genes transportadores. Bleasby K. et al. 2006. Xenobiotica 36 (10-11) : 963-88. Mientras que el transporte de ácidos biliares a través de la membrana basolateral de hepatocitos sustancialmente es mediado por NTCP así como OATP, ocurre eflujo de ácidos biliares por RP3 y MRP4 (papel compensatorio) . Los transportadores de cásete de enlace ATP, BSEP y MRP2 median la secreción de ácidos biliares a través de la membrana canalicular, que ya son absorbidos en forma pasiva o activa en el íleo distante por ASBT. Inducción de BSEP y supresión de expresión de gen NTCP por altos niveles de ácidos biliares se considera que es una respuesta adaptativa a la acumulación de ácidos biliares hidrofóbicos en hepatocitos. Anwer MS. 2004. Hepatology 39 (3 ): 581-90 ; Arrese M. and Ananthanarayanan M. 2004. Pflugers Arch 449 (2) : 123-31. Los datos actuales muestran que la inhibición de FGF19 resulta en una reducción de niveles de expresión de NTCP y OATP y una expresión sustancialmente incrementada de BSEP, MRP2 y MRP3 tanto in vivo como in vitro sugiere transporte de ácidos biliares alterado en el hígado. Además, los efectos in vivo se recapitularon in vitro, sugiriendo que el modelo de hepatocitos primario in vivo fue un modelo razonable de efectos anti-FGF19. Desafortunadamente, cambios en genes transportadores de ácidos biliares no se traducen en un efecto funcional significante en nuestro modelo de cultivo emparedado de hepatocitos, que podría deberse a alta variabilidad observada en ese modelo.

El transporte intracelular de ácidos biliares a través del aspecto luminal de enterocitos se facilita por IBABP y, Ost-a y Ost-ß facilitan el transporte de enterocitos para reentrada a la sangre portal para completar la circulación enterohepátic . Alrefai A and Gilí RK. 2007. Pharm Res 24 (10) : 1803-23. Incrementa de expresión de IBABP y Ost-a se observa en el tejido ileal de monos tratados con anti-FGF19 que tienen diarrea. Además, la expresión incrementada de IBABP y Ost- en células epiteliales intestinales tratadas con ácidos biliares (Caco-2) se observa indicando cambios consistentes con la absorción de ácidos biliares en el íleo. Además, los datos muestran que DCA incrementa la expresión de FGF19 en células Caco-2 y disminuye la captación de taurocolato que coincide con estudios previos que muestran ácidos biliares que directamente regulan por incremento FGF19 y disminuyen la resistencia eléctrica trans-epitelial (TEER) en células epiteliales intestinales. Hughes R. et al. 2008. Nutr Cáncer 60 (2) : 259-66 ; Raimondi F. et al. 2008. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 294 (4 ) : G906-13. De manera interesante, en el estudio actual, co-tratamiento de monocapas Caco-2 con DCA y anti-FGF19 sólo rescata parcialmente la reducción mediada por DCA en captación de taurocolato indicando que DCA media la disminución en función de transporte puede no ser completamente dependiente de FGF19. Varios estudios muestran que los ácidos biliares regulan genes transportadores ileales, tales como ASBT, IBABP, Osta y Ost D y su importancia en transporte de ácidos biliares en el intestino delgado y homeostasis son consistentes con los datos que muestran la expresión de transporte ileal alterada en respuesta a ácidos biliares in vivo e in vitro. Ballatori N. et al. 2008. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 295 (1) :G179-G186; Dawson PA et al. 2003. J Biol Chem 278 (36) : 33920-7 ; Dawson PA et al. 2005. J Biol Chem 280 (8) : 6960-8 ; Lee H. et al. 2006. J Lipid Res 47 (1) :201-14; Nakahara M. et al. 2005. J Biol Chem 280 (51) :42283-9; Rao A. et al. 2008. Proc Nati Acad Sci USA 105 (10) :3891-6. Ácido quenodeoxicólico (CDCA) y ácido cólico (CA) son los productos inmediatos de las rutas de síntesis de ácidos biliares referidas como ácidos biliares primarias, que ante conjugación y deshidroxilación producen ácidos biliares secundarios principales LCA y DCA, respectivamente. Lefebyre P. et al. 2009. Physiol Rev 89:147-91. Bajo condiciones normales la mayoría de los ácidos biliares secundarios se reabsorben activamente en el íleo y una pequeña fracción no absorbida excretada en las heces. Mientras que la excreción de ácidos biliares fecales total refleja una medida de la síntesis de ácidos biliares hepáticos bajo condiciones de estado estable, excreción de ácidos biliares fecales elevada se ha asociado con transportes ileales alterados y circulación enterohepática. Lefebyre P. et al. 2009. Physiol Rev 89:147-91. Los datos muestran cambios en composición de ácidos biliares fecales asociados con expresión de gen transportador ileal en animales tratados con anti-FGF19 indica circulación enterohepática perturbada. Además, el efecto catártico de un exceso de ácidos biliares fecales se ha mostrado que es una de las causas subyacentes en varios ámbitos clínicos asociados con mala absorción de ácidos biliares manifestada a través de diarrea acuosa crónica y esteatorrea. Westergaard H. 2007. Curr Treat Options Gastroenterol 10(l):28-33. En los Ejemplos, caracterización de ácidos biliares fecales mostró un aumento en metabolitos de ácido cólico, incluyendo DCA y ácido iso-litocólico, que son altamente catárticos como se describe en Hofmann AF. 1977. The J Infecí Dis. 135, Supplement, S126-32, y puede explicar la diarrea observada en los monos tratados con anti-FGF19. Mientras que otro estudio mostró pacientes con mala absorción de ácidos biliares tienen reducido FGF19 en suero, Walters JR et al. 2009. Clin Gastroenterol Hepatol 7 (11) :1189-94, este es el primer estudio que muestra la inhibición mediada por anticuerpo de FGF19 provoca incrementada síntesis de ácidos biliares y subsecuentemente mala absorción encuentra soporte .

En conclusión, los hallazgos como se ilustra en la Figura 8, muestran que la inhibición de FGF19 con anti-FGF19 des-reprime regulación de Cyp7al y aumenta la síntesis de ácidos biliares in vitro e in vivo y también altera la expresión de transportador de ácidos biliares hepáticos. Como resultado, ácidos biliares de suero elevados subsecuentemente alteran la expresión de transportador de ácidos biliares en el intestino resultando en perturbación de circulación enterohepática y el desarrollo de diarrea y toxicidad del hígado. Este estudio es el primero en demostrar esta relación con homeostasis de ácidos biliares en un primate no humano como resultado de efectos en diana.

Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplos para propósitos de claridad de comprensión, las descripciones y ejemplos no deberán interpretarse como limitantes del alcance de la invención. Las descripciones de todas las patentes y literatura científica aquí citadas se incorporan expresamente en su totalidad por referencia.

Claims (45)

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar una enfermedad o desorden en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un modulador FGF19 y estimar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo (por ejemplo, en comparación con una referencia) durante el tratamiento con el modulador FGF19.

2. Un método para tratar una enfermedad o desorden en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva de un modulador FGF19, en donde el tratamiento se basa en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo (por ejemplo en comparación con una referencia) .

3. Un método para tratar una enfermedad o desorden en un individuo, el método comprende: determinar que una muestra del individuo comprende niveles sustancialmente normales o niveles reducidos de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) y administrar una cantidad efectiva de un modulador FGF19 al individuo, con lo que la enfermedad o desorden se trata.

4. Un método para tratar una enfermedad o desorden, que comprende: (a) seleccionar a un individuo que tiene la enfermedad o desorden, en donde el individuo comprende niveles substancialmente normales o niveles reducidos de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo (por ejemplo, en comparación con una referencia) ; y (b) administrar al individuo así seleccionado, una cantidad efectiva de un modulador FGF19 con lo que se trata la enfermedad o desorden.

5. Un método para identificar a un individuo que es más o menos probable que exhiba beneficio del tratamiento que comprende un modulador FGF19, el método comprende: determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo, en donde niveles reducidos y/o niveles sustancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) en la muestra, indican que el individuo es más probable que exhiban beneficio por tratamiento que comprende el modulador FGF19 o niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, comparado con una referencia) indica que el individuo es menos probable que exhiba a beneficio del tratamiento que comprende el modulador FGF19.

6. Un método para pronosticar si un individuo con una enfermedad o desorden es más o menos probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende un modulador FGF19, el método comprende determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo, con lo que niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) indican que el individuo es más probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende el modulador FGF19 y niveles reducidos y/o niveles substancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) indica que el individuo es menos probable que desarrolle toxicidad a tratamiento que comprende el modulador FGF19.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde la toxicidad es diarrea (por ejemplo, diarrea severa) , deshidratación, bajo consumo de alimentos, disminuido peso corporal, y/o morbilidad.

8. Un método para determinar si un individuo con una enfermedad o desorden deberá continuar o interrumpir tratamiento que comprende un modulador FGF19, el método comprende medir en una muestra del individuo, niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares, en donde los niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) determina que el individuo deberá interrumpir tratamiento que comprende el modulador FGF19 y reducidos niveles y/o niveles substancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) determina que el individuo deberá continuar el tratamiento que comprende el modulador FGF19.

9. Un método para identificar a un individuo como más probablemente conveniente o menos probablemente conveniente que continúe un tratamiento, en donde el tratamiento comprende un modulador FGF19, con base en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo, en donde niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) identifica al individuo menos probable adecuado para continuar el tratamiento que comprende el modulador FGF19 y reducidos niveles y/o niveles substancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) identifica al individuo que es más probable conveniente que continúe el tratamiento que comprende el modulador FGF19.

10. Método para optimizar la eficacia terapéutica y/o reducir toxicidad asociadas con un tratamiento de una enfermedad o desorden en un individuo que tiene la enfermedad o desorden que se somete a tratamiento, que comprende: determinar los niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestran del individuo, en donde niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares indican una necesidad por disminuir la cantidad y/o frecuencia de subsecuente administración de un modulador FGF19 al individuo.

11. Un método para identificar a un individuo que tiene una enfermedad o desorden como más probablemente conveniente o menos probablemente conveniente para continuar una dosis y/o programa de dosis de un tratamiento, en donde el tratamiento comprende un modulador FGF19, con base en niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo, en donde niveles elevados de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) identifican al individuo como menos probable conveniente que continúe la dosis y/o programa de dosis del tratamiento que comprende el modulador FGF19 y reducidos niveles y/o niveles substancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) identifica al individuo como más probablemente conveniente que continúe la dosis y/o programa de dosis del tratamiento que comprende el modulador FGF19.

12. Un método de ensayo para optimizar eficacia de dosis en un individuo que recibe un modulador FGF19, el método comprende: (a) determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo; (b) recomendar una dosis subsecuente del modulador FGF19 con base en el nivel del biomarcador de metabolismo de ácidos biliares.

13. Un método de ensayo para evaluar el riesgo que un individuo desarrolle toxicidad a un modulador FGF19, el método comprende: (a) determinar niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares en una muestra del individuo; (b) evaluar el riesgo de que el individuo desarrolle toxicidad al modulador FGF19 con base en los niveles de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-13, en donde el método además comprende administrar una cantidad efectiva del modulador FGF19 (por ejemplo, al individuo que tiene niveles reducidos y/o niveles substancialmente normales de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares (por ejemplo, en comparación con una referencia) ) .

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es una enzima del hígado.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde la enzima del hígado es una enzima de suero-hígado .

17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es un ácido biliar.

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el ácido biliar es un ácido biliar total.

19. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el ácido biliar es ácido biliar hidrofóbico.

20. El método de conformidad con la reivindicación 17, en donde el ácido biliar es un ácido biliar secundario.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el ácido biliar secundario es ácido litocólico.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde el ácido biliar secundario es ácido deoxicólico.

23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es aspartato aminotransferasa (AST) , alanina transaminasa (ALT) , gamma glutamil transpeptidasa (GGT) , alfa-L-fucosidasa (AFU) , adenosina deaminasa (ADA) , actividad de colinesterasa (CHE) , alfa-fetoproteína (AFP) , y/o niveles de bilirubina total (TBIL) .

24. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares es Cyp7o¡l, BSEP, MRP2, MRP3, Ost-a, Ost-ß, y/o IBABP.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, en donde el biomarcador de metabolismo de ácidos biliares se incrementa en más de aproximadamente 1.1-veces, aproximadamente 1.5-veces, aproximadamente 2-veces, aproximadamente 2.5 -veces, aproximadamente 3 -veces, aproximadamente 4 -veces, aproximadamente 5 -veces, aproximadamente 10-veces, aproximadamente 15 -veces, y/o aproximadamente 20-veces.

26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en donde la referencia es un nivel promedio del uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares de individuo sano y/o población sana de individuos (por ejemplo, en donde el nivel se mide por un método similar y/o el mismo) .

27. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en donde la referencia es un nivel promedio del uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares de un segundo individuo que tiene la enfermedad o desorden y/o población de individuos que tiene la enfermedad o desorden (por ejemplo., en donde el nivel se mide por un método similar y/o igual) .

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, en donde la referencia es el nivel de uno o más biomarcadores de metabolismo de ácidos biliares antes de empezar el tratamiento y/o al tiempo de iniciar el tratamiento con el modulador FGF19.

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, en donde la muestra es una muestra de suero y/o una muestra fecal.

30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, en donde el modulador FGF19 es un antagonista FGF19.

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde el antagonista FGF19 inhibe y/o liga a FGF19, FGFR4 , y/o klotho (e.g. , KLB) .

32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 30-31, en donde el antagonista FGF19 es un anticuerpo, polipéptido de enlace, molécula pequeña, y/o polinucleótido .

33. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde el antagonista FGF19 es un anticuerpo anti-FGF19.

34. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-33, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-34, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 33-35, en donde el anticuerpo anti-FGF19 comprende: (i) una cadena ligera que comprende (a) una región hipervariable (HVR) -Ll que comprende una secuencia de aminoácidos KASQDINSFLA (SEQ ID NO:l) o KASQDINSFLS (SEQ ID NO: 7); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVD (SEQ ID NO: 2), RANRLVS (SEQ ID NO : 8 ) , O RANRLVE (SEQ ID NO: 9); y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos LQYDEFPLT (SEQ ID NO: 3); y (ii) una cadena pesada que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFSLTTYGVH (SEQ ID NO: 4); (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos es GVIWPGGGTDYNAAFIS (SEQ ID NO: 5); y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos es VRKEYANLYAMDY (SEQ ID NO: 6) .

37. El método de conformidad con la reivindicación 36, en donde HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVD (SEQ ID NO: 2) .

38. El método de conformidad con la reivindicación 36, en donde HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVS (SEQ ID NO: 8).

39. El método de conformidad con la reivindicación 36, en donde HVR-L2 comprende la secuencia de aminoácidos RANRLVE (SEQ ID NO: 9).

40. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36-39, en donde HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos KASQDINSFLA (SEQ ID NO:l).

41. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 36-39, en donde HVR-L1 comprende la secuencia de aminoácidos KASQDINSFLS (SEQ ID NO: 7).

42. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32-41, en donde el anticuerpo comprende (i) secuencia marco consenso de sub-grupo K humano 1, o (ii) secuencia marco consenso de sub-grupo III humano de cadena pesada .

43. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-42, en donde el modulador FGF19 (por ejemplo, antagonista FGF19, e.g., anticuerpo anti-FGF19) es una dosis mayor que o igual a 3 mg/kg (por ejemplo, mayor que o igual a aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, y/o aproximadamente 100 mg/kg y/o aproximadamente 10-100 mg/kg) .

44. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-43, en donde la enfermedad o desorden es una enfermedad o desorden proliferativo .

45. El método de conformidad con la reivindicación 44, en donde la enfermedad o desorden proliferativo es cáncer.