MX2014008299A - Identificacion de genero especifico de celulas espermaticas y embriones utilizando acidos nucleicos bloqueados. - Google Patents

Abstract

Se describen células espermáticas y embriones que comprenden un ácido nucleico bloqueado etiquetado unido a una secuencia de repetición de género específico. Los métodos para identificar y separar células espermáticas o embriones que contengan un ácido nucleico bloqueado etiquetado de células espermáticas o embriones que no contienen oligonucleótido etiquetado producen fracciones embrionales o celulares espermáticas enriquecidas de género. Las fracciones separadas son útiles en la producción de descendencias de un sexo predeterminado.

Description

IDENTIFICACIÓN DE GÉNERO ESPECÍFICO DE CÉLULAS ESPERMÁTICAS Y EMBRIONES UTILIZANDO ÁCIDOS NUCLEICOS BLOQUEADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La producción de descendencias de un sexo predeterminado, o en una relación de sexo predeterminado, es deseable en un número de industrias, incluyendo la ganadería. La separación de género específico de células espermáticas o embriones puede facilitar la producción de descendencias que tengan un sexo predeterminado. Células espermáticas separadas se pueden utilizar en inseminación artificial o fertilización in vi tro para producir cigotos que evolucionen en organismos de un sexo predeterminado. Sin embargo, técnicas para producir poblaciones de células espermáticas o embriones que están lo suficientemente enriquecidos de género están carentes .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En un aspecto, se proporciona un método para separar una población de células espermáticas o embriones poniendo en contacto la población con un ácido nucleico bloqueado etiquetado capaz de unir una secuencia de repetición en tándem de género específico que ocurre en una porción de la población. Las células espermáticas o embriones etiquetados son después separados de las células espermáticas sin etiquetar.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto, se proporciona una célula espermática o embrión que tienen una secuencia de repetición en tándem de género especifico y una porción oligonucleótida etiquetada, tal como un ácido nucleico bloqueado, unido a la secuencia de género especifico.

En un aspecto, se proporciona una población de células espermáticas o embriones que tienen una secuencia de repetición en tándem de género especifico que ocurre en el cromosoma X o Y. Una porción de la población de células espermáticas o embriones tienen una porción oligonucleótida etiquetada, la cual es un ácido nucleico bloqueado, unido a la secuencia de género especifico.

En un aspecto, el sexo de un embrión es identificado por medio del contacto de al menos una célula del embrión con un ácido nucleico bloqueado. El ácido nucleico bloqueado comprende una etiqueta y tiene la capacidad de unir una secuencia de repetición en tándem de género especifico presente en las células de ya sea el embrión masculino o femenino. Detectar la presencia o ausencia de la etiqueta en el embrión facilita identificar el sexo del embrión.

En un aspecto, un método para dirigir ADN de secuencia especifica con ácidos nucleicos bloqueados, tal como para el uso en modulación de sitio especifico de expresión de gen, o inducción de cambios de ADN genómico de sitio especifico (incluyendo mutación, recombinación o reparación) en células vivas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una representación esquemática que muestra la ubicación de secuencias de repetición en tándem de género especifico (GSTRS) y secuencias blanco en un cromosoma .

La figura 2 es una secuencia no expresada repetida del cromosoma Y bobino que muestra la ubicación de secuencias de repetición en tándem (GSTRS) .

La figura 3 es una ilustración que muestra la estructura de un ácido nucleico bloqueado funcionalizado con pireno y la funcionalidad de ácidos nucleicos bloqueados invasores con nucleótidos bicatenarios . Texp es la temperatura experimental y Tm es la temperatura de disociación.

La figura 4 es una fotografía que muestra el núcleo somático bovino masculino y LNA invasor.

La figura 5 es una fotografía que muestra LNA-Cy3 invasor en un embrión bovino masculino reparado.

La figura 6 es una fotografía que muestra un embrión Bovino vivo etiquetado con sonda INV-Cy3 y coetiquetado con Hoechst 33342 para mostrar la co-localización de INV-Cy3 en el núcleo etiquetado con Hoechst.

La figura 7 es una fotografía que muestra esperma porcino reparado hibridizado para una sonda iLNA específica para una secuencia de cromosoma Y.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona a la identificación del sexo de células espermáticas y embriones y la generación de fracciones de célula espermática o fracciones embrionarias que son enriquecidas para el cromosoma X o Y. En una modalidad, la invención proporciona métodos para separar células espermáticas que contengan una porción oligonucleótida etiquetada (un ácido nucleico bloqueado) unido a una secuencia de repetición en tándem de género específico o un complemento de una secuencia de repetición en tándem de género específico. Las fracciones oligonucleótidas convenientemente unidas en número suficiente a una región del cromosoma para generar una señal detectable que se pueda utilizar como una base para distinguir, y opcionalmente separa células que contengan la secuencia de repetición en tándem de género especifico de las que no. La invención proporciona además un método para la separación de células espermáticas o embriones que portan un cromosoma X de células espermáticas o embriones que portan un cromosoma Y. Las fracciones celulares espermáticas enriquecidas de género pueden ser utilizadas para fertilizar óvulos para producir descendencias de un sexo predeterminado. La invención además proporciona un método para selección de embriones que portan un cromosoma X o embriones que portan un cromosoma Y. Los embriones que han sido puestos en contacto con ácido nucleico bloqueado etiquetado son adecuadamente viables, de manera que la destrucción de una o más células del embrión se puede evitar .

En otro aspecto la invención se relaciona a la capacidad de dirigir ADN de secuencia especifica que se pueda utilizar para modulación de sitio especifico de expresión de gen, inducción de cambios de ADN genómicos específicos (incluyendo mutación, recombinación o reparación) en células vivientes mediante la unión y activación especifica de un ácido nucleico bloqueado.

Como se utiliza en la presente, una "secuencia de repetición en tándem de género especifico" o "GSTRS" es una secuencia de cromosoma no autosómica que es repetida en ya sea el cromosoma Y o el cromosoma X, pero no ambos. Múltiples GSTRS ocurren en una región del cromosoma X o Y, como se mostró esquemáticamente en la figura 1. La figura 2 muestra una secuencia no expresada repetida del cromosoma Y bovino que muestra la ubicación de secuencias de repetición en tándem (GSTRS) . Las GSTRS pueden ocurrir donde quiera en el cromosoma X o Y. En algunas modalidades, los destinos de GSTRS de la invención ocurren en o cerca del fin del cromosoma. La secuencia de repetición en tándem de género especifico puede comprender al menos aproximadamente 10 nucleótidos, al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos, al menos aproximadamente 500 nucleótidos, al menos aproximadamente 1,000 nucleótidos, al menos aproximadamente 2,000 nucleótidos, al menos aproximadamente 3,000 nucleótidos, o al menos aproximadamente 4,000 nucleótidos, y menos de aproximadamente 10,000 nucleótidos, menos de aproximadamente 9,000 nucleótidos, menos de aproximadamente 8,000 nucleótidos, menos de aproximadamente 7,000 nucleótidos, menos de aproximadamente 6,000 nucleótidos, o menos de aproximadamente 5,000 nucleótidos. Convenientemente hay menos de aproximadamente 50,000 nucleótidos, aproximadamente 10,000 nucleótidos, aproximadamente 5,000 nucleótidos, aproximadamente 3,000 nucleótidos, aproximadamente 2,000 nucleótidos, aproximadamente 1,000 nucleótidos, aproximadamente 500 nucleótidos, aproximadamente 300 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, aproximadamente 1 nucleótido, o cero nucleótidos entre cada unidad de GSTRS repetida. La GSTRS no tiene que ser repetida como exactamente la misma secuencia, y alguna variación en las secuencias repetidas es posible sin afectar el alcance de la invención. Las unidades de GSTRS repetidas pueden compartir al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 97%, al menos aproximadamente 98%, o al menos aproximadamente 99% de identidad una con otra. El porcentaje de identidad se puede determinar utilizando algoritmos usados en programas BLASTn o MEGABLAST, los cuales se pueden utilizar para obtener secuencias homologas a un polinucleótido de referencia, como se conoce en la técnica. Los algoritmos utilizados para alineación de secuencia están descritos por Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), FEMS Microbiol Lett . 174:247-250. La GSTRS se puede repetir al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, al menos aproximadamente 300 veces, al menos aproximadamente 400 veces, al menos aproximadamente 500 veces, al menos aproximadamente 750 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces en un cromosoma.

Para cada GSTRS, un ácido nucleico bloqueado puede ser seleccionado para unirse a la GSTRS o un complemento de la GSTRS. Como esquemáticamente describió la figura 1, el ácido nucleico bloqueado puede dirigir una secuencia blanco más corta dentro de la GSTRS. Como se utiliza en la presente, "secuencia blanco" es un segmento de ADN dentro de la GSTRS, en donde el ácido nucleico bloqueado une la secuencia blanco o el complemento de la secuencia blanco. La secuencia blanco puede incluir al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 12, al menos aproximadamente 14 nucleótidos, al menos aproximadamente 16 nucleótidos, o al menos aproximadamente 18 nucleótidos. La secuencia blanco puede incluir menos de aproximadamente 100, menos de aproximadamente 90, menos de aproximadamente 80, menos de aproximadamente 70, menos de aproximadamente 50, menos de aproximadamente 40, menos de aproximadamente 30, menos de aproximadamente 20, o menos de aproximadamente 16 nucleótidos. El ácido nucleico bloqueado puede unir aproximadamente al menos 4 nucleótidos, al menos aproximadamente 5 nucleótidos, al menos aproximadamente 6 nucleótidos, al menos aproximadamente 9 nucleótidos, al menos aproximadamente 12 nucleótidos, al menos aproximadamente 15 nucleotidos, al menos aproximadamente 20 nucleotidos, al menos aproximadamente 25 nucleotidos, al menos aproximadamente 30 nucleotidos, o al menos aproximadamente 35 nucleotidos de la GSTRS o el complemento de la GSTRS . El ácido nucleico bloqueado se puede unir a menos de aproximadamente 100 nucleotidos, menos de aproximadamente 50 nucleotidos, menos de aproximadamente 45 nucleotidos, menos de aproximadamente 40 nucleotidos, o menos de aproximadamente 20 nucleotidos de la GSTRS o el complemento de la GSTRS.

GSTRS adecuadas pueden se seleccionar buscando bases de datos públicas para secuencias de ADN que son altamente repetitivas en únicamente el cromosoma X o Y. Secuencias blanco convenientes dentro de la GSTRS se pueden seleccionar escaneando la GSTRS para purinas consecutivas o pirimidinas consecutivas, por ejemplo, secuencias de homopurina u homopirimidina . Las secuencias de homopurina u homopirimidina facilitan la unión de fracciones de oligonucleótido tal como ácidos nucleicos bloqueados al surco mayor de ADN dúplex para formar un triplex. La secuencia blanco dentro de la secuencia de repetición en tándem de género especifico puede incluir, pero no está limitado a, secuencias de homopurina u homopirimidina, como en ciertas modalidades, los ácidos nucleicos bloqueados tienen la capacidad de unir ADN de cualquier secuencia, incluyendo secuencias de ADN mezcladas que incluyen todas nucleótidos diferentes, y no sólo homopurinas u homopiridaminas .

En algunas modalidades la secuencia blanco es por si misma una unidad repetida dentro de la GSTRS. La GSTRS puede incluir al menos aproximadamente 1, al menos aproximadamente 2, al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100, o al menos aproximadamente 200 unidades repetidas de secuencia blanco. Una GSTRS que tiene un número más alto de unidades repetidas facilitarán la unión de más fracciones de oligonucleotidos a las GSTRS. Convenientemente, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 200, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 1,000, al menos aproximadamente 5,000, al menos aproximadamente 25,000, o al menos aproximadamente 50,000 fracciones de oligonucleotidos se unen a las GSTRS.

En algunas modalidades, más de una secuencia blanco se puede seleccionar dentro de la GSTRS, o un complemento de la GSTRS. Una GSTRS que tiene un número más alto de secuencias blanco facilitará la unión de más fracciones de oligonucleótidos a las GSTRS. En otras modalidades, más de un tipo de ácido nucleico bloqueado se puede seleccionar para unir la GSTRS o un complemento de la GSTRS.

La porción de oligonucleótido que une la secuencia blanco es un ácido nucleico bloqueado (LNA) , y son particularmente convenientes los ácidos nucleicos bloqueados invasores a (iLNA) . Los ácidos nucleicos bloqueados (LNA) son nucleótidos ARN modificados con un puente extra el cual "bloquea" la ribosa en la conformación 3' endo (North) . Los nucleótidos LNA se pueden mezclar con residuos de ADN o ARN. Las fracciones de oligonucleótidos son típicamente sintetizados químicamente. La conformación de ribosa bloqueada mejora el apilamiento base y pre-organización troncal. Esto significativamente aumenta las propiedades de hibridación (temperatura de fusión) de oligonucleótidos.

LNA invasores son ADN dúplex con "+1 arreglos intercatenarios zipper" de monómeros 2 ' amino-alfa-l-LNA funcionalizados por intercalador . Los LNA invasores facilitan el propósito de secuencia sin restricción de ADN bicatenario (ADNds) en condiciones relevantes fisiológicamente y tienen la capacidad de reconocer específicamente secuencia blanco corta mezclada de ADNds.

Tecnologías actuales de sonda, tales como TFO (triplex formando oligonucleótidos) y ??? (ácidos nucleicos de péptidos) , típicamente la secuencia blanco restringe y/o no requiere resistencia iónica fisiológica para el reconocimiento eficiente de ADNds . LNA invasores los cuales son sondas dúplex con puntos dinámicos que consisten de +1 monómeros N2-pirenofuncionalizados 2' amino-alfa-L-LNA intercatenarios zipper, habilitan selección eficiente de ADNds isosecuenciales . Los nucleótidos iLNA aumentan la fuerza, sensibilidad y- especificidad de técnicas basadas en oligonucleótidos y facilitan selección de secuencia especifica de secuencia mezclada de ADNds en condiciones fisiológicas .

LNA e iLNA pueden ser químicamente sintetizados. Métodos convenientes para sintetizar LNA e iLNA están descritos en la Publicación PCT No. WO2011/032034 , la cual está en la presente incorporada como referencia en su totalidad. La figura 3 ilustra la estructura y funcionamiento de un LNA invasor adecuado. Los ácidos nucleicos bloqueados pueden mostrar afinidad de unión aumentada en dirección a ADN bicatenario (por medio de apareamiento de bases Hoggsteen) , ADN monocatenario (por medio de apareamiento de bases Watson-Crick) , y destinos de ARN monocatenario (por medio de apareamiento de bases Watson-Crick) . Los ácidos nucleicos bloqueados mejoran la discriminación de destinos de ácido nucleico desiguales para reducir falsos positivos y efectos específicos no seleccionados en aplicaciones diagnósticas y biológicas. Los ácidos nucleicos bloqueados también pueden mejorar la estabilidad contra degradación por enzimas, tal como nucleasas.

Fórmula Un nucleótido C5 funcionalizado conveniente para utilizar en un ácido nucleico bloqueado para utilizar en los métodos y composiciones descritos en la presente se muestran en la fórmula X. Con respecto a la fórmula X, R1 se puede seleccionar de hidrógeno, hidroxilo, tiol, alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, fracciones cargadas, y complejos metálicos. R2 se puede seleccionar de hidrógeno, alifático, heteroalifático, arilo, heteroarilo, grupo funcional, grupos protectores, un compuesto que contiene heteroátomo, tal como un compuesto que contiene fósforo, un compuesto que contiene nitrógeno, un compuesto que contiene oxígeno, un compuesto que contiene sulfuro, y un compuesto que contiene selenio. R3 se puede seleccionar de hidrógeno, un compuesto que contiene heteroátomo, tal como un compuesto que contiene fósforo, un compuesto que contiene nitrógeno, un compuesto que contiene oxígeno, un compuesto que contiene sulfuro, y un compuesto que contiene selenio. R4 es un nucleobase seleccionado de nucleobases naturales o no naturales. La porción enlazante se puede seleccionar de alifática, arilo, heteroalifática, y heteroarilo. Y se puede seleccionar de oxígeno, sulfuro, o NR5 en donde R5 es seleccionado de hidrógeno, alifático, arilo, heteroalifático, y heteroarilo; y m+n = 2 a 4.

En ciertas modalidades, R1 se puede seleccionar de éter, carbonilo, nitrilo, disulfuro, tioéter, amina, ácido amino, aminoglucósidos , carbohidratos, fluoróforos, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos , péptidos, intercaladores, lipidosis, esteróles, porfirinas, proteínas, y vitaminas. En modalidades particulares, R1 se puede seleccionar de amida, éster, ácido carboxílico, aldehido, cetona, derivados de espermina, grupos de guanidina, etiquetas espinales, sondas electroquímicas, ácidos grasos, gliceroles, glicoles, glicol de polietileno, etiquetas FRET de redox activas, y derivados de ferroceno. Incluso muy típicamente, R1 se puede seleccionar de hidrogeno, hidróxilo, tiol, amina primaria, biotina, ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico, fluoresceina, rodamina, cianina, pireno, perileno, coroneno, adamantino, acridina, fenantrolina, difenilfosforilazida, fragmento Tat VIH, transportan, colesterol, litocólico-oleil, miristoil, docosanol, lauroil, estearoil, palmitoil, oleoil, y linoleoil, dihidrotestosterona, ácido litocólico, ácido fólico, y vitamina E.

En ciertas modalidades el monómero es de la Fórmula Y Fórmula Y El ácido nucleico bloqueado que se une a la GSTRS puede incluir una etiqueta que es detectable cuando se une a la secuencia de repetición en tándem de género especifico. Etiquetas convenientes incluyen, pero no están limitadas a, tintas, moléculas fluorescentes tales como CY3 o CY5, moléculas de densidad pesada tal como oro o hierro, moléculas magnéticas, nanoparticulas , picoparticulas , o cualquier combinación de las mismas. El ácido nucleico bloqueado etiquetado se une en números suficientes a las GSTRS para producir una señal detectable. La señal puede ser detectable por medio de cualquier método conveniente incluyendo, pero no limitado a, centrifugación, fluorescencia, luminiscencia, microscopía, fuerza magnética, densitometría, o combinaciones de las mismas. Los métodos de acoplamiento de etiquetas para oligonucleótidos son conocidos en la técnica y pueden ser adaptados para acoplarse a los ácidos nucleicos bloqueados descritos en la presente.

El ácido nucleico bloqueado que une a las GSTRS puede incluir una cadena reactiva que es activada cuando se une a la secuencia de repetición en tándem de género específico y que puede afectar, por ejemplo, la integridad de ADN, metabolismo celular, viabilidad, motilidad, fertilidad, o una combinación de los mismos. Grupos reactivos convenientes incluyen, pero no están limitados a, reticuladores de amina, toxinas, secuencias de ARN, secuencias de ADN, enzimas, nanopartículas , picopartículas , o cualquier combinación de los mismos. El ácido nucleico bloqueado activado se une en suficiente números a las GSTRS para producir una reacción en cadena. La reacción en cadena puede afectar la integridad celular del ADN, viabilidad celular, motilidad celular, metabolismo, fertilidad, y puede permitir segregación de la población celular seleccionada de la población celular no unida y a partir de ahí permite la separación, segregación, o discriminación de la población celular, afectando por tanto la relación de sexo después de la fertilización. Los métodos de acoplamiento de etiquetas a oligonucleótidos son conocidos en la técnica y pueden ser adaptados para acoplarse a los ácidos nucleicos bloqueados descritos en la presente.

En otras modalidades, los ácidos nucleicos bloqueados se pueden etiquetar con etiquetas que están activas para transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) o para activación de liberación condicional de grupos reactivos específicos (CRA) . Algunos ácidos nucleicos bloqueados pueden ser etiquetados con una FRET o donante de CRA, y otros pueden ser etiquetados con una FRET o aceptador de CRA. La agitación de la etiqueta del donante puede agitar la etiqueta del aceptador, y ocasionar que la etiqueta del aceptador presente fluorescencia o libere el grupo activado. FRET puede por tanto utilizarse para mejorar o diferenciar la señal de los ácidos nucleicos bloqueados etiquetados unidos a GSTRS íntimamente en el cromosoma y mejore la relación señal ruido. Por lo tanto la CRA se puede utilizar para afectar, inhibir, o modificar la integridad, metabolismo, motilidad, viabilidad, o fertilidad de la célula seleccionada/activada. Por ejemplo, dos ácidos nucleicos bloqueados pueden estar designados para unirse a una secuencia blanco de manera que los ácidos nucleicos bloqueados se sitúen cerca uno del otro después de unirse a la secuencia blanco, por ejemplo, un primer ácido nucleico bloqueado puede ser designado para unir pares de bases 1 a 12 y un segundo ácido nucleico bloqueado puede ser designado para unir pares de bases 13 a 24 de una secuencia blanco 24 de pares de bases en longitud. Cuando dos diferentes ácidos nucleicos bloqueados son etiquetados con moléculas de tinta convenientes, por ejemplo una proteina fluorescente ciano (CFP) como donante y proteina fluorescente amarilla (YFP) como aceptador, FRET se puede utilizar. Las células etiquetadas pueden ser agitadas con luz de una longitud de onda conveniente. Por ejemplo, si son agitadas con una longitud de onda de 440 nm, CFP emitirá luz en una onda de longitud de 480 nm la cual traslapa con la longitud de onda de agitación de YFP, y llevará a un pico de emisión de señal YPF en 535 nm cuando ambos ácidos nucleicos bloqueados estén juntos. Después de la activación el proceso puede también liberar grupos activos, tóxicos, ARN, ADN, enzimas, que afectan, pero no están limitados a, vida, metabolismo, motilidad y fertilidad de la célula seleccionada.

En otra modalidad, la etiqueta puede ser convenientemente una molécula, tal como ADN o ARN, o átomo unido al ácido nucleico bloqueado que mejora la activación o desactiva el proceso fisiológico de la célula, y puede ser tóxico y/o facilita la destrucción, incapacidad o inactivación de la célula cuando se une a una GSTRS . Por ejemplo, una toxina celular cuando es unida a la GSTRS, puede ocasionar que la célula muera, puede facilitar debilitación del funcionamiento de la célula, puede interrumpir fisiológicamente la célula, o puede afectar la integridad celular, de manera que la célula se vuelva inviable o incapacitada. Los mecanismos por medio de los cuales la etiqueta puede afectar la célula incluyen, sin limitación, un aumento en pH intra-celular , una acumulación de toxinas celulares, inducción de fototoxicidad selectiva, debilitación de función mitocondrial, motilidad celular alterada, estimulo de reacción acrosómica, muerte celular a través de una acción celular o la acción de ondas electromagnéticas en la etiqueta y combinaciones de los mismos. Se pueden generar por tanto fracciones celulares espermáticas enriquecidas sin necesidad de separar una población viable de células etiquetadas de una población viable de células sin etiquetar. La etiquetación se puede utilizar en conjunto con, o independientemente de, una o más etiquetas detectables unidas al mismo u otros ácidos nucleicos bloqueados.

Convenientemente, la molécula o átomo que facilita la destrucción o incapacidad de las funciones celulares efectivamente cuando esté cerca a otras etiquetas, cuyas etiquetas pueden ser las mismas o diferentes, y las cuales puedan cada una ser unidas para separar ácidos nucleicos bloqueados, como podría ocurrir después de que ocurre la unión de las GSTRS.

Las etiquetas también se pueden utilizar lo cual regula la capacidad, viabilidad, motilidad, fertilidad o combinación de las mismas de células espermáticas que contienen una GSTRS. Por consiguiente, el tiempo en el cual una célula espermática etiquetada que contiene la GSTRS tiene la capacidad de fertilizar un óvulo se puede controlar. Por ejemplo, una célula espermática puede ser incapacitada en su habilidad para fertilizar un ovocito, induciendo capacitación prematura, afectando la motilidad celular o patrón de motilidad, o induciendo apoptosis o muerte celular. La fertilización de un óvulo entonces se puede retrasar por una cantidad de tiempo apropiada, de manera que la porción etiquetada de células en la población es incapaz de fertilizar el óvulo.

Las etiquetas convenientes las cuales se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, metales nobles tales como plata, oro, platino, paladio, rodio e iridio, y aleaciones y moléculas de los mismos, así como compuestos magnéticos, etiquetas convenientes pueden incluir también ARNsi, iones, proteínas, péptidos, y etiquetas activadas después de la liberación para afectar integridad celular, viabilidad, motilidad o fertilidad. Convenientemente estas etiquetas pueden estar unidas como picopartículas o nanoparticulas. Las células etiquetadas con los metales o compuestos pueden subsecuentemente estar expuestos a radiación electromagnética, tal como sonó- o radio-ondas, las cuales pueden calentar y/o agitar la etiqueta resultando en la viabilidad de la célula que está siendo deteriorada o reducida. Otras etiquetas convenientes incluyen calcio o compuestos que contengan calcio, activadores de ion/calcio, activadores de pH/ion hidrógeno, compuestos orgánicos con grupos de alcohol, ácidos, y enzimas desnaturalizadas tal como tripsina.

Las etiquetas pueden estar unidas a oligonucleótidos que utilizan técnicas conocidas en esta técnica para acoplar en general moléculas a oligonucleótidos.

En una modalidad adicional, métodos para distinguir y separar células espermáticas o embriones que contengan un ácido nucleico bloqueado unido a una GSTRS. En algunas modalidades, las células espermáticas o embriones son mamíferos. Convenientemente, las células espermáticas o embriones son mamíferos, peces o aves, o de vertebrados. Las células espermáticas pueden ser de origen porcino, equino, bovino, ovino, caprino, felino, canino o humano. En otras modalidades, las células espermáticas o embriones son peces o aves. Como se utiliza en la presente, una "población" de células espermáticas o embriones significa al menos dos células espermáticas o al menos dos embriones. Sin embargo, la tecnología también se puede utilizar para identificar y específicamente etiquetar un embrión individual (tal como para determinación del sexo) o célula espermática (tal como para llevar a cabo ICSI) .

En un primer paso del método para identificar género o para generar fracciones embrionarias o células espermáticas enriquecidas de género, después del lavado con tampón y equilibración, las células son puestas en contacto con la porción oligonucleótida etiquetada. En algunas modalidades, la célula o células son permeablilizadas para facilitar la entrada del oligonucleótido a las células y acceso a la GSTRS. Las células pueden ser permeabilízadas por cualquier técnica conveniente, incluyendo pero no limitado a, presión osmótica, electroporación, liposomas, péptidos impregnados, una temperatura modificada (por ejemplo aumentada o disminuida) o combinaciones de los mismos. En otras modalidades, el ácido nucleico bloqueado etiquetado es pasiva o activamente transportado en la célula. El ácido nucleico bloqueado puede incluir además una porción de transporte, tal como un péptido de transporte, micro o nanoparticulas, lo cual facilita o interviene en la absorción activa del ácido nucleico bloqueado a la célula. Péptidos de transporte convenientes están comercialmente disponibles de AnaSpec (San José, CA, E.U.A.) e incluye Arg9, TAT, y Cys-TAT . Péptidos de transporte compatibles con el transportador de ergotioneina también se pueden utilizar.

Una vez que los ácidos nucleicos bloqueados son unidos a la secuencia de ADN repetida, las células espermáticas se pueden identificar y/o separar. Las agrupaciones de ácido nucleico bloqueado etiquetado en la región de la GSTRS produce una señal (física, óptica o química) que se puede detectar y habilitar las células que contienen la GSTRS para distinguirse de células que no contienen la GSTRS o no pero induce reacciones físicas, químicas u otras que habilitan las células que contiene la GSTRS unida a pero no exclusivo, ser específicamente afectado en su integridad, viabilidad, motilidad, metabolismo, fertilidad o cualquier combinación de los mismos. Una vez etiquetadas, las células se pueden detectar o separar, o ambas detectadas y separadas. Los métodos convenientes para separar células incluyen, pero no están limitados a, micromanipulación, centrifugación, fuerza magnética, citometria de flujo, densitometría, o agentes químicos que inducen cambios en el metabolismo, viabilidad, motilidad, integridad, fertilidad o cualquier combinación de los mismos. Adecuadamente, al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% de las células en la población separada de células comprenden un ácido nucleico bloqueado etiquetado unido a la GSTRS. La población de células puede estar separada en una porción etiquetada que contenga la GSTRS, y una porción sin etiquetar que no contenga la GSTRS.

En una modalidad, la porción etiquetada incluye células espermáticas que contienen un cromosoma X etiquetadas con el oligonucleótido, y la porción sin etiquetar incluye células espermáticas que contienen cromosoma Y no etiquetado con oligonucleótido. En otra modalidad, la porción etiquetada incluye células espermáticas que contienen un cromosoma Y etiquetado con el oligonucleótido, y la porción sin etiquetar incluye células espermáticas que contienen un cromosoma X no etiquetado con oligonucleótido. Convenientemente, una porción puede contener células espermáticas en las cuales al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de las células espermáticas comprenden un cromosoma X. Alternativamente, una porción puede contener células espermáticas en las cuales al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 65%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de las células espermáticas comprenden un cromosoma Y.

Las fracciones separadas convenientemente contienen células espermáticas viables. Como se utiliza en la presente, "viable" se refiere a una célula espermática que tiene la capacidad de fertilizar un óvulo para producir un embrión. Convenientemente, una porción espermática separada contiene esperma en donde al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% de las células espermáticas son viables.

Una porción celular enriquecida de género se puede utilizar para fertilizar un óvulo in vitro o in vivo. La fertilización de un óvulo se puede lograr, por ejemplo, vía inseminación artificial, incluyendo, pero no limitado a, inseminación intra-vaginal, intra-cervical , intra-uterina o quirúrgica, o mediante inyección de esperma intracitoplásmica (ICSI). Una porción etiquetada o porción sin etiquetar puede utilizarse para fertilización in vivo o in vitro. Se puede dejar que el óvulo fertilizado se desarrolle para producir un embrión de sexo predeterminado.

En una modalidad adicional, la invención proporciona métodos para determinar el sexo de embriones. Los ácidos nucleicos bloqueados etiquetados designados para unirse a una GSTRS como se describió anteriormente pueden ser incubados con embriones, ingresar los embriones, y unir la GSTRS. Como con las células espermáticas, los embriones pueden ser permeabilizados para facilitar la entrada del ácido nucleico bloqueado etiquetado a los embriones. Una o más células del embrión pueden también eliminarse o biopsiar y permeabilizar para facilitar la entrada del oligonucleótido etiquetado. El sexo de las células biopsiadas puede entonces ser correlacionado con el embrión del cual fueron eliminadas las células. La porción oligonucleótida etiquetada también se puede utilizar para marcar e identificar un embrión vivo sin afectar el desarrollo y fertilidad del embrión vivo. Una vez que el ácido nucleico bloqueado es unido a la GSTRS, los embriones pueden ser vistos bajo un microscopio de disección o microscopio de fluorescencia para distinguir embriones que contienen la GSTRS de esos que no contienen la GSTRS. Como con las células espermáticas como se describió anteriormente, la población de embriones puede estar separada en una porción etiquetada que contiene la GSTRS, y una porción sin etiquetar que no contiene la GSTRS.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ayudar en un mayor entendimiento de la invención. Los materiales particulares y condiciones empleados pretenden ser más ilustrativos de la invención y no están limitados sobre el alcance razonable de las reivindicaciones anexas.

EJEMPLOS Ejemplo 1: GSTRS porcina, secuencias destino y fracciones oligonucleótidas correspondientes .

Dos iLNA complementarios (dúplex) designadas "Secuencia A" y "Secuencia A inversa" cada una une la secuencia blanco y de blanco inversa mostrada en la SEC ID NO: 2 del ADN bicatenario. La SEC ID NO: 2 es una secuencia de 14-nucleótido en posiciones nucleótidas 3231 a 3244 de la GSTRS descrita en la SEC ID NO: 1. La SEC ID NO: 1 ocurre en el cromosoma Y porcino y tiene número de entrada de secuencia X12696 (McGraw y otros (1988) Nucleic Acids Research, volumen 16, página 10389) . La Secuencia A y Secuencia inversa A fueron cada una sintetizada con una molécula fluorescente CY3 unida al 5'-end por medio de una unión éster. Las secuencias A e inversa A fueron personalizadas Prof. P. Hrdlicka Biorganic chemistry de University of Idaho. iLNA fueron recibidos como un polvo liofilizado, y fueron precipitados en agua ultrapura y almacenados en alícuotas a -20°C y a -80°C.

Las secuencias de ADN repetida en tándem somático fueron identificadas en el cromosoma porcino 1 con número de entrada de secuencia X51555 (SEC ID NO: 3) . Es una secuencia ADN 313 pares de base que es repetido aproximadamente 3000 a 6000 veces. Dos iLNA designados "Secuencia B" y "Secuencia inversa B" fueron cada uno designados para unirse a la secuencia blanco mostrada en la SEC ID NO: 4. La SEC ID NO: 4 es una secuencia 14-nucleótida en posiciones nucleótidas 120 a 133 de la secuencia de ADN de repetición en tándem mostrada en la SEC ID NO: 3. Ambas la Secuencia B y Secuencia inversa B fueron cada una sintetizadas con una molécula fluorescente CY3 enlazada al 5'-end por una unión de éster. Esta secuencia de ADN somática (SEC ID NO: 3) fue utilizada como un control negativo para experimentos.

Los ejemplos de secuencias de ADN de GSTRS porcino, secuencias blanco, y fracciones oligonucleótidas correspondientes se muestran en la Tabla 1 a continuación.

TABLA 1 Ejemplo 2: GSTRS bovina, secuencias blanco, y fracciones oligonucleótidas correspondientes .

Un par de bases de GSTRS 1399 fue identificado en el cromosoma X bovino en locus V00125 (SEC ID NO: 5) con número de entrada de secuencia V00125. Dos iLNA complementario (dúplex) designados "Secuencia C" y "Secuencia inversa C" une cada una la secuencia blanco y de blanco inversa mostradas en la SEC ID NO: 5 de ADN bicatenario. La SEC ID NO: 5 es una secuencia 20-nucleótida en posiciones nucleótidas 561 a 581 de la GSTRS mostrada en la SEC ID NO: 5. La secuencia C y Secuencia inversa C fueron cada una sintetizadas con una molécula fluorescente CY3 unida al 5'end por medio de una unión de éster. Las secuencias C e inversa C fueron personalizados Prof.P. Hrdlicka Biorganic Chemistry de University of Idaho. iLNA fueron recibidos como polvo liofilizado, y fueron precipitados en agua ultrapura y almacenados en alícuotas a -20°C y a -80°C.

TABLA 2 Ejemplo 3: Método para etiquetar células somáticas y esperma porcino reparado con conjugado CY3-ÍLNA. Se agregaron semen porcino recién eyaculado o semen porcino descongelado (aproximadamente 100 millones de células espermáticas) a 10 mL de solución salina fosfatada (PBS) . La suspensión se centrifugó por 5 minutos a 800 x g. El gránulo se precipitó en 1 mL de NaOH 3 M. La suspensión fue incubada a temperatura ambiente por 5 minutos y centrifugada por 5 minutos a 800 x g. El gránulo se precipitó en PBS 2 mL y centrifugado por 5 minutos a 800 x g. El gránulo se precipitó en PBS o tampón fosfatado (PB) para obtener una concentración final de 10 millones de células espermáticas por mL de PBS.

Una suspensión de núcleo somático masculino fue preparada utilizando métodos estándar como sigue: a. se preparó una suspensión de núcleo somático bovino masculino utilizando métodos estándar de: tratamiento hipotónico de células utilizando KC1, centrifugando las células y precipitándolas en 3:1 metanol : ácido acético después almacenándolas (-20°C) en esta solución hasta que estén listas para su uso. b. 0.5 pL del núcleo fijo fueron colocados en un portaobjetos de plástico del microscopio; c. el núcleo se secó y después el portaobjetos se calentó a 60 °C por 2 min; d. el tampón de etiquetado se preparó como sigue: 1. Se agregaron 500 pL de 10 mM, Tris HCl+lmM EDTA (es decir tampón TE estándar, pH 7.2) a un tubo de microcentrifugado; 2. se agregaron 0.5 pL de secuencia LNA invasora A y secuencia inversa A (de una solución almacenada de 50uM conc en dH20) ; 3. La mezcla se agitó durante 2-3 seg para mezclar, la solución se mantuvo a temperatura ambiente hasta que sea necesario. e. se agregó 300 pL del tampón para etiquetar por encima del núcleo fijo; f. el portaobjetos se colocó en un medio de humidificación a 37°C por 3 hr. g. después de la incubación, el tampón de etiqueta se lavó con el tampón TE y a 37C por 5 min; h. Después del lavado, el portaobjetos se secó y después 3.0 µ?, de medio de montaje que contiene DAPI (es decir SlowFade con DAPI, Invitrogen) se agregaron a la cubierta de la muestra con un cubreobjetos; i. el portaobjetos se colocó en la etapa de microscopio utilizando un microscopio que tiene capacidades fluorescentes; j . Las muestras se observaron en 10X utilizando un filtro DAPI para ubicar el núcleo y después cambiando a 40X y utilizando el filtro Cy3 para agitar la tinta Cy3 conjugada al Invasor LNA.

Después del pre-tratamiento de las células espermáticas, dúplex LNA etiquetado CY3 como se preparó en el Ejemplo 1 (designada Secuencia A e inversa A) se incubó con las células espermáticas en una concentración final iLNA de 100 ng/mL por 2 horas a 38 °C. Las células espermáticas se centrifugaron por 5 minutos a 800 x g, el gránulo se precipitó en PBST (PBS con 0.05% Tween 20), y la suspensión se incubó por 20 minutos a 38 °C. Las células espermáticas se centrifugaron por 5 minutos a 800 x g, y el gránulo se precipitó en PBS o PB. Células espermáticas tratadas con iLNA dúplex (Secuencia A/inversa A) etiquetada CY3 (4µ?_) fueron vistas bajo un microscopio fluorescente Zeiss AxioSkop. La cadena DAPI fue opcionalmente añadida a la muestra justo antes de la observación con el microscopio. Se observó la unión selectiva del iLNA etiquetado CY3 al cromosoma Y de semen porcino arreglado. Las células espermáticas porcinas arregladas pre-tratadas con NaOH y RNasa A e incubadas con cromosoma Y especifico CY3-ÍLNA cromosoma Y manchado en rojo. Los cromosomas porcinos somáticos tratados con CY3-ÍLNA de cromosoma Y especifico se mancharon de rojo. Los cromosomas porcinos somáticos manchados con DAPI que une el ADN y ARN y fueron manchados de azul. Se generó una imagen fusionada de cromosomas porcinos somáticos manchados con DAPI y CY3-ÍLNA. Los cromosomas Y parecían estar teñidos de rosa, indicando la unión selectiva de sonda CY3-ÍLNA a los cromosomas Y.

Se encontró que las señales presentes en 161 de 302 espermas (53.3%) consisten de una etiqueta simple fluorescente redonda ubicada centralmente en la cabeza del esperma. Se observó la señal como un punto agradable en el núcleo de todas las células somáticas masculinas.

Como un control, semen porcino recién eyaculado se preparó y permeabilizó como se describió anteriormente. Un conjugado CY3-ÍLNA con secuencia de base (CCCTAA)3, disponible del Departamento de Química de University of Idaho que une a los telómeros de todos los cromosomas mamíferos se incubaron con células espermáticas precipitadas en PBS en una concentración iLNA final de 00 ng/µ?- por 2 horas a temperatura ambiente. Células espermáticas (4 µ?,) tratadas con CY3-ÍLNA (CCCTAA) 3 fueron vistas bajo microscopio de fluorescencia Zeiss AxioSkop. Se observó unión selectiva de CY3-ÍLNA (CCCTAA) 3 a todos los telómeros de cromosoma porcino del semen porcino arreglado. Los cromosomas manchados con 4 ' , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI ) que no une específicamente ADN y ARN aparecieron en azul. En contraste, CY3-iLNA (CCCTAA) 3 mancharon cromosomas en rosa. La figura 4 muestra núcleo somático bovino masculino etiquetado similarmente etiquetado con el invasor LNA.

Ejemplo 4: Método de etiquetado de células espermáticas bovinas vivas con conjugado CY3-ÍLNA.

Se agregaron semen de toro recién eyaculado o semen de toro descongelado (aproximadamente 100 millones de células espermáticas) a 10 mL de solución salina fosfatada (PBS) . La suspensión se centrifugó por 5 minutos a 800 x g. El gránulo se precipitó en PBS o solución fosfatada (PB) para obtener una concentración final de 10 millones de células espermáticas por mL de PBS.

Después del pre-tratamiento de las células espermáticas, dúplex LNA etiquetado CY3 (designada secuencia C e inversa C) como se prepararon en el Ejemplo 1 se incubó con las células espermáticas en una concentración final iLNA de 100 ng/mL por 2 horas a 38°C. Las células espermáticas se centrifugaron por 5 minutos en 800 x g, el gránulo se precipitó en PBST (PBS con 0.05% Tween 20), y la suspensión se incubó por 20 minutos a 38°C. Las células espermáticas tratadas con iLNA dúplex (Secuencia C/inversa C) etiquetada CY3 (4pL) fueron vistas bajo un microscopio fluorescente Zeiss AxioSkop. La mancha DAPI fue opcionalmente se agregó a la muestra justo antes de la observación con el microscopio. Se observó unión selectiva de CY3 iLNA etiquetado al cromosoma Y del semen de toro como puntos rojos en el núcleo. En células espermáticas de toro paralelamente destruidas pre-tratadas con NaOH y RNasa A e incubadas con el cromosoma específico Y CY3-ÍLNA también manchados en rojo. Los cromosomas porcinos somáticos tratados con el cromosoma específico Y CY3-ÍLNA también fueron manchados con rojo. Los cromosomas porcinos somáticos manchados con DAPI que une ADN y ARN y fueron manchados en azul.

La figura 5 muestra al invasor LNA-Cy3 en un embrión bovino masculino arreglado.

Ejemplo 5: Determinación de sexo de embriones bovinos vivos Embriones bovinos en etapa de blastocitos recientemente cultivados (dia 7 idealmente) se lavaron con solución salina fosfatada (PBS) y se transfirieron a un pozo de 40 ]iL de un microplaca (ibidi) que se precargó con IX PBS pH 7.2 Se agregaron 0.5 ? (100 ng) de secuencia iLNA C e inversa C (de una concentración existente de 50 µ? en dH20) . La microplaca que contiene el embrión se colocó en una incubadora a 37 °C que fue humidificada y se incubó por 2.5 hr. Después de la incubación los embriones fueron transferidos a otro pozo de 40 L conteniendo IX PBS sin iLNA. Los embriones se lavaron por 5 min a temperatura ambiente, y después la microplaca se colocó en una etapa de microscopio utilizando un microscopio que está provisto con capacidad fluorescente (microscopio fluoresente Zeiss AxioSkop) . Los embriones son observados a 10X para ubicar, después vistos a 20X o 40X utilizando fluorescencia.

La sonda dúplex C iLNA e inversa C selecciona el único cromosoma Y de secuencia específica SEC ID NO: 5. Se detectaron los cromosomas Y como una mancha roja fluorescente brillosa dentro del núcleo blastómero . La ausencia de señal indicó ADN embrionario femenino. La exactitud del procedimiento del sexo se demostró por medio de la determinación del género paralelo del mismo embrión utilizando un método PCR establecido designado para el locus del gen especifico masculino SRY bovino. En base a 18 embriones bovinos producidos in vitro generando un resultado para ambos ensayos, hubo una coincidencia del 100% (18/18) de la asignación de género.

La figura 6 muestra embrión bovino etiquetado con sonda INV-Cy3 y co-etiquetada con Hoechst 33342 para mostrar la co-localización de INV-Cy3 en núcleo etiquetado con Hoechst .

Ejemplo 6: Fertilización in vitro de óvulos porcinos con semen porcino enriquecido con cromosoma X o Y Se utilizaron fracciones de células espermáticas porcinas viables etiquetadas con CY3-ÍLNA o sin etiquetar para fertilizar óvulos porcinos. Aproximadamente 1.5 a 2 horas antes de preparar el semen, una placa o plato que contenga 5 a 10 mL de medios TALP y una placa o plato que contenga de 5 a 10 mL de medios FERT (TALP+cafeína ) se prepararon y colocaron en una incubadora 38.5°C por al menos 1.5 horas para equilibrar. Adicionalmente, aproximadamente 30 mL de solución salina de semen (0.9% de salina + BSA) se colocó en una cubierta para calentar a temperatura ambiente.

Las cámaras de cálculo de visión de esperma se calentaron.

Para preparar el semen, 2 a 3 mL de la porción celular espermática enriquecida con cromosoma X o Y fue aumentada a 10 mL con solución salina de semen (0.9% salina+BSA) . La suspensión se centrifugó a 800 x g por 3 minutos. La solución salina de semen fue disminuida a gránulo de esperma, el volumen aumento a 10 mL con solución salina de semen fresco, el gránulo precipitado en solución salina fresca, y la suspensión centrifugada. El proceso de lavado puede repetirse por un total de tres veces. El gránulo de esperma final se precipitó en 3 mL de TALP, mezclado suavemente, y una pequeña muestra se eliminó para motilidad subsecuente del esperma y determinación de concentración.

Para preparar porción espermática enriquecida con cromosoma X o Y congelado-descongelado, se colocó una gota de semen congelado (0.5 ce) en un baño de agua a 50°C durante 10 segundos. El esperma congelado fue después revestida sobre un gradiente de densidad y centrifugada a 350 x g durante 10 minutos. El gránulo se lavó una vez en 2 mL de CellGuard (Minitube, Verona, WI, E.U.A.) y centrifugado en 200 x g durante 10 minutos. El gránulo se diluyó y mezcló suavemente en 1 mL de medio TALP, y una pequeña muestra fue eliminada para determinación de motilidad espermática. La motilidad espermática y concentración fue determinada utilizando Sperm Vision (Minitube of America, Verona, WI, E.U.A.).

Para fertilizar los ovocitos, 10 L de esperma en medios FERT (en una concentración de 2.5 x IO5 esperma/mL) fue añadida a un pozo de 500 L que contenga 50 ovocitos. La fertilización in vitro para ovocitos porcinos también está descrita en Rath et al., (J. Anim. Sci. 77:3346-3352 y Long, y otros (1999) Theriogenology 51:1375-1390), cada uno de los cuales está en la presente incorporado como referencia en su totalidad.

Ejemplo 7: Generación de un conjugado de iLNA etiquetado CY3 y el uso para identificar esperma masculino y femenino Imitaciones de ADN sintético conjugado a una tinta fluorescente se utilizaron para detección in situ de cromosomas Y en preparaciones de metafase de células y espermatozoide somáticos bovinos. Utilizando células somáticas bovinas masculinas y el cromosoma Y como un patrón, se diseñó y sintetizó a medida una síntesis de un iLNA conjugado CY3.

Una "Secuencia C e inversa C" iLNA designada se diseñó para unir a la secuencia blanco mostrada en la SEC ID NO: 6. La SEC ID NO: 6 es una secuencia 20-nucleótida en posiciones nucleótidas 561 a 581 de la GSTRS mostrada en la SEC ID NO: 5. La SEC ID NO: 5 es una secuencia de cromosoma Y bovino hasta ser repetida 60,000 vlces (Perret, J. et al., 1990. A polymorphic satellite sequence maps to the pericentric región of the bovine Y chromosome; Genomics Vol 6(3)pp 482-490). La sonda iLNA designada "Secuencia C e inversa C" fue sintetizada a medida con una molécula fluorescente CY3 ligada al 5' -end por medio de un enlace tipo éster: CY3-CAC TAT TAT CGC CAT C El esperma de todo sexuado generado de la citometria de flujo fue evaluado con sonda iLNA (Secuencia C) para exactitud de puntuación. Probando diferentes condiciones de etiquetado, se encontró que la breve incubación de cromosomas de metafase con iLNA produjo una señal localizada en el cromosoma Y. La población de esperma clasificado por Y mostró etiquetado con la sonda PNA en 104 señales en las cabezas de espermas fuera de 118 contados. La población clasificada por X mostró etiquetado con la sonda especifica iLNA en 8 señales en cabezas de esperma fuera de 119 contadas. En otras pruebas, no estuvieron presentes señales cuando los cromosomas de células somáticas femeninas bovinas fueron incubadas con la sonda iLNA.

Las señales iLNA presentes en aproximadamente 50% de esperma fueron encontradas que consisten de una mancha simple redonda fluorescente, centralmente ubicada, en la cabeza del esperma. Esperma de toro sin clasificar proporcionaron 23 señales fuera de 43 cabezas de esperma (53.4%). La sonda iLNA también se encontró que produce señal en lineas celulares somáticas bovinas masculinas y en embriones con una relación similar.

La figura 7 muestra esperma porcino hibridado a sonda iLNA especifica para una secuencia de cromosoma Y. El cromosoma Y reside en la mitad de la cabeza del esperma.

Ejemplo 8: La separación de células espermáticas viables etiquetadas de manera fluorescente mediante citometria de flujo El semen será precipitado en un diluyente para semen (AndroHep CellGuard para esperma porcino, comercialmente disponible de initube of America, Verona, I, E.U.A.) para dar aproximadamente 1 x 107 células por mL. 1 ng de conjugado de CY3-ÍLNA del Ejemplo 1 (Secuencia A) se agregará a 0.6 mL de suspensión celular espermática. La suspensión se incubará a 30C por 2 horas. La absorción de iLNA en el esperma se verificará por medio de microscopía fluorescente .

Las células espermáticas etiquetadas se separará de las células espermáticas sin etiquetar se separará de las células espermáticas sin etiquetar bajo flujo con las siguientes condiciones: las células espermáticas porcinas se separarán utilizando un FACSVantage SE con citómetro de flujo opcional DiVa (BD Biosciences, San José, CA, E.U.A.) con 100 mW de 488 nm de luz de un láser de ión Coherent INNOVO 90C Argón. Se utilizará una punta de boquilla de 100 pm a una presión de cubierta de 0.08 MPa (12 psi) . El fluido de cubierta utilizado será solución salina fosfatada estéril de Dulbecco (DPBS, sin Ca2+ o Mg2+, Sigma-Aldrich, St . Louis, MO, E.U.A. ). Los detectores utilizados incluirán FSC-A para dispersión avanzada, SSC-A para dispersión lateral, FL1-A con un filtro pasabanda 530/30 nm para detectar cualquier material auto-fluorescente, FSC- para discriminación doble, y detector FL2-A CY3 con un filtro pasabanda 585/42 nm para detectar PNA con etiqueta fluorescente CY3. Un histograma de citoirtetría de flujo que ilustra la separación de células espermáticas porcinas etiquetadas y sin etiquetar demostrará la unión selectiva de CY3-PNA (Secuencia A) al cromosoma Y y la separación de esperma con cromosoma X del esperma con cromosoma Y. Al menos 85% de las células en la porción etiquetada se espera que contengan el cromosoma Y. Al menos 85% de las células de la porción sin etiquetar se espera que contengan el cromosoma X. Esto será validado utilizando PCR de células espermáticas individuales probadas para la presencia del gen SRY.

Ejemplo 9: Sondas adicionales para unir secuencias blanco bovinas y porcinas Las tablas 3-6 muestran sondas adecuadas para unir cualquiera de las secuencias blanco bovinas o porcinas mostradas en la figura 2 (bovina) o SEC ID NO: 1, lo cual ocurre en el cromosoma Y porcino y tiene número de acceso de secuencia X12696 (McGraw et al., (1988) Nucleic Acids Research, volumen 16, página 10389. Los nucleótidos subrayados muestran la posición de los nucleótidos funcionalizados . Cy3 indica que la sonda ha sido etiquetada con Cy3. Los números 9 y 4 y N en las secuencias mostradas en la Tabla 6 indican elementos que desestabilizan la sonda. Las tablas 3, 4 y 5 también proporcionan la Tm (temperatura en la cual el 50% de las sondas disocian de su destino o temperatura de disociación de unión) de las diferentes sondas para las secuencias blanco así como la TA (Afinidad diferencial) de la sonda contra el destino dúplex ADN. Una TA positiva indica afinidad más alta de la sonda para ADN monocatenario . Mientras más alta sea la temperatura diferencial, más fuerte es la unión al ADN monocatenario.

Tabla 3 Sondas bovinas Tabla 4 : Sondas Bovinas adicionales 5 15 Tabla 5 : Sondas porcinas Tabla 6 Secuencias Bovinas Adicionales Secuencia 5'-Cv3 AGC CCT GTG 9 CCCTG 3'- TCG GGA CAC ? GGG AC Cy3 5 -Cy3 AGC CCT GTG 4 CCC TG 3'- TCG GGA CAC 4 GGG AC Cv3 5'-Cv AGC CCT GTG CCC TG 3'- TCG GGA CAC N GGG AC Cv3 5'-Cv3 AGC CCT GTG 9 CCC TG 3' TCG GGA CAC GGG AC Cv3 5'-Cv¾ AGC CCT GTG CCC TG 3'- TCG GGA CAC 9 GGG AC Cy3 5'-Cv3 AGC CCT GTG 4 CCC TG 3'- TCG GGA CAC GGG AC Cv3 5'-Cv3 AGC CCT GTG CCC TG 3'- TCG GGA CAC 4 GGG AC Cv3 5' Cy3 AGC CCT GTG CCC TG 3'- TCG GGA CAC GGG AC Cv3 5'-Cv3AGC CCT GTG CCCTG 3'- TCG GGA CAC N GGG AC Cy3 Modalidades adicionales funcionales de sondas que se puedan utilizar para la determinación de género en animales, muy comúnmente, en bovinos, se muestra en la Tabla 7, en donde Cy3 es un fluoróforo Cy3; subrayados A/C/G/T están los monómeros; y B subrayado es un monómero abultado (no emparejado) .

Tabla 7 Región de Destino de Sonda en series Bovinas Las siguientes tablas 8-10 describen las propiedades de desnaturalización térmica de sondas que se puedan utilizar para la determinación de género de células individuales o reuniones multicelulares de ciertos animales y humanos; más comúnmente células somáticas) células espermáticas o embriones de ciertos animales y humanos; incluso más comúnmente, células somáticas, células espermáticas o embriones de bovino.

Como antes, las sondas despliegan estabilidades térmicas que oscilan de significativamente más baja a moderadamente más alta que ADN bicatenarios correspondientes de blancos sin modificar (note delta Tm valores de -13 C a +9; columna 4), mientras dúplex de sonda blanco (columna 2 y 3) son significativamente más termoestables (oscilan de +5 a +24 C) . Por consiguiente, todas las sondas (las cuales tienen entre dos a cinco +1 arreglos monoméricos zipper) despliegan valores TA significativamente positivos sugiriendo potencial significante para selección de ácido nucleico bicatenario blanco, más comúnmente ADNds .

Tabla 8: Propiedades de desnaturalización térmica de sondas ejemplares en donde T=120Y; A=120'W; C=140'X y G=140'Y Todavía otro ejemplo funcional de una modalidad particular se proporciona en la Tabla 9 a continuación, la cual muestra propiedades de desnaturalización térmica y valores TA para sondas modificadas con la fórmula z de monómero sin bloquear. fórmula z; R=CH2PY Se observan patrones similares como fueron vistos para otros monómeros descritos, es decir, las sondas despliegan termoestablidad relativamente baja mientras que las sondas dúplex blanco son significativamente más termoestables . Las sondas que contienen uno o más +1 arreglo zipper de la fórmula z de monómero sin bloquear por tanto despliegan valores TA significativamente positivos y por tanto el potencial significante para seleccionar ácido nucleico bicatenario blanco, más comúnmente ADNds blanco.

Tabla 9 Propiedades de desnaturalización térmica y valores TA para sondas modificadas con la fórmula z de monómero sin bloquear Modalidades particulares detallan las sondas bicatenarias con ciertos arreglos zipper de monómeros que comprenden las asi llamadas pseudo nucleobasas complementarias (por ejemplo, tal como 2-tiouracilo, 2 , 6- diamonopurinas, inosina y pirrólo- [2 , 3-d] -pirimidina-2- ( 3H) -uno) , más comúnmente, +1 arreglos zipper de monómeros que comprenden nucleobases pseudo complementarias, incluso más comúnmente, +1 arreglos zipper de monómeros tales como fórmula Y. Ejemplos de ejemplos funcionales de estas modalidades particulares se dan en la Tabla 8 más adelante.

Modalidades adicionales particulares detallan sondas bicatenarias con ciertos arreglos zipper (más comúnmente +1 zippers) de monómeros que comprenden nucleobases en donde, además, el nucleótido opuesto del monómero descrito que comprende una nucleobase pseudo complementaria es un nucleótido o monómero descrito que comprende una nucleobase pseudo complementaria (por ejemplo, dicho un 2-tiouracil , 2 , 6-diamonopurinas , inosina y pirrolo- [2 , 3-d] pirimidina-2- (3H) -uno) . Para ejemplos funcionales representativos, por favor vea las entradas 2 y 4 en la Tabla 29 más adelante, en donde D es un monómero de ADN con una nucleobase 2 , ß-diaminopurina (es decir, 2 , 6-diaminopurina-2' -deoxiribosida ) . Con referencia a la Tabla 8 a continuación, se observó que las sondas bicatenarias con -1 o +1 arreglos zipper de la fórmula monomérica Y despliegan valores TA positivos, y por tanto potencial significante para seleccionar ácido nucleico bicatenario blanco por medio del método descrito en las figuras 1-2, más comúnmente, ADNds .

Con mayo referencia a la Tabla 8 a continuación, se observó que las sondas bicatenarias con -1 o +1 arreglos zipper de la fórmula monomérica Y, en donde, además, el nucleótido opuesto de la fórmula monomérica Y es D despliega valores TA positivos, y por tanto potencial significante para seleccionar ácido nucleico bicatenario bicatenario blanco por medio del método descrito en las figuras 1-2, más comúnmente, ADNds .

Tabla 10 Sondas bicatenarias con -1 o +1 arreglos zipper de la fórmula monomérica Se debe entender que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles de estructura y el arreglo de componentes establecidos en la descripción anterior o ilustrados en los dibujos. La invención tiene la capacidad de otras modalidades y de ser practicada o de ser llevada a cabo en varias maneras. También, se debe entender que la fraseología y terminología en la presente utilizadas es para el propósito de descripción y no debe considerarse como limitante. El uso de "que incluyen", "que comprenden", o "que tienen" y variaciones de los mismos en la presente pretenden abarcar los conceptos enlistados después de esto y equivalentes de los mismos así como artículos adicionales. El uso de los términos "un" y "uno" y "el" y referentes similares en el contexto de describir la invención deben considerarse que cubren ambos, el singular y el plural, a menos que se indique de otra manera en la presente o claramente se contradiga por el contexto.

La recitación de variaciones de valores en la presente están simplemente destinados para servir como un método de escritura corta de referir individualmente a cada valor separado que cae dentro del rango, a menos que se indique de otra manera en la presente, y cada valor separado está incorporado en la especificación como si estuviera individualmente recitado en la misma. Todos los métodos descritos en la presente se pueden llevar a cabo en cualquier orden conveniente a menos que se indique de otra manera en la presente o de otra forma se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera de todos los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente, está destinado únicamente para iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se reclame de otra manera. El lenguaje en la especificación no debe considerarse como indicante de cualquier elemento no reclamado como esencial para la práctica de la invención.

Las modalidades preferidas de esta invención están en la presente descritas, incluyendo el mejor modo conocido para los inventores de llevar a cabo la invención. Variaciones de esas modalidades preferidas pueden volverse aparentes para esos expertos en la técnica después de la lectura de la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos empleen dichas variaciones como sea apropiado, y los inventores pretenden que la invención sea practicada de otra manera diferente a la descrita específicamente en la presente. Por consiguiente, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia recitada en las reivindicaciones anexas a esta conforme esté permitido por la ley aplicable. Más aún, cualquier combinación de los elementos arriba descritos en todas las variaciones posibles de la misma está abarcada por la invención a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente de otra forma por contexto .

Claims (27)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Un método para separar una población de células espermáticas o embriones que comprende: a) poner en contacto la población con un ácido nucleico bloqueado etiquetado capaz de unir una secuencia de repetición en tándem de género especifico en una porción de la población para proporcionar una porción etiquetada y una porción sin etiquetar; y b) separar la porción etiquetada de la porción sin etiquetar.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico bloqueado comprende un ácido nucleico bloqueado invasor.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque una pluralidad de ácidos nucleicos bloqueados se unen a la secuencia de repetición en tándem de género especifico en el paso (a) .

4. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el ácido nucleico bloqueado es etiquetado con una etiqueta fluorescente, una etiqueta de densidad pesada, una etiqueta magnética, una nanoparticula, una toxina, un ADN, un ARNsi, una enzima, un ion especifico, y combinaciones de los mismos.

5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la población comprende células espermáticas y al menos 70% de las células de la porción etiquetada comprende un cromosoma Y y al menos 70% de las células de la porción sin etiquetar comprende un cromosoma X.

6. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la población comprende células espermáticas y al menos 70% de células de la porción etiquetada comprende un cromosoma X y al menos 70% de las células de la porción sin etiquetar comprende un cromosoma Y.

7. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la población comprende células espermáticas, y en donde al menos 50% de las células de la porción etiquetada o la porción sin etiquetar son viables después del paso (b) .

8. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque la población comprende células espermáticas y en donde separar las células en el paso (b) comprende separación física por medio de citometría de flujo, centrifugación, fuerza magnética, o separación química utilizando procesos que afecten el metabolismo, viabilidad, motilidad, integridad o fertilidad.

9. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque comprende además permeabilizar las células espermáticas o embriones antes o durante el paso (a) .

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque las células espermáticas o embriones son permeabilizados utilizando electroporación, liposomas, presión osmótica, o péptidos impregnados.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende además el uso de micro, nano u otras partículas para facilitar la penetración del ácido nucleico bloqueado en las células espermáticas o embriones antes a o durante el paso (a) .

12. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el ácido nucleico bloqueado penetra las células espermáticas o embriones permeabilizados por electroporación, liposomas, nano o micro partículas, presión osmótica, o péptidos impregnados.

13. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque la secuencia de repetición en tándem de género específico comprende una secuencia telomérica.

1 . El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque la secuencia de repetición en tándem de género especifico es de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 10,000 nucleótidos.

15. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque el oligonucleótido etiquetado es de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 nucleótidos.

16. El método de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque la población comprende células espermáticas mamiferas o embriones mamíferos seleccionados de bovino, porcino, canino, y equino.

17. Una célula espermática o embrión que comprende secuencia de repetición en tándem de género específico y un ácido nucleico bloqueado unido a la secuencia de repetición en tándem de género específico.

18. La célula espermática o embrión de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el ácido nucleico bloqueado es un ácido nucleico bloqueado invasor.

19. La célula espermática o embrión de conformidad con la reivindicación 17 ó 18, caracterizada porque el ácido nucleico bloqueado es etiquetado con una etiqueta fluorescente, una etiqueta de densidad pesada, una etiqueta magnética, una nanopartícula, o combinaciones de los mismos.

20. Una población de células espermáticas, cada célula en la población que comprende un cromosoma X que comprende una secuencia de repetición en tándem de género especifico o un cromosoma Y que comprende una secuencia de repetición en tándem de género especifico, en donde al menos 30% de las células comprenden un ácido nucleico bloqueado unido a la secuencia de género especifico.

21. Las células de conformidad con la reivindicación 20, caracterizadas porque al menos 70% de las células comprenden el ácido nucleico bloqueado unido a la secuencia de género especifico.

22. Las células de conformidad con la reivindicación 20, caracterizadas porque al menos 90% de las células comprenden el ácido nucleico bloqueado unido a la secuencia de género especifico.

23. Un método para identificar el sexo de un embrión, el método que comprende: (a) poner en contacto al menos una célula del embrión con un ácido nucleico bloqueado, el ácido nucleico bloqueado que comprende una etiqueta y capacidad de unirse una secuencia de repetición en tándem de género especifico, y (b) detectar la presencia o ausencia de la etiqueta en el embrión.

24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque al menos una célula del embrión es viable .

25. El método de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, caracterizado porque cada célula del embrión es puesta en contacto con el ácido nucleico bloqueado.

26. El método de conformidad con la reivindicación 23, 24 o 25, caracterizado porque el embrión comprende el ácido nucleico bloqueado unido a la secuencia de repetición en tándem de género especifico y en donde el embrión es viable .

27. El método de conformidad con la reivindicación 23, 24 , 25 ó 26, caracterizado porque la etiqueta comprende CY3 y en donde la etiqueta es detectada utilizando técnicas fluorométricas .