MX2014008157A - Anticuerpos anti-lrp5 y metodos de uso. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona anticuerpo anti-LRP5 y métodos para su preparación y uso.

Description

ANTICUERPOS ANTI-LRP5 Y MÉTODOS DE USO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de conformidad con 35 USC 119(e) de la Solicitud Provisoria Estadounidense No. 61/588100 presentada el 18 de enero 2012, cuyo contenido se incorpora a la presente a modo de referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos anti-LRP5 y métodos para su utilización.

ANTECEDENTES Se ha establecido ahora que la angiogénesis es un contribuyente importante a la patogénesis de una variedad de trastornos. Estos incluyen tumores sólidos y metástasis, enfermedades neovasculares intraoculares tales como retinopatías, por ej., retinopatía diabética, oclusión venosa de retina (RVO, por sus siglas en inglés), degeneración macular relacionada con la edad de tipo húmeda (AMD, por sus siglas en inglés), glaucoma neovascular, rechazo inmune de tejido córneo transplantado y otros tejidos, y artritis reumatoide. Duda et al. J. Clin. Oncology 25(26): 4033^2 (2007); Kesisis et al. Curr. Pharm. Des. 13: 2795-809 (2007); Zhang & Ma Prog. Ret. & Eye Res. 26: 1-37 (2007).

La retina recibe su suministro de sangre de los vasos sanguíneos de la retina, los cuales abastecen la parte interna de la retina, y los vasos sanguíneos coroidales, los cuales abastecen la parte externa. Se produce daño a los vasos sanguíneos de la retina en diversos procesos de enfermedad incluyendo retinopatía diabética, retinopatía del prematuro, y oclusiones venosas de retina centrales y ramificadas (retinopatías isquémicas). La isquemia de retina de este daño da como resultado la neovascularización indeseable. La neovascularización coroidal se produce en una cantidad de otros procesos de enfermedad, incluyendo AMD. En contraste, la vascularización incompleta de la retina es una característica distintiva en pacientes con ciertas enfermedades genéticas, por ej. vitreoretinopatía exudativa familiar (FEVR, por sus siglas en inglés), enfermedad de Coats, y enfermedad de Norrie causada por la mutación del receptor Wnt Frizzled4 (Fzd4), el co-receptor LRP5 o el ligando secretado Norrin (Berger et al. Nature Genet. 1 :199-203 (1992); Chen et al. Nature Genet. 1 :204-208 (1992); Robitaille et al. Nature Genet. 32:326-30 (2002); Toomes et al. Am. J. Hum. Genet. 74:721-30 (2004)). Una proteína adicional, TSPAN12, ha demostrado estar involucrada en el señalamiento de Norrin (Junge et al. Cell 139:299-3 1 (2009) y WO 2010/030813). Se ha informado además que las mutaciones en el gen Tspan12 son la causa de FEVR (Poulter et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 14;53(6):2873-9 (2012); Yang et al. Molecular Vision 17:1128-1135 (2011); Poulter et al. The American Journal of Human Genetics 86, 248-253 (2010)). Los modelos para estas enfermedades genéticas están disponibles en ratones con eliminación de genes homólogos correspondientes.

A pesar de los muchos avances en el campo de la angiogénesis ocular, existe aun la necesidad de identificar objetivos y desarrollar medios que puedan complementar o aumentar la eficacia de las terapias existentes.

SÍNTESIS La invención provee anticuerpos anti-LRP5 y métodos para su preparación y uso, particularmente en el tratamiento de afecciones y enfermedades asociadas con la angiogénesis.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado que se une a la proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP5, por sus siglas en inglés), donde el anticuerpo potencia la actividad de Norrin y/o el señalamiento de Norrin/Fzd4. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo que se une a LRP5.

En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos YYRYAPYRSLGMDV (SEC ID NO: 23) o WIPQSYPFX^YKSGFDY, donde Xi es A o R (SEC ID NO: 24), (b) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYYXiYPFT, donde es L o S (SEC ID NO: 25), y (c) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos GXilSXaXaG^STYYADSVKG, donde Xi es A o G, X2 es A o S, X3 es P o S, X4 es S o W (SEC ID NO: 26), o SRISSNGGSTYYADSVKG (SEC ID NO: 27). En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFSSYAMXL donde X, es H o S (SEC ID NO: 28), (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos GX1ISX2X3GX4STYYADSVKG, donde X1 es A o G, X2 es A o S, X3 es P o S, X4 es S o W (SEC ID NO: 26), o SRISSNGGSTYYADSVKG (SEC ID NO: 27) y (c) HVR- H3 que comprende la secuencia de aminoácidos YYRYAPYRSLGMDV (SEC ID NO: 23) o WIPQSYPF^SYKSGFDY, donde X, es A o R (SEC ID NO: 24). En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende además (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQGISSYLA (SEC ID NO: 29) o RASQX^X^YLA, donde es A, G, S o V, X2 es I o M, X3 es F, G, S o Y, y X4 es G, S o Y (SEC ID NO: 30); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEC ID NO: 31) o DASX^ES, donde Xi es S o T y X2 es L o R (SEC ID NO: 32); y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYYXiYPFT, donde Xi es L o S (SEC ID NO: 33). En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQGISSYLA (SEC ID NO: 29) o RASQX1X2X3X4YLA, donde ?t es A, G, S o V, X2 es I o M, X3 es G, F, Y o S, y X4 es G, Y o S (SEC ID NO: 30); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEC ID NO: 31) o DASX^ES, donde X, es S o T y X2 es L o R (SEC ID NO: 32); y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYYX1YPFT, donde X1 es L o S (SEC ID NO: 33). En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una o más secuencias estructurales de dominios variables de cadena pesada seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID NO: 34-37. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende (a) una secuencia VH que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno de SEC ID NOs: 1 a 1 1 ; (b) una secuencia VL que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno de SEC ID NOs: 12 a 22; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b). En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VH de uno de SEC ID NOs: 1 a 11. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VL de uno de SEC ID NOs: 12 a 22. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende una secuencia VH de uno de SEC ID NOs: 1 a 11 y una secuencia VL de uno de SEC ID NOs: 12 a 22. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende las secuencias VH y VL de un anticuerpo mostrado en las Figuras 4A -5B. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo lgG1 de longitud completa.

En otro aspecto, la invención provee ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo de la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona una célula huésped que comprende un ácido nucleico de la invención. En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar una célula huésped de la invención de modo que se produzca el anticuerpo. En algunas realizaciones, el método comprende además recuperar el anticuerpo de la célula huésped.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención y un agente citotóxico. En algunas realizaciones, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la formulación farmacéutica comprende además un agente terapéutico adicional, por ej. un antagonista de VEGF (incluyendo, por ej., un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de anticuerpo, por ej. ranibizumab, un receptor de VEGF soluble, por ej. aflibercept, o un aptámero, por ej. pegaptanib), un agonista TSPAN12, plasmina, plasminógeno, activador de plasminógeno de tejido, un inhibidor de TNF-a, y/o un esteroide, por ej. triamcinolona o dexametasona.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para utilizar como un medicamento. En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para usar en el tratamiento de una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopatía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva. En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para utilizar para potenciar la actividad de Norrin y/o el señalamiento de Norrin/Fzd4. En algunas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo de la invención para utilizar en la manufactura de un medicamento. En algunas realizaciones, el medicamento es para el tratamiento de una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva. En algunas realizaciones, el medicamento es para potenciar la actividad de Norrin y/o el señalamiento de Norrin/Fzd4.

En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para tratar a un individuo que tiene una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención. En algunas realizaciones, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de un agente terapéutico adicional, por ej. un antagonista de VEGF (incluyendo, por ej., un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de anticuerpo, por ej. ranibizumab, un receptor de VEGF soluble, por ej. aflibercept, o un aptámero, por ej. pegaptanib), una proteína NORRIN recombinante, un agonista de TSPAN12, plasmina, plasminógeno, activador de plasminógeno tisular, un inhibidor de TNF-a, y/o un esteroide, por ej. triamcinolona o dexametasona. En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para potenciar la actividad de Norrin y/o el señalamiento de Norrin/Fzd4 en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención para potenciar la actividad de Norrin y/o el señalamiento de Norrin/Fzd4. En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para rescatar un defecto de señalamiento en un individuo causado por la mutación en Norrin y/o Fzd4 que comprende administrar el anticuerpo de la reivindicación 1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y 1 B muestran que los anticuerpos anti-LRP5 potencian el señalamiento mediado por Norrin/Fzd4 y rescatan la mutación de Fzd4M-i57v. En estas Figuras se utiliza el prefijo "P6C", mientras que en otros sitios en la memoria descriptiva se utiliza "YW629" en forma indistinta.

Las Figuras 2A y 2B muestran que los anticuerpos anti-LRP5 potencian la actividad de Norrin y rescatan la pérdida de Tspan12 en células microvascu lares endoteliales de retina humanas (HREMVC, por sus siglas en inglés). En estas Figuras se utiliza el prefijo "P6C", mientras que en otros sitios de la memoria descriptiva se utiliza "YW629" en forma indistinta.

Las Figuras 3A y 3B muestran que un anticuerpo anti-LRP5 rescata parcialmente defectos vasculares en ratones ("knockout") con eliminación de Tspan12. En estas Figuras se utiliza el prefijo "P6C", mientras que en otros lugares de la memoria descriptiva se utiliza "YW629" en forma indistinta.

Las Figuras 4A y 4B muestra las secuencias de regiones variables de cadena pesada para diversos anticuerpos anti-LRP5 con CDR-H1 , CDR-H2, y CDR-H3 en casilleros. Los correspondientes números de ID de SEC: para estas secuencias son los siguientes: YW629.42 (SEC ID NO: 1), YW629.42.57 (SEC ID NO: 2), YW629.42.58 (SEC ID NO: 3), YW629.42.65 (SEC ID NO: 4), YW629.51 (SEC ID NO: 5), YW629.51.13 (SEC ID NO: 6), YW629.51.61 (SEC ID NO: 7), YW629.51.63 (SEC ID NO: 8), YW629.51.77 (SEC ID NO: 9), YW629.51.78 (SEC ID NO: 10), y YW629.51.80 (SEC ID NO: 11).

Las Figuras 5A y 5B muestra las secuencias de regiones variables de cadena liviana para diversos anticuerpos anti-LRP5 con CDR-L1, CDR-L2, y CDR-L3 en casilleros. Los correspondientes números de ID de SEC: para estas secuencias son los siguientes: YW629.42 (SEC ID NO: 12), YW629.42.57 (SEC ID NO: 13), YW629.42.58 (SEC ID NO: 14), YW629.42.65 (SEC ID NO: 15), YW629.51 (SEC ID NO: 16), YW629.51.13 (SEC ID NO: 17), YW629.51.61 (SEC ID NO: 18), YW629.51.63 (SEC ID NO: 19), YW629.51.77 (SEC ID NO: 20), YW629.51.78 (SEC ID NO: 21 ), y YW629.51.80 (SEC ID NO: 22).

Las Figuras 6A y 6B muestran que un anticuerpo anti-LRP5 rescata parcialmente los defectos vasculares asociados con la anulación ("knockout") de Tspan12.

Las Figuras 7A-7C muestran que un anticuerpo anti-LRP5 promueve el recrecimiento vascular y reduce la angiogénesis patológica en el modelo de retinopatía inducida por oxígeno de enfermedad vascular de la retina.

Las Figuras 8A-8C muestran que un anticuerpo anti-LRP5 potencia Norrin y el señalamiento de Wnt7b, pero antagonizando al mismo tiempo el señalamiento de Wnt3a.

Las Figuras 9A y 9B muestran que un anticuerpo anti-LRP5 rescata el defecto de señalamiento de mutaciones en componente ligando o receptor que reducen el agrupamiento de receptores.

Las Figuras 10A y 10B muestran que se requiere bivalencia de anticuerpo para el potenciamiento mediado por el anticuerpo anti-LRP5 del señalamiento de Norrin, pero no la inhibición del señalamiento de Wnt3a.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Una "estructura humana aceptora" para los propósitos de esta invención es una estructura que comprende la secuencia de aminoácidos de una estructura de dominio variable (VL) de cadena liviana o una estructura de dominio variable (VH) de cadena pesada derivada de una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura de consenso humana, según lo descrito más adelante. Una estructura humana aceptora "derivada de" una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura consenso humana puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de la misma, o puede contener cambios en la secuencia de aminoácidos. En algunas realizaciones, la cantidad de cambios de aminoácidos son 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos. En algunas realizaciones, la estructura humana aceptora VL es idéntica en secuencia a la secuencia estructural de inmunoglobulina humana VL o secuencia estructural consenso humana.

"Afinidad" se refiere a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (por ej., un anticuerpo) y su socio de unión (por ej., un antígeno). A menos que se indique lo contrario, en el presente contexto, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca la cual refleja una interacción 1:1 entre miembros de un par de unión (por ej., anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X para su socio Y puede ser generalmente representada por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo aquellos descritos en esta invención. Las realizaciones ilustrativas y ejemplares específicas para medir la afinidad de unión son descritas en lo que sigue.

Un anticuerpo "madurado por afinidad" se refiere a un anticuerpo con una o más alteraciones en una o más regiones hipervariables (HVRs, por sus siglas en inglés), en comparación con un anticuerpo parental el cual no posee dichas alteraciones, resultando dichas alteraciones en una mejora en la afinidad del anticuerpo para el antígeno.

Los términos "anticuerpo anti-LRP5" y "un anticuerpo que se une a LRP5" se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse a LRP5 con suficiente afinidad de modo que el anticuerpo es útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico en el direccionamiento a LRP5. En una realización, el grado de unión de un anticuerpo anti-LRP5 a una proteína no LRP5, no relacionada, es inferior a aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo a LRP5 según lo medido, por ej., por un radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés). En ciertas realizaciones, un anticuerpo que se une a LRP5 tiene una constante de disociación (Kd) de < 1 µ?, < 100 nM, < 10 n , < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o < 0,001 nM (por ej. ??^ ? o menos, por ej. de ??^ ? a 10~13 M, por ej., de 10"9 M a 10"13 M). En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-LRP5 se une a un epítopo de LRP5 que es conservado entre LRP5 de diferentes especies.

El término "anticuerpo" en esta invención se utiliza en el sentido más amplio y abarca diversas estructuras de anticuerpo, incluyendo aunque sin limitarse a anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ej., anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpos siempre y cuando exhiban la actividad de unión al antígeno deseada.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula que no es un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al cual se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, aunque sin limitarse a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpos de cadena única (por ej. scFv); y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos.

Un "anticuerpo que se une al mismo epítopo" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competición en 50% o más, y a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competición en 50% o más. En la presente se proporciona un ensayo de competición ejemplar.

El término anticuerpo "quimérico" se refiere a un anticuerpo en el cual una porción de la cadena pesada y/o liviana deriva de una fuente o especie en particular, mientras que el resto de la cadena pesada y/o liviana deriva de una fuente o especie diferente.

La "clase" de un anticuerpo se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseída por su cadena pesada. Existen cinco clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de estas pueden ser adicionalmente divididas en subclases (isotipos), por ej., IgGi, lgG2, lgG3> lgG4, IgAi, e lgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de ¡nmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ, respectivamente.

El término "agente citotóxico" en el presente contexto se refiere a una sustancia que inhibe o evita una función celular y/o causa la muerte o destrucción celular. Los agentes citotóxicos incluyen, aunque no se limitan a, isótopos rad ..iactivos ( ,por ej ·., A .t.211 , . I131 , . I125 , Y90 , D Re 186 , 0 R?e 88 , S e.m-J53 , D ??;2 2 , O P32 , P Dkb212 e « isótopos radiactivos de Lu); agentes o fármacos quimioterapéuticos (por ej., metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina u otros agentes intercalantes); agentes inhibidores del crecimiento; enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo sus fragmentos y/o variantes; y los diversos agentes antitumorales o anticancerígenos descritos más adelante.

"Funciones efectoras" se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe de un anticuerpo, las cuales varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: unión a C1q y citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés); unión al receptor Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés); fagocitosis; regulación descendiente de receptores de superficie celular (por ej. receptor de células B); y activación de células B.

Una "cantidad eficaz" de un agente, por ej., una formulación farmacéutica, se refiere a una cantidad eficaz, en dosis y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado.

El término "región Fe" en esta invención se utiliza para definir una región de terminal C de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene por lo menos una porción de la región constante. El término incluye regiones Fe de secuencia nativa y regiones Fe variantes. En una realización, una región Fe de cadena pesada de IgG humana se extiende desde Cys226, o desde Pro230, hasta el término carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina de terminal C (Lys447) de la región Fe puede o no estar presente. A menos que se especifique lo contrario en la presente, la numeración de residuos de aminoácidos en la región Fe o región constante es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también denominado el índice EU, según lo descrito en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

"Estructura" o "FR" se refiere a residuos de dominio variable que no son los residuos de región hipervariable (HVR, por sus siglas en inglés). La FR de un dominio variable consiste en general en cuatro dominios de FR: FR1 , FR2, FR3, y FR4. Por consiguiente, las secuencias de HVR y FR en general aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" y "anticuerpo entero" se utilizan en la presente en forma intercambiable para hacer referencia a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a una estructura de anticuerpo nativa o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe según lo definido en esta invención.

Los términos "célula huésped", "línea de células huéspedes" y "cultivo de células huéspedes" se utilizan indistintamente y se refieren a células en las cuales se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la progenie de dichas células. Las células huéspedes incluyen "transformantes" y "células transformadas" las cuales incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de la misma sin importar la cantidad de pasajes. La progenie puede no ser completamente idéntica en el contenido de ácido nucleico a una célula parental, pero puede contener mutaciones. La progenie muíante que tiene la misma función o actividad biológica a la rastreada o seleccionada en la célula originalmente transformada se incluye en la presente invención.

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano o una célula humana o derivado de una fuente no humana que utiliza repertorios de anticuerpos humanos u otras secuencias que codifican anticuerpos humanos. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humanos.

Una "estructura consenso humana" es una estructura la cual representa los residuos de aminoácidos de presentación más común en una selección de secuencias estructurales VL o VH de inmunoglobulina humana. En general, la selección de secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Publicación NIH 91-3242, Bethesda MD (1991), tomos 1-3. En una realización, para el VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En una realización, para el VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende residuos de aminoácidos de HVRs no humanas y residuos de aminoácidos de FRs humanas. En ciertas realizaciones, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de las HVRs (por ej., CDRs) corresponden a aquellas de un anticuerpo no humano, y la totalidad o sustancialmente la totalidad de las FRs corresponden a aquellas de un anticuerpo humano. Un anticuerpo humanizado opcionalmente puede comprender por lo menos una porción de una región constante de anticuerpo derivada de un anticuerpo humano. Una "forma humanizada" de un anticuerpo, por ej., un anticuerpo no humano, se refiere a un anticuerpo que ha sufrido humanización.

El término "región hipervariable" o "HVR," en el presente contexto, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable de anticuerpo que es hipervariable en secuencia y/o forma lazos estructuralmente definidos ("lazos hipervariables"). En general, los anticuerpos de cuatro cadenas nativos comprenden seis HVRs; tres en la VH (H1 , H2, H3), y tres en la VL (L1 , L2, L3). HVRs generalmente comprenden residuos de aminoácidos de los lazos hipervariables y/o de las "regiones determinantes de complementariedad" (CDRs), siendo estas últimas de variabilidad de secuencia más alta y/o estando involucradas en el reconocimiento del antígeno. Los ejemplos de lazos hipervariables se producen en los residuos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), y 96-101 (H3). (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987).) Los ejemplos de CDRs (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1 , CDR-H2, y CDR-H3) se producen en los residuos de aminoácidos 24-34 de L1 , 50-56 de L2, 89-97 de L3, 31-35B de H1 , 50-65 de H2, y 95-102 de H3. (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).) Con la excepción de CDR1 en VH, CDRs en general comprenden los residuos de aminoácidos que forman los lazos hipervariables. Las CDRs también comprenden "residuos determinantes de especificidad" o "SDRs," que son residuos que contactan antígeno. SDRs están contenidas dentro de regiones de las CDRs denominadas CDRs abreviadas, o a-CDRs. Los ejemplos de a-CDRs (a-CDR-L1 , a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1 , a-CDR-H2, y a-CDR-H3) se producen en los residuos de aminoácidos 31-34 de L1 , 50-55 de L2, 89-96 de L3, 31-35B de H1 , 50-58 de H2, y 95-102 de H3. (Ver Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008).) A menos que se indique lo contrario, los residuos de HVR y otros residuos en el dominio variable (por ej., residuos FR) están numerados en la presente de acuerdo con Kabat et al., supra.

Un "inmunoconjugado" es un anticuerpo conjugado a una o más molécula(s) heteróloga(s), incluyendo aunque sin limitarse a un agente citotóxico.

Un "individuo" o "sujeto" es un mamífero. Los mamíferos incluyen, aunque sin limitarse a, animales domesticados (por ej., vacas, ovejas, gatos, perros y caballos), primates (por ej., humanos y primates no humanos tales como monos), conejos y roedores (por ej., ratones y ratas). En ciertas realizaciones, el individuo o sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que ha sido separado de un componente de su medioambiente natural. En algunas realizaciones, un anticuerpo es purificado hasta más del 95% o 99% de pureza según lo determinado por, por ejemplo, electroforesis (por ej., SDS-PAGE, enfoque isoeléctrico (IEF), electroforesis capilar) o cromatografía (por ej., HPLC de intercambio iónico o de fase inversa). Para una revisión de los métodos de evaluación de la pureza del anticuerpo, véase, por ej., Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

Un ácido nucleico "aislado" se refiere a una molécula de ácido nucleico que ha sido separada de un componente de su medioambiente natural. Un ácido nucleico aislado incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que contienen comúnmente la molécula de ácido nucleico, aunque la molécula de ácido nucleico está presente extracromosómicamente o en una ubicación cromosómica que es diferente de su ubicación cromosómica natural.

"Acido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-LRP5" se refiere a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican cadenas pesada y liviana de anticuerpo (o sus fragmentos), incluyendo dicha o dichas moléculas de ácido nucleico en un vector único o vectores separados, y dicha o dichas moléculas de ácido nucleico presentes en una o más ubicaciones en una célula huésped.

El término "anticuerpo monoclonal" en el presente contexto se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles anticuerpos variantes, por ej., que contienen mutaciones naturales o que surgen durante la producción de una preparación de anticuerpos monoclonales, dichas variantes generalmente están presentes en cantidades menores. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales, las cuales incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante en un antígeno. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como siendo obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como requiriendo la producción del anticuerpo por cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que serán utilizados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante una variedad de técnicas, incluyendo aunque sin limitarse al método del hibridoma, métodos de ADN recombinante, métodos de exhibición de fagos, y métodos que utilizan animales transgénicos que contienen la totalidad o parte de los sitios de inmunoglobulina humana, dichos métodos y otros métodos ejemplares para preparar anticuerpos monoclonales son descritos en esta invención.

Un "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no está conjugado a un resto heterólogo (por ej., un resto citotóxico) o radioetiqueta. El anticuerpo desnudo puede estar presente en una formulación farmacéutica.

"Anticuerpos nativos" se refieren a moléculas de inmunoglobulina naturales con estructuras variables. Por ejemplo, los anticuerpos nativos de IgG son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestos por dos cadenas livianas idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que están enlazadas a disulfuro. Del término N al C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también denominada un dominio pesado variable o un dominio variable de cadena pesada, seguido por tres dominios constantes (CH1 , CH2, y CH3). Similarmente, del término N al C, cada cadena liviana tiene una región variable (VL), también denominada un dominio liviano variable o un dominio variable de cadena liviana, seguido por un dominio liviano constante (CL). La cadena liviana de un anticuerpo puede ser asignada a uno de dos tipos, denominados kappa (?) y lambda (?), en base a la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

El término "inserto de envase" se utiliza para hacer referencia a instrucciones habitualmente incluidas en envases comerciales de productos terapéuticos, que contienen información sobre las indicaciones, uso, dosificación, administración, terapia combinada, contraindicaciones y/o advertencias con respecto al uso de dichos productos terapéuticos.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencias de aminoácidos" con respecto a una secuencia polipeptídica de referencia se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia polipeptídica de referencia, luego de alinear las secuencias e introducir espacios vacíos, en caso necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencias, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencias. La alineación para los propósitos de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos puede lograrse de diversas maneras que se encuentra dentro del conocimiento en la técnica, por ejemplo, usando programas informáticos de computación disponibles para el público tales como BLAST, BLAST-2, ALIGN o el programa informático Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para alinear secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr la alineación máxima con respecto a la longitud completa de las secuencias que se están comparando. Para los propósitos de la presente invención, sin embargo, % de valores de identidad de secuencias de aminoácidos se generan usando el programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2. El programa de computación para comparación de secuencias ALIGN-2 fue creado por Genentech, Inc., y el código de fuente ha sido presentado con la documentación del usuario en la Oficina Estadounidense de Derechos de Autor, Washington D.C., 20559, donde está registrado bajo el N° de Registro de Derecho de Autor de Estados Unidos TXU510087. El programa ALIGN-2 está disponible para el público de Genentech, Inc., Sur de San Francisco, California, o puede ser compilado del código de fuente. El programa ALIGN-2 debería ser compilado para uso en un sistema operativo UNIX, incluyendo UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones en las cuales se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, el % de identidad de secuencias de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos A determinada con, o contra una secuencia de aminoácidos B determinada (lo cual puede denominarse, alternativamente, como una secuencia A de aminoácidos determinada que tiene o comprende un cierto % de identidad de secuencias de aminoácidos con, o contra una secuencia B de aminoácidos determinada) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y donde X es la cantidad de residuos de aminoácidos con resultado de coincidencias idénticas en el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en esa alineación de programas de A y B, y donde Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que donde la longitud de secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencias de aminoácidos de A a B no será igual al % de identidad de secuencias de aminoácidos de B a A. A menos que se indique específicamente lo contrario, todos los valores porcentuales de identidad de secuencias de aminoácidos utilizados en esta invención son obtenidos según lo descrito en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa informático ALIGN-2.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación la cual está en una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en la misma sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales los cuales son inaceptablemente tóxicos para un sujeto al cual se le administraría la formulación.

Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, que no es un ingrediente activo, que es no tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, aunque sin limitarse a, un buffer, excipiente, estabilizante o conservante.

El término "proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad" o "LRP5," en el presente contexto, se refiere a cualquier LRP5 nativa de cualquier fuente de vertebrado, incluyendo mamíferos tales como primates (por ej. humanos) y roedores (por ej., ratones y ratas), a menos que se indique lo contrario. El término abarca LRP5 sin procesar, de "longitud completa" así como también cualquier forma de LRP5 que es el resultado del procesamiento en la célula. El término también abarca variantes naturales de LRP5, por ej., variantes de corte y empalme o variantes alélicas. La secuencia de aminoácidos de una LRP5 humana ejemplar es la siguiente: MEAAPPGPPWPLLLLLLLLLALCGCPAPAAASPLLLFANRRDVRLVDAGGV LEST IVVSGLEDAAAVDFQFSKGAVYWTDVSEEAIKQTYLNQTGAAVQNVVISGLVSPD GLACDWVGKKLYWTDSETNRIEVANLNGTSRKVLFWQDLDQPRAIALDPAHGYM YWTDWGETPRIERAGMDGSTRKIIVDSDIYWPNGLTIDLEEQKLYWADAKLSFIHR ANLDGSFRQKVVEGSLTHPFALTLSGDTLYWTDWQTRSIHACNKRTGGKRKEILS ALYSPMDIQVLSQERQPFFHTRCEEDNGGCSHLCLLSPSEPFYTCACPTGVQLQDN GRTCKAGAEEVLLLARRTDLRRISLDTPDFTDIVLQVDDIRHAIAIDYDPLEGYVYW TDDEVRAIRRAYLDGSGAQTLVNTEINDPDGIAVDWVARNLYWTDTGTDRIEVTR LNGTSRKILVSEDLDEPRAIALHPVMGLMYWTDWGENPKIECANLDGQERRVLVN ASLGWPNGLALDLQEG LYWGDAKTDKIEVINVDGTKRRTLLEDKLPHIFGFTLL GDFIYWTDWQRRSIERVHKVKASRDVIIDQLPDLMGLKAVNVAKVVGTNPCADR NGGCSHLCFFTPHATTRCGCPIGLELLSD KTCIVPEAFLVFTSRAAIHRISLETN ND VAIPLTGVKEASALDFDVSNNHIYWTDVSLKTISRAFMNGSSVEHVVEFGLDYPEG MAVDWMGKNLYWADTGTNRIEVARLDGQFRQVLVWRDLDNPRSLALDPTKGYI YWTEWGGKPRIVRAFMDGTNCMTLVDKVGRANDLTIDYADQRLYWTDLDTNMI ESSNMLGQERVVIADDLPHPFGLTQYSDYIYWTDWNLHSIERADKTSGRNRTLIQG HLDFVMDILVFHSSRQDGLNDC HNNGQCGQLCLAIPGGHRCGCASHYTLDPSSR NCSPPTTFLLFSQKSAISRMIPDDQHSPDLILPLHGLRNVKAIDYDPLDKFIYWVDGR QNIKRAKDDGTQPFVLTSLSQGQNPDRQPHDLSIDIYSRTLFWTCEATNTINVHRLS GEAMGVVLRGDRDKPRAIVVNAERGYLYFTNMQDRAAKIERAALDGTEREVLFT TGLIRPVALVVDNTLGKLFWVDADLKRIESCDLSGANRLTLEDANIVQPLGLTILG KHLYWIDRQQQMIERVEKTTGDKRTRIQGRVAHLTGIHAVEEVSLEEFSAHPCARD NGGCSHICIAKGDGTPRCSCPVHLVLLQNLLTCGEPPTCSPDQFACATGEIDCIPGA WRCDGFPECDDQSDEEGCPVCSAAQFPCARGQCVDLRLRCDGEADCQDRSDEAD CDAICLPNQFRCASGQCVLIKQQCDSFPDCIDGSDELMCEITKPPSDDSPAHSSAIGP VIGIILSLFVMGGVYFVCQRVVCQRYAGANGPFPHEYVSGTPHVPLNFIAPGGSQH GPFTGIACGKSMMSSVSLMGGRGGVPLYDRNHVTGASSSSSSSTKATLYPPILNPPP SPATDPSLYNMDMFYSSNIPATARPYRPYIIRGMAPPTTPCSTDVCDSDYSASRWK ASKYYLDLNSDSDPYPPPPTPHSQYLSAEDSCPPSPATERSYFHLFPPPPSPCTDSS (SEC ID NO: 42).

En el presente contexto, "tratamiento" (y sus variaciones gramaticales tales como "tratar" o "que trata") se refiere a la intervención clínica en un intento de alterar el curso natural del individuo que se está tratando, y puede realizarse ya sea para profilaxis o durante el transcurso de la patología clínica. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, aunque sin limitarse a, prevención de la aparición o recurrencia de enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, prevención de metástasis, reducción de la velocidad de progreso de la enfermedad, mejora o paliación del estado de la enfermedad, y remisión o prognosis mejorada. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se utilizan para retardar el desarrollo de una enfermedad o ralentizar el progreso de una enfermedad.

El término "región variable" o "dominio variable" se refiere al dominio de una cadena pesada o liviana de anticuerpo que está involucrado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena liviana (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo generalmente tienen estructuras similares, comprendiendo cada dominio cuatro regiones estructurales conservadas (FRs) y tres regiones hipervariables (HVRs). (Véase, por ej., Kindt et al. Kuby Immunology, 6ta ed., W.H. Freeman y Co., página 91 (2007).) Un dominio único de VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno. Por añadidura, los anticuerpos que se unen a un antígeno en particular pueden ser aislados usando un dominio VH o VL de un anticuerpo que se une al antígeno para seleccionar una genoteca de dominios VL o VH complementarios, respectivamente. Ver, por ej., Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991 ).

El término "vector," en el presente contexto, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al cual está ligada. El término incluye el vector como una estructura de ácidos nucleicos de autorreplicación así como también el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la cual se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los cuales están ligados operativamente. Dichos vectores son denominados en la presente invención "vectores de expresión".

COMPOSICIONES Y MÉTODOS En un aspecto, la invención se basa, en parte, en el descubrimiento de anticuerpos que potencian el señalamiento de Norrin y/o Norrin/Frizzled4. En ciertas realizaciones, se proporcionan anticuerpos que se unen a LRP5. Los anticuerpos de la invención son útiles, por ej., para el diagnóstico o tratamiento de retinopatías que incluyen retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, y retinopatía hipertensiva.

Anticuerpos Anti-LRP5 Ejemplificativos En un aspecto, la invención proporciona anticuerpos aislados que se unen a LRP5. En ciertas realizaciones, un anticuerpo anti-LRP5 potencia la actividad de Norrin y/o el señalamiento de Norrin/Fzd4.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo anti-PRO que comprende por lo menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs seleccionadas entre (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 28; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO:26 o 27; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 23 o 24; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 29 o 30; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 31 o 32; y (f) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 33.

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende por lo menos una, por lo menos dos, o la totalidad de tres secuencias VH HVR seleccionadas entre (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 28; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 26 o 27; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 23 o 24. En una realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 23 o 24. En otra realización, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 23 o 24 y HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 33. En una realización adicional, el anticuerpo comprende HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 23 o 24, HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 33, y HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 26 o 27. En una realización adicional, el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 28; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 26 o 27; y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 23 o 24.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende por lo menos una, por lo menos dos, o la totalidad de tres secuencias VL HVR seleccionadas entre (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 29 o 30; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 31 o 32; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 33. En una realización, el anticuerpo comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 29 o 30; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 31 o 32; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 33.

En otro aspecto, un anticuerpo de la invención comprende (a) un dominio VH que comprende por lo menos una, por lo menos dos, o las tres secuencias VH HVR seleccionadas entre (i) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 28, (ii) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 26 o 27, y (iii) HVR-H3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEC ID NO: 23 o 24; y (b) un dominio VL que comprende por lo menos una, por lo menos dos, o las tres secuencias VL HVR seleccionadas entre (i) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 29 o 30, (ii) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 31 o 32, y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 33.

En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo que comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 28; (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 26 o 27; (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 23 o 24; (d) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 29 o 30; (e) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 31 o 32; y (f) HVR-L3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre SEC ID NO: 33.

En cualquiera de las realizaciones antes mencionadas, un anticuerpo anti-LRP5 puede ser humanizado. En una realización, un anticuerpo anti-LRP5 comprende HVRs como en cualquiera de las realizaciones precedentes, y comprende además una estructura humana aceptara, por ej. una estructura de inmunoglobulina humana o una estructura consenso humana. En otra realización, un anticuerpo anti-LRP5 comprende HVRs como en cualquiera de las realizaciones precedentes, y comprende además un VH o VL que comprende una secuencia FR, donde las secuencias FR son como sigue. Para la cadena pesada, FR1 comprende la secuencia EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEC ID NO: 34), FR2 comprende la secuencia WVRQAPGKGLEWV (SEC ID NO: 35), FR3 comprende la secuencia RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEC ID NO: 36), FR4 comprende la secuencia WGQ (SEC ID NO: 37). Para la cadena liviana, FR1 comprende la secuencia DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEC ID NO: 38), FR2 comprende la secuencia WYQQKPGKAPKLLIY (SEC ID NO: 39), FR3 comprende la secuencia GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEC ID NO: 40), FR4 comprende la secuencia FGQGTKVEIKR (SEC ID NO: 41).

En otro aspecto, un anticuerpo anti-LRP5 comprende una secuencia de dominio variable (VH) de cadena pesada que tiene por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEC ID NOs: 1-11. En ciertas realizaciones, una secuencia de VH que tiene por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ej., sustituciones conservadoras), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, pero un anticuerpo anti-LRP5 que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a LRP5. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos han sido sustituidos, insertados y/o delecionados en cualquiera de SEC ID NOs: 1-11. En ciertas realizaciones, las sustituciones, inserciones, o deleciones se producen en regiones fuera de las HVRs (es decir, en las FRs). Opcionalmente, el anticuerpo anti-LRP5 comprende la secuencia de VH en cualquiera de SEC ID NOs: 1-11, incluyendo modificaciones pos-traducción de esa secuencia. En una realización en particular, el VH comprende una, dos o tres HVRs seleccionadas entre: (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 28, (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 26 o 27, y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 23 o 24.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LRP5, donde el anticuerpo comprende un dominio variable (VL) de cadena liviana que tiene por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 12-22. En ciertas realizaciones, una secuencia de VL que tiene por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad contiene sustituciones (por ej., sustituciones conservadoras), inserciones, o deleciones con relación a la secuencia de referencia, aunque un anticuerpo anti-PRO que comprende esa secuencia retiene la capacidad de unirse a PRO. En ciertas realizaciones, un total de 1 a 10 aminoácidos han sido sustituidos, insertados y/o delecionados en SEC ID NO: 12-22. En ciertas realizaciones, las sustituciones, inserciones o deleciones se producen en regiones fuera de las HVRs (es decir, en las FRs). Opcionalmente, el anticuerpo anti-LRP5 comprende la secuencia de VL en SEC ID NO: 12-22, que incluye modificaciones pos-traducción de esa secuencia. En una realización en particular, el VL comprende una, dos o tres HVRs seleccionadas entre (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 29 o 30; (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 31 o 32; y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 33.

En otro aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LRP5, donde el anticuerpo comprende un VH como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente, y un VL como en cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente. En una realización, el anticuerpo comprende las secuencias de VH y VL en cualquiera de SEC ID NOs: 1-11 y SEC ID NOs: 12-22, respectivamente, incluyendo modificaciones pos-traducción de esas secuencias. En algunas realizaciones, el anticuerpo comprende secuencias de VH y VL como sigue: SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 2 y SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 3 y SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 4 y SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 6 y SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 7 y SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 8 y SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 9 y SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 21 , o SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 22.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-LRP5 proporcionado en esta invención. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-LRP5 que comprende una secuencia de VH de SEC ID NO: 1 y una secuencia de VL de SEC ID NO: 12 o que comprende una secuencia de VH de SEC ID NO: 5 y una secuencia de VL de SEC ID NO: 16.

En un aspecto más de la invención, un anticuerpo anti-LRP5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones antes mencionadas es un anticuerpo monoclonal, incluyendo un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En una realización, un anticuerpo anti-LRP5 es un fragmento de anticuerpo, por ej., un Fv, Fab, Fab', scFv, diacuerpo, o fragmento F(ab')2. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, por ej., un anticuerpo de lgG1 intacto u otra clase de anticuerpo o isotipo según lo definido en la presente invención.

En un aspecto adicional, un anticuerpo anti-LRP5 de acuerdo con cualquiera de las realizaciones antes mencionadas puede incorporar cualquiera de las características, singulares o en combinación, según lo descrito en las Secciones 1-7 a continuación: Afinidad del Anticuerpo En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en esta invención tiene una constante de disociación (Kd) de= 1 µ?, < 100 nM,= 10 nM,= 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM, o < 0,001 nM (por ej. ??^ ? o menos, por ej. de ??^ ? a 10" 3 M, por ej., de 10_9 M a 10"13 M).

En una realización, Kd se mide mediante un ensayo de unión al antígeno radioetiquetado (RIA, por sus siglas en inglés) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno según lo descrito por el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de Fabs para el antígeno se mide equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno rotulado con (125l) en presencia de una serie de titulación de antígeno sin rotular, luego capturando el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (ver, por ej., Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para establecer condiciones para el ensayo, se recubren durante toda la noche placas de múltiples pocilios MICROTITER® (Thermo Scientific) con 5 g/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en carbonato sódico 50 mM (pH 9.6), y posteriormente bloqueado con 2% (p/v) de seroalbúmina bovina en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), se mezclan 100 pM o 26 pM de antígeno-[125l] con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ej., consistente con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). Luego, el Fab de interés se incuba durante toda la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período más largo (por ej., alrededor de 65 horas) para asegurar que se alcance el equilibrio. A continuación, las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura ambiente (por ej., durante una hora). Luego, la solución se retira y la placa se lava ocho veces con 0,1% de polisorbato 20 (TWEEN-20®) en PBS. Cuando las placas se han secado, se agregan 150 µ?/pocillo de agente de centelleo (MICROSCINT-20™; Packard), y las placas se cuenta en un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos de o igual a 20% de unión máxima se escogen para utilizar en ensayos de unión competitiva.

De acuerdo con otra realización, Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmón de superficie usando un BIACORE®-2000 o un BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (UR). Brevemente, chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE, Inc.) se activan con clorhidrato de ?/— etil— ? '— (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y /V-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye con acetato de sodio 10 mM, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 µ?) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 µ?/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Luego de la inyección de antígeno, se inyecta etanolamina 1 M para bloquear los grupos sin reaccionar. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas dobles de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de surfactante polisorbato 20 (TWEEN-20™) (PBST) a 25°C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 µ?/min. Las velocidades de asociación (kasoc) y velocidades de disociación (kd¡soc) se calculan usando un modelo de unión Langmuir una a uno simple (Programa Informático de Evaluación BIACORE ® versión 3.2) mediante el ajuste simultáneo de los sensogramas de asociación y disociación. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se calcula como la relación kd¡soc/kasoc ? er- Por eÍ- Cnen et al- J- Mol. Biol. 293:865-881 (1999).

Si la velocidad de asociación excede 106 M~1 s~1 por el ensayo de resonancia de plasmón de superficie antes mencionado, entonces la velocidad de asociación puede determinarse usando una técnica de templado fluorescente que mide el aumento o disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm de pasabanda) a 25°C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones en aumento de antígeno según lo medido en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro serie 8000 SLM-AMINCO (ThermoSpectronic) con un recipiente agitado.

Fragmentos de Anticuerpo En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en esta invención es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos incluyen, aunque sin limitación, fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, y scFv, y otros fragmentos descritos más adelante. Para una reseña de ciertos fragmentos de anticuerpos, véase Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para una reseña de fragmentos scFv, véase, por ej., Pluckthün, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., (Springer-Verlag, Nueva York), pp. 269-315 (1994); véase también WO 93/16185; y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.571.894 y 5.587.458. Para una descripción de fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden residuos de epítopos de unión al receptor de rescate y que tienen aumento de la vida media in vivo, ver la Patente de los Estados Unidos No. 5.869.046.

Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Ver, por ejemplo, EP 404.097; WO 1993/01161 ; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos son también descritos en Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpos que comprenden la totalidad o una porción del dominio variable de cadena pesada o la totalidad o una porción del dominio variable de cadena liviana de un anticuerpo.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; ver, por ej., Patente de los Estados Unidos No. 6.248.516 B1).

Los fragmentos de anticuerpos pueden ser preparados mediante diversas técnicas, incluyendo aunque sin limitarse a digestión proteolítica de un anticuerpo intacto así como también producción por células huéspedes recombinantes (por ej. E. eoli o fago), según lo descrito en esta invención.

Anticuerpos Quiméricos y Humanizados En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en esta invención es un anticuerpo quimérico. Ciertos anticuerpos quiméricos son descritos, por ej., en la Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81 :6851-6855 (1984)). En un ejemplo, un anticuerpo quimérico comprende una región variable no humana (por ej., una región variable derivada de un ratón, rata, hámster, conejo, o primate no humano, tal como un mono) y una región constante humana. En un ejemplo adicional, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo "con cambio de clase" en el cual la clase o subclase ha sido cambiada de aquella del anticuerpo parental. Los anticuerpos quiméricos incluyen sus fragmentos de unión al antígeno.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo quimérico es un anticuerpo humanizado. Típicamente, un anticuerpo no humano es humanizado para reducir la inmunogenicidad a humanos, reteniendo al mismo tiempo la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano parental. En general, un anticuerpo humanizado comprende uno o más dominios variables en las cuales HVRs, por ej., CDRs, (o sus porciones) derivan de un anticuerpo no humano, y FRs (o sus porciones) derivan de secuencias de anticuerpos humanos. Un anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante humana. En algunas realizaciones, algunos residuos FR en un anticuerpo humanizado son sustituidos con residuos correspondientes de un anticuerpo no humano (por ej., el anticuerpo del cual derivan los residuos de HVR), por ej., para restaurar o mejorar la especificidad o afinidad del anticuerpo.

Los anticuerpos humanizados y métodos para su preparación son revisados, por ej., en Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), y son adicionalmente descritos, por ej., en Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 , y 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que describe injerto de SDR (a-CDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que describe "resurfacing"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que describe el "barajado de FR"); y Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) y Klimka et al., Br. J. Cáncer, 83:252-260 (2000) (que describe el método de "selección guiada" al barajado de FR (FR shuffling).

Las regiones estructurales humanas que pueden utilizarse para la humanización incluyen aunque sin limitarse a: regiones estructurales seleccionadas usando el método de "mejor ajuste" (ver, por ej., Sims et al. J. Immunol. 151 :2296 (1993)); regiones estructurales derivadas de la secuencia consenso de anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de regiones variables de cadena liviana o pesada (ver, por ej., Cárter et al. Proc. Nati. Acad.

Sci. USA, 89:4285 (1992); y Presta et al. J. Immunol., 151 :2623 (1993)); regiones estructurales maduras humanas (mutadas somáticamente) o regiones estructurales de línea germinal humana (ver, por ej., Almagro y Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); y regiones estructurales derivadas de la selección de genotecas FR (ver, por ej., Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) y Rosok et al., J. Biol. Chem. 271 :22611-22618 (1996)).

Anticuerpos Humanos En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en esta invención es un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos usando diversas técnicas conocidas en el campo. Los anticuerpos humanos son descritos generalmente en van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) y Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

Los anticuerpos humanos pueden ser preparados administrando un inmunogeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir anticuerpos humanos intactos o anticuerpos intactos con regiones variables humanas en respuesta al desafío antigénico. Dichos animales típicamente contienen la totalidad o una porción de los lugares de inmunoglobulina humana, los cuales reemplazan a los lugares de inmunoglobulina endógenos, o los cuales están presentes extracromosómicamente o integrados arbitrariamente en los cromosomas del animal. En dichos ratones transgénicos, los lugares de inmunoglobulina endógenos han sido generalmente inactivados. Para la reseña de los métodos para obtener anticuerpos humanos de animales transgénicos, ver Lonberg, Nal Biotech. 23:1117-1125 (2005). Ver también, por ej., las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6.075.181 y 6.150.584 que describen la tecnología XENOMOUSE™; Patente de los Estados Unidos No. 5.770.429 que describe la tecnología HUMAB®; Patente de los Estados Unidos No. 7.041.870 que describe la tecnología K-M MOUSE®, y la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. US 2007/0061900, que describe la tecnología VELOCIMOUSE®). Las regiones variables humanas de anticuerpos intactos generados por dichos animales pueden ser adicionalmente modificadas, por ej., combinando con una región constante humana diferente.

Los anticuerpos humanos también pueden ser preparados mediante métodos basados en hibridoma. Se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón- humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos. (Ver, por ej., Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987); y Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991 ).) Los anticuerpos humanos generados por medio de tecnología del hibridoma de células B humanas son también descritos en Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Los métodos adicionales incluyen aquellos descritos, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos No. 7.189.826 (la cual describe la producción de anticuerpos de IgM humanos monoclonales a partir de líneas celulares de hibridoma) y Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que describe hibridomas humanos- humanos). La tecnología de hibridoma humano (tecnología Trioma) es también descrita en Vollmers y Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) y Vollmers y Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Los anticuerpos humanos también pueden ser generados aislando secuencias de dominios variables de clones de Fv seleccionadas de genotecas de exhibición de fagos derivadas humanas. Luego, dichas secuencias de dominio variable pueden combinarse con un dominio constante humano deseado. Las técnicas para seleccionar anticuerpos humanos de genotecas de anticuerpos son descritas a continuación.

Anticuerpos Derivados de Genotecas Los anticuerpos de la invención pueden ser aislados por screening de genotecas combinadas para anticuerpos con la actividad o actividades deseadas.

Por ejemplo, en la técnica se conoce una variedad de métodos para generar genotecas de exhibición de fagos y screening de dichas genotecas para anticuerpos que poseen las características de unión deseadas. Dichos métodos son descritos, por ej., en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) y son adicionalmente descritos, por ej., en the McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581- 597 (1992); Marks y Bradbury, en Methods in Molecular Biology 248:161-17 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004).

En ciertos métodos de exhibición de fagos, los repertorios de genes VH y VL son clonados por separado mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) y recombinados arbitrariamente en genotecas de fagos, las cuales pueden ser luego seleccionadas para fago de unión al antígeno según lo descrito en Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). El fago típicamente exhibe fragmentos de anticuerpos, ya sea como fragmentos Fv de una sola cadena (scFv) o como fragmentos Fab. Las genotecas de fuentes inmunizadas proporcionan anticuerpos de elevada afinidad contra el inmunógeno sin el requerimiento de construir hibridomas. Alternativamente, el repertorio "naive" (como se presenta en la naturaleza) puede ser clonado (por ej., de humano) para proporcionar una única fuente de anticuerpos con un amplio rango de antígenos propios y ajenos sin inmunización alguna según lo descrito por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, las genotecas "naive" también pueden ser preparadas sintéticamente clonando segmentos de genes V sin reordenamiento a partir de células madre, y usando cebadores de PCR que contienen secuencia al azar para codificar las regiones CDR3 altamente variables y para lograr el reordenamiento in vitro, según lo descrito por Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Las publicaciones de patentes que describen genotecas de fagos de anticuerpos humanos incluyen, por ejemplo: Patente de los Estados Unidos No. 5.750.373, y Publicaciones de Patentes de los Estados Unidos Nos. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, y 2009/0002360.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos aislados de genotecas de anticuerpos humanos se consideran anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpos humanos en esta invención. 6. Anticuerpos Multiespecífícos En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en esta invención es un anticuerpo multiespecífico, por ej. un anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos multiespecífícos son anticuerpos monoclonales que tienen especificidades de unión para por lo menos dos sitios diferentes. En ciertas realizaciones, una de las especificidades de unión es para LRP5 y la otra es para cualquier otro antígeno. En ciertas realizaciones, la otra especificidad de unión es para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés). En ciertas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes de LRP5. Los anticuerpos biespecíficos también pueden ser utilizados para localizar agentes citotóxicos para células que expresan LRP5. Los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos.

Las técnicas para preparar anticuerpos multiespecífícos incluyen, aunque sin limitarse a, coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobulina que tienen diferentes especificidades (ver Milstein y Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, y Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), e ingeniería "knob-in-hole" (mutaciones de acoplamiento) (ver, por ej., la Patente de los Estados Unidos No. 5.731.168). Los anticuerpos multiespecífícos también pueden ser preparados mediante técnicas de ingeniería genética de efectos de maniobras electrostáticas para preparar moléculas heterodiméricas de anticuerpos Fe (WO 2009/089004A1); entrecruzamiento de dos o más anticuerpos o fragmentos (ver, por ej., Patente de los Estados Unidos No. 4.676.980, y Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); usando cierres de leucina para producir anticuerpos biespecíficos (ver, por ej., Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); usando tecnología de "diacuerpos" para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos (ver, por ej., Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); y usando dímeros de Fv de cadena única (sFv) (ver, por ej. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); y preparar anticuerpos triespecíficos según lo descrito, por ej., en Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos construidos por técnicas de ingeniería genética con tres o más sitios de unión al antígeno funcionales, incluyendo "Anticuerpos de pulpo," son también incluidos en esta invención (ver, por ej. US 2006/0025576A1).

El anticuerpo o fragmento de esta invención incluye además un "FAb de Doble Acción" o "DAF" que comprende un sitio de unión al antígeno que se une a LRP5 así como también a otro antígeno diferente (ver, US 2008/0069820, por ejemplo). 7. Variantes de Anticuerpos En ciertas realizaciones, las variantes de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos proporcionados por esta invención son contempladas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos de un anticuerpo pueden prepararse mediante la introducción de modificaciones apropiadas en la secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo, o mediante síntesis peptídica. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se puede realizar cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución para arribar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas, por ej., unión al antígeno.

Sustitución. Inserción, v Variantes de Deleción En ciertas realizaciones, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una o más sustituciones de aminoácidos. Los sitios de interés para mutagénesis de sustitución incluyen las HVRs y FRs. Las sustituciones conservadoras son mostradas en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones conservadoras". Se proporcionan cambios más sustanciales en la Tabla 1 bajo el encabezamiento de "sustituciones ejemplares" y según lo descrito adicionalmente más adelante con referencia a las clases de cadena lateral de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser introducidas en un anticuerpo de interés y los productos seleccionados para una actividad deseada, por ej., unión al antígeno retenida/ mejorada, reducción de la inmunogenicidad o mejora de ADCC o CDC.

TABLA 1 Los aminoácidos pueden ser agrupados de acuerdo con las propiedades comunes de cadena lateral: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que influyen sobre la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Las sustituciones no conservadoras abarcarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase.

Un tipo de variante sustitucional involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo parental (por ej. un anticuerpo humanizado o humano). En general, la o las variantes resultantes seleccionadas para estudio adicional tendrán modificaciones (por ej., mejoras) en ciertas propiedades biológicas (por ej., aumento de afinidad, reducción de la inmunogenicidad) con relación al anticuerpo parental y/o tendrán ciertas propiedades biológicas sustancialmente retenidas del anticuerpo parental. Una variante sustitucional ejemplar es un anticuerpo madurado por afinidad, la cual puede ser generada convenientemente, por ej., usando técnicas de maduración por afinidad basadas en exhibición de fagos tales como aquellas descritas en esta invención. Brevemente, uno o más residuos HVR son mutados y los anticuerpos variantes exhibidos en fago y seleccionados para una actividad biológica en particular (por ej. afinidad de unión).

Pueden realizarse alteraciones (por ej., sustituciones) en HVRs, por ej., para mejorar la afinidad hacia el anticuerpo. Dichas alteraciones pueden ser realizadas en "puntos calientes" ("hotspots") de HVR, es decir, residuos codificados por codones que sufren mutación a elevada frecuencia durante el proceso de maduración somática (ver, por ej., Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), y/o SDRs (a-CDRs), siendo analizada la variante VH o VL resultante para afinidad de unión. La maduración por afinidad mediante la construcción y reselección a partir de genotecas secundarias ha sido descrita, por ej., en Hoogenboom et al. en Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed.f Human Press, Toto a, NJ, (2001).) En algunas realizaciones de maduración por afinidad, se introduce diversidad en los genes variables seleccionados para maduración mediante cualquiera de una variedad de métodos (por ej., PCR propensa al error, barajado de cadena, o mutagénesis dirigida a oligonucleótidos). Luego se crea una genoteca secundaria. Luego, la genoteca se selecciona para identificar cualquier variante de anticuerpo con la afinidad deseada. Otro método para introducir diversidad involucra métodos dirigidos a HVR, en los cuales diversos residuos de HVR (por ej., 4-6 residuos por vez) son aleatorizados. Los residuos HVR involucrados en la unión al antígeno pueden ser específicamente identificados, por ej., usando mutagénesis de exploración con alanina o modelado. CDR-H3 y CDR-L3 en particular son frecuentemente tomados como objetivo.

En ciertas realizaciones, pueden ocurrir sustituciones, inserciones o deleciones dentro de una o más HVRs siempre y cuando dichas alteraciones no reduzcan sustancialmente la capacidad del anticuerpo de unirse al antígeno. Por ejemplo, se pueden realizar alteraciones conservadoras (por ej., sustituciones conservadoras según lo proporcionado en esta invención) en HVRs que no reducen sustancialmente la afinidad de unión. Dichas alteraciones pueden estar afuera de los "puntos calientes" de HVR o SDRs. En ciertas realizaciones de las secuencias de VH y VL variantes proporcionadas anteriormente, cada HVR está sin alterar, o no contiene más de uno, dos o tres sustituciones de aminoácidos.

Un método útil para la identificación de residuos o regiones de un anticuerpo que puede ser tomado como objetivo para la mutagénesis se denomina "mutagénesis de exploración con alanina" según lo descrito por Cunníngham y Wells (1989) Science, 244:1081-1085. En este método, un residuo o grupo de residuos objetivos (por ej., residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) son identificados y reemplazados por un aminoácido neutro o con carga negativa (por ej., alanina o polialanina) para determinar si la interacción del anticuerpo con el antígeno se ve afectada. Se pueden introducir otras sustituciones en los lugares de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones iniciales. Alternativamente, o adicionalmente, una estructura cristalina de un complejo antígeno - anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Dichos residuos de contacto y residuos lindantes pueden ser tomados como objetivo o eliminados como candidatos para la sustitución. Pueden seleccionarse variantes para determinar si contienen las propiedades deseadas.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones de terminal amino- y/o carboxilo que oscilan en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen cien residuos o más, así como también inserciones de intrasecuencias de residuos de aminoácido único o múltiples aminoácidos. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo de terminal N. Otras variantes insercionales del anticuerpo o molécula de anticuerpo incluyen la fusión al término N o C del anticuerpo a una enzima (por ej. para ADEPT) o un polipéptido el cual aumenta la vida media sérica del anticuerpo.

Variantes de glicosilación En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en esta invención es alterado para aumentar o reducir el grado hasta el cual el anticuerpo es glicosilado. La adición o deleción de sitios de glicosilación a un anticuerpo puede lograrse convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de modo que se crea o elimina uno o más sitios de glicosilación.

Donde el anticuerpo comprende una región Fe, se puede alterar el carbohidrato unido al mismo. Los anticuerpos nativos producidos por células de mamífero típicamente comprenden un oligosacárido ramificado, biantenario que está generalmente unido por una N-ligación a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, por ej., Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). El oligosacárido puede incluir diversos carbohidratos, por ej., mañosa, N-acetil glucosamina (GIcNAc), galactosa, y ácido siálico, así como también una fucosa unida a un GIcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenaria. En algunas realizaciones, pueden realizarse modificaciones del oligosacárido en un anticuerpo de la invención a fin de crear variantes de anticuerpos con ciertas propiedades mejoradas.

En una realización, se proporcionan variantes de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidrato que carece de fucosa unida (directa o indirectamente) a una región Fe. Por ejemplo, la cantidad de fucosa en dicho anticuerpo puede ser entre 1% y 80%, entre 1 % y 65%, entre 5% y 65% o entre 20% y 40%. La cantidad de fucosa se determina calculando la cantidad promedio de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297, con relación a la suma de todas las glicoestructuras unidas a Asn 297 (por ej. estructuras complejas, híbridas y de alto contenido de mañosa) según lo medido por espectrometría de masas MALDI-TOF, según lo descrito en WO 2008/077546, por ejemplo. Asn297 se refiere al residuo asparagina situado en aproximadamente la posición 297 en la región Fe (numeración Eu de residuos de región Fe); sin embargo, Asn297 también puede estar situado aproximadamente ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente abajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones menores de secuencias en los anticuerpos. Dichas variantes de fucosilación pueden tener una función mejorada . de ADCC. Ver, por ej., Publicaciones de Patentes de Estados Unidos Nos. US 2003/0157108 (Presta, L); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Los ejemplos de publicaciones relacionadas con variantes de anticuerpos "desfucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Los ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos desfucosilados incluyen células Lec13 CHO deficientes en fucosilación proteica (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Sol. de Pat. Estadounidense No US 2003/0157108 A1 , Presta, L; y WO 2004/056312 A1 , Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11), y líneas de células knockout, tales como gen de alfa-1 ,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO anuladas ("knockout") (ver, por ej., Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y WO2003/085 07).

Se proporcionan además variantes de anticuerpos con oligosacáridos bisectados, por ej., en las cuales un oligosacárido biantenario unido a la región Fe del anticuerpo es biseccionado por GIcNAc. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener fucosilación reducida y/o función de ADCC mejorada. Se describen ejemplos de dichas variantes de anticuerpos, por ej., en WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente de los Estados Unidos No. 6.602.684 (Umana et al.); y US 2005/0123546 (Umana et al.). Se proporcionan además variantes de anticuerpos con por lo menos un residuo de galactosa en el oligosacárido unido a la región Fe. Dichas variantes de anticuerpos pueden tener una función CDC mejorada. Dichas variantes de anticuerpos son descritas, por ej., en WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); y WO 1999/22764 (Raju, S.).

Variantes de región Fe En ciertas realizaciones, se pueden introducir una o más modificaciones de aminoácidos en la región Fe de un anticuerpo proporcionado en esta invención, generando así una variante de región Fe. La variante de región Fe puede comprender una secuencia de región Fe humana (por e , una región De de lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4 humana) que comprende una modificación de aminoácidos (por ej. una sustitución) en una o más posiciones de aminoácidos.

En ciertas realizaciones, la invención contempla una variante de anticuerpos que posee alguna, pero no todas las funciones efectoras, que la tornan un candidato deseable para aplicaciones en las cuales la vida media del anticuerpo in vivo es importante sin embargo ciertas funciones efectoras (tales como complemento y ADCC) son innecesarias o perjudiciales. Se pueden llevar a cabo ensayos de citotoxicidad in vitro y/o in vivo para confirmar la reducción/ agotamiento de actividades de CDC y/o ADCC. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de unión al receptor de Fe (FcR) para asegurar que el anticuerpo carezca de unión al FcyR (por ende probablemente carezca de actividad de ADCC), pero retiene la capacidad de unión al FcRn. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan Fc(RIII solamente, mientras que los monocitos expresa Fc(RI, Fc(RII y Fc(RIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se sintetiza en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Los ejemplos no limitativos de ensayos in vitro para evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 5.500.362 (ver, por ej. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) y Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821 ,337 (ver Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativamente, se pueden emplear métodos de ensayo no radiactivos (ver, por ejemplo, ACTI™ ensayo de citotoxicidad no radiactiva para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; y CytoTox 96® ensayo de citotoxicidad no radiactiva (Promega, Madison, Wl). Las células efectoras útiles para dichos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC, por sus siglas en inglés) y células Asesinas Naturales (NK, por sus siglas en inglés). Alternativamente, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser evaluada in vivo, por ej., en un modelo animal tal como aquel descrito en Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). También pueden llevarse a cabo ensayos de unión a C1q para confirmar que el anticuerpo sea incapaz de unirse a C1q y por ende carece de actividad de CDC. Ver, por ej., ELISA de unión a C1q y C3c en WO 2006/029879 y WO 2005/100402. Para evaluar la activación del complemento, se puede llevar a cabo un ensayo de CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101 :1045-1052 (2003); y Cragg, M.S. y M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). También pueden llevarse a cabo determinaciones de unión a FcRn y de evacuación in vivo /vida media usando métodos conocidos en la técnica (ver, por ej., Petkova, S.B. et al., Intl. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).

Los anticuerpos con función efectora reducida incluyen aquellos con sustitución de uno o más de residuos de región Fe 238, 265, 269, 270, 297, 327 y 329 (Patente de los Estados Unidos No. 6.737.056). Dichos mutantes de Fe incluyen mutantes de Fe con sustituciones en dos o más de posiciones de aminoácidos 265, 269, 270, 297 y 327, incluyendo el denominado mutante de Fe "DANA" con sustitución de los residuos 265 y 297 a alanina (Patente de los Estados Unidos No. 7.332.581).

Se describen ciertas variantes de anticuerpos con unión mejorada o reducida a FcRs. (Ver, por ej., Patente de los Estados Unidos No. 6.737.056; WO 2004/056312, y Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).) En ciertas realizaciones, una variante de anticuerpo comprende una región de Fe con una o más sustituciones de aminoácidos las cuales mejoran ADCC, por ej., sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región de Fe (numeración EU de residuos).

En algunas realizaciones, se realizan alteraciones en la región de Fe que dan como resultado unión a C1q alterada (es decir, mejorada o reducida) y/o Citotoxicidad que Depende del Complemento (CDC), por ej., según lo descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 6.194.551 , WO 99/51642, y Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178^184 (2000).

Los anticuerpos con vidas medias aumentadas e unión mejorada al receptor de Fe neonatal (FcRn), el cual es responsable de la transferencia de IgGs maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), son descritos en US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Aquellos anticuerpos comprenden una región Fe con una o más sustituciones allí los cuales mejoran la unión de la región de Fe a FcRn. Dichas variantes de Fe incluyen aquellas con sustituciones en uno o más de los residuos de región Fe: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311 , 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 o 434, por ej., sustitución de residuo de región Fe 434 (Patente de los Estados Unidos No. 7.371.826).

Ver también Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente de los Estados Unidos No. 5.648.260; Patente de los Estados Unidos No. 5.624.821 ; y WO 94/29351 con respecto a otros ejemplos de variantes de región Fe.

Variantes de anticuerpos modificadas por técnicas de ingeniería genética con cisteína En ciertas realizaciones, puede ser deseable crear anticuerpos modificados por técnicas de ingeniería genética con cisteína, por ej., "thioMAbs," en donde uno o más residuos de un anticuerpo son sustituidos con residuos cisteína. En realizaciones particulares, los residuos sustituidos ocurren en sitios accesibles del anticuerpo. Mediante la sustitución de esos residuos con cisteína, los grupos tiol reactivos son así posicionados en sitios accesibles del anticuerpo y pueden utilizarse para conjugar el anticuerpo a otros restos, tales como restos farmacológicos o restos farmacológicos ligantes, para crear un inmunoconjugado, según lo descrito adicionalmente en la presente invención. En ciertas realizaciones, cualquiera o más de los siguientes residuos puede ser sustituido con cisteína: V205 (numeración Kabat) de la cadena liviana; A118 (numeración EU) de la cadena pesada; y S400 (numeración EU) de la región de Fe de cadena pesada. Pueden generarse anticuerpos modificados con cisteína según lo descrito, por ej., en la Patente de los Estados Unidos No. 7.521.541.

Derivados de Anticuerpos En ciertas realizaciones, un anticuerpo proporcionado en esta invención puede ser adicionalmente modificado para contener restos no proteináceos adicionales que son conocidos en la técnica y están fácilmente disponibles. Los restos adecuados para derivación del anticuerpo incluyen aunque sin limitarse a polímeros hidrosolubles. Los ejemplos no limitativos de polímeros hidrosolubles incluyen, aunque sin limitarse a, políetilenglícol (PEG), copolímeros de etílenglicol /propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinil alcohol, polivinil pirrolidona, poli— 1 , 3-dioxolano, poli-1 ,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (ya sea homopolímeros o copolímeros al azar), y dextrano o polí(n-viníl pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de propropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno / óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ej., glicerol), polivinil alcohol, y sus mezclas. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. La cantidad de polímeros unidos al anticuerpo puede variar, y si se unen más de un polímero, pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, la cantidad y/o tipo de polímeros empleados para la derivación pueden determinarse en base a consideraciones que incluyen, aunque sin limitarse a, las propiedades particulares o funciones del anticuerpo a ser mejorado, ya sea que el derivado del anticuerpo sea utilizado en una terapia bajo condiciones definidas, etc.

En otra realización, se proveen conjugados de un anticuerpo y resto no proteináceo que pueden calentarse selectivamente mediante la exposición a radiación. En una realización, el resto no proteináceo es un nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). La radiación puede ser de cualquier longitud de onda, e incluye, aunque sin limitación, longitudes de onda que no dañan células comunes, pero que calientan el resto no proteináceo hasta una temperatura a la cual las células próximas al resto no proteináceo del anticuerpo son eliminadas.

Métodos Recombinantes y Composiciones Los anticuerpos pueden ser producidos usando métodos recombinantes y composiciones, por ej., según lo descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 4.816.567. En una realización, se proporciona el ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo anti-LRP5 descrito en esta invención. Dicho ácido nucleico puede codificar una secuencia de aminoácido que comprende el VL y/o una secuencia de aminoácido que comprende el VH del anticuerpo (por ej., las cadenas liviana y/o pesada del anticuerpo). En una realización adicional, se proporcionan uno o más vectores (por ej., vectores de expresión) que comprenden dicho ácido nucleico. En una realización adicional, se proporciona una célula huésped que comprende dicho ácido nucleico. En una realización de ese tipo, una célula huésped comprende {por ej., ha sido transformada con): (1) un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo, o (2) un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VL del anticuerpo y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende el VH del anticuerpo. En una realización, la célula huésped es eucariótica, por ej. una célula de Ovario de Hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés) o célula linfoide (por ej., célula YO, NSO, Sp20). En una realización, se proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-LRP5, donde el método comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica el anticuerpo, según lo proporcionado anteriormente, en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo, y opcionalmente recuperar el anticuerpo de la célula huésped (o medio de cultivo de célula huésped).

Para la producción recombinante de un anticuerpo anti-LRP5, el ácido nucleico que codifica un anticuerpo, por ej., según lo descrito con anterioridad en la presente, se aisla y se inserta en uno o más vectores para posterior clonación y/o expresión en una célula huésped. Dicho ácido nucleico puede ser fácilmente aislado y secuenciado usando procedimientos convencionales (por ej., usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y liviana del anticuerpo).

Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión de vectores que codifican anticuerpos incluyen células procarióticas o eucarióticas descritas en esta invención. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos en bacterias, en particular cuando no son necesarias la glicosilación y función del efector Fe. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, véase, por ej., las Patentes Estadounidenses Nos. 5.648.237, 5.789.199, y 5.840.523. (Ver también Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, que describe la expresión de fragmentos de anticuerpos en E. coli.) Luego de la expresión, el anticuerpo puede ser aislado de la pasta celular bacteriana en una fracción soluble y puede ser adicionalmente purificado.

Además de procariotas, los microbios eucarióticos tales como los hongos filamentosos o levadura son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores que codifican anticuerpos, incluyendo hongos y cepas de levaduras cuyas rutas de glicosilación han sido "humanizadas" dando como resultado la producción de un anticuerpo con un patrón de glicosilación parcial o totalmente humano. Ver Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), y Li et al., Nal Biotech. 24:210-215 (2006).

Las células huéspedes adecuadas para la expresión de anticuerpo glicosilado son también derivadas de organismos multicelulares (invertebrados y vertebrados). Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de planta e insecto. Se han identificado numerosas cepas baculovirales las cuales pueden utilizarse en conjunto con células de insecto, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células de planta también pueden utilizarse como huéspedes. Ver, por ej., las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978, y 6.417.429 (que describen la tecnología PLANTIBODIES™ para producir anticuerpos en plantas transgénicas).

También pueden utilizarse células de vertebrados como huéspedes. Por ejemplo, las líneas de células de mamífero que se adaptan para crecer en suspensión pueden ser útiles. Otros ejemplos de líneas de células huéspedes de mamífero útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7); la línea de riñon embriónico humano (células 293 o 293 según lo descrito, por ej., en Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK); células sertoli de ratón (células TM4 según lo descrito, por ej., en Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1); células de riñon de mono verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humanas (HELA); células de riñon caninas (MDCK; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A); células de pulmón humanas (W138); células de hígado humanas (Hep G2); tumor mamario de ratón (MMT 060562); células TRI, según lo descrito, por ej., en Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 ( 982); células MRC 5; y células FS4. Otras líneas de células huéspedes de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células DHFR" CHO (Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); y líneas celulares cte mieloma tales como YO, NSO y Sp2/0. Para una reseña de ciertas líneas de células huéspedes de mamífero adecuadas para la producción de anticuerpos, véase, por ej., Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).

Ensayos Los anticuerpos Anti-LRP5 proporcionados en esta invención pueden ser identificados, seleccionados, o caracterizados por sus propiedades físico/ químicas y/ o actividades biológicas mediante diversos ensayos conocidos en la técnica.

Ensayos de unión y otros ensayos En un aspecto, un anticuerpo de la invención se analiza para determinar su actividad de unión al antígeno, por ej., mediante métodos conocidos tales como ELISA, Western blot, etc.

En otro aspecto, pueden emplearse ensayos de competición para identificar un anticuerpo que compite con YW629.42 o YW629.51 para la unión a LRP5. En ciertas realizaciones, dicho anticuerpo competidor se une al mismo epítopo (por ej., un epítopo lineal o un epítopo conformacional) que es unido por YW629.42 o YW629.51. Los métodos ejemplificativos detallados para el mapeo de un epítopo al cual se une un anticuerpo son proporcionados en Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," en Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

En un ensayo de competición ejemplificativo, se incuba LRP5 inmovilizado en una solución que comprende un primer anticuerpo rotulado que se une a LRP5 (por ej., YW629.42 o YW629.51) y un segundo anticuerpo no rotulado que está siendo ensayado para determinar su capacidad para competir con el primer anticuerpo para la unión a LRP5. El segundo anticuerpo puede estar presente en un sobrenadante de hibridoma. Como control, el LRP5 inmovilizado se incuba en una solución que comprende el primer anticuerpo rotulado pero no el segundo anticuerpo no rotulado. Luego de la incubación bajo condiciones que permiten la unión del primer anticuerpo a LRP5, se elimina el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de rótulo asociado con LRP5 inmovilizado. Si la cantidad de rótulo asociada con LRP5 inmovilizado es sustancialmente reducida en la muestra de ensayo con relación a la muestra control, entonces eso indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo para la unión a LRP5. Ver Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap. 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

Ensayos de Actividad En un aspecto, se proporcionan ensayos para identificar anticuerpos anti- LRP5 que tienen una actividad biológica. La actividad biológica puede incluir, por ej., la unión a LRP5, potenciación de la actividad de Norrin, o potenciación del señalamiento de Norrin/Fzd4. También se proporcionan anticuerpos que tienen dicha actividad biológica in vivo y/o in vitro.

En ciertas realizaciones, se analiza un anticuerpo de la invención para dicha actividad biológica. En un ensayo de activación de Wnt/Norrin ejemplar, LRP5 y proteína Fzd4, o las variantes relevantes (es decir Fzd4Mi57v) se expresan transitoriamente con plásmidos reporteros de luciferasa Topflash en células 293T.

Las células que expresan estas proteínas son expuestas a ligandos Norrin o Wnt y, luego de una incubación durante 16 horas a 37°C, se determina el nivel de activación midiendo la cantidad de luminiscencia de luciferasa. Si se aumenta sustancialmente la cantidad de luminiscencia por la adición del ligando en presencia de anticuerpo LRP5 entonces eso indica que el anticuerpo potencia el señalamiento de Fzd4/Norrin. Cuando se utiliza Fzd4Mi57v, que tiene señalamiento disminuido en presencia de Norrin, el aumento de la luminiscencia en presencia de anticuerpo LRP5 se considera que rescata el defecto en el señalamiento de Fzd4.

En un ensayo de activación de Wnt/Norrin adicional, las células endoteliales de la retina humanas cultivadas pueden ser expuestas a ligandos Norrin o Wnt en presencia de anticuerpo LRP5 o anticuerpo control durante 24-48 horas y se puede determinar el nivel de genes reporteros Wnt conocidos (es decir, Axin-2 o PV-1) por RT-PCR cuantitativa. En la situación del anticuerpo control, luego de la adición de ligandos de Norrin y Wnt, la cantidad de ARN de Axin-2 aumentará, mientras que la cantidad de ARN de PV-1 disminuirá, con relación a la no adición de ligando. Si la presencia del anticuerpo LRP5, potenciación del señalamiento de Norrin daría como resultado un aumento adicional en Axin-2 y a la inversa, una disminución en PV-1. Este ensayo también puede ser realizado en células tratadas con siRNA para reducir la expresión de Tspan 2. En células con expresión disminuida de Tspan12 no hay cambio alguno en Axin-2 en presencia de Norrin. Si el anticuerpo LRP5, pero no el anticuerpo control, es capaz de causar un aumento en Axin-2 en ausencia de la expresión de Tspan12, entonces se considera que este anticuerpo rescata el defecto en el señalamiento de Fzd4/Norrin que es resultado de la pérdida de Tspan12.

Inmunoconjugados La invención provee además inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-LRP5 de esta invención conjugado a uno o más agentes citotóxicos, tales como agentes o fármacos quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ej., toxinas proteicas, toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, vegetal o animal, o sus fragmentos), o isótopos radiactivos.

En una realización, un inmunoconjugado es un conjugado de anticuerpo-fármaco (ADC, por sus siglas en inglés) en el cual un anticuerpo es conjugado a uno o más fármacos, incluyendo aunque sin limitarse a maytansinoide (ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.208.020, 5.416.064 y Patente Europea EP 0 425 235 B1); una auristatina tal como restos de fármaco monometilauristatina DE y DF (MMAE y MMAF) (ver Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.635.483 y 5.780.588, y 7.498.298); una dolastatina; una calicheamicina o su derivado (ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701 , 5.770.710, 5.773.001, y 5.877.296; Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993); y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)); una antraciclina tal como daunomicina o doxorubicina (ver Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med.

Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); y Patente de los Estados Unidos No. 6.630.579); metotrexato; vindesina; un taxano tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel, y ortataxel; un tricoteceno; y CC1065.

En otra realización, un ¡nmunoconjugado comprende un anticuerpo según lo descrito en esta invención conjugado a una toxina enzimáticamente activa o a su fragmento, incluyendo aunque sin limitarse a cadena A de difteria, fragmentos activos de no unión de la toxina de la difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, y los tricotecenos.

En otra realización, un ¡nmunoconjugado comprende un anticuerpo según lo descrito en esta invención conjugado a un átomo radiactivo para formar un radioconjugado. Se encuentra disponible una variedad de isótopos radiactivos para la producción de radioconjugados. Los ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radiactivos de Lu. Cuando el radioconjugado se utiliza para detección, el mismo puede comprender un átomo radiactivo para estudios de escintigrafía, por ejemplo tc99m o 1123, o una etiqueta de espín para la toma de imágenes por resonancia magnética nuclear (NMR, por sus siglas en inglés) (también conocido como toma de imágenes por resonancia magnética, mri), tal como yodo-123 nuevamente, yodo-131 , indio-111 , flúor— 19, carbonc—13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los conjugados de un anticuerpo y agente citotóxico pueden prepararse usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N— succi n im id i I— 3— (2— pi rid i Id itio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCI), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una ¡nmunotoxina de ricina según lo descrito en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminapentaacético rotulado con Carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Ver WO94/11026. El ligante puede ser un "ligante disociable" que facilita la liberación de un fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un ligante lábil al ácido, ligante sensible a peptidasa, ligante fotolábil, ligante de dimetilo o ligante que contiene disulfuro (Chari et al., Cáncer Res. 52:127-131 (1992); Patente de los Estados Unidos No. 5.208.020).

Los inmunoconjugados o ADCs de la presente invención contemplan expresamente, aunque sin limitarse a dichos conjugados preparados con reactivos entrecruzadores incluyendo, aunque sin limitarse a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato) los cuales están disponibles en el mercado (por ej., de Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A).

Métodos y Composiciones para Diagnóstico y Detección En ciertas realizaciones, cualquiera de los anticuerpos anti-LRP5 proporcionados en esta invención es útil para detectar la presencia de LRP5 en una muestra biológica. El término "detectar" en el presente contexto abarca la detección cuantitativa o cualitativa. En ciertas realizaciones, una muestra biológica comprende una célula o tejido, tal como tejido ocular, incluyendo tejido de la retina.

En una realización, se proporciona un anticuerpo anti-LRP5 para utilizar en un método de diagnóstico o detección. En un aspecto adicional, se proporciona un método para detectar la presencia de LRP5 en una muestra biológica. En ciertas realizaciones, el método comprende poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo anti-LRP5 según lo descrito en esta invención bajo condiciones que permiten la unión del anticuerpo anti-LRP5 a LRP5, y detectar si se forma un complejo o no entre el anticuerpo anti-LRP5 y LRP5. Dicho método puede ser un método in vitro o in vivo. En una realización, se utiliza un anticuerpo anti-LRP5 para seleccionar sujetos elegibles para terapia con un anticuerpo anti-LRP5, por ej. donde LRP5 es un biomarcador para selección de pacientes.

Los trastornos ejemplares que pueden ser diagnosticados usando un anticuerpo de la invención incluyen retinopatías que incluyen retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, enfermedad de Coats', enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, y retinopatía hipertensiva.

En ciertas realizaciones, se proporcionan anticuerpos anti-LRP5 etiquetados. Las etiquetas incluyen, aunque sin limitarse a, etiquetas o restos que se detectan directamente (tales como etiquetas fluorescentes, cromofóricas, densas en electrones, quimioluminiscentes, y radiactivas), así como también restos, tales como enzimas o ligandos, que se detectan indirectamente, por ej., a través de una reacción enzimática o interacción molecular. Los ejemplos de etiquetas incluyen, aunque sin limitarse a, los radioisótopos 32P, 14C, 125l, 3H, y 13 1, fluoróforos tales como quelatos de tierras raras o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansilo, umbeliferona, luceriferasas, por ej., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana (Patente de los Estados Unidos No. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinadionas, peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés), fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas, por ej., glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, oxidasas hete rocícl ¡cas tales como uricasa y xantina oxidasa, acopladas con una enzima que emplea peróxido de hidrógeno para oxidar un precursor de tinte tal como HRP, lactoperoxidasa, o microperoxidasa, biotina/avidirta, etiquetas espín, etiquetas de bacteriófago, radicales libres estables y similares.

Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones farmacéuticas de un anticuerpo anti-LRP5 según lo descrito en esta invención se preparan mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables opcionales (Remmgton's Pharmaceutical Sciences 16ta edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen, aunque sin limitarse a: buffers tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de benzetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina, o ¡nmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos metálicos {por ej. complejos de Zn-proteína); y/o surfactantes no iónicos tales como polietilenglicol (PEG). Los portadores farmacéuticamente aceptables ejemplares de esta invención incluyen además agentes de dispersión de fármacos intersticiales tales como glicoproteínas de hialuronidasa activas neutras solubles (sHASEGP, por sus siglas en inglés), por ejemplo, glicoproteínas de hialuronidasa PH-20 solubles humanas, tales como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Ciertas sHASEGPs ejemplares y métodos de uso, incluyendo rHuPH20, son descritos en la Publicación de Patente de los Estados Unidos Nos. 2005/0260186 y 2006/0104968. En un aspecto, se combina una sHASEGP con una o más glicosaminoglicanasas adicionales tales como condroitinasas.

Las formulaciones de anticuerpo liofilizados ejemplares se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 6.267.958. Las formulaciones de anticuerpos acuosas incluyen aquellas descritas en la Patente de los Estados Unidos No. 6.171.586 y WO2006/044908, incluyendo estas últimas formulaciones un buffer de histidina- acetato.

La formulación de esta invención también puede contener más de un ingrediente activo según lo necesario para la indicación en particular que se está tratando, con preferencia aquellos con actividades complementarias que no afectan adversamente uno al otro. Por ejemplo, puede ser conveniente proporcionar además un antagonista del VEGF (incluyendo, por ej., un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de anticuerpo, por ej. ranibizumab, un receptor del VEGF soluble o su fragmento, por ej. aflibercept, o un aptámero, por ej. pegaptanib), un agonista de TSPAN12, plasmina, plasminógeno, activador de plasminógeno tisular, triamcinolona, un inhibidor de TNF-a, y/o dexametasona. Dichos ingredientes activos están adecuadamente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el propósito pretendido.

Los ingredientes activos pueden estar atrapados en microcapsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas son descritas en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ta edición, Osol, A. Ed. (1980).

Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, matrices que están en la forma de artículos conformados, por ej. películas o microcápsulas.

Las formulaciones que se utilizarán para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad pueden lograrse fácilmente, por ej., por filtración a través de membranas de filtración estériles.

Métodos Terapéuticos y Composiciones Se puede emplear cualquiera de los anticuerpos anti-LRP5 proporcionados en esta invención en métodos terapéuticos.

En un aspecto, se proporciona un anticuerpo anti-LRP5 para utilizar como un medicamento. En otros aspectos, se proporciona un anticuerpo anti-LRP5 para utilizar en el tratamiento de retinopatías que incluyen retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, enfermedad de Coats, enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, y retinopatía hipertensiva. En ciertas realizaciones, se proporciona un anticuerpo anti-LRP5 para utilizar en un método de tratamiento. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-LRP5 para utilizar en un método para tratar un individuo que tiene una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, enfermedad de Coats, enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-LRP5. En una realización de ese tipo, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ej., según lo descrito más adelante. En realizaciones adicionales, la invención proporciona un anticuerpo anti-LRP5 para utilizar en la potenciación de la actividad de Norrin y/o potenciación del señalamiento de Norrin/Fzd4. En ciertas realizaciones, la invención proporciona un anticuerpo anti-LRP5 para utilizar en un método para potenciar la actividad de Norrin y/o potenciar el señalamiento de Norrin/Fzd4 en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo anti-LRP5 para potenciar la actividad de Norrin y/o potenciar el señalamiento de Norrin/Fzd4. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones antes mencionadas es preferentemente un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de un anticuerpo anti-LRP5 en la manufactura o preparación de un medicamento. En una realización, el medicamento es para el tratamiento de una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva. En una realización adicional, el medicamento es para utilizar en un método para tratar una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, Enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva que comprende administrar a un individuo que tiene una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopia patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, Enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hípertensiva una cantidad eficaz del medicamento. En una realización de ese tipo, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional, por ej., según lo descrito más adelante. En una realización adicional, el medicamento es para potenciar la actividad de Norrin y/o potenciar el señalamiento de Norrin/Fzd4. En una realización adicional, el medicamento es para utilizar en un método para potenciar la actividad de Norrin y/o potenciar el señalamiento de Norrin/Fzd4 en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del medicamento para potenciar la actividad de Norrin y/o potenciar el señalamiento de Norrin/Fzd4. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones antes mencionadas puede ser un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para tratar una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopia patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, Enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis- Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva. En una realización, el método comprende la administración a un individuo que tiene dicha retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, Enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-LRP5. En una realización de ese tipo, el método comprende además administrar al individuo una cantidad eficaz de por lo menos un agente terapéutico adicional, según lo descrito más adelante. Un "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones antes mencionadas puede ser un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método para potenciar la actividad de Norrin y/o potenciar el señalamiento de Norrin/Fzd4 en un individuo. En una realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-LRP5 para potenciar la actividad de Norrin y/o potenciar el señalamiento de Norrin/Fzd4. En una realización, un "individuo" es un ser humano.

En un aspecto adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los anticuerpos anti-LRP5 proporcionados en esta invención, por ej., para utilizar en cualquiera de los métodos terapéuticos antes mencionados. En una realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-LRP5 proporcionados en esta invención y un portador farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una formulación farmacéutica comprende cualquiera de los anticuerpos anti-LRP5 proporcionados en la presente invención y por lo menos un agente terapéutico adicional, por ej., según lo descrito más adelante.

Los anticuerpos de la invención pueden utilizarse ya sea por sí solos o en combinación con otros agentes en una terapia. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ser administrado en forma conjunta con por lo menos un agente terapéutico adicional. En ciertas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un antagonista del VEGF (incluyendo, por ej., un anticuerpo anti-VEGF o fragmento de anticuerpo, por ej. ranibizumab, un receptor del VEGF soluble o su fragmento, por ej. aflibercept, o un aptámero, por ej. pegaptanib), un agonista de TSPAN12, plasmina, plasminógeno, activador de plasminógeno tisular, triamcinolona, un inhibidor de TNF-a, y/o dexametasona.

Dichas terapias combinadas señaladas con anterioridad abarcan la administración combinada (donde dos o más agentes terapéutico son incluidos en las mismas formulaciones o en formulaciones separadas), y administración separada, en cuyo caso, la administración del anticuerpo de la invención puede ocurrir antes de, en forma simultánea, y/o después de, la administración del agente terapéutico adicional y/o adyuvante.

Un anticuerpo de la invención (y cualquier agente terapéutico adicional) puede ser administrado por cualquier medio adecuado, incluyendo la administración parenteral, intrapulmonar, e intranasal, y, si se desea para tratamiento local, por administración intraocular (por ej. administración intravítrea). Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, o subcutánea. La dosificación puede ser mediante cualquier ruta adecuada, por ej. por inyecciones, tal como la administración intravítrea, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Se contemplan en esta invención diversos programas de dosificación incluyendo aunque sin limitarse a administraciones únicas o múltiples en diversos puntos en el tiempo, administración por bolo e infusión por pulso.

Los anticuerpos de la invención serían formulados, dosificados y administrados en forma consistente con la buena práctica médica. Los factores para tener en cuenta en este contexto incluyen el trastorno en particular que se está tratando, el mamífero en particular que se está tratando, la afección clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los profesionales médicos. El anticuerpo no necesariamente pero es opcionalmente formulado con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de dichos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento, y otros factores descritos anteriormente. Estos se utilizan, en general, en las mismas dosificaciones y con rutas de administración según lo descrito en esta invención, o aproximadamente entre 1 y 99% de las dosificaciones descritas en esta invención, o en cualquier dosificación y mediante cualquier ruta que es empíricamente/ clínicamente determinada como apropiada.

Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de un anticuerpo de la invención (cuando se utiliza sola o en combinación con uno o más otros agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad que se está tratando, el tipo de anticuerpo, la severidad y transcurso de la enfermedad, si el anticuerpo es administrado para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al anticuerpo, y la discreción del médico interviniente. El anticuerpo es adecuadamente administrado al paciente de una vez o en una serie de tratamientos. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 pg/kg a 15 mg/kg (por ej. 0,1mg/kg-10mg/kg) de anticuerpo puede ser una dosificación candidata inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, por una o más administraciones separadas, o por infusión continua. Una dosificación diaria típica podría oscilar entre aproximadamente 1 pg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados con anterioridad. Para administraciones repetidas durante varios días o más prolongadas, dependiendo de la afección, el tratamiento sería generalmente sostenido hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Una dosificación ejemplificativa del anticuerpo estaría dentro del rango entre aproximadamente 0,05 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. Por lo tanto, se puede administrar al paciente una o más dosis de alrededor de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de los mismos). Dichas dosis pueden ser administradas en forma intermitente, por ej. cada semana o cada tres semanas (por ej. de modo que el paciente reciba entre aproximadamente dos y aproximadamente veinte, o por ej. aproximadamente seis dosis del anticuerpo). Puede administrarse una dosis de carga más elevada inicial, seguida por una o más dosis más bajas. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El progreso de esta terapia es fácilmente monitoreado por técnicas y ensayos convencionales.

Se entiende que cualquiera de las formulaciones antes mencionadas o métodos terapéuticos puede llevarse a cabo usando un inmunoconjugado de la invención en lugar de, o además de, un anticuerpo anti-LRP5.

Artículos de Manufactura En otro aspecto de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento, prevención y/o diagnóstico de los trastornos descritos con anterioridad. El artículo de manufactura comprende un envase y un inserto de etiqueta o paquete en o asociado con el envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los envases pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase sostiene una composición la cual está sola o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener una boca de acceso estéril (por ejemplo el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es un anticuerpo de la invención. La etiqueta o inserto de paquete indica que la composición se utiliza para tratar la afección de elección. Asimismo, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un anticuerpo de la invención; y (b) un segundo envase con una composición contenida en el mismo, donde la composición comprende un agente terapéutico citotóxico adicional o otro agente terapéutico. El artículo de manufactura en esta realización de la invención puede comprender además un inserto de paquete que indica que las composiciones pueden utilizarse para tratar una afección en particular. Alternativa, o adicionalmente, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprende un buffer farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostátíca para inyección (BWFI, por sus siglas en inglés), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros buffers, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

Se entiende que cualquiera de los artículos antes mencionados de manufactura puede incluir un inmunoconjugado de la invención en lugar de o además de un anticuerpo anti-LRP5.

EJEMPLOS Lo que sigue son ejemplos de métodos y composiciones de la invención. Se entiende que pueden practicarse diversas otras realizaciones, dada la descripción general proporcionada con anterioridad.

Ejemplo 1 : Generación de anticuerpos anti-LRP5 Clasificación y Screening de Genotecas para Identificar Anticuerpos Anti-LRP5-E3/E4 Nosotros generamos diversas construcciones de expresión de LRP5, incluyendo aquellas que codifican toda la región extracelular, los cuatro dominios ß-propulsores en su totalidad E1-4, cada dominio ß-propulsor solo, y E3-E4, y descubrimos que solamente el clon que codifica los dominios E3-E4 produjo una cantidad significativa de proteína expresada soluble. Por lo tanto, utilizamos dominios LRP5 humanos biotinilados E3-E4 generados internamente (E644-Q1263 de SEC ID NO : 42) como antígeno para la clasificación de genotecas. Se recubrieron inmunoplacas Maxisorp® de 96 pocilios Nunc durante toda la noche a 4°C con NeutrAvidin® (Fisher Scientific, #89890, 10pg/ml) o estreptravidina (Fisher Scientific, #21125, 10pg/ml) y se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente con buffer de bloqueo de fago PBST (solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 1 % (p/v) seroalbúmina bovina (BSA) y 0,05% (v/v) tween-20). Luego se capturó LRP5-E3/E4 biotinilado (10pg/ml) sobre la placa mediante NeutrAvidin®/estreptravidina durante 1 hora a temperatura ambiente. Las genotecas de fagos sintéticas de anticuerpos humanos (ver, por ej., Lee et al., J. Immunol. eth. 284:119-132, 2004, Liang et al., J. Molec. Biol. 366: 815-829, 2007) se agregaron a placas de antígenos por separado y se incubaron durante toda la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, las placas recubiertas con antígeno se lavaron diez veces con PBT (PBS con 0.05% Tween®-20), y el fago unido se eluyó con HCI 50mM y NaCI 500mM durante 30 minutos y se neutralizó con un volumen igual de base Tris 1 M (pH7.5). Los fagos recuperados se amplificaron en células XL-1 de E. coli. Durante las subsiguientes rondas de selección, se redujo la incubación de fago de anticuerpo con las placas recubiertas con antígeno a 2-3 horas, y se aumentó gradualmente la severidad del lavado de las placas.

Después de 6 rondas de cribado, se observó un enriquecimiento significativo. Se escogieron 96 clones cada uno del rastreo de genotecas para determinar si se unían específicamente a LRP5E3/E4 humano. Las regiones variables de estos clones fueron secuenciadas por PCR para identificar clones de secuencia única.

El sobrenadante de fago se diluyó 1:5 en buffer de ELISA (ensayo de inmunoabsorbencia vinculada con enzima) (PBS con 0,5% BSA, 0,05% Tween® 20) en un volumen total de 100µ? y se transfirió a las placas recubiertas con proteína objetivo (iMg/ml LRP5E3/E4 directamente recubierto durante toda la noche) o placa recubierta con neutravidina/estreptavidina (5pg/ml de cada proteína). La placa se agitó suavemente durante 1 hora para permitir que el fago se uniera a las placas recubiertas con proteína. La placa se lavó diez veces con PBS-0.05% Tween® 20. La unión se cuantificó agregando anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en buffer de ELISA (1:5000) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron diez veces con PBS-0.05% Tween® 20. A continuación, se agregaron 10?µ?/pocillo de una relación 1:1 de sustrato de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) Peroxidasa y Solución de Peroxidasa B (H2O2) (Kírkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD)) al pocilio y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo agregando 100µ? de ácido fosfórico 0.1 M (H3P04) a cada pocilio y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se determinó la DO (densidad óptica) del color amarillo en cada pocilio usando un lector de placas de ELISA estándar a 450 nm. Se calculó la reducción de la DO (%) mediante la siguiente ecuación: reducción de DO450nm (%) = [(DO450nm de pocilios con competidor) / (DO450nm de pocilio sin competidor)]""! 00 Los clones que tenían la DO45onm por lo menos 5 veces más alta de LRP5E3/E4 que el fondo se escogieron y reformatearon en lgG1 humana de longitud completa clonando regiones VL y VH de clones individuales en el vector LPG3 y LPG4 respectivamente. Estos clones fueron posteriormente expresados transitoriamente en células CHO de mamífero, y purificados con una columna de proteína A.

Construcción de Genotecas y Estrategia de Cribado para Mejora de Afinidad de Clones Derivados de las Genotecas de Fagos Sintéticas Para cada clon que demostró actividad de ensayo basado en células prometedora, YW629.42 y YW629.51 , se generó fagémido que contenía 4 codones de parada (TAA) en CDR L3 y que exhibían Fab monovalente en la superficie de bacteriófago M13. Estos fagémidos sirvieron como los patrones para mutagénesis Kunkel para la construcción de genotecas de maduración por afinidad. Para la maduración por afinidad, se utilizó una estrategia de aleatorización suave, donde se sintetizó ADN mutagénico con mezclas 70-10-10-10 de bases que favorecen a los nucleótidos del tipo salvaje para obtener el índice de mutación de aproximadamente 50% en las posiciones seleccionadas (Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994)). Se seleccionaron para la aleatorización cuatro combinaciones diferentes de lazos de CDR, H1/L3, H2/L3, H3/L3, y L1/L2/L3.

Para la selección que mejora la afinidad, LRP5E3/E4 generado internamente se biotiniló, en primer lugar, bajo condición limitadora de reactivos. Las genotecas de fagos se sometieron a seis rondas de clasificación en solución con severidad en aumento. Para la primera ronda de clasificación en solución, 3 D.O./ml en 1 % BSA y 0,05% Tween® 20 de rendimiento de fago se incubaron a placas previamente recubiertas con LRP5E3/E4 durante 3 horas. Los pocilios se lavaron con PBS-0,05% Tween® 20 diez veces. El fago unido se eluyó con 150ul/pocillo HCI 50mM, KCI 500mM durante 30 minutos, y posteriormente se neutralizó mediante 50ul/pocillo de Tris 1 M pH8, se tituló y se propagó para la siguiente ronda. Para las rondas posteriores, se realizó cribado de las genotecas de fagos en fase de solución, donde la genoteca de fagos se incubó con concentración inicial de proteína objetivo biotinilada 100 nM (la concentración se basa en un valor de IC50 de fago de clon parental) en 100µ? de buffer SuperBIock (Pierce Biotechnology) durante 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó adicionalmente 10X con SuperBIock, y se aplicaron ???µ?/pocillo a pocilios recubiertos con NeutrAvidin® (10pg/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente con suave agitación. Para determinar la unión al fondo, pocilios control que contenían fago se capturaron en placas recubiertas con neutravidina. Luego el fago unido se lavó, se eluyó y se propagó según lo descrito para la primera ronda.

Se llevaron a cabo cinco rondas más de clasificación de las soluciones junto con severidad de selección en aumento. El primer par de rondas es para selección por asociación (on-rate) disminuyendo la concentración de proteína objetivo biotinilada de 100nM a 0,5nM, y las dos últimas rondas es para la selección por disociación (off-rate) agregando cantidades en exceso de proteína objetivo no biotinilada (300 a 1000 veces más) para sacar de competición a los aglutinantes más débiles a temperatura ambiente.

ELISA para Cribado de Afinidad de Alto Rendimiento (Competición de Un Solo Punto) Las colonias se escogieron de la sexta ronda de cribado para selección. Se cultivaron colonias durante la noche a 37°C en 1 ml/pocillo de medio 2YT con 50pg/ml de carbenicilina y 1x 1010/ml M13K07 en placa de 96 pocilios (Falcon). De la misma placa, se incluyó una colonia de fago parental infectado XL-1 como control. Se recubrieron placas Nunc axisorp de 96 pocilios con ???µ?/pocillo de LRP5E3/E4 (0,5pg/ml) en PBS a 4°C durante toda la noche. Las placas se bloquearon con 150µ? de 1% BSA y 0,05% Tween® 20 en PBS 20 durante 1 hora. 35 ul del sobrenadante de fago se diluyó con hasta 75 ul en buffer de ELISA (ensayo de inmunoabsorbencia vinculado con enzima) (PBS con 0,5% BSA, 0,05% Tween® 20) con o sin 5nM LRP5E3/4 y se dejó incubando durante 1 hora a temperatura ambiente en una placa F (NUNC). Se transfirieron 95µ? de mezcla lado a lado a las placas recubiertas con antígeno. La placa se agitó suavemente durante 15 min y se lavó diez veces con PBS-0,05% Tween® 20. Se cuantificó la unión agregando anticuerpo anti- M13 conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) en buffer de ELISA (1 :2500) y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS-0,05% Tween® 20 diez veces. Luego, se agregaron ???µ?/pocillo de sustrato de Peroxidasa al pocilio y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo agregando 100µ? de ácido fosfórico 0,1 M (H3P04) a cada pocilio y se dejó incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se determinó la DO (densidad óptica) de cada pocilio usando un lector de placas de ELISA convencional a 450 nm. En comparación con la reducción de la D045onm (%) del pocilio de fago parental (100%), los clones que tenían la reducción de DO450nm (%) inferior a 50% se escogieron para análisis de secuencia. Los clones únicos se seleccionaron para preparación de fago para determinar la afinidad de unión (IC50 de fago) contra antígeno objetivo LRP5E3/E4 mediante comparación con el clon parental. El clon que demostró la mayor mejora de la afinidad se reformateó en lgG1 humana para la producción de anticuerpos y análisis cinético de unión BIAcore™ adicional y otros ensayos in vitro o in vivo. Las secuencias de dominio variable para ciertos anticuerpos que fueron identificados mediante este proceso se muestran en las Figuras 4A -5B. En esta memoria descriptiva, los prefijos "YW629" y "P6C" pueden utilizarse indistintamente. Por consiguiente, por ej., el anticuerpo descrito como YW629.51.61 es el mismo que P6C.51.61.

Caracterización de Anticuerpos Anti-LRP5 (BIAcore) Se midieron las afinidades de unión de IgGs anti-LRP5E3/E4 mediante Resonancia de Plasmón Superficial (SPR, por sus siglas en inglés) usando un instrumento BIAcore™-T100. Se capturaron IgGs humanas anti- LRP5E3/E4 mediante anticuerpo Fe anti- humano de ratón (GE Healthcare, cat# BR-1008-39) recubierto en chips biosensores CM5 para lograr aproximadamente 200 unidades de respuesta (UR). Para las mediciones cinéticas, se inyectaron diluciones seriadas dobles (500nM a 0,245nM) de LRP5E3/E4 humano (GNE) en buffer de HBS-P (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCI 0,15 M, 0,005%surfactante P20) a 25°C con una velocidad de flujo de 30 µ?/min. Se calcularon las constantes de asociación (/ on) y las constantes de disociación (/c0ff) usando un modelo de unión simple Langmuir uno a uno (Programa Informático de Evaluación BIAcore versión 2.0.2). Se calculó la constante de disociación en equilibrio (KQ) como la relación /c0ff//c0n- Los resultados de este análisis para los anticuerpos en las Figuras 4A-5B se muestran en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2. Análisis BIAcore de anticuerpos anti-LRP5 Ejemplo 2: Identificación de anticuerpo con actividad potenciadora de la ruta de Norrin Norrin hace señales a través de un complejo de membrana que comprende LRP5, Frizzled4 (FZD4) y Tetraspanin12 (TSPAN12). Las mutantes han sido identificadas en cada uno de Norrin (por ej. Norrin-C95R), FZD4 (por ej. FZD4- M157V) y TSPAN12 (por ej. TSPAN12-G188R), las cuales exhiben deficiencias de señalamiento. Nosotros ensayamos la capacidad de diversos anticuerpos de LRP5 para impactar sobre el señalamiento mediado por Norrin.

En placas de 24 pocilios, 1.6x105 células/pocilio fueron transfectadas con mezcla de ADN que contenía mezcla informante de b-Catenina (TOPFIash, pRL- CMV, y pCan-myc-lef-1), LRP5, y Fzd4 o Fzd4-M157V. Veinticuatro horas después de la transfeccion, se agregó la cantidad indicada de cada anticuerpo LRP5. Una hora después, se agregaron 125 ng/ml de Norrin recombinante a pocilios según lo indicado. Luego de una incubación adicional de 16 horas a 37°C, las células se lisaron y se midió la expresión de luciferasa de Luciérnaga y Renilla usando Reactivos Promega Dual-Glo® Reagents. Los valores de luciferasa de luciérnaga se normalizaron a expresión de Renilla. Norrin activa la expresión del genes informantes en 5 veces con relación a sin ligando. La adición de cantidades en aumento de anticuerpo potencia la actividad de Norrin hasta -10 veces a 0,1- 1 g/ml en todos los anticuerpos ensayados (Figura 1A). Cuando Fzd4-M157V es sustituido por Fzd4 en la transfeccion, la activación de Norrin es reducida solamente 2 veces. La adición de anticuerpos LRP5 rescata el señalamiento defectuoso hasta niveles que se asemejan a Fzd4 tipo salvaje (Figura 1 B). Estos datos indican que los anticuerpos anti-LRP5 potencian el señalamiento de Norrin/Fzd4 y rescatan la mutación Fzd4-M157V.

Se sembraron 3x105 células microvasculares endoteliales de retina humanas (HREMVC, por sus siglas en inglés) en un plato de 6 pocilios. Al día siguiente se agregaron 10pg/ml del anticuerpo indicado, seguido por 1 ,25pg/ml de Norrin, una hora más tarde. Después de 24 horas adicionales, el ARN fue aislado para análisis de Q-PCR de genes objetivo de Norrin, PV-1 (regulado descendentemente por Norrin) y Axin-2 (regulado ascendentemente por Norrin). La adición de Norrin regula hacia arriba la expresión de Axin-2 ~1.6 veces y regula hacia abajo PV-1 ~0,7 veces, con relación a sin ligando. La adición de anticuerpos LRP5 indicados regula hacia arriba adicionalmente Axin-2 hasta ~2 veces y regula hacia abajo PV-1 hasta ~0,5 veces (Figura 2A). Se sembraron 3X105 HREMVC en platos de 6 pocilios. Una vez que las células se habían adherido (~4 horas), las mismas se transfectaron con 100nM control o Tspan12 siRNA usando reactivo de transfeccion DharmaFECT®. Al día siguiente las células se sembraron en una placa de 24 pocilios y se trataron con anticuerpo indicado y ligando (como se describió anteriormente). Según lo indicado mediante la medición de la expresión del gen Axin-2, el knockdown de Tspan12 evita la activación con Norrin. La adición de 10pg/ml de los anticuerpos LRP-5 indicados rescata parcialmente este señalamiento de Norrin defectuoso (Figura 2B). Estos datos indican que lo anticuerpos LRP5 potencian la actividad de Norrin y rescatan la pérdida de Tspan12.

A continuación ensayamos la actividad de los anticuerpos anti-LRP5 in vivo. Se trataron compañeros de jaula con anulación (knockout (KO)) de Tspan12 y del tipo salvaje con 25mg/kg de anti-gD (anticuerpo control negativo) o con anticuerpo anti-LRP5 (YW629.42) diariamente de P3-P14. En P15, se les quitó el núcleo a los ojos y las retinas se recolectaron para la tinción vascular con isolectina biotinilada B4. Las retinas se tiñeron con estreptavidina-AF488, con preparación completa, y se les tomaron imágenes usando microscopía confocal. Se compilaron proyecciones XY y Z desde pilas de 1 ,6 micrones capturadas a través del espesor de cada retina. Según lo esperado, los vasos sanguíneos de la retina con anulación (KO) de Tspan12 se paran en el plexus vascular superficial y forman pequeñas agrupaciones vasculares patológicas justo debajo de la capa celular ganglional. El tratamiento con P6C.42, pero no con anticuerpo control anti-gD, rescata parcialmente el defecto vascular de KO Tspan12 promoviendo la vascularización de capas profundas y reduciendo el agrupamiento vascular anormal (Figura 3A). En P15, los ratones con anulación (KO) de Tspan12 no pueden formar un lecho vascular plexiforme interno (IPL, por sus siglas en inglés) que es típico en ratones tipo salvaje. El tratamiento con YW629.42 restaura parcialmente la vasculatura de IPL en comparación con la región similar en ratones tratados con anti-gD. (n=3 animales/ grupo de tratamiento; Figura 3B).

Estos datos demuestran que un anticuerpo anti-LRP5 rescata parcialmente defectos vasculares en los ratones con anulación (knockout) de Tspan12 in vivo.

Los ratones compañeros de jaula con anulación (KO) de Tspan12 y heterocigóticos también fueron tratados con 25 mg/kg de anticuerpo anti-gD o anti-LRP5 (P6C.51.61). Para los datos mostrados en la Figura 6A, los ratones fueron tratados diariamente de P6-P15 y sacrificados en P16 (6 ratones/ grupo de tratamiento). Se les quitó el núcleo a los ojos y las retinas se recolectaron para la tinción vascular con isolectina biotinilada B4. Las retinas se tiñeron con estreptavidina-AF488, con preparación completa, y se les tomaron imágenes usando microscopía confocal. Se compilaron proyecciones XY y Z desde pilas de 1 ,6 micrones capturadas a través del espesor de cada retina. Los ratones Tspan12 +/- exhiben una vasculatura normal de la retina que consiste en tres capas vasculares distintas (Figura 6A, izquierda, barra de escala 100 um). Según lo esperado, los vasos sanguíneos de la retina de los ratones Tspan12 -/-, tratados con anticuerpo control anti-gD, se paran en el plexus vascular superficial y forman pequeñas agrupaciones vasculares patológicas debajo de la capa celular ganglional (Figura 6A, centro). El tratamiento con P6C.51 ,61 rescata parcialmente el defecto vascular de Tspan12 promoviendo la vascularización de capas profundas y reduciendo el agrupamiento vascular anormal (Figura 6A, derecha). Para los datos mostrados en la Figura 6B, los ratones fueron tratados diariamente de P3-P15, seguido por días alternos de P15-P30 (8 ratones/ grupo de tratamiento). En P31 , los ojos fueron extirpados y las retinas fueron recolectadas y tratadas según lo descrito anteriormente. Se tomaron imágenes de los vasos sanguíneos en la capa plexiforme interna (IPL, por sus siglas en inglés) mediante microscopía confocal. La IPL de ratones Tspan12+/- contiene la red capilar sana típica (Figura 6B, izquierda, barra de escala 50µ?t?), mientras que Tspan12-/-tratados con anticuerpo control anti-gD no forman una red capilar y desarrollan fragmentos de vasos sanguíneos anormales en la IPL (Figura 6B, centro). El tratamiento con P6C.51.61 restaura parcialmente la formación de red capilar en la IPL (Figura 6B, derecha).

A continuación analizaron anticuerpos anti-LRP5 en un modelo de retinopatía inducida por oxígeno (OIR, por sus siglas en inglés), que recapitula ciertas características patológicas de trastornos vasculares de la retina de adultos, tales como disminución del flujo capilar y angiogénesis patológica en oclusión venosa de retina y retinopatía diabética. El modelo consiste en 2 fases: una fase hiperóxica de días posnatales 7-12 (P7-P12) que da como resultado la obliteración del vaso en la retina central, y una fase hipóxica relativa de P12-P17 que conduce a angiogénesis patológica. Brevemente, durante la fase 1 , ratones neonatales P7 se colocan en una cámara hiperóxica que consiste en 75% de oxígeno durante 5 días. Durante esta fase, la vasculatura de la retina existente se revierte, dando como resultado la obliteración del vaso alrededor de la cabeza del nervio óptico en el centro. Durante la segunda fase, se crían ratones P12 en aire ambiente que consiste en 20% de oxígeno. La obliteración del vaso central conduce a una respuesta hipóxica que causa angiogénesis patológica. Para los datos mostrados en la Figura 7A, los ratones C57BI6/N fueron sometidos al procedimiento de OIR según lo descrito anteriormente. Los ratones fueron tratados con 25 mg/kg de anticuerpo anti-gD (anticuerpo control negativo) o ant¡-LRP5 (PC6.51.61) diariamente de P12-P17. En P17, los ojos fueron extirpados y las retinas fueron recolectadas y teñidas con isolectina B4 según lo descrito con anterioridad. El área total de la retina, el área con obliteración del vaso (subrayada en el centro), y la vasculatura patológica se midieron usando el programa informático de toma de imágenes Fiji. La Figura 7B muestra el análisis de los datos y a pesar del hecho de que no hubo diferencia significativa alguna en el área total de la retina entre grupo de tratamiento, los ratones tratados con P6C.51.61 tuvieron un recrecimiento vascular significativamente mayor dentro del área con obliteración del vaso que los ratones compañeros de jaula tratados con anti-gD. La Figura 7C muestra que el recrecimiento vascular aumentado en los animales tratados con P6C.51.61 fue acompañado por una tendencia hacia una reducción de la formación de los vasos sanguíneos patológicos con relación al grupo tratado con anti-gD. n=5 animales/ grupo de tratamiento.

Ejemplo 3: Análisis de actividad potenciadora de la ruta de Norrin de anticuerpos anti-LRP5 Llevamos a cabo experimentos para comprender el mecanismo mediante el cual nuestros anticuerpos anti-LRP5 actúan sobre la ruta de Norrin y sus otros componentes. En placas de 24 pocilios, se transfectaron 1.6x105 células/ pocilio con una mezcla de ADNs que contienen TOPFIash, pRL-CMV, y pCan-myc-lef-1 , LRP5, FZD-4, y ADNc que codifica los ligandos indicados (Norrin, o Wnt7b, o Wnt3a). Dieciseis horas después de la transfección, se agregaron 10 pg/ml de anticuerpo P6C.61.51. Luego de una incubación adicional de 16 horas a 37°C, las células fueron Usadas y se midió la expresión de luciferasa de Luciérnaga y Renilla usando Reactivos Promega Dual-Glo® Reagents. Los valores de luciferasa de luciérnaga se normalizaron a la expresión de la Renilla. La Figura 8A muestra que Norrin activa la expresión de genes informantes 6 veces con relación al caso de sin ligando y que la adición de lO g/ml de P6C.51.61 potencia la actividad de Norrin en 3 veces con relación a Norrin solamente. La Figura 7B muestra experimentos que demuestran que Wnt7b activa la expresión de la luciferasa en ~20 veces en ausencia de anticuerpo y aumento de 2 veces con respecto a Wnt7b por P6C.51.61. La Figura 7C muestra que la presencia de Wnt3a activa la expresión de luciferasa en >40 veces en ausencia de anticuerpo pero esta actividad es significativamente antagonizada en presencia de P6C.51.61. En conjunto, estos datos muestran que P6C.51.61 potencia el señalamiento de Norrin y Wnt7b, aunque antagoniza el señalamiento de Wnt3a.

Fzd4Mi57 y NorrinC95R son mutaciones que se producen en pacientes con trastornos de espectro FEVR y estas mutaciones conducen a una disminución del agrupamiento en el complejo de receptores Fzd4/LRP5/Norrin (Junge ef al. Cell 139:299-311 (2009)). Junge et al. demostraron que la sobreexpresión de TSPAN12 podría rescatar los defectos de agrupamiento asociados con Fzd4 i57v y Norrinc95R y restauran el señalamiento hasta los niveles tipo salvaje. Analizamos si P6C.51.61 podría agrupar el complejo de receptores y similarmente rescatar estas mutaciones. En placas de 24 pocilios, se transfectaron 1.6x105 células/pocilio con una mezcla de ADNs que contiene TOPFIash, pRL-CMV, pCan-myc-lef-1 , LRP5, Fzd4 o FZD4M157V, y Norrin o NorrinC95R- Dieciseis horas después de la transfección, se agregaron 10 g/ml de anticuerpo P6C.61.51 según lo indicado. Después de una incubación adicional de 16 horas a 37°C, las células fueron lisadas y se midió la expresión de luciferasa de Luciérnaga y Renilla usando Reactivos Promega Dual-Glo®. Se normalizaron los valores de luciferasa de luciérnaga a la expresión de Renilla. La Figura 8A muestra que Norrin activa la expresión de genes informantes en ~6 veces con relación al caso de sin ligando en presencia de Fzd4 tipo salvaje. Bajo estas condiciones, la adición de 10 g/ml de P6C.51.61 potencia la actividad de Norrin en 3 veces con relación a Norrin solamente. Cuando Fzd4Mi57v es sustituido por Fzd4 en la transfección, se reduce la activación de Norrin a ~2 veces con relación a sin ligando. La adición de P6C.51.61 rescata el señalamiento defectuoso de Fzd4Mi57v hasta niveles que se asemejan a Fzd4 tipo salvaje (línea punteada). La Figura 8B muestra que el reemplazo de Norrin con NorrinC95R conduce a una disminución significativa en la activación de la ruta en ausencia de anticuerpo pero en presencia de P6C.51.61 , se restaura la activación de Norrinc95R hasta el nivel asociado con Norrin tipo salvaje (línea punteada). Estos resultados demuestran que P6C.51.61 rescata mutaciones en componentes de receptores que reducen el agolpamiento de receptores.

A continuación analizamos el impacto de la valencia del anticuerpo de actividad. Descubrimos que se requiere unión bivalene para la potenciación anti-LRP5 del señalamiento de Norrin, aunque no la inhibición del señalamiento de Wnt3a. En placas de 24 pocilios, se transfectaron 1.6x105 células / pocilio con una mezcla de ADNs que contenía TOPFIash, pRL-CMV, y pCan-myc-lef-1 , LRP5, y FZD-4. Veinticuatro horas después de la transfección, se agregó la cantidad indicada de cada anticuerpo LRP5. Una hora más tarde, se agregaron 125ng/ml de Norrin recombinante o 200ng/ml de Wnt3a. Después de una incubación adicional de 16 horas a 37°C, las células fueron lisadas y se midió la expresión de luciferasa de Luciérnaga y Renilla usando Reactivos Promega Dual-Glo®. Se normalizaron los valores de luciferasa de luciérnaga a la expresión de Renilla. La Figura 10A muestra que Norrin activa la expresión de genes informantes en ~8 veces con relación al control sin ligando. La adición de 10pg/ml de anticuerpo LRP5 bivalente (P6C.51) potencia la actividad de Norrin en >2 veces pero la adición de 10pg/ml de anticuerpo (Fab) LRP5 monovalente no puede potenciar el señalamiento de Norrin. La Figura 10B muestra que el anticuerpo anti-LRP5 antagoniza el señalamiento de Wnt3a en presencia de 1Ü g/ml de LRP5 bivalente o monovalente. Estos datos sugieren que se requiere la naturaleza bivalente del MAb anti-LRP5 MAb para el agrupamiento del complejo de receptores, lo cual se sabe que se requiere para el señalamiento de Norrin.

Si bien la invención que antecede ha sido descrita con ciertos detalles a modo de ilustración y ejemplo con el objetivo de comprenderla mejor, las descripciones y ejemplos no deberían interpretarse como una limitación al alcance de la invención. Las descripciones de toda patente y literatura científica mencionadas en esta invención se incorporan expresamente en su totalidad a modo de referencia.

Claims (28)

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma cómo la misma ha de ser llevada a la práctica se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Un anticuerpo aislado que se une a la proteína 5 relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad (LRP5), donde el anticuerpo potencia la actividad de Norrin y/o el señalamiento de Norrin/Fzd4.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1 , el cual es un anticuerpo monoclonal.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 , el cual es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico.

4 . El anticuerpo de la reivindicación 1 , el cual es un fragmento de anticuerpo que se une a LRP5.

5. El anticuerpo de la reivindicación 1 , donde el anticuerpo comprende (a) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos YYRYAPYRSLGMDV (SEC ID NO: 23) o WIPQSYPFXiSYKSGFDY, donde X, es A o R (SEC ID NO: 24), (b) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYYX1YPFT, donde X1 es L o S (SEC ID NO: 25), y (c) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos GX1 ISX2X3GX4STYYADSVKG , donde X1 es A o G, X2 es A o S, X3 es P o S, X4 es S o W (SEC ID NO: 26), o SRISSNGGSTYYADSVKG (SEC ID NO: 27).

6. El anticuerpo de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende (a) HVR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos GFTFSSYAMX1, donde Xi es H o S (SEC ID NO: 28), (b) HVR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos GXi ISX2X3GX4STYYADSVKG, donde X1 es A o G, X2 es A o S, X3 es P o S, X4 es S o W (SEC ID NO: 26), o SRISSNGGSTYYADSVKG (SEC ID NO: 27) y (c) HVR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos YYRYAPYRSLGMDV (SEC ID NO: 23) o WIPQSYPFX^YKSGFDY, donde Xi es A o R (SEC ID NO: 24).

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, el cual comprende además (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQGISSYLA (SEC ID NO: 29) o RASQX1X2X3X4YI-A, donde X es A, G, S o V, X2 es I o M, X3 es F, G, S o Y, y X4 es G, S o Y (SEC ID NO: 30); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEC ID NO: 31) o DASX1X2ES, donde X1 es S o T y X2 es L o R (SEC ID NO: 32); y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYYX1YPFT, donde X1 es L o S (SEC ID NO: 33).

8. El anticuerpo de la reivindicación 1 , que comprende (a) HVR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos RASQGISSYLA (SEC ID NO: 29) o RASQX1X2X3X4YLA, donde X1 es A, G, S o V, X2 es I o M, X3 es G, F, Y o S, y X4 es G, Y o S (SEC ID NO: 30); (b) HVR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos AASSLQS (SEC ID NO: 31) o DASX^ES, donde X, es S o T y X2 es L o R (SEC ID NO: 32); y (c) HVR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos QQYYXiYPFT, donde X, es L o S (SEC ID NO: 33).

9. El anticuerpo de la reivindicación 6, el cual comprende además una o más secuencias estructurales de dominio variable de cadena pesada seleccionadas entre el grupo que consiste en SEC ID NO: 34-37.

10. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende (a) una secuencia VH que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno de SEC ID NOs: 1 a 11 ; (b) una secuencia VL que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de uno de SEC ID NOs: 12 a 22; o (c) una secuencia VH como en (a) y una secuencia VL como en (b).

11. El anticuerpo de la reivindicación 10, que comprende una secuencia VH de uno de SEC ID NOs: 1 a 11.

12. El anticuerpo de la reivindicación 10, que comprende una secuencia VL de uno de SEC ID NOs: 12 a 22.

13. Un anticuerpo que comprende una secuencia VH de uno de SEC ID NOs: 1 a 11 y una secuencia VL de uno de SEC ID NOs: 12 a 22.

14. El anticuerpo de la reivindicación 1 , el cual es un anticuerpo de lgG1 de longitud completa.

15. Acido nucleico aislado que codifica el anticuerpo de la reivindicación 1.

16. Una célula huésped que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 15.

17. Un método para producir un anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 16 de modo que se produzca el anticuerpo.

18. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 y un agente citotóxico.

19. Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

20. El anticuerpo de la reivindicación 1 para utilizar como un medicamento.

21. El anticuerpo de la reivindicación 1 para utilizar en el tratamiento de una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, Enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva.

22. El anticuerpo de la reivindicación 1 para utilizar en la potenciación de la actividad de Norrin y/o señalamiento de Norrin/Fzd4.

23. El uso del anticuerpo de la reivindicación 1 en la manufactura de un medicamento.

24. El uso de la reivindicación 23, donde el medicamento es para el tratamiento de una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, Enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva.

25. El uso de la reivindicación 23, donde el medicamento es para la potenciación de la actividad de Norrin y/o el señalamiento de Norrin/Fzd4.

26. Un método para tratar a un individuo que tiene una retinopatía que incluye retinopatía diabética proliferativa, CNV, AMD, retinopatía diabética y otras retinopatías relacionadas con isquemia, DME, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo, CRVO, BRVO, neovascularización córnea, neovascularización de la retina, ROP, FEVR, Enfermedad de Coats, Enfermedad de Norrie, OPPG (Síndrome de Osteoporosis-Pseudoglioma), hemorragia de la subconjuntiva, o retinopatía hipertensiva que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo de la reivindicación 1.

27. Un método para potenciar la actividad de Norrin y/o el señalamiento de Norrin/Fzd4 en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo de la reivindicación 1 para potenciar la actividad de Norrin y/o el señalamiento de Norrin/Fzd4.

28. Un método para rescatar un defecto de señalamiento en un individuo causado por mutación en Norrin y/o Fzd4 que comprende administrar el anticuerpo de la reivindicación 1.