MX2014006391A - Agentes terapéuticos que comprenden secuencias de aminoácidos de insulina. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere en parte a agentes que proporcionan una absorción lenta desde un sitio de inyección. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas comprenden una secuencia de aminoácidos de insulina y una secuencia de aminoácidos que proporciona absorción lenta desde un sitio de inyección, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que tiene un patrón de residuos de prolina sustancialmente repetitivo.

Description

AGENTES TERAPÉUTICOS QUE COMPRENDEN SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS DE INSULINA PRIORIDAD La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos N.° 61/563.985, presentada el 28 de noviembre de 2011, cuyo contenido se incorpora al presente en su totalidad por referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en parte a formas de insulina y a sus derivados con acción biológica prolongada.

DESCRIPCIÓN DEL ARCHIVO DE TEXTO PRESENTADO ELECTRÓNICAMENTE El contenido del archivo de texto presentado electrónicamente se incorpora al presente por referencia en su totalidad: Una copia en formato legible por computadora del listado de secuencias (nombre del archivo: PHAS_025_0lWO_SeqList_ST25.txt, fecha de grabación: 28 de noviembre de 2012, tamaño del archivo 38 kilobytes) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La eficacia de los fármacos de moléculas pequeñas y de péptidos suele verse limitada por la vida media de dichos fármacos en la circulación, asi como las dificultades para obtener niveles plasmáticos sustancialmente constantes. Por ejemplo, la incretina GLP-1 se debe administrar en dosis relativamente altas para contrarrestar la vida media corta en la circulación y estas dosis altas están asociadas con náuseas, entre otros. Murphy y Bloom, Nonpeptidic glucagon-like peptide 1 receptor agonists: A magic bullet for diabetes? PNAS 104 (3):689-690 (2007). Además, el agente peptidico péptido intestinal vasoactivo (VIP, por sus siglas en inglés) presenta una vida media, en algunas estimaciones, de menos de un minuto, lo que hace que este agente sea poco práctico para el uso farmacéutico. Domschke y col., Vasoactive intestinal peptide in man: pharmacokinetics, metabolic and circulatory effects, Gut 19:1049-1053 (1978); Henning y Sawmiller, Vasoactive intestinal peptide: cardiovascular effects, Cardiovascular Research 49:27-37 (2001) . La vida media plasmática corta de los fármacos peptidicos suele deberse al aclaramiento renal rápido asi como a la degradación enzimática durante la circulación sistémica .

La insulina, o sus derivados, presentan dificultades similares. La insulina permanece activa solo por un periodo breve antes de su degradación por las enzimas (p. ej . , la insulinasa) y, por lo tanto, presenta una vida media de solo aproximadamente 6 minutos. Además, la insulina puede ser absorbida rápidamente por un sujeto y, por lo tanto, el sujeto puede requerir dos o más inyecciones de insulina diarias, con un ajuste de las dosis según el autocontrol de los niveles de glucosa en sangre. Por otra parte, los picos y los valles en los niveles de insulina crean complicaciones significativas para los sujetos. Aún existe la necesidad de terapias de insulina que presenten absorción lenta de la circulación y que proporcionen un nivel de estado estacionario de control de la glucosa ampliado.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas basadas en insulina para liberación progresiva y métodos para administrar un régimen de tratamiento con las formulaciones de liberación progresiva. La invención proporciona asi una farmacocinética mejorada para las formulaciones farmacéuticas basadas en insulina.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica para proporcionar control glucémico prolongado que comprende una cantidad eficaz de una proteina, la cual proteina comprende una secuencia de aminoácidos de insulina y una secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva desde un sitio de inyección y excipientes farmacéuticos para lograr la liberación progresiva.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar la diabetes que comprenden administrar una composición farmacéutica para proporcionar control glucémico prolongado. La composición comprende una cantidad eficaz de una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos de insulina y una secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva desde un sitio de inyección y excipientes farmacéuticos para lograr la liberación progresiva en un paciente que lo necesita. En algunas realizaciones, el paciente tiene diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2. En algunas realizaciones, el método comprende administrar la composición farmacéutica con una frecuencia de entre 1 y aproximadamente 30 veces por mes, o aproximadamente una vez por semana, o aproximadamente dos o tres veces por semana, o aproximadamente una vez por día. En algunas realizaciones, el método comprende administrar la composición farmacéutica por vía subcutánea.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1A muestra la secuencia de la proinsulina humana (SEC. ID. N.°: 13) . La secuencia de la proinsulina consiste en las cadenas B y A unidas con el péptido C. Se retira el péptido C para formar insulina madura después de la escisión enzimática en los dos sitios dibásicos adyacentes (subrayado en cursiva) .

La figura IB muestra un diagrama de una construcción denominada PE0139 o INSUMERA o Insulina-ELPl-120 , que tiene 120 unidades de ELP fusionadas con el extremo carboxilo terminal de la cadena A.

La figura 2 muestra un mapa del plásmido pPE0139.

La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteina de fusión proinsulina ELP1-120 (SEC ID N.°: 14). La secuencia de la proinsulina (subrayada) está fusionada con la secuencia ELP1-120. La secuencia de aminoácidos opcionalmente incluye un residuo de metionina de iniciación en el extremo amino terminal.

La figura 4 muestra un experimento SDS-PAGE no reductor.

El SDS-PAGE no reductor mostró la disminución esperada del peso molecular de la proteina de fusión después del procesamiento enzimático a medida que se escindió el péptido C. Carril 1: estándar preteñido SEEBLUE® Plus2 ( INVITROGEN) , carril 2: ELP1-120, carril 3: Proinsulina ELP1-120, carril 4: Insulina ELP-120 3 µg, carril 5: Insulina ELP1-120 6 pg, carril 6: estándar preteñido SEEBLUE® Plus2 (INVITROGEN) .

La figura 5 muestra un análisis de transferencia Western de la cadena B antiinsulina. Se realizó un análisis de transferencia Western de la cadena B antiinsulina para confirmar la presencia de las cadenas A y B fusionadas a ELP. Los datos mostraron la presencia de la cadena B en condiciones no reductoras que indica la formación de un enlace disulfuro entre las cadenas A y B. La reducción de la proteina de fusión y de los enlaces disulfuro provocó la eliminación de la cadena B de la fusión. Carril 1: fusión de Insulina ELP que muestra la ausencia de la cadena B, carril 2: fusión de Insulina ELP no reductora que muestra la presencia de la cadena B, carril 3: ELP1-120, carril 4: fusión de Proinsulina ELP que muestra la presencia de la cadena B.

La figura 6 muestra los datos de ESI-MS sobre insulina-ELP1-120 sin procesar. La espectrometría de masas de ionización por electrospray confirmó la masa de fusión de Proinsulina ELP sin procesar de 57008.5 Da (códigos SGS Mscan 104531 y 104532). Estuvieron presentes otros aductos de sal adicionales .

La figura 7 muestra los datos de ESI-MS sobre pPE0139 procesada. La espectrometría de masas de ionización por electrospray confirmó la masa de la fusión de Insulina ELP madura después de la remoción enzimática del péptido C (códigos SGS M-scan 107610) . El ESI-MS de la Insulina ELP mostró un pico del producto principal con una masa molecular de aproximadamente 53298 Da que indica la Insulina ELP madura después de la escisión del péptido C. Los picos menores probablemente se atribuyan como una fusión degradada parcialmente o aductos de la sal.

La figura 8 muestra la reducción de la glucosa en la sangre en un ratón normal con fusión de Insulina-ELPl-120 en comparación con la insulina glargina.

La figura 9 muestra la dosificación de INSUMERA (PE0139) en un modelo de ratón de diabetes mellitus tipo 1 (diabetes tipo 1, T1D ) . Específicamente, se muestran los datos de dosis única. Los resultados demuestran una mayor duración de la reducción de la glucosa para INSUMERA, en comparación con la dosificación equimolar de LANTUS (insulina glargina, SANOFI-AVENTIS) . STZ es estreptozotocina; el grupo no tratado se refiere a animales normales, no diabéticos; N=8 por grupo.

La figura 10 muestra la dosificación de INSUMERA (PE0139) en un modelo de ratón de diabetes mellitus tipo 1 (diabetes tipo 1, T1DM) . Específicamente, se muestran los datos de dosificación diaria. Los resultados demuestran la superioridad de INSUMERA, en comparación con LANTUS ( insulina glargina, SANOFI-AVENTIS) , con respecto a la actividad y a la vida media. STZ es estreptozotocina; el grupo no tratado se refiere a animales no diabéticos, normales; en el momento 6h, N=5 para los grupos de 25 mg y 50 mg/kg; en el momento 8h, N=3 para el grupo de 25 mg/kg y n=2 para el grupo de 50 mg/kg; en el momento 24h, N=l para 25 mg/kg y N=7 para los grupos de 5 mg/kg.

La figura 11A muestra la titulación de dosis baja de INSUMERA (PE0139) en un modelo de ratón de diabetes mellitus tipo 1 (diabetes tipo 1, T1DM) en comparación con LANTUS (insulina glargina, SANOFI-AVENTIS) . Específicamente, la figura 11A muestra una única dosis s.c. STZ es estreptozotocina; el grupo no tratado se refiere a animales normales, no diabéticos; N=8 para LANTUS, PE0139 1 mg/kg y grupos no tratados; N=7 para el grupo PE0139 3,33 mg/kg.

La figura 11B muestra la titulación de dosis baja de INSUMERA (PE0139) en un modelo de ratón de diabetes mellitus tipo 1 (diabetes tipo 1, T1D ) en comparación con LANTUS (insulina glargina, SANOFI-AVENTIS) . Específicamente, la figura 11B muestra 14 días de dosificación s.c. diaria. STZ es estreptozotocina; el grupo no tratado se refiere a animales normales, no diabéticos; N=8 para LANTUS, PE0139 1 mg/kg y grupos no tratados; N=7 para el grupo PE0139 3,33 mg/kg.

La figura 12A muestra que INSUMERA (PE0139) tiene un control glucémico significativamente mejorado con relación al LANTUS (insulina glargina, SANOFI-AVENTIS ) . Se observa una reducción del 27-39% en la glucosa en la sangre del área bajo la curva (AUC) 1, 3, 7 y 14 con relación a Lantus. Específicamente, la figura 12A muestra el día 1 de la administración del compuesto y el AUC de la glucosa en sangre AUC a las 0-24h.

La figura 12B muestra que INSUMERA (PE0139) tiene un control glucémico significativamente mejorado con relación al LANTUS (insulina glargina, SANOFI-AVENTIS) . Se observa una reducción del 27-39% en la glucosa en la sangre del área bajo la curva (AUC) 1, 3, 7 y 14 con relación a Lantus. Específicamente, la figura 12B muestra el día 14 de la administración del compuesto y el AUC de la glucosa en sangre AUC a las 0-24h.

La figura 13A muestra que INSUMERA (PE0139) presenta una vida media prolongada con una pequeña proporción pico-valle después de una inyección subcutánea. Específicamente, la figura 13A muestra los niveles farmacocinéticos (PK) del fármaco después de una única inyección s.c. en porcinos diabéticos .

La figura 13B muestra que INSUMERA (PE0139) alcanza niveles farmacocinéticos (PK) pico-valle en estado estacionario después de inyecciones subcutáneas diarias. Específicamente, la figura 13B muestra inyecciones s.c. diarias en porcinos diabéticos durante 2 semanas; se miden los niveles PK antes de la dosificación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas basadas en insulina que presentan acción biológica prolongada. También se proporcionan métodos para tratar la enfermedad, incluida la hiperglucemia y la diabetes, con las composiciones de la presente invención.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica para proporcionar control glucémico prolongado que comprende una cantidad eficaz de una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos de insulina y una secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva desde un sitio de inyección y excipientes farmacéuticos para lograr la liberación progresiva.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de insulina comprende una secuencia de aminoácidos de cadena A y una de cadena B y la cadena A y la cadena B tienen la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.°: 13 (figura 1), que tiene opcionalmente de 1 a 8 inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos colectivamente. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos que proporciona una absorción lenta desde el sitio de inyección está unida por enlace covalente con la cadena A de insulina. En otra realización, la cadena A y la cadena B están unidas por uno o más enlaces disulfuro o están unidas a través de un péptido o conector químico.

En otra realización, la secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva tiene un patrón de residuos de prolina sustancialmente repetitivo. El patrón sustancialmente repetitivo puede formar una serie o patrón de giros ß. En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva es una secuencia de aminoácidos del péptido similar a elastina (ELP) . En otra realización, el ELP comprende repeticiones de VPGXG (SEC ID N.°: 3), en donde cada X se selecciona independientemente de residuos de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina. En otra realización, la secuencia de aminoácidos del ELP comprende repeticiones de AVGVP (SEC ID N.°: 4), IPGVG (SEC ID N.°: 6) o LPGVG (SEC ID N.°: 8). En diversas realizaciones, el ELP comprende al menos 15, o al menos 30, o al menos 60, o al menos 90, o al menos 120, o al menos 180 repeticiones de una unidad de aminoácido de ELP. En otra realización, la secuencia de aminoácidos del ELP tiene una tiene una temperatura de transición de casi 37 °C en solución salina normal.

En otra realización, la composición farmacéutica es una proteína de fusión. En otra realización, la composición farmacéutica comprende la SEC ID N.°: 14 (figura 3).

En otra realización, la secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva forma una estructura de espiral aleatorio o no globular extendida o un biopolímero sin estructura, incluido un biopolimero en el cual al menos el 50% de los aminoácidos carecen de una estructura secundaria como se determina por el algoritmo de Chou-Fasman. En otra realización, la secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva es una proteina que tiene una estructura extendida, no globular o una estructura de espiral aleatorio.

En otro aspecto, la invención proporciona métodos para tratar la diabetes que comprenden administrar la composición farmacéutica descrita en el presente a un paciente que lo necesita. En algunas realizaciones, el paciente tiene hiperglucemia, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 u obesidad. En algunas realizaciones, el método comprende administrar la composición farmacéutica con una frecuencia de entre 1 y aproximadamente 30 veces por mes, o aproximadamente una vez por semana, o aproximadamente dos o tres veces por semana, o aproximadamente una vez por dia. En algunas realizaciones, el método comprende administrar la composición farmacéutica por vía subcutánea.

Secuencias de aminoácidos de insulina Se pueden utilizar inyecciones de insulina, p. ej . de insulina humana, para tratar la diabetes. Las células productoras de insulina del cuerpo se denominan células ß y se encuentran en la glándula del páncreas. Estas células se agrupan para formar los "islotes de Langerhans" que llevan el nombre del estudiante de medicina alemán que las describió.

La síntesis de la insulina comienza en la traducción del gen de la insulina, que reside en el cromosoma 11. Durante la traducción, se eliminan dos intrones del producto de ARNm, que codifica una proteina de 110 aminoácidos de longitud. Este producto de traducción primario se denomina preproinsulina y es inactivo. Contiene un péptido señal de 24 aminoácidos de longitud, que es necesario para que la proteina atraviese la membrana celular. La proinsulina humana consiste en cadenas A y B unidas con el péptido C de 31 aminoácidos (figura 1) .

Una vez que la preproinsulina alcanza el reticulo endoplásmico, se escinde una proteasa del péptido señal para crear la proinsulina. Específicamente, una vez que se forman enlaces disulfuro entre las cadenas A y B, la proinsulina se convierte en insulina madura in vivo mediante la remoción del péptido C por un sistema similar a tripsina/carboxipeptidasa B. La proinsulina consiste en tres dominios: una cadena B aminoterminal, una cadena A carboxiloterminal y un péptido conector en el medio conocido como el péptido C. La insulina está compuesta por dos cadenas de aminoácidos denominadas cadena A (21 aminoácidos - GIVEQCCASVCSLYQLENYCN) (SEC ID N.°: 15) y cadena B (30 aminoácidos FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKA) (SEC ID N.°: 16), que están unidas por dos puentes disulfuro. Hay un 3o puente disulfuro dentro de la cadena A que une al 6° residuo con el 11° residuo de la cadena A. En la mayoría de las especies, la longitud y las composiciones de los aminoácidos de las cadenas A y B son similares, y las posiciones de los tres enlaces disulfuro son altamente conservadas. Por este motivo, la insulina de cerdo puede reemplazar los niveles de insulina humanos deficientes en los pacientes diabéticos. En la actualidad, la insulina porcina se ha reemplazado en gran medida por la producción masiva de proinsulina humana por bacterias (insulina recombinante) .

Las moléculas de insulina tienden a formar dímeros en solución y en presencia de iones de zinc, los dímeros de insulina se asocian en hexámeros. Mientras que los monómeros de la insulina se difunden fácilmente a través de la sangre y tienen un efecto rápido, los hexámeros se difunden lentamente y tienen un retraso en el inicio de la acción. En el diseño de la insulina recombinante, se puede modificar la estructura de la insulina para reducir la tendencia de la molécula de insulina a formar dímeros y hexámeros, pero de modo que no se interrumpa la unión con el receptor de insulina. De este modo, se realiza una serie de preparaciones, que van desde la acción rápida a la acción prolongada.

Dentro del retículo endoplásmico, la proinsulina se expone a varias peptidasas específicas que eliminan el péptido C y que generan la forma madura y activa de la insulina. En el aparato de Golgi, la insulina y el péptido C libre se empaquetan en gránulos secretores, que se acumulan en el citoplasma de las células ß. La exocitosis de los gránulos es activada por el ingreso de glucosa en las células beta. La secreción de insulina tiene un efecto amplio sobre el metabolismo.

Existen dos fases de liberación de insulina en respuesta a un aumento en la glucosa. La primera es una liberación inmediata de insulina. Esto se atribuye a la liberación de la insulina preformada, que se almacena en gránulos secretores. Después de un retraso breve, hay una segunda liberación más prolongada de insulina recién sintetizada.

Una vez liberada, la insulina permanece activa solo durante un momento antes de ser degrada por las enzimas. La insulinasa que se encuentra en el hígado y en los ríñones descompone la insulina que circula en el plasma y, como consecuencia, la insulina tiene una vida media de solo aproximadamente 6 minutos. Esta breve duración de la acción produce cambios rápidos en los niveles circulantes de insulina .

Se han desarrollado análogos de la insulina con propiedades terapéuticas mejoradas (Owens y col., 2001, Lancet 358: 739-46; Vajo y col., 2001, Endocr Rev 22: 706-17) y estos análogos se pueden utilizar con relación a la presente invención. Se utilizan diversas estrategias, incluida la elongación del extremo terminal COOH de la cadena B de insulina y el diseño de insulinas aciladas con ácidos grasos con afinidad sustancial por la albúmina para generar análogos de insulina con acción más prolongada. Sin embargo, los tratamientos in vivo con los compuestos de insulina de acción más prolongada disponibles aún producen una alta frecuencia de excursiones de hipo e hiperglucemia y una reducción leve de la HbAlc. En consecuencia, el desarrollo de un análogo de la insulina realmente estable y de acción prolongada sigue siendo una tarea importante.

Los análogos funcionales de la insulina que se pueden utilizar de acuerdo con la invención incluyen análogos de acción rápida como lispro, aspart y glulisina, que se absorben rápidamente (< 30 minutos) después de la inyección subcutánea, alcanzan el pico a la hora y tienen una duración de la acción relativamente corta (3 a 4 horas) . Además, se han desarrollado dos análogos de la insulina de acción prolongada: glargina y detemir, que se pueden utilizar con relación a la invención. Los análogos de la insulina de acción prolongada tienen un inicio de la acción de aproximadamente dos horas y alcanzan una meseta de acción biológica a las 4 a 6 horas y pueden durar hasta 24 horas.

Por lo tanto, en una realización, la secuencia de aminoácidos de insulina puede contener la cadena A y/o B de lispro (también denominado HUMALOG, Eli Lilly) . La insulina lispro difiere de la insulina humana por la sustitución de prolina por lisina en la posición 28 y la sustitución de lisina por prolina en la posición 29 de la cadena B de insulina. Aunque estas modificaciones no alteran la unión al receptor, ayudan a bloquear la formación de dimeros y hexámeros de insulina, lo que permite que haya mayores cantidades de insulina monomérica activa disponibles para las inyecciones postprandiales .

En otra realización, la secuencia de aminoácidos de insulina puede contener una cadena A y/o B de aspart (también denominado NOVOLOG, Novo Nordisk) . La insulina aspart está diseñada con el único reemplazo del aminoácido prolina por ácido aspártico en la posición 28 de la cadena B de insulina humana. Esta modificación ayuda a bloquear la formación de hexámeros de insulina, lo que crea una insulina de acción más rápida · En otra realización, la secuencia de aminoácidos de insulina puede contener una cadena A y/o B de glulisina (también denominada APIDRA, Sanofi-Aventis) . La insulina glulisina es un análogo de acción rápida creado mediante la sustitución de la asparagina en la posición 3 por lisina y de la lisina en la posición 29 por glutamina de la cadena B de insulina humana. La insulina glulisina tiene un inicio de la acción más rápido y una duración de la acción más breve en comparación con la insulina humana normal.

En otra realización, la secuencia de aminoácidos de insulina puede contener una cadena A y/o B de glargina (también denominada LANTUS, Sanofi-Aventis ) . LANTUS presenta absorción retrasada debido a su pH ácido que provoca la formación microprecipitada de cristales de insulina en presencia de pH fisiológico neutral. La insulina glargina difiere de la insulina humana en que se reemplaza el aminoácido asparagina en la posición 21 de la cadena A por glicina y se añaden dos argininas al extremo carboxilo terminal de la cadena B. En comparación con la insulina protamina neutra Hagedorn (NPH) para tomar antes de ir a dormir (una insulina de acción intermedia) , la insulina glargina está asociada con menos hipoglucemia nocturna en los pacientes con diabetes tipo 2.

En otra realización, la secuencia de aminoácidos de insulina puede contener una cadena A y/o B de detemir (también denominado LEVEMIR, Novo Nordisk) . La insulina detemir es un análogo de la insulina de acción prolongada, soluble (a pH neutro) , en la cual se elimina el aminoácido treonina en B30 y se acetila un ácido graso de miristoilo de 14 carbonos con el grupo épsilon-amino de LysB29. Después de la inyección subcutánea, se disocia el detemir, mediante lo cual se expone el ácido graso libre que permite la unión reversible con las moléculas de albúmina. Por lo tanto, en estado estacionario, se reduce en gran medida la concentración de insulina libre no unida, lo que produce niveles estables de glucosa plasmática.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de insulina puede ser un análogo de insulina de cadena única (SIA) (p. ej . , como se describe en la patente de Estados Unidos 6.630.438 y WO 2008/019368, que se incorporan al presente por referencia en su totalidad) . Los análogos de insulina de cadena única abarcan un grupo de proteínas relacionadas estructuralmente en donde las cadenas A y B se unen por enlace covalente por un conector polipeptidico . El conector polipeptidico conecta el extremo carboxilo terminal de la cadena B con el extremo amino terminal de la cadena A. El conector puede ser de cualquier longitud siempre que proporcione la conformación estructural necesaria para que el SIA tenga un efecto de unión al receptor de insulina y captación de glucosa. En algunas realizaciones, el conector es de aproximadamente 5-18 aminoácidos de longitud. En otras realizaciones, el conector es de aproximadamente 9-15 aminoácidos de longitud. En determinadas realizaciones, el conector es de aproximadamente 12 aminoácidos de longitud. En determinadas realizaciones ejemplares, el conector tiene la secuencia KDDNPNLPRLVR (SEC ID N.°: 17) o GAGSSSRRAPQT (SEC ID N.°: 18). Sin embargo, se debe entender que son posibles muchas variaciones de esta secuencia, por ejemplo, de longitud (adiciones y eliminaciones) y sustituciones de aminoácidos sin afectar sustancialmente la eficacia del SIA producido sobre la captación de glucosa y las actividades de unión al receptor de insulina. Por ejemplo, se pueden añadir o eliminar varios residuos de aminoácidos diferentes de cualquiera de los extremos sin disminuir sustancialmente la actividad del SIA producido.

Un análogo de la insulina de cadena única ejemplar que se encuentra actualmente en desarrollo clínico es la albulina (Duttaroy y col., 2005, Diabetes 54: 251-8). Se puede producir la albulina en la levadura o en células mamiferas. Consiste en las cadenas B y A de la insulina humana (100% de identidad con la insulina humana nativa) unidas por un conector dodecapeptidico y fusionadas con las terminales NH2 de la seroalbúmina humana natural. Para la expresión y la purificación de la albulina, Duttaroy y col. construyeron un constructo genético sintético codificante de una insulina de cadena única que contenia la cadena B- y A- de la insulina humana madura unidas por un conector dodecapeptidico que utiliza cuatro cebadores superpuestos y amplificación de PCR. El producto resultante de PCR estaba ligado en marco entre el péptido señal de la seroalbúmina humana (HSA) y el terminal NH2 de la HSA madura, presente dentro de un vector pSAC35 para la expresión en la levadura. De acuerdo con la presente invención, el componente HSA de la abulina se puede reemplazar por una secuencia de aminoácidos que proporciona liberación progresiva como se describe en el presente.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una secuencia de aminoácidos que proporciona liberación progresiva, incluido, por ejemplo, un péptido similar a elastina (ELP) y una secuencia de aminoácidos de insulina. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la insulina es una insulina mamifera, como insulina humana o insulina porcina. De acuerdo con la invención, la secuencia de aminoácidos que proporciona un componente de liberación progresiva puede estar acoplada (p. ej . , por fusión recombinante o conjugación química) con la cadena A o la cadena B de la insulina o con ambas. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos que proporciona una absorción lenta desde el sitio de inyección está unida por enlace covalente con la cadena A de insulina. La insulina puede comprender cada una de las cadenas A, B y C (SEC ID N.°: 19 y 20) o puede contener una forma procesada, que contiene solo las cadenas A y B.. En algunas realizaciones, las cadenas A y B están conectadas por un péptido de unión corto, para crear una insulina de cadena única. La insulina puede ser un análogo funcional de la insulina humana, incluido fragmentos funcionales truncados en el extremo amino terminal y/o en el extremo carboxilo terminal (de una o ambas cadenas A y B) por de 1 a 10 aminoácidos, incluido por 1, 2, 3 o aproximadamente 5 aminoácidos. Los análogos funcionales pueden contener de 1 a 10 inserciones, eliminaciones y/o sustituciones de aminoácidos (colectivamente) con respecto a la secuencia nativa (p. ej . , SEC ID N.°: 15 y 16) y en cada caso mantienen la actividad del péptido. Por ejemplo, los análogos funcionales pueden tener 1, 2, 3, 4 o 5 inserciones, eliminaciones y/o sustituciones de aminoácidos (colectivamente) con respecto a la secuencia nativa (que puede contener cadenas A y B, o cadenas A, B y C) . Esta actividad se puede confirmar o analizar utilizando cualquier ensayo disponible, incluidos los que se describen en el presente. En estas u otras realizaciones, el componente de insulina tiene al menos aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o el 98% de identidad con cada una de las secuencias nativas para las cadenas A y B (SEC ID N.°:15 y 16) . La determinación de la identidad de secuencia entre dos secuencias (p. ej . , entre una secuencia nativa y un análogo funcional) se puede lograr utilizando cualquier herramienta de alineación, incluido Tatusova y col., Blast 2 sequences -a new tool for comparing protein and nucleotide sequences, FE S Microbiol Lett . 174:247-250 (1999). El componente de insulina puede contener modificaciones químicas adicionales conocidas en la técnica.

Para caracterizar las propiedades de unión in vitro de un análogo de insulina o de una secuencia de aminoácidos que proporciona un análogo de insulina que contiene liberación progresiva, se pueden realizar ensayos de unión de competición en diversas líneas celulares que expresan el receptor de insulina (Jehle y col., 1996, Diabetologia 39: 421-432) . Por ejemplo, se pueden emplear ensayos de unión de competición que utilizan células CHO con sobreexpresión del receptor de insulina humana. La insulina también se puede unir al receptor IGF-1 con una menor afinidad que al receptor de insulina. Para determinar la afinidad de unión de una secuencia de aminoácidos que proporciona un análogo de insulina que contiene liberación progresiva, se puede realizar un ensayo de unión de competición con IGF-1 marcado con 1251 en células L6.

Las actividades de la insulina incluyen la estimulación de la eliminación de glucosa periférica e inhibición de la producción de glucosa hepática. La capacidad de una secuencia de aminoácidos que proporciona un análogo de insulina que contiene liberación progresiva de mediar estas actividades biológicas se puede analizar in vitro empleando las metodologías conocidas. Por ejemplo, se puede medir el efecto de una secuencia de aminoácidos que proporciona un análogo que contiene liberación progresiva sobre la captación de glucosa en adipocitos 3T3-L1 y comparar con el de la insulina. El pretratamiento de las células con un análogo biológicamente activo generalmente produce un aumento dependiente de la dosis en la captación de 2-desoxiglucosa . La capacidad de una secuencia de aminoácidos que proporciona un análogo de insulina que contiene liberación progresiva de regular la producción de glucosa se puede medir en cualquier cantidad de tipos de células, por ejemplo, células de hepatoma H4IIe. En este ensayo, el pretratamiento con un análogo biológicamente activo generalmente produce una inhibición dependiente de la dosis de la cantidad de glucosa liberada .

Secuencias de ami oácidos que proporcionan liberación progresiva En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación progresiva comprende unidades estructurales que forman enlaces de hidrógeno a través de grupos de la estructura principal y/o de cadenas laterales de proteínas y que pueden aportar interacciones hidrófobas a la formación de la matriz. En algunas realizaciones, las cadenas laterales de aminoácidos no contienen grupos donantes de enlaces de hidrógeno, con los enlaces de hidrógeno formados sustancialmente a través de la estructura principal de la proteína. Los aminoácidos ejemplares incluyen prolina, alanina, valina, glicina e isoleucina y aminoácidos similares. En algunas realizaciones, las unidades estructurales son unidades estructurales sustancialmente repetitivas, para crear un motivo estructural sustancialmente repetitivo, y una capacidad de formación de enlaces de hidrógeno sustancialmente repetitiva. En estas y otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos comprende al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 40% o al menos el 50% de prolina, que se puede ubicar en un patrón sustancialmente repetitivo. El patrón sustancialmente repetitivo de la prolina puede crear una estructura de giros ß repetitiva. En este contexto, un patrón sustancialmente repetitivo significa que al menos el 50% o al menos el 75% de los residuos de prolina de la secuencia de aminoácidos forman parte de una unidad estructural definible. En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos comprende amino cidos con cadenas laterales donantes de enlaces de hidrogeno, como serina, treonina y/o tirosina. En algunas realizaciones, la secuencia repetitiva puede contener de uno a aproximadamente cuatro residuos de prolina, con los residuos restantes seleccionados independientemente de residuos no polares, como glicina, alanina, leucina, isoleucina y valina. Los residuos no polares o hidrófobos pueden aportar interacciones hidrófobas a la formación de la matriz.

Las secuencias de aminoácidos pueden formar un estado "similar a un gel" luego de la inyección a una temperatura superior que la temperatura de almacenamiento. Las secuencias ejemplares tienen unidades peptidicas repetitivas y/o pueden ser relativamente no estructuradas a la temperatura inferior y lograr un estado estructurado con enlaces de hidrógeno a la temperatura superior.

En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz a temperatura corporal es un péptido que tiene unidades repetitivas de entre cuatro y diez aminoácidos. La unidad repetitiva puede formar uno, dos o tres enlaces de hidrógeno en la formación de la matriz. En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz a temperatura corporal es una secuencia de aminoácidos de seda, elastina, colágeno o keratina, o una imitación de estos, o una secuencia de aminoácidos divulgada en la patentes de Estados Unidos 6.355.776, que se incorpora al presente por referencia.

En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos es una secuencia de una proteína similar a elastina (ELP) . La secuencia de ELP comprende o consiste en unidades peptídicas estructurales o secuencias que están relacionadas o que imitan a la proteína de la elastina. La secuencia de ELP se construye a partir de unidades estructurales de entre tres y aproximadamente veinte aminoácidos o, en algunas realizaciones, de entre cuatro y diez aminoácidos, como cuatro, cinco o seis aminoácidos. La longitud de las unidades estructurales individuales puede variar o puede ser uniforme. Las unidades estructurales ejemplares incluyen unidades definidas por SEC ID N.°: 1-12 (abajo), que se pueden emplear como unidades estructurales repetitivas, incluido unidades repetitivas en tándem o se pueden emplear en alguna combinación. Por lo tanto, ELP puede comprender o consistir esencialmente en unidades estructurales seleccionadas de SEC ID N.°: 1-12, como se define a continuación.

En algunas realizaciones, incluido las realizaciones en las cuales las unidades estructurales son unidades de ELP, la secuencia de aminoácidos comprende o consiste esencialmente en entre aproximadamente 10 y aproximadamente 500 unidades estructurales o, en determinadas realizaciones, en entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200 unidades estructurales, o en determinadas realizaciones, en entre aproximadamente 80 y aproximadamente 200 unidades estructurales, o en entre aproximadamente 80 y aproximadamente 150 unidades estructurales, como uno o una combinación de unidades definidas por la SEC ID N.°: 1-12. Por lo tanto, las unidades estructurales colectivamente pueden tener una longitud de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 2000 residuos de aminoácidos, o entre aproximadamente 100 y aproximadamente 800 residuos de aminoácidos, o entre aproximadamente 200 y aproximadamente 700 residuos de aminoácidos, o entre aproximadamente 400 y aproximadamente 600 residuos de aminoácidos.

La secuencia de aminoácidos puede presentar una transición de fase inversa reversible y visible con la formulación seleccionada. Es decir, la secuencia de aminoácidos puede ser desordenada estructuralmente y altamente soluble en la formulación por debajo de una temperatura de transición (Tt), pero presentar una transición de fase desordenada a ordenada brusca (intervalo 2-3 °C) cuando la temperatura de la formulación supera la Tt . Además de la temperatura, la longitud del polímero de aminoácidos, la composición de aminoácidos, la fuerza iónica, el pH, la presión, la temperatura, los disolventes seleccionados, la presencia de solutos orgánicos y la concentración de la proteína también pueden afectar las propiedades de transición y estas se pueden ajusfar en la formulación para obtener el perfil de absorción deseado. El perfil de absorción se puede evaluar fácilmente mediante la determinación de la concentración en plasma o de la actividad de la secuencia de aminoácidos de insulina en el tiempo.

En determinadas realizaciones, los componentes de ELP pueden estar formados de unidades estructurales, incluido, entre otros: (a) el tetrapéptido Val-Pro-Gly-Gly o VPGG (SEC ID N.°: 1) ; (b) el tetrapéptido Ile-Pro-Gly-Gly o IPGG (SEC ID N.°: 2 ) ; (c) el pentapéptido Val-Pro-Gly-X-Gly (SEC ID N.°: 3) o VPGXG, en donde X es cualquier residuo de aminoácidos natural o no natural y en donde X varía opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas (d) el pentapéptido Ala-Val-Gly-Val-Pro o AVGVP (SEC ID .0 : 4 ) ; (e) el pentapéptido Ile-Pro-Gly-X-Gly o IPGXG (SEC ID N.°: 5), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos natural o no natural y en donde X varia opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas; (f) el pentapéptido Ile-Pro-Gly-Val-Gly o IPGVG (SEC ID . ° : 6 ) ; (g) el pentapéptido Leu-Pro-Gly-X-Gly o LPGXG (SEC ID N.°: 7), en donde X es cualquier residuo de aminoácidos natural o no natural y en donde X varia opcionalmente entre repeticiones poliméricas u oligoméricas; (h) el pentapéptido Leu-Pro-Gly-Val-Gly o LPGVG (SEC ID N . ° : 8 ) ; (i) el hexapéptido Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly o VAPGVG (SEC ID N. ° : 9) ; (j) el octapéptido Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Val-Gly o GVGVPGVG (SEC ID N.°: 10); (k) el nonapéptido Val-Pro-Gly-Phe-Gly-Val-Gly-Ala-Gly o VPGFGVGAG (SEC ID N.°: 11); y (1) los nonapéptidos Val-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Pro-Gly-Gly o VPGVGVPGG (SEC ID N.°: 12) .

Estas unidades estructurales definidas por SEC ID N.°: 1-12 pueden formar unidades de repetición estructurales o se pueden utilizar en combinación para formar un ELP. En algunas realizaciones, el componente de ELP se forma enteramente (o casi enteramente) de uno o de una combinación de (p. ej . , 2, 3 o 4) unidades estructurales seleccionadas de SEC ID N.°: 1-12. En otras realizaciones, al menos el 75%, o al menos el 80%, o al menos el 90% del componente de ELP se forma a partir de una o de una combinación de unidades estructurales seleccionadas de SEC ID N.°: 1-12 y que pueden estar presentes como unidades repetitivas.

En determinadas realizaciones, el ELP comprende unidades de repetición, incluidas unidades repetitivas en tándem, de Val-Pro-Gly-X-Gly (SEC ID N.°: 3), en donde X es como se definió anteriormente y en donde el porcentaje de unidades de Val-Pro-Gly-X-Gly (SEC ID N.°: 3) tomado con respecto al componente de ELP completo (que puede comprender unidades estructurales diferentes de VPGXG (SEC ID N.°: 3)) es mayor que aproximadamente el 50%, o mayor que aproximadamente el 75%, o mayor que aproximadamente el 85%, o mayor que aproximadamente el 95% del ELP. El ELP puede contener motivos de 5 a 15 unidades estructurales (p. ej . , aproximadamente 10 unidades estructurales) de SEC ID N.°: 3, con el residuo huésped X variando entre al menos 2 o al menos 3 de las unidades en el motivo. Los residuos huéspedes se pueden seleccionar de forma independiente, como de residuos no polares o hidrófobos, como los aminoácidos V, I, L, A, G y W (y se pueden seleccionar de modo que mantengan una propiedad de transición de fase inversa deseada) .

En algunas realizaciones, el ELP puede formar una estructura de giros ß. Se describen secuencias de péptidos ejemplares adecuadas para crear una estructura de giros ß en la solicitud de patente internacional PCT/US96/05186, que se incorpora al presente por referencia en su totalidad. Por ejemplo, se puede modificar el cuarto residuo (X) en la secuencia VPGXG (SEC ID N.°: 3) sin eliminar la formación de un giro ß.

Se puede describir la estructura de ELP ejemplares utilizando la notación ELPk [XiYj-n], en donde k designa una unidad de repetición de ELP especifica, las letras mayúsculas entre paréntesis son códigos de aminoácidos de letra única y sus subíndices correspondientes designan la proporción relativa de cada residuo huésped X en las unidades estructurales (cuando corresponde) y n describe la longitud total del ELP en cantidad de repeticiones estructurales. Por ejemplo, ELP1 [V5A2G3-10] designa un componente de ELP que contiene 10 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEC ID N.°: 3), en donde X es valina, alanina y glicina en una proporción relativa de aproximadamente 5:2:3; ELPl [K1V2F1-4] designa un componente de ELP que contiene 4 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEC ID N.°: 3), en donde X es lisina, valina y fenilalanina en una proporción relativa de aproximadamente 1:2:1; ELP1 [K1V7F1-9] designa un polipéptido que contiene 9 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEC ID N.°: 3), en donde X es lisina, valina y fenilalanina en una proporción relativa de aproximadamente 1:7:1; ELP1 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEC ID N.°:3), en donde X es valina; ELP1 [V-20] designa un polipéptido que contiene 20 unidades de repetición del pentapéptido VPGXG (SEC ID N.°: 3), en donde X es valina; ELP2 [5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades de repetición del pentapéptido AVGVP (SEC ID N.°: 4); ELP3 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades de repetición del pentapéptido IPGXG (SEC ID N.°: 5), en donde X es valina; ELP4 [V-5] designa un polipéptido que contiene 5 unidades de repetición del pentapéptido LPGXG (SEC ID N.°: 7), en donde X es valina.

Con respecto a ELP, la Tt depende de la hidrofobicidad del residuo huésped. Por lo tanto, al variar la identidad de los residuos huéspedes y sus fracciones molares, se pueden sintetizar ELP que presentan una transición inversa en un intervalo amplio. Por lo tanto, se puede disminuir la Tt en una longitud de ELP determinada mediante la incorporación de una fracción mayor de residuos de huéspedes hidrófobos en la secuencia de ELP. Algunos ejemplos de residuos huéspedes hidrófobos adecuados incluyen valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, triptofano y metionina. También se puede utilizar la tirosina, que es moderadamente hidrófoba. Contrariamente, se puede aumentar la Tt mediante la incorporación de residuos, como los que se seleccionan de: ácido glutámico, cisteina, lisina, aspartato, alanina, asparagina, serina, treonina, glicina, arginina y glutamina.

Para los polipéptidos que tienen un peso molecular > 100.000, la escala de hidrofobicidad presentada en PCT/US96/05186 (que se incorpora al presente por referencia en su totalidad) proporciona un medio para predecir la Tt aproximada de una secuencia de ELP especifica. Para los polipéptidos que tienen un peso molecular <100.000, se puede predecir o determinar la Tt mediante la siguiente función cuadrática: Tt = 0 + M1X + M2X2 en donde X es el MW de la proteina de fusión y 0 = 116,21; MI = -1,7499; M2 = 0,010349.

En algunas realizaciones, ELP se selecciona o se designa para proporcionar una Tt que oscila entre aproximadamente 10 y aproximadamente 37 °C en condiciones de formulación, como entre aproximadamente 20 y aproximadamente 37 °C, o entre aproximadamente 25 y aproximadamente 37 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de transición en condiciones fisiológicas (p. ej . , solución salina 0,9%) es de entre aproximadamente 34 a 36 °C, para considerar una temperatura periférica levemente inferior.

En determinadas realizaciones, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz con enlaces de hidrógeno a temperatura corporal comprende [VPGXG] 90 (SEC ID N.°: 31), en donde cada X se selecciona de V, G y A, y en donde la proporción de V:G:A puede ser aproximadamente 5:3:2. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz con enlaces de hidrógeno a temperatura corporal puede comprender [VPGXG] 120 (SEC ID N.°: 32), en donde cada X se selecciona de V, G y A, y en donde la proporción de V:G:A puede ser aproximadamente 5:3:2. Como se muestra aquí, 120 unidades estructurales de este ELP pueden proporcionar una temperatura de transición de aproximadamente 37 °C con aproximadamente 5 a 15 mg/ml (p. ej . , aproximadamente 10 mg/ml) de proteina. En concentraciones de aproximadamente 40 a aproximadamente 100 mg/mL, la temperatura de transición de fases es aproximadamente 35 grados centígrados (apenas inferior a la temperatura corporal) , lo que permite que la temperatura corporal periférica sea apenas inferior que 37 °C.

Alternativamente, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz a temperatura corporal comprende [VPGVG] 90 (SEC ID N.°: 31) o [VPGVG] 120 (SEC ID N.°: 32) . Como se muestra aquí, 120 unidades estructurales de este ELP pueden proporcionar una temperatura de transición de aproximadamente 37 °C con aproximadamente 0, 005 a 0,05 mg/ml (p. ej . , aproximadamente 0,01 mg/ml) de proteína.

Los polímeros de proteínas de péptido similar a elastina (ELP) y las proteínas de fusión recombinantes se pueden preparar como se describen en la publicación de la patente estadounidense N.° 2010/0022455, que se incorpora al presente por referencia.

En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz a temperatura corporal puede incluir un espiral aleatorio o una estructura no globular extendida. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz a temperatura corporal puede comprender una secuencia de aminoácidos divulgada en la publicación de la patente estadounidense N.° 2008/0286808, la publicación de la patente IPO N.° 2008/155134 y la publicación de la patente estadounidense N.° 2011/0123487, las cuales se incorporan al presente por referencia en su totalidad. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz a temperatura corporal puede estar compuesta predominantemente de prolina con uno o más de residuos de serina, alanina y glicina. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz a temperatura corporal es el 50%, o el 60%, o el 70%, o el 75%, o el 80%, o el 90% de residuos de prolina, serina, alanina y glicina (colectivamente) .

Por ejemplo, en algunas realizaciones la secuencia de aminoácidos comprende un polímero recombinante no estructurado de al menos 40 aminoácidos. Por ejemplo, se puede definir el polímero no estructurado en donde la suma de los residuos de glicina (G) , aspartato (D) , alanina (A) , serina (S) , treonina (T) , glutamato (E) y prolina (P) presentes en el polímero no estructurado constituya más de aproximadamente el 80% de los aminoácidos totales. En algunas realizaciones, al menos el 50% de los aminoácidos carecen de estructura secundaria según lo determinado por el algoritmo de Chou-Fasman. El polímero no estructurado puede comprender más de aproximadamente 100, 150, 200 o más aminoácidos contiguos. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos forma un dominio de espiral aleatorio. En particular, un polipéptido o polímero de aminoácidos que tiene o que forma una "conformación espiral aleatoria" sustancialmente carece de una estructura secundaria y terciaria definida.

En diversas realizaciones, el sujeto objetivo es un ser humano y la temperatura corporal es aproximadamente 37 °C y, por lo tanto, se designa la composición farmacéutica para proporcionar una liberación progresiva a esta temperatura. Una liberación lenta a la circulación con inversión de la formación de enlaces de hidrógeno y/o interacciones hidrófobas es impulsada por una caida en la concentración a medida que el producto se difunde en el sitio de inyección, aunque la temperatura corporal permanezca constante. En otras realizaciones, el sujeto es un mamífero no humano y se designa la composición farmacéutica para presentar una liberación progresiva a la temperatura corporal del mamífero, que puede ser de aproximadamente 30 a aproximadamente 40 °C en algunas realizaciones, como para determinadas mascotas domésticas (p. ej . , perro o gato) o ganado (p. ej . , vacas, caballos, ovejas o cerdos) . Generalmente, la Tt es superior que las condiciones de almacenamiento de la formulación (que pueden ser de 10 a aproximadamente 25 °C o de 15 a 22 °C) , de modo que la composición farmacéutica permanece en solución durante la inyección.

En algunas realizaciones, la liberación lenta se efectúa mediante la administración de formulaciones frías (p. ej . , 2-15 °C o 2-10 °C o 2-5 °C) de las composiciones farmacéuticas de la presente invención. En consecuencia, en algunas realizaciones, se proporcionan formulaciones frías. Las formulaciones frías se pueden administrar a entre aproximadamente 2 y aproximadamente 3 °C, aproximadamente 2 y aproximadamente 4 °C, aproximadamente 2 y aproximadamente 5 °C, aproximadamente 2 y aproximadamente 6 °C, aproximadamente 2 y aproximadamente 7 °C, aproximadamente 2 y aproximadamente 8 °C, aproximadamente 2 y aproximadamente 10 °C, aproximadamente 2 y aproximadamente 12 °C, aproximadamente 2 y aproximadamente 14 °C, aproximadamente 2 y aproximadamente 15 °C , aproximadamente 2 y aproximadamente 16 °C, aproximadamente 2 y aproximadamente 20 °C, aproximadamente 10 y aproximadamente 25 °C o entre 15 y 22 °C.

La composición farmacéutica, generalmente, es para "administración sistémica", lo que significa que el agente no se administra localmente a un sitio patológico o a un sitio de acción. En cambio, el agente es absorbido por el torrente sanguíneo desde el sitio de inyección, en donde el agente actúa sistémicamente o es transportado a un sitio de acción a través de la circulación.

Liberación progresiva En un aspecto, la invención proporciona una formulación farmacéutica de liberación progresiva. La formulación comprende una composición farmacéutica para administración sistémica, en donde la composición farmacéutica comprende una secuencia de aminoácidos de insulina y una secuencia de aminoácidos capaz de formar una matriz reversible (es decir, una secuencia de aminoácidos que proporcione liberación progresiva) a la temperatura corporal de un sujeto como se describe en el presente. La matriz reversible está formada por enlaces de hidrógeno (p. ej . , enlaces de hidrógeno intra y/o intermoleculares) asi como por contribuciones hidrófobas. La formulación además comprende uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables que inducen la formación de la matriz después de la administración. La matriz proporciona una absorción lenta a la circulación desde un sitio de inyección. La liberación progresiva, o absorción lenta desde el sitio de inyección, se debe a una inversión lenta de la matriz a medida que la concentración se disipa en el sitio de inyección. Una vez que el producto pasa a la circulación, la formulación proporciona una vida media prolongada y estabilidad mejorada. Por lo tanto, se obtiene una combinación única de absorción lenta y vida media prolongada, lo que conduce a un perfil PK deseable con una proporción pico-valle poco profunda y/o Tmax largo.

Específicamente, la invención proporciona una farmacocinética mejorada para los fármacos peptídicos como las secuencias de aminoácidos de insulina, incluido un perfil PK relativamente uniforme con una proporción pico-valle baja y/o un Tmax largo. Se puede mantener el perfil PK con un plan de administración relativamente poco frecuente, como de una a ocho inyecciones por mes en algunas realizaciones.

En un aspecto, la invención proporciona una formulación farmacéutica de liberación progresiva. La formulación comprende una composición farmacéutica para administración sistémica, en donde la composición farmacéutica comprende una secuencia de aminoácidos de insulina y una secuencia de aminoácidos capaz de formar una matriz a la temperatura corporal de un sujeto. La matriz reversible está formada por enlaces de hidrógeno (p. ej . , enlaces de hidrógeno intra y/o intermoleculares) así como por contribuciones hidrófobas. La formulación además comprende uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables que inducen la formación de la matriz después de la administración. La matriz proporciona una absorción lenta a la circulación desde un sitio de inyección y, sin limitarse por la teoría, esta absorción lenta se debe a la inversión lenta de la matriz a medida que disminuye la concentración de proteínas en el sitio de inyección. El perfil de absorción lenta proporciona un perfil PK uniforme y un régimen de administración conveniente y cómodo. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la concentración plasmática de la secuencia de aminoácidos de insulina en el transcurso de los días (p. ej . , de 2 a aproximadamente 60 días, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 30 días) no cambia por más que un factor de 10, o por más que un factor de aproximadamente 5 o por más que un factor de aproximadamente 3. Generalmente, se observa este perfil PK uniforme sobre varias administraciones (sustancialmente espaciadas uniformemente), por ejemplo al menos 2, al menos aproximadamente 5 o al menos aproximadamente 10 administraciones de la formulación. En algunas realizaciones, se exhibe la absorción lenta por un Tmax (tiempo para la concentración plasmática máxima) de más de aproximadamente 5 horas, más de aproximadamente 10 horas, más de aproximadamente 20 horas, más de aproximadamente 30 horas o más de aproximadamente 50 horas.

La liberación progresiva, o absorción lenta del sitio de inyección, está controlada por la secuencia de aminoácidos capaz de formar la matriz con enlaces de hidrógeno a la temperatura corporal del sujeto, así como los componentes de la formulación.

La formulación comprende uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables que inducen la formación de la matriz después de la administración. Por ejemplo, dichos excipientes incluyen sales y otros excipientes que pueden actuar para estabilizar enlaces de hidrógeno. Las sales ejemplares incluyen sales de metal alcalinotérreo tales como sodio, potasio y calcio. Los contraiones incluyen cloruro y fosfato. Las sales ejemplares incluyen cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio y fosfato de potasio.

Se ajusta la concentración de proteínas en la formulación para llevar, junto con los excipientes, la formación de la matriz a la temperatura de administración. Por ejemplo, mayores concentraciones de proteínas ayudan a conducir a la formación de la matriz y la concentración de proteínas necesaria para este fin varía dependiendo de la serie ELP utilizada. Por ejemplo, en las realizaciones que utilizan un ELP1-120 o secuencias de aminoácidos con temperaturas de transición semejantes, la proteína está presente en el intervalo de entre aproximadamente 1 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL o está presente en el intervalo de entre aproximadamente 5 mg/mL y aproximadamente 125 mg/mL. La composición farmacéutica puede estar presente en el intervalo entre aproximadamente 10 mg/mL y aproximadamente 50- mg/mL o entre aproximadamente 15 mg/mL y aproximadamente 30 mg/mL. En las realizaciones que utilizan un ELP4-120 o secuencias de aminoácidos con temperaturas de transición semejantes, la proteína está presente en el intervalo de entre aproximadamente 0,005 mg/mL y aproximadamente 50 mg/mL o está presente en el intervalo de entre aproximadamente 0,01 mg/mL y aproximadamente 20 mg/mL.

La composición farmacéutica se formula a un pH, fuerza iónica, y generalmente con excipientes suficientes para llevar la formación de la matriz a la temperatura corporal (p. e . , 37 °C o entre 34 y 36 °C en algunas realizaciones). La composición farmacéutica generalmente se prepara de modo que no forma la matriz en condiciones de almacenamiento. Las condiciones de almacenamiento generalmente son menores que la temperatura de transición de la formulación, por ejemplo menores que aproximadamente 32 °C, menores que aproximadamente 30 °C, menores que aproximadamente 27 °C, menores que aproximadamente 25 °C, menores que aproximadamente 20 °C o menores que aproximadamente 15 °C. Por ejemplo, la formulación puede ser isotónica con sangre o tener una fuerza iónica que imita las condiciones fisiológicas. Por ejemplo, la formulación puede tener una fuerza iónica de al menos la de cloruro de sodio 25 mM, al menos la de cloruro de sodio 30 mM, al menos la de cloruro de sodio 40 mM, al menos la de cloruro de sodio 50 mM, al menos la de cloruro de sodio 75 mM, al menos la de cloruro de sodio 100 mM o al menos la de cloruro de sodio 150 mM. En determinadas realizaciones, la formulación tiene una fuerza iónica inferior a la de aproximadamente 0,9% de solución salina. En algunas realizaciones, la formulación comprende dos o más de cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de sodio y fosfato de sodio dibásico.

En determinadas realizaciones, la formulación puede comprender histidina aproximadamente 50 mM, histidina aproximadamente 40 mM, histidina aproximadamente 30 mM, histidina aproximadamente 25 mM, histidina aproximadamente 20 mM o histidina aproximadamente 15 mM.

La formulación liquida puede comprender cloruro de sodio aproximadamente 100 mM e histidina aproximadamente 20 mM y se puede almacenar en ambiente refrigerado o a temperatura ambiente. Se puede alterar la concentración de sal para proporcionar isotonicidad en el sitio de inyección.

La formulación se puede empaquetar en forma de jeringas o plumas pre-dosificadas para administración una vez por semana, dos veces por semana o entre una y ocho veces por semana, o alternativamente rellenas en vial convencional y similares .

En las realizaciones ejemplares, la invención proporciona una formulación farmacéutica de liberación progresiva que comprende un agente terapéutico, el cual agente terapéutico (p. ej . , agente terapéutico de proteina o péptido) que comprende una secuencia de aminoácidos de insulina y una secuencia de aminoácidos que comprende [VPGXG]90 (SEC ID N.°: 31) o [VPGXG] 120 (SEC ID N.°: 32), donde cada X se selecciona de V, G y A. V, G y A pueden estar presentes en una proporción de aproximadamente 5:3:2. Alternativamente, la secuencia de aminoácidos comprende [VPGVG] 90 (SEC ID N.°: 31) o [VPGVG] 120 (SEC ID N.°: 32) . La formulación además comprende uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables para la formación de una matriz reversible de una forma acuosa después de la administración a un sujeto humano. Insulina y sus derivados se describen en el presente y en la solicitud provisional de Estados Unidos N.° 61/563.985, que se incorpora al presente por referencia.

En estas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de insulina puede estar presente en el intervalo de entre aproximadamente 0,5 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL, o estar presente en el intervalo de entre aproximadamente 5 mg/mL y aproximadamente 125 mg/mL. La secuencia de aminoácidos de insulina está presente en el intervalo de entre aproximadamente 10 mg/mL y aproximadamente 50 mg/mL, el intervalo de entre aproximadamente 15 mg/mL y aproximadamente 30 mg/mL. La formulación puede tener una fuerza iónica de al menos la de cloruro de sodio 25 mM, al menos la de cloruro de sodio 30 mM, al menos la de cloruro de sodio 40 mM, al menos la de cloruro de sodio 50 mM, al menos la de cloruro de sodio 75 itiM o al menos la de cloruro de sodio 100 m . La formulación puede tener una fuerza iónica inferior a la de aproximadamente 0,9% de solución salina. La formulación comprende dos o más de cloruro de calcio, cloruro de magnesio, cloruro de potasio, fosfato de potasio monobásico, cloruro de sodio y fosfato de sodio dibásico.

También se pueden emplear otros componentes de la formulación, por ejemplo, para lograr la estabilidad deseada. Dichos componentes incluyen uno o más aminoácidos o alcohol de azúcar (p. ej . , manitol), conservantes y agentes tamponantes, y dichos ingredientes se conocen en la técnica.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para administrar un régimen de liberación progresiva de una secuencia de aminoácidos de insulina. El método comprende administrar la formulación descrita en el presente a un sujeto que lo necesita, en donde la formulación se administra entre aproximadamente 1 y aproximadamente 8 veces por mes.

En algunas realizaciones, la formulación se administra aproximadamente una vez por semana y se puede administrar por vía subcutánea o intramuscular. En algunas realizaciones, el sitio de administración no es un sitio patológico, por ejemplo, no es el sitio de acción pretendido.

En diversas realizaciones, la concentración plasmática de la secuencia de aminoácidos de insulina no cambia por más que un factor de 10, un factor de aproximadamente 5, un factor de aproximadamente 3 durante el curso de varias administraciones, por ejemplo al menos 2, al menos aproximadamente 5 o al menos aproximadamente 10 administraciones de la formulación. Las administraciones son sustancialmente espaciadas uniformemente, por ejemplo, aproximadamente todos los días, aproximadamente una vez por semana o entre una y aproximadamente cinco veces por mes.

En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano, pero en otras realizaciones puede ser un mamífero no humano, por ejemplo una mascota doméstica (p. ej . , perro o gato) o ganado o animal de granja (p. ej . , caballos, vacas, ovejas o cerdos).

Conjugación y acoplamiento Una proteína de fusión producida de forma recombinante, de acuerdo con determinadas realizaciones de la invención, incluye una secuencia de aminoácidos que proporciona liberación progresiva (p. ej . , ELP) y una secuencia de aminoácidos de insulina asociadas entre sí por fusión genética. Por ejemplo, se puede generar la proteína de fusión por traducción de un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos de insulina clonada en marco con la secuencia de aminoácidos que proporciona el componente de liberación progresiva.

En determinadas realizaciones, se pueden fusionar la secuencia de aminoácidos que proporciona un componente de liberación progresiva y la secuencia de aminoácidos de insulina utilizando un péptido conector de diversas longitudes para proporcionar una mayor separación física y permitir más movilidad espacial entre las porciones fusionadas, y aumentar así la accesibilidad de la secuencia de aminoácidos de insulina para unirse a su receptor. El péptido conector puede consistir en aminoácidos que son flexibles o más rígidos. Por ejemplo, un conector flexible puede incluir aminoácidos que tengan cadenas laterales relativamente pequeñas, y que pueden ser hidrofílicas . Sin limitación, el conector flexible puede comprender residuos de glicina y/o serina. Los conectores más rígidos pueden contener, por ejemplo, cadenas laterales de aminoácidos más obstaculizantes estéricamente, como (sin limitación) tirosina o histidina. El conector puede tener menos de aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10 o 5 residuos de aminoácidos. El conector puede estar unido por enlace covalente con una secuencia de aminoácidos de insulina y una secuencia de aminoácidos que proporciona el componente de liberación progresiva, por ejemplo, mediante fusión recombinante .

El conector o espaciador peptídico puede ser escindible o no escindible por proteasa. Por ejemplo, los espaciadores peptidicos escindióles incluyen, sin limitación, una secuencia de péptidos reconocida por proteasas (ín vitro o in vivo) de tipo variable, como Tev, trombina, factor Xa, plasmina (proteasas de sangre) , metaloproteasas, catepsinas (p. ej . , GFLG, SEC ID N.°: 21, etc.) y proteasas encontradas en otros compartimientos corporales. En algunas realizaciones que utilizan conectores escindibles, la proteina de fusión puede ser inactiva, menos activa o menos potente como una fusión, que después se activa luego de la escisión del espaciador in vivo. Alternativamente, cuando la secuencia de aminoácidos de insulina es suficientemente activa como una fusión, se puede emplear un espaciador no escindible. El espaciador no escindible puede ser de cualquier tipo adecuado, incluido, por ejemplo, fracciones espadadoras no escindibles que tienen la fórmula [ (Gly) n-Ser] m (SEC ID N.°: 34), en donde n es de 1 a 4, inclusive, y m es de 1 a 4, inclusive. Alternativamente, se podría emplear una secuencia de ELP corta diferente de la ELP de estructura principal en lugar de un conector o espaciador, mientras que logre el efecto necesario.

En otras realizaciones, la composición farmacéutica es una fusión recombinante que tiene una secuencia de aminoácidos de insulina flanqueada en cada extremo terminal por una secuencia de aminoácidos que proporciona un componente de liberación progresiva. Al menos una de las secuencias de aminoácidos que proporciona un componente de liberación progresiva puede estar unida mediante un espaciador escindible, de modo que la secuencia de aminoácidos de insulina esté inactiva, pero activada in vivo por la remoción proteolitica de un componente de ELP único. La fusión de la secuencia de aminoácidos que proporciona liberación progresiva única resultante es activa y tiene una vida media mejorada (u otra propiedad descrita en el presente) in vivo.

En otras realizaciones, la presente invención proporciona conjugados químicos de una secuencia de aminoácidos de insulina y la secuencia de aminoácidos que proporciona un componente de liberación progresiva. Los conjugados se pueden realizar mediante el acoplamiento químico de una secuencia de aminoácidos que proporciona un componente de liberación progresiva con una secuencia de aminoácidos de insulina mediante cualquier cantidad de métodos conocidos en la técnica (véase, p. ej . , Nilsson y col., 2005, Ann Rev Biophys Bio Structure 34: 91-118). En algunas realizaciones, se puede formar el conjugado químico mediante la formación de enlaces covalentes de la secuencia de aminoácidos de insulina con la secuencia de aminoácidos que proporciona un componente de liberación progresiva, directamente o a través de una fracción conectora corta o larga, a través de uno o más grupos funcionales en el componente proteico terapéutico, p. ej . , grupos amina, carboxilo, fenilo, tiol o hidroxilo, para formar un conjugado covalente. Se pueden utilizar diversos conectores convencionales, p. ej . , diisocianatos , diisotiocianatos , carbodiimidas , ésteres de bis (hidroxisuccinimida) , ésteres de maleimida-hidroxisuccinimida, glutaraldehido y similares.

Además, los espaciadores químicos no peptídicos pueden ser de cualquier tipo adecuado, incluido por ejemplo, por conectores funcionales descritos en Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, publicado por Academic Press, Inc., 1995, y los especificados en Cross-Linking Reagents Technical Handbook, comercializado por Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, Illinois) , cuyas divulgaciones se incorporan al presente por referencia en su totalidad. Algunos espaciadores químicos ejemplares incluyen conectores homobifuncionales que se pueden unir a grupos amina de Lys, así como conectores heterobifuncionales que se pueden unir a Cys en un extremo terminal y a Lys en el otro extremo terminal.

En determinadas realizaciones, los componentes de ELP relativamente pequeños (p. ej . , componentes de ELP de menos de aproximadamente 30 kDa, 25 kDa, 20 kDa, 15 kDa o 10 kDa) , que no sufren transición a temperatura ambiente (o temperatura corporal humana, p. ej . , Tt >37 °C) , están acoplados químicamente o reticuladós. Por ejemplo, se pueden acoplar químicamente dos componentes de ELP relativamente pequeños, que tienen las mismas propiedades o diferentes. Dicho acoplamiento, en algunas realizaciones, puede ocurrir in vivo, mediante la adición de un único residuo de cisteína o alrededor del extremo carboxilo terminal del ELP. Dichos componentes de ELP pueden estar fusionados con una o más secuencias de aminoácidos de insulina, para aumentar la actividad o la avidez en la diana.

Métodos para tratar enfermedades En diversas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la presente invención, según se describen aquí, se utilizan para el manejo y cuidado de un paciente que tiene una patología tal como diabetes o hiperglucemia, u otras afecciones para las cuales se indica administración de insulina con el propósito de combatir o aliviar los síntomas y complicaciones de dichas afecciones, incluso diversos trastornos metabólicos. El tratamiento incluye administrar una formulación de la presente invención para prevenir el inicio de los síntomas o complicaciones, aliviar los síntomas o complicaciones o eliminar la enfermedad, afección o trastorno. Los presentes métodos incluyen el tratamiento de diabetes tipo 1, es decir, una afección en la cual el cuerpo no produce insulina y, por lo tanto, no puede controlar la cantidad de azúcar en la sangre y diabetes tipo 2, es decir, una afección en la cual el cuerpo no utiliza insulina normalmente y, por lo tanto, no puede controlar la cantidad de azúcar en la sangre.

En diversas realizaciones, la liberación progresiva proporciona control glucémico prolongado. Control glucémico se refiere a los niveles típicos de azúcar en sangre (glucosa) en una persona con diabetes mellitus. Muchas de las complicaciones a largo plazo de la diabetes, incluso complicaciones microvasculares , provienen de muchos años de hiperglucemia . El control glucémico prolongado es un objetivo importante del cuidado de la diabetes. Debido a que los niveles de azúcar en sangre fluctúan durante el día y los registros de glucosa son indicadores imperfectos de estos cambios, el porcentaje de hemoglobina que es glicosilada se utiliza como una medida aproximada de control glucémico a largo plazo en ensayos de investigación y atención clínica de personas con diabetes. En esta prueba, la hemoglobina Ale o hemoglobina glicosilada refleja los valores promedio de glucosa durante los 2-3 meses anteriores.

En personas no diabéticas con metabolismo de glucosa normal, los niveles de hemoglobina glicosilada usualmente son aproximadamente el 4-6% por los métodos más comunes (los intervalos normales pueden varias según el método) . El "control glucémico perfecto" indica que los niveles de glucosa son siempre normales (p. ej . aproximadamente 70-130 mg/dl o aproximadamente 3,9-7,2 mmol/L) y no se pueden distinguir de una persona sin diabetes. En realidad, debido a las imperfecciones de las medidas del tratamiento, incluso el "control glucémico bueno" describe niveles de glucosa en sangre que hacen un promedio algo mayor de lo normal gran parte del tiempo. Cabe destacar que lo que se considera "control glucémico bueno" varia según la edad y susceptibilidad del paciente a la hipoglucemia . La Asociación Americana de Diabetes ha abogado para que los pacientes y médicos se esfuercen por promediar valores de glucosa y hemoglobina Ale por debajo de 200 mg/dl (11 mmol/1) y el 8%. "Control glucémico malo" se refiere a niveles de glucosa en sangre y hemoglobina glicosilada persistentemente elevados, que pueden oscilar entre, p. ej . , aproximadamente 200-500 mg/dl (aproximadamente 11-28 mmol/L) y aproximadamente 9-15% o más durante meses y años antes de que aparezcan complicaciones graves.

En diversas realizaciones, la presente invención proporciona terapias de combinación y/o co-formulaciones que comprenden las composiciones farmacéuticas descritas aquí y otros agentes que son eficaces para tratar enfermedades, por ejemplo las descritas anteriormente.

En una realización, la invención proporciona combinación o co-formulación con receptor glucagón (GLP) -agonista de receptor 1, por ejemplo GLP-1 (SEC ID N.°: 22), exendin-4 (SEC ID N.°: 23), o análogos funcionales y/o derivados de estos como se divulga en la patente estadounidense 8.178.495, que se incorpora al presente por referencia. En algunas realizaciones, el GLP-1 es GLP-1 (A-B) , en donde A es un entero entre 1 y 7 y B es un entero entre 38 y 45. En algunas realizaciones, el GLP-1 es GLP-1 (7-36) (SEC ID N.°: 24), un análogo funcional de este o GLP-1 (7-37) (SEC ID N.°: 25) o análogo funcional de este.

En otra realización, la invención proporciona combinación o co-formulación con GLP-2 (SEC ID N.°: 26), GIP (SEC ID N.°: 27), glucagón (SEC ID N.°: 28), y oxintomodulina (SEC ID N.°: 29) o análogos funcionales y/o derivados de estos. Los análogos funcionales pueden contener de 1 a 10 inserciones, eliminaciones y/o sustituciones de aminoácidos (colectivamente) con respecto a la secuencia nativa.

En diversas realizaciones, las terapias de combinación y/o co-formulaciones comprenden proteínas de fusión, por ejemplo, con ELP o un componente formador de matriz como se describe en el presente. En algunas realizaciones, ELP comprende al menos 60 unidades (SEC ID N.°: 30), 90 unidades (SEC ID N.°: 31), 120 unidades (SEC ID N.°: 32) o 180 unidades de VPGXG (SEC ID N.°: 33), donde X es un aminoácido seleccionado independientemente. En diversas realizaciones, X es V, G o A en una relación de 5:3:2, K, V o F en una relación de 1:2:1, K, V o F en una relación de 1:7:1 o V.

En otra realización, la invención proporciona combinación o co-formulación con diversas formas de insulina como se describe en el presente. En una realización, la insulina es una insulina de acción rápida.

EJEMPLOS Se fusionó genéticamente proinsulina humana con el biopolimero ELP1-120 y se expresó en la fracción soluble de E coli. Después del procesamiento enzimático de purificación de la fracción de proinsulina en insulina madura, se evalúo la proteina de fusión en cuanto a la disminución de la glucosa en un modelo de ratón normal y se comparó con la insulina sola. La fusión de insulina ELP mostró una disminución de la glucosa similar a la insulina. Además, se observó que el efecto reductor de la proteina de fusión se extendió durante más tiempo que el de la insulina en el modelo.

Construcción de la fusión de insulina La proinsulina humana consiste en cadenas B y A unidas con el péptido C de 31 aminoácidos (figuras 1A y IB) . Una vez que se forman enlaces disulfuro entre las cadenas B y A, la proinsulina se convierte en insulina madura in vivo mediante la remoción del péptido C por un sistema similar a tripsina/carboxipeptidasa B. Este procesamiento de péptidos se puede replicar in vitro utilizando carboxipeptidasa B y tripsina recombinante. Como la fusión se expresa en la fracción soluble de E. coli, no son necesarias etapas de replegamiento .

Se sintetizó la secuencia de nucleótidos de proinsulina y se subclonó en el vector basado en pET pPBl031, se colocó en el extremo amino terminal de la secuencia de ELPl-120 para realizar el plásmido pPE0139 (figura 2) .

La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de una proteina de fusión proinsulina ELPl-120 (SEC ID N.°: 14). La secuencia de la proinsulina (subrayada) está fusionada con la secuencia ELPl-120. La secuencia de aminoácidos opcionalmente incluye un residuo de metionina de iniciación en el extremo amino terminal.

Fermentación Se expresó el plásmido de fusión de insulina ELP pPE0139 en la fracción intracelular de E. coli bajo control del promotor T7 en un proceso de fermentación semicontinuo . Se amplió la solución madre de células de glicerol utilizando un cultivo celular en un matraz de agitación de dos etapas en medio de origen no animal, semidefinido (ECPM + prolina) con glicerol como fuente de carbono principal y extracto de levadura como fuente de nitrógeno principal. Cuando se logró la densidad celular en el cultivo celular, se traspasó el cultivo a un termentador que contenia el mismo medio que el cultivo celular. Se mantuvieron los parámetros del proceso (pH, temperatura, oxigeno disuelto) en un punto establecido a través de control de PID. El cultivo creció hasta que alcanzó una fase estacionaria tras lo cual inició una alimentación con glicerol/extracto de levadura/sulfato de magnesio. Se mantuvo el cultivo con limitación de carbono y se logró la inducción del promotor utilizando IPTG. Al final de la fermentación, se centrifugó el cultivo para separar la biomasa que contenia la fusión de insulina ELP del medio gastado. Se almacenó la pasta de células a -70 °C hasta la purificación posterior.

Purificación Se resuspendió la pasta de células congelada en tampón de lisis que contenia urea 2M (para la disociación de la insulina ELP) y se mezcló hasta la homogeneidad. Se logró la lisis utilizando un microfluidizador para romper las membranas celulares. Se utilizó un sistema de filtración de flujo tangencial de dos etapas (TFF) para aclarar y concentrar el producto. Se pasó la fusión de insulina ELP por una columna HIC como una etapa de captura y se lavaron los contaminantes de las células huésped. Se eluyó el producto utilizando un gradiente para fraccionar cualquier impureza relacionada con el producto (especies degradadas) . Se realizó el intercambio de tampón TFF en las fracciones seleccionadas para eliminar la sal residual antes de dos columnas de intercambio aniónico para eliminar el ADN residual, la endotoxina y las proteínas de células huésped. Se utilizó un intercambio de tampón y concentración TFF final para formular el producto. Se utilizó filtración de 0,2 µ? para la esterilización. Se almacenó el producto a 4 °C hasta la digestión enzimática.

Procesamiento enzimático de fusión de proinsulina ELP (PE0083) Se diluyó proinsulina ELP1-120 purificada a 1 mg/mL en tampón de formulación. Se preparó una solución de enzimas 2X para el procesamiento de la proinsulina ELP en insulina ELP madura de la siguiente manera: bicarbonato de sodio 50 mM, tripsina 2 ug/mL y carboxipeptidasa B 20 ug/mL. Se añadió la solución de enzimas 2X a un volumen igual de PE0083 1 mg/mL y se incubó a 37 °C durante 1-2 horas. Se detuvo la reacción enzimática utilizando las propiedades de transición de fases del ELP. Se añadió cloruro de sodio a la reacción para inducir la transición de fases de la fusión. La insulina ELP madura formó un coacervato y se sedimentó mediante centrifugación. Se lavaron las enzimas residuales y se resolubilizó la fusión sedimentada en un tampón de baja salinidad. Se realizaron purificaciones de transición de fases de dos etapas.

El SDS-PAGE no reductor (figura 4) mostró la disminución esperada del peso molecular de la proteina de fusión después del procesamiento enzimático a medida que se escindió el péptido C.

Se realizó un análisis de transferencia Western de la cadena B antiinsulina (figura 5) para confirmar la presencia de las cadenas A y B fusionadas a ELP. Los datos mostraron la presencia de la cadena B en condiciones no reductoras que indica la formación de un enlace disulfuro entre las cadenas A y B. La reducción de la proteina de fusión y de los enlaces disulfuro provocó la eliminación de la cadena B de la fusión.

La espectrometría de masas de ionización por electrospray confirmó la masa de la fusión de proinsulina ELP (figura 6) y la fusión de Insulina ELP madura después de la remoción enzimática del péptido C (figura 7) . Otros aductos de sal estuvieron presentes en ambos ejemplos. Se confirmó la presencia de enlaces disulfuro utilizando un ensayo de reactivo de Ellman. La ausencia de tioles libres indicó la formación de enlaces disulfuro.

Disminución de la glucosa in vivo Se sometió a ayuno a ratones normales durante la noche y se les inyectó por via subcutánea solución salina (control negativo) , 13 nmol/kg insulina glargina (control positivo) o 35 nmol/kg fusión de insulina ELP (INSU ERA) . Se tomaron lecturas de glucosa en sangre antes de la dosificación y a cada hora después de 8 horas y 24 horas después de la dosificación. Se les dio alimento 1 hora después de la dosis. La figura 8 muestra los datos de glucosa en sangre (promedio +-SE) . La fusión de insulina ELP muestra una disminución de la glucosa en sangre significativa contra el control salino. Además, la fusión de insulina ELP mostró una disminución de la glucosa en sangre que se extendió por más tiempo (7 horas) que el control de insulina glargina (2 horas) .

Efectos in vivo en un modelo de diabetes tipo 1 Se dosificó una fusión de ELP-insulina, INSUMERA (PE0139), en un modelo de ratón de diabetes mellitus tipo 1 (diabetes tipo 1, T1DM) . Específicamente, se muestran los datos de dosis única en la figura 9. Los resultados demostraron una mayor duración de la reducción de la glucosa para INSUMERA, en comparación con la dosificación equimolar de LANTUS (insulina glargina, SANOFI-AVENTIS) . Cuando se dosificaron los compuestos en un régimen diario (figura 10) , los resultados demuestran la superioridad de INSUMERA, en comparación con LANTUS (insulina glargina, SANOFI-AVENTIS ) , con respecto a la actividad y a la vida media.

Las figuras 11A y 11B muestran la titulación de dosis baja de INSUMERA (PE0139) en un modelo de ratón de diabetes mellitus tipo 1 (diabetes tipo 1, T1DM) en comparación con LANTUS (insulina glargina, SANOFI-AVENTIS) . La figura 11A muestra una dosis s.c. única mientras que la figura 11B muestra 14 dias de dosificación s.c. diaria. En ambos casos, se muestra el efecto más pronunciado y progresivo de disminución de la glucosa en' sangre de INSUMERA.

También se realizaron estudios para determinar la medida del control glucémico, una medición de los niveles típicos de glucosa en sangre en un paciente, de la INSUMERA. Las figuras 12A y 11B muestran que INSUMERA (PE0139) tiene un control glucémico significativamente mejorado con relación al LANTUS (insulina glargina, SANOFI-AVENTIS) . Se observa una reducción del 27-39% en el área bajo la curva (AUC) de la glucosa en sangre. La figura 12A muestra el día 1 de la administración del compuesto y el AUC de la glucosa en sangre AUC a las 0-24h. La figura 12B muestra el día 14 de la administración del compuesto y el AUC de la glucosa en sangre AUC a las 0-24h. INSUMERA redujo el AUC de la glucosa en sangre más eficazmente que LANTUS en ambos regímenes de dosificación.

También se realizaron estudios para evaluar la farmacocinética (PK) del tratamiento con INSUMERA. En los porcinos diabéticos, se siguió un régimen de inyección s.c. única (figura 13A) o inyecciones s.c. diarias durante 2 semanas (figura 13B) . Los resultados muestran que INSUMERA presenta una vida media prolongada con una pequeña proporción pico-valle después de una inyección subcutánea.

EQUIVALENTES Los entendidos en la técnica reconocerán o podrán determinar usando solamente la experimentación de rutina, numerosos equivalentes de las realizaciones especificas descritas específicamente en la presente. Se pretende que dichos equivalentes estén comprendidos en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (34)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para proporcionar control glucémico prolongado que comprende una cantidad eficaz de una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos de insulina y una secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva desde un sitio de inyección y excipientes farmacéuticos para lograr la liberación progresiva.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la secuencia de aminoácidos de insulina comprende una secuencia de aminoácidos de cadena A y una de cadena B, en donde la cadena A y la cadena B tienen la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.°: 13, que tiene opcionalmente de 1 a 8 inserciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos colectivamente .

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2 en la cual la secuencia de aminoácidos que proporciona una absorción lenta desde el sitio de inyección está unida por enlace covalente con la cadena A de insulina.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 2 o 3 en la cual la cadena A y la cadena B están unidas por uno o más enlaces disulfuro.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 2 o 3 en la cual la cadena A y la cadena B están unidas a través de un péptido o conector químico.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva tiene un patrón de residuos de prolina sustancialmente repetitivo.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6 en la cual la secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva es una secuencia de aminoácidos del péptido similar a elastina (ELP) .

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 en la cual el ELP comprende repeticiones de VPGXG (SEC ID N.°: 3), en donde cada X se selecciona independientemente de residuos de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina y valina.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 8 en la cual X es valina.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 en la cual la secuencia de aminoácidos del ELP comprende repeticiones de AVGVP (SEC ID N.°: 4), IPGVG (SEC ID N.°: 6) o LPGVG (SEC ID N. ° : 8) .

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 en la cual el ELP comprende al menos 15 repeticiones de una unidad de aminoácido de ELP.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 en la cual el ELP comprende al menos 30 repeticiones de una unidad de ELP.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 en la cual el ELP comprende al menos 60 repeticiones de una unidad de ELP.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 en la cual el ELP comprende al menos 90 repeticiones de una unidad de ELP.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 en la cual el ELP comprende al menos 120 repeticiones de una unidad de ELP.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 en la cual el ELP comprende al menos 180 repeticiones de una unidad de ELP.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la composición farmacéutica comprende la SEC ID

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 en la cual el ELP tiene una temperatura de transición de casi 37 °C en solución salina normal.

19. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva forma una estructura de espiral aleatorio o no globular extendida o un biopolimero sin estructura, incluido un biopolimero en el cual al menos el 50% de los aminoácidos carecen de una estructura secundaria como se determina por el algoritmo de Chou-Fasman.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la secuencia de aminoácidos es una proteina que tiene una estructura extendida, no globular o una estructura de espiral aleatorio.

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la composición farmacéutica es una proteina de fusión .

22. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la composición farmacéutica comprende cloruro de sodio aproximadamente 110 mM e histidina aproximadamente 20 mM.

23. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la composición farmacéutica se formula para administrar aproximadamente una vez por semana.

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la composición farmacéutica se formula para administrar diariamente.

25. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la composición farmacéutica se formula para administrar en dosis de entre aproximadamente 0,5 mg/mL y aproximadamente 200 mg/mL.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 en la cual la composición farmacéutica se formula para administrar en dosis de entre aproximadamente 10 mg/mL y aproximadamente 50 mg/mL.

27. Un método para tratar la diabetes que comprende administrar una composición farmacéutica para proporcionar control glucémico prolongado que comprende una cantidad eficaz de una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos de insulina y una secuencia de aminoácidos que proporciona una liberación progresiva desde un sitio de inyección y excipientes farmacéuticos para lograr la liberación progresiva a un paciente que las necesita.

28. El método de la reivindicación 27 en el cual el paciente tiene diabetes tipo 1.

29. El método de la reivindicación 27 en el cual el paciente tiene diabetes tipo 2.

30. El método de la reivindicación 27 en el cual la composición farmacéutica se administra con una frecuencia de entre 1 y aproximadamente 30 veces por mes.

31. El método de la reivindicación 27 en el cual la composición farmacéutica se administra aproximadamente una vez por semana.

32. El método de la reivindicación 27 en el cual la composición farmacéutica se administra dos o tres veces por semana .

33. El método de la reivindicación 27 en el cual la composición farmacéutica se administra aproximadamente una vez por día.

34. El método de la reivindicación 27 en el cual la composición farmacéutica se administra por via subcutánea.