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MX2014005564A - Moleculas que son anticuerpos con especificado por ox40 humano. - Google Patents

Moleculas que son anticuerpos con especificado por ox40 humano.

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MX2014005564A
MX2014005564A MX2014005564A MX2014005564A MX2014005564A MX 2014005564 A MX2014005564 A MX 2014005564A MX 2014005564 A MX2014005564 A MX 2014005564A MX 2014005564 A MX2014005564 A MX 2014005564A MX 2014005564 A MX2014005564 A MX 2014005564A
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fusion protein
variable domain
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MX2014005564A
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David Paul Humphreys
Ralph Adams
Pallavi Bhatta
Sam Phillip Heywood
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Ucb Pharma Sa
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Publication date
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Abstract

La invención se refiere a moléculas que son anticuerpos con especificidad por determinantes antigénicos de OX40 humano, a usos terapéuticos de las moléculas que son anticuerpos y a métodos para producir las moléculas que son anticuerpos.

Description

MOLECULAS QUE SON ANTICUERPOS CON ESPECIFICIDAD POR 0X40 HUMANO CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a moléculas que son anticuerpos con especificidad por determinantes antigénicos de 0X40 y a composiciones que los comprenden. La presente invención también se refiere a los usos terapéuticos de las moléculas que son anticuerpos, las composiciones y a métodos para producir las moléculas que son anticuerpos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION OX40 (que también se conoce como CD134, TNFRSF4 , ACT35 o TXGP1L) es un miembro de la superfamilia de receptores de TNF, la cual incluye 4-1BB, CD27, CD30 y CD40. El dominio de unión al ligando extracelular de OX40 está compuesto por 3 dominios ricos en cisteína (CRD, por sus siglas en inglés) completos y un cuarto CRD C-terminal parcial (Bodmer et al., 2002, Trends Biochem Sci, 27, 19-26) .
El ligando para OX40 es OX40L y 3 copias de 0X40 se unen al ligando trimérico para formar el complejo OX40-OX40L (Compaan y Hymowitz, 2006, Structure, 14, 1321-1330) . 0X40 es un receptor unido a la membrana; a pesar de ello, también se ha detectado una isoforma soluble (Taylor y Schwarz, 2001, J. Immunol . Methods, 255, 67-72). En la actualidad se desconoce la importancia funcional de la forma Ref. 248367 soluble. OX40 no se expresa en linfocitos T en reposo, pero se expresa de forma transitoria en linfocitos T activados tras la unión del receptor del linfocito T (TCR, por sus siglas en inglés) . El ligando para OX40, OX40L, es un miembro de la familia de TNF y se expresa en células presentadoras de antígenos activadas (APC, por sus siglas en inglés) , que incluyen linfocitos B, macrófagos, células endoteliales y células dendríticas (DC, por sus siglas en inglés) . 0X40 es un receptor coestimulador importante y requiere la participación secuencial de CD28 y 0X40 para la supervivencia y la proliferación óptima de los linfocitos T. La unión de 0X40 a linfocitos T activados provoca una mayor producción de citocinas y la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ (Gramaglia et al., 2000, J. Immunol , 165, 3043-3050, Bansal-Pakala et al., 2004, J. Immunol, 172, 4821-425) y puede participar en las respuestas de Thl y Th2 en curso (Gramaglia et al., 1998, J. Immuno . , 161, 6510-6517, Arestides et al., 2002, Eur. J. Immunol. 32, 2874-2880). La coestimulación de 0X40 prolonga la supervivencia de los linfocitos T más allá de la fase efectora inicial de la respuesta inmunitaria e incrementa el número de linfocitos T de memoria mediante la inhibición de la muerte de los linfocitos T efectores.
Cuando la activación inmunitaria es excesiva o incontrolada, se puede producir una alergia patológica, asma, inflamación, enfermedades autoinmunitarias y otras enfermedades relacionadas. Debido a que 0X40 actúa potenciando las respuestas inmunitarias, puede agravar las enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias.
Se ha demostrado la función de las interacciones OX40/OX40L para modelos de enfermedades en ratones que carecen de OX40. Para la encefalomielitis alérgica experimental (EAE) , un modelo de esclerosis múltiple, se observaron menos signos clínicos graves y un infiltrado inflamatorio reducido en el SNC en ratones que carecían de OX40 (Carboni et al., 2003, J. Neuroimmunology, 145, 1-11). Además, los ratones que carecían de OX40 cebados y estimulados con ovoalbúmina exhibieron una reducción de la inflamación pulmonar (reducción de un 80-90% de la eosinofilia) , una reducción de la producción de mucosidad y una hiperreactividad de las vías respiratorias significativamente atenuada (Jember et al., 2001, J". Exp. Med. , 193, 387-392). Los anticuerpos monoclonales para el ligando OX40 de murinos han presentado efectos beneficiosos en el modelo de artritis reumatoide de tipo artritis inducida por colágeno (Yoshioka et al., 2000, Eur. J. I munol . , 30, 2815-2823), EAE (Nohara et al., 2001, J". Immunol., 166, 2108-2115), ratones diabéticos no obesos (NOD) (Pakala et al., 2004, Eur. J. Immunol., 34, 3039-3046), colitis en ratones con linfocitos T restaurados (Malmstrom et al., 2001, J".
Immunol., 166, 6972-6981, Totsuka et al . , 2003, Am. J. Physiol. Gastrointest . Liver Physiol . , 284, G595-G603) y modelos de inflamación pulmonar (Salek-Ardakani et al., 2003, J". Exp. Med. , 198, 315-324, Hoshino et al., 2003, Eur. J. Immunol., 33, 861-869) . Se ha probado un anticuerpo para 0X40L humano en un modelo de inflamación pulmonar en macacos Rhesus y ha dado como resultado una reducción de los niveles de IL-5, IL-13 y linfocitos T de memoria efectores en fluido de lavado bronquial después de la estimulación con un alérgeno (Seshasayee et al., 2007, J". Clin. Invest . , 117, 3868-3878) .
Se ha observado un incremento de la expresión de 0X40 en varias enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias . Esto incluye un incremento de la expresión de 0X40 en linfocitos T aislados del fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (Brugnoni D et al., 1998, Br. J. Rheum. , 37, 584-585; Yoshioka et al., 2000, Eur. J. Immunol., 30, 2815-2823; Giacomelli R et al., 2001, Clin. Exp. Rheumatol . , 19, 317-320) . De forma similar, se ha observado un incremento de la expresión de OX40 en tejido gastrointestinal de pacientes con colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn (Souza et al., 1999, Gut, 45, 856-863; Stuber et al., 2000, Eur. J. Clin. Invest., 30, 594-599) y en lesiones activas de pacientes con esclerosis múltiple (Carboni et al., 2003, J". Neuroimmunology, 145, 1-11) . OX40L también se puede detectar en el músculo liso de las vías respiratorias (ASM, por sus siglas en inglés) de seres humanos y las células de ASM de pacientes con asma presentan unas respuestas inflamatorias mayores frente a la unión de 0X4OL que los donantes sanos, lo cual indica que la vía de OX40/OX40L desempeña una función en el asma (Burgess et al., 2004, J". Allergy Clin Immunol . , 113, 683-689; Burgess et al., 2005, J". Allergy Clin Immunol., 115, 302-308). También se ha descrito que los linfocitos T CD4+ aislados de la sangre periférica de pacientes con lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés) expresan niveles elevados de 0X40 que se asocian con la actividad de la enfermedad (Patschan et al., 2006, Clin. Exp. Immunol., 145, 235-242) .
Dada la función de 0X40 en la alergia, el asma y enfermedades asociadas con la autoinmunidad y la inflamación, una estrategia para la terapia en estas enfermedades consiste en bloquear la señalización OX40-OX40L mediante el uso de anticuerpos anti-OX40L o anticuerpos anti-OX40 antagonistas.
Los anticuerpos anti-OX40L han sido descritos, remítase, por ejemplo, al documento WO2006/029879.
Se han descrito numerosos anticuerpos anti-OX40 agonistas, pero se conocen muy pocos anticuerpos anti-OX40 antagonistas. Stuber et al., 1996, J. Exp. Med, 183, 979-989 han generado un anticuerpo policlonal anti-OX40 de ratón producido en conejo, el cual bloquea la interacción entre 0X40 y OX40L. Imura et al., 1996, J. Exp . Med, 2185-2195 han generado anticuerpos monoclonales de ratón, 131 y 315, los cuales se unen a 0X 0 humano.
En el documento W02007/062245 se han descrito anticuerpos antagonistas totalmente humanos; el anticuerpo de afinidad más elevada tenía una afinidad por OX40 expresado en la superficie celular (linfocitos T activados) de 11 nM.
En el documento WO2008/106116 se han descrito anticuerpos antagonistas humanizados y el anticuerpo con la mejor afinidad por 0X40 tenía una afinidad de 0.94 nM.
Se han descrito otros anticuerpos anti-OX40, que incluyen L106 de murino (Patente de EE . UU. N.° 6.277.962) y ACT35 de murino, los cuales se pueden adquirir del proveedor comercial eBioscience.
Hemos descrito previamente anticuerpos anti-OX40 antagonistas de alta afinidad en la Solicitud de Patente Internacional número WO2010/096418.
También hemos descrito previamente, en la Solicitud de Patente Internacional número WO2010/035012 , una molécula de fusión que es un anticuerpo multiespecífico novedoso, que se denomina en lo sucesivo en la presente Fab-dsFv y se ilustra en la Figura 1 de la presente. La misma solicitud proporciona regiones variables de unión anti-albúmina útiles, las cuales se pueden utilizar para prolongar la semivida de la molécula.
En la presente invención, estas regiones variables de unión a albúmina han sido mejoradas y combinadas en el formato Fab-dsFv con los anticuerpos anti-OX40 descritos en WO2010/096418. La nueva molécula biespecífica de la presente invención presenta una eficacia mejorada en una serie de ensayos in vivo e in vitro que se describen en la presente en comparación con la molécula Fab' -PEG descrita previamente en WO2010/096418. Por consiguiente, la presente invención proporciona una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico, la cual se une tanto a OX40 humano como a albúmina de suero humano y la cual es adecuada para su uso en el tratamiento o la profilaxis de trastornos patológicos mediados por 0X40 o asociados con un incremento del nivel de 0X40.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención (formato Fab-dsFv) .
Las Figuras 2A—8B muestran ciertas secuencias de ADN o de aminoácidos relacionadas con un anticuerpo de acuerdo con la descripción.
La Figura 9A muestra la unión de A26 Fab-dsFv marcado con AlexaFluor 488 a linfocitos T CD4+OX40+ humanos activados.
La Figura 9B muestra la unión para A26 Fab' , A26 Fab-Fv y A26 Fab' -PEG en presencia de HSA al 5% en linfocitos T CD4+, OX40+ humanos activados.
La Figura 10A muestra el efecto de A26 Fab-dsFv sobre la producción de citocinas en PBMC expuestas a un extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus .
La Figura 10B muestra la capacidad de A26 Fab-dsFv para inhibir la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ en un modelo con ratones Hu-NSG.
La Figura 11A muestra la inhibición de la unión de 0X4OL a linfocitos T CD4+ 0X40+ activados humanos por parte de A26 Fab-dsFv.
La Figura 11B muestra la inhibición de la unión de OX40L a linfocitos T CD4+ OX40+ activados humanos por parte de A26 Fab' , A26 Fab-dsFv, A26 Fab' -PEG y dos controles.
La Figura 12A muestra que A26 Fab-Fv inhibe la reacción de linfocitos mixtos (MLR) en seres humanos.
La Figura 12B muestra que A26 Fab-Fv inhibe la producción de IFN-gamma durante la MLR en seres humanos.
La Figura 13 muestra que A26 Fab-Fv reduce el porcentaje de linfocitos T (CD25+) CD4+ activados después de una reestimulación del antígeno secundario con un extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus .
Las Figuras 14A a 14D muestran que cuando Fab-Fv y Fab-PEG se administran antes de la transferencia celular, inhiben de forma dependiente de la dosis la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ en el modelo Hu-NSG.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El anticuerpo humanizado anti-OX40 CA044_00026 se denomina en la presente A26.
La molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención, denominada en la presente Fab-dsFv, se ilustra en la Figura 1. En la presente invención, la porción Fab (que comprende las primeras regiones variables de la cadena ligera y pesada y los dominios constantes) se une a 0X40 humano y la porción dsFv (que comprende las segundas regiones variables de la cadena ligera y pesada, unidas por un enlace disulfuro) se une a la albúmina de suero humano. En particular, la porción Fab comprende CDR derivadas de un anticuerpo anti-OX40 antagonista y la porción Fv comprende las regiones variables de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo humanizado anti-albúmina y estas regiones variables de unión a albúmina están conectadas mediante un enlace disulfuro.
Por consiguiente, la presente invención proporciona una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico, la cual se une a 0X40 humano y a albúmina de suero humano, que comprende : una cadena pesada que comprende, en secuencia desde el extremo N-terminal, un primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) , un dominio CH1 y un segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2), una cadena ligera que comprende, en secuencia desde el extremo N-terminal, un primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) , un dominio CL y un segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) , donde las cadenas ligera y pesada están alineadas de un modo tal que VH1 y VL1 forman un primer sitio de unión al antígeno y VH2 y VL2 forman un segundo sitio de unión al antígeno, donde el antígeno que se une al primer sitio de unión al antígeno es 0X 0 humano y el antígeno que se une al segundo sitio de unión al antígeno es albúmina de suero humano, en particular donde el primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID N0:1 para CDR-H1, la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3 y el primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3, donde el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) tiene la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 11 y el segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) tiene la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 12 y el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) y el segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) están conectados mediante un enlace disulfuro.
Los residuos en los dominios variables de los anticuerpos se numeran convencionalmente según un sistema ideado por Kabat et al. Este sistema se expone en Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of I munological Interes , US Department of Health and Human Services, NIH, EE . UU. (en lo sucesivo en la presente "Kabat et al. (supra)") . En la presente memoria descriptiva se utiliza este sistema de numeración excepto cuando se indique de otro modo.
Las designaciones de los residuos de Kabat no siempre corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos aminoacídicos . La secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que en la numeración estricta de Kabat corresponden a un acortamiento de, o una inserción en, un componente estructural, ya sea una región marco o una región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), de la estructura básica del dominio variable. La numeración correcta de Kabat de los residuos se puede determinar para un anticuerpo dado alineando residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar" .
Las CDR del dominio variable de la cadena pesada están localizadas en los residuos 31-35 (CDR-H1) , residuos 50-65 (CDR-H2) y residuos 95-102 (CDR-H3) según el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, según Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M. J. Mol. Biol . , 196, 901-917 (1987)), el bucle equivalente a CDR-H1 se extiende desde el residuo 26 hasta el residuo 32. Por lo tanto, a menos que se indique de otro modo, se pretende que el término "CDR-H1" , tal como se utiliza en la presente, se refiera a los residuos 26-35, como se describe mediante una combinación del sistema de numeración de Kabat y la definición topológica de bucle de Chothia.
Las CDR del dominio variable de la cadena ligera están localizadas en los residuos 24-34 (CDR-L1) , residuos 50-56 (CDR-L2) y residuos 89-97 (CDR-L3) según el sistema de numeración de Kabat.
La proteína de fusión biespecífica de la presente invención comprende un fragmento Fab del anticuerpo anti-OX40 antagonista que se ha descrito previamente en O2010/096418. El término "antagonista", tal como se utiliza en la presente, describe una proteína de fusión que es un anticuerpo capaz de inhibir y/o neutralizar la actividad de señalización biológica de 0X40, por ejemplo, bloqueando la unión, o reduciendo sustancialmente la unión, de 0X40 al ligando de OX40 e inhibiendo de este modo la activación de OX40.
El cribado de anticuerpos para identificar los que se unen a OX40 se puede llevar a cabo utilizando ensayos para medir la unión a 0X40 humano y/o ensayos para medir la capacidad para bloquear la unión de OX40 a su ligando, OX40L.
Un ejemplo de un ensayo de unión es un ELISA, en particular, que utiliza una proteína de fusión de 0X 0 humano y Fe humano, la cual se inmoviliza sobre placas, y que emplea un anticuerpo secundario conjugado para detectar el anticuerpo anti-OX40 unido a la proteína de fusión. Un ejemplo de un ensayo de bloqueo es un ensayo basado en citometría de flujo que mide el bloqueo de la unión de la proteína de fusión que tiene OX40 como ligando a 0X40 en células CD4 humanas. Para detectar la cantidad de proteína de fusión que tiene 0X40 como ligando que se une a la célula, se utiliza un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. En este ensayo se observa una reducción de la señal a medida que el anticuerpo del sobrenadante bloquea la unión de la proteína de fusión del ligando a 0X40. Otro ejemplo de un ensayo de bloqueo es un ensayo en el cual el bloqueo de la coestimulación de linfocitos T humanos vírgenes mediado por la proteína de fusión que tiene OX40 como ligando, la cual se aplica como recubrimiento a una placa, se mide cuantificando la incorporación de timidina con tritio.
En la presente invención, las regiones variables están humanizadas. Los anticuerpos humanizados (que incluyen anticuerpos con injertos de CDR) son moléculas que son anticuerpos con una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) procedentes de una especie no humana y una región marco procedente de una molécula de inmunoglobulina humana (remítase, p. ej . , a US 5,585,089 y WO91/09967) . Se debe tener en cuenta que quizás solo sea necesario transferir los residuos determinantes de la especificidad de las CDR en lugar de toda la CDR (remítase, por ejemplo, a Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Los anticuerpos humanizados pueden comprender además opcionalmente uno o más residuos marco derivados de la especie no humana a partir de la cual se obtuvieron las CDR.
En la presente invención, las CDR de VH1 y VL1 se obtienen a partir del anticuerpo conocido como A26, que se describe en WO2010/096418. Por consiguiente, en la proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención, el primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:l para CDR-H1, la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 23 para CDR-H2 y la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3 y el primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 4 o la SEQ ID NO: 24 para CDR-Ll, la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 5 para CDR-L2 y la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 6 para CDR-L3.
Se debe tener en cuenta que se pueden realizar una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en las CDR proporcionadas en la presente invención sin alterar de 5 forma significativa la capacidad del anticuerpo para unirse a OX40 y neutralizar la actividad de OX40. El efecto de cualesquiera sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos puede ser evaluado fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo, utilizando los métodos que se describen en W02010/096418 , para determinar la unión a OX40 y la inhibición de la interacción OX40/OX40L. Por consiguiente, la presente invención proporciona un anticuerpo biespecífico que presenta especificidad por OX40 humano, que comprende CDRH-1 (SEQ ID N0:1), CDRH-2 (SEQ ID NO : 2 ) , CDRH-3 (SEQ ID N0:3), CDRL-1 (SEQ ID N0:4), CDRL-2 (SEQ ID N0:5) y CDRL-3 (SEQ ID NO:6) según se muestra en la Figura 2(C), por ejemplo, en el cual uno o más aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, en una o más de las CDR se ha sustituido por otro aminoácido, tal como un aminoácido similar, según se define posteriormente en la presente.
En una modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende una cadena pesada, donde el primer dominio variable de la cadena pesada comprende tres CDR donde la secuencia de CDRH-1 presenta al menos un 90% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID N0:1, CDRH-2 presenta al menos un 90% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 2 y/o CDRH-3 presenta al menos un 90% de identidad o similitud respecto a 1 la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende una cadena pesada, donde el dominio variable de la cadena pesada comprende tres CDR donde la secuencia de CDRH-1 presenta al menos un 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID N0:1, CDRH-2 presenta al menos un 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 2 y/o CDRH-3 presenta al menos un 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 3.
El término "identidad", tal como se utiliza en la presente, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo aminoacídico es idéntico entre las secuencias. El término "similitud", tal como se utiliza en la presente, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el residuo aminoacídico es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, la leucina se puede sustituir por isoleucina o valina. Otros aminoácidos que se pueden sustituir a menudo el uno por el otro incluyen, sin carácter limitante: - fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas) ; - lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas) ; - aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas) ; - asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de tipo amida) ; y - cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre) . Los grados de identidad y similitud se pueden calcular fácilmente {Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. , ed. , Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds . , Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Seguence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J. , eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991, el software BLAST™ que se puede adquirir de NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol . 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet . 3:266-272; Madden, T.L. et al., 1996, Met . Enzymol . 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).
En otra modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende una cadena ligera, donde el primer dominio variable de la cadena ligera comprende tres CDR donde la secuencia de CDRL-1 presenta al menos un 90% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:4, CDRL-2 presenta al menos un 90% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 5 y/o CDRL-3 presenta al menos un 90% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 6. En otra modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende una cadena ligera, donde el primer dominio variable de la cadena ligera comprende tres CDR donde la secuencia de CDRL-1 presenta al menos un 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:4, CDRL-2 presenta al menos un 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 5 y/o CDRL-3 presenta al menos un 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID N0:6.
En una modalidad, la porción Fab de la proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico proporcionada en la presente invención es una molécula que es un anticuerpo humanizado o con injerto de CDR que comprende una o más de las CDR proporcionadas en las SEQ ID N0s:l, 2, 3, 4, 5 y/o 6 (Figura 2(C)) o sus variantes. La expresión "molécula que es un anticuerpo con injerto de CDR", tal como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula que es un anticuerpo donde la cadena ligera y/o pesada contiene una o más CDR (incluidas, si se desea, una o más CDR modificadas) procedentes de un anticuerpo donante (p. ej . , un anticuerpo monoclonal de murino) injertadas en un marco de la región variable de la cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo aceptor (p. ej . , un anticuerpo humano) . Para consultar un artículo de revisión, remítase a Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. En una modalidad, en lugar de transferir toda la CDR, solo se transfieren al marco del anticuerpo humano uno o más de los residuos determinantes de la especi icidad procedentes de cualquiera de las CDR descritas anteriormente en la presente (remítase, por ejemplo, a Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una modalidad, solo se transfieren al marco del anticuerpo humano los residuos determinantes de la especificidad procedentes de una o más de las CDR descritas anteriormente en la presente. En otra modalidad, solo se transfieren al marco del anticuerpo humano los residuos determinantes de la especificidad procedentes de cada una de las CDR descritas anteriormente en la presente.
Cuando se injertan las CDR o los residuos determinantes de la especificidad, se puede utilizar cualquier secuencia adecuada del marco de la región variable aceptora, teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donante a partir del cual se obtienen las CDR, incluidas las regiones marco de ratón, primate y ser humano. De forma adecuada, el anticuerpo con injerto de CDR de acuerdo con la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones marco aceptoras humanas, así como una o más de las CDR o los residuos determinantes de la especificidad descritos anteriormente. De este modo, en una modalidad se proporciona un anticuerpo con injerto de CDR neutralizante, donde el dominio variable comprende regiones marco aceptoras humanas y CDR donantes no humanas.
Los ejemplos de marcos humanos que se pueden utilizar en la presente invención son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al., supra) . Por ejemplo, KOL y NEWM se pueden utilizar para la cadena pesada, REI se puede utilizar para la cadena ligera, y EU, LAY y POM se pueden utilizar tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Como alternativa, se pueden utilizar secuencias de líneas germinales humanas; estas se pueden adquirir en: http : //vbase . mrc-cpe . cam . ac . uk/ En un anticuerpo con injerto de CDR de la presente invención, no es necesario que las cadenas ligera y pesada aceptoras se obtengan forzosamente a partir del mismo anticuerpo y, si se desea, pueden comprender cadenas compuestas que tengan regiones marco derivadas de diferentes cadenas .
Una región marco adecuada para el primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) de la presente invención se obtiene a partir de la secuencia 1-3 3-07 del subgrupo VH3 humano junto con JH4. Una región marco adecuada para la cadena ligera para el primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) se obtiene a partir de la secuencia 2-1 1-02 del subgrupo VKl de la línea germinal humana junto con JK4.
Además, en una región variable del anticuerpo con injerto de CDR de la presente invención, no es necesario que las regiones marco tengan exactamente la misma secuencia que la del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los residuos inusuales se pueden cambiar por residuos que aparezcan de forma más frecuente para aquella clase o tipo de cadena aceptora. Como alternativa, los residuos seleccionados en las regiones marco aceptoras se pueden cambiar de forma que correspondan al residuo que se encuentra en la misma posición en el anticuerpo donante (remítase a Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324) . Tales cambios se deberían mantener en el mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. En el documento WO 91/09967 se expone un protocolo para seleccionar residuos en las regiones marco aceptoras que pueden requerir cambios.
De forma adecuada, en la primera región variable de la cadena pesada (VH1) de la presente invención, si la cadena pesada aceptora tiene la secuencia 1-3 3-07 de VH3 humana junto con JH4 , entonces las regiones marco aceptoras de la cadena pesada comprenden, además de una o más CDR donantes, un residuo donante en al menos una de las posiciones 37, 73, 78 o 94 (según Kabat et al., (supra) ) . Por consiguiente, se proporciona una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico, donde al menos los residuos en las posiciones 37, 73, 78 y 94 del primer dominio variable de la cadena pesada son residuos donantes.
De forma adecuada, en la primera región variable de la cadena ligera (VL1) de la presente invención, si la cadena ligera aceptora tiene la secuencia 2-1 1-02 del subgrupo VK1 humano junto con JK4 , entonces las regiones marco aceptoras de la cadena ligera comprenden, además de una o más CDR donantes, un residuo donante en al menos una de las posiciones 64 o 71. Por consiguiente, se proporciona una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico, donde al menos los residuos en las posiciones 64 y 71 del primer dominio variable de la cadena ligera son residuos donantes.
Los residuos donantes son residuos procedentes del anticuerpo donante, es decir, el anticuerpo a partir del cual se obtienen originariamente las CDR.
En una modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende una cadena pesada, donde el primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 8 de la Figura 2(B).
Se debe tener en cuenta que se pueden realizar una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, en los primeros dominios variables de la cadena ligera y pesada, que se proporcionan en la presente invención, sin alterar de forma significativa la capacidad de la proteína de fusión que es un anticuerpo para unirse a OX40 y neutralizar la actividad de OX40. El efecto de cualesquiera sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos puede ser evaluado fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo, utilizando los métodos que se describen en WO2010/096418 , para determinar la unión a 0X40 y el bloqueo del ligando.
En una modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende una cadena pesada, donde el primer dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que presenta al menos un 60% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 8 de la Figura 2(B). En una modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena pesada (VH1) , donde el primer dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que presenta al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 8.
En una modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende una cadena ligera, donde el primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 7 de la Figura 2(A) .
En otra modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende una cadena ligera, donde el primer dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que presenta al menos un 60% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 7. En una modalidad, la proteína de fusión que es un anticuerpo de la presente invención comprende una cadena ligera, donde el primer dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que presenta al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 7.
En una modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende una cadena pesada, donde el primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 8, y una cadena ligera, donde el primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 7.
En otra modalidad de la invención, la proteína de fusión que es un anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde el primer dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que presenta al menos un 60% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 8 y el primer dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que presenta al menos un 60% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 7. De forma adecuada, la proteína de fusión que es un anticuerpo comprende una cadena pesada, donde el primer dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que presenta al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 8 , y una cadena ligera, donde el primer dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que presenta al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 7.
En la proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención, la cadena pesada comprende un dominio CH1 y la cadena ligera comprende un dominio CL, ya sea kappa o lambda.
En una modalidad, una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención comprende una cadena pesada, donde la cadena pesada comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 10, y una cadena ligera, donde la cadena ligera comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 9.
Se debe tener en cuenta que se pueden realizar una o más sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2 aminoácidos, en los dominios variables y/o constantes del anticuerpo que se proporcionan en la presente invención sin alterar de forma significativa la capacidad del anticuerpo para unirse a OX40 y neutralizar la actividad de OX40. El efecto de cualesquiera sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos puede ser evaluado fácilmente por un experto en la técnica, por ejemplo, utilizando los métodos que se describen en WO2010096418 , para determinar la unión a OX40 y el bloqueo de la interacción OX40/OX40L.
En una modalidad de la invención, la proteína de fusión que es un anticuerpo comprende una cadena pesada, donde los dominios VHl y CH1 de la cadena pesada comprenden una secuencia que presenta al menos un 60% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 10. De forma adecuada, la fusión que es un anticuerpo comprende una cadena pesada, donde los dominios VHl y CH1 de la cadena pesada comprenden una secuencia que presenta al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 10.
En una modalidad, una molécula de fusión que es un anticuerpo biespecífico de acuerdo con la presente invención comprende una cadena ligera que comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 9 de la Figura 2(D) .
En una modalidad de la invención, la proteína de fusión que es un anticuerpo comprende una cadena ligera, donde los dominios VL1 y CH1 de la cadena ligera comprenden una secuencia que presenta al menos un 60% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 9. Por ejemplo, la proteína de fusión que es un anticuerpo comprende una cadena ligera, donde los dominios VL1 y CL de la cadena ligera comprenden una secuencia que presenta al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 9.
El segundo antígeno que se une a la proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención es la albúmina de suero humano. Esta se une a la porción Fv de Fab-dsFv, la cual está constituida por los segundos dominios variables de la cadena ligera y pesada, VH2 y VL2. En la presente invención, VH2 y VL2 se obtienen a partir de los anticuerpos descritos en WO2010/035012 y representan un injerto mejorado más humano de ese anticuerpo.
En una modalidad, el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) presenta la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 11 de la Figura 3(a) .
En una modalidad, el segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) presenta la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 12 de la Figura 3(B) .
Por consiguiente, la presente invención proporciona una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico, la cual se une a 0X40 humano y a albúmina de suero humano, que comprende : una cadena pesada que comprende, en secuencia desde el extremo N-terminal, un primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) , un dominio CH1 y un segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) , una cadena ligera que comprende, en secuencia desde el extremo N-terminal, un primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) , un dominio CL y un segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) , donde las cadenas ligera y pesada están alineadas de un modo tal que VH1 y VL1 forman un primer sitio de unión al antígeno y VH2 y VL2 forman un segundo sitio de unión al antígeno, donde el antígeno que se une al primer sitio de unión al antígeno es OX40 humano y el antígeno que se une al segundo sitio de unión al antígeno es albúmina de suero humano, donde el primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID N0:1 para CDR-H1, la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 2 para CDR-H2 y la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3 y el primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: para CDR-L1, la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 5 para CDR-L2 y la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3, donde el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) tiene la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 11 y el segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) tiene la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 12 y el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) y el segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) están conectados mediante un enlace disulfuro.
Preferentemente, el dominio CH1 y el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) están conectados mediante un conector y el dominio CL y el segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) están conectados mediante un conector. Se puede utilizar cualquier secuencia conectora peptídica adecuada y esta puede ser la misma en cada cadena o diferente Los conectores adecuados se han descrito previamente en WO2010/035012 y se incorporan a la presente por referencia. En la Figura 3(C) y 3(D) se muestran ejemplos de conectores adecuados. En una modalidad, el conector entre el dominio CH1 y el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) comprende o está constituido por la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:13 de la Figura 3(C). En una modalidad, el conector entre el dominio CH1 y el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) comprende o está constituido por la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO:14 de la Figura 3(C) . En una modalidad, el conector entre el dominio CL y el segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) comprende o está constituido por la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 14 de la Figura 3(D) .
En una modalidad, el conector en la cadena ligera es una secuencia de 15 aminoácidos, en particular GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 29) .
En una modalidad, el conector en la cadena pesada es una secuencia de 16 aminoácidos, en particular SGGGGSGGGGTGGGGS (SEQ ID NO: 30) .
En una modalidad, la presente invención proporciona una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico, donde la cadena pesada comprende o está constituida por la secuencia que se proporciona en la Figura 3(E) (SEQ ID NO:15) y la cadena ligera comprende o está constituida por la secuencia que se proporciona en la Figura 3(F) (SEQ ID NO:16) En una modalidad de la invención, la proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde la cadena pesada comprende una secuencia que presenta al menos un 60% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 15 y la cadena ligera comprende una secuencia que presenta al menos un 60% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 16. En general, la fusión que es un anticuerpo comprende una cadena pesada, donde la cadena pesada comprende una secuencia que presenta al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 15, y una cadena ligera, donde la cadena ligera comprende una secuencia que presenta al menos un 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de identidad o similitud respecto a la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 16.
Las moléculas de fusión que son anticuerpos de la presente invención presentan de forma adecuada una afinidad de unión elevada, en particular una afinidad picomolar por 0X40 humano y una afinidad nanomolar por la albúmina de suero humano. La afinidad se puede medir utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluida la resonancia de plasmones superficiales, p. e . , BIAcore™, como se describe para 0X40 en WO2010096418 y para la albúmina de suero en WO2010/035012 , utilizando 0X40 o albúmina de suero naturales aislados o recombinantes o una proteína/polipéptido de fusión adecuado.
En un ejemplo, la afinidad se mide utilizando 0X40 humano recombinante de dominio extracelular, como se describe en WO2010/096418. En un ejemplo, el OX40 humano recombinante de dominio extracelular utilizado es un dímero, por ejemplo, un dímero de fusión Fe. De forma adecuada, las moléculas de fusión que son anticuerpos de la presente invención presentan una afinidad de unión para OX40 humano aislado de aproximadamente 200 pM o inferior. En una modalidad, la molécula que es un anticuerpo de la presente invención presenta una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o inferior. En una modalidad, la molécula que es un anticuerpo de la presente invención presenta una afinidad de unión de aproximadamente 50 pM o inferior. En una modalidad, la molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención presenta una afinidad de unión de aproximadamente 40 pM o inferior.
Las moléculas de fusión que son anticuerpos de la presente invención presentan de forma adecuada una afinidad de unión elevada para 0X40 humano que se expresa en la superficie de linfocitos T activados, por ejemplo, una afinidad nanomolar o picomolar. La afinidad se puede medir utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, incluido el método que se describe en O2010096418 que utiliza linfocitos T humanos CD4+ OX40+ activados. En particular, las moléculas de fusión que son anticuerpos de la presente invención presentan una afinidad de unión para OX40 humano que se expresa en la superficie celular de aproximadamente 2 nM o mejor. En un ejemplo, las moléculas que son anticuerpos de la presente invención presentan una afinidad de unión para 0X4 O humano que se expresa en la superficie celular de aproximadamente 1 nM o mejor. En otro ejemplo, las moléculas que son anticuerpos de la presente invención presentan una afinidad de unión para 0X40 humano que se expresa en la superficie celular de aproximadamente 0.5 nM o mejor. En otro ejemplo, las moléculas que son anticuerpos de la presente invención presentan una afinidad de unión para 0X40 humano que se expresa en la superficie celular de aproximadamente 0.2 nM o mejor.
De forma adecuada, las moléculas de fusión que son anticuerpos de la presente invención presentan una afinidad de unión para albúmina de suero humano aislada de aproximadamente 50 nM o inferior. De forma adecuada, las moléculas de fusión que son anticuerpos de la presente invención presentan una afinidad de unión para albúmina de suero humano aislada de aproximadamente 20 nM o inferior. En una modalidad, la molécula que es un anticuerpo de la presente invención presenta una afinidad de unión de aproximadamente 10 nM o inferior. En una modalidad, la molécula que es un anticuerpo de la presente invención presenta una afinidad de unión de aproximadamente 5 nM o inferior. En una modalidad, la molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención presenta una afinidad de unión de aproximadamente 2 nM o inferior.
Las moléculas de fusión que son anticuerpos de la presente invención se pueden unir a albúmina de suero humano y a albúmina de suero de macaco cangrejero, rata y ratón. En una modalidad, la proteína de fusión que es un anticuerpo de la presente invención se une a albúmina de suero de macaco cangrejero con una afinidad de 5 nM o inferior. En una modalidad, la proteína de fusión que es un anticuerpo de la presente invención se une a albúmina de suero de ratón con una afinidad de 5 nM o inferior.
Las moléculas de fusión que son anticuerpos de la presente invención son capaces de unirse a 0X40 humano y a albúmina de suero humano de forma simultánea.
De forma beneficiosa, las moléculas de fusión de la presente invención presentan una afinidad elevada por 0X40 y también presentan una semivida adecuada in vivo para que sean terapéuticamente útiles, por ejemplo, la semivida está comprendida en el intervalo de 5-15 días, tal como 7-11 días.
Se debe tener en cuenta que la afinidad por 0X40 humano y/o albúmina de suero humano de la proteína de fusión que es un anticuerpo proporcionada en la presente invención se puede alterar utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por consiguiente, la presente invención también se refiere a variantes de las moléculas que son anticuerpos de la presente invención, las cuales presentan una afinidad mejorada por 0X40 y por la albúmina de suero humano. Tales variantes se pueden obtener mediante una serie de protocolos de maduración de la afinidad, que incluyen la mutación de las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol . , 254, 392-403, 1995), la transposición de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10 , 779-783, 1992), el uso de cepas mutadoras de E. coli (Lo et al., J. Mol. Biol., 250 , 359-368, 1996), la transposición de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol . , 8, 724-733, 1997), la presentación de fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256 , 77-88, 1996) y PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Vaughan et al. (supra) discuten estos métodos de maduración de la afinidad.
En una modalidad, las moléculas de fusión que son anticuerpos biespecífieos de la presente invención bloquean la interacción entre 0X40 y 0X40L. En el documento WO2010/096418 se describen numerosos ensayos adecuados para determinar la capacidad de un anticuerpo para bloquear esta interacción. En una modalidad, la presente invención proporciona una proteína de fusión que es un anticuerpo con especificidad por OX40 humano, que es capaz de inhibir la unión de 0X4OL humano (cuando se evalúa con una concentración final de 2 pg/ml) a linfocitos T CD4+OX40+ humanos activados en un 50% con una concentración inferior a 0.5 nM. En una modalidad, el OX40L humano utilizado en el ensayo es 0X40 humano natural. En una modalidad, el 0X40 humano utilizado en el ensayo es OX40 humano recombinante . si se desea, un anticuerpo para su uso en la presente invención se puede conjugar con una o más moléculas efectoras. Se debe tener en cuenta que la molécula efectora puede comprender una única molécula efectora o dos o más de tales moléculas enlazadas de modo que formen un único resto que se pueda unir a los anticuerpos de la presente invención. Cuando se desee obtener un fragmento de anticuerpo enlazado a una molécula efectora, esto se puede preparar mediante procedimientos de ADN recombinante o procedimientos químicos estándar, en los cuales el fragmento de anticuerpo se enlaza directamente o mediante un agente de acoplamiento a la molécula efectora. Las técnicas para conjugar tales moléculas efectoras con anticuerpos son muy conocidas en la técnica (remítase a Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2.a ed. , Robinson et al., eds . , 1987, págs . 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol . Rev. , 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los que se describen en WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO 03/031581. Como alternativa, cuando la molécula efectora es una proteína o un polipéptido, la unión se puede conseguir utilizando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en WO 86/01533 y EP0392745.
La expresión "molécula efectora", tal como se utiliza en la presente, incluye, por ejemplo, agentes antineoplásticos , fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, otro anticuerpo o fragmentos de anticuerpo, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos y sus fragmentos, p. ej . , ADN, ARN y sus fragmentos, radionucleidos , particularmente radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos marcadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que se pueden detectar mediante espectroscopia ESR o RMN.
Los ejemplos de moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos, incluido cualquier agente que sea perjudicial para las células (p. ej . , que las destruya) . Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas , epotilonas, estaurosporina, maitansinoides , espongistatinas , rizoxina, halicondrinas , roridinas, hemiasterlinas , taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides , procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de estos .
Las moléculas efectoras también incluyen, sin carácter limitante, antimetabolitos (p. ej . , metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo, decarbacina) , agentes alquilantes (p. ej . , mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfano, dibromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiaminplatino (II) (DDP) , cisplatino) , antraciclinas (p. ej . , daunorrubicina (antiguamente daunomicina) y doxorrubicina) , antibióticos (p. ej . , dactinomicina (antiguamente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC) , caliqueamicinas o duocarmiciñas) y agentes antimitóticos (p. ej . , vincristina y vinblastina) .
Otras moléculas efectoras pueden incluir radionucleidos quelados tales como 11:LIn y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252 , Iridio192 y Volframio188/Renio188 ; o fármacos tales como, sin carácter limitante, alquilfosfocolinas , inhibidores de topoisomerasas I, taxoides y suramina.
Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, sin carácter limitante, enzimas proteolíticas , hidrolasas, liasas, isomerasas, transíerasas . Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, sin carácter limitante, inmunoglobulinas , toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o la toxina diftérica, una proteína tal como la insulina, el factor de necrosis tumoral, el interferón a, el interferón ß, el factor de crecimiento de nervios, el factor de crecimiento derivado de plaquetas o el activador del plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, p. ej . , angiostatina o endostatina, o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1) , interleucina-2 (IL-2) , el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) , el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) , el factor de crecimiento de nervios (NGF) u otros factores de crecimiento e inmunoglobulinas .
Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, en el diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes , nucleidos radioactivos, metales emisores de positrones (para su uso en tomografía de emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Remítase en general a la Patente de EE. UU. N.° 4.741.900 para consultar los iones metálicos que se pueden conjugar con los anticuerpos para su uso en diagnósticos. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina ; los materiales luminiscentes adecuados incluyen el luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y acecuorina; y los nucleidos radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In y 99Tc.
Cuando la molécula efectora es un polímero, en general puede ser un polímero sintético o de origen natural, por ejemplo, un polímero de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, o un polisacárido ramificado o no ramificado, p. ej . , un homo- o heteropolisacárido .
Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi .
Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen poli (etilenglicol ) , poli (propilenglicol) , poli (alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituidos, o derivados de estos, especialmente poli (etilenglicol) opcionalmente sustituido, tal como metoxipoli (etilenglicol) o derivados de este.
Los polímeros de origen natural específicos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de estos.
Se pretende que el término "derivados" , tal como se utiliza en la presente, incluya derivados reactivos, por ejemplo, grupos reactivos selectivos para tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar unido al polímero directamente o a través de un segmento conector. Se debe tener en cuenta que el residuo de un grupo de este tipo formará parte en algunos casos del producto como el grupo conector entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.
El tamaño del polímero se puede modificar según se desee, pero generalmente estará comprendido en un intervalo de pesos moleculares medios de 500 Da a 50 000 Da, por ejemplo, de 5000 a 40 000 Da, tal como de 20 000 a 40 000 Da.
En un ejemplo, las moléculas efectoras adecuadas se pueden unir a través de cualquier cadena lateral de un aminoácido o grupo funcional de un aminoácido terminal disponible localizado en la proteína de fusión que es un anticuerpo, por ejemplo, cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Tales aminoácidos pueden existir de forma natural en el fragmento de anticuerpo o se pueden modificar en el fragmento utilizando métodos de ADN recombinante (remítase, por ejemplo, a US 5,219,996, US 5,667,425 y WO 98/25971) .
La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la o las cadenas pesadas y/o ligeras de una molécula que es un anticuerpo de la presente invención. De forma adecuada, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o la cadena ligera de una molécula que es un anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo, producido mediante procesamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de estos.
Las secuencias de ADN que codifican una molécula que es un anticuerpo de la presente invención se pueden obtener mediante métodos muy conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican parte o la totalidad de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo se pueden sintetizar según se desee a partir de las secuencias de ADN determinadas o en función de las secuencias de aminoácidos correspondientes.
El ADN que codifica las secuencias marco aceptoras se encuentra generalmente a la disposición de los expertos en la técnica y se puede sintetizar fácilmente en función de sus secuencias de aminoácidos conocidas.
Para preparar las secuencias de ADN que codifican la molécula que es un anticuerpo de la presente invención, se pueden utilizar técnicas estándar de biología molecular. Las secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar completamente o en parte utilizando técnicas de síntesis de oligonucleótidos . Se pueden utilizar técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) según convenga.
Se proporcionan ejemplos de secuencias adecuadas en la SEQ ID NO:21 de la Figura 5 (a), la SEQ ID NO:22 de la Figura 5(b), la SEQ ID NO: 23 de la Figura 6(a) y la SEQ ID NO: 24 de la Figura 6(b). Los nucleótidos 1-63 en la SEQ ID N0:21 y 1-63 en la SEQ ID NO: 23 codifican la secuencia del péptido señal OmpA, que se escinde para obtener una molécula de fusión que es un anticuerpo antagonista de la presente invención. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada de una proteína de fusión que es un anticuerpo de la presente invención que comprende la SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena ligera de una molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención que comprende la SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.
Se proporcionan otros ejemplos de secuencias adecuadas en la SEQ ID NO:25 de la Figura 7(a), la SEQ ID NO:26 de la Figura 7(b), la SEQ ID NO:27 de la Figura 8(a) y la SEQ ID NO:28 de la Figura 6(b). Los nucleótidos 1-57 en la SEQ ID NO: 25 y 1-60 en la SEQ ID NO: 27 codifican la secuencia del péptido señal del anticuerpo de ratón B72.3 (Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1(6) 499-505), que se escinde para obtener una molécula de fusión que es un anticuerpo antagonista de la presente invención. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada de una proteína de fusión que es un anticuerpo de la presente invención que comprende la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26. La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena ligera de una molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención que comprende la SEQ ID NO: 27 o SEQ ID NO: 28.
La presente invención también se refiere a un vector de expresión o clonación que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Por consiguiente, se proporciona un vector de expresión o clonación que comprende una o más secuencias de ADN que codifican una proteína de fusión que es un anticuerpo de la presente invención. De forma adecuada, el vector de expresión o clonación comprende dos secuencias de ADN, las cuales codifican la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula que es un anticuerpo de la presente invención, respectivamente. De forma adecuada, un vector de acuerdo con la presente invención comprende las secuencias que se proporcionan en la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 23. Los nucleótidos 1-63 en la SEQ ID NO: 21 y 1-63 en la SEQ ID NO: 23 codifican la secuencia del péptido señal de OmpA Los métodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son de uso común para los expertos en la técnica. En este sentido, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology" , 1999, F. M. Ausubel (ed) , Wiley Interscience, Nueva York y al "Maniatis Manual" producido por Cold Spring Harbor Publishing.
También se proporciona una célula huésped que comprende uno o más vectores de expresión o clonación que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican una proteína de fusión que es un anticuerpo de la presente invención. Se puede utilizar cualquier sistema adecuado de célula huésped/vector para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula que es un anticuerpo de la presente invención. Se pueden utilizar sistemas bacterianos, por ejemplo, E. coli y otros sistemas microbianos, o también se pueden utilizar sistemas de expresión en células huésped eucariotas, por ejemplo, de mamífero. Las células huésped de mamífero adecuadas incluyen CHO, células de mieloma o células de hibridoma.
La presente invención también proporciona un proceso para producir una molécula de fusión que es un anticuerpo de acuerdo con la presente invención que comprende cultivar una célula huésped que contiene un vector de la presente invención en condiciones adecuadas para provocar la expresión de la proteína a partir del ADN que codifica la molécula que es un anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula que es un anticuerpo.
Para producir productos que comprenden las cadenas tanto pesada como ligera, la línea celular se puede transfectar con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. De manera alternativa, se puede utilizar un único vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.
Dado que las proteínas de fusión que son anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o la profilaxis de una afección patológica, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula que es un anticuerpo de la presente invención combinada con uno o más de los siguientes: un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de una proteína de fusión que es un anticuerpo de la invención para la elaboración de un medicamento. La composición se suministrará habitualmente como parte de una composición farmacéutica estéril que incluirá normalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona un proceso para preparar una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de los siguientes: un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
La molécula de fusión que es un anticuerpo puede ser el único principio activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico, o puede ir acompañada de otros principios activos, incluidos otros ingredientes que sean anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos anti-TNF, anti-lL-?ß, anti-linfocitos T, anti-IFNy o anti-LPS, o ingredientes que no sean anticuerpos tales como xantinas. Otros principios activos adecuados incluyen anticuerpos capaces de inducir tolerancia, por ejemplo, anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4.
En una modalidad adicional, la proteína de fusión que es un anticuerpo o la composición de acuerdo con la descripción se emplea combinada con un agente farmacéuticamente activo adicional, por ejemplo, un corticosteroide (tal como propionato de fluticasona) y/o un agonista beta-2 (tal como salbutamol, salmeterol o formoterol) o inhibidores del crecimiento y la proliferación celulares (tales como rapamicina, ciclofosfamida, metotrexato) o, como alternativa, un inhibidor de CD28 y/o CD40. En una modalidad, el inhibidor es una molécula de bajo peso molecular. En otra modalidad, el inhibidor es un anticuerpo específico para la diana.
Las composiciones farmacéuticas comprenden de forma adecuada una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión que es un anticuerpo de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a la cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección objetivo, o para exhibir un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente en ensayos de cultivos celulares o en modelos con animales, habitualmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo con animales también se puede utilizar para determinar el intervalo de concentraciones y la vía de administración adecuados. Tal información se puede utilizar posteriormente para determinar las dosis y las vías de administración útiles en seres humanos.
La cantidad terapéuticamente eficaz exacta para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado patológico, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la o las combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar mediante experimentación rutinaria y se deja al criterio del médico. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz estará comprendida entre 0.01 mg/kg y 50 mg/kg, por ejemplo, entre 0.1 mg/kg y 20 mg/kg. Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar de forma conveniente en formas farmacéuticas unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis.
Las composiciones se pueden administrar individualmente a un paciente o se pueden administrar combinadas (p. ej . , de forma simultánea, secuencial o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.
La dosis que se administra de la molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la afección que se ha de tratar, el grado de inflamación presente y de si la molécula que es un anticuerpo se está utilizando de forma profiláctica o para tratar una afección existente.
La frecuencia de la dosis dependerá de la semivida de la molécula de fusión que es un anticuerpo y de la duración de su efecto. Si la molécula que es un anticuerpo tiene una semivida corta (p. ej . , de 2 a 10 horas), quizás sea necesario administrar una o más dosis por día. Como alternativa, si la molécula que es un anticuerpo tiene una semivida larga (p. ej.. , de 2 a 15 días), quizás solo sea necesario administrar una dosis una vez al día, una vez a la semana o incluso una vez cada 1 o 2 meses.
El portador farmacéuticamente aceptable no debería inducir por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y no debería ser tóxico. Los portadores adecuados pueden ser macromoléculas de gran tamaño que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polipéptidos , liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas .
Se pueden utilizar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los portadores farmacéuticamente aceptables en las composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, puede haber sustancias auxiliares presentes en estas composiciones, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias amortiguadoras del pH. Estos portadores hacen posible que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas y suspensiones, para que el paciente las ingiera.
Las formas de administración adecuadas incluyen formas adecuadas para administración parenteral, p. ej . , por inyección o infusión, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. En los casos en los que el producto está destinado a inyección o infusión, puede adoptar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un portador acuoso u oleoso y puede contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, la molécula que es un anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstituirla antes de su uso con un líquido estéril adecuado.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos que se han de tratar pueden ser animales. Sin embargo, en una o más modalidades, las composiciones están adaptadas para la administración a sujetos humanos.
De forma adecuada, en las formulaciones de acuerdo con la presente descripción, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento, por ejemplo, si el pH de la formulación es 7 entonces puede ser adecuado un pl de 8-9 o superior. Sin pretender vincularse a ninguna teoría, se cree que esto puede proporcionar en última instancia una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento permanece en solución.
En un aspecto, de forma beneficiosa la molécula de fusión de la presente descripción no tiene un pl que corresponda a una molécula global neutra. Esto hace que la molécula sea menos propensa a agregarse.
Las composiciones farmacéuticas de esta invención se pueden administrar mediante cualquier número de vías, que incluyen, sin carácter limitante, la vía oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial , intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, remítase a WO 98/20734), subcutánea, intraperitoneal , intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. También se pueden utilizar hipoaerosoles para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Habitualmente , las composiciones terapéuticas se pueden preparar como composiciones inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para la solución o suspensión en portadores líquidos antes de la inyección.
El suministro directo de las composiciones se llevará a cabo en general mediante inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se suministrarán al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar a una lesión. El tratamiento de las dosis puede ser un programa de una única dosis o un programa de múltiples dosis.
Se debe tener en cuenta que el principio activo en la composición será una molécula que es un anticuerpo. Como tal, este será sensible a la degradación en el aparato digestivo. De este modo, si la composición se va a administrar mediante una vía que utilice el aparato digestivo, la composición deberá contener agentes que protejan al anticuerpo contra la degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez que haya sido absorbido desde el aparato digestivo.
En Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991) se puede consultar una exposición exhaustiva de portadores farmacéuticamente aceptables.
En una modalidad, la formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas, incluida la inhalación.
Los preparados inhalables adecuados incluyen polvos inhalables, aerosoles dosificadores que contienen gases propelentes o soluciones inhalables exentas de gases propelentes. Los polvos inhalables de acuerdo con la descripción que contienen la sustancia activa pueden estar constituidos únicamente por las sustancias activas mencionadas anteriormente o por una mezcla de las sustancias activas mencionadas anteriormente con un excipiente fisiológicamente aceptable.
Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (p. ej . , glucosa o arabinosa) , disacáridos (p. ej . , lactosa, sacarosa, maltosa), oligo- y polisacáridos (p . ej . , dextranos) , polialcoholes (p. ej . , sorbitol, manitol, xilitol) , sales (p. ej . , cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sí. Convenientemente se utilizan mono- o disacáridos, estando el uso de lactosa o glucosa particularmente pero no exclusivamente en forma de sus hidratos.
Las partículas para la deposición en el pulmón requieren un tamaño de partícula inferior a 10 mieras, tal como de 1-9 mieras, por ejemplo, de 0.1 a 5 µ??, en particular de 1 a 5 µp?. El tamaño de partícula del principio activo (tal como el anticuerpo o fragmento) tiene una importancia primordial.
Los gases propelentes que se pueden utilizar para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la técnica. Los gases propelentes adecuados se seleccionan entre hidrocarburos tales como n-propano, p-butano o isobutano y halohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propelentes mencionados anteriormente se pueden utilizar por sí solos o mezclas entre sí.
Los gases propelentes particularmente adecuados son los derivados halogenados de alcanos seleccionados entre TG 11, TG 12, TG 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, son particularmente adecuados TG134a (1, 1, 1, 2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) , y sus mezclas.
Los aerosoles inhalables que contienen gases propelentes también pueden contener otros ingredientes tales como codisolventes , estabilizantes, agentes tensioactivos (tensioactivos) , antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica .
Los aerosoles inhalables que contienen un gas propelente de acuerdo con la invención pueden contener hasta un 5% en peso de la sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, de un 0.002 a un 5% en peso, de un 0.01 a un 3% en peso, de un 0.015 a un 2% en peso, de un 0.1 a un 2% en peso, de un 0.5 a un 2% en peso o de un 0.5 a un 1% en peso del principio activo.
Como alternativa, las administraciones tópicas al pulmón también se pueden realizar mediante la administración de una formulación en solución o suspensión líquida, por ejemplo, empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (p. ej . , el nebulizador Pari LC-Jet Plus (R) conectado a un compresor Parí Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.) .
La proteína de fusión que es un anticuerpo de la invención se puede suministrar dispersada en un disolvente, p. ej . , en forma de una solución o una suspensión. Se puede suspender en una solución fisiológica adecuada, p. ej . , una solución salina u otro disolvente farmacológicamente aceptable o una solución tamponada. Las soluciones tamponadas conocidas en la técnica pueden contener de 0.05 mg a 0.15 mg de edetato disódico, de 8.0 mg a 9.0 mg de NaCl, de 0.15 mg a 0.25 mg de polisorbato, de 0.25 mg a 0.30 mg de ácido cítrico anhidro, y de 0.45 mg a 0.55 mg de citrato de sodio por 1 mi de agua para conseguir un pH de aproximadamente 4.0-5.0. Una suspensión puede emplear, por ejemplo, un anticuerpo liofilizado .
Las formulaciones terapéuticas en suspensión o solución también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son muy conocidos en la técnica e incluyen tampones (p. ej . , tampón de citrato, tampón de fosfato, tampón de acetato y tampón de bicarbonato) , aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos , proteínas (p. ej . , albúmina de suero) , EDTA, cloruro sódico, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las soluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o en microesferas biodegradables . La formulación se proporcionará generalmente en una forma sustancialmente estéril, empleando procesos de fabricación estériles .
Esto puede incluir la producción y esterilización por filtración de la solución/disolvente tamponado utilizado para la formulación, la suspensión aséptica del anticuerpo en la solución/disolvente tamponado estéril, y la dispensación de la formulación en receptáculos estériles mediante métodos con los cuales estarán familiarizados los expertos en la técnica.
La formulación nebulizable de acuerdo con la presente descripción se puede proporcionar, por ejemplo, como unidades de dosis individuales (p. ej . , viales o recipientes de plástico cerrados herméticamente) envasadas en envoltorios de papel de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, p. ej . , 2 mL, de disolvente/solución tamponado.
Las proteínas de fusión que son anticuerpos descritas en la presente pueden ser adecuadas para el suministro mediante nebulización.
También se contempla que el anticuerpo de la presente invención se pueda administrar mediante uso de terapia génica. Para conseguir esto, las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de la molécula que es un anticuerpo bajo el control de componentes de ADN adecuados se introducen en un paciente de forma que las cadenas del anticuerpo se expresen a partir de las secuencias de ADN y se acoplen in situ.
La presente invención también proporciona una molécula de fusión que es un anticuerpo (o composiciones que la comprenden) para su uso en el control de enfermedades inflamatorias, por ejemplo, una enfermedad inflamatoria aguda o crónica. De forma adecuada, la molécula que es un anticuerpo (o composiciones que la comprenden) se puede utilizar para reducir el proceso inflamatorio o para prevenir el proceso inflamatorio. En una modalidad, se proporciona una reducción in vivo de linfocitos T activados, en particular los implicados en respuestas inmunitarias inflamatorias inadecuadas, por ejemplo, que se dirigen hacia la proximidad/localización de tal respuesta.
La reducción de linfocitos T activados, tal como se utiliza en la presente, puede ser una reducción de un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por ciento o superior en comparación con los linfocitos antes del tratamiento o sin tratamiento. Convenientemente, el tratamiento con un anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la presente invención puede permitir la reducción en el nivel de linfocitos T activados sin reducir el nivel general de linfocitos T (linfocitos T desactivados) del paciente. Esto puede dar como resultado menos efectos secundarios y posiblemente puede evitar la disminución de linfocitos T en el paciente.
La presente invención también proporciona la molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención para su uso en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por 0X40 o que está asociado con un incremento del nivel de OX40. La afección patológica se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo constituido por infecciones (víricas, bacterianas, fúngicas y parasitarias), choque endotóxico asociado con una infección, artritis, artritis reumatoide, asma, EPOC, enfermedad inflamatoria pélvica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad de Peyronie, celiaquía, enfermedad de la vesícula biliar, enfermedad pilonidal, peritonitis, psoriasis, vasculitis, adhesiones quirúrgicas, apoplejía, diabetes de tipo I, enfermedad de Lyme, artritis, meningoencefalitis , uveitis autoinmunitaria, trastornos inflamatorios del sistema nervioso central y periférico mediados por el sistema inmunitario tales como esclerosis múltiple, lupus (tal como lupus eritematoso sistémico y nefritis lúpica) y síndrome de Guillain-Barr, dermatitis atópica, hepatitis autoimmunitaria, alveolitis fibrosante, enfermedad de Graves, nefropatía por IgA, púrpura idiopática trombocitopénica, enfermedad de eniere, pénfigo, cirrosis biliar primaria, sarcoidosis, esclerodermia, granulomatosis de Wegener, otros trastornos autoinmunitarios , pancreatitis, traumatismo (cirugía) , enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplantes, cardiopatía, incluidas las enfermedades isquémicas tales como infarto de miocardio, así como aterosclerosis , coagulación intravascular, resorción ósea, osteoporosis , osteoartritis , periodontitis e hipoclorhidria .
En una modalidad, la proteína de fusión que es un anticuerpo de acuerdo con la invención se utiliza en el tratamiento de alergia, EPOC, enfermedad autoinmunitaria, artritis reumatoide, asma, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, miastenia grave, enfermedad de Graves, rechazo de trasplantes, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schonlein, esclerosis sistémica o inflamación pulmonar inducida por virus.
En una modalidad, la proteína de fusión que es un anticuerpo de acuerdo con la invención se utiliza en el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo constituido por alergia, EPOC, enfermedad autoinmunitaria, artritis reumatoide, asma, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, miastenia grave, enfermedad de Graves, rechazo de trasplantes, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schonlein, esclerosis sistémica e inflamación pulmonar inducida por virus .
La presente invención también proporciona una molécula de fusión que es un anticuerpo de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento o la profilaxis del dolor, en particular el dolor asociado con la inflamación.
En una modalidad, el mecanismo mediante el cual actúan las moléculas de fusión de la presente descripción incluye uno o más de los siguientes: inhibición de la proliferación o supervivencia de los linfocitos T, mejora de la generación de TReg, reducción de la diferenciación de linfocitos B y/o disminución de la producción de citocinas.
La presente invención proporciona además el uso de una molécula de fusión que es un anticuerpo o una composición de acuerdo con la presente invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por 0X 0 o que está asociado con un incremento del nivel de OX40, en particular el trastorno patológico es artritis reumatoide, asma o EPOC.
La presente invención proporciona además el uso de una molécula que es un anticuerpo, un fragmento o una composición de acuerdo con la presente invención en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una o más indicaciones médicas descritas en la presente.
Una molécula de fusión que es un anticuerpo o una composición de la presente invención se puede utilizar en cualquier terapia en la que se desee reducir los efectos de 0X40 en el cuerpo humano o animal. 0X40 puede estar circulando en el organismo o puede estar presente en un nivel indeseablemente elevado localizado en un sitio particular del organismo, por ejemplo, un sitio de inflamación.
En una modalidad, la molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención, o una composición que la comprende, se utiliza para el control de la enfermedad inflamatoria, p. ej . , según se describe en la presente.
La presente invención también proporciona un método para tratar sujetos humanos o animales que padecen o corren el riesgo de padecer un trastorno mediado por OX40, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad eficaz de la molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención o una composición que la comprende.
En una modalidad, se proporciona una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico purificada, la cual se une a 0X40 humano y a albúmina de suero humano, en una forma sustancialmente purificada, en particular exenta o sustancialmente exenta de endotoxinas y/o proteínas o ADN de la célula huésped.
Se pretende que la expresión "forma purificada", tal como se utiliza anteriormente, se refiera a una pureza de al menos un 90%, tal como una pureza de un 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% p/p o superior.
Se pretende que la expresión "sustancialmente exenta de endotoxinas" se refiera en general a un contenido de endotoxinas de 1 EU por mg de producto de anticuerpo o inferior, tal como 0.5 o 0.1 EU por mg de producto.
Se pretende que la expresión "sustancialmente exenta de proteínas o ADN de la célula huésped" se refiera en general a un contenido de proteínas y/o ADN de la célula huésped de 400 ]ig por mg de producto de anticuerpo o inferior, tal como 100 pg por mg o inferior, en particular 20 \ig por mg, según convenga .
La molécula de fusión que es un anticuerpo de la presente invención también se puede utilizar en la diagnosis, por ejemplo, en la diagnosis in vivo y la tomografía de estados patológicos que impliquen 0X40.
Convenientemente, se cree que las moléculas de fusión de la presente son seguras para su administración a seres humanos con una dosis terapéutica adecuada, en particular debido a que no son superagonistas y que es poco probable que provoquen una cascada de citocinas.
El término "superagonista" , tal como se utiliza en la presente, se refiere a un anticuerpo que expande los linfocitos T en ausencia de la participación de TCR.
En una modalidad, A26 Fab-Fv reduce el índice de división, lo cual indica que hay menos células de la población disponibles para la división; este efecto está mediado presuntamente por las células NK que están expresando OX40. El índice de división representa el número medio de divisiones celulares que ha sufrido una célula en la población original e incluye las células no divididas .
El índice de proliferación refleja únicamente la proliferación de la población que responde y, en una modalidad, el efecto inhibidor de A26 Fab-Fv utilizando esta medida se reduce relativamente.
Se pretende que el término "que comprende", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiera a "que incluye " .
Cuando sea técnicamente adecuado, las modalidades de la invención se pueden combinar.
En la presente, las modalidades se describen de modo que comprendan ciertas características/elementos. La descripción también se extiende para separar las modalidades constituidas o constituidas esencialmente por las características/elementos.
La presente invención se describe además a título ilustrativo solamente en los siguientes ejemplos, que se refieren a las Figuras adjuntas, donde : EJEMPLOS Figuras en detalle: Figura 1: Una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de la presente invención, que se denomina Fab-dsFv.
Figura 2A) Región V de la cadena ligera del anticuerpo A26 (SEQ ID NO : 7 ) .
Figura 2B) Región V de la cadena pesada del anticuerpo A26 (SEQ ID NO: 8) .
Figura 2C) CDRH1 (SEQ ID NO : 1 ) , CDRH2 (SEQ ID N0:2) , CDRH3 (SEQ ID NO : 3 ) , CDRL1 (SEQ ID NO : 4 ) , CDRL2 (SEQ ID NO : 5 ) y CDRL3 (SEQ ID NO : 6 ) del anticuerpo A26.
Figura 2D) Cadena ligera del componente Fab del anticuerpo A26 (SEQ ID NO:9).
Figuras 2E) Cadena pesada del componente Fab del anticuerpo A26 (SEQ ID NO: 10) .
Figura 3A) Cadena pesada del componente Fv anti-albúmina 645gH5 (SEQ ID NO: 11) .
Figura 3B) Cadena ligera del componente Fv anti-albúmina 645gL4 (SEQ ID NO:12).
Figura 3C) Conector 1 (SEQ ID NO:13).
Figura 3D) Conector 2 (SEQ ID NO: 14).
Figura 3E) Cadena pesada de Fab-dsFv (SEQ ID NO: 15) .
Figura 3F) Cadena ligera de Fab-dsFv (SEQ ID NO: 16) .
Figura 4A) Dominio variable de la cadena pesada 645gl (SEQ ID NO: 17) .
Figura 4B) Dominio variable de la cadena ligera 645gl (SEQ ID NO:18).
Figura 4C) A26 Fab-dsFv 645gHl (SEQ ID NO: 19) .
Figura 4D) A26 Fab-dsFv 645gLl (SEQ ID NO: 20) .
Figura 5A) ADN que codifica la cadena pesada de Fab-dsFv, incluido el líder OmpA (SEQ ID NO: 21) .
Figura 5B) ADN que codifica la cadena pesada de Fab-dsFv sin el líder OmpA (SEQ ID NO: 22) .
Figura 6A ADN que codifica la cadena ligera de Fab-dsFv, incluido el líder OmpA (SEQ ID NO:23).
Figura 6B) ADN que codifica la cadena ligera de Fab-dsFv sin el líder OmpA (SEQ ID NO: 24) .
Figura 7A) ADN que codifica la cadena pesada de Fab-dsFv, incluido el líder B72.3 (SEQ ID NO:25).
Figura 7B) ADN que codifica la cadena pesada de Fab-dsFv sin el líder B72.3 (SEQ ID NO:26) .
Figura 8A) ADN que codifica la cadena ligera de Fab-dsFv, incluido el líder B72.3 (SEQ ID NO:27).
Figura 8B) ADN que codifica la cadena ligera de Fab-dsFv sin el líder B72.3 (SEQ ID NO:28).
La Figura 9A muestra la unión de A26 Fab-dsFv marcado con AlexaFluor 488 a linfocitos T CD4+OX40+ humanos activados.
La Figura 9B muestra la unión para A26 Fab' , A26 Fab-Fv y A26 Fab'-PEG en presencia de HSA al 5% en linfocitos T CD4+, OX40+ humanos activados.
La Figura 10A muestra el efecto de A26 Fab-dsFv sobre la producción de citocinas en PBMC expuestas a un extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus .
La Figura lOBmuestra la capacidad de A26 Fab-dsFv para inhibir la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ en un modelo con ratones Hu-NSG.
La Figura 11A muestra la inhibición de la unión de 0X4OL a linfocitos T CD4+ 0X 0+ activados humanos por parte de A26 Fab-dsFv.
La Figura 11B muestra la inhibición de la unión de OX40L a linfocitos T CD4+ OX40+ activados humanos por parte de A26 Fab' , A26 Fab-dsFv, A26 Fab' -PEG y dos controles.
La Figura 12A muestra que A26 Fab-Fv inhibe la reacción de linfocitos mixtos (MLR) en seres humanos.
La Figura 12B muestra que A26 Fab-Fv inhibe la producción de IFN-gamma durante la MLR en seres humanos.
La Figura 13 muestra que A26 Fab-Fv reduce el porcentaje de linfocitos T (CD25+) CD4+ activados después de una reestimulación del antígeno secundario con un extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus .
Las Figuras 14A a 14D muestran que cuando Fab-Fv y Fab-PEG se administran antes de la transferencia celular, inhiben de forma dependiente de la dosis la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ en el modelo Hu-NSG.
Manipulaciones del ADN y métodos generales Se utilizaron cepas de E. coli competentes para las transformaciones y el desarrollo rutinario de los cultivos. Las enzimas de modificación y restricción de ADN se obtuvieron de Roche Diagnostics Ltd. y New England Biolabs. Las preparaciones de los plásmidos se llevaron a cabo utilizando los kits de purificación de plásmidos Maxi (QIAGEN, N.° de catálogo 12165) . Las reacciones de secuenciación del ADN se llevaron a cabo utilizando el kit de secuenciación del terminador ABI Prism Big Dye (N.° de catálogo 4304149) y se realizaron en un secuenciador automatizado ABI 3100 (Applied Biosystems) . Los datos se analizaron utilizando el programa Sequencher (Genecodes) . Los oligonucleótidos se obtuvieron de Simga o Invitrogen. Los genes que codifican las secuencias iniciales de la región V se construyeron mediante una estrategia de síntesis automatizada con DNA2.0 y se modificaron para generar las versiones injertadas mediante mutagénesis dirigida a los oligonucleótidos. La concentración de Fab-Fv se determinó mediante un método de HPLC basado en la Proteína G.
EJEMPLO 1 Generación y análisis de diferentes injertos de humanización de 645 en A26Fab-645dsFv Hemos descrito previamente el formato del anticuerpo Fab-dsFv (Figura 1) (que se denomina en ocasiones en la presente simplemente Fab-Fv) y un anticuerpo anti-albúmina humanizado que se conoce como *645gHlgLl' en O2010/035012. También hemos descrito previamente la generación de un anticuerpo anti-OX40 antagonista humanizado, conocido como ??26', y un fragmento Fab' PEGilato de este en WO2010/096418. En la presente, describimos la generación de un nuevo injerto humanizado mejorado del anticuerpo '645' conocido como 6 5dsgH5gL4 y la generación de una molécula que es un anticuerpo Fab-dsFv, la cual incorpora el injerto en el componente Fv y las regiones variables de ??26' en el componente Fab. Las regiones variables de A26 se muestran en la Figura 2a y 2b (SEQ ID NOs 7 y 8) .
Las secuencias de las regiones variables y constantes de A26 combinadas se muestran en la Figura 2d y e (SEQ ID NOs 9 y 10) .
Las secuencias de 645gHl y gLl se muestran en la Figura 4(a) y (b) , SEQ ID NOs 17 y 18.
Cuando se utiliza el término Fab' -PEG o A26 Fab' -PEG, se refiere a A26 Fab-40K PEG' que se describe en W02010/096418. 1.1. Construcción de los plásmidos conectores A26Fab- 645dsFv(gHlgLl) y A26Fab-645dsFv (gH5gL4) G4S La totalidad de la región codificante de la cadena ligera de A26Fab-645dsF (gLl) (SEQ ID NO: 20) se clonó en un vector de expresión de mamífero UCB bajo el control del promotor HCMV-MIE y la secuencia de poliA SV40E. La región variable de la cadena ligera de 645dsFv(gLl) (SEQ ID N0:18) se mutó para obtener 645dsFv(gL4) (SEQ ID NO: 12) mediante un método de PCR de superposición. La totalidad de la región codificante de la cadena pesada de A26Fab-645dsFv (gHl) (SEQ ID NO: 19) se clonó en un vector de expresión de mamífero UCB bajo el control del promotor HCMV-MIE y la secuencia de poliA SV40E. La región variable de la cadena pesada de 645dsFv(gHl) (SEQ ID NO: 17) se mutó para obtener 645dsFv(gH5) (SEQ ID NO: 11) mediante un método de PCR de superposición. Los constructos se verificaron por secuenciación . Ambos constructos contenían el conector 3xG4S que se proporciona en la SEQ ID NO:14, Figura 3(d). 1.2 Expresión en mamíferos de A26Fab-645dsF (gHlgLl) y A26Fab-645dsFv(gH5gL4) Se transíectaron células HEK293 con los plásmidos de cadena pesada y ligera utilizando el reactivo de transfección 293fectin de Invitrogen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Resumiendo, se incubaron 25 ]ig del plásmido de cadena pesada y 25 µg del plásmido de cadena ligera con 100 µ? de 293fectin y 1700 µ? de medio Optipro durante 20 min a temp. amb. A continuación, la mezcla se añadió a 50xl06 células HEK293 en 50 mi de suspensión y se incubó durante 6 días con agitación a 37 °C. Después de 6 días, el sobrenadante se recolectó por centrifugación a 1500xg durante 10 minutos para eliminar las células y a continuación se filtró con un filtro estéril de 0.22 µp?. 1.3 Purificación con la Proteína G de A26Fab-645dsF (gHlgLl) y A26Fab-645dsF (gH5gL4) Los sobrenadantes de -50 mi filtrados con un filtro de 0.22 µp? se concentraron hasta ~2 mi utilizando concentradores Amicon Ultra- 15 con una membrana que tenía un corte de pesos moleculares de 10 kDa y se centrifugaron a 4000xg en un rotor basculante. Se aplicaron 1.8 mi de sobrenadante concentrado con un flujo de 1 ml/min a una columna Gammabind Plus Sepharose de 1 mi (GE Healthcare) equilibrada en fosfato 20 mM, NaCl 40 mM, pH 7.4. La columna se lavó con fosfato 20 mM, NaCl 40 mM, pH 7.4 y el material unido se eluyó con glicina 0.1 M/HC1, pH 2.7. Se recolectó el pico de elución y el pH se ajustó a un pH de ~7 con Tris 2 M/HCl, pH 8.5. La elución de pH ajustado se concentró, se sometió a diafiltración con fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7.4 utilizando concentradores Amicon Ultra- 15 con una membrana que tenía un corte de pesos moleculares de 10 kDa y se centrifugó a 4000xg en un rotor basculante, hasta que quedó un volumen final de -0.3 mi. 1.4 Análisis de exclusión por tamaño de A26Fab- 645dsFv(gHlgLl) y A26Fab-645dsF (gH5gL4) Las muestras purificadas con la Proteína G se analizaron mediante HPLC de exclusión por tamaño. Las muestras se separaron en una columna Superdex 200 10/300 GL Tricorn (GE Healthcare) , que se realizó con un gradiente isocrático de PBS pH 7.4 con un flujo de 1 ml/min. La detección del pico fue a 280 nm y el peso molecular aparente se calculó por comparación con una curva estándar de proteínas de peso molecular conocido frente al volumen de elución. El hecho de cambiar el injerto de humanización de 645dsFv, gHlgLl por gH5gL4 , dio como resultado un incremento del porcentaje del monómero de A26Fab-645dsFv expresado desde un 59% hasta un 71%, un incremento de un 12%, sin ningún cambio en la estabilidad térmica de dsFv (no se muestran los datos) ni en la afinidad de unión de dsFv a HSA (no se muestran los datos) .
Ejemplo 2 2.1 Cinética de BIAcore para A26 Fab-dsFv (645gH5gL4) que se une a 0X40 En este ejemplo y todos los que le siguen, el A26 Fab-dsFv 645gH5gL4 tenía la secuencia de la cadena pesada que se proporciona en la SEQ ID N0:15 (Figura 3(e)) y la secuencia de la cadena ligera que se proporciona en la SEQ ID NO: 16 (Figura 3 (f) ) , es decir, la cadena pesada contenía el conector G4S, G4T, G4S que se proporciona en la SEQ ID NO: 13, Figura 3(c).
Se llevó a cabo un BIA (análisis de interacción biamolecular) utilizando un BIAcore T200 (GE Healthcare) . El reactivo Affinipure, el cual es un fragmento F(ab' )2 anti-IgG humana producido en cabra que es específico para el fragmento F(ab' )2 (Jackson ImmunoResearch) , se inmovilizó en un chip sensor CM5 mediante una reacción química de acoplamiento de amina hasta un nivel de captura de =5000 unidades de respuesta (RU) . Se utilizó el tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0.05%, GE Healthcare) como el tampón de elución con una tasa de flujo de 10 µ??/t???. Se utilizó una inyección de 10 µ?? de A26 Fab ' con una concentración de 0.5 9/p??? o A26Fab-dsFv con una concentración de ^g/mL para su captura por parte del F(ab')2 anti-IgG humana inmovilizado. Se realizó una titulación de OX40 humano sobre el A26 capturado para varias concentraciones (desde 25 nM hasta 1.5625 nM) con una tasa de flujo de 30 µ?,/????. La superficie se regeneró con una inyección de 2 x 10 µ?? de HCl 50 m , seguida de una inyección de 5 µ??? de NaOH 5 mM con una tasa de flujo de ? ? µ??/p???. Las curvas de unión con sustracción del fondo se analizaron utilizando el software T200evaluation (versión 1.0) siguiendo los procedimientos estándar. Los parámetros cinéticos se determinaron a partir del algoritmo de ajuste.
Media de 4 determinaciones Tabla 1 2.2. Cinética de BIAcore para ?26 Fab-dsFv (645gH5gL4) que se une a albúmina Se llevó a cabo un BIA (análisis de interacción biamolecular) utilizando un BIAcore T200 (GE Healthcare) . El reactivo Affinipure, el cual es un fragmento F(ab' ) 2 anti-IgG humana producido en cabra que es específico para el fragmento F(ab' )2 (Jackson ImmunoResearch) , se inmovilizó en un chip sensor CM5 mediante una reacción química de acoplamiento de amina hasta un nivel de captura de -5000 unidades de respuesta (RU) . Se utilizó el tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7.4, NaCl 0.15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0.05%, GE Healthcare) como el tampón de elución con una tasa de flujo de 10 µ??/????. Se utilizó una inyección de 10 µ?.. de Fab-Fv con una concentración de 0.75 µ9/???]1? para su captura por parte del F(ab')2 anti-IgG humana inmovilizado. Se realizó una titulación de albúmina de suero humano (???) , albúmina de suero de ratón (MSA) y albúmina de suero de macaco cangrejero (CSA) sobre el Fab-Fv capturado para varias concentraciones (desde 50 nM hasta 6.25 nM) con una tasa de flujo de 30 µ?_?/????. La superficie se regeneró con una inyección de 2 x 10 µ:[- de HCl 50 mM, seguida de una inyección de 5 µ?. de NaOH 5 mM con una tasa de flujo de ? ?µ??/p???. Las curvas de unión con sustracción del fondo se analizaron utilizando el software T200evaluation (versión 1.0) siguiendo los procedimientos estándar. Los parámetros cinéticos se determinaron a partir del algoritmo de ajuste.
Tabla 2 Media de 3 determinaciones 2.3 Demostración de que A26 Fab-dsFv (645gH5gL4) se une a 0X40 y a albúmina de forma simultánea Se evaluó la unión simultánea de 0X40 humano y albúmina de suero humano a A26 Fab-dsFv. El constructo de A26 Fab-dsFv se capturó en la superficie del chip sensor como se ha indicado en el método para la cinética de Biacore para la unión de A26 Fab-dsFv a albúmina. Se realizó una titulación de HAS 50nM, 0X 0 25nM o una solución mixta con una concentración final de HSA 50nM y 0X40 25nM, por separado, sobre el A26 Fab-dsFv capturado. La respuesta de unión para la solución combinada de HSA/OX40 fue equivalente a la suma de las respuestas de las inyecciones independientes. Esto confirma que Fab-dsFv es capaz de unirse de forma simultánea tanto a 0X40 humano como a HSA.
Tabla 3 2.4 Afinidad basada en las células de A26 Fab-dsFv (645gH5gL4) Métodos : Unión de A26 Fab-Fv a linfocitos T CD4+OX40+ activados humanos Se aislaron PBMC mediante una separación con un gradiente de Ficoll y se activaron con 4 µg/mL de PHA-L durante 3 días a 37 °C, con un 5% de C02 y un 100% de humedad. Se aislaron linfocitos T CD4+ mediante una selección negativa utilizando microesferas magnéticas (kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ II para seres humanos; Miltenyi Biotec) . Se incubaron aproximadamente 1 x 105 células en presencia del anticuerpo en tampón Facs (PBS/BSA al 0.2%/NaN3 al 0.09%) o en tampón Facs suplementado con HSA al 5% a 4 °C. La concentración final del anticuerpo estaba comprendida entre 48 nM y 0.0005 nM. Las células se lavaron en PBS antes del análisis por citometría de flujo utilizando un FACScalibur (Becton Dickinson) . Se generaron dos grupos de datos de titulación en ambas condiciones tamponantes, uno con A26 Fab-dsFv y el segundo con un control irrelevante de Fab-Fv para determinar la unión no específica. El número de moles de anticuerpo unido se calculó utilizando valores interpolados a partir de una curva estándar generada utilizando microesferas comprimidas de cantidades diferentes pero conocidas de un tinte fluorescente. Se determinó la media geométrica de los valores de fluorescencia en los análisis de citometría de flujo de las células y las microesferas . La unión no específica se sustrajo de los valores de A26 Fab-dsFv y la curva de unión específica generada de este modo se analizó por regresión no lineal utilizando una ecuación de unión a un sitio (Graphpad Prism®) para determinar el valor de KD.
Para determinar la afinidad de A26 Fab-dsFv por el antígeno expresado en la superficie celular, se realizaron experimentos de unión en condiciones de saturación utilizando linfocitos T CD4+OX40+ activados y A26 Fab-dsFv marcado con Alexa Fluor 488. Para determinar el valor de KD, se utilizó la unión específica del anticuerpo al receptor en el punto de equilibrio para un intervalo de concentraciones del anticuerpo, asumiendo que solo una fracción muy pequeña del anticuerpo se unía al receptor en cualquier punto de la curva de unión.
La unión en el punto de equilibrio se describe utilizando la siguiente ecuación: Receptorllbre + Anticuerpollbre 4 * Receptor-Anticuerpo koff La tasa de asociación del anticuerpo con el receptor = [Receptor ubre] x [Anticuerpo ubre] · La tasa de disociación del complejo receptor-anticuerpo = k0ff x [Receptor-Anticuerpo] .
En el punto de equilibrio, las tasas de asociación y disociación son iguales y se puede obtener una ecuación que describe la isoterma de unión; en una gráfica semi-log, la unión es sigmoidal . El valor de KD se define mediante el cociente k0ff/kon y se puede calcular a partir de la curva de unión como la concentración para la cual tiene lugar una unión que es la mitad de la máxima.
La unión de A26 Fab-Fv marcado con AlexaFluor488 a linfocitos T CD4+OX40+ humanos activados se midió mediante citometría de flujo para un intervalo de concentraciones de 5-log.
En la Figura 9A se muestra una curva de unión representativa para A26 Fab-Fv.
El valor medio de KD obtenido para células activadas de 5 donantes diferentes fue de 145 pM.
En la Figura 9B se muestra una curva de unión comparativa para A26 Fab, A26 Fab-Fv y A26 Fab-PEG.
Las gráficas representan la media de 4 o 5 experimentos, donde se utilizó un donante diferente para cada experimento.
Se aislaron PBMC mediante una separación con un gradiente de Ficoll y se activaron con 4 µg/mL de PHA-L durante 3 días a 37 °C, con un 5% de C02 y un 100% de humedad. Después de esto, se aislaron linfocitos T CD4+ mediante una selección negativa utilizando microesferas magnéticas (kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ II para seres humanos; Miltenyi Biotec) . Se incubaron aproximadamente 1 x 105 células en presencia del anticuerpo en tampón Facs (PBS/BSA al 0.2%/NaN3 al 0.09%) o en tampón Facs suplementado con HSA al 5% a 4 °C. La concentración final del anticuerpo estaba comprendida entre 48 nM y 0.0005 nM . Las células se lavaron en PBS antes del análisis por citometría de flujo utilizando un FACScalibur (Becton Dickinson) . También se generaron grupos de datos de titulación para los anticuerpos de control del isotipo para cada formato de A26 con el fin de determinar la unión no específica. El número de moles de anticuerpo unido se calculó utilizando valores interpolados a partir de una curva estándar generada a partir de microesferas comprimidas de cantidades diferentes pero conocidas de un tinte fluorescente. Se determinó la media geométrica de los valores de fluorescencia en los análisis de citometría de flujo de las células y las microesferas. La unión no específica se sustrajo de los valores de A26 Fab-Fv y la curva de unión específica generada de este modo se analizó por regresión no lineal utilizando una ecuación de unión a un sitio (Graphpad Prism®) para determinar el valor de KD .
Tabla 4: Valores medios de KD para anticuerpos A26 en ensayos de afinidad en células humanas Ejemplo 3: A26 Fab-Fv modula la producción de citocinas de PBMC expuestas a un extracto alergenico de Dermatophagoides pteronyssinus Se aislaron PBMC de voluntarios que padecían alergia mediante una separación con un gradiente de Ficoll. Las PBMC purificadas se expusieron a 25 µg/mL de un extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus en presencia del anticuerpo de ensayo (intervalo de concentraciones: desde 50 pg/mL hasta 0.0005 g/mL) en un volumen final de 200 pL por pocilio en una placa de 96 pocilios de fondo redondo. Después de 6 días de incubación a 37 °C, con un 5% de C02 y un 100% de humedad, los sobrenadantes se recolectaron y se analizaron para determinar el contenido de IL-13 mediante MSD . La gráfica de la Figura 10 (a) muestra datos representativos de un donante representativo de 4, donde la CE50 media para la inhibición de la producción de IL-13 fue de 0.87 nM (intervalo desde 0.6 nM hasta 1.07 nM) .
Tabla 5: Valores medios de CE50 para anticuerpos A26 en ensayos in vi tro para HDM en seres humanos Los valores de CE50 se calcularo a partir de curvas de inhibición de donantes individuales mediante regresión no lineal utilizando el software Graphpad Prism® A26 Fab-Fv reduce el porcentaje de linfocitos T (CD25+) CD4+ activados después de una reestimulación del antígeno secundario con un extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus Se estimularon in vitro linfocitos T CD4+ de donantes que padecían alergia durante 7 días con 25 ug/ml de un extracto alergénico de Dermatophagoides pteronyssinus (Greer) y APC autólogo, sin ningún anticuerpo o en presencia de 10 ug/ml de A26 Fab'PEG, A26 Fab-Fv o Fab' de control (A33 Fab') Las células se lavaron, se dejaron reposar durante 3 días y a continuación se volvieron a estimular con el extracto de Dermatophagoides pteronyssinus del mismo modo que anteriormente (Figura 13) . Después de 3 días, las células se lavaron y se tiñeron de forma fluorescente para determinar CD3 , CD4 y CD25 de superficie. A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo con un citómetro de flujo FACS Canto (BD) . Las células se seleccionaron en linfocitos vivos y para una expresión CD3+CD4+ antes del análisis. Los datos representan n = 3 donantes, incluida la media, n.s, A26 Fab-Fv comparado con Fab' de control (la significancia se midió utilizando una prueba t apareada de 2 colas) .
Ejemplo 4: A26 Fab-Fv inhibe la proliferación de linfocitos T CD4+ y CD8+ en un modelo con ratones Hu-NSG Se administraron dosis s.c. de 0.03, 0.3, 3 o 30 mg/kg de A26 Fab-Fv a ratones un día antes de transferir 1 x 107 PBMC humanas en la cavidad peritoneal . Después de 14 días, los ratones se desangraron mediante una punción cardíaca con anestesia terminal y a continuación se sacrificaron mediante dislocación cervical. Posteriormente, se determinó el número de linfocitos CD4+ y CD8+ humanos en la sangre mediante un análisis FACS (Figura 10 (b) ) . Los datos (n=10) se expresan como la media ± SEM y el análisis estadístico consiste en una ANOVA de una vía con una prueba posterior de Bonferron . Los valores representan el % de inhibición + SEM.
Los resultados se muestran en las Figuras 14A a 14D.
El modelo Hu-NSG ha demostrado que A26 Fab-Fv inhibe significativamente la proliferación de linfocitos T humanos in vivo e indica que A26 Fab-Fv es un candidato terapéutico viable para la inhibición de patologías mediadas por linfocitos T. Además, el formato de Fab-Fv confirió una mayor eficacia para dosis más bajas que el formato de Fab' PEG. La reducción de esta respuesta xenoproliferativa de los linfocitos T del donante puede proporcionar pruebas a favor de que A26 Fab-Fv podría ser un agente terapéutico viable para la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) .
Ejemplo 5: Capacidad para bloquear el ligando La capacidad de A26 Fab-dsFv para bloquear la interacción entre OX40 expresado en la superficie celular y 0X40L recombinante se evaluó utilizando un ensayo para bloquear el ligando basado en citometría de flujo. Resumiendo, se preincubaron linfocitos T CD4+OX40+ humanos activados con una titulación de A26 Fab-Fv. Posteriormente, se añadió OX40L recombinante a las células y se permitió que se uniera en presencia de A26 Fab-dsFv. A continuación, la proporción de OX40L unido se detectó por citometría de flujo utilizando un reactivo secundario marcado. La Figura 11 muestra una curva de inhibición que representa los datos combinados de 3 donantes independientes y demuestra que A26 Fab-dsFv es capaz de bloquear completamente la unión de 0X40L. La CI50 media para la inhibición de la unión de 0X4 OL recombinante fue de 0.44 nM (n = 3 donantes) .
Métodos: Inhibición de la unión de 0X4OL a linfocitos T CD4+OX40+ activados humanos por parte de A26 Fab-Fv Se aislaron PBMC mediante una separación con un gradiente de Ficoll y se activaron con 4 µ9/?t?]-. de PHA-L (Sigma) durante 3 días a 37 °C, con un 5% de C02 y un 100% de humedad. A continuación, los linfocitos T CD4+ se purificaron a partir del cultivo mediante una selección negativa utilizando columnas MACS (Miltenyi Biotech, kit de aislamiento de linfocitos T CD4+ II) . Se incubaron 2 x 105 linfocitos T CD4+ en presencia de A26 Fab-dsFv (intervalo de concentraciones finales: 10 ig/vaL - 0.000056 µ9/?t??- (136.6 nM - 0.000765 nM) ) durante 30 minutos a 4 °C. Se añadió OX40L (CD252 muCD8 biotinilado, Ancell) con una concentración final de 2 g/mL y se incubó durante 30 minutos más a 4 °C. Se lavaron las células y la unión de 0X40L se detectó mediante la incubación con estreptavidina marcada con PE (Jackson Immunoresearch) antes del análisis por citometría de flujo utilizando un FACS Canto (Becton Dickinson) . Se utilizó un Fab-dsFv coincidente que no se unía a 0X40 como control. La curva de inhibición se analizó por regresión no lineal (Graphpad Prism®) para determinar la CI50. En las Figuras 11A-11B se muestra una curva de inhibición que representa los datos combinados de 3 donantes independientes, donde los puntos de evaluación representan la media y las barras de error representan la SEM.
La CE50 media para la inhibición de la unión de 0X4 OL recombinante a OX40 por parte de A26 Fab-Fv fue de 0.445 nM. En comparación, A26 Fab'PEG fue ligeramente menos potente a la hora de bloquear el ligando (CE50 = 0.739 nM) , mientras que A26 Fab' presentó una potencia marginalmente mayor (CE50 = 0.242 nM) que Fab-Fv, según se muestra a continuación.
Tabla 6 : Valores de CE50 para la inhibición de la unión de OX40L a linfocitos T CD4+OX40+ activados humanos por parte de anticuerpos A26 Los valores de CE50 se calcularon a partir de curvas de inhibición de donantes individuales mediante regresión no lineal utilizando el software Graphpad Prism®.
Ejemplo 6: Efecto de A26 Fab-Fv en ensayos humanos funcionales in vitro Se evaluó el efecto de A26 Fab-Fv sobre interacciones celulares dependientes de OX40-OX40L en una serie de ensayos con linfocitos humanos dirigidos por antígenos. Estos ensayos se llevaron a cabo en presencia de suero humano al 5% para garantizar la saturación del sitio de unión a albúmina de la región Fv, que es lo que cabría esperar que sucediera in vivo A26 Fab-Fv inhibe la reacción de linfocitos mixtos La reacción alogénica de linfocitos mixtos de una vía (MLR) es un modelo in vitro de proliferación y activación de linfocitos T alorreactivos (Bach et al., 1964, O'Flaherty et al., 2000) . Los linfocitos T donantes se activan mediante el reconocimiento de antígenos MHC alogénicos en PBMC estimulantes donantes no relacionadas, lo cual da como resultado la proliferación celular y la producción de citocinas (Lukacs et al., 1993). Se ha demostrado que la alorreacción de los linfocitos T está dirigida tanto por el antígeno MHC alogénico como por el péptido unido (Sherman et al., 1993) . La magnitud de una respuesta MLR se correlaciona con el grado de discrepancias en MHC entre el par estimulador-respondedor (Forrester et al., 2004). Una respuesta MLR da como resultado la proliferación de células del donante respondedor y la producción de citocinas derivadas de linfocitos T tanto Thl (IL-2, IFN-? y TNF-a) como Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13). Se cree que el perfil de citocinas exacto en una MLR es específico para el par estimulador-respondedor (Jordán et al., 2002). Los ensayos MLR se han utilizado extensamente en investigación para estudiar vías de activación de linfocitos T, para cribar fármacos inmunosupresores y para predecir el posible rechazo de órganos del donante en receptores de trasplantes (Bromelow efc al. , 2001) .
Se investigó el efecto de A26 Fab-Fv sobre la activación y la proliferación de linfocitos T alorreactivos humanos in vitro utilizando un ensayo MLR esencialmente como el descrito por O'Flaherty et al., 2000. Se cultivaron conjuntamente PBMC de dos donantes no relacionados en presencia o ausencia de A26 Fab-Fv, A26 Fab' o A26 Fab'PEG y se midió la proliferación celular mediante la incorporación de 3H-timidina. Como se muestra en la Figura 12, A26 Fab-Fv inhibió la proliferación celular de un modo dependiente de la concentración con un valor de CE50 de 0.56 nM (40.9 ng/mL) y una inhibición máxima de un 55% (n = 3 apareamientos de donantes) . A26 Fab-Fv fue ligeramente más potente que A26 Fab'PEG, el cual presentó un valor de CE50 de 0.88 nM, mientras que A26 Fab' presentó un valor de CE50 de 0.25 nM como se muestra en la Tabla 7.
Se aislaron PBMC humanas de dos donantes no relacionados a partir de la sangre entera. Las células de un donante se desactivaron por irradiación ? para generar la población del estimulador. Las células del donante restante formaron la población del respondedor. Las poblaciones del estimulador y el respondedor se mezclaron con una proporción 1:1 (lxlO5 células/donante) y se cultivaron en presencia de A26 Fab' , A26 Fab-Fv o A26 Fab'PEG (0.4 ng - 25 yg/mL) durante 6 días.
Se utilizó el reactivo Fab-Fv CA162-01297.1 interno como un control de isotipo coincidente. La proliferación celular se midió el día 6 mediante la incorporación de 3H-timidina (0.5 Ci/pocillo) . Los datos se muestran como el porcentaje de inhibición respecto al respondedor más la respuesta del estimulador en ausencia del reactivo biológico, y son los datos combinados de tres apareamientos de donantes. Los valores de CE50 se calcularon utilizando el software Graphpad Prism® .
Tabla 7 : Valores de CE50 para la inhibición de la respuesta proliferativa MLR en seres humanos por parte de anticuerpos A26 Los sobrenadantes de la MLR de seres humanos también se analizaron para investigar el efecto de ?2T Fab-Fv sobre la producción de citocinas. Según se muestra en la Figura 5.4, A26 Fab-Fv inhibió de forma significativa la producción de IFN-? en MLR en una media de un 81% (n - 3 apareamientos de donantes) .
Se aislaron PBMC humanas de dos donantes no relacionados a partir de la sangre entera. Las células de un donante se desactivaron por irradiación ? para generar la población del estimulador. Las células del donante restante formaron la población del respondedor. Las poblaciones del estimulador y el respondedor se mezclaron con una proporción 1:1 (lxlO5 células/donante) y se cultivaron en presencia de 25 µ9/p?1 de A26 Fab' , A26 Fab-Fv o A26 Fab'PEG o controles (A33 Fab' o CA162.01297.1) durante 6 días. Los sobrenadantes se recolectaron y se analizaron para determinar el contenido de IFN-? utilizando un ensayo MSD. El porcentaje de inhibición se calculó con relación a las células cultivadas sin anticuerpo. Las gráficas representan los datos agrupados de tres donantes (media ± S.E.M). ** = p < 0.01; A26 Fab-Fv comparado con Fab-Fv de control (la significancia se midió utilizando una prueba t apareada de 2 colas) .
Ejemplo 7: Unión de A26 Fab-Fv a células NK en una MLR de seres humanos Se investigó el efecto de A26 Fab-Fv sobre la división de células NK en una MLR. La alorreacción de linfocitos T dirige la respuesta de linfocitos mixtos y A26 Fab-Fv inhibe significativamente la división de linfocitos T y la producción de IFNy en este sistema. La inhibición de la división de células NK también podría contribuir a la reducción de la producción de IFNy. Utilizando células respondedoras marcadas con CFSE, se demostró la inhibición de la división de células NK mediante el análisis FACS de la población que se estaba dividiendo (Figura 5.6). Se muestran dos medidas diferentes de la división celular. El índice de división representa el número medio de divisiones celulares que ha sufrido una célula en la población original e incluye las células no divididas; A26 Fab-Fv reduce el índice de división, lo cual indica que hay menos células de la población disponibles para la división; este efecto está mediado presuntamente por las células NK que están expresando OX40. El índice de proliferación refleja únicamente la proliferación de la población que responde y el efecto inhibidor de A26 Fab-Fv utilizando esta medida se reduce relativamente .
Ejemplo 8: Valores medios de KD / CE50 para A26 Fab-Fv en seres humanos en ensayos in vitro Obviamente, se sobreentenderá que la presente invención 1 se ha descrito únicamente a modo de ejemplo, no se pretende que sea limitante de ningún modo, y que se pueden realizar modificaciones de los detalles dentro del alcance de las reivindicaciones que se exponen posteriormente en la presente Las características preferidas de cada modalidad de la invención son como para cada una de las demás modalidades mutatis mutandis . Todas las publicaciones, incluidas, sin carácter limitante, las patentes y solicitudes de patente, citadas en esta memoria descriptiva se incorporan a la presente por referencia como si se indicase que cada publicación individual se incorpora de forma específica e individual por referencia a la presente como si se hubiera expuesto de forma completa.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (20)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico, la cual se une a 0X 0 humano y a albúmina de suero humano, caracterizada porque comprende: una cadena pesada que comprende, en secuencia desde el extremo N-terminal, un primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) , un dominio CH1 y un segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2), una cadena ligera que comprende, en secuencia desde el extremo N-terminal, un primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) , un dominio CL y un segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) , donde las cadenas ligera y pesada están alineadas de un modo tal que VH1 y VL1 forman un primer sitio de unión al antígeno y VH2 y VL2 forman un segundo sitio de unión al antígeno, donde el antígeno que se une al primer sitio de unión al antígeno es 0X40 humano y el antígeno que se une al segundo sitio de unión al antígeno es albúmina de suero humano, donde el primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID N0:1 para CDR-H1, la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3 y el primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 5 para CDR-L2 y la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3, donde el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) tiene la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 11 y el segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) tiene la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 12 y el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) y el segundo dominio variable de la cadena ligera (VL2) están conectados mediante un enlace disulfuro.
2. Una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque antagoniza la unión de OX40 a OX40L.
3. Una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque hay un conector peptídico entre el dominio CHl y el segundo dominio variable de la cadena pesada (VH2) .
4. Una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque hay un conector peptídico entre el dominio CL y el segundo dominio variable de la cadena ligera (VL1) .
5. Una proteína de fusión que es un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque el primer dominio variable de la cadena pesada (VH1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO : 8.
6. Una proteína de fusión que es un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque el primer dominio variable de la cadena ligera (VL1) comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 7.
7. Una proteína de fusión que es un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque la cadena pesada comprende o está constituida por la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 15.
8. Una proteína de fusión que es un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque la cadena ligera comprende o está constituida por la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 16.
9. Una proteína de fusión caracterizada porque es un anticuerpo biespecífico, la cual se une a 0X40 humano y a albúmina de suero humano, que presenta una cadena pesada que comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 15 y una cadena ligera que comprende la secuencia que se proporciona en la SEQ ID NO: 16.
10. Una secuencia de ADN aislada que codifica la o las cadenas pesadas y/o ligeras de una proteína de fusión, caracterizada porque es un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.
11. Un vector de clonación o expresión, caracterizado porque comprende una o más secuencias de ADN de conformidad con la reivindicación 10.
12. Un vector de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende las secuencias que se proporcionan en la SEQ ID NO: 22 y la SEQ ID NO: 24.
13. Una célula huésped, caracterizada porque comprende uno o más vectores de clonación o expresión de conformidad con la reivindicación 11 o 12.
14. Un proceso para producir la proteína de fusión que es uno anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 13 y aislar la proteína de fusión que es un anticuerpo.
15. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, combinada con uno o más de los siguientes: un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
16. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque comprende adicionalmente otros principios activos.
17. Una proteína de fusión, caracterizada porque es un anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15 o 16, para su uso en terapia.
18. Una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 o una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15 o 16, para su usarse en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por 0X40 o que está asociado con un incremento del nivel de OX40.
19. El uso de una proteína de fusión que es un anticuerpo biespecífico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno patológico que está mediado por 0X40 o que está asociado con un incremento del nivel de 0X40.
20. El uso de conformidad con la reivindicación 18 o 19, donde el trastorno patológico es una enfermedad seleccionada del grupo constituido por alergia, EPOC, enfermedad autoinmunitaria, artritis reumatoide, asma, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, diabetes de tipo 1, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, nefritis lúpica, miastenia grave, enfermedad de Graves, rechazo de trasplantes, granulomatosis de Wegener, púrpura de Henoch-Schonlein, esclerosis sistémica e inflamación pulmonar inducida por virus.
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