MX2014005311A

MX2014005311A - Formulaciones para el tratamiento de diabetes.

Info

Publication number: MX2014005311A
Application number: MX2014005311A
Authority: MX
Inventors: Steven Prestelski; Nancy Scott
Original assignee: Xeris Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-10-31
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2014-10-06
Also published as: CA2853942C; PL2773331T3; US9138479B2; CN103930096B; WO2013067022A1; EP2773331A1; KR102007057B1; ZA201403795B; JP6117811B2; JP2014532667A; DK2773331T3; EA027744B1; MX349383B; ES2574761T3; AU2012332556B2; EA201490913A1; SG11201401921YA; CN103930096A; CA2853942A1; AU2012332556A1

Abstract

Se describe una formulación para la administración parenteral que comprende insulina que comprende una memoria de pH entre 1 a 4 o entre 6 a 8 y un solvente polar aprótico, en donde la insulina es solubilizada en el solvente polar aprótico, en donde la insulina solubilizada comprende formas monoméricas o diméricas estables de insulina o mezclas de las mismas, y en donde el contenido de agua de la formulación es igual a o menor que 15% p/v.

Description

FORMULACIONES PARA EL TRATAMIENTO DE DIABETES REFERENCIA CRUZADA A SOLCI ITUDES RELACIOAN DAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud estadounidense provisional no. 61 /609, 123, presentada el 9 de marzo de 2012 y la solicitud estadounidense provisional no. 61 /553,388, presentada el 31 de octubre de 201 1 . Los contenidos de las solicitudes antes referidas son incorporados en esta aplicación por referencia.

Antecedentes de la invención A. Campo de la invención La invención concierne formulaciones de insulina para administración parenteral. Estas formulaciones pueden incluir formas monoméricas y diméricas estables de insulina, acelerando por ello la velocidad de absorción de insulina en un torrente sanguíneo del sujeto.

B. Descripción de técnica relacionada Los pacientes con diabetes Tipo 1 producen poca a nada insulina, y así el tratamiento primario para diabetes tipo 1 es terapia de insulina exógena. Además, debido a las limitaciones de tratamientos no de insulina, muchos pacientes con diabetes Tipo 2 requieren eventualmente terapia de insulina. Históricamente, la insulina ha sido usada por más de 90 años para tratar diabetes. Un régimen típico involucra administrar varias inyecciones de insulina cada día: una insulina basal de acción prolongada una o dos veces al día y una insulina de acción rápida a la hora de los alimentos. Aunque este régimen de tratamiento es aceptado como efectivo, tiene limitaciones. Primero, a los pacientes generalmente les desagrada inyectarse ellos mismos insulina debido a la inconveniencia y dolor de las agujas. Como resultado, los pacientes tienden a no cumplir adecuadamente con los regímenes de tratamiento prescritos. De manera más importante, aún cuando son administrados apropiadamente, los productos de insulina inyectables no a la hora de los alimentos replica adecuadamente la acción fisiológica natural de la insulina humana. En particular, la respuesta de primera fase en un no diabético consiste de un pico de insulina con el nivel de insulina en la sangre elevándose dentro de varios minutos de la entrada de glucosa en la sangre a partir de un alimento. El nivel de insulina en la sangre tendrá pico entonces entre 30 y 60 minutos después del inicio de acción. En contraste, la insulina inyectada entra a la sangre lentamente, con la concentración máxima observada (Cmax) ocurriendo 90 minutos o más siguiendo la inyección de insulina humana regular.

Varias clases de inulina y análogos de insulina terapéuticos han sido desarrolladas para alcanzar perfiles farmacocinéticos (PK) diferentes, tal como negociando el inicio de acción y tiempo para insulina en plasma pico con duración de la acción. Una mejora clave en tratamientos de insulina fue la introducción de análogos de insulina de rápida acción, incluyendo Humalog®, Novolog® y Apidra®. Sin embargo, aún con estos análogos, los niveles de insulina pico normalmente ocurren ~60 minutos siguiendo la inyección. La falla de productos de insulina actualmente comercializados para imitar adecuadamente la liberación de insulina de primera fase resulta en niveles de insulina deficientes al inicio de una comida y niveles de insulina excesivos entre comidas, lo cual puede tener el efecto fisiológico de hiperglicemia poco después del inicio de la comida e hipoglicemia tardía después de las comidas. Ambas situaciones representan retos significativos a la promesa de una tecnología de páncreas artificial de circuito cerrado porque los algoritmos complejos son requeridos para manejar ambas latencias.

Para pacientes diabéticos tratados con insulina, la ruta de administración primaria de insulina exógena es subcutánea y los parámetros primarios del perfil PK son dependientes de la absorción subcutánea. Una variedad de variables afecta la absorción de insulina subcutáneamente inyectada (por ejemplo, flujo de sangre, velocidades de difusión y estado de asociación). Cuando las velocidades de flujo sanguíneo son suficientes, los factores limitantes de velocidad para absorción de insulina insoluble son (i) transporte intersticial a los capilares por difusión, y (ii) la restricción de transporte sobre la membrana capilar ambos los cuales son gobernados por el tamaño de la molécula (es decir, estado de asociación de insulina).

Normalmente, las formulaciones de insulina son basadas en agua.

Una razón para esto es que la mayoría del cuerpo humano está hecho de agua, incluyendo el plasma de sangre, el cual es un ambiente acuoso. Por lo tanto, existe una tendencia natural para administrar una formulación de medicamento que es compatible con el ambiente de que el medicamento pretende alcanzar. Aunque las formas de insulina monoméricas y diméricas son más fácilmente absorbidas en el torrente sanguíneo debido a sus tamaños más pequeños cuando se comparan con la forma de hexámero de insulina, la insulina generalmente está presente en composiciones farmacéuticas en la forma de hexámeros unidos a cinc, estabilizados. La insulina monomérica en solución acuosa es inestable, formando fibrillas amiloides y degradándose a través de trayectorias mediadas con agua. Aunque la estructura de hexámero promueve la estabilidad en solución (pH 5-8), también obstruye la difusión y absorción subsecuente. Además, el volumen del depósito de inyección también tendrá un efecto sobre difusión, de manera que mientras mayor es el volumen, menor será la velocidad de difusión. Esta combinación de factores que es principalmente responsable de la latencia en el inicio de acción y niveles de insulina en plasma pico.

Para prevenir la fibrilación y degradación de insulina en solución acuosa al tiempo que también promueven la absorción subcutánea, los análogos de insulina han sido desarrollados donde la secuencia de aminoácidos ha sido cambiada para reducir la propensión de auto-asociación mientras que se conserva la afinidad de unión de receptores. Estas clases de insulina son referidas frecuentemente como insulina "monomérica", pero realmente existen como hexámeros débilmente asociados. La absorción de tales preparaciones todavía será retardada debido a que es dependiente de la difusión y reducción subsecuente en concentración subcutánea requerida para que el hexámero se disocie al dímero/monómero. Los análogos de insulina con equilibro a favor del estado monomérico (por ejemplo, el análogo de insulina Lispro) han mostrado una absorción más rápida y una duración de acción más corta. Sin embargo, estas moléculas análogas son menos estables y más propensas a agregación irreversible bajo tensión térmica y mecánica en comparación con la insulina hexamérica. Más aún , estos agregados dism inuyen no solo la dosis de i nsuli na disponible, sino tam bién pueden inducir irritación o reacciones inmunes en los pacientes. Las preocupaciones tam bién han emergido en estudios experimentales y epidemiológicos con respecto a la señalización prolongada de la maquinaria de receptor y la inducción de proliferación de tumor por algunos análogos de insul ina más nuevos. A pesar de sus déficits, los análogos de insu lina son costosos - aproximadamente dos veces la insulina humana regular.

Breve descripción de la i nvención La presente invención proporciona una solución a los problemas actuales que enfrenan las form ulaciones de i nsu lina. La invención reside en secar i nsu lina en un amortiguador para crear una forma seca de insulina que mantiene un pH deseado después de que es reconstituido y sol ubilizado en un solvente polar aprótico. La formulación resultante incluye formas monoméricas y diméricas solubilizadas y estabil izadas de insulina . Notablemente, las formulaciones pueden tener cantidades relativamente bajas de agua (20, 1 5, 1 0, 5, 4, 3, 2, 1 % o menos) o pueden ser no acuosas, lo cual permite además q ue cantidades incrementadas de insulina estén presentes en la formulación, reduciendo por ello el volumen de la formulación conteniendo insulina a ser administrado a un sujeto. Además, la invención permite usar ambas formas de insulina no modificadas o naturales y modificadas o análogas. Dicho de otra manera, aunque los análogos de insulina pueden ser usados con la presente invención, la insulina no modificada/natural también puede ser usada y permanece estable tanto en sus formas monoméricas como diméricas.

En un aspecto de la presente invención, se describe una formulación comprendiendo insulina que tiene una memoria de pH entre 1 a 4 (o 1 a 3 o aproximadamente 2) o entre 6 a 8 (o 6.5 a 7.5 o aproixmadamente 7) , y un solvente polar aprótico, en donde la insulina puede ser solubilizada en el solvente polar aprótico, en donde la insulina solubilizada puede incluir formas monoméricas o diméricas estables o mezclas de las mismas, y en donde el contenido de agua de la formulación puede ser igual a o menos de 20, 1 5, 10, 5, 4, 3, 2, 1 % p/v o p/v o menos (por ejemplo, anhidra). La formulación puede ser usada para administración parenteral. En ciertos aspectos, el solvente polar aprótico puede ser dimetilsulfóxido (DMSO), n-metil pirrolidona (NMP), acetato de etilo, dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA) o carbonato de propileno, o mezclas de los mismos. En ciertos aspectos, el solvente polar aprótico puede ser dimetilsulfóxido (DMSO). En algunos aspectos, la formulación comprende 3 mg/ml a 50 mg/ml, 3 mg/ml a 10 mg/ml, o 10 mg/ml a 50 mg/ml de insulina. En otros, puede incluir 0.5, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 0, 1 5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100 mg/ml, o más o según sea necesario, o cualquier rango ahí. En algunos aspectos, la mayoría de la insulina dentro de la formulación es forma monomérica o forma dimérica o una combinación de formas monoméricas y diméricas. La formulación puede incluirá demás ingredientes que son capaces de reducir la agregación de formas monoméricas o diméricas de insulina. Ejemplos no limitantes de tales ingredientes incluyen urea, cloruro de guanidinio, un aminoácido, un azúcar, un poliol, un polímero, un ácido, o un surfactante, o mezclas de los mismos. En ciertos aspectos, el ácido puede ser ácido acético, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido glutámico, ácido aspártico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, o ácido adípico, o mezclas de los mismos. La formulación puede incluir un co-solvente. Un ejemplo no limitante de un co-solvente es agua. En algunos aspectos, la formulación no incluye cinc, incluye bajas cantidades de cinc y/o incluye cinc que es unido a un agente quelante con el fin de reducir la probabilidad de formación de hexámero. En ciertos aspectos, la insulina puede ser secada previamente en un amortiguador no volátil, dicho amortiguador puede tener un rango de pH entre 1 a 4 o entre 1 a 3 o aproximadamente 2 o entre 6 a 8 o 6.5 a 7.5 o aproximadamente 7. Ejemplos de amortiguadores no volátiles pueden ser un amortiguador de glicina, un amortiguador de citrato o un amortiguador de fosfato o mezclas de los mismos. En algunos aspectos, el amortiguador puede incluir un agente quelante. Ejemplos o limitantes de agentes quelantes incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilen glicol tetraacético (EGTA), ácido tartárico, glicerina o ácido cítrico o cualquier combinación de los mismos. La formulación también puede incluir un ingrediente que es capaz de deprimir el punto de congelación del solvente polar aprótico a aproximadamente 0°C y ejemplos no limitantes de tal ingrediente incluyen agua, un azúcar, un alcohol de azúcar, o mezclas de los mismos. En algunos casos, la insulina puede ser insulina humana no modificada o natural. En otros aspectos, la composición puede incluir además un auxiliar de insulina, tal como un análogo de amilina. El análogo de amilina puede ser solubilizado en la formulación. Un ejemplo no limitante de un análogo de amilina es pramlintida. La pramlintida puede ser procesada de manera que tiene una memoria de pH entre 1 a 5, o 2, 3, o 4, o aproximadamente 2. En algunos casos particulares de la co-formulación, la memoria de pH de insulina puede ser aproximadamente 2 y la memoria de pH de pramlintida puede ser aproximadamente 2. En algunos aspectos, el procesamiento de la pramlintida puede incluir secar dicha pramlintida en un amortiguador no volátil, teniendo dicho amortiguador un rango de pH entre 1 a 5, o 2, 3, o 4, o aproximadamente 2. En formulaciones que incluyen insulina y pramlintida, el contenido de agua puede ser entre 5 a 20% p/v o p/p o 5 a 15% p/v o p/p o 7 a 12% p/v o p/p, u 8 a 10% p/v o p/p, o aproximadamente 9% p/v o p/p. La formulación puede estar en forma líquida. La formulación puede ser una solución. En ciertos aspectos, al menos 50, 60, 70, 80 o 90% o más de la insulina dentro de la formulación puede permanecer química y físicamente estable cuando la formulación es almacenada a temperatura ambiente durante un mes. En algunos aspectos, la formulación puede estar comprendida dentro de un recipiente. El recipiente puede ser una jeringa, un dispositivo de inyección de pluma, un dispositivo auto-inyector, una bomba o una bolsa de perfusión. En ciertos aspectos, el solvente polar aprótico puede ser la fase continua de la formulación. La formulación puede incluir al menos 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 o % p/v o p/p del solvente polar aprótico. La insulina dentro de la formulación puede ser meta-estable.

También se describe un método para reducir el nivel de glucosa en sangre comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad de lo mismo cualquiera de una de las formulaciones de la presente invención en una cantidad efectiva para reducir el nivel de glucosa en sangre en el sujeto. El sujeto puede ser un humano (adulto o niño), un animal (por ejemplo, chimpancé, caballo, vaca, cerdo, conejo, rata, ratón, etc.). En ciertos aspectos, el nivel de glucosa en sangre en el sujeto es reducido dentro de 1 0, 20, 30 minutos, 60 minutos o 90 minutos después de la administración. En algunos casos, la Tmax ½ temprana de nivel de insulina en sangre en el sujeto ocurre dentro de 10, 20, 30, 40, 50 o 60 minutos después de la administración o dentro de 30 a 60 minutos después de la administración. El sujeto puede haber sido ya diagnosticado con diabetes tipo I o tipo II o puede ser susceptible a desarrollar diabetes tipo I o I I . En algunos casos, la formulación puede ser administrada dentro de 30, 20, 1 5, 10 minutos, 5 minutos o 1 minuto antes de la ingestión de alimento por el sujeto, o dentro de 1 minuto, 5 minutos, 1 0, 1 5, 20 o 30 minutos después de la ingestión del alimento por el sujeto.

También se describe un método para hacer las formulaciones de la presente invención. El método puede incluir secar una mezcla comprendiendo insulina y un amortiguador no volátil para obtener insulina deshidratada, en donde la insulina deshidratada puede tener una memoria de pH entre 1 a 4 (o 2 a 3 o aproximadamente 2) o 6 a 8 (o 6.5 a 7.5 o aproximadamente 7) y reconstituir subsecuentemente la insulina deshidratada en un solvente polar aprótico, en donde la insulina puede ser solubilizada en el solvente polar aprótico, en donde la insulina solubilizada puede incluir formas monoméricas o diméricas estables de insulina o mezclas de las mismas, y en donde el contenido de gua de la formulación puede ser igual a o menor que 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 % p/v o p/p o menos (por ejemplo, anhidro). El método puede incluir además secar una mezcla comprendiendo un análogo de amilina y un segundo amortiguador no volátil para obtener un análogo de amilina deshidratado y reconstituir el análogo de amilina deshidratado en el solvente polar aprótico junto con la insulina deshidratada, en donde el análogo de amilina deshidratado puede ser solubilizado en el solvente polar aprótico. Como se nota antes, el análogo de amilina puede ser pramlintida y puede ser procesado para tener una memoria de pH entre 1 a 5, o 2, 3, o 4, o en particular casos de aproximadamente 2. En algunos casos particulares de la co-formulación, la memoria de pH de insulina puede ser aproximadamente 2 y la memoria de pH de pramlintida puede ser aproximadamente 2. El segundo amortiguador no volátil puede tener un rango de pH entre 1 a 5 o aproximadamente 2, 3 o 4, o más particularmente aproximadamente 2. Este método puede incluir además adicionar un co-solvente, tal como agua a la formulación en cantidades que varían desde 5 hasta 20% p/v o p/p o 5 a 15% p/v o p/p o 7 hasta 1 2% p/v o p/p, u 8 a 10% p/v o p/p, o aproximadamente 9% p/v o p/p.

Otro aspecto único de la presente invención es que puede ser contenido en un recipiente, ser almacenado, o ser inmediatamente lista para administración parenteral sobre como una base necesaria sin tener que reconstituir o diluir la formulación. Por lo tanto, el recipiente en el que la formulación puede ser almacenada puede ser una jeringa, un dispositivo de inyección de pluma, un dispositivo auto-inyector, una bomba o una bolsa de perfusión. También se contempla para uso en las formulaciones ingredientes/excipientes farmacéuticos adicionales, ejemplo no limitante de los cuales incluyen: antioxidantes (ejemplos incluyen ácido ascórbico, cisteína, metionina, monotioglicerol, tiosulfato de sodio, sulfitos, BHT, BHA, palmitato de ascorbilo, galato de propilo o vitamina E); agentes quelantes (ejemplos incluyen EDTA, EGTA, ácido tartárico, glicerina o ácido cítrico); o conservadores (ejemplos incluyen alcoholes alquílico, alcohol bencílico, un metil parabeno o un propil parabeno o mezclas de los mismos). La formulación puede estar en forma líquida, forma semi-sólida o forma de gel. Como se discute más abajo, la formulación puede tener un rango de viscosidad deseada (en un ejemplo no limitante, tal como un rango podría estar entre 0.5 a 15 cps).

Se contempla que cualquier modalidad discutida en esta especificación puede ser implementada con respecto a cualquier método o composición de la invención y viceversa. Adicionalmente, las composiciones de la invención pueden ser usadas para alcanzar métodos de la invención.

"Insulina" significa insulina humana, no humana, recombinante, purificada y/o sintética (por ejemplo, insulina modificada o análogos de insulina). "Insulina humana" significa que la hormona de péptido humana insulina que s secretada por el páncreas - puede ser aislada, a partir de una fuente natural, hecha a partir de un organismo genéticamente alterado, fabricado vía química sintética, comprada, etc. "Insulina no humana" es insulina derivada de un animal (por ejemplo, cerdo, vaca, etc. ).

"Insulina modificada" o "análogo de insulina" es una forma alterada de insulina, diferente de aquélla en la naturaleza (por ejemplo, modificación química, estructura diferente, secuencia de aminoácidos diferente), pero todavía disponible para un sujeto (por ejemplo, humano) para realizar la misma función como insulina natural/no modificada. Por ejemplo, a través de ingeniería genética de la codificación de DNA, la secuencia de aminoácido de insulina puede ser cambiada para alterar sus características ADME (adsorción, distribución, metabolismo y/o excreción). Ejemplos de insulina modificada o análogos de insulina incluyen Lispro®, Aspart®; Glulisine®, Detemir®; Deglucdec®, etc. Insulina no modificada o natural incluye la secuencia de aminoácidos natural o que ocurre de manera natural.

"Insulina estable" significa insulina dentro de la formulación no se agrega irreversiblemente dentro de la formulación o de otra manera pierde su actividad una vez que la formulación es administrada. La insulina retiene su actividad una vez absorbida en la sangre. Sin desear ligar a una teoría, se cree que la insulina dentro de la formulación de la presente invención es "meta-estable" ya que aunque la conformación de la insulina solubilizada puede cambiar, la insulina se revierte a su conformación natural una vez que es administrada y absorbida en la sangre. Además, se cree que el cambio conformacional de insulina dentro de la formulación reduce la probabilidad de agregación con otros monómeros y dímeros de insulina o auxiliares, tales como análogos de amilina presentes dentro de la formulación. La forma de insulina monomérica significa insulina en su forma monomérica. La forma de insulina dimérica significa insulina en su forma dimérica (por ejemplo, dos monómeros asociados o acoplados juntos). La forma de insulina de hexámero significa insulina en su forma de hexámero (por ejemplo, tres formas diméricas asociadas o acopladas juntas).

"Libre de cinc" o "baja en cinc" significa que la formulación incluye aproximadamente 0.6% o menos (por ejemplo, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1 , 0%) de cinc en relación al contenido de insulina o 3 iones de cinc por 6 monómeros de insulina o menos (por ejemplo, 2, 1 , 0).

"Solvente polar aprótico" significa un solvente polar que no contiene hidrógeno ácido y no actúa como un donador de enlace de hidrógeno. Como se nota antes, ejemplos no limitantes incluyen dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), acetato de etilo, n-metil pirrolidona (NMP), dimetilacetamida (DMA) y carbonato de propileno.

"Administración parenteral" se refiere a la administración de la formulación bajo o a través de una o más capas de piel o membranas mucosas de un animal, tal como un humano. Las administraciones parenterales estándares están dadas en la región subcutánea o intramuscular de un animal, por ejemplo, un paciente humano. Estas ubicaciones profundas son enfocadas debido a que el tejido se expande más fácilmente, en relación a sitios dérmicos someros, para acomodar los volúmenes de inyección para entregar las formulaciones de insulina. La administración puede ser con una aguja, bomba, dispositivo de inyección, catéter, etc.

"Portador farmacéuticamente aceptable" significa un solvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o vehículo para entregar insulina a un mamífero, tal como un animal o humano.

Ingrediente, excipiente o componente "farmacéuticamente aceptable" es uno que es adecuado para usarse con humanos y/o animales sin efectos laterales adversos (tal como toxicidad, irritación y respuesta alérgica) acorde con una proporción riesgo/beneficio razonable.

"Biocompatible" significa que es adecuado para uso con humanos o animales sin efectos laterales adversos indebidos (tales como toxicidad, irritación y respuesta alérgica) acorde con una proporción riesgo/beneficio razonable.

"Biodisponibilidad" se refiere al grado al cual la insulina es absorbida de la formulación por el sujeto.

"Sistémico" significa, con respecto a la entrega o administración de insulina a un sujeto, que el agente terapéutico es detectable en un nivel biológicamente significativo en el plasma de sangre del sujeto.

"Paciente", "sujeto" o "individuo" se refiere a un mamífero (por ejemplo, humano, primate, perro, gato, bovino, ovino, porcino, equino, ratón, rata, hámster, conejo o conejillo de Indias).

"I nhibir" o "reducir" o cualquier variación de estos términos, cuando se usa en las reivindicaciones y/o la especificación incluye cualquier disminución o inhibición completa medible para lograr un resultado deseado.

"Efectivo" o "tratar" o "prevenir" o cualquier variación de estos términos, cuando se usa en las reivindicaciones y/o especificación, significa adecuado a lograr un resultado deseado, esperado o pretendido.

El término "alrededor" o "aproximadamente" son definidos por estar tan cerca como es entendido por alguien de habilidad ordinaria en la técnica, y en una modalidad no limitante los términos son definidos por estar dentro de 1 0%, de preferencia dentro de 5%, más preferiblemente dentro de 1 % y muy preferiblemente dentro de 0.5%. Además, "substancialmente no acuoso" se refiere a menos de 5%, 4%, 3%, 2%, 1 % o menos en peso o volumen de agua.

El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa en conjunción con el término "comprende" en las reivindicaciones y/o la especificación puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".

Las palabras "comprendiendo" (y cualquier forma de comprendiendo, tal como "comprenden" y "comprende"), "teniendo (y cualquier forma de teniendo, tal como "tienen" y "tiene"), incluyendo" (y cualquier forma de incluyendo, tal como "incluye" e "incluyen"), o "conteniendo" (y cualquier forma de conteniendo, tal como "contiene" y "contienen") son inclusivas o de extremo abierto y no excluyen elementos o pasos de método no declarados, adicionales.

Las composiciones y métodos para su uso pueden "comprender", "consistir esencialmente de", o "consistir de" cualquiera de los ingredientes o pasos descritos a lo largo de la especificación. Con respecto a la fase de transición "consiste esencialmente de", en un aspecto no limitante, una característica básica y novedosa de las formulaciones y métodos descritos en esta especificación incluye la estabilidad y solubilidad de las formas monoméricas y/o diméricas de insulina dentro de dichas formulaciones. Por lo tanto, los ingredientes que pueden afectar la estabilidad o solubilidad de las formas monoméricas y/o diméricas de insulina dentro de las formulaciones serían excluidas de dichas formulaciones, en casos donde una reivindicación usa la fase de transición "consiste esencialmente de".

Otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada. Sin embargo, se debería entender que la descripción detallada y los ejemplos, al tiempo que indican modalidades específicas de la invención, están dadas a manera de ilustración solamente. Además, se contempla que los cambios y modificaciones dentro del espíritu y alcance de la invención se volverán evidentes para aquéllos expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Breve descripción de los dibujos Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y son incluidos para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede ser mejor entendida por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de modalidades específicas presentadas a continuación.

FIG. 1: los espectros de FTIR de formulaciones de DMSO/Insulina y acuosa/insulina.

FIG. 2: Peso molecular aparente de formulaciones de DMSO/insulina y acuosa/insulina.

FIG. 3: Distribución de radio hidrodinámico para Ins-E a 50 mg/ml en DMSO. El eje horizontal es una rejilla logarítmicamente espaciada de valores de radio hidrodinámico (con puntos adyacentes que difieren por un factor de ~1.3). El análisis cubre un rango de radios de ~0.01 nm a ~20 µ??. Los picos a 0.01-0.1 nm, los cuales son artefactos que surgen de después de pulsado del fotodetector han sido suprimidos.

FIG. 4: Distribución de radio hidrodinámico para Ins-E a 30 mg/ml en DMSO (ver antes FIG. 3 para explicación de gráfica).

FIG. 5: Distribución de radio hidrodinámico para Ins-E a 10 mg/ml en DMSO (ver antes FIG. 3 para explicación de gráfica).

FIG. 6: Distribución de radio hidrodinámico para Ins-E a 3 mg/ml en DMSO (ver antes FIG. 3 para explicación de gráfica).

FIG. 7: Distribución de radio hidrodinámica por lns-H20 a 10 mg/ml en amortiguador E (ver antes FIG. 3 para explicación de gráfica).

FIG. 8: Distribución de radio hidrodinámico para Ins-hhO a 10 mg/ml en amortiguador F (ver antes FIG. 3 para explicación de gráfica).

Descripción de modalidades ilustrativas Como se discute antes, las dificultades asociadas con formular insulina en sus formas monoméricas o diméricas para administración parenteral son bien documentadas. Las soluciones actuales a tales dificultades también son bien documentadas y aceptadas como práctica estándar en el campo de formulaciones. Por ejemplo, los análogos de insulina/insulina modificada han sido preparados para reducir su afinidad de unión con ella misma en espera de evitar la formación de hexámeros de los análogos. Estos análogos son administrados normalmente en un ambiente acuoso, lo cual reduce su estabilidad y los hace más propensos a agregación irreversible una vez que ocurre la agregación. Adicionalmente, tales análogos son costosos y pueden inducir irritación o reacciones inmunes en los pacientes.

Por comparación, los inventores han encontrado una solución a los problemas antes mencionados. La solución reside en preparar insulina que tiene una memoria de pH particular y reconstituir y solubilizar dicha insulina en un solvente polar aprótico. La formulación resultante, la cual puede tener bajas cantidades de agua a nada de agua, incluye formas de insulina monoméricas y diméricas solubilizadas y estabilizadas. Además, la solubilidad incrementada de insulina en solventes polares apróticos resulta en una formulación de volumen bajo que tiene altas cantidades de formas de inulina monoméricas y diméricas. De manera notable, las formulaciones pueden ser usadas tanto para insulina modificada como no modificada. En el caso de una insulina no modificada, uno puede evitar problemas asociados con usar moléculas de insulina modificada/análogas tales como irritación, respuesta inmunogénica y costos.

Estos y otros aspectos no limitantes de la presente invención son discutidos a continuación.

A. I nsulina La insulina ayuda al uso corporal o almacenar la glucosa en sangre que obtiene de los alimentos. En personas con diabetes tipo 1 , el páncreas ya no hace insulina. Mientras que las personas con diabetes tipo 2 hacen insulina, la respuesta de sus cuerpos no es eficiente o no es adecuada, lo cual frecuentemente es referido como resistencia a insulina.

La insulina por sí misma es una hormona de péptido que es bien conocida y caracterizada. La forma monomérica de insulina humana está compuesta por 51 aminoácidos, que es caracterizada adicionalmente en dos cadenas de péptidos referidas como la cadena A y la cadena B que son acopladas por enlaces disulfuro. En la mayoría de las especies, la cadena A consiste de 21 aminoácidos y la cadena B de 30 aminoácidos. Aunque la secuencia de aminoácidos de insulina varía entre las especies, ciertos segmentos de la molécula son altamente conservados. Estas similitudes en la secuencia de aminoácidos de insulina conducen a una conformación tridimensional de insulina que es muy similar entre las especies, y la insulina de un animal puede ser biológicamente activa en otras especies. Por ejemplo, la insulina de cerdo ha sido ampliamente usada para tratar pacientes humanos. La forma de monómero de insulina puede asociarse para formar dímeros. Los dímeros pueden asociarse para formar hexámeros, lo cual normalmente ocurre en la presencia de cinc.

Ambas formas monoméricas y diméricas de insulina se difunden fácilmente en la sangre. Por comparación, los hexámeros se difunden pobremente en gran parte debido a sus tamaños significativamente mayor. Como se nota antes, esto ha conducido a la producción de insulina modificada o análogos de insulina (por ejemplo, Lispro®, Aspart®, Glulisine®, Detemir®, Deglucdec®, etc.), los cuales están comercialmente disponibles y utilizables en el contexto de la presente invención. Además, la insulina no modificada regular también está fácilmente disponible (por ejemplo, Humilin® R, Humulin® N , Humulin® 70/30, Novolin®, etc.) y también utilizable en el contexto de la presente invención. En ciertos aspectos, la forma regular/no modificada de insulina puede ser usada en lugar de la forma modificada, con el fin de reducir costos alérgicos o inmunogénicos o para reducir los costos de la formulación. La insulina es actualmente producida por numerosos fabricantes incluyendo compañías farmacéuticas y fabricante de medicamentos por contrato. Los fabricantes farmacéuticos incluyen Eli Lilly and Co. , Novo Nordisk, y Sanofi. Los fabricantes por contrato incluyen Sigma-Aldrich, Lonza y Biocon. La insulina usada en los Ejemplos de esta especificación fue insulina humana no modificada recombinante comprada a Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO).

B. Memoria de pH Los inventores también descubrieron un paso de procesamiento que puede ser usado para estabilizar adicionalmente la insulina solubilizada dentro de la formulación . Este paso incluye mezclar insulina con un amortiguador no volátil en una solución acuosa y entonces secar la mezcla para obtener insulina deseada. Antes del secado, la solución acuosa tiene un rango de pH entre 1 a 4 o entre 6 a 8, lo cual son los rangos de pH óptimos para estabilidad de insulina en un ambiente acuoso. Así, una vez que la mezcla se seca, produce una insulina deshidratada teniendo una "memoria de pH" entre 1 a 4 o entre 6 a 8, de manera que la memoria de pH permanece después de que la insulina deshidratada es solubilizada dentro del solvente polar aprótico. En algunos casos particulares cuando se incluye adicionalmente pramlintida, la memoria de pH de insulina puede ser aproximadamente 2 y la memoria de pH de pramlintida puede ser aproximadamente 2.

En particular, la "memoria de pH" de insulina es el perfil de carga resultante (estado de protonación) después de secar insulina a partir de una solución acuosa amortiguada (por ejemplo, desde un amortiguador no volátil). El estado de protonación, y así la solubilidad y estabilidad de insulina en solvente polares apróticos es afectado por el pH de la mezcla o solución de insulina acuosa antes del secado. Cuando la insulina es secada en una especie de amortiguador en la cual tanto los componentes ácidos como básicos son no volátiles, la memoria de pH de la insulina deshidratada será aproximadamente igual al pH de la mezcla o solución de insulina acuosa. Ver, por ejemplo, Enzymatic Reactions in Organic Media (Reacciones enzimáticas en medios orgánicos), Koskinen, A. M. P. , y Klibanov, A. M. , eds. , Springer (1996): Adicionalmente, el pH de la solución acuosa amortiguada (por ejemplo, amortiguador no volátil), en la cual la insulina es secada puede ser optimizado para producir una memoria de pH para la insulina que resulta en estabilidad óptima, solubilidad máxima, y degradación mínima cuando la insulina deshidratada es reconstituida subsecuentemente en el solvente polar aprótico. Por lo tanto, cuando la insulina deshidratada es reconstituida en tal solvente, la insulina en la formulación reconstituida mantendrá las características de solubilidad y estabilidad de la memoria de pH óptima.

La memoria de pH de insulina puede medirse en varias formas. En un método, la memoria de pH es medida al reconstituir la insulina deshidratada en agua no amortiguada y medir el pH de la mezcla o solución de insulina reconstituida con un indicador de pH, tal como papel pH o un electrodo de pH calibrado. De manera alternativa, la memoria de pH puede ser determinada al adicionar al menos 20% de agua a la formulación de insulina/solvente polar aprótico y medir el pH de la formulación con un indicador de pH . Ver, por ejemplo, Baughman y Kreevoy, "Determination of Acidity in 80% Dimethyl Sulfoxide-20% Water" (Determinación de acidez en 80% sulfóxido de dimetilo-20% agua), Journal a/Physical Chemistry, 78(4):421 -23 (1 974). La medición de pH en una solución de solvente polar aprótico-agua puede requerir una pequeña corrección (es decir, no más de 0.2 unidad de pH en cuanto a Baughman y Kreevoy, supra) .

En vista de lo anterior, los amortiguadores no volátiles que son útiles en las formulaciones descritas en la presente son aquéllos que son útiles para establecer un pH de estabilidad máxima/degradación mínima, así como aquéllos que son útiles para remover el contenido de agua o humedad residual de la insulina. Los amortiguadores no volátiles incluyen aquellos amortiguadores que no se evaporarán en una manera similar a agua sobre secado/liofilización. Los amortiguadores no volátiles adecuados incluyen, por ejemplo, amortiguadores de glicina, amortiguadores de citrato, amortiguadores de fosfato y similares. En casos particulares, el amortiguador no volátil es un amortiguador de glicina o un amortiguador de citrato.

El secado de la insulina con el amortiguador no volátil puede ser realizado usando técnicas de secado por aspersión, técnicas de secado por congelación, técnicas de liofilización, técnicas de centrifugación a vacío, etc. Las técnicas de secado por aspersión son bien conocidas para aquellos expertos en la técnica. El secado por aspersión incluye los pasos de atomización de una solución conteniendo uno más sólidos (por ejemplo, agente terapéutico) vía un disco centrífugo de boquilla, u otro dispositivo, seguido por evaporación del solvente de las gotitas. La naturaleza del polvo que resulta es la función de varias variables incluyendo la concentración de soluto inicial , distribución de tamaño de gotitas producidas y la velocidad de remoción de soluto. Las partículas producidas pueden comprender agregados de partículas primarias, las cuales consisten de cristales y/o sólidos amorfos dependiendo de la velocidad y condiciones de remoción de solvente. Un proceso de secado por aspersión para preparar polvos ultra-finos de medicamentos es descrito, por ejemplo, en la patente estadounidense no. 6,051 ,256. Los procedimientos de secado por congelación son bien conocidos en la técnica, y son descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense no. 4,608,764 y patente estadounidense no. 4,848,094. Procesos de secado por congelación por aspersión son descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense no. 5,208,998. Otras técnicas de secado por aspersión son descritos, en las patentes estadounidenses nos. 6,253,463; 6,001 ,336; 5,260,306; y las publicaciones internacionales de PCT nos. W091 /16882 y WO 96/09814.

Las técnicas de liofilización son bien conocidas para aquéllos expertos en la técnica. La liofilización es una técnica de deshidratación que tiene lugar mientras que un producto está en un estado congelado y bajo un vacío (sublimación de hielo bajo un vacío) y secado mediante calentamiento suave. Estas condiciones estabilizan el producto, y minimizan la oxidación y otros procesos de degradación. Las condiciones de secado por congelación permiten correr el proceso a bajas temperaturas, por lo tanto, los productos térmicamente lábiles pueden ser conservados. Los pasos en secado por congelación incluyen pretratamiento, congelación, secado primario y secado secundario. El pretatamiento incluye cualquier método para tratar el producto antes de la congelación. Esto puede incluir concentrar el producto, revisión de formulación (es decir, adición de componentes para aumentar la estabilidad y/o mejorar el procesamiento), disminuir un solvente de alta presión de vapor o aumentar el área de superficie. Los métodos de pretratamiento incluyen: concentración de congelación, concentración de fase de solución, y formular específicamente para conservar la apariencia de producto o para proporcionar la lioprotección para productos reactivos, y son descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense no. 6, 199,297. Las condiciones de liofilización "estándares", son descritas, por ejemplo, en la patente estadounidense no. 5,031 ,336, y en "Freeze Dryaing of Pharamaceuticals" (Secado por congelación de farmacéuticos) (DeLuca, Patrick P. , J. Vac. Sci. Technol. , Vo.. 14, No. 1 , Enero/Febrero 1977); y "The Lyophilization of Pharmaceuticals: A Literature Review" (La liofilización de farmacéuticos: Una revisión de literatura) (Williams, N.A. , y G. P. Poli i , Journal of Parenteral Science and Technology, Vol. 38, No. 2, Marzo/Abril 1 984).

En ciertos aspectos, el ciclo de liofilización puede ser realizado parcialmente antes de la temperatura de transición de vidrio (Tg) de insulina para inducir un colapso de la misma para formar una torta densa contiendo humedad residual. En otras modalidades, el ciclo de liofilización es realizado por debajo de la temperatura de transición de vidrio de insulina con el fin de evitar un colapso con el fin de lograr un secado completo de las partículas de insulina.

C. Solvente polar aprótico Después de que la insulina deshidratada teniendo su memoria de pH seleccionada es obtenida, la insulina deshidratada puede ser entonces reconstituida y solubilizada en un solvente polar aprótico. Los solventes polares apróticos incluyen esos solventes que carecen de un hidrógeno ácido. Esta característica es útil para mantener la memoria de pH de la insulina deshidratada. Ejemplos no limitantes de solventes polares apróticos incluyen dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), acetato de etilo, n-metil pirrolidona (N P), dimetilacetamida (DMA), carbonato de propileno y mezclas de los mismos. Cada uno de estos solventes son bien conocidos y comercialmente disponibles de una amplia variedad de fuentes.

Como se muestra en los ejemplos, la insulina solubilizada resulta en formas monómericas y diméricas estables de insulina, lo cual puede resultar en un producto de insulina de acción rápida o ultra-rápida. Además, y como se nota antes, y sin desear ligar a una teoría, se cree que la insulina solubilizada es "meta-estable" en el solvente polar aprótico. Se piensa que esta meta-estabilidad es derivada de la combinación de la memoria de pH de insulina y la solubilidad de la insulina dentro del solvente polar aprótico.

D. Ingredientes para reducir agregación de insulina Los ingredientes adicionales pueden ser adicionados a la formulación que reduce adicionalmente la probabilidad de agregación de las formas monómericas y/o diméricas de insulina. Estos ingredientes pueden ser usados para reducir tal agregación dentro de la formulación antes de la administración (por ejemplo, durante el almacenamiento) o post-administración (por ejemplo, después de la administración y antes de la absorción en un torrente sanguíneo del sujeto). Tales ingredientes que pueden ser usados incluyen urea, cloruro de guanidinio, aminoácidos, azúcares, polioles, polímeros, ácidos, surfactantes, o mezclas de los mismos. Tales ingredientes están comercialmente disponibles a partir de una amplia variedad de fuentes.

E. Contenido de agua de formulaciones Las formulaciones de la presente invención pueden tener un bajo contenido de agua o humedad en virtud de usar cantidades relativamente altas de los solventes polares apróticos. Esto puede proporiocnar estabilidad adicional para las formas monoméricas y diméricas de insulina presentes dentro de las formulaciones al reducir la probabilidad de agregación de dichos monómeros y dímeros. Por ejemplo, las formulaciones de la presente invención pueden tener un contenido de humedad o agua que 20% , 19%, 18%, 17%, 16% , 1 5%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1 %, 0.5%, 0.25%, 0.1 %, 0.05%, 0.025%, 0.01 %, a 0% en peso o volumen de la formulación. En algunos casos, sin embargo, el agua también puede ser usada como un co-solvente, tal como cuando la formulación de la presente invención incluye insulina y pramlintida.

F. Co-formulaciones de insulina/pramlintida La amilina, una hormona de células ß que es normalmente co-secretada con insulina en respuesta a la ingestión de glucosa, también es completamente deficientes en pacientes con diabetes mellitus tipo 1 .

La amilina exhibe varios efectos glucorregulatorios que complementan aquéllos de insulina en regulación de glucosa postprandial. La amilina humana natural es inadecuada para uso clínico o farmacéutico de varias propiedades fisicoquímicas, incluyendo pobre solubilidad, auto-agregación y formación de fibrillas amiloides y placas amiloides.

La pramlintida es un análogo de amilina humana desarrollada al substituir selectivamente prolina para Ala-25, Ser-28 y Ser-29. Se ocupa de las propiedades fisicoquímicas subóptimas de amilina humana mientras que conserva las acciones metabólicas importantes. La pramlintida está ampliamente disponibles de varias fuentes comerciales (por ejemplo, Symlin® de Amylin Pharmaceuticals).

La proamlintida es administrada normalmente vía inyecciones subcutáneas separadas además de insulina. Esta práctica es aceptada por alguna sub-población de pacientes, pero tomando inyecciones adicionales crea una carga significativa en pacientes que ya se inyectan insulina múltiples veces al día. También es posible que algunos pacientes pudieran ya sea mezclar inadvertida o deliberadamente pramlintida e insulina en la misma jeringa antes de la inyección, conduciendo a eventos adversos o indeseables.

Una de las razones para administraciones separadas de pramlintida e insulina es que estos medicamentos están en conflicto en sus sistemas amortiguadores, haciendo difícil la compatibilidad de una formulación mixta. Por ejemplo, varias insulinas y análogos de insulina tienen un punto isoeléctrico en el rango de 5-6 y son formulados así a un pH de alrededor de 7. La pramlintida tiene un punto isoeléctrico de >10.5, es óptimamente estable a un pH bajo, y es formulado a un pH normalmente de alrededor de 4. La interacción de formulaciones de pramlintida e insulina a diferentes pHs y diferentes capacidades amortiguadores frecuentemente resulta en precipitación de componentes de insulina solubles o solubilizacion de los componentes de insulina cristalinos. Estudios in vitro con pramlintida y formulaciones de insulina de acción rápida y prolongada encontraron variabilidad substancial en la solubilidad de insulina cuando varias cantidades de insulina fueron mezcladas con cantidades fijas de pramlintida.

Estos problemas de co-formulaciones son resueltos por la presente invención. Por ejemplo, la pramlintida puede ser deshidratada en un sistema amortiguador de manera que tenga una memoria de pH entre 1 a 5, o 2, 3 o 4, o más particularmente alrededor de 2. La insulina puede ser deshidratada en el mismo sistema amortiguador o uno separado, de manera que tiene una memoria de pH de alrededor de 1 a 4, 1 a 3 o alrededor de 2 o 6 a 8 o alrededor de 7. La pramlintida de insulinas deshidratadas puede ser entonces reconstituida y solubilizada dentro del mismo solvente polar aprótico y mantener sus respectivas características de solubilidad y estabilidad dentro de la misma formulación. Como tales, solo una formulación simple es necesaria para administrar tanto pramlintida e insulina a un sujeto. Tal co-formulación sería menor la resistencia a sujetos a una terapia que imitara más estrechamente la respuesta fisiológica natural a la elevación post-prandial en niveles de glucosa en sangre. En algunos casos particulares de la co-formulación, la memoria de pH de insulina puede ser aproximadamente 2 y la memoria de pH de pramlintida puede ser aproximadamente 2.

Además de la pramlintida, otros agonistas de amilina pueden ser usados en el contexto de la presente invención. Tales agonistas pueden ser recombinantes o purificados a partir de una fuente natural. Los agonistas de amilina pueden ser humanos o no humanos. El agonista de amilina también puede ser un análogo de amilina, el cual puede basarse en la secuencia de aminoácidos de amilina humana pero que no tiene una o más diferentes de aminoácidos, o una amilina químicamente modificada o análogo de amilina. Las dosificaciones del agonista de amilina dependen de su biodisponibilidad y el paciente a ser tratado. "Amilina humana" incluye la hormona de péptido humana secretada por el páncreas, ya sea aislado de una fuente natural, preparado a través de química de péptido sintético o hecha mediante microorganismos genéticamente alterados. "Análogo de amilina" es una amilina alterada, diferente de la amilina secretada por el páncreas, pero todavía disponible para el cuerpo para realizar la misma acción que la amilina natural.

G. Dosificaciones Cualquier dosificación adecuada de insulina, pramlintida, o combinación de ambas puede ser administrada usando las formulaciones de la presente invención. La dosificación administrada variará, por supuesto, dependiendo de los factores conocidos, tales como: las características farmacodinámicas del medicamento particular, sal, o combinación de los mismos; la edad, salud o peso del sujeto; la naturaleza y grado de los síntomas; las características metabólicas del agente terapéutico y paciente, la clase de tratamiento concurrente; la frecuencia de tratamiento: o el efecto deseado. En general, la insulina puede estar presente en la formulación en una cantidad que varía desde aproximadament e0.5 mg/ml hasta aproximadamente 1 00 mg/ml. En algunas modalidades, la insulina está presente en la formulación en una cantidad que varía desde aproximadamente 3 mg/ml hasta aproximadamente 1 00 mg/ml, 3 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, 10 mg/ml hasta aproximadamente 50 mg/ml, o desde aproximadamente 50 mg/ml hasta aproximadamente 100 mg/ml. En ciertos aspectos, la cantidad de insulina con la formulación varía desde aproximadamente 3 mg/ml hasta aproximadamente 10 mg/ml, lo cual puede resultar en una porción significativa de la insulina que está presente en forma monomérica (ver los datos en los Ejemplos). En otros casos, la cantidad de insulina con la formulación varía desde aproximadamente 10 mg/ml hasta aproximadamente 50 mg/ml, lo cual puede resultar en una mayoría de la insulina que está presente en forma dimérica (ver los datos en los Ejemplos). En algunas modalidades, la pramlintida está presente en la formulación en una cantidad que varía desde 0.1 hasta 10 mg/ml, o 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1 , 2, 3, 4, 5, 7,8, o 9 mg/ml o según sea necesario. Nuevamente, será fácilmente evidente para aquéllos de habilidad que la dosificación de medicamento puede ser variada dependiendo del medicamento usado y la enfermedad, desorden o condiocn a ser tratada, y la concentración del medicamento en la formulación variará dependiendo de la solubilidad de medicamento, dosificación y método de administración.

H. Ingredientes/excipientes farmacéuticos adicionales Las formulaciones de la presente invención pueden incluir ingredientes/excipientes farmacéuticos adicionales para desarrollar adicionalmente una fórmula para tener una propiedad táctil deseada, rango de viscosidad o para proteger adicionalmente la insulina o pramlintida. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir adicionalmente cualquiera de, cualquier combinación de, o todos de un antioxidante (ejemplos no limitantes de los cuales incluyen ácido ascórbico, cisteína, metionina, monotioglicerol, tiosulfato de sodio, sulfitos, BHT, BHA, palmitato de ascorbilo, galato de propilo o vitamina E o cualquier combinación de los mismos); un agente quelante (ejemplos no limitantes de los cuales incluyen EDTA, EGTA, ácido tartárico y sales de los mismos, glicerina y ácido cítrico y sales de los mismos); y/o un conservador (ejemplos no limitantes de los cuales incluyen alcoholes alquílicos, alcoholes bencílicos, metil parabenos, propíl parabenos y mezclas de los mismos) . Además, las formulaciones de la presente invención también pueden incluir un solvente prótico no acuoso (ejemplos no limitantes de los cuales incluyen polietilenglicol (PEG), propilenglicol (PG), polivinilpirrolidona (PVP), metoxipropilenglicol (MPEG), glicerol, glicofurol y mezclas de los mismos).

I . Kits/recipientes Los kits también son contemplados como que son usados en ciertos aspectos d le presente invención. Por ejemplo, una formulación de la presente invención puede ser incluida dentro de un kit. Un kit puede incluir un recipiente. En un aspecto, por ejemplo, la formulación puede estar comprendida dentro de un recipiente que está listo para ser administrada parenteralmente a un sujeto sin tener que reconstituir o diluir la formulación. Esto es, la formulación a ser administrada puede ser almacenada en el recipiente y estar lita para usarse según sea necesario. El recipiente de almacenamiento puede ser una jeringa, un dispositivo de inyección de pluma, un dispositivo auto-inyector o una bomba. Los dispositivos de pluma/auto-inyector adecuados incluyen, pero no están limitados a, aquéllos dispositivos de pluma/auto-inyección fabricados por Becton-Dickenson, Swedish Healthcare Limited (SHL Group), YpsoMed Ag y similares. Los dispositivos de bomba adecuados incluyen, peor no están limitados a, esos dispositivos de bomba fabricados por Tándem Diabetes Care, Inc. , Delsys Pharmaceuticals y similares.

De manera alternativa, un kit de la presente invención puede incluir múltiples recipientes o múltiples compartimentos dentro de un recipiente. Cada recipiente o múltiples compartimientos pueden ser usados para almacenar, por ejemplo, el solvente no acuoso biocompatible y el medicamento de molécula pequeña por separado. Entonces, según sea necesario, el solvente y medicamento pueden ser mezclados juntos y administrados inmediatamente o almacenado durante un tiempo posterior, según sea necesario.

J. Método para hacer la formulación Las formulaciones de la presente invención pueden hacerse al usar los siguientes pasos. Estos pasos fueron usados para hacer las formulaciones en los Ejemplos de la especificación. 1 . la Insulina acuosa es preparada al disolver polvo de insulina (por ejemplo, insulina humana recombinante, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) en el amortiguador acuoso deseado (comprendiendo la especie de amortiguador específica, concentración y pH; por ejemplo, citrato, pH 2.0) a una concentración de insulina de 10 mg/ml. 2. Pramlintida (por ejemplo, AmbhioPharm , Inc. , Beech Island, SC y C S Bio, Inc. , Menlo Park, CA, la cual fue usada en los Ejemplos de la especificación) puede prepararse de manera similar, excepto que la pramlintida puede ser disuelta en amortiguador acuoso a una concentración de 2 mg/ml. 3a. La solución de insulina o pramlintida es dispensada en viales de HPLC o liofilización transparentes y liofilizada de acuerdo con el siguiente ciclo de liofilización o similar en la Tabla 1 .

Tabla 1 3b. De manera alternativa, la solución de insulina o pramlintida acuosa es dispensada en tubos de microcentrífuga y secados por centrifugación bajo vacío y calor suave (25-30°C). 4. Polvo de insulina o pramlintida deshidratada a la memoria de pH seleccionada es disuelta en DMSO mediante pipeteo suave a la concentración deseada, o la concentración es permitida mediante el sistema amortiguador particular y pH. 5. Las soluciones resultantes son valoradas visualmente por claridad y/o analizadas por dispersión de luz usando espectroscopia visible a 630 nM, y usada en varias aplicaciones corriente abajo.

Ejemplos La presente invención será descrita con mayor detalle a manera de los ejemplos específicos. Los siguientes ejemplos son ofrecidos para fines ilustrativos, y no pretenden limitar la invención en cualquier manera. Aquéllos de habilidad en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos, los cuales pueden ser cambiados o modificados para producir esencialmente los mismos resultados.

Ejemplo 1 Este ejem plo proporciona i nformación sobre cómo preparar formulaciones de insul ina/DMSO, en los cuales la insulina tiene una memoria de pH de alrededor de 2. Las formulaciones de insulina/h^O comparativas también son provistas y usadas para análisis espectroscópico infrarrojo de transformada de Fourier (FITR) y dispersión de luz dinámica (DLS) (discutido más adelante en los Ejemplos 2 y 3, respectivamente). Notar que la insulina usada en los Ejemplos de esta especificación fue insu lina humana no modificada recombinante comprada a Sigma-Aldrich (Saint Lou is, MO) .

I nsulina/amortiguador A/DMSO: Se disolvió insulina humana recombinante (Sigma-Aldrich, Saint Louis , MO) a una concentración de 1 0 mg/ml en amortiguador A (es decir, 1 0m M citrato + 1 mM EDTA, pH 2.0), dispensado en viales de hPLC en alícuotas de 0.25 mi y liofilizada de acuerdo con el proced imiento señalado en los pasos 1 -5 anteriores en la sección " Método para hacer la formulación" . La insulina liofilizada en cada vial tuvo una memoria de pH de 2.0 y se reconstituyó con 1 00 µ? de DMSO a una concentración de 25 mg/ml (la insu lina se solubilizó en DMSO por inspección visual). Las alícuotas de este stock fueron diluidas entonces adicionalmente con amortiguador A para crear soluciones de ¡nsulina/DMSO/H20 amortiguadas con citrato como se desea (por ejemplo, 12.5 y 5 mg/ml de insulina en DMSO y amortiguador A). Estas formulaciones son referidas como "Ins-A/DMSO" o diluciones indicadas de las mismas.

Insulina/amortiguador A/H20: La insulina fue disuelta a una concentración de 10 mg/ml en agua destilada, deionizada y liofilizada en alícuotas de 0.25 mi. La fuente de insulina y los procedimientos de liofilización fueron iguales como se describen antes. Los viales fueron reconstituidos con 250 µ? de amortiguador A (es decir, H2O + 10 mM citrato + 1 mM EDTA, pH 2.0),, lo cual produjo una insulina en solución de amortiguador A a 10 mg/ml. Las alícuotas de este stock fueron entonces diluidas adicionalmente con amortiguador A para crear soluciones de insulina/amortiguador A según se desea (por ejemplo, 5 mg/ml de insulina en amortiguador A). La insulina fue solubilizada en amortiguador A por inspección visual. Estas formulaciones son referidas como "lns-A/H20".

Insulina/amortiguador E/DMSO: La insulina fue disuelta a una concentración de 10 mg/ml en amortiguador E (es decir, H20 + 10 mM citrato + 1 mM EDTA + 10 mM NaCI, pH 2.0) y se liofilizó en alícuotas de 0.5 mi. La fuente de insulina y los procedimientos de liofilización fueron los mismos que aquéllos descritos antes. La insulina liofilizada en cada vial tuvo una memoria de pH de 2.0 y fue reconstituida con 100 µ? de DMSO a una concentración de 50 mg/ml. La insulina fue solubilizada en DMSO por inspección visual. Las alícuotas de este stock fueron entonces diluidas adicionalmente con DMSO para crear soluciones de insulina/DMSO según se desea (por ejemplo, 30, 25, 1 0, 5 y 3 mg/ml de insulina en DMSO). Estas formulaciones son referidas como "I ns-E/DMSO".

Insulina/amortiguador E y F/H20: La insulina fue disuelta a una concentración de 10 mg/ml en agua destilada, deionizada y liofilizada en alícuotas de 0.5 mi. La fuente de insulina y los procedimientos de liofilización fueron iguales que aquéllos descritos antes. Un vial fue reconstituido con 500 µ? de amortiguador E, lo cual produjo una solución de insulina en amortiguador E a 10 mg/ml. El otro vial fue reconstituido con 500 µ? de amortiguador F (es decir, H20 + 1 0 mM fosfato-citrato + 1 mM EDTA + 10 mM NaCI, pH 7.0); lo cual produjo una solución de insulina en amortiguador F a 10 mg/ml. La insulina fue solubilizada tanto en las soluciones de amortiguador E como F por inspección visual. Estas muestras son referidas como "I ns-E/F O" e "lns-F/H20" , respectivamente.

Ejemplo 2 Este ejemplo proporciona los datos FTI R que muestran los efectos de DMSO sobre conformación de insulina. BioTools Inc. (Júpiter, Florida US) realizó el análisis de FTI R y proporcionó los datos correspondientes (ver más adelante).

Materiales y métodos para el análisis de FTIR: Se prepararon las siguientes formulaciones para el análisis de FTI R: Fórmula 1 (F 1 ): Ins-A/DMSO diluida con 1 parte de amortiguador A a 12.5 mg/ml Fórmula 2 (F2): Ins-A/h^O diluida a 5 mg/ml con amortiguador A Fórmula 3 (F3): lns-A/H20 reconstituida a 10 mg/ml con amortiguador A. Fórmula 4 (F4): Ins-A/D SO a 25 mg/ml.

Fórmula 5 (F5): I ns-A/DMSO diluida con 4 partes de amortiguador A a 5 mg/ml.

Los espectros de FTI R fueron recolectados en el espectrómetro PROTA FTI R (BioTools, Inc) equipado con un detector DTGS a resolución de 4 cm-1 con tiempo de recolección de 20 minutos para cada muestra y amortiguador. Las muestras fueron disueltas como se describe, y se colocaron en 6 um BioCell con ventanas CaF2 para muestras basadas en agua y 75 mieras para muestras basadas en DMSO. Todo el análisis espectral (substracción de amortiguador y elucidación de estructura) se realizó usando la suite de software PROTA.

Resultados: la FIG. 1 muestra los espectros de FTI R en la región de amida sensible a conformación 1 . Estos datos confirman que la insulina no desdobla irreversiblemente en DMSO, ya que el perfil de insulina permanece relativamente constante sobre las fórmulas 1 -5 que fueron probadas. De manera notable, la fórmula 3 muestra el espectro de insulina típico indicativo de una proteína de lámina ß, hélice a. La fórmula 4 muestra un desplazamiento a una mayor frecuencia mientras que se retiene su perfil. Esto puede ser el resultado de un cambio conformacional o el carácter de unión de hidrógeno más fuerte del solvente de DMSO. La fórmula 5 es esencialmente idéntica al espectro acuoso de insulina. Estos datos en la FIG. 1 confirman que la insulina no se desdobla irreversiblemente en DMSO.

Ejemplo 3 Este ejemplo proporciona análisis de DLS para confirmar el estado de asociación de insulina (es decir, forma monomérica, forma dimérica, forma hexaméríca) en DMSO con comparación a muestras de control. Alliance Protein Laboratories (Thousand Oaks, California, US) realizó el análisis de DLS y proporcionó los datos correspondientes (ver más adelante). Notar que los sistemas de amortiguador E y amortiguador F fueron usados debido a la presencia de NaCI, lo cual es necesario para realizar el ensayo de DLS.

Materiales y métodos para análisis de DLS: Las siguientes formulaciones fueron preparadas para el análisis de DLS: Fórmula 6 (F6): I ns-E/DMSO a 50 mg/ml.

Fórmula 7 (F7): I ns-E/DMSO a 30 mg/ml.

Fórmula 8 (F8): Ins-E/DMOS a 10 mg/ml.

Fórmula 9 (F): Ins-E/DMSO a 3 mg/ml.

Fórmula 10 (F10): l ns-E/H20 a 10 mg/ml.

Fórmula 1 1 (F1 1 ): l ns-F/H20 a 10 mg/ml.

En DLS (también conocida como dispersión de luz cuasi-elástica o espectroscopia de correlación de fotones), las fluctuaciones dependientes de tiempo en luz dispersa son medidas. Estas fluctuaciones son relacionadas al movimiento browniano de las moléculas, y por lo tanto pueden usarse para determinar el coeficiente de difusión. Este coeficiente de difusión es convertido usualmente al radio hidrodinámico (Stokes), Rh, a través de la relación de Stokes-Einstein: Rh = kpT/6TTn.D donde kp es la constante de Boltzmann, T es la temperatura absoluta, ? es la viscosidad de solvente y D es el coeficiente de difusión.

Los datos fueron recolectados a una temperatura regulada de 25°C usando un instrumento de Protein Solutions (ahora Wyatt Technology) DynaPro MS/X usando celdas de dispersión de cuarzo de 12 µ?. Las muestras fueron centrifugadas por 10 minutos en una microcentrífuga (Fisher modelo 235 A) para remover los particulados grandes y polvo antes de cargar en la probeta de análisis. Normalmente se registraron y promediaron 25 acumulaciones de datos de diez segundos para mejorar la señal/ruido. Los datos resultantes fueron analizados con el software Dynamics versión 6.12.0.3. provisto por el fabricante. Los tamaños promedio (promedio z) se basan en el método de acumulados. Las distribuciones de tamaño fueron calculadas usando el método de análisis Dynals. Las fracciones en peso fueron estimadas usando el modelo de esferas de Ralleigh. La calibración de instrumento es absoluta, con base en unidades de tiempo y distancia (con distancia medida por la longitud de onda de la fuente de luz). Sin embargo, esa calibración de instrumento es confirmada anualmente usando los estándares de tamaño de esfera de látex calibrados (diámetro 21 ± 1 .5 nm , producto 3020A lote 35266 de Thermo Scientific). El índice de viscosidad del DMSO fue asignado como 1 .991 cp y 1 .4768.

Resultados globales: El estado de agregación de insulina en DMSO fue examinado usando dispersión de luz dinámica (DLS). La insulina monomérica tiene un MW verdadero de aproximadamente 6 kDa. En consecuencia, la insulina dimérica tendría un MW verdadero de 12 kDA e insulina hexamérica, 36 kDa. La FIG. 2 resume el peso molecular aparente (MW) de insulina medido en el DMSO preparado y soluciones acuosas (es decir, las fórmulas 6-10). El MW aparente de insulina en una formulación acuosa a pH 7.0 y concentración de 1 0 mg/ml (Fórmula 10) es 53 kDa. A esta alta concentración, la solución es problamente no ideal, con efectos intermoleculares resultando en un MW aparente que es mayor que el MW verdadero. Sin importar esto, el MW aparente medido es indicativo de insulina en un estado hexamérico.

Con respecto a las formulaciones de insulina/DMSO, a 10 mg/ml (fórmula 7), el MW aparente es 16 kDa, aproximadamente un tercio del MW de insulina acuosa a 1 0 mg/ml (fórmula 10), indicando que la insulina en DMSO se asocia como un dímero en esta concentración. También parece ser el caso para concentraciones de hasta 50 mg/ml (fórmulas 8-9), ya que la diferencia aproximadamente lineal en MW aparente observada con concentración creciente es probablemente un artefacto de un efecto de volumen excluido típico para esta técnica. Sin embargo, la reducción en MW aparente a 13 kDa a 3 mg/ml (fórmula 6) se desvía esta tendencia, e indica que la disociación reversible a momero existe a esta concentración.

Estos estudios de DLS sugieren que, sobre rango de concentraciones de uso relevantes, el estado multimérico más grande de I NS-2E en DMSO es un dímero, y en el extremo menor del rango de concentración, existe un equilibrio de monómero-dímero. Estos hallazgos están en contraste con formulaciones de insulina acuosas, donde predomina el hexámero - incluso en la ausencia de cinc - y el monómero es inestable y fibrilla rápidamente. Con base en los modelos de cinética actuales de asociación y absorción de insulina, se espera que una formulación de insulina desprovista de insulina hexamérica resultaría en cinética de absorción más rápida que aquéllos de insulinas de acción rápida actuales (por ejemplo, Lispro®, Apart®, etc.), las cuales todavía contienen cantidades significativas de insulina hexamérica. Tomados juntos, estos estudios fisicoquímicos muestran la aproximación de usar un solvente no acuoso para desarrollar una formulación de insulina de acción ultra-rápida es más probable de ser exitosa que una aproximación acuosa. En solución acuosa, incluyendo formulaciones de acción rápida, ia insulina monomérica es inestable y la forma hexamérica predomina, mientras que en DMSO, el monómero/dímero de insulina más rápidamente absorbido es termodinámicamente preferido, aún a concentraciones relativamente altas. Adicionalmente, estos datos (incluyendo los datos de DLS y FTI R) muestran que cualquier cambio conformacional que parezca ser inducido por DMSO es reversible sobre reconstitución en un medio acuoso.

Resultados específicos para la Fórmula 6 (I ns-E/DMSO a 50 mg/ml): La distribución de tamaño (histograma de intensidad de dispersión vs. Radio hidrodinámico) para Ins-E a 50 mg/ml en DMSO es mostrado en la FIG . 3. El pico principal (en peso) es el primer pico, el cual tiene un radio promedio de 2.1 2 nm y representa 34.7% de la intensidad de dispersión total . Ese radio corresponde a una masa molar de aproximadamente 20 kDa , con base en los estándares de proteínas globulares acuosos. Además del pico principal , tres picos a mayores radios son detectados, a radios promedio de 1 1 0 nm , 2.29 µ?? , y 9.85 µ?t? . Aunque estos otros 3 picos contribuyen a aproximadamente 2/3 de la intensidad de dispersión total, realmente representan una fracción muy menor sobre un porcentaje en base de peso, como se estima en la Tabla 2 a contin uación . Desafortunadamente no es posible hacer estimados de fracción significativa en peso para especies mayores que 1 µ?t? debido a (1 ) la dispersión de tales partículas grandes es muy dependiente de la forma detallada de la partícula (debido a las reflexiones internas) , y (2) casi toda la l uz dispersada es emitida en la dirección hacia adelante, con solo una dimin uta fracción en el ángulo de 90° observada aquí . Algunas o todas las demás especies pudieran ser debidas a contaminantes o componentes de amortiguador disueltos de manera incompleta en lugar de agregados de insulina .

Tabla 2* (Resumen para I ns-E a 50 mg/ml en DIVISO) *radio promedio z 24.5 nm ; intensidad promedio 1 82 kctn/s. **la fracción en peso para especie de este tamaño no puede ser estimada confiablemente así que su pico fue excluido de este cálculo.

Resultados específicos para Fórm ula 7 (I ns-E/DMSO a 30 mg/m l) : La distribución de tamaño obtenida para I NS-E a 30 mg/ml en DMSO es mostrada en la FIG . 4. A esta concentración , el pico principal se ha desplazado a un rad io ligeramente menor de 2.02 nm (masa estimada de 1 7 kDa) . Notablemente, la especie a 2.29 y 9.85 µ?t? ya no es detectada, sugiriendo fuertemente que aquéllas fueron componentes de amortiguador los cuales se han disuelto ahora. La intensidad relativa de la especie cerca de 1 00 nm tam bién ha caído substancialmente. A esta concentración se detectó una nueva especie a 1 7.7 nm . Debido a q ue la especie representa solo 1 .9% de la luz dispersada total , es posible que esta especie estuviera presente al mismo nivel en la muestra a 50 mg/ml, pero no fue detectada debido a que se perd ió en el brillo (la fuerte dispersión de la especie a 1 00 nm y mayor) . Los datos crudos de DLS (la función de autocorrelación) tiene un rango dinámico limitado, y eso sign ifica que la especie la cual representa menos de ~ 1 % de la luz dispersada total cae frecuentemente por abajo del umbral de detección . Un resumen de estos datos es provisto en la Tabla 3 para la fórmula 7.

Tabla 3* (Resumen para Ins-E a 30 mg/ml en DMSO) *radio promedio z 2.12 nm; intensidad promedio 77.9 kcnt/s.

Resultados específicos para la Fórmula 8 (Ins-E/DMSO a 10 mg/ml). La distribución de tamaño a 10 mg/ml en DMSO es mostrada en la FIG. 5. La dilución ha desplazado adicionalmente el pico principal hacia abajo a 1.94 nm (masa estimada 16 kDa). A esta concentración, el pico a 17.7 nm no fue detectado y la intensidad relativa de la especie cerca de 100 nm ha caído adicionalmente. Una traza de partículas grandes a 5.45 µp? también estuvo presente (pero la remoción de tal especie por la centrifugación algunas veces no es completa). La Tabla 4 proporciona un resumen de los datos para la Fórmula 8: Tabla 4* (Resumen para Ins-E a 10 mg/ml en DMSO) *radio promedio z 1.07 nm; intensidad promedio 43.1 kcnt/s. ** la fracción en peso para la especie de este tamaño no puede ser estimada confiablemente, de manera que este pico fue excluido para este cálculo.

Resultados específicos para la Fórmula 9 (Ins-E/DMSO a 3 mg/ml): La distribución de tamaño a 3 mg/ml en DMSO es mostrada en la FIG. 6. A esta concentración, el pico principal cae a 1.79 nm (masa estimada 13 kDa). A esta concentración, se detectó un nuevo pico a 6.34 nm, la cual puede representan una pequeña cantidad de agregados de insulina (quizás generado por la liof ilización) . El pico visto en esta muestra a 60.8 nm es probablemente el mismo material medido como 100-110 nm a las concentraciones mayores - el desplazamiento aparente podría deberse ya sea a la menor señal/ruido a esta concentración, o pudiera ser una consecuencia de resolver el nuevo pico a 6.34 nm. La Tabla 5 proporciona un resumen de los datos para la Formula 9.

Tabla 5* (Resumen para Ins-E a 3 mg/ml en DMSO) *radio promedio z 0.24 nm ; intensidad promedio 31 .4 kcnt/s.

Resultados específicos para la Fórmula 10 (Ins-E/h^O): La distribución de tamaño para lns-H20 en amortiguador E (pH 2.0) es mostrada en la FIG. 7. El pico principal ocurre a un radio de 3.08 nm. Ese radio corresponde a una masa estimada de 47 kDa, sugiriendo que la muestra todavía es predominantemente hexámero (o más) a este pH bajo. Notar que a una concentración de 10 mg/ml, los efectos no ideales de solución ("amontonamiento molecular") pueden estar provocando alguna distorsión del tamaño, pero si la distorsión se va hacia arriba o hacia abajo depende de si los efectos de volumen excluidos o electrostáticos dominan. Las trazas de especies más grandes a 27 nm y 165 nm también fueron detectadas, pero si éstas representan agregados de insulina o contaminantes particulados no está claro. La Tabla 6 proporciona un resumen de los datos para la Fórmula 1 0.

Tabla 6* (Resumen para I ns-hhO a 10 mg/ml en amortiguador E) *radio promedio z 4.06 nm; intensidad promedio 375 kcnt/s.

Resultados específicos para la Fórmula 10 (lns-F/H20): La distribución de tamaño para lns-H20 en amortiguador F (pH 7.0) es mostrada en la FIG. 8. El pico principal ocurre a un radio de 3.26 nm. Ese radio corresponde a una masa estimada de 53 kDa. Aquí nuevamente a 10 mg/ml, los efectos no ideales de solución pueden estar provocando alguna distorsión del tamaño, pero la menor carga a pH neutral probablemente significaría que domina el volumen excluido y por lo tanto el tamaño aparente sería ligeramente mayor que el tamaño verdadero. Las trazas de especies más grandes a 35 nm y 238 nm también fueron detectadas. La Tabla 7 proporciona un resumen de los datos para la Fórmula 1 1 .

Tabla 7* (Resumen para l ns-H20 a 10 mg/ml en amortiguador F) *radio promedio z 3.80 nm; intensidad promedio 447 kcnt/s.

Ejemplo 4 Este ejemplo proporciona datos concernientes a pramlintida y co- formulaciones de insulina/pramlintida en el contexto de las formulaciones de la presente invención.

Solubilidad de pramlintida en DMSO y co-solventes DMSO-agua: Las soluciones de pramlintida fueron preparadas a una concentración de 2 mg/ml en 10 mM citrato, pH 2.0, o 10 mM citrato, pH 4.0, cada una con o sin 2 mg/ml de tre alosa. Las soluciones fueron secadas mediante centrifugación bajo vacío durante aproximadamente 3.5 horas a 25- 30°C, o liofilizadas como se describió antes.

La pramlintida amortiguada con citrato deshidratada con una memoria de pH de 2.0 (con y sin trehalosa) se disolvió completamente en DMSO puro durante varios minutos con pipeteado suave intermitente a 20 mg/ml (la más alta concentración probada) . La solución resultante fue capaz de fluir y completamente clara mediante inspección visual.

La pramlintida amortiguada con citrato deshidratada con una memoria de pH de 4.0 fue un tanto resistente para reconstitución a la concentración inicial de 2 mg/ml en DMSO puro, y fue efectivamente insoluble en agua. La adición de entre 6% y 10% de agua a pramlintida en DMSO a concentraciones de pramlintida nominales entre 2 y 5 mg/ml, resultó en solubilidad mejorada o casi completa del péptido como se midió mediante inspección visual.

Co-formulación de insulina y pramlintida: Una co-formulación de insulina y pramlintida fue preparada como sigue: se disolvió insulina humana recombinante a una concentración de 10 mg/ml en 10 mM citrato/1 .0 mM amortiguador EDTA, pH 2. La pramlintida fue disuelta a una concentración de 2mg/ml en 1 0 mM citrato, pH 2.0, con o sin 2 mg/ml de trehalosa. Las soluciones fueron secadas por centrifugación bajo vacío en alícuotas de 0.5 mi como se describe antes. La insulina fue reconstituida con 50 µ? DMSO a una concentración de 1 00 mg/ml, y la pramlintida se reconstituyó con 50 µ? DMSO a una concentración de 20 mg/ml. Volúmenes iguales de las soluciones de péptido-DMSO fueron mezcladas para producir una solución combinada de 50 mg/ml insulina y 1 0 mg/ml pramlintida, con o sin 1 0 mg/ml trehalosa. Las soluciones fueron capaces de fluir y completamente claras mediante inspección visual. La proporción de 5: 1 (p/p) insulina: pramlintida es una proporción de dosificación terapéutica representativa posible, y los péptidos fueron mantenidos establemente en una solución altamente concentrada, simple, sobre 6 horas de observación visual. Con tecnología de formulación pre-existente, estos péptidos requieren sistemas amortiguadores incompatible separados, lo cual a su vez requieren administración vía inyecciones separadas en sitios separados en el cuerpo - una barrera significativa para la implementación de este benéfico tratamiento.

Ejemplo 5 Este es un ejemplo profético para deteminar la bioactividad, capacidades farmacológicas y farmacocinéticas de las formulaciones de la presente invención cuando se comparan contra productos de insulina de acción rápida existentes (por ejemplo, Aspart®, Glulisine®, Lispro®).

Bioactividad: La acción de insulina a nivel celular involucra la unión al receptor de insulina (I R) , autofosforilación de receptor, fosforilación mediada por IR de substratos receptores de insulina, y activación subsecuente de la cascada de PI3 cinasa-Akt. La unión de receptor es determinada, en parte, por el estado de asociación de la molécula de insulina, y así puede ser una medida no solo de la bioactividad global de una formulación de insulina, sino también el estado multi- (o mono-) mérico del péptido. La bioactividad de las formulaciones de la presente invención pueden medirse y compararse por su capacidad para inducir la fosforilación de I R en fibroblastos de embriones de ratón que sobre-expresan la isoforma IR-B (la principal versión encontrada en tejidos sensibles a insulina), usando un kit de ensayo inmunosorbente enlazado a enzima (ELISA) de R&D Systems. Como I R que se une solo no necesariamente predice señalización corriente abajo más próxima a la última respuesta biológica, tal como regulación de glucosa y captación de ácidos grasos y lipólisis, los lisados celulres pueden ser cuantificados de manera similar para Akt fosforilado (ver Marks, A.G. , et al. (201 1 ), "Plasma distribution and signaling activities of IGF-I I precursors." (Distribución de plasma y actividades de señalización de precursores IGF-I I .) Endocrinology 152:922-930; Denley, A. , et al. (2007), "Differential activation of insulin receptor substrates (I RS)-1 and 2 by IGF-activated insulin receptor" (Activación diferencial de substratos receptores de insulina (IRS)-1 y 2 mediante receptores de insulina activados por IGF), Mol . Cell. Biol. 27:3569-3577; y Denley, A. , et al. (2006), "Differential activation of insulin receptor isoforms by insulin-like growth factors es determined by the C domain" (Activación diferencial de isoformas receptoras de insulina mediante factores de crecimiento como insulina es determinada por el dominio C), Endocrinology, 147: 1020-1 036, todas incorporadas por referencia).

Farmacología: Estudios farmacológicos pueden ser realizados usando un modelo de cerdo consciente infusionado con octreótido con un puerto de acceso vascular de morada subcutánea (VAP). El modelo de cerdo consciente Yorkshire no diabético puede ser usado en la base de: (a) fisiología de carbohidratos similar a humanos, (b) venas grandes adecuadas para colocación de catéter IV, (c) el modelo consciente obvia complicaciones de anestesia prolongada (atelectasis, neumonía, intubación/extubación difícil), y (d) un cerdo puede ser usado para múltiples estudios. El estudio puede ser diseñado para probar formulaciones de la presente invención teniendo una dosis de insulina aceptable (por ejemplo, 0.2 mg/kg) usando los puntos en el tiempo 0, 5, 1 0, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 180 y 240 minutos.

Farmacocinética: Las muestras de sangre pueden ser ensayadas usando un ensayo previamente validado para insulina natural y análoga en suero de cerdo a OHSU (ver Mercodia Iso-lnsulin ELISA, producto número 10-1 128-01 , fabricado por Mercodia AB Uppsala, Suecia). Los niveles en sangre de insulina humana (por ejemplo, formulaciones de la presente invención y una formulación acuosa comparativa) así como análogos de insulina pueden ser cuantificados sobre el curso de tiempo indicado y comparados por área bajo la curva, Cmax, Tmax, ½ Tmax temprana y ½ Tmax tardía. Los puntos finales primarios pueden ser los valores ½ Tmax temprana y tardía, los cuales son substancialmente más sensibles a cambios en PK que Tmax. Tmax frecuentemente ocurre en una meseta larga, lo cual puede ser difícil de medir y producir resultados engañosos, mientras que los valores tempranos y tardíos se elevan y caen rápidamente y son así mucho más confiables.

Todos los ingredientes, composiciones o métodos descritos y reclamados en esta especificación pueden hacerse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Aunque los ingredientes, composiciones o métodos de esta invención han sido descritos en términos de modalidades particulares, será evidente para aquéllos de habilidad en la técnica que variaciones pueden ser aplicadas a los ingredientes activos, composiciones o métodos y en los pasos o en la secuencia de pasos del método descrito en la presente sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Una formulación para administración parenteral que comprende: (a) la insulina que comprende una memoria de pH entre 1 a 4 o entre 6 a 8 y ha sido deshidratada previamente a partir de un amortiguador no volátil; y (b) un solvente polar aprótico, en donde la insulina es solubilizada en el solvente polar aprótico, en donde la mayoría de la insulina solubilizada comprende formas monoméricas o diméricas estables de insulina o mezclas de las mismas; y en donde el contenido de agua de la formulación es igual a o menor que 1 5% p/v.

2. La formulación de la reivindicación 1 , en donde la memoria de pH de la insulina está entre 1 a 4 o entre 1 a 3, o aproximadamente 2.

3. La formulación de la reivindicación 1 , en donde la memoria de pH de la insulina está entre 6 a 8 o aproximadamente 7.

4. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el solvente polar aprótico es dimetiisulfoxido (DMSO), n-metil pirrolidona (NMP), acetato de etilo, dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA), o carbonato de propileno, o mezclas de los mismos.

5. La formulación de la reivindicación 4, en donde el solvente polar aprótico es dimetilsulfóxido (DMSO).

6. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en donde la formulación comprende 3 mg/ml a 50 mg/ml, 3 mg/ml a 10 mg/ml o 10 mg/ml a 50 mg/ml de insulina.

7. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde la mayoría de la insulina solubilizada está en forma monomérica.

8. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en donde la mayoría de la insulina solubilizada está en forma dimérica.

9. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, que comprende además un ingrediente que es capaz de reducir la agregación de formas monoméricas o diméricas de insulina.

10. La formulación de la reivindicación 9, en donde el ingrediente que es capaz de reducir la agregación de formas monoméricas o diméricas de insulina es urea, cloruro de guanidinio, un aminoácido, un azúcar, un poliol, un polímero, un ácido, o un surfactante, o mezclas de los mismos.

1 1 . La formulación de la reivindicación 10, en donde el ácido es ácido acético, ácido ascórbico, ácido cítrico, ácido glutámico, ácido aspártico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, o ácido adípico, o mezclas de los mismos.

12. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, que comprende además un co-solvente.

1 3. La formulación de la reivindicación 12, en donde el co-solvente es agua.

14. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -1 3, en donde la formulación no incluye cinc o en conde el cinc presente en la formulación está unido a un agente quelante.

15. La formulación de la reivindicación 14, en donde el amortiguador no volátil es un amortiguador de glicina, un amortiguador de citrato, o un amortiguador de fosfato, o mezclas de los mismos.

16. La formulación de la reivindicación 1 5, en donde el amortiguador comprende un agente quelante.

17. La formulación de la reivindicación 14 o reivindicación 16, en donde el agente quelante es ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol tetraacético (ETA) , ácido tartárico, glicerina, o ácido cítrico.

18. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -17, que comprende además un ingrediente que es capaz de deprimir el punto de congelación del solvente aprótico polar hasta aproximadamente 0°C.

1 9. La formulación de la reivindicación 18, en donde el ingrediente que es capaz de deprimir el punto de congelación del solvente polar aprótico hasta aproximadamente 0°C es agua, un azúcar, un alcohol de azúcar o mezclas de los mismos.

20. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -19, en donde la insulina es insulina humana no modificada.

21 . La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -20, que comprende además un análogo de amilina que es solubilizado en la formulación.

22. La formulación de la reivindicación 21 , en donde el análogo de amilina es pramlintida.

23. La formulación de la reivindicación 22, en donde la pramlintida tiene una memoria de pH de aproximadamente 2 o en donde la pramlintida tiene una memoria de pH de aproximadamente 2 y la insulina tiene una memoria de pH de aproximadamente 2.

24. La formulación de la reivindicación 23, en donde la pramlintida ha sido previamente deshidratada en un amortiguador no volátil, teniendo dicho amortiguador un pH de aproximadamente 2.

25. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 22-24, en donde el contenido de agua de la formulación está entre 5 a 15% p/v, 7 a 12% p/v, u 8 a 1 0% p/v, o aproximadamente 9% p/v.

26. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -25, en donde la formulación está en forma líquida.

27. La formulación de la reivindicación 26, en donde la formulación es una solución.

28. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -27, en donde al menos 90% de la insulina dentro de la formulación permanece química y físicamente estable cuando la formulación es almacenada a temperatura ambiente durante un mes.

29. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -28, en donde la formulación está comprendida dentro de un recipiente.

30. La formulación de la reivindicación 29, en donde el recipiente es una jeringa, un dispositivo de inyección de pluma, un dispositivo auto-inyector, una bomba, o una bolsa de perfusión.

31 . La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -30, en donde el solvente polar aprótico es la fase continua de la formulación.

32. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -31 , en donde la formulación comprende al menos 75, 80, 85, 90 o 95% p/v del solvente polar aprótico.

33. La formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -32, en donde la insulina solubilizada es meta-estable.

34. Un método para reducir el nivel de glucosa en sangre comprendiendo administrar a un sujeto en necesidad del mismo cualquiera de las formulaciones 1 -33 en una cantidad efectiva para reducir el nivel de glucosa en sangre en el sujeto.

35. El método de la reivindicación 34, en donde el nivel de glucosa en sangre en el sujeto es reducido dentro de 30 minutos, 60 minutos, o 90 minutos después de la administración.

36. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-35, en donde ½ Tmax temprana del nivel de insulina en sangre en el sujeto ocurre dentro de 30 a 60 minutos después de la administración.

37. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-36, en donde el sujeto ha sido diagnosticado con diabetes tipo I o tipo I I.

38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 34-37, en donde la formulación es administrada dentro de 1 0 minutos, 5 minutos, o 1 minuto antes de la ingestión de alimento por el sujeto, o dentro de 1 minuto, 5 minutos o 1 0 minutos después de la ingestión de alimento por el sujeto.

39. Un método para hacer la formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1 -33, que comprende: (a) secar una mezcla comprendiendo insulina y un amortiguador no volátil para obtener insulina deshidratada, en donde la insulina deshidratada tiene una memoria de pH entre 1 a 4 o 6 a 8; y (b) reconstituir la insulina deshidratada en un solvente polar aprótico, en donde la insulina es solubilizada en el solvente polar aprótico, en donde la insulina solubilizada comprende formas monoméricas o diméricas estables de insulina o mezclas de las mismas, y en donde el contenido de agua de la formulación es igual a o menor que 1 5% p/v.

40. El método de la reivindicación 39, en donde la memoria de pH de la insulina está entre 1 a 4 o entre 1 a 3, o aproximadamente 2.

41 . El método de la reivindicación 39, en donde la memoria de pH de la insulina está entre 6 a 8 o aproximadamente 7.

42. El método de cualquiera de las reivindicaciones 39-41 , en donde el solvente polar aprótico es dimetiisulfoxido (DMSO), n-metil pirrolidona (NMP), acetato de etilo, dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida (DMA) o carbonato de propileno, o mezclas de los mismos.

43. El método de la reivindicación 42, en donde el solvente polar aprótico es dimetiisulfoxido (DMSO).

44. El método de cualquiera de las reivindicaciones 39-43, en donde la formulación comprende 3 mg/ml a 50 mg/ml, 3 mg/ml a 10 mg/ml o 10 mg/ml a 50 mg/ml de insulina, o 50 mg/ml a 1 00 mg/ml de insulina.

45. El método de cualquiera de las reivindicaciones 39-44, en donde la mayoría de la insulina solubilizada está en forma monomérica o en forma dimérica.

46. El método de cualquiera de las reivindicaciones 39-45, que comprende además: (c) secar una mezcla comprendiendo un análogo de amilina y el mismo amortiguador no volátil en el paso (a) o un segundo amortiguador no volátil para obtener un análogo de amilina deshidratado, y (d) reconstituir el análogo de amilina deshidratado en el solvente polar aprótico junto con la insulina deshidratada, en donde el análogo de amilina deshidratado es solubilizado en el solvente polar aprótico.

47. El método de la reivindicación 46, en donde el análogo de amilina es pramlintida, y en donde la pramlintida tiene una memoria de pH de aproximadamente 2 o en donde la pramlintida tiene una memoria de pH de aproximadamente 2 y la insulina tiene una memoria de pH de aproximadamente 2.

48. El método de cualquiera de las reivindicaciones 46-47, en donde el amortiguador no volátil tiene un rango de pH de aproximadamente 2.

49. El método de cualquiera de las reivindicaciones 45-58, que comprende además adicionar entre 5 a 1 5% p/v de la formulación de agua como co-solvente. RES UM EN Se describe una formulación para la administración parenteral que comprende insulina que comprende una memoria de pH entre 1 a 4 o entre 6 a 8 y un solvente polar aprótico, en donde la insulina es solubilizada en el solvente polar aprótico, en donde la insulina solubilizada comprende formas monoméricas o diméricas estables de insulina o mezclas de las mismas, y en donde el contenido de agua de la formulación es igual a o menor que 1 5% p/v.