MX2014003891A - Molecula terapeutica de union al antigeno con un dominio de union a fcrn que promueve la eliminacion del antigeno. - Google Patents
Molecula terapeutica de union al antigeno con un dominio de union a fcrn que promueve la eliminacion del antigeno.Info
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Abstract
La presente invención proporciona: un dominio modificado de unión a FcRn que tiene una afinidad mejorada para el receptor Fc neonatal (FcRn por sus siglas en inglés) a pH neutro; una molécula de unión al antígeno que comprende dicho dominio de unión a FcRn, que tiene baja inmunogenicidad, alta estabilidad y forma solamente algunos elementos aglutinados; una molécula modificada de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión a FcRn al pH neutro o ácido sin una mayor actividad de unión al pH neutro para un anticuerpo antifármaco preexistente; el uso de las moléculas de unión al antígeno para mejorar la absorción del antígeno mediada por medio de la molécula de unión al antígeno en las células; el uso de las moléculas de unión al antígeno para reducir la concentración en plasma de un antígeno específico; el uso del dominio modificado de unión a FcRn para aumentar el número total de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno puede unirse antes de su degradación; el uso del dominio modificado de unión a FcRn para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión al antígeno; los métodos para disminuir la actividad de unión para un anticuerpo antifármaco preexistente; y los métodos para producir dichas moléculas de unión al antígeno.
Description
MOLÉCULA TERAPÉUTICA DE UNIÓN AL ANTÍGENO CON UN
DOMINIO DE UNIÓN A FcRn QUE PROMUEVE LA ELIMINACIÓN
DEL ANTÍGENO
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a: un dominio modificado de unión a FcRn que tiene una afinidad mejorada para el Receptor Fe neonatal (FcRn, por sus siglas en inglés) a pH neutro; una molécula de unión al antígeno que comprende dicho dominio de unión a FcRn, que tiene baja inmunogenicidad, alta estabilidad y forma solamente algunos elementos aglutinados; una molécula modificada de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión a FcRn a pH neutro o ácido sin una mayor actividad de unión a pH neutro para un anticuerpo antifármaco preexistente; el uso de las moléculas de unión al antígeno para mejorar la absorción del antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno en las células; el uso de las moléculas de unión al antígeno para reducir la concentración plasmática de un antígeno específico; el uso del dominio modificado de unión a FcRn para aumentar el número total de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno puede unirse antes de su degradación; el uso del dominio modificado de unión a FcRn para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión al antígeno; los métodos para disminuir la actividad de unión para un anticuerpo antifármaco preexistente; y
los métodos para producir dichas moléculas de unión al antígeno.
Antecedentes de la Invención
Debido a su alta estabilidad en plasma y pocos efectos secundarios, un mayor número de anticuerpos se está usando como productos farmacéuticos. Un anticuerpo convencional que dirige un antígeno soluble une el antígeno en el plasma del paciente después de la inyección y después persiste establemente en la forma de un complejo de anticuerpo-antígeno hasta la degradación. Mientras que un anticuerpo común tiene generalmente una vida promedio larga (1-3 semanas), un antígeno tiene un vida promedio relativamente corta de menos de un día. Un antígeno en complejo con un anticuerpo por lo tanto tiene una vida promedio significativamente más larga que el antígeno solo. Por lo tanto, la concentración del antígeno tiende a aumentar después de la inyección de un anticuerpo convencional. Tales casos se han reportado para los anticuerpos que dirigen varios antígenos solubles, como IL-6 (J Immunotoxicol. 2005, 3, 131-9. (NPL 1)), amiloide beta (MAbs. septiembre-octubre de 2010;2(5):576-88 (NPL 2)), MCP-1 (ARTHRITIS & RHEUMATISM 2006, 54.2387-92 (NPL 3)), hepcídina (AAPS J. 2010, 12(4):646-57. (NPL 4)) y receptor slL-6 (Blood. 15 de noviembre 2008;112 (10):3959-64. (NPL 5)). Los reportes han descrito un aumento de aproximadamente 10 a 1000 veces (dependencia del antígeno) de la concentración total del antígeno en plasma de la línea de base sobre la administración
del anticuerpo.
Como tal aumento de la concentración total del antígeno en plasma no se desea, las estrategias para eliminar el antígeno por un anticuerpo terapéutico se han desarrollado. Una de estas estrategias es disponer el antígeno rápidamente al usar un anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH que ha aumentado la afinidad de unión al receptor Fe neonatal para la IgG (FcRn, por sus siglas en inglés) (ver por ejemplo el número de solicitud PCT PCT/JP2011/001888 (PTL 1)). El FcRn es una proteína encontrada en la membrana de muchas células. Un anticuerpo con mayor actividad de unión a FcRn a pH neutro unirá FcRn en la superficie celular, por lo cual el receptor con el anticuerpo se internaliza en las células en una vesícula. Como el pH en el interior de la vesícula se disminuye gradualmente, el antígeno disociará del anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH, debido a su baja afinidad al pH ácido. El antígeno disociado entonces se degrada mientras que el FcRn y el anticuerpo unido se reciclan de nuevo a la superficie de las células antes de la degradación. Por consiguiente, un anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH que aumenta con la actividad de unión a FcRn a pH neutro puede usarse para eliminar un antígeno del plasma y para disminuir su concentración plasmática.
Los estudios anteriores también han demostrado que la ingeniería Fe para aumentar la afinidad de unión a FcRn a pH
ácido puede también mejorar la eficacia de reciclaje endosomal y la farmacocinética del anticuerpo. Por ejemplo, la variante M252Y/S254T/T256E (YTE, por sus siglas en inglés) (J Biol Chem, 2006, 281:23514-23524 (NPL 6)), la variante M428L/N434S (LS, por sus siglas en inglés) (Biotechnol National, 2010 28:157-159. (NPL 7)), T250Q/ 428L (J Immunol. 2006, 176 (1):346-56. (NPL 8)) y la variante de N434H (Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2):283-290. (NPL 9)) mostraron la mejora en la vida promedio con relación a la lgG1 nativa.
Sin embargo, tales sustituciones tienen también el riesgo de alterar las propiedades del anticuerpo que son importantes para el desarrollo de un anticuerpo terapéutico como la estabilidad del anticuerpo, la inmunogenicidad, el comportamiento de agregación y la afinidad de unión para los anticuerpos preexistentes (por ejemplo factor reumatoide). Por lo tanto el objetivo principal de la presente invención es proporcionar un dominio modificado de unión a LcRn que no sólo mejore la eliminación de un anticuerpo sino también cumpla los criterios para desarrollar una molécula terapéutica de unión al antígeno. Estos criterios de desarrollabilidad son en particular la alta estabilidad, la baja inmunogenicidad, el bajo porcentaje de elementos aglutinados, y la baja afinidad de unión para los anticuerpos antifármacos preexistentes (ADA, por sus siglas en inglés).
Los documentos de la técnica anterior relacionados con la presente invención se muestran a continuación. Todos los
documentos citados en esta especificación se incorporan en la presente por referencia.
Lista de Citas
Literatura de Patente
[PTL 1] PCT/JP2011/00188 (WO/2011 /122011 ) , ANTIGEN-BINDING MOLECULES THAT PROMOTE ANTIGEN CLEARANCE
Literatura no Relacionada con Patente
[NPL 1] Martin PL, Cornacoff J, Prabhakar U, Lohr T, Treacy G, Sutherland JE, Hersey S, Martin E; Reviews Preclinical Safety and Immune-Modulating Effects of Therapeutic Monoclonal Antibodies to lnterleukin-6 and Tumor Necrosis Factor-alfa in Cynomolgus Macaques; J Immunotoxicol. 2005, 3, 131-9 [NPL 2] Davda JP, Hansen RJ.; Properties of a general PK/PD model of antibody - ligand interactions for therapeutic antibodies that bind to soluble endogenous targets; MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):576-88.
[NPL 3] Haringman JJ, Gerlag DM, Smeets TJ, Baeten D, van den Bosch F, Bresnihan B, Breedveld FC, Dinant HJ, Legay F, Gram H, Loetscher P, Schmouder R, Woodworth T, Tak PP.; A randomized controlled trial W/ an anti-CCL2 (anti-monocyte chemotactic protein 1) monoclonal antibody in patients W7 rheumatoid arthritis; ARTHRITIS and RHEUMATISM 2006, 54,2387-92.
[NPL 4] Xiao JJ, Krzyzanski W, Wang YM, Li H, Rose MJ, Ma M, Wu Y, Hinkle B, Perez-Ruixo JJ.; Pharmacokinetics of anti-
hepcidin monoclonal antibody Ab 12B9m andhepcidin in cynomolgus monkeys.; AAPS J. 2010, 12(4), 646-57.)
[NPL 5] Nishimoto N, Terao K, Mima T, Nakahara H, Takagi N, Kakehi T.; Mechanisms and pathologic significances in increase in serum interleukin-6 (IL-6) and soluble IL-6 receptor after administration of an anti-IL-6 receptor antibody, tocilizumab, in patients W/ rheumatoid arthritis and Castleman disease; Blood. 2008 Nov 15; 112(10):3959-64.
[NPL 6] J Biol Chem, 2006, 281:23514-23524
[NPL 7] Nat Biotechnol, 201028:157-159
[NPL 8] J Immunol. 2006, 176(l):346-56
[NPL 9] Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2):283-290
Breve Descripción de la Invención
Problema Técnico
La presente invención fue concebida en vista de las circunstancias descritas antes. Un objetivo de la presente invención es proporcionar un dominio modificado de unión a FcRn que tenga una afinidad mejorada para el FcRn a pH neutro; una molécula de unión al antígeno que comprende dicho dominio de unión a FcRn, donde dicha molécula de unión al antígeno tiene baja inmunogenicidad, alta estabilidad y forma solamente pocos elementos aglutinados; una molécula modificada de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión a FcRn a pH neutro o ácido sin una mayor actividad de unión a pH neutro para
un anticuerpo antifármaco preexistente; el uso de las moléculas de unión al antígeno para mejorar la absorción de antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno en las células; el uso de la molécula de unión al antígeno para reducir la concentración plasmática de un antígeno específico; el uso del dominio modificado de unión a FcRn para aumentar el número total de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno puede unirse antes de su degradación; el uso del dominio modificado de unión a FcRn para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión al antígeno; y los métodos para producir dichas moléculas de unión al antígeno. Solución al Problema
Los presentes inventores condujeron estudios dedicados en los dominios modificados de unión a FcRn que tienen una afinidad mejorada para FcRn a pH neutro y en las moléculas de unión al antígeno que comprenden dicho dominio de unión a FcRn que tienen baja inmunogenicidad, alta estabilidad y forman solamente pocos elementos aglutinados. A consecuencia, los presentes inventores descubrieron que las sustituciones en las posiciones específicas del dominio de unión a FcRn aumentan la afinidad para el FcRn a pH neutro sin sustancialmente aumentar la inmunogenicidad, sin sustancialmente disminuir la estabilidad y/o sin sustancialmente aumentar la relación de la especie de alto peso molecular.
Además, los presentes inventores condujeron estudios
dedicados en dominios modificados de unión a FcRn con una afinidad mejorada para FcRn a pH neutro o pH ácido pero sin una actividad de unión significativamente aumentada para un anticuerpo antifármaco preexistente y en moléculas de unión al antígeno que comprenden un dominio de unión a FcRn. A consecuencia, los presentes inventores descubrieron que las sustituciones en las posiciones específicas del dominio de unión a FcRn disminuyen la afinidad para un anticuerpo antifármaco preexistente a pH neutro sin sustancialmente disminuir la actividad de unión a FcRn.
Específicamente, la presente invención se relaciona con:
[1] Una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio modificado de unión a FcRn, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, donde los números indican la posición de la sustitución de acuerdo con la enumeración de EU.
[2] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [1], donde el dominio de unión a FcRn tiene
a) una sustitución de aminoácido del aminoácido en la posición EU252 y EU434; y
b) una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238,
EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU387, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
[3] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [1] o [2], donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende
en la posición EU238 un ácido aspártico,
en la posición EU250 una valina,
en la posición EU252 una tirosina,
en la posición EU254 una treonina,
en la posición EU255 una leucina,
en la posición EU256 un ácido glutámico,
en la posición EU258 un ácido aspártico o una isoleucina, en la posición EU286 un ácido glutámico,
en la posición EU307 una glutamina,
en la posición EU308 una prolina,
en la posición EU309 un ácido glutámico,
en la posición EU311 una alanina o una histidina,
en la posición EU315 un ácido aspártico,
en la posición EU428 una isoleucina,
en la posición EU433 una alanina, una lisina, una prolina, una arginina, o una serina,
en la posición EU434 una tirosina, o un triptófano, y/o en la posición EU436 una isoleucina, una leucina, una valina, una treonina, o una fenilalanina.
[4] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [2],
donde el dominio de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido de un aminoácido en una o más combinaciones de posición seleccionadas del grupo que consiste en
a) EU252, EU434, y EU436;
b) EU252, EU307, EU311 y EU434;
c) EU252, EU315, y EU434;
d) EU252, EU308, y EU434;
e) EU238, EU252, y EU434;
f) EU252, EU434, EU307, EU311, y EU436; y
g) EU252, EU387, y EU434.
[5] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [4], donde el dominio de unión a FcRn comprende:
a) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU315 un ácido aspártico, y en la posición EU434 una tirosina; o b) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una isoleucina; o
c) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una leucina; o
d) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
e) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una isoleucina.
[6] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [2], donde el dominio de unión a FcRn comprende una sustitución de
aminoácido en tres o más posiciones, donde tres o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en
a) EU252/EU434/EU307/EU311/EU286;
b) EU252/EU434/EU307/EU311/EU286/EU254;
c) EU252/EU434/EU307/EU311/EU436;
d) EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU254;
e) EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU250;
f) EU252/EU434/EU308/EU250;
g) EU252/EU434/EU308/EU250/EU436; y
h) EU252/EU434/EU308/EU250/EU307/EU311.
[7] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [6], donde el dominio de unión a FcRn comprende:
a) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina y en la posición EU434 una tirosina; o
b) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina y en la posición EU434 una tirosina; o
c) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición 436 una isoleucina;
d) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una isoleucina; o
e) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU308 una prolina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina; o
f) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina; o
g) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina; o h) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU308 una prolina, y en la posición EU434 una tirosina; o
i) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU308 una prolina, en la posición EU311 una alanina, y en la posición EU434 una tirosina.
[8] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [2], donde el dominio de unión a FcRn comprende una sustitución de
aminoácido en tres o más posiciones donde tres o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en
a) EU252 y EU434 y EU307 y EU311 y EU436 y EU286; b) EU252 y EU434 y EU307 y EU311 y EU436 y EU250 y EU308;
c) EU252 y EU434 y EU307 y EU311 y EU436 y EU250 y EU286 y EU308;
d) EU252 y EU434 y EU307 y EU311 y EU436 y EU250 y EU286 y EU308 y EU428.
[9] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [8], donde el dominio de unión a FcRn comprende:
a) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
b) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la prolina de la posición EU308, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o c) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la prolina de la posición EU308, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
d) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252
una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la prolina de la posición EU308, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina.
[10] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [2], donde el dominio de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en tres o más posiciones donde tres o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en.
a) EU434 y EU307 y EU311 ;
b) EU434 y EU307 y EU309 y EU311 ; o
c) EU434 y EU250 y EU252 y EU436.
[11] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [10], donde el dominio de unión a FcRn comprende:
a) en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una histidina y en la posición EU434 una tirosina; o
b) en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU309 un ácido glutámico, en la posición EU311 una alanina y en la posición EU434 una tirosina; o
c) en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU309 un ácido glutámico, en la posición EU311 una histidina y en la posición EU434 una tirosina; o
d) en la posición EU250 una valina; en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina.
[12] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con
cualquiera de [1] a [11], donde la relación de la especie de alto peso molecular es menor del 2%.
[13] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [12], donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que tiene
a) una menor actividad de unión para el antígeno a pH 5.5-6.5 que a pH 7-8 o
b) una actividad "de unión dependiente de la concentración de calcio" para el antígeno.
[14] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [5], donde la actividad de unión de dicha molécula de unión para el FcRn a pH 7 es 50-150 nM, Tm es mayor de 63.0°C, y el conteo de Epibase es menor de 250.
[15] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] y [6] a [7], y donde la actividad de unión de dicha molécula de unión para FcRn a pH 7 es 15-50 nM, Tm es mayor de 60°C, y el conteo de Epibase es menor de 500.
[16] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [3] y [8] a [9], y donde la actividad de unión de dicha molécula de unión para FcRn a pH 7 es más potente que 15 nM, Tm es mayor de 57.5°C, y el conteo de Epibase es menor de 500.
[17] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [3], donde el dominio de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido
a) en las posiciones EU238, EU255 y/o EU258, y
b) en tres o más posiciones, donde tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 4 a7.
[18] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [17], donde
a) en la posición EU257 del dominio de unión a FcRn el aminoácido no es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en alanina, valina, isoleucina, leucina, y treonina, y/o b) en la posición EU252 del dominio de unión a FcRn el aminoácido no es triptófano.
[19] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [18], donde la molécula de unión al antígeno tiene una actividad de unión para un anticuerpo antifármaco preexistente que no se aumenta significativamente con respecto a la afinidad de unión de un anticuerpo de control que comprende un dominio de unión a FcRn intacto.
[20] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [19], donde el dominio de unión a FcRn además comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
[21] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [20], donde el dominio de unión a FcRn comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en
en la posición EU387 una arginina,
en la posición EU422 un ácido glutámico, una arginina, o una serina, un ácido aspártico, una lisina, una treonina o una glutamina;
en la posición EU424 un ácido glutámico o una arginina, una lisina, o una asparagina;
en la posición EU426 un ácido aspártico, una glutamina, una alanina, o una tirosina;
en la posición EU433 un ácido aspártico;
en la posición EU436 una treonina;
en la posición EU438 un ácido glutámico, una arginina, una serina, o una lisina; y
en la posición EU440 un ácido glutámico, un ácido aspártico o una glutamina.
[22] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [21], donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende tres o más sustituciones, donde las tres o más sustituciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 12 a 13.
[23] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [22], donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende tres o más sustituciones, donde las tres o más sustituciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 14 a 15.
[24] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con
cualquiera de [20] a [23], donde el dominio de unión a FcRn comprende:
a) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU387 una arginina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
b) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU422 un ácido glutámico, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
c) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU422 una arginina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
d) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU422 una serina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
e) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU424 un ácido glutámico, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
f) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU424 una arginina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
g) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, en la posición EU436 una valina, y en la posición EU438 un ácido glutámico; o
h) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, en la posición EU436 una valina, y en la posición EU438 una arginina; o
i) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, en la posición EU436 una valina, y en la posición EU438 una serina; o
j) en la posición EU252 una tirosina, en la posición
EU434 una tirosina, en la posición EU436 una valina, y en la posición EU440 un ácido glutámico.
[25] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [24], donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
[26] El uso de la molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [25] para mejorar la absorción del antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno en las células.
[27] El uso de la molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [25] para reducir la concentración plasmática de un antígeno específico, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que pueda unir dicho antígeno.
[28] Un método para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión al antígeno, comprende la etapa de introducir una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn de dichas moléculas de unión al antígeno en una o más de las
posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
[29] Un método para retrasar la eliminación de una molécula de unión al antígeno en un sujeto, comprende la etapa de introducir una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
[30] Un método para prolongar el tiempo de retención de plasma de una molécula de unión al antígeno, comprende la etapa de introducir una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
[31] Un método para aumentar la relación de eliminación del antígeno en plasma de una molécula de unión al antígeno, comprende la etapa de introducir una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
[32] Un método para aumentar la capacidad de una molécula de unión al antígeno de eliminar el antígeno en plasma, comprende la etapa de introducir una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
[33] El método de acuerdo con cualquiera de [28] a [32], donde además una sustitución de aminoácido en la posición EU256 en el dominio de unión a FcRn se introduce.
[34] El método de acuerdo con cualquiera de [28] a [33], donde el método además comprende una etapa de introducir en el dominio de unión a FcRn una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
[35] Un método para producir las moléculas de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [1] a [25], que comprende las etapas de
(a) seleccionar un dominio de unión a FcRn original y alterar el FcRn original introduciendo una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436;
(b) seleccionar un dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno y alterar por lo menos un aminoácido en el dominio de unión al antígeno para conseguir un dominio de unión al antígeno dependiente al pH o un dominio de unión al antígeno dependiente del ión de calcio;
(c) obtener un gen que codifica una molécula de unión al antígeno en la cual el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno preparados en (a) y (b) se ligan y
(d) producir una molécula de unión al antígeno al usar el gen preparado en (c).
[36] El método de acuerdo con [35], donde en la etapa a) además se introduce una sustitución de aminoácido en la posición EU256 en el dominio de unión a FcRn.
[37] El método de acuerdo con cualquiera de [35] a [36], donde el método además comprende una etapa de introducir en el dominio de unión a FcRn una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
[38] Una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio modificado de unión a FcRn, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440, donde la afinidad de unión de dicha molécula de unión al antígeno para un anticuerpo antifármaco preexistente (ADA, por sus siglas
en inglés) a un pH neutro no se aumenta significativamente con respecto a la afinidad de unión de la molécula de unión al antígeno que comprende un dominio intacto de unión a FcRn.
[39] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [38] donde la molécula de unión al antígeno tiene además una mayor afinidad de unión para un FcRn en los intervalos de pH neutro o ácido.
[40] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [38] o [39], donde el aminoácido uno o más que sustituyen de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440 se selecciona del grupo que consiste en
a) en la posición EU387 una arginina;
b) en la posición EU422 un ácido glutámico, una arginina, una serina, ácido aspártico, Usina, treonina, o glutamina;
c) en la posición EU424 un ácido glutámico, una arginina, una Usina, o aspa ra g i ñas;
d) en la posición EU426 un ácido aspártico, a glutamina, una alanina, o una tirosina;
e) en la posición EU433 un ácido aspártico
f) en la posición EU436 a treonina
g) en la posición EU438 un ácido glutámico, una arginina, una serina, o una Usina; y
h) en la posición EU440 un ácido glutámico, un ácido aspártico, o una glutamina.
[41] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [38] a [40], donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en cualquiera o más posiciones o una de las combinaciones indicadas en la Tabla 10.
[42] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [38] a [40], donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende cualquiera de la sustitución de aminoácido o de las combinaciones de sustitución indicadas en la Tabla 11.
[43] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [39] a [42], donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones del dominio de unión a FcRn seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU434, y EU436, donde dichas sustituciones confieren un aumento en la actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro o pH ácido.
[44] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [39] a [43], donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones de dominio de unión a FcRn
i) a) EU438/ EU440 o b) EU424; y
¡i) a) EU434, b) EU252/EU254/EU256; c) EU428/EU434; o d) EU250/EU428.
[45] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [44], donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende sustituciones de aminoácidos
i) a) EU438R/EU440E o b) EU424N; y
ii) a) M434H; b) M252Y/S254T/T256E; c) M428F/N434S; o d) T250Q y M428F (numeración de EU).
[46] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [45], donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende tres o más sustituciones de aminoácidos donde las tres o más sustituciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 13 y 15.
[47] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de [39] a [42] donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende las sustituciones
a) en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU438, EU440, EU433, o en dos o más posiciones donde las dos posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en EU422/EU424, y EU438/EU440; y
b) dos o más posiciones donde las dos posiciones son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 9.
[48] La molécula de unión al antígeno de acuerdo con [47], donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende tres o más las sustituciones de aminoácidos donde las tres o más sustituciones de aminoácidos son una de las combinaciones
indicadas en las Tablas 12 o 14.
[49] La molécula de unión al antígeno de cualquiera de [39] a [48] donde dicha molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno dependiente al pH o un dominio de unión al antígeno dependiente del ion de calcio.
[50] Un método para disminuir la actividad de unión para un ADA preexistente de una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn que tenía una mayor actividad de unión para un FcRn a pH neutro o ácido y una mayor actividad de unión para un ADA preexistente a un pH neutro, dicho método comprende las etapas de
a) proporcionar de una molécula de unión al antígeno con un dominio de unión a FcRn que tiene una mayor actividad de unión para FcRn a pH neutro o ácido y una mayor actividad de unión para un ADA preexistente a un pH neutro; y
b) sustituir un aminoácido en el dominio de unión a FcRn en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440 para producir una molécula de unión al antígeno con un dominio modificado de unión a FcRn.
[51] El método de acuerdo con [50], donde la etapa b) comprende sustituir un aminoácido en tres o más posiciones donde las tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 10.
[52] El método de acuerdo con [50], donde la etapa b)
comprende la introducción de tres o más sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a FcRn donde las tres o más sustituciones de aminoácidos son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 11.
[53] Un método para aumentar el número total de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno puede unirse sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de
a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original,
b) alterar el dominio de unión a FcRn original de la etapa a) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436; y
c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
[54] Un método para facilitar la liberación extracelular de una molécula de unión al antígeno libre de antígeno tomada en las células en una forma unida al antígeno sin aumentar
significativamente la actividad de unión de dicha molécula de unión al antígeno para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, que comprende las etapas de a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original,
b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, ELJ252, ELJ254, ELJ255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, y EU428; y
c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
[55] Un método para aumentar la capacidad de una molécula de unión al antígeno para eliminar el antígeno en plasma sin aumentar significativamente la actividad de unión para el ADA preexistente a pH neutro comparado al anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de
a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original,
b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del
dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, y EU428; y
c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
[56] Un método para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión al antígeno sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de
a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original,
b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436; y
c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más
posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
[57] Un método para reducir la concentración plasmática del antígeno total o libre sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de
a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que pueda unir dicho antígeno,
b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436; y
c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
[58] Un método para producir una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn que tenía una mayor actividad de unión para un FcRn a pH neutro o ácido y
una menor actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro, dicho método comprende las etapas de
(a) proporcionar un dominio de unión a FcRn que tiene una mayor actividad de unión para un FcRn a intervalos de pH neutro o ácido y el ADA preexistente a intervalos de pH neutro,
(b) sustituir un aminoácido en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440,
(c) seleccionar un dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno y alterar por lo menos un aminoácido en el dominio de unión al antígeno para conseguir un dominio de unión al antígeno dependiente al pH, o seleccionar un dominio de unión al antígeno dependiente del ion de calcio;
(d) obtener un gen que codifica una molécula de unión al antígeno en la cual el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno preparados en (a) y (b) se ligan y
(e) producir una molécula de unión al antígeno al usar el gen preparado en (c), donde dicha molécula de unión al antígeno producida tiene una mayor actividad de unión para un FcRn a pH neutro o ácido y una menor actividad de unión para un ADA endógeno a pH neutro con respecto a un dominio de unión al antígeno original que tiene un dominio intacto de unión a FcRn.
[59] El método de acuerdo con [58], donde el dominio de unión a FcRn que tiene una mayor actividad de unión para FcRn y el ADA preexistente a intervalos de pH neutro o ácido y para el
ADA preexistente a intervalos de pH neutro comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
[60] El método de acuerdo con cualquiera de [53] a [57], donde la sustitución de aminoácido introducida en la etapa a) está en tres o más posiciones donde tres dichos o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 4 a 7.
[61] El método de acuerdo con cualquiera de [53] a [60], donde las sustituciones de aminoácidos introducidas en la etapa b) están en tres o más posiciones donde dichas tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 10.
Breve Descripción de los Dibujos
[Fig. 1A] La Fig. 1A muestra una descripción esquemática de la eliminación del antígeno del plasma de un anticuerpo de la técnica anterior ("anticuerpo convencional") comparada con el anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH con FcRn mejorado, ambos unen un antígeno soluble a pH neutro. El anticuerpo convencional une al antígeno en el plasma y no es tomado específicamente por las células en los endosomas ácidos. Bajo condiciones ácidas de los endosomas, el anticuerpo convencional une el FcRn dentro de una vesícula y se transporta de nuevo a la superficie de la célula donde se libera de nuevo. El
antígeno está unido al dominio de unión al antígeno durante la internalización entera y el proceso de reciclado. Un anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH con FcRn mejorado que une al pH neutro unido al FcRn en la superficie de la célula y se internaliza rápidamente en la célula y por lo tanto en una mayor frecuencia que un anticuerpo convencional. Bajo condición ácida en los endosomas, el antígeno disocia del anticuerpo modificado y se transfiere al lisosoma donde se degrada proteolíticamente. El anticuerpo, todavía unido al FcRn, se recicla de nuevo a la superficie celular. Allí, el anticuerpo libre reciclado puede unirse a otro antígeno de nuevo. Repitiendo este ciclo de absorción mediada por FcRn, disociación y degradación del antígeno, y reciclado de anticuerpo, tal anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH con afinidad de unión mejorada a FcRn a pH neutro puede suministrar una cantidad significativamente mayor de antígeno al lisosoma que un anticuerpo convencional y por lo tanto puede reducir la concentración total de antígeno en plasma más considerablemente que un anticuerpo convencional.
[Fig. 1B] La Fig. 1B muestra una representación esquemática de la disociación de un antígeno soluble de un anticuerpo de IgG con un dominio de unión al antígeno dependiente al pH en el endosoma. Esto da lugar a la eliminación mayor del antígeno, y permite que el anticuerpo una a otro antígeno en el plasma.
[Fig. 2] La Fig. 2 muestra la gráfica de afinidad de unión
a hFcRn (eje x) y Tm de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe en el eje y (variantes Fe F1-F599: cuadrado abierto; Variantes Fe F600-F1052: cuadrado cerrado).
[Fig.3] La Fig. 3 muestra la gráfica de afinidad de unión a hFcRn (eje x) y la porción de alto peso molecular (HMW, por sus siglas en inglés) (en %) (eje y) de anticuerpos que comprenden las variantes Fe (variantes Fe F1-F599: cuadrado abierto, variantes Fe F600-F1050: cuadrado cerrado).
[Fig.4] La Fig. 4 muestra la gráfica de afinidad de unión a hFcRn (eje x) y del conteo de inmunogenicidad (conteo de Epibase) de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe (variantes Fe F1-F599: cuadrado abierto, variantes Fe F600-F1052: cuadrado cerrado).
[Fig.5] La Fig. 5 muestra la gráfica de afinidad de unión a hFcRn (eje x) y la temperatura de fusión Tm (eje y) de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn es más potente que 15 nM (variantes Fe de F1-F599 con Kd inferior o igual a 15 nM: cuadrado abierto, variantes Fe de F600-F1052 con Kd inferior o igual a 15 nM (Grupo 1): cuadrado cerrado).
[Fig.6] La Fig. 6 muestra la gráfica de afinidad de unión a hFcRn (eje x) y HMW (en %) (eje y) de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn es más potente que 15 nM (variantes Fe de F1-F599 con Kd inferior o igual a 15 nM: cuadrado abierto; Variantes Fe de F600-F1052
con Kd inferior o igual a 15 nM (Grupo 1): cuadrado cerrado).
[Fig.7] La Fig. 7 muestra la gráfica afinidad de unión a hFcRn y el conteo de inmunogenicidad de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn es más potente que 15 nM (variantes Fe de F1-F599 con Kd inferior o igual a 15 nM: cuadrado abierto; Variantes Fe de F600-F1052 con Kd inferior o igual a 15 nM (Grupo 1): cuadrado cerrado).
[Fig.8] La Fig. 8 muestra la gráfica de afinidad de unión a hFcRn y la Tm de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn está entre 15 nM y 50 nM (variantes Fe de F1-F599 con Kd = 15-50 nM, cuadrado abierto; Variantes Fe de F600-F1052 con Kd = 15-50 nM (Grupo 2): cuadrado cerrado)
[Fig.9] La Fig. 9 muestra la gráfica de afinidad de unión a hFcRn y de HMW (%) de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn está entre 15 nM y 50 nM (variantes Fe de F1-F599 con Kd = 15-50 nM, cuadrado abierto; Variantes Fe de F600-F1052 con Kd = 15-50 nM (Grupo 2): cuadrado cerrado).
[Fig- 10] La Fig. 10 muestra la gráfica de la afinidad de unión a hFcRn y el conteo de inmunogenicidad de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn está entre 15 nM y 50 nM (variantes de Fe F1-F599 con Kd=15-50 nM, cuadrado abierto; Variantes Fe de F600-F1052 con Kd = 15-50 nM (Grupo 2): cuadrado cerrado)
[Fig. 11] La Fig. 11 muestra la gráfica de afinidad de unión a hFcRn y la Tm de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn está entre 50 nM y 150 nM (variantes Fe de F1-F599 con Kd = 50-150 nM, cuadrado abierto; Variantes Fe de F600-F1052 con Kd = 50-150 nM (Grupo 3): cuadrado cerrado).
[Fig. 12] La Fig. 12 muestra la gráfica de afinidad de unión a hFcRn y de HMW (%) de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn está entre 50 nM y 150 nM (variantes Fe de F1-F599 con Kd = 50-150 nM, cuadrado abierto; Variantes Fe de F600-F1052 con Kd = 50-150 nM (Grupo 3): cuadrado cerrado).
[Fig. 13] La Fig. 13 muestra un gráfica de afinidad de unión a hFcRn y el conteo de inmunogenicidad de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn está entre 50 nM y 150 nM (variantes Fe de F1-F599 con Kd = 50-150 nM: cuadrado abierto; Variantes Fe de F600-F1052 con Kd = 50-150 nM (Grupo 3): cuadrado cerrado.
[Fig. 14] La Fig. 14 muestra la gráfica de afinidad de unión a hFcRn y de Tm de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn está entre 150 nM y 700nM (variantes de Fe F1-F599 con Kd = 150-700 nM, cuadrado abierto; Variantes F600-F1052 Fe con Kd = 150-700nM (Grupo 4): cuadrado cerrado).
[Fig. 15] La Fig. 15 muestra la gráfica de afinidad de unión
a hFcRn y de HMW (%) de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn está entre 150 nM y 700 nM (variantes Fe de F1-F599 con Kd = 150-700 nM: cuadrado abierto; Variantes Fe de F600-F1052 con Kd=150-700 nM (Grupo 4): cuadrado cerrado).
[Fig. 16] La Fig. 16 muestra la gráfica de afinidad de unión a hFcRn y el conteo de inmunogenicidad de los anticuerpos que comprenden las variantes Fe cuya afinidad de unión a hFcRn está entre 150 nM y 700 nM (variantes Fe de F1-F599 con Kd = 150-700 nM: cuadrado abierto; Variantes Fe de F600-F1052 con Kd = 150-700 nM (Grupo 4): cuadrado cerrado).
[Fig. 17] La Fig. 17 muestra una representación gráfica de la concentración del antígeno en plasma (hslL-6R) durante el transcurso del tiempo en un ratón transgénico del FcRn humano después de la inyección de Fv4-lgG1, de Fv4-F652, de Fv4-F890 y de Fv4-F946 y en un ratón de control (ninguna inyección de anticuerpo).
[Fig. 18] La Fig. 18 muestra una representación gráfica de la concentración del anticuerpo en plasma durante el transcurso del tiempo en el ratón transgénico del FcRn humano después de la inyección de Fv4-lgG1, de Fv4-F652, de Fv4-F890 y de Fv4-F946.
[Fig. 19] La Fig. 19 muestra una representación gráfica de la concentración del antígeno en plasma (hslL-6R) durante el transcurso del tiempo en el ratón transgénico del FcRn humano
del control (ninguna inyección de anticuerpo) y después de la inyección de Fv4-lgG1, de Fv4-FI 1 y de Fv4-F652.
[Fig. 20] La Fig. 20 muestra una representación gráfica de la concentración del anticuerpo en plasma durante el transcurso del tiempo en el ratón transgénico del FcRn humano después de la inyección de Fv4-lgG1, de Fv4-FI 1 y de Fv4-F652.
[Fig. 21] La Fig. 21 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra el anticuerpo anti-receptor IL-6 humanizado Fv4-lgG1 (Fig. 21-1), una variante de YTE (Fig. 21-2) y una variante de LS (Fig.
21- 3) de los mismos.
[Fig. 22] La Fig. 22 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 15 pacientes con AR individuales contra el anticuerpo anti-receptor IL-6 humanizado Fv4-lgG1 (Fig.
22- 1), un Fv4-N434H (Fig. 22-2), un Fv4-F11 (Fig. 22-3), un Fv4-F68 (Fig. 22-4), un Fv4-890 (Fig. 22-5) y un Fv4-F947 (Fig. 22-6).
[Fig. 23] La Fig. 23 muestra la media (Fig. 23-1), media geométrica (Fig. 23-2) y la mediana (Fig. 23-3) de la respuesta de ECL del suero a partir de quince pacientes con AR individuales contra Fv4-lgG1, Fv4-F11, Fv4-F68, Fv4-F890 y Fv4-F947 mostrados en la Fig. 22.
[Fig. 24] La Fig. 24 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas
en inglés) del suero a partir de 15 pacientes con AR individuales contra el anticuerpo anti-receptor IL-6 humanizado Fv4-lgG1 (Fig. 24-1) y de las variantes Fv4-F890, Fv4-F1058, Fv4-F1059, Fv4-F1060, Fv4-F1061, Fv4-F1062, Fv4-F1063, Fv4-F1064, Fv4-F1065, Fv4-F1066, Fv4-F1067, Fv4-F1068, Fv4-F1069, Fv4-F1070, Fv4-F1071, Fv4-F1072, y Fv4-F1073 (Fig. 24-2 a Fig. 24-18).
[Fig. 25] La Fig. 25 muestra la media (Fig. 25-1), media geométrica (Fig. 25-2) y la mediana (Fig. 25-3) de la respuesta de ECL del suero a partir de quince pacientes con AR individuales contra Fv4-lgG1, las variantes Fv4-F890, Fv4-F1058, Fv4-F1059, Fv4-F1060, Fv4-F1061, Fv4-F1062, Fv4-F1063, Fv4-F1064, Fv4-F1065, Fv4-F1066, Fv4-F1067, Fv4-F1068, Fv4-F1069, Fv4-F1070, Fv4-F1071, Fv4-F1072, y Fv4-F1073 mostradas en la Fig. 24.
[Fig. 26] La Fig. 26 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 15 pacientes con AR individuales contra las variantes Fv4-FI 104, Fv4-FI 105, y Fv4-FI 106.
[Fig. 27] La Fig. 27 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 15 pacientes con AR individuales contra las variantes Fv4-FI 107, Fv4-F1108, Fv4-F1109, Fv4-F1110, Fv4-F111I, Fv4-F1112, Fv4-F1113, y Fv4-F1114 (Fig. 27-1 a Fig. 27-8)
[Fig. 28] Fig. 28 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 15 pacientes con AR individuales contra las variantes Fv4-F1230 (Fig. 28-1), Fv4-F1231 (Fig. 28-2), Fv4-F1232, y (Fig. 28-3).
[Fig. 29] La Fig. 29 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 15 pacientes con AR Individuales contra las variantes Fv4-F947, Fv4-F1119, Fv4-F1120, Fv4-F1121, FV4-F1122, Fv4-F1123, y Fv4-F1124.
[Fig. 30] La Fig. 30-1 a Fig. 30-4 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 15 pacientes con AR individuales contra las variantes Fv4-F939, Fv4-F1291, Fv4-F1268, and Fv4-F1269. La Fig. 30-5 a la Fig. 30-9 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra las variantes Fv4-F1243, Fv4-F1245, Fv4-F1321, Fv4-F1340, y Fv4-F1323.
[Fig.31] La Fig. 31 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 15 pacientes con AR individuales contra las variantes Fv4-F890 (Fig. 31-1) y Fv4-F1115 ( = F890 + S424N, Fig. 31-2).
[Fig. 32] La Fig. muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 15 or 30 pacientes con AR individuales contra las variantes Fv4-YTE (Fig. 32-1), Fv4-F1166 (=YTE + Q438R/S440E, Fig. 32-2), Fv4-F1167 ( = YTE + S424N, Fig. 32-3), Fv4-LS (Fig. 32-4), Fv4-F1170 (=LS + Q438R/S440E, Fig.
32- 5), Fv4-F1171 (LS + S424N, Fig. 32-6), Fv4-N434H (Fig. 32-7), Fv4-F1172 ( = N434H + Q438R/ S440E, Fig. 32-8), Fv4-F1173 ( = N434H + S424N, Fig. 32-9)).
[Fig.33] La Fig. 33 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra las variantes Fv4-FS, Fv4-F1380 (Fig. 33-2), Fv4-F1384 (Fig. 33-3), Fv4-F1385 (Fig. 33-4), Fv4-F1386 (FS + S426Y, Fig.
33- 5), Fv4-F1388 (Fig. 33-6), y Fv4-F1389 (FS + Y436T, Fig. 33-7).
[Fig. 34] La Fig. 34 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F939.
[Fig.35] La Fig. 35 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1378.
[Fig.36] La Fig. 36 muestra la representación gráfica de
la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1379.
[Fig.37] La Fig. 37 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1262.
[Fig.38] La Fig. 38 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1138.
[Fig. 39] La Fig. 39 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1344.
[Fig. 40] La Fig. 40 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1349.
[Fig. 41] La Fig. 41 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1350.
[Fig. 42] La Fig. 42 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas
en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1351.
[Fig. 43] La Fig. 43 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1261.
[Fig. 44] La Fig. 44 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1263.
[Fig. 45] La Fig. 45 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1305.
[Fig. 46] La Fig. 46 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1306.
[Fig. 47] La Fig. 47 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1268.
[Fig. 48] La Fig. 48 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales
contra la variante F1269.
[Fig. 49] La Fig. 49 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1413.
[Fig. 50] La Fig. 50 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1416.
[F¡9- 51] La Fig. 51 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1419.
[Fig. 52] La Fig. 52 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1420.
[Fig. 53] La Fig. 53 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1370.
[Fig. 54] La Fig. 54 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F 1371.
[Fig. 55] La Fig. 55 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1599.
[Fig. 56] La Fig. 56 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1600.
[Fig. 57] La Fig. 57 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1566.
[Fig. 58] La Fig. 58 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1448.
[Fig. 59] La Fig. 59 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F 1601.
[Fig. 60] La Fig. 60 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1602.
[Fig. 61] La Fig. 61 muestra la representación gráfica de
la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1603.
[Fig. 62] La Fig. 62 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1531.
[Fig. 63] La Fig. 63 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1604.
[Fig. 64] La Fig. 64 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1605.
[Fig. 65] La Fig. 65 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1586.
[Fig. 66] La Fig. 66 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1592.
[Fig. 67] La Fig. 67 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas
en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1610.
[Fig. 68] La Fig. 68 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F 1611.
[Fig. 69] La Fig. 69 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1612.
[Fig. 70] La Fig. 70 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1613.
[Fig. 71] La Fig. 71 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1614.
[Fig. 72] La Fig. 72 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1615.
[Fig. 73] La Fig. 73 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales
contra la variante F1567.
[Fig. 74] La Fig. 74 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1572.
[Fig. 75] La Fig. 75 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1576.
[Fig. 76] La Fig. 76 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1578.
[Fig. 77] La Fig. 77 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1579.
[Fig. 78] La Fig. 78 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1641.
[Fig. 79] La Fig. 79 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1642.
[Fig. 80] La Fig. 80 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1643.
[Fig. 81] La Fig. 81 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1644.
[Fig. 82] La Fig. 82 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1645.
[Fig. 83] La Fig. 83 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1646.
[Fig. 84] La Fig. 84 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1647.
[Fig. 85] La Fig. 85 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1648.
[Fig. 86] La Fig. 86 muestra la representación gráfica de
la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1649.
[Fig. 87] La Fig. 87 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1650.
[Fig. 88] La Fig. 88 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F 1651.
[Fig. 89] La Fig. 89 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1652.
[Fig. 90] La Fig. 90 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1653.
[Fig. 91] La Fig. 91 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1654.
[Fig. 92] La Fig. 92 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas
en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1655.
[Fig. 93] La Fig. 93 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1329.
[Fig. 94] La Fig. 94 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1331.
[Fig. 95] La Fig. 95 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1718.
[Fig. 96] La Fig. 96 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1719.
[Fig. 97] La Fig. 97 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1720.
[Fig. 98] La Fig. 98 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales
contra la variante F1721.
[Fig. 99] La Fig. 99 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1671.
[Fig. 100] La Fig. 100 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1670.
[Fig. 101] La Fig. 101 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F 1711.
[Fig. 102] La Fig. 102 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1712.
[Fig. 103] La Fig. 103 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1713.
[Fig. 104] La Fig. 104 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1722.
[Fig. 105] La Fig. 105 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1723.
[Fig. 106] La Fig. 106 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1724.
[Fig. 107] La Fig. 107 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1725.
[Fig. 108] La Fig. 108 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1675.
[Fig. 109] La Fig. 109 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1714.
[Fig. 10] La Fig. 110 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1715.
[Fig. 111] La Fig. 111 muestra la representación gráfica de
la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1716.
[Fig. 112] La Fig. 112 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1717.
[Fig. 13] La Fig. 113 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1683.
[Fig. 114] La Fig. 114 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1756.
[Fig. 115] La Fig. 115 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1757.
[Fig. 116] La Fig. 116 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1758.
[Fig. 117] La Fig. 117 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas
en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1759.
[Fig. 118] La Fig. 118 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1681.
[Fig. 119] La Fig. 119 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1749.
[Fig. 120] La Fig. 120 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1750.
[Fig. 121] La Fig. 121 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1751.
[Fig. 122] La Fig. 122 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1760.
[Fig. 123] La Fig. 123 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales
contra la variante F1761.
[Flg. 124] La Fig. 124 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1762.
[Fig. 125] La Fig. 125 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1763.
[Fig. 126] La Fig. 126 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en Inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR Individuales contra la variante F1752.
[Fig. 127] La Fig. 127 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1753.
[Fig. 128] La Fig. 128 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1754.
[Fig. 129] La Fig. 129 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1755.
[Fig. 130] La Fig. 130 muestra la representación gráfica de la respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) del suero a partir de 30 pacientes con AR individuales contra la variante F1685.
[Fig. 131] La Fig. 131 muestra la representación gráfica de de la concentración anticuerpo en plasma durante el transcurso del tiempo en un ratón transgénico FcRn humano después de la inyección de Fv4-lgG1, Fv4-F1243, y Fv4-F1245.
[Fig. 132] La Fig. 132 muestra la representación gráfica de la concentración del antígeno en plasma (hslL-6R, por sus siglas en inglés) durante el transcurso del tiempo en un ratón transgénico FcRn humano después de la inyección de Fv4-lgG1, Fv4-F1243, y Fv4-F1245 y en un ratón de control (sin inyección de anticuerpo).
[Fig. 133] La Fig. 133 muestra la representación gráfica de la concentración del antígeno en plasma durante el transcurso del tiempo en un ratón transgénico FcRn humano después de la inyección de Fv4-lgG1, Fv4-F1389.
[Fig. 134] La Fig. 134 muestra un sensograma del análisis de SPR. La unión a hlgA del anticuerpo anti-hlgA se analizó bajo diferente condición (pH, concentración de Ca).
[Fig. 135] La Fig. 135 muestra una representación gráfica de la concentración del anticuerpo en plasma durante el transcurso del tiempo en el ratón transgénico del FcRn humano después de la inyección de GA2-F760 y de GA2-F1331.
[Fig. 136] La Fig. 136 muestra una representación gráfica de la concentración de hlgA en plasma durante el transcurso del tiempo en el ratón transgénico del FcRn humano después de la inyección de GA2-F760 y de GA2-F1331.
[Fig. 137] La Fig. 137 muestra una representación gráfica de la concentración del anticuerpo en plasma durante el transcurso del tiempo en el ratón transgénico del FcRn humano después de la inyección de 278-F760 y de 278-F1331.
[Fig. 138] La Fig. 138 muestra una representación gráfica de la concentración del hlgE en plasma (Asp6) durante el transcurso del tiempo en el ratón transgénico del FcRn humano después de la inyección de 278-F760 y de 278-F1331.
Descripción Detallada de la Invención
Antes que los presentes materiales y los métodos se describan, debe entenderse que estas descripciones simplemente ilustrativas solamente y no se proponen para ser limitantes. Debe también entenderse que la presente invención no está limitada a los tamaños, formas, dimensiones, materiales, metodologías, protocolos, etc. particulares descritos en la presente, como éstas pueden variar de acuerdo con la experimentación y/u optimización rutinaria. La terminología usada en la descripción está con el fin de describir las versiones particulares o las modalidades solamente, y no se propone limitar el alcance de la presente invención que será limitada solamente por las reivindicaciones anexas. A menos que se definan de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entienden comúnmente por uno de los expertos en la técnica a la cual la presente invención pertenece. En caso de conflicto, lo controlará la presente especificación, incluye definiciones.
La descripción de cada publicación, patente o solicitud de patente mencionada en esta especificación se incorpora específicamente por referencia en la presente en su totalidad. Sin embargo, ninguna en la presente debe ser interpretada como una admisión que la invención no pretende anteceder tal descripción por virtud o invención anterior.
Las palabras "un", "uno", y "el" como se usan en la presente se entienden "por lo menos" a menos que se indique de otra manera específicamente.
Los estudios descritos en el documento WO/2011 /122011 han demostrado que las moléculas de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpo del receptor anti-l L6) con mayor unión a FcRn a pH 7.4 son capaces de eliminar el antígeno del plasma y disminuir la concentración total del antígeno en plasma, y que por lo tanto, la eficacia de la eliminación del antígeno puede mejorarse mediante la unión al antígeno dependiente al pH (unido al antígeno dentro del plasma a pH 7.4 y disocia el antígeno dentro del endosoma ácido a pH 6.0) o mediante la unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio ionizado (unido al antígeno dentro del plasma a alta concentración de
calcio ionizado y disocia el antígeno dentro del endosoma a baja concentración de calcio ionizado) (ver Figura 1B). El mecanismo de eliminación del antígeno del plasma por el anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH con afinidad de unión mejorada a FcRn a pH neutro con respecto al anticuerpo convencional se muestra en la Figura 1A.
La presente invención proporciona nuevas sustituciones del aminoácido en el dominio de unión a FcRn que aumentan la actividad de unión a FcRn de una molécula de unión al antígeno a los intervalos de pH ácido y neutro, donde la actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro es más potente que una de una IgG intacta o de una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn intacto (por ejemplo, más potente que 3200 nM). Las moléculas modificadas de unión al antígeno pueden reducir la concentración total del antígeno en plasma después de su administración más que una molécula de unión al antígeno de control que comprende el mismo dominio de unión al antígeno pero un dominio de unión a FcRn de IgG humana intacta.
Los receptores Fe son proteínas en la superficie de células inmunes como células eliminadoras naturales, macrófagos, neutrófilos y mastocítos. Unen a la región Fe (Fragmento, cristalizable) de anticuerpos que se unen a las células infectadas o a los patógenos invasores y estimulan células fagocíticas o citotóxicas para destruir los microbios, o células infectadas
mediante fagocitosis mediados por anticuerpos o citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos.
Existen varios diferentes tipos de receptores Fe, se clasifican basados en el tipo de anticuerpo que reconocen. En la presente, el término "FcRn" se refiere al receptor Fe neonade tal manera que une la IgG, es similar en estructura a la proteína MHC clase I y que, en humanos, es codificado por el gen FCGRT.
El término "dominio de unión a FcRn" como se usa en la presente se refiere a un dominio de proteína que une directa o indirectamente al FcRn. Preferiblemente el FcRn es un FcRn mamífero, más preferiblemente, un FcRn humano. Un dominio de unión a FcRn que une directamente a un FcRn es una región Fe de anticuerpo. Mientras tanto, las regiones capaces de unir a un polipéptido como albúmina o IgG, que tienen actividad de unión a FcRn humano, pueden unir indirectamente a FcRn humano a través de la albúmina, IgG, o tal. Así, tal región de unión a FcRn humano puede ser una región que une a un polipéptido que tiene actividad de unión a FcRn humano.
El término "región Fe" o "región Fe de una molécula de unión al antígeno" como se usa en la presente se refiere a un dominio de unión a FcRn que une directamente a FcRn, preferiblemente a un FcRn mamífero, más preferiblemente a un FcRn humano. En particular, una región Fe es una región Fe de un anticuerpo. Preferiblemente, la región Fe es una región Fe mamífera, más preferiblemente una región Fe humana. En
particular, la región Fe de la invención es una región Fe que comprende el segundo y tercer dominio constante de una ¡nmunoglobulina humana (CH2 y CH3), más preferiblemente la bisagra, CH2 y CH3. Preferiblemente, la ¡nmunoglobulina es una IgG. Preferiblemente, la región Fe es una región Fe de lgG1 humana.
La presente invención proporciona una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio modificado de unión a FcRn donde dicha molécula de unión al antígeno tiene una mayor actividad de unión a FcRn en un intervalo de pH neutro con respecto a una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio de unión a FcRn intacto.
En particular, la presente invención proporciona una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio modificado de unión a FcRn con una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436. La molécula de unión al antígeno de la presente invención puede también comprender sustituciones en las posiciones adicionales. Por ejemplo, la molécula de unión al antígeno puede comprender una sustitución en la posición EU256 además de una sustitución en una o más de las posiciones mencionadas anteriormente. Preferiblementé, el aminoácido en la posición EU256 se sustituye con un ácido glutámico.
El término "afinidad de unión" o "actividad de unión" se refiere a la fuerza de interacción no covalente entre dos sustancias como se midió por la constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés) del complejo formado por las dos sustancias, a menos que definida expresamente de otra manera. Una proteína de unión (o "ligando") puede, por ejemplo, tener una KD de menos de 10"5, 10"6, 10"7 o 10"8 M para una molécula objetivo particular, por ejemplo, el FcRn. Mayor unión de afinidad de un ligando de unión a un objetivo, un primer intervalo de pH con relación a un objetivo en un segundo intervalo de pH puede indicarse por una KD de menor valor numérico para unir el objetivo en el primer intervalo de pH que la KD de valor numérico para unir el objetivo en el segundo intervalo de pH. Las diferencias en afinidad de unión pueden ser por lo menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 70, 80, 100, 500, o 1000 veces. La afinidad de unión puede determinarse por una variedad de métodos incluyendo resonancia de plasmón superficial, diálisis de equilibrio, unión de equilibrio, filtración de gel, ELISA, o espectroscopia (por ejemplo, al usar un análisis de fluorescencia).
Una mayor afinidad de unión de un dominio de unión a FcRn para FcRn en un intervalo de pH corresponde a un aumento medido de la afinidad de unión a FcRn con respecto a la afinidad de unión a FcRn medida para un dominio de unión a FcRn intacto. Las diferencias en la afinidad de unión de KD (intacta)/KD
(variante) son por lo menos 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 70, 80, 100, 500, o 1000 veces. Una mayor afinidad de unión de un dominio de unión a FcRn para FcRn puede estar en los intervalos de pH ácido o neutro.
El término "molécula de unión al antígeno que comprende un dominio intacto de unión a FcRn" se refiere a una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio no modificado de unión a FcRn. El término "dominio de unión a FcRn de IgG intacta" como se usa en la presente se refiere a un dominio de unión a FcRn no modificado de una IgG humana. En particular, el dominio de unión a FcRn es el dominio de unión a FcRn de una IgG humana intacta. Preferiblemente, un dominio de unión a FcRn intacto es una región Fe intacta. El término "anticuerpo que comprende una región Fe intacta" se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fe no modificada. El anticuerpo del cual la región Fe no modificada se origina es preferiblemente una IgG. Más preferiblemente, es una lgG1, una lgG2, una lgG3 o una lgG4 humana, aún más preferiblemente, una IgG 1 humana. En una modalidad particularmente preferida de la presente invención un anticuerpo que comprende una región Fe intacta es un anticuerpo que comprende una región Fe no modificada. Un anticuerpo que comprende una región Fe intacta puede ser una IgG humana intacta.
El término "IgG intacta" como se usa en la presente se refiere a una IgG no modificada y no se limita a una clase
específica de IgG. Esto se entiende que la IgG 1 , lgG2, lgG3, lgG4 humana o sus variantes alotípicas pueden usarse como "IgG humana intacta" mientras pueda unir al FcRn humano en el intervalo de pH ácido. Preferiblemente, "IgG intacta" es una lgG1 humana. Preferiblemente, una IgG intacta es una IgG que comprende una región Fe tipo silvestre.
En el contexto de la presente invención, una mayor actividad de unión a FcRn de la molécula de unión al antígeno en los intervalos de pH neutro es preferiblemente más potente que la KD de 3.2 micromoles. Preferiblemente, la mayor actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro es más potente que 700 nanomolar, más preferiblemente más potente que 500 nanomolar y más preferiblemente, más potente que 150 nanomolar.
Una mayor actividad de unión a FcRn de la molécula de unión al antígeno de la presente invención en los intervalos de pH ácido es generalmente una actividad de unión a FcRn de aproximadamente 2 veces o aproximadamente 100 veces más potente que la actividad de unión a FcRn de una IgG intacta. Preferiblemente, la mayor actividad de unión a FcRn de la molécula de unión al antígeno en los intervalos de pH ácido es por lo menos 10 veces más potente que la actividad de unión a FcRn de una IgG intacta. Más preferiblemente, la mayor actividad de unión a FcRn de una molécula de unión al antígeno de la presente invención en el intervalo de pH ácido es por lo menos 20 veces más potente que la actividad de unión a FcRn de una IgG
intacta.
Los términos "intervalo de pH neutro" y "pH neutro" como se usa en la presente, se refiere comúnmente a pH 6.7 a pH 10.0, preferiblemente cualquier valor de pH dentro de pH 7.0 a pH 8.0, ejemplos de los cuales incluyen pH 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, y 8.0. Un valor de pH ácido particularmente preferido es pH 7.4, el cual aproxima el pH de plasma (sangre) in vivo.
Los términos "intervalo de pH ácido" y "pH ácido" como se usa en la presente, se refiere comúnmente a pH 4.0 a pH 6.5, preferiblemente a cualquier valor de pH dentro de pH 5.5 a pH 6.5, ejemplos de los cuales incluyen pH 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, y 6.5. Un valor de pH ácido particularmente preferido oscila de pH 5.8 a pH 6.0, el cual aproxima el pH en el endosoma temprano in vivo.
Las posiciones de aminoácidos se refieren en esta aplicación, como, por ejemplo, "EU387" o "posición 387", son, a menos que se indique lo contrario, numeradas de acuerdo a un esquema llamado el sistema de numeración de EU (Kabat, E. A., T. T. Wu, H. M. Perry, K. S. Gottesman, C. Foeler. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest. No. 91-3242 U. S. Public Health Services, National Institutes of Health, Bethesda) y se refieren a las posiciones en un dominio de unión a FcRn, en particular en una región Fe. En una manera similar, las sustituciones se indican como, por ejemplo, "EU387R" o "EU440E",
donde el número dado después de "EU" indica la posición de la sustitución de acuerdo con la numeración de EU, y la letra después del número en el aminoácido sustituido dado en el código de una letra. Las sustituciones también puede escribirse como (aminoácido 1 )-posición-(aminoácido 2) mediante las cuales el primer aminoácido es el aminoácido sustituido y el segundo aminoácido es el aminoácido sustituyente en la posición especificada.
Los términos "sustitución" y "sustitución de un aminoácido" como se usa en la presente se refieren a una sustitución de un aminoácido en una secuencia de aminoácido con otra, donde el último es diferente del aminoácido sustituido. Los métodos para sustituir un aminoácido son bien conocidos por el experto en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, mutaciones de la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de aminoácido.
Más particularmente, una sustitución de un aminoácido en un dominio de unión a FcRn se refiere a una sustitución de un aminoácido en referencia a la secuencia de aminoácido de un dominio de unión a FcRn original. Un dominio modificado de unión a FcRn ya que tiene las sustituciones deseadas también se incluye en el dominio de unión a FcRn de la presente invención.
Un dominio de unión a FcRn original es un dominio de unión a FcRn que tiene en la posición EU238 una prolina, en la posición EU250 una treonina, en la posición EU252 una metionina, en la posición EU254 una serina, en la posición EU255 una arginina, en la posición EU256 una treonina, en la posición EU258 un ácido
glutámico, en la posición EU286 una asparagina, en la posición EU307 una treonina, en la posición EU308 una valina, en la posición EU309 una leucina, en la posición EU311 una glutamina, en la posición EU315 una asparagina, en la posición EU387 una prolina, en la posición EU422 una valina, en la posición EU424 una serina, en la posición EU426 una serina, en la posición EU428 una metionina, en la posición EU433 una histidina, en la posición EU434 una asparagina, en la posición EU436 una tirosina, en la posición EU438 una glutamina, y en la posición EU440 una serina y ninguna o baja afinidad para FcRn a pH neutro (más débil de 3200 nM). El dominio de unión a FcRn original puede comprender sustituciones en otras posiciones pero preferiblemente, el dominio de unión a FcRn original está no modificado. Preferiblemente, el dominio de unión a FcRn original es una región Fe (región Fe original). Preferiblemente, la región Fe original se deriva de un anticuerpo mamífero; más preferiblemente, la región Fe original es la región Fe de un anticuerpo humano. Una región Fe de un anticuerpo humano en la presente se refiere como una región Fe humana.
Una región Fe original es, preferiblemente una región Fe intacta, más preferiblemente una región Fe intacta humana. Preferiblemente, la región Fe original es la región Fe de una IgG, más preferiblemente de una IgG humana. Aún más preferiblemente, una región Fe original es una región Fe humana que comprende el dominio CH2 tipo silvestre y CH3 tipo silvestre
de bisagra tipo silvestre. En el contexto de la presente invención, el término anticuerpo original se refiere a un anticuerpo que comprende una región Fe original.
Las moléculas de unión al antígeno original incluyen, pero no se limitan a, proteínas receptoras (receptores unidos a membrana y receptores solubles), anticuerpos que reconocen un antígeno de la membrana como marcadores de superficie celular, y anticuerpos que reconocen un antígeno soluble como citocinas.
El término "molécula de unión al antígeno original" como se usa en la presente se refiere a una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio de unión a FcRn original. El origen de "molécula de unión al antígeno original" no está limitado y puede obtenerse a partir de cualquier organismo: de animales no humanos o humanos. Preferiblemente, el organismo se selecciona del grupo que consiste en ratón, rata, conejillo de Indias, hámster, jerbo, gato, conejo, perro, cabra, ovejas, vaca, caballo, camello, y primate no humano. En otra modalidad, la "molécula de unión al antígeno original" puede también obtenerse a partir de macaco, tití, macaco de la India, chimpancé o humano. La IgG original puede ser una IgG que ocurre naturalmente, o una variante o una versión modificada de una IgG que ocurre naturalmente. La IgG original puede referirse al polipéptido propio, a las composiciones que comprenden la IgG original, o a la secuencia de aminoácido que la codifica. Debe observarse que la "IgG original" incluye la IgG producida recombinantemente
comercial conocida como se explica a continuación. Preferiblemente, la "IgG original" se obtiene a partir de la lgG1 humana pero no se limita a una subclase específica de IgG. Esto se entiende que lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4 humanas pueden usarse apropiadamente como la "IgG original". En una manera similar, cualquier subclase de las IgG de cualquier organismo descrito antes puede usarse preferiblemente como la "IgG original". El ejemplo de la variante o de la versión modificada de una IgG que ocurre naturalmente se describe en Curr Opin Biotechnol. Diciembre de 2009; 20(6): 685-91, Curr Opin Immunol. Agosto de 2008; 20(4): 460-70, Protein Eng Des Sel. Abril de 2010; 23(4): 195-202, WO 2009/086320, WO 2008/092117, WO 2007/041635 y WO 2006/105338, pero no limitados por los mismos.
Un dominio de unión a FcRn o región Fe de la presente invención puede comprender una sustitución en dos o más posiciones la cual se refiere en la presente como "combinación" de sustituciones. Por ejemplo, una región Fe definida por la combinación "EU424/EU434/EU436" es una región Fe que comprende una sustitución en las posiciones EU424, EU434 y EU436.
El aminoácido sustituyente (el aminoácido con el cual el aminoácido en el dominio de unión a FcRn original se sustituye) puede ser cualquier aminoácido a menos que se mencionado específicamente en la presente, incluyendo pero sin limitarse al grupo que consiste en: alanina (Ala, A), arginina (arg, R), asparaginas (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína, (cys, C),
ácido glutámico (glu, E), glutamina (glu, Q), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina (ile, I), leucina (leu, F), Usina (lys, K), metionina (met, M), fenilaianina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptófano (trp, W), tirosina (tyr, Y), y valina (val, V). Preferiblemente, el aminoácido sustituyente en cualquiera de las posiciones EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440 se selecciona del grupo que consiste en: alanina (Ala, A), arginina (arg, R), ácido glutámico (glu, E), glutamina (gln, Q), ácido aspártico (asp, D), serina (ser, S), treonina (thr, T), tirosina (tyr, Y), y Usina (lys, K).
En una modalidad preferida de la presente invención, la molécula de unión al antígeno de la presente invención tiene un dominio modificado de unión a FcRn que comprende una sustitución de aminoácido con un aminoácido diferente de uno sustituido
a) en la posición EU252 y EU434, y
b) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
El aminoácido sustituyente puede ser cualquier aminoácido a menos que se mencione específicamente en la presente. Los Aminoácidos sustituyentes preferidos para las posiciones EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436 se muestran en la Tabla 1.
[Tabla 1]
Aminoácidos sustituyentes preferidos
Preferiblemente, el dominio modificado de unión a FcRn de la presente invención comprende por lo menos una de las sustituciones de aminoácidos indicadas en la Tabla 1. Es posible usar los dominios de unión a FcRn sin ninguna alteración, siempre y cuando ya tengan por lo menos uno de los aminoácidos dados antes en la posición especificada y dicho dominio de unión a FcRn tiene actividad de unión a FcRn humano en los intervalos de pH ácido y neutro, por lo cual la actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH neutro es aumentada.
En una modalidad preferida, la molécula modificada de unión al antígeno de la presente invención comprende una modificación en tres o más posiciones en el dominio de unión a FcRn, donde tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 2, 4 a 7.
[Tabla 2]
Combinaciones preferidas de posiciones para las sustituciones en el dominio de unión a FcRn
En una modalidad más preferida, la molécula de unión al antígeno de la presente la invención comprende tres o más sustituciones de aminoácidos en un dominio de unión a FcRn, donde las tres o más sustituciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 3, 12, 14, y 17 a 20.
[Tabla 3]
Combinaciones de sustitución preferidas en el dominio de unión a FcRn
Modificar un dominio de unión a FcRn introduciendo sustituciones puede reducir la estabilidad de la molécula de unión al antígeno (WO/2007/092772). La estabilidad de una proteína de fármaco es crítica para la fabricación de productos farmacéuticos, debido a que las proteínas con pobre estabilidad tienden a agregarse fácilmente durante almacenamiento. Por lo tanto la estabilidad reducida causada por las sustituciones en la región Fe haría el desarrollo de una formulación estable difícil (WO2007/092772).
Además, la pureza de una proteína de fármaco con respecto a especies de monómero y a especies de alto peso molecular es también importante para el desarrollo farmacéutico. La lgG1 tipo silvestre después de la purificación de la proteína A no contiene una cantidad significativa de especies de alto peso molecular, pero modifica un dominio de unión a FcRn introduciendo sustituciones puede dar lugar a una mayor cantidad de especie de alto peso molecular. En tal caso, las especies de alto peso molecular necesitan ser eliminadas de las sustancias de fármaco a granel mediante un proceso de purificación que pueda ser difícil
en el desarrollo del proceso de la purificación.
Por otra parte, la inmunogenicidad de un producto farmacéutico de proteínas en humano es importante, puesto que la presencia de anticuerpos antifármacos daría lugar a la eliminación del fármaco del cuerpo y así de la pérdida de eficacia terapéutica (IDrugs 2009; 12:233-7). Cuando las sustituciones se introducen en un dominio Fe tipo silvestre (como dominio Fe de IgG 1 ) , la secuencia modificada se convierte en una secuencia no humana. Tal secuencia modificada podía presentarse por la MHC clase II y por lo tanto podía ser inmunogenética en pacientes humanos.
Las proteínas no serán desarrolladas como un fármaco si comprenden variantes Fe que exhiben pobre estabilidad y pureza, y la pobre inmunogenicidad obstaculizaría el desarrollo clínico. Es por lo tanto un objetivo de la presente invención mejorar la afinidad de unión a FcRn a pH7.4 sin perder la estabilidad significativa;
aumenta la cantidad de relación de especies de alto peso molecular, y
aumenta el riesgo de inmunogenicidad (riesgo de formación de anticuerpo antifármaco)
(GRUPO 1 )
Por lo tanto, la presente invención también proporciona una molécula de unión al antígeno que comprende una sustitución de aminoácido en el dominio de unión a FcRn en las posiciones
EU252, EU434, EU307 y EU311, que tienen una actividad de unión para el FcRn a pH 7 de más de 15 nM, una temperatura de fusión Tm de 57.5°C o mayor, un HMW de menos del 2% y una baja inmunogenicidad donde una baja inmunogenicidad es equivalente a un conteo de menos de 500 determinad con Epibase (Lonza).
Preferiblemente, una molécula de unión al antígeno que comprende una sustitución de aminoácido en el dominio de unión a FcRn en cuatro o más posiciones, donde las cuatro o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en
a) EU252/EU434/EU307/EU311/EU436, y
b) EU252/EU434/EU307/EU311/EU436 en combinación con una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU286, EU308, y EU428.
Las combinaciones preferidas se indican en la Tabla 4.
[Tabla 4]
Preferidas particulares son las combinaciones a), g), h) e i) de la Tabla 4.
En una modalidad aún más preferida, el dominio modificado de unión a FcRn comprende:
a) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
b) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU308 una prolina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
c) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la prolina de la posición
EU308, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o
d) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la prolina de la posición EU308, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina.
(GRUPO 2)
La presente invención también proporciona una molécula de unión al antígeno que comprende una sustitución de aminoácido en el dominio de unión a FcRn en tres o más posiciones, donde dichas tres o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en a) EU252/EU434/EU307/EU311 ; y b) EU252/EU434/EU308; donde la actividad de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno a pH neutro es 15 a 50 n , la Tm es mayor de 60°C, un HMW de menos del 2% y donde la molécula de unión al antígeno tiene una baja inmunogenicidad por lo cual una baja inmunogenicidad es equivalente a un conteo de menos de 500 determinado con Epibase (Lonza).
En una modalidad preferida, las sustituciones de aminoácidos están en las cuatro o más posiciones donde las cuatro o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 5.
[Tabla 5]
combinaciones preferidas
Más preferida es una molécula de unión al antígeno que comprende cuatro o más sustituciones de aminoácidos donde las cuatro o más sustituciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en:
a) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina y en la posición EU434 una tirosina;
b) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina y en la posición EU434 una tirosina;
c) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición 436 una isoleucina; d) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una isoleucina;
e) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición
EU308 una prolina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina;
f) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina;
g) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina;
h) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU308 una prolina, y en la posición EU434 una tirosina; e
i) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición 307 una glutamina, en la posición
EU308 una prolina, en la posición EU311 una alanina, y en la posición EU434 una tirosina.
(Grupo 3)
La presente invención también proporciona una molécula de unión al antígeno que comprende una sustitución de aminoácido en el dominio de unión a FcRn
a) en las posiciones EU252/EU434; y
b) en la posición EU436 y/o en la posición EU254 y/o en la posición EU315;
y que tiene una actividad de unión a FcRn a pH 7 de 50 a 150 nM, una Tm mayor de 63°C, a un HMW de menos del 2% y a una muy baja inmunogenicidad, donde una muy baja inmunogenicidad se define como un conteo de menos de 250 determinado con Epibase (Lonza).
Preferiblemente, las sustituciones de aminoácidos están en tres o más posiciones, donde las tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 6.
[Tabla 6]
combinaciones preferidas
En una modalidad más preferida, la molécula modificada de unión al antígeno comprende tres o más sustituciones de
aminoácidos donde las tres o más sustituciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en:
a) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU315 un ácido aspártico, y en la posición EU434 una tirosina; b) en la posición EU252 una tirosina, en la posición
EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una isoleucina;
c) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una leucina;
d) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; y
e) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una isoleucina.
(GRUPO 4)
La presente invención además proporciona una molécula de unión al antígeno que comprende una sustitución de aminoácido en el dominio de unión a FcRn en tres o más posiciones, donde las tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 7. Dichas moléculas modificadas de unión al antígeno tienen una actividad de unión para el FcRn a pH 7 de 150 a 700 nM, una Tm mayor de 66.5°C, un HMW de menos del 2% y una muy baja inmunogenicidad, donde una muy baja inmunogenicidad se define como un conteo de menos de 250 determinado con Epibase (Lonza).
[Tabla 7]
Preferiblemente, las moléculas modificadas de unión al antígeno comprenden tres o más sustituciones donde las tres o más sustituciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en
a) en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una histidina, y en la posición EU434 una tirosina;
b) en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU309 un ácido glutámico, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina;
c) en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU309 un ácido glutámico, en la posición EU311 una histidina, en la posición EU434 una tirosina; o
d) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, en la posición EU436 una valina.
Anticuerpo antifármaco preexistente
Las sustituciones de aminoácidos en un anticuerpo pueden producir consecuencias negativas, por ejemplo, un aumento en la inmunogenicidad del anticuerpo terapéutico que, a su vez, puede dar lugar a una tormenta de citocina y/o una producción de
anticuerpos antifármacos (ADAs, por sus siglas en inglés). Puesto que los ADA como pueden influenciar la eficacia y la farmacocinética de anticuerpos terapéuticos y llevar a veces a efectos secundarios serios, la utilidad y la eficacia clínicas de los anticuerpos terapéuticos pueden limitarse. Muchos factores influencian la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos, y la presencia de epítopos efectores de células T es uno de los factores. Igualmente, la presencia de anticuerpos preexistentes contra un anticuerpo terapéutico puede también ser problemática. Un ejemplo de tal anticuerpo preexistente es el factor reumatoide (RF, por sus siglas en inglés), un autoanticuerpo (un anticuerpo dirigido contra una proteína propia) contra la porción Fe de un anticuerpo (es decir, IgG). El factor reumatoide se encuentra en particular en pacientes que sufren de lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés) o artritis reumatoide. En pacientes con artritis, el RF y la IgG se unen para formar complejos inmunes que contribuyen al proceso de la enfermedad. Recientemente, se reportó que un anticuerpo humanizado de lgG1 anti-CD4 que tenía una mutación Asn434His produjo la unión al factor reumatoide significativo (Clin Pharmacol Ther. febrero de 2011;89(2):283-90 (NPL9)). Los estudios detallados han confirmado que la mutación de Asn434His en la I g G 1 humana aumentó la unión del factor reumatoide a la región Fe del anticuerpo comparada a la lgG1 humano original.
El RF es un autoanticuerpo policlonal contra IgG humana, y
el epítopo del RF en la secuencia de la IgG humana varía entre los clones, pero el epítopo de RF parece estar localizado en la región de interfaz CH2/CH3 así como el dominio CH3 que podría traslaparse con el epítopo de unión a FcRn. Por lo tanto, las mutaciones para aumentar la afinidad de unión a FcRn a pH neutro pudieron también aumentar la afinidad de unión al clon específico de RF.
Por consiguiente, es preferible aumentar la afinidad de unión a FcRn a pH neutro y/o ácido sin también aumentar la afinidad de unión del anticuerpo terapéutico para un anticuerpo preexistente en el plasma a pH neutro.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona moléculas de unión al antígeno que comprenden un dominio modificado de unión a FcRn (preferiblemente una región Fe modificada), por lo cual la actividad de unión para un ADA preexistente a un pH neutro no se aumentada significativamente con respecto a la afinidad de unión de una molécula de unión al antígeno que comprende un región Fe tipo silvestre. El dominio modificado de unión a FcRn (región Fe modificada) comprende preferiblemente una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
Las sustituciones descritas antes se introducen preferiblemente en un dominio de unión a FcRn o una región Fe
de una molécula de unión al antígeno que ha aumentado la afinidad para el FcRn a pH neutro o ácido por lo cual dicho dominio modificado de unión a FcRn o región Fe tiene una mayor actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro. El efecto de las sustituciones es una menor actividad de unión para el ADA preexistente. Por lo tanto, en una modalidad preferida, un dominio modificado de unión a FcRn o una región Fe modificada de la presente invención tiene una menor actividad de unión a un ADA preexistente con respecto a un dominio de unión a FcRn o una región Fe que tiene una mayor actividad de unión al FcRn a pH neutro o ácido, y una mayor actividad de unión al anticuerpo antifármaco preexistente en los intervalos de pH neutro. Preferiblemente, una molécula de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión a pH neutro para el FcRn y un ADA preexistente son las moléculas de unión al antígeno que comprenden una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436 como se describe anteriormente. Puede también comprender una sustitución en la posición EU256 además de una sustitución en una o más posiciones mencionadas anteriormente. Preferiblemente, el aminoácido en la posición EU256 se sustituye con un ácido glutámico.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona
moléculas de unión al antígeno que comprenden una región Fe modificada la cual tiene una mayor afinidad para FcRn a pH neutro o ácido por lo cual la afinidad para un anticuerpo antifármaco preexistente (ADA, por sus siglas en inglés) a un pH neutro no se aumenta significativamente en comparación con la afinidad de unión de la molécula de unión al antígeno que comprende un región Fe tipo silvestre. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe modificada con una mayor afinidad para FcRn a pH neutro o ácido que comprende una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
Preferiblemente, la molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe modificada con una mayor afinidad para FcRn a pH neutro o ácido, por lo cual la actividad de unión a pH neutro para un ADA preexistente no se aumenta significativamente en comparación con una molécula de unión al antígeno de control, donde la región Fe modificada comprende una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones seleccionadas de las sustituciones como se muestra en la Tabla 8.
[Tabla 8]
Sustitución de aminoácidos:
El término "anticuerpo antifármaco" y "ADA" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo endógeno que tiene afinidad de unión para un epítopo localizado en un anticuerpo terapéutico y es así capaz de unir dicho anticuerpo terapéutico. El término "anticuerpo antifármaco preexistente" y "ADA preexistente" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo antifármaco que está presente y es detectable en la sangre de un paciente antes de la administración del anticuerpo terapéutico al paciente. Preferiblemente, el ADA preexistente es un anticuerpo humano. En una modalidad particularmente preferida, el ADA preexistente es el factor reumatoide, un autoanticuerpo policlonal o monoclonal contra la región Fe de anticuerpo de IgG humana. Los epítopos del factor reumatoide están localizados en la región de interfaz CH2/CH3 así como el dominio CH3 pero pueden variar entre clones.
Una molécula de unión al antígeno que comprende una región de dominio de unión a FcRn (o una región Fe) que tiene una mayor afinidad para FcRn a pH neutro o ácido y para un anticuerpo antifármaco preexistente a pH neutro es una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn (o una región Fe) que fue modificado para aumentar la afinidad de unión del dominio de unión a FcRn (o región Fe) de una molécula de unión al antígeno para FcRn con respecto a un anticuerpo que comprende un dominio de unión a FcRn intacto (o región Fe intacta). Las modificaciones contempladas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácido de la porción Fe de un dominio de unión al antígeno. La molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn o una región Fe, que tiene una mayor actividad de unión para a) un ADA preexistente a un intervalo de pH neutro y para FcRn a pH neutro (en caso de una molécula de unión al antígeno de interés que tiene una mayor actividad de unión a FcRn a un pH neutro) o ácido (en caso de una molécula de unión al antígeno de interés que tiene una mayor actividad de unión a FcRn a un pH ácido) se refiere en la presente como "Anticuerpo de Referencia". Un "Anticuerpo de Referencia" es preferiblemente la molécula modificada de unión al antígeno antes de sustituir un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440, más preferiblemente
antes de introducir cualquiera de las sustituciones indicadas en la Tabla 8. Un "Anticuerpo de Referencia" puede ser una molécula de unión al antígeno que comprende una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
Un ejemplo para un "Anticuerpo de Referencia" que tiene una mayor actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH neutro es una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe con mayor afinidad para FcRn en los intervalos de pH neutro y que tiene mayor afinidad para un ADA preexistente a pH neutro que comprende una sustitución de aminoácido en la región Fe en
a) las posiciones EU252 y EU434; y
b) una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, y EU436.
Más Preferiblemente, la molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe con mayor afinidad para FcRn en los intervalos de pH neutro y que tiene mayor afinidad para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro comprende una de las combinaciones indicadas en la Tabla 9.
[Tabla 9]
Combinaciones preferidas de sustituciones de un Anticuerpo de Referencia que tiene una mayor actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH neutro.
Un ejemplo para un "Anticuerpo de Referencia" que tiene una mayor actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH ácido es una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe con mayor afinidad para FcRn en los intervalos de pH ácido y que tiene mayor afinidad para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro comprende preferiblemente una sustitución
i) en la posición EU434, o
ii) en dos o más posiciones, donde las dos o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en a) EU252/EU254/EU256; b) EU428/EU434; y
c) EU250/EU428.
Preferiblemente, la molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe con mayor afinidad en los intervalos de pH ácido y que tiene mayor afinidad para un ADA preexistente a pH neutro comprende
i) las sustituciones M434H; o
¡i) una de las combinaciones del grupo que consiste en a) M252Y/S254T/T256E; b) M428L/N434S; y c) T250Q y M428L (numeración de EU).
Preferiblemente, la molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe que comprende una de las siguientes sustituciones o las combinaciones a) M252Y/S254T/T256E, b) M428L/N434S o c) T250Q y M428L o d) M434H (numeración de EU) tiene una mayor actividad de unión al FcRn al pH ácido sin aumentar la actividad de unión en los intervalos de pH neutro.
La actividad de unión de una región Fe de molécula de unión al antigeno para un anticuerpo antifármaco preexistente se expresó en la presente solicitud como una respuesta de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) a pH neutro; sin embargo, hay otros métodos adecuados para determinar la actividad de unión para un ADA preexistente conocido al experto en la técnica. Un ensayo de ECL es por ejemplo, descrito en Moxness et al (Clin Chem, 2005, 51:1983-85) y en los EJEMPLOS de la presente invención. Las condiciones usadas en el ensayo para determinar la actividad de unión para un ADA preexistente pueden seleccionarse apropiadamente por los expertos en la técnica, y así no están particularmente limitadas.
Una aumentada o mayor afinidad de unión para un ADA preexistente es mayor con respecto a la afinidad de unión para el ADA preexistente de una Molécula de unión al Antígeno de
Control.
El término "Molécula de Unión al Antígeno de Control" como se usa en la presente se refiere a una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe humana intacta, preferiblemente un anticuerpo o un derivado de anticuerpo que comprende una región Fe humana intacta.
La afinidad de unión para un ADA preexistente puede determinarse en cualquier temperatura a partir de 10°Centígrados a 50°Centígrados. Preferiblemente, una temperatura a partir de 15°Centígrados a 40°Centígrados se emplea para determinar la afinidad de unión entre la región Fe humana y el ADA preexistente humano. Más preferiblemente, cualquier temperatura a partir de 20°Centígrados a 35°Centígrados, como cualquiera de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, y 35°C se emplea para determinar la afinidad de unión entre la región Fe humana y el ADA preexistente humano. Preferiblemente, la temperatura está entre 20 y 25°C, preferiblemente a 25°C. En una modalidad preferida, la interacción entre el ADA preexistente humano y la región Fe humana se mide a pH 7.4 (o pH 7.0) y a 25°C.
En el contexto de la presente invención, el término "una mayor afinidad de unión para un ADA preexistente" se refiere a un aumento medido en afinidad de unión (es decir, KD) de una molécula de unión al antígeno de la presente invención para un ADA preexistente con respecto a la afinidad de unión medida de
una Molécula de Unión al Antígeno de Control para el ADA preexistente. Tal aumento en la afinidad de unión para un ADA preexistente puede observarse en un paciente individual o en un grupo de pacientes.
Los términos "pacientes" y "paciente" como se usa en la presente, no están particularmente limitados y no incluyen todos los seres humanos que sufren de una enfermedad y a quienes en el curso de un tratamiento se administró una molécula de unión al antígeno terapéutica. Preferiblemente, un paciente es una persona que sufre de una enfermedad autoinmune. Preferiblemente, un paciente es una persona que sufre de una enfermedad artrítica o lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés). Las enfermedades artríticas incluyen en particular artritis reumatoide.
En el contexto de la presente invención, un aumento significativo de la actividad de unión para un ADA preexistente en un paciente individual corresponde a un aumento medido de por lo menos el 10%, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50%, por lo menos el 60% de la actividad de unión para un ADA preexistente de una molécula de unión al antígeno terapéutico (es decir, un anticuerpo terapéutico) que comprende una región Fe modificada en un paciente con respecto a la afinidad de unión para el ADA preexistente de una Molécula de Unión al Antígeno de Control. Preferiblemente el aumento es por lo menos el 20%, más preferiblemente el aumento
es por lo menos el 30%, aún más preferiblemente, es por lo menos el 40% y más preferiblemente el aumento es por lo menos el 50% de la actividad de unión de una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe modificada con respecto a la afinidad de unión para el ADA preexistente de una molécula de unión al antígeno de control. Alternativamente, un aumento significativo en la actividad de unión de una molécula de unión al antígeno para un ADA preexistente en un paciente es preferiblemente una respuesta de ECL a la molécula de unión al antígeno de más de 250, preferiblemente a un ECL de por lo menos 500, más preferiblemente a un ECL de por lo menos 1000, más preferiblemente a un ECL de por lo menos 2000. Más preferiblemente, el aumento es un aumento con respecto a la respuesta de ECL de una Molécula de Unión al Antígeno de Control de menos de 500 (preferiblemente de menos de 250). Los intervalos preferidos entre la actividad de unión para un ADA preexistente de la Molécula de Unión al Antígeno de Control y la de una molécula de unión al antígeno con una región Fe modificada son en particular respuestas de ECL de menos de 250 por lo menos a 250, de menos de 250 por lo menos a 500, de menos de 500 a 500 o más, de menos de 500 a 1000 o más, y de menos de 500 por lo menos 2000.
El aumento en la actividad de unión para un ADA preexistente puede también corresponder a un aumento medido en la porción de pacientes en una población de pacientes que
tiene una respuesta de ECL de por lo menos 500 (preferiblemente por lo menos 250) a la molécula de unión al antígeno con una mayor actividad de unión a) el FcRn a pH neutro o ácido y b) un ADA preexistente a pH neutro con respecto a la porción de pacientes que tienen una respuesta de ECL de por lo menos 500 (preferiblemente por lo menos 250) a pH neutro a una Molécula de Unión al Antígeno de Control. Un aumento "significativo" en la porción de pacientes en una población de pacientes es preferiblemente un aumento de por lo menos el 10%, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50% que tienen una respuesta de ECL de la molécula de unión al antígeno terapéutica que comprende una región Fe modificada al factor reumatoide a pH neutro de 500 o de menos (preferiblemente de 250 o más) comparada con la porción de pacientes que tienen una respuesta de ECL a una Molécula de Unión al Antígeno de Control. Preferiblemente el aumento es por lo menos el 20%, más preferiblemente por lo menos el 30%, aún más preferiblemente, es por lo menos el 40% y más preferiblemente es el 50% o más.
En el contexto de la presente invención, una disminución de la afinidad de unión para un ADA preexistente se refiere a una disminución medida de la actividad de unión (es decir, la respuesta de KD o de ECL) con respecto a la actividad de unión medida para un Anticuerpo de Referencia. Tal disminución de la afinidad de unión para un ADA preexistente puede observarse en
un paciente individual o en un grupo de pacientes. La disminución de la afinidad de una molécula de unión al antígeno terapéutica para un ADA preexistente a pH neutro de un paciente individual se refiere a una disminución medida a pH neutro de la actividad de unión con respecto a la actividad de unión medida para un Anticuerpo de Referencia para el ADA preexistente a pH neutro en dicho paciente. Preferiblemente, una disminución significativa de un paciente individual es una disminución medida a pH neutro de por lo menos el 10%, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50% en la actividad de unión de la molécula modificada de unión al antígeno para un ADA preexistente con respecto a la actividad de unión de un Anticuerpo de Referencia para un ADA preexistente a pH neutro. Más preferiblemente, la disminución es por lo menos el 30%, aún más preferiblemente, es el 40% y más preferiblemente es el 50% o más con respecto a un Anticuerpo de Referencia.
Alternativamente, la disminución significativa de un paciente individual de una actividad de unión de una molécula modificada de unión al antígeno para un ADA preexistente puede medirse como una disminución de la respuesta de ECL de dicha molécula de unión al antígeno con respecto a la respuesta de ECL de un Anticuerpo de Referencia a partir de una respuesta de ECL de 500 o más, (preferiblemente, de un ECL de 1000 o más, más preferiblemente de un ECL de 2000 o más), de menos de 500, preferiblemente de menos de 250. Las disminuciones preferidas
son de una respuesta de ECL de 500 o más a una respuesta de ECL de menos de 500, más preferiblemente por lo menos de 250 a menos de 250, aún más preferiblemente desde por lo menos 500 o menos de 250. Los intervalos preferidos son, en particular, desde por lo menos 250 a menos de 250, desde por lo menos 500 a menos de 250, desde por lo menos 1000 a menos de 250, desde por lo menos de 2000 a menos de 250, desde por lo menos 500 a menos de 500, desde por lo menos 1000 a menos de 500, y desde por lo menos 2000 a menos de 500.
La disminución puede también ser una disminución en porcentaje de pacientes en una población de pacientes que tenga una mayor unión de su ADA preexistente a la molécula modificada de unión al antígeno en intervalos de pH neutro. En otras palabras, la disminución puede medirse como una disminución del porcentaje de gente que tiene una respuesta de ECL de su ADA preexistente a una molécula modificada de unión al antígeno con respecto a la respuesta de ECL a un Anticuerpo de Referencia. Preferiblemente, una disminución puede ser una disminución de por lo menos el 10%, por lo menos el 20%, por lo menos el 30%, por lo menos el 40%, por lo menos el 50% de la porción de pacientes de una población de pacientes en la cual la molécula de unión al antígeno terapéutica tiene una mayor actividad de unión a un ADA preexistente con respecto a la porción de pacientes que tiene una mayor actividad de unión del Anticuerpo de Referencia al ADA preexistente, donde la mayor unión se expresa como una
respuesta de ECL de 500 o más, preferiblemente 250 o más. Preferiblemente la disminución es por lo menos el 20%, más preferiblemente la disminución es por lo menos el 30%, aún más preferiblemente, es el 40% y más preferiblemente es el 50% o más.
En una modalidad preferida, una molécula de unión al antígeno terapéutica de la presente invención tiene baja actividad de unión para un ADA preexistente a un pH neutro. En particular, la actividad de unión de una molécula modificada de unión al antígeno de la presente invención para un ADA preexistente a un pH neutro preferiblemente de manera significativa disminuida comparada con la actividad de unión de un Anticuerpo de Referencia para un ADA preexistente a pH neutro. Más preferiblemente, la actividad de unión de una molécula modificada de unión al antígeno de la presente invención para un ADA preexistente a un pH neutro no es mayor significativamente con respecto a la afinidad de unión de una Molécula de Unión al Antígeno de Control (tiene aproximadamente la misma actividad de unión para un ADA preexistente como la Molécula de Unión al Antígeno de Control). Una baja actividad de unión o una afinidad de línea de base para un ADA preexistente es preferiblemente una respuesta de ECL de menos de 500 en un paciente individual. Preferiblemente, una respuesta de ECL es menor de 250. En una población de pacientes, una baja actividad de unión para un ADA preexistente es una respuesta de ECL de menos de 500 en 90%
de los pacientes en la población de pacientes, preferiblemente en 95% de los pacientes, más preferiblemente en 98% de los pacientes.
En una modalidad más preferida, la molécula de unión al antígeno que comprende un dominio modificado de unión a FcRn con una mayor afinidad para FcRn a pH neutro o ácido, donde la actividad de unión a pH neutro para un ADA preexistente no se mayor significativamente con respecto a una Molécula de Unión al Antígeno de Control, por lo cual el dominio modificado de unión a FcRn de la presente invención comprende una sustitución en una o más de las posiciones o de las combinaciones indicadas en la Tabla 10.
[Tabla 10]
Posiciones y combinaciones de posiciones para las sustituciones en dominio de unión a FcRn:
En una modalidad más preferida, la molécula de unión al antígeno de la presente invención comprende un dominio modificado de unión a FcRn que tiene uno o más de las sustituciones o de las combinaciones indicadas en la Tabla 11.
[Tabla 11]
Sustituciones y combinaciones de sustituciones dominio de unión a FcRn:
En una modalidad preferida, la molécula de unión al antígeno que comprende un dominio modificado de unión a FcRn con a) una mayor afinidad para FcRn a pH neutro o ácido b) una afinidad de unión para un ADA preexistente a pH neutro que significativamente no se mayor comparado con una Molécula de Unión al Antígeno de Control, dicha molécula de unión al antígeno comprende cualquiera de las combinaciones de sustituciones
indicadas en la Tabla 12.
También preferiblemente, una molécula de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión a FcRn a intervalos de pH neutro y una afinidad de unión para un ADA preexistente a pH neutro que no se mayor significativamente con respecto a una molécula de unión al antígeno que comprende un región Fe tipo silvestre comprende una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn en a) una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU387, EU422, EU424, EU438, EU440, EU433, o b) en dos o más posiciones, donde dos o más posiciones son la combinación EU422/EU424; o EU438/EU440. Más preferiblemente, las sustituciones se seleccionan de entre las sustituciones indicadas en la Tabla 11.
Aún más preferiblemente, un dominio de unión a FcRn de una molécula de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión para el FcRn a intervalos de pH neutro y una afinidad de unión para un ADA preexistente a pH neutro que no es mayor significativamente con respecto a una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe tipo silvestre que comprende cualquiera de las combinaciones de sustitución indicadas en la Tabla 12. En particular, las moléculas modificadas de unión al antígeno preferidas que tienen una mayor actividad de unión a FcRn a intervalos de pH neutro por lo cual la afinidad de unión a pH neutro para un ADA preexistente no es mayor significativamente comprende tres o más sustituciones en
el dominio de unión a FcRn, donde las tres o más sustituciones son cualquiera de las combinaciones No. (2) (26) y (28) (59) a indicadas en la Tabla 12.
[Tabla 12]
Las combinaciones de sustituciones en la región Fe que aumentan la actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH neutro sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente (posiciones dadas de acuerdo con el esquema de numeración de EU).
La presente invención también proporciona una molécula de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión para el FcRn a intervalos de pH ácido y una afinidad de unión para un ADA preexistente a pH neutro que no se mayor significativamente con respecto a una Molécula de Unión al Antígeno de Control, que comprende una sustitución de aminoácido en a) la posición EU424
o b) la posición EU438/EU440.
Más preferiblemente, las sustituciones se seleccionan entre a) EU424N y EU438R/EU440E.
Preferiblemente, un dominio de unión a FcRn de una molécula de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión para el FcRn a intervalos de pH ácido y una afinidad de unión para un ADA preexistente a pH neutro que no se mayor significativamente con respecto a una Molécula de Unión al Antígeno de Control, comprende una de las combinaciones de sustitución indicadas en la Tabla 13. Más preferiblemente, la molécula de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH ácido por lo cual la afinidad de unión para un ADA preexistente a pH neutro que no se mayor significativamente con respecto a una Molécula de Unión al Antígeno de Control, comprende cualquiera de las combinaciones de sustitución No. (13) a (28) indicadas en la Tabla 13.
[Tabla 13]
Las combinaciones de sustituciones en la región Fe que aumentan la actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH ácido sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente (posiciones dadas de acuerdo con el esquema de numeración de EU).
Además de una sustitución en cualquiera de las posiciones EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440, la región Fe de la presente invención puede también comprender la sustitución adicional de un aminoácido en una o más de las siguientes posiciones:
EU248, EU249, EU250, EU251, EU252, EU253, EU254, EU255, EU256, EU257, EU305, EU306, EU307, EU308, EU309, EU310, EU311, EU312, EU313, EU314, EU342, EU343, EU344, EU345, EU346, EU347, EU348, EU349, EU350, EU351, EU352, EU380, EU381, EU382, EU383, EU384, EU385, EU386, EU388, EU414, EU415, EU416, EU417, EU418, EU419, EU420, EU421, EU423, EU425, EU427, EU428, EU429, EU430, EU431, EU432, EU433, EU434, EU435, EU436, EU437, EU441, EU442, EU443, y EU444.
Sustituir una región Fe en cualquiera de estas posiciones puede reducir la afinidad de unión para un ADA preexistente, en particular para el factor reumatoide, sin afectar negativamente a la afinidad de unión para FcRn.
Además, los métodos de la presente invención pueden comprender además la etapa de sustituir la región Fe de la molécula de unión al antígeno como se describe anteriormente en una o más de las siguientes posiciones:
EU248, EU249, EU250, EU251, EU252, EU253, EU254, EU255, EU256, EU257, EU305, EU306, EU307, EU308, EU309, EU310, EU311, EU312, EU313, EU314, EU342, EU343, EU344, EU345, EU346, EU347, EU348, EU349, EU350, EU351, EU352, EU380, EU381, EU382, EU383, EU384, EU385, EU386, EU388, EU414, EU415, EU416, EU417, EU418, EU419, EU420, EU421, EU423, EU425, EU427, EU428, EU429, EU430, EU431, EU432, EU433, EU434, EU435, EU436, EU437, EU441, EU442, EU443, y EU444.
Actividad débil o no unión para un receptor efector o una proteína de complemento
Unir a los receptores Fe gamma o proteínas de complemento puede también causar efectos indeseados (por ejemplo, activación inadecuada de plaquetas). Una molécula modificada de unión al antígeno que no une los receptores efectores como el receptor Rila Fe gamma es segura y/o más efectiva. Por lo tanto, en una modalidad preferida, las moléculas modificadas de unión al antígeno de la presente invención tienen además una débil actividad de unión para un receptor efector o no unen a un receptor efector. Los ejemplos de un receptor efector incluyen pero no se limitan a activar los receptores Fe gamma, en particular el receptor I Fe gamma, el receptor II Fe gamma y el receptor III Fe gamma. El receptor I Fe gamma incluye el receptor la Fe gamma, el receptor Ib Fe gamma, y el receptor le Fe gamma, y subtipos de los mismos. El receptor gamma II Fe
gamma incluye el receptor lia Fe gamma (que tiene dos alotipos R131 y H131) y el receptor llb Fe gamma. El receptor III Fe gamma incluye el receptor Illa Fe gamma (que tiene dos alotipos: VI58 y F158) y el receptor lllb Fe gamma (que tiene dos alotipos: 111 b- A Fe gamma y lllb-NA2 Fe gamma). Los anticuerpos que tienen una débil actividad de unión para los receptores efectores o no unidos a ellos son ejemplos de anticuerpos que comprenden una región Fe silenciosa o anticuerpos sin una región Fe (por ejemplo, diacuerpos Fab, F(ab)'2, scFv, sc(Fv)2,).
Los ejemplos para las regiones Fe que no tienen una débil o ninguna actividad de unión para los receptores efectores son, por ejemplo, descritos en Strohl et al. (Current Opinión in Biotechnology (2009) 20(6), 685-691). En particular se describen, por ejemplo, las regiones Fe desglicosiladas (N297A, N297Q), y los ejemplos de una región Fe silenciosa, que son regiones Fe modificadas para funcionalidad efectora silenciada (o inmunosupresiva) (IgG 1 -L234A/L235A, lgG1- H268Q/A330S/P331S, lgG1 -C226S/C229S, IgG 1 - C226S/C229S/E233P/L234V/L235A, lgG1 -L234F/L235E/P331 S, lgG2-V234A/G237A, lgG2-H268Q/V309L/A330S/A331 S, lgG4-L235A/G237A/E318A, lgG4-L236E). El documento
W02008/092117 describe anticuerpos que comprenden regiones Fe silenciosas que comprenden las sustituciones G236R/L328R, L235G/G236R, N325A/L328R, o N325L/L328R (posiciones de acuerdo con el sistema de numeración de EU). Además, el
documento WO 2000/042072 describe anticuerpos que comprenden regiones Fe silenciosas que comprenden sustituciones en una o más de las posiciones EU233, EU234, EU235, y EU237. El documento WO 2009/011941 describe anticuerpos que comprenden las regiones Fe silenciosas que comprenden la supresión de residuos de EU231 a EU238. Davis et al (Journal of Rheumatology (2007) 34(11): 2204-2210) describe anticuerpos que comprenden las regiones Fe silenciosas que comprenden las sustituciones C220S/C226S/C229S/P238S. Shields et al (Journal of Biological Chemistry (2001) 276 (9), 6591-6604) describen anticuerpos que comprenden las regiones Fe silenciosas que comprenden la sustitución D265A.
El término "débil unión para los receptores efectores" se refiere a una actividad de unión que es 95% o menos, preferiblemente 90% o menos, 85% o menos, 80% o menos, 75% o menos, más preferiblemente 70% o menos, 65% o menos, 60% o menos, 55% o menos, 50% o menos, 45% o menos, 40% o menos, 35% o menos, 30% o menos, 25% o menos, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos, 9% o menos, 8% o menos, 7% o menos, 6% o menos, 5% o menos, 4% o menos, 3% o menos, 2% o menos, 1% o menos de la actividad de unión de una IgG intacta (o un anticuerpo que comprende una región Fe intacta) para el receptor efector. La actividad de unión a un R Fe gamma reducida preferiblemente por un factor de por lo menos aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 50 veces o más,
aproximadamente 100 veces o más con respecto a la actividad de unión de una IgG intacta (o un anticuerpo que comprende una región Fe intacta) para el receptor efector.
Una región Fe silenciosa es una región Fe modificada que comprende una o más sustituciones, inserciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos que reducen la unión a para un receptor efector con respecto a una región Fe intacta. La actividad de unión para un receptor efector puede ser tan reducida que la región Fe no une un receptor efector más. Los ejemplos de una región Fe silenciosa incluyen pero no se limitan a las regiones Fe que comprenden una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU234, EU235, EU236, EU237, EU238, EU239, EU265, EU266, EU267, EU269, EU270, EU271, EU295, EU296, EU297, EU298, EU300, EU324, EU325, EU327, EU328, EU329, EU331, y EU332.
En particular, una región Fe silenciosa tiene una sustitución en uno o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU234, EU235, EU236, EU237, EU238, EU239, EU265, EU266, EU267, EU269, EU270, EU271, EU295, EU296, EU297, EU298, EU300, EU324, EU325, EU327, EU328, EU329, EU331, y EU332 con un aminoácido seleccionado de la lista a continuación. Preferiblemente, una región Fe silenciosa tiene una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU235, EU237, EU238, EU239, EU270, EU298, EU325, y EU329
con un aminoácido seleccionado de la lista a continuación.
El aminoácido en la posición EU234 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, y Thr.
El aminoácido en la posición EU235 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, lie, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val y Arg.
El aminoácido en la posición EU236 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Asn, Gln, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro y Tyr.
El aminoácido en la posición EU237 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Me, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Val, Tyr y Arg.
El aminoácido en la posición EU238 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Asn, Gln, Glu, Gly, His, lie, Lys, Thr, Trp y Arg.
El aminoácido en la posición EU239 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Gln, His, Lys, Phe, Pro, Trp, Tyr y Arg.
El aminoácido en la posición EU265 se sustituye
preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Me, Leu, Lys, et, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.,
El aminoácido en la posición EU266 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Lys, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp y Tyr.
El aminoácido en la posición EU267 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, His, Lys, Phe, Pro, Trp y Tyr.
El aminoácido en la posición EU269 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Me, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
El aminoácido en la posición EU270 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Arg, Asn, Gln, Gly, His, Me, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
El aminoácido en la posición EU271 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, His, Phe, Ser, Thr, Trp y Tyr.
El aminoácido en la posición EU295 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Asn, Asp, Gly, His, Phe, Ser, Trp y Tyr.
El aminoácido en la posición EU296 se sustituye
preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Gly, Lys y Pro.
El aminoácido en la posición EU297 se sustituye preferiblemente con Ala.
El aminoácido en la posición EU298 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Gly, Lys, Pro, Trp y Tyr.
El aminoácido en la posición EU300 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Lys y Pro.
El aminoácido en la posición EU324 se sustituye preferiblemente con Lys o Pro.
El aminoácido en la posición EU325 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Arg, Gly, His, Me, Lys, Phe, Pro, Thr, Trp, Tyr, y Val.
El aminoácido en la posición EU327 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Gln, His, Me, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.
El aminoácido en la posición EU328 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Asn, Gly, His, Lys y Pro.
El aminoácido en la posición EU329 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo
que consiste en: Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val y Arg.
El aminoácido en la posición EU330 se sustituye preferiblemente con Pro o Ser.
El aminoácido en la posición EU331 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Gly y Lys.
El aminoácido en la posición EU332 se sustituye preferiblemente con uno de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Arg, Lys y Pro.
Preferiblemente, una región Fe silenciosa comprende una sustitución en la posición EU235 con Lys o Arg, EU237 con Lys o Arg, EU238 con Lys o Arg, EU239 con Lys o Arg, EU270 con Phe, EU298 con Gly, EU325 con Gly o EU329 con Lys o Arg. Más preferiblemente, una región Fe silenciosa comprende una sustitución en la posición EU235 con arginina y en la posición EU239 con lisina. Más preferiblemente, comprende las sustituciones L235R/S239K.
Además, las moléculas modificadas de unión al antígeno de la presente invención son preferiblemente desglicosiladas. Más preferiblemente, la molécula modificada de unión al antígeno de la presente invención comprende una mutación en un sitio de glicosilación de cadena pesada para prevenir la glicosilación en el sitio como, por ejemplo, descrito en el documento W02005/03175. Así, en una modalidad preferida de la presente
invención, las moléculas modificadas de unión al antígeno de aglicosilo son preparadas modificando el sitio de glicosilación de cadena pesada, es decir, introduciendo la sustitución N297Q o N297A (posición de acuerdo con el sistema de numeración de EU), y expresando la proteína en una célula hospedadora apropiada. Para introducir una sustitución un método como se describe en los EJEMPLOS puede usarse.
En una modalidad específica de la presente invención, las moléculas modificadas de unión al antígeno de la presente invención de la misma tienen una débil actividad de unión para una proteína de complemento o no unen a una proteína de complemento. Preferiblemente, la proteína de complemento es Clq. Una débil actividad de unión para una proteína de complemento es preferiblemente una actividad de unión para una proteína de complemento que es reducida por un factor de aproximadamente 10 veces o más, aproximadamente 50 veces o más, aproximadamente 100 veces o más con respecto a la actividad de unión para una proteína de complemento de una IgG intacta o de un anticuerpo que comprende una región Fe intacta. La actividad de unión de una región Fe para una proteína de complemento puede reducirse mediante la modificación de la secuencia de aminoácido como sustituciones, inserciones, adiciones y/o supresiones del aminoácido.
En una modalidad preferida de la presente invención, la molécula de unión al antígeno tiene una afinidad de unión a FcRn
mayor al pH ácido o neutro y tiene una actividad de unión débil o ninguna para un receptor efector y/o una proteína de complemento. Preferiblemente, tal molécula de unión al antígeno comprende una sustitución en el dominio de unión a FcRn en
a) una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, y
b) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU234, EU235, EU236, EU237, EU238, EU239, EU265, EU266, EU267, EU269, EU270, EU271, EU295, EU296, EU297 EU298, EU300, EU324, EU325, EU327, EU328, EU329, EU331, y EU332 (de acuerdo con el sistema de numeración de EU). Más preferiblemente, la molécula modificada de unión al antígeno de la presente invención que tiene una actividad de unión reducida o ninguna para los receptores efectores y/o proteínas de complemento comprende una o más sustituciones en las regiones Fe seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución en la posición EU235 con Lys o Arg, en la posición EU237 con Lys o Arg, en la posición EU238 con Lys o Arg, en la posición EU239 con Lys o Arg, en la posición EU270 con Phe, EU298 con Gly, en la posición EU325 con Gly y en la posición EU329 con Lys o Arg. Aún más preferiblemente, comprende una sustitución en la región Fe en la posición EU235 con Arg y en la posición EU239 con Lys. Y aún más preferiblemente, comprende
la combinación de sustitución L235R/S239K en la región Fe.
Preferiblemente, tales moléculas de unión al antígeno no tienen tampoco actividad de unión mayor significativamente para un ADA preexistente. Por lo tanto, la molécula de unión al antígeno de la presente invención que no tiene una actividad de unión reducida o ninguna para los receptores efectores y/o las proteínas de complemento comprende además sustituciones de un aminoácido en c) una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y ELJ440. En una modalidad más preferida de la presente invención, las moléculas modificadas de unión al antígeno comprenden tres o más sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a FcRn, donde las tres o más sustituciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 14 y 15.
[Tabla 14]
Las combinaciones de sustitución que aumentan la actividad de unión a FcRn a pH neutro sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente, y reducen la actividad de unión para los receptores efectores y/o las proteínas de complemento
[Tabla 15]
Las combinaciones de sustitución que aumentan la actividad de unión a FcRn a pH ácido sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente, y reducir la actividad de unión para los receptores efectores y/o proteínas de complemento
Modificaciones adicionales
Además, la molécula de unión al antígeno de la presente invención comprende además de las modificaciones descritas antes, en la posición EU257 del dominio de unión a FcRn no un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: alanina, valina, isoleucina, leucina, y treonina, y/o en la posición EU252 del dominio de unión a FcRn no un triptófano. En otras palabras, la molécula de unión al antígeno preferida de la presente invención comprende además de cualquiera de las modificaciones descritas antes en las posiciones EU257 una alanina, una valina, una isoleucina, una leucina, una treonina, una arginina, una asparagina, un ácido aspártico, una cisteína, un ácido glutámico, una glutamina, una glicina, una histidina, una Usina, una metionina, una fenilalanina, una prolina, una serina, un triptófano, o una tirosina, y en la posición EU252 una arginina, una asparagina, un ácido aspártico, una cisteína, un ácido glutámico, una glutamina, una glicina, una histidina, una lisina, una metionina, una fenilalanina, una prolina, una serina, o una tirosina.
También preferido es un dominio modificado de unión a FcRn el cual comprende además de las sustituciones en
cualquiera de las posiciones o las combinaciones en la presente de las posiciones, en la posición EU239 una lisina y/o en la posición EU270 una fenilalanina.
Molécula de unión al antígeno
Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención no están particularmente limitadas, mientras incluyan un dominio de unión al antígeno que tiene una actividad de unión específica a un antígeno objetivo y un dominio de unión a FcRn de la presente invención. Los dominios de unión al antígeno preferidos comprenden, por ejemplo, dominios que tienen una región de unión al antígeno de un anticuerpo. La región de unión al antígeno de un anticuerpo comprende, por ejemplo, las CDR. La región de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener las seis CDR del anticuerpo entero, o una, dos, o más CDR. La región de unión al antígeno de anticuerpo comprende supresiones, sustituciones, adiciones, y/o inserciones del aminoácido, o puede comprender una porción de CDR.
Por una parte, las moléculas de unión al antígeno de la presente invención incluyen moléculas de unión al antígeno que tienen una actividad antagónica (moléculas de unión al antígeno antagónico), moléculas de unión al antígeno que tienen una actividad agonística (molécula de unión al antígeno agonístico), y moléculas que tienen citotoxícidad. En una modalidad preferida, las moléculas de unión al antígeno son moléculas de unión al antígeno antagónicas, en particular, moléculas de unión al
antígeno antagónicas que reconocen un antígeno como un receptor o una citocina.
La molécula de unión al antígeno de la presente invención es preferiblemente un anticuerpo. Los anticuerpos preferidos en el contexto de la presente invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos de IgG. Cuando el anticuerpo que se usará es un anticuerpo de IgG, el tipo de IgG no está particularmente limitado; así, la IgG puede pertenecer a cualquier isotipo (subclase) como, lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4. Para una región constante de IgG 1 , lgG2, lgG3, o lgG4 humana, se describen los polimorfismos de genes (alotipos) en "Sequences of proteins of immunological ¡nterest, Número de Publicación de NIH 91-3242". Estos alotipos pueden también usarse para la región constante en esta aplicación. Especialmente, para la lgG1 humana, ambos aminoácidos Asp-Glu-Leu (DEL) y Glu-Glu-Met (EEM) pueden usarse para los residuos en 356-358 en la numeración de EU. Similarmente, para la región constante de kappa de inmunoglobulina humana, los polimorfismos de genes (alotipos) se describen en "Sequences of proteins of immunological interest, Número de Publicación de NIH 91-3242". Estos alotipos pueden también usarse para la región constante en esta aplicación. Además, las moléculas de unión al antígeno de la presente invención pueden incluir la región constante de anticuerpo, y las mutaciones de aminoácidos pueden introducirse en la región constante. Las mutaciones de aminoácidos que se introducirán
incluyen, por ejemplo, las que refuerzan o deterioran la unión al receptor Fe gamma (Proc Nati Acad Sci U S A. 14 de marzo de 2006; 103(11): 4005-10), pero no se limitan a estos ejemplos. Alternativamente, es también posible alterar la unión dependiente al pH seleccionando una región constante apropiada como la lgG2 (WO09125825).
Cuando una molécula de unión al antígeno de la presente invención es un anticuerpo, el anticuerpo puede derivarse de cualquier animal, como un ratón, humano, rata, conejo, cabra, o camello. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano. Además, el anticuerpo puede ser un anticuerpo alterado, por ejemplo, un anticuerpo quimérico, y en particular, un anticuerpo alterado que comprende una sustitución de aminoácido en la secuencia de un anticuerpo humanizado, etc. La categoría de anticuerpos contemplada por la presente invención también incluye anticuerpos biespecíficos, productos de modificación de anticuerpo ligados con varias moléculas, y polipéptidos que comprenden fragmentos de anticuerpo (particularmente fragmentos de anticuerpo inmunogenético e inmunoreactivo). En una modalidad preferida, la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo monoclonal.
Los "anticuerpos quiméricos" son anticuerpos preparados combinando secuencias derivadas de diferentes animales. Específicamente, un anticuerpo quimérico incluye, por ejemplo, anticuerpos que tienen regiones variables (V) de cadena pesada y
ligera a partir de un anticuerpo de ratón y regiones constantes (C) de cadena pesada y ligera a partir de un anticuerpo humano. Se conocen los métodos para generar anticuerpos quiméricos. En el caso de un anticuerpo quimérico humano-ratón, por ejemplo, un ADN que codifica una región V de anticuerpo puede ligarse a un ADN que codifica una región C de anticuerpo humano; este puede insertarse en un vector de expresión e introducirse en un huésped para producir el anticuerpo quimérico.
"Anticuerpos humanizados", también referidos como anticuerpos humanos reformados, se conocen en la técnica como anticuerpos en los cuales las regiones determinantes de complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano, por ejemplo, un ratón, se trasplanta en las CDR de un anticuerpo humano. Los métodos para identificar las CDR se conocen (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877)). Las tecnologías de recombinación genética generales adecuadas para este fin también se conocen (ver Solicitud de Patente Europea EP 125023; y WO 96/02576). Los anticuerpos humanizados pueden producirse mediante métodos conocidos, por ejemplo, las CDR de un anticuerpo de ratón pueden determinarse, y se obtiene un ADN que codifica un anticuerpo en el cual se ligan la CDR a la región de marco (FR, por sus siglas en inglés) de un anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados pueden
entonces producirse al usar un sistema que usa vectores de expresión convencionales. Tales ADN puede sintetizarse mediante PCR, al usar como cebadores varios oligonucleótidos preparados para tener porciones que se traslapen con las regiones de extremo de la CDR y la FR (ver el método descrito en el documento WO 98/13388). Las FR de anticuerpo humano ligadas a través de las CDR se selecciona de tal manera que las CDR forman un sitio de enlace al antígeno adecuado. Si se requiere, los aminoácidos en las FR de una región variable de anticuerpo pueden alterarse de modo que las CDR del anticuerpo humano reformado pueda formar un sitio de enlace al antígeno adecuado (Sato et al., Cáncer Res. (1993) 53: 10.01-6). Los residuos de aminoácidos en las FR que puede alterarse incluyen las porciones que unen directamente a un antígeno a través de los enlaces no covalentes (Amit et al., Science (1986) 233: 747-53), las porciones que influencian o tienen un efecto en la estructura de CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17), y las porciones implicadas en las interacciones de VH-VL (EP 239400).
Cuando las moléculas de unión al antígeno de la presente invención son anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados, las regiones constantes de estos anticuerpos se derivan preferiblemente de anticuerpos humanos. Por ejemplo, pueden usarse C-gamma1, C-gamma2, C-gamma3, y C-gamma4 para la cadena H, mientras que pueden usarse C-kappa y C-lambda para
la L cadena. Por otra parte, si se requiere, las mutaciones de aminoácidos pueden introducirse en la región C de anticuerpo humano para mejorar o disminuir la unión al receptor Fc-gamma o para mejorar la estabilidad o productividad del anticuerpo. Un anticuerpo quimérico de la presente invención incluye preferiblemente una región variable de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano y una región constante derivada de un anticuerpo humano. Mientras tanto, un anticuerpo humanizado incluye preferiblemente las CDR de un anticuerpo derivado de un mamífero no humano y las regiones FR y C derivadas de un anticuerpo humano. Las regiones constantes derivadas de anticuerpos humanos incluyen preferiblemente una región de unión a FcRn humano. Tales anticuerpos incluyen, por ejemplo, IgGs ( I g G 1 , lgG2, lgG3, e lgG4). Las regiones constantes usadas para los anticuerpos humanizados de la presente invención pueden ser regiones constantes de anticuerpos de cualquier isotipo. Una región constante derivada de la lgG1 humana se usa preferiblemente, aunque no se limita a la misma. Las FR derivadas de un anticuerpo humano, la cuales se usan para los anticuerpos humanizados, no se limita particularmente tampoco, y puede derivarse de un anticuerpo de cualquier isotipo.
El término "anticuerpo biespecífico" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo que tiene, en la misma molécula de anticuerpo, regiones variables que reconocen diferentes epítopos. Un anticuerpo biespecífico puede ser un
anticuerpo que reconoce dos o más diferentes antígenos, o un anticuerpo que reconoce dos o más diferentes epítopos en un mismo antígeno.
Además, los polipéptidos que incluyen fragmentos de anticuerpo pueden ser, por ejemplo, scFv-Fc (WO 2005/037989), dAb-Fc, y proteínas de fusión Fe. Los fragmentos de anticuerpos en tales polipéptidos pueden ser por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, scFvs (Nat Biotechnol. Septiembre de 2005; 23(9): 1126-36), anticuerpos de dominio (dAbs) (WO 2004/058821, WO 2003/002609), la región Fe puede usarse como un dominio de unión a FcRn humano cuando una molécula incluye una región Fe. Alternativamente, un dominio de unión a FcRn puede fusionarse a estas moléculas.
Además, las moléculas de unión al antígeno que son aplicables a la presente invención pueden ser o pueden comprender moléculas similares a anticuerpos (por ejemplo, una proteína de fusión de una región Fe de la presente invención con una molécula similar a anticuerpo). Una molécula similar a anticuerpo (molécula de andamio, molécula de péptido) es una molécula que puede exhibir funciones uniendo a una molécula objetivo (Current Opinión in Biotechnology (2006) 17: 653-658; Current Opinión in Biotechnology (2007) 18: 1-10; Current Opinión in Structural Biology (1997) 7: 463-469; Protein Science (2006) 15: 14-27), e incluyen, por ejemplo, DARPins (WO 2002/020565), Aficuerpo (WO 1995/001937), Avimer (WO 2004/044011; WO
2005/040229), y Adnectina (WO 2002/032925). Si estas moléculas similares a anticuerpos pueden unirse para dirigir las moléculas de una manera dependiente al pH o dependiente al calcio y/o tiene actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro, es posible facilitar la absorción del antigeno en las células por las moléculas de unión al antígeno, facilitar la reducción de la concentración del antígeno en plasma administrando las moléculas de unión al antígeno, y mejorar la farmacocinética de las moléculas de unión al antígeno, y aumentar el número de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno pueda unirse.
Además, la molécula de unión al antígeno puede ser una proteína que resulta de la fusión entre un dominio de unión a FcRn de la presente invención y una proteína de receptor que une a un objetivo que incluye un ligando, e incluye, por ejemplo, proteínas de fusión de TNFR-Fc, proteínas de fusión de ILIR-Fc, proteínas de fusión de VEGFR-Fc, y proteínas de fusión de CTLA4-FC (Nat Med. 2003, Jan; 9(1): 47-52; BioDrugs. (2006) 20(3): 151-60). Si estas proteínas de fusión de dominio de unión al receptor FcRns unen a una molécula objetivo incluyendo un ligando de una manera dependiente al pH o dependiente al calcio además de tener actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro, es posible facilitar la absorción del antígeno en las células por las moléculas de unión al antígeno, facilitar la reducción de la concentración del antígeno en plasma
administrando las moléculas de unión al antígeno, y mejorar la farmacocinética de las moléculas de unión al antígeno, y aumentar el número de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno pueda unirse. Una proteína de receptor se diseña y se modifica apropiadamente para incluir un dominio de unión de la proteína de receptor a un objetivo que incluye un ligando. Como se refirió en los ejemplos anteriormente (es decir proteínas de fusión de TNFR-Fc, proteínas de fusión de ILIR-Fc, proteínas de fusión de VEGFR-Fc y proteínas de fusión de CTLA4-Fc) una molécula soluble del receptor que comprende un dominio extracelular de estas proteínas de receptor que se requiere para unir a estos objetivos incluyendo ligandos es particularmente preferida. Tales moléculas del receptor diseñadas y modificadas se refieren como receptores artificiales en la presente invención. Los métodos para diseñar y modificar una molécula del receptor para construir una molécula del receptor artificial se conocen y de hecho son convencionales en la técnica.
Además, los anticuerpos de la presente invención pueden haber modificado las cadenas de azúcar. Los anticuerpos con las cadenas de azúcar modificadas incluyen, por ejemplo, anticuerpos con glicosilación modificada (WO 99/54342), anticuerpos que son deficientes en fucosa que se agrega a la cadena de azúcar (WO 00/61739; WO 02/31140; WO 2006/067847; WO 2006/067913), y anticuerpos que tienen cadenas de azúcar con GIcNAc de
bisección (WO 02/79255).
De acuerdo con el Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671, la actividad de unión FcRn humano de la IgG 1 humana intacta en el intervalo de pH ácido (pH 6.0) es KD 1.7 micromoles (microM), mientras que en el intervalo de pH neutro la actividad es casi indetectable. Así, en una modalidad preferida, la molécula de unión al antígeno de la presente invención incluye las moléculas de unión al antígeno en cuya actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH ácido es más potente que KD 1.7 micromoles y es idéntica o más potente en el intervalo de pH neutro que la de la IgG humana intacta. En una modalidad más preferida su actividad de unión para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro no es significativamente mayor comparada a la lgG1 intacta. Los valores de KD anteriores son determinados por el método descrito en el Journal of Immunology (2009) 182: 7663-7671 (inmovilizando la molécula de unión al antígeno sobre una matriz y cargando el FcRn humano como un analito).
La constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés) puede usarse como valor de la actividad de unión a FcRn humano. Sin embargo, la actividad de unión a FcRn humano de la IgG humana intacta tiene poca actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro (pH 7.4). Por consiguiente, es a menudo difícil calcular la actividad como la KD. Los métodos para evaluar si la actividad de unión a FcRn humano es mayor
que el de la IgG humana intacta a pH 7.4 incluyen métodos de evaluación comparando las intensidades de la respuesta de Biacore después de cargar los analitos a la misma concentración. Específicamente, cuando la respuesta después de cargar una matriz FcRn humano inmovilizada con una molécula de unión al antígeno a pH 7.4 es más potente que la respuesta después de cargar FcRn humano sobre una matriz inmovilizada con la IgG humana intacta a pH 7.4, la actividad de unión a FcRn humano de la molécula de unión al antígeno se juzga para ser mayor que la de la IgG humana intacta a pH 7.4.
En el contexto de la presente invención, el pH 7.0 puede usarse como el intervalo de pH neutro. Al usar el pH 7.0 como un pH neutro pueden facilitar la débil interacción entre el FcRn humano y el dominio de unión a FcRn. Como una temperatura empleada en la condición de ensayo, una afinidad de unión puede evaluarse a cualquier temperatura desde 10°Centígrados a 50°Centígrados. Preferiblemente, una temperatura que oscila desde 15°Centígrados a 40°Centígrados se emplea para determinar la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcRn humano y el FcRn humano. Preferiblemente, cualquier temperatura que oscila desde 20°Centígrados a 35°Centígrados, como cualquiera de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, y 35°C también se emplean para determinar la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcRn humano y el FcRn humano. Una temperatura a 25°C descrita en el EJEMPLO 5 del
documento WO2011/122011 es un ejemplo para la modalidad de esta invención. En una modalidad preferida, una interacción entre el FcRn humano y el dominio de unión a FcRn puede medirse a pH 7.0 y a 25°C como se describe en el EJEMPLO 5 del documento WO2011 /122011. La afinidad de unión de la molécula de unión al antígeno a FcRn humano puede medirse mediante Biacore como se describe en el EJEMPLO 5 del documento WO2011/122011.
Preferiblemente la afinidad de unión en los intervalos de pH neutro se mide a pH 7.4, que está cercana al pH en plasma in vivo (sangre). E pH 7.0 puede usarse como alternativa a pH 7.4 cuando es difícil para evaluar la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcRn humano y el FcRn humano debidos su baja afinidad a pH 7.4. Preferiblemente la afinidad de unión a intervalos de pH ácido se mide a pH 6.0, que está cercano al pH en el endosoma temprano in vivo. Como una temperatura empleada en la condición de ensayo, una afinidad de unión entre el dominio de unión a FcRn humano y el FcRn humano puede evaluarse en cualquier temperatura desde 10°C a 50°C. Preferiblemente, una temperatura desde 15°C a 40°C se emplea para determinar la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcRn humano y el FcRn humano. Más preferiblemente, cualquier temperatura desde 20°C a 35°C, como de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, y 35°C también se emplea para determinar la afinidad de unión entre el dominio de unión a FcRn
humano y el FcRn humano. Una temperatura a 25°C se describe por ejemplo, en el ejemplo 5 del documento WO2011 /122011 y en el EXMAPLES de esta invención.
Se usa una lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4 humana intacta preferiblemente como la IgG humana intacta de referencia que se comparará con las moléculas de unión al antígeno para su actividad de unión al FcRn humano o la actividad in vivo. Preferiblemente, una molécula de unión al antígeno que comprende el mismo dominio de unión al antígeno que como molécula de unión al antígeno de interés y una región Fe de IgG humana intacta como un dominio de unión a FcRn humano se usa como referencia. Más preferiblemente, una lgG1 humana intacta se usa como la IgG humana intacta de referencia para comparar su actividad de unión al FcRn humano o la actividad in vivo con la actividad de unión al FcRn humano o la actividad in vivo de una molécula de unión al antígeno de la presente invención.
Las condiciones usadas en el ensayo para la unión al antígeno o la actividad de unión a FcRn humano con excepción del pH se pueden seleccionar apropiadamente por los expertos en la técnica, y las condiciones no son particularmente limitadas. Por ejemplo, las condiciones de usar el amortiguador de MES a 37°C como se describe en el documento WO 2009/125825 pueden usarse para determinar la actividad. En otra modalidad, el amortiguador del Na-fosfato a 25°C como se describe en el Ejemplo 4 o 5 del documento WO2011 /122011 puede usarse para
determinar la actividad. Mientras tanto, la actividad de unión al antígeno y la actividad de unión a FcRn humano de la molécula de unión al antígeno pueden determinarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, al usar Biacore (GE Healthcare) o similares. Cuando el antígeno es un antígeno soluble, la actividad de una molécula de unión al antígeno para unir al antígeno soluble puede determinarse cargando el antígeno como un analito sobre una matriz inmovilizada con la molécula de unión al antígeno. Alternativamente, cuando el antígeno es un antígeno tipo membrana, la actividad de la molécula de unión al antígeno para unir al antígeno tipo membrana puede determinarse cargando la molécula de unión al antígeno como un analito sobre una matriz inmovilizada por antígeno. La actividad de unión a FcRn humano de una molécula de unión al antígeno puede determinarse cargando el FcRn humano o la molécula de unión al antígeno como un analito sobre una matriz inmovilizada con la molécula de unión al antígeno o el FcRn humano, respectivamente.
La presente invención proporciona una molécula de unión al antígeno de la presente invención que comprende un dominio de unión al antígeno y una región Fe humana que tienen una mayor actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH neutro. Preferiblemente, su actividad de unión para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro no es mayor significativamente. La actividad de unión a FcRn de tal molécula de unión al antígeno en
los intervalos de pH neutro es preferiblemente más potente que la KD de 3.2 micromoles. Preferiblemente, la actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro es más potente que 700 nanomolar, aún más preferiblemente más potente que 500 nanomolar y más preferiblemente, más potente que 150 nanomolar. Preferiblemente, la molécula de unión al antígeno tiene una mayor actividad de unión a FcRn humano en los intervalos de pH neutro y una actividad de unión al antígeno que es menor en el intervalo de pH ácido que en el intervalo de pH neutro o que es menor a una baja concentración de calcio que a una condición de alta concentración de calcio. Preferiblemente, la actividad de unión de tal molécula de unión al antígeno para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro no se mayor significativamente. La presente invención también proporciona una molécula de unión al antígeno de la presente invención que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión a FcRn humano, donde su actividad de unión a FcRn humano se aumenta en los intervalos de pH neutro, además donde la actividad de unión a FcRn humano en los intervalos de pH neutro es 28 veces más potente que el de una IgG humana intacta, preferiblemente, la actividad de unión a FcRn humano en los intervalos de pH neutro es 38 veces más potente que el de una IgG humana intacta. Preferiblemente, la actividad de unión de tal molécula de unión al antígeno para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro no se mayor significativamente. La
molécula de unión al antígeno de la presente invención con una mayor actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH neutro. Preferiblemente una actividad de unión para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro que no se aumenta significativamente de manera preferible, tiene actividad de unión al FcRn humano a pH 7.0 y a 25°C que es 28 veces más potente, preferiblemente 38 veces más potente, que la IgG humana intacta que la IgG humana intacta. Alternativamente, la actividad de unión a FcRn humano de la molécula de unión al antígeno con una mayor actividad de unión a FcRn a pH 7.0 y a 25°C es preferiblemente más potente que la KD de 3.2 micromoles. Más preferiblemente, la actividad de unión a FcRn a un pH 7.0 y a 25°Centígrados es más potente que 700 nanomolar, preferiblemente más potente que 500 nanomolar y más preferiblemente, más potente que 150 nanomolar.
La presente invención proporciona una molécula de unión al antígeno de la presente invención, que comprende un dominio de unión al antígeno y una región Fe humana de la presente invención, con una mayor actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH ácido y una actividad de unión para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro que no se aumentan significativamente. La presente invención también proporciona una molécula de unión al antígeno de la presente invención que comprende un dominio de unión al antígeno y un dominio de unión a FcRn humano que tienen una mayor actividad de unión a FcRn
humano en el intervalo de pH ácido y una actividad de unión para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro que no se aumentan significativamente con respecto a la actividad de unión para un ADA preexistente de una IgG intacta, donde la actividad de unión a FcRn humano en los intervalos de pH ácido está están en el intervalo de 2 veces a aproximadamente 100 veces más potente que la actividad de unión a FcRn humano de una IgG humana intacta. Preferiblemente, la actividad de unión a FcRn humano de la molécula de unión al antígeno de la presente invención en los intervalos de pH ácido es por lo menos 10 veces más potente que la actividad de unión a FcRn de una IgG humana intacta, más preferiblemente, la actividad de unión a FcRn humano en los intervalos de pH ácido es por lo menos 20 veces más potente que el de una IgG humana intacta. La molécula de unión al antígeno de la presente invención con una mayor actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH ácido por lo cual su actividad de unión para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro no se aumenta significativamente tiene actividad de unión a FcRn humano a pH 6.0 y a 25°C que es 10 veces más potente, preferiblemente veces 20 más potente, que la IgG humana intacta.
Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención pueden tener una mayor actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH neutro así como una actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido que es menor que la
actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro o una actividad de unión al antígeno en una baja concentración de calcio que es menor que la actividad de unión al antígeno a una condición de alta concentración de calcio. Los ejemplos específicos de tales moléculas de unión al antígeno incluyen los que tienen una mayor actividad de unión para FcRn humano a pH 7.4 que una Ig intacta, y cuya actividad de unión al antígeno es menor a pH 5.8 que a pH 7.4 que se presume para ser el pH in vivo del endosoma y del plasma tempranos, respectivamente. Una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno es menor a pH 5.8 que a pH 7.4 puede también referirse como una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno es más potente a pH 7.4 que a pH 5.8. El valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4), que es una relación de la constante de disociación (KD, por sus siglas en inglés) contra un antígeno a pH 5.8 y pH 7.4, es 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 50, 70, 80, 100, 500, 1000 o 10.000 preferiblemente 2 o mayor, más preferiblemente 10 o mayor, y aún más preferiblemente 40 o mayor. El límite superior del valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor, por ejemplo, 400, 1.000, o 10.000, siempre y cuando ia producción sea posible al usar las tecnologías de los expertos en la técnica.
También preferidos son las moléculas de unión al antígeno de la presente invención que tienen una mayor actividad de unión a FcRn en los intervalos de pH ácido, así como una baja actividad
de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido que en el intervalo de pH neutro o una menor actividad de unión al antígeno a una baja concentración de calcio que a una alta concentración de calcio. Preferiblemente, la actividad de unión de tal molécula de unión al antígeno para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro no se aumenta significativamente. Los ejemplos específicos de tales moléculas de unión al antígeno incluyen los que tienen una mayor actividad de unión para FcRn humano de pH 5.8 a pH 6.0 que una IgG, que se presume para ser el pH in vivo del endosoma temprano y cuya actividad de unión al antígeno es menor a pH 5.8 que a pH 7.4. Una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno es menor a pH 5.8 que a pH 7.4 puede también referirse como una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno sea más débil a pH 5.8 que a pH 7.4. Preferiblemente, una molécula de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión para FcRn en los intervalos de pH ácido tiene actividad de unión a FcRn más potente que la IgG humana intacta en el intervalo de pH neutro.
Los dominios modificados de unión a FcRn de la presente invención son aplicables a cualquier molécula de unión al antígeno, sin importar el tipo de antígeno objetivo.
Una molécula de unión al antígeno de la presente invención puede tener otras propiedades. Por ejemplo, puede ser una molécula de unión al antígeno agonística o antagónica, a condición de que tiene a) la mayor actividad de unión a FcRn
humano requerida a intervalos de pH neutro, o b) una mayor actividad de unión a FcRn humano en los intervalos ácidos y su actividad de unión para un ADA preexistente no se aumentan significativamente. Preferiblemente, la actividad de unión al antígeno de tal molécula de unión al antígeno es menor en el intervalo de pH ácido que en el intervalo de pH neutro. Las moléculas de unión al antígeno preferidas de la presente invención incluyen, por ejemplo, moléculas de unión al antígeno antagónicas. Tal molécula de unión al antígeno antagónica es comúnmente una molécula de unión al antígeno que inhibe la señalización intracelular mediada por receptor bloqueando la unión entre el ligando (agonista) y el receptor.
Mientras tanto, una molécula de unión al antígeno de la presente invención puede reconocer cualquier antígeno. Los antígenos específicos reconocidos por una molécula de unión al antígeno de la presente invención incluyen, por ejemplo, las proteínas de receptor descritas antes (receptores unidos a membrana y receptores solubles), antígenos de membrana como marcadores de superficie celular, y antígenos solubles como citocinas. Tales antígenos incluyen, por ejemplo, los antígenos descritos a continuación.
Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención que comprende un dominio de unión al antígeno pueden usarse a diferencia del pH como una diferencia ambiental entre el plasma y el endosoma para afinidad de unión diferenciada de una molécula
de unión al antígeno a un antígeno en el plasma y el endosoma (unión potente en el plasma y débil unión al endosoma). Puesto que la diferencia ambiental entre el plasma y el endosoma no se limita a una diferencia del pH, la propiedad de unión dependiente al pH en la unión de una molécula de unión al antígeno a un antígeno puede ser sustituida usando otros factores cuya concentración sea diferente dentro del plasma y del endosoma, como por ejemplo, la concentración de calcio ionizado. Tal factor se puede también usarse para generar un anticuerpo que una al antígeno dentro del plasma pero disocia el antígeno dentro del endosoma. Por lo tanto, la presente invención también incluye una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn humano, cuya actividad de unión a FcRn humano se aumenta en los intervalos de pH neutro cuya actividad de unión al antígeno en el endosoma es menor en comparación con el plasma. Preferiblemente, la actividad de unión de estas moléculas de unión al antígeno en los intervalos de pH neutro para un ADA preexistente no se aumenta significativamente. La actividad de unión a FcRn humano de tal molécula de unión al antígeno está en el plasma más potente que la de la IgG humana intacta, y además el dominio de unión al antígeno de tal molécula de unión al antígeno tiene una menor afinidad para el antígeno dentro del endosoma que en el plasma. Preferiblemente, el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido es
a menos de que, en el intervalo de pH neutro (dominio de unión al antígeno dependiente al pH) o un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno es menor con una baja concentración de calcio que bajo condición de alta concentración de calcio (dominio de unión al antígeno dependiente de concentración de calcio). La presente invención también incluye una molécula de unión al antígeno con un dominio de unión a FcRn humano, que tiene una mayor actividad de unión a FcRn humano en los intervalos de pH ácido, y dicha molécula de unión al antígeno comprende además un dominio de unión al antígeno que tiene una menor afinidad para el antígeno dentro del endosoma que en el plasma, de tal manera que la actividad de unión a FcRn humano de la molécula de unión al antígeno en el endosoma es más potente que la de la IgG humana intacta, y la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno en el endosoma es más potente que en el plasma. Preferiblemente, la actividad de unión de éstas moléculas de unión al antígeno en los intervalos de pH neutro para un ADA preexistente no se aumentan significativamente. Preferiblemente, el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido es a menos de que, en el intervalo de pH neutro (dominio de unión al antígeno dependiente al pH) o un dominio de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno es menor con una baja concentración de calcio que bajo una condición de alta
concentración de calcio (dominio de unión al antígeno dependiente de concentración de calcio).
Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención facilitan la absorción del antígeno en las células, en particular cuando las moléculas de unión al antígeno de la presente invención comprenden un dominio de unión al antígeno que es un dominio de unión al antígeno dependiente al pH o un dominio de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio. Las moléculas de unión al antígeno se disocian fácilmente del antígeno en el endosoma, y después son liberadas al exterior de la célula mediante la unión al FcRn humano. Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención se presumen para unir fácilmente a un antígeno en el plasma de nuevo. Así, por ejemplo, cuando la molécula de unión al antígeno de la presente invención es una molécula de unión al antígeno de neutralizante, la reducción de la concentración del antígeno en plasma puede ser facilitada administrando la molécula.
Dominio de unión al antígeno
Preferiblemente, el dominio de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno tiene una afinidad disminuida para el antígeno a un pH ácido o a baja concentración de ion calcio. Más preferiblemente, el dominio de unión al antígeno es un dominio de unión al antígeno dependiente al pH o un dominio de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio ionizada descrita en la presente.
A) Dominio de unión al antígeno dependiente al pH
Además, la molécula de unión al antígeno de la presente invención comprende preferiblemente un dominio de unión al antígeno dependiente al pH cuya actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido es a menos de que, en el intervalo de pH neutro. Dicha molécula de unión al antígeno tiene preferiblemente una menor actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido que en el intervalo de pH neutro. La relación de actividad de unión no está limitado, a condición de que la actividad de unión al antígeno sea menor en el intervalo de pH ácido que en el intervalo de pH neutro. En una modalidad preferida, las moléculas de unión al antígeno de la presente invención incluyen moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a pH 7.4 es dos veces o mayor que a pH 5.8, preferiblemente la actividad de unión al antígeno a pH 7.4 es diez veces o mayor que a pH 5.8. En una modalidad aún más preferida, las moléculas de unión al antígeno de la presente invención incluyen moléculas de unión ai antígeno cuya actividad de unión al antígeno a pH 7.4 es 40 veces o mayor que a pH 5.8.
Los ejemplos específicos de moléculas de unión al antígeno las de la presente invención incluyen las modalidades descritas en el documento WO 2009/125825. En una modalidad preferida, la molécula de unión al antígeno de la presente invención que comprende un dominio de unión al antígeno dependiente al pH tiene una actividad de unión al antígeno a pH 5.8 que es menor
que a pH 7.4, donde el valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4), el cual es una relación de la KD para el antígeno a pH 5.8 y que a pH 7.4, es preferiblemente 2 o mayor, preferiblemente 10 o mayor, y aún más preferiblemente 40 o mayor. El límite superior del valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor, por ejemplo, 400, 1.000, o 10,000, siempre y cuando la producción sea posible al usar las tecnologías de los expertos en la técnica.
En otro preferido modalidad, la molécula de unión al antígeno de la presente invención cuya actividad de unión al antígeno a pH 5.8 es menor que a pH 7.4, tiene valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4), la cual es una relación de la KD para el antígeno a pH 5.8 y la KD para el antígeno a pH 7.4, que es 2 o mayor, más preferiblemente 5 o mayor, aún más preferiblemente 10 o mayor, y aún más preferiblemente 30 o mayor. El límite superior del valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor, por ejemplo, 50, 100, o 200, a condición de que la producción pueda usar las tecnologías de los expertos en la técnica.
Las condiciones con excepción del pH en el cual la actividad de unión al antígeno, la actividad de unión para un ADA preexistente y la actividad de unión a FcRn humano se miden pueden seleccionarse apropiadamente por los expertos en la técnica, y tales condiciones no están particularmente limitadas; sin embargo, las mediciones pueden realizarse, por ejemplo, bajo
condiciones del amortiguador de MES y a 37°C, como se describe en los Ejemplos. Además, la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno puede determinarse mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, al usar Biacore T100 (GE Healthcare) o similares, como se describe en los Ejemplos.
Los métodos para reducir (deteriorar) la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menor que el de la actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro (métodos para conferir la capacidad de unión dependiente al pH) no son métodos particularmente limitados y adecuados se conocen por el experto en la técnica. El documento WO 2009/125825, por ejemplo, describe los métodos para reducir (deteriorar) la actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menos de que, en el intervalo de pH neutro sustituyendo la histidina para un aminoácido en el dominio de unión al antígeno o insertando la histidina en el dominio de unión al antígeno. Es además conocido que un anticuerpo se puede conferir con una actividad de unión al antígeno dependiente al pH sustituyendo la histidina para un aminoácido en el anticuerpo (FEBS Letter (1992) 309(1): 85-88). Otros métodos adecuados incluyen métodos para sustituir los aminoácidos no naturales para aminoácidos en el dominio de unión al antígeno o insertar aminoácidos no naturales en el dominio de unión al antígeno. Se conoce que pKa puede
ajustarse artificialmente al usar aminoácidos no naturales (Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 34; Chem Soc Rev. 2004 Sep 10, 33 (7): 422-30; Amino Acids. (1999) 16(3-4): 345-79). Cualquier aminoácido no natural puede usarse en el contexto de la presente invención. De hecho, es posible usar aminoácidos no naturales conocidos por los expertos en la técnica.
En una modalidad preferida, la molécula de unión al antígeno de la presente invención que comprende un dominio de unión al antígeno con una actividad de unión al antígeno que es menor en el intervalo de pH ácido que en el intervalo de pH neutro, incluye moléculas de unión al antígeno en las cuales por lo menos un aminoácido en la molécula de unión al antígeno se sustituye con histidina o un aminoácido no natural, y/o en las cuales por lo menos se ha insertado una histidina o un aminoácido no natural. El sitio en el cual se introduce la histidina o la mutación no natural del aminoácido no está particularmente limitado y puede ser cualquier sitio juzgado adecuado por el experto en la técnica, a condición de que la actividad de unión al antígeno resultante en el intervalo de pH ácido es más débil que en el intervalo de pH neutro (el valor de la KD (en el intervalo de pH ácido)/KD (en el intervalo de pH neutro) es mayor o el valor de la KD (en el intervalo de pH ácido)/KD (en el intervalo de pH neutro) es mayor) con respecto a la sustitución anterior. Los ejemplos incluyen regiones variables y las CDR de un anticuerpo en el caso la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo. El
número de aminoácidos que se sustituirán con histidina o aminoácido no natural y el número de aminoácidos que se insertarán pueden determinarse apropiadamente por los expertos en la técnica. Un aminoácido puede sustituirse con histidina o aminoácido no natural, o un aminoácido puede insertarse, o dos o más aminoácidos pueden sustituirse con histidina o aminoácidos no naturales, o dos o más aminoácidos pueden insertarse. Por otra parte, aparte de las sustituciones de la histidina o aminoácido no natural o la inserción de la histidina o del aminoácido no natural, la supresión, la adición, la inserción, y/o la sustitución y similares de otros aminoácidos pueden también realizarse simultáneamente. Las sustituciones de la histidina o del aminoácido no natural o la inserción de la histidina o del aminoácido no natural pueden realizarse aleatoriamente el usar un método como escaneo de histidina, que usa histidina en vez de alanina en el escaneo de alanina que se conoce por los expertos en la técnica. Las moléculas de unión al antígeno cuya KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) o KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) es mayor en comparación antes de que la mutación pueda seleccionarse de las moléculas de unión al antígeno en las cuales la histidina o la mutación del aminoácido no natural se ha introducido aleatoriamente.
Preferiblemente, se mantiene la actividad de unión del dominio de unión al antígeno a pH neutro (es decir, pH 7.4). Cuando la actividad de unión al antígeno de tal molécula de unión
al antígeno antes de la histidina o de la mutación del aminoácido no natural se ajusta como 100%, la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno a pH 7.4 después de la histidina o de la mutación del aminoácido no natural es por lo menos 10% o más, preferiblemente 50% o más, más preferiblemente 80% o más, y aún más preferiblemente 90% o más. La actividad de unión al antígeno a pH 7.4 después de la histidina o de la mutación del aminoácido no natural puede ser más potente que la actividad de unión al antígeno a pH 7.4 antes de histidina o de la mutación del aminoácido no natural. Cuando la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno es disminuida debido a la sustitución o inserción de la histidina o aminoácido no natural, la actividad de unión al antígeno puede ajustarse introduciendo la sustitución, supresión, adición, y/o inserción y similares de uno o más aminoácidos en la molécula de unión al antígeno de modo que la actividad de unión al antígeno llegue a ser equivalente a la de la sustitución o la inserción de la histidina anterior.
En el contexto de la presente invención, cuando la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo, los sitios posibles de la sustitución de histidina o aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, secuencias de CDR y secuencias responsables de la estructura de CDR de un anticuerpo, incluyendo, por ejemplo, los sitios descritos en el documento WO 2009/125825.
Además, la presente invención proporciona moléculas de
unión al antigeno que tienen sustitución de histidina o de un aminoácido no natural por lo menos un aminoácido en uno de los siguientes sitios
Cadena pesada: H27, H31, H32, H33, H35, H50, H58, H59, H61, H62, H63, H64, H65, H99, H100b, y H102
Cadena ligera: L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, L90, L92, y L94 H32, H61, L53, L90, y L94 de estos sitios de alteración, se presumen para ser sitios de alteración altamente generales. Las posiciones del aminoácido se muestran de acuerdo con la numeración de Kabat (Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). El sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se refiere a un residuo en el dominio variable (aproximadamente 1-107 residuos de la cadena ligera y 1-113 residuos de la cadena pesada). Las combinaciones específicamente preferidas de sitios para las sustituciones de histidina o del aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, la combinación de H27, H31, y H35; la combinación de H27, H31, H32, H35, H58, H62, y H102; la combinación de L32 y L53; y la combinación de L28, L32, y L53. Además, las combinaciones preferidas de sitios de sustituciones en las cadenas pesadas y ligeras incluyen, por ejemplo, la combinación de H27, H31, L32, y L53.
Cuando el antigeno es un receptor IL-6 (por ejemplo, receptor IL-6 humana), los sitios de alteración preferidos incluyen
pero no se limitan particularmente a los siguientes:
Cadena pesada: H27, H31, H32, H35, H50, H58, H61, H62,
H63, H64, H65, H100b, y H102
Cadena ligera: L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92, y L94
Las combinaciones específicamente preferidas de sitios para la sustitución de histidina o del aminoácido no natural incluyen, por ejemplo, la combinación de H27, H31, y H35; la combinación de H27, H31, H32, H35, H58, H62, y H102; la combinación de L32 y L53; y la combinación de L28, L32, y L53. Además, las combinaciones preferidas de sitios de sustitución en las cadenas pesadas y ligeras incluyen, por ejemplo, la combinación de H27, H31 , L32, y L53.
La histidina o los aminoácidos no natural puede sustituirse en una o más de las posiciones mencionadas anteriormente.
Alternativamente, la molécula de unión al antígeno de la presente invención puede comprender una región constante de anticuerpo que se alteró de modo que la actividad de unión al antígeno a pH 5.8 es menor que la de a pH 7.4. Los métodos para alterar las regiones constantes de anticuerpos contenidas en las moléculas de unión al antígeno se conocen y de hecho son convencionales para el experto en la técnica. Ejemplos específicos de las regiones constantes de anticuerpos después de la alteración incluyen las regiones constantes descritas en los Ejemplos en el documento WO 2009/125825 (SEC ID NOs: 11, 12,
13, y 14).
Mientras tanto, se conocen los métodos para alterar una región constante de anticuerpo incluyen, por ejemplo, métodos para evaluar varios isotipos de región constante (lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4) y seleccionar isotipos que reducen la actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido (aumentar el velocidad de disociación en el intervalo de pH ácido). Tales métodos también incluyen métodos para reducir la actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido (aumentando el velocidad de disociación en el intervalo de pH ácido) introduciendo sustituciones de aminoácidos en las secuencias de aminoácido de isotipos tipo silvestre (secuencias de aminoácidos de lgG1, lgG2, lgG3, o lgG4 tipo silvestre). La secuencia de región de bisagra en la región constante de anticuerpo es considerablemente diferente entre los isotipos (lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4), y la diferencia en la secuencia de aminoácido de región de bisagra tiene un gran impacto en la actividad de unión al antígeno. Así, es posible seleccionar un isotipo apropiado para reducir la actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido (aumentar el velocidad de disociación en el intervalo de pH ácido) dependiendo del tipo de antígeno o de epítopo. Además, puesto que la diferencia en la secuencia de aminoácido de la región de bisagra tiene un gran impacto en la actividad de unión al antígeno, los sitios de sustitución de aminoácido preferidos en las secuencias de aminoácido de isotipos tipo silvestre se
presumen por estar dentro de la región de bisagra.
Los métodos descritos antes pueden usarse para producir moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido es reducida (debilitada) a menos que en el intervalo de pH neutro (moléculas de unión al antígeno que se unen de una manera dependiente al pH) mediante la sustitución de aminoácido o la inserción de las moléculas de unión al antígeno que no tienen tal propiedad. Otros métodos incluyen métodos para directamente obtener moléculas de unión al antígeno que tienen la propiedad descrita antes. Por ejemplo, los anticuerpos que tienen una propiedad deseada de interés pueden seleccionarse directamente mediante evaluación al usar la unión al antígeno dependiente al pH como un indicador de los anticuerpos obtenidos al inmunizar animales (ratones, ratas, hámsteres, conejos, ratones transgénicos de ¡nmunoglobulina humana, ratas transgénicas de inmunoglobulina humana, conejos transgénicos de inmunoglobulina humana, llamas, camellos, etc.) con un antígeno. Los anticuerpos pueden generarse mediante tecnología de hibridoma o tecnología de clonación de células B (Bernasconi et al, Science (2002) 298, 2199-2202; WO2008/081008) que son métodos conocidos por los expertos en la técnica, pero no se limitan a los mismos. Alternativamente, los anticuerpos que tienen la propiedad de interés pueden seleccionarse directamente mediante evaluación al usar la unión al antígeno dependiente al pH como un indicador
de una biblioteca que presenta el dominio de unión al antígeno in vitro. Tal biblioteca incluye la biblioteca sin tratamiento humana, la biblioteca inmunizada a partir del animal no humano y la biblioteca semisintética humana y la biblioteca sintética que son bibliotecas conocidas por los expertos en la técnica (Methods Mol Biol. 2002; 178: 87-100; J Immunol Methods. Junio de 2004; 289(1-2): 65-80; y Expert Opin Biol Ther. Mayo de 2007; 7(5): 763-79), pero no se limitan a los mismos. Sin embargo, los métodos no se limitan particularmente a estos ejemplos.
B) Dominio de Unión al Antígeno Dependiente de Calcio Ionizado
En otra modalidad preferida, la molécula de unión al antígeno de la presente invención comprende un dominio de unión al antígeno dependiente del ion de calcio. La actividad de unión al antígeno de tal molécula de unión al antígeno depende de la concentración de calcio, por lo cual la actividad de unión al antígeno a una baja concentración de calcio es menor que la de a una alta concentración de calcio.
Preferiblemente, la actividad de unión al antígeno incluye la actividad de unión al antígeno en una concentración calcio ionizada de 0.5 a 10 micromoles. Las concentraciones de calcio ionizadas más preferibles incluyen la concentración de calcio ionizado en el endosoma temprano in vivo. Específicamente, la actividad de unión al antígeno incluye la actividad e 1 a 5 micromoles. Mientras tanto, la actividad de unión al antígeno de
una molécula de unión al antígeno a una alta concentración de calcio no está particularmente limitada, a condición de que la actividad de unión al antígeno esté a una concentración de calcio ionizado de 100 micromoles a 10 mM. Preferiblemente, la actividad de unión al antígeno incluye la actividad de unión al antígeno en una concentración de calcio ionizado de 200 micromoles a 5 mM. Preferiblemente, una baja concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 0.1 a 30 micromoles, y una alta concentración de calcio es una concentración de calcio ionizado de 100 micromoles a 10 mM.
Preferiblemente, la baja concentración de calcio es una concentración intraendosomal de calcio ionizado, y la alta concentración de calcio es una concentración plasmática de calcio ionizado. Más específicamente, las moléculas de unión al antígeno que comprenden dicho dominio de unión al antígeno dependiente de calcio incluyen las moléculas de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno en la concentración de calcio ionizado en el endosoma temprano in vivo (una baja concentración de calcio de como 1 a 5 micromoles) es menor que la de la concentración de calcio ionizado en plasma in vivo (una alta concentración de calcio de como 0.5 a 2.5 mM).
Con respecto a la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno a una baja concentración de calcio es menor que la de una alta concentración de calcio, no hay limitación en esta diferencia en la
actividad de unión al antígeno, a condición de que la actividad de unión al antígeno a una baja concentración de calcio sea menor que la de una alta concentración de calcio. Es incluso aceptable que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno es solamente ligeramente menor bajo una condición de baja concentración de calcio.
En una modalidad preferida, para una molécula de unión al antígeno de la presente invención cuya actividad de unión al antígeno a una baja concentración de calcio (baja Ca) es menor que la de una alta concentración de calcio (alta Ca), el valor de la KD (baja Ca)/KD (alta Ca), que es la relación de KD entre la baja y la alta concentración de calcio, es 2 o más, preferiblemente el valor de la KD (baja Ca)/KD (alta Ca) es 10 o más, y más preferiblemente el valor de la KD (baja Ca)/KD (alta Ca) es 40 o más. El límite superior del valor de la KD (baja Ca)/KD (alta Ca) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor como 400, 1,000, y 10,000 a condición de que puede ser producido mediante las técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
En otra modalidad preferida, para una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno dependiente de calcio cuya actividad de unión al antígeno a una baja concentración de calcio es menor que la de una alta concentración de calcio, el valor de la KD (baja Ca)/KD (alta Ca), que es la relación de la KD para un antígeno entre una condición
de baja concentración de calcio y un pH 7.4, es 2 o más, preferiblemente el valor de la KD (baja Ca)/KD (alta Ca) es 5 o más, más preferiblemente el valor de la KD (baja Ca)/KD (alta Ca) es 10 o más, y preferiblemente el valor de la KD (baja Ca)/KD (alta Ca) sigue siendo 30 o más. El límite superior del valor de la KD (baja Ca)/KD (alta Ca) no está particularmente limitado, y puede ser cualquier valor como 50, 100, y 200 mientras pueda ser producido mediante las técnicas conocidas por los expertos en la técnica.
La actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno puede determinarse mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las condiciones apropiadas además de la concentración de calcio ionizado pueden seleccionarse por los expertos en la técnica. La actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno puede evaluarse al usando la KD (disociación constante), la KD aparente (constante de disociación aparente), la KD de velocidad de disociación (velocidad de disociación), la KD aparente (disociación aparente: velocidad de disociación aparente), o similares. Pueden determinarse mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, al usar la gráfica de Biacore (GE Healthcare), de Scatchard, FACS, o similares.
Las moléculas de unión al antígeno que se valorarán por el método de valoración de la presente invención pueden ser cualquiera de las moléculas de unión al antígeno. Es posible
evaluar, por ejemplo, moléculas de unión al antígeno que tienen una secuencia natural o moléculas de unión al antígeno que tienen una secuencia de aminoácido con una sustitución. Las moléculas de unión al antígeno que comprenden un dominio de unión al antígeno dependiente del ion de calcio que se evaluarán mediante el método de valoración de la presente invención pueden prepararse mediante cualquier método. Es posible usar, por ejemplo, anticuerpos preexistentes, bibliotecas preexistentes (bibliotecas de fagos, etc.), y anticuerpos y bibliotecas preparadas a partir de células B de animales inmunizados o hibridomas preparados inmunizando animales, anticuerpos o bibliotecas obtenidas introduciendo aminoácidos capaces de quelatar el calcio (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico) o mutaciones de aminoácido no natural en tales anticuerpos o bibliotecas (bibliotecas con alto contenido de aminoácidos no naturales o de los aminoácidos capaces de quelatar el calcio (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico), bibliotecas introducidas con mutaciones de aminoácido no natural o mutaciones con aminoácidos capaces de quelatar el calcio (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico) en los sitios específicos, o similares) o semejantes.
Una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno bajo una condición de baja concentración de calcio es menor que la bajo una condición de alta concentración de calcio puede evaluarse, identificarse y aislarse fácilmente el usar
métodos convencionales en la técnica (ver, por ejemplo, el número de Solicitud PCT PCT/JP2011/077619. Los ejemplos de tales métodos de valoración incluyen la etapa de ensayar una molécula de unión al antígeno que tiene por lo menos una función seleccionada de:
(i) la función para promover la absorción de un antigeno en las células;
(ii) la función de unir a un antígeno dos o más veces;
(iii) la función para promover la reducción de la concentración del antígeno en plasma; y
(iv) la función de la retención de plasma superior.
Específicamente, la presente invención proporciona métodos para evaluar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión al antígeno dependiente del ion de calcio, que comprende las etapas de:
(a) determinar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una condición de baja concentración de calcio;
(b) determinar la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno bajo una condición de alta concentración de calcio; y
(c) seleccionar una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno bajo la condición de baja concentración de calcio es menor que bajo la condición de alta concentración de calcio.
Un método para producir una molécula de unión al antígeno con un dominio de unión al antígeno dependiente del ion de calcio es por ejemplo, un método que comprende las etapas de:
(a) determinar la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno bajo una condición de baja concentración de calcio;
(b) determinar la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno bajo una condición de alta concentración de calcio; y
(c) seleccionar una molécula de unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno bajo la condición de baja concentración de calcio es menor que la de bajo la condición de alta concentración de calcio.
Otro método para producir una molécula de unión al antígeno con un dominio de unión al antígeno dependiente del ion de calcio es el método que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto con un antígeno con una molécula de unión al antígeno o una biblioteca de las moléculas de unión al antígeno bajo una condición de alta concentración de calcio;
(b) obtener una molécula de unión al antígeno que une al antígeno en la etapa (a);
(c) permitir que la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (b) se coloque bajo una condición de baja concentración de calcio;
(d) obtener una molécula de unión al antígeno cuya
actividad de unión al antígeno en la etapa (c) es menor que la actividad para la selección en la etapa (b);
(e) obtener un gen que codifica la molécula de unión al antígeno obtenida en la etapa (d); y
(f) producir la molécula de unión al antígeno al usar el gen obtenido en la etapa (e).
Las etapas (a) a (e) pueden repetirse dos o más veces. Así, la presente invención proporciona los métodos que además comprenden la etapa de repetir las etapas (a) a (e) dos o más veces en los métodos descritos antes. El número de repeticiones de las etapas (a) a (e) no está particularmente limitado; sin embargo, el número es generalmente diez o menos.
Las moléculas de unión al antígeno que se usan en los métodos de producción de la presente invención pueden prepararse mediante cualquier método convencional. Por ejemplo, es posible usar anticuerpos preexistentes, bibliotecas preexistentes (bibliotecas de fagos y similares), anticuerpos y bibliotecas que se preparan a partir de hibridomas obtenidos inmunizando animales o de células B de animales, anticuerpos y bibliotecas inmunizados preparados introduciendo la histidina o mutaciones del aminoácido no natural en los anticuerpos y las bibliotecas descritos antes (bibliotecas con alto contenido de histidina o de aminoácido no natural, bibliotecas introducidas con histidina o aminoácido no natural en los sitios específicos, y similares) y semejantes.
Métodos adicionales para evaluar tales moléculas de unión al antígeno dependiente del ion de calcio o dominios de unión al antígeno dependiente del ion de calcio se describen en el Número de Solicitud PCT PCT/JP2011 /O 77619.
Antígenos
Los antígenos que son reconocidos por las moléculas de unión al antígeno de la presente invención, como los anticuerpos de la presente invención, no están particularmente limitados. Tales moléculas de unión al antígeno de la presente invención pueden reconocer cualquier antígeno. Los ejemplos específicos de un antígeno que es reconocido por la molécula de unión al antígeno de la presente invención incluyen pero no se limitan a: 17-IA, 4-1 BB, 4Dc, 6-ceto-PGF1 a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, Receptor de Adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, Activina, Activina A, Activina AB, Activina B, Activina C, Activina RIA, Activina RIA ALK-2, Activina RIB ALK-4, Activina RIIA, Activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM 12 , ADAM15, ADAM 17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, Adresinas, adiponectina , ribosilciclasa-1 ADP, aFGF, AGE, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, alérgeno, alfal-antiquimiotripsina, alfal-antitripsina, sinucleína alfa, antagonista alfa-V/beta-1 , aminina, amilina, beta-amiloide, región variable de cadena pesada de inmunoglobulina amiloide, región variable de cadena ligera de inmunoglobulina amiloide, Andrógeno, ANG, angiotensinógeno, Ligando de angiopoyetina-2, anti-ld, antitrombinalll,, Ántrax, APAF-1, APE, APJ, apo A1, apo
suero amiloide A, Apo-SAA, APP, ABRIL, AR, ARC, ART, Artemina, ASPÁRTICO, factor natriurético atrial, péptido natriurético atrial, péptidos natriuréticos atriales A, péptidos natriuréticos atriales B, péptidos natriuréticos atriales C, av/b3 integrina, Axl, B7-1, B7-2, B7-H, BACE, BACE-1, antígeno protector de Bacillus anthracis, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bel, BC A, BDNF, b-ECGF, beta-2-microglobulina, betalactamasa, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CA , BLK, estimulador del linfocito B (BlyS, por sus siglas en inglés), BMP, BMP-2 (BMP-2a), BMP-3 (Osteogenina) , BMP-4 (BMP-2b), BMP-5, BMP-6 (Vgr-1), BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BMPR-II (BRK-3), BMPs, BOK, Bombesina, factor neurotrófico derivado del hueso, hormona de crecimiento bovino, BPDE, BPDE-ADN, BRK-2, BTC, molécula de adhesión de célula e linfocito B, C10, inhibidor de Cl, C1q, C3, C3a, C4, C5, C5a(complemento 5a), CA125, CAD-8, Cadherin-3, calcitonina, cAMP, anhidrasa carbónica-IX, antígeno carcinoembriónico (CEA, por sus siglas en inglés), antígeno asociado a carcinoma, Cardiotrofina-1 , Catepsina A, Catepsina B, Catepsina C/DPPI, Catepsina D, Catepsina E, Catepsina H, Catepsina L, Catepsina O, Catepsina S, Catepsina V, Catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1/I-309, CCL11/Eotaxina, CCL12/MCP-5, CCL13/MCP-4, CCL14/HCC-1, CCL15/HCC-2, CCL16/HCC-4, CCL17/TARC, CCL18/PARC, CCL19/ELC, CCL2/MCP-1, CCL20/MIP-3-alfa, CCL21/SLC,
CCL22/MDC, CCL23/MPIF-1, CCL24/Eotaxin-2, CCL25/TECK, CCL26/Eotaxina-3, CCL27/CTACK, CCL28/MEC, CCL3/M 1 P-1 -alfa, CCL3LI/LD-78-beta, CCL4/MIP-l-beta, CCL5/RANTES, CCL6/C10, CCL7/MCP-3, CCL8/MCP-2, CCL9/10/MTP-1 -gamma, CCR, CCR1, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1 , CD10, CD105, CD11a, CD11b, CD11c, CD123, CD13, CD137, CD138, CD14, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD15, CD152, CD16, CD164, CD18, CD19, CD2, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD26, CD27L, CD28, CD29, CD3, CD30, CD30L, CD32, CD33 (proteínas p67), CD34, CD37, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD49b, CD5, CD51, CD52, CD54, CD55, CD56, CD6, CD61 , CD64, CD66e, CD7, CD70, CD74, CD8, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD105, CD158a, CEA, CEACAM5, CFTR, cGMP, CGRP receptor, CINC, CKb8-1, Claudin18, CLC, toxina de Clostridium botulinum, toxina de Clostridium difficile, toxina de Clostridium perfringens, c-Met, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, factor de complemento 3 (C3), factor de complemento D, globulina de unión a corticoesteroide, receptor del factor estimulante de colonias-1, COX, C-Ret, CRG-2, CRTH2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1/Fractalkine, CX3CR1, CXCL, CXCL1/Gro-alfa, CXCL10, CXCL11 /l-TAC, CXCL12/SDF-l-alfa/beta, CXCL13/BCA-1 , CXCL14/BRAK, CXCL15/Lungkine, CXCL16, CXCL16, CXCL2/Gro-beta CXCL3/Gro-gamma, CXCL3, CXCL4/PF4, CXCL5/ENA-78, CXCL6/GCP-2, CXCL7/NAP-2, CXCL8/IL-8, CXCL9/Mig,
CXCLIO/I P-10, CXCR, CXCR1 , CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, cistatina C, antígeno asociado a tumor con citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, factor acelerador de degradación, ligando de proteína 4 similar a Delta, (IGF-1 en cerebro), Dhh, DHICA oxidasa, Dickkopf-1, digoxina, Dipeptidil peptidasa IV, DKI, DNAM-1, Dnasa, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), proteína 7 que contiene el dominio similar a EGF, Elastasa, elastina, AME, EMMPRIN, ENA, ENA-78, Endosialina, receptor de endotelina, endotoxina, Enkefalinasa, eNOS, EoT, Eotaxina, Eotaxina-2, eotaxinia, EpCAM, Ephrina B2/EphB4, receptor de la tirosina cinasa Epha2, receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, por sus siglas en inglés), receptor ErbB2, receptor de la tirosina cinasa ErbB3, ERCC, eritropoyetina (EPO, por sus siglas en inglés), receptor de la eritropoyetina, E-selectina, ET-1, Exodus-2, proteína F de RSV, F10, F11, F12, F13, F5, F9, factor la, factor IX, factor Xa, factor VII, factor VIII, factor VI Me, Fas, FcalfaR, FcepsilonRI, Fcgammallb, FcgammaRI, FcgammaRlla, FcgammaRllla, FcgammaRlllb, FcRn, FEN-1, Ferritina, FGF, FGF-19, FGF-2, receptor FGF-2, FGF-3, FGF-8, FGF-ácido, FGF-básico, FGFR, FGFR-3, Fibrina, proteína de activación de fibroblasto (FAP, por sus siglas en inglés), factor de crecimiento de fibroblasto, factor de crecimiento de fibroblasto-10, fibronectina, FL, FLIP, Flt-3, ligando FLT3, receptor de Folato, hormona estimuladora de folículo (FSH, por sus siglas en inglés),
Fractalcina (CX3C), cadena pesada libre, cadena ligera libre, FZD1, FZD10, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, G-CSF, G-CSF receptor, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-15 (MIC-1), GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14/CDMP-1), GDF-6 (BMP-13/CDMP-2), GDF-7 (BMP-12/CDMP-3), GDF-8 (Miostatina), GDF-9, GDNF, Gelsolina, GFAP, GF-CSF, GFR-alfa1, GFR-alfa2, GFR-alfa3, GF-beta1, GF-betal, glicoproteína envolvente de gH, GITR, Glucagón, receptor de glucagón, Receptor del péptido 1 similar a Glucagón, Glut 4, Glutamato carboxipeptidasa II, receptores de la hormona de la gly-coproteína, glicoproteína llb/llla (GP llb/llla), Glypican-3, GM-CSF, receptor de GM-CSF, gpl30, gpl40, gp72, granulocito-CFS (G-CSF), GRO/MGSA, factor de liberación de la hormona de crecimiento, GRO-beta, GRO-gamma, H. pylori, Hapteno (NP-cap o NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCC 1, glicoproteína envolvente de HCMV gB, HCMV UL, factor de crecimiento hemopoyético (HGF, por sus siglas en inglés), Hep B gp120, cofactor de heparina II, factor de crecimiento hepático, antígeno protector de Bacillus anthracis, glicoproteína del virus E2 de la hepatitis C, Hepatitis E, Hepcidina, Herí, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), glicoproteína gB del virus del herpes simple (HSV, por sus siglas en inglés), HGF, HGFA, antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA, por sus siglas en inglés), proteínas evolventes del VIH como GP120, bucle HIV MIB gp 120 V3, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HMGB-1, HRG, Hrk,
HSP47, Hsp90, glicoproteína HSV gD, miosina cardiaca humana, citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés), hormona de crecimiento humano (hGH, por sus siglas en inglés), albúmina de suero humano, activador plasminógeno tipo tejido humano (t-PA, por sus siglas en inglés), Huntingtin, HVEM, IAP, ICAM, ICA -1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, IgA, receptor IgA, IgE, IGF, proteínas de unión a IGF, IGF-1, IGF-1 R, IGF-2, IGFBP, IGFR, receptores IL, IL-1, IL-10, IL-10, receptores IL-11, IL-11, receptores IL-12, IL-12, receptores IL-13, IL-13, receptores IL-15, IL-15, receptores IL-16, IL-16, receptores IL-17, IL-17, receptores IL-18 (IGIF), IL-18, receptores I L- 1 alfa, IL-1beta, IL-1, receptores IL-2, IL-2, receptores IL-20, IL-20, receptores IL-21, IL-21, IL-23, receptores IL-23, receptores IL-2, receptores IL-3, IL-3, receptores IL-31, IL-31, receptores IL-3, receptores IL-4, IL-4 receptores IL-5, IL-5, receptores IL-6, IL-6, receptores IL-7, IL-7, receptores IL-8, IL-8, receptores IL-9, IL-9, inmunocomplejo de inmunoglobulina, inmunoglobulinas, INF-alfa, receptores INF-alfa, receptores INF-beta, INF-beta, INF-alfa, receptores INF-alfa, INF-beta, receptores INF-beta, INF-gamma, receptores INF-gamma, IFN tipo-l, receptor IFN tipo-l, influenza, inhibina, Inhibina alfa, Inhibina beta, iNOS, insulina, Cadena de insulin A, Cadena de insulina B, Factor de crecimiento 1 similar a insulina, Factor de crecimiento 2 similar a insulina, proteínas de unión del factor de crecimiento similar a insulina, integrina, integrina alfa2, integrina alfa3, integrina alfa4, integrina
alfa4/beta1, integrina alfa-V/beta-3, integrina alfa-V/beta-6, integrina alfa4/beta7, integrina alfa5/beta1, integrina alfa5/beta3, integrina alfa5/beta6, integrina alfa-delta (alfaV), integrina alfa-theta, integrina betal, integrina beta2, integrina beta3(GPIIb-llla), IP-10, l-TAC, JE, Calicreína, Calicreina 11, Calicreina 12, Calicreina 14, Calicreína 15, Calicreína 2, Calicreína 5, Calicreína 6, Calicreína L1, Calicreína L2, Calicreína L3, Calicreína L4, calistatina, KC, KDR, Factor de Crecimiento de Queratinocitos (KGF, por sus siglas en inglés), Factor de Crecimiento de Queratinocitos-2 (KGF-2, por sus siglas en inglés), KGF, receptor similar a inmunoglobulina eliminadora, ligando de kit (KL, por sus siglas en inglés), tirosina cinasa de kit, laminina 5, LAMP, LAPP (Amilina, polipéptido de islote-amiloide), LAP (TGF-1), péptido asociado a estado latente, TGF-1 latente, TGF-1 bp1 latente, ETB, LDGF, LDL, receptor LDL, LECT2, Lefty, Leptin, hormona luteinizante, antígeno Lewis-Y, antígeno relacionado Lewis-Y, LFA- , LFA-3, receptores LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteínas, LIX, LKN, Lptn, Selectina L, LT-a, IT-b, LTB4, LTBP-1, tensioactivo de pulmón, hormona luteinizante, Linfotactina, Receptor de linfotoxina beta, Receptor Lisoesfingolípido, Mac-1, macrófago-CSF (M-CSF), MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, maspina, MCAM, MCK-2, MCP, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-I (MCAF), M-CSF, MDC, MDC (67 a. a.), MDC (69 a. a.), megsina, Mer, Familia del receptor de la tirosina cinasa MET, METALOPROTEASAS, Glicoproteína de membrana
0X2, Mesotelina, receptor MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), proteína microbiana, MIF, MIG, MIP, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, MIP-3 alfa, MIP-3 beta, MIP-4, MK, MAC1, MMP, M P-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, proteína atrayente de monocitos, factor inhibidor de colonias de monocitos, péptido asociado a la gonadotropina de ratón, MPIF, Mpo, MSK, MSP, MUC-16, MUC18, mucina (Mud), Sustancia inhibidora Muelleriana, Mug, MuSK, glicoproteína asociada a mielina, factor inhibidor progenitor mieloide-1 (MPIF-1, por sus siglas en inglés), NAIP, Nanocuerpo, NAP, NAP-2, NCA 90, NCAD, N-Cadherina, NCAM, Neprilisina, molécula de adhesión de célula neural, neroserpina, factor de crecimiento neuronal, Neurotrofina-3, Neurotrofina-4, Neurotrofina-6, Neuropilina 1, Neurturina, NGF-beta, NGFR, NKG20, hormona de crecimiento de N-metionilo humano, nNOS, NO, Nogo-A, receptor de Nogo, proteína tipo 3 no estructural (NS3) del virus de la hepatitis C, NOS, Npn, NRG-3, NT, NT-3, NT-4, NTN, OB, OGGI, Oncostatina M, OP-2, OPG, OPN, OSM, receptores OSM, factores osteoinductivos, osteopontina, 0X40 L, OX40R, LDL oxidado, p150, p95, PADPr, hormona paratiroidea, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-Cadherina, PCNA, PCSK9, PDGF, receptor PDGF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PDGF-D, PDK-1, PECAM, PEDF, PEM, PF-4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIGF, PIN, PLA2, factor de crecimiento de la placenta, fosfatasa alcalina placentaria (PLAP, por sus siglas en inglés), lactógeno
placentario, inhibidor activador de plasminógeno-1 , factor de crecimiento de plaqueta, plgR, PLP, cadenas poliglicol de diferente tamaño (por ejemplo, PEG-20, PEG-30, PEG40), PP14, precalicreína, proteína del prión, procalcitonina, proteína 1 eliminadora de célula programada, proinsulina, prolactina, Proproteína convertasa PC9, prorelaxina, antígeno de membrana específica de la próstata (PSMA, por sus siglas en inglés), Proteína A, Proteína C, Proteína D, Proteína S, Proteína Z, PS, PSA, PSCA, PsmAr, PTEN, PTHrp, Ptk, PTN , p-selectina glicoproteína ligando 1, R51, RAGE, RANK, RANKL, RANTES, relaxina, Cadena de Relaxina A, Cadena de Relaxina B, renina, virus respiratorio sincitial (RSV, por sus siglas en inglés) F, Ret, reticulon 4, Factores reumatoides, RLI P76, RPA2, RPK-1, RSK, RSV Fgp, S100, RON-8, SCF/KL, SCGF, Esclerostina, SDF-1, SDF1 alfa, SDF1 beta, SERINA, Amiloide en suero P, Albúmina en suero, sFRP-3, Shh, Toxina II similar a Shiga, SIGIRR, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, S AC, SMDF, S OH, SOD, SPARC, receptor 1 de esfingosina-1 -fosfato, ácido estafilococicolipoteicoico, Stat, STEAP, STEAP-II, factor de célula madre (SCF, por sus siglas en inglés), estreptocinasa, dismutasa de superóxido, syndecan-1 , TACE, TACI, TAG-72 (glicoproteina-72 asociada a tumor), TARC, TB, TCA-3, receptor de células T alfa/beta, TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, Tenascina, TERT, fosfatase alcalina similar a PLAP testicular, TfR, TGF, TGF-alfa, TGF-beta , Pan TGF-beta específica, TGF-beta Rll, TGF-beta Rllb, TGF-beta RUI, TGF-beta
R1 (ALK-5), TGF-betal, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, TGF-I, Trombina, trombopoyetina (TPO, por sus siglas en inglés), receptor de la linfoproteína tímica estromal, Timo Ck-1, hormona estimulante de la tiroides (TSH, por sus siglas en inglés), tiroxina, globulina de unión a tiroxina, Tie, TIMP, TIQ, Factor de tejido, inhibidor de proteasa del factor de tejido, proteína del factor de tejido, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, receptor-I TNF, receptor-ll de TNF, TNF-alfa, TNF-beta, TNF-beta2, TNFc, TNF-RI , TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2/DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5/KILLER/TRICK-2A/TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1 /LIT/TRI D) , TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2/TRUNDD), TNFRSF11 A (RANK ODF R/TRANCE R), TNFRSF11 B (OPG OCIF/TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF12A, TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR/HveA/LIGHT R/TR2), TNFRSF16 (NGFR P75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ/TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1 A (TNF Rl CD120a/p55-60), TNFRSF1B (TNF Rll CD120b/p75-80), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRSF25 (DR3 Apo-3/LARD/TR-3/TRAMP/WSL-1), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII/TNFC R), TNFRSF4 (0X40 ACT35/TXGP 1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1/APT1/CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68/TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1 BB CD137/ILA), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFSF10 (Ligando TRAIL Apo-2/TL2),
TNFSF11 (ODF del Ligando TRANCE/RANK/Ligando OPG), TNFSF12 (Ligando TWEAK ???-3/Ligando DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS/TALL1 /TH AN K/TN FSF20) , TNFSF14 (Ligando LIGHT HVEM/LTg), TNFSF15 (TL1 A/VEGI), TNFSF18 (Ligando GITR Ligando AITR/TL6), TNFSF1A (Conectina de TNF-a/DI F/TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa/TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC/p33), TNFSF4 (Ligando OX40 gp34/TXGP1), TNFSF5 (CD154 del Ligando CD40/gp39/HIGM1/IMD3/TRAP), TNFSF6 (Ligando Apo-1 Ligando Fas/Ligando APT1), TNFSF7 (CD70 del Ligando CD27), TNFSF8 (CD153 del Ligando CD30), TNFSF9 (Ligando 4-1 BB Ligando CD137), TNF-alfa, TNF-beta, TNIL-I, metabilito tóxico, TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, receptor de la transferrina, factores de transformación de crecimiento (TGF, por sus siglas en inglés) como TGF-alfa y TGF-beta, glicoproteína de transmembrana NMB, Transtiretina, TRF, Trk, TROP-2, Glicoproteína Trofoblástica, TSG, TSLP, Factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés), antígeno asociado a tumor CA 125, carbohidrato relacionado a Lewis Y que expresa el antígeno asociado a tumor, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, Urocinasa, VAP-1, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés), vaspina, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherina, VE-Cadherina-2, VEFGR-1 (flt-1), VEFGR-2, receptor de VEGF (VEGFR, por sus siglas en inglés), VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, Antígenos virales, receptor VitB 12 , Receptor de vitronectina, VLA, VLA-1, VLA-4,
integrina de VNR, Factor de von Willebrand (vWF, por sus siglas en inglés), WIF-1, WNT1, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, XCL1, XCL2/SCM-l-beta, XCLI/Linfotactina, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aa, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1 , EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, I L-20/I L-20R, LDL oxidizado, PCSK9, precalicreína, RON, TMEM16F, SOD1, Cromogranina A, Cromogranina B, tau, VAP1, Quininógeno de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9,, factor B, factor D, factor H, properdina, esclerostina, fibrinógeno, fibrina, protrombina, trombina, factor de tejido, factor V, factor Va, factor VII, factor Vila, factor VIII, factor Villa, factor IX, factor IXa, factor X, factor XA, factor XI, factor Xla, factor XII, factor Xlla, factor XIII, factor XI 11 a , TFPI, antitrombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminógeno, plasmina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Sindecano-1, Sindecano-2, Sindecano-3, Sindecano-4, LPA, S1P.
Las moléculas de unión al antígeno descritas en la presente invención son capaces de reducir la concentración del antígeno total de los antígenos descritos antes en plasma. Las moléculas de unión al antígeno descritas en la presente invención son también capaces de eliminar el virus, las bacterias, y el hongo del
plasma uniéndolos a los componentes estructurales del virus, de las bacterias y del hongo. Particularmente, la proteína F de RSV, ácido estafilococicolipoteicoico, toxina de Clostridium difficile, Toxina II similar a Shiga, antígeno protector de Bacillus anthracis y glicoproteína del virus E2 de la hepatitis C pueden usarse como componentes estructurales del virus, de las bacterias y del hongo.
Uso
La presente invención también proporciona muchos usos de las moléculas de unión al antígeno de la presente invención como se describe anteriormente.
Así, la presente invención proporciona el uso de las moléculas modificadas de unión al antígeno de la presente invención para mejorar la absorción del antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno en células. Además, la presente invención también proporciona métodos para mejorar la absorción del antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno en células que comprenden alterar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original, sustituyendo un aminoácido en el dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436 y de tal modo aumentando la actividad de unión a FcRn a pH neutro con respecto a una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio de unión a FcRn intacto.
En la presente, el término "absorción del antígeno en células" mediada por una molécula de unión al antígeno se entiende que los antígenos son tomados en células mediante endocitosis. Mientras tanto, en la presente, el término "facilita la absorción en células" se entiende que se reduce la velocidad de absorción intracelular de la molécula de unión al antígeno unida a un antígeno en plasma es mejorada, y/o la cantidad de reciclaje del antígeno de absorción al plasma. Esto se entiende que la velocidad de absorción en las células es facilitada con respecto a la molécula de unión al antígeno antes de la modificación del dominio de unión a FcRn y así antes de aumentar la actividad de unión al FcRn humano de la molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro, o antes de aumentar la actividad de unión a FcRn humano y de reducir ia actividad de unión al antígeno (capacidad de unión) de la molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido menor que su actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro. La velocidad se mejora preferiblemente con respecto a la IgG intacta, y más preferiblemente con respecto a la IgG humana intacta. Así, en la presente invención, si la absorción del antígeno en células es facilitada por una molécula de unión al antígeno puede evaluarse basada en un aumento en la velocidad de absorción del antígeno en células. La velocidad de absorción del antígeno en células puede calcularse, por ejemplo, monitoreando durante el transcurso del tiempo de reducción en la concentración del
antígeno en el medio de cultivo que contiene células que expresan el FcRn humano después de agregar el antígeno y la molécula de unión al antígeno al medio, o monitoreando durante el transcurso del tiempo la cantidad de absorción del antígeno en células que expresan el FcRn humano. Al usar métodos de la presente invención para facilitar la velocidad de absorción del antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno en células, por ejemplo, la velocidad de eliminación del antígeno del plasma puede mejorarse administrando moléculas de unión al antígeno de la presente invención. Así, si absorción del antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno en células es facilitada puede también evaluarse, por ejemplo, probando si la velocidad de eliminación del antígeno del plasma es acelerada o si la concentración del antígeno total en plasma es reducida administrando una molécula de unión al antígeno de la presente invención.
En la presente, el término "concentración del antígeno total en plasma" se entiende la suma de la molécula de unión al antígeno une al antígeno y la concentración del antígeno no unido, o "concentración del antígeno libre en plasma" que es la concentración del antígeno no unido de la molécula de unión al antígeno. Varios métodos para medir la "concentración del antígeno en plasma" y la "concentración del antígeno libre en plasma" son bien conocidos en la técnica como se describe a continuación.
La presente invención también proporciona el uso de la molécula de unión al antígeno de la presente invención para aumentar el número total de antígenos a los cuales una molécula de unión al antígeno puede unirse antes de su degradación. La presente invención también proporciona métodos para aumentar el número de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno puede unirse, al usar una molécula de unión al antígeno de la presente invención. Específicamente, la presente invención proporciona métodos para aumentar el número total de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno pueda unirse, sustituyendo un aminoácido en el dominio de unión a FcRn original de dicha molécula de unión al antígeno en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436 y de tal modo aumentando la actividad de unión a FcRn a pH neutro con respecto a una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio de unión a FcRn intacto.
Un "anticuerpo convencional" puede unirse generalmente solamente uno o dos antígenos antes de que se degrade en el endosoma. Una molécula de unión al antígeno de la presente invención puede aumentar el número de ciclos alcanzados hasta que se degrade la molécula de unión al antígeno, por lo cual cada ciclo consiste en: unir un antígeno a la molécula de unión al antígeno en plasma, absorción intracelular de la molécula de
unión al antígeno unida al antígeno, y disociación del antígeno en el endosoma, seguido por el regreso de la molécula de unión al antígeno al plasma. Esto se entiende que el número de ciclos es aumentado con respecto a la molécula de unión al antígeno antes de la modificación del dominio de unión a FcRn y así antes de aumentar la actividad de unión a FcRn humano de la molécula de unión al antígeno a pH neutro o el intervalo ácido, o antes de aumentar la actividad de unión a FcRn humano y de reducir la actividad de unión al antígeno (capacidad de unión) de la molécula de unión al antigeno en el intervalo de pH ácido menor que su actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro. Así, si el número de ciclos es aumentado puede evaluarse probando si la "absorción intracelular es facilitada" descrita antes o si la "farmacocinética es mejorada" como se describe a continuación.
La presente invención también proporciona el uso de moléculas de unión al antígeno de la presente invención para mejorar el retiro del antígeno de la sangre en mamíferos, es decir, en humanos. En particular, la presente invención proporciona el uso de la molécula de unión al antígeno de la presente invención para reducir la concentración plasmática de un antígeno específico, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que pueda unir dicho antígeno. La presente invención también proporciona un método para reducir la concentración plasmática de un antígeno
especifico, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que pueda unir dicho antígeno, sustituyendo un aminoácido en un dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436 y de tal modo aumentando la actividad de unión a FcRn a pH neutro con respecto a una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio de unión a FcRn intacto.
La presente invención también proporciona el uso de las moléculas de unión al antígeno de la presente invención para facilitar la liberación extracelular de la molécula de unión al antígeno libre de antígeno tomada en células en una forma unida al antígeno. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para facilitar la liberación extracelular de la molécula de unión al antígeno libre de antígeno tomada en células en una forma unida al antígeno sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro comparada al anticuerpo original, sustituyendo un aminoácido en el dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436 y de tal modo aumentando la actividad de unión a FcRn a pH neutro con respecto a una molécula de unión al antígeno que tiene un
dominio de unión a FcRn intacto.
En la presente, la "liberación extracelular de la molécula de unión al antígeno libre de antígeno tomada en células de una forma unida al antígeno" no se entiende necesariamente que todas las moléculas de unión al antígeno unidas al antígeno tomado en las células son liberadas en una forma libre de antígeno fuera de la célula. Es aceptable que la proporción de las moléculas de unión al antígeno liberadas en una forma libre de antígeno al exterior de la célula se aumente en comparación con antes de la modificación del dominio de unión a FcRn y así antes de reducir la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menos de que, en el intervalo de pH neutro y de aumentar la actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro. La molécula de unión al antígeno liberada al exterior de la célula conserva preferiblemente la actividad de unión al antígeno.
La presente invención también proporciona el uso de un dominio de unión a FcRn de la presente invención para aumentar la capacidad de la molécula de unión al antígeno de eliminar el antígeno en plasma. En la presente invención, los "métodos para aumentar la capacidad de eliminar el antígeno en plasma" son sinónimos a los "métodos para aumentar la capacidad de una molécula de unión al antígeno de eliminar el antígeno de plasma". Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para aumentar la capacidad de una molécula de unión al antígeno
de eliminar el antígeno en plasma sustituyendo un aminoácido en el dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436 y de tal modo aumentando la actividad de unión a FcRn a pH neutro y/o ácido con respecto a una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio de unión a FcRn intacto.
En la presente, el término "capacidad de eliminar el antígeno en plasma" se entiende la capacidad de eliminar el antígeno del plasma cuando las moléculas de unión al antígeno se administran o se secretan in vivo. Así, el "aumento en la capacidad de la molécula de unión al antígeno de eliminar el antígeno en plasma" en la presente se entiende que la velocidad de eliminación del antígeno del plasma es acelerada sobre la administración de la molécula de unión al antígeno en comparación con antes de la modificación del dominio de unión a FcRn y así antes de aumentar la actividad de unión a FcRn humano de la molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro o antes de aumentar la actividad de unión a FcRn humano y simultáneamente de reducir su actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menos de que, en el intervalo de pH neutro. El aumento en la actividad de una molécula de unión al antígeno para eliminar el antígeno del plasma puede evaluarse, por ejemplo, administrando un antígeno soluble y una molécula de
unión al antígeno in vivo, y midiendo la concentración del antígeno soluble en plasma después de la administración. Cuando la concentración del antígeno soluble en plasma después de la administración del antígeno soluble y la molécula modificada de unión al antígeno se reducen, la capacidad de la molécula de unión al antígeno de eliminar el antígeno en plasma se puede juzgar para ser aumentada. Una forma de antígeno soluble puede ser la molécula de unión al antígeno unida al antígeno o la molécula de unión al antígeno no unida al antígeno cuya concentración puede determinarse como "molécula de unión al antígeno unida a la concentración del antígeno en plasma" y "molécula de unión al antígeno no unida a la concentración del antígeno en plasma" respectivamente. El último es sinónimo a "concentración del antígeno libre en plasma". Puesto que la "concentración del antígeno total en plasma" se entiende la suma de la molécula de unión antígeno unida al antígeno y concentración del antígeno no unida, o "concentración del antígeno libre en plasma" que es la molécula de unión al antígeno no unida a la concentración del antígeno, la concentración del antígeno soluble puede determinarse como "concentración del antígeno total en plasma". Varios métodos para medir la "concentración del antígeno total en plasma" o la "concentración del antígeno libre en plasma" son bien conocidos en la técnica como se describe a continuación.
La presente invención también proporciona el uso del
dominio de unión a FcRn de la presente invención para mejorar la farmacocinética de moléculas de unión al antígeno. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para mejorar la farmacocinética de la molécula de unión al antígeno sustituyendo un aminoácido en el dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436 y de tal modo aumentando la actividad de unión a FcRn a pH neutro y/o ácido con respecto a una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio de unión a FcRn intacto.
En la presente, los términos "mejora de la farmacocinética", "mejora de la farmacocinética", y "farmacocinética superior" pueden exponerse como "mejora de retención de plasma (sangre), "mejora de retención de plasma (sangre)", "retención de plasma superior (sangre)", y "retención de plasma prolongada (sangre)". Estos términos se usan en la presente como sinónimos.
La mejora de la farmacocinética comprende particularmente:
(1) una eliminación retrasada: que prolonga el tiempo entre la administración y la eliminación de las moléculas de unión al antígeno del plasma con respecto a una Molécula de Unión al Antígeno de Control (por ejemplo, moléculas de unión al antígeno que tienen un dominio de unión a FcRn intacto); y/o
(2) prolongar el tiempo de retención de plasma de las moléculas de unión al antígeno, preferiblemente en una forma en
la cual el anticuerpo o el derivado de anticuerpo puede unirse a su antígeno después de la administración de las moléculas de unión al antígeno con respecto a el tiempo de retención de plasma de tal Molécula de Unión al Antígeno de Control (por ejemplo, moléculas de unión al antígeno que tienen un dominio de unión a FcRn intacto); y/o
(3) acortar el período durante el cual el antígeno está libre (no unido a una molécula de unión al antígeno en el cuerpo) entre la administración y la eliminación de las moléculas de unión al antígeno con respecto a una Molécula de Unión al Antígeno de Control (prolongación del período entre la administración y la eliminación durante las cuales las moléculas de unión al antígeno están unidas a su antígeno en el cuerpo de un sujeto con respecto a las moléculas de unión al antígeno de control (por ejemplo, moléculas de unión al antígeno que tienen un dominio de unión a FcRn intacto); y/o
(4) aumentar la velocidad de unión al antígeno a moléculas de unión al antígeno contra el antígeno total en el cuerpo con respecto al velocidad de unión del antígeno a una Molécula de Unión al Antígeno de Control (por ejemplo, moléculas de unión al antígeno que tienen un dominio de unión a FcRn intacto) antes de la degradación del anticuerpo (aumentando el número de eventos de unión de las moléculas de unión al antígeno con su antígeno entre la administración y la degradación del anticuerpo o el anticuerpo derivado con respecto al número de
eventos de unión de las moléculas de unión al antígeno de control entre la administración y la degradación).
(5) reducir la concentración del antígeno total o libre en plasma después de la administración de las moléculas de unión al antígeno comparadas con la concentración del antígeno total o libre en plasma después de la administración de una Molécula de Unión al Antígeno de Control (por ejemplo, moléculas de unión al antígeno que tienen un dominio de unión a FcRn intacto).
La presente invención también proporciona un método para retrasar la eliminación de una molécula de unión al antígeno en un sujeto, que comprende la etapa de introducir una modificación en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
El término "mejora de la farmacocinética" como se usa en la presente se refiere no sólo a la prolongación del período entre la administración de la molécula de unión al antígeno a un sujeto (humanos, o animales no humanos como ratones, ratas, monos, conejos, y perros) y la eliminación del plasma (por ejemplo, hasta que la molécula de unión al antígeno se degrade intracelularmente o similares y no pueda volver al plasma) a, pero también a la prolongación de la retención de plasma de la molécula de unión al antígeno en una forma que permita la unión
al antígeno (por ejemplo, en una forma libre de antígeno de la molécula de unión al antígeno) durante el período de administración hasta la degradación de la molécula de unión al antígeno.
Por lo tanto, la presente invención también proporciona un método para prolongar el tiempo de retención de plasma de una molécula de unión al antígeno, que comprende la etapa de introducir una modificación en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436. La IgG humana intacta puede unirse a FcRn de animales no humanos. Por ejemplo, la administración a ratones se usa preferiblemente para confirmar la propiedad de la molécula de unión al antígeno de la invención puesto que la IgG humana intacta puede unirse al FcRn de ratón más potente que a FcRn humano (Int Immunol. El diciembre de 2001; 13(12): 1551-9). Como otro ejemplo, el ratón en el cual se interrumpen sus genes de FcRn nativos y un transgén para el gen de FcRn humano se albergan para ser expresados (Methods Mol Biol. 2010; 602: 93-104) pueden también preferiblemente usarse para ser administrados para confirmar la propiedad de la molécula de unión al antígeno de la invención descrita a continuación.
Específicamente, la "mejora de la farmacocinética" también
incluye la prolongación del período entre la administración y la degradación de la molécula de unión al antígeno durante la cual no está unida a un antígeno (la forma libre de antígeno de la molécula de unión al antígeno). La molécula de unión al antígeno en plasma no puede unirse a un nuevo antígeno cuando la molécula de unión al antígeno ya se ha unido a un antígeno. Asi, cuanto más largo es el período durante el cual la molécula de unión al antígeno no está unida a un antígeno, más largo es el período durante el cual tiene el potencial para unir a un nuevo antígeno (mayor será la probabilidad de la unión a otro antígeno). En otras palabras, más antígenos serán unidos durante un corto período de tiempo. Por lo tanto, la concentración plasmática de la forma libre de antígeno de la molécula de unión al antígeno puede aumentarse y el período total durante el cual el antígeno es unido a la molécula de unión al antígeno puede ser prolongado acelerando la eliminación del antígeno del plasma mediante la administración de la molécula modificada de unión al antígeno.
Específicamente, en la presente "mejora de la farmacocinética de una molécula de unión al antígeno" incluye la mejora de un parámetro farmacocinético de la forma libre de antígeno de la molécula de unión al antígeno (cualquiera de la prolongación de la vida promedio en plasma, la prolongación del tiempo de retención promedio en plasma, y el deterioro de la eliminación de plasma), la prolongación del período durante el cual el antígeno es unido a la molécula del antígeno después de
la administración de la molécula modificada de unión al antígeno, y la aceleración de la eliminación del antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno del plasma.
La mejora de la farmacocinética de la molécula de unión al antígeno puede evaluarse determinando cualquiera de los parámetros, vida promedio en plasma, tiempo de retención de plasma promedio, y eliminación de plasma para la molécula de unión al antígeno o la forma libre de antígeno de los mismos ("Pharmacokinetics: Enshu ni yoru Rikai (Understanding through practice)" Nanzando). Por ejemplo, la concentración plasmática de la molécula de unión al antígeno o la forma libre de antígeno de la misa se determina después de la administración de la molécula de unión al antígeno a los ratones, a las ratas, a los monos, a los conejos, a los perros, o a los humanos. Entonces, se determina cada parámetro. Cuando se prolonga la vida promedio del plasma o el tiempo de retención de plasma promedio, la farmacocinética de la molécula de unión al antígeno puede juzgarse para ser mejorada. Los parámetros pueden determinarse por los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Los parámetros pueden evaluarse apropiadamente, por ejemplo, mediante análisis no compartimental al usar el software de análisis de farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acuerdo con el manual de instrucción anexo. La concentración plasmática de la molécula de unión al antígeno libre de antígeno puede determinarse por los métodos conocidos por los expertos en la
técnica, por ejemplo, al usar el método de ensayo descrito en Clin Pharmacol. abril de 2008; 48 (4): 406-17.
En la presente, el término "mejora de la farmacocinética" también incluye la prolongación del período que un antígeno está unido a una molécula de unión al antígeno después de la administración de la molécula de unión al antígeno. Si el período que el antígeno está unido a la molécula de unión al antígeno después de la administración de la molécula de unión al antígeno se prolonga puede evaluarse determinando la concentración plasmática del antígeno libre. La prolongación puede juzgarse basada en la concentración plasmática determinada de antígeno libre o el período de tiempo requerido para un aumento en la relación de la concentración del antígeno libre a la concentración del antígeno total.
La presente invención también proporciona el uso de las moléculas de unión al antígeno de la presente invención para reducir la concentración plasmática del antígeno total o libre de un antígeno específico, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que puede unir dicho antígeno. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos para reducir la concentración plasmática del antígeno total o libre, dicho método comprende las etapas de: a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al
antígeno que puede unir dicho antígeno,
b) sustituir un aminoácido en el dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436 y de tal modo aumentando la actividad de unión a FcRn a pH neutro con respecto a una molécula de unión al antígeno que tiene un dominio de unión a FcRn intacto.
Por otra parte, la presente invención proporciona, comprender la etapa de introducir una modificación en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311 , EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436. El término "índice de eliminación del antígeno" como se usa en la presente se refiere al número de antígenos que una molécula de unión al antígeno puede eliminar del plasma en el tiempo entre la administración y la eliminación (es decir, la degradación) del anticuerpo o del derivado de anticuerpo.
La concentración plasmática del antígeno libre no unida a la molécula de unión al antígeno o la relación de la concentración del antígeno libre a la concentración total puede determinarse por los métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, por el método descrito en Pharm Res. enero de 2006; 23 (1): 95-103. Alternativamente, cuando un antígeno exhibe una
función particular in vivo, si el antígeno está unido a una molécula de unión al antígeno que neutraliza la función del antígeno (molécula antagónica) puede evaluarse probando si la función del antígeno está neutralizada. Si la función del antígeno está neutralizada puede evaluarse ensayando un marcador in vivo que refleje la función del antígeno. Si el antígeno está unido a una molécula de unión al antígeno que active la función del antígeno (molécula agonística) puede evaluarse ensayando un marcador in vivo que refleje la función del antígeno.
La determinación de la concentración plasmática de antígeno libre y la relación de la cantidad de antígeno libre en plasma a la cantidad de antígeno total en plasma, ensayo de marcador in vivo, y tales mediciones no está particularmente limitada; sin embargo, se realizan los ensayos preferiblemente después de que cierto período de tiempo haya pasado después de la administración de la molécula de unión al antígeno. En la presente invención, el período después de la administración de la molécula de unión al antígeno no está particularmente limitado; los expertos en la técnica pueden determinar el período apropiado dependiendo de las propiedades y similares de la molécula de unión al antígeno administrada. Tales vida promedios incluyen, por ejemplo, un día después de la administración de la molécula de unión al antígeno, tres días después de la administración de la molécula de unión al antígeno, siete días después de la administración de la molécula de unión al antígeno, 14 días
después de la administración de la molécula de unión al antígeno, y 28 días después de la administración de la molécula de unión al antígeno. En la presente, el término "concentración del antígeno en plasma" se entiende o bien "concentración del antígeno total en plasma" que es la suma de la molécula de unión al antígeno unida al antígeno y la concentración del antígeno no unido o "concentración del antígeno libre en plasma" que es la concentración del antígeno no unido de la molécula de unión al antígeno.
La concentración del antígeno total en plasma puede bajarse por la administración de la molécula de unión al antígeno de la presente invención por 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1,000 veces, o incluso superior en comparación con la administración de una molécula de unión al antígeno de referencia que comprende la región Fe de IgG humana intacta como dominio de unión a FcRn humano o comparada cuando la molécula de unión al antígeno del dominio de la presente invención no se administra.
La relación de la molécula antígeno molar/unión al antígeno puede calcularse como se muestra a continuación;
valor A: Concentración del antígeno molar en cada punto de tiempo
valor B: Concentración de la molécula de unión al antígeno molar en cada punto de tiempo
valor C: Concentración del antígeno molar por
concentración de la molécula de unión al antígeno molar (relación de la molécula de antígeno molar/unión al antígeno) en cada punto de tiempo C=A/B.
Un menor valor C indica una mayor eficacia de la eliminación del antígeno por molécula de unión al antígeno mientras que un mayor valor C indica menor rendimiento de eliminación del antígeno por molécula de unión al antígeno.
La relación de la molécula de antígeno molar/unión al antígeno puede disminuirse por la administración de la molécula de unión al antígeno de la presente invención por 2 veces, 5 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1,000 veces, o incluso superior en comparación con la administración de una molécula de unión al antígeno de referencia que comprende la región Fe de IgG humana intacta como un dominio de unión a FcRn humano.
En la presente, una IgG 1 , lgG2, lgG3 o lgG4 humana intacta se usa preferiblemente como la IgG humana intacta para un propósito de una IgG humana intacta de referencia de ser comparada con las moléculas de unión al antígeno para su actividad de unión al FcRn humano o actividad in vivo. Preferiblemente, una molécula de unión al antígeno de referencia que comprende el mismo dominio de unión al antígeno como una molécula de unión al antígeno de interés y la región Fe de IgG humana intacta como un dominio de unión a FcRn humano puede usarse apropiadamente. Más preferiblemente, una lgG1 humana
intacta se usa para un propósito de una IgG humana intacta de referencia a ser comparada con las moléculas de unión al antígeno para su actividad de unión al FcRn humano o la actividad in vivo.
La reducción de la concentración del antígeno total en relación de antígeno/anticuerpo en plasma o molar puede evaluarse como se describe en los Ejemplos 6, 8, y 13 del documento WO2011/122011. Más específicamente, al usar la línea 32 o la línea 276 de ratón transgénico de FcRn humano (Jackson Laboratories, Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104.), pueden evaluarse por el modelo de co-inyección de antígeno-anticuerpo o el modelo de infusión de antígeno en estado estacionario cuando la molécula de unión al antígeno de interés no tiene una reacción cruzada con el antígeno de contrapartes de ratón. Cuando la molécula de unión al antígeno de reacción cruzada con la contraparte de ratón, pueden evaluarse simplemente inyectando la molécula de unión al antígeno a la línea 32 o la línea 276 de ratón transgénico de FcRn humano (Jackson Laboratories). En el modelo de co-inyección, una mezcla de molécula de unión al antígeno y antígeno se administra al ratón. En el modelo de infusión de antígeno en estado estacionario, una bomba de infusión que contiene una solución de antígeno se implanta al ratón para alcanzar una concentración constante de antígeno en plasma, y después la molécula de unión al antígeno se inyecta al ratón. La misma dosificación se usa
para todas las moléculas de unión al antígeno de prueba administradas. La concentración del antígeno total en plasma, la concentración del antígeno libre en la concentración de molécula de unión al antígeno en plasma se midió en un punto de tiempo apropiado al usar métodos conocidos por los expertos en la técnica.
La concentración del antígeno total o libre en plasma y la relación de molécula de antígeno molar/unión al antígeno puede medirse a 2, 4, 7, 14, 28, 56, o 84 días después de la administración para evaluar el efecto a largo plazo de la presente invención. En otras palabras, una concentración del antígeno en plasma a largo plazo es determinada al medir la concentración del antígeno total o libre en plasma y la relación de la molécula de antígeno molar/unión al antígeno a 2, 4, 7, 14, 28, 56, o 84 días después de la administración de una molécula de unión al antígeno para evaluar la propiedad de la molécula de unión al antígeno de la presente invención. Si la reducción de la concentración del antígeno en plasma o de la relación de la molécula de antígeno molar/unión al antígeno es alcanzada por la molécula de unión al antígeno descrita en la presente invención puede determinarse por la evaluación de la reducción en cualquiera de uno o más de los puntos de tiempo descritos antes.
La concentración del antígeno total o libre en plasma y la relación de la molécula de antígeno molar/unión al antígeno puede medirse a 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12, o 24 horas después
de la administración para evaluar el efecto a corto plazo de la presente invención. En otras palabras, una concentración del antígeno en plasma a corto plazo es determinada midiendo la concentración del antígeno total o libre en plasma y la relación de la molécula de antígeno molar/unión al antígeno a 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12, o 24 horas después de la administración de una molécula de unión al antígeno para evaluar la propiedad de la molécula de unión al antígeno de la presente invención.
Más específicamente, estas moléculas de unión al antígeno que tienen un efecto a largo plazo en la actividad para eliminar el antígeno en plasma como se describe en la presente invención tienen actividad de unión a FcRn humano a pH 7.0 y 25°C dentro de un intervalo de 28 veces a 440 veces más potente que la Ig G 1 intacta humana o la KD dentro de un intervalo de 3.0 micromoles a 0.2 micromoles. Preferiblemente, la KD está dentro de un intervalo de 700 nanomolar a 0.2 nanomolar, más preferiblemente, la KD está dentro de un intervalo de 500 nanomolar a 3.5 nanomolar, más preferiblemente, dentro de un intervalo de 150 nanomolar a 3.5 nanomolar. Una concentración del antígeno en plasma a largo plazo es determinada midiendo la concentración del antígeno total o libre en plasma y la relación de la molécula de antígeno molar/unión al antígeno a 2, 4, 7, 14, 28, 56, o 84 días después de la administración de una molécula de unión al antígeno para evaluar el efecto a largo plazo de la molécula de unión al antígeno de la presente invención en
actividad para eliminar el antígeno en plasma. Si la reducción de la concentración del antígeno en plasma o la relación de la molécula de antígeno molar/unión al antígeno es alcanzada por la molécula de unión al antígeno descrita en la presente invención puede determinarse por la evaluación de la reducción de cualquiera de uno o más de los puntos de tiempo descritos antes.
Aún más específicamente, estas moléculas de unión al antígeno que tienen un efecto a corto plazo para eliminar el antígeno en plasma como se describe en la presente invención tienen actividad de unión a FcRn humano a pH 7.0 y a 25°Centígrados 440 veces más potente que la IgG humana intacta o la KD más potente que 0.2 de micromoles, preferiblemente más potente que 700 nanomolar, más preferiblemente más potente que 500 nanomolar, más preferiblemente, más potente que 150 nanomolar. Una concentración de antígeno a corto plazo en plasma es determinada midiendo la concentración del antígeno total o libre en plasma y la relación de la molécula de antígeno molar/unión al antígeno a 15 minutos, 1, 2, 4, 8, 12, o 24 horas después de la administración de una molécula de unión al antígeno para evaluar el efecto a corto plazo de la molécula de unión al antígeno de la presente invención en actividad para eliminar el antígeno en plasma.
La ruta de administración de una molécula de unión al antígeno de la presente invención puede seleccionarse de inyección intradérmica, intravenosa, intravítrea, subcutánea,
intraperitoneal , parenteral e intramuscular.
En el contexto de la presente invención, la mejora de la farmacocinética en el humano es preferida. Cuando la retención de plasma en el humano es difícil de determinar, puede predecirse basada en la retención de plasma en ratones (por ejemplo, ratones normales, ratones transgénicos que expresan el antígeno humano, ratones transgénicos que expresan el FcRn humano) o monos (por ejemplo, macacos).
En la presente el término "que reduce la actividad de unión al antigeno de una molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menos de que, en el intervalo de pH neutro" se entiende que la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno de pH 4.0 a pH 6.5 está deteriorada con respecto a su actividad de unión al antígeno de pH 6.7 a pH 10.0. Preferiblemente, la frase anterior se entiende que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de pH 5.5 a pH 6.5 está deteriorada con respecto a la de pH 7.0 a pH 8.0, más preferiblemente se entiende que su actividad de unión al antígeno al pH endosomal temprano está deteriorada con respecto a su actividad de unión al antígeno en el pH de plasma in vivo. Específicamente, la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de pH 5.8 a pH 6.0 se deteriora con respecto a la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno a pH 7.4.
En la presente el término "que reduce la actividad de unión
al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro a menos de que, en el intervalo de pH ácido" se entiende que la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno de pH 6.7 a pH 10.0 está deteriorada con respecto a su actividad de unión al antígeno de pH 4.0 a pH 6.5. Preferiblemente, la frase anterior se entiende que la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno de pH 7.0 a pH 8.0 está deteriorada con respecto a la de pH 5.5 a pH 6.5, más preferiblemente se entiende que su actividad de unión al antígeno en el plasma pH in vivo está deteriorada con respecto a su actividad de unión al antígeno al pH endosomal temprano. Específicamente, la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno a pH 7.4 se deteriora con respecto a la actividad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno de pH 5.8 a pH 6.0.
Mientras tanto, en la presente la expresión "que reduce la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menos de que, en el intervalo de pH neutro" también se expresa como "que aumenta la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro más que en el intervalo de pH ácido". Específicamente, en la presente invención, es posible aumentar la relación de la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno entre los intervalos de pH ácido y neutro. Por ejemplo, el valor de la KD (pH 5.8)/KD (pH 7.4) es
aumentado en una modalidad descrita a continuación. La relación de la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno entre los intervalos de pH ácido y neutro se puede aumentar, por ejemplo, reduciendo su actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido, aumentando su actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro, o ambas.
La expresión "que reduce la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro a menos de que, en el intervalo de pH ácido" también se expresa como "que aumenta la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a más de que, en el intervalo de pH neutro". Específicamente, en la presente invención, es posible aumentar la relación de la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno entre los intervalos de pH ácido y neutro. Por ejemplo, el valor de la KD (pH 7.4)/KD (pH 5.8) se mayor de una modalidad descrita a continuación. La relación de la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno entre los intervalos de pH ácido y neutro puede aumentarse, por ejemplo, reduciendo su actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro, aumentando su actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido, o ambas.
El término "que reduce la actividad de unión al antígeno (capacidad de unión) a bajas concentraciones de iones de calcio a menos que su actividad de unión al antígeno a alta
concentración de ion calcio" como se usa en la presente se refiere a disminuir la afinidad de unión del dominio de unión al antígeno para el antígeno a una baja concentración de ion calcio comparada con la afinidad de unión para el antígeno del dicho dominio de unión al antígeno en una alta concentración de ion calcio. La baja concentración de calcio es preferiblemente de 0.5 a 10 micromoles, más preferiblemente de 0.1 a 30 micromoles de calcio ionizado, y la alta concentración de calcio es de 100 micromoles a 10 mM, más preferiblemente de 200 micromoles a 5 mM de calcio ionizado.
En la presente, la expresión "que deteriora la actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido con respecto a aquella en el intervalo de pH neutro" se usa a veces en vez de "que reduce la actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menos de que, en el intervalo de pH neutro".
En la presente, la actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH ácido se entiende la actividad de unión a FcRn humano de pH 4.0 a pH 6.5, preferiblemente la actividad de unión a FcRn humano de pH 5.5 a pH 6.5, y particularmente de manera preferible la actividad de unión a FcRn humano de pH 5.8 a pH 6.0, que es comparable al pH endosomal temprano in vivo. Mientras tanto, en la presente la actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro se entiende la actividad de unión a FcRn humano de pH 6.7 a pH 10.0, preferiblemente la actividad de unión a FcRn humano de pH 7.0 a pH 8.0, y
particularmente de manera preferible la actividad de unión a FcRn humano de pH 7.4, que es comparable al pH en plasma in vivo.
Aunque la molécula de unión al antígeno y los usos de la presente invención no se limitan a ninguna teoría particular, la relación entre la reducción (deterioro) de la capacidad de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menos de que, en el intervalo de pH neutro y/o el aumento (mejora) de la actividad de unión a FcRn humano en el intervalo de pH neutro y el aumento en el número de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno pueda unirse, debido a la facilitación de absorción de las moléculas de unión al antígeno en las células, y la mejora de la eliminación de antígeno del plasma puede explicarse como sigue.
Por ejemplo, cuando la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo que une a un antígeno de membrana, el anticuerpo administrado en el cuerpo unido al antígeno y después se toma a través de la internalización en endosomas en las células junto con el antígeno mientras que el anticuerpo se mantiene unido al antígeno. Entonces, el anticuerpo desplaza a los lisosomas mientras que el anticuerpo se mantiene unido al antígeno, y el anticuerpo es degradado por el lisosoma junto con el antígeno. La eliminación mediada por internalización del plasma se llama eliminación dependiente del antígeno, y tal eliminación se ha reportado con numerosas moléculas de anticuerpos (Drug Discov Today, enero de 2006; 11(1-2): 81-8). Cuando una sola molécula
del anticuerpo de IgG une a los antígenos de una manera bivalente, se internaliza la única molécula de anticuerpo mientras que el anticuerpo se mantiene unido a las dos moléculas de antígeno, y se degrada en el lisosoma. Por consiguiente, en el caso de los anticuerpos comunes, una molécula del anticuerpo de IgG no puede unirse a tres o más moléculas de antígeno. Por ejemplo, una sola molécula de anticuerpo de IgG que tiene una actividad neutralizante no puede neutralizar tres o más moléculas de antígeno.
La retención relativamente prolongada (eliminación lenta) de las moléculas de IgG en el plasma es debido a la función del FcRn humano el cual es conocido como un receptor de recuperación de las moléculas de IgG. Cuando se toman en endosomas a través de la pinocitosis, las moléculas de IgG unen a FcRn humano expresado en los endosomas bajo la condición acida en los endosomas. Mientras que las moléculas de IgG que no unen la transferencia de FcRn humano a los lisosomas donde se degradan, las moléculas de IgG que están unidas al FcRn humano se desplazan a la superficie celular y regresan de nuevo en el plasma disociando el FcRn humano bajo condición neutra en el plasma.
Alternativamente, cuando la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo que une a un antígeno soluble, el anticuerpo administrado en el cuerpo une al antígeno y después se toma en las células mientras que el anticuerpo se mantiene unido al
antígeno. Muchos anticuerpos tomados en las células se liberan al exterior de la célula a través del FcRn. Sin embargo, puesto que los anticuerpos se liberan al exterior de la célula, con los anticuerpos mantenidos unidos a los antígenos, los anticuerpos no pueden unirse a los antígenos de nuevo. Así, similar a los anticuerpos que unen a los antígenos de membrana, en el caso de los anticuerpos comunes, una molécula del anticuerpo de IgG no pueden unir a tres o más moléculas de antígeno.
Los anticuerpos de unión al antígenos dependiente al pH que unen potentemente a un antígeno bajo la condiciones neutra en plasma pero disocian del antígeno bajo condiciones ácidas en el endosoma (es decir, los anticuerpos que unen bajo condiciones neutras pero disocian bajo condiciones ácidas) pueden disociar del antígeno en el endosoma. Tales anticuerpos de unión al antígenos dependientes del pH pueden unir a los antígenos de nuevo cuando se reciclan al plasma por FcRn después de la disociación de antígeno; así, cada anticuerpo puede unirse repetidamente a un número de antígenos. Además, el antígeno unido a la molécula de unión al antígeno se disocia en el endosoma y no se recicla al plasma. Esto facilita la absorción del antígeno mediado por la molécula de unión al antígeno en las células. Así, la administración de una molécula de unión al antígeno puede mejorar la eliminación del antígeno y de tal modo reduce la concentración del antígeno en plasma.
Un anticuerpo de unión al antígeno dependiente de la
concentración de calcio, que une potentemente a un antígeno bajo una condición de alta concentración de calcio en plasma, y disocia del antígeno bajo una condición de baja concentración de calcio en el endosoma, puede disociar del antígeno dentro del endosoma. El anticuerpo de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio puede unirse a un antígeno de nuevo cuando se recicla al plasma a través del FcRn después de la disociación del antígeno. Así, tal único anticuerpo puede unirse repetidamente a los múltiples antígenos. Mientras tanto, un antígeno unido a la molécula de unión al antígeno no se recicla al plasma debido a que el antígeno disocia en el endosoma, y así, la molécula de unión al antígeno promueve la absorción del antígeno en las células. La administración de la molécula de unión al antígeno promueve la eliminación de un antígeno, y ésta permite una disminución de la concentración de antígeno en plasma.
La absorción del antígeno mediado por la molécula de unión al antígeno en las células puede ser facilitada además confiriendo la actividad de unión a FcRn humano bajo condiciones neutras (pH 7.4) a un anticuerpo que une a un antígeno de una manera dependiente al pH (unido bajo condiciones neutras pero disocia bajo condiciones ácidas). Así, la administración de una molécula de unión al antígeno puede mejorar la eliminación del antígeno y de tal modo reduce la concentración del antígeno en plasma. Normalmente, el anticuerpo y el complejo de antígeno-anticuerpo son tomados en las células mediante endocitosis no específica, y
después transportados a la superficie celular uniendo a FcRn bajo condiciones ácidas en el endosoma. El anticuerpo y el complejo de antígeno-anticuerpo se reciclan al plasma a través de la disociación del FcRn bajo la condición neutra en la superficie celular. Así, cuando un anticuerpo que exhibe suficiente dependencia del pH en la unión al antígeno (unido bajo condiciones neutras pero disocia bajo condiciones ácidas) une al antígeno en el plasma y después se disocia del antígeno unido en el endosoma, la velocidad de eliminación del antígeno se presume para ser igual a la velocidad de absorción del antígeno en las células a través de endocitosis no específica. Por una parte, cuando la dependencia del pH es insuficiente, el antígeno que no disoció en el endosoma también se recicla al plasma. Mientras tanto, cuando la dependencia del pH es suficiente, la etapa determinación de velocidad en la eliminación del antígeno es la absorción en las células mediante endocitosis no específica. Alguno del FcRn se presume estar localizado en la superficie celular debido a que el FcRn transporta anticuerpos del endosoma a la superficie celular.
Los presentes inventores presumieron que las inmunoglobulinas tipo IgG, que son una de moléculas de unión al antígeno, tiene comúnmente poca capacidad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro, pero las que exhiben capacidad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro podrían unir a FcRn en la superficie celular y son tomadas así en las células de una
manera dependiente de FcRn uniendo el FcRn de superficie celular. La velocidad de absorción mediada por FcRn en las células es más rápida que la velocidad de absorción en las células mediante endocitosis no específica. Así, la velocidad de eliminación del antígeno puede acelerarse además confiriendo la capacidad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro. Específicamente, una molécula de unión al antígeno que tiene capacidad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro transporta un antígeno en las células más rápidamente que la inmunoglobulina tipo IgG común (humana intacta), y entonces la molécula de unión al antígeno se disocia del antígeno en el endosoma. La molécula de unión al antígeno se recicla a la superficie celular o al plasma, y de nuevo une a otro antígeno y se toma en las células a través de FcRn. La velocidad de este ciclo puede ser acelerada mejorando capacidad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro, de tal modo acelerando la velocidad de eliminación del antígeno en plasma. Además, la eficacia puede ser mejorada además reduciendo la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menos que en el intervalo de pH neutro. Además, el número de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno puede unirse, se presume para aumentarse con un número aumentado de ciclos alcanzados por una sola molécula de unión al antígeno. La molécula de unión al antígeno de la presente invención comprende un dominio de unión al antígeno y
un dominio de unión a FcRn. Puesto que el dominio de unión a FcRn no afecta al unión al antígeno, o envista del mecanismo describió antes, la facilidad de la absorción del antígeno mediado por la molécula de unión al antígeno en las células puede esperarse sin importar el tipo de antígeno, y como un resultado aumenta la velocidad de eliminación del antígeno reduciendo la actividad de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido (capacidad de unión) a menos que en el intervalo de pH neutro y/o aumentando su actividad de unión a FcRn en el plasma pH.
En todos los usos anteriores las moléculas de unión al antígeno de la presente invención pueden también comprender una sustitución en la posición EU256 además de una sustitución en una o más posiciones mencionadas. Preferiblemente, el aminoácido en la posición EU256 se sustituye con un ácido glutámico. Además, todos los métodos anteriores de uso pueden también comprender una sustitución en la posición EU256 además de una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, por lo cual el aminoácido en la posición EU256 es sustituido preferiblemente con un ácido glutámico.
En una modalidad preferida de todos los usos y los métodos anteriores, la región de unión a FcRn es una región Fe en más preferiblemente, es una región Fe humana.
Por otra parte, la sustitución en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original para aumentar la actividad de unión a FcRn a pH neutro o ácido está preferiblemente en la posición EU252 y EU434 y una en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, y EU436. Más preferiblemente, las sustituciones están en tres o más posiciones donde dichas tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 2, y 4 a 7. Aún más preferiblemente, las sustituciones son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 3.
Además, los métodos anteriores de uso pueden comprender adicionalmente una etapa de introducir una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440, y de tal modo disminuyendo una mayor actividad de unión para un ADA preexistente. Preferiblemente, las sustituciones son combinaciones seleccionadas de la Tabla 11.
Además, los métodos anteriores de uso pueden también comprender una etapa adicional de introducir en una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU234, EU235, EU236, EU237, EU238, EU239, EU265, EU266, EU267, EU269, EU270, EU271, EU295, EU296, EU297 EU298, EU300, EU324, EU325, EU327, EU328, EU329, EU331, y EU332 (de
acuerdo con el sistema de numeración de EU). Preferiblemente, se introducen las sustituciones L235R/S239K. Preferiblemente, las sustituciones son combinaciones seleccionadas de la Tabla 14.
La molécula de unión al antígeno de todas los usos y los método anteriores de uso puede comprender un dominio de unión al antígeno dependiente al pH o un dominio de unión al antígeno dependiente del ión de calcio. La absorción del antígeno en las células mediadas por las moléculas de unión al antígeno de la presente invención es mejorada además reduciendo la actividad de unión al antígeno (capacidad de unión) en el intervalo de pH ácido de la molécula de unión al antígeno descrita antes a menos que su actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH neutro. También preferida es la mejora adicional de la absorción del antígeno en las células reduciendo la actividad de unión al antígeno (capacidad de unión) de la molécula de unión al antígeno de la presente invención en la disminución de la concentración de ion calcio (es decir de 0.5 a 10 micromoles) a menos que su actividad de unión al antígeno a alta concentración de ion calcio (es decir, de 100 micromoles a 10 mM), por ejemplo, sustituyendo el dominio de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno con un dominio de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio ionizado. Alternativamente, la molécula de unión al antígeno original ya comprende un dominio de unión al antígeno dependiente de la
concentración de calcio ionizado. Los métodos para reducir la actividad de unión al antígeno (capacidad de unión) en el intervalo de pH ácido alterando por lo menos un aminoácido en el dominio de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno descrita antes se describen antes. Preferiblemente, el dominio de unión al antígeno es alterado sustituyendo la histidina por al menos un aminoácido o insertando por lo menos una histidina en el dominio de unión al antígeno de la molécula de unión al antígeno descrita antes que facilita la absorción del antígeno en las células.
La eliminación de la molécula modificada de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión a FcRn a pH neutro o ácido puede disminuir cuando estas modificaciones aumentan la afinidad de la molécula de unión al antígeno para un ADA preexistente, por ejemplo, el factor reumatoide. Estos medios además modifican tal anticuerpo y de tal modo disminuyen la afinidad para un ADA preexistente, se disminuyó el número de ciclos puede aumentarse comparado con la molécula de unión al antígeno antes de la segunda modificación, y así antes de la afinidad para un ADA preexistente.
Estas moléculas de unión al antígeno de la presente invención cuya afinidad para un anticuerpo antifármaco preexistente no se aumentan significativamente a un pH neutro con respecto a una región Fe tipo silvestre, en particular las que se incluyen en el dominio de unión a FcRn una sustitución de
aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440, son particularmente útiles como anticuerpos terapéuticos para tratar pacientes humanos que sufren de una enfermedad autoinmune, rechazos de trasplantes (injerto contra -enfermedad del receptor), otras enfermedades inflamatorias y enfermedades alérgicas.
Una enfermedad autoinmune es una enfermedad que ocurre cuando el tejido del cuerpo es atacado por su propio sistema inmune. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes contempladas en la presente incluyen lupus eritematoso sistémico, nefritis por lupus, penfigoide, pénfigo, dermatomiositis, hepatitis autoinmune, síndrome de Sjogren, tiroiditis de Hashimoto, artritis reumatoide, diabetes juvenil (tipo 1), polimiositis, esclerodermia, enfermedad de Addison, enfermedad celíaca, síndrome de Guillain-Barre, miocardiopatía dilatada, enfermedad mixta del tejido conectivo, granulomatosis de Wegener, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, vitíligo, anemia perniciosa, glomerulonefritis, y fibrosis pulmonar. Miastenia gravis, enfermedad de Graves, púrpura trombocitopénica idiopática, anemia hemolítica, diabetes mellitus, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple, psoriasis, y enfermedades autoinmunes inducidas por fármacos, por ejemplo, lupus inducido por fármacos. Preferiblemente, la enfermedad autoinmune es lupus
eritematoso sistémico o nefritis por lupus. El rechazo al trasplante incluye la enfermedad de injerto contra huésped que es un proceso en el cual el sistema inmune del receptor de trasplante ataca al órgano o tejido trasplantado. Otras enfermedades inflamatorias y alérgicas incluyen aterosclerosis y fiebre del heno.
Una mayor afinidad de unión para un ADA preexistente puede reducir la utilidad y la eficacia clínicas de un anticuerpo terapéutico. Como tal la utilidad de un anticuerpo terapéutico puede limitarse por el ADA preexistente, puesto que este ADA puede influenciar su eficacia y farmacocinética (por ejemplo, índice de degradación). A veces esta unión puede llevar a efectos secundarios serios. Además, la presente invención proporciona un método para disminuir la actividad de unión a pH neutro para un ADA preexistente del dominio de unión al antígeno que comprende una región Fe con una mayor actividad de unión para FcRn a pH neutro o ácido y una mayor actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro.
La presente invención también proporciona el uso de las moléculas de unión al antígeno de la presente invención que comprende un dominio modificado de unión a FcRn para disminuir la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro de una molécula de unión al antígeno que tiene una mayor afinidad para FcRn a pH neutro o ácido y una mayor actividad de unión para un ADA preexistente.
En particular, la presente invención proporciona un método para disminuir la actividad de unión a pH neutro para un ADA preexistente de una región Fe de una molécula de unión al antígeno que tiene una mayor actividad de unión para FcRn a pH neutro o ácido, dicho método comprende
a) proporcionar una región Fe que tiene una mayor actividad de unión para FcRn a pH neutro o ácido y para un ADA preexistente a pH neutro y
b) sustituir un aminoácido en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU387, EU422, EU424,
EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
La región Fe preferida en la etapa a) es una región Fe humana. Preferiblemente, la región Fe que tiene una mayor actividad de unión para FcRn a intervalos de pH neutro o ácido y para el ADA preexistente en los intervalos de pH neutro comprende una sustitución de un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436. Preferiblemente, comprende una sustitución en las posiciones en cualquiera de las combinaciones de las posiciones seleccionadas de la Tabla 2 y 4 a 7. Aún más preferiblemente, comprende cualquiera de las sustituciones o combinaciones de sustituciones indicadas en las Tablas 3 y 17 a 20.
Preferiblemente, la etapa b) comprende sustituir un
aminoácido en cualquiera de las posiciones en la Tabla 8. Más preferiblemente, la etapa b) comprende introducir una de las sustituciones o de las combinaciones seleccionadas de la Tabla 11.
También preferiblemente, la molécula de unión al antígeno comprende adicionalmente un dominio de unión al antígeno dependiente al pH o un dominio de unión al antígeno dependiente del ión de calcio.
Por otra parte, la presente invención proporciona un método para disminuir la actividad de unión para un ADA preexistente de una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe que tiene una mayor actividad de unión para FcRn a pH neutro, dicho método comprende las etapas de:
a) proporcionar de una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe una mayor actividad de unión para FcRn a pH ácido y para un ADA preexistente a un pH neutro y
b) sustituir un aminoácido en la región Fe en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
La región Fe preferida en la etapa a) es una región Fe humana. Preferiblemente, la región Fe que tiene una mayor actividad de unión para FcRn en los intervalos de pH neutro y para el ADA preexistente en los intervalos de pH neutro comprende una sustitución de un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU238,
EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436. Puede también comprender una sustitución en la posición EU256 además de una sustitución en una o más posiciones mencionadas anteriormente, por lo cual el aminoácido en la posición EU256 es sustituido preferiblemente con un ácido glutámico. Más preferiblemente, comprende una sustitución en las posiciones de cualquiera de las combinaciones de posición seleccionadas de las Tablas 2 y 4 a 7. Aún más preferiblemente, comprende cualquiera de las sustituciones o las combinaciones de la sustitución seleccionadas de cualquiera de de la Tabla 3 y 17 a 20.
Preferiblemente, la etapa b) comprende sustituir un aminoácido en cualquiera de las posiciones en la Tabla 10. Más preferiblemente, las posiciones se seleccionan del grupo que consiste en a) EU387, b) EU422, c) EU424, d) EU438, e) EU440, f) EU422/EU424, y g) EU438/EU440. Aún más preferiblemente, la etapa b) comprende introducir una de las sustituciones o las combinaciones seleccionadas de la Tabla 11.
Por otra parte, la presente invención proporciona un método para disminuir la actividad de unión para un ADA preexistente de una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe que tiene una mayor actividad de unión para FcRn al pH ácido, dicho método comprende las etapas de:
a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que
comprende una región Fe con una mayor actividad de unión para FcRn al pH ácido y para un ADA preexistente a un pH neutro y b) sustituir un aminoácido en la región Fe en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
La región Fe preferida en la etapa a) es una región Fe humana. Preferiblemente, la región Fe que tiene una mayor actividad de unión para FcRn al pH ácido y para el ADA preexistente en los intervalos de pH neutro comprende una sustitución de aminoácido comprende una sustitución
i) en la posición EU434, o
ii) en dos o más posiciones, donde dos o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en a) EU252/EU254/EU256; b) EU428/EU434; y c) EU250/EU428 Preferiblemente, la región Fe comprende i) la sustitución de M434H; o ii) una de las combinaciones del grupo que consiste en a) EU252/EU254/EU256; b) EU428/EU434; y c) EU250/EU428 (numeración de EU).
En una modalidad preferida, en la etapa b) un aminoácido se sustituye en a) la posición EU424 o b) las posiciones EU438/EU440. Más preferiblemente, las sustituciones son a) EU424N o b) la combinación EU438R/EU440E.
En una modalidad adicional preferida, los métodos para disminuir la actividad de unión para un ADA preexistente comprenden además la etapa c) confirmar que dicha molécula de
unión al antígeno con un dominio Fe modificado tiene una menor actividad de unión para un ADA endógeno como se compara con la actividad de unión para la molécula de unión al antígeno original como se indica en la etapa a) comprendida de un dominio Fe intacto.
También preferiblemente, la molécula de unión al antígeno comprende adicionalmente un dominio de unión al antígeno dependiente al pH o un dominio de unión al antígeno dependiente del ión de calcio.
La presente invención proporciona el uso de una molécula de unión al antígeno de la presente invención para aumentar retiro del antígeno de la sangre de un mamífero, preferiblemente un paciente humano que sufre de una enfermedad autoinmune.
La presente invención además proporciona un método para aumentar el número total de antígenos a los cuales una sola molécula de unión al antígeno puede unirse sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de
a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original,
b) alterar el dominio de unión a FcRn original de la etapa a) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252,
EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436; y
c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
La presente invención además proporciona un método para facilitar la liberación extracelular de una molécula de unión al antígeno libre de antígeno tomada en las células en una forma unida al antígeno sin aumentar significativamente la actividad de unión de la molécula de unión a dicho antígeno para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, que comprende las etapas de
a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original,
b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, y EU428; y
c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más
posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
La presente invención además proporciona un método para aumentar la capacidad de una molécula de unión al antígeno para eliminar el antígeno en plasma sin aumentar significativamente la actividad de unión para el ADA preexistente a pH neutro comparado al anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de
a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original,
b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, y EU428; y
c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
La presente invención además proporciona un método para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión al antígeno sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original,
dicho método comprende las etapas de
a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original,
b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436; y
c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
La presente invención además proporciona un método para reducir la concentración plasmática del antígeno total o libre sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de
a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que pueda unir dicho antígeno,
b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del
dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436; y
c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
La región Fe preferida en la etapa a) en los métodos anteriores de uso es una región Fe humana. En una modalidad preferida, la sustitución de aminoácido en una o más posiciones en la etapa b) es una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, por lo cual la región Fe de la etapa b) tiene una mayor actividad de unión para FcRn y un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro. Puede también comprender una sustitución en la posición EU256 además de una sustitución en una o más posiciones mencionadas anteriormente, por lo cual el aminoácido en la posición EU256 se sustituye preferiblemente con un ácido glutámico. Más preferiblemente, comprende una sustitución en las posiciones de cualquiera de las combinaciones de posición seleccionadas de las Tablas 2 y 4 a 7. Aún más preferiblemente, comprende cualquiera de las
sustituciones o las combinaciones de sustitución seleccionadas de la Tabla 3 y 17 a 20.
Preferiblemente, la etapa c) comprende sustituir un aminoácido en cualquiera de las posiciones en la Tabla 10. Más preferiblemente, las posiciones se seleccionan del grupo que consiste en a) EU387, b) EU422, c) EU424, d) EU438, e) EU440, f) EU422/EU424, y g) EU438/EU440. Aún más preferiblemente, la etapa c) comprende introducir una de las sustituciones o de las combinaciones seleccionadas de la Tabla 11.
En otra modalidad preferida, la sustitución de aminoácido en una o más posiciones en la etapa b) es una sustitución
i) en la posición EU434, o
ii) en dos o más posiciones, donde dos o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en a) EU252/EU254/EU256; b) EU428/EU434; y c) EU250/EU428, por lo cual la región Fe de la etapa b) tiene una mayor actividad de unión a FcRn a intervalos ácidos y una mayor actividad de unión para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro. Preferiblemente, la región Fe comprende i) la sustitución M434H; o ii) una de las combinaciones del grupo que consiste en a) M252Y/S254T/T256E; b) M428L/N434S; y c) T250Q y M428L (numeración de EU). En una modalidad preferida, en la etapa c) un aminoácido se sustituye en a) la posición EU424 o b) las posiciones EU438/EU440. Más preferiblemente, las sustituciones son a) EU424N o la combinación EU438R/EU440E.
Composición farmacéutica
La presente invención también se relaciona con las composiciones farmacéuticas que incluyen moléculas de unión al antígeno de la presente invención, o moléculas de unión al antígeno producidas por los métodos de producción de la presente invención. Las moléculas de unión al antígeno de la presentes invención y las moléculas de unión al antígeno producidas por los métodos de producción de la presente invención tienen mayor actividad para reducir la concentración del antígeno en plasma mediante la administración con respecto a las moléculas de unión al antígeno comunes, y son por lo tanto útiles como composiciones farmacéuticas. La composición farmacéutica de la presente invención puede incluir portadores farmacéuticamente aceptables. En la presente invención, las composiciones farmacéuticas se refieren ordinariamente a los agentes para tratar o prevenir, o probar y diagnosticar enfermedades.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, pueden usarse parenteralmente, en la forma de inyecciones de soluciones o de suspensiones estériles incluyendo agua u otro líquido farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, tales composiciones pueden formularse mezclándose en la forma de unidad de dosis requerida en la práctica de fabricación de medicina aprobada generalmente por la
combinación apropiada con portadores o medios farmacéuticamente aceptables, específicamente con agua estéril, solución salina fisiológica, aceite vegetal, agente emulsionante, de suspensión, tensioactivo, estabilizador, saborizante, excipiente, vehículo, conservante, aglutinante, o similares. En tales formulaciones, la cantidad de ingrediente activo puede ser fácilmente y ajustarse de rutinariamente para obtener una cantidad apropiada en un intervalo predeterminado.
Las composiciones estériles para inyección pueden formularse al usar vehículos como agua destilada para inyección, de acuerdo con la práctica de formulación estándar. Las soluciones acuosas para inyección incluyen, por ejemplo, soluciones salinas e isotónicas fisiológicas que contienen dextrosa u otros adyuvantes (por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, D-manitol, y cloruro sódico). Es también posible usar en combinación solubilizantes apropiados, por ejemplo, alcoholes (etanol y similares), polialcoholes (propilenglicol, polietilenglicol, y similares), tensioactivos no iónicos (polisorbato 80(TM), HCO-50, y similares).
Los aceites incluyen aceite de sésamo y aceites de soja. El benzoato bencílico y/o alcohol bencílico pueden usarse en combinación como solubilizantes. Es también posible combinar amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de fosfato y amortiguador de acetato de sodio), agentes calmantes (por ejemplo, clorhidrato de procaína), estabilizadores (por ejemplo,
alcohol bencílico y fenol), y/o antioxidantes. Las ampollas apropiadas se llenan con las inyecciones preparadas.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se administran preferiblemente de manera parenteral. Por ejemplo, las composiciones pueden estar en la forma de dosificación para inyecciones, administración transnasal, administración transpulmonar, o administración transdérmica. Tales composiciones pueden administrarse sistémica o localmente por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, o similares.
Los métodos de administración pueden seleccionarse apropiadamente en consideración de la edad y de los síntomas del paciente. La dosis de una composición farmacéutica que contiene una molécula de unión al antígeno puede ser, por ejemplo, de 0,0001 a 1,000 mg/kg para cada administración. Alternativamente, la dosis puede ser, por ejemplo, de 0.001 a 100,000 mg por paciente. Sin embargo, la presente invención no está limitada por los valores numéricos descritos antes. Las dosis y los métodos de administración varían dependiendo del peso, la edad, los síntomas del paciente y similares. Los expertos en la técnica pueden ajustar la dosis y los métodos de administración apropiados en consideración de los factores descritos antes.
Los aminoácidos contenidos en las secuencias de aminoácidos de la presente invención pueden ser modificados
después de la translación. Por ejemplo, la modificación de una glutamina N terminal en un ácido piroglutámico mediante piroglutamilación es bien conocida por los expertos en la técnica. Naturalmente, tales aminoácidos modificados después de la translación se incluyen en las secuencias de aminoácidos en la presente invención.
Métodos de Producción
La presente invención proporciona métodos para producir moléculas de unión al antígeno de la presente invención. En particular, la presente invención proporciona de método para producir moléculas de unión al antígeno que tienen un dominio de unión a FcRn con una mayor actividad de unión para FcRn a pH neutro con respecto a una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe tipo silvestre.
La presente invención proporciona un método para producir una molécula de unión al antígeno, la cual comprende las etapas de:
(a) seleccionar un dominio de unión a FcRn original y alterar el FcRn original con una sustitución de un aminoácido en la secuencia de aminoácido con otro aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU252, EU434, EU436, EU315, EU311, EU308, EU307, EU286, EU254, EU250, EU238, EU387, EU422, EU424, EU428, EU438 y EU440;
(b) seleccionar un dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno y alterar por lo menos un
aminoácido en el dominio de unión al antígeno para conseguir un dominio de unión al antígeno dependiente al pH o un dominio de unión al antígeno dependiente del ión de calcio;
(c) obtener un gen que codifica una molécula de unión al antígeno en el cual el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno preparados en (a) y (b) se ligan; y
(d) producir una molécula de unión al antígeno al usar el gen preparado en (c).
Preferiblemente, la molécula de unión al antígeno seleccionada comprende un dominio de unión al antígeno que tiene una menor actividad de unión para el antígeno a un pH 5.5-6.5 que a pH 7-8 o tiene una actividad de unión al antígeno dependiente del calcio. Preferiblemente, el dominio de unión a FcRn de la etapa a) es un dominio de unión a FcRn de la presente invención. Más preferiblemente, el dominio de unión a FcRn comprende sustituciones de un aminoácido en tres o más posiciones, donde dichas tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 2, y 4 a 7. Aún más preferiblemente, el dominio de unión a FcRn comprende tres o más sustituciones donde dichas tres o más sustituciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 3, 17 a 20.
Las etapas (a) pueden comprender sustituir una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433,
EU434, y EU436 y seleccionar un dominio de unión a FcRn que tiene actividad de unión a FcRn humano más potente en el intervalo de pH neutro que la KD de 3.2 micromoles.
La etapa (b) puede comprender seleccionar un dominio de unión al antígeno y alterar por lo menos de un aminoácido en el dominio de unión al antígeno como se describe anteriormente para conseguir un dominio de unión al antígeno dependiente al pH, o seleccionar un dominio de unión al antígeno dependiente del ion de calcio. La alteración de un aminoácido es sustituir preferiblemente histidina por lo menos un aminoácido o insertar por lo menos una histidina. Mientras tanto, el sitio donde por lo menos una mutación de histidina se introduce no está particularmente limitado, y así se puede introducirse en cualquier posición siempre que la mutación de histidina reduzca la actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menos que esté en el intervalo de pH neutro. Tales mutaciones de histidina pueden introducirse en un solo sitio o dos o más sitios. Las etapas a) y b) pueden repetirse dos veces o más veces. El número de veces de repetir las etapas (a) y (b) no está particularmente limitado; sin embargo, el número es comúnmente diez veces o menos.
Un enlazador que une operativamente el dominio de unión a FcRn y el dominio de unión al antígeno preparado en (a) y (b) no se limitan a cualquier forma. El dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno pueden ligarse mediante
fuerzas covalentes o no covalentes. En particular, el enlazador puede ser un enlazador de péptido o un enlazador químico o un par de enlazado como una combinación de biotina y de estreptavidina. La modificación de un polipéptido incluye el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno se conoce en la técnica. En otra modalidad, el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno de la presente invención pueden ligarse formando una proteína de fusión entre el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno. Con el fin de construir la proteína de fusión entre el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno, los genes que codifican el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno pueden ligarse operacionalmente a fin de formarse en el polipéptido de fusión de marco. Apropiadamente, un enlazador que comprende el péptido que consiste en varios aminoácidos puede insertarse entre el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno. Varios enlazadores flexibles como el enlazador cuya secuencia consiste en (GGGGS)n (SEC ID NO: 11) se conocen en la técnica.
La presente invención además proporciona un método para producir una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn con una mayor actividad de unión para FcRn a pH neutro o ácido sin una actividad de unión significativamente mayor para un ADA preexistente a pH neutro
comparada con una molécula de unión al antígeno que comprende un región Fe tipo silvestre.
Preferiblemente, los métodos para producir una molécula de unión al antígeno que comprende una región Fe con una mayor actividad de unión para FcRn a pH neutro o ácido y una menor actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro, comprenden las etapas de:
(a) proporcionar una región Fe que tiene una mayor actividad de unión para FcRn en los intervalos de pH neutro o ácido y una mayor actividad de unión para un ADA preexistente en los intervalos de pH neutro,
b) sustituir un aminoácido en la secuencia de aminoácido de la región Fe en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
(c) alterar por lo menos un aminoácido en el dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno y seleccionar una molécula de unión al antígeno que tiene actividad de unión de un antígeno más potente en el intervalo de pH neutro que en el intervalo de pH ácido;
(d) obtener un gen que codifica una molécula de unión al antígeno en la cual el dominio de unión a FcRn humano preparado en (b) y el dominio de unión al antígeno preparado en (c) se ligan y
(e) producir una molécula de unión al antígeno al usar el
gen preparado en (d).
La región Fe preferida en la etapa a) es una región Fe humana. Preferiblemente, la región Fe que tiene una mayor actividad de unión para FcRn y el ADA preexistente en los intervalos de pH neutro o ácido y para el ADA preexistente en los intervalos de pH neutro comprende una sustitución de un aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436. Más preferiblemente, comprende sustituciones en las posiciones de cualquiera de las combinaciones de posición seleccionadas de las Tablas 2 y 4 a 7. Aún más preferiblemente, comprende cualquiera de las sustituciones o las combinaciones de sustituciones indicadas en cualquiera de las Tablas 3 y 17 a 20. Preferiblemente, la etapa a) incluye proporcionar una secuencia de nucleótido que codifica una región Fe que tiene una mayor actividad de unión para FcRn y el ADA preexistente en los intervalos de pH neutro o ácido.
Preferiblemente, las sustituciones en la etapa b) sustituciones de aminoácidos en una o más posiciones o una combinación de posición como se indica en la Tabla 10. Más preferiblemente, las sustituciones de la etapa b) son una de las combinaciones de sustitución indicadas en la Tabla 11. El aminoácido en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433,
EU436, EU438 y EU440 en la etapa b) es sustituido preferiblemente sustituyendo uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótido.
Las etapas (b) y (c) pueden realizarse en cualquier orden. Además, la etapa c) puede comprender alterar por lo menos un aminoácido en el dominio de unión al antígeno como se describe anteriormente para conseguir un dominio de unión al antígeno dependiente al pH, o seleccionar un dominio de unión al antígeno dependiente del ion de calcio. En la etapa (c), alterar un aminoácido es sustituir preferiblemente la histidina por lo menos un aminoácido o insertar por lo menos una histidina. Mientras tanto, el sitio donde por lo menos la una mutación de histidina se introduce no está particularmente limitado, y así puede introducirse en cualquier posición a fin de que la mutación de histidina reduzca la actividad de unión al antígeno en el intervalo de pH ácido a menos que esté en el intervalo de pH neutro. Tales mutaciones de histidina pueden introducirse en un solo sitio o dos o más sitios. Las etapas b) y c) pueden repetirse dos veces o más veces. El número de veces de repetir las etapas (b) y (c) no está particularmente limitado; sin embargo, el número es comúnmente diez veces o menos.
Un enlazador operablemente liga el dominio de unión a FcRn y el dominio de unión al antígeno preparado en (b) y (c) no se limita a cualquier forma. El dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno pueden ligarse mediante
fuerzas covalentes o no covalentes. En particular, el enlazador puede ser un enlazador de péptido o un enlazador químico o un par de unión como una combinación de biotina y de estreptavidina. La modificación de un polipéptido que incluye el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno se conoce en la técnica. En otra modalidad, el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno de la presente invención pueden ligares formando una proteína de fusión entre el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno. Para la construcción de la proteína de fusión entre el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno, los genes que codifican el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno puede ligarse operacionalmente a fin de formarse en el polipéptido de fusión de marco. Apropiadamente, un enlazador que comprende el péptido que consiste en varios aminoácidos puede insertarse entre el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno. Varios enlazadores flexibles como el enlazador cuya secuencia consiste en (GGGGS)n (SEC ID NO: 11) se conocen en la técnica.
Así, los métodos de producción de la presente invención pueden comprender además las etapas de alterar los aminoácidos descritos antes y sustituir o insertar la histidina. En los métodos de producción de la presente invención, los aminoácidos no naturales pueden usarse en vez de la histidina. Por lo tanto, la
presente invención puede también entenderse sustituyendo la histidina anterior por aminoácidos no naturales.
La etapa a) de los métodos de producción de la presente invención puede también comprender una sustitución en la posición EU256 además de una sustitución en una o más posiciones mencionadas anteriormente, por lo cual el aminoácido en la posición EU256 es sustituido preferiblemente con un ácido glutámico.
Además, los métodos de producción de la presente invención pueden comprender además una etapa que comprende sustituir un aminoácido en la secuencia de aminoácido de la región Fe en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU234, EU235, EU236, EU237, EU238, EU239, EU265, EU266, EU267, EU269, EU270, EU271, EU295, EU296, EU297 EU298, EU300, EU324, EU325, EU327, EU328, EU329, EU331, y EU332 (de acuerdo con el sistema de numeración de EU). Preferiblemente, se introducen las sustituciones
L235R/S239K.
Los dominios de unión a FcRn Original y las moléculas de unión al antígeno que los comprenden que se usan en los métodos de producción de la presente invención pueden prepararse por cualquier método. Por ejemplo, es posible usar anticuerpos preexistentes, bibliotecas preexistentes (bibliotecas de fagos y similares), anticuerpos y bibliotecas que se preparan a partir de hibridomas obtenidos inmunizando animales o a partir de
células B de animales inmunizados, anticuerpos y bibliotecas preparadas introduciendo alteraciones del aminoácido aleatorias en los anticuerpos y bibliotecas descritas antes, anticuerpos y bibliotecas preparados cerca introduciendo hístidina o mutaciones del aminoácido no natural en los anticuerpos y las bibliotecas descritas antes (bibliotecas con alto contenido de histidina o aminoácido no natural, bibliotecas introducidas con histidina o aminoácido no natural en sitios específicos, similares) y semejantes.
La actividad de unión al antígeno y la actividad de unión al FcRn humano de una molécula de unión al antígeno pueden determinarse por los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las condiciones a excepción del pH pueden determinarse apropiadamente por los expertos en la técnica.
En los métodos de producción descritos antes, el antígeno y la molécula de unión al antígeno pueden unirse entre sí en cualquier estado, y el FcRn humano y la molécula de unión al antígeno pueden unirse entre sí en cualquier estado. El estado no está particularmente limitado; por ejemplo, el antígeno o el FcRn humano pueden ponerse en contacto con una molécula de unión al antígeno inmovilizada para unir la molécula de unión al antígeno. Alternativamente, la molécula de unión al antígeno puede ponerse en contacto con un antígeno inmovilizado o un FcRn humano para unir la molécula de unión al antígeno. Alternativamente, la molécula de unión al antígeno puede ponerse
en contacto con el antígeno o el FcRn humano en una solución para unir la molécula de unión al antígeno.
Las moléculas de unión al antígeno producidas mediante los métodos descritos antes pueden ser cualquier molécula de unión al antígeno de la presente invención; y las moléculas de unión al antígeno preferidas incluyen, por ejemplo, estas que tienen un dominio de unión al antígeno que es un dominio de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio ionizado o un dominio de unión al antígeno con sustitución de histidina para aminoácidos o inserción de por lo menos una histidina, y dicha molécula de unión al antígeno además comprende un dominio de unión a FcRn humano, que comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436 (numeración de EU). La molécula de unión al antígeno de la presente invención puede también comprender una sustitución en la posición EU256 además de una sustitución en una o más posiciones mencionadas antes. Preferiblemente, el aminoácido en la posición EU256 se sustituye con un ácido glutámico. Más preferiblemente, el dominio de unión a FcRn comprende sustituciones de un aminoácido en tres o más posiciones, donde dichas tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 2, y 4 a 7. Aún más preferiblemente, el dominio de unión a FcRn comprende tres o
más sustituciones donde dichas tres o más sustituciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 3, 17 a 20
Las moléculas de unión al antígeno preferidas adicionales incluyen por ejemplo, estas que tienen un dominio de unión al antígeno que es un dominio de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio ionizado o un dominio de unión al antígeno con sustitución de histidina para aminoácidos o inserción de por lo menos una histidina, y dicha molécula de unión al antígeno comprende además una región Fe humana con sustituciones de aminoácidos en uno o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440. Más preferiblemente, el dominio de unión a FcRn contiene sustituciones de un aminoácido en el dominio de unión a FcRn humano en tres o más posiciones donde dichas tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 9 y 10.
Una molécula de unión al antígeno más preferida incluye estas que tienen un dominio de unión al antígeno que es un dominio de unión al antígeno dependiente de la concentración de calcio ionizado o un dominio de unión al antígeno con sustitución de histidina para aminoácidos o inserción de por lo menos una histidina, y dicha molécula de unión al antígeno comprende además una región Fe humana con sustituciones del aminoácido a) en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255,
EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, y
b) en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en: EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440 (numeración de EU).
Preferiblemente, el aminoácido en la posición EU256 se sustituye con un ácido glutámico.
Más preferiblemente, las moléculas de unión al antígeno comprenden una combinación de sustitución indicada en los Tablas 11 a 13.
Un anticuerpo que tiene una actividad deseada puede seleccionarse al evaluar un número de anticuerpos obtenidos a partir de bibliotecas o hibridomas de anticuerpos descritos a continuación.
Cuando se alteran los aminoácidos en una molécula de unión al antígeno, es posible usar una secuencia conocida para la secuencia de aminoácido de una molécula de unión al antígeno antes de la alteración o la secuencia de aminoácido de una molécula de unión al antígeno identificada nuevamente por los métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, cuando la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo, puede obtenerse a partir de bibliotecas de anticuerpos o clonando un gen que codifica anticuerpos a partir de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales.
Con respecto a bibliotecas de anticuerpos, muchas
bibliotecas de anticuerpos ya se conocen, y los métodos para producir bibliotecas de anticuerpos también se conocen; por lo tanto, los expertos en la técnica pueden obtener apropiadamente bibliotecas de anticuerpos. Por ejemplo, con respecto a bibliotecas de fagos, uno puede referir a la literatura como Clackson et al., Nature (1991) 352: 624-8; Marks et al., J. Mol. Biol. (1991) 222: 581-97; Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. (1993) 21: 2265-6; Griffiths et al., EMBO J. (1994) 13: 324.0-60; Vaughan et al., Nature Biotechnology (1996) 14: 309-14 y Número de Publicación de Kohyo de Patente Japonesa (JP-A) H20-504970 (publicación de fase nacional Japonesa no examinada que corresponde a una publicación internacional no Japonesa). Además, es posible usar métodos conocidos, como métodos que usan células eucarióticas como bibliotecas (WO 95/15393) y métodos de exhibición de ribosoma. Además, las tecnologías para obtener los anticuerpos humanos mediante la selección al usar bibliotecas de anticuerpos humanas también se conocen. Por ejemplo, regiones variables de anticuerpos humanos pueden expresarse en la superficie de fagos como simples anticuerpos de cadena (scFvs, por sus siglas en inglés) al usar métodos de exhibición de bacteriófagos, y fagos que unen a los antígenos pueden seleccionarse. El análisis genético de los fagos seleccionados puede determinare las secuencias de ADN que codifican las regiones variables de anticuerpos humanos que unen a los antígenos. Una vez que se revelan las secuencias de
ADN de los scFvs que unen a los antígenos, los vectores de expresión adecuados pueden producirse basados en estas secuencias para obtener anticuerpos humanos. Estos métodos son ya bien conocidos, y uno puede referirse a los documentos WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, y WO 95/15388.
En cuanto a los métodos para obtener genes que codifican anticuerpos a partir de hibridomas, las tecnologías conocidas pueden usarse básicamente, que implican el uso de antígenos o células deseadas que expresen los antígenos deseados como antígenos sensibilizantes, al usar éstos para realizar inmunizaciones de acuerdo con los métodos de inmunización convencionales, fusionando las células inmunes resultantes con células originales conocidas mediante métodos de fusión celular convencionales, evaluando las células productoras del anticuerpo monoclonal (hibridomas) mediante métodos de valoración convencionales, ADNc de sintetización de regiones variables de anticuerpo (regiones V) a partir de ARNm de los hibridomas obtenidos al usar transcriptasa inversa, y ligándolos a los ADN que codifica las regiones constantes de anticuerpo deseadas (regiones C).
Más específicamente, los antígenos sensibilizantes para obtener genes de molécula de unión al antígenos descritos antes que codifican las cadenas H y las cadenas L pueden incluir, por ejemplo, los antígenos completos con inmunogenicidad y los
antígenos incompletos incluyendo haptenos y similares sin inmunogenicidad; sin embargo no se limitan a estos ejemplos. Por ejemplo, es posible usar proteínas enteras y péptidos parciales de proteínas de interés. Además, se conoce que las sustancias que comprenden polisacáridos, ácidos nucleicos, lípidos, y similares pueden ser antígenos. Así, los antígenos de las moléculas de unión al antígeno de la presente invención no están particularmente limitados. Los antígenos pueden prepararse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante métodos basados en baculovirus (por ejemplo, WO 98/46777) y similares. Los hibridomas pueden producirse, por ejemplo, mediante el método de Milstein et al. (G. Kohler y C. Milstein, Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) y similares. Cuando la inmunogenicidad de un antígeno es baja, la inmunización puede realizarse después de ligar el antígeno a una macromolécula que tiene inmunogenicidad, como albúmina. Alternativamente, si es necesario, los antígenos pueden convertirse en antígenos solubles ligándolos a otras moléculas. Cuando las moléculas de membrana como antígenos de membrana (por ejemplo, receptores) se usan como antígenos, las porciones de las regiones extracelulares de los antígenos de membrana pueden usarse como un fragmento, o células que expresan moléculas de transmembrana en su superficie celular pueden usarse como inmunógenos.
Las células productoras de la molécula de unión al antígeno
puede obtenerse inmunizando animales al usar antígenos sensibilizantes apropiados descritos antes. Alternativamente, las células productoras de la molécula de unión al antígeno pueden prepararse mediante inmunización in vitro de linfocitos que pueden producir moléculas de unión al antígeno. Varios mamíferos pueden usarse para inmunización; tales animales usados generalmente incluyen roedores, lagomorfos, y primates. Tales animales incluyen, por ejemplo, roedores como ratones, ratas, y hámsteres; lagomorfos como conejos; y primates incluyendo monos como macacos, macacos de la India, babuinos, y chimpancés. Además, los animales transgénicos que llevan repertorios de gene de anticuerpo humano también se conocen, y los anticuerpos humanos pueden obtenerse al usar estos animales (ver el documento WO 96/34096; Méndez et al., Nat. Genet. (1997) 15: 146-56). En vez de usar tales animales transgénicos, por ejemplo, los anticuerpos humanos deseados que tenían actividad de unión contra antígenos pueden obtenerse mediante sensibilización in vitro de linfocitos humanos con antígenos o células deseadas que expresaban los antígenos deseados, y después se fusionan los linfocitos sensibilizados con células de mieloma humana como U266 (ver Número de Publicación Kokoku de Solicitud de Patente Japonesa (JP-B) H01-59878 (solicitud de patente Japonesa examinada, aprobada publicada para oposición)). Además, los anticuerpos humanos deseados pueden obtenerse inmunizando animales transgénicos
que llevan un repertorio completo de genes de anticuerpos humanos, con antígenos deseados (ver los documentos WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 96/34096, y WO 96/33735).
La inmunización animal puede realizarse apropiadamente diluyendo y suspendiendo un antígeno sensibilizante en solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés), solución salina fisiológico, o similares, y mezclándolo con un adyuvante para emulsionar, si es necesario. Este entonces se inyecta intraperitoneal o subcutáneamente en animales. Entonces, el antígeno sensibilizante mezclado con el adyuvante incompleto de Freund se administra preferiblemente varias veces cada cuatro a 21 días. La producción del anticuerpo puede confirmarse midiendo el título del anticuerpo de interés en los sueros animales al usar métodos convencionales.
Las células productoras de moléculas de unión al antígeno obtenidas a partir de linfocitos o de animales inmunizados con un antígeno deseado puedes fusionarse con células de mieloma para generar hibridomas al usar agentes de fusión convencionales (por ejemplo, polietileng licol) (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies y Practice, Academic Press, (1986) 59-103). Cuando se requiera, las células de hibridoma pueden cultivarse y hacerse crecer, y la especificidad de unión de la molécula de unión al antígeno producida a partir de estos hibridomas puede medirse al usar métodos de análisis conocidos, como inmunoprecipitación,
radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés), y ensayo inmunosorbente ligado a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés). Después de esto, si es necesario, los hibridomas que producen moléculas de unión al antígeno de interés cuya especificidad, afinidad, o actividad se ha determinado pueden subclonarse mediante métodos como dilución limitante.
Después, los genes que codifican las moléculas de unión al antígeno seleccionadas pueden clonarse a partir de hibridomas o las células productoras de moléculas de unión al antígeno (linfocitos sensibilizados, y similares) al usar sondas que pueden unir específicamente a las moléculas de unión al antígeno (por ejemplo, oligonucleótidos complementarios a secuencias que codifican las regiones constantes de anticuerpo). Es también posible clonar los genes del ARNm al usar RT-PCR. Las inmunoglobulinas se clasifican en cinco diferentes clases, IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Estas clases se dividen además en varias subclases (isotipos) (por ejemplo, lgG-1, lgG-2, lgG-3, e lgG-4; lgA-1 e lgA-2; y similares). Las cadenas H y las cadenas L usadas en la presente invención para producir moléculas de unión al antígeno no están particularmente limitadas y pueden originarse de anticuerpos que pertenecen a cualquiera de estas clases o subclases; sin embargo, la IgG es particularmente preferida.
En la presente, es posible alterar genes codificantes de
cadena H y genes codificantes de cadena L al usar tecnologías de ingeniería genética. Los anticuerpos genéticamente alterados, como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, que se han alterado artificialmente con el fin de disminuir la inmunogenicidad heteróloga y similares contra humanos, pueden producirse apropiadamente para los anticuerpos como anticuerpos de ratón, anticuerpos de rata, anticuerpos de conejo, anticuerpos de hámster, anticuerpos de ovejas, y anticuerpos de camello. Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos que incluyen regiones variables de cadena H y de cadena L de anticuerpo de mamífero no humano, como anticuerpo de ratón, y las regiones constantes de cadena H y de cadena L de anticuerpo humano. Los anticuerpos quiméricos pueden obtenerse ligando un ADN que codifica una región variable de un anticuerpo de ratón a un ADN que codifica una región constante de un anticuerpo humano, insertando este en un vector de expresión, e introduciendo el vector en un huésped para producir el anticuerpo. Un anticuerpo humanizado, que también se llama un anticuerpo humano reformado, puede sintetizarse mediante PCR al usar varios oligonucleótidos producidos de modo que tiene porciones traslapadas en los extremos de las secuencias de ADN diseñadas para ligar las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) de un anticuerpo de un mamífero no humano como un ratón. El ADN resultante puede ligarse a un ADN que codifica una región constante de anticuerpo humano. El
ADN ligado puede insertarse en un vector de expresión, y el vector puede introducirse en un huésped para producir el anticuerpo (ver los documentos EP 239400 y WO 96/02576). Se selecciona los FR de anticuerpo humano que se ligan a través de la CDR cuando la CDR forma un sitio de unión al antígeno favorable. Si es necesario, los aminoácidos en la región de marco de una región variable de anticuerpo pueden sustituirse de tal manera que la CDR del anticuerpo humano reformado forma un sitio de unión al antígeno apropiado (K. Sato et al., Cáncer Res. (1993) 53: 10.01-10.06).
Además de la humanización descrita antes, los anticuerpos pueden alterarse para mejorar sus propiedades biológicas, por ejemplo, la unión al antígeno. En la presente invención, tales alteraciones pueden alcanzarse por métodos como mutagénesis dirigida al sitio (ver por ejemplo, Kunkel (1910.0) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82: 488), mutagénesis de PCR, y mutagénesis de cásete. En general, los anticuerpos mutantes cuyas propiedades biológicas han sido mejoradas muestran homología de secuencia de aminoácido y/o similitud del 70% o mayor, más preferiblemente 80% o mayor, y aún más preferiblemente 90% o mayor (por ejemplo, 95% o mayor, 97%, 98%, o 99%), cuando se compara con la secuencia de aminoácido de la región variable de anticuerpo original. En la presente, homología de secuencia y/o similitud se define como la relación de los residuos de aminoácidos que son homólogos (mismo residuo) o similares
(residuos de aminoácidos clasificados en el mismo grupo basado en las propiedades generales de las cadenas laterales de aminoácido) a los residuos de anticuerpo original, después de que el valor de la homología de la secuencia haya sido maximizado por la alineación de la secuencia y la introducción de separación, si es necesario. En general, los residuos del aminoácido natural se clasifican en los grupos basados en las características de sus cadenas laterales como sigue:
(1) hidrofóbico: alanina, isoleucina, valina, metionina, y leucina;
(2) hidrofílico neutro: asparagina, glutamina, cisteína, treonina, y serina;
(3) ácido: ácido aspártico y ácido glutámico;
(4) básico: arginina, histidina, y Usina;
(5) residuos que afectan la orientación de la cadena: glicina, y prolina; y
(6) aromático: tirosina, triptófano, y fenilalanina.
Además, la presente invención proporciona genes que codifican el dominio de unión a FcRn de la presente invención y las moléculas de unión al antígeno de la presente invención. Los genes que codifican las moléculas de unión al antígeno de la presente invención pueden ser cualquier gen, y pueden ser ADNs, ARNs, análogos del ácido nucleico, o similares.
Además, la presente invención también proporciona células hospedadoras que llevan los genes descritos antes. Las células
hospedadoras no están particularmente limitadas y no incluyen, por ejemplo, E. coli y varias células animales. Las células hospedadoras pueden usarse, por ejemplo, como sistema de producción para producir y para expresar los anticuerpos de la presente invención. Los sistemas de producción in vitro e in vivo están disponibles para los sistemas de producción de polipéptido. Tales sistemas de producción in vitro incluyen, por ejemplo, sistemas de producción al usar células eucarióticas o células procarióticas.
Las células eucarióticas que pueden usarse como células hospedadoras incluyen, por ejemplo, células animales, células de plantas, y células fungicidas. Las células animales incluyen: células mamíferas, por ejemplo, CHO (Línea celular de ovario de hámster chino), COS (línea celular de riñón de mono), mieloma (Sp2/0, NSO etc), BHK (línea celular de riñón de hámster bebé) Hela, Vero, HEK293 (línea celular de riñón embrionario humano con ADN de adenovirus dividido (Ad)5), células PER.C6 (línea celular de retiniana embrionaria humana transformada con los genes E1A y E1B del Adenovirus Tipo 5 (Ad5)) 293, etc (ver Current Protocols in Protein Science (mayo, 2001, Unidad 5.9, Tabla 5.9.1)), células anfibias como oocitos de Xenopus laevis (Valle et al., Nature (1981) 291: 338-340); y células de insectos como células Sf9, Sf21, y Tn5.CHO-DG44, CHO-DX11 B, células COS7, células HEK293, y células BHK se usan preferiblemente para expresar los anticuerpos de la presente invención. Entre las
células animales, las células CHO son particularmente preferibles para la expresión a gran escala. Los vectores pueden introducirse en las células hospedadoras, por ejemplo, mediante métodos de fosfato de calcio, métodos de DEAE-dextrano, métodos que usan el liposoma catiónico DOTAP (Boehringer-Mannheim), métodos de electroporación, y métodos de lipofección.
Con respecto a las células de plantas, por ejemplo, células derivadas de Nicotiana tabacum y lenteja de agua (Lemna menor) se conocen como sistema de producción de proteína. Los callos pueden cultivarse a partir de estas células para producir las moléculas de unión al antígeno de la presente invención. Con respecto a células fungicidas, los sistemas de expresión de proteína conocidos son los que usan células de levadura, por ejemplo, células del género Saccharomyces (como Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe); y células de hongos filamentosos, por ejemplo, género Aspergillus (como Aspergillus niger). Estas células pueden usarse como un huésped para producir las moléculas de unión al antígeno de la presente invención.
Las células bacterianas pueden usarse en los sistemas de producción procarióticos. Con respecto a las células bacterianas, los sistemas de producción que usan Bacillus subtilis se conocen además de los sistemas de producción que usan E. coli descritos antes. Tales sistemas pueden usarse en producir las moléculas
de unión al antígeno de la presente invención.
Los genes obtenidos mediante los métodos de producción de la presente invención son llevados comúnmente por (insertados en) vectores apropiados, y después introducidos en las células hospedadoras. Los vectores no están particularmente limitados siempre que retengan establemente los ácidos nucleicos insertados. Por ejemplo, cuando la E. coli se usa como el huésped, los vectores de clonación preferidos incluyen el vector pBluescript (Stratagene); sin embargo, varios vectores comercialmente disponibles pueden usarse. Cuando se usan vectores para producir las moléculas de unión al antígeno de la presente invención, los vectores de expresión son particularmente útiles. Los vectores de expresión no están particularmente limitados siempre que los vectores expresen las moléculas de unión al antígeno in vitro, en E. coli, en células cultivadas, o en un cuerpo de un organismo. Por ejemplo, el vector pBEST (Promega) es preferido para la expresión in vitro; el vector pET (Invitrogen) es preferido para E. coli; el vector pME18S-FL3 (Número de acceso de GenBank AB009864) es preferido para las células de cultivo; y el vector pME18S (Mol Cell Biol. (1988) 8: 466-472) es preferido para los cuerpos de organismos. Además, la proteína EBNA1 puede co-expresarse para aumentar el número de clones del gen de interés. En este caso, se usa un vector que incluye OriP como un sitio de iniciación de replicación (Biotechnol Bioeng. 20 de octubre de 2001,75(2): 197-203, Biotechnol Bioeng.
20 de septiembre de 2005;91 (6):670-7.) Los ADN de la presente invención puede insertarse en los vectores mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante ligadura al usar sitios de enzima de restricción (Current protocols in Molecular Biology, edit. Ausubel et al., (1987) Publish. John Wiley & Sons, Section 11.4-11.11).
Las células hospedadoras anteriores no están particularmente limitadas, y varias células hospedadoras pueden usarse dependiendo del propósito. Los ejemplos de las células para expresar las moléculas de unión al antígeno incluyen células bacterianas (como las de Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Streptomyces, y Bacillus subtilis), células eucarióticas (como las de levadura y Aspergillus), células de insectos (como Drosophila S2 y Spodoptera SF9), células animales (como CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, y células de melanoma de Bowes), y células de plantas. Los vectores pueden introducirse en una célula hospedadora mediante métodos conocidos, por ejemplo, métodos de precipitación de fosfato de calcio, métodos de electroporación (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, Section 9.1-9.9), métodos de lipofección, y métodos de microinjección.
Las células hospedadoras pueden cultivarse mediante métodos conocidos. Por ejemplo, cuando se usan células animales como un huésped, DMEM, MEM, RPMI1640, o IMDM
pueden usarse como el medio de cultivo. Se pueden usar con suplementos de suero como FBS o suero de becerro fetal (FCS, por sus siglas en inglés). Las células pueden cultivarse en cultivos libres de suero. El pH preferido es de aproximadamente 6 a 8 durante el curso del cultivo. La incubación se realiza comúnmente de 30 a 40°C por aproximadamente de 15 a 200 horas. Se intercambia, se airea, o se agita, como sea necesario el medio.
Las señales de secreción apropiadas pueden incorporarse a polipéptidos de interés de manera que las moléculas de unión al antígeno expresadas en la célula hospedadora e secretan en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico, o en el ambiente extracelular. Estas señales pueden ser endógenas a las moléculas de unión al antígeno de interés o pueden ser señales heterólogas.
Por una parte, por ejemplo, los sistemas de producción que usan animales o plantas pueden usarse como sistemas para producir polipéptidos ¡n vivo. Un polinucleótido de interés se introduce en un animal o una planta y el polipéptido se produce en el cuerpo del animal o de la planta, y después se recolecta. Los "huéspedes" de la presente invención incluyen tales animales y plantas.
El sistema de producción que usa animales incluye estos que usan mamíferos o insectos. Es posible usar mamíferos como cabras, cerdos, ovejas, ratones, y bovinos (Vicki Glaser
SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). Los mamíferos pueden ser animales transgénicos.
Por ejemplo, un polinucleótido que codifica una molécula de unión al antígeno de la presente invención se prepara como un gen de fusión con un gen que codifica un polipéptido producido específicamente en leche, como la beta-caseína de cabra. Después, los embriones de cabra se inyectan con fragmentos de polinucleótido que contienen el gen de fusión, y después se trasplantan a las cabras hembra. Las moléculas de unión al antígeno deseadas pueden obtenerse de la leche producida por las cabras transgénicas, que nacen de las cabras que recibieron los embriones, o de sus descendientes. Las hormonas pueden administrarse como sea apropiado para aumentar el volumen de con leche que contiene la molécula de unión al antígeno producida en las cabras transgénicas (Ebert et al., Bío/Technology (1994) 12: 699-702).
Los insectos como gusanos de seda pueden usarse para producir las moléculas de unión al antígeno de la presente invención. Cuando se usan los gusanos de seda, los baculovirus que llevan un polinucleótido que codifica una molécula de unión al antígeno de interés pueden usarse para infectar los gusanos de seda, y la molécula de unión al antígeno de interés pueden obtenerse de sus fluidos corporales.
Además, cuando las plantas se usan para producir las moléculas de unión al antígeno de la presente invención, por
ejemplo, el tabaco puede usarse. Cuando se usa el tabaco, un polinucleótido que codifica una molécula de unión al antígeno de interés se inserta en un vector de expresión de planta, por ejemplo, pMON 530, y entonces el vector se introduce en las bacterias, como Agrobacterium tumefaciens. Las bacterias entonces se permiten infectar el tabaco como Nicotiana tabacum, y las moléculas de unión al antígeno deseadas pueden recolectarse de sus hojas (Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-138). Alternativamente, es posible infectar la lenteja de agua (Lemna menor) con bacterias similares. Después de la clonación, las moléculas de unión al antígeno deseadas pueden obtenerse a partir de las células de la lenteja de agua Cox KM et al., Nat. Biotechnol. diciembre de 2006; 24(12): 1591-1597).
Las moléculas de unión al antígeno así obtenidas pueden aislarse desde el interior o del exterior (como el medio y la leche) de las células hospedadoras, y purificarse como moléculas de unión al antígeno sustancialmente puras y homogéneas. Los métodos para aislar y purificar las moléculas de unión al antígeno no están particularmente limitados, y los métodos de aislamiento y de purificación usados generalmente para la purificación de polipéptido pueden usarse. Las moléculas de unión al antígeno pueden aislarse y purificarse, mediante selección y combinación apropiadamente, por ejemplo, columnas de cromatografía, filtración, ultrafiltración, desalado, precipitación de solvente, extracción de solvente, destilación, inmunoprecipitación,
electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, enfoque isoeléctrico, diálisis, y recristalización.
Los ejemplos de las técnicas de cromatografía incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, filtración en gel, cromatografía de fase inversa, y la cromatografía de adsorción (Strategies for Protein Purification y Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. arshak et al., (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). Tales métodos cromatográficos pueden conducirse al usa cromatografía de fase líquida como HPLC y FPLC. Las columnas usadas para la cromatografía de afinidad incluyen, columnas de proteína A y columnas de proteína G. Las columnas que usan la proteína A incluyen, por ejemplo, Hyper D, POROS, y Sefarosa F. F. (Pharmacia).
Si es necesario, una molécula de unión al antígeno puede modificarse arbitrariamente, y los péptidos pueden suprimirse parcialmente permitiendo que una enzima de modificación de proteína apropiada actúe antes o después de la purificación de la molécula de unión al antígeno. Tales enzimas de modificación de proteína incluyen, por ejemplo, tripsina, quimotripsina, lisilendopeptidasas, proteínas cinasas, y glucosidasas.
Ejemplos
Mientras que la presente invención se describe en la presente en detalle y con referencia a las modalidades
específicas de la misma, debe entenderse que la descripción anterior es ejemplar y explicativa en naturaleza y se propone para ilustrar la presente invención y sus modalidades preferidas. A través de la experimentación rutinaria, un experto en la técnica reconocerá fácilmente que varios cambios y modificaciones pueden hacerse en la presente sin apartarse del espíritu y del alcance de la presente invención, cuyos términos y límites de la cual se definen por las reivindicaciones anexas.
[Ejemplo 1] La construcción de la nueva afinidad de unión al FcRn a pH neutro mejoró las variantes de Fe
Las regiones Fe de la molécula de unión al antígeno (anticuerpo) que interactúan con FcRn (Nat Rev Immunol. septiembre de 2007; 7(9):715-25) se modificaron para tener una afinidad de unión mejorada a FcRn a pH neutro para mejorar la eliminación de antígeno del plasma. El mecanismo de la eliminación de antígeno del plasma por el anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH con afinidad de unión mejorada a FcRn a pH neutro con respecto al anticuerpo convencional se muestra en la Figura 1A.
Los Ejemplos 1-17 del documento WO2011/122011 describen las mutaciones (sustituciones de aminoácidos) que mejoran la afinidad de unión a FcRn a pH neutro y describen las variantes Fe de F1 a F599 (Tabla 16) que se generaron con el foco en mejorar la afinidad de unión a FcRn a pH neutro de anticuerpos. Sin embargo, para el desarrollo farmacéutico de los anticuerpos que comprenden
tales variantes Fe, no sólo su propiedad farmacológica (es decir, unión a FcRn mejorado) sino también la estabilidad, la pureza y la inmunogenicidad deben considerarse. Los anticuerpos que exhiben pobre estabilidad y pureza no son adecuados como fármaco, y la pobre inmunogenicidad obstaculizaría su desarrollo clínico.
1-1. Diseño y generación de variantes Fe con afinidad de unión mejorada al hFcRn a pH neutro
Se diseñaron varias variantes Fe con afinidad de unión mejorada al hFcRn a pH neutro mientras mantenía alta estabilidad, alta pureza y bajo riesgo de inmunogenicidad. Las mutaciones (sustituciones de aminoácidos) introducidas en la región Fe de la Ig G 1 tipo silvestre se muestran para cada una de las variantes Fe en la Tabla 16 (lgG1-FI a FI434). Las sustituciones de aminoácidos se introdujeron en VH3-lgG1 (SEC ID NO: 1) para generar las variantes Fe por el método conocido por los expertos en la técnica descrito en el Ejemplo de Referencia 1 del documento WO201 /1220 1.
[Tabla 1]
Variantes Fe
Las variantes (lgG1-F600 a lgG-F1434) cada una comprende una cadena pesada preparada como se describe anteriormente y L(WT)-CK (SEC ID NO: 2) se expresó y purificó mediante el método conocido por los expertos en la técnica descrito en el Ejemplo de Referencia 2 del documento WO2011/122011.
1-2. Evaluación de afinidad de unión a FcRn de las variantes Fe al usar Biacore
Se preparó la afinidad de unión a hFcRn de las nuevas variantes Fe en el Ejemplo 1 (F600-F1434) y las variantes Fe anteriores preparadas en el Ejemplo 1 del documento WO2011/122011 (F1-F599) se evaluaron al usar Biacore T100 (GE Healthcare). Para este propósito, se preparó el FcRn humano como se describe en el Ejemplo de Referencia A2. Se inmovilizó una cantidad apropiada de la proteína L (ACTIGEN) sobre la matriz de Sensor CM4 (GE Healthcare) mediante el método de combinación de amino, y la matriz se dejó capturar en un anticuerpo de interés. Entonces, se inyectaron las soluciones de FcRn diluidas y el amortiguador de corrida (como solución de referencia) para dejar que el FcRn humano interactué con el anticuerpo capturado en la matriz de sensor. El amortiguador de corrida usado comprende 50 mmol/l de fosfato de sodio, 150 mmol/l de NaCI, y 0.05% (p/v) de Tween 20 (pH 7.0). Se diluyó el FcRn al usar cada amortiguador. Se regeneró la matriz al usar 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5). Se realizaron los ensayos exclusivamente a 25°C. La constante de velocidad de disociación ka (1/Ms) y la constante de velocidad de asociación kd (1/s), ambas de las cuales son parámetros cinéticos, se calcularon basadas en los sensogramas obtenidos en los ensayos, y se determinó la KD (M) de cada anticuerpo para el FcRn humano a partir de estos valores. Se calculó cada parámetro al usar el
Software de Evaluación Biacore T100 (GE Healthcare). La afinidad de unión de todas las variantes Fe se muestra en la Tabla 16.
1-3. Evaluación de estabilidad de las variantes Fe al usar fluorimetría diferencial de barrido (DSF, por sus siglas en inglés)
Se preparó la estabilidad de las nuevas variantes Fe en el Ejemplo 1 (F600-F1434) y se evaluaron las variantes Fe anteriores preparadas en el Ejemplo 1 del documento WO2011/122011 (F1-F599) al usar la fluorimetría diferencial de barrido (DSF, por sus siglas en inglés). Este método consiste en medir la intensidad de fluorescencia de una sonda sensible a polaridad a temperaturas aumentadas gradualmente, y obtener la temperatura de transición de la exposición de las regiones hidrofóbicas de las proteínas. Ya se reportó que las temperaturas de transición adquiridas al usar DSF están en una buena correlación con las temperaturas de fusión adquiridas al usar la calorimetría diferencial de barrido (Journal of Pharmaceutical Science 2010; 4: 1707-1720). Se diluyó el tinte de color anaranjado SYPRO (Sondas moleculares) en PBS (Sigma), y se agregó a las soluciones de proteína. Se usó cada muestra con 20 microlitros de la solución teñida. Se recolectó la emisión de fluorescencia a 555 nm con una longitud de onda de excitación fija a 470 nm. Durante el experimento de DSF, se aumentó la temperatura de 30 a 99°C e incrementos de 0.4°C con un tiempo de equilibrio de 6 segundos en cada temperatura antes de la
medición. Se analizaron los datos al usar el software Serie Rotor-Gene Q (QIAGEN). Se definió la temperatura de la transición de fluorescencia como la temperatura de fusión (Tm, por sus siglas en inglés). Los valores de la Tm de las variantes Fe F1-F1434 se muestran en la Tabla 16.
1-4. Evaluación de pureza de las variantes Fe al usar cromatografía de exclusión por tamaño (SEC. por sus siglas en inglés)
El porcentaje de la especie de alto peso molecular (HMW (%), por sus siglas en inglés) de las nuevas variantes Fe preparado en el Ejemplo 1 (F600-F1434) y las variantes Fe anteriores preparadas en el Ejemplo 1 del documento WO2011/122011 (F1-F599) se evaluaron al usar la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC, por sus siglas en inglés). Se realizó la SEC en el sistema de Clase ACQUITY UPLC H (Waters). Se inyectaron los anticuerpos sobre una columna BEH200 SEC (1.7 micrómetros, 4.6 x 150 mm, Waters). La fase móvil fue 0.05 M de fosfato de sodio, 0.3 M de cloruro sódico (pH 7.0, Isekyu), implementada isocráticamente a una velocidad de flujo de 0.3 ml/min. Se detectaron las proteínas eluidas mediante absorbencia UV a 215 nm. Se analizaron los datos al usar Empower2 (Waters). Se registraron los máximos de elución antes que el máximo del monómero de anticuerpo en el porcentaje de los componentes de HMW. La HMW (%) de todas las variantes Fe (F1-F1434) se muestran en la Tabla 16.
1-5. Evaluación del riesgo de inmunogenicidad de variantes Fe al usar en la Epibase de herramienta de predicción de inmunogenicidad en silico
La utilidad y la eficacia clínicas de los anticuerpos terapéuticos pueden limitarse por la producción de anticuerpos antifármacos (ADAs, por sus siglas en inglés), puesto que la ADA puede influenciar su eficacia y farmacocinética y llevar a veces a efectos secundarios serios. Aunque muchos factores influencien la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos, un número de reportes describen la importancia de los epítopos efectores de células T presentes en la proteína terapéutica.
En las herramientas de silico para predecir epítopos células T, como Epibase (Lonza), se han desarrollado ¡Tope/TCED (Antitope) y EpiMatrix (EpiVax). Al usar éstas herramientas en silico, la presencia del epítopo de células T en cada secuencia de aminoácido se puede predecir (Expert Opin Biol Ther. marzo de 2007;7(3):405-18.), permitiendo la evaluación de la inmunogenicidad potencial de las variantes Fe. Se usó Epibase Light (Lonza) para evaluar la inmunogenicidad potencial de las variantes Fe.
La Epibase Light (Lonza) es una herramienta en silico para calcular la afinidad de unión del péptido 9 mer para alelos DRB1 mayores al usar un algoritmo FASTER (Expert Opin Biol Ther. marzo de 2007;7(3):405-18.). La Epibase Light (Lonza) identifica epítopos de células T con unión potente y media la une a MHC
clase II. Se calculó el conteo de inmunogenicidad en s i I ico para cada una de las variantes Fe al usar la siguiente fórmula incorporada en sistema de Epibase Light (Lonza). Conteo de inmunogenicidad = Suma ((cada frecuencia de población del alotipo DRB1) x (número de epítopos críticos)).
Para la frecuencia de población del alotipo DRB1 usada en la fórmula, se usó la siguiente frecuencia de la población del alotipo de DRB1 basada en la población Caucásica.
DRB1*0701 (25.3%), DRB1 501 (23.1%), DRB1*0301 (21.7%), DRB1*0101 (15.3%), DRB1*0401 (13.8%), DRB1*1101 (11.8%), DRB1 302 (8.0%), DRB1*1401 (4.9%), DRB1*0403 (2.3%), DRB1*0901 (1.8%).
Se usó el número total de cualquier epítopo de unión potente y medio identificado en la región constante (CH1-hinge-CH2-CH3) de las variantes por el algoritmo FASTER como el número de epítopos críticos en la fórmula. Los epítopos filtrados son aquellos con la secuencia de línea germinal del anticuerpo humano o regiones de unión entre la región variable y la región constante, y solamente se consideran los epítopos no filtrados (contado como epítopo crítico) en el cálculo de conteo de inmunogenicidad.
Se calculó el conteo de inmunogenicidad de la secuencia de aminoácido de las nuevas variantes Fe de describe en el Ejemplo 1 (F600-F1434) y las variantes Fe anteriores descritas en el Ejemplo 1 del documento WO2011 /122011 (F1-F599) al usar el
sistema de Epibase Light (Lonza) descrito. Se muestra el conteo de inmunogenicidad de todas las variantes Fe (F1-F1434) en la Tabla 16.
[Ejemplo 2] Variantes de Fe mejoradas de unión a FcRn de identificación con especies de alta estabilidad, bajo peso molecular y bajo riesgo de inmunogenicidad
2-1. Análisis de variantes Fe anteriores v nuevas mediante Tm trazada. Las HMW(%) v conteo de inmunogenicidad contra afinidad de unión a hFcRn
La afinidad de unión a hFcRn y la Tm de las variantes Fe anteriores (F1-F599) descritas en el Ejemplo 1 del documento WO2011/122011 y las nuevas variantes Fe (F600-F1052) generadas y evaluadas en el Ejemplo 1 se graficaron y se muestran en la Figura 2. Se graficaron la afinidad de unión a hFcRn y la HMW (%) de las variantes Fe anteriores y nuevas y se muestran en la Figura 3. Se graficaron la afinidad de unión a hFcRn y el conteo de inmunogenicidad de las variantes Fe F1-F599 y las nuevas variantes Fe (F600-F1052) y se muestran en la Figura 4.
Se suprimieron las nuevas variantes Fe (F600-F1052) y las variantes Fe anteriores (F1-F599) de las variantes que tenían la mutación Ser239Fys o Asp270Phe. Puesto que la mutación Ser239Fys y Asp270Phe mejoró la estabilidad (TM) mientras que no mejoró la afinidad de unión a FcRn y no redujo la afinidad de unión a todos los receptores gamma Fe humano, en el siguiente
análisis detallado del Grupo 1-4, la estabilidad de las variantes Fe debe compararse dentro de las variantes que no tienen la mutación Ser239Fys ni Asp270Phe.
Además, las nuevas variantes Fe (F600-F1052) y las variantes Fe anteriores (F1-F599) de las variantes que tenían la mutación de Pro257Xxx (Xxx es Ala o Val o lie o Leu o Thr) o Met252Trp se suprimieron de las gráficas aunque estas variantes mejoren la afinidad de unión a FcRn. La mutación Pro257Xxx y Met252Trp no exhibió reducción significativa en Tm que sugería que las variantes con la mutación Pro257Xxx y Met252Trp tienen alta estabilidad. Sin embargo, estas variantes que tenían las mutaciones Pro257Xxx o Met252Trp mostraron agregación significativa y la precipitación durante un estudio de estabilidad acelerada o cuando se almacenaron refrigeradas. Debido a su estabilidad perjudicial, las variantes Fe con la mutación Pro257Xxx y Met252Trp no son aceptables para el desarrollo farmacéutico y por lo tanto, en el siguiente análisis detallado del Grupo 1-4, tales variantes Fe deben suprimirse de las gráficas.
2-2. Análisis detallado del Grupo 1 (afinidad de unión al hFcRn más potente que 15 nM)
Las nuevas variantes Fe (F600-F1052) generadas y evaluadas en el Ejemplo 1, y las variantes Fe anteriores (F1-F599) descritas en el Ejemplo 1 del documento WO2011 /122011 , con afinidad de unión al hFcRn más potente que 15 nM (descritas como Grupo 1 de aquí en adelante), se analizaron detalladamente
mediante afinidad de unión a hFcRn trazada en eje X y Tm, HMW (%) y conteo de inmunogenicidad en el eje Y.
El análisis detallado del Grupo 1 graficando la afinidad de unión a hFcRn (KD más potente que 15 nM) en el eje X y TM, HMW (%) y conteo de inmunogenicidad en el eje Y se muestran respectivamente en la Figura 5, 6 y 7.
En cuanto a los criterios de desarrollabilidad de las variantes Fe en el Grupo 1, los criterios de Tm se ajustaron como mayores de 57.5°C, los criterios de HMW (%) se ajustaron como menor de 2%, y el conteo de inmunogenicidad se ajustó como menor de 500.
Las Variantes Fe en el Grupo 1 que satisface todos los criterios de desarrollabilidad (Tm mayor de 57.5°C, HMW (%) menor de 2%, y conteo de inmunogenicidad menor de 500) se muestran en la Tabla 17.
[Tabla 17]
Ningunas de las variantes Fe anteriores (F1-F599) tenían una afinidad más potente que 15 nM, mientras que varias nuevas variantes Fe generadas en el EJEMPLO 1 fueron más potentes que 15 nM y cumplen todos los criterios de desarrollabilidad. Tales nuevas variantes Fe del Grupo 1 descritas en la Tabla 17 son extremadamente valiosas para que el dominio Fe permita la eliminación del antígeno muy rápida y extensa del plasma especialmente cuando se usan en combinación con el dominio de unión al antígeno dependiente al pH.
2-3. Análisis detallado del Grupo 2 (afinidad de unión al hFcRn entre 15 nM v 50 nM)
Las nuevas variantes Fe (F600-F1052) generadas y evaluadas en el Ejemplo 1, y las variantes Fe anteriores (F1-F599) descritas en el Ejemplo 1 del documento WO2011 /122011 , con afinidad de unión al hFcRn entre 15 nM y 50 nM (de aquí en adelante llamadas el "Grupo 2"), se analizaron detalladamente graficando la afinidad de unión a hFcRn en el eje X y Tm, HMW (%) y conteo de inmunogenicidad en el eje Y.
El análisis detallado del Grupo 2 graficando la afinidad de unión a hFcRn (KD entre 15 nM y 50 nM) en el eje X, y Tm, HMW (%) o conteo de inmunogenicidad en el eje Y se muestran en la Figura 8, 9 y 10, respectivamente.
En cuanto a los criterios de desarrollabilidad de las variantes Fe en el Grupo 2, los criterios de Tm se ajustaron como mayor de 60°C, los criterios de HMW (%) se ajustaron como
menor de 2%, y el conteo de inmunogenicidad se ajustó como menor de 500.
Las Variantes Fe en el Grupo 2 que satisface todos los criterios de desarrollabilidad (Tm mayor de 60°C, HMW (%) menor de 2%, y conteo de inmunogenicidad menor de 500) se muestran en la Tabla 18.
[Tabla 18]
Ningunas de las variantes Fe anteriores (F1-F599) satisficieron todos los criterios de desarrollabilidad, pero varias
de las nuevas variantes Fe generadas en el Ejemplo 1 cumplieron todos. Tales variantes Fe del Grupo 2 que cumplen los criterios de desarrollabilidad son extremadamente valiosas para permitir la eliminación rápida y extensa del antígeno del plasma especialmente cuando se usan en combinación con dominio de unión al antígeno dependiente al pH.
2.4 Análisis detallado del Grupo 3 (afinidad de unión al hFcRn entre 50 n v 150 nM)
Las nuevas variantes Fe (F600-F1052) generadas y evaluadas en el Ejemplo 1, y las variantes Fe anteriores (F1-F599) descritas en el Ejemplo 1 del documento WO2011/122011 , con afinidad de unión al hFcRn entre 50 nM y 150 nM (llamados a continuación "Grupo 3"), se analizadas detalladamente graficando la afinidad de unión a hFcRn en el eje X y Tm, HMW(%) y conteo de inmunogenícidad en el eje Y.
El análisis detallado del Grupo 3 graficando la afinidad de unión a hFcRn (KD entre 50 nM y 150 nM) en el eje X, y Tm, HMW(%) o el conteo de inmunogenícidad en el eje Y se muestran en la Figura 11, 12 y 13, respectivamente.
En cuanto a los criterios de desarrollabilidad de las variantes Fe en el Grupo 3, los criterios de Tm se ajustaron como mayor de 63.0°C, los criterios de HMW(%) se ajustaron como menor de 2%, y el conteo de inmunogenícidad se ajustó como menor de 250.
Las variantes Fe en el Grupo 3 que satisface todos los
criterios de desarrollabilidad (Tm mayor de 63.0°C, HMW(%) menor de 2%, y conteo de inmunogenicidad menor de 250) se muestran en la Tabla 19.
[Tabla 19]
Ningunas de las variantes Fe anteriores (F1-F599) satisficieron todos los criterios de desarrollabilidad, mientras que las varias nuevas variantes Fe generadas en el Ejemplo 1 cumplieron todos. Tales nuevas variantes Fe del Grupo 3 que cumplen todos los criterios de desarrollabilidad son extremadamente valiosas para permitir la eliminación del antígeno moderada y continua del plasma especialmente usado en combinación con el dominio de unión al antígeno dependiente al pH.
2-5. Análisis detallado del Grupo 4 (afinidad de unión al hFcRn entre 150 nM v 700 nM)
Las nuevas variantes Fe (F600-F1052) generadas y evaluadas en el Ejemplo 1, y las variantes Fe anteriores (F1-F599) descritas en el Ejemplo 1 del documento WO2011 /122011 , con afinidad de unión al hFcRn entre 150 nM y 700 nM (llamadas a continuación "Grupo 4"), se analizaron detalladamente graficando la afinidad de unión a hFcRn en el eje X y Tm, HMW(%) y el conteo de inmunogenicidad en el eje Y.
El análisis detallado del Grupo 4 graficando la afinidad de unión a hFcRn (KD entre 150 nM y 700 nM) en el eje X, y Tm, HMW(%) o el conteo de inmunogenicidad en el eje Y se muestran en la Figura 14, 15 y 16, respectivamente.
En cuanto a los criterios de desarrollabilidad de las variantes Fe en el Grupo 4, los criterios de Tm se ajustaron como mayor de 66.5°C, los criterios de HMW(%) se ajustaron como menor de 2%, y el conteo de inmunogenicidad se ajustó como menor de 250.
Las variantes Fe en el Grupo 4 que satisface todos los criterios de desarrollabilidad (Tm mayor que 66.5°C, HMW(%) menor de 2%, y conteo de inmunogenicidad menor de 250) se muestran en la Tabla 20.
[Tabla 20]
Ningunas de las variantes Fe anteriores (F1-F599) satisficieron todos los criterios de desarrollabilidad , mientras que las varias nuevas variantes Fe generadas en el Ejemplo 1 resolvieron todos. Tales nuevas variantes Fe del Grupo 4 que cumplen todos los criterios de desarrollabilidad son extremadamente valiosas para permitir la eliminación moderada y continua del antígeno del plasma usadas especialmente en combinación con el dominio de unión al antígeno dependiente al PH.
En resumen, las nuevas variantes Fe descritas en la Tabla 17 a 20 tienen alta Tm, baja HMW(%), y bajo conteo de inmunogenicidad que son adecuados para el desarrollo farmacéutico de la molécula de unión al antígeno capaz de eliminar el antígeno del plasma.
[Ejemplo 3] Estudio de eliminación del antígeno in vivo de las nuevas variantes Fe en el modelo de infusión de estado estacionario del receptor IL-6 humana al usar un transgénico de
FcRn humano
3.1 Preparación de anticuerpos para estudio in vivo
El anticuerpo IgG 1 del receptor IL6 anti-humano dependiente al pH, Fv4-lgG1 comprende VH3-lgG1 (SEC ID NO: 1 ) y VL3-CK (SEC ID NO: 3), Fv4-F11 de variante Fe anterior comprende VH3-F11 (SEC ID NO: 4) y VL3-CK (SEC ID NO: 3), nuevas variantes Fe, Fv4-F652 comprende VH3-F652 (SEC ID NO: 5) y VL3-CK (SEC ID NO: 3), y Fv4-F890 comprende VH3-F890 (SEC ID NO: 6) y VL3-CK (SEC ID NO: 3), y Fv4-F946 comprende VH3-F946 (SEC ID NO: 7) y VL3-CK (SEC ID NO: 3) se expresaron y purificaron mediante el método conocido por los expertos en la técnica descritos en el Ejemplo de Referencia 2 del documento WO2011 /122011.
Se realizó el estudio de eliminación del antígeno in vivo de Fv4-lgG1, Fv4-F11, Fv4-F652, Fv4-F890 y Fv4-F946 en modelo de infusión de estado estacionario del receptor IL-6 humana al usar el transgénico de FcRn humano.
3-2. Estudio in vivo de anticuerpos mediante el modelo de infusión de estado estacionario al usar la línea 32 de ratón transgénico de FcRn humano
Se condujo una prueba in vivo mediante el modelo de infusión de estado estacionario al usar la línea 32 de ratón transgénico de FcRn humano. Una bomba de infusión (BOMBA MINI-OSMÓTICA MODELO 2004; alzet) que contenía el receptor IL-6 humana soluble se implantó bajo la piel en la parte posterior
de la línea 32 transgénica de FcRn humano (línea 32 de Tg B6.mFcRn-/-.hFcRn ++ ratón (B6.mFcRn-/-.hFCRN Tg32 B6.Cg-Fcgrt<tm1 Dcr> Tg(FCGRT)32Dcr), Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104) para preparar los animales modelo en los cuales la concentración plasmática del receptor IL-6 humano soluble se mantuvo constante. Se administraron los anticuerpos del receptor IL-6 anti-humana a los animales modelo para evaluar la dinámica in vivo después de la administración del receptor IL-6 humana soluble. Se administró el anticuerpo CD4 anti-ratón monoclonal (internamente) a 20 mg/kg antes de implantar la bomba de infusión, y 7 y 17 días después de la administración del anticuerpo en la vena caudal para suprimir la producción del anticuerpo neutralizante contra el receptor IL-6 humana soluble. Entonces, una bomba de infusión que contenía 92.8 microgramos/ml de receptor IL-6 humana soluble fue implantó bajo la piel en la parte posterior de los ratones. Tres días después de la implantación de una bomba de infusión, se administrados los anticuerpos del receptor IL-6 anti-humana una vez en la vena caudal. En el estudio 1, se administrados Fv4-IgG 1 , Fv4-F652, Fv4-F890 y Fv4-F946 a una dosificación de 1 mg/kg junto con aproximadamente 1 g/kg de Sanglopor (CSL Behring), y en el estudio 2, se administrados Fv4-lgG1, Fv4-F11 y Fv4-F652 a 1 mg/kg. En ambos estudios, no se administró ningún anticuerpo al grupo de control (ninguna inyección de anticuerpo). Se recolectó la sangre a puntos de tiempo apropiados después de
la administración del anticuerpo del receptor IL-6anti-humana. La sangre recolectada se centrifugó inmediatamente a 15,000 rpm y 4°C durante 15 minutos para separar el plasma. Se almacenó el plasma separado en un refrigerador a -20°C o inferior antes del ensayo.
3-3. Medición de la concentración de plasma del anticuerpo del receptor IL-6 anti-humana mediante ELISA
Se midió la concentración del anticuerpo del receptor IL-6 anti-humana en plasma de ratón mediante ELISA. El fragmento del anticuerpo F(ab')2 de la IgG anti-humana (cadena gamma específica) (Sigma) se dispensó sobre un Nunc-lmmunoPlate MaxiSorp (Nalge Nunc International) y se dejó en reposo durante la noche a 4°C para preparar las placas inmovilizadas con IgG anti-humana. Muestras de la curva de calibración que tienen concentraciones en plasma de 0.8, 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, y 0.0125 microgramos/ml, y las muestras de plasma de ratón diluidas 100 veces o se preparan más. Se agregaron 200 microlitros de 20 ng/ml de hslL-6R a 100 microlitros de las muestras de la curva de calibración y las muestras de plasma, y entonces las muestras se dejaron en reposo durante una hora a temperatura ambiente. Posteriormente, las muestras se dispensaron sobre las placas Inmovilizadas con IgG anti-humana, y se dejaron en reposo durante una hora a temperatura ambiente. Entonces, se agregó el Anticuerpo de IL-6R Anti-Humana Biotinilado (R&D) para reaccionar durante una hora a temperatura
ambiente. Posteriormente, se agregó Estreptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) para reaccionar durante una hora a temperatura ambiente, y se realizó la reacción cromogénica al usar el Sustrato de Micropozos TMB de un Componente para HRP (BioFX Laboratories) como un sustrato. Después de parar la reacción con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), se midió la absorbencia a 450 nm mediante un lector de microplaca. Se calculó la concentración plasmática de ratón a partir de la absorbencia de la curva de calibración al usar el software analítico SOFTmax PRO (Dispositivos Moleculares).
3-4. Medición de la concentración plasmática de hslL-6R mediante ensayo de electroquimioluminescencia
Se midió la concentración de hslL-6R en plasma de ratón mediante electroquimioluminescencia. Se ajustaron las muestras de la curva de calibración de hslL-6R a concentraciones de 2,000, 1,000, 500, 250, 125, 62.5, y 31.25 pg/ml, y se prepararon las muestras del plasma de ratón diluidas 50 veces o más. Se mezclaron las muestras con una solución de anticuerpo IL-6R anti-humano monoclonal (R&D) rutenio-etiquetado con éster de NHS etiquetado con Sulfo (Meso Scale Discovery), el anticuerpo IL-6R anti-humano Biotinilado (R&D, Systems Inc., USA), y el tocilizumab (C ugai Pharmaceutical Co., Ltd.)), y después se dejo reaccionar durante la noche a 37°C. La concentración final de tocilizumab como un anticuerpo del receptor IL-6 anti-humana fue 333 microgramos/ml, que es en exceso de la concentración del
anticuerpo del receptor IL-6 anti-humana contenido en las muestras, para el propósito de unir casi todas las moléculas de hslL-6R en las muestras al tocilizumab. Posteriormente, las muestras se dispusieron en una placa de Estreptavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery), y se dejaron reaccionar durante una hora a temperatura ambiente, y se realizó el lavarse. Inmediatamente después que se dispensó el Amortiguador de Lectura T (x4) (Meso Scale Discovery), se realizó la medición mediante el Lector de Sector PR 400 (Meso Scale Discovery). La concentración de hslL-6R se calculó basada en la respuesta de la curva de calibración al usar el software analítico SOFTmax PRO (Dispositivos Moleculares).
3-5. Resultado de estudio 1: efecto de eliminación del antígeno in vivo de las nuevas variantes Fe
La Figura 17 muestra el perfil del tiempo de concentración de hslL-6R en plasma y la Figura 18 muestra el perfil del tiempo de concentración del anticuerpo en plasma después de la inyección de Fv4-lgG1, Fv4-F652, Fv4-F890 y Fv4-F946. Comparado con Fv4-lgG1 y el control (ninguna inyección de anticuerpo), Fv4-F652, Fv4-F890 y Fv4-F946 tienen nuevas variantes Fe con unión mejorada a FcRn a pH neutro exhibieron reducción significativa de la concentración de hslL-6R en plasma demostrando el efecto de eliminación del antígeno in vivo del anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH con unión mejorada a FcRn a pH neutro. A pesar de que Fv4-F652 y Fv4-
F890 demostraron 30 veces y 10 veces de efecto de eliminación del antígeno a 7 días comparado con Fv4-lgG1, respectivamente, el perfil del tiempo de concentración del anticuerpo en plasma de Fv4-F652 y Fv4-F890 fue comparable con Fv4-lgG1.
Por lo tanto, este estudio demostró que Fv4-F652 y Fv4-F890 podían eliminar selectivamente el antígeno soluble del plasma mientras que mantenían la farmacocinética del anticuerpo comparable a la de Fv4-lgG1. Fv4-F890 pertenece al Grupo 3, y este estudio demostró que las variantes Fe en el Grupo 3 pueden entonces reducir la concentración del antígeno en plasma por aproximadamente 10 veces mientras que mantienen la farmacocinética del anticuerpo comparable con lgG1. Esto se entiende que aplicando la variante Fe del Grupo 3 al anticuerpo IgG 1 unido al antígeno dependiente al pH puede bajar la dosificación del anticuerpo por 10 veces. Tal reducción en la dosificación del anticuerpo por la variante Fe del Grupo 3 es significativa especialmente cuando la dosificación del anticuerpo necesita reducirse, y requiere simultáneamente dosificación infrecuente.
Por una parte, Fv4-F946 demostró 100 veces de reducción de la concentración de hslL-6R en plasma comparada con Fv4-lgG1, y la eliminación del anticuerpo de Fv4-F946 fue más grande que Fv4-lgG1. Fv4-F946 pertenece al Grupo 2, y este estudio demostró que las variantes Fe en el Grupo 2 pueden reducir la concentración del antígeno en plasma por aproximadamente 100
veces aunque la eliminación del anticuerpo sea mayor que lgG1. Esto se entiende que aplicando la variante Fe del Grupo 2 al anticuerpo I g G 1 unido al antígeno dependiente al pH puede reducir la concentración del antígeno en plasma total por aproximadamente 100 veces. En caso de que la concentración del antígeno en plasma objetivo sea demasiado alta para neutralizarse mediante la dosificación de anticuerpo realista (es decir 100 mg/kg), 100 veces de reducción de la concentración del antígeno total sin importar el aumento de eliminación del antígeno por la variante Fe del Grupo 2 se entiende que el antígeno objetivo puede neutralizarse por menos de 10 mg/kg, que es una dosificación de anticuerpo realista.
La afinidad de unión a hFcRn de Fv4-F652 y Fv4-F890 se midió múltiples veces, y la afinidad contra hFcRn fue 2.4E-07 M (n = 7) para F652, y 1.1E-07 M (n=12) para F890. Los estudios anteriores descritos en el Ejemplo 1 del documento WO2011 /122011 revelaron el grado de eliminación del antígeno y la eliminación del anticuerpo correlacionados con la afinidad de unión a FcRn a pH neutro. Como se muestra en la Figura 17, Fv4-F652 exhibió un grado más grande de la eliminación del antígeno comparado con Fv4-F890 aunque la farmacocinética del anticuerpo fue comparable con Fv4-F890. Por lo tanto, se sugirió que la mutación específica en F652 contribuyó al efecto de barrido mejorado del antígeno.
Para identificar que el residuo contribuyó al efecto de
barrido del antígeno mejorado de F652, se realizó el estudio 2 al usar F11 (doble mutante Met252Tyr, Asn434Tyr) y F652 (triple mutante Pro238Asp, Met252Tyr, Asn434Tyr). La afinidad contra hFcRn fue 3.1E-07 M (n = 12) para F 11 , que fue comparable a la afinidad medida para F652.
3-6 Resultado del estudio 2: efecto eliminación del antígeno in vivo de la mutación Pro238Asp
La Figura 19 muestra el perfil del tiempo de concentración de hslL-6R en plasma y la Figura 20 muestra el perfil del tiempo de concentración del anticuerpo en plasma después de la inyección de Fv4-lgG1, Fv4-F11 y Fv4-F652. Aunque Fv4-F11 exhibió la reducción de la concentración de hslL-6R en plasma, Fv4-F652 exhibió una reducción más grande de la concentración hslL-6R en plasma. Fv4-F11 y Fv4-F652 exhibieron el perfil del tiempo de concentración del anticuerpo en plasma comparable.
Por lo tanto, este estudio demostró que la mutación Pro238Asp podía mejorar el plasma de eliminación del antígeno mientras que mantenía la farmacocinética del anticuerpo comparable a Fv4-lgG1. Por lo tanto, la mutación Pro238Asp es extremadamente valiosa para mejorar la eliminación del antígeno por el anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH.
[Ejemplo 4] Eliminación del factor reumatoide que une al FcRn que une las variantes Fe mejoradas mediante mutagénesis dirigida al sitio
La utilidad y eficacia clínica de los anticuerpos terapéuticos
puede limitarse por la producción de anticuerpos antifármacos (ADAs, por sus siglas en inglés), puesto que la ADA puede influenciar su eficacia y farmacocinética y llevar a veces a efectos secundarios serios. Muchos factores influencian la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos, y la presencia de epítopos de células T efectoras es uno de los factores. Además, la presencia de anticuerpos preexistentes contra el anticuerpo terapéutico puede también ser problemática desde el punto de ADA. Especialmente en caso de anticuerpo terapéutico para pacientes con enfermedad autoinmune como artritis reumatoide, factor reumatoide, un autoanticuerpo contra IgG humana, podría ser un problema del anticuerpo preexistente. Recientemente, se reportó que el anticuerpo lgG1 anti-CD4 humanizado con la mutación Asn434His produjo la unión al factor reumatoide significativo (Clin Pharmacol Ther. febrero de 2011 ;89(2):283-90). El estudio de detalle ha confirmado que la mutación Asn434His en la lgG1 humana aumentó la unión del factor reumatoide a la región Fe del anticuerpo comparada a la IgG 1 humana original.
El factor reumatoide es un autoanticuerpo policlonal contra IgG humana, y su epítopo en IgG humana varía entre el clon, pero su epítopo parece estar localizado en la región de interfaz CH2/CH3 así como el dominio CH3 que podría traslaparse con el epítopo de unión a FcRn. Por lo tanto, las mutaciones para aumentar la afinidad de unión a FcRn pudieron también aumentar la afinidad de unión al clon específico del factor reumatoide.
Los estudios anteriores han demostrado que la ingeniería de Fe para aumentar la afinidad de unión a FcRn al pH ácido mejoró la eficacia de reciclaje endosomal y prolongó la farmacocinética del anticuerpo. Por ejemplo, la variante M252 Y/S254T/T256E (YTE) (J Biol Chem 2006 281:23514-23524.), la variante M428L/N434S (LS) (Nat Biotechnol, 2010 28:157-159.) y la variante N434H (Clinical Pharmacology & Therapeutics (201 1) 89(2):283-290.) mostraron mejora en vida promedio con relación a lgG1 nativo.
Para alcanzar la eliminación del antigeno del plasma, las regiones Fe de la molécula de unión al antígeno (anticuerpo) que interactúan con FcRn (Nat Rev Immunol. septiembre de 2007;7(9):715-25) se dirigen para tener afinidad de unión mejorada a FcRn a pH neutro, tales variantes Fe dirigidas incluyen la variante F11, la variante F68, la variante F890 y la variante F947. El mecanismo de eliminación del antígeno del plasma por el anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH con afinidad de unión mejorada a FcRn a pH neutro con respecto al anticuerpo convencional se muestra en la Figura 1.
Tal variante Fe con unión a FcRn mejorado (o a pH 6.0 y/o a pH neutro) podría exhibir mayor unión al factor reumatoide como en el caso de la mutación Asn434His descrita previamente. Por lo tanto, se probó si estas variantes Fe mejoradas de unión a FcRn exhibirían mayor de unión al factor reumatoide. Los anticuerpos variables usados en el siguiente estudio fueron Fv4-
hlgG1, Fv4-YTE, Fv4-FS, FV4-N434H, FV4-F11, FV4-F68, FV4-890 y Fv4-F947.
4-1. Estudio de unión al factor reumatoide de variantes Fe mejoradas de unión a FcRn
Se realizó el ensayo de unión contra factor reumatoide mediante electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés) a pH 7.4. Se realizaron los ensayos con el suero de 15 o 30 pacientes con AR individuales (Proteogenex). Las muestras de suero se diluyeron 50 veces, el anticuerpo de prueba etiquetado con biotina (1 microgramos/ml) y el anticuerpo de prueba etiquetado con NHS-éster MARCADO CON SULFO (Meso Scale Discovery) (1 microgramo/ml) se mezclaron e incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente. Entonces, se agregaron las mezclas a las placas de 96 pozos de MULTI-MATRIZ cubiertas con Estreptavidina (Meso Scale Discovery), y las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente y se lavaron. Después de que se agregó el Amortiguador de Lectura T (x4) (Meso Scale Discovery) a cada pozo, las placas se colocan inmediatamente en el Lector SECTOR imagen 2400 (Meso Scale Discovery) y se midió la quimioluminiscencia.
Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 21 y 22. Las Figuras 21 y 22 son la respuesta de ECL del suero de 15 o 30 pacientes con AR individuales. Fv4-hlgG1 con la Ig G 1 humana nativa (Figura 21-1 y 22-1) mostró solamente débil unión al factor reumatoide, mientras que todas las variantes Fe
mejoradas de unión a FcRn (Fv4-YTE (Figura 21-2), Fv4-LS (Figura 21-3), Fv4-N434H (Figura 22-2), Fv4-F11 (Figura 22-3), Fv4-F68 (Figura 22-4), Fv4-890 (Figura 22-5) y Fv4-F947 (Figura 22-6)) mejoraron significativamente la unión al factor reumatoide en más de los dos donantes. Este estudio demuestra claramente que la inmunogenicidad relacionada con el factor reumatoide preexistente puede ser un problema cuando se considera el desarrollo clínico del anticuerpo terapéutico con afinidad de unión mejorada a FcRn para la enfermedad autoinmune como artritis reumatoide. La Figura 23 muestra la media, media geométrica y mediana de la respuesta de ECL del suero de las variantes del anticuerpo mencionadas anteriormente con la sangre de quince pacientes con RA.
Por lo tanto, en el siguiente estudio, se generaron paneles de variantes que podrían reducir potencialmente la unión al factor reumatoide policlonal mientras que mantenían la capacidad de unión a FcRn.
4-2. Reducción de unión al factor reumatoide de variantes Fe mejoradas de unión a FcRn introduciendo mutaciones en la región Fe
Para generar las variantes con unión al factor reumatoide policlonal reducido mientras mantienen la capacidad de unión a FcRn, las mutaciones se introducen racionalmente a los residuos superficiales cerca del interfaz CH2/CH3 que se asume que no interfiere con la interacción FcRn humano/lgG humana.
Se seleccionó Fv4-F890 como la variante Fe original, y simple mutación y las variantes Fe combinadas de la simple mutación se introdujeran en Fv4-F890. Se generaron las nuevas variantes Fe F1058 a F1073, a F1107 a F1114, F1104 a F1106, y F1230 a F1232 descritas en la Tabla 21. Además, se seleccionó Fv4-F947 como la variante Fe original y se introdujeron las mismas mutaciones simples y combinadas. Se generaron las nuevas variantes Fe F1119-F1124 descritas en la Tabla 21. Primero se evaluaron las variantes para su afinidad de unión a FcRn humano a pH7.0. Los resultados también se describen en la Tabla 21. En comparación con cualquiera del Fv4-F890 o Fv4- F947 original, estas variantes no muestran la reducción significativa en la afinidad de unión contra el FcRn humano, mostrando que estas mutaciones no afectaron la unión a FcRn humano.
[Tabla 21]
Luego se realizó un estudio de unión al factor reumatoide a pH 7 para las variantes en la Tabla 21. Los resultados de este
estudio se muestran en las Figuras 24 a 29. Estas figuras muestran la respuesta de ECL del suero a partir de quince pacientes con AR individuales para las siguientes variantes del anticuerpo: Fv4-lgG1, Fv4-F890, Fv4-F1058 a Fv4-1073 (Figura 24), Fv4-F1104 a Fv4-F1106 (Figura 26), Fv4- F1107 a Fv4-F1 114 (Figura 27), Fv4-F1230 a Fv4-F1232 (Figura 28), Fv4-947 y Fv4-F1119 a Fv4-F1124 (Figura 29). Las Figuras 25-1, 25-2 y 25-3 son la media, media geométrica y mediana de la respuesta de ECL del suero a partir de quince pacientes con RA para las variantes Fv4-lgG1, Fv4-F890, y Fv4-F1058 a Fv4-1073.
Sorpresivamente, en comparación con F890 que exhibió la unión al factor reumatoide potente, las nuevas variantes Fe con la simple mutación a F890, como F1062, F1064-F1072 y F1107-F 1114 exhibieron la reducción significativa en la unión al factor reumatoide. Especialmente, F1062, F1064, F1068, F1070, F1072, F1107 a F1109 y F1111-F1113 exhibieron la unión al factor reumatoide comparable como la lgG1 nativa que demuestra que el mayor riesgo de inmunogenicidad de la variante F890 se eliminó totalmente introduciendo la simple mutación adicional para reducir la unión al factor reumatoide sin afectar al unión al FcRn humano. Puesto que el factor reumatoide en pacientes es un anticuerpo policlonal que une a los múltiples epítopos en la región Fe, fue sorpresivamente que una simple mutación eliminó significativamente la unión del factor reumatoide a la región Fe.
Además, en comparación con la simple Fe F1070 (Q438R) o
F1072 (S440E) transformada, la Fe F1106 doble transformada (Q438R/S440E) mostraron reducción significativa en la unión al factor reumatoide. Igualmente, la Fe F1230 doble transformada (Q438R/S440D), F1231 (Q438K/S440E) y F1232 (Q438K/S440D) también mostraron reducción adicional en la unión al factor reumatoide por combinación de mutaciones. Mientras tanto, F1104 (V422E/S424R) o F1105 (V422S/S424R) no mostró ningún efecto de combinación.
Además, con Fv4-F939 seleccionada como la variante Fe original, otras mutaciones para aumentar la unión a FcRn (S254T o T256E) y para reducir la unión al factor reumatoide (H433D) se evaluaron. Se generaron nuevas variantes Fe (F1291, F1268, F1269, F1243, F1245, F1321, F1340 y F1323) descritas en la Tabla 22. Primero, se evaluaron las variantes por su afinidad de unión a FcRn humano a pH 7.0. Los resultados también se describen en la Tabla 22.
[Tabla 22]
Entonces se realizó el estudio de unión al factor reumatoide para estas variantes como se describe anteriormente. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 30. Sorpresivamente, en comparación con F939, F1291 (simple mutación de H433D a F939) exhibió la reducción significativa en la unión al factor reumatoide en algunos donantes. Similarmente, en comparación con F1321, F1323 (simple mutación de H433D a F 1321 ) exhibió la reducción significativa en la unión al factor
reumatoide en algunos donantes. Además, las mutaciones Q438R/S440E, Q438K/S440D y Q438K/S440E mostraron la reducción significativa en la unión al factor reumatoide con las variantes que tenían otras mutaciones para aumentar la unión a FcRn (S254T o T256E).
4-3. Reducción de la unión al factor reumatoide de variantes Fe mejoradas de unión a FcRn introduciendo la N-glicosilación adicional en la región Fe
La introducción de N-glicosilación adicional cerca del epítopo de unión al factor reumatoide puede también anular la unión al factor reumatoide, debido al obstáculo estérico con N-glicosilación grande. La mutación puede seleccionarse desde el punto de modo que la mutación introduzca la secuencia de N-glicosilación (Asn-Xxx-Ser/Th r) mientras que mantiene la unión a FcRn. Para introducir la secuencia de N-glicosilación adicional en la región Fe, las simples o dobles mutaciones se introducen en Fv4-F11. Se generaron las nuevas variantes Fe (F1077-F1083, F1094-F1097) descritas en la Tabla 23. Las variantes se evaluaron para su afinidad de unión a FcRn humano a pH7.0 y la presencia de glicosilación adicional por SDS-Page. Los resultados se describen en la Tabla 23. F1077 (K248N), F1080 (S424N), F1081 (Y436N/Q438T) y F1082 (Q438N) se encontraron por tener glicosilación adicional, y especialmente F1080 (S424N) mantuvo afinidad de unión contra FcRn humano.
[Tabla 23]
Por lo tanto, en el siguiente estudio, la mutación S424N se introdujo en Fv4-F890, Fv4-F1115 descrita en la Tabla 24 se generó y evaluó para su afinidad de unión a FcRn humano a pH 7.0. Los resultados también se describen en la Tabla 24.
[Tabla 24]
Entonces realizamos el estudio de unión al factor reumatoide para estas variantes como se describe anteriormente. El resultado de este estudio se muestra en la Figura 31. Sorpresivamente, el solo mutante S424N, Fv4-F1115, exhibió reducción significativa en la unión al factor reumatoide. Este resultado sugiere que la introducción de N-glicosilación adicional es el proceso eficaz para anular la unión al factor reumatoide.
4-4. Reducción de la unión al factor reumatoide de la Variante YTE. N434H y LS
Para reducir la unión al factor reumatoide de las variantes Fv4-YTE, Fv4-N434H y Fv4-LS, que mejora la unión a FcRn a pH ácido y prolonga la farmacocinética de anticuerpo, las mutaciones Q438R/S440E o la mutación S424N se introducen en estas variantes. Se generaron las nuevas variantes Fe (F1166, F1167, F1172, F1173, F1170 y F 1171 ) descritas en la Tabla 25. Primero las variantes se evaluaron por su afinidad de unión a FcRn humano a pH6.0. Los resultados también se describen en la Tabla 25.
[Tabla 25]
Entonces realizamos el estudio de unión al factor reumatoide para estas variantes (Fv4-F1166, F1167, F1172, F1173, F1170 y F 1171 ) como se describe anteriormente. El resultado de este estudio se muestra en la Figura 32. En comparación con YTE que exhibió potente unión al factor reumatoide en dos donantes (90216S y 90214S), F1166 (Q438R/S440E) y F1167 (S424N) exhibió reducción significativa en la unión al factor reumatoide. Además, F1173 y F1171 mostraron que la mutación S424N podría también anular la unión al factor reumatoide de la variante N434H y FS. Sin embargo, las mutaciones Q438R/S440E no podrían anular la unión al factor reumatoide de la variante N434H y FS totalmente, la unión al factor reumatoide se observó en uno o dos donantes.
4-5. Mutaciones alternativas para la reducción de la unión al factor reumatoide de la variante FS
Las nuevas simples mutaciones se introdujeron en Fv4-FS, se generaron las variantes Fe (Fv4-F1380 a Fv4-F1392) descritas en la Tabla 26.
[Tabla 26]
Entonces realizamos el estudio de unión al factor reumatoide para las variantes que mantiene la unión a FcRn a pH 6.0 (Fv4-F1380, F1384-F1386, F1388 y F1389). El resultado de este estudio se muestra en la Figura 33. Estas variantes exhibieron reducción significativa en la unión al factor reumatoide en algunos donantes. Especialmente, Fv4-F1389 exhibió la unión al factor reumatoide comparable como la lgG1 nativa.
Por lo tanto, la mutación como Pro387Arg, Val422Glu, Val422Arg, Val422Ser, Val422Asp, Val422Lys, Val422Thr, Val422Gln, Ser424Glu, Ser424Arg, Ser424Lys, Ser424Asn, Ser426Asp, Ser426Ala, Ser426Gln, Ser426Tyr, His433Asp, Tyr436Thr, Gln438Glu, Gln438Arg, Gln438Ser, Gln438Lys, Ser440Glu, Ser440Asp, Ser440Gln (las posiciones se dan en la numeración de EU) es extremadamente útil para reducir la inmunogenicidad de la molécula de unión al antígeno que contiene la región Fe aumentada de unión a FcRn (por ejemplo, F1-F1434) como el anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH con afinidad de unión mejorada a FcRn a pH neutro que es capaz de eliminar el antígeno del plasma y el anticuerpo con afinidad de unión mejorada a FcRn al pH ácido que es capaz de mejorar la farmacocinética del anticuerpo.
Los sitios de mutación con excepción de EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440 para reducir la unión del factor reumatoide sin afectar la unión al FcRn humano podrán seleccionarse de 248-257, 305-314, 342-352, 380-386,
388, 414-421, 423, 425-437, 439, y 441-444 en la numeración de EU.
[Ejemplo 5] Reducción de unión al factor reumatoide de nuevas variantes Fe con unión mejorada a FcRn humano a pH neutro
Se generaron las nuevas variantes Fe (F939, F1378, F1379, F1262, F1138, F1344, F1349, F1350, F1351, F1261, F1263, F1305, F1306, F1268, F1269, F1413, F1416, F1419, F1420, F1370, F1371, F1599, F1600, F1566, F1448, F1601-F1603, F1531, F1604, F1605, F1586, F1592, F1610-F1615, F1567, F1572, F1576, F1578, F1579, F1641-F1655, F1329, F1331) descritas en la Tabla 27. Primero las variantes se evaluaron para su afinidad de unión a FcRn humano a pH 7.0. Los resultados también se describen en la Tabla 27.
[Tabla 27]
Entonces realizamos el estudio de unión al factor reumatoide a pH 7.4 para las variantes en la Tabla 27. Los resultados de este estudio se muestran en las Figuras 34 a 94.
Las dobles mutaciones para disminuir la unión al factor reumatoide (Q438R/S440E, Q438R/S440D, Q438K/S440E y Q438K/S440D) mostraron la reducción significativa en la unión al factor reumatoide a otras mutaciones para aumentar la unión a FcRn a pH neutro.
5-1. Reducción de la unión al factor reumatoide de nuevas variantes Fe con unión mejorada a FcRn humano a pH ácido
Se generaron nuevas variantes Fe (F1718-F1721 , F1671, F1670, F1711-F1713, F1722-F1725, F1675, F1714-F1717, F1683, F1756-F1759, F1681, F1749-F1751, F1760-F1763, F1752-F1755, F1685) descritas en la Tabla 28. Primero las variantes se evaluaron para su afinidad de unión a FcRn humano a pH 6.0. Los resultados también se describen en la Tabla 28.
[Tabla 28]
Entonces realizamos el estudio de unión reumatoide a pH 7.4 para las variantes en la Tabla
resultados de este estudio se muestran en las Figuras 95 a 130.
Las dobles mutaciones para disminuir la unión al factor a reumatoide (Q438R/S440E, Q438R/S440D, Q438K/S440E y Q438K/S440D) mostraron reducción significativa en la unión al factor reumatoide a otras mutaciones para aumentar la unión a FcRn a pH ácido.
[Ejemplo 6] El estudio de eliminación del antígeno in vivo de las nuevas variantes Fe en modelo de infusión de estado estacionario del receptor IL-6 humana usa ratones transgénicos de FcRn humano
6-1. Preparación de anticuerpos para el estudio in vivo
El anticuerpo lgG1 receptor IL6 anti-humano dependiente al pH, Fv4-lgG1 comprende VH3-lgG1 (SEC ID NO: 1) y VL3-CK (SEC ID NO: 3), nuevas variantes Fe, Fv4-F1243 comprende VH3-F1243 (SEC ID NO: 8) y VL3-CK (SEC ID NO: 3), y Fv4-F1245 comprende VH3-F1245 (SEC ID NO: 9) y VL3-CK (SEC ID NO: 3) se expresaron y purificaron mediante el método conocido por los expertos en la técnica descritos en el Ejemplo 2 del documento WO2011/122011.
Como se describe en el Ejemplo 4. Fv4-F1243 y Fv4-F1245 tienen la nueva región Fe con afinidad de unión mejorada a FcRn humano a pH neutro, pero significativamente reducido la unión al factor reumatoide. Para evaluar el efecto de eliminación del antígeno de estas variantes, se realizó un estudio in vivo de Fv4-IgG 1 , Fv4-F1243 y Fv4-F1245 en un modelo de infusión de estado
estacionario del receptor IL-6 humana al usar ratones transgénicos de FcRn humano.
6-2. Estudio in vivo de anticuerpos por el modelo de infusión de estado estacionario al usar la línea 32 de ratón transgénico de FcRn humano
Se condujo una prueba in vivo por el modelo de infusión de estado estacionario al usar la línea 32 de ratón transgénico de FcRn humano por los mismos métodos descritos en el Ejemplo 13 del documento WO2011 /122011.
6-3. Resultado del estudio: efecto de eliminación del antígeno in vivo de nuevas variantes Fe
La Figura 131 muestra el perfil del tiempo de concentración de hslL-6R en plasma y la Figura 132 muestra el perfil del tiempo de concentración del anticuerpo en plasma después de la inyección de Fv4-lgG1, Fv4-F1243 y Fv4-F1245. En comparación con Fv4-lgG1 y el control (ninguna inyección de anticuerpo), Fv4-F1243 y Fv4-F1245 que tenían nuevas variantes Fe con unión mejorad a FcRn a pH neutro exhibieron la reducción significativa de la concentración de hslL-6R en plasma que demuestra la eliminación del antígeno in vivo del anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH con unión mejorada a FcRn a pH neutro. Fv4-F1243 y Fv4-F1245 demostraron el efecto de eliminación del antígeno 10 veces en el día 21 o el día 7 comparado a Fv4-lgG1, respectivamente, por lo cual el perfil del tiempo de concentración del anticuerpo en plasma de Fv4-F1243 y
Fv4-F1245 fue comparable a Fv4-lgG1.
[Ejemplo 7] estudio de PK in vivo de nuevas variantes Fe al usar ratones transgénicos de FcRn humano
7-1. Preparación de anticuerpos para el estudio in vivo
Se expresaron el anticuerpo IgG 1 del receptor IL6 antihumano dependiente al pH, Fv4-lgG1 comprende VH3-lgG1 (SEC ID NO: 1) y VL3-CK (SEC ID NO: 3), una nueva variante Fe, Fv4-F1389 comprende VH3-F1389 (SEC ID NO: 10) y VL3-CK (SEC ID NO: 3), y se purificaron mediante el método conocido por los expertos en la técnica descritos en el Ejemplo de Referencia 2 del documento WO2011/122011.
Como se describe en el Ejemplo 4 y 5, Fv4-F1389 tiene una nueva región Fe con afinidad de unión a FcRn humano mejorada al pH ácido, pero unión significativamente reducida al factor reumatoide. Para evaluar la farmacocinética de esta variante, se realizó un estudio in vivo de Fv4-lgG1 y Fv4-F1389 al usar los ratones transgénicos de FcRn humano.
7-2. Estudio in vivo de anticuerpos al usar la línea 32 de ratón transgénico de FcRn humano
Se condujo una prueba in vivo al usar la línea 32 de ratón transgénico de FcRn humano por los mismos métodos descritos en el Ejemplo 13 del documento WO2011 /122011.
7-3. Resultado del estudio de PK in vivo de nuevas variantes Fe
La Figura 133 muestra el perfil del tiempo de concentración
del anticuerpo en plasma después de la inyección de Fv4-lgG1 y Fv4-F1389. En comparación con Fv4-lg<31, Fv4-F1389 que tenía las nuevas variantes Fe con unión mejorada a FcRn a pH ácido y unión reducida para que el factor reumatoide exhiba la farmacocinética mejorada. Las nuevas variantes Fe descritas en la Tabla 28 han aumentado la afinidad de unión a FcRn a pH6.0 al mismo nivel como F1389. Por lo tanto, se espera que estas variantes también exhiban la farmacocinética mejorada al usar la línea 32 de ratón transgénico de FcRn humano mientras que tengan unión reducida al factor reumatoide.
[Ejemplo 8] Preparación de anticuerpos que unen a IgA humana de una manera dependiente del calcio
8-1. Preparación de IgA humana (hlgA, por sus siglas en inglés)
Se preparó la IgA humana (más adelante también abreviada como "hlgA") como un antígeno al usar las siguientes técnicas recombinantes. Se expresó la hlgA (la región variable se deriva de un anticuerpo del receptor IF-6 anti-humano) cultivando células hospedadoras que llevaban vectores recombinantes insertados con H (WT)-lgAI (SEC ID NO: 12) y L (WT) (SEC ID NO: 13) y purificadas por un método conocido por los expertos en la técnica al usar la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de filtración en gel.
8-2. Expresión y purificación de anticuerpos que unen a hlgA
GA2-lgG1 (cadena pesada de la SEC ID NO: 14; cadena ligera de la SEC ID NO: 15) es un anticuerpo que unen a hlgA. La secuencia de ADN que codifica la cadena pesada de GA2-lgG1 (SEC ID NO: 14) y la cadena ligera de GA2-lgG1 (SEC ID NO: 15) se insertaron en los plásmidos de expresión de células animales mediante un método conocido por los expertos en la técnica. El anticuerpo se expresó por el método descrito a continuación. Las células de la línea FreeStyle 293-F derivada de células de riñón fetal humano (Invitrogen) se suspendieron en Medio de Expresión FreeStyle 293 (Invitrogen). Se sembró la suspensión celular en una placa de 6 pozos (3 ml/pozo) a una densidad celular de 1.33 x 106 células/ml. Entonces, se introdujeron los plásmidos construidos en las células mediante un método de lipofección. Se cultivaron las células durante cuatro días en una incubadora de C02 (37°C, 8% de C02, 90 rpm). Se purificaron los anticuerpos a partir de los sobrenadantes de cultivo aislados por un método conocido por los expertos en la técnica al usar la rProtein A Sepharose™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Se midió la absorbencia (longitud de onda: 280 nm) de las soluciones de anticuerpo purificadas al usar un espectrofotómetro. Las concentraciones de anticuerpo se determinaron a partir de los valores medidos al usar el coeficiente de absorción calculado por el método de PACE (Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
8-3. Evaluación de anticuerpos obtenidos para la actividad de unión a hlgA dependiente de calcio
Se evaluaron los anticuerpos aislados como se describe en 8-2 por su actividad de unión a hlgA (constante de disociación KD (M)) al usar Biacore T200 (GE Healthcare). Los amortiguadores de corrida usados en la medición fueron 0.05% de Tween 20/20 mmol/l de ACES/150 mmol/l de NaCI (pH 7.4 o 5.8) que contiene 3 microM o 1.2 mM de CaCI2.
El anticuerpo se dejo unir a la matriz de Sensor CM5 (GE Healthcare) inmovilizado con una cantidad adecuada de proteína recombinante A/G (Thermo Scientific) mediante el método de combinación de amino. Entonces, una concentración apropiada de hlgA (descrita en 8-1) se inyectó como un analito para permitir la interacción con el anticuerpo en la matriz de sensor. Se realizó la medición a 37°C. Después de la medición, se inyectaron 10 mmol/l de glicina-HCI (pH 1.5) para regenerar la matriz de sensor. Se calculó la constante de disociación KD (M) a partir del resultado de medición mediante el análisis de ajuste de curva y el análisis de parámetro de equilibrio al usar el software de evaluación de Biacore T200 (GE Healthcare). El resultado y los sensogramas obtenidos se muestran en la Tabla 29 y la Fig. 134, respectivamente. Se reveló que GA2-lgG1 unido potentemente a hlgA a una concentración de Ca2+ de 1.2 mM mientras que el anticuerpo unido débilmente a hlgA a una concentración de Ca2+ de 3 microM 3. Además, a una concentración de Ca2+ de 1.2 mM, GA2-lgG1 se mostró para unir a IgA humana potentemente a pH 7.4 pero débilmente a pH 5.8.
Más específicamente, GA2-lgG1 se reveló para unir a IgA humana de una manera dependiente al pH y al calcio.
[Tabla 29]
[Ejemplo 9] Preparación de anticuerpos con región Fe modificada que unen a hlgA de una manera dependiente de calcio
Después, evaluar el efecto de unión a FcRn en la eliminación del antígeno (hlgA) del plasma, se construyó GA2-F760 (cadena pesada de la SEC ID NO: 16; cadena ligera de la SEC ID NO: 15) introduciendo las sustituciones de aminoácido L235R y S239K en GA2-lgG1 para eliminar la unión a FcgammaR. Además se construyó GA2-F1331 (cadena pesada de la SEC ID NO: 17; cadena ligera de la SEC ID NO: 15) introduciendo la sustitución de aminoácido G236R, M252Y, S254T, T256E, N434Y, Y436V, Q438R y S440E en GA2-F760, que une a FcRn más
potente que GA2-F760 a pH 7.4. Se expresaron los anticuerpos modificados por el método descrito sobre usar plásmidos de expresión animal insertados con las secuencias de ADN que codifican GA2-F1331 (cadena pesada de la SEC ID NO: 17; cadena ligera de la SEC ID NO: 15) y GA2-F760 (cadena pesada de la SEC ID NO: 16; cadena ligera de la SEC ID NO: 15) por un método conocido por los expertos en la técnica. Se determinaron las concentraciones de anticuerpo después de la purificación. Se evaluó GA2-F760 para su unión a varios FcgammaR de ratón (mFcgammaRI, mFcgammaRII, mFcgammaRIII, y mFcgammaRIV). El resultado mostró que GA2-F760 no unió a cualquiera de los receptores.
[Ejemplo 10] Evaluación del efecto de anticuerpos de unión a hlgA dependientes de Ca en la retención de plasma de un antígeno al usar ratones transgénicos de FcRn humano
10-1. Prueba in vivo al usar ratones transgénicos de FcRn humano
Se evaluó la farmacocinética del anticuerpo hlgA y anti-hlgA después de la administración de hlgA (IgA humana; preparada como se describe en el Ejemplo 8) sola o en combinación con un anticuerpo anti-hlgA a los ratones transgénicos de FcRn humano (línea 32 B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg +/+ ratón, Jackson Laboratories; ethods Mol Biol. (2010) 602: 93-104). Se administró una mezcla de anticuerpo hlgA y anti-hlgA una vez en una dosis de 10 ml/kg a través de la vena caudal. Los GA2-F760 y GA2-F1331 descritos
antes fueron los anticuerpos anti-hlgA que se usaron.
En cada mezcla, la concentración de hlgA fue 80 microg/ml y la concentración de anticuerpo anti-hlgA fue 2.69 mg/ml. Bajo las condiciones descritas antes, se predijo la mayoría de hlgA para unir al anticuerpo puesto que el anticuerpo anti-hlgA esté presente en suficiente exceso sobre hlgA. Se recolectó la sangre a partir de ratones quince minutos, una hora, dos horas, siete horas, un día, tres días, siete días y catorce días después de la administración. La sangre recogida se centrifugó inmediatamente durante 15 minutos a 12,000 rpm y 4°C para obtener el plasma. Se almacenó el plasma separada en un congelador a -20°C o por debajo hasta la medición.
10-2. Determinación de la concentración de anticuerpo anti-hlgA en plasma en ratones transgénicos de FcRn humano mediante ELISA
Se determinaron las concentraciones de anticuerpo anti-hlgA en plasma de ratón mediante ELISA. Primero, se prepararon las placas Inmovilizadas con IgG anti-Humana dividiendo en alícuotas la IgG anti-humano (cadena gamma específica) Anticuerpo de Fragmento F(ab')2 (SIGMA) a cada pozo de la placa Nunc-lnmuna, MaxiSorp (Nalge nunc International) y dejando las placas en reposo a 4°C durante la noche. Se prepararon muestras de curva estándar del anticuerpo anti-hlgA preparadas como soluciones estándar a concentraciones de plasma de 0.5, 0.25, 0 125, 0.0625, 0.03125, 0.01563, y 0.007813
microg/ml y muestras de ensayo diluyendo muestras de plasma de ratón 100 veces o más se dividieron en alícuotas en las placas inmovilizadas con IgG anti-humana, y entonces las placas se incubaron a 25°C durante una hora. Después, el conjugado de Biotina (BIOT) de IgG Anti-Humana de Cabra (cadena gamma específica) (Southern Biotechnology Associates Inc.) se dividió en alícuotas en cada pozo de las placas, y entonces las placas se incubaron a 25°C durante una hora. Entonces, se agregó Estreptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) a cada pozo de las placas, después de lo cual se incubaron las placas a 25°C durante una hora. La reacción cromogénica al usar el Sustrato de Micropozos T B de un Componente para HRP (BioFX Laboratories) como un sustrato se terminó con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), y entonces se midió la mezcla de reacción en cada pozo al usar un lector de microplaca para medir la absorbencia a 450 nm. Se calculó la concentración del anticuerpo anti-hlgA en plasma de ratón a partir de la absorbencia de la curva estándar al usar el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). El curso de tiempo de las concentraciones del anticuerpo en plasma de GA2-F1331, y GA2-F760 en los ratones transgénicos de FcRn humano, que se determinaron por el método descrito antes, se muestra en la Fig. 135.
10-3. Determinación de la concentración de hlgA en plasma mediante ELISA
Se midieron las concentraciones de hlgA en plasma de ratón mediante ELISA. Primero, se prepararon las placas inmovilizadas con IgA Anti-Humana dividiendo en alícuotas el anticuerpo IgA Anti-Humana de Cabra (BETHYL) en cada pozo de la placa Nunc-Inmuna, axiSorp (Nalge nunc International) y dejando las placas en reposo a 4°C durante la noche. Se prepararon las muestras estándar de la curva estándar de hlgA como soluciones estándar a concentraciones de plasma de 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, y 0.00625 microg/ml y se prepararon muestras de ensayo diluyendo las muestras de plasma de ratón 100 veces o más. Se mezcló cada muestra (100 microL) con 200 microL de 500 ng/ml de hslL-6R a temperatura ambiente durante una hora, y después se dividieron en alícuotas a 100 microL/pozo en las placas inmovilizadas con IgA Anti-Humana. Las placas resultantes se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, después de agregar el Anticuerpo IL-6R Antihumana Biotinilado (R&D) en cada pozo de las placas, se incubaron las placas a temperatura ambiente durante una hora. Entonces, después de dividir en alícuotas la Estreptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) en cada pozo de las placas, se incubaron las placas a temperatura ambiente durante una hora. La reacción cromogénica al usarse como un Sustrato de Micropozos TMB de un Componente para HRP (BioFX Laboratories) se terminó con ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical), y después la mezcla de reacción en cada pozo se
midió al usar un lector del microplaca para medir la absorbencia a 450 nm. Se calculó la concentración plasmática de ratón a partir de la absorbencia de la curva estándar al usar el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). El curso de tiempo de las concentraciones de hlgA en plasma en ratones transgénicos de FcRn humano después de la administración intravenosa, como se determina por el método descrito antes, se muestra en la Figura 136.
El resultado mostró que la eliminación de hlgA fue acelerada marcadamente cuando la hlgA se administró en combinación con GA2-F1331, un anticuerpo que exhibe la unión a FcRn humano potente, con respecto a cuando la hlgA se administró en combinación con GA2-F760, que tiene afinidad muy débil a FcRn humano.
[Ejemplo 11] Preparación del anticuerpo anti-lgE dependiente al pH
11-1. Preparación del anticuerpo IgE anti-humano
Para preparar los anticuerpos IgE anti-humano dependiente al pH, se expresó la IgE humana (cadena pesada de la SEC ID NO: 18; cadena ligera de la SEC ID NO: 19) (la región variable se derivó de un anticuerpo glypican3 antihumano) como un antígeno al usar FreeStyle293 (Life Technologies). Se preparó la IgE humana purificando la IgE humana expresada al usar un método cromatográfico convencional conocido por los expertos en la técnica.
Se seleccionó un anticuerpo que une a IgE humana de una manera dependiente al pH de un número de anticuerpos obtenidos. El anticuerpo de IgE anti-humana seleccionado se expresó al usar la región constante de cadena pesada de I g G 1 humana y la región constante de cadena ligera humana, y después se purificó. El anticuerpo producido se nombró el clon 278 (cadena pesada de la SEC ID NO: 20; cadena ligera de la SEC ID NO: 21).
11 -2. Evaluación de anticuerpos de IgE anti-humana para su actividad de unión y actividad de unión dependiente al pH
Los anticuerpos capaces de disociación a partir de antígenos dentro del endosoma pueden crearse no sólo diseñándolos con el fin de unirse a los antígenos de una manera dependiente al pH, sino también diseñándolos con el fin unirse a los antígenos de una manera dependiente al Ca. Así, se evaluó el clon 278 y el Xolair de control (omalizumab; Novartis) cuya actividad de unión a IgE- no depende de pH/Ca para su dependencia de pH y dependencia de pH/Ca de la actividad de unión a IgE humana (hlgE, por sus siglas en inglés).
Más específicamente, las actividades de unión a hlgE
(constante de disociación KD (M)) del clon 278 y Xolair se evaluaron al usar Biacore T200 (GE Healthcare). Los amortiguadores de corridas usados en el ensayo fueorn:
1.2 mmol/l de CaCI2/0.05% de Tween 20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI, pH 7.4;
1.2 mmol/l de CaCI2/0.05% de Tween 20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI, pH 5.8; y
3 micromol/l de CaCI2/0.05% de Tween 20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCI, pH 5.8.
Se agregó un péptido sintetizado químicamente que tiene una secuencia derivada de proteína glypican 3 humana (SEC ID NO: 22) cuya C terminal de Lys está biotinilada (más adelante abreviada como "péptido GPC3 biotinilado") en una cantidad apropiada e inmovilizó sobre la matriz de Sensor SA (GE Healthcare) basada en la afinidad entre la biotina y la estreptavidina. Se inmovilizó la IgE humana sobre la matriz inyectándola a una concentración apropiada con el fin de atraparla por el péptido GPC3 biotinilado. Como analito, se inyectó el clon 278 a una concentración apropiada y se dejó interactuar con la IgE humana en la matriz de sensor. Entonces, se inyectaron 10 mmol/l de glicina-HCL (pH 1.5) para regenerar la matriz de sensor. Se midió la interacción siempre a 37°C. Se analizó el resultado de la medición mediante el ajuste de la curva al usar el Software de Evaluación Biacore T200 (GE Healthcare) para calcular la constante de velocidad de asociación ka (1/Ms) y la constante de velocidad de disociación kd (1/s). Se calculó la constante de disociación KD (M) a partir de las constantes descritas antes. Además, se calcularon las relaciones de KD en cada anticuerpo bajo condiciones de [pH 5.8, 1.2 mM de Ca] a [pH 7.4, 1.2 mM de Ca] para evaluar la unión a dependiente al pH,
mientras que se calcularon las relaciones de KD en cada anticuerpo bajo condiciones de [pH 5.8, 3 microM de Ca] a [pH 7.4, 1.2 mM de Ca] para evaluara la unión dependiente al pH/Ca. El resultado se muestra en la Tabla 30.
[Tabla 30]
[Ejemplo 12] Preparación de anticuerpos con la región Fe modificada que unen a IgE humana para la prueba in vivo
Después, para evaluar el efecto de unión a FcRn en la eliminación del antígeno (IgE humana) del plasma, se construyó 278-F760 (cadena pesada de la SEC ID NO: 23; cadena ligera de la SEC ID NO: 21) para eliminar la unión a FcgammaR. Además se construyó 278-F1331 (cadena pesada de la SEC ID NO: 24; cadena ligera de la SEC ID NO: 21) introduciendo la sustitución de aminoácido G236R, M252Y, S254T, T256E, N434Y, Y436V, Q438R y S440E en 278-F760, que une a FcRn más potente que 278-F760 a pH 7.4. Se expresaron los anticuerpos modificados por el método descrito sobre usar plásmidos de expresión de animales insertados con secuencias de ADN que codifican 278-F1331 (cadena pesada de la SEC ID NO: 24; cadena ligera de la SEC ID NO: 21) y 278-F760 (cadena pesada de la SEC ID NO: 23; cadena ligera de la SEC ID NO: 21) por un método conocido por los expertos en la técnica. Se determinaron las concentraciones de anticuerpo después de la purificación.
[Ejemplo 13] Evaluación in vivo del clon 278
13-1. Preparación de IgE humana (hlgE (Asp6)) para la evaluación in vivo
La hlgE (Asp6) (la región variable se deriva de un anticuerpo glypican3 anti-humano), que es una IgE humana para evaluación in vivo que consiste en una cadena pesada (SEC ID NO: 25) y una cadena ligera (SEC ID NO: 19), se produjo por el
mismo método como se describe en el Ejemplo 11. La hlgE (Asp6) es una molécula modificada que resulta a partir de la alteración como-asparagina-a-ácido aspártico en los seis sitios de glicosilación ligados a N en la IgE humana de modo que la heterogeneidad en la cadena de azúcar ligada a N de la IgE humana no es afectada por los cambios dependientes del tiempo en la concentración plasmática de la IgE humana como un antígeno.
13-2. Evaluación del clon 278 para el efecto de acelerar la eliminación de la IgE humana al usar ratones transgénicos de FcRn humano
Se evaluó la farmacocinética de la hlgE (Asp6) y el anticuerpo IgE anti-humana después de la administración de hlgE (Asp6) en combinación con un anticuerpo anti-hlgE (278-F760 y 278-F1331) y Sanglopor (Inmunoglobulina humana normal, CSL Behring) a ratones transgénicos de FcRn humano (línea 32 B6.mFcRn-/-.hFcRn Tg 32 +/+ ratón, Jackson Laboratories; Methods Mol Biol. (2010) 602: 93-104). Se administró una mezcla de hlgE (Asp6), anticuerpo IgE anti-humana y Sanglopor (las concentraciones se muestran en la Tabla 31) una vez a una dosis de 10 ml/kg a través de la vena caudal. Bajo las condiciones descritas antes, se predijo la hlgE (Asp6) para unir casi totalmente al anticuerpo puesto que cada anticuerpo está presente suficientemente en exceso sobre hlgE (Asp6). Se recolectó la sangre de los ratones cinco minutos, dos horas, siete
horas, un día, dos días, cuatro o cinco días, siete días, catorce días, veintiuno días, y veintiocho días después de la administración. Se centrifugó la sangre recolectada inmediatamente a 15,000 rpm y 4°C durante 5 minutos para obtener el plasma. El plasma separado se almacenó en un congelador a -20°C o por debajo hasta la medición.
[Tabla 31]
13-3. Determinación de concentración del anticuerpo IgE anti-humana en plasma en ratones transgénicos de FcRn humano
Se determinaron las concentraciones del anticuerpo anti-hlgE en plasma de ratón mediante ensayo de electroquimioluminescencia (ECL, por sus siglas en inglés). Se prepararon las muestras de curva estándar a concentraciones de plasma de 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, y 0.25 microgramos/ml. Se dividieron en alícuotas las muestras de curva estándar y las muestras de ensayo en plasma de ratón en placas de ECL inmovilizadas con hlgE(Asp6). Las placas se dejaron en reposo a
4°C durante la noche. Entonces, e Anticuerpo Anti-conejo (Cabra), etiquetado con SULFO-TAG (Meso Scale Discovery) se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante una hora. Inmediatamente después se dispensó el Amortiguador de Lectura T (x4) (Meso Scale Discovery), se realizó la medición por el Lector de Sector de Imagen 2400 (Meso Scale Discovery). Se calculó la concentración plasmática de ratón de la respuesta de la curva estándar al usar el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). Un curso de tiempo de la concentración del anticuerpo en plasma después de la administración intravenosa, que se determinó por el método describió antes, se muestra en la Fig. 137.
13-4. Determinación de la concentración de hlgE(Asp6) en plasma en ratones transgénicos de FcRn humano
Se determinaron las concentraciones de hlgE(Asp6) en plasma de ratón mediante ELISA. Se prepararon las muestras de curva estándar a concentraciones de plasma de 192, 96, 48, 24, 12, 6, y 3 ng/ml. Se agregó Xolair (Novartis) a 10 microgramos/ml a las muestras de curva estándar y las muestras de ensayo del plasma de ratón para igualar el inmunocomplejo de hlgE(Asp6) y el anticuerpo anti-hlgE. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, las muestras de curva estándar y se dividieron en alícuotas las muestras de ensayo del plasma de ratón en inmunoplacas (MABTECH) inmovilizadas con anticuerpo de IgE anti-humana o munoplacas (Nunc F96
MicroWell Píate (Nalge nunc International)) inmovilizadas con el anticuerpo de IgE anti-humano (clon 107; MABTECH). Las placas se dejaron en reposo a temperatura ambiente por dos horas o a 4°C durante la noche. Entonces, la proteína de núcleo GPC3 humano (SEC ID NO: 26), anticuerpo anti-GPC3 biotinilado con NHS-PEG4-Biotin (Thermo Fisher Scientific) (preparado en Chugai pharmaceutical Co., Ltd.), y Estreptavidina-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) se hicieron reaccionar secuencialmente durante una hora cada uno. La reacción cromogénica al usarse como un Sustrato de Micropozos TMB de un Componente para HRP (BioFX Laboratories) se terminó con ácido sulfúrico 1 N (Showa Chemical), y después se determinó la concentración plasmática de ratón por un método en el cual el desarrollo de color se evaluó midiendo la absorbencia a 450 nm al usar un lector de microplaca o un método en el cual una reacción luminiscente se mejora al usar Sustrato Quimioluminiscente de SuperSignal(r) Pico ELISA (Thermo Fisher Scientific) como un sustrato y la intensidad de luminiscencia se midió con un lector de microplaca. Se calculó la concentración en el plasma de ratón a partir de la intensidad de absorbencia o de luminiscencia de la curva estándar al usar el software de análisis SOFTmax PRO (Molecular Devices). El curso de tiempo de la concentración de hlgE(Asp6) en plasma después de la administración intravenosa, que se determinó por el método describió antes, se muestra en la Fig. 138.
El resultado mostró que la eliminación de IgE humana fue acelerada significativamente cuando la IgE humana se administró en combinación con 278-F1331, que une a FcRn humano mucho más potente que 278-F76Q. Específicamente, se demostró que no sólo en el caso de IL6R y de IgA, sino también en el caso de IgE, un anticuerpo de unión al antígeno dependiente al pH que tiene mayor actividad de unión a FcRn puede acelerar la eliminación de antígeno del plasma y disminuir la concentración del antígeno en plasma.
[Ejemplo de Referencia A1] Preparación de receptor IL-6 humano soluble (HSIL-6R)
El receptor IL-6 humana recombinante como un antígeno se preparó como sigue. Una línea celular expresa constitutivamente el receptor IL-6 humana soluble (más adelante referido como hslL-6R) que tiene la secuencia de aminoácido de las posiciones 1 a 357 del extremo N como se reportó en J. Immunol. 152: 4958-4968 (1994) se estableció por un método conocido por los expertos en la técnica. Se cultivaron las células para expresar hslL-6R. Se purificó hslL-6R a partir del sobrenadante de cultivo por dos etapas: cromatografía en columna de Azul Sefarosa 6 FF y cromatografía de filtración en gel. Una fracción eluida como el máximo principal en la etapa final se usó como el producto de purificación final.
[Ejemplo de Referencia A2] Preparación del FcRn humano
FcRn es un heterodímero de la cadena alfa de FcRn y la
beta2-microglobulina. Se prepararon cebadores Oligo-ADN basados en la secuencia de gen FcRn humano publicado (J Exp Med. 1 de diciembre de 1994; 180(6): 2377-81). Se preparó un fragmento de ADN que codificaba el gen entero mediante PCR al usar el ADNc humano (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech) como un molde y los cebadores preparados. Usando el fragmento de ADN obtenido como un molde, se amplificó un fragmento de ADN que codificaba el dominio extracelular que contenía la región de señal (Metí -Leu290) mediante PCR, y se insertó en un vector de expresión de célula mamífera. Igualmente, se preparados cebadores oligo-ADN basados en la secuencia de gen beta2-microglobulina humana publicada (Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 99 (26): 16899-16903 (2002)). Se preparó un fragmento de ADN que codifica el gen entero mediante PCR al usar el ADNc humano (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech) como un molde y los cebadores preparados. Usando el fragmento de ADN obtenido como un molde, se amplificó un fragmento de ADN que codifica la proteína completa que contiene una región de señal (Metí -Metí 19) mediante PCR y se insertó en un vector de expresión de célula mamífera.
Se expresó el FcRn humano soluble por el siguiente procedimiento. Se introdujeron los plásmidos construidos para expresar la cadena alfa de FcRn humano (SEC ID NO: 27) y beta2-microglobulina (SEC ID NO: 28) en las células de la línea celular derivada del cáncer de riñon embrionario humano
HEK293H (Invitrogen) por el método de lipofección al usar PEI (Polyscience) . Se recolectó el sobrenadante de cultivo resultante, y se purificó FcRn al usar la IgG Sepharose 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) , seguido por purificación adicional al usar HiTrap Q HP (GE Healthcare) (J Immunol. 2002 Nov 1 ; 169(9): 5171-80).
[Ejemplo de Referencia A3] Preparación de la IgA humana (hlgA)
Se expresó la hlgA comprende H (WT)-lgAI (SEC ID NO: 12) y L (WT) (SEC ID NO: 13) y se purificó por el método conocido por los expertos en la técnica que al usar la rProtein L-agarosa (ACTIgen) seguido por cromatografía de filtración en gel.
[Ejemplo de Referencia A4] Preparación de la plexin A1 humana soluble (hsPlexin A1)
Se preparó la plexina A1 humana soluble recombinante como un antígeno (más adelante referida como hsPlexin A1) como sigue. Se construyó la hsPlexin A1 por referencia a la Secuencia de Referencia NCBI (NP_115618). Especialmente, la hsPlexin A1 se comprende de la secuencia de aminoácido de las posiciones 27-1243 a partir de la etiqueta FLAG de la referencia NCBI anteriormente mencionada (DYKDDDDK, SEC ID NO: 29) se conectó con su extremo C. La hsPlexin A1 se expresó transitoriamente al usar FreeStyle293 (Invitrogen) y se purificó a partir del sobrenadante de cultivo por dos etapas: Cromatografía en columna anti-FLAG y cromatografía de filtración en gel. Una
fracción eluida como el máximo principal en la etapa final se usó como el producto de purificación final.
Aplicabilidad Industrial
Cuando un anticuerpo convencional que dirige el antígeno soluble se administra a un sujeto, el antígeno une al anticuerpo y persiste estable en plasma. Puesto que un antígeno unido a un anticuerpo tiene una vida promedio significativamente más larga que un antígeno simple, la concentración de antígeno puede después de la inyección de un anticuerpo convencional a aproximadamente 10 a 1000 veces de concentración de antígeno en plasma total de la línea de base. Tal aumentando de la concentración de antígeno en plasma total no es preferible para un anticuerpo terapéutico, debido a que la concentración de anticuerpo (dosificación) tiene que ser 10 a 1000 veces mayor de la necesaria comparada a cuando no ocurre ningún aumento sustancial en la concentración de antígeno en plasma total. Por lo tanto, un anticuerpo que elimina el antígeno del plasma y también reduce la concentración de antígeno en plasma total comparada con un anticuerpo convencional es extremadamente valioso puesto que la dosificación requerida sería 10 a 100 veces menor que la requerida para un anticuerpo convencional.
Los presentes inventores condujeron estudios dedicados a dominios de unión a FcRn modificados que tienen una afinidad mejorada para FcRn a pH neutro y moléculas de unión al antígeno que comprenden dicho dominio de unión a FcRn que tienen baja
inmunogenicidad, alta estabilidad y forman solamente algunos elementos aglutinados. Como un resultado, se descubrió que las sustituciones en las posiciones específicas del dominio de unión a FcRn aumentaron la afinidad para el FcRn a pH neutro sin sustancialmente aumentar la inmunogenicidad y la relación de la especie de alto peso molecular, y sin estabilidad disminuida sustancialmente de las moléculas de unión al antígeno que comprenden el dominio de unión a FcRn. Las moléculas de unión al antígeno que comprenden el dominio de unión a FcRn de la presente invención son superiores en farmacocinética en facilitar la reducción de la concentración del antígeno en plasma y cumplen los criterios de desarrollabilidad de baja inmunogenicidad, alta estabilidad y muy pocos elementos aglutinados.
Además, la ingeniería de Fe para aumentar la afinidad de unión a FcRn a pH neutro o ácido puede mejorar la eficacia de reciclaje endosomal y la farmacocinética del anticuerpo. Sin embargo, las modificaciones de la secuencia de aminoácido de un anticuerpo (por ejemplo, sustituciones e inserciones del aminoácido) pueden también aumentar la inmunogenicidad del anticuerpo terapéutico que, a su vez, pueden dar lugar a una tormenta de citocina y/o una producción de anticuerpos antifármacos (ADA, por sus siglas en inglés).
Los presentes inventores condujeron estudios dedicados en moléculas de unión al antígeno que comprenden un dominio
modificado de unión a FcRn cuya actividad de unión para un anticuerpo antifármaco preexistente (ADA, por sus siglas en inglés) se aumentó a pH neutro debido a las sustituciones en el dominio de unión a FcRn que aumentó la afinidad para FcRn a pH neutro o pH ácido. Como un resultado, se descubrió que otras sustituciones en las posiciones específicas del dominio de unión a FcRn disminuyen la actividad de unión para un anticuerpo antifármaco preexistente (ADA, por sus siglas en inglés) a pH neutro mientras mantiene a un alto grado la mayor actividad de unión a FcRn al pH respectivo. Las moléculas de unión al antígeno de la presente invención son superiores en farmacocinética en facilitar la reducción de la concentración del antígeno en plasma sin aumentar la eliminación de anticuerpo.
Claims (61)
1. Una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio modificado de unión a FcRn, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, donde los números indican la posición de la sustitución de acuerdo con la numeración de EU.
2. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1, donde el dominio de unión a FcRn tiene a) una sustitución de aminoácido del aminoácido en la posición EU252 y EU434; y b) una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU387, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
3. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende en la posición EU238 un ácido aspártico, en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU255 una leucina, en la posición EU256 un ácido glutámico, en la posición EU258 un ácido aspártico o una isoleucina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU308 una prolina, en la posición EU309 un ácido glutámico, en la posición EU311 una alanina o una histidina, en la posición EU315 un ácido aspártico, en la posición EU428 una isoleucina, en la posición EU433 una alanina, una Usina, una prolina, una arginina, o una serina, en la posición EU434 una tirosina, o un triptófano, y/o en la posición EU436 una isoleucina, una leucina, una valina, una treonina, o una fenilalanina.
4. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 2, donde el dominio de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido de un aminoácido en una o más combinaciones de la posición seleccionadas del grupo que consiste en a) EU252, EU434, y EU436; b) EU252, EU307, EU311 y EU434; c) EU252, EU315, y EU434; d) EU252, EU308, y EU434; e) EU238, EU252, y EU434; f) EU252, EU434, EU307, EU311, y EU436; y g) EU252, EU387, y EU434.
5. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 4, donde el dominio de unión a FcRn comprende: a) en la posición EU252 a tirosina, en la posición EU315 un ácido aspártico, y en la posición EU434 a tirosina; o b) en la posición EU252 a tirosina, en la posición EU434 a tirosina, y en la posición EU436 una ísoleucina; o c) en la posición EU252 a tirosina, en la posición EU434 a tirosina, y en la posición EU436 una leucina; o d) en la posición EU252 a tirosina, en la posición EU434 a tirosina, y en la posición EU436 una valina; o e) en la posición EU252 a tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU434 a tirosina, y en la posición EU436 una isoleucina.
6. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 2, donde el dominio de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en tres o más posiciones, donde tres o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en a) EU252/EU434/EU307/EU311/EU286; b) EU252/EU434/EU307/EU311/EU286/EU254; c) EU252/EU434/EU307/EU311/EU436; d) EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU254; e) EU252/EU434/EU307/EU311/EU436/EU250; f) EU252/EU434/EU308/EU250; g) EU252/EU434/EU308/EU250/EU436; y ) EU252/EU434/EU308/EU250/EU307/EU311.
7. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 6, donde el dominio de unión a FcRn comprende: a) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina y en la posición EU434 una tirosina; o b) en la posición EU252 a tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU286 a ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina y en la posición EU434 una tirosina; o c) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición 436 una isoleucina; o d) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una isoleucina; o e) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU254 una treonina, en la posición EU308 una prolina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina; o f) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina; o g) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina; o h) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU308 una prolina, y en la posición EU434 una tirosina; o i) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU308 una prolina, en la posición EU311 una alanina, y en la posición EU434 una tirosina.
8. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 2, donde el dominio de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en tres o más posiciones donde tres o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en a) EU252 y EU434 y EU307 y EU311 y EU436 y EU286; b) EU252 y EU434 y EU307 y EU311 y EU436 y EU250 y EU308; c) EU252 y EU434 y EU307 y EU311 y EU436 y EU250 y EU286 y EU308; d) EU252 y EU434 y EU307 y EU311 y EU436 y EU250 y EU286 y EU308 y EU428.
9. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 8, donde el dominio de unión a FcRn comprende: a) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o b) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU308 prolina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o c) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU308 prolina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o d) en la posición EU250 una valina, en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU286 un ácido glutámico, en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU308 prolina, en la posición EU311 una alanina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina.
10. La molécula de unión al antigeno de acuerdo con la reivindicación 2, donde el dominio de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en tres o más posiciones donde tres o más posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en: a) EU434 y EU307 y EU311 ; b) EU434 y EU307 y EU309 y EU311 ; o c) EU434 y EU250 y EU252 y EU436.
11. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 10, donde el dominio de unión a FcRn comprende: a) en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU311 una histidina y en la posición EU434 una tirosina; o b) en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU309 un ácido glutámico, en la posición EU311 una alanina y en la posición EU434 una tirosina; o c) en la posición EU307 una glutamina, en la posición EU309 un ácido glutámico, en la posición EU311 una histidina y en la posición EU434 una tirosina; o d) en la posición EU250 una valina; en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina y en la posición EU436 una valina.
12. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde la relación de la especie de alto peso molecular es menor del 2%.
13. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que tiene a) una menor actividad de unión para el antígeno a pH 5.5-6.5 que a pH 7-8 o b) una actividad "de unión dependiente de la concentración de calcio" para el antígeno.
14. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la actividad de unión de dicha molécula de unión para el FcRn a pH 7 es 50-150 nM, Tm es mayor de 63.0°C, y el conteo de Epibase es menor de 250.
15. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y de las reivindicaciones 6 a 7, y donde la actividad de unión de dicha molécula de unión para FcRn a pH 7 es 15-50 nM, Tm es mayor de 60°C, y el conteo de Epibase es menor de 500.
16. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y de las reivindicaciones 8 a 9, y donde la actividad de unión de dicha molécula de unión para FcRn a pH 7 es más potente que 15 nM, Tm es mayor de 57.5°C, y el conteo de Epibase es menor de 500.
17. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el dominio de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido a) en las posiciones EU238, EU255 y/o EU258, y b) en tres o más posiciones, donde tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 4 a 7.
18. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde a) en la posición EU257 del dominio de unión a FcRn el aminoácido no es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en la alanina, la valina, la ¡soleucina, la leucina, y la treonina, y/o b) en la posición EU252 del dominio de unión a FcRn el aminoácido no es triptófano.
19. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde la molécula de unión al antígeno tiene una actividad de unión para un anticuerpo antifármaco preexistente que no aumenta significativamente con respecto a la afinidad de unión de un anticuerpo de control que comprende un dominio de unión a FcRn intacto.
20. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 19, donde el dominio de unión a FcRn además comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
21. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 20, donde el dominio de unión al FcRn comprende una o más sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en en la posición EU387 una arginina, en la posición EU422 un ácido glutámico, una arginina, o una serina, un ácido aspártico, una Usina, una treonina o una glutamina; en la posición EU424 un ácido glutámico o una arginina, una lisina, o una asparagina; en la posición EU426 un ácido aspártico, una glutamina, una alanina, o una tirosina; en la posición EU433 un ácido aspártico; en la posición EU436 una treonina; en la posición EU438 un ácido glutámico, una arginina, una serina, o una lisina; y en la posición EU440 un ácido glutámico, ácido aspártico o una glutamina.
22. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende tres o más sustituciones, donde las tres o más sustituciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 12 a 13.
23. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende tres o más sustituciones, donde las tres o más sustituciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 14 a 15.
24. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, donde el dominio de unión a FcRn comprende: a) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU387 una arginina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o b) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU422 un ácido glutámico, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o c) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU422 una arginina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o d) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU422 a serina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o e) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU424 un ácido glutámico, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o f) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU424 una arginina, en la posición EU434 una tirosina, y en la posición EU436 una valina; o g) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, en la posición EU436 una valina, y en la posición EU438 un ácido glutámico; o h) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, en la posición EU436 una valina, y en la posición EU438 una arginina; o i) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, en la posición EU436 una valina, y en la posición EU438 a serina; o j) en la posición EU252 una tirosina, en la posición EU434 una tirosina, en la posición EU436 una valina, y en la posición EU440 un ácido glutámico.
25. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, donde la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo.
26. El uso de la molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para mejorar la absorción del antígeno mediada por la molécula de unión al antígeno en las células.
27. El uso de la molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25 para reducir la concentración plasmática de un antígeno específico, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que pueda unir dicho antígeno.
28. Un método para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión al antígeno, que comprende la etapa de introducir una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn de dichas moléculas de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
29. Un método para retrasar la eliminación de una molécula de unión al antígeno en un sujeto, que comprende la etapa de introducir una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
30. Un método para prolongar el tiempo de retención de plasma de una molécula de unión al antígeno, que comprende la etapa de introducir una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
31. Un método para aumentar la velocidad de eliminación del antígeno en plasma de una molécula de unión al antígeno, que comprende la etapa de introducir una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
32. Un método para aumentar la capacidad de una molécula de unión al antígeno de eliminar el antígeno en plasma, que comprende la etapa de introducir una sustitución de aminoácido en un dominio de unión a FcRn de dicha molécula de unión al antígeno en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
33. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, donde además se introduce una sustitución de aminoácido en la posición EU256 en el dominio de unión a FcRn.
34. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, donde el método además comprende una etapa de introducir en el dominio de unión a FcRn una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
35. Un método para producir las moléculas de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende las etapas de (a) seleccionar un dominio de unión a FcRn original y alterar el FcRn original introduciendo una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436; (b) seleccionar un dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno y alterar por lo menos un aminoácido en el dominio de unión al antígeno para conseguir un dominio de unión al antígeno dependiente al pH o un dominio de unión al antígeno dependiente del ión de calcio; (c) obtener un gen que codifica una molécula de unión al antígeno en la cual el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno se prepararon en (a) y (b) y (d) producir una molécula de unión al antígeno al usar el gen preparado en (c).
36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, donde en la etapa a) además se introduce una sustitución de aminoácido en la posición EU256 en el dominio de unión a FcRn.
37. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 35 a 36, donde el método además comprende una etapa de introducir en el dominio de unión a FcRn una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
38. Una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio modificado de unión a FcRn, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440, donde la afinidad de unión de dicha molécula de unión al antígeno para un anticuerpo antifármaco preexistente a un pH neutro no se aumentan significativamente con respecto a la afinidad de unión de la molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn intacto.
39. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 38, donde la molécula de unión al antígeno tiene además una mayor afinidad de unión para un FcRn en los intervalos de pH neutro o ácido.
40. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 38 o 39, donde el aminoácido sustituye una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440 se selecciona del grupo que consiste en a) en la posición EU387 una arginina; b) en la posición EU422 un ácido glutámico, una arginina, una serina, ácido aspártico, lisina, treonina, o glutamina; c) en la posición EU424 un ácido glutámico, una arginina, una lisina, o asparaginas; d) en la posición EU426 un ácido aspártico, una glutamina, una alanina, o una tirosina; e) en la posición EU433 un ácido aspártico f) en la posición EU436 una treonina g) en la posición EU438 un ácido glutámico, una arginina, una serina, o una lisina; y h) en la posición EU440 un ácido glutámico, un ácido aspártico, o una glutamina.
41. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones o una de las combinaciones indicadas en la Tabla 10.
42. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 38 a 40, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende cualquiera de la sustitución de aminoácido o las combinaciones de la sustitución indicadas en la Tabla 11.
43. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende además una sustitución de aminoácido en una o más posiciones del dominio de unión a FcRn seleccionado del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU434, y EU436, donde dichas sustituciones confieren un aumento en la actividad de unión a FcRn en el intervalo de pH neutro o pH ácido.
44. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 43, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende las sustituciones de aminoácidos en las posiciones del dominio de unión a FcRn i) a) EU438/EU440 o b) EU424; y ii) a) EU434, b) EU252/EU254/EU256; c) EU428/EU434; o d) EU250/EU428.
45. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 44, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende las sustituciones de aminoácidos i) a) EU438R/EU440E o b) EU424N; y ii) a) M434H; b) M252Y/S254T/T256E; c) 428F/N434S; o d) T250Q y M428F (numeración de EU).
46. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 45, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende tres o más sustituciones de aminoácidos donde las tres o más sustituciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 13 y 15.
47. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39 a 42, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende las sustituciones a) en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU438, EU440, EU433, o en dos o más posiciones donde las dos posiciones son una de las combinaciones del grupo que consiste en EU422/EU424, y EU438/EU440; y b) dos o más posiciones donde las dos posiciones son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 9.
48. La molécula de unión al antígeno de acuerdo con la reivindicación 47, donde el dominio modificado de unión a FcRn comprende tres o más sustituciones de aminoácidos donde tres o más sustituciones de aminoácidos son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 12 o 14.
49. La molécula de unión al antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 39 a 48, donde dicha molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno dependiente al pH o un dominio de unión al antígeno dependiente del ión de calcio.
50. Un método para disminuir la actividad de unión para un ADA preexistente de una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn que tenía una mayor actividad de unión para un FcRn a pH neutro o ácido y una mayor actividad de unión para un ADA preexistente a un pH neutro, dicho método comprende las etapas de a) proporcionar una molécula de unión al antígeno con un dominio de unión a FcRn que tiene una mayor actividad de unión para FcRn a pH neutro o ácido y una mayor actividad de unión para un ADA preexistente a un pH neutro; y d) sustituir un aminoácido en el dominio de unión a FcRn en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440 para producir una molécula de unión al antígeno con un dominio modificado de unión a FcRn.
51. El método de acuerdo con la reivindicación 50, donde la etapa b) comprende sustituir un aminoácido en tres o más posiciones donde tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 10.
52. El método de acuerdo con la reivindicación 50, donde la etapa b) comprende introducir tres o de más sustituciones de aminoácidos en el dominio de unión a FcRn donde tres o más sustituciones de aminoácidos son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 11.
53. Un método para aumentar el número total de antígenos a los cuales una simple molécula de unión al antígeno puede unirse sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original, b) alterar el dominio de unión a FcRn original de la etapa a) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436; y c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
54. Un método para facilitar la liberación extracelular de una molécula de unión al antígeno libre de antígeno tomada en las células en una forma unida al antígeno sin aumentar significativamente la actividad de unión de dicha molécula de unión al antígeno para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, que comprende las etapas de a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original, b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, y EU428; y c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
55. Un método para aumentar la capacidad de una molécula de unión al antígeno para eliminar el antígeno en plasma sin aumentar significativamente la actividad de unión para el ADA preexistente a pH neutro en comparación con el anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original, b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436, y EU428; y c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
56. Un método para mejorar la farmacocinética de una molécula de unión al antígeno sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original, b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436; y b) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
57. Un método para reducir la concentración plasmática del antígeno total o libre sin aumentar significativamente la actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro con respecto a un anticuerpo original, dicho método comprende las etapas de a) proporcionar una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn original, donde la molécula de unión al antígeno comprende un dominio de unión al antígeno que pueda unir dicho antígeno, b) alterar el dominio de unión a FcRn original sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258 EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436; y c) alterar el dominio modificado de unión a FcRn de la etapa b) sustituyendo un aminoácido en la secuencia de aminoácido del dominio de unión a FcRn original en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440.
58. Un método para producir una molécula de unión al antígeno que comprende un dominio de unión a FcRn que tenía una mayor actividad de unión para un FcRn a pM neutro o ácido y una menor actividad de unión para un ADA preexistente a pH neutro, dicho método comprende las etapas de (a) proporcionar un dominio de unión a FcRn que tiene una mayor actividad de unión para un FcRn en los intervalos de pH neutro o ácido y el ADA preexistente en los intervalos de pH neutro, (b) sustituir un aminoácido en una o más de las posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU387, EU422, EU424, EU426, EU433, EU436, EU438 y EU440, (c) seleccionar un dominio de unión al antígeno de una molécula de unión al antígeno y alterar por lo menos un aminoácido en el dominio de unión al antígeno para conseguir un dominio de unión al antígeno dependiente al pH, o seleccionar un dominio de unión al antígeno dependiente del ion de calcio; (d) obtener un gen que codifica una molécula de unión al antígeno en el cual el dominio de unión a FcRn humano y el dominio de unión al antígeno preparados en (a) y (b) se ligan y (e) producir una molécula de unión al antígeno al usar el gene preparado en (c), donde dicha molécula de unión al antígeno producida tiene una mayor actividad de unión para un FcRn a pH neutro o ácido y una menor actividad de unión para un ADA endógeno a pH neutro con respecto a un dominio de unión al antígeno original que tiene un dominio de unión a FcRn intacto.
59. El método de acuerdo con la reivindicación 58, donde el dominio de unión a FcRn tiene una mayor actividad de unión para FcRn y el ADA preexistente a intervalos de pH neutro o ácido y para el ADA preexistente en los intervalos de pH neutro comprende una sustitución de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en EU238, EU250, EU252, EU254, EU255, EU256, EU258, EU286, EU307, EU308, EU309, EU311, EU315, EU428, EU433, EU434, y EU436.
60. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 53 a 57, donde la sustitución de aminoácido introducida en la etapa a) está en tres o más posiciones donde dichas tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en las Tablas 4 a 7.
61. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 53 a 60, donde las sustituciones de aminoácidos introducidas en la etapa b) están en tres o más posiciones donde dichas tres o más posiciones son una de las combinaciones indicadas en la Tabla 10.
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