MX2014003176A

MX2014003176A - Celulas t diseñadas mediante arn para el tratamiento de cancer.

Info

Publication number: MX2014003176A
Application number: MX2014003176A
Authority: MX
Inventors: Carl H June; Yangbing Zhao
Original assignee: Univ Pennsylvania
Priority date: 2011-09-16
Filing date: 2012-09-17
Publication date: 2015-08-05
Also published as: CN103946952A; US20250340869A1; US20140227237A1; US20200087659A1; IL231171A0; EP2756521A2; BR112014006176A2; US11274298B2; SG11201400527XA; EA201490636A1; US20220170012A1; KR20140060541A; EP2756521A4; WO2013040557A2; US10421960B2; WO2013040557A3; CA2848410A1; BR112014006176A8; AU2012308205A1; JP2014533928A

Abstract

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para generar células T transfectadas con Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) de ARN. Las células T diseñadas con ARN se pueden utilizar en terapia adoptada para tratar cáncer.

Description

CÉLULAS T DISEÑADAS MEDIANTE ARN PARA EL TRATAM I ENTO DE CÁNCER Referencia Cruzada con Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama la prioridad de la Solicitud Provisional Norteamericana Serie No. 61 /535,608, presentada el 16 de septiembre de 201 1 , cuyos contenidos están incorporados en su totalidad a la presente invención como referencia.

Antecedentes de la Invención Aunque se ha establecido el efecto del injerto versus leucemia (GVL) en pacientes que pasan por trasplante de celula mad re hematopoyética (SCT), lo que sug iere q ue la leucemia linfoblástica ag uda (ALL) puede ser controlada mediante trayectorias transmitidas mediante inm unidad celular, la carencia relativa de eficacia de la infusión de linfocitos donadores para ALL, sugiere que las células leucémicas son pobremente inmunogénicas. Es necesario encontrar nuevos métodos q ue superen la deficiente inmunogenicidad de tumor y que tengan el potencial de ser eficaces para el tratamiento de ALL con menos toxicidad que los métodos estándar utilizados para tratar enfermedad de alto riesgo y reincidente, incluyendo SCT (Horowitz, et al, 1990, Blood 75(3) :555-562; Mehta , 1 993, Leuk Lymphoma 10(6) :427-432) .

Los receptores de antígeno q uiméricos (CAR) son moléculas q ue combinan la especificidad a base de anticuerpo para antígenos de superficie asociados con tumor con dominios intracelulares que activan el receptor de celula T con actividad inmune celular antitumor específica (Eshhar, 1997, Cáncer Immunol Immunother 45(3-4) 131-136; Eshhar et al, 1993, Proc Nati Acad Sci E.U.A. 90(2):720-724; Brocker y Karjalainen, 1998, Adv Immunol 68:257-269). Estos CARs permiten que una célula T logre la activación primaria independiente del MHC a través de regiones extracelulares específicas del antígeno Fv de cadena simple (scFv) fusionadas a dominios intracelulares que proporcionan la activación de célula T y señales de co estimulación. Los CARs de segunda y tercera generación, también proporcionan señales coestimuladoras adecuadas mediante motivos de activación intracelular CD28 y/o CD137 (4-IBB) que aumentan la secreción de citocina y la actividad antitumor en una variedad de modelos de leucemia y tumor sólido (Pinthus, et al„ 2004, J Clin Invest 114(12): 1774-1781; Milone, et al, 2009, Mol Ther 17(8): 1453-1464; Sadelain, et al, 2009, Curr Opin Immunol 21 (2):215-223) .

La mayor parte de los investigadores han logrado una transferencia de gen CAR eficiente de tumor humano y antígeno de V1H en células T humanas mediante retrovirus o lentivirus derivado de V1H, y algunos de estos productos de terapia celular han avanzado a pruebas Fase I / 11 (Deeks et al., 2002, Mol Ther 5(6) :788-797; Kershaw, et al, 2006, Clin Cáncer Res 12(20 Pt 1 ) : 6106-6115; Pule, et al, 2008, Nat Med 14(11): 1264- 1270; T i 11 , et al, 2008, B!ood 112(6): 2261 -2271 ) . Recientemente se ha reportado, el uso de células T CAR+ dirigidas mediante CD19 en tres pacientes con CLL (Porter et al, 2011, N Eng J Med, 365: 725-733). Dos de tres de estos pacientes con enfermedad refractaria y altas cargas de tumor ingresaron a una remisión total después de 4 semanas. Estas respuestas han sido sostenidas y las células T CAR+ persistieron durante >6 meses, lo que sugiere la eficacia de esta teenología. Los métodos que utilizan vectores virales de integración tienen claras ventajas, incluyendo expresión a largo plazo del CAR en células infusionadas a través de múltiples divisiones celulares. Sin embargo, las pruebas clínicas interactivas que incorporan rápidamente las innovaciones del diseño CAR, pueden ser difíciles de implementar utilizando vectores virales, debido a la complejidad de pruebas de liberación y el alto costo de la producción de vector. Además, existen aspectos de regulación al utilizar este método. Esto se ha observado claramente en el caso de un vector retroviral utilizado en modificación de gen de células madre hematopoyéticas en el tratamiento de inmunodeficiencia combinada severa enlazada por X (Hacein-Bcy-Abina et al, 2008, J Clin Invest 118(9):3132-3142). En el caso de vectores lentivirales, o en la configuración de la modificación genética de linfocitos maduros, esto es un aspecto teórico, aunque es un aspecto para los reguladores de las tecnologías de terapia genética y celular.

La transfección de mARN transmitida por electroporación es u n metodo potencialmente complementario para expresión genética que no da como resultado mod ificación genética permanente de las células. El uso del mARN para aplicaciones de terapia genética, fue descrito primero por Malone et al . , dentro del contexto de transfección transmitida por liposomas (Malone , et al, 1989, Proc Nati Acad Sci E . U .A. 86( 16) :6077-6081 ). Actualmente se ha desarrollado la electroporación exitosa de mARN en linfocitos T primarios y ha sido utilizada para transferencia genética TCR eficiente (Zhao , et al , 2006, Mol Ther 1 3(1 ): 151 -1 59; Zhao, et al , 2005, J I mmunol. 174(7):4415-4423). Más recientemente, los CARs dirigidos contra el antígeno Her2/neu fueron introducidos en células T mediante electroporación mARN , y se descu brió q ue son más efectivos q ue los anticuerpos Her2/neu en u n modelo de xenomjerto de cáncer de seno (Yoon, et al, 2009, Cáncer Gene Ther 16(6) :489-497). Otros CARs dirigidos por antígenos objetivo humano introducidos en células T mediante electroporación mARN incluyen los que dirigen CEA y ErbB2 (Birkholz et al, 2009, Gene Ther 16(5) :596-604) . Au nque una cantidad de artículos reportan eficacia utilizando este método en tumores sólidos después de inyecciones intratumoral o en modelos intraperitoneales de inyección local , no se ha demostrado un éxito similar en modelos precl ínicos de leucemia diseminada, posiblemente debido a la dificultad para log rar eficacia en un modelo diseminado utilizando un sistema de expresión temporal (Rabinovich, et al, 2009, Hum Gene Ther 20(1 ) : 51 -61 ) .

CD19 es un antígeno de superficie restringida en celulas B y se expresa en células pre-B tempranas y la mayor parte de leucemias y linfomas de célula (Nadler, et al., 1983 J Immunol 1311(1 ):244-250). Esto hace a CD19 un antígeno atractivo para terapia dirigida, ya que se expresa en el linaje de células malignas y un subconjunto específico de linfocitos B tempranos y maduros, pero no en células madre hematopoyéticas. Se ha postulado que la reducción de CD19 permite la restauración eventual de un conjunto de célula B normal de la población precursora negativa CD19 (Cheadle et al, 2010, J Immunol 184(4): 1885-1896). La experiencia con rituximab, el anticuerpo monoclonal anti-CD20 utilizado para tratamiento de malignidades de célula B y enfermedades autommune, ha mostrado que es bien tolerada la deficiencia de célula B inducida por terapia (Plosker y Figgitt, 2003, Drugs 63(8):803-843; van Vollenhoven, et al, 2010, J Rheumatol 37(3):558-567).

La transferencia adoptada de CTLs, ha mostrado ser más prometedora tanto en infecciones virales como en cánceres. Después de muchos años de resultados en desacuerdo con terapia de célula T de receptor de antígeno quimérico (CAR), los sistemas de cultivos mejorados y teenologías de diseño celular están conduciendo a células T CAR con efectos antitumor más potentes (Sadelain et al, 2009, Curr Opin Immunol 21 :215-23). Los resultados de pruebas clínicas recientes indican resultados clínicos mejorados con CARs introducidos con vectores retrovirales (Till et al, 2008, Blood 112:2261-71; Pule et al, 2008, Nat Med 14: 1264-70). Posiblemente no sea sorprendente, que estas celulas CAR también presenten toxicidad incrementada (Brentjens et al, 2010, Mol Ther 18:666-8; Morgan et al, 2010, Mol Ther 18:843-51). Las editoriales recientes han descrito la necesidad de CARs más seguros (Heslop, 2010, Mol Ther 18:661-2; Buning et al, 2010, Hum Gene Ther 21: 1039-42).

Por lo tanto, existe una urgente necesidad en la téenica de composiciones y métodos para proporcionar composiciones y métodos adicionales para efectuar la transferencia adoptada de CTLs. La presente invención atiende esta necesidad.

Breve DescriDción de la Invención La presente invención proporciona un ARN transcrito in vitro o ARN sintético que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, una región de señalización coestimuladora, y un dominio de señalización de CD3-zeta. En una modalidad, el dominio extracelular comprende una porción de enlace de antígenos. En una modalidad, la porción de enlace de antígeno enlaza a un antígeno de tumor. En una modalidad, el antígeno de tumor es un antígeno asociado con cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colorectal, cáncer de hígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, melanoma metastático, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma de no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer uterino, y cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro , en donde el vector es pD- A.ssl .OF.BBZ.2bg.150A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN, comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 8.

En una modalidad, el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.19.0F.2bg .150A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

En una modalidad, el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD- A.GD2.0F.8TMBBZ.2bg. 150A. En una modalidad, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 28. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

En una modalidad, el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.1 50A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 27. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

En una modalidad, la región de señalización coestimuladora comprende el dominio intracelular de una molecula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, 0X40, CD30, CD40, PD-1 , ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1 ), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza específicamente con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una cola poli(A) que comprende aproximadamente 150 bases de adenosina. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una 3’UTR que comprende al menos u na repetición de u na 3 ’UTR derivada de beta-globulina h umana .

La presente invención tambien proporciona una célula T que comprende un ARN transcrito in vitro o ARN sintético que comprende un ácido nucleico que codifica u n dominio extracelular, un dominio de transmembrana , una región de señalización coestimu ladora, y un dominio de señalización de CD3-zeta . En una modalidad , el dominio extracelular comprende u na porción de enlace de antígeno. En una modalidad , la porción de enlace de antígeno enlaza a un antígeno de tumor. En una modalidad, el antígeno de tumor es u n antígeno asociado con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colorectal, cáncer de h ígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón , melanoma, melanoma metastático, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata , cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma de no Hodgkin , linfoma de Hodgkin , cáncer uterino, y cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad , el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.ssl .OF . BBZ.2bg .150A. En u na modalidad , el vector comprende una secuencia de ácido n ucleico de SEQ I D NO: 4. En una modalidad , el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 8.

En una modalidad, el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.19.0F.2bg .150A. En una modalidad, el vector comprende una secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

En una modalidad, el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.GD2 OF.8TMBBZ.2bg. 150A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 28. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

En una modalidad, el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.1 50A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

En una modalidad, la región de señalización coestimuladora comprende el dominio intracelular de una molecula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza específicamente con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una cola poli(A) que comprende aproximadamente 150 bases de adenosina. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una 3’UTR que comprende al menos una repetición de una 3’UTR derivada de beta-globulina humana.

La presente invención también proporciona un método para generar una población de células T diseñadas con ARN que expresan temporalmente ARN exógeno. El método comprende introducir un ARN transcrito in vitro o ARN sintético en una célula T, en donde el ARN comprende un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, una región de señalización coestimuladora, y un dominio de señalización de CD3-zeta. En una modalidad, el dominio extracelular comprende una porción de enlace de antígeno. En una modalidad, la porción de enlace de antígeno enlaza a un antígeno de tumor. En una modalidad, el antígeno de tumor es un antígeno asociado con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colorectal, cáncer de hígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, melanoma metastático, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma de no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer uterino, y cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.ssl .OF.BBZ.2bg.150A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 8.

En una modalidad, el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.19.0F.2bg .150A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

En una modalidad, el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD- A.GD2.0F.8TMBBZ.2bg. 150A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 28. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

En una modalidad, el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.1 50A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

La presente invención también proporciona un método para tratar a un paciente con cáncer. El método comprende administrar al paciente una célula T diseñada para expresar temporalmente ARN exógeno, en donde el ARN comprende un ácido nucleico que codifica un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, una región de señalización coestimuladora, y un dominio de señalización de CD3-zeta. En una modalidad, el dominio extracelular comprende una porción de enlace de antígenos. En una modalidad, la porción de enlace de antígeno enlaza a un antígeno de tumor. En una modalidad, el antígeno de tumor es un antígeno asociado con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colorectal, cáncer de hígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, melanoma metastático, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma de no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer uterino, y cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, el método comprende repetir la administración de una célula T. En una modalidad, el método comprende administrar un agente quimioterapéutico al paciente.

En una modalidad, el ARN es transcrito a partir de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.ss 1.OF. BBZ.2bg .150A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 4. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6, y SEQ ID NO: 8.

En una modalidad, el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.19.0F.2bg.150A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

En una modalidad, el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD- A.GD2.0F.8TMBBZ.2bg. 150A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 28. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

En una modalidad, el ARN se transcribe a partir de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD- A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.1 50A. En una modalidad, el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 27. En una modalidad, el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

En una modalidad, la región de señalización coestimuladora comprende el dominio intracelular de una molecula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-IBB, 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza específicamente con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una cola de poli(A) que comprende aproximadamente 150 bases de adenosina. En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico comprende una 3’UTR que comprende al menos una repetición de una 3’UTR derivada de beta-globulina humana.

Breve Descripción de las Figuras La siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas de la presente invención, será mejor comprendida cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. Para el propósito de ilustrar la presente invención, se muestran en los dibujos modalidades en las cuales son las actualmente preferidas.

Deberá quedar entendido, sin embargo, que la presente invención no se limita a los ajustes e instrumentaciones precisas de las modalidades mostradas en los dibujos.

La figura 1, comprende las figuras 1A y 1B, es una serie de imágenes que demuestran que la optimización del mARN mediante modificación de las UTRs confiere expresión de alto nivel de CARs en celulas T electroporadas. La figura 1A, es una representación esquemática de la construcción ss1-bbz con diferentes modificaciones de 5'UTR o 3'UTR. El vector IVT con base en pGEM que contiene ss1-bbz (pGEM-ss1 bbz.64A) se modificó tal como se describe en otras partes del presente documento para agregar una 3’UTR (2bgUTR.64A), 5'UTR (SP163.64A), una cola poli(A) más larga (150A), o tanto 3’UTR como poli(A) más larga (2bgUTR.150A). La figura 1B es una imagen que demuestra que el ARN elaborado de construcciones modificadas fue electroporado en células T y la expresión de transgen fue seguida por citometría de flujo. La figura 1 B i es una imagen que ilustra histogramas de expresión de transgen el día 1 después de la electroporación. La figura 1 B i i es una imagen que ilustra la intensidad de fluorescencia promedio (MFI) de CAR durante 4 días después de la electroporación. Los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes.

La figura 2, que comprende las figuras 2A a 2C, es una serie de imágenes que demuestran que la optimización de la cobertura de ARN incrementa y sostiene la expresión de CAR en celulas T electroporadas . La figu ra 2A es u na imagen que demuestra que células T fueron electroporadas con ARN IVT cubierto mediante el método de cobertura indicado, incluyendo el uso del análogo RC , ARCA, o CE en una dosis de ARN fija de 2.5 mg/100 de célu la T. La expresión de transgen se monitoreo midiendo M F I utilizando citometría de flujo en los momentos indicados después de la electroporación (EP) . La figu ra 2B, es u na imagen que demuestra que las células T del experimento anterior se monitoreo mediante citometría de flujo para determinar la fracción de células que expresan el transgen . La fig ura 2C es una imagen que ilustra células T electroporadas con ARN IVT que codifica ss1 -bbz cubierto mediante diferentes métodos de cobertura , incluyendo ARCA, CE, CE con la adición de poli(A) (C E + A) , ARN de cobertura 1 generado por sistema CE capí (C E 1 ) , o ARN de cobertura 1 generado por sistema CE capí más poli (A) enzimático (CE1 +A) en una dosis de ARN de 10 mg ARN/100 mL, de células T. Se monitoreo la expresión de transgen mediante citometría de flujo (M F I) d urante 3 d ías después de la electroporación . Los datos son representativos de dos experimentos independientes.

La fig ura 3, que comprende las figu ras 3A a 3D, es una serie de imágenes q ue demuestran la expresión de CAR ARN sostenida y utilizando ARN generado de construcciones de vector que cumplen con las regulaciones. Cuatro horas después de la electroporación , las celulas T electroporadas con el ARN indicado, se cocultivaron con K562-meso o K562-CD19 durante 16 horas. La figura 3A es una imagen que demuestra que la activación de célula T específica de antígeno fue detectada mediante la inducción de expresión 4-IBB. La figura 3B es una imagen que demuestra que la producción IL-2 se midió mediante ELISA. La figura 3C es una imagen que demuestra que las células T estimuladas fueron electroporadas con ARN de grado clínico (10 mg ARN/100 mL, de células T) generado de pD-A.ss1 .OF (superior) o pD-A.19.OF (inferior) y la expresión de transgen se monitoreo en el momento indicado. La figura 3D es una imagen que demuestra que 1 día después de la electroporación, la función de célula T diseñada mediante ARN fue probada midiendo la translocación de superficie CD107a después de que las células T que expresan el CAR de ARN indicado fueron cocultivas durante 4 horas con objetivos K562-CD19 o K562-meso. Las células efectoras se cerraron en CD3. Los datos son representativos de al menos dos experimentos independientes.

La figura 4, que comprende las figuras 4A a 4C, es una serie de imágenes que demuestran la regresión de tumores vascularizados avanzados en ratones tratados con células T diseñadas con ARN. La figura 4A, es una imagen que demuestra que los tumores de flanco fueron establecidos mediante inyección M108 (s.c.) en ratones NOD/scid/yc(-/-) (NSG) (n = 6). Sesenta y seis días después de la inoculación de tumor, los ratones fueron aleatorizados para ecualizar la carga de tumor y fueron tratados con células T electroporadas mediante ss1-bbz ARN. Las células T (10 x 106 a 15 x 106) fueron inyectadas en forma intratumoral cada 4 días para un total de cuatro inyecciones utilizando el mismo donador saludable. Los ratones tratados con solución salina y sirvieron como controles (n = 3). El tamaño del tumor se midió semanalmente. La figura 4B es una imagen que demuestra que los tumores i.p. diseminados fueron establecidos en ratones NSG (n = 6 por grupo) mediante inyección i.p. con 8 x 106 M108-células Luc. Comenzando el día 58, las células T electroporadas con CAR ARN (1 x 107) que expresan ss1-bbz fueron inyectadas dos veces a la semana durante 2 semanas. Las células T diseñadas con ARN que expresan CAR ARN CD19-bbz o solución salina, fueron inyectadas como controles. El día 78, la señal de luminiscencia disminuyó significativamente en los ratones ss1-bbz en comparación con ratones CD19-bbz (P < 0.01). La figura 4C es una imagen que ilustra BLI de un ratón simple tratado con una sola inyección el día 58 de células T (1 x 107) que expresan el CAR ss1-bbz utilizando un vector lentiviral. Se trazaron los datos BLI para el experimento descrito en la figura 4B. Las barras SE. *, P < 0.05; **, P < 0.01. La señal BLI en el grupo de solución salina se truncó en el extremo alto debido a la saturación del sistema de imágenes.

La figura 5, que comprende las figuras 5A a 5C, es una serie de imágenes que demuestran que múltiples inyecciones de celulas T diseñadas con ARN autólogo controlan el crecimiento del cáncer diseminado avanzado en un modelo de ratón de xenomjerto. La figura 5A es una imagen que demuestra que los ratones NOD/scid/yc(-/-)(n = 30) fueron inyectados con 8 x 106 M108-células de tumor Luc (i.p.) y los ratones fueron aleatorizados en tres grupos antes de comenzar la terapia con células T autólogas electroporadas con ARN (107 por inyección) que expresan CAR ss1-bbz, CAR CD19-bbz de control, o solución salina el día 56 después de la inoculación del tumor. Se inyectaron células T autólogas i.p. y las imágenes se llevaron a cabo en animales sobrevivientes tal como se indica. Las imágenes comenzaron 5 días antes del inicio del tratamiento de célula T. El tumor BLI disminuyó significativamente en los ratones CAR ss1 (38.6%) en comparación tanto con los ratones CAR CD19 (243.6%) como de solución salina (237.1%) después de las primeras seis dosis (P < 0.001). La figura 5B es una imagen que demuestra un análisis Kaplan-Meier. La supervivencia promedio fue significativamente mayor en los ratones CAR ss1 en comparación con los ratones CAR CD19 y la solución salina (P < 0.05). La figura 5C es una imagen que demuestra que se acumularon significativamente menos ascitos en los ratones CAR ss1, ya que el cambio promedio en el peso corporal total fue menor en comparación con los grupos de ratones tanto de CAR CD19 como de solución salina (P < 0.001 ).

La figura 6, es una imagen que ilustra los diversos niveles de la expresión de transgen CAR en celulas T. Las células T activadas fueron electroporadas con ARN que codifican CARs scFv ss1 de anti-mesotelina con porciones de señalización indicadas, y citometría de flujo utilizada para medir la expresión de superficie 19 horas después de la electroporación. Las células T electroporadas sin ARN, se utilizaron como un control negativo. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La figura 7 es una imagen que ilustra las células T electroporadas con CARs de ARN ss1 generados mediante diferentes métodos que fueron cocultivados 1:1 con objetivos que expresan mesotelina (K562-meso) u objetivos de control (K562-CD19) el día 1 posterior a la electroporación y se cultivaron durante 48 horas antes de que la expresión de transgen de superficie (MFI) fuera medida mediante citometría de flujo. Abreviaturas: ARCA, análogo de cobertura anti reversa; CE1+A, enzima 1 de cobertura más poli(A) larga; CE1, enzima 1 de cobertura con 64 poli (A) ; CE+A, enzima de cobertura más poli(A) largo 150; RC, análogo de cobertura regular; NoEP, mock electroporada . Los datos son representativos de 2 experimentos independientes.

La figura 8, es una imagen que ilustra la expresión de transgen de celulas T electroporadas con ARNs generadas de vector IVT de grado clínico pD-A.ss1.OF (ss1. OF) y pD-A.19.0F (19. OF), en comparación con sus vectores de origen pDrive-ss1 .2bgUTR.150A (pDrive.ssl) y pDrive-19.2bgUTR.1 50A (pDrive.19) 20 horas después de la electroporación . Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La figura 9, es una imagen que ilustra la actividad lítica específica de células T electroporadas con ARN CAR ss1-bbz o 19-bbz. 20 horas después de la electroporación, se utilizó un ensayo CTL a base de flujo de 4 horas que contiene una mezcla de objetivos K562-CD19 o K562-meso etiquetados en una proporción de efector:objetivo de 10:1. Los valores de porcentaje mostrados en el cuadrante superior derecho, son el exterminio específico calculado del objetivo relevante. Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La figura 10, es una imagen que demuestra que los ratones tratados tal como se muestra en la figura 4A fueron sacrificados el día 98 después de la inoculación del tumor y fotografiados. Las flechas señalan hacia los tumores.

La figura 11, es una imagen que ilustra el programa de las inyecciones de BLI célula T, para pruebas experimentales de múltiples inyecciones de células T diseñadas con ARN que fueron autólogas para el tumor tal como se describe en la figura 5. Se inyectaron 30 ratones con celu las de tumor 8 x 106 M 108-Luc (I P) y los ratones fueron aleatorizados en 3 grupos antes de comenzar la terapia con células T autólogas electroporadas con CAR indicado el d ía 56. Las inyecciones de célula T (1 x 107 cél ulas T por inyección) y los tiempos de BLI están indicados. BLI comenzó 5 días antes de las inyecciones de célula T para proporcionar una med ida de línea de base de la carga de tumor.

La figu ra 1 2, que comprende las figuras 12A a 12D, es u na serie de imágenes que demuestran el procedimiento de electroporación de mARN optimizado que da como resultado la expresión uniforme en la superficie de alto nivel y la función específica de células T diseñadas con ARN in vitro. La fig ura 12A es una imagen que ilustra la expresión CAR tal como se mide mediante la intensidad fluorescente promedio (M FI) en diferentes pu ntos de tiempo después de la electroporación con mARN CD 19-BBz en células T de sangre periférica estimuladas con anti-CD3 y CD28 (histog ramas abiertos) ; célu las T no electroporadas fueron utilizadas como control negativo (histograma lleno) . La figura 12B es u na imagen que ilustra las células T CAR+ de ARN que exterminan específicamente los objetivos CD 19. Se llevó a cabo un ensayo CTL a base de flujo en el d ía indicado después de la electroporación con K562-CD 19 como objetivo y K562-meso como control . La fig ura 1 2C es una imagen q ue demuestra que las PBLs fueron electroporadas con ss1-BBz, CD19-BBz o sin mARN (Mock). Cuatro horas despues de la electroporación, las células T fueron co-cultivadas con K562, NALM-6, o K562 que expresan ya sea CD19 (K562-CD19) o mesotelina (K562-meso) y analizadas para manchado CD107a. Las células T positivas CD3 fueron cerradas. Únicamente se observó expresión CD107a específica de antígeno. La figura 12D es una imagen que demuestra que cuatro horas después de la electroporación, las células T electroporadas con mARN que codifica CD19-BBz o ss1-BBz fueron co-cultivadas con células objetivo K562-meso o K562-CD19 durante 16 horas. La producción IL-2 se midió en el sobrenadante mediante ELISA, con incrementos significativos en la producción IL-2 en una forma específica de antígeno (* = p<0.01). Los datos son representativos de al menos 2 experimentos independientes.

La figura 13, que comprende las figuras 13A a 13D, es una serie de imágenes que ilustran la expresión de transgen potencialmente sintonizable y las funciones efectoras de células T CAR+ ARN. La figura 13A, es una imagen que demuestra que la expresión de transgen de células T CAR+ ARN electroporadas con la cantidad indicada de ARN CD19-BBz se muestra como una función del tiempo. Histogramas de expresión de transgen de mARN CAR 19-BBz electroporado. La figura 13B, es una imagen que ilustra los datos de expresión de transgen de la figura 13A trazada como una gráfica de líneas.

El rango de dism inución es similar a pesar de los diferentes M FI observados en la fig ura 13A. La figu ra 13C, es una imagen que ilustra la lisis específica de celulas de tumor CD 19 + con células T CAR electroporadas con las cantidades indicadas de ARN . La lisis medida utilizando un ensayo CTL citométrico de flujo utilizando K562-CD 19 como objetivo es el d ía 1 (panel izquierdo) y el d ía 3 (panel derecho) después de electroporación . Aunque existe poca diferencia en el d ía 1 , por el día 3 se observa una disminución dependiente de la dosis en la lisis específica relativa a la dosis de ARN . La figura 13D, es una imagen que ilustra la secreción I FN-g mediante células T diseñadas con ARN (4 horas después de la electroporación) con la cantidad indicada de ARN co-cultivado du rante la noche con células objetivo diluidas en serie (K562-CD 1 9) u objetivos de control (K562-meso en 1 : 1 ) ensayadas mediante ELISA. La secreción I FN-g se titu la con la cantidad objetivo, y se sugiere que no es estad ísticamente diferente en forma significativa entre los grupos positivos CAR CD 19 a través de una tendencia hacia una menor secreción de citocina con dosis ARN inferiores.

La figura 14, que comprende las figu ras 14A y 14B, es una serie de imágenes que ilustran la expresión y función de CARs ARN in vivo. La figura 14A es una imagen q ue demuestra que los ratones NO D/SC I D/gc /_ (N SG) fueron inyectados con 107 PBLs ya sea IV o en forma intraperitoneal (I P) cuatro horas después de la electroporación con ss 1 -BBz o C D 19-BBz. Los ratones fueron sacrificados después de 48 horas, y se aislaron los PBLs humanos de la sang re periférica, bazo, médula ósea y lavado intraperitoneal (I P) utilizando un equipo de selección negativo de célula T (Dynal Magnetic Beads). Las células pu rificadas fueron manchadas para la expresión CD3 y CAR humana (mediante un IgG anti-ratón de cabra panespecífico) y analizadas mediante citometría de flujo. El manchado de fondo significativo de las células precursoras de méd ula de ratón se observó en el compartimento de méd ula ósea a pesar de la selección negativa. Se recuperaron las células CD3 + CAR+ de la sangre, bazo y un lavado peritoneal aunque raramente de la médula ósea femoral en este punto de tiempo. La figura 14B , es una imagen que ilustra que las células T purificadas recuperadas de lavados intraperitoneales 2 d ías después de la inyección de los ratones mediante ruta IV o I P con C D 19-BBz fueron utilizadas en u n ensayo CTL a base de flujo. Las células T electroporadas ARN C D 1 9-BBz que habían sido cultivadas in vitro durante dos d ías (CD19 In Vitro) y las células T electroporadas (sin mARN) fueron utilizadas como controles. La gráfica muestra el porcentaje de lisis del PBLs purificado contra objetivos K562-CD 19 o K562-meso. La lisis específica objetivo observada en CTLs CAR recuperados es comparable con la de CAR+ PBLs cultivadas in vitro y es significativamente mayor que sin controles de mARN (p<0.01 ) .

La figura 15, que comprende las figuras 15A y 15B, es una serie de imágenes que ilustran el tráfico y proliferación específica de CARs ARN en ratones que contiene tumor. La figura 15A, es una imagen que demuestra que los ratones NOD/SCID/yc ^NSG) los ratones fueron inyectadas IV con 106 células Nalm-6 seguido de siete días después con 5 x 106 de célula T cuatro horas después de la electroporación con construcciones de mARN indicadas. Las células T también han sido transfectadas en forma estable con la construcción lentiviral para expresar luciferasa de luciérnaga, y se generaron imágenes de los ratones para bioluminiscencia. La gráfica indica el promedio de flujo de fotones total individual ± error estándar para cada uno de los grupos indicados (n = 8). La figura 15B, es una imagen que demuestra que los CARs ARN CD19 exhiben una señal de bioluminiscencia en incremento y una distribución anatómica consistente con la migración a sitios de enfermedad y proliferación de célula T diseñada con ARN. Los mapas de calor de densidad de fotones el 3 días después de la inyección, sugieren que las células T mock, o las células T que expresan los CARs ARN con especificidad irrelevante contra mesotelina, se agrupan en forma pasiva en el bazo (flanco izquierdo en el mapa de calor) y no incrementan en densidad de fotones, lo que indica una carencia de proliferación. Se debe observar que las células 5 x 106 producen un flujo p/s/cm2 de ~2 x 107 , equivalente entre todos los grupos inmediatamente despues de la inyección . Los ratones tratados con solución salina representan la autoluminiscencia de fondo de 5 x 105 p/s/cm2.

La figura 16, que comprende las figuras 16A a 16D, es una serie de imágenes q ue ilustran la eficacia terapéutica y la especificidad de una sola inyección de células T CAR+ ARN en modelo de xenomjerto Nalm-6. La fig u ra 16A es una imagen que demuestra q ue los ratones NSG fueron inyectados con 106 Nalm-6 transducido para expresar en forma estable luciferasa de luciérnaga tal como en la figura 17, seg uido de u na inyección en la vena de la cola simple de células T 2.5 x 107 electroporadas con mARN C D1 9-BBz o meso-BBz siete d ías después (flecha). Se generaron imágenes de los animales en los puntos de tiempo indicados después de la inyección , con un flujo de fotón total ± SE indicado en el eje Y; 5 x 1 05 p/sec/cm2/sr representa ratones sin células que contienen luciferasa. (* = p<0.01 ) . La fig ura 16B, es u na imagen q ue ilustra los mapas de calor de densidad de calor de fotones de leucemia positiva de luciferasa de luciérnaga en ratones representativos el Día 5 (2 d ías pre-tratamiento) y Día 8 (24 horas posteriores a CAR+ PB Ls) . Los ratones comenzaron con una carga igual de leucemia aunque los CAR+ PBLs dirigidos a CD 19 red ucen la carga de enfermedad mediante 2 reg istros (pero no la eliminan) tal como se mide mediante densidad de fotones. La figu ra 16C es una imagen que ilustra que la supervivencia de los ratones tratados con celulas T CAR+ ARN CD 1 9-BBz se prolonga en forma significativa en comparación con control de solución salina y g rupos de célula T CAR de ARN meso-BBz. (p<0.01 med iante análisis de clasificación de reg istro) . La figura 16D es u na imagen que ilustra la supervivencia con CTLs CAR ARN q ue se compara en forma favorable con la de CTLs CAR generados en forma lentiviral en el mismo modelo a través de sobrevivientes a no largo plazo que se observan con una sola infusión de CTL’s CAR ARN , en forma consistente con nuestra observación de que la inyección simple no elimina totalmente la enfermedad (n = 1 2, resumen de 2 experimentos independientes) .

La fig ura 17, es una imagen que ilustra el crecimiento de tumor rápido y la letalidad de Nalm-6 en ratones NSG con xenomjerto. Los ratones NSG (n = 8) fueron inyectados con 106 células Nalm-6 transducidas para expresar en forma estable luciferasa de luciérnaga. Se generaron imágenes de los animales en los puntos de tiempo indicados después de la inyección , con un flujo de fotones total indicado en el eje Y; 5 x 105 p/sec/cm2/sr representa el fondo de ratones sin células q ue contienen luciferasa. Las imágenes son de un ratón representativo seguido en todos los puntos de tiempo; el animal q uedo moribu ndo el Día 24.

La figura 18, que comprende las figuras 18A a 18C , es u na serie de imágenes q ue ilustran q ue la titu lación de ARN da como resultado una secreción I L-2 potencialmente sintonizable.

La figura 18A es una imagen que ilustra la secreción I L-2 mediante celulas T diseñadas con ARN (4 horas después de electroporación) con la cantidad ind icada de ARN co-cultivado d urante la noche con células objetivo (K562-C D 1 9) en una proporción E:T de 2 : 1 medida mediante formación Luminex. La figura 18B es una imagen que ilustra el enrso de tiempo y el sitio de reincidencia en ratones representativos de CTLs CAR ARN o CTLs CAR Lentiviral . Los ratones fueron tratados tal como se describe en la figu ra 16. La región periodontal es un sitio de albergue para leucemia en ratones tratados tanto con ARN como CTL lentiviral. Con el tiempo, los ratones tratados con células T diseñadas mediante ARN reincidieron en forma sistémica , mientras que los ratones tratados en forma lentiviral murieron de complicaciones locales y/o reincidencia sistémica a menos que se hubieran podido despejar las regiones periodontales y paraespinales. La figura 18C es una imagen de los ratones el D ía 35 que muestra la variabilidad de la reincidencia incluso con el sitio de albergue periodontal consistente. El ratón de la izquierda muestra la construcción de u na reincidencia difusa con señal en el bazo, vértebras y fému res. El tercer ratón muestra una reincidencia paraespinal incipiente , que da como resultado eventualmente la parálisis de la extremidad trasera.

La figu ra 19, es un esquema de u n plásmido pD-A.ss 1 .OF. BBZ.2bg .150 A (SEQ I D NO: 4) .

La figura 20, es un esquema de un plásmido pD-A.19.0F.2bg.150A (SEQ ID NO: 5).

La figura 21, es un esquema de una construcción de vectores GD2-BBZ basados IVT pGEM-64A.

La figura 22, es un conjunto de gráficas que ilustra la expresión de CARs dirigidos mediante GD2 un día despues de la electroporación .

La figura 23, ilustra los resultados de un experimento que revisa la función de células T CAR ARN GD2 utilizando un ensayo CD 107a. Las células electroporadas con diversos ARN CAR dirigidos mediante GD2 fueron co-cultivadas con SY5Y (línea de célula de tumor GD2 + ) o NLFwt (línea de célula de tumor GD2), y la expresión CD107a fue detectada mediante citometría de flujo en un ensayo de cultivo de 4 horas.

La figura 24, es una gráfica que ilustra los niveles de IFN-gamma producido y secretado mediante células T electroporadas al momento del cocultivo con SY5Y (línea de célula de tumor GD2 + ) o NLFwt (línea de célula de tumor GD2). El sobrenadante fue recolectado 24 horas después del co cultivo y se detectó el IFN-gamma mediante ELISA.

La figura 25, es un esquema que ilustra la construcción de vectores pD-A.GD2 OF.8TMBBZ.abg.1 50A para la producción de ARN GMP CAR GD2. Se utilizó PCR de traslape para generar libre de ORF interno GD2-8TMBBZ (OF). Se eliminaron dos ORFs internas mediante mutaciones PCR de codones ATG sin alterar la estructura de lectura abierta CAR.

La figura 26, es una imagen que ilustra la línea de tiempo de un estudio animal CAR ARN GD2 de neuroblastoma.

La figura 27, es una gráfica que ilustra el grado de carga de tumor a lo largo del curso del tiempo del tratamiento con celulas T electroporadas para recibir ARN que codifica CARs dirigidos GD2 o CARs dirigidos por CD19 comparados con PBS tratados como control negativo.

La figura 28, es un conjunto de imágenes que ilustra la presencia de células de tumor en ratones tratados con CAR ARN GD2 y CAR ARN CD19.

La figura 29, es un conjunto de gráficas que ilustra el nivel de expresión cMet en líneas de células K562-CD19, K562-cMet, L55, SK-OV3, y OV79.

La figura 30, es un esquema que detalla la construcción de construcciones CAR cMet.BBZ libres de ORF interno (OF).

La figura 31, que comprende la figura 31A y 31B, ilustra los resultados de experimentos que revisan la expresión y función de versiones clínicas de CARs ARN dirigidos por cMet. La figura 31, es un conjunto de gráficas que ilustra los resultados de un ensayo CD107a que revisa la función de diversos CARs de ARN de cMet cuando se co-cultivan ya sea con una línea de célula positiva cMet (L55 o SK-OV3), o una línea de célula negativa cMet (K562-CD19). CD107a se detectó mediante citometría de flujo en un ensayo de cultivo de 4 horas.

La figu ra 31 B ilustra un conju nto de g ráficas q ue muestran la expresión de CAR 24 horas despues de la electroporación .

La figura 32 , q ue comprende la figura 32A y 32B, ilustra los resultados de experimentos q ue revisan la producción I FN-gamma de células T electroporadas CAR ARN de cMet cuando se co-cultivan con líneas de célula de tumor. La figura 32A, ilustra una gráfica que ilustra los resultados de experimentos en donde las células T fueron electroporadas con ARN IVT que codifica u no de los diversos CARs cMet y que fueron cocultivados posteriormente ya sea con líneas de célula de tumor positivo cMet (L55 o SK-OV3) o una línea de célula negativa (K562-CD 19). Se recolectó el sobrenadante 24 horas después del cocultivo y se sometió a ELISA para detectar I FN-gamma seg regado . La fig ura 32B ilustra el mapa de la construcción pD-A.cMet.O F.8TM BBZ.2bg UTR.1 50A q ue fue elegida para experimentos animales y la prueba clínica potencial basada en su expresión de transgen y fu ncionalidad .

La figura 33, es un conjunto de gráficas que ¡lustra el nivel de expresión cMet en l íneas de célula de tumor SK-OV3, 888mel , 624mel , 526mel , y K562.

La figu ra 34, es un conjunto de gráficas que ilustra el nivel de expresión CAR en células T electroporadas . El d ía 10 las células T estimuladas fueron electroporadas con ARN CAR CD9, o ARN CAR cMet o sin electroporación (No EP) . Después de cultivo durante la noche, se detectó la expresión CAR CD 19 o CAR cMet mediante citometría de flujo.

La figura 35, es un conjunto de gráficas que ilustra la expresión CD107a de celulas T electroporadas CAR ARN cMet estimuladas con melanoma. Las células T electroporadas con ARN fueron estimuladas con líneas de célula de tumor indicadas, incluyendo líneas de melanoma CD19+ Nalm6, cMet+ SK-OV3 y cMet+ (888mel, 624mel y 526mel). K562 se utilizó como control CD19- y cMet- Después de 4 horas de estimulación, la expresión CD107a fue monitoreada mediante citometría de flujo. Las células fueron cerradas CD8 + .

La figura 36, es una gráfica que ilustra la cantidad de producción IFN-gamma de células T electroporadas CAR ARN cMet estimuladas con melanoma. Las células T electroporadas con ARN fueron estimuladas con líneas de célula de tumor indicadas, incluyendo líneas de melanoma CD19+ Nalm6, cMet+ SK-OV3 y cMet+ (888mel, 624mel y 526mel). K562 se utilizó como control CD19- y cMet-. Después de 24 horas de estimulación, se ensayó la producción IFN-gamma mediante ELISA.

La figura 37, ilustra el diseño de un experimento in vivo que revisa el efecto terapéutico de CARs ARN cMet.

La figura 38, es una gráfica que ilustra la carga de tumor de ratones tratados con PBS (como control negativo), células T electroporadas CAR ARN cMet, o células T electroporadas CAR ARN CD19. Se combinó la terapia de célula T CAR con tratamiento Citoxan (LP. 60 mg/kg) proporcionado un d ía antes de la inyección de celula T.

La figura 39, es una gráfica que ilustra la carga de tumor en ratones con CD 19 leucemia positiva, tratados con CARs suministrado ya sea mediante ARN IVT o vectores lentivirales. Las células T electroporadas ARN CD 19 exhiben carga de tumor reducida en comparación con el control , pero no despejan el tumor, tal como se observa mediante CARs C D19 sum inistrados en forma lentiviral . Las flechas designan los tiempos de inyección de las células T electroporadas CAR ARN .

La figura 40, es una gráfica que ilustra la carga de tumor en ratones tratados con células T electroporadas CAR ARN con o sin tratamiento de Citoxan combinada . Los ratones recibieron el tratamiento Citoxan (chemo) y CAR combinado a menos que se indiq ue de otra manera. Los datos presentados demuestran que la disminución de células T, previa mediante CAR mejora el tratamiento Citoxan conferido mediante infusiones repetidas de células T CAR ARN .

La fig ura 41 , es u na gráfica que ilustra el porcentaje de supervivencia de ratones tratados con células T electroporadas ARN con o sin tratamiento Citoxan combinado. Los ratones recibieron tratamiento Citoxan (quimio) y CAR combinado, a menos q ue se ind ique lo contrario. Los datos ilustran q ue la supervivencia general se prolonga en las infusiones de Citoxan y repetidas de terapias de células T CAR ARN .

La figura 42, es una gráfica que ilustra el g rado de carga de tumor en los ratones tratados con celulas T CAR , cuando el CAR se suministra ya sea a través de vector antiviral o mediante ARN IVT. Para grupos ARN , se combinó terapia con 60 mg/kg de Citoxan suministrado 24 horas antes de la segunda infusión de células T CAR ARN . Las construcciones CAR utilizadas fueron y sea de tipo natural (WT), optimizadas por codón (CO) , o fueron mutadas para eliminar un motivo de dileucina (LL) .

La fig u ra 43, es u n conjunto de gráficas que ilustran el porcentaje de supervivencia de ratones tratados con células T CAR CD1 9-BBZ (superior) y con células T CAR CD 19-28BBZ. Para grupos ARN , se combinó terapia con 60 mg/kg de Citoxan suministrada 24 horas antes de u na infusión de repetición de células T CAR electroporadas con ARN . Las construcciones CAR utilizadas fueron ya sea tipo natural (WT), optimizadas por codón (CO) , o fueron mutadas para eliminar un motivo de d ileucina (LL) .

La fig ura 44, es u n conjunto de imágenes que ilustran los g rados de tumor, tal como se mide a través de bioluminiscencia, en ratones 5 d ías después de una sola inyección de células T CAR. Las células T fueron modificadas a través del suministro de ARN IVT que codifica el CAR, a menos en donde se observa como suministradas mediante vector lentiviral (lenti). Las construcciones CAR utilizadas fueron ya sea tipo natural (WT), optimizadas por codón (CO), o fueron mutadas para eliminar un motivo de d ileuci na (LL).

La figu ra 45, es u n conjunto de imágenes que ilustra la extensión del tumor, tal como se mide a través de bioluminescencia, en ratones el d ía 21 , 7 días después del tratamiento combinado de la segunda infusión de células T CAR y tratamiento Citoxan . Las células T fueron mod ificadas a través de suministro de ARN IVT que codifica el CAR , a menos en donde se observó que se suministra mediante vector lentiviral (lenti) . Los animales tratados en forma lentiviral no recibieron el Citoxan o la segu nda infusión de células T. Las construcciones CAR utilizadas fueron ya sea tipo natural (WT), optimizadas por codón (CO), o fueron mutadas para eliminar un motivo de dileucina (LL) .

La figura 46, es una gráfica que ilustra la carga de tumor en ratones tratados con células T CAR 19-BBz. Los ratones fueron tratados con una sola dosis de células T suministradas en forma lentiviral 19-BBz o con múltiples dosis de células T CAR ARN 19-BBz. Las célu las T CAR ARN fueron ya sea suministradas solas, o en combinación con tratamiento Citoxan (proporcionado 1 d ía antes de la infusión de célula T). Se revisaron las mú ltiples estrategias de dosificación de las células T CAR ARN , en donde varió el número de células T en cada infusión .

La fig u ra 47, es un conjunto de imágenes que ilustran la extensión del tumor el d ía 22 en ratones tratados con celulas T CAR 19-BBz. Los ratones fueron tratados con una sola dosis de células T 1 9-BBz suministrada en forma lentiviral, o con múltiples dosis de células T CAR ARN 1 9-BBz. Las células T CAR ARN fueron ya sea suministradas solas, o en combinación con tratamiento Citoxan (proporcionado 1 d ía antes de la infusión de célula T) . Las estrategias de dosificación múltiple de las células T CAR ARN fueron revisadas, en donde varió el n úmero de células T en cada infusión .

La figura 48 , es u n conjunto de imágenes que ilustra la extensión del tumor a lo largo del curso de tiempo del estudio en ratones tratados con células T CAR 19-BBz. Los ratones fueron tratados con una sola dosis de células T 19-BBz suministradas en forma lentiviral o con m últiples dosis de células T CAR ARN 1 9-BBz. Las células T CAR ARN fueron ya sea suministradas sola o en combinación con tratamiento Citoxan (proporcionadas el 1 d ía antes de la infusión de célula T) . Se revisaron las estrategias de dosificación múltiple en las células T CAR ARN , en donde varió el n úmero de célu las T en cada infusión .

La fig u ra 49, es u na g ráfica q ue ¡lustra el porcentaje de supervivencia en ratones tratados con células T CAR 19-BBz. Los ratones fueron tratados con una sola dosis de células T 19-BBz suministradas en forma lentiviral o con múltiples dosis de células T CAR ARN 1 9-BBz. Las células T CAR ARN fueron ya sea suministradas solas, o en combinación con tratamiento Citoxan (proporcionadas el 1 d ía antes de la infusión de celula T) . Se revisaron las estrategias de dosificación múltiple de las células T CAR ARN , en donde varió el número de células T en cada infusión .

La figu ra 50, es un conju nto de gráficas que ilustra el porcentaje de supervivencia en ratones tratados con células T CAR 19-BBz, células T CAR 19-28BBz, o células T CAR meso-BBz. Los ratones tratados con u na sola dosis de células T CAR suministradas en forma lentiviral o con múltiples dosis de células T electroporadas CAR ARN . Las células T electroporadas CAR ARN fueron ya sea suministradas solas, o en combinación con tratamiento de Citoxan (proporcionadas 1 d ía antes de la infusión de célula T). Se revisaron las estrategias de dosificación múltiple de células T CAR ARN , en donde varió el n úmero de células T en cada infusión ión Detal lada de la I nvención La presente invención se refiere al descubrimiento de q ue las células T autólogas de u n paciente con cáncer pueden ser diseñadas con ARN para proporcionar u na terapia efectiva para tratar al paciente. Las células T diseñadas mediante ARN proporcionan un método novedoso para transferencia de célula adoptada, que permite una plataforma flexible para el tratamiento de cáncer. En algunos casos, las células T d iseñadas con ARN pueden ser utilizadas como u n complemento al uso de células T diseñadas retrovirales y lentivirales. El uso de célu las T d iseñadas con ARN puede incrementar el índice terapéutico en células T diseñadas para expresar dominios de activación poderosos sin los aspectos de segu ridad asociados del uso de vectores virales que tienen el potencial de integrarse en el genoma de célula huésped .

La presente invención se refiere de manera general al uso de células T transfectadas con ARN que codifica un Receptor de Antígeno Quimérico (CAR). Las células T transfectadas con ARN q ue codifica un CAR, son referidas en la presente invención como células T diseñadas con ARN . Los CARs combinan un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico, con una molécula de señalización intracelular. Por ejemplo, la molécula de señalización intracelular puede comprender u no o más módulos de señalización de cadena CD3, 4-1 BB y CD28. Por consiguiente, la presente invención proporciona células T diseñadas con ARN y métodos para su uso para terapia adoptada .

U na ventaja de utilizar células T diseñadas con ARN es que el CAR se expresa du rante un tiempo limitado en la célula. Después de la expresión temporal de CAR, el fenotipo de la célula reg resa al tipo natu ral . Por lo tanto, la duración del tratamiento puede ser controlada utilizando células que son transfectadas temporalmente con CAR.

En una modalidad , la presente invención incluye células autólogas que son electroporadas con mARN que expresa un CAR anti-CD19, un CAR de antimesotelina, un CAR, un CAR ant¡-GD2 o un CAR anti-cMet. Sin embargo, la presente invención no debe ser limitada a CD19, mesotelina, GD2 y cMet como la molécula objetivo. Más bien, cualquier dominio de enlace de antígeno dirigido contra cualquier molécula objetivo puede ser utilizada dentro del contexto del CAR. Preferentemente, el CAR de la presente invención, combina un dominio de reconocimiento de antígeno de un anticuerpo específico con un dominio intracelular de la cadena CD3-zeta o proteína FcyR1 en una proteína quimérica simple. La presente invención, por consiguiente, incluye un ARN que codifica dichas combinaciones.

En una modalidad, el CAR comprende además un dominio de señalización 4-1BB. Por ejemplo, las células T diseñadas con ARN de la presente invención, pueden ser generadas introduciendo un ARNm transcrito in vitro de un CAR, por ejemplo, un dominio de articulación y transmembrana aCD19, CD8a y dominios de señalización 4-1BB y CD3-zeta humanos en la célula. Las células T diseñadas con ARN de la presente invención pueden ser infusionadas en un paciente con propósitos terapéuticos. En algunos casos, el CAR puede comprender además CD28.

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar a un paciente utilizando terapia de célula T adoptada, en donde las celulas T son modificadas para comprender una secuencia de ARN q ue codifica un CAR . El método puede ser utilizado para tratar cualq uier número de trastornos incluyendo cánceres y trastornos inmu ne. En alg unos casos, el método comprende administrar células T modificadas con ARN varias veces d urante el enrso de u na terapia. En una modalidad , el método comprende administrar en forma adicional u na composición terapéutica adicional. Por ejemplo, en una modalidad , el método comprende administrar un agente q uimioterapéutico.

Definiciones A menos q ue se defina de otra forma, todos los términos téenicos y científicos aq u í utilizados, tienen los mismos significados a los comúnmente comprendidos por un experto en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los aqu í descritos pueden ser utilizados en la práctica para probar la presente invención , los materiales y métodos preferidos se describen en la presente invención . En la descripción y reivindicación de la presente invención , se utilizará la siguiente terminolog ía.

También q uedará entendido que la terminolog ía aquí utilizada es con el propósito de describir únicamente modalidades particulares, y no pretende ser limitante.

Tal como se utiliza en la presente invención , una tapa 5’ (tambien denominada tapa ARN , una tapa de 7-metilguanosina de ARN o una tapa m7G de ARN) es un nucleótido de guanina modificado que ha sido ag regado a la parte frontal o extremo 5’ de un ARN mensajero eucariótico poco después del inicio de la transcripción . El tapón 5’ consiste en un g rupo terminal el cual es enlazado al primer nucleótido transcrito. Su presencia es importante para el reconocimiento por parte de la ribosoma y la protección de las RNasas. Se acopla la adición del tapón a la transfección , y ocurre en forma cotranscripción , de modo que uno tiene influencia en el otro. Poco después del inicio de la transcripción , el extremo 5’ del mARN que está siendo sintetizado es enlazado por un complejo de sintetización con tapón asociado con la polimerasa de ARN . Este complejo enzimático cataliza las reacciones q u ímicas q ue son requeridas para el taponeado de mARN . La síntesis procede como u na reacción bioq u ímica de pasos múltiples. La porción de taponeo puede ser modificada para mod ular la funcionalidad del mARN tal como su estabilidad o eficiencia de traducción .

Los artículos “un” y “uno, una” se utilizan en la presente invención para referirse a uno o más de u no (es decir, al menos u no) de los objetos gramaticales del artículo. A manera de ejemplo, “un elemento” significa u n elemento o más de un elemento.

El término “aproximadamente” tal como se utiliza en la presente invención , cuando se refiere a u n valor medible, tal como una cantidad, una duración de tiempo y similares, se entiende que comprende variaciones del ±20% o ±10%, más preferentemente del ±5%, incluso más preferentemente del ±1%, y aún más preferentemente del ±0.1% del valor específico, o las variaciones que sean adecuadas para llevar a cabo los métodos descritos.

El término “anticuerpo” tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que enlaza específicamente con un antígeno. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser partes inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos normalmente son tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos en la presente invención pueden existir en una variedad de formas incluyendo por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, así como anticuerpos de cadena simple (scFv) y anticuerpos humanizados (Harlow et al, 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al, 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor, Nueva York; Houston et al, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al, 1988, Science 242:423-426).

El término “antígeno” o “Ag”, tal como se utiliza en la presente invención, se define como una molécula que provoca u na respuesta inmu ne. Esta respuesta inmune puede implicar ya sea prod ucción de anticuerpos o la activación de células inmunológicamente competentes, o ambos. Los expertos en la téenica comprenderán q ue cualquier macromolécula , incluyendo virtualmente todas las proteínas o péptidos, pueden servir como un antígeno. Además, los antígenos pueden ser derivados de AD N recombinante o genómico. U n experto en la técnica comprenderá q ue cualquier ADN , q ue comprenda u na secuencia de n ucleótido o u na secuencia de nucleótido parcial que codifica una proteína que provoca u na respuesta inmune, q ue codifica por consig uiente un “antígeno”, es el término q ue se utiliza en la presente especificación . Además, un experto en la técnica comprenderá que un antígeno no necesita ser codificado únicamente por una secuencia de nucleótido de longitud total de un gen . Se puede apreciar fácilmente que la presente invención incluye, pero no se limita a, el uso de secuencias de nucleótido parciales de más de u n gen y q ue estas secuencias de nucleótido son ajustadas en varias combinaciones para provocar la respuesta inmune deseada. Además , un experto en la técnica comprenderá que un antígeno no necesita ser codificado por un “gen” en lo absoluto. Se podrá apreciar fácilmente q ue un antígeno puede ser generado, sintetizado o derivado de una muestra biológica . Dicha muestra biológica puede incluir, pero no se limita a una muestra de tejido, muestra de tumor, una célula o fluido biológico.

El termino “efecto antitumor” tal como se utiliza en la presente invención , se refiere a u n efecto biológico el cual puede ser manifestado por una disminución en el volumen de tumor, una disminución en el número de cél ulas de tumor, una disminución en el n úmero de metástasis, u n incremento en la expectativa de vida , o disminución de los diversos síntomas fisiológicos asociados con la condición cancerígena. Un “efecto antitumor” también puede ser manifestado por la capacidad de los péptidos, polinucleótidos, células y anticuerpos de la presente invención en la prevención del su rgimiento de tumor en el primer lugar.

Tal como se utiliza en la presente invención , el término “autólogo” se entiende que se refiere a cualq uier material derivado del mismo individuo, el cual posteriormente será reintroducido en el individ uo.

El término “alogeneico” se refiere a u n injerto derivado de u n animal d ife rente de la misma especie.

El término “xenogeneico" se refiere a u n injerto derivado de un animal de una diferente especie.

El término “cáncer”, tal como se utiliza en la presente invención , se define como una enfermedad caracterizada por el rápido y descontrolado crecimiento de células aberrantes. Las células de cáncer pueden dispersarse en forma local o a través del torrente sangu íneo y sistema linfático a otras partes del cuerpo. Los ejemplos de diversos cánceres incluyen pero no se limitan a cáncer de cerebro , cáncer de vejiga , cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colorrectal , cáncer de h ígado , cáncer de riñón , linfoma , leucemia, cáncer de pulmón , melanoma, melanoma metastático, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata , cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de piel , timoma, sarcoma, linfoma de no Hodgkin, linfoma de Hodgkin , cáncer uterino y similares.

El termino “que codifica” se refiere a la propiedad inherente de las secuencias específicas de los n ucleótidos en u n polinucleótido, tal como un gen , u n cADN o un mARN, para servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas y en procesos biológicos que tienen ya sea una secuencia de nucleótidos definida (por ejemplo, rARN , tARN y mARN) o una secuencia definida de aminoácidos y las propiedades biológicas que resultan de las mismas. Por lo tanto, un gen que codifica una proteína si la transcripción y traducción del mARN que corresponde a dicho gen produce la proteína en una célula u otro sistema biológ ico . Tanto la hebra de codificación , la secuencia de nucleótido de la misma que es idéntica a la secuencia de mARN y q ue normalmente se proporciona en los listados de secuencia , y la hebra sin codificación , utilizada como la plantilla para transcripción de un gen o cADN , pueden ser referidos como que codifican la proteína u otro producto de dicho gen o cADN .

A menos que se especifique de otra manera, u na “secuencia de n ucleótido que codifica una secuencia de aminoácido” incluye todas las secuencias de nucleótido que son versiones degeneradas de cada una de las otras, y que codifican la misma secuencia de am inoácido. Las secuencias de nucleótido que codifican proteínas y ARN pueden incluir i ntrones.

La “cantidad efectiva” o “cantidad terapeuticamente efectiva” se utilizan en forma intercambiable en la presente invención , y se refieren a una cantidad de un compuesto, form ulación , material o composición, tal como aqu í se describe efectiva para lograr un resultado biológico particular. Dichos resultados pueden incluir, pero no se limitan a, la in hibición de infección de virus tal como se determina a través de cualqu ier medio adecuado de la téenica .

Tal como se utiliza en la presente invención , el término “endógeno” se refiere a cualquier material procedente o prod ucido dentro de u n organismo, célula, tejido o sistema.

Tal como se utiliza en la presente invención , el término “exógeno” se refiere a cualquier material i ntroducido procedente de o producido fuera de un organismo, célula, tejido o sistema.

El término “expresión”, tal como se utiliza en la presente invención , se define como la transcripción y/o trad ucción de una secuencia de nucleótido particular operada por su promotor.

El término “homólogo” tal como se utiliza en la presente invención , se refiere a la identidad de secuencia de subunidad entre dos molecu las poliméricas, por ejemplo, entre dos moléculas de ácido nucleico, tal como dos moléculas de ADN , o dos moléculas de ARN , o entre dos moléculas de polipéptido. Cuando u na posición de subun idad en ambas de las dos moléculas está ocupado por la misma subunidad monomérica, por ejemplo, si una posición en cada una de las dos moléculas de ADN está ocupada por adenina, entonces son homólogas en dicha posición . La homolog ía entre dos secuencias es una función directa del n úmero de posiciones de correspondencia u homólogas; por ejemplo, si la mitad (por ejemplo, cinco posiciones en u n pol ímero, diez subu nidades de longitud) de las posiciones en dos secuencias son homólogas, las dos secuencias son el 50% homólogas; si el 90% de las posiciones (por ejemplo 9 de 10) son correspondientes u homólogas, las dos secuencias son el 90% homólogas.

Tal como se utiliza en la presente invención , un “material de instrucción” incluye una publicación, un registro, un d iag rama o cualqu ier otro medio de expresión que puede ser utilizado para comunicar la utilidad de las composiciones y métodos de la presente invención . El material de instrucción del equipo de la presente invención , puede ser fijado, por ejemplo, a un contenedor que contiene el ácido n ucleico, péptido y/o composición de la presente invención o puede ser enviado junto con un contenedor que contiene el ácido nucleico, péptido y/o composición . Alternativamente, el material de instrucción puede ser enviado por separado desde el contenedor con la intención de que el material de instrucción y el compuesto sean utilizados en forma cooperativa por el receptor.

Tal como se utiliza en la presente invención , “ARN transcrito in vitro” se refiere al ARN . Preferentemente mARN, que ha sido sintetizado in vitro. Generalmente , el ARN tanscrito in vitro se genera de un vector de transcripción in vitro . El vector de transcripción in vitro comprende una plantilla que se utiliza para generar el ARN transcrito in vitro.

El termino “aislado” significa alterado o eliminado del estado natural . Por ejemplo, un ácido n ucleico o u n péptido presente naturalmente en un animal vivo no es “aislado”, au nque el mismo ácido nucleico o péptido parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natu ral , está “aislado”. U n ácido nucleico o proteína aislada pueden existir en forma substancialmente pu rificada , o pueden existir en u n ambiente no nativo, tal como por ejemplo, u na célula huésped .

Dentro del contexto de la presente invención , se utilizan las sig uientes abreviaturas para las bases de ácido n ucleico que ocu rren comúnmente. “A” se refiere a adenosina , “C” se refiere a citosina, “G” se refiere a guanosina, “T” se refiere a timidina y “U” se refiere a uridina.

A menos que se especifiq ue de otra manera, u na “secuencia de nucleótido que codifica una secuencia de aminoácido” incluye todas las secuencias de n ucleótido q ue son versiones degeneradas una de la otra, y que codifican la misma secuencia de aminoácido. La frase secuencia de n ucleótido que codifica u na proteína o un ARN , tambien puede incluir intrones hasta el g rado en el q ue la secuencia de nucleótido que codifica la proteína pueda, en algunas versiones, contener u n intrón(s) .

Tal como se utiliza en la presente invención , un “cuadro de lectura abierta” o “ORF” es una serie de n ucleótidos que contiene una secuencia de bases que podrían codificar potencialmente un polipéptido o proteína . Un cuadro de lectura abierta se localiza entre la secuencia del código de inicio (codón de inicio o codón de arranque) y la secuencia del codón de detención (codón de terminación).

La administración “parenteral” de una composición inmunogén ica incluye , por ejemplo, inyección su bcutánea (s.c.), intravenosa (s.c.) , intramuscular (i .m.) o i ntraesternal , o téenicas de infusión .

El término “polín ucleótido” tal como se utiliza en la presente invención , se define como u na cadena de nucleótidos. Además , los ácidos n ucleicos son pol ímeros de nucleótidos. Por lo tanto, los ácidos nucleicos y polin ucleótidos, tal como se utiliza en la presente invención , son intercambiables. Un experto en la técn ica tiene el conocimiento general de que los ácidos nucleicos son polinucleótidos, los cuales pueden ser hid rolizados en los “n ucleótidos” monoméricos. Los n ucleótidos monoméricos pueden ser hid rolizados en nucleósidos. Tal como se utiliza en la presente invención , los polinucleótidos incluyen pero no se limitan a todas las secuencias de ácido nucleico las cuales son obten idas por cualquier medio disponible en la téenica , incluyendo, sin limitación , medios recombinantes, es decir, la clonación de secuencias de ácido nucleico de una biblioteca recombinante o u n genoma celular, utilizando tecnolog ía de clonación ordinaria y PCR™, y similares, o mediante medios sintéticos.

Tal como se utiliza en la presente invención , los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” se utilizan de manera intercambiable, y se refieren a un compuesto comprendido de resid uos de aminoácido enlazados en forma covalente por enlaces de péptido. Una proteína o péptido deben contener al menos dos aminoácidos, y se colocan sin limitación en el número máximo de aminoácidos que pueda comprender una secuencia de proteína o de péptido. Los péptidos incluyen cualquier péptido o proteína que comprenda dos o más aminoácidos unidos entre sí por enlaces de péptido. Tal como se utiliza en la presente invención , el término se refiere tanto a cadenas cortas, que también son referidas comúnmente en la técnica como péptidos, oligopéptidos y oligómeros , por ejemplo, y a cadenas más largas, las cuales generalmente son referidas en la técn ica como proteínas, de las cuales existen muchos tipos. Los “polipéptidos” incluyen por ejemplo, fragmentos biológicamente activos, polipéptidos substancialmente homólogos, oligopéptidos, homod ímeros, heterod ímeros, variantes de polipéptidos, polipéptidos modificados, derivados, análogos, proteínas de fusión , entre otros. Los polipéptidos incluyen péptidos natu rales, péptidos recombinantes, péptidos sintéticos, o una combinación de los mismos.

Tal como se utiliza en la presente invención , u n “poli(A)” es u na serie de adenosinas ad heridas por poliadenilación al mARN . En la modalidad preferida de u n constructor para expresión temporal , el poliA tiene entre 50 y 5000, preferentemente más de 64, más preferentemente más de 100, lo más preferentemente más de 300 o 400. Las secuencias poli(A) pueden ser modificadas química o enzimáticamente para mod ular la funcionalidad mARN , tal como localización, estabilidad o eficiencia de traducción .

Tal como se utiliza en la presente invención , la “poliadenilación” se refiere al enlace covalente de una porción de poliadenililo, o su variante modificada, a una molécula de ARN mensajero . En organismos eucarióticos, la mayor parte de las moléculas de ARN mensajero (mARN) son poliadeniladas en el extremo 3’. La cola poli(A) 3' es u na secuencia larga de n ucleótidos de adenina (con frecuencia varios cientos) agregados al pre-mARN a través de la acción de una enzima, polimerasa de poliadenilato. En eucariotos superiores, la cola poli(A) se agrega a las transcripciones q ue contienen una secuencia específica , la señal de poliadenilación . La cola poli(A) y la proteína enlazada a la misma ayudan a proteger mARN de la deg radación por las exonucleasas. La poliadenilación tambien es importante para terminación de transcripción , exportación del mARNs desde el n úcleo y trad ucción . La poliadenilación ocu rre en el núcleo inmediatamente después de la transcripción del ADN en ARN , au nq ue adicionalmente también puede ocu rrir posteriormente en el citoplasma. Después de que se ha terminado la transcripción, la cadena de mARN se disocia a través de la acción de un complejo de endonucleasa asociado con polimerasa de ARN. El sitio de disociación normalmente está caracterizado por la presencia de una secuencia base AAUAAA cerca al sitio de disociación . U na vez que el mARN ha sido disociado, los residuos de adenosina se agregan al extremo 3' libre en el sitio de disociación .

El término “sujeto” pretende incluir organismos vivos en donde se puede provocar una respuesta inmune (por ejemplo, mam íferos) .

Tal como se utiliza en la presente invención , una célula “substancialmente pu rificada” es una célula que está esencialmente libre de otros tipos de células. U na célula substancialmente pu rificada también se refiere a u na célula que ha sido separada de otros tipos de célu las , con los cuales normalmente se asocia en su estado de surgimiento natural . En algunos casos, u na población de celula substancialmente pu rificada se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a u na célula que ha sido separada de las células con las cuales está asociada natu ralmente en su estado natural. En algunas modalidades , las células son cultivadas in vitro. En otras modalidades , las células no son cultivadas in vitro.

El término “terapéutico", tal como se utiliza en la presente invención , significa un tratamiento y/o profilaxis. Un efecto terapéutico se obtiene mediante supresión , remisión o erradicación de un estado de enfermedad .

El término “transfectado” o “transformado” o “transducido” tal como se utiliza en la presente invención , se refiere a un proceso mediante el cual el ácido n ucleico exógeno es transferido o introd ucido en u na célula huésped . U na célula “transfectada” o “transformada” o “transd ucida” es una que ha sido transfectada, transformada o transducida con ácido n ucleico exógeno. La célula incluye la célula primaria y su progenie.

Tal como se utiliza en la presente invención , el término “temporal” se refiere a la expresión de un transgen no integrado durante un período de horas, días o semanas, en donde el período de tiempo de expresión es menor al período de tiempo de expresión del gen si se integra en el genoma o está contenido dentro del replicón de plásmido estable en la célula huesped .

U n “vector” es u na composición de materia que comprende u n ácido n ucleico aislado y que puede ser utilizada para suministrar el ácido nucleico aislado al interior de una célula. Se conocen numerosos vectores en la téenica, que incluyen pero no se limitan a polinucleótidos lineales, polinucleótidos asociados con compuestos iónicos o anfifílicos, plásmidos y virus. Por lo tanto el término “vector” incluye un plásmido de réplica autónoma o un virus. El término también debe ser construido para incluir compuestos sin plásmido y no virales q ue facilitan la transferencia de ácido nucleico en células, tal como, por ejemplo, un compuesto de polilisina, liposomas y similares. Los ejemplos de vectores virales incluyen pero no se limitan a vectores adenovirales, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovirales y similares.

Por el término "enlace específico” tal como se utiliza en la presente invención , se entiende un anticuerpo, o un ligando que reconoce y enlaza con una parte de enlace cognato (por ejemplo, una molécula estimuladora y/o coestimuladora presente en una célula T) , proteína presente en una muestra pero en donde el anticuerpo o ligando no reconoce substancialmente o enlaza otra molécula en la muestra .

Rangos: varios aspectos de la presente invención , pueden ser presentados en un formato de rangos . Deberá quedar entendido q ue la descripción en formato de rangos es meramente por conveniencia y brevedad y no deberá ser construida como una limitación inflexible del alcance de la presente invención . Por consiguiente, la descripción de un rango debe ser considerada para tener descritos en forma específica todos los posibles subrangos, así como los valores n umericos individuales dentro de dicho rango. Por ejemplo, la descripción de un rango, tal como de 1 a 6 debe ser considerado que tiene descritos específicamente los rangos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc. , así como los números individuales dentro de dicho rango, por ejemplo, 1 , 2 , 2.7, 3, 4, 5, 5.3 y 6. Esto aplica sin importar el alcance del rango.

Descripción La presente invención proporciona una estrategia alternativa para el uso de u n virus para la expresión de un CAR en una célula . La presente invención se dirige a un CAR que codifica ARN que es transfectado en u na célula y expresada temporalmente en la misma. La expresión sin integración, temporal de CAR en u na célula mitiga los aspectos asociados con la expresión permanente e integrada de CAR en una célula. La presente invención proporciona por lo tanto terapia a base de CAR adicional en donde la expresión CAR en una célula puede ser reversible . Dicha reversión de expresión CAR en una célula puede ser más deseable en ciertas circunstancias cl ínicas q ue la expresión no reversible de CAR. Por lo tanto, la presente invención ciertas ventajas deseables con respecto a la expresión permanente de CAR en ciertas circunstancias cl ínicas.

La presente invención proporciona composiciones y metodos para generar células CAR de expresión temporal , y también proporcionar composiciones y métodos para administrar dichas célu las a un sujeto.

En comparación con los sistemas de expresión a largo plazo (integración) , la transfección de ARN facilita los cambios interactivos más rápidos en el d iseño de CAR, que son adecuados para un sistema de cumplimiento con G M P. Los costos de fabricación son mucho menores. Las pruebas de liberación son menos complejas .

Composiciones La presente invención incluye una construcción de ARN que puede ser transfectada directamente en una célula. Un método para generar u n mARN para utilizarse en transfección implica transcripción in vitro (IVT) de una plantilla con cebadores diseñados en forma especial , seg uidos de la adición de poliA, para producir una construcción que contiene una secuencia no traducida 3’ y 5’ (“UTR”), un tapón 5’ y/o el Sitio de Entrada de Ribosoma I nterno (I RES) , el gen q ue será expresado y una cola poliA, normalmente de 50 a 2000 bases de long itud . El ARN producido de esta forma puede transfectar eficientemente diferentes tipos de células.

En una modalidad, la construcción de ARN comprende un 3 'UTR que comprende al menos un 3'UTR derivado de betaglobulina humana. En una modalidad, la construcción de ARN comprende una 3'UTR que comprende dos repeticiones de 3'UTR derivadas de betaglobulina humana (2bgUTR). En una modalidad, la construcción de ARN comprende una cola poli(A) que comprende 150 bases de adenosina (150A). En una modalidad, la construcción de ARN comprende una 5'UTR que comprende un tapón de 5'. En una modalidad, el tapón de 5' comprende un análogo de tapa antiinversión (ARCA). En una modalidad, el tapón 5’ comprende capí. La presente invención está basada parcialmente en el descubrimiento de que la estructura particular de 5 'UTR, 3 'UTR y la cola poli(A) tienen influencia en la producción de ARN y la expresión de CAR resultante.

En una modalidad, la plantilla incluye secuencias del CAR. Preferentemente, el CAR comprende un dominio extracelular, un dominio de transmembrana y un dominio citoplásmico. El dominio extracelular y el dominio de transmembrana pueden ser derivados de cualquier fuente deseada de dichos dominios. Dominio de enlace de antíqeno El dominio extracelular puede ser obtenido de cualquiera de una amplia variedad de dominios extracelulares o proteínas segregadas asociadas con el enlace de ligando y/o transducción de señal. En una modalidad, el dominio extracelular puede consistir en una cadena pesada Ig que pueda a su vez ser asociada en forma covalente con la cadena l igera Ig en virtud de la presencia de CH 1 y regiones de articu lación , o puede q uedar covalentemente asociada con otros complejos de cadena pesada/ligera en virtud de la presencia de la articulación , los dominios CH2 y CH3. En el último caso, el complejo de cadena pesada/ligera q ue queda u nido a la construcción quimerica, puede constituir un anticuerpo con especificidad que es distinta a la especificidad de anticuerpo de la construcción quimérica. Dependiendo de la fu nción del anticuerpo, la estructura deseada y la transducción de señal, toda la cadena puede ser utilizada o se puede utilizar una cadena truncada, en donde todo o parte de los dominios CH 1 , CH2 o CH3 pueden ser eliminados, o todo o parte de la región de articulación puede ser eliminada .

El dominio extracelular puede ser dirigido a cualq uier antígeno deseado. Por ejemplo, cuando se desea un CAR antitumor, el dominio extracelular elegido que será i ncorporado en el CAR puede ser u n antígeno q ue esté asociado con el tumor. El tumor puede ser cualquier tipo de tumor, siempre q ue tenga un antígeno de superficie celu lar que sea reconocido por el CAR. En otra modalidad , el CAR puede ser u no para el cual existe actualmente un anticuerpo monoclonal específico o puede ser generado en el futuro.

En una modalidad , la plantilla para el CAR ADN está diseñada para ser dirigida a un antígeno de interes por medio del diseño de un antígeno deseado en el CAR. Dentro del contexto de la presente invención , el “antígeno de tumor” o “antígeno de trastorno hiperproliferativo” o “antígeno asociado con un trastorno h iperproliferativo” se refiere a antígenos que son comunes para trastornos hiperproliferativos específicos. En ciertos aspectos, los antígenos del trastorno h iperproliferativo de la presente invención , se derivan de cánceres que incluyen pero no se limitan a melanoma primaria o metastático, mesotelioma, timoma, linfoma, sarcoma , neu roblastoma, cáncer de pu lmón , cáncer de h ígado, linfoma de no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemias, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y adenocarcinomas tales como cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer pancreático, y similares.

Los antígenos de tumor son proteínas que son producidas por células de tumor que provocan u na respuesta inmune, particularmente respuestas inmu ne transmitidas por célula T. En una modalidad , el antígeno de tumor de la presente invención comprende uno o más epítopes de cáncer antigénico reconocidos en forma inmunológica por linfocitos de infiltración de tumor (TI L) derivados de un tumor de cáncer de un mam ífero . La selección del dominio de enlace de antígeno de la presente invención , dependerá del tipo particu lar de cáncer que será tratado. Los antígenos de tumor son bien conocidos en la téenica e incluyen por ejemplo un antígeno asociado con glioma, antígeno carcinoembriónico (CEA), gonadotropina coriónica b-humana, alfafetoproteína (AFP), AFP reactiva con lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, transcriptasa inversa de telomerasa humana, RU1, RU2 (AS), esterasa de carboxilo intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, proteasa, antígeno específico de próstata (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, prosteína, PSMA, Her2/neu, survivina y telomerasa, antígeno-1 de tumor de carcinoma de próstata (PCTA-1), MAGE, ELF2M, elastasa de neutrófilo, efrinaB2, CD22, receptor de factor de crecimiento de insulina (IGF)-I, IGF-II, IGF-I y mesotelina.

En una modalidad, el antígeno de tumor comprende uno o más epítopes de cáncer antigénicos asociados con un tumor maligno. Los tumores malignos expresan un número de proteínas que pueden servir como antígenos objetivo para un ataque inmune. Estas moléculas incluyen, pero no se limitan a antígenos específicos de tejido tales como mesotelina, MART-1, tirosinasa y GP 100 en melanoma y fosfatasa de ácido prostético (PAP) y antígeno específico de próstata (PSA) en cáncer de próstata. Otros ejemplos no limitantes de moléculas objetivo pertenecen al grupo de moléculas relacionadas con transformación, tal como el oncogen HER-2/Neu/ErbB-2. Aún otros ejemplos no limitantes de antígenos objetivo son antígenos oncofetales tales como antígeno carcinoembriónico. En linfoma de célula B, la inmunoglobulina de idiotipo específica de tumor constituye un antígeno de inmunoglobulina específico realmente de tumor que es ú nico para el tumor individual . Los antígenos de diferenciación de celula B tales como CD 19, CD20 y CD37 son otros candidatos para los antígenos objetivo en linfoma de célula B. Alg unos de estos antígenos (CEA, H ER-2, CD 19, C D20, idiotipo) han sido utilizados como objetivos para inmu noterapia pasiva con anticuerpos monoclonales con el sitio limitado pero se consideran útiles en la presente invención .

El tipo de antígeno de tumor referido en la presente invención , también puede ser un antígeno específico de tumor (TSA) o un antígeno asociado con tumor (TAA) . U n TSA es único para células de tumor y no ocurre en otras células en el cuerpo. U n antígeno asociado con TAA no es único para una célula de tumor y más bien también se expresa en u na célula normal bajo condiciones que fallan para inducir u n estado de tolerancia inmu nológica para el antígeno. La expresión del antígeno en el tumor puede ocurrir bajo cond iciones que permiten q ue el sistema inmune responda al antígeno. Los TAAs pueden ser antígenos que son expresados en células normales durante el desarrollo fetal cuando el sistema inmune está inmaduro y no tiene la capacidad de responder o pueden ser antígenos que normalmente están presentes en n iveles extremadamente bajos en célu las normales pero que se expresan en niveles mucho mayores en célu las de tumor.

Los ejemplos no limitantes de antígenos TSA o TAA incluyen los siguientes: antígenos de diferenciación tales como M ART- 1 /MelanA (MART-I), gp100 (Pmel 17), tirosinasa, TRP-1, TRP-2 y antígenos de multilinaje específicos de tumor, tales como MAGE-1 , MAGE-3, BAGE, GAGE-1 , GAGE-2, p15; antígenos embriónicos sobreexpresados tales como CEA; oncogenes sobreexpresados y genes supresores de tumor mutados tales como p53, Ras, HER-2/neu; antígenos de tumor únicos que resultan de translocaciones cromosomales ; tales como BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, YL-RAR; y antígenos virales, tales como antígenos de virus de Epstein Barr EBVA y los antígenos de virus de papiloma humano (VPH) E6 y E7. Otros antígenos a base de proteína, grandes incluyen TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-Catenina, CDK4, Mum-1, p 15, p 16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, alfa-fetoproteína, beta-HCG , BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43 , CD68\P1 , CO-029, FGF-5, G250, Ga733\EpCAM , HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG 16, TA-90\proteína de enlace Mac-2\proteína asociada con ciclofilina C, TAAL6, TAG72, TLP y TPS.

En una modalidad preferida, la parte del dominio de enlace de antígeno de CAR, dirige un antígeno que incluye pero no se limita a CD19, CD20, CD22, ROR1, Mesotelina, CD33/IL3Ra, c-Met, PSM A, Glicolípido F77, EGFRvlll, GD-2, MY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, y similares.

GD2 es un disialogangliósido que se expresa en los tumores de origen neuroectodermico, incluyendo neuroblastoma y melanoma, y es otro objetivo útil en la presente invención. Además, la tirosina qumasa receptora cMet, es otro objetivo útil en la presente invención, ya que con frecuencia se sobreexpresada en una variedad de carcinomas, incluyendo carcinoma de pulmón de célula no pequeña (NSCLC), carcinomas gástricos, de ovario, pancreáticos, de tiroides, de mama, de cabeza y cuello, de colon y riñón.

El antígeno de tumor y los epítopes de cáncer antigénico de los mismos, puede ser purificado y aislado de fuentes naturales tales como de aislados clínicos primarios, líneas celulares y similares. Los péptidos de cáncer y sus epítopes antigénicos también pueden obtenerse mediante síntesis química o mediante téenicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Las técnicas para síntesis recombinante se describen en las Publicaciones de Steward et al. (1969); Bodansky et al. (1976); Meienhofer (1983); and Schroder et al. (1965). Además, tal como se describe en la Publicación de Renkvist et al. (2001), existen numerosos antígenos conocidos en la técnica. Aunque los análogos o epítopes modificados en forma artificial no se describen, un experto en la técnica reconoce como obtener o generarlos por medios estándar en la téenica . Otros antígenos identificados mediante anticuerpos y tal como se detectan mediante tecnología Serex (ver la Publicación de Sahin et al. (1997) y Chen et al . (2000)) , se identifican en la base de datos del Ludwig I nstitute for Cáncer Research.

Dependiendo del antígeno deseado que será dirigido, el CAR de la presente invención puede ser d iseñado para incluir la porción de enlace de antígeno adecuada que es especifica para el objetivo de antígeno deseado. Por ejemplo, si C D 19 es el antígeno deseado que será dirigido, se puede utilizar un anticuerpo pa ra CD19 como la porción de enlace de antígeno para la incorporación en el CAR de la presente invención . Dominio de transmembrana Con respecto al dominio de transmembrana , la plantilla para el CAR ARN puede ser diseñada para comprender un dominio de transmembrana que se fusiona al dominio extracelular de CAR. En una modalidad , se utiliza el dominio de transmembrana que natu ralmente está asociado con u no de los dominios. En algu nos casos , el dominio de transmembrana puede ser seleccionado o modificado mediante substitución de aminoácido para evitar el enlace de dichos dominios a los dominios de transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de membrana de superficie para min imizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.

El dominio de transmembrana puede ser derivado ya sea de u na fuente natu ral o sintetica. Cuando la fuente es natural, el dominio puede ser derivado de cualquier proteína enlazada por membrana o de transmembrana. Las regiones de transmembran a de uso particular en la presente invención pueden ser derivadas de (es decir, comprenden al menos las región(s) de transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de célula T, CD28, CD3 epsilon , CD45, CD4, CD5, C D8, CD9, CD 16, CD22 , CD33, CD37, CD64 , CD80, CD86, C D 1 34, CD 1 37, CD 154. Como alternativa, el dominio de transmembran a puede ser sintético, en cuyo caso comprenderá resid uos predominantemente hid rofóbicos tales como leucina y valina. Preferentemente, se encontraron triplete de fenilalanina, triptofan y valina en cada extremo de u n dominio de transmembrana sintético. Opcionalmente, un enlazador de oligo o polipéptido corto , preferentemente de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud pueden formar un enlace entre el dominio de transmembrana y el dominio de señalización citoplásmico del CAR. Un doblete de glicina-serina proporciona u n enlazador particularmente adecuado.

En una modalidad , el dominio de transmembrana se selecciona del dominio de transmembrana CD8 , el dominio de transmembran a CD28, el dominio de transmembrana 4-1 BB o el dominio de transmembrana C D3-zeta. En algunos casos, el dominio de transmembrana también puede comprender un domin io de articu lación . En una modalidad , el dominio de articulación es un dominio de articulación CD8a. En otra modalidad , el dominio de articulación es un dominio de articulación IgG .

Dominio Citoplásmico El dominio citoplásmico o de otra manera, el dominio de señalización i ntracelular del CAR de la presente invención , es responsable de la activación de al menos una de las funciones efectoras normales de la célula inmune en donde se ha colocado el CAR. El término “función efectora” se refiere a una fu nción especializada de una célula. La función efectora de una célula T, por ejemplo, puede ser la actividad citol ítica o actividad auxiliar incluyendo la secreción de citocinas. Por lo tanto el término “dominio de señalización intracelular” se refiere a la parte de u na proteína que transduce la señal de función efectora y dirige la célula a que lleve a cabo una función especializada. Aunq ue normalmente se puede emplear todo el dominio de señalización intracelular, en muchos casos no es necesario utilizar toda la cadena. Hasta el grado en que una parte truncada del dominio de señalización intracelular sea utilizada, dicha parte truncada puede ser utilizada en lugar de la cadena intacta , siempre que transduzca la señal de función efectora . El término “dominio de señalización intracelular, significa por lo tanto que incluye cualquier parte truncada del dominio de señalización intracelular suficiente para transducir la señal de función efectora .

Los ejemplos preferidos de dominios de señalización intracelular para utilizarse en el CAR de la presente invención, incluyen las secuencias citoplásmicas del receptor de célula T (TCR) y los correceptores que actúan en concierto para iniciar la transducción de señal después del enganche del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias, y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.

Se sabe que las señales generadas a través de la TCR solas son insuficientes para la activación total de la célula T, y q ue también se req uiere una señal secundaria o coestimuladora. Por lo tanto, la activación de la célula T se puede decir que es transmitida por dos distintas clases de secuencia de señalización citoplásmica: las q ue inician la activación primaria dependiente de antígenos a través del TCR (secuencias de señalización citoplásmica primaria) y las que actúan en u na forma independiente del antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (secuencias de señalización citoplásmica secundaria) .

Las secuencias de señalización citoplásmica primarias reg u lan la activación primaria del complejo TC R ya sea en u na forma de estimulación o en forma de inh ibición . Las secuencias de señalización citoplásmica primarias que actúan en forma estimuladora pueden contener motivos de señalización que son conocidos como motivos de activación a base de tirosina inmunorreceptora o ITAMs.

Los ejemplos de secuencias de señalización citoplásmica primarios que contienen ITAM que son de uso particu lar en la presente invención , incluyen los derivados de TCR zeta, FcR gamma , FcR beta, C D3 gamma, CD3 delta , CD3 epsilon , CD5, CD22 , CD79a , C D79b y C D66d . Es particularmente preferido que la molecula de señalización citoplásmica en el CAR de la presente invención , comprenda una secuencia de señalización citoplásmica derivada de C D3 zeta.

En una modalidad preferida, el domin io citoplásmico de CAR puede ser diseñado para comprender el dominio de señalización C D3-zeta por si mismo o combinado con cualquier otro dominio(s) citoplásmico deseado útil dentro del contexto del CAR de la presente invención . Por ejemplo, el dominio citoplásmico de CAR puede comprender u na parte de cadena CD3 zeta y u na región de señalización coestimuladora. La región de señalización coestimuladora se refiere a una parte del CAR que comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora. U na molécula coestimuladora es u na molécula de superficie celular además de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requ iere para una respuesta eficiente de los linfocitos para u n antígeno. Los ejemplos de dichas moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1 BB (CD137), 0X40, C D30, CD40, PD-1 , ICOS , antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1 ), C D2 , CD7, LIG HT, N KG2C , B7-H3, y un ligando que en laza específicamente con CD83, y similares. Por lo tanto, au nque la presente invención se ejemplifica principalmente con 4-1 BB como el elemento de señalización coestimu lador, otros elementos coestimuladores están dentro del alcance de la presente invención .

Las secuencias de señalización citoplásmica dentro de la parte de señalización citoplásmica del CAR de la presente invención se pueden enlazar entre si , en un orden aleatorio o específico. Opcionalmente, un enlazador de oligo o peptido corto, preferentemente entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, puede formar el en lace. U n doblete de glicina-serina proporciona un enlazador particularmente adecuado.

En una modalidad , la plantilla para el CAR ARN puede ser diseñada para comprender el dominio de señalización 4-1 BB por si mismo o combinado con otro dominio(s) citoplásmico deseado, útil dentro del contexto del CAR de la presente invención . En u na modalidad , el dominio citoplásmico se diseña para comprender el dominio de señalización de C D3-zeta y el dominio de señalización de 4-1 BB. En otra modalidad , el dominio citoplásmico está diseñado para comprender el dominio de señalización CD3-zeta , el dominio de señalización de 4-1 BB, y el dominio de señalización de CD28.

En u na modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el dominio extracelular de un dominio variable de cadena simple de u n anticuerpo monoclonal anti-C D 19, el dominio de transmembrana comprende el dominio de articulación y transmembrana de CD8a, y el dominio citoplásmico comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1 BB.

En u na modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el dominio extracelular de un dominio variable de cadena simple de u n anticuerpo monoclonal anti-C D 19, el dominio de transmembrana comprende el dominio de articulación y transmembrana de CD8a, y el dominio citoplásmico comprende el dominio de señalización de CD3-zeta, el domin io de señalización de CD28, y el dominio de señalización de 4-1 BB.

En u na modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el dominio extracelular de un dominio variable de cadena simple de u n anticuerpo monoclonal de anti-mesotelina, el dominio de transmembrana comprende el dominio de articu lación y transmembrana de CD8a, y el dominio citoplásmico comprende el domin io de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1 BB .

En u na modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el dominio extracelular de un domi nio variable de cadena simple de un anticuerpo monoclonal anti-GD2 , el dominio de transmembrana comprende el dominio de transmembrana de C D8 , y el dominio citoplásmico comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1 BB .

En una modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el dominio extracelular de un dominio variable de cadena simple de un anticuerpo monoclonal anti-G D2 , el dominio de transmembrana comprende el dominio de transmembrana de CD28, y el dominio citoplásmico comprende el domin io de señalización de C D3-zeta y el dominio de señalización de 4-1 BB.

En una modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el dominio extracelular de un dominio variable de cadena simple de un anticuerpo monoclonal anti-G D2 , el dom in io de transmembrana comprende el dominio de transmembrana de C D3-zeta, y el dominio citoplásmico comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1 BB.

En u na modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el dominio extracelular de un dominio variable de cadena simple de un anticuerpo monoclonal anti-cMet, el dominio de transmembrana comprende el dominio de transmembrana de CD8 y el dominio citoplásmico comprende el dominio de señalización de CD3-zeta y el dominio de señalización de 4-1 BB .

En u na modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el dominio extracelular de un dominio variable de cadena simple de un anticuerpo monoclonal anti-cMet, el domin io de transmembrana comprende el dominio de transmembrana de CD8 y el dominio citoplásmico comprende el domin io de señalización de C D3-zeta y el dominio de señalización de 4-1 BB.

En u na modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el dominio extracelular de un dominio variable de cadena simple de un anticuerpo monoclonal anti-cMet, el dominio de transmembrana comprende el dominio de transmembrana de 4-1 BB y el dominio citoplásmico comprende el domin io de señalización de C D3-zeta y el dominio de señalización de 4-1 BB .

En una modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el domin io extracelular de un dominio variable de cadena simple de un anticuerpo monoclonal anti-cMet y el dominio citoplásmico comprende el dominio de señalización de C D3-zeta y el dominio de señalización de CD28.

En u na modalidad , la plantilla para el CAR ARN comprende el dominio extracelular de un dominio variable de cadena simple de un anticuerpo monoclonal anti-cMet, el dominio de transmembrana comprende el dominio de transmembrana de CD28, y el dominio citoplásmico comprende el domin io de señalización de C D3-zeta, el dominio de señalización CD28 y el dominio de señalización de 4-1 BB.

En algunos casos, la plantilla se modifica para eliminar los cuadros de lectu ra abierta interna (ORFs) para producir plantillas que están libres del cuadro de lectu ra abierta interna (OF). En una modalidad, la plantilla es un codón optimizado para utilizarse en una especie específica. Por ejemplo, en una modalidad , la plantilla es optimizada por codón para utilizarse en humanos . En una modalidad , la plantilla se modifica para eliminar los motivos de dileucina.

En una modalidad , la plantilla está comprendida dentro de u n vector IVT o plásmido. En una modalidad, el plásmido comprende una secuencia de n ucleótido q ue comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ I D NO: 4 y SEQ I D NO : 5.

En una modalidad , la plantilla comprende una secuencia de n ucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ I D NOs : 6-24. En otra modalidad, la construcción de ARN de la presente invención se transcribe de una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ I D NOs: 6-24.

En u na modalidad , la plantilla comprende u na cola poli(A). En una modalidad , la cola poli(A) comprende 1 50 bases de adenosina. En una modalidad, la cola poli(A) comprende u na secuencia de nucleótido que comprende la SEQ I D NO: 25.

En u na modalidad , la plantilla comprende una 3 ' UTR que comprende al menos una repetición de una 3'UTR derivada de beta-globulina humana. En una modalidad , la plantilla comprende u na 3'UTR que comprende una secuencia de n ucleótido que comprende la SEQ I D NO: 26.

Transfección de ARN En la presente invención se describen metodos para producir los CARs de ARN transcritos in vitro de la presente invención . En una modalidad , el CAR de ARN transcrito puede ser introd ucido en una célula como u na forma de transfección temporal . El ARN se produce a través de transcripción in vitro utilizando una plantilla generada por reacción de cadena de polimerasa (PCR) . El ADN de interés de cualquier fuente puede ser convertido directamente mediante PCR de una plantilla para la síntesis mARN in vitro utilizando cebadores adecuados y polimerasa de ARN . La fuente del AD N puede ser, por ejemplo, ADN genómico, ADN de plásmido, ADN de fago, cADN , secuencia de ADN sintética o cualquier otra fuente adecuada de ADN . La plantilla deseada para transcripción in vitro es el CAR de la presente invención . Por ejemplo, la plantilla para el CAR ARN comprende un dominio extracelular q ue comprende un dominio variable de cadena simple de un anticuerpo anti-tumor; un dominio de transmembrana; y un dominio citoplásmico que comprende el dominio de señalización de CD3-zeta . En una modalidad , la plantilla comprende una secuencia de nucleótido que comprende una secuencia seleccionada del g rupo que consiste en SEQ I D NOs 6-24.

En una modalidad , el AD N que será utilizado para PC R contiene u n cuadro de lectura abierto. El ADN puede ser de cualq uier secuencia de ADN de origen natural del genoma de un organ ismo . En una modalidad, el ADN es u n gen de longitud total de interés de una parte de un gen . El gen puede incluir parte o todas las regiones no traducidas 5' y/o 3' (UTRs) . El gen puede incluir exones e intrones. En una modalidad , el ADN que será utilizado para PCR es u n gen humano . En otra modalidad , el ADN que será utilizado para PCR es un gen humano que incluye las 5' y 3' UTRs. El ADN puede ser alternativamente u na secuencia de ADN artificial que normalmente no se expresa en un organismo de origen natural. U na secuencia de ADN artificial de ejemplo es una que contiene partes de genes que se ligan juntos para formar una estructura de lectura abierta que codifica una proteína de fusión . Las partes de ADN que son ligadas juntas , pueden ser de un solo organismo o de más de u n organismo.

Los genes que pueden ser utilizados como fuentes de ADN para PCR incluyen genes que codifican polipéptidos que proporcionan un efecto terapéutico o profiláctico para u n organismo q ue se pueden utilizar para d iagnosticar una enfermedad o trastorno en un organismo. Los genes preferidos son genes que son útiles para un tratamiento a corto plazo, o en donde existen aspectos de seg uridad con respecto a la dosificación o al gen expresado. Por ejemplo, para tratamientos de cáncer, los trastornos autommune , las infecciones por parásitos, virales, bacterianas, fúngicas u otras , el transgen(s) que será expresado puede codificar u n polipeptido que funciona como un ligando o receptor para células del sistema inmune, o puede funcionar para estimular o inhibir el sistema inmune de un organismo . No es recomendable tener estimulación en enrso prolongada del sistema inmu ne, ni es necesario producir cambios que permanezcan después del tratamiento exitoso, ya q ue esto posteriormente puede provocar un nuevo problema. Para tratamiento de un trastorno autoi nmune, puede ser deseable inhibir o suprimir el sistema inmu ne durante el brote, pero no a largo plazo, lo cual puede dar como resultado que el paciente quede sensible a una infección .

Se utiliza PCR para generar una plantilla para transcripción in vitro de mARN que se utiliza para transfección . Los métodos para llevar a cabo PCR son bien conocidos en la téenica. Los cebadores para utilizarse en PCR están diseñados para tener regiones que son substancialmente complementarias para regiones del ADN que será utilizado como una plantilla para PCR. El término “substancialmente complementario” tal como aqu í se utiliza , se refiere a secuencias de nucleótidos en donde la mayoría o todas las bases en la secuencia del cebador son complementarias, o una o más bases son no complementarias, o están desacopladas. Las secuencias substancialmente complementarias tienen la capacidad de endurecerse o hibridar con el ADN objetivo proyectado bajo condiciones de end urecimiento utilizadas para PC R. Los cebadores pueden ser diseñados para ser substancialmente complementarios con cualq uier parte de la plantilla de ADN . Por ejemplo, los cebadores pueden ser d iseñados para amplificar la parte del gen que normalmente se transcribe en células (el cuadro de lectura abierta) , incluyendo UTRs 5' y 3' . Los cebadores también pueden ser diseñados para amplificar u na parte de un gen que codifica u n dominio de interés particular. En una modalidad , los cebadores están diseñados para amplificar la región de codificación de un cADN humano, incluyendo toda o parte de las UTRs 5' y 3'. Los cebadores útiles para PCR son generados mediante métodos sintéticos q ue son bien conocidos en la téenica. Los “cebadores directos” son cebadores q ue contienen una región de nucleótidos q ue son substancialmente complementarios para los nucleótidos en la plantilla de AD N que están en la corriente ascendente de la secuencia de ADN que será amplificada.

Se utiliza el término “corriente descendente” en la presente invención para referi rse a una posición 5, de la secuencia de ADN que será amplificada en forma relativa a la hebra de codificación . Los “cebadores inversos” son cebadores que contienen u na región de nucleótidos que son substancialmente complementarios a una plantilla de ADN de hebra doble que son la corriente descendente de la secuencia de AD N que será amplificada. El término “corriente descendente” se utiliza en la presente invención para referirse a una posición 5 de la secuencia de ADN q ue será amplificada en forma relativa a la hebra de codificación .

Se puede utilizar cualquier polimerasa de ADN útil para PC R en los metodos aqu í descritos. Los reactivos y la polimerasa están comercialmente disponibles en una cantidad de fuentes.

Las estructuras químicas con la capacidad de promover eficiencia de estabilidad y/o traducción también pueden ser utilizadas. El ARN tiene preferentemente UTRs 5’ y 3’. En una modalidad , La 5’UTR tiene entre cero y 3000 n ucleótidos de longitud . La longitud de las secuencias 5’UTR y 3’ que serán agregadas a la región de codificación pueden ser alteradas a través de diferentes métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, d iseño de cebadores para PCR que se endurezcan en d iferentes regiones de las UTRs. Utilizando este método, un experto en la téenica puede mod ificar las longitudes 5’UTR y 3’ req ueridas para log rar la eficiencia de traducción óptima después de la transfección del ARN transcrito.

Las UTRs 5’ y 3’ pueden ser de origen natural , UTRs 5’ y 3’ endógenas del gen de interés. Alternativamente, las secuencias UTR que no son endógenas para el gen de interés pueden ser agregadas incorporando las secuencias UTR en los cebadores d irectos e inversos o a través de otras modificaciones de la plantilla. El uso de las secuencias UTR q ue no son endógenas para el gen de interes, puede ser útil para modificar la eficiencia de estabilidad y/o traducción del ARN . Por ejemplo, se sabe q ue los elementos con alto contenido de AU en las secuencias 3’UTR pueden d ismin uir la estabilidad del mARN . Por consiguiente, las 3’UTR se pueden seleccionar o diseñar para incrementar la estabilidad del ARN transcrito con base en las propiedades de las UTRs que son bien conocidas en la téenica.

En una modalidad , la 5’UTR puede contener la secuencia de Kozak del gen endógeno. Como alternativa, cuando u na 5’UTR que no es endógena para el gen de interés está siendo ag regada med iante PCR tal como se describió anteriormente, se puede volver a d iseñar una secuencia Kozak de consenso ag regando la secuencia 5’UTR. Las secuencias de Kozak pueden incrementar la eficiencia de traducción de algunas transcripciones de ARN , pero no parecen ser requeridas para q ue todos los ARNs tengan la capacidad de u na traducción eficiente. El requerimiento de secuencias de Kozak para muchos mARNs es bien conocida en la técnica . En otras modalidades, la 5’UTR puede ser derivada de un virus de ARN cuyo genoma ARN es estable en las células. En otras modalidades , se pueden utilizar varios análogos de nucleótido en la 3’UTR o 5’ para impedir la degradación de la exon ucleasa del mARN .

Para permitir la síntesis del ARN a pa rtir de una plantilla de ADN sin la necesidad de clonar u n gen , se debe adherir un promotor de transcripción a la corriente ascendente de la plantilla de AD N de la secuencia q ue será transcrita . Cuando una secuencia que funciona como un promotor para una polimerasa de ARN se agrega al extremo 5’ del cebador directo, el promotor de polimerasa de ARN q ueda incorporado en la corriente ascendente del producto PC R del cuadro de lectura abierta que será transcrito. En una modalidad preferida, el promotor es un promotor de polimerasa T7, tal como se describe en cualquier parte en la presente invención . Otros promotores útiles incluyen pero no se limitan a, promotores de polimerasa de ARN T3 y SP6. Las secuencias del nucleótido de consenso para los promotores T7, T3 y SP6 son conocidas en la teenica .

En u na modalidad preferida, el mARN tiene tanto un tapón en el extremo 5’ como una cola poli(A) 3’ q ue determina el enlace de ribosoma, el inicio de trad ucción y la estabilidad del mARN en la célula . En un plantilla de ADN circular, por ejemplo, ADN de plásmido, la polimerasa de ARN produce un producto concatamérico largo que no es adecuado para la expresión en células eucarióticas. La transcripción del ADN de plásmido linealizada en el extremo de la 3’UTR da como resultado u n mARN de tamaño normal , que no es efectivo en la transfección eucariótica, incluso si se poliadenila después de la transcripción .

En una plantilla de ADN lineal , la polimerasa de ARN T7 de fago puede extender el extremo 3’ de la transcripción más allá de la última base de la plantilla (Schenborn and M ierendorf, N uc Acids Res. , 1 3 :6223-36 (1985); Nacheva and Berzal- Herranz, Eur. J . Biochem. , 270: 1485-65 (2003).

El metodo de integración convencional de las extensiones de poliA/T en una plantilla de ADN , es clonación molecular. Sin embargo, la secuencia poliA/T integrada en el ADN de plásmido puede orig inar la inestabilidad de plásmido, lo cual es por lo q ue las plantillas de ADN de plásmido obtenidas de células bacterianas, con frecuencia están altamente contaminadas con eliminaciones y otras aberraciones. Esto hace a los proced imientos de clonación no ú nicamente laboriosos y tardados, sino con frecuencia, no son confiables. Esto es por lo q ue es altamente deseable un método que permite la construcción de plantillas de ADN con una extensión poliA/T 3’ sin clonación .

Segmento poliA/T de la plantilla de ADN de transcripción puede ser producido durante PCR, utilizando un cebador inverso que contiene una cola poliT, tal como una cola 100T (el tamaño puede ser de 50-5000 T), o después de PCR a través de cualquier otro método, incluyendo pero sin limitarse a ligad u ra de AD N o recombinación in vitro. Las colas poli(A) también proporcionan estabilidad para los ARNs y reducen su degradación . Generalmente, la longitud de una cola poli(A) se correlaciona positivamente con la estabilidad del ARN transcrito. En una modalidad, la cola poli(A) tiene entre 100 y 5000 adenosinas.

Las colas poli(A) de los ARNs pueden ser extendidas en forma adicional despues de la transcripción in vitro con el uso de una polimerasa poli(A), tal como polimerasa poliA de E. coli (E-PAP). En una modalidad, el incremento de la longitud de una cola poli(A) de 100 nucleótidos entre 300 y 400 nucleótidos, da como resultado un incremento de aproximadamente dos veces en la eficiencia de traducción del ARN. Además, la adhesión de diferentes grupos químicos al extremo 3’, puede incrementar la estabilidad de mARN. Dicha adhesión puede contener nucleótidos modificados/artificiales, aptámeros y otros compuestos. Por ejemplo, los análogos ATP pueden ser incorporados en la cola poli(A) utilizando polimerasa poli(A). Los análogos ATP pueden incrementar en forma adicional la estabilidad del ARN.

Los tapones 5’ también proporcionan estabilidad a las moléculas de ARN. En una modalidad preferida, los ARNs producidos mediante los métodos aquí descritos incluyen un tapón 5’. El tapón 5’ se proporciona utilizando téenicas conocidas en el arte y aquí descritas (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., ARN, 7: 1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

Los ARNs se producen mediante los metodos aq uí descritos también pueden contener u na secuencia de sitio de entrada de ribosoma interna (I RES). La secuencia I RES puede ser cualquier secuencia viral , cromosomal o diseñada en forma artificial que inicie el enlace de ribosoma independiente del tapón al mARN , y facilite el inicio de la traducción . Cualquiera solutos adecuados para electroporación celular, que pueden contener factores q ue faciliten la permeabilidad y viabilidad celular tal como azúcares, péptidos, l ípidos , proteínas, antioxidantes y tensoactivos pueden ser inclu idos.

En una modalidad , la presente invención incluye análogos de ARN y tipo ARN sintético que codifican un CAR . Esto es, la presente invención incluye ARN que codifica CAR y construcciones tipo ARN fabricadas a través de cualquier método conocido en la téenica, incluyendo por ejemplo, ARN IVT y ARN sintetizado. En una modalidad , el ARN se sintetiza a través de métodos conocidos de síntesis de oligon ucleótido. Los métodos de síntesis de oligonucleótido incl uyen por ejemplo, síntesis de H-fosfonato, síntesis de fosfodiéster, síntesis de fosfotriéster, síntesis de triéster de fosfito y el método de fosforamidita. En alg unos casos, la síntesis de la construcción de ARN i ncluye la incorporación de derivados o análogos de nucleótido/nucleósido . Por lo tanto, en una modalidad, el ARN de la presente invención comprende un derivado o análogo de n ucleótido/nucleósido. Por ejemplo, un tipo de análogo es LNA, tal como beta-D-oxi-LNA, alfa-L-oxi-LN A, beta-D-amino-LNA y beta-D-tio-LNA y beta-D-oxi-LNA. Los metodos para producir ARN sintetizada son bien conocidos en la téenica, se describen por ejemplo en la Patente Norteamericana No: 8,242 ,248, Patente Norteamericana No: 6 , 1 1 1 ,095, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No: 201 0/0324278, Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No: 2010/0137010 y Publicación I nternacional PCT No: WO 2007/031081 , cada una de las cuales está incorporada como referencia. Además, la presente invención incluye ARN que codifica CAR y construcciones tipo ARN fabricadas a través de métodos hasta ahora desconocidos, siempre que las construcciones comprendan una secuencia que cod ifique los componentes del CAR aq uí descrito.

El ARN puede ser introd ucido en células objetivo utilizando cualquier número de diferentes métodos, por ejemplo métodos comercialmente disponibles que incluyen , pero no se limitan a, electroporación (Amaxa N ucleofector-l I (Amaxa Biosystems, Colog ne, Alemania)) , (ECM 830 (BTX) (Harvard I nstruments, Boston , Mass.) o el Gene Pulser I I (BioRad, Denver, Colo. ) , M ultiporator (Eppendort, Hamburg Alemania), transfección transmitida por liposomas catiónicos utilizando lipofección , encapsulación de pol ímero, transfección transmitida por péptido o sistemas de suministro de partículas biol ísticas tales como “pistolas genéticas” (ver por ejemplo la Publicación de Nishikawa, et al . H um Gene Ther. , 12(8) :861 -70 (2001 ). Celulas T Diseñadas con ARN El CAR de mARN del transcrito in vitro puede ser suministrado en d iferentes tipos de células eucarióticas, así como en tejidos y organismos completos utilizando células transfectadas como transportadores o sumin istro local libre de células o sistémico de mARN encapsulado , enlazado o descubierto. El método utilizado puede ser para cualquier propósitos en donde se requiera o sea suficiente la expresión temporal.

Los métodos descritos pueden ser aplicados a la mod ulación de la actividad celular en investigación y terapia básica, en los campos de cáncer, células madre , infecciones agudas y crónicas, y enfermedades autommune, incluyendo mod ulación de las trayectoria de desarrollo.

Los métodos también proporcionan la capacidad de control el nivel de expresión en u n amplio rango mediante el cambio de la cantidad del ARN de entrada , siendo posible regular en forma individual el nivel de expresión de cada gen transfectado. Además, las téenicas a base de PCR de la producción mARN facilitan en g ran parte el diseño de los mARNs de receptor quiméricos con diferentes estructuras y combinación de sus dominios. Por ejemplo, el variar los diferentes dominios coestimuladores/efectores intracelulares en los múltiples receptores quiméricos en la misma célula, permite la determinación de la estructura de las combinaciones de receptor que evalúan el mayor n ivel de citotoxicidad contra objetivos multiantigenicos, y al mismo tiempo, la más baja citotoxicidad hacia células normales.

U na ventaja de los métodos de la presente invención , es q ue la transfección de ARN es esencialmente temporal y libre de vector: se puede suministrar u n transgen de ARN a un linfocito y expresarse en el mismo después de u na breve activación celular in vitro, como un cartucho de expresión m ínima sin la necesidad de cualquier secuencia viral ad icional. Bajo estas condiciones, la integración del transgen en el genoma de célula huésped es improbable. La clonación de células no es necesaria debido a la eficiencia de transfección del ARN y a su capacidad de modificar de manera un iforme toda la población de linfocitos. Por lo tanto, las células que contienen u na construcción de ARN introducidas de acuerdo con el método descrito pueden ser utilizadas en forma terapéutica. Por ejemplo, una población de células de linfocitos se extrae de un paciente, se transfecta con diferentes construcciones de ARN , y posteriormente se vuelve a introducir en el paciente. La población de célu las transfectadas posteriormente dirige el linfoma u otras células de cáncer que contienen el CD 19 o el otro antígeno objetivo. Un beneficio del uso de células transfectadas con ARN es que el transgen de ARN tiene una vida med ia limitada. La proteína codificada únicamente será prod ucida mediante celulas transfectadas durante un período de tiempo limitado. Esto sirve para red ucir el riesgo de consecuencias no proyectadas cuando las células genéticamente modificadas se introducen en u n paciente.

En la modalidad preferida, se utiliza la teenolog ía para terapia personalizada. Por ejemplo, para tratamiento de tumores , se recolecta la sangre o células del paciente a través de un método adecuado, tal como aféresis, biopsia o venopunción . Las célu las se cultivan durante al menos 24 horas tiempo durante el cual las células son transfectadas con una construcción de ARN adecuada para tratar el tumor. Las células pueden ser almacenadas congeladas antes de la transfección, si es necesario. Posteriormente se reg resan al paciente en el tiempo adecuado y en la dosis adecuada . En una modalidad , las células modificadas con ARN se administran al paciente varias veces.

La terapia inmune con ARN transcrito in vitro (IVT-ARN) hace uso de dos diferentes estrategias, ambas de las cuales han sido probadas con éxito en diversos modelos animales. Las células se transfectan con ARN transcrito i n vitro por medio de lipofección o electroporación y se administran al sujeto. Preferentemente, es deseable estabilizar el IVT-ARN utilizando diversas modificaciones con el objeto de lograr la expresión prolongada del IVT-ARN transferido.

Algunos vectores IVT son conocidos en la literatu ra y se utilizan en una forma estándar como plantilla para transcripción in vitro y han sido geneticamente modificados de tal forma q ue se produzca transcripciones de ARN estabilizadas. Los protocolos actuales utilizados en la téenica, están basados en un vector de plásmido con la sig uientes estructura : un promotor de polimerasa de ARN 5’ que permite la transcripción de ARN , seguido de u n gen de interés el cual está flanqueado ya sea en 3’ y/o 5’ por las regiones no traducidas (UTR) , y u n cartucho de poliadenilo 3’ que contiene u na cadena de nucleótidos A. Antes de la transcripción in vitro, el plásmido circular es linealizado en la corriente descendente del cartucho de poliadenilo mediante enzimas de restricción tipo I I (la secuencia de reconocimiento corresponde al sitio de d isociación) . El cartucho de poliaden ilo corresponde por lo tanto a la última secuencia de poli(A) en la transcripción . Como resultado de este procedimiento, algu nos nucleótidos permanecen como parte del sitio de disociación de enzima después de la linearización y se extienden o cubren la secuencia de poli (A) en el extremo 3’. No está claro si esta proyección no fisiológica afecta la cantidad de proteína producida en forma intracelular procedente de dicha construcción .

El ARN tiene diferentes ventajas con respecto a los métodos de plásmido o virales más tradicionales. La expresión genética de una fuente ARN no requ iere transcripción , y el producto de proteína se produce rápidamente después de la transfección . Además, ya que el ARN gana acceso únicamente al citoplasma, en lugar de al núcleo, por consiguiente los metodos de transfección típicos dan como resultado un rango extremadamente alto de transfección . Además, los métodos a base de plásmido requieren que el promotor conduzca a la expresión del gen de interés para que sea activa en las células bajo estud io.

En otro aspecto, la construcción de ARN puede ser suministrada en las células mediante electroporación . Ver por ejemplo las formulaciones y metodolog ía de electroporación de las construcciones de ácido nucleico en células de mamífero q ue se enseñan en las publicaciones de patente US 2004/0014645, US 2005/0052630A1 , US 2005/0070841 A1 , U S 2004/0059285A1 , US 2004/0092907A1 . Los diversos parámetros que incluyen la fuerza del campo eléctrico requerida para electroporación de cualquier tipo de célula, son generalmente conocidos en la literatura de investigación relevante , así como en numerosas patentes y solicitudes de patente en el campo. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 6,678,556, Patente Norteamericana No. 7, 1 71 ,264 y Patente Norteamericana No. 7 , 173, 1 1 6. Los aparatos para aplicación terapéutica de electroporación están disponibles comercialmente por ejemplo en el Med Pulser™ DNA Electroporation Therapy System (I novio/Genetron ¡es, San Diego, Calif) , y se describen en Patentes Norteamericanas tales como Patente Norteamericana No. 6, 567 ,694 ; Patente Norteamericana No. 6, 516,223, Patente Norteamericana No. 5,993,434, Patente Norteamericana No. 6 , 181 ,964, Patente Norteamericana No. 6,241 , 701 y Patente Norteamericana No. 6,233,482 ; la electroporación también puede ser utilizada para transfección de células in vitro tal como se describe por ejemplo en la Publicación de Patente US20070128708A1 . La electroporación también puede utilizarse para suministrar ácidos nucleicos en células in vitro. Por consiguiente, la admin istración transmitida por electroporación en células de ácidos n ucleico incluyendo construcción de expresión que utilizan cualquiera de muchos dispositivos y sistemas de electroporación disponibles conocidos para los expertos en la téenica , presenta u n n uevo med io para su min istrar u n ARN de interés a u na célula objetivo.

Fuen te s de células T Antes de la expansión y modificación genética , se obtiene una fuente de células T de un sujeto. El término “sujeto” pretende incluir organ ismos vivos en donde se puede provocar una respuesta inmune (por ejemplo u n mamífero) . Los ejemplos de sujetos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas y especies transgénicas de los mismos . Las células T pueden obtenerse de una cantidad de fuentes, incluyendo células mononucleares de sangre periférica, médu la ósea, tejido de nodo linfático, sang re de la méd ula, tejido del timo, tejido de u n sitio de infección , ascitos, efusión pleural, tejido del bazo y tumores. En ciertas modalidades de la presente invención, cualquier n úmero de l íneas de celula T disponibles en la téenica pueden ser utilizadas. En ciertas modalidades de la presente invención , las célu las T pueden obtenerse de una unidad de sangre recolectada de u n sujeto utilizando cualq uier número de técnicas conocidas para los expertos en la técnica, tal como separación Ficoll™. En una modalidad preferida , las células de la sangre en circu lación de un individuo se obtienen mediante aféresis. El producto de aféresis normalmente contiene linfocitos, incluyendo células T, monocitos, gran ulocitos, células B , otros g lóbulos blancos n ucleados , g lóbulos rojos y plaquetas. En u na modalidad , las células recolectadas mediante aféresis pueden ser lavadas para eliminar la fracción de plasma y para colocar las células en un amortig uador o medio adecuado para pasos de procesamiento subsecuentes. En una modalidad de la presente invención , las célu las se lavan con solución salina amortiguada por fosfato (PBS). En una modalidad alternativa, la solución de lavado carece de calcio y puede carecer de magnesio, o puede carecer de muchos, si no es que todos los cationes divalentes. N uevamente , en forma sorprendente, los pasos de activación inicial en la ausencia de calcio conducen a activación magnificada. Como los expertos en la técnica podrán apreciar fácilmente, se puede lograr un paso de lavado a través de métodos conocidos en la técnica, tal como med iante el uso de centrifugación de “flujo semiautomatizada” (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991 , Baxter CytoMate, o el Haemonetics Cell Saver 5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Despues del lavado, las células pueden volverse a suspender en una variedad de amortiguadores biocompatibles , tales como por ejemplo, Ca-free, Mg-free PBS, PlasmaLyte A, u otra solución salina con o sin amortig uador. Alternativamente, los componentes no deseables de la muestra de aféresis pueden ser eliminados y las células resuspendidas directamente en el medio de cultivo.

En otra modalidad , las células T se aíslan de los linfocitos de sang re periférica mediante la lisis de g lóbulos rojos y la reducción de monocitos, por ejemplo, mediante centrifugación a través de u n gradiente PERCO LL™ o mediante elutriación centrífuga de contraflujo. Se puede aislar subsecuentemente una subpoblación específica de células T, tal como células T C D3 + , CD28 + , C D4 + , CD8 + , CD45RA y CD45RO+ mediante téenicas de selección positiva o negativa . Por ejemplo, en una modalidad , las células T se aíslan mediante incubación con cuentas conj ugadas mediante anti-CD3/anti-C D28 (es decir, 3x28), tal como DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, durante un período de tiempo suficiente para la selección positiva de células T deseadas. En una modalidad , el período de tiempo es de aproximadamente 30 minutos. En una modalidad ad icional , el período de tiempo fluctúa de 30 minutos a 36 horas o más, y todos los valores enteros q ue existen entre ellos. En una modalidad adicional, el período de tiempo es de al menos 1 , 2, 3, 4, 5 o 6 horas. Aún en otra modalidad preferida, el período de tiempo es de 10 a 24 horas. En una modalidad preferida, el período de tiempo de incubación es de 24 horas. Para aislamiento de celulas T de pacientes con leucemia , el uso de tiempos de incubación más largos, tal como 24 horas, puede incrementar el rendimiento celular. Los tiempos de incubación más largos pueden ser utilizados para aislar células T en cualquier situación en donde existan pocas células T, en comparación con otros tipos celulares, tal como en aislamiento de linfocitos de infiltración del tumor (TI L) del tejido de tumor o de individuos inmu nocomprometidos. Además, el uso de tiempos de incu bación más largos puede incrementar la eficiencia de captura de las células T CD8 + . Por lo tanto, acortando o alargando simplemente el tiempo, se permite q ue las células T enlacen a los gránulos CD3/CD28 y/o incrementando o disminuyendo la proporción de los grán ulos a célu las T, tal como se describe con mayor detalle en la presente invención, se pueden seleccionar preferentemente subpoblaciones de células T para o contra en el inicio de cultivo o en otros puntos de tiempo durante el proceso. Además, al incrementar o disminuir la proporción de anticuerpos anti-CD3 y/o anti-CD28 en los g rán ulos u otra superficie, las subpoblaciones de células T pueden ser seleccionadas preferentemente para o contra en el inicio de cultivo o en otros puntos de tiempo deseados . Los expertos en la teenica pod rán reconocer que se pueden utilizar múltiples vueltas de selección dentro del contexto de la presente invención . En ciertas modalidades, puede ser deseable llevar a cabo procedimientos de selección y el uso de las células “no seleccionadas” en el proceso de activación y expansión . Las células “no seleccionadas” también pueden someterse a vueltas de selección adicionales.

El enriq uecimiento de una población de célula T mediante selección negativa puede lograrse con u na combinación de anticuerpos dirigidos a los marcadores de superficie únicos para las células seleccionadas en forma negativa . U n método es clasificación y/o selección celular mediante in munoadherencia magnética negativa o citometría de flujo que utiliza u n cóctel de anticuerpos monoclonales dirigidos a marcadores de superficie celular presentes en las células seleccionadas en forma negativa . Por ejemplo , para en riquecer las células CD4 + med iante selección negativa, un cóctel de anticuerpo monoclonal normalmente incluye anticuerpos para CD 14, CD20, CD 1 1 b, CD 16 , H LA-DR y CD8. En ciertas modalidades, puede ser deseable enriquecer o seleccionar positivamente para células T reg uladoras que expresan normalmente CD4 + , CD25 + , C D62Lh , G ITR y FoxP3 + . Alternativamente, en ciertas modalidades, las células reguladoras T se disminuyen mediante gránulos conjugados con anti-CD25 u otro metodo de selección similar.

Para aislamiento de una población de células deseadas med iante selección positiva o negativa , la concentración de células y la superficie (por ejemplo, partícu las tales como g rán ulos) pueden variar. En ciertas modalidades, puede ser deseable d isminuir sign ificativamente el volumen en el cual se mezclan los g ránu los y las células (es deci r, incrementar la concentración de células) para asegu rar el contacto máximo de las células y gránulos. Por ejemplo, en una modalidad , se utiliza una concentración de 2 billones de células/ml. En una modalidad , se utiliza una concentración de 1 billón células/ml. En una modalidad adicional , se utilizan más de 100 millones de células/ml. En una modalidad adicional, se utiliza una concentración de células de 10, 1 5, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 millones de células/ml . En otra modalidad , se utiliza una concentración de células de 75, 80, 85, 90, 95 o 100 millones de células/ml . En modalidades adicionales, se pueden utilizar concentraciones de 125 o 1 50 millones de células/ml . Utilizando altas concentraciones se pueden obtener como resultado rend imiento celular, activación celular y expansión celular incrementados. Además, el uso de altas concentraciones celulares permite una captura más eficiente de las células, que puede expresar débilmente antígenos objetivo de interés, tal como células T negativas CD28, o de muestras en donde pueden estar presentes muchas celulas de tumor (es decir, sangre leucémica, tejido de tumor, etc.) . Dichas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y puede ser recomendable su obtención . Por ejemplo , utilizando alta concentración de células, se permite la selección más eficiente de células T CD8+ q ue normalmente tienen una expresión CD28 más débil .

En u na modalidad relacionada, puede ser deseable utilizar menores concentraciones de células. Diluyendo en forma significativa la mezcla de células T y la superficie (por ejemplo partículas tales como g rán ulos) , se minimizan las interacciones entre las partículas y las células. Esto selecciona células q ue expresan altas cantidades de antígenos deseables para ser enlazados a las partículas . Por ejemplo, las células T CD4 + expresan mayores n iveles de CD28 y son captu rados en forma más eficiente que las células T CD8+ en concentraciones d iluidas. En una modalidad, la concentración de células utilizadas es 5 X 1 06/ml . En otras modalidades, la concentración utilizada puede ser de aproximadamente 1 X 105/ml a 1 X 106/ml, y cualq uier valor entero entre ellos .

En otras modalidades, las células pueden ser incubadas en u n rotador para longitudes de tiempo diversas en velocidades d iversas ya sea a una temperatu ra de 2 a 10°C o a temperatura ambiente .

Las células T para estimulación también pueden ser congeladas despues de un paso de lavado. Sin pretender limitarse a la teoría, la congelación y el paso subsecuente de descongelación proporciona un producto más uniforme, eliminando granulocitos y hasta cierto grado monocitos en la población celular. Después de que el paso de lavado elimina el plasma y las plaquetas, las células pueden ser suspendidas en una solución de congelación . Aunque se conocen muchas soluciones y parámetros de congelación en la téenica, y será útil dentro de este contexto, un método implica utilizar PBS que contiene 20% de DMSO y 8% de albúmina de suero humano, o un medio de cultivo que contiene 10% de Dextran 40 y 5% de Dextrosa, 20% de Albúmina de Suero H umano y 7.5% de DM SO, o 31 .25% de Plasmalyte-A, 31 .25% de Dextrosa 5% , 0.45% de NaCI , 1 0% de Dextran 40 y 5% de Dextrosa , 20% de Albúmina de Suero H umano, y 7.5% de DM SO u otro medio de congelación celular adecuado q ue contiene por ejemplo, Hespan and PlasmaLyte A, posteriormente las células se congelan a una temperatura de -80°C en un rango de un 1 o por minuto y se almacenan en la fase de vapor de u n tanque de almacenamiento de nitrógeno l íqu ido. Se pueden utilizar otros métodos de congelación controlada , así como congelación no controlada inmediatamente a u na temperatu ra de -20°C o en n itrógeno l íquido.

En ciertas modalidades, las células crioconservadas se descongelan y lavan tal como aqu í se describe, y se dejan reposar durante una hora a temperatura ambiente antes de la activación utilizando los metodos de la presente invención.

También se contempla dentro del contexto de la presente invención la recolección de muestras de sangre o producto de aféresis de u n sujeto en un período de tiem po previo a cuando se pueden necesitar las células expandidas tal como aqu í se describe. Por lo tanto, la fuente de las células q ue serán expandidas pueda ser recolectada en cualq u ier punto de tiempo necesario, y las células deseadas , tal como células T, aisladas y congeladas para uso posterior en terapia de célula T para cualquier n úmero de enfermedades o cond iciones que podrían beneficiarse de terapia de célula T, tal como las aqu í descritas. En una modalidad , se toma una muestra de sangre o una aféresis de u n sujeto generalmente sano. En ciertas modalidades, se toma una muestra de sang re o una aféresis de un sujeto generalmente sano qu ien está en riesgo de desarrollar una enfermedad, pero que aú n no ha desarrollado la enfermedad , y se a íslan las células de interés y se congelan para uso posterior. En ciertas modalidades, las células T pueden ser expand idas, congeladas y utilizadas en un momento posterior. En ciertas modalidades , las muestras se recolectan de un paciente poco después del diagnóstico de una enfermedad particular tal como se describe en la presente invención , pero antes de cualq uier tratamiento. En una modalidad adicional, las células se aíslan de u na muestra de sang re o una aferesis de un sujeto antes de cualq uier número de modalidades de tratamiento relevantes , incl uyendo pero sin limitarse a tratamiento con agentes tales como natalizumab, efalizumab, agentes antivirales, quimioterapia , radiación, agentes inmunosupresores tales como ciclosporina , azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAM PATH , anticuerpos anti-CD3, Citoxan , fludarabina, ciclosporina , FK506, rapamicina , ácido micofenólico, esteroides, FR901228 e irradiación . Estos fármacos inhiben ya sea la calcineurina de fosfatasa dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la qumasa p70S6 que es importante para señalización inducida por factor de crecimiento (rapamicina) . (Liu et al. , Cell 66:807-81 5, 1991 ; Henderson et al. , I mmun . 73:316-321 , 1991 ; Bierer et al. , Curr. Opin . Immun . 5:763-773 , 1993). En u na modalidad adicional, las células se aíslan de un paciente y se congelan para uso posterior en conj unto con (por ejemplo, antes, en forma simultánea o después) de transplante de méd ula ósea y célula mad re, la terapia de ablación de célula T utilizando ya sea agentes de quimioterapia, tales como fludarabina , terapia de radiación de rayo externo (XRT), ciclofosfamida, o anticuerpos tales como OKT3 o CAM PATH . En otra modalidad, las células se aíslan antes de, y se pueden congelar para uso posterior para tratamiento después de terapia de ablación de célula B, tal como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan .

En una modalidad adicional de la presente invención , las celulas T se obtienen de un paciente directamente después de tratamiento con un tratamiento de base no celular, y las células T se diseñan para comprender el CAR ARN de la presente invención . A este respecto, se ha observado q ue después de ciertos tratamientos de cáncer, en particular tratamientos con fármacos que dañan el sistema inmu ne, poco después del tratamiento durante el período cuando los pacientes normalmente pueden recuperarse del mismo, la calidad de las células T obtenidas puede ser óptima o mejorada en cuanto a su capacidad de expenderse ex vivo. De ig ual manera, después de la manipulación ex vivo utilizando los métodos aquí descritos, estas células pueden estar en un estado preferido para injerto mejorado y expansión in vivo. Por lo tanto , se contempla dentro del contexto de la presente invención recolectar células de sangre, incluyendo células T, célu las dend ríticas u otras células de linaje hematopoyético, durante esta fase de recuperación. Además, en ciertas modalidades, los regímenes de movilización (por ejemplo, movilización con G M-CSF) y acondicionam iento se pueden utilizar para crear una condición en un sujeto en donde se ve favorecida la repoblación , recirculación , regeneración y/o expansión de los tipos de células particulares, especialmente durante una ventana de tiempo definida después de la terapia . Los tipos de celulas ilustrativos incluyen células T, células B, células dendríticas y otras células del sistema inmune.

Activación v Expansión de Células T Antes de la transfección de células T, las células pueden ser activadas y expandidas utilizando métodos tal como se describen, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; y en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 20060121005.

Generalmente, las células T de la presente invención se expanden mediante contacto con una superficie que tienen adherido a la misma un agente que estimula una señal asociada con complejo CD3/TCR, y un ligando que estimula una molécula de coestimulación en la superficie de las células T. En particular, las poblaciones de célula T pueden ser estimuladas tal como aquí se describe, tal como mediante contacto con un anticuerpo anti-CD3, o un fragmento de enlace de antígenos del mismo, o un anticuerpo anti-CD2 inmovilizado en una superficie, o mediante el contacto con un activador de proteína qumasa C (por ejemplo, briostatina) junto con un ionóforo de calcio. Para coestimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se utiliza un ligando que enlaza la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células T puede contactarse con u n anticuerpo anti-CD3 y u n anticuerpo anti-CD28 bajo condiciones adecuadas para estim ular la proliferación de celulas T. Para estimular la proliferación ya sea de células T CD4+ o células T CD8+, un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28. Los ejemplos de un anticuerpo anti-C D28 incluyen 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, Francia) que se pueden utilizar con otros métodos comúnmente conocidos en la téen ica (Berg et al., Transplant Proc. 30(8) :3975-3977, 1998 ; Haanen et ai., J. Exp. Med. 190(9): 1 3191 328 , 1 999 ; Garland et al. , J. Immunol Meth. 227( 1 -2):53-63, 1999) .

En ciertas modalidades, la señal estimuladora primaria y la señal coestimuladora para la célula T pueden proporcionarse mediante diferentes protocolos . Por ejemplo, los agentes que proporcionan cada señal pueden estar en solución o acoplarse a una superficie . Cuando se acoplan a una superficie, los agentes pueden ser acoplados a la misma superficie (es decir, en la formación “cis”) o a superficies separadas (es decir, en la formación “trans”). Alternativamente, se puede acoplar un agente a u na superficie u otro agente en la solución. En una modalidad , el agente que proporciona la señal coestimuladora se enlaza a u na superficie celular y el agente que proporciona la señal de activación primaria está en solución o se acopla a u na superficie. En ciertas modalidades, ambos agentes pueden estar en la solución . En otra modalidad , los agentes pueden estar en u na forma soluble, y posteriormente reticularse a una superficie, tal como u na celula que expresa receptores Fe, o un anticuerpo u otro agente de enlace que enlazará a los agentes. A este respecto, ver por ejemplo las Publicaciones de Solicitud de Patente Norteamericana Nos. 20040101519 y 20060034810 para células que presentan antígenos artificiales (aAPCs) que están contempladas para utilizarse en la activación y expansión de células T en la presente invención .

En una modalidad , los dos agentes se inmovilizan sobre grán ulos, ya sea en el mismo gránulo , es decir, “cis”, o en grán ulos separados, es decir, “trans”. A manera de ejemplo, el agente que proporciona la señal de activación primaria es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de enlace de antígenos del mismo, y el agente q ue proporciona la señal coestimuladora es un anticuerpo anti-C D28 o un fragmento de enlace de antígenos del mismo; y ambos agentes se commovilizan en el mismo gránulo en cantidades moleculares equivalentes. En una modalidad , se utilizó una proporción 1 : 1 de cada anticuerpo enlazado a los gránulos para la expansión de célula T CD4+ y crecimiento de célula T. En ciertos aspectos de la presente invención , una proporción de anticuerpos anti CD3: C D28 enlazada a los grán ulos se utiliza de modo que se observe un incremento en la expansión de célula T en comparación con la expansión observada utilizando u na proporción de 1 : 1 . En una modalidad particular, se observa u n incremento de aproximadamente a aproximadamente 3 veces en comparación con la expansión observada utilizando una proporción de 1:1. En una modalidad, la proporción de un anticuerpo CD3:CD28 enlazado a los gránulos fluctúa de 100:1 a 1:100, y todos los valores enteros entre ellos. En un aspecto de la presente invención, se enlaza más anticuerpo anti-CD28 a las partículas que anticuerpo anti-CD3, es decir, la proporción de CD3:CD28 es menor a uno. En ciertas modalidades de la presente invención, la proporción de anticuerpo anti CD28 a anticuerpo anti CD3 enlazado a los gránulos es mayor a 2:1. En una modalidad particular, se utiliza una proporción de 1:100 CD3:CD28 de anticuerpo enlazada a los gránulos. En otra modalidad, se utiliza una proporción de 1:75 CD3:CD28 de anticuerpo enlazada a los gránulos. En una modalidad adicional, se utiliza una proporción de 1:50 CD3:CD28 de anticuerpo enlazada a los gránulos. En otra modalidad, se utiliza una proporción de 1:30 CD3:CD28 de anticuerpo enlazada a los gránulos. En una modalidad preferida, se utiliza una proporción de 1:10 CD3:CD28 de anticuerpo enlazada a los gránulos. En otra modalidad, se utiliza una proporción de 1:3 CD3:CD28 de anticuerpo enlazada a los gránulos. Aún en otra modalidad, se utiliza una proporción de 3:1 CD3:CD28 de anticuerpo enlazada a los gránulos.

Las proporciones de partículas a celulas de 1:500 a 500:1 y cualquier valor entero entre éstas, pueden ser utilizadas para estimular células T u otras células objetivo. Tal como lo podrán apreciar fácilmente los expertos en la téenica, la proporción de partículas a células puede depender del tamaño de partícula relativo a la célula objetivo. Por ejemplo, los gránulos de tamaño pequeño pueden enlazar únicamente a pocas células, mientras que los gránulos más grandes pueden enlazar a muchas células En ciertas modalidades, la proporción de células a partículas fluctúa de 1:100 a 100:1 y cualquier valor entero entre ellos, y en modalidades adicionales, la proporción comprende 1:9 a 9:1 y cualquier valor entero entre ellos, que se puede utilizar para estimular las células T. La proporción de partículas acopladas mediante anti-CD3- y anti-CD28 a las células T que da como resultado la estimulación de célula T, puede variar tal como se observó anteriormente, sin embargo, ciertos valores preferidos incluyen 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2: 1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 y 15:1 con una proporción preferida siendo de al menos 1:1 partículas por célula T. En una modalidad, se utiliza una proporción de partículas a células de 1:1 o menos. En una modalidad particular, una proporción preferida de partícula:célula es 1:5. En modalidades adicionales, la proporción de partículas a células puede variar dependiendo del día de estimulación. Por ejemplo, en una modalidad, la proporción de partículas a células es de 1:1 a 10:1 el primer día y se agregan partículas adicionales a las celulas cada día, o un día sí y un día no posteriormente hasta 10 días, en proporciones finales de 1:1 a 1:10 (con base en los conteos celulares el día de la adición). En una modalidad particular, la proporción de partículas a células es de 1:1 el primer día de la estimulación, y se ajusta a 1:5 el tercero y qumto días de la estimulación. En otra modalidad, se agregan partículas en una base diaria o un día sí y un día no en una proporción final de 1:1 el primer día, y 1:5 el tercero y quinto días de la estimulación. En otra modalidad, la proporción de partículas a células es de 2:1 el primer día de la estimulación y se ajusta a 1:10 el tercero y quinto días de la estimulación. En otra modalidad, las partículas se agregan en una base diaria o un día sí y un día no en una proporción final de 1:1 en el primer día, y 1:10 en el tercero y quinto días de la estimulación. Un experto en la téenica apreciará que la variedad de otras proporciones puede ser adecuada para utilizarse en la presente invención. En particular, las proporciones variarán dependiendo del tamaño de partícula en el tamaño y tipo celular.

En modalidades adicionales de la presente invención, las células tales como células T, se combinan con gránulos recubiertos con agente, los gránulos y las células se separan subsecuentemente y posteriormente se cultivan las células. En una modalidad alternativa, antes del cultivo, los gránulos recubiertos con agente y las células no se separan, sino que se cultivan juntas. En una modalidad adicional, los gránulos y las celulas se concentran primero mediante aplicación de una fuerza, tal como una fuerza magnética, dando como resultado la ligadura incrementada de marcadores de superficie celular, ind uciendo de esta forma la estimulación celular.

A manera de ejemplo, las proteínas de superficie celular pueden ser ligadas permitiendo que los gránulos paramagnéticos a los cuales se adh ieren anti-C D3 y anti-C D28 (g rán ulos 3x28) contacten las células T. En una modalidad , las células (por ejemplo, células T 104 a 1 09) y gránulos (por ejemplo, gránu los paramagnéticos T C D3/CD28 DY ABEADS® M-450 en una proporción de 1 : 1 ) se combinan en un amortiguador, preferentemente PBS (sin cationes divalentes tales como , calcio y magnesio). N uevamente, los expertos en la téenica pod rán apreciar fácilmente cualquier concentración celular que pueda ser utilizada. Por ejemplo, la célula objetivo puede ser m uy rara en la muestra y comprender ú nicamente 0.01 % de la muestra o toda la muestra (es decir, 100%) puede comprender la célula objetivo de interés. Por consiguiente, cualquier número células está dentro del contexto de la presente invención . En ciertas modalidades, puede ser deseable disminuir significativamente el volumen en el cual se mezclan las partículas y células juntas (es decir, incrementar la concentración de células), para asegu rar u n contacto máximo de células y partículas. Por ejemplo, en una modalidad , se utiliza una concentración de aproximadamente 2 billones de celulas/ml . En otra modalidad , se utiliza más de 100 m illones de células/ml . En una modalidad adicional , se utiliza una concentración de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 , 45, o 50 millones de células/ml. En otra modalidad adicional , se utiliza una concentración de células de 75 , 80, 85, 90, 95 o 100 millones de célu las/ml. En modalidades adicionales, se pueden utilizar concentraciones de 125 o 1 50 millones de células/ml. Utilizando altas concentraciones, se puede obtener como resultado un rendimiento celular, activación celular y expansión celular incrementado. Además, el uso de altas concentraciones permite una captu ra más eficiente de células que pueden expresar débilmente antígenos objetivo de interés, tal como células T negativas C D28. Dichas poblaciones de células pueden tener valor terapéutico y pueden ser deseables de obtener en ciertas modalidades. Por ejemplo, utilizando alta concentración de células se permite la selección más eficiente de células T CD8+ las cuales normalmente tienen una expresión C D28 más débil .

En u na modalidad de la presente invención , la mezcla puede ser cultivada durante varias horas (aproximadamente 3 horas) hasta aproximadamente 14 días o cualquier valor entero en horas entre ellos. En otra modalidad , la mezcla puede ser cultivada d u rante 21 d ías. En una modalidad de la presente invención los gránulos y las células T se enltivan juntos durante aproximadamente ocho d ías. En otra modalidad , los g ránulos y las celulas T se cultivan juntos durante 2 a 3 días. También pueden ser deseables diversos ciclos de estimulación de modo que el tiempo de cultivo de las células T puede ser de 60 días o más. Las condiciones adecuadas para cultivo de célula T incluyen un medio adecuado (por ejemplo, Minimal Essential Media o RPMI Media 1640 o, X-vivo 15, (Lonza)) que puede contener factores necesarios para proliferación y viabilidad, incluyendo suero (es decir suero humano o de bovino fetal), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-g, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGF y TNF-a, o cualquiera otros aditivos para el crecimiento de células conocidas para los expertos en la téenica. Otros aditivos para el crecimiento de células incluyen, pero no se limitan a, tensoactivos, plasmanato y agentes de reducción tales como N-acetil-cisteína y 2-mercaptoetanol. El medio puede incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15 y X-Vivo 20, Optimizador con aminoácidos agregados, piruvato de sodio y vitaminas, ya sea libres de suero o suplementado con una cantidad adecuada de suero (o plasma) o un conjunto de hormonas definido, y/o una cantidad de citocina(s) suficiente para el crecimiento y expansión de las células T. Los antibióticos, por ejemplo penicilina y estreptomicina, están incluidos únicamente en los cultivos experimentales, no en cultivos de células que serán infusionadas en un sujeto. Las células objetivo se mantienen bajo condiciones deseadas para soportar el crecimiento, por ejemplo, u na temperatura (por ejemplo 37°C) y atmósfera (por ejemplo, aire más 5% CO2) adecuadas.

Las celulas T que han sido expuestas a tiempos de estimulación variados pueden exhibir diferentes características. Por ejemplo, los productos de células mononucleares de sangre típica y sangre periférica aferesada , tienen una población de célula T auxiliar (TH , C D4 + ) que es mayor a la población de célula T citotóxica o supresora (Tc, C D8 + ) . La expansión ex vivo de células T mediante receptores CD3 y CD28 de estimulación prod uce una población de células T que antes de aproximadamente los d ías 8 y 9 consiste predominantemente en células TH , aunque después de aproximadamente los d ías 8 y 9, la población de células T comprenden una población cada vez mayor de células Tc. Por consiguiente, dependiendo de propósito de tratamiento , la infusión de u n sujeto con una población de células T q ue comprenden predominantemente células TH puede ser conveniente. Convenientemente, si se ha aislado un subconjunto específico de antígeno de células Tc, puede ser benéfico expandir este subconjunto en un mayor grado.

Además , además de los marcadores CD4 y CD8 , otros marcadores fenotípicos varían significativamente, pero en g ran parte, en forma reprod ucible du rante el curso del proceso de expansión celular. Por lo tanto, dicha capacidad de reproducción permite la capacidad de diseñar a la medida un producto de celula T activado para propósitos específicos. Aplicación Terapéutica La presente invención incluye un tipo de terapia celular en donde las células T son genéticamente modificadas para expresar temporalmente u n receptor de antígeno q uimérico (CAR) y una célula T diseñada mediante ARN que se infusiona a un receptor que necesita de la misma. La célula infusionada tiene la capacidad de exterminar células de tumor en el receptor. Sin pretender limitarse a teoría alguna, la respuesta de inmunidad antitumor provocada por las células T diseñadas con ARN , puede ser una respuesta in mu ne activa o pasiva. La respuesta puede ser parte de un método de ¡nmunoterapia adoptada, en donde se utilizan célu las T diseñadas con ARN, tal como células CART1 9.

Las células T diseñadas con ARN de la presente invención , puede ser un tipo de vacuna para la inmu n ización ex vivo y/o terapia in vivo en un mam ífero. Preferentemente , el mamífero es u n humano.

Con respecto a la inmunización ex vivo, al menos algo de lo siguiente ocurre in vitro antes de la administración de la célula en un mamífero: i) expansión de las células, ii) introducción de CAR ARN a las células o iii) crioconservación de las células.

Los procedimientos ex vivo son bien conocidos en la téenica y se describen de manera más completa más adelante.

En síntesis , las celulas se aíslan de un mamífero (preferentemente un humano) y se modifican genéticamente (es decir, transducidas o transfectadas in vitro) con CAR ARN de la presente invención. La célula diseñada con ARN puede administrarse a un receptor mamífero para proporcionar un beneficio terapéutico. El receptor de mamífero puede ser un h umano, y la célula diseñada con ARN puede ser autóloga con respecto al receptor. Alternativamente, las células pueden ser alogeneicas, singeneicas o xenogeneicas con respecto al receptor.

El procedimiento para expansión ex vivo de las células progenitoras y mad re hematopoyéticas se describe en la Patente Norteamericana No. 5, 199,942 , incorporada a la presente invención como referencia , se puede aplicar a las células de la presente invención . Otros métodos adecuados son conocidos en la téenica, por consiguiente la presente invención no se limita a cualquier método en particular para la expansión ex vivo de las células. En síntesis, el cultivo ex vivo y la expansión de células T comprende: ( 1 ) recolectar células progenitoras y madre hematopoyéticas C D34+ de un mam ífero de la recolección de sang re periférica o explantes de médula ósea; y (2) expander dichas célu las ex vivo. Además de los factores de crecimiento celu lar descritos en la Patente Norteamericana No. 5, 199,942, se pueden utilizar otros factores tales como flt3-L, I L-1 , I L-3 y ligando c-kit para cultivo y expansión de las células.

Además de utilizar las vacunas a base de células en términos de inmunización ex vivo, la presente invención también proporciona composiciones y métodos para que la inmunización in vivo genere una respuesta inmune dirigida contra un antígeno en un paciente.

Las células T diseñadas con ARN de la presente invención, pueden administrarse ya sea solas o como una composición farmacéutica en combinación con diluyentes y/o con otros componentes tales como IL-2 u otras poblaciones de citocinas o células. En síntesis, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender una población celular objetivo tal como aquí se describe, en combinación con uno o más transportadores, diluyentes o excipientes farmacéutica o fisiológicamente aceptables. Dichas composiciones pueden comprender amortiguadores tales como solución salina amortiguada neutral, solución salina amortiguada por fosfato y similares; carbohidratos tales como glucosa, mañosa, sacarosa o dextranos, manitol; proteínas; polipéptidos o aminoácidos tales como glicina; antioxidantes; agentes de quelación tales como EDTA o glutationa, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio) y conservadores. Las composiciones de la presente invención se formulan preferentemente para administración intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en una forma adecuada a la enfermedad que será tratada (o evitada). La cantidad y frecuencia de administ ración será determinada por factores tales como la condición del paciente, y el tipo y severidad de la enfermedad del paciente, aunque las dosificaciones adecuadas podrán ser determinadas mediante pruebas clínicas.

Cuando “una cantidad inmunológicamente efectiva”, “cantidad antitumor efectiva”, “cantidad de inhibición de tumor efectiva” o “cantidad terapéutica” se indica, la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención que serán administradas puede ser determinada por un especialista con consideración de diferencias individuales en edad, peso, tamaño de tumor, grado de infección o metástasis y condición del paciente (sujeto). Se puede manifestar de manera general que una composición farmacéutica que comprende las células T aquí descritas puede ser administ rada en una dosificación de 104 a 109 células/kg de peso corporal, preferentemente 105 a 106 células/kg de peso corporal, incluyendo todos los valores enteros dentro de este rango. Las composiciones de célula T también se pueden administrar múltiples veces en estas dosis. La cantidad de células T administradas a cada dosis puede variar. Por ejemplo, en una modalidad, la primera administración comprende una dosis relativamente alta, en donde las dosis subsecuentes comprenden una dosis relativamente baja. Las células pueden ser administradas utilizando teenicas de infusión que son comú nmente conocidas en la inmu noterapia (ver por ejemplo la Publicación de Rosenberg et al . , New Eng . J . of Med . 319: 1676, 1 988) . La dosificación y régimen de tratamiento óptimo para u n paciente particular, puede ser determinada fácilmente por un experto en la técnica de la medicina, mediante el monitore del paciente con respecto a sig nos de enfermedad y ajustar el tratamiento de manera correspond iente.

En ciertas modalidades, puede ser conven iente admin istrar células T activadas a u n sujeto y posteriormente volver a extraer sang re (o llevar a cabo una aféresis) , las células T activadas procedentes de la muestra de sangre de acuerdo con la presente invención, y volver a infusionar al paciente con estas células T activadas y expandidas . Este proceso se puede llevar a cabo varias veces d urante algunas semanas. En ciertas modalidades , las células T pueden ser activadas de extracciones de sangre de 10cc a 400cc. En ciertas modalidades , las células T se activan de extracciones de sangre de 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc o 100cc. Sin pretender limitarse a la teoría, utilizando el protocolo de extracción de sangre múltiple/reinfusión múltiple , se pueden seleccionar ciertas poblaciones de células T.

La admin istración de las composiciones de la presente invención se puede llevar a cabo en cualquier forma conveniente, incluyendo mediante inhalación por aerosol, inyección , ingestión , transfusión, implante o transplante. Las composiciones aq u í descritas pueden administrarse a un paciente en forma subcutánea, intradermica , intratumoral , intranodal , intramed ular, intramuscular, mediante inyección intravenosa (i .v.) o intraperitoneal . En una modalidad , las composiciones de célula T de la presente invención se adm in istran a un paciente mediante inyección intradérmica o subcutánea . En otra modalidad , las composiciones de células de la presente invención se administran preferentemente mediante inyección i .v. Las composiciones de células T se pueden inyectar directamente en un tumor, nodo linfático o sitio de infección .

En ciertas modalidades de la presente invención , las células activadas expandidas utilizando los métodos aqu í descritos, u otros métodos conocidos en la téenica en donde se expanden las células T a niveles terapéuticos , se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, en forma simultánea o después de) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes , incluyendo pero sin limitarse a tratamiento con agentes tales como terapia antiviral , cidofovir e interleucina-2 , Citarabina (también conocida como ARA-C) o tratamiento con natalizumab para pacientes MS o tratamiento efalizumab para pacientes de psoriasis u otros tratam ientos para pacientes PM L. En modalidades adicionales, las células T de la presente invención se puede utilizar en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAM PATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpo, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido mifenólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben ya sea la calcineurina de fosfatasa dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por factor de crecimiento (rapamicina). (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). En una modalidad adicional, las composiciones celulares de la presente invención se administran a un paciente junto con (por ejemplo, antes, en forma simultánea o despues) de trasplante de médula ósea, terapia de ablación de célula T utilizando ya sea agentes de quimioterapia, tales como fludarabina, terapia de radiación de rayo externo (XRT), ciclofosfamida (Citoxan), o anticuerpos tales como OKT3 o CAMPATH. En otra modalidad, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de la terapia de ablación de célula B, tal como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en una modalidad, los sujetos pueden pasar por tratamiento estándar con quimioterapia de alta dosis seguido de transplante de célula madre de sangre periférica. En ciertas modalidades , despues del transplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmu ne expandidas de la presente invención . En una modalidad adicional , las células expandidas se administran antes o después de la cirugía. Por ejemplo , se ha descubierto en la presente invención que la terapia Citoxan combinada con múltiples infusiones de células T CAR ARN , mejora el despeje del tumor y la supervivencia .

La dosificación de los tratamientos anteriores que serán administrados a un paciente, variará con la naturaleza precisa de la condición que esté siendo tratada y el receptor del tratamiento. El escalado de las dosis para administración h umana , se puede llevar a cabo de acuerdo con prácticas aceptadas en la téenica. La dosis para CAM PATH , por ejemplo, generalmente está dentro del rango de 1 hasta aproximadamente 100 mg para un paciente ad ulto, normalmente administrada diariamente durante un período de 1 a 30 d ías. La dosis diaria preferida es de 1 a 10 mg al d ía, au nque en algunos casos, se pueden utilizar mayores dosis de hasta 40 mg al día (descrito en la Patente Norteamericana No. 6, 120 , 766) .

EJ EMPLOS EXPERI M ENTALES La presente invención se describe en forma adicional con detalle mediante la referencia a los sig uientes ejemplos experimentales. Los ejemplos se proporcionan con los propósitos de ilustración solamente, y no están proyectados para ser limitantes a menos que se especifiq ue de otra manera.

Por lo tanto, la presente invención no deberá ser construida en forma alg una como limitada a los siguientes ejemplos, sino más bien , deberá ser construida para comprender cualquiera y todas las variaciones q ue sean evidentes como resultado de las enseñanzas aq u í proporcionadas.

Sin descripción ad icional , se considera que un experto en la teenica puede, utilizando la descripción anterior y los siguientes ejemplos ilustrativos, hacer uso y utilizar los compuestos de la presente invención y practicar los métodos reivindicados . Por consiguiente los ejemplos de operación que se encuentran a contin uación , señalan de manera específica las modalidades preferidas de la presente invención , y no serán construidos como limitantes en forma alguna de la presente descripción .

Ejemplo 1 : Células T Autóloaas Electroporadas que Expresan un Receptor de Antíoeno Quimérico Transmiten Regresión del Tumor Diseminado H umano La redirección de la especificidad del antígeno linfocito T med iante transferencia genética puede proporcionar grandes números de linfocitos T reactivos a tumor para inmunoterapia adoptada. Sin embargo, pueden haber aspectos de seguridad asociados con la producción de vector viral en la aplicación cl ínica de células T que expresan receptores de antígeno q uimérico (CAR) . Se considera que los linfocitos T pueden ser mod ificados por gen mediante electroporación ARN sin aspectos de seguridad asociados con la integración. Para establecer una plataforma segura para inmunoterapia adoptada, el esqueleto del vector para la transcripción in vitro de ARN fue optimizado para lograr una expresión de transgen de alto nivel. La expresión de CAR y la función de las celulas T electroporadas con ARN se detectó hasta una semana después de la electroporación . Los resultados aquí presentados demuestran que múltiples inyecciones de células T electroporadas con CAR ARN, transmitieron la regresión de los tumores de mesotelioma de flanco vascularizado grandes en ratones NOD/scid/yc(-/-). También ocurrió una reducción de tumor dramática cuando los tumores derivados de humanos intraperitoneales preexistentes, que habían estado creciendo in vivo durante >50 días, fueron tratados mediante múltiples inyecciones de células T humanas autólogas electroporadas con mARN CAR antimesotelina.

Los materiales y métodos empleados en estos experimentos se describirán a continuación.

Materiales v Métodos Construcción de vectores de mARN de transcripción in vitro para CARs La mesotelina (ss1) y los CARs específicos de CD19 (Carpenito et al., 2009, Proc Nati Acad Sci U S A 106:3360-5; Milone et al., 2009, Mol Ther 17: 1453-64) fueron amplificados mediante PCR utilizando los cebadores ss1F (cctaagcttaccgccatggccttaccagtgac; SEQ ID NO: 1), CD19F (cctaagcttaccgccatggccttaccagtgaccgcc; SEQ ID NO: 2) y zetaR (cctgcggccgc ttagcgagggggcagggcc; SEQ ID NO: 3). Los productos PCR fueron subclonados en un vector a base de pGEM.64A, reemplazando GFP de pGEM-GFP.64A (Zhao et al., 2006, Mol Ther 13: 151-9) para producir vectores ss1 y CD19 a base de pGEM.64A. Para agregar a las construcciones las regiones sin traducción 5’ o 3’ (UTR) y poli(A) más largas, se reemplazó la secuencia 64 poli(A) en vectores pGEM.ss1.bbz.64A o pGEM-CD1 9.bbz.64A por dos repeticiones de 3’ UTR de globulina beta (2bgUTR) con o sin secuencias 150 poli(A) (150A) sintetizadas mediante PCR, y se confirmó en forma adicional mediante secuenciación. Sin embargo, los vectores a base de pGEM utilizan ampicilina para selección, y esto no es compatible con la guía reguladora de FDA para producción GMP y la última aplicación clínica. Por lo tanto, el cADN con UTRs se transfirió a pDrive (Qiagen), que tambien utiliza canamicina para selección. Primero, se cortó ss1.bbz.2bgUTR.150A o CD1 9.bbz.2bgUTR. 150A del vector pGEM mediante digestión Hind III y Ndel (extremo romo lleno) y se subclonaron en pDrive mediante Kpnl y Notl (extremo romo lleno). El inserto con la orientación correcta fue confirmado mediante secuenciación para generar pDrive. ss1 bbz.2bgUTR.150A y pDrive. CD19. bbz.2bgUTR.150A. Hubieron dos pasos para finalizar los vectores para uso clínico potencial: 1) El gen de resistencia a ampicilina en los vectores pDrive se eliminó mediante digestión doble con Ahdl y BciVI; 2) Los cuadros de lectura abierta internos en CD19.bbz y ssl.bbz fueron eliminados mediante mutagenesis PCR para producir pD-A.19.OF.2bg.150A (SEQ ID NO: 5) y pD-A.ss1 OF.2bg.150A (SEQ ID NO: 4).

Transcripción in vitro de ARN Se utilizaron tres sistemas ARN IVT para comparar la calidad, cantidad y costo de ARN: Equipo mMESSAGE mMACHINE® T7 (Ambion, Inc) que utiliza el análogo de tapón regular (RC) 7-metilGpppG; mMESSAGE mMACHINE® T7 Ultra (Ambion, Inc) que genera ARN IVT con el análogo de Tapón Anti-lnverso (ARCA, 7-metil(3’-O-metil) GpppG)m7G(5’)ppp(5’)G), y el Sistema de ARN mScript™ (Epicentre, Madison, Wl) que utiliza cobertura de enzimas (CE) y cobertura de enzimas 2’-0-Metiltransferasa para generar Cap 1 IVT ARN (Epicentre). El RC está incorporado con una eficiencia de cobertura de hasta el 40%, aunque el ARCA incrementa la eficacia de cobertura hasta el 80%, y el sistema CE puede dar como resultado hasta el 100% de eficiencia de cobertura. Los diversos productos de ARN IVT fueron purificados utilizando el Equipo RNeasy Mini (Qiagen, Inc., Valencia, CA) y el ARN purificado se eluyó en agua libre de RNase en 1 a 2 mg/ml.

Preparación de ARN IVT de grado clínico Para generar vectores de ADN de plásmido que cumplen con las regulaciones que contienen las estructuras de lectura abierta CAR (ORF) sin ORFs interno, se subclonaron insertos de ADN para cADN CAR con secuencias UTR y poli-A de los vectores a base de pGEM para el vector pDrive que contiene un marcador de selección de canamicina para generar pdrive.19bbz (para CD19-bbz) y pDrive. ss1 bbz (para ss1-bbz) tal como se describió anteriormente. Para eliminar las proteínas aberrantes potenciales traducidas de los ORFs internos anidados dentro del ORF CAR, todos los ORF internos tanto en CD19-bbz como ss1-bbz mayores en tamaño a 60 pb fueron mutados mediante mutagenesis PCR. Por lo tanto, pD-A.19.OF y pD-A.ss1.OF que están libres de ORFs internos fueron generados para 19-bbz y ss1-bbz respectivamente. El ARN Ss1-bbz que contiene los ORFs párenteles fueron transcritos a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 6. Las construcciones ss1-bbz libres de ORF interna se transcribieron de una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 8. El ARN ss1-bbz que contiene los ORFs de origen fueron transcritos de una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 7. Las construcciones CD19-bbz libres de ORF interno se transcribieron de una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 9.

Cultivo de célula T Se purificaron linfocitos donados por donadores saludables anónimos y células T mediante elutriación. En alg unos experimentos, se utilizaron celulas T crioconservadas y células de tumor del mismo paciente. El “paciente 108” tuvo meso te liorna maligno. Como parte de una prueba clínica temprana, este paciente pasó por leucoferesis y tuvo células de tumor generadas de su efusión pleu ral malig na. Las células T fueron activadas mediante la adición de g ránulos C D3/CD28 (I nvitrogen), y un solo ciclo de estimulación tal como se describe (Levine et al. , 1997, J Immunol 1 59:5921 -30) . Para el experimento mostrado en la figura 5 , las células T 108 del paciente fueron estimuladas con células que presentan antígenos artificiales irradiados q ue expresan 4-1 BBL y cargadas con anticuerpo monoclonal anti-CD3 (mAb) OKT3 y CD28 mAb 9.3 tal como se describe (Suhoski et al. , 2007, Mol Ther 15:981 -8). Las células T se mantuvieron a u na densidad de 0.8 x 106 a 1 x 1 06 células/mL en RPM I 1640 con 10% FCS y 1 % de penicilina-estreptomicina (R 1 0) después de la estimulación con el g ránulo.

Electroporación de ARN de^élulas T El d ía 1 0 del cultivo, se recolectaron células T activadas y se electroporaron . Se utilizaron dos sistemas de electroporación : BTX CM830 (Harvard Apparatus BTX, Holliston , MA, USA) y Maxcyte (Maxcyte I nc, Rockville, M D, USA). Para electroporación utilizando BTX EM830, las células T estimuladas sometidas a electroporación fueron lavadas tres veces con OPTI-M EM (Invitrogen) y resuspendidas en OPTI- M EM a una concentración final de 1 a 3x108/ml. Subsecuentemente, se mezclaron 0.1 a 0.2 mi de celulas con 10 pg/0.1 mi de célu las T en ARN IVT (o como se indicó) y se electroporaron en u na cubeta de a 2-mm (Harvard Apparatus BTX, Holliston , MA, USA) . Para electroporación utilizando Maxcyte, se siguió el manual de instrucción utilizando una cámara de procesamiento OC-400 (Maxcyte I nc, Rockville, M D, USA) con programas integ rados.

Detección CAR en células T electroporadas Las células se lavaron y suspend ieron en amortig uador FACs (PBS más 0.1 % de azida de sodio y 0.4% de BSA). Se agregaron al tubo anticuerpos F(ab)2 anti-ratón de cabra policlonales etiquetados con biotina (anti-Fab, Jackson Immunoresearch , West Grove , PA) , y las célula se incubaron a u na temperatu ra de 4°C du rante 25 minutos y se lavaron dos veces. Las células se mancharon posteriormente con estreptavidina etiq uetada con ficoeritrina (BD Pharmingen , San Diego, CA) .

ELI SA Se lavaron las células objetivo y se suspendieron en 106 células/m L en R 10. Se ag regaron cien mil de cada tipo celular objetivo a cada uno de los 2 depósitos de una placa de fondo redondo de 96 depósitos (Corning) . Se lavaron las células T efectoras y se resuspendieron en 1 06 células/mL en R 10. Se combinaron cien mil células T efectoras con células objetivo en los depósitos indicados de la placa de 96 depósitos. Además, se prepararon depósitos que contienen células T solas. Las placas se incubaron a una temperatura de 37°C durante 18 a 20 horas. Después de la incubación , se recolectó el sobrenadante y se sometió a un ensayo ELI SA utilizando métodos estándar (Pierce, Rockford , I L) .

Manchado CD 1 07a Las células se revistieron en un E :T de 1 : 1 ( 105 efectores: 105 efectivos) en 160 m I de med io RPM I completo en una placa de 96 depósitos. Se agregaron 20 mI de anti-CD107a Ab etiquetado con ficoeritrina (BD Pharmingen , San Diego, CA) y la placa se incubó a una temperatura de 37°C durante 1 hora antes de ag regar Golgi Stop y se incubó du rante otras 2.5 horas. Después de 2.5 horas, se agregaron 10 ml de FITC-anti-C D8 y APC-anti-CD3 y se incubaron a una temperatu ra de 37°C du rante 30 minutos. Después de la incubación, las muestras se lavaron una vez con amortiguador FACS. Se llevó a cabo adquisición con citometría de flujo con BD FacsCalibu r (BD Biosciences) , y se llevó a cabo el análisis con FlowJo (Treestar Inc, Ashland , OR) .

CTL de flujo Se utilizó una versión ligeramente modificada de citotoxicidad con citometría de flujo (Cao et al . , 2010 Cytometry Part A 77:534-45) . En este ensayo, se midió la citotoxicidad de células objetivo comparando la supervivencia de células objetivo relativa a la supervivencia de celulas de control negativo. Las células de control negativo y las células objetivo se combinaron en el mismo tubo con las células T efectoras. Las células objetivo se prepararon transduciendo células K562 párenteles con CD19 humano o mesotelina tal como se describe (Carpenito et al., 2009, Proc Nati Acad Sci U S A 106:3360-5; Milone et al., 2009, Mol Ther 17: 1453-64). En los experimentos, los efectos citolíticos de células T CD19-CAR y células T Meso-CAR se probaron utilizando una mezcla de ambas células objetivo (K562-CD19 o K562-meso). Se suspendieron K562-meso en un medio R10 en una concentración de 1.5x106 células/mL y se agregó la tinta fluorescente CelITracker™ Orange CMRA (Invitrogen) en una concentración de 5 mM. Las células se mezclaron y posteriormente se incubaron a temperatura de 37°C durante 30 minutos. Las células se lavaron posteriormente y se suspendieron en R10. Posteriormente, se incubaron K562-meso a una temperatura de 37°C durante 60 minutos. Las células se lavaron posteriormente dos veces y se suspendieron en R10. Se suspendieron K562-CD19 en PBS + 0.1% BSA en 1x106 células/mL. Se agregó el éster de succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína de tinta fluorescente (CFSE) (Invitrogen) a esta suspensión celular a una concentración de 1 mM. Las células se incubaron durante 10 minutos a una temperatura de 37°C. Después de la incubación, se detuvo la reacción de etiquetado agregando un volumen de FBS que fue igual al volumen de suspensión celular y las celulas se incubaron durante 2 minutos a RT. Las células se lavaron y suspendieron en R10. Los cultivos se prepararon en una placa de cultivo de 96 depósitos por duplicado en las siguientes proporciones de célula T: célula objetivo: 10: 1 , 3: 1 y 1 : 1 . Las células objetivo siempre fueron 10,000 K562-meso en 0.1 mi. Cada cultivo también contenía 104 de células de control negativo K562-CD19. Además, los cultivos se prepararon de modo que contenían únicamente células K562-CD19 más K562-meso. Los cultivos se incubaron durante 4 horas a una temperatura de 37°C. Inmediatamente después de la incubación, se agregó 7AAD (7-aminoactinomicina D) (BD Pharmingen) tal como lo recomendó el fabricante, y se llevó a cabo la adquisición con citometría de flujo con un BD Calibur (BD Biosciences) . Se sincronizó un análisis en células negativas-7AAD (vivas), y se determinaron los porcentajes de células K562-CD19 vivas y K562-meso vivas para cada cultivo de célula T + célula objetivo. El porcentaje de supervivencia de K562-meso se determinó dividiendo el porcentaje de células K562-meso vivas entre el porcentaje de células de control K562-CD19 vivas. El porcentaje de supervivencia corregido de K562-meso, se calculó dividiendo el porcentaje de supervivencia de K562-meso en cada cultivo de célula T + célula objetivo mediante la proporción del porcentaje de las células objetivo K562-meso: porcentaje de células de control negativo K562-meso en tubos q ue contienen únicamente celulas objetivo K562-meso y células de control K562-CD 19 sin cualquiera células T efectoras. Esta corrección fue necesaria para abarcar la variación en los números de células de partida y para la muerte de células objetivo espontánea. Se calculó la citotoxicidad como el porcentaje de citotoxicidad de K562-meso = 100 - porcentaje de supervivencia corregido de K562-meso. Para todas las proporciones de efectorarobjetivo, se determinó la citotoxicidad por duplicado y los resultados fueron promediados.

Estudios de xenomierto de ratón Se llevaron a cabo estudios tal como se describió anteriormente con ciertas modificaciones (Teachey et al . , 2006, Blood 107: 1 149-55; Teachey et al . , 2008 , Blood 1 12:2020-3). En síntesis , se obtuvieron ratones NOD-SC I D-yc-/- (NSG) de 6 a 10 semanas de edad en Jackson Laboratory (Bar Harbor, M E) , o se criaron localmente bajo u n protocolo del comité institucional del uso y cuidado de animales aprobado (IAC UC) y se mantuvieron bajo condiciones libres de patógeno. La derivación del mesotelioma humano M 1 08 del paciente 1 08 se utilizó para establecer los tumores de flanco utilizando 5x1 0 células tal como se describió anteriormente (Carpenito et al. , 2009, Proc Nati Acad Sci U S A 106:3360-5) . Las células de tumor M 108 también fueron diseñadas con u n vector lentiviral para expresar luciferasa de luciérnaga, produciendo la línea de célula M 108- Luc. Los animales se inyectaron en forma intraperitoneal (I P) con 8x106 de M 108-Luc viable. El crecimiento de tumor se mon itoreó por tamaño utilizando medidas de calibrador para tumores de flanco, y mediante generación de imágenes bioluminiscentes y peso corporal para tumores I P.

Imágenes de bioluminiscencia (BU) Se monitoreó el crecimiento de tumor mediante BLI . Se generaron imágenes de los ratones anestesiados utilizando el sistema Xenogen Spectrum y el software Living Image v3.2. A los ratones se les administró inyección I P de 150 mg/kg de peso corporal de D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton , MA), suspendido en PBS esteril en u na concentración de 15 mg/mL (1 00 ml de solución de luciferina/1 0 g de peso corporal del ratón) . La titulación previa de M 108-Luc indicó el tiempo para el pico de la emisión de fotones como de cinco min utos , con una emisión pico que du ra de 6 a 10 minutos. Se generó la imagen de cada animal solo (para cuantificación de fotones) o en g rupos de hasta 5 ratones (para propósitos de despliegue) en la posición bocabajo en el mismo punto de tiempo relativo después de la inyección de luciferina (6 min utos) . Se recolectaron los datos hasta que se alcanzó el rango medio de la escala lineal (conteos de 600 a 60000) o se alcanzaron las preparaciones de exposición máxima (f/parada 1 , contenedor g rande y 1 a 2 segundos) y posteriormente se convirtieron a fotones/segu ndo/cm2/esteradian para normalizar cada imagen para el tiempo de exposición , f/detención, contenedor y tamaño de animal . Para la localización anatómica, se sobreimpuso un mapa de seudocolor que representa la i ntensidad de luz sobre la imagen de referencia de la superficie de cuerpo de escala de grises. Para los propósitos de despliegue de datos, se generaron imágenes de los ratones sin celulas q ue contienen luciferasa en las configuraciones máximas, y se obtuvo un valor promedio de 3.6x105 p/s/cm2/sr.

C o nsideraciones estadísticas Se llevó a cabo el análisis con STATA versión 10 (StataCorp) o Prism 4 (Software Graph Pad) . Los datos in vitro representan los medios de duplicados, y las comparaciones de los promedios se elaboraron mediante la prueba Man n-Whitncy. Para comparación entre mú ltiples grupos, se llevó a cabo un análisis Kruskal-Wallis con pruebas de comparación múltiple de Du nn para comparar grupos individuales. Se compararon las curvas de supervivencia utilizando la prueba de registro-clasificación con u na corrección de Bonferroni para comparar múltiples enrvas .

Los resultados de los experimentos se describen a continuación : La electroporación de CARs de ARN transmite expresión variable en células T estimuladas Se ha reportado previamente que los CARs scFv ss1 anti-mesotelina con combinaciones de O ?3z, C D28 y dominios de activación de 4-1BB son expresados en forma estable y con alto nivel en celulas T cuando se introducen utilizando teenología de vector lentiviral (Carpenito et al., 2009, Proc Nati Acad Sci U S A 106:3360-5). Las células T humanas fueron activadas durante 10 días tal como se describió previamente (Levine et al., 1997, J Immunol 159:5921-30), y las células regresaron a un estado casi de reposo, en donde fueron electroporadas con ss1 scFv que codifica el ARN con las combinaciones de porciones de señalización previamente descritas. El nivel de expresión de transgen se encontró como no uniforme (figura 6), ya que las células T electroporadas con CAR que contiene O?3z solo (ss1-z), mostraron la más alta expresión de transgen, seguido de niveles casi equivalentes de expresión ss1-28z (CD28 + O?3z) y ss1-bbz (4-1BB + O?3z). Debido a que los CARs de “segunda generación” que contienen dominios de coestimulación parecen superiores en diversas pruebas preclínicas y clínicas de etapa temprana cuando se expresan con sistemas de vector viral (Carpenito et al., 2009, Proc Nati Acad Sci U S A 106:3360-5; Milone et al., 2009, Mol Ther 17: 1453-64; Zhao et al., 2009, J Immunol 183:5563-74; Zhong et al., 2009, Mol Ther 18:413-20), se decidió no optimizar la expresión del ss1-z CAR de “primera generación”. Más bien, los CARs ss1-bbz y CD19-bbz de segunda generación fueron elegidos para optimización adicional utilizando electroporación de ARN debido a que se prueban en una prueba clínica utilizando tecnología de vector lentiviral.

La de construcciones de ARN la expresión de transaen en celulas T estimu ladas La modificación estructural de regiones sin codificación mediante incorporación de dos repeticiones de regiones no trad ucidas 3’ (UTR) de b-globulina y secuencias poli(A) más largas, ha mostrado incrementar la estabilidad de ARN , la eficiencia de trad ucción y la función de células dendríticas transfectadas con ARN (Holtkamp et al . , 2006, Blood 1 08:4009-17) . Sin embargo, estas estrategias no han sido evaluadas sistemáticamente en células T electroporadas con ARN . Para probar si este método aplica a linfocitos T humanos, se modificó el vector IVT (pG EM-ss 1 bbz.64A) ag regando 5’UTR (SP163) o 3’UTR [dos repeticiones de 3’UTR derivadas de b-globina humano (2bgUTR) o una secuencia poli(A) (150A) prolongada tal como se muestra en la figura 1 A] . Se deriva el incrementador de traducción SP 163 de 5’UTR del gen de factor de crecimiento endotelial vascular y se reporta para incrementar los n iveles de expresión de 2 a 5 veces en comparación con el promotor solo (Stein et al. , 1 998, Mol Cell Biol 1 8:31 12-9) . El ARN elaborado de estas construcciones fue electroporado en células T estimuladas. Tal como se muestra en la figura 1 B, en comparación con la construcción TVT básica q ue contiene el tracto 64-poli(A) , la adición de 3’UTR de b-g lobu lina (2bg UTR) y la cola de poli(A) (150A) más larga incrementó la expresión de transgen , especialmente cuando se combina (2bg UTR.150A) . En contraste, la incorporación de la secuencia SP1 63 en el extremo 5’ de ss 1 -bbz reprimió la expresión de transgen, lo cual puede deberse a la eficacia de cobertura reducido cuando se ag rega la secuencia SP163.

La optimización de la estructu ra de tapón 5’ incrementa la expresión v fu nción de CARs en celulas T electroporadas El tapón 5’ localizado en el extremo de la molécula mARN consiste en u n n ucleótido de guanina conectado a mARN mediante ligadu ra de trifosfato 5’ a 5’. Se han descrito varias estructuras de tapón , incluyendo los tapones 0 y 1 (Banerjee, 1980, Microbiol Rev 44: 1 75-205) . Se han utilizado varios métodos para incorporar una estructura de tapón 5’ en la construcción de transgen y cola poli(A). Los sistemas comercialmente disponibles incorporan el tapón 0 o 1 utilizando métodos de cotranscripción o enzimáticos para producir mARN coberturas. Este proceso es importante para optimizar el incremento de eficiencia de trad ucción , y debido al considerable costo de diversos sistemas de cobertura. El ARN elaborado utilizando los diferentes sistemas de cobertura fue electroporado en células T estimuladas, y se monitoreó la expresión de transgen mediante citometría de flujo (figura 2A y 2 B). Los resultados mostraron que la expresión de transgen de células T electroporadas con ARN de cobertu ra mediante análogo de tapón antiinverso (ARCA) fue de 3 veces más que el ARN de cobertura con análogo de tapón regular (RC) en 4 horas. La persistencia de transgen del ARN de cobertura con ARCA tambien fue incrementada en el d ía 5 después de la electroporación >50% de las células T hasta q ue expresaron el CAR, tal como se muestra en la figura 2B .

Posteriormente se comparó la adición enzimática de los tapones 0 y 1 con la adición no enzimática de ARCA. La ventaja potencial de utilizar el sistema de cobertu ra de enzima (CE) es q ue este método incluye C E y mScript 2’-O-metiltransferasa que trabajan en conjunto para producir la estructu ra de tapón cap í , que es m uy similar a ARCA y proporciona una eficacia de trad ucción superior en muchos sistemas in vivo. Para evaluar la eficiencia del ARN del tapón 0 o 1 que codifica ss1 -bbz, se electroporaron célu las T humanas con ARN elaborado mediante ARCA, CE , cap í C Es o CEs más poli(A) adicional . Tal como se muestra en la figura 2C, la expresión CAR utilizando electroporación de ARN de tapón 1 fue equivalente al mARN IVT ARCA. La expresión de transgen se incrementó en forma adicional mediante la incorporación de la cola poli(A) más larga, consistente con los resultados en la fig u ra 1 .

U na ventaja funcional potencial del ARN IVT optimizado, es que la expresión CAR puede ser sosten ida, ya que la traducción del CAR ad icional puede conducir a u na expresión más persistente y superar la desregulación inducida por el reconocimiento objetivo y expansión homeostática. Las células T activadas fueron electroporadas con diversas preparaciones de ARN que cod ifican ss 1 -bbz, y posteriormente cocultivadas con células objetivo K562-meso o K562-CD 19 de control durante 2 d ías (figura 7) . Las células T electroporadas con ARN ss1 -bbz cobertura con ARCA y CE 1 o CE 1 +A puede mantener aú n su expresión de transgen después de estimularse con la línea de célula K562-meso en comparación con las mismas células T cocultivadas con células objetivo de control . En contraste, las células T electroporadas con ARN ss 1 -bbz de cobertura por el análogo RC no tienen CAR detectable en la superficie después del cocultivo con el objetivo que contiene antígeno.

Con base en los resultados anteriores y otros datos, se puede concluir que el ARN de cobertu ra con ARCA o con tapón 1 y la cola poli(A) larga , es el mejor sistema de prod ucción de ARN entre los ARNs probados. Para producción GM P a g ran escala de ARN IVT, cuando el costo de prod ucción también se considera, se prefiere el tapón 1 .

Función in vitro de CARs ARN IVT optimizada Los ARNs preparados de ambos plásmidos q ue contienen secuencias CAR libres de ORF de origen o internas fueron electroporados en células T, y se descubrió q ue la expresión de transgen de los ARNs con células T electroporadas libres de ORF interno fue equivalente a las células T electroporadas con ARNs con secuencias de origen (fig ura 8) a las 20 horas después de la electroporación . Sin embargo, la prolongación substancial de la expresión CAR observada en célu las T activadas electroporadas con ARN de grado clínico generadas de ARN pD-A.ss1.OF o pD-A.19.OF libre de ORF interno utilizando el sistema CE incorporó tanto el tapón 1, como poli(A) prolongado en ARNs IVT (figura 3). La expresión de transgen del ARN IVT optimizada puede ser detectada en 7 días despues de la electroporación ARN tanto para CARs ARN meso y CD19, tal como se muestra en la figura 3C.

Los estudios previos han mostrado que 4-1BB se activa en células T CD8+ después de la estimulación de receptor de célula T (Wolfl et al., 2007, Blood 110:201-10). Las células T en volumen electroporadas con ARN ss1-bbz o CD19-bbz, fueron incubadas con células objetivo que expresan ya sea metotelina o CD19, y se encontró una activación robusta de 4-1BB particularmente en células T CD8 + , que fueron específicas del objetivo (figura 3A). Las células T que expresan los CARs ARN también segregaron cantidades substanciales de interleucina-2 (IL-2) y CD107a translocado en un reconocimiento específico de objetivo (figura 3B y 3D). Finalmente, en un ensayo lítico a base de flujo, se descubrió que las células T electroporadas con ARN CAR tanto CD19 (19. OF) como ss1 (ssl.OF), pueden lisar específicamente células objetivo en forma eficiente (figura 9).

Las células T electroporadas con ARN transmiten la regresión de xenomiertos de mesotelioma diseminados humanos Se llevó a cabo primero un experimento piloto para evaluar el potencial terapeutico de células T que expresan CARs de ARN optimizados en ratones que contienen tumores preestablecidos g randes. Se establecieron tumores positivos de mesotelina en ratones NSG tal como se reportó anteriormente (Carpen ito et al ., 2009, Proc Nati Acad Sci USA 106:3360-5) . Sesenta y seis días después de la inoculación de tumor, se inyectaron en forma intratumoral , dos veces a la semana du rante dos semanas, 10 x 1 06 a 1 5 x 106 de células T electroporadas con CAR de ARN ss 1 -bbz. El programa de administración bisemanal estuvo basado en los datos de expresión in vitro mostrados en la figura 3. Tal como se aprecia en la figu ra 4A, los tumores regresaron a los ratones tratados con células T electroporadas con ss1 ARN , mientras que se observó u n crecimiento de tumor progresivo en el g rupo de ratones de control. Al momento en que los ratones fueron sacrificados el d ía 98 , el tamaño de tumor fue substancialmente más pequeño en todos los ratones tratados con células T electroporadas, que los ratones tratados con solución salina (figu ra 1 0) . Estos resultados indican el potencial terapéutico de múltiples inyecciones de células T diseñadas con ARN ; sin embargo, no son tan potentes en el mismo modelo de tumor utilizando células T transducidas lentivirales, en donde dos inyecciones intratumoral de células T tuvieron la capacidad de cu rar a la mayor parte de los ratones (Carpen ito et al . , 2009, Proc Nati Acad Sci U S A 106:3360-5) .

El modelo M 108-Luc fue desarrollado para probar si las celulas T electroporadas con CAR ARN tienen la capacidad para tratar ratones que contienen tumores g randes diseminados. Las células de origen M 108 fueron transd ucidas en forma estable con luciferasa de luciérnaga para permitir las imágenes de bioluminiscencia (BLI) , y en experimentos preliminares, se descubrió que los ratones N SG desarrollan enfermedad ampliamente diseminada con ascitos prog resivos y que todos los ratones murieron o quedaron moribundos el día 100. Los ratones NSG ratones (n = 18) fueron inyectados con M 108-Luc, y fueron aleatorizados en tres g rupos de tratamiento i.p. El d ía 58 después de la inyección del tumor, cuando todos los ratones tuvieron tumores grandes vascularizados con ascitos y nódulos metastáticos q ue revisten la cavidad peritoneal , se inyectaron los ratones (i. p.) células T electroporadas CAR ARN ss1 -bbz hasta un donador saludable, dos veces a la semana d urante 2 semanas. Como u n control para especificidad CAR, se inyectó a u n g rupo de ratones con células T diseñadas con ARN CD 19-bbz, y se trató otro grupo con solución salina. La carga de tumor en el g rupo CAR ARN ss1 -bbz disminuyó progresivamente desde la línea desde la base el d ía 53. Además, el d ía 78 después de la inoculación de tumor, el crecimiento de tumor en el g rupo tratado con célula T diseñado con ARN ss 1 -bbz se reprimió en forma significativa (P < 0.01 ) en comparación con los grupos tanto tratados con solución salina como con célula T ARN C D 19-bbz (figu ra 4B). En un experimento lado por lado, un ratón tratado con celulas T CAR ss1 -bbz expresadas utilizando u n vector lentiviral , exhibió u n efecto de tratamiento más robusto (figu ra 4C) , similar a los datos previamente publicados (Carpenito et al, 2009, Proc Nati Acad Sci E . U .A. 106:3360-5) . Sin embargo, el grupo tratado con célula T diseñado con ARN ss1 -bbz tuvo una ventaja de supervivencia y una disminución significativa del crecimiento de tumor entre los días 72 y 92, punto en el cual todos los ratones de control murieron por el progreso del tumor (figu ra 4C) .

Las células T autóloaas electroporadas con CAR ARN transmiten regresión de mesotelioma diseminado Los estudios anteriores indican que las inyecciones bisemanales de células T diseñadas con ARN pueden controlar el flanco avanzado y los tumores i. p. , y que la in hibición depende de la especificidad CAR , ya que las células T que expresan el CAR ARN CD 1 9 no fueron efectivas. Sin embargo, las células T en d ichos experimentos se obtuvieron de donadores saludables y fueron alogeneicas para el tumor. Debido a que se observaron efectos antitumor halogeneicos con administración a largo plazo repetida de las células T CAR ARN , se uti lizaron las células mononucleares de sang re periférica autólogas del paciente del cual se derivó el tumor M 108. Las células T fueron estimuladas y electroporadas utilizando ARN grado GM P . Se aleatorizaron treinta ratones N SG en tres grupos de tratamiento i. p. , tal como se ilustra en el diagrama de la figura 1 1 . Los ratones fueron inoculados con M 108-Luc (i. p.) el día 0 y tratados con celulas T CAR ARN ss1 -bbz o C D1 9-bbz, o con control salino, y la carga de tumor fue monitoreada mediante BLI en serie y el peso corporal tal como se indicó. La terapia corporal inició el d ía 56, cuando el tumor avanzó con base en el descubrimiento de los ascitos en la revisión física y en las señales BLI de alto nivel . La carga de tumor fue reducida dramáticamente en el g rupo tratado con células T electroporadas con célu las T CAR ARN ss1 -bbz, mientras que el tumor continuó creciendo en los ratones de control tratados ya sea con células T CAR ARN CD 19-bbz o con solución salina (figu ras 5A y 5C) . I ncluso en esta configuración, en donde las células T son autólogas para el tumor, aún hubo u n efecto de tratamiento con CAR CD19 moderado, lo cual puede ser debido al esqueleto de ARN , ya que es improbable q ue este relacionado con el CAR scFv C D 19 CAR debido a que no h ubieron células B en estos ratones. Sin embargo, después de las primeras seis dosis de células T, las imágenes revelaron u na bioluminiscencia de tumor con un cambio promedio más bajo en los ratones CAR ss1 (39%) en comparación con ratones tanto CAR CD 19 (244%) como de control salino (237% ; P < 0.001 ). El 50% de la supervivencia promedio después de la inyección de célula T, fue significativamente (P < 0.05) mayor en los ratones CAR ss1 (73 días) en comparación con los ratones CAR CD 19 (62 días) y de control salino (36 d ías ; figura 5B). Despues de q ue se administraron las primeras seis dosis, el cambio promedio en el peso corporal total fue menor en los ratones CAR ARN ss 1 ( 1 .62 g) en comparación con los ratones tanto CAR C D1 9 (6.21 g) como de control salino (1 1 .4 g ; P < 0.001 ; figura 5C) . Aunque se observó la estabilidad de la enfermedad incluso la “curación” en las imágenes en algu nos de los ratones CAR ss 1 , el tumor reincid ió eventualmente. A pesar de proporcionar ocho dosis de tratamiento adicionales, se observó el progreso del tumor en los ratones CAR ss1 . Por lo tanto, las Inyecciones repetidas de células T CAR ARN ss 1 -bbz puede proporcionar u n beneficio de supervivencia para tumores diseminados avanzados. El mecanismo de reincidencia de tumor a pesar de la terapia continuada, está bajo investigación .

Las múltiples invecciones de células T activadas expresan CARs ARN electroporados La meta de estos experimentos fue determinar el potencial terapéutico de las células T activadas que expresan CARs ARN electroporadas. Los resultados presentados en la presente invención muestran q ue los CARs mARN proporcionan u na plataforma que se espera sea más segu ra y más económica que los vectores retrovirales o lentivirales para la evaluación de n uevos objetivos. En el caso de toxicidad , las inyecciones de células T CAR ARN pueden ser terminadas, y se puede esperar q ue la toxicidad se elimine rápidamente. Sin embargo, las celulas T CAR ARN tienen un potencial de tratamiento sustancial , especialmente en tumores en compartimentos, tal como mesotelioma . Se espera que las células T CAR ARN complementen las terapias q ue actualmente están siendo desarrolladas con CARs retrovirales y lentivirales.

El método fue para optimizar primero la expresión de ARN y posteriormente probar una estrategia de dosificación múltiple en modelos de tumor robustos. Este es el primer reporte que indica que las células T redirigidas pueden tener efectos antitumor in vivo potentes sin el uso de un sistema de vector de integración . Utilizando el mARN IVT optimizado, los resultados aquí presentados muestran que las que células T CAR ARN tienen potentes efectos antitumor en el flanco avanzado y tumores intraperitoneales. Además, estos estudios son los primeros q ue muestran que las células T autólogas obtenidas de un paciente con cáncer avanzado pueden ser diseñadas y mostradas para controlar el tumor metastático en modelos preclínicos robustos.

Se ha observado previamente que la electroporación de ARN puede mod ificar la función de célula T in vitro (Smits et al, 2004, Leukemia 18: 1898-902; Schaft et al , 2006, Cáncer Immunol I mmunother 55: 1 1 32-41 ; Zhao et al , 2006 , Mol Ther 13: 151 -9) . Mitchell y colegas (Mitchell et al , 2008, Hum Gene Ther 19:51 1 -21 ) reportó que las células T pueden ser modificadas funcionalmente mediante transfección de ARN del receptor de quimiocina CXC R2 para migrar en forma eficiente hacia una variedad de quimiocinas específicas de CXCR2 in vitro e in vivo. Yoon y colegas (Yoon et al, 2009, Cáncer Gene Ther 16:489-97) mostraron recientemente que la transferencia adoptada de las celulas T electroporadas con CAR ARN Her2/neu en el modelo de xenomjerto SKOV3 , cond uce a u n rango disminuido de crecimiento de tumor en comparación con la transferencia de células T transfectadas con mock. U n reporte reciente mostró la factibilidad de la transfección de mARN de un receptor quimérico CD 1 9 en una línea de célula exterminadora natural , pero sin un modelo preclínico o demostración de u n efecto ¡n vivo (Li et al , 201 0, Cáncer Gene Ther 1 7: 147-54) . Sin embargo, n inguno de estos reportes demuestran la regresión in vivo de tumores avanzados grandes y la extensión de supervivencia utilizando células T electroporadas con ARN .

Existe una variedad de métodos sin integración para diseñar células T (June et al, 2009, Nat Rev I mmu nol 9:704-16) . U n método de expresión temporal hacia inmu noterapia CAR, tal como transfección mARN , corre en contra con los esfuerzos comunes del campo . Sin embargo, la teenología en incremento para la transfección de ARN puede complementar el uso de CARs q ue son expresados establemente mediante la integ ración de sistemas de transposon o vector viral. Mediante comparación sistemática del 3’UTR y 5’UTR , la i ncorporación de las colas poli(A) más largas, la cobertura eficiente de ARN , y la eliminación de ORFs internos, tuvieron la capacidad de lograr un alto nivel y una mayor expresión de los CARs ARN de las celulas T electroporadas.

El paradigma prevalente en el campo de transferencia adoptada es que la persistencia a largo plazo de las células dentro del paciente, es la clave de la eficacia (J unio, 2007, J Clin Invest 1 1 7: 1466-76; Rosenberg et al . , 2008 , Nat Rev Cáncer 8 :299-308) . Sin embargo , cada vez está más materializado que las células transferidas pueden perder su capacidad de funcionar dentro del microambiente de tumor, en forma más rápida (Teague et al. , 2006, Nat Med 12: 335-41 ) . Los datos aqu í presentados, sugieren q ue p ueden ser posible proporcionar mú ltiples inyecciones de células T más frecuentes , q ue expresan únicamente temporalmente los transgenes de elección , evitando la acumulación de células T CAR que se han vuelto tolerables, y por consiguiente log rar una eficacia antitumor con u n perfil de seg uridad mejorado. Alternativamente, la teenolog ía en incremento para la transfección de ARN puede complementar el uso de CARs q ue son expresados establemente med iante la integ ración de sistemas de transposon o vector viral.

Se han observado diversos eventos adversos y otros son teóricamente posibles con la terapia de célula T de CAR. Recientemente se han reportado dos muertes después del tratamiento con células T CAR modificadas en forma retroviral y los eventos tóxicos tempranos han estado relacionados con los efectos sistémicos de la liberación de citocina (Brentjens et al, 2010 , Mol Ther 18:666-8 ; Morgan et al , 2010, Mol Ther 18 :843-51 ) . Como una consecuencia de estos eventos cl ínicos, las editoriales recientes han descrito la necesidad de CARs más segu ros (Heslop, 2010, Mol Ther 18 :661 -2; Bu ning et al , 2010, H um Gene Ther 21 : 1039-42). Otras toxicidades encontradas con las células T CAR transducidas en formas estable han sido efectos en el objetivo, fuera de los órganos, tal como la d isminución de células B normales después de la terapia CAR C D 19, o la inducción de toxicidad hepática después de la terapia IX de anhidrasa carbónica (Lamers et al, 2006, J Clin Oncol 24:e20-2) . Sin pretender lim itarse a teoría alg una en particular, se considera que la administración repetida de los CARs ARN puede ser requerida para provocar esta forma de toxicidad, y que la toxicidad se puede resolver después de la interrupción de las infusiones de célula T CAR ARN . Finalmente, los aspectos con respecto a la introducción lentiviral o retroviral de los CARs en los CTLs, incluyen el riesgo conocido de transformación maligna de la mutagénesis de inserción (Nienhuis et al, 2006, Mol Ther 1 3: 1031 : 19; Bushman et al , 2007, J Clin I nvest 1 17:2083-6) . Ya que no existe integración en el genoma de célula h uésped , y la expresión CAR está autolimitada, estos aspectos son impedidos por la transfección de mARN .

Sin pretender limitarse a teoría algu na, se considera que la limitación potencial primaria de la terapia CAR, es la persistencia relativamente corta de los CARs ARN . Se puede esperar que esto se exacerbe cuando las celulas T CAR ARN se administran a huéspedes que han sido linfodisminuidos, lo cual puede esperarse que dé como resultado la i nd ucción de la proliferación homeostática de las células T CAR, y como consecuencia , la pérdida acelerada de expresión CAR en la superficie de célula T. Por lo tanto, las célu las T CAR ARN pueden ser más efectivas cuando se proporcionan para tumores en compartimento tal como mesotelioma o tumores del sistema nervioso central . Además, la administración más frecuente de los CARs ARN puede ser requerida en huéspedes linfodisminu idos.

Además de proporcionar una forma de manejo de toxicidad como la q ue se describe en la presente invención , existen d iversas oportu nidades potenciales para la terapia de célula T CAR ARN . Primero, los CARs ARN ofrecen el potencial de acelerar el ritmo del desarrollo de CAR, proporcionando una trayectoria más flexible y más rápida para la cl ínica y de esta forma permitiendo un método interactivo eficiente para optimizar el diseño y la potencia de CAR. Con base en los datos aq uí presentados, se planea abrir una prueba fase I, para probar los CARs ARN . El proceso de aprobación de reg ulación es menos complicado con CARs ARN que con CARs expresados en forma estable, q ue requieren integración genómica . El mARN de grado cl ín ico es menos costoso de producir que los vectores retrovirales o lentovirales de integración , aunque más costoso que el ADN de plásmido q ue está siendo utilizado en protocolos a base de transfección y transposon (Till et al , 2008, Blood 1 12 :2261 -71 ; Singh et al, 2008, Cáncer Res 68:2961 -71 ). En segundo lugar, puede ser atractivo combinar la terapia de “eliminación” de CAR ARN utilizando CARs potentes pero potencialmente tóxicos para la inducción de remisión , con terapia de consolidación y mantenimiento que utiliza CARs expresados en forma estable como una estrategia para proporcionar celulas CAR con u n potencial de memoria.

En síntesis, las múltiples inyecciones de células T d iseñadas con ARN son u n método novedoso para transferencia de célula adoptada , q ue proporciona una plataforma efectiva y suficiente en costo para el tratamiento de enfermedades de cáncer. Además, este método puede incrementar el índice terapéutico de las células T diseñadas para expresar dominios de activación poderosos sin los aspectos de seguridad asociados de los vectores virales de integración .

Eiemolo 2 : Tratamiento de leucemia avanzada en ratones con células T diseñadas con mARN Aunque los CARs expresados en forma estable q ue contienen linfocitos T Citotóxicos (CTLs) generados mediante vectores virales de integ ración son eficaces y tienen u na potencial resistencia a largo plazo, una terapia alternativa es utilizar CARs que se expresan temporalmente en donde las celulas T son electroporadas con un ARN transcrito in vitro optimizado q ue codifica un CAR contra un objetivo deseado (por ejemplo, CD 1 9) . Los resu ltados aqu í presentados demuestran que las células T que expresan un CAR anti-C D1 9 introducidas med iante electroporación con ARN optimizado fueron exterminadores potentes y específicos de célu las objetivo C D 19. Las células T CAR ARN C D 19 proporcionadas a ratones inmunodeficientes que contienen leucemia xenomjertada, migraron rápidamente a los sitios de enfermedad y retuvieron actividad l ítica específica de objetivo significativa . En forma inesperada, una sola inyección de células T CAR ARN CD 19 redujo la carga de enfermedad en un d ía después de la administración , dando como resultado una prolongación significativa de supervivencia en un modelo de xenoinjerto de leucemia ag resivo. La expresión de superficie de los CARs ARN puede ser titu lada, proporcionando células T con niveles potencialmente afinables de funciones efectoras tales como liberación de citocina y citotoxicidad . Los CARs ARN son un método de diseño genético que debe ser sometido a genotoxicidad , y proporciona una plataforma para optimizar rápidamente el diseño CAR antes de proceder a sistemas de expresión estable más costosos y laboriosos.

Los Materiales y metodos empleados en estos experimentos se describen a continuación Materiales v métodos Construcción de vectores de transcripción in vitro ÍIVT) v electroporación de ARN Los CARs dirigidos por CD19 y mesotelina (meso) con dominios de señalización 4-1BB y C03C (19-BBz y ss1-BBz, respectivamente) han sido descritos anteriormente (Milone, et al, 2009, Mol Ther 17(8): 1453-1464; Carpenito et al, 2009, Proc Nati Acad Sci E.U.A. 106(9):3360-3365). Los productos PCR se subclonaron en un vector a base de pGEM.64A reemplazando GFP de pGEM-GFP.64A (Zhao, et al, 2006, Mol Ther 13(1): 151-159) con productos PCR digeridos por enzima de restricción con Hind III y Not I para producir pGEM-ss1 bbz.64A y pGEM-CD1 9bbz.64A. Similarmente, se construyeron versiones de tercera generación de los CARs utilizando el dominio de señalización CD28. Los cDNAs CAR reemplazados fueron confirmados mediante secuenciación directa y fueron linealizados mediante digestión Spel antes de ARN IVT. El sistema de ARN mScript (Epicentre, Madison, Wl) fue utilizado para generar ARN IVT cobertura. El ARN IVT fue purificado utilizando un Equipo RNeasy Mini (Qiagen, Inc., Valencia, CA) y el ARN purificado se eluyo en agua libre de RNasa en 1-2 mg/ml. Se estimularon células T humanas mediante gránulos CD3/CD28 tal como se describe (Carpenito et al, 2009, Proc Nati Acad Sci E. U .A. 106(9):3360-3365) . Las celulas T estimuladas se lavaron tres veces con O PTI-M EM y se resuspendieron en OPTI-M EM en una concentración final de 1 -3 x 108/ml antes de la electroporación . Subsecuentemente, las células T estimuladas fueron mezcladas con 1 0 mg/0.1 mi de células T de ARN IVT (tal como se indica) y se electroporaron en una enbeta de 2-mm (Harvard Apparatus BTX, Holliston, MA, U SA) utilizando u n ECM830 Electro Square Wave Porator (Harvard Apparatus BTX) . La viabilidad de postranfección fluctúo del 50 al 80% , y en todos los casos las células T viables para inyección tuvieron un >99% de expresión CAR al momento del uso. Para los experimentos de tráfico, las células T fueron transdúcidas establemente con una construcción lentiviral de luciferasa de luciérnaga antes de la transfección de mARN . Construcción de vectores lentivirales con diferentes CARs Los vectores lentivirales que codifican los diversos CARs bajo control de transcripción del promotor EF-Ia fueron generados tal como se describió previamente (I mai et al, 2004, Leukemia 18(4) : 676-684; M ilone, et al , 2009, Mol Ther 17(8): 1453-1464) . También se generaron vectores lentivirales de expresión CAR en donde las secuencias CAR fueron precedidas en estructura ya sea por una secuencia eG FP o luciferasa de luciérnaga (FFluc) seguido de la secuencia de salto ribosomal 2A de FM DV. Estos vectores permiten la expresión dual de G FP o FFluc y los CARs de u na sola transcripción ARN . Todas las construcciones fueron verificadas mediante secuenciación .

D e t e c ción CAR en celulas T electroporadas Las células se lavaron y suspend ieron en amortiguador FACS (solución salina amortiguada por fosfato (PBS) con azida de sodio al 0.1 % y albúmina de suero de bovino al 0.4% (BSA)). Las células se incubaron en 4°C d urante 25 minutos con anticuerpos F(ab)2 antiratón de cabra policlonales etiq uetados con Biotina (anti-Fab, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y posteriormente se lavaron dos veces con amortiguador FACS . Las célu las se mancharon posteriormente con estreptavid ina etiquetada con ficoeritrina (B D Pharmingen , San Diego , CA) . Se llevó a cabo la adq uisición de citometría de flujo con un BD FacsCalibu r (BD Biosciences), y el análisis se llevó a cabo con Flow Jo (Treestar I nc, Ashland , OR) .

Ensayos ELI SA v Luminex Las células dirigidas se lavaron y suspendieron en 106 células/mL en CIO (RPM I 1640 suplementado con Suero de Becerro Fetal al 10% (FCS) , I nvitrogen) . Se agregaron 105 células objetivo de cada tipo a cada uno de los 2 depósitos de u na placa de fondo redondo de 96 depósitos (Corning). Se lavaron los cultivos de célu las T efectoras y se suspendieron en 106 células/m L en C 1 0. Se combinaron 105 células T efectoras con células objetivo en los depósitos indicados en las placas de 96 depósitos. Además se prepararon depósitos que contienen únicamente células T. Las placas se incubaron a una temperatura de 37°C durante 18 a 20 horas. Despues de la incubación. Se llevó a cabo un ensayo ELISA en el sobrenadante utilizando instrucciones del fabricante (Pierce, Rockford, IL). Se probaron por duplicado 50 microlitros de sobrenadante de cultivo, y los resultados se reportan en mg/ml. Manchado CD1 07a Se revistieron células en una proporción efectora: objetivo (E:T) de 1:1 (105 efectores 105 objetivo) en 160 mI de medio C 10 en una placa de 96 depósitos de fondo redondo. Los controles incluyeron depósitos sin células objetivo para evaluar los niveles de fondo de CD107a. Se agregaron 20 ml de Ab etiquetado con ficoeritrina anti-CD 107a (BD Pharmingen, San Diego, CA), la placa se agitó suavemente y se incubó a una temperatura de 37°C durante 1 hora. Se agregó una solución Golgi Stop y las placas se incubaron durante otras 2.5 horas. Posteriormente las células se mancharon con 10 pL de FITC-anti-CD8 y APC-anti-CD3 (BD Pharmingen, San Diego, CA), y se lavaron. Se llevó a cabo la adquisición de citometría de flujo con un BD FacsCalibur (BD Biosciences) , y el análisis se llevó a cabo con Flow Jo (Treestar Inc, Ashland, OR).

Ensayo de Linfocito T Citotóxico de Citometría de Flujo Se utilizó una versión ligeramente modificada de un ensayo de citotoxicidad de citometría de flujo (Hermans et al, 2004, J Immunol Methods 285(l):25-40). En este ensayo, la citoxicidad de las células objetivo se midió comparando la supervivencia de celulas objetivo en forma relativa a la supervivencia de células de control negativo del mismo tubo que las células efectoras. En los experimentos aquí descritos, las células objetivo fueron células K562 que expresan CD19 humano (K562-CD19), y las células de control negativo fueron células K562 que expresan mesotelina (K562-meso). Las K562-meso fueron etiquetadas con tinta fluorescente 5-(y-6)-(((4-clorometil)benzoil)amino) tetrametirodamina (CMTMR).

(Invitrogen) las células K562-CD19 fueron etiquetadas con éster succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE). (Invitrogen) los cultivos se prepararon en una placa de cultivo de 96 depósitos por duplicado en las siguientes proporciones de células T, célula objetivo: 10:1, 3:1, y 1:1, utilizando células objetivo 104 CD19+ y células de control 104 meso + . Para algunos experimentos en donde se utilizaron tanto K562-CD19 como K562-meso como células objetivo y se etiquetaron con CFSE, una línea de célula de mesotelioma NSO que es negativa para CD19 fue etiquetada con CMRA como un control negativo. Los cultivos se incubaron durante 4 horas a una temperatura de 37°C . Inmediatamente después de la incubación, se agregó 7-AAD (7-aminoactinomicina D) (BD Pharmingen) según la recomendación del fabricante. El análisis se sincronizó en células negativas 7AAD (vivas), y se determinaron los porcentajes de células K562-CD19 y K562-meso vivas para cada cultivo de célula T más célula objetivo. Para cada cultivo, se determinó el porcentaje de supervivencia de K562-CD 19 dividiendo el porcentaje de K562-CD 1 9 vivas entre el porcentaje de celulas de control K562-meso vivas. El porcentaje de supervivencia corregido de K562-CD 19 fue calculado dividiendo el porcentaje de supervivencia de K562-CD 19 en cada cultivo de célula T más célula objetivo entre la proporción del porcentaje de las células T objetivo K562-C D 19:porcentaje de células de control negativo K562-meso en tubos q ue contienen únicamente células objetivo K562-CD 19 y células de control negativo K562-meso sin cualqu ier célula T efectora. Esta corrección fue necesaria para tomar en cuenta la variación en los números de células de partida para muerte de célula objetivo espontánea. Se calcu ló la citotoxicidad como 100-(porcentajes corregido de supervivencia de K562-CD 1 9). Para todas las proporciones de efectora :objetivo, se determinó la citotoxicidad por d uplicado y los resultados fueron promediados.

Estudios de Xenomierto de Ratón Se llevaron a cabo estudios tal como se describió anteriormente con ciertas modificaciones (Teachey, et al , 2006, Blood 107(3) : 1 149-1 155 Teachey, et al . , 2008 , Blood 1 1 2(5): 2020-2023) . En síntesis, se obtuvieron rato nes NOD-SCID-yc '- (N SG) de 6 a 10 semanas de edad del laboratorio Jackson Laboratory (Bar Harbor, M E) o se criaron localmente bajo un protocolo institucional aprobado del comité de cuidado y uso de animales (IACUC) y se mantuvieron bajo condiciones libres de patógenos. Se obtuvo la l ínea ALL humana CD1 9+ Nalm-6 en la Recolección de Cultivo Tipo Americano (ATCC, Manassas, VA) . Los an imales se inyectaron mediante la vena de la cola con Nalm-6 celulas 106 viables en 0.2 mL de PBS estéril . Las células T se inyectaron mediante la vena de la cola en 5 x 106 , 1 x 1 07 o células 2.5 x 1 07 en un volumen de 0.2 mL de PBS estéril 7 d ías después de la inyección de Nalm-6. Nalm-6 en esta dosis produce en forma confiable leucemia fatal en el ratón NSG dentro de 22 a 25 d ías si se deja sin tratar. Los experimentos previos demostraron que la detección confiable más temprana de la enfermedad (>0.1 %) en médula ósea femoral fue de 7 d ías después de la inyección , y por lo tanto este punto de tiempo es el elegido para intervención terapéutica y el correlacionado con enfermedad bioluminiscente. Los animales se monitorearon cercanamente con respecto a signos de enfermedad de injerto versus huésped y otra toxicidad, tal como se puede evidenciar mediante pérdida de peso del > 10% , pérd ida de pelo, diarrea o conjuntivitis, así como parálisis de extremidad trasera relacionada con leucemia . Se obtuvo sang re periférica mediante sangrado retroorbital , y se determinó la presencia de ALL e injerto de célula T mediante citometría de flujo utilizando tubos BD Trucount (BD Biosciences) tal como se describe en las instrucciones del fabricante. La expresión CD 19, C D20, CD4, CD3, CD 10 y/o C D8 (segú n se requiera) fue detectada manchando con anticuerpos monoclonales conj ugados en forma fluorescente (BD Biosciences). La expresión de los CARs CD 19 o SSI scFv fue detectada utilizando fragmento F(ab’)2 biotinilado de suero IgG anti-ratón de cabra (específico de scFvs de origen de mú rido) (Jackson I mmu noResearch) seguido de manchado con estreptavidina-PE (BD Biosciences/Pharmingen).

Imágenes Bioluminiscentes Se generaron ratones de imágenes anestesiados utilizando un sistema de espectro Xenogen Spectrum y el software Living Image v4.0. A los ratones se les administró una inyección intraperitoneal de 1 50 mg/kg de D-luciferina (Caliper Life Sciences, Hopkinton , MA) . La titulación previa tanto de celulas Nalm-6 como célu las T humanas transd úcidas con vector de luciferasa de luciérnaga, indicó el tiempo para el pico de la emisión de fotones como de 5 minutos, durando la emisión del pico de 6 a 1 0 min utos. Se generó una imagen de cada animal (para cuantificación de fotones) o en grupos de hasta 5 ratones (para propósitos de despliegue) en la posición boca abajo anterior-posterior en el mismo punto de tiempo relativo después de la inyección de luciferina (6 minutos). Los datos fueron recolectados hasta que se alcanzó un rango medio de escala lineal (conteos de 600 a 60000) o hasta que se alcanzaran las configu raciones de exposición máxima (f detención 1 , depósito grande y 120 segundos) , y posteriormente se convirtieron en fotones/segundo/cm2/esteradian para normalizar cada imagen con el tiempo de exposición, f detención , depósito y tamaño del animal . Para localización anatómica, se sobre impuso u n mapa de seudocolor que representa la intensidad de luz sobre la imagen de referencia con la superficie del cuerpo en escala de grises. Para propósitos de despliegue de datos, se generaron imágenes de los ratones sin celulas que contienen luciferasa en las configu raciones máximas, y se obtuvo un valor promedio de 3.6 x 105 p/s/cm2/sr. Los ratones con Nalm-6 que contienen luciferasa normalmente quedaron moribundos con leucemia cuando el fl ujo de fotones alcanzó 5 x 101 1 p/s/cm2/sr, proporcionando u n rango de detención de 6 órdenes de magnitud. Similarmente, se utilizaron las versiones de expresión de luciferasa de diversos CARs para detectar el tráfico de células T hacia los sitios de tumor y evaluar la expansión de las células T transferidas en el ratón huésped . Pruebas de Identidad de Líneas Celu lar Se obtuvieron líneas de células de origen Nalm-6 y K562 de ATCC (Manassas, VA) y se genotipificaron mediante análisis de repetición tándem corto (Masters, et al , 2001 , Proc Nati Acad Sci E . U .A. 98(14) :8012-8017) . Las l íneas celulares fueron verificadas cada seis meses, o después de cualquier mod ificación genética tal como CD 1 9 o transd ucción de luciferasa o para asegu rar la identidad .

Consideraciones Estad ísticas Se llevó a cabo el análisis con STATA versión 10 (Statacorp, College Station , Texas) o Prism 4 (G raphpad Software, La Jolla , CA) . Los datos in vitro representan promedios de duplicados, y las comparaciones de los promedios se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitncy . Para comparación entre los grupos múltiples, se llevó a cabo el análisis de Kruskal-Wallis con pruebas de Comparación Dunn Múltiple para comparar grupos individuales. Se compararon las curvas de supervivencia utilizando la prueba de registro-clasificación con u na corrección de Bonferroni para comparar múltiples conju ntos de datos.

Los resultados de los experimentos se describen a continuación .

La generación de celulas _ T que expresan mARN mediante t r a n sfección de CAR da como resultado hasta 10 d ías después de la expresión en la superficie con actividad l ítica detectable Se evaluó in vitro la persistencia de expresión y la actividad citolítica de los CAR+ CTLs transfectados con mARN (CARs ARN) . La alta expresión en la superficie persistió in vitro d u rante 6 d ías antes de la derivación h acia abajo hacia las células sin expresión de l ínea de base a los 1 0 d ías (la fig ura 1 A y datos no son m ostrados) . Ésta alta resiste ncia al tra nsgen prolongada fue diferente a la m ayor pa rte de los reportes del pico y du ración de la expresión de un antígeno de superficie después de la transfección de mARN (Birkholz et al, 2009, Gene Ther 16(5):596-604; Rabinovich, et al, 2009, Hum Gene Ther 20(1 ):51-61 ; Yoon, et al, 2009, Cáncer Gene Ther 16(6):489-497; L¡, et al, 2010, Cáncer Gene Ther 17(3): 147-154), posiblemente debido al vector IVT optimizado y a la producción de ARN (datos no mostrados). En paralelo, el potencial citotóxico de las células T que expresan CAR in vitro se evaluó con un ensayo de exterminación a base de citometría de flujo. La lisis específica de más del 50% de las células objetivo en una proporción E:T de 2:1 se observó de los días 1 a 4. Aunque la actividad citotóxica disminuyó en los días del 5 al 6, incluso con una reducción de registro de 2 a 3 en la expresión de superficie de CAR, se observó cierta actividad lítica y estuvo sobre la de la lisis de antecedente de las células transfectadas (figura 12B). La actividad lítica específica declinó en paralelo con el declive de MFI con el transgen expresado, aunque se observó una actividad lítica significativa (p<0.05) en los controles no electroporados en una proporción E:T de 20:1 6 días después de la electroporación.

Para evaluar en forma adicional la actividad lítica de las células T CAR + ARN, se estimularon y electroporaron tal como se indicó anteriormente, posteriormente se cultivaron junto con diversas células objetivo 4 horas después de la electroporación para revisar el potencial citolítico y la especificidad objetivo. Se utilizó la expresión de CD107a como un marcador de desg ranulación de celula cito I ítica . (Betts y Koup, 2004, Methods Cell B i o I 75:497-512). Además del objetivo de interés (CD 19) , CAR dirig ida contra la mesotelina de antígeno irrelevante (no expresada en los linfocitos) se utilizó como un control . Las células K562 no expresan ni CD 19 n i mesotelina, au nque son transdúcidas fácilmente para expresar una variedad de genes q ue las hacen células objetivo flexibles para evaluaciones de citotoxicidad ¡n vitro (Suhoski et al , 2007, Mol Ther 15(5) :981 -988) . Las células T CAR+ ARN dirigidas por C D 1 9 se desgranulan y expresan CD1 07a únicamente en la presencia del objetivo CD19 + , lo que indica el reconocimiento específico del antígeno y la fu nción lítica (figu ra 12C). Esto incluyó tanto la línea de célula de leucemia objetivo CD 19 Nalm-6, así como las células K562 transdúcidas para expresar C D 19. Como un control , la mesotelina de reconocimiento CAR lisa únicamente en forma específica a células mesotelina + K562, tal como se mide a través del mismo ensayo CD 107a. Las células T CAR+ dirigidas a mesotelina no expresadas en CD 107a en la presencia de K562 de origen negativo de mesotelina, la línea C D197mesotelina-ALL Nalm-6, o K562 transdúcida para expresar CD 19 en la superficie, pero no mesotelina. Un experimento de cocultivo que utiliza tanto un CAR anti-meso como dominios de señalización 4-I BB y TCR zeta (BBz) y un CAR anti-CD 1 9-BBz también demostraron li beración específica de la interleucina-2 ( I L - 2 ) en la presencia de un objetivo adecuado tal como se mide mediante ELISA del sobrenadante, lo que sugiere la activación de celula T específica de antígeno (figura 12D).

Relación del nivel de expresión CAR con la dosis de ARN de entrada Los reportes recientes de severos eventos adversos después de la administración de células T CAR construidas mediante transferencia de gen retroviral (Brentjens et al, 2010, Molecular Therapy 18(4):666-668; Morgan, et al, 2010, Mol Ther 18(4):843-851 ) sugieren que una plataforma de expresión de CARs con niveles predeterminados de expresión en la superficie o que asegura la autoexpresión limitada (tal como ARN) puede ser recomendable. Al titular la dosis mARN, se observa una variación de aproximadamente 100 veces de la expresión en la superficie de CAR ARN mediante MFI (figura 13A). A pesar de la variación en la MFI en la superficie, el rango de disminución de declinación de expresión (expresado como porcentaje) es similar (figura 13B). Las células T CAR+ ARN exhiben una actividad lítica similar el día 1 después de la electroporación (figura 13C, panel izquierdo) y la secreción de IFN-g (figura 13D). También se probó la secreción de IL-2). Esto es consistente con un reporte reciente que utiliza una diferente metodología (James, et al., 2010, The Journal de Immunology 184(8):4284). Sin embargo, por el Día 3, se observó una disminución dependiente de la dosis en la actividad lítica, en donde las dosis de ARN inferiores son menos efectivas en comparación con sus efectos el Día 1 , mientras que las dosis más altas (40 y 20 pg) tienen perfiles Uticos similares en cada proporción E :T el Día 3 tal como en el Día 1 . Esto sugiere que la expresión de superficie inicial que parece proporcionar al ARN de entrada, puede dirigir el tiempo y grado de actividad lítica. Esto puede ser útil para controlar la d uración del efecto y potencialmente la duración de la liberación de citocina, au nq ue esto permanece en estudio.

Tráfico in vivo de CTL CAR + Con base en los datos in vitro anteriores demuestran la expresión de CAR ARN du rante hasta u na semana, se evaluó la función citol ítica de las celulas T CAR+ transfectadas con mARN después de 48 horas en un modelo de ratón de xenomjerto. Se inocularon ratones N SG a través de la vena de la cola con la línea CD1 91 ALL Nalm-6 siete días antes de la infusión de 107 de células T CAR+ ARN BBz-19-BBz o anti-meso (SS1 ) (fig u ra 14). Los ratones fueron sacrificados 48 horas después de la infusión de célula T, y células T fueron recuperadas y enriquecidas de la sang re periférica, bazo, méd ula ósea femoral y un lavado peritoneal q ue utiliza u n protocolo de selección negativo. Después de 48 horas de proliferación in vivo y exposición a los objetivos CD 19 Nalm-6, las células T que expresan CAR aún pueden ser detectadas en sang re periférica, bazo y peritoneo. La expresión CAR anti-CD 1 9 en la superficie es moderadamente inferior que la de las células T cultivadas por control de compañ ía in vitro (figu ra 14A) . Las célu las T CAR meso-BBz que no han sido expuestas a objetivos que expresan el antígeno sustituto de mesotelina cognato, también fueron recuperadas de estos compartimentos. Las poblaciones positivas de CAR generales procedentes del bazo, fueron del 75% (como un porcentaje de las células C D3+ humanas totales recuperadas) para C D 19 y del 68% para mesotelina en este pu nto de tiempo. Por lo tanto aunque las CTLs CAR CD 19 se expandieron en base en la bioluminiscencia (figu ra 1 5) y las CTLs CAR de mesotelina no , parece que las CTLs CAR CD 19 proliferantes producen la progenie CAR+ . Si la proliferación transmitida por CAR diera como resultado una progenie negativa de CAR, el porcentaje de células positivas CAR CD 19 debe ser menor q ue el de las CTLs CAR de mesotelina no proliferante. Se recu peraron de la méd ula ósea femoral en este punto de tiempo pocas células CD3+ h umanas para cualquier construcción , debido probablemente en parte a la distribución d iluida de las células T a través de las regiones inaccesibles de la médula (cuerpos vertebrales, calvario). Los sueros IgG anti ratón de cabra utilizados para manchar CAR, también reaccionan en forma cruzada con muchas células precu rsoras de médula ósea lo q ue proporciona u n antecedente de alto nivel en la evaluación de este compartimento.

Se utilizaron células recuperadas de los lavados peritoneales d urante 48 horas, las cuales tuvieron la mayor parte de la población en riquecida con C D3+ y CAR+ humanas sin importar si las celulas T fueron administradas I P o IV, para caracterización in vitro adicional . Las célu las T recuperadas del peritoneo de ratones 48 horas después de la inyección de 107 de célu las T CAR+ se probó para citotoxicidad específica de antígeno en un ensayo CTL a base de citometría de flujo (figu ra 14B) . Se obtuvo la lisis objetivo específica de antígeno significativa con células T CAR+ ARN recuperadas de ratones después de 48 horas, comparables con las que se enltivaron in vitro durante 48 horas.

Posteriormente, se evaluó la distribución anatómica de las CTLs CAR ARN d urante 3 d ías utilizando bioluminiscencia in vivo. Los ratones fueron infusíonados con Nalm-6 y el día 7, con 5 x 106 de células T CAR+ ARN (50% C D4 y 50% CD8, ambas IV) . Para evaluar del reconocimiento de efectos de antígeno y la señalización CAR en la biodistribución , se compararon las células T CAR+ ARN que expresan 19-BBz, ss 1 -BBz, así como las células T transfectadas mock. Las células T que fueron transdúcidas en forma estable con una construcción lentiviral de luciferasa de luciérnaga antes de la transfección de mARN , se utilizaron para permitir el rastreo bioluminiscente in vivo y la cuantificación relativa. La retención en sitios de enfermedad y la subsecuente proliferación tal como se indica mediante el incremento de la señal bioluminiscente total, así como los mapas de calor en sitios de enfermedad conocidos requirieron el reconocimiento de un antígeno objetivo (fig ura 15) . Las celulas T con CARs contra antígenos no están presentes en las células de modelo (mesotelina) o transfectadas con mock concentradas en el bazo, y no mostraron incremento en bioluminiscencia con el tiempo a parti r de la inyección . La carencia de incremento de actividad de bioluminiscencia sugiere u na carencia de expansión de célu la T in vivo , ya que la señal luminiscente es directamente proporcional al número de células (Zhao, et al , 2005, J Biomed Opt 10(4) :41 210; Dobrenkov et al, 2008, J N ucí Med 49(7) : 1 162-1 170) . Las células T con 19-BBz que migraron , fueron retenidas y proliferaron en sitios de enfermedad (esqueleto axial y médu la ósea femoral , bazo, así como probablemente el h ígado en el flanco derecho) (figura 1 5B) . Además, la señal bioluminiscente total incrementó con respecto al ratón completo, así como los sitios de implicación conocida mediante Nalm-6, consistente con la expansión proliferativa del número de célula T (figura 1 5A). En un experimento de curso de tiempo con Nalm-6 transd úcidas en forma estable con l uciferasa de luciérnaga, reveló que la enfermedad está presente en los mismos l ugares (esq ueleto axial , médula ósea femoral , bazo e h ígado) y que un incremento de cuatro registros en la señal bioluminiscente correspondió a una carga de enfermedad en incremento (figuras 17 y 18) . En forma consistente con experimentos previos, existen pocos, si es que hay, CTLs presentes en el compartimento de sangre periferica du rante los 3 d ías iniciales después de la inyección de célula T, con < 10 células T humanas/p L detectadas mediante cuantificación TruCou nt, aunque se detectan grandes n úmeros de células T h umanas en la sangre periférica en puntos de tiempo posteriores. Similarmente, la aparición de Nalm-6 en la sang re periférica es un evento tard ío en este modelo, con los ratones mostrando < 10 células ALL humanas/pL de sangre periférica, hasta un poco antes que los an imales estaban moribundos, normalmente el día 21 (datos no mostrados) . En múltiples repeticiones de este modelo experimental , esto permanece como el descubrimiento consistente , señalando la sensibilidad de bioluminiscencia con respecto a la evaluación tradicional utilizando citometría de flujo para cuantíficar CTLs o ráfagas en la sangre periférica.

Eficacia in vivo de CTLs CAR+ contra ALL C D1 9+ en un modelo de xenomierto Con el objeto de evaluar la eficacia in vivo potencial de los CTLs CAR ARN , los animales fueron tratados como se indicó anteriormente, aunq ue se les proporcionó una sola dosis mayor de células T (2.5 x 107) el Día 7 posterior a la inocu lación del tumor. Se eligió una dosis de 2.5 x 1 07 en lugar de 1 07 células lo q ue hipotetiza q ue, ya q ue la expresión de receptor fue autolimitada a unos cuantos días, la expansión de células conducida por CAR similarmente puede ser limitada y se puede requerir una dosis de celula de partida superior para demostrar la eficacia en una alta carga de tumor. Los modelos preclínicos que utilizan células T CAR+ CD19 transd úcidas en forma estable con retrovirus han utilizado un programa de 3 o 4 inyecciones separadas con 3-4 x 107 cél ulas T totales en modelos sim ilares. (Shaffer, et al, 201 1 , Blood 1 17(16):4304-14; Brentjens et al, 2007, Clin Cáncer Res 1 3(18 Pt l):5426-5435) Sorprendentemente, se observó una reducción de 2 registros de la señal bioluminiscente en tan pronto como 24 horas después de la i nyección , una reducción que fue sostenida con el tiempo (p<0.01 , figura 5A) . La señal de bioluminiscencia se redujo en forma global , sin la evidencia de un depósito para que los CTLs fallen en penetrar (figura 16B) , aunque la señal n unca alcanzó niveles no detectables, lo que indica que no fue completamente despejada. Es de observarse, que los mapas de calor bidimensionales no tienen la capacidad de separar la enfermedad C N S de otros sitios, de modo que se realizaron las imágenes ex vivo del cerebro, cráneo, colu mna y vértebras, las cuales revelaron que C NS parecen no estar implicada en forma significativa en este pu nto de tiempo (Día 5) . Más bien , la base del calvario/cráneo y los cuerpos vertebrales están implicados con leucemia, dando surgimiento a los mapas de calor en la cabeza y espalda del ratón . Esto es consistente con otros reportes de la mig ración temprana de células hematopoyéticas humanas en ratones inmunodeficientes evaluados mediante imágenes ópticas (Kalchenko, et al , 2006, J Biomed Opt 1 1 (5) :050507) .

Los CTLs CAR d irigidos por mesotelina no tuvieron efecto significativo con la carga de la enfermedad bioluminiscente, lo que indica un pequeño efecto xenogeneico o alogeneico no específico. La reducción inicial en la carga de enfermedad es rápida, aunque de vida corta ya que la enfermedad bioluminiscente comienza su rgir a los 4 días de la inyección. El grado de reducción de enfermedad y el retraso subsecuente para alcanzar la carga de enfermedad fatal (>2 x 101 1 p/s/cm2/sr) se correlaciona directamente con la supervivencia. Finalmente, la inyección CTL CAR+ ARN dio como resultado la prolongación sign ificativa (p<0.01 mediante la prueba de clasificación de registro de los datos de supervivencia) de la supervivencia en comparación con animales q uienes no recibieron CTLs y animales de control que recibieron la misma dosis de CTLs CAR+ ARN 2.5 x 1 07 dirigida contra mesotelina de antígeno irrelevante (figu ra 16C) . J untos, estos resultados indican que los CTLs CAR+ ARN exhiben efectos antitumor robustos exterminando en forma específica células objetivo después de la migración y proliferación en ratones con xenomjerto eliminados, avanzados. De manera importante, la supervivencia de los CTLs CAR+ ARN se comparó con la de CTLs CAR generados en forma lentiviral, expresados establemente en el mismo modelo Nalm-6. En este caso, los CTLs CAR fueron generados mediante transducción lentiviral para contener el mismo CAR 1 9-BBz de los CTLs generados mediante ARN . Se inyectaron 107 CTLs de CAR lentivirales el Día 7 despues de Nalm-6, con base en la dosificación determinada previamente. A los ratones se les dio seguimiento como se indicó anteriormente, y la supervivencia promedio no fue diferente entre CAR ARN y los CTLs CAR lentivirales , au nque se observó una supervivencia a largo plazo con los CTLs CAR lentivirales que se expresan en forma persistente (figu ra 5D) .

Tratamiento de leucemia avanzada en ratones con células T diseñadas mediante mARN Los resultados de pruebas cl ínicas recientes ind ican resultados cl ínicos mejorados con CARs introducidos con vectores retrovi rales (Pule, et al, 2008, Nat Med 14(1 1 ): 1264-1 270; Till , et al , 2008, Blood 1 12(6):2261 -2271 ) . Las editoriales recientes han descrito la necesidad de CARs más seg uros (Buning et al, 201 0, Human Gene Therapy 21 (9) : 1039-42 ; Heslop, 2010 , Molecular Therapy 1 8(4):661 -662) . Los datos aq uí descritos, describen el desarrollo de una plataforma que tiene el potencial de incrementar la ventana terapéutica con CARs que contienen dominios de señalización cada vez más potentes. Los descubrimientos aqu í presentados son los primeros en demostrar los efectos terapéuticos de los CTLs CAR+ ARN para leucemia diseminada en un modelo precl ínico.

U n metodo de expresión temporal hace inmunoterapia CAR, tal como transfección de mARN corre en contra de n uestros esfuerzos previos, y los de la mayor parte de los investigadores en el campo. Los datos aq u í descritos son los primeros en indicar que una sola inyección de células T CAR + transfectadas con mARN puede lograr un efecto sistémico, expandiendo y persistiendo lo suficiente in vivo, para migrar a sitios distantes de leucemia diseminada y para retener sus efectos citotóxicos. La expansión conducida con CAR, masiva de las células T se observó du rante el período de expresión CAR. Los resultados de la presente invención demuestran una reducción de 2 registros de la carga leucémica y una supervivencia prolongada en un modelo se xenomjerto ag resivo caracterizado por un rápido injerto de ALL humano. De manera importante, la supervivencia en ratones que contiene una leucemia xenoinjertada administrada como u na inyección simple de CTLs CAR ARN es comparable con la superficie de supervivencia log rada mediante CTLs CAR de lentivirus estables. Los sitios y programación de reincidencia son similares entre estos grupos, aunq ue ún icamente los CARs expresados en forma estable dieron como resultado curaciones a largo plazo (> 180 días) . La supervivencia en el modelo CAR ARN está correlacionada directamente con el g rado de reducción de enfermedad inicial , aunq ue las regiones periodontales y paraespinales permanecen como los primeros sitios de reincidencia en modelos CAR tanto de ARN como lentivirales.

Con el descubrimiento actual con respecto a que la expresión en la superficie de CAR es relativamente independiente de la dosis de mARN, con un IFN-g dependiente de la dosis de mARN en forma relativa y la secreción de citocina IL-2 con el tiempo resultantes, surge la posibilidad de diseñar niveles de expresión para mitigar la liberación de citocina que pueda dar como resultado la toxicidad. Otras toxicidades encontradas con celulas T CAR transdúcidas estable ha sido efectos en objetivo/fuera de los órganos, tal como la disminución esperada de las células B normales después de terapia CAR CD19, o la inducción de toxicidad hepática después de la terapia IX de anhidrasa carbónica (Lamers, et al, 2006, J.Clin Oncol. 24(13):e20-e22). Sin pretender limitarse a teoría en particular, se considera que la administración repetida de CARs ARN puede ser requerida para provocar esta forma de toxicidad. Finalmente, los aspectos con respecto a la introducción lentiviral o retroviral de CARs en CTLs, incluye la posibilidad teórica de transformación maligna a partir de mutagénesis de inserción, un sujeto de observación reguladora significativa incluso para células T maduras (Nienhuis, et al, 2006, Molecular Therapy 13(6): 1031-1049; Bushman, 2007, J Clin Invest 117(8):2083-2086). Ya que no existe integración en el genoma de célula huésped y la expresión CAR está autolimitada , estos aspectos son se evitan potencialmente mediante transfección de mARN . Tambien de manera importante, ya que los CARs expresados por ARN parecen funcionar en forma similar a los CARs expresados en forma estable tanto in vitro como in vivo en modelos animales precl ínicos a corto plazo, esta plataforma proporciona una forma potencialmente más rápida para evaluar las interacciones en el diseño CAR y pueden ser traducidas nuevamente a los sistemas de expresión estable.

Esto reasegura que los datos con los CTLs CAR ARN aquí revisados, muestran todas las propiedades citotóxicas a base de objetivo de sus contrapartes lentivirales (Carpen ito et al, 2009, Proc Nati Acad Sci E . U .A. 106(9) :3360-3365; M ilone, et al , 2009, Mol Ther 1 7(8) : 1453-1464) . Los CTLs CAR ARN exhibieron especificidad de antígeno con habilidad concomitante para mig rar a y expandirse en los sitios de leucemia diseminada después de una inyección IV simple. El tráfico de las CTLs CAR a los sitios de enfermedad es importante para su fu nción anti-tumor, como ha sido demostrado en u n modelo de xenomjerto de cáncer de próstata (Dobrenkov et al , 2008 , J N ucí Med 49(7) : 1 162-1 1 70) , y este trabajo es el primero en demostrar q ue las CTLs CAR ARN C D 1 9 pueden transitar hacia, y funcionar en todos los sitios de leucemia diseminada después de u na sola inyección en la vena de la cola. De manera importante, aqu í se describe que los CARs ARN aún se expresan en altos niveles despues de la circulación y expansión en un tumor que contiene xenomjerto, lo que indica CTLs funcionales a pesar de la internalización de receptor potencial y la dilución de ARN de la proliferación después del enganche de antígeno. Existen varias oportunidades potenciales para terapia CTL CAR ARN . Primero, ofrecen una estrategia potencial para mig ración de toxicidad (expresión autolimitada) q ue no es posible con CARs , expresado en forma estable, con la posible excepción de la incorporación de sistema suicidas con CARs expresados en forma estable (Marktel , et al , 2003 , Blood 101 (4): 1290-1298; Sato, et al . , 2007, Mol.Ther. 1 5(5) :962-970) . Segundo, los CARs de ARN ofrecen el potencial de acelerar el ritmo del desarrollo de CAR, proporcionando una trayectoria flexible y más rápida para la clínica , y permitiendo de esta forma un método interactivo eficiente para optimizar el diseño y la potencia de CAR. El proceso de aprobación reguladora tiene el potencial de ser menos complicado con CARs de ARN que con CARs expresados en forma estable que requ ieren integ ración genómica. El mARN de grado clínico es mucho menos costoso en su prod ucción que los vectores retrovirales o lentivi rales de integ ración , y un poco más costoso q ue el ADN de plásmido que está siendo utilizado en protocolos a base de transposon y transfección (Sing h , et al, 2008, Cáncer Research 68(8):2961 -2971 ; Till , et al , 2008 , Blood 1 12(6):2261 -2271 ). El cómo la efectividad de costo real se desempeñará finalmente , será determinado por el n úmero de celulas T, n úmero de Infusiones y du ración de respuesta-factores aún desconocidos . Finalmente, puede ser atractivo combi nar terapia de “eliminación” CAR ARN , utilizando CARs potentes pero potencialmente tóxicos para inducción de remisión , con terapia de consolidación y mantenimiento utilizando CARs expresados en forma esta ble como u na estrategia para proporcionar células CAR+ de memoria. En síntesis , una plataforma de expresión a corto plazo cuyo desarrollo de describe en la presente invención , proporciona una alternativa para terapia celular, y puede tener la ventaja de ciertas aplicaciones, y con infusiones repetidas con el tiempo pueden ser posible lograr un control de enfermedad a largo plazo o la erradicación de leucemia resistente a tratamiento.

Ejemplo 3: Prueba clínica de células T re-dirigidas autólogas El agente de investigación en este protocolo son las células T autólogas transfectadas con inmu noreceptor de anti-mesotelina q uimérico scFv. Para maximizar la seguridad , la prueba utiliza célu las T electroporadas con el CAR mARN de mesotelina. Se puede generar u n CAR mARN representativo med iante una representación in vitro del plásmido pD-A.ss 1 OF. BBZ.2bg .1 50A (ver figura 19) o pD-A.1 9.0F.2bg .1 50A (ver fig ura 20) . Tal como se describe en cualq uier parte en la presente invención , utilizando el CAR mARN se permite ú nicamente un período de expresión limitado. Si se observan efectos secundarios, se pueden terminar las infusiones de celula T y la toxicidad puede ser abatida rápidamente debido a q ue la expresión del CAR mARN se limita a unos pocos d ías, haciendo de esta forma los efectos secu ndarios más temporales y manejables.

Este protocolo está diseñado para determinar la seguridad de la administración de célula T CAR redirigida por anti-mesotelina autóloga IV. La toxicidad primaria que puede ser anticipada, es que las células T diseñadas pueden causar inflamación, es decir, serositis, en el peritoneo y las superficies de pleura-pericardio debido a la expresión de mesotelina de bajo nivel normal en estas superficies serosas.

Los Materiales y métodos empleados en estos experimentos se describen a continuación Materiales v métodos Plásmido La derivación de la construcción de plásmido final fue un proceso de pasos múltiples q ue comprendió la clonación en plásmidos intermedios. Se utilizaron dos diferentes plásmidos para clonar el fragmento ssl . bbz. El fragmento scFv de mesotelina (ss 1 ) se clonó primero a través del laboratorio del Translational Research Prog ram (Programa de I nvestigación de Traducción) (TRP) de la construcción previamente publicada del Doctor Pastan (Chowd hury et al, 1998). La articulación CD8a humana y el dominio de transmembrana j unto con la secuencia 41BB y CD3C, se clonó mediante PCR a partir del plásmido pELNS.CDI 9-BBz descrito anteriormente (Milone et al, 2009). El fragmento se clonó primero en el vector pGEM.GFP.64A. Este vector se modificó mediante la adición de dos repeticiones de beta globina 3’UTR y 150 pb de secuencia poli A (reemplazando la secuencia 64 poliA en pGEM.GFP.64A) para una expresión de gen incrementada (Holtkamp 2006). El plásmido que cumple con GMP para el uso en clínica fue derivado de la subclonación del fragmento ss1.bbz.2bgUTR.150A de pGEM en el vector pDrive. El vector de clonación pDrive (Qiagen) está diseñado para clonar en forma altamente eficiente los productos PCR a traves de hibridación UA. Esto permite la selección tanto de ampicilina como canamicina de clones recombinantes y viene con los sitios de cebador de secuenciación universal, y los promotores tanto T7 como de SP6 para transcripción in vitro. Primero, se cortó ss1.bbz.2bgUTR.150A del vector pGEM mediante Hind III y Ndel (romo lleno) y se subclonó en el corte pDrive mediante Kpnl y Notl (romo lleno). El inserto con la orientación correcta fue confirmado mediante secuencia para generar pDrive. ss1 bbz.2bgUTR.150A. Se eliminó el gen de resistencia a ampicilina en vectores pDrive mediante digestión doble con Ahdl y BciVI. Para eliminar las proteínas aberrantes potenciales traducidas de los cuadros de lectura abierta internos (ORF) dentro de los ORFs CAR, todos los ORF internos que fueron mayores a 60 pb de tamaño, fueron mutados mediante mutagenesis PCR, aunque el ORF del CAR ss1 se mantuvo intacto. El plásmido resultante fue designado pD-A.ss 1 bbz.OF.2bg.150A.

Transformación bacteriana La construcción pD-A.ss1 bbz.OF.2bg.150A final se introdujo en células E Coli Químicamente Competentes OneShot TOP 10 (Invitrogen) como para CVPF SOP 1188. Se generó un banco de células maestro y las células se probaron para seguridad, pureza e identidad, tal como se describe en TCEF SOP 1190.

Preparación de ADN Hasta 10 mg de AND de plásmido preparado como un lote, fueron generados utilizando el equipo de aislamiento de ADN QIAfilter Plasmid Giga como para SOP 1191, a partir de dos medidas de 1.25 litros de medio LB que contienen 100 mg/ml canamicina. Se linealizaron 1 mg de ADN en un tiempo, con la enzima de restricción Spel durante la noche a una temperatura de 37°C. La linearización se confirmó mediante electroforesis de gel antes de la purificación a gran escala utilizando el equipo Qiagen Plasmid Maxi. Los criterios de liberación para ADN incluyen apariencia, concentración, pureza, esterilidad y conformación de gel para linearización.

Preparación de ARN Para probar la eficiencia de traducción, se generó el ADN de un número de diferentes sistemas comerciales disponibles tal como se describe en cualquier parte en la presente invención . En comparación con los sistemas de cotranscripción , se seleccionó el sistema de mARN mScript debido a que proporciona virtualmente el 100% de taponeo de las transcripciones, el 100% de orientación de tapón adecuada , e incorpora una estructura de refuerzo de traducción de Tapón 1 q ue puede incrementar la eficiencia de traducción . Se proporciona un lote diseñado del Sistema mARN mScript™ acompañado por el Certificado de Análisis del equipo. El ARN puede estar utilizando el eq uipo RNeasy Maxi (Qiagen) . El ARN transcrito ¡n vitro fue crioconservado en alícuotas de 0.5 mL en una concentración de 1 mg/ml_. La calidad y cantidad de ARN fue analizada med iante 1 % de electroforesis de gel de agarosa despues de 1 5 min utos de desnatu ralización a una temperatu ra de 70°C en amortiguador de desnaturalización de mARN (I nvitrogen , Carlsbad , CA) y se cuantificó mediante espectrometría UV (OD260/280). La evaluación de la expresión de transgen de las células T electroporadas con este mARN también se llevó a cabo como parte de la caracterización fu ncional .

Fabricación de Prod ucto de Células T CAR Las T-células CD3+ son enriquecidas a parti r de un producto de leucaféresis mediante disminución de monocitos mediante elutriación centrifuga de contraflujo en el CaridianBCT Elutra, que emplea un conjunto desechable del sistema cerrado de un solo uso . El d ía 0, se inició el proceso de fabricación de celula T con activación con gránulos mag néticos recubiertos con anticuerpo monoclonal anti-CD3/CD28, y la expansión se inició en una bolsa de cultivo de tejido estática. Después de 5 d ías, las células fueron transferidas a un bioreactor WAVE si fue necesario para expansión adicional. Al final del cultivo, las células se disminuyeron de los g ránulos magnéticos, se lavaron y se concentraron utilizando el sistema Haemonetics Cell Saver. Las células pos-recolección se incubaron d urante la noche a u na temperatu ra de 37°C para electroporación la siguiente mañana. Las células se lavaron y resuspendieron en amortig uador Electroporation (Maxcyte) y se cargaron en el ensamble de procesamiento Maxcyte . Las células se electroporaron con el ARN ss 1 , y se dejaron recuperar durante 4 horas y posteriormente se formularon en u n medio de crioconservación infusible.

El n úmero total de células du rante la recolección de las células electroporadas puede utilizarse para calcular las seis dosis que pueden ser crioconservadas. Con un criterio de liberación CD3+ de >80% y un criterio en proceso de viabilidad del >80% antes de la crioconservación y del >70% para el frasco sentinel, a todos los sujetos se les puede administrar la misma cantidad de células T viables y CD3+ +/- 20% . Se pueden tomar muestras al momento de la crioconservación para med ir la expresión CAR utilizando citometría de flujo, sin embargo esta información no está d isponible en tiempo real . Por consig uiente, aunque el porcentaje de celu las positivas, CAR puede ser calculado subsecuentemente y utilizado como un criterio de liberación , el producto final no puede ser normalizado al número de células positivas CAR. Ú nicamente los productos finales que cumplen con los criterios de liberación del ³20% positivos para expresión CAR, y q ue cumplen con otros criterios de liberación tal como se manifiesta en el protocolo, serán administrados.

Adicionalmente, se pueden crioconservar aproximadamente 10 frascos de células T SS 1 y retenerse como frascos sentinel , para llevar a cabo un conteo de viabilidad y coagulación de gel de endotoxina al momento de la primera infusión, y para evaluación de viabilidad en cada infusión subsecuente. Se pueden utilizar los frascos restantes para llevar a cabo los ensayos funcionales “ú nicamente para información (FIO)”. Todas las células crioconservadas se pueden almacenar a u n congelador a u na temperatu ra de £-1 30°C.

La expresión de CAR después de la electroporación es parte de los criterios de liberación para el producto de célula final. Esto se lleva a cabo mediante manchado de la superficie de las células con un IgG anti-ratón de cabra, anticuerpo F(ab')2 (Jackson I mmunoResearch) seg uido de estreptavidina etiquetada con PE (BD Pharmingen) y análisis de citometría de flujo. Los criterios de liberación se ajustan al ³20% de celulas positivas.

Estabilidad de Productos de Células T CAR Las células T CAR ss1 serán crioconservadas 4 horas después de la electroporación , y descongeladas y administradas en u na venta na de 3 meses después de la fabricación de la célula T. Se ha demostrado que la expresión scFv de mesotelina de las células T CAR ss 1 crioconservadas aproximadamente en 30 días en £-1 30°C fue del 97.4% , casi idéntico al tiempo de crioconservación (96.9%), y los otros productos de célula T crioconservados son estables durante al menos 6 meses. La viabilidad después de la descongelación , con base en los conteos de azu l Trypan fue del 75.2% en comparación con el 98.7% . Los datos de expresión sugieren que el producto final es estable d urante almacenamiento para la prueba , y q ue el frasco sentinel para dosis adicionales debe cumplir con criterios de liberación de u na viabilidad al 70% y expresión CAR al ³20% . Los frascos adicionales de células CAR ss 1 serán descongelados a los 3, 6, 9, y 1 2 meses después de la crioconservación , y la viabilidad y expresión de transgen probada para generar los datos de estabilidad del producto adicionales.

Administración IV de célula T CAR La infusión tendrá lugar en u na habitación aislada en el CTRC , utilizando precauciones para pacientes inmunosuprimidos.

Una o dos bolsas de celulas T transfectadas serán transportadas mediante el coord inador del protocolo o enfermera en hielo húmedo procedente de la I nstalación Clínica de Producción de Célula y Vacuna (Clinical Cell and Vaccine Producción Facility) (CVPF) a los Servicios de I nvestigación de Fármacos (I nvestigational Drug Services) (I DS) en el Hospital de U niversidad de Pensilvania (U niversity de Pennsylvania Hospital).

Los I DS se registrarán en el prod ucto de contabilidad, verifican el nombre del paciente y el identificador tal como se proporciona a través del coordinador de la prueba clínica, y se desprende una etiqueta de la etiqueta perforada de 2 partes fijada a la bolsa para mantenerse en los registros I DS. Las células T transfectadas serán transportadas por el coordinador de protocolo o enfermera del I DS a la cama del sujeto en CTRC.

Las células T transfectadas serán descongeladas por un miembro del personal de CVPF en un baño de ag ua a una temperatura de 37°C en la cama del sujeto inmed iatamente después del transporte desde el I DS . Si el prod ucto de célula T CAR parece tener una bolsa dañada o con infiltración , o parece de otra forma comprometido, no debe ser infusionado, y debe ser reg resado a la CVPF tal como se especifica a contin uación .

Las células serán infusionadas al sujeto mientras permanecen en frío a través de una enfermera del CTRC dentro de aproximadamente 1 0 a 15 min utos despues de descongelarse. Las células T transfectadas (en un volumen de ~ 100 m L) serán infusionadas en forma i ntravenosa rápidamente a través de un conjunto para sang re tipo Y libre de látex calibre 18 con una llave de paso de tres vías. La dosificación tend rá lugar mediante infusión por gravedad . Si el rango de infusión med iante gravedad es demasiado lento, el prod ucto de fármaco de célula T transfectada puede ser extraído en una jeringa de 50 mL a través de la llave de paso, e infusionado manualmente en el rango requerido. No debe haber grumos congelados que permanezcan en la bolsa.

Antes de la infusión , dos individuos verificarán independientemente en la información en la etiqueta en cada bolsa en la presencia del sujeto, y confirmarán que la información comdice correctamente con el participante .

Los pacientes serán monitoreados d u rante y después de la infusión de las célu las T transfectadas. Se obtendrán los datos de presión de sang re, frecuencia cardiaca , frecuencia respiratoria y oximetría de pulsación y se registraran inmediatamente antes de la dosificación y cada 1 5 minutos d urante 2 horas después del término de la infusión . Debe estar d isponible u n carrito de emergencia para una situación de emergencia.

Si no ocurren síntomas y los signos vitales del sujeto permanecen normales 3 horas después de la i nfusión , el sujeto será enviado a su casa con instrucciones de reg resar al hospital en caso de que se desarrollen cualquiera síntomas. Si no es estable la medida de un signo vital , continuará obteniendose aproximadamente cada 1 5 min utos hasta que se estabilicen los signos vitales del sujeto, o el médico dé de alta al paciente. Al sujeto se le pedirá no abandonar la instalación hasta q ue el médico considere que es segu ro para él .

A los 60 min utos (± 5 minutos) después del término de la dosificación de célula T CAR transd úcida , se obtendrá una muestra de sangre para una determinación de línea de base del n úmero de célula C I RT trand úcido.

Los sujetos recibirán instrucciones de regresar a la CTRC a las 24 horas para pruebas de sang re y revisión de seguimiento .

Sin pretender limitarse a teoría algu na, se considera que el estudio propuesto debe minimizar los riesgos fatales por d iversas razones: 1 ) no se está utilizando un régimen de linfodismin ución preinfusión ; 2) la transducción de célula T ocurrirá con mARN , no retrovirus, reduciendo de esta forma la persistencia de estas células d u rante varios d ías; 3) la mesotelina tiene expresión nativa limitada para superficies serosas en el pericardio, pleura y cavidades perifonéales. En el caso de reacción cruzada de mesotelina y el proceso inflamatorio que conduce a acumulación de fluidos, estas cavidades pueden ser accesadas en forma rápida y fácil en una forma m ínimamente invasiva para eliminar el fluido conforme se inicia la terapia anti-linfocito (esteroides).

Esta es u na prueba clínica primero en humanos de una n ueva entidad molecular, sin embargo; se han llevado a cabo otras pruebas fase I con celulas T CAR similares. La dosis farmacológicamente efectiva (PED) de las cél ulas T CAR en el xenomjerto de tumor de ratón N O D/S C I D/YC-/- es de 1 x 10 7 células T CAR/ratón . En esta dosis, algunos de los ratones desarrollan enfermedad de injerto xenogeneico versus huésped.

Los pacientes del cohorte 1 (n = 3) reciben u na sola infusión de 1 x 108 utilizando dosificación plana con células T CAR ARN anti-meso el día 0 y una infusión de 1 x 109 de células T CAR ARN el d ía 7, proporcionando a los pacientes el cumplimiento con las evaluaciones de seg u ridad especificadas por el protocolo antes de la infusión del día 7.

A los sujetos del Cohorte 2 (n = 6) se les proporcionan 2 ciclos de célu las T CAR modificadas separadas por una semana para evaluar la toxicidad de la infusión . Un ciclo consiste en 3 infusiones un día s í y un día no (Lunes, Miércoles, Viernes). El ciclo 1 consiste de 3 dosis de 1 x 108 de células T CAR dosificadas e n MWF (día 0, 2 , 4) , y pasando después las evaluaciones de seg uridad , el ciclo 2 consiste de 3 dosis de 1 x 1 09 de células T CAR dosificadas en MWF (día 14 , 16, 18). Si u na circunstancia no prevista evita que comience la infusión el d ía 14 tal como está programado, se puede posponer el ciclo 2 del Cohorte 2 hasta el Día 21 . Los d ías 21 a 35 tambien serán reprogramables de manera correspondiente. Los meses 2 , 3, 6 permanecen iguales.

Los sujetos en el cohorte 1 pueden ser inscritos en el cohorte 2 al final de su período de monitoreo (3 meses después de la última infusión) si satisfacen todos los criterios de inclusión/excreción . Se puede escalonar la inscripción del paciente en los cohortes, de modo q ue no se trata u n nuevo paciente hasta q ue el paciente anterior tal cumple con las evaluaciones de seguridad . Los sujetos pueden ser inscritos en serie con cada sujeto teniendo que completar ambos ciclos de tratamiento después de un período de observación de toxicidad de siete d ías para el cohorte 1 (Día 14) y de u n período de observación de toxicidad de 10 días para el cohorte 2 (Día 28) antes del tratamiento de los pacientes subsecuentes.

En el caso de DLTs , la dosis puede ser escalada hacia abajo 1 0 veces. Por lo tanto, si ocurre la toxicidad du rante el ciclo 1 en 108 células T CAR , entonces todas las infusiones (dosis 1 a 6) podrán ser reducidas a 107 de C I Rs. En el caso de toxicidad inmanejable en las 107 célu las T CAR, se puede detener la prueba .

La dosis objetivo por infusión es de 1 x 1 08 ± 20% células para el primer ciclo (una dosis para el Cohorte 1 y tres dosis para el Cohorte 2) y 1 x 1 0s ±20% células para el segundo ciclo (una dosis para el Cohorte 1 y tres dosis para el Cohorte 2). La dosis mínimamente aceptable es de 1 x 108. Si la expansión de celula total es menor a la dosis de célula aceptable total, el paciente puede pasar por u na segunda aféresis en un intento de expand ir más células y cumplir con la dosis objetivo total. Si no existen contraindicaciones para la segunda aféresis, si la segunda aféresis y la segunda expansión fallan en producir dosis mínimamente aceptables, la dosis será considerada como u na falla de fabricación .

Ejemplo 4: Uso compasivo de células T CAR diseñadas con ARN Este protocolo se diseñó para probar la inyección IV de células T CAR ARN , que son específicas para mesotelina. Después de la determinación de tolerabilidad de hasta 9 inyecciones planeadas mediante ROA IV, el sujeto recibirá u na administración IT de células T CAR ARN x 2. Los ciclos de células T CAR ARN IV y IT serán repetidos como tolerados en intervalos de ~6 a 8 semanas en la ausencia de enfermedad progresiva. El resultado de este paciente gu iará el desarrollo subsecuente de una prueba del protocolo de concepto fase I completamente desarrollada.

La cuestión más importante en el desarrollo de células T CAR para terapia de cáncer es determinar la segu ridad de la ventana terapéutica en este caso el equilibrio de los efectos antitumor potenciales y las serositis que pueden ocu rrir mediante la dirección de mesotelina . Las células T CAR ARN han sido desarrolladas para este propósito , de modo que los efectos antitumor pueden ser observados en dos modelos precl ínicos robustos. El plan de manejo de toxicidad es guiado por el hecho de que en el caso de toxicidad , las celulas T CAR ARN desaparecerán rápidamente de 2 a 3 d ías después de la interrupción de la inyección de célula T CAR. Este estudio piloto de uso, compasivo, determinará la seguridad, tolerabilidad y potencial de injerto de las células T específicas de mesotelina en un paciente con cáncer pancreático metastático . La severidad y factibilidad de las rutas de administración IT y IV, se identificarán en este protocolo. El esquema de protocolo general se muestra en la figura 21 .

El estudio consiste en 1 ) una fase de clasificación , 2) seguimiento durante u na fase de intervención/tratamiento de ~8 semanas que consiste en flebotomía/aféresis, infusión e inyección de células T, biopsia de tumor, y 3) generación de etapa y seguimiento. Se ofrecerán ciclos repetidos de células al sujeto, si la evaluación tiene enfermedad estable o mejor.

A f é resis/fleb otomía El paciente o el donador gemelo tend rán la clasificación de leucaféresis estándar antes del procedimiento. Para células T IT, 1 00 mi de flebotom ía pueden proporcionar suficientes linfocitos para fabricación . Se puede requerir u na aféresis de 7 a 12 litros para la dosis IV de células T con el objeto de recolectar aproximadamente 1 x 1 09 células T o más. Los sujetos con acceso venoso deficiente pueden tener una colocación de cateter temporal para el uso de aféresis. Este catéter será insertado antes de la aféresis y eliminado u na vez que se complete el procedimiento de la aféresis. Las muestras periféricas serán tomadas para inmunoensayos de l ínea de base. Los leucocitos de sangre de línea de base para los requerimientos de recordatorio de FDA y para investigación , también son obtenidos y crioconservados.

Evaluación de pre-invección La semana previa a la dosificación con el agente de estud io, el paciente tendrá un historial de intervalo y revisión física, revisión de medicación concomitante , estado de desempeño ECOG , clasificación AE. Se debe realizar lo siguiente a las 2 semanas antes de la dosificación : EKG y CXR (clasificación de línea de base para serositis) , CBC , química (LFTs) , CEA y CA-19-9.

Preparación v Administración del Fármaco del Estud io Las células T se prepararon en la I nstalación Clínica de Producción de Células y Vacu na (Clinical Cell and Vaccine Prod uction Facility) (CVPF) y no se liberaron hasta que se cumplieron con los criterios de liberación especificada por la FDA para las células infusionadas (por ejemplo, pureza , esterilidad , pirogen icidad celular, etc.).

Administración IV en el Centro de I nvestigación Cl ín ica v de Traducción (Clinical and Translational Research Center (CTRC) Las células T en una o dos bolsas segú n sea adecuado para la dosificación , serán transportadas en paquetes fríos si están frescas, o en hielo seco si están crioconservadas a la cama del sujeto en la CTRC. Las células son administradas mediante infusión intravenosa rápida en u n rango de flujo de aproximadamente 1 0 a 20 mi por min uto a través de u n conj unto para extracción de sang re tipo Y libre de látex de calibre 18 o comparable con una llave de paso de 3 vías . La bolsa será suavemente masajeada hasta que las células ya estén descongeladas. No debe haber grumos congelados en el contenedor. La d u ración de la infusión será de aproximadamente 15 minutos. A cada bolsa de infusión se le fijará una etiq ueta que contiene lo siguiente: “PARA USO Ú N ICAM ENTE AUTÓLOGO/SI NG EN EICO” (FOR AUTOLOGOUS/SYNGENEI C USE ON LY). Además de la etiqueta tendrá al menos dos identificadores ú nicos tales como iniciales, fechas de nacimiento y n úmero de estudio del sujeto. Antes de la infusión , dos individuos verificarán en forma independiente toda esta información en la presencia del sujeto, para confirmar de esta manera que la información corresponde correctamente con el participante. Si el prod ucto de célula T parece tener una bolsa dañada o con filtración , o parece de otra forma comprometida, no deberá ser infusionada.

Estará disponible un equipo de emergencia médica (es decir carrito de emergencia) durante la infusión en caso en que el sujeto tenga una respuesta alérgica o crisis hipotensiva severa, o cualq uier otra reacción a la infusión . Se tomarán los sig nos vitales (temperatu ra, rango de respi ración , pulsación y presión sangu ínea), antes o despues de la infusión, posteriormente cada 15 minutos d urante al menos cada media hora y hasta que estos signos sean satisfactorios y estables . Se proporcionan detalles: Se revisaran las medicaciones concomitante.

Las células T serán transportadas en paquetes fríos desde la I nstalación Clínica de Producción de Célula y Vacu na (Clinical Cell and Vaccine Producción Facility (CVPF) a la cama del paciente.

La infusión tendrá lugar en la CTRC .

Si están congeladas, las célu las T autólogas serán descongeladas en un baño de agua a una temperatura de 37°C en la cama del paciente. Las células son i nfusionadas en aproximadamente 1 0 a 40 minutos después de la descongelación . Las células T (en un volumen de ~50-1 00 mL si están crioconservadas y 100-300 mL si están frescas) serán infusionadas en forma intravenosa en un rango de aproximadamente 10 mL/minuto a través de un conju nto para extracción de sang re Y tipo libre de látex de calibre 18 o eq uivalente con una llave de paso de 3 vías. La dosificación tend rá lugar mediante dosificación por g ravedad . Si el rango de infusión med iante gravedad es demasiado lento, el producto de fármaco de célula T autólogo, puede ser extraído en una jeringa de 50 mL mediante la llave de paso e infusionado manualmente en el rango req uerido .

Se obtendrán la presión sangu ínea, frecuencia cardiaca, frecuencia respiratoria y oximetría de pulsación y se registrarán inmediatamente antes de la dosificación y cada 1 5 minutos du rante 2 horas despues del inicio de la infusión . Estará disponible u n carrito de emergencia para una situación de emergencia.

A los 15 min utos (± 5 minutos) después del término de la dosificación con células T, se obtendrá u na muestra de sangre para una determinación de línea de base del número de células T infusionadas.

Si no ocu rren síntomas y los signos vitales del paciente permanecen normales 1 hora después de la inyección , el paciente será dado de alta. Si no es estable la medida de un signo vital, continuará siendo obtenida aproximadamente cada 1 5 min utos hasta que los signos vitales del paciente se estabilicen , o el médico dé de alta al paciente.

El paciente será admitido para observación durante la noche después de la infusión inicial. Se administran infusiones en una base qod M-W-F, y una vez determi nada la tolerabilidad , entonces el sujeto será infusionado en una base de paciente externo, si es posible, y al sujeto se le darán instrucciones de regresar a las 24 horas para pruebas de sangre y seguimiento de acuerdo con el SOE.

Premedicación Los efectos secundarios despues de las infusiones de célula T incluyen fiebre temporal , escalofríos, fatiga y/o náusea. Se recomienda q ue antes de la infusión el sujeto sea premedicado con acetaminofen 650 mg por la boca y clorhidrato de difenhidramina 25-50 mg por la boca o IV, antes de la infusión de células T. Estas medicaciones pueden ser repetidas cada seis horas seg ún sea necesario. Se puede prescribir un curso de medicación anti-inflamatorio no esteroidal si el paciente continúa teniendo fiebre no aliviada mediante acetaminofen . Se recomienda que el paciente no reciba corticoesteroides sistémicos tales como hidrocortisona, pred nisona, prednisolona (Solu-Medrol) o dexametasona (Decadron) en cualquier momento, excepto en el caso de una emergencia de perder la vida , ya que esto puede tener u n efecto adverso en las células T. si se req uieren corticoesteroides, por una reacción infusional aguda, se recomienda una dosis inicial de hidrocortisona de 100 mg. Para inyección IT, los pacientes no recibirán en forma rutinaria premedicaciones, además de los anestésicos para el dolor de la inyección .

Invecciones de célula T IV Antes de la inyección del agente de estudio, el paciente tend rá un estado desempeño ECOG , clasificación AE, CBC, y LFTs revisados. El objetivo es administrar célu las T tres veces a la semana, es decir, MWF, d urante 3 semanas. Es probable que las complicaciones medicas por intervención o d ías festivos , por ejemplo, puedan alterar el problema ; las infusiones prog ramadas serán ajustadas prn con la meta de 3 inyecciones a la semana según sea tolerado.

El sujeto recibirá infusiones en una habitación aislada. Las células serán descongeladas en la cama del paciente. Las células descongeladas serán proporcionadas en un rango de infusión tan rápido como sea tolerado, de modo q ue la d uración de cada infusión será de aproximadamente 10 a 15 minutos. Con el objeto de facilitar el mezclado, las células se administrarán en forma simultánea, utilizando un adaptador Y. Se obtiene una muestra de sangre para determinación del nivel de célula T de linea de base antes de la infusión y 20 minutos después de la infusión . El sujeto será fusionado y premedicado según sea lo adecuado. Se evaluarán los sig nos vitales del sujeto y se llevará a cabo la oximetría de pulsación antes de la dosificación al final de la infusión y cada 15 minutos posteriormente durante 1 hora y hasta que estén estables. El paciente será hospitalizado du rante la noche después de la primera infusión . Las infusiones posteriores serán administradas en una base de paciente externo según sea permitido . El paciente será instruido de regresar a las oficinas de H UP a las 24 horas para pruebas de sangre y seguimiento.

Las toxicidades específicas que garantizan el retraso de las infusiones de celula T incluyen : 1 ) Pulmonar: Requerimiento de oxígeno suplementario para mantener la saturación a más del 95% o la presencia de anormalidades radiog ráficas en los rayos x de tórax que sean progresivas; 2) Card iacas: N ueva arritmia cardiaca no controlada con manejo médico. 3) Hipotensión que requiere soporte de presor. 4) I nfección Activa: Cultivos de sangre positivos para bacterias, hongos o virus a las 48 horas de la infusión de célula T.

Después de la infusión del agente de estudio, se debe obtener sangre a los ~20 minutos después de la inyección/i nfusión para citocinas y citometría de fl ujo. Se obtendrá suero para med idas de citocinas.

Radiología de intervención (invección IT) invección de célula T v biopsia de tumor Las células T serán inyectadas en las lesiones de tumor utilizando gu ía ultrasónica y otras generaciones de imagen, según lo recomienda la radiolog ía invasiva. El paciente puede ser premedicado con un anxiolítico (por ejemplo, Ativan) o inyectado bajo sedación consciente. El paciente puede tener 2.5 a 5.0 g ramos de crema de lidocaína/prilocaína (EM LA) aplicada en el sitio de inyección de al menos 30 mi nutos antes del procedimiento para anestesia local. El área de la piel que será inyectada será limpiada con betadina , y después, más lidocaína (1 %) será inyectada en la piel y tejidos subcutáneos, y el tumor y área peritumoral infiltrado con las célu las T, intentando inyectar desde los márgenes del tumor hasta las áreas centrales.

Antes de la inyección de celulas T CAR, se obtend rán biopsias de aguja central utilizando una aguja de calibre 16 Ga que sirven como línea de base para la expresión de mesotelina, y los otros parámetros descritos en los pu ntos extremos secundarios. Se debe obtener sangre periférica antes y después de la inyección para citocinas y citometría de flujo.

Las evaluaciones de respuesta de tumor comenzarán a las + 4 y +8 semanas mediante imágenes abdominales (PET/CT, CT o M RI) y posteriormente de acuerdo con las prácticas y cuidados estándar cada 2 meses durante 2 años después de las infusiones de célula T o hasta que el paciente req uiera terapia alternativa para su enfermedad . Se espera q ue la actividad metabólica de las células T pueda obscurecer la interpretación de los escaneos PET, ya que puede ser difícil interpretar la actividad metabólica del tumor a partir de la inflamación activada por las células T.

Terapia de Célula T Adicional En la ausencia de enfermedad prog resiva , se pueden administrar infusiones de células T IT y IV en ciclos continuos de 6 a 8 semanas. En el caso de respuestas inmune humorales para células de T CAR, no contin uarán las inyecciones sistémicas (IV) de células T. Sin embargo, en la ausencia del progreso de la enfermedad , el paciente conti nuará recibiendo mensualmente inyecciones de celula T IT en los sitios de enfermedad activa, según lo tolere.

Los sujetos regresaran el mes 3 y 6 después de la infusión de célula T. En estas visitas de estudio, el sujeto pasará por lo siguiente: revisión física, documentación de eventos adversos y extracciones de sangre para hematología, química, urianálisis, CA-19-9, y laboratorios de investigación.

Ejemplo 5: CAR ARN dirigido mediante GD2 GD2 es un disialogangliósido expresado en tumores con origen neuroectodérmico, incluyendo neuroblastomas y melanomas. La especificidad de tumor de GD2 permite para su uso dirigir CTLs modificados genéticamente que expresan CAR ARN. Los datos presentados en la presente invención demuestran que los CTLs electroporados con ARN IVT que codifican un CAR que comprenden un GD2 scFv (en donde scFv enlaza a GD2) detectan y tratan efectivamente los tumores que expresan GD2.

Se utilizaron vectores pGEM-64A para crear vectores IVT GD2-BBZ. Se utilizó PCR de traslape para generar pGEM-GD2-8TMBBZ, pGEM-G D2- 28TMBBZ y pGEM-GD2-ZTMBBZ, utilizando un vector lentiviral que contiene GD2-zeta CAR que proporciona una articulación GD2 scFv y IgG y pD-A.cMet.OF.8TMBBZ que proporciona 4-1BB-zeta (figura 21). Cada transmembrana fue introducida mediante cebadores PCR. El ARN IVT producidos con estos vectores, comprende cada uno un dominio de enlace de antígeno GD2 scFv, así como dominio de señalización intracelular 4-IBB y CD3-zeta. Además, se produjeron tres diferentes vectores, cada uno diferente en la identidad del dominio de transmembrana. Por lo tanto, los CARs ARN GD2 comprendieron ya sea un dominio de transmembrana CD8, un dominio de transmembrana CD28, o un dominio de transmembrana CD3-zeta.

Se transcribió ARN GD2-8TMBBZ (que contiene el dominio de transmembrana CD8) a partir de una secuencia de nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 10. Se transcribió GD2-28TMBBZ (que contiene la región de transmembrana CD28) a partir de la secuencia de nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 11. Se transcribió GD2-ZTMBBZ (que contiene el dominio de transmembrana CD3-zeta) a partir de una secuencia de nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 12.

Se utilizó citometría de flujo para determinar la expresión de superficie de las diversas composiciones CAR GD2 un día despues de la electroporación . Tal como se muestra en la figura 22, GD2-8TMBBZ y G D2-28TM B BZ se expresaron en alto nivel en células electroporadas.

Para revisar la función de las células T CAR ARN GD2, se llevó a cabo un ensayo CD107a en las células T electroporadas. Las células T se electroporaron con diferente ARN CAR GD2 tal como se indica (utilizando un CAR CD19 como un control) y se cultivaron en conjunto ya sea con una línea de tumor positiva GD2 (SY5Y) o un control negativo (NLFwt). Se detectó la activación de CD107a mediante citometría de flujo en un ensayo de cultivo de 4 horas, tal como se describe en otras partes de la presente invención. La figura 23 demuestra la activación de CD 107a en celulas electroporadas CAR ARN GD2, lo que indica el reconocimiento objetivo.

Las células electroporadas también se evaluaron para secreción IFN-gamma después de un cocultivo con diversas líneas de célula de tumor. Las células T electroporadas con diferente ARN CAR GD2 tal como se indica (utilizando un CAR CD19 como un control) se cocultivaron con la línea de tumor positivo GD2 (SY5Y), y el control negativo (NLFwt). El sobrenadante se recolectó mediante 24 horas después del cocultivo y se sometió a ensayo E LISA para detección de la secreción IFN-gamma. La figura 24 ilustra que las células electroporadas CAR ARN GD2, pero no las células electroporadas con CAR CD19 o células no electroporadas, secretaron IFN-gamma después de la incubación con tumores que expresan GD2.

Con el objeto de eliminar los cuadros de lectura abierta internos (ORFs) que existieron dentro de la construcción GD2-8TMBBZ, se utilizó PCR de traslape para generar pD-A.GD2.0F.8TMBBZ. Se utilizó pGEM-GD2-8TMBBZ como una plantilla y el producto PCR se subclonó en un vector pD-A de pD-A.19OF.2bgUTR.150A. Se eliminaron dos ORFs internos mediante mutaciones PCR de los codones ATG sin producir un cambio en el ORF CARD (figura 25). El cuadro de lectura abierta interno libre de GD2.0F.8TMBBZ se transcribió a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 13 Para evaluar la efectividad de CARs ARN GD2 para tratar in vivo tumores que expresan GD2, se llevó a cabo un estudio animal utilizando ratones inyectados con celulas de neuroblastoma SY5Y, modificadas para expresar luciferasa. Las células T se electroporaron con ARN elaborado de pD-A GD2.OF.8TMBBZ.2bg. 150A. Este vector comprende dos repeticiones de una 3’ UTRderivada de beta-globulina y una cola poli(A) que comprende bases 150 A. El vector pD-A.GD2 OF.8TMBBZ.2bg. 150A comprende una secuencia de nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 28. La figura 26 ilustra la línea de tiempo del estudio, en donde los tumores fueron inyectados 8 días antes de la primera administración de las células T electroporadas (células T ARN 5M). Las dosis subsecuentes de células T electroporadas se administraron en forma intravenosa el día 14 (células T ARN 14M) y el día 16 (células T ARN 16M). Se llevó a cabo la imagen de bioluminiscencia (BLI) a través del curso de tiempo del estudio, tal como se ilustra.

La cuantificación de la cantidad del neuroblastoma que expresa GD2 en ratones inyectados con tumor se ilustra en la figura 27. Los ratones inyectados con celulas T electroporadas con ARN CAR G D2 demostraron disminución de la carga de tumor en comparación con las electroporadas con ARN CAR C D 19 y las tratadas únicamente con PBS . La fig ura 28 proporciona mapas de calor de las células de tumor en ratones tratados con CAR ARN G D2 y CAR ARN CD 19, lo que demuestra tumores reducidos en los animales tratados con CAR ARN G D2. olo 6: CAR ARN diriqido con cMet cMet es una tirosina qumasa receptora encontrada en numerosos tipos de cánceres, incluyendo carcinoma de célula no peq ueña (NSCLC), carcinomas gástricos, de ovario, pancreáticos, de tiroides, de mama , de cabeza y cuello, de colon y de riñón. Por lo tanto, tal como aqu í se presenta, la capacidad de desarrollar CARs ARN IVT q ue dirijan cMet, puede probar utilidad para tratar una variedad de formas de cáncer.

Primero se revisó la expresión cMet en una variedad de líneas de tumor. La expresión cMet de diferentes líneas celulares se detectó mediante citometría de flujo utilizando anticuerpo anti-cMet (HG F R Anti-H umano/c-M ET Fluorescein MAb , R&D System). Tal como se ilustra en la figu ra 29 , las l íneas de célula de tumor K562-cMet, L55, SK-OV3 y OV79 expresan todas hasta cierto g rado cMet, y por lo tanto se pueden utilizar en experimentos para revisar la actividad funcional de los CARs ARN cMet.

Con base en las pruebas de clasificación in icial , los CARs cMet ARN con diferentes regiones de transmembrana (TM) (regiones TM de CD8, CD28 o 4-1BB) y con ORF interno libre (cMet.OF) (figura 30), fueron generados mediante PCR de traslape y subclonados en un vector a base de pDrive reemplazando CD19.OF.BBZ de pD-A.19OF.BBZ.2bgUTR.150A con cMet.OF. BBZs. Los CARs ARN cMet aquí construidos y probados son: cMet.OF. 8TM.BBZ, cMet.OF.28TMBBZ, cMet.OF. BBTMBBZ, cMet.28TM28BBZ y cMet.28Z. Por lo tanto, las construcciones aquí descritas todas contienen un dominio de enlace de antígeno scFv dirigido por cMet, y al menos uno de los dominios intracelulares CD28, 4-1BB y CD3-zeta. cMet.OF.8TMBBZ se transcribe a partir de una secuencia de nucleótido que comprende SEQ ID NO: 14. cMet.OF.28TM BBZ se transcribe a partir de una secuencia de nucleótido que comprende SEQ ID NO: 15. cMet.OF. BBTMBBZ se transcribe a partir de una secuencia de nucleótido que comprende SEQ ID NO: 16. cMet.28TM28BBZ se transcribe a partir de una secuencia de nucleótido que comprende SEQ ID NO: 17. cMet.28Z se transcribe a partir de una secuencia de nucleótido que comprende SEQ ID NO: 18.

La funcionalidad de las diversas formas de CAR ARN cMET se evaluó en un ensayo CD107a. Las celulas T electroporadas con diferente ARN CAR cMet tal como se indica en la figura 31 (utilizando CD19 CAR, CD19.0F BBZ como un control) se cocultivaron con líneas de tumor positivo cMet, L55 y SL-OV3, y K562-CD19 de control negativo. Se detectó la activación de CD107a mediante citometría de flujo en un ensayo de cultivo de 4 horas (figura 31 A). La figura 31B muestra el nivel de expresión CAR 24 horas despues de la electroporación.

También se revisó la producción IFN-gamma y la secreción mediante células T electroporadas con CAR ARN cMet después de un cocultivo con diferentes líneas celulares. Las células T electroporadas con diferentes ARN CAR cMet, tal como se indica en la figura 32 (utilizando un CD19 CAR, 19BBZ como un control), se cultivaron junto con líneas de tumor positivas cMet, L55 y SL-OV3, y el control negativo K562-CD19. El sobrenadante se recolectó 24 horas después del cocultivo y se sometió a ensayo ELISA para secreción IFN-gamma (figura 32A). Con base tanto en la expresión de transgen como en la función de células T electroporadas ARN CAR cMet, se eligió pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR.1 50A (la construcción se muestra en la figura 32B) para experimento en animales y pruebas clínicas potenciales. Este vector comprende dos repeticiones de una 3’ UTRderivada de una beta-globulina humana y una cola poli(A) que comprende bases 150 A. El vector pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR. 150A comprende una secuencia de nucleótidos que comprende la SEQ ID NO: 27. Se transcribió CAR cMet.OF.8TMBBZ a partir de una secuencia de nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 14, y comprende un dominio de enlace de antígeno cMet scFv, una región de transmembrana CD8, un dominio de señalización intracelular 4-1BB y un dominio de señalización CD3-zeta.

Para el siguiente grupo de experimentos, se utilizó cMet.OF.8TMBBZ como el CAR ARN cMET. Se evaluaron las líneas de celula de tumor de melanoma adicionales con respecto a su expresión de superficie de cMet (figura 33). Las células se mancharon con Ab anti-cMet conjugado con PE o Ab IgG de Isotipo, lo que mostró que las líneas de célula SK-OV3, 888me1, 624me1 y 526me1 todas expresan cMet, mientras que la línea K562 no lo hizo.

La expresión CAR del CAR ARN cMet.OF.8TMBBZ se evaluó mediante citometría de flujo. El día 10 las células T estimuladas fueron electroporadas ya sea con ARN CAR CD19 o ARN CAR cMet, o no fueron electroporadas (No EP). Después de cultivo durante la noche, se detectó la expresión CAR CD19 o CAR cMet mediante citometría de flujo, lo que muestra que las células T electroporadas con cMet.OF.8TMBBZ tuvieron expresión CAR substancial (figura 34).

Posteriormente, se llevó a cabo un ensayo CD107a para revisar la actividad funcional del CAR ARN cMet.OF.8TMBBZ cuando se cultivaron junto con una variedad de líneas de célula de tumor. Las células T electroporadas con ARN fueron estimuladas con una línea de célula de tumor, incluyendo líneas de melanoma CD19+ Nalm6, cMet+ SK-OV3 y cMet+ (888me1, 624me1 y 526me1). Se utilizó K562 como un control CD19- y cMet-. Despues de 4 horas de estimulación, se monitoreó la expresión CD107a mediante citometría de flujo. Las células fueron sincronizadas con CD8 + . Tal como se muestra en la figura 35, CD107a se activó en todas las condiciones de las células T CAR ARN cMet electroporadas cultivadas junto con una línea de célula de tumor cMet+.

Se evaluó la producción IFN-gamma y la secreción mediante células T electroporadas CAR ARN cMet cultivadas junto con diversas líneas de tumor. Las células T electroporadas ARN CAR cMet.OF.8TMBBZ se estimularon con una línea de célula de tumor, que incluye líneas de melanoma CD19+ Nalm6, cMet+ SK-OV3 y cMet+ (888me1, 624me1 y 526me1). Se utilizó K562 como un control CD19- y cMet-. Después de 24 horas de estimulación, se ensayó la producción IFN-gamma mediante ELISA. Tal como se ilustra en la figura 36, se incrementó la secreción IFN-gamma en todas las condiciones de células T electroporadas CAR ARN cMet cultivadas junto con una línea de célula de tumor cMet+.

Posteriormente, se diseñó un estudio en animales y se llevó a cabo para evaluar la efectividad de tratar tumores cMet+ in vivo con CARs ARN cMet. La figura 37 proporciona el diseño de estudio en donde se implantaron células de tumor SKOV3-Luc en forma subcutánea el día 0, y se administraron células T electroporadas ARN CAR cMet.OF.8TMBBZ en forma ¡ntratumoral en las semanas 7, 9 y 11. Además, los animales fueron tratados con Citoxan 24 horas antes de cada administración de celula T.

La cuantificación y la carga de tumor, tal como se mide mediante la multiplicación del cambio de flujo total , se ilustra en la figura 38. Se muestra que la carga de tumor se disminuye en ratones tratados con CAR ARN cMet + Citoxan . Estos datos demuestran q ue los CARs ARN dirigidos a cMet son efectivos para tratar tumores cMet+ .

DIO 7 : T ratamiento de CAR ARN v Citoxan Con base en múltiples experimentos de tratamiento de tumor en animales con CARs ARN , se descubrió que unos pocos d ías después del tratamiento, las células T de ARN tanto lenti-CD 19z como CD 19 ARN mostraron eficacia de tratamiento similar. Aunque las célula T CAR ARN CD 19 mostró una carga de tumor significativamente menor q ue las células T de control , o los ratones tratados con solución salina (B LI inferior 1 o 2 registros), no despejan el tumor en forma tan efectiva como los CARs CD 19 que codifican lentivirus (figu ra 39). Las inyecciones de células T adicionales (la segunda y la tercera) no parecen agregar cualquier beneficio de tratamiento adicional, en comparación con los ratones tratados con células T Lenti-CD 19Z, lo cual muestra una represión de tumor contin ua (figura 39). La eficacia de tratamiento de múltiples inyecciones de células T se puede comparar con los experimentos anteriores utilizando una sola dosis de inyección de células T, lo que indica que la carencia de eficacia de tratamiento de las células T reinyectadas observada, puede ser debido a la preexistencia de células T no funcionales expandidas desde la primera inyección de célula T. Tal como aquí se presenta, se revisa si la ablación de dichas células T no funcionales, antes de las nuevas inyecciones de células T, mejora el tratamiento de múltiples inyecciones de células T CAR ARN.

Para experimentos iniciales, se electroporaron células T con uno de: CD19-Z, CD19-BBZ, CD19-28z y CD 19-28BBZ. Las células T electroporadas con SS1-BBz se utilizaron como un control. Se transcribió CD19-Z a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 19. Se transcribió CD19-BBZ a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 7. Se transcribió CD19-28z a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 20. Se transcribió CD19-28BBz a partir de una secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 21.

El día 5 posterior a la inyección Nalm-6-Luc en ratones NSG, se inyectaron 107 células T electroporadas con ARN (iv). Siete días después de la primera inyección de célula T, se administró quimioterapia (Citoxan; CYTX, 80mg/kg) (ip) para extirpar las T preexistentes. Un día después de la quimio, se administra la segunda inyección de 107 células T. Se administró Citoxan (CYTX, 50mg/kg) un día antes de la tercera y cuarta inyecciones de células T. Los ratones tratados con solución salina o solución salina + quimio se utilizaron como controles. Se generaron imágenes de los ratones y se desangraron semanalmente para monitorear las cargas de tu mor y celula T. La fig ura 40 demuestra q ue los tratamientos con qu imioterapia CYTX incrementan la reducción de tumor transmitida por infusiones repetidas de CARs ARN dirigidas con CD 19. La figura 41 ilustra la supervivencia general de animales en los d iversos grupos de tratamiento, lo cual muestra que las infusiones repetidas de células T CAR ARN únicamente prolongan la supervivencia cuando se combinan con u na reducción de la infusión previa a base de Citoxan .

En los sig uientes experimentos, se utilizaron ratones con Leucemia Primaria-CBG/NSG de 5 d ías. A los 5 d ías de la administración de las célu las de u na l ínea de célula de leucemia primaria modificada para expresar el gen verde de escarabajo Limuniscus (CBG) , se inyectaron (iv) 1 07 células T electroporadas ARN . Siete d ías después de la primera inyección de células T, se proporcionó quimioterapia (Citoxan , 60mg/kg) (ip) para extirpar las células T preexistentes. Un día después de la quimio, se administró una segunda inyección de 107 células T. Se administró el Citoxan u n d ía antes de las terceras inyecciones de cél ula T. Se generaron imágenes de los ratones y se desangraron semanalmente para monitorear las cargas de tumor y célula T. Se utilizaron los siguientes grupos de tratamiento: vector.19.28BBZ, IVT ARN lentivi ral , 19.28BBZ CO (secuencia de ADN CAR CD 19-28BBZ optimizada por codón), IVT ARN 19.28BBZ LL (se mutó el motivo de dileucina C D28), IVT ARN 1 9.28BBZ wt (CD28 con motivo de d ileucina) , Vector Lentiviral 1 9BBZ, IVT ARN 19BBZ CO (secuencia de ADN CAR CD 19-BBZ optimizada por codón), se transcribió IVT ARN 1 9BBZ wt. 19.28BBZ CO a partir de una secuencia de n ucleótidos que comprende la SEQ I D NO : 22. Se transcribió 1 9.28BBZ LL a partir de una secuencia de n ucleótidos que comprende la SEQ I D NO : 23. Se transcribió 19BBZ CO a partir de u na secuencia de nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 24.

Las celulas T electroporadas con IVT ARN ssI BBZ se utilizaron como un control . Se llevaron a cabo múltiples inyecciones de célula T ú nicamente en grupos de tratamiento con células T electroporadas de ARN (sin células T transducidas lentivirales). La figura 42 ilustra la carga de tumor en las primeras tres semanas del estudio, lo que muestra que el efecto de Citoxan se repitió y que la carga de tumor disminuyó en forma ad icional cuando se combinaron dosificaciones múltiples de CARs ARN con Citoxan . La figu ra 43 ilustra el porcentaje de supervivencia de an imales tratados.

La figu ra 44 ilustra mapas de calor de animales en cada grupo de tratamiento el d ía 10, 5 d ías después de u na sola inyección de 107 células T CAR, en tanto que la figura 45 ilustra mapas de calor de animales en cada g rupo de tratamiento el d ía 21 , 7 d ías despues del tratamiento con Citoxan y una segunda inyección de 107 células (segunda inyección ún icamente en g rupos CAR ARN) . Los mapas de calor demuestran q ue el tratamiento combinado de Citoxan y las m últiples inyección CAR ARN reducen las células de tumor en forma similar a los tratamientos CAR lentivirales.

El siguiente estudio revisó diferentes estrategias de dosificación de la cantidad de células T administradas en las múltiples inyecciones. Se utilizaron ratones Nalm-6-Luc/NSG de siete d ías. El d ía 7 después de la administración de células de leucemia, se inyectaron células T electroporadas con ARN en d iferentes dosis (iv). Siete días después de la primera inyección de célula T, se administró quimioterapia (Citoxan, 60mg/kg) (ip) para extirpar las células T preexistentes. Un día después de la quimio , se administró la segunda inyección de cél ulas T. Se aplicó Citoxan un d ía antes de la tercera inyección de células T. Se generaron imágenes de los ratones y se desangraron semanalmente para monitorear las cargas de tu mor y célula T. Se utilizaron los siguientes g rupos de tratamiento: Lentiviral vector-C D 1 9BBZ - 10e6/ratón ; CD 19BBZ ARN , ratones 10e6 para las 3 inyecciones; ARN CD 19BBZ, primera inyección -20e6/ratón , segunda y tercera - 10e6/ratón ; ARN CD 19BBZ, primera inyección - 20e6/ratón , seg unda y tercera - 5e6/ratón ; ARN C D19BBZ, 10e6/ratón para las 3 inyecciones - sin Citoxan ; ARN CD1 9BBZ, primera inyección - 20e6/ratón , segunda y tercera - 1 0e6/ratón - sin Citoxan . Las células T electroporadas con ARN ss I BBZ - primera inyección : 20e6/ratón , segunda y tercera - 10e6/ratón se utilizó como un control. La figura 46 ilustra la carga de tumor de animales en cada grupo de tratamiento las primeras 3 semanas del estudio. Los datos aquí presentados demuestran que los animales q ue reciben múltiples inyecciones de célula T CAR ARN CD 19-BBz combinado con Citoxan , tuvieron menos carga de tumor que los que reciben múltiples inyecciones solamente de células T CAR ARN CD 19-BBz.

La figura 47 proporciona mapas de calor de an imales en cada grupo de tratamiento el d ía 22 del estudio. Se puede apreciar que la quimioterapia, tal como se proporciona mediante Citoxan es vital en la eliminación de tumores en ratones tratados con múltiples inyecciones de CAR ARN . La figura 48 proporciona mapas de calor adicionales de animales a lo largo del curso de tiempo del estudio, lo que muestra la reducción sostenida de tumores en los grupos 20-5-5 y 20-1 0-10, cuando se combinan con tratamientos de Citoxan .

El porcentaje de supervivencia , tal como se ilustra en las fig uras 49 y 50, muestran nuevamente que Citoxan incrementa el tratamiento conferido mediante múltiples inyecciones de células T CAR ARN . Estos resultados muestran que un régimen de CAR ARN de dosis altas (20-5-5) con tratamientos Citoxan da como resultado aproximadamente el 40% de supervivencia en aproximadamente 75 d ías despues de la inducción de leucemia, mientras que todos los grupos de tratamiento que no incluyeron Citoxan tuvieron una supervivencia del 0% a los 65 d ías posteriores. Los datos aqu í presentados demuestran q ue la q uimioterapia incrementa d rásticamente el tratamiento y la reducción de tumor conferida por los CAR ARN .

La descripción de cada patente, solicitud de patente y publicación aquí mencionada está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia. Aunque la presente invención ha sido descrita con referencia a modalidades específicas, se podrá apreciar que los expertos en la téenica podrán considerar otras modalidades y variaciones de la presente invención , sin apartarse de la esencia y alcance real de la presente invención . Las reivindicaciones adjuntas están proyectadas para incluir todas de d ichas variaciones de modalidades y equ ivalentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un ARN transcrito in vitro o ARN sintético que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, una región de señalización coestimuladora y un dominio de señalización de CD3-zeta.

2. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el dominio extracelular comprende una porción de enlace de antígeno.

3. El ARN de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la porción de enlace de antígeno enlaza a un antígeno de tumor.

4. El ARN de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el antígeno de tumor es un antígeno asociado con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, melanoma metastático, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma de no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer uterino y cualquier combinación de los mismos.

5. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.ss1 OF.BBZ.2bg.150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4.

6. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.

7. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.19 OF.2bg.150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5.

8. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

9. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg. 1 50A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 28.

10. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

11. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR. 150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 27.

12. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

13. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la región de señalización coestimuladora comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza específicamente con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

14. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende una cola poli(A) que comprende aproximadamente 150 bases de adenosina.

15. El ARN de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende una 3’UTRque comprende al menos una repetición de una 3’UTRderivada de beta-globulina humana.

16. Una célula T que comprende un ARN transcrito in vitro o un ARN sintético en donde el ARN comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, una región de señalización coestimuladora y un dominio de señalización de CD3-zeta.

17. La celula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el dominio extracelular comprende una porción de enlace de antígeno.

18. La célula T de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la porción de enlace de antígeno, enlaza a un antígeno de tumor.

19. La célula T de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el antígeno de tumor es un antígeno asociado con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer de hígado, cáncer de riñón, linfoma, leucemia, cáncer de pulmón, melanoma, melanoma metastático, mesotelioma, neuroblastoma, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de piel, timoma, sarcoma, linfoma de no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, cáncer uterino y cualquier combinación de los mismos.

20. La célula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.ss1 OF.BBZ.2bg.150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4.

21. La celula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.

22. La célula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.19.0 F.2bg .150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5.

23. La célula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

24. La célula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.GD2.0F.8TMBBZ.2bg.1 50A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 28.

25. La célula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

26. La célula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD- A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR. 150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 27.

27. La celula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

28. La célula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la región de señalización coestimuladora comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1 ), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza específicamente con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

29. La célula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende una cola poli(A) que comprende aproximadamente 150 bases de adenosina.

30. La célula T de acuerdo con la reivindicación 16, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende una 3’UTRque comprende al menos una repetición de una 3’ UTRderivada de beta-globulina humana.

31. Un método para generar una población de células T d iseñadas con ARN que expresan temporalmente ARN exógeno, en donde el metodo comprende introducir u n ARN transcrito in vitro o ARN sintético en una célu la T, en donde el ARN comprende u na secuencia de ácido n ucleico q ue codifica un dominio extracelular, un dominio de transmembrana , u na región de señalización coestimuladora y un dominio de señalización de C D3-zeta.

32. El método de acuerdo con la reivindicación 31 , en donde el domin io extracelular comprende una porción de enlace de antígeno.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 32 , en donde la porción de enlace de antígeno enlaza a u n antígeno de tumor.

34. El método de acuerdo con la reivindicación 33, en donde el antígeno de tumor es un antígeno asociado con un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de vejiga , cáncer de mama , cáncer cervical , cáncer colorrectal, cáncer de h ígado, cáncer de riñón , linfoma, leucemia, cáncer de pulmón , melanoma , melanoma metastático, mesotelioma, neuroblastoma , cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer pancreático, cáncer renal , cáncer de piel , timoma , sarcoma, linfoma de no Hodgkin , linfoma de Hodgkin , cáncer uterino y cualquier combinación de los mismos.

35. El método de acuerdo con la reivindicación 31 , en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4.

36. El metodo de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.

37. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.19.0 F.2bg .150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5.

38. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

39. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg. 150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 28.

40. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

41. El metodo de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD- A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR. 150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 27.

42. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

43. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la región de señalización coestimuladora comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1 ), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza específicamente con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

44. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende una cola poli(A) que comprende aproximadamente 150 bases de adenosina.

45. El método de acuerdo con la reivindicación 31, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende una 3’UTRque comprende al menos una repetición de una 3’ UTRderivada de beta-globulina h umana.

46. U n metodo para tratar a un paciente con cáncer, en donde el método comprende administrar al paciente una célula T diseñadas para expresar temporalmente ARN exógeno, en donde el ARN comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio extracelular, un dominio de transmembrana, una región de señalización coestimuladora y un dominio de señalización CD3-zeta.

47. El método de acuerdo con la reivind icación 46 , en donde el dominio extracelular comprende una porción de enlace de antígeno.

48. El método de acuerdo con la reivindicación 47, en donde la porción de enlace de antígeno enlaza a un antígeno de tumor.

49. El método de acuerdo con la reivindicación 48 , en donde el antígeno de tumor es un antígeno asociado con un cáncer seleccionado del g rupo que consiste en cáncer de cerebro, cáncer de vejiga , cáncer de mama , cáncer cervical, cáncer colorrectal , cáncer de h ígado , cáncer de riñón , linfoma, leucemia, cáncer de pulmón , melanoma, melanoma metastático, mesotelioma , neuroblastoma , cáncer de ovario, cáncer de próstata , cáncer pancreático, cáncer renal , cáncer de piel , timoma , sarcoma , linfoma de no Hodgkin , linfoma de Hodgkin , cáncer uterino y cualquier combinación de los mismos.

50. El metodo de acuerdo con la reivindicación 46, que comprende repetir la administración de una célula T.

51. El método de acuerdo con la reivindicación 46, que comprende administrar un agente quimioterapéutico al paciente.

52. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.ss1.OF.BBZ.2bg.150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4.

53. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 8.

54. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.19.0F.2bg.150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 5.

55. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24.

56. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD-A.GD2.OF.8TMBBZ.2bg. 150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 28.

57. El metodo de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 13.

58. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el ARN se transcribe de un vector de transcripción in vitro, en donde el vector es pD- A.cMet.OF.8TMBBZ.2bgUTR. 150A, en donde el vector comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 27.

59. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde el ADN del cual se transcribe el ARN comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18.

60. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde la región de señalización coestimuladora comprende el dominio intracelular de una molécula coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB, 0X40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, antígeno-1 asociado con función de linfocito (LFA-1 ), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, un ligando que enlaza específicamente con CD83, y cualquier combinación de los mismos.

61 . El metodo de acuerdo con la reivindicación 46, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende una cola poli(A) que comprende aproximadamente 1 50 bases de adenosina.

62. El método de acuerdo con la reivind icación 46 , en donde la secuencia de ácido nucleico comprende u na 3’UTRque comprende al menos una repetición de una 3’ UTRderivada de beta-globulina h umana. RES UM EN La presente invención se refiere a composiciones y metodos para generar células T transfectadas con Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) de ARN . Las células T diseñadas con ARN se pueden utilizar en terapia adoptada para tratar cáncer.