MX2014002880A - Biocatalizador de celula completa en la degradacion de biomasa celulosica. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con microorganismos los cuales presentan celulasas en su superficie. Los microorganismos correspondientes se producen con la ayuda de los plásmidos correspondientes los cuales codifican una sección que comprende un péptido señal, una celulasa heteráloga, un sitio de reconocimiento de proteasa opcional, un enlazante transmembranal y un dominio transportador de un autotransportador o una variante del mismo. Los microorganismos ventajosamente se utilizan en la conversión de celulosa en celobiosa y/o glucosa. También es posible recuperar los microorganismos de la mezcla de reacción después de la conversión a través de sustratos sencillos. Además, una combinación de varios microorganismos, los cuales están poblados con exocelulasas, endocelulasas y beta-glucosidasas se utilizan para producir glucosa a partir de celulosa o madera.

Description

BIOCATALIZADOR DE CELULA COMPLETA EN LA DEGRADACION DE BIO ASA CELULOSICA DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se relaciona con una molécula de ácido nucleico que comprende los siguientes componentes: (1) una sección la cual codifica para un pép ido señal, (2) una sección la cual codifica para una celulasa heteróloga, (3) una sección opcional la cual codifica para un sitio de reconocimiento de proteasa, (4) una sección la cual codifica para un enlazante transmembranal , y (5) una sección la cual codifica para un dominio transportador de un autotransportador o de una variante del mismo.

Los aspectos adicionales de la presente invención se relacionan con polipéptidos los cuales son codificados por una molécula ácido nucleico como se describe en lo anterior, microorganismos los cuales presentan los polipéptidos correspondientes en su superficie y fracciones de membrana que se pueden obtener de estos microorganismos. La presente invención también se relaciona con un método para la producción de productos de reacción, en particular de productos de reacción de celulosa utilizando microorganismos o fracciones de membrana y también el uso de microorganismos y/o preparaciones de membrana para producir productos a partir de una reacción la cual es catalizada por una celulasa.

No. de Ref . :247342 Las celulasas son enzimas las cuales pueden degradar celulosa en su unidad básica, beta-glucosa. Las celulasas se forman únicamente a partir de una parte pequeña de los organismos que degradan plantas tales como por ejemplo, bacterias especiales y flagelados y partir de microorganismos que degradan madera tales como hongos. Con la ayuda de estas enzimas los microorganismos correspondientes son capaces de dividir y reciclar metabólreamente celulosa, la cual normalmente también consiste de 3000 a 15,000 moléculas de glucosa, en productos de degradación y finalmente en glucosa. Las celulasas incluyen, en particular, tres tipos de enzimas cuyos efectos combinados permiten una digestión racional de las moléculas de celulosa: 1. Endocelulasas (clase de enzima, EC 3.2.1.4): Estas enzimas dividen celulosa en secciones más grandes y, a diferencia de otras celulasas, también funcionan dentro de cadenas de celulosa. En particular, las endocelulasas se pueden volver activas en "regiones amorfas" en las cuales las moléculas de celulosa están desordenadas unas en relación con otras. Como un resultado de esto, las enzimas generan un número más grande de extremos de cadena . 2. Exocelulasas (EC 3.2.1.91): estas enzimas únicamente dividen celulosa de sus extremos mientras continuamente acortan las cadenas de celulosa. La reacción de las exocelulasas típicamente provocan unidades celobiosa (disacáridos) , pero también glucosa, celotriosa o celultetraosa para separar por división a partir de la cadena de celulosa. 3. Celobiosa o beta-glucosidasa (EC 3.2.1.21): Este grupo de enzimas divide el enlace beta-glucosídico entre dos moléculas de glucosa de la celobiosa y de esta manera vuelve disponible la glucosa para procesos metabólicos adicionales.

Cada una de las tres enzimas mencionadas es capaz de atacar la biomasa celulósica por sí misma. No obstante, se supone que una combinación de los tipos de enzima se comporta sinergísticamente en un alto grado dado que atacan diferentes unidades estructurales naturales de la biomasa celulósica.

En particular, cuando se utiliza celobioasa se puede esperar que la degradación de las celobiosas, celotriosas y otros celooligosacá idos superiores proporcionados por las endocelulasas y exocelulasas en glucosa genera un desplazamiento del equilibrio de las reacciones catalizadas enzimáticamente y de esta manera alienta una conversión más eficaz.

La celulosa y hemicelulosa son componentes principales de la madera y muchas plantas y de esta manera representan una materia prima disponible libremente. Un problema con la conversión del material, no obstente, se encuentra en la dificultad de separarlo, por ejemplo en glucosa, el cual representa un obstáculo para su uso extenso en la obtención de bioetanol.

En el estado de la técnica, actualmente están presentes algunas enzimas purificadas que se utilizan para descomponer celulosa en glucosa las cuales generalmente deben ser aisladas de cultivos micóticos tales como Trichoderma reesei o C. acetobulyticuna (cf. Shah et al., Ap . Biochem. Biotech. (1991), vol . 18/29, 99 - 106). La purificación de las enzimas individuales y el mezclado de una combinación de enzimas eficaz antes del uso en la descomposición de biomasa celulósica representa un factor de costo significativo en el estado de la técnica actual. También es imposible en el estado de la técnica recuperar las enzimas libres correspondientes del producto obtenido. Por lo tanto, existe la necesidad de una forma de elaboración fácil de celulasas la cual, en primer lugar, permita una manufactura y procesos de mezclado simplificados y en segundo lugar permita que las enzimas sean recuperadas conforme son utilizadas, de una manera sencilla.

Un problema de la presente invención por lo tanto se encuentra en suministrar un agente con una actividad de celulasa, por lo que el agente no es accesible fácilmente para moléculas de sustrato pero también puede ser amplificada, reciclada y regenerada de una manera sencilla. Esto habilitaría varias etapas de catalizador sin la necesidad de fabricar repetidamente agente nuevo. Un problema adicional de la presente invención se encuentra en proporcionar un agente que presente propiedades favorables respecto a su genética, termoestabilidad, susceptibilidad a almacenamiento y estabilidad.

Los inventores han descubierto, sorprendentemente, que mediante el uso de un sistema autotransportador, las celulasas se pueden expresar en la superficie de microorganismos y son suficientemente estables con respecto a las condiciones de reacción para la división de celulosa y la separación posterior de los productos obtenidos. Sorprendentemente también se ha encontrado que los microorganismos los cuales transportan las celulasas correspondientes en su superficie pueden ser incubadas y permanecer estables en diversas soluciones y amortiguadores bajo condiciones variables durante un período prolongado.

La autopresentación representa una herramienta elegante para presentar proteínas recombinantes sobre la superficie de las bacterias. Este sistema de expresión se basa en el mecanismo de secreción de la familia de proteínas de los autotransportadores, los cuales pertenecen al sistema de secreción tipo V.

En bacterias gramnegativas , la vía autotransportadora se conforma tanto del transporte de proteínas a la superficie celular así como la secreción de proteínas en el espacio extracelular (José y Meyer, 2007) . Las proteínas autotransportadoras son sintetizadas como proteínas precursoras, las cuales satisfacen todos los requerimientos estructurales para el transporte a la superficie celular (José, 2006) . Son sintetizadas con un péptido señal N-terminal, el cual es típico para la vía Sec, la cual habilita el cruce de la membrana interna. Una vez en el periplasma, la parte C-terminal del precursor, después de dividir el péptido señal, se pliega a sí misma en la membrana exterior como una estructura similar a poro conocida como un beta-barril. El dominio pasajero unido N-terminal es trasladado a través de este poro a la superficie (José et al., 2002) . Aquí se puede separar por división -ya sea autoproteolíticamente o por una proteasa adicional- o permanecer anclado a la envoltura de la célula por medio del dominio transportador.

La sustitución del pasajero natural por una proteína recombinante genera la translocación a la superficie de la misma. Para hacer esto, se deben utilizar procesos de ingeniería genética para construir un precursor artificial que consiste de un péptido señal, el pasajero recombinante, el beta-barril y una región enlazante entre las mismas, la cual es necesaria para acceso irrestricto a la superficie. El autotransportador AIDA-I ya se ha utilizado con éxito de esta manera para una presentación eficiente en superficie de diversos dominios pasajeros (Henderson efc al., 2004) . En el sistema de autopresentación, se ha observado una autoasociación de subunidades sobre una enzima activa, por ejemplo, en la enzima dimérica sorbitol-deshidrogenasa (José, 2002; José and von Schwichow, 2004) .

En particular, la tecnología de autopresentacion es un método de expresión para proteínas específicas en la superficie de la membrana exterior de E. coli y otras bacterias gramnegativas con un sistema de autopresentacion que se basa en el mecanismo de secreción natural de las proteínas autotransportadoras (A. Banerjee et al. (2002)). En este caso, el transporte de la proteína pasajera recombinante se puede llevar a cabo simplemente al insertar su secuencia codificante en el marco de lectura, o su secuencia codificante entre el péptido señal y el dominio de translocación del vector de autopresentacion utilizando técnicas de ingeniería genética comunes. El péptido señal se puede obtener de una subunidad de la toxina del cólera y se puede combinar con un promotor artificial. En consecuencia, la proteína pasajera destinada para translocación a través de la membrana exterior se expresa como proteína de fusión recombinante con otra proteína, conocida como un autotransportador, sobre la membrana exterior de E. coli (AIDA-I) (José, 2006) . La porción C-terminal de la proteína autotransportadora forma una estructura similar a poro (ß-barril) dentro de la membrana exterior de la membrana de E. coli (José, 1995, 2006, 2007) .

El concepto del sistema de autopresentacion, descrito por primera vez por José et al. (1995), se ha conocido durante más de 15 años. Mientras tanto, se ha demostrado que se puede utilizar para producir células con nitrilasas inmovilizadas en el mismo (véase WO 2011/057820) y enzimas activas redox las que a su vez generan factores redox, en particular NAD/NADH y NADP/NADPH (véase WO 2012/025628) , los cuales muestran la actividad deseada. No obstante, la transferencia del sistema de autopresentacion a una clase de enzima nueva aún representa retos considerables para las personas expertas en el ámbito, especialmente puesto que no se garantiza una naturalización correcta de las proteínas, en ausencia de los chaperones, los cuales algunas veces son necesarios. Hasta ahora, el estado de la técnica no ha descrito ni sugerido el uso del sistema autotransportador para la inmovilización de celulasas.

El problema de la presente invención se resuelve por la materia objeto de las reivindicaciones independientes. Se pueden derivar modalidades preferidas a partir de las reivindicaciones dependientes.

El problema de la presente invención se resuelve de acuerdo con un primer aspecto por una molécula de ácido nucleico que comprende: (1) una sección que codifica para un péptido señal, (2) una sección que codifica para una celulasa eteróloga o una variante de la misma, (3) una sección opcional que codifica para un sitio de reconocimiento de proteasa, (4) una sección que codifica para un enlazante transmembrana1 , y (5) una sección que codifica para un dominio transportador de un autotransportador o una variante del mismo.

Los aspectos adicionales de la presente invención se relacionan con proteínas y polipéptidos , obtenibles por transcripción de las moléculas de ácido nucleico correspondientes y microorganismos que contienen las proteínas correspondientes y preparaciones de membrana asequibles a partir de estos microorganismos. Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un método para producir un producto de reacción utilizando por lo menos una celulasa, que comprende las siguientes etapas: (i) preparación de por lo menos un microorganismo, el cual presenta una célula en su superficie y/o una preparación de membrana de este microorganismo, y (ii) poner en contacto por lo menos un microorganismo y/o una preparación de membrana con uno o más sustratos de celulasa bajo condiciones compatibles con la actividad de celulasa.

Finalmente, la presente invención también se relaciona con el uso de microorganismos o preparaciones de membrana descritas para fabricar productos de reacción los cuales se pueden producir a partir de catálisis de celulasa y también métodos para la producción de microorganismos y preparaciones de membrana correspondientes.

En una modalidad preferida de la presente invención, la molécula de ácido nucleico se enlaza funcionalmente con una secuencia para regulación de expresión. En una modalidad preferida, el término "secuencia para regulación de expresión", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de ácido nucleico la cual puede regular el nivel de expresión de una molécula de ácido nucleico, preferiblemente corriente abajo de la secuencia para regulación de expresión. La secuencia para regulación de expresión puede ser, por ejemplo, un promotor. Las personas expertas en el ámbito están familiarizadas con secuencias adecuadas para regulación de expresión y métodos para el enlace funcional de estas secuencias con una molécula de ácido nucleico. En relación con la presente invención, las secuencias de regulación de expresión se prefieren especialmente las cuales codifican para reguladores de expresión los cuales pueden ser activados con la ayuda de los inductores isopropiltioglucopiranósido (IPTG) o arabinosa, en particular L-arabinosa.

En una modalidad preferida de la presente invención, la molécula de ácido nucleico es parte de un plásmido recombinante .

En una modalidad preferida de la presente invención, el término "heterólogo" , como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico la cual se ha construido utilizando métodos de ingeniería genética, por ejemplo, mediante empalme de una secuencia para regulación de expresión y una secuencia que se va a expresar, la cual normalmente no se encuentra bajo el control de esta secuencia para regulación de expresión o mediante el uso de una secuencia la cual tiene una mutación puntual a partir de la secuencia original. De esta manera, incluso si solo una sección de una construcción se describe como heteróloga, por lo tanto implica que la construcción completa es heteróloga. Las personas expertas en el ámbito están familiarizadas con los métodos de ingeniería genética. En una modalidad preferida adicional, el término "heterólogo" como se utiliza en la presente se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para un polipéptido la cual está empalmada a una secuencia para regulación de expresión y/o una secuencia fusionada, la cual se deriva de un organismo diferente de la secuencia para regulación de expresión que se va a expresar. En una modalidad preferida adicional, el término "heterólogo", como se utiliza en la presente en relación con un polipéptido de celulasa significa que la sección de la molécula de ácido nucleico la cual codifica para la celulasa, se ha obtenido o se ha tomado de un organismo diferente que por lo menos una sección adicional, de manera que el dominio a transportador o la secuencia para regulación de expresión o el enlazante transmembranal . Por ejemplo, la celulasa es heteróloga si se ha obtenido de Bacillus subtilis, pero todas las demás secuencias se han obtenido de E. coli. En una modalidad preferida adicional, el término "heterólogo" , como se utiliza en la presente, significa que la secuencia de ácido nucleico descrita como heteróloga se ha derivado de un organismo el cual es diferente del hospedador u hospedador destinado o utilizado para expresar o amplificar esta secuencia de ácido nucleico.

En una modalidad preferida especialmente, la molécula de ácido nucleico comprende las secuencias SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 3 o SEC ID NO : 5 o variantes de las mismas.

En una modalidad de la presente invención, el término "péptido señal", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de aminoácidos, preferiblemente en la parte N-terminal de un polipéptido, con el efecto de que el polipéptido, cuando se expresa en el citosol de una célula hospedadora, es sometido a translocación a un compartimiento específico de la célula, preferiblemente un compartimiento diferente del citosol. En una modalidad preferida especialmente, la célula hospedadora es una bacteria gramnegativa y el péptido señal provoca que el polipéptido naciente o completado sea sometido a translocación en el periplasma de la membrana exterior de la célula de la bacteria gramnegativa.

En una modalidad preferida adicional de la presente invención, el término "sitio de reconocimiento de proteasa", como se utiliza en la presente, se refiere a un patrón de secuencia de aminoácidos específico en un polipéptido, en donde este patrón de secuencia se reconoce específicamente por la proteasa de manera que se une y escinde al polipéptido.

Dentro del alcance de la presente invención, también se prefiere si el término "enlazante transmembranal " , como se utiliza en la presente, se refiere a una sección de polipéptido flexible la cual se utiliza para enlazar el dominio autotransportador con el polipéptido regenerador de factor redox, pero es suficientemente flexible para habilitar una naturalización independiente y/o transporte del polipéptido de regeneración de factor redox.

En una modalidad preferida de la presente invención, el término "dominio transportador de un autotransportador" se refiere a un dominio el cual puede ser utilizado para obtener el producto de expresión de una molécula de ácido nucleico, si se sintetiza ribosómicamente dentro de la célula, preferiblemente en el citoplasma bacteriano y es sometido a translocación a la membrana exterior de la célula, preferiblemente al lado de la membrana exterior que está expuesto al ambiente extracelular . En una modalidad especialmente preferida, el dominio transportador tiene el efecto de que el producto de expresión se localiza sobre la superficie externa de la membrana exterior. En una modalidad preferida de la presente invención, el dominio transportador de un autotransportador es una proteína que se localiza sobre la membrana exterior de la célula y la sección que codifica para una celulasa es parte de un dominio, bucle o alguna otra parte del dominio transportador o se fusiona al mismo de manera que la celulasa se presenta sobre la superficie de la célula. En una modalidad preferida adicional de la presente invención, el dominio transportador de un autotransportador es una proteína de un sistema el cual puede ser utilizado para presentar polipéptidos sobre la superficie de una célula.

En una modalidad preferida, las variantes de aminoácidos o secuencias de ácido nucleico a las que se hace referencia en la presente solicitud de manera explícita, por ejemplo por el nombre o el número de deposición o incluso por el término "variante de" o, de manera implícita, por ejemplo por una descripción de su función en el contexto de la presente invención. En una modalidad preferida, el término "variante" como se utiliza en la presente comprende un aminoácido o secuencias de ácido nucleico que son 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 ó 99% idénticas al aminoácido que sirve como referencia y, bajo condiciones comparables, muestra actividad de celulasa similar. En una modalidad preferida, el término "variante" comprende, con respecto a una secuencia de aminoácidos, aquellas secuencias de aminoácidos que tienen uno o más cambios de aminoácidos conservadores en relación a la secuencia de referencia. En una modalidad preferida, los términos "variantes" de una secuencia de aminoácidos o secuencia de ácido nucleico comprenden secciones activas y/o fragmentos de la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico. En una modalidad preferida, el término "sección activa", como se utiliza en la presente, se refiere a una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico que es más corta que la secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico de longitud completa pero que aún retiene por lo menos parte de su actividad biológica esencial, por ejemplo, como una celulasa. En una modalidad preferida, el término "variante" de un ácido nucleico comprende los ácidos nucleicos de la cadena complementaria los cuales - preferiblemente bajo condiciones rigurosas - hibridizan con el ácido nucleico de referencia. La rigurosidad de las reacciones de hibridación se puede determinar fácilmente por una persona experta en el ámbito y habitualmente es un cálculo empírico, como una función de la longitud de la sonda, la temperatura de lavado y la concentración de sal. En general, sondas más largas requieren mayores temperaturas para una asociación perfecta mientras que sondas más cortas requieren temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para renaturalización, cuando las cadenas complementarias están en un ambiente que tiene una temperatura por debajo del punto de fusión de las cadenas. Cuanto mayor es el grado de homología deseado entre la sonda y una secuencia hibridizable mayor es la temperatura relativa que se puede aplicar. Por lo tanto, se deduce que temperaturas relativas superiores tienden a volver las condiciones de reación más rigurosas, mientras que temperaturas más bajas reducen esta rigurosidad. Los detalles adicionales de una explicación de la rigurosidad de las reacciones de hibridación se puede encontrar en Ausubel et al. (1995). En otra modalidad preferida el término "variante" de un ácido nucleico o aminoácido se refiere a un ácido nucleico o aminoácido que tiene, por lo menos hasta cierto grado, la misma actividad biológica y/o función que el ácido nucleico o aminoácido de referencia. En una modalidad preferida, el término "variante" de una secuencia de ácido nucleico, como se utiliza en la presente, se refiere a otra secuencia de ácido nucleico la cual codifica para una secuencia de aminoácidos que es similar a la secuencia de aminoácidos de referencia.

En una modalidad preferida, el término "celulasa" se refiere a una enzima de la clase EC 3.2.1.4, EC 3.2.1.91 o EC 3.2.1.21. En una modalidad preferida adicional la celulasa es una celulasa de Bacillus subtilís o Clostridium thermocellu . La celulasa puede ser una endo- , exo- o exocelulasa o una beta-glucosidasa . Dentro del alcance de la presente invención, no obstante, es preferible si es una endocelulasa de Bacillus subtilis, una exocelulasa de Clostridíum thermocellum o una beta-glucosidasa de Clostrídium thermocellum. Es especialmente preferible si es una enzima con una secuencia de acuerdo con la SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 4 o SEC ID NO: 6 o una variante de la misma.

Preferiblemente, la celulasa se fusiona con un dominio transportador de un autotransportador.

El dominio transportador del autotransportador de acuerdo con la invención puede ser cualquier dominio transportador de un autotransportador y preferiblemente es capaz de formar una estructura de ß-barril. Una descripción extensa de las estructuras de ß-barril y los ejmplos preferidos para autotransportadores de ß-barril se describen en WO 97/35022 y forman parte de la presente descripción como referencia. Henderson et al. (2004) describe proteínas autotransportadoras con dominios autotransportadores adecuados (un resumen se puede encontrar en la Tabla 1 en Henderson et al., 2004). La descripción de Henderson et al. (2004) forma parte de la presente descripción como referencia. Por ejemplo, el dominio transportador del autotransportador se puede seleccionar de: Ssp (P09489, S. mareescens) , Ssp-hl (BAA33455, S. marcescens) , Ssp-H2 (BAA11383, S. marcescens), PspA (BAA36466, P. fluorescens) , PspB (BAA36467, P. fluorescens) , Ssal (AAA80490. P. haemolytica) , SphBl (CAC44081, B. pertussis) , AspA/NalP (AA 71715, N. meningitidis) , VacA (Q48247, H. pylori) , AIDA-I (Q03155, E. coli) , IcsA (AAA26547, S. flexneri), MisL (AAD16954, S. entérica), TihA (AAD41751, E. coli) , Ag43 (P39180. E. coli) , ShdA (AAD25110. S. entérica), Au A (CAB89117, IV. meningitidis), Tsh (154632, E. coli), SepA (CAC05786, S. flexneri), EspC (AAC44731, E. coli), EspP (CAA66144, E. coli), Pet (AAC26634, E. coli), Pie (AAD23953, E. coli), SigA (AAF67320, S. flexneri), Sat (AAG30168, E. coli), Vat (AAO21903, E. coli), EpeA (AAL18821, E. coli), EatA (AA017297, E. coli), EspI (CAC39286, E. coli), EaaA (AAF63237, E. coli), EaaC (AAF63038, E. coli) , Pertactina (P14283, B. pertussis) , BrkA (AAA51646, B. pertussis) , Tef (AAQ82668, B. Pertussis) , Vag8 (AAC31247, B. pertussis) , PmpD (084818, C. trachomatis) , Pmp20 (Q9Z812, C. pneumoi-iae) , Pmp21 (Q9Z6U5, C. pneumoniae) , proteasa IgAl (NP_283693, N. meningitidis) , App (CAC14670. iV. meningitidis) , proteasa IgAl (P45386, H. influenzae) , Hap (P45387, íí. influenzae) , rOmpA (P15921, R. rickettsii) , rOmpB (Q53047, R. rickettsii) , ApeE (AAC38796, S. entérica) , EstA (AAB61674, P. aeruginosa) , Lip-1 (P40601, X. luminiscens) , McaP (AAP97134, M. catarrhalis) , BabA (AAC38081, H. pylori) , SabA (AAD06240. H. pylori) , AlpA (CAB05386, H. pylori) , Aae (AAP21063, A . actinomyeetem-comitans) , NanB (AAG35309, P. haemolytica) y variantes de estos autotransportadores . Para cada uno de los ejemplos de proteínas autotransportadoras , los ejemplos, de los números de acceso y especies adecuados de GenBank, para los cuales se pueden obtener autotransportadores se proporcionan entre paréntesis. Dentro del ámbito de la presente invención, el dominio transportador en el autotransportador preferiblemente se selecciona del grupo que comprende Ssp, Ssp-hl, Ssp-h2, PspA, PspB, Ssal, SphBl, AspA/NalP, VacA, AIDA-I, IcsA, MisL, TibA, Ag43, ShdA, AutA, Tsh, SepA, EspC, EspP, Pet, Pie, SigA, Sat, Vat, EpeA, EatA, EspI, EaaA, EaaC, Pertactina, BrkA, Tef, Vag8 , PmpD, Pmp20, Pmp21, proteasa AgAl, App, Hap, rOmpA, rOmpB, ApeE, EstA, Lip-1, McaP, BabA, SabA, AlpA, Aae, NanB y variantes de los mismos. En una modalidad preferida especialmente, el dominio transportador es un dominio transportador del sistema de autopresentación, también denominado como una vía autotransportadora del tipo AIDA-I de células bacterias gramnegativas , en particular de E. coli o una variante del mismo, por ejemplo, los descritos por Niewert et al. (2001) .

Las variantes de las secuencias autotransportadoras mencionadas en lo anterior se pueden obtener, por ejemplo, al alterar la secuencia de aminoácidos en las estructuras de bucle del ß-barril que no pertenezcan a las secciones transmembranales . Opcionalmente, los ácidos nucleicos que codifican para los bucles de superficie se pueden suprimir por completo. Además, se pueden realizar intercambios de aminoácidos conservadores dentro de las estructuras de lámina plegada ß antipáticas, es decir, intercambio de un aminoácido hidrofílico por otro aminoácido hidrofílico y/o intercambio de un aminoácido hidrofobico por otro aminoácido hidrofobico. Preferiblemente, a nivel de aminoácidos una variante tiene una identidad de secuencia de por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95% o por lo menos 98% con la secuencia correspondiente que se encuentre de modo natural del dominio autotransportador, especialmente en la región de estructuras de láminas plegadas ß.

Como se describe en lo anterior, el problema de la presente invención se resuelve, en un aspecto, por un microorganismo el cual expresa un polipéptido en su superficie, como se describe en lo anterior o que ha sido transformado utilizando una molécula de ácido nucleico como se describe en lo anterior.

En una modalidad preferida, el término "microorganismo", el cual se utiliza de manera intercambiable con el término "célula hospedadora" , como se utiliza en la presente, se refiere a un microorganismo el cual es capaz de expresar un polipéptido. Este microorganismo también se puede denominar como un "catalizador de célula completa" o "biocatalizador de célula completa" . En otra modalidad preferida, la célula o célula hospedadora es una célula procariótica , preferiblemente una célula bacteriana gramnegativa, de manera muy especial preferiblemente una célula de E. coli. En otra modalidad preferida, la célula es una célula eucariótica. En otra modalidad preferida la célula o célula hospedadora es una espora de una procariota.

Una célula bacteriana comprende un número de compartimientos los cuales están separados entre sí por membranas hidrofóbicas . Una célula bacteriana grampositiva tiene una membrana plasmática la cual delimita el citosol, el interior de la célula. La membrana plasmática está rodeada por una capa de péptidoglucano . En contraste, la bacteria gramnegativa posee, además de la membrana plasmática, otra membrana conocida como la membrana exterior. El término "superficie", como se utiliza en la presente, prefriblemente se refiere a una capa del microorganismo que está expuesto al ambiente, en donde el ambiente es, por ejemplo, el medio de cultivo líquido utilizado como un cultivo para la célula de interés. En una modalidad preferida muy especialmente, un polipéptido de acuerdo con la presente invención se expresa en el exterior de la membrana exterior y una célula bacteriana gramnegativa. En una modalidad preferida, un polipéptido de acuerdo con la presente invención se expresa en el interior de la membrana exterior de una célula bacteriana gramnega iva. En otra modalidad preferida, el polipéptido de acuerdo con la invención se expresa en el exterior de un esferoplasto, el cual es una célula bacteriana gramnegativa a partir de la cual se ha separado la membrana exterior. La persona experta en el ámbito estará familiarizada con métodos que se pueden utilizara producir esferoplastos . En otra modalidad preferida, el polipéptido de acuerdo con la invención se expresa en el exterior de una célula bacteriana grampositiva . De esta manera, como se utilizan en la presente, los términos "presentado en la superficie" y "expresado en la superficie" son sinónimos.

De acuerdo con un aspecto adicional, el problema de la presente invención se resuelve por una fracción de membrana la cual se puede obtener a partir de la célula de acuerdo con el aspecto previo de la presente invención.

En una modalidad preferida de la presente invención, la fracción de membrana o la preparación de membrana, los dos términos se utilizan de manera intercambiable, comprende una celulasa de acuerdo con el primer aspecto de la invención, preferiblemente en un estado catalíticamente activo. Los términos "fracción de membrana" y "preparación de membrana", como se utilizan en la presente, de manera preferible se refieren a un producto que está enriquecido en constituyentes de membrana, preferiblemente constituyentes de la membrana exterior de una bacteria gramnegativa . Una persona experta en el ámbito está familiarizada con protocolos y métodos que se pueden utilizar para producir preparaciones de membrana. Por ejemplo, las células bacterianas se pueden recolectar a partir de un cultivo y se pueden enviar a lisis, por ejemplo, por ciclos de congelamiento y recalentamiento, irradiación acústica, suspensión en amortiguador de lisis o similar, seguido por centrifugación diferencial, con el fin de aislar fracciones de membrana de las células. En una modalidad preferida de la presente invención, la preparación de membrana es una preparación de la membrana exterior, es decir, una preparación en la cual existe enriquecimiento de los constituyentes de la membrana exterior en relación a los constituyentes de otras membranas y compartimientos, tales como el citosol, la membrana interior y el periplasma. Las personas expertas en el ámbito están f miliarizadas con protocolos y métodos que se pueden utilizar para aislar o enriquecer la membrana exterior o constituyentes de la misma, por ejemplo un tratamiento de lisozima de células bacterianas, seguido por etapas de centrifugación. En una modalidad preferida, la fracción de membrana puede ser tratada como una fracción de membrana, es decir, el contenido o las propiedades de la fracción de membrana se han modificado, por ejemplo al purificar un constituyentes proteínico de la fracción de membrana o al solubilizar las fracciones de membrana y/o al tomar constituyentes de la fracción de membrana en vesículas. En una modalidad preferida de la presente invención, la fracción de membrana se puede inmovilizar - por ejemplo en la superficie de un vaso o una columna.

De acuerdo con un aspecto adicional, el problema de la presente invención se resuelve por un método para producir un producto de reacción utilizando o por lo menos una celulasa, que comprende las siguientes etapas: (i) preparación de por lo menos un microorganismo el cual presenta una celulasa en su superficie, y/o una preparación de membrana de este microorganismo, y (ii) poner en contacto por lo menos un microorganismo y/o preparación de membrana con uno o más sustratos de celulasa bajo condiciones compatibles con actividad de celulasa. La expresión "presentada" se debe entender, en relación con la presente invención, que significa que la celulasa se proyecta al medio circundante del microorganismo o los microorganismos.

El método de acuerdo con la invención puede ser aplicado venta osamente de manera especial si el producto de la reacción catalizada por la celulasa es un mono-, di- u oligosacárido y si por lo menos un sustrato de celulasa es una fuente de polisacárido, especialmente de manera preferible una fuente de celulosa. Los términos "fuente de polisacárido" y "fuente de celulosa" debe entenderse que significa que los materiales que contienen polisacáridos o celulosa, preferiblemente como componente principal, no necesariamente consisten únicamente de los mismos. Si la fuente de celulosa es celulosa, dependiendo de la celulasa utilizada, se pueden obtener los productos resultantes de glucosa, celulosa y oligosacáridos basados en glucosa.

Además, el método de acuerdo con la invención ventajosamente se puede aplicar adicionalmente si se incluye una etapa (iii) de recuperación del microorganismo utilizado en la etapa (ii) . La recuperación se puede realizar, por ejemplo, por separación mediante centrifugación de las células de la mezcla de reacción.

Dentro del alcance de la presente invención ha surgido que la etapa (ii) preferiblemente se puede llevar a cabo en un intervalo de pH de 4.5 a 6.5, de manera especialmente preferible en un intervalo de 5.5 a 6.5. Las celulasas presentan su actividad más alta para los valores de pH correspondientes. Además, también se ha demostrado útil seleccionar la temperatura durante la etapa (ii) en el intervalo de 30 a 80°C, preferiblemente en el intervalo de 50 a 65°C, puesto que las celulasas presentan el nivel más alto de actividad en este intervalo de temperatura.

En los métodos descritos en lo anterior, si se han utilizado celulasas las cuales no producen glucosa como producto final, puede ser útil convertir los productos producidos a glucosa puesto que en presencia de volúmenes más grandes de celobiosa, la actividad de las enzimas se puede deteriorar. Dentro del alcance de la presente invención, la adición de glucosidasas en la etapa (ii) del método descrito en lo anterior por lo tanto es lo que se prefiere. Estas glucosidasas ventajosamente no son enzimas unidas a microorganismos, de manera especialmente preferible estas son beta-glucosidasa de almendras.

Cualquiera de los polisacáridos se puede utilizar como una fuente de polisacáridos los cuales son el producto de descomposición de celulasa. Dentro del alcance de la presente invención, no obstante, se ha vuelto evidente que es es especialmente ventajoso si una fuente de celulosa se utiliza como una fuente de polisacáridos. La fuente de celulosa puede ser ya sea celulosa purificada con solo porciones pequeñas de sustancias extrañas (preferiblemente en el intervalo de menos de 80% en peso, en particular en el intervalo de menos de 90% en peso) . En particular, puede ser agua de desperdicio comunal, la cual se puede utilizar directamente o a partir de la cual se puede recuperar celulosa utilizando métodos conocidos y después se puede convertir con uno o varios microorganismos. De igual manera, el agua de desperdicio que contiene celulosa de trabajos de pulpa de madera o molinos de papel se puede utilizar como la fuente de celulosa. No obstante, también es posible utilizar una fuente de celulosa la cual contenga contaminantes tales como, por ejemplo, madera la cual pueda haber sido pretratada. La madera ventajosamente puede ser madera que se selecciona de pino, alerce, picea, haya, eucalipto, abeto, álamo, pino, haya, roble, fresno, castaño, abedul, cerezo, arce o nogal. Una madera preferida dentro del alcance de la invención es madera de álamo. De manera alternativa, no obstante, los restos de plantas anuales que contengan celulosa, por ejemplo, paja se pueden utilizar en el método de acuerdo con la invención como una fuente de polisacáridos . La madera o restos de planta correspondientes pueden ser pretratados, por ejemplo, para eliminar cualquier hemicelulosa que puedan contener. No obstante, la fuente de polisacáridos puede contener cantidades significativas de lignina, también es posible utilizar madera o residuos de planta los cuales contengan hemicelulosa.

En el método de acuerdo con la invención, un tipo de microorganismos los cuales presentan una clase específica de celulasas en su superficie se puede utilizar, pero también es posible utilizar una mezcla de microorganismos la cual presenta diversas clases de celulasas en su superficie. Es preferible si se utiliza, en el método, por lo menos una mezcla de por lo menos una endo- y por lo menos una exocelulasa, de manera especialmente preferible una mezcla de por lo menos una endo- y por lo menos una exocelulasa y por lo menos una beta-glucosidasa . En una modalidad preferida especialmente, la relación de microorganismos modificados en endo- respecto a exocelulasa es 25:75 a 75:25 y de manera más especial preferiblemente 25:75 a 40:60, la mezcla está libre de microorganismos modificados por beta-glucosidasa. En otra modalidad preferida, el método utiliza una mezcla de endo- y exocelulasa y microorganismos modificados en beta-glucosidasa, la cual de manera preferible especialmente está presente en una relación de aproximadamente 1:2:1. La endocelulasa preferiblemente incluye una secuencia peptídica SEC ID NO: 2. La exocelulasa, independientemente de esto, preferiblemente incluye una secuencia peptídica SEC ID NO: 4. La beta-glucosidasa, independientemente de esto, preferiblemente incluye una secuencia peptídica de la SEC ID NO: 6.

Uh aspecto adicional de la presente invención se relaciona con el uso de microorganismos, como se describe en lo anterior o fracciones de membrana, como también se describe en lo anterior, para elaborar un producto de una reacción la cual es catalizada por una celulasa. En una modalidad preferida especialmente, el producto es un producto de degradación de celulosa, en particular glucosa y/o celobiosa.

En otra modalidad preferida, el problema de la presente invención se resuelve por un método para producir un microorganismo el cual presenta una celulasa en su superficie, y que comprende las etapas de: (a) insertar una molécula de ácido nucleico como se describe en lo anterior que contiene una secuencia de control de expresión unida operativamente a la molécula de ácido nucleico, en un microorganismo, y opcionalmente (b) poner en contacto al microorganismo con una sustancia que activa la secuencia de control de expresión.

Igualmente, el problema de la presente invención se resuelve por un método para producir una preparación de membrana la cual incluye, además de las etapas (a) y (b) descritas en lo anterior, una etapa subsecuente de obtención de la preparación de membrana partir del microorganismo.

Las medidas necesarias para esta etapa son las mismas que las descritas previamente.

En otra modalidad preferida, el problema de la presente invención se resuelve por una composición la cual contiene uno o más de los microorganismos descritos en lo anterior los cuales presentan celulasas en su superficie y/o una preparcion de membrana correspondiente.

La presente invención también se ilutra por las siguientes figuras, los ejemplos, los cuales no deben considerarse como limitantes, los rasgos adicionales, modalidades y puntos principales y ventajas de los cuales se pueden derivar de la invención.

La figura 1 muestra una estructura esquemática de un cásete de autopresentación . El péptido señal (SP, por sus siglas en inglés) sirve como transporte a través de la membrana interior. El ß-barril se pliega a sí mismo en la membrana exterior y se ancla a la construcción en ese lugar.

El enlazante es necesario para garantizar translocación completa del pasajero, en este caso, CipA, sobre la superficie de la célula.

La figura 2 muestra una tarjeta de restricción del plásmido para expresión de Cel5A en el sistema T7 inducible (izquierda) y en el sistema constitutivo (derecha) . El plásmido a la izquierda es un derivado de pET-lld (Novagen) y ha sido transformado en E. coli cepa BL21 (DE3) , el plásmido de la derecha es un derecha de pJM007 (Maurer et al., 1997) y ha sido transformado en E. coli BL21.

La figura 3 es una tarjeta de restricción del plásmido para la expresión de la proteína de fusión CelK en el sistema de pBAD inducible (izquierda) y en el sistema constitutivo (derecha) . El plásmido a la izquierda es un derivado (pBAD/glII A (Invitrogen) y se ha transformado en E. coli BL21, mientras el plásmido de la derecha es un derivado pJM007 (Maurer et al., 1997) y ha sido transformado en E. coli BL21.

La figura 4 es una tarjeta de restricción del plásmido para la expresión de la proteína de fusión BglA en el sistema T7 inducible (izquierda) y el sistema constitutivo (derecha) . El plásmido a la izquierda es un derivado de pET-lld (Novagen) y ha sido transformado en E. coli cepa BL21(DE3), mientras que el plásmido de la derecha es un derivado de pJM007 (Maurer et al., 1997) y ha sido transformado en E. coli BL21.

La figura 5 es una comparación de la expresión de la proteína de fusión Cel5A y la proteína de fusión de un control sin sentido (NC, por sus siglas en inglés) en la superficie de E. coli BL21(DE3) . Las proteínas de la membrana exterior se han aislado por medio de fraccionamiento de célula diferencial, se han separado utilizando SDS-PAGE (acrilamida 10%) y se han teñido con azul brillante de Coomassie. M: estándar de tramaño de proteína, -/+ IPTG: no inducida o inducida; T: cepa hospedadora .

La figura 6 es una prueba de la presentación de superficie de la proteína de fusión Cel5A en E. coli BL21(DE3) . Las proteínas de la membrana exterior se han aislado por medio de fraccionamiento de célula diferencial, se han separado SDS-PAGE (acrilamida 10%) y se han teñido utilizando azul brillante de Coomassie. M: estándar de tamaño de proteína; WT: cepa hospedadora, PK: proteinasa K. La digestión de células completas con PK se llevó a cabo antes del aislamiento de la proteína de membrana exterior.

La figura 7 es un espectro de p-nitrofenolato bajo condiciones de CelK. Se determina fotométricamente p-nitrofenol 5 mM en amortiguador de Na-citrato (pH 6) después de 10 minutos de incubación a 60 °C y alcalinización subsecuente .

La figura 8 es la actividad de CelK inducible (pBAD) versus constitutiva (pJM) . Las células se incuban con p-nitrofenol-celobiósido durante 3 min a 60°C y pH 6. Después de la incubación se lleva a cabo la alcalinización utilizando carbonato de sodio. El p-nitrofenolato resultante se detecta a 400 nra. Blanco: amortiguador + sustrato (sin células) . WT: cepa hospedadora (sin plásmido) .

La figura 9 es un control sin sentido (NC) para la actividad de CelK. Las células se mezclan con p-nitrofenol-celobiósido y se incuban a 60 °C y pH 6. El p-nitrofenolato que se forma se detecta a 400 nm después de 1, 2, 3 y 4 min. La alcalinización se llevó a cabo de antemano utilizando carbonato de sodio. WT: cepa hospedadora. La figura muestra MW + SD; n = 2.

La figura 10 es una comparación de la expresión de la proteína de fusión CelK y de la proteína de fusión de un control sin sentido (NC) en E. coli BL21. Las proteínas de la membrana exterior se aislan utilizando fraccionamiento celular diferencial, se separan utilizando SDS-PAGE (acrilamida 10%) y se tiñen utilizando azul brillante de Coomassie. M: estándar de tamaño de proteína; WT: cepa hospedadora.

La figura 11 muestra la estabilidad al almacenamiento de la cepa CelK. Las células se almacenan durante 8 días a 4°C y la actividad de CelK se determina a 60°C y pH por medio de un incremento en el p-nitrofenolato producido a 400 nm. WT: cepa hospedadora; NC: control sin sentido. La figura muestra MW + SD; n = 3.

La figura 12 es una prueba de la presentación de superficie de la proteína de fusión CelK en E. coli BL21. Las proteínas de la membrana exterior se han aislado utilizando fraccionamiento de célula diferencial, se han separado utilizando SDS-PAGE (acrilamida 10%) y se han teñido utilizando azul brillante de Coomassie. M: Estándar de tamaño de proteína; T: cepa hospedadora; PK: proteinasa K. La digestión de células completas con PK se llevó a cabo antes del aislamiento de la proteína de membrana exterior.

La figura 13 es la expresión de la proteína de fusión BglA en el sistema pET inducible y el sistema pJM constitutivo en la superficie de E. coli BL21(DE3) y E. coli BL21. Las proteínas de membrana exterior se aislaron utilizando fraccionamiento de célula diferencial, se separaron utilizando SDS-PAGE (acrilamida 10%) y se tiñen utilizando azul brillante de Coomassie. WT: cepa hospedadora; n. ind e ind. : -/+ IPTG; M: estándar de tamaño de proteína.

La figura 14 muestra la actividad de BglA inducible (pET) versus constitutiva (pJM) . Las células se incuban utilizando p-nitrofenol -glucopiranósido durante 1 h a 60°C y pH 6. Después de la incubación la alcalinización se llevó a cabo con carbonato de sodio. El p-nitrofenolato resultante se detectó a 400 nm. Blanco: amortiguador + sustrato (sin células) . WT : cepa hospedadora (sin plásmido) . La figura muestra W + SD; n = 3.

La figura 15 muestra la actividad de BglA y el control sin sentido (CelK) . Las células se mezclan con p-nitrofenol -glucopiranósido y se incuban a 60°C y pH 6.

El p-nitrofenolato resultante se detecta después de 15, 30, 45 y 60 min a 400 nm. La alcalinización se llevó a cabo de antemano con carbonato de sodio. La cepa hospedadora E. coli BL21(DE3) se utilizó como control. Blanco: amortiguador + sustrato (sin células) . La figura muestra MW ± SD; n = 3.

La figura 16 es una prueba de la presentación en superficie de la proteína de fusión BglA en E. coli BL21(DE3) . Las proteínas de membrana exterior se aislan utilizando fraccionamiento de célula diferencial, se separan utilizando SDS-PAGE (acrilamida 10%) y se tiñen utilizando azul brillante de Coomassie. M: estándar de tamaño de proteína; WT : cepa hospedadora; PK: Proteinasa K. La digestión de células completas con PK se llevó a cabo antes del aislamiento de proteína de membrana exterior.

La figura 17 muestra la actividad de CelK a pH 5 y pH 6. La actividad de CelK se determinó a 60°C y pH 5 y pH 6 por medio de incremento de p-nitrofenolato a 400 nm. Se utilizó p-nitrofenol-celobiósido como sustrato y se utilizó como control la cepa hospedadora E. coli BL21. La figura 17 muestra MW ± SD; n = 3.

La figura 18 muestra la actividad de CMCasa en la cepa Cel5A. La cepa Cel5A y la cepa hospedadora E. coli BL21(DE3) se mezclan con CMC 1% y se incuban a 60 °C y pH 6. Después de períodos de incubación variables los azúcares reductores formados se detectan por medio de análisis DNS a 540 nm. Células blanco (BZ) : células únicamente (sin CMC) ; sustrato en blanco (BS) : CMC + amortiguador únicamente (sin células) . La figura 18 muestra MW ± SD; n = 3.

Las figuras 19A-19B muestran la actividad de avicelasa de la cepa CelK en presencia y ausencia de una beta-glucosidasa . La cepa CelK se mezcla, en presencia y ausencia de beta-glucosidasa (+/-) elaborada de almendras con Avicel 1% y se incuba a 60°C y pH 6. Después de intervalos variables, los azúcares reductores que se forman se detectan por análisis de DNS a 540 nm. La cepa hospedadora E. coli BL21 se utiliza como control. Fig. 19A: valores de absorción a 540 nm. Células blanco (BZ) : células únicamente (sin Avicel); sustrato en blanco (BS, por sus siglas en inglés) : Avicel + amortiguador únicamente (sin células) . Fig. 19B: azúcares reductores formados por la cepa CelK, en mg glucosa/ml. Las figuras 19A-19B muestran MW ± SD; n = 3.

Las figuras 20A-20B muestran la actividad en papel filtro (FP, por sus siglas en inglés) de las celulasas de autopresentación a escala de placa de microtitulación . Las celulasas se incuban en diversas relaciones con una placa FP (2.4 mg) a 60 °C. Las mezclas sin BglA contienen 0.5 U/ml de beta-glucosidasa de almendras. Después de período de incubación variables los azúcares reductores formados se detectan por medio del análisis DNS a 540 nm. Fig. 20A: Valores de absorción a 540 nm. WT: cepa hospedadora; sustrato en blanco (BS) : FP + amortiguador (sin células) . Fig. 20B: Azúcares reductores formados por celulasas, en mg de glucosa/ml. Las figuras 20A-20B muestran MW ± SD; n = 2.

Las figuras 21A-21B son la actividad en papel filtro (FP) de las celulasas de autopresentación . Escala de microtitulación versus estándar. Las celulasas se mezclan en partes iguales y se incuban ya sea a 2.4 mg de placa de papel filtro (micro) o con 50 mg de una tira de papel filtro (estándar) durante 3 días a 60°C. Los azúcares reductores formados se detectan por medio de un análisis DNS a 540 nm. Fig. 21A: valores de absorción a 540 nm. WT: cepa hospedadora; sustrato en blanco (BS) : FP + amortiguador (sin células) . Fig. 21B: azúcares reductores formados por las celulasas, en mg de glucosa/ml. Las figuras 21A-21B muestra MW ± SD; n = 2.

La figura 22 muestra la degradación de álamo por celulasas de autopresentación. Las celulasas se mezclan en partes iguales y se incuban con álamo 4% durante 88 h a 60°C. Los azúcares reductores formados se detectaron por medio del análisis DMS a 540 nm. La figura 22 muestra MW ± SD; n = 2.

EJEMPLOS GENERALIDADES Las celulasas se ligan como "pasajeros" en el cásete de autopresentación, de manera que la proteina se expresa como proteina de fusión. La figura 1 muestra la estructura esquemática de esta construcción. El cásete de autopresentacion se encuentra en diversos sistemas de expresión de manera que para la clonación de los pasajeros de celulasa, en primer lugar se utilizan dos sistemas de autopresentacion inducibles - IPTG (derivado de pET) y arabinosa (derivado de pBAD) - y uno constitutivo (derivado de pJM) .

Las secuencias de genes de las tres celulasas se adaptan al "uso de codón" de E. coli y se sintetizan por Life Technologies (síntesis de genes GeneArtMR) . Las secuencias de gen optimizadas y las secuencias de aminoácidos derivadas de los mismos están en el protocolo de secuencia. Los genes se insertan en los vectores de autopresentacion utilizando las interfases unidas Xho I y Kpn I. Para cada celulasa, se utiliza un sistema de autopresentacion tanto inducible como constitutivo. En el caso del sistema inducible, el vector pET autopresentacion se utiliza para la endocelulasa Cel5A y la ß-glucosidasa BglA. Puesto que CelK, a 2.4 kb es muy grande, el vector de autopresentacion pBAD se utiliza para CelK puesto que es más pequeño en comparación con el vector de autopresentacion pET. Los plásmidos de celulasa de autopresentacion generados son todos por lo tanto < 10 kb y se resumen en la Tabla 1. Las tarjetas de plásmido respectivas se muestran en la figura 2 a la figura 4.

TABLA 1: Los plásmidos inducibles por IPTG (derivados de pET) se transforman en E. coli BL21 (DE3) (B, F- , dcm, o pT, Ion, hsdS (rB- mB-) gal, ? (DE3 ) ) . Para los plásmidos inducibles por arabinosa (derivados de pBAD) y constitutivos (derivados de pJM) se utiliza E. coli BL21 (B, F-, dcm, ompT, Ion, hsdS (rB- mB-) gal) . Las cepas de E. coli generadas también se enumeran en la Tabla 1.

CONDICIONES DE EXPRESION PARA CELULASAS La expresión de las proteínas de fusión de celulasas inducen ya sea al agregar IPTG o con L-arabinosa. En el caso de expresión constitutiva, no necesita agregarse inductor. Las condiciones de expresión de las cepas de celulasa generadas (véase Tabla 1) se enumeran en la Tabla 2. Se agrega IPTG o L-arabinosa tan pronto como el cultivo principal alcanza una D0578 de 0.5 - 0.6.

TABLA 2 Con el fin de excluir cualquier influencia de puente disulfuro periplásmicos en el transporte de celulasa, las células se cultivan con ß-mercaptoetanol (ME) 10 mM. Las células se cultivan si ME son las que se utilizan como comparación .

EJEMPLO 1: ENDOCELULASA Cel5A Las cepas Cel5A (E. coli BL21 (DE3 ) ET-AT-Cel5A y E. coli (BL21pJM-AT-Cel5A) se hacen crecer de acuerdo con la Tabla 2 sin y con ME y se preparan para ya sea prueba de actividad o para aislamiento de las proteínas de membrana exterior .

Actividad de Cel5A: inducible versus constitutiva La actividad de la endocelulasa se detecta utilizando el análisis de placa CMC. Esto involucra producir placas de agar que consisten de amortiguador de análisis y sustrato (carboximetilcelulosa) . Se gotean 10 µ? de células (DO57820) sobre cada una de las placas y después se incuban a 50°C. Las placas CMC se tiñen utilizando rojo Congo, el cual tiñe las cadenas de polisacárido con n > 6 monómeros. Para finalizar las placas se decoloran utilizando NaCl . Si se descompone CMC, se forma un halo ligero alrededor de las células mientras que las moléculas de CMC no hidrolizadas continúan proporcionando una tinción rojo oscuro.

Con el fin de determinar el período de incubación óptimo a 50°C, se selecciona una serie de 0.5 - 2 h. Además de las cepas de celulasa, el hospedador también se prueba para degradación de CMC. Los resultados muestran que la cepa Cel5A inducible provoca degradación de CMC dependiente del tiempo (los halos se vuelven más grandes conforme se incrementa el período de incubación) . Contrario a esto, no se detecta degradación de CMC con la cepa Cel5A constitutiva. Como se anticipaba, el hospedador no muestra degradación de CMC. La adición de ME durante el crecimiento no tiene efecto.

El experimento muestra que la degradación de CMC es posible con la cepa Cel5A inducible. El crecimiento de las células puede producirse sin agregar mercaptoetanol. Es suficiente un período de incubación de 30 min para las placas de CMC.

Actividad de Cel5A: Control sin sentido Con el fin de excluir cualquier influencia del ß-barril en la actividad de Cel5A, el análisis de placa de CMC también se lleva a cabo con células las cuales presentan un pasajero diferente en la superficie el cual no es capaz de degradar CMC. Esta cepa en lo siguiente se denominará como control sin sentido. También se realiza una prueba de manera que el promotor sea "holgado" . Esto significa que la proteína de fusión Cel5A se debe expresar incluso sin la adición del inductor. Para hacerlo así, la cepa Cel5A no se induce y la actividad se compara con células inducidas. La prueba demuestra que la cepa Cel5A no inducida presenta ligera degradación de CMC. Esto muestra que, sin el inductor, se produce cierta cantidad de expresión de la proteína de fusión Cel5A. La degradación de CMC de la cepa Cel5A inducida, no obstante, es marcada de manera más fuerte. El control sin sentido no muestra degradación de CMC, exactamente como lo realiza la cepa hospedadora sin el plásmido. Este halo marcado muy ligeramente en el control sin sentido y el hospedador es comparable con la muestra de amortiguador. Así, esta es una reacción no específica del amortiguador a la placa de agar.

Con el fin de garantizar el número de moléculas de ß-barril de la cepa Cel5A y el control sin sentido son comparables, las proteínas de membrana exterior se aislaron de las células probadas y se separaron utilizando SDS-PAGE. Las proteínas de membrana exterior de E. coli Ompf (37 kDa) y OmpA (35 kDa) se utilizan como proteínas marcadores para la fracción de membrana exterior. El resultado se muestra en la figura 5. Después de inducción con IPTG, se detectaron bandas comparablemente fuertes para la proteína de fusión Cel5A y la proteína de fusión del control sin sentido, las cuales corresponden bien con el MW calculado de aproximadamente 102 kDa y 96 kDa. Con la cepa Cel5A no inducida, no se detectaron bandas para la proteína de fusión Cel5A. De igual manera, como se anticipaba, el hospedador no mostró bandas para la proteína de fusión Cel5A y el control sin sentido.

Por lo tanto se demostró que la degradación de CMC causada por la cepa Cel5A involucra una reacción de celulasa específica.

Estabilidad de almacenamiento de la cepa Cel5A Con el fin de probar si la cepa Cel5A puede ser almacenada a 4°C, se determinó la actividad de las células a partir de la prueba 3.2 después de 10 días de almacenamiento. Fue evidente de la prueba que la cepa Cel5A almacenada no muestra pérdida de actividad en este período. La degradación de CMC es comparable con células frescas. El hospedador y el control sin sentido no mostraron degradación de CMC.

La prueba muestra que es posible almacenar la cepa Cel5A durante por lo menos 10 días a 4°C sin pérdida de actividad.

Presentación en superficie de la cepa Cel5A La expresión exitosa de la proteína de fusión Cel5A se ha demostrado en lo anterior. La detección de la proteína de fusión en la membrana exterior, no obstante, aún no proporciona conclusión alguna respecto a su orientación. Como se desea las enzimas pueden estar orientadas hacia el espacio extracelular o hacia el periplasma. Al incubar células de bacteria intactas con proteinasa K seguido por preparación de las proteínas de membrana exterior bacteriana, es posible detectar la presentación en superficie de un pasajero de autopresentación . Puesto que las moléculas de proteinasa K son incapaces, debido a su tamaño, de pasar a través de la membrana exterior de E. colí, la incubación de células completas con estas proteasas simplemente resulta en la digestión de proteínas localizadas sobre la superficie de la membrana exterior. Las proteínas de membrana exterior OmpF y OmpA están protegidas de la digestión por proteasas dado que son proteínas de membrana integral. Por lo tanto, su detección después de tratamiento con proteasa se puede considerar como un índice de la integridad de las células.

Con el fin de detectar la presentación en superficie, la cepa Cel5A se incuba con proteinasa K, posterior a inducción de la expresión Cel5A. Las células inducidas se utilizan como comparación la cual no ha sido tratada con la proteasa. La cepa hospedadora E. coli y la cepa Cel5A no inducida se utilizan como controles. En la figura 6 se puede observar la fuerte expresión, ya demostrada, de la proteína de fusión Cel5A después de inducción de IPTG a aproximadamente 102 kDa (véase la figura 4) . Como se anticipaba, ni la cepa hospedadora E. coli ni la cepa Cel5A no inducida se detectó la expresión en aproximadamente 102 kDa. Debido a la fuerte expresión de Cel5A, es difícil una degradación proteolítica completa de la proteína de fusión Cel5A. La reducción en las bandas Cel5A con el mantenimiento simultáneo de las bandas OmpF y OmpA posterior al tratamiento con proteasa indica con claridad a favor de una orientación hacia fuera de Cel5A.

EJEMPLO 2; EXOCELULASA CelK Las cepas CelK (E. coli BL21pBAD-AT-CelK y E. coli BL21pJM-AT- Cel5K) se cultivan de acuerdo con la Tabla 2 sin y con mercaptoetanol y se preparan para ya sea una prueba de actividad o para aislamiento de las proteínas de membrana exterior.

Actividad de Cel5A: Análisis de p-nitrofenolato La actividad de la exocelulasa se determina fotométricamente por medio de un incremento en p-nitrofenolato . Se utiliza como sustrato el celobiósido p-nitrofenol. En la literatura se ha descrito para el p-nitrofenolato un máximo de absorción de 380-420 nm. Con el fin de determinar la longitud de onda óptima para la medición de p-nitrofenolato, en primer lugar se registra un espectro bajo condiciones de análisis de CelK. Para hacer esto, se agrega p-nitrofenol a amortiguador de citrato de sodio a pH 6 y se incuba a 60 °C. Puesto que la coloración amarillo del p-nitrofenolato es notoria de manera más fuerte cuando es alcalina, la muestra se alcaliniza adicionalmente con carbonato de sodio y después se mide fotométricamente en la placa de microtitulación . La figura 7 muestra que bajo condiciones de CelK, es posible una medición de p-nitrofenolato en aproximadamente 360 a 450 nm. En base en la literatura se define una medición de absorción a 400 nm para el siguiente análisis de CelK.

Con el fin de determinar la actividad de la cepa CelK, se realiza una curva estándar con p-nitrofenolato (0 mM a l mM) . Las muestras de p-nitrofenolato se tratan de la misma manera que las muestras de CelK y se miden no diluidas y diluidas 1:2, respectivamente.

Actividad de CelK: Constitutiva versus inducible Las pruebas preliminares de CelK han demostrado que la cepa CelK inducible presenta mayor actividad en comparación con la cepa CelK constitutiva. Con el fin de determinar una relación precisa, las actividades se determinan en una comparación directa. Los resultados se muestran en la figura 8. Para la cepa CelK inducible, utilizando una curva estándar, se determina la actividad de 210 mU/D0578l/ml . Para la cepa CelK constitutiva, después de 3 min a 60°C, no se observa conversión en la D05781 utilizada. Por lo tanto, la cepa CelK constitutiva (D057al) se incuba durante 30 min a 60 °C. Ahora se determina la absorción a 400 nm de 0.25, la cual corresponde a una actividad de 2.2 mU/D0578l/ml . La cepa CelK inducible por lo tanto es aproximadamente 100 veces más activa por comparación con la cepa CelK constitutiva. Las otras pruebas por lo tanto continúan con la cepa CelK inducible (cultivo sin mercaptoetanol ) .

Actividad de CelK: Control sin sentido De la misma manera que la endocelulasa, un control sin sentido para actividad también se prueba para la exocelulasa. La figura 12 muestra que la D0578 de la cepa CelK en la mezcla debe ser = 1. En la siguiente prueba, se determina DO5780.5. Puesto que la formación de p-nitrofenolato es de antemano muy marcada después de aproximadamente 3 min (véase la figura 8) , se selecciona para esta prueba una serie en tiempo de 0 a 4 min. Para realizar esto, la cepa CelK, el control sin sentido y la cepa hospedadora se mezclan con celobiósido p-nitrofenol y después de cada minuto, el p-nitrofenolato formado se mide a 400 nm. Las muestras se diluyen 1:2 antes de alcalinización. El resultado se muestra en la figura 9. Surge que la DO5780.5 es suficiente para la medición de actividad. Para la cepa CelK, utilizando la curva estándar (diluida 1:2), se calcula una actividad de aproximadamente 300 mU/D0578l/ml . Se observan los primeros 3 min. Después de esto, la reacción ya no es lineal. El control sin sentido mostró, como lo hizo la cepa hospedadora, que no hay conversión del sustrato.

Con el fin de verificar si la expresión de la proteína de fusión CelK y de la proteína de fusión del control sin sentido son las mismas, además de la prueba de actividad, las proteínas de la membrana exterior se aislaron y se separaron utilizando SDS-PAGE. Las proteínas de membrana exterior de E. coli OmpF (37 kDa) y OmpA (35 kDa) se utilizaron como proteínas marcadoras para la fracción de membrana exterior. Los resultados se muestran en la figura 10. Después de inducción con arabinosa, se detectaron bandas comparablemente fuertes para la proteína de fusión CelK y la proteína de fusión del control sin sentido, lo cual corresponde bien al MW calculado de aproximadamente 139 kDa y 103 kDa. No se observaron en la cepa hospedadora bandas de las dos proteínas de fusión.

Esta prueba demostró que la conversión de p-nitrofenolato es una reacción específica de CelK.

Estabilidad al almacenamiento de la cepa CelK Con el fin de probar si la cepa CelK puede ser almacenada a 4°C, la actividad de las células de la prueba anterior se determinó después de 8 días de almacenamiento. La figura 11 muestra que la cepa CelK almacenada no muestra pérdida de actividad en este período. La formación de p-nitrofenolato es comparable con células frescas (figura 9) . Aquí, también, se obtiene una actividad de aproximadamente 300 mU/DOS78l/ml . El hospedador y el control sin sentido no mostraron conversión del sustrato.

La prueba demostró que es posible almacenar la cepa CelK por al menos 8 días a 4°C sin pérdida de actividad.

Presentación en superficie de la cepa CelK La expresión exitosa de la proteína de fusión CelK ya se ha demostrado en la figura 10. Con el fin de confirmar las orientaciones afuera de la enzima, la cepa CelK se trata con proteinasa K y después se aislan las proteínas de membrana exterior. CmpF y OmpA se consideran como prueba de la integridad de las células después del tratamiento de proteasa.

La cepa CelK se incuba con proteinasa K después de inducción de la expresión de CelK.

Las células inducidas las cuales no han sido tratadas con proteasa se utilizan como comparación. La cepa hospedadora E. coli y la cepa CelK no inducida se utilizan como controles. En la figura 12, la fuerte expresión de la proteína de fusión CelK se muestra de antemano, posterior a inducción con arabinosa en aproximadamente 139 kDa, como se puede observar. Como se anticipó, ni la cepa hospedadora E. coli ni la cepa CelK no inducida detectaron expresión en aproximadamente 130 kDa. Debido a la fuerte expresión de CelK es difícil una degradación proteolítica completa de la proteína de fusión CelK. La banda CelK pudo haber desaparecido completamente, pero la banda OmpA es en cierta medida más débil en comparación con la cepa hospedadora. No obstante, esto indica claramente a favor de una orientación hacia fuera de la enzima.

EJEMPLO 3; BETA-GLUCOSIDASA BglA Expresión y actividad de BglA: Inducible versus constitutiva La expresión de la proteína de fusión, en el caso del sistema constitutivo, se llevó a cabo durante 24 h a 37 °C. La inducción de la expresión en el sistema pET se obtiene por medio de incubación durante 1 hora de las células con IPTG 1 mM a 30 °C, una vez que se ha obtenido una D0578 de 0.6. No hay necesidad de agregar ß-mercaptoetanol 10 mM durante el cultivo, dado que la secuencia de aminoácidos de BglA contiene únicamente una cisteína y de esta manera no se pueden formar puentes disulfuro en el periplasma lo cual puede afectar el transporte.

Una vez que se han generado dos cepas BglA (inducida y constitutiva) la expresión de la proteína de fusión BglA en la membrana exterior de E. coli debe verificarse. Para hacer esto, las proteínas de membrana exterior de ambas cepas se aislan y separan utilizando SDS-PAGE. Las proteínas de membrana exterior de E. coli, OmpF (37 kDa) y OmpA (35 kDa) se utilizan como proteínas marcadores para la fracción de membrana exterior. Los resultados se muestran en la figura 13. En el caso del sistema de expresión inducible, posterior a inducción con IPTG se detecta una banda fuerte de la proteína de fusión BglA, lo cual corresponde bien al MW calculado de aproximadamente 101 kDa. Para la cepa BglA no inducida y para la cepa hospedadora, como se anticipó no se pudo detectar una banda para la proteína de fusión BglA. En el sistema constitutivo, no se detectó expresión de la proteína de fusión BglA. La experiencia ha demostrado que la detección de un pasajero expresado constitutivamente por medio de tinción de Coomassie no es suficientemente sensible.

Una vez que la expresión de la proteína de fusión BglA se ha verificado, la actividad de BglA de la cepa constitutiva e inducible se determinó por medio de p-nitrofenol-glucopiranósido como sustrato. La actividad de la cepa BglA se determina fotométricamente por medio de la formación de p-nitrofenolato a 400 nm. Contrario a la exocelulasa CelK, se utiliza como sustrato p-nitrofenol-glucopiranósido. Con el fin de establecer el análisis, la prueba se lleva a cabo en primer lugar utilizando una ß-glucosidasa adquirida (de almendra) . Para hacerlo de esta manera, se selecciona las condiciones óptimas para esta enzima (pH 5 y 35 °C) . Se utilizan dos concentraciones diferentes. Se detecta una actividad dependiente de concentración de la ß-glucosidasa . Como se anticipó, el blanco no muestra incremento en p-nitrofenolato .

La actividad de BglA se determinó por medio de medición de absorción del p-nitrofenolato producido a 400 nm (cambio de color a amarillo) . La reacción se lleva a cabo, en base en lo publicado, en condiciones óptimas para BglA a un valor de pH de 6.0 y una temperatura de incubación de 60°C. Puesto que el período de incubación de la cepa BglA con el sustrato no se conoce, las mezclas de reacción se incuban hasta que se puede observar una coloración amarillo claro (p-nitrofenolato) . En el caso de la cepa BglA inducible, esto se registra después de 1 h a 60°C. Antes de la medición fotométrica, las células se separan y el sobrenadante se transfiere a una placa de microtitulación de 96 pozos.

Después de alcalinización al agregar carbonato de sodio, la medición de absorción se llevó a cabo a 400 nm. En la figura 14, se puede ver que la cepa BglA inducible es capaz de convertir p-nitrofenol-glucopiranósido (incremento de p-nitrofenolato a 400 nm) . Contrario a esto, la cepa BglA constitutiva no muestra formación de p-nitrofenolato dentro de 1 h a 60° . No se ha intentado un período de incubación más prolongado. Tanto el blanco como la cepa hospedadora no mostraron conversión del sustrato. Al igual que con otras dos celulasas, se obtiene mejor actividad con el sistema de expresión inducible.

Actividad de BglA: control sin sentido Una vez que se ha demostrado que la cepa BglA inducible es activa, se registra una serie en tiempo con el fin de poder determinar mejor la actividad. Al mismo tiempo, correspondiente a otras dos celulasas, también se prueba un "control sin sentido". Esta es una cepa E. coli, la cual presenta un pasajero diferente en la superficie el cual no puede convertir el sustrato. Se selecciona la cepa CelK. Aunque esta es una celulasa, CelK no puede convertir p nitrofenol glucopiranósido . Con el fin de determinar la actividad de BglA, en primer lugar, se registra una curva estándar para p-nitrofenol . Después, la cepa BglA, el control sin sentido (cepa CelK) y la cepa hospedadora se mezcla con p-nitrofenol glucopiranósido y después de hacer variar los períodos de incubación a 60°C, el p-nitrofenolato formado se mide a 400 nm. En la figura 15, se puede observar que la cepa BglA muestra un incremento continuo en p-nitrofenolato con respecto al tiempo. Utilizando la curva estándar, se calcula la actividad de BglA de aproximadamente 1 mU/ml/DOl. El control sin sentido, al igual que la cepa hospedadora E. coli BL21(DE3) no muestra conversión del sustrato.

Presentación de superficie de BglA en E. coli (BL21(DE3) La actividad exitosa BglA de la cepa inducible se muestra en la figura 14, mientras que la expresión de las proteínas de fusión BglA se ilustra en la figura 13. Con el fin de detectar la presentación de superficie, la cepa BglA se incuba con proteinasa K después de inducción de expresión de BglA. La proteasa, debido a su tamaño, es incapaz de obtenerse en la célula de E. coli y por lo tanto únicamente degrada proteínas las cuales están en la superficie de la célula. Como comparación, se utilizaron células inducidas las cuales no han sido tratadas con proteasa. La cepa hospedadora de E. coli y la cepa BglA no inducida se utilizan como controles. OmpA y OmpF son proteínas de membrana integrales las cuales están protegidas contra digestión por proteasas. Por lo tanto, estas sirven como un índice para la integridad de las células. En la figura 13, la expresión fuerte mostrada de antemano de la proteína de fusión BglA posterior a la inducción por IPTG en aproximadamente 101 kDa se puede observar. Como se anticipó, la expresión de aproximadamente 101 kDa no se detectó ni en la cepa hospedadora de E. coli ni en la cepa de BglA no inducida (figura 16) . Debido a la fuerte expresión de BglA, es difícil la degradación proteolítica completa de la proteína de fusión BglA. La reducción de bandas BglA mientras las bandas OmpF y OmpA se mantienen después del tratamiento de proteasa, de acuerdo con nuestra experiencia, indica claramente a favor de una orientación hacia fuera de BglA.

EJEMPLO 4 Con la ayuda de la tecnología de autopresentación, es posible presentar tres celulasas activas en la superficie de E. coli. En todos los casos, un sistema de expresión inducible es lo mejor. Las cepas de celulasa y su cultivo se resumen en la Tabla 2.

Con el fin de utilizar las celulasas de autopresentación juntas para una degradación sinergística de celulosa, se deben definir parámetros comunes tales como valor de pH y temperatura. La exocelulasa y ß-glucosidasa tienen un pH óptimo de 6.0. La temperatura óptima es 60°C. No obstante, la endocelulasa tiene un pH óptimo de 5.0 y una temperatura óptima de 50 °C.

Determinación de la temperatura común Puesto que dos de las tres celulasas (CelK y BglA) tienen una temperatura óptima de 60 °C, es necesario probar si la endocelulasa Cel5A también es activa a 60°C. En la literatura, se describe una ligera reducción en la actividad de Cel5A (aproximadamente 5 a 10%) a 60 °C, en comparación con la actividad a 50°C (Lin L et al., 2009). La actividad de Cel5A se determina utilizando las pruebas en placa de CMC a pH 5. Esto se realiza al gotear células Cel5A sobre la placa de CMC y después incubar durante 30 min a 50°C, 55°C y 60°C. La cepa hospedadora E. coli BL21(DE3) y el amortiguador se utilizaron como control. Las placas de CMC se tiñieron utilizando rojo Congo. Finalmente, las placas se decoloraron con NaCl . Se encontró que la célula Cel5A se degradan igualmente bien a cada temperatura de CMC utilizada (halo ligero) mientras que la cepa hospedadora y el amortiguador fueron negativos. Las células Cel5A por lo tanto también se pueden utilizar a 60°C. En el pasaje siguiente por lo tanto, la investigación con la totalidad de las tres celulasas se llevó a cabo a 60 °C.

Determinación del valor de pH común La exocelulasa (CelK) y ß-glucosidasa (BglA) tienen un pH óptimo de 6. No obstante, la endocelulasa (Cel5A) tiene un pH óptimo de 5. La literatura describe una reducción en la actividad de Cel5A a pH 6 en comparación con pH 5 (Lin L et al, 2009) . Por lo tanto, fue necesario probar si es posible utilizar CelK a pH 5. Para hacer esto, la cepa CelK, después de inducción de la expresión de proteína, se recolectó primero en amortiguador de citrato de sodio pH 6 y en segundo lugar el amortiguador de acetato de sodio pH 5. La actividad de CelK se determinó a partir del incremento en p-nitrofenolato 400 nm por degradación de p-nitrofenol celobiósido (pNPC) a 60°C. La cepa hospedadora E. coli BL21 se utilizó como control. La figura 17 muestra que bajo ambas condiciones de pH se puede observar un incremento en p-nitrofenolato mientras que la cepa hospedadora permanece sin alteración. También se puede observar que a pH 6, en comparación con pH 5, se produce más p-nitrofenolato. A pH 6, la actividad de CelK en promedio de 270 mU/ml/D01 se obtiene. No obstante, a pH 5, es únicamente aproximadamente 110 mU/ml/D01. De manera que una disminución en el pH en el análisis, de pH 6 a pH 5, genera una disminución de 60% en la actividad de CelK.

Una pérdida de actividad también se describe para la endocelulasa Cel5A, cuando el pH se incrementa de 5 a 6. Pero puesto que la ß-glucosidasa BglA también tiene un óptimo a pH de 6, los análisis subsecuentes se llevaron a cabo a pH 6 de manera que únicamente una enzima debe ser utilizada bajo condiciones de pH no óptimas.

Detección de los azúcares reductores: Establecimiento del análisis DNS La actividad de celulasa común de las celulasas de autopresentación se prueba después en sustratos de celulosa. Esto se realiza, por ejemplo, utilizando colorimetría al medir los azúcares reductores liberados de acuerdo con el método de ácido dinitrosalicílico (Miller GL 1959) . El método relaciona la oxidación de un compuesto carbonilo con la reducción de un grupo nitro en ácido 3,5-dinitrosalicílico bajo condiciones alcalinas. Esto involucra reducir ácido 3,5-dinitrosalicílico a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, el cual tiene un máximo de absorción a 540 nm. En esta reacción, el color de la solución de DNS cambia de naranja-amarillo a rojo.

Actividad de CMCasa de la endocelulasa Cel5A Hasta ahora, la actividad de Cel5A se ha medido indirectamente utilizando la prueba de placa CMC. Al utilizar el método de DNS, los extremos reductores de la carboximetilcelulosa formados se pueden determinar cuantitativamente por la reacción de Cel5A. Para hacer esto, la cepa Cel5A se mezcla con CMC 1% y se incuba a 60°C. Después de períodos de incubación variables las células se separan y el sobrenadante se mezcla con reactivo DNS. Después de la incubación a 95°C y 4°C, se determina la absorción a 540 nm utilizando fotometría. La cepa hospedadora E. coli BL21 (DE3) se utiliza como control. Como controles, se utilizan únicamente células (BZ) o únicamente CMC (BS) . En la figura 18 se puede observar que la cepa Cel5A forma extremos reductores los cuales se pueden detectar utilizando reactivo DNS. Debido a las sustituciones carboximetilo, la degradación CMC no es una reacción lineal, dado que la endocelulasa es afectada por el grado de sustitución. Por lo tanto, no debe excederse una tasa de conversión de aproximadamente 5%. Después de 30 min a 60°C, la cepa Cel5A convierte aproximadamente 8% de la CMC. Con el fin de obtener una mejor estimación de la actividad de Cel5A, la incubación a 60°C debe ser < 30 min. La cepa hospedadora y los otros dos controles utilizados, como se anticipaba, no muestran actividad de endocelulasa.

EJEMPLO 5: ACTIVIDAD DE AVICELASA DE LA EXOCELULASA CelK La actividad de exocelulasa hasta ahora ha sido determinada con p-nitrofenol-celobiósido. Este es un sustrato soluble y por lo tanto fácilmente convertible. Con el fin de probar la actividad de CelK sobre regiones de celulosa cristalinas, se utilizó como sustrato Avicel (celulosa microcristalina) . Esto se realizó al incubar la cepa CelK con Avicel 1% a 60 °C después de períodos de incubación variables, los azúcares reductores liberados se determinaron por medio del análisis DNS a 540 nm. La concentración de los azúcares reductores se determinó utilizando una curva estándar para glucosa en mg de glucosa/ml. Dado que la exocelulasa libera celobiosa, una ß-glucosidasa se agregó durante la conversión de Avicel, la cual degrada la celulosa en dos unidades de azúcares reductores en forma de glucosa. Esto habilita una determinación más precisa de la cantidad de azúcares reductores formados, puesto que esto se calcula en base en la curva estándar en glucosa. Al mismo tiempo, la celobiosa actúa como un inhibidor de la exocelulasa, la cual es removida utilizando la ß-glucosidasa . La conversión de Avicel se analiza en presencia y ausencia de ß-glucosidasa de almendras, disponible comercialmente, purificada. La cepa hospedadora E. coli BL21 se utiliza como comparación. Como controles únicamente se utilizan células (BZ) o únicamente sustrato (BS) . Se puede observar de la figura 19A que la cepa CelK es capaz de degradar celulosa microcristalina. La cepa hospedadora, así como los controles utilizados no mostraron incremento en los azúcares reductores. La concentración de azúcares reductores liberados se muestra en la figura 19B. Como se esperaba, existe una mayor concentración en presencia de ß-glucosidasa a partir de almendras, por comparación con la conversión sin ß-glucosidasa . ß-glucosidasa BglA: Actividad de pNPGasa La mezcla de celulasa disponible comercialmente CelluclastMR (Novozymes) contiene celulasas de los hongos Trichoderma reseei ATCC 26921. Esta mezcla cataliza la degradación de celulosa en glucosa, celobiosa y polímeros de glucosa superiores. Para la mejor conversión de celulosa posible, se recomienda el uso adicional de una ß-glucosidasa de Aspergillus niger (NovozymMR 188) . La dosis escrita es Novozyme Celluclast 1% y Novozym 188 0.2%. Las condiciones óptimas para Cellulcast son una temperatura de 50 a 60 °C y un valor de pH de 4.5 a 6.0. Por lo tanto, para comparación, las condiciones de reacción de las celulasas de autopresentación de 60°C y pH 6 son las que se adoptan.

La actividad de ß-glucosidasa se determinó fotométricamente (actividad de pNPGasa) con p-nitrofenol-glucopiranósido (pNPG) por medio de un incremento en p-nitrofenol-glucopiranósido a 400 nm. Esto se realiza al incubar la cepa BglA (DO57S20) con pNPG durante 15 min a 60°C. La cepa hospedadora E. coli BL21 (DE3) y el amortiguador (blanco) se utilizan como control. Para comparación, se incuban Celluclast 1% y Novozyml88 0.2% con pNPG a 60 °C. Puesto que después de solo 3 minutos se observa un cambio de coloración amarillo fuerte, el contenido de p-nitrofenolato se mide después de 3 min, en vez de después de 15 min, lo que corresponde a BglA. Celluclast 1% y Novol88 0.2%, en comparación con la cepa BglA, la cual se utiliza en una concentración de DO57820, muestra un incremento más fuerte en p-nitrofenolato. Los controles, como se esperaba, no muestran actividad de pNPGasa.

Con la ayuda del estándar de p-nitrofenolato, se calculó la actividad de ß-glucosidasa en U/l (véase la Tabla 3) . Novozym 188 mostró una actividad 14 veces mejor en comparación con la cepa BglA. Celluclast mostró una actividad 12 veces más fuerte.

TABLA 3 Exocelulasa CelK: Actividad de pNPCasa La actividad de la exocelulasa se determinó fotométricamente, por razones prácticas, con p-nitrofenol-celobiósido (pNPC) por medio de un incremento en p-nitrofenolato a 400 nm (actividad de pNPCasa) . Esto se realizó al incubar la cepa CelK (DO5780.5) y Celluclast (1%) con pNPC durante 4 minutos a 60 °C. La cepa hospedadora E. coli BL21 y el amortiguador (blanco) se utilizaron como controles. La cepa CelK con una DO5780.5 mostró un incremento más fuerte en p-nitrofenolato en comparación con Celluclast 1%. Ambos controles utilizados mostraron, como se esperaba, nula actividad de pNPCasa. Con la ayuda del estándar de p-nitrofenolato, se calculó la actividad de CelK en U/I (véase Tabla 4) . La cepa CelK muestra el doble de la actividad de pNPCasa en comparación con Celluclast.

TABLA 4 Endocelulasa Cel5A: Actividad de CMCasa La actividad de endocelulasa se calcula con CMC al determinar los azúcares reductores por medio del análisis DNS (actividad de CMCasa) . Esto se realiza al incubar la cepa Cel5A (DO57820) y Celluclast 1% con CMC durante 15 min a 60 °C. La cepa hospedadora E. coli BL21(DE3) y el amortiguador (blanco) se utilizan como controles. Con Celluclast se observa una liberación más fuerte de azúcares reductores en comparación con la cepa Cel5A. Con la ayuda de la curva estándar de glucosa, la actividad de CMCasa se calculó en U/I (véase Tabla 5) . Celluclast muestra una actividad de CMCasa 2.4 veces mejor en comparación con la cepa Cel5A. No obstante, CMC no es específico para endocelulasas. Las exocelulasas y ß-glucosidasas también liberan cantidades pequeñas de azúcares reductores a partir de CMC. Puesto que Celluclast es una mezcla de celulasas de Trichodenna, CMC, por sí mismo, se convierte mejor por comparación con la cepa Cel5A, la cual presenta únicamente una endocelulasa en la superficie. La actividad de CMCasa 2.4 veces mejor de Celluclast por lo tanto no iguala a 2.4 veces mejor en la actividad de endocelulasa.

TABLA 5 EJEMPLO 6: RECICLADO DE CELULASAS DE AUTOPRESENTACION Una ventaja de las celulasas de autopresentacion en comparación con las enzimas solubles es que es simple recuperar el catalizador de célula completa de la mezcla de reacción. Las células se sedimentan, resuspenden en un sistema amortiguador apropiado y después están disponibles para conversión adicional. Con el fin de probar si el proceso de reciclado tiene efecto alguno sobre la actividad de las celulasas, después de determinar la actividad básica (ciclo 0) las cepas de celulasa se recuperan un total de dos veces y se mezclan con sustrato fresco (ciclo 1 y 2) . El porcentaje de actividad de las cepas de celulasa recicladas se determina por comparación con la actividad básica respectiva.

Reciclado de ß-glucosidasa BglA: Actividad de pNPGasa La actividad de ß-glucosidasa se determinó fotométricamente con p-nitrofenol-glucopiranósido (pNPG) por medio de un incremento en p-nitrofenolato 400 nm (actividad de pNPGasa) . Esto se realizó al incubar la cepa BglA (DO57820) con pNPG durante 15 minutos a pH 6 y 60°C. Después las células se sedimentaron y se midió la actividad nuevamente después de la suspensión (ciclo 1 y 2) . La actividad se determinó por medio de un incremento en p-nitrofenolato a 400 nm y representa un valor promedio de tres mediciones individuales. El resultado de las pruebas de reciclado muestra que la actividad de la enzima se mueve, en el ámbito de la desviación estándar, al mismo nivel para todos los ciclos. Por lo tanto, el reciclado no tiene efecto sobre la actividad BglA. La cepa de BglA por lo tanto puede reutilizarse por lo menos dos veces después de ser recuperada de la mezcla de reacción.

Reciclado de Exocelulasa CelK: Actividad de pNPCasa La actividad de la exocelulasa se determina fotométricamente con p-nitrofenol-celobiósido (pNPC) por medio del incremento en p-nitrofenolato 400 nm (actividad de pNPCasa) . Esto se realiza al incubar la cepa CelK (DO5780.5) con pNPC durante durante 4 minutos a pH 6 y 60°C. Después las células se sedimentan y se mide la actividad nuevamente después de resuspensión (ciclo 1 y 2) . La actividad se determinó por medio de un incremento en p-nitrofenolato 400 nm y representa un valor promedio de tres mediciones individuales. El resultado de las pruebas de reciclado muestra que la actividad de la enzima se desplaza, en el ámbito de la desviación estándar, al mismo nivel para todos los ciclos. El reciclado por lo tanto no tiene efecto sobre la actividad de CelK. Al igual que con la cepa BglA, la cepa CelK de esta manera puede ser reutilizada por lo menos dos veces .

Reciclado de la endocelulasa Cel5A: Actividad de CMCasa La actividad de endocelulasa se calculó al determinar los azúcares reductores por medio del análisis DNS (actividad de CMCasa) . Esto se realizó al incubar la cepa Cel5A (DOS7820) con CMC durante 15 minutos a pH 6 y 60°C. Después las células se sedimentaron y la actividad se midió nuevamente después de la resuspensión (ciclo 1 y 2) . Los azúcares reductores liberados se detectaron por medio del análisis DNS a 540 nm. Los valores determinados son valores promedio de tres mediciones individuales. La actividad de Cel5A mostró una disminución después de la primera recuperación de aproximadamente 14% (ciclo 1) . Después de otro reciclado (ciclo 2) se registró una caída en la actividad de aproximadamente 63%, por comparación con la actividad básica (ciclo 0) . Contrario a la cepa BglA y CelK, el reciclado de la cepa Cel5A se asocia con una reducción en la actividad. Debido a la caída en la actividad después de este primer ciclo es moderada, no obstante, la cepa Cel5A puede ser reutilizada por lo menos una vez.

EJEMPLO 7; ANALISIS DE PAPEL FILTRO (FPA) El FPA es un método estándar para el análisis de actividad de celulasa en su totalidad (exo-, endocelulasa y ß-glucosidasa) y fue desarrollado por Mandéis efc al en 1976. De acuerdo con la IUPAC (siglas para Unión Internacional De Química Pura y Aplicada) la FPA se lleva a cabo utilizando una tira de papel filtro de 1 x 6 cm (Whatman No. 1) como sustrato estándar (aproximadamente 50 mg) y 1.5 mi de volumen total. La unidad internacional para actividad de papel filtro (FPU, por sus siglas en inglés) se define como micromol de equivalente de glucosa (azúcares reductores) liberados por minuto. Con la FPA, no más de 2 mg de glucosa deben ser liberados a partir de 50 mg de papel filtro (4% de conversión) en 60 min. Debido a la estructura de la celulosa, la degradación no es lineal. Por lo tanto, únicamente una conversión de hasta 4% se describe como lineal. Los azúcares reductores formados se determinan utilizando el método de DNS . Puesto que la actividad ahora puede ser detectada para cada celulasa de autopresentacion, ahora debe investigarse la actividad sinergística . Esto se realiza al producir una mezcla de la totalidad de las tres celulasas y determinar la actividad FP.

Análisis FP a escala de placa de microtitulacion Debido al volumen total de 1.5 mi y las altas cantidades de reactivo DNS (3 mi por mezcla) que se van a utilizar, la FPA de acuerdo con la IUPAC está muy involucrada si uno decide investigar varias mezclas de celulasa para actividad FP. En la literatura, el análisis FP se describe a escala de placa de microtitulacion con un volumen total de 71 µ? (Xiao Z et al, 2004) . Para hacer esto, se producen placas FP con la ayuda de un punzón. La relación de volumen de reacción de papel filtro se calcula por medio del área de papel filtro (placa FP versus tira FP) . Esto garantiza que incluso a escala de placa de microtitulacion, la mezcla se realiza de acuerdo con la IUPAC. Puesto que no se conoce cuál es la mejor relación de mezcla de las celulasas de autopresentacion individuales, se prueban diversas mezclas para determinar actividad FP. Mezclas sin la cepa BglA se mezclan con ß-glucosidasa a partir de almendras. La cepa hospedadora (BZ) y la placa FP con amortiguador (BS) se utilizan como controles. La actividad de Fpasa se determina después de períodos de incubación variables a 60 °C por medio de los azúcares reductores liberados por medio del análisis DNS . Antes de la medición todas las mezclas se combinan durante 10 min con ß-glucosidasa para asegurar que la celobiosa aún no convertida se degrada en glucosa, lo que resulta en una determinación más precisa de los azúcares reductores. Después de separar las células, los azúcares reductores en el sobrenadante se determinan a 540 nm. El resultado se muestra en las figuras 20A-20B. Tanto la mezcla de celulasa con ß-glucosidasa disponible comercialmente así como la mezcla con la totalidad de las tres celulasas autopresentadas mostraron una conversión del papel filtro. Después de 5 días de incubación a 60°C, la mezcla 50:50 (CelK:CeI5A) demostró ser la mejor. Los controles utilizados son negativos y no muestran conversión del papel filtro (figura 20A) . La cantidad de los azúcares reductores liberados se determina en mg de glucosa/ml utilizando la curva estándar de glucosa (véase la figura 20B) . Después de 5 días se obtienen aproximadamente 0.2 mg/ml. Debido a la estructura amorfa y cristalina de la celulosa, la degradación no es una reacción lineal. Con el fin de determinar la actividad de FPasa en FPU/I, por lo tanto, como se establece de acuerdo con la IUPAC, se consultan los valores de medición de 1 h. Los resultados se resumen en la Tabla 6.

TABLA 6 Estándar del análisis FP Debido al volumen total bajo (71 µ?) utilizado para la conversión de la placa FP, se demostró que es difícil separar las células después de 3 días, dado que la placa FP ha absorbido casi la totalidad del fluido. Por lo tanto, el análisis FP estándar de acuerdo con la IUPAC se lleva a cabo con un volumen total de 1.5 mi. Se utiliza una escala de placa de microtitulación como control. Para hacerlo de esta manera, la totalidad de las tres celulasas de autopresentación se mezclan en la misma relación y se incuban, primero con 1 x 6 cm de tira de papel filtro (estándar) y en segundo lugar con una placa de papel filtro (micro) durante 3 días a 60°C. La cepa hospedadora y el papel filtro sin células (BS) se utilizan como controles. El resultado se muestra en las figuras 21A-21B. Se puede observar que se forman más azúcares reductores en la mezcla estándar después de 3 días a 60°C, en comparación con la mezcla micro. En la mezcla estándar la combinación es mejor, dado que las células están en contacto en todo momento con la tira de papel filtro. En la mezcla micro, la mayor parte de las células están por encima de la placa de papel filtro de manera que no todas las células están en contacto con el FP en todo momento. Los dos controles utilizados mostraron, como se esperaba, actividad nula de FPasa (figura 21A) . La cantidad de azúcares reductores liberados se determina con ayuda de la curva estándar de glucosa, en mg de glucosa/ml (véase la figura 21B) . En la mezcla micro, después de 3 días a 60°C, se determinan 0.06 mg/ml de azúcares reductores. En contraste, en la mezcla estándar se obtienen 0.38 mg/ml. Debido a un mejor mezclado, por lo tanto, se obtiene un mejor rendimiento de 6.3 veces.

EJEMPLO 8: CONVERSION DE MADERA DE ALAMO Se ha demostrado que las celulasas de autopresentación pueden degradar papel filtro (véase las figuras 20A-20B) . Puesto que el papel filtro no contiene lignina y únicamente una proporción muy pequeña de hemicelulosa, ahora necesita utilizarse un sustrato más complejo. Para esto, se utiliza álamo tratado con presión de vapor. La hemicelulosa se remueve por el tratamiento previo, aunque la lignina aún está presente. En primer lugar, la lignina forma una barrera física puesto que cubre las superficies de las celulasas y en segundo lugar una barrera química, puesto que las celulasas se pueden unir por lignina y de esta manera, de nuevo, ya no tienen acceso a la celulosa. Con el fin de investigar la degradación de álamo por las celulasas, se mezclan las celulasas de autopresentación en partes iguales y se incuban con álamo 4% durante 88 h a 60 °C. La cepa hospedadora y el álamo en el amortiguador sin células (BS) se utiliza como controles. Después de la incubación, el álamo y las células se sedimentan por centrifugación. El sobrenadante se utiliza adicionalmente para determinar los azúcares reductores formados por medio del análisis DNS . El resultado se muestra en la figura 22. Los sobrenadantes muestran un color amarillento incluso antes de la medición, similar a la del reactivo DNS. Por lo tanto, después de incubación con el reactivo DNS, los valores de absorción a 540 nm son mayores, en comparación con los del análisis FP, en el cual los sobrenadantes son transparentes (véase las figuras 20A-20B) . No es posible determinar la concentración, en mg de glucosa/ml, puesto que no existen estándares de glucosa adecuados disponibles. No obstante, una absorción mayor después de 88 h a 60 °C se observa con las celulasas en comparación con los dos controles usados. Las celulasas de autopresentación de esta manera son capaces de convertir sustratos incluso más complejos.

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Miller GL (1959) Analytical Chemistry 31:426-428 Xiao Zhizhuang, Storms R, Tsang A (2004) Biotechnology and Bioengineering 88 (7) : 832-837 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una molécula de ácido nucleico, caracterizada porque comprende los siguientes componentes: (1) una sección que codifica para un péptido señal, (2) una sección que codifica para una celulasa eteróloga, (3) una sección opcional que codifica para un sitio de reconocimiento de proteasa, (4) una sección que codifica para un enlazante transmembranal, y (5) una sección que codifica para un dominio transortador de un autotransportador o una variante del mismo.

2. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la celulasa es una beta-glucosidasa o una endo- o exocelulasa, que preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de endocelulasa de Bacillus subtilis, exocelulasa de Clostridium thermocellum y beta-glucosidasa de Clostridium thermocellum.

3. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio transportador de un autotransportador se selecciona del grupo que comprende Ssp, Ssp-hl, Ssp-h2, PspA, PspB, Ssal, SphBl, AspA/NalP, VacA, AIDA-I, IcsA, MisL, TibA, Ag43, ShdA, AutA, Tsh, SepA, EspC, EspP, Pet, Pic, SigA, Sat, Vat, EpeA, EatA, Espl, EaaA, EaaC, Pertactina, BrkA, Tef, Vag8, PmpD, Pmp20, Pmp21, proteasa IgAl, App, Hap, rOmpA, rOmpB, ApeE, EstA, Lip-1, McaP, BabA, SabA, AlpA, Aae, NanB y variantes de los mismos.

4. La molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque contiene una secuencia de control de expresión unida operativamente a la molécula de ácido nucleico, la cual de manera preferible puede ser activada al agregar isopropiltioglucopiranosido (IPTG) o arabinosa.

5. Un polipéptido, caracterizado porque es codificado por una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un microorganismo caracterizado porque expresa en su superficie un polipéptido de conformidad con la reivindicación 5, o ha sido transformado utilizando una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

7. El microorganismo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque se basa en un microorganismo gramnegativo, preferiblemente Escherichia coli.

8. Una fracción de membrana, caracterizada porque se puede obtener a partir de la célula de conformidad con la reivindicación 6 o la reivindicación 7.

9. Un método para producir un producto de reacción utilizando por lo menos una celulasa, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: (i) preparación de un microorganismo de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, o una preparación de membrana de conformidad con la reivindicación 8, y (ii) poner en contacto el microorganismo y/o la preparación de membrana con uno o más sustratos de celulasa bajo condiciones compatibles con la actividad celulasa.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el producto de la reacción catalizada por la celulasa es un mono- o di- u oligosacárido y en donde por lo menos un sustrato de celulasa es una fuente de polisacárido, preferiblemente una fuente de celulosa.

11. El método de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque la etapa (ii) se lleva a cabo a un pH en el intervalo de 4.5 a 6.5, preferiblemente en el intervalo de 5.5 a 6.5.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque la etapa (ii) se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de 30 a 80°C, preferiblemente en el intervalo de 50 a 65°C.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque en la etapa (ii) se agrega una glucosidasa.

14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado porque incluye una etapa adicional (iii) de recuperar el microorganismo utilizado en la etapa (ii) .

15. Un método para producir un microorganismo, el cual presenta una celulasa recombinante en su superficie, caracterizado porque incluye: a) la inserción de una secuencia de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el microorganismo, y b) opcionalmente , el tratamiento del microorganismo con una sustancia la cual activa la expresión de la secuencia de control .