MX2014001981A

MX2014001981A - Método de formación de apósito biológico para regeneración de piel (tegumento) y sus anexos tegumentarios mediante células adherentes clonogénicas de origen endometrial.

Info

Publication number: MX2014001981A
Application number: MX2014001981A
Authority: MX
Inventors: Ricardo Rangel Martinez
Original assignee: Ct Biotecnologico De Terapias Avanzadas S A De C V
Priority date: 2014-02-19
Filing date: 2014-02-19
Publication date: 2014-10-07
Also published as: MX363247B

Abstract

La presente invención tiene que ver con dispositivos y métodos para el aislamiento de microexplantes adherentes endometriales y sus células estromales clonogénicas derivadas de estas, obtenidas del flujo menstrual, con aplicación medica como biológica que contempla el uso de dispositivos y métodos para el aislamiento de microexplantes surgidos de clonación de explantos, adherentes endometriales y células estromales clonogénicas derivadas, obtenidas del flujo menstrual, desarrollo y empleo para la construcción de apósitos biológicos para regenerar o restaurar o sanar heridas de la piel o tegumento; como su cultivo cosecha y empleo de las mismas para la construcción de apósitos biológicos para regenerar o restaurar o sanar heridas de la piel producto de lesiones por quemadura (radiación ó química) ulceras de cualquier tipo u origen, lesiones por fricción o cualquier otro mecanismo que provoque la pérdida de la integridad estructural de la piel, anexos tegumentarios, y circulación anexa al área de la herida de la piel. Conformado por dispositivos y métodos para la recolección, aislamiento de microexplantes que permite la clonación de explantos, adherentes endometriales y de células estromales clonogénicas para la restauración de lesiones que provoquen la pérdida de la integridad estructural de la piel o tegumento, anexos tegumentarios como circulación anexa al área dañada.

Description

MÉTODO DE FORMACIÓN DE APOSITO BIOLÓGICO PARA REGENERACIÓN DE PIEL (TEGUMENTO) Y SUS ANEXOS TEGUMENTARIOS MEDIANTE CÉLULAS ADHERENTES CLONOGÉNICAS DE ORIGEN ENDOMETRIAL.

CAMPO TECNICO Método o procedimiento con aplicación medica como biológica que contempla el uso de dispositivos y métodos para el aislamiento de microexplantes surgidos de clonación de explantos, adherentes endometriales y células estromales clonogénicas derivadas, obtenidas del flujo menstrual, desarrollo y empleo para la construcción de apositos biológicos para regenerar o restaurar o sanar heridas de la piel o tegumento producto de lesiones diversas como ulceras de cualquier tipo u origen, lesiones por fricción o cualquier otro mecanismo que provoque la pérdida de la integridad estructural.

OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención, según se expresa en el enunciado del apartado descriptivo, se refiere a una invención relativa a un novedoso aposito biológico que guarda como propósito ser empleado en la regeneración de la piel o tegumento que se encuentra o sufriera alteraciones en su arquitectura sea por diversas causas en donde implique fricción, calor, radiación, entre otras como la formación de úlcera como consecuencia de enfermedades crónico-degenerativas, por permanencia de posición, o por efectos del envejecimiento.

Conformado por dispositivos y métodos para el aislamiento de microexplantes que permite la clonación de explantos, adherentes endometriales y de células estromales (constituye ciertos tipos de tejido conjuntivo) clonogénicas derivadas obtenidas del flujo menstrual, su cultivo, desarrollo y empleo para la construcción de apositos biológicos para regenerar o restaurar de la piel producto de lesiones diversas sea por quemadura ( radiación ó química) ulceras de cualquier tipo u origen, lesiones por fricción o cualquier otro mecanismo que provoque la pérdida de la integridad estructural de la piel o tegumento, anexos tegumentarios como circulación anexa al área dañada.

ANTECEDENTES En la actualidad existe la línea y trabajos de investigación de las células madre adultas, en particular, las células madre mesenquimaticas ó mesenquimales, también denominadas células estromales mesenquimales, células tallo o células troncales mesenquimaticas; se trata de una subpoblación de células con capacidad de autorrenovación, pluripotencia ( pueden producir más de un tipo de célula especializada del organismo, pero no todos los tipos), inmunomodulación e inmunotolerancia, estas células fueron aisladas en la década de 1970 pero fue hasta la década de 1990 que se consiguió caracterizar fenótipicamente a estas células. En un principio, la fuente de obtención de células madre mesenquimaticas ó mesenquimales { MM) fue la médula ósea misma que es cosechada por punción a la cresta iliaca; las muestran de estas células presentan características importantes que las diferencian de las células madre hematopoy éticas que actualmente son utilizadas para la regeneración de la medula ósea en paciente que enfrentan enfermedades relacionadas al sistema sanguíneo como leucemias, linfomas, anemias, entre otras diversas A diferencia de las células hematopoyéticas, las células mesenquimales no expresan marcadores o moléculas en la superficie de la membrana celular relacionada al estirpe hematopoyético, por lo tanto son negativas al antígeno CD34, CD45, HLA-DR y otros marcadores similares; asimismo muestran un inmunofenotipo surgido de la aplicación de la técnica para estudiar la proteína expresada por las células, característico entre las que se incluyen las moléculas: CD73, CD90, CD105, CD44, entre otras con características de linaje mesenquimal; se ha comprobado que estas células una vez aisladas cumplen con las tres características principales requeridas para ser consideradas como células tallo, estas células no se establecen como especializadas hacia un linaje específico, por lo cual se someten a una división simétrica posible en una expansión m Vitro guardando como resultado multiplicar hasta en 60 veces su población inicial sin perder dicha propiedad o diferenciarse hacia un linaje en particular. Bajo los estímulos externos y señales bioquímicas apropiadas, estas células poseen la facultad de reprogramar su núcleo para iniciar la síntesis de proteínas que le darán un fenotipo particular con funciones fisiológicas específicas, por tanto estas células pueden diferenciarse a células del linaje endodérmico y ectodérmico además del mesodérmico, demostrándose así su carácter pluripoténte dado que pueden producir más de un tipo de célula especializada del organismo. En condiciones "/>; Vitro" estas células han sido capaces de diferenciar a células adipocíticas, cardiomiocito, condorcito, célula hepática, pancreática, de linaje neural, endotelial, pulmonar, por mencionar algunos; por tal motivo se les considera como una herramienta ideal en la disciplina de la medicina regenerativa.

Además de esta propiedad, la célula mesenquimal genera una cantidad considerable de moléculas bioactivas que generan un efecto considerable en el impulso inicial a los mecanismos regenerativos propiamente dichos, secretando factores de crecimiento celular las cuales estimulan a las células residentes en órganos y tejidos específicos a dividirse y regenerar áreas afectadas o no funcionales, al tiempo que secretan factores anti-inflamatonos inhibiendo el efecto negativo de la inflamación crónica en los órganos dañados, de igual forma las células secretan una gran cantidad de factores angiogénicos los cuales promueven una revascularización en tejidos dañados. Por otra parte ha sido comprobado que secretan proteínas de remodelación tisular como las metaloproteinasas, la cuales degradan proteínas de la matriz extracelular presentes en lesiones sometidas a un microambiente pro-ínflamatono y que inducen de forma localizada a la producción de tejido fibrótico y con ello generan la substitución de un tejido funcional por otro inverso; resultando que la propiedad de remodelación puede llegar a invertir el proceso descrito, generando una remodelación funcional del tejido. En este sentido, existe una propiedad de igual interés de las células madre mesenquimales que versa sobre la inmunomodulación e inmunotolerancia; en los estudios iniciales in Vi tro se descubrió que en el co-cultivo de células mesenquimales, sea en sistemas de cultivo de mezcla de linfocitos tanto unidireccionales como bidireccionales, se modificaban los resultados clásicos de esta prueba. Habitualmente dicha prueba era rutinaria para detectar diferencias de las moléculas de histocompatibilidad entre donador y receptor en el trasplante de médula ósea; en el cultivo unidireccional se arrestaba a una de las sub-poblaciones en cuanto a su posibilidad de poder dividirse, ya sea con radiación ó alguna substa cia química que inhibiera su división celular, como resultado, se esperaba que si existiera diferencias en las moléculas de histocompatibilidad, la población de células no arrestadas de linfocitos T reconocería estas diferencias, activándose y dividiéndose en respuesta a las diferencias antigénicas vistas desde el punto vista molécular por el receptor del linfocito T, para entonces realizar una medición de la incorporación de timidina tntiada para cuantificar esta respuesta de activación y división celular, en estos pasos, se agregan células madre mesenquimales desarrolladas in Vitro, estas eran capaces de inhibir dicho efecto de forma inesperada Rápidamente se descubrió que las células mesenquimales secretan una gran cantidad de interleucinas y otras moléculas accesorias que tienen un profundo efecto sobre la biología clásica de las células del sistema inmunológico; en general se han identificado más de 1 5 moléculas que cambian dramáticamente el destino funcional de los linfocitos y otras células del sistema inmunológico. Por ejemplo, se ha estudiado el efecto de las células madre mesenquimales sobre los linfocitos T activados y se han observado varios mecanismos de interés; uno de ellos se refiere al cambio de perfil de secreción de citocínas que induce la células mesenquimal sobre los linfocitos CD8+ citotóxicos; al entrar en contacto célula-célula o a través de mediadores solubles, el linfocito CD8+ se transforma en un Linfocito CD8,CD4+ FoxP - - el cual secreta ahora citocínas del perfil TH2 de inmunomodulación e inmunotolerancia. La inhibición de linfocitos T activados y linfocitos B t se ha visto alterada de igual forma por la presencia de la molécula HLA-G, la cual se expresa tanto en la membrana de la célula mesenquimal como en forma soluble, en la cual funciona como un mediador de inmunomodulación y anti-inflamación a larga distancia técnicamente con gran relevancia a nivel sistémico Los elementos y propiedades enlistadas han permitido utilizar a estas células para el tratamiento de la llamada enfermedad injerto contra huésped (EICH), la cual se presenta cuando no existe una compatibilidad al 1 00% entre el donador y el receptor en el trasplante de medula ósea; dado que el receptor ó paciente en dichos casos se encuentra mielo-ablativo por el efecto de la quimioterapia y/o la radio terapia, el paciente no posee sistema inmunológico, y por otra parte las células del donador no sólo están compuestas por células madre hematopoyéticas sino también se encue tra una gran cantidad de células del sistema inmunológico del mismo sujeto, las cuales son totalmente inmuno-competentes, capaces de detectar aquellas diferencias en las moléculas de histocompatibilidad del receptor Como consecuencia se activan o reaccionan y se multiplican los linfocitos T citotóxicos del donador, viajando a todo el cuerpo e iniciando un daño generalizado, centrándose el ataque a los epitelios y endotelios tanto de la piel como del intestino; como tratamiento habitual, se administran mmunosupresores para inhibir esta respuesta por parte de las células del donado Existen un gran número de casos en que el paciente se torna refractario al medicamento inmunomodulador (sustancia que modifica la capacidad del sistema inmune de ejercer una o mas de sus funciones), por lo que la enfermedad injerto contra huésped (E1CH ) se generaliza llevando al paciente a un estado de alto nesgo e incluso se degenera en la muerte del sujeto En estos casos y similares se a logrado controlar esta enfermedad mediante el empleo de dosis que van de 1 a 3 millones de células mesenquimales por kilogramo de peso. dichos ensayos se comenzaron en el año 2000 y en los 13 años transcurridos, la Food and Drug Administraron (FDA) de los Estados Unidos de Norteamérica dio por permitido el primer medicamento en donde el principio activo es la célula madre mesenquimal alogénica viva, lo cual ha generado un enorme interés en todas las instituciones de investigación del mundo y hasta la fecha se han registrado más de 300 protocolos clínicos ante la Food and Drug Administraron (FDA) en más de 100 enfermedades crónico degenerativas y autoinmunes A la fecha ya existen vanas metodologías para el aislamiento de células madre mesenquimales, entre estos métodos se incluyen: • Centrifugación diferencial.

• Centrifugación en gradiente de densidad, • Depleción de eritrocitos con hidroxietíi almidón o cualquier otro polímero de alto peso molecular que se una a los eritrocitos y deje un plasma rico en células mononucleares, • Selección positiva con perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos monocionales específicos para el aislamiento de células mesenquimales, • Selección negativa mediante el empleo de perlas magnéticas recubiertas con anticuerpos monocionales dirigidas a poblaciones celulares no deseables • En el caso de tejidos sólidos se emplea la digestión enzimática con colagenasa o tripsina o alguna otra enzima que digiera la matriz extracelular que circunda a la célula de interés para luego someterse a ¡os métodos antes mencionados.

El cultivo y expansión de las células aisladas se realiza con metodologías estandarizadas, empleando para ello medios de cultivo comerciales pudiendo se estos el medio medio de cultivo mínimo esencial modificado con sales de Dubelcco (DMEM) (Biowhittaker), en sus variantes bajo en glucosa o alto en glucosa; de forma general estos medios se complementan con antibióticos y un porcentaje conocido de suero fetal bovino, también existen medios libres de suero animal suplementado con factores de crecimiento recombinantes para promover la proliferación de las células en cultivo; otros métodos de cultivo emplean lisados plaquetanos autólogos para promover la proliferación celular Estas células han demostrado ser estables en los cultivos de largo plazo, comprobándose su estabilidad crómosomica y funcional después de duplicar su población inicial por más de 60 veces, dado que para su aplicación terapéutica, estas células deben expandirse para obtener dosis celulares que van de 1 a 3 millones de células por kilogramo de peso, para tal propósito se debe realizar la cosecha por métodos estandarizados los cuales pueden ser enzimaticos ó mecánicos, pudiéndose utilizar la tripsina o un gendarme (varil la cilindrica moldeada en polipropileno de 4.7 mm. ø y 203 mm. de longitud con un final plano en diagonal) respectivamente; las células obtenidas deben trabajarse en laboratorios que sigan la filosofía de trabajo "Good Mamifaclíiring l'raciice.s la cual busca garantizar la obtención de producto terapéutico grado clínico Las células obtenidas bajo estos procesos pueden almacenarse por largos periodos de tiempo, siendo posible crio-preservarlas en nitrógeno líquido, existiendo protocolos que permiten ir disminuyendo la temperatura a tasa controlada, a razón de un grado centígrado por minuto; estos protocolos aunado a los agentes cno-protectores utilizados, garantizan obtener tras la descongelación altos porcentajes de viabilidad, lo cual se traduce en traduce en el caso de la restauración de heridas o lesione Se han descrito varios métodos que buscan imitar la arquitectura de la piel, así se han constando capas de queratinocitos y fibroblastos autólogos para propiciar la regeneración dérmica, de igual forma se han realizado constructos de estas mismas células con proteínas de la matriz extracelular como lo es la colágena, esta proteína tiene la capacidad de gelificarse bajo condiciones de reacción específicas, lográndose obtener una capa gelatinosa en donde se encuentran embebidos los queratinocitos y fibroblastos, también se ha empleado el uso de gel de fibrina o plasma rico en plaquetas autólogo Otra aproximación ha sido la utilización de membrana amniótica des-celularizada y sembrada con queratinocitos y fibroblastos autólogos para generar una membrana que intentara regenerar la piel; los geles de fibrina también se han empleado usando células mesenquimales de médula ósea autóloga y se han colocado en forma de empaste sobre heridas y quemaduras. En la actualidad, cada uno de estos sistemas como otros diversos requieren tomar biopsias de piel para ser capaces de obtener las células que se mezclan con las proteínas naturales ó sintéticas para lograr obtener discretas cantidades de substituto dérmico con la desventaja temporal de su desarrollo en plazo de 02 o 03 semanas para ser capaces de obtener cantidades suficientes de células y sean empleadas en las heridas de las personas que presentan lesiones o daños, al mismo tiempo existen membranas de queratinocítos liofil izados y crio-preservados para su aplicación en quemaduras, sin embargo estos productos no e trcgan los beneficios de la aplicación de células vivas La presente invención no solo describe una método para la colecta de flujo menstrual en un sistema cenado, su aislamiento, cultivo y recolección, sino también descube un método de constaicción de aposito biológico preparada con células madre endometnales adhe entes y alogénicas/universales con alta capacidad regenerativa; lográndose construir apositos para cubrir áreas corporales de más del 90% de la superficie corporal promedio en tan solo algunas horas, en una ventaja temporal inmensa con aplicación casi universa! Esta innovación permite tener un producto de utilización inmediata con el objeto de la restauración/regeneración de heridas de la piel prov ocadas por procesos crónico degenerativos como las ulceras, lesiones de la piel provocadas por quemaduras ( químicas ó por radiación ) ó lesiones de la piel provocadas por fricción; esto cen una gran repercusión ya que se reducen los tiempos de hospitalización de una manera dramática, además de inhibir Sos procesos cicatrizales fibróíicos que en un gran numero de casos generan serios problemas psicológicos en los pacientes y ios concomitantes problemas de rechazos social BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es una vista en perspectiva frontal de los elementos dispositivo cerrado de recolección cerrado con vtsta en el receptor del flujo, la tubería o tubo anexo y bolsa colectora La figura 2 es una vista superior del receptor del flujo en acercamiento con orificio en el mismo La figura 3 es una vista lateral de acercamiento de la bolsa colectora del dispositivo cenado La figura 4 es una vista interior de los elementos del disruptor de coágulos conformado por aros disruptores La figura 5 es una vista frontal de la campana de flujo laminar donde se procesan las muestras de flujo menstrual La figura 6 es una vista lateral del denominado dispositivo disruptor de mucinas en el que se ingresa la muestra una vez diluida con solución salina y tras la homogenización de la muestra; constituido por bolsa de procesamiento de volumen fijo y entrada especial para anexo de jeringa ¡ ! La figura 7 es una vista en perspectiva frontal de la placa de cultivo celular en donde se desarrollan las células endometnales en un medio de cultivo de expansión a las células estromales adherentes.

La figura 8 es una vista en perspectiva frontal del aposito biológico como se observa en su contenido y presentación en done se contiene las células madre inesenquimales endometnales La figura 9 es una vista en perspectiva lateral del tubo cónico estéril de 1 mi para el vertido de soluciones.

La figura 10 es una vista en perspectiva frontal del cnoviales de criopreservación donde se establen las células cnopreservadas en la solución de criopreservación La figura 1 1 es una vista en perspectiva front l de la malla de alginato La figura 12 es una vista lateral en perspectiva del dispositivo que guarda función de contenedor de almacenamiento La figura 13 es una vista lateral en perspectiva de la gelatina grado medico utilizada por el presente método La figura 14 es una v ista lateral en perspectiva de la pipeta v olumétrica de 10 mi estéril DESCRIPCION DETALLADA HI método de formación de aposito biológico para regeneración de piel (tegumento ) y sus anexos tegumentarios mediante células adherentes clonogénicas de origen endometria, se encuentra conformado por las células adherentes provenientes de los micro-explantes aislados del flujo menstrual (0 1 ), para lo cual se obtiene donadoras sanas de entre las edades de 1 8 y 25 años a las cuales se realizan estudios serológicos y moleculares para descartar cualquier infección como por ejemplo: Hepatitis B y C, Sífilis. Chagas, Brusella. H1V tipo 1 y 11, Otomegalovirus, HTLV, HPV, aun a pesar de resultados favorables para la recolección se realiza un seguimiento de 40 días para repetir el estudio y eliminar la presencia de falsos negativos por el efecto de periodo ventana que presentan algunos virus.

Confirmados los resultados le es colocado a la donadora por especialista el dispositivo cerrado (02) este paso se realiza a su vez de un seguimiento clínico de la donadora, con miras a disminuir el nesgo de contaminación de la muestra, con este objetivo el especialista realiza estudios microbiológicos para descartar cualquier infección de vías urinarias, útero ó matriz; siendo posible la administración de manera profi láctica antibióticos en fechas cercanos o relativas al ciclo menstrual de la donadora sobre el flujo menstrual; realizando la recolección durante los días de mayor flujo, tentativamente el pnmeio y segundo día de la menstruación Se asea el área de los genitales extemos pre io ¾ la colocación del dispositivo cerrado (02 ) para que el especialista introduce el receptor del flujo (03 ) en el cuello uterino, mientras que la donadora es sujeta aun a una posición cómoda que le permita mantenerse inclinada para aplicar el efecto de la gravedad, el flujo recorre el dispositivo cerrado (02) colector del flujo menstrual, hasta la bolsa colectora del dispositivo cerrado (04) para la colecta del flujo menstrual Dicho dispositivo cerrado (02) permite aislar permite aislar el flujo menstrual en un sistema cerrado que mantiene la esterilidad de la muestra colectada, consta de un receptor del flujo (03 ) construido de un materia! hipo-alergénico que puede constituirse de siltcona o cualquier polímero natura! ó sintético aprobado para su uso en humanos, contando a su vez con un orificio en ¡a base del receptor del flujo (05) el cual se une directamente con tubería o tubo anexo (06) que dirige ei flujo menstrual a la bolsa colectora del dispositivo cerrado (04 ).

La tubería o tubo anexo (06) unido al orificio en Sa base del receptor del flujo (05 ) esta constituido de material plástico ó cualquier otro material poliménco, natural ó sintético, la tubería o tubo anexo (06) de dicho dispositivo se une a su vez a un dis ruptor de coágulos (07) conformado por aros disruptores (08 ) el cual está conformado por una llave de tres vías la cual se dirige a una jeringa con embolo de capacidad variable en su volumen no limitado capaz de constituir cantidades de 3, 5, 1 0,20 o 50 mi. Dicha jeringa contiene un adaptador consistente en un cilindro que contienen su interior vanas hileras de alambre, acero inoxidable o plástico ó hilo de cualquier naturaleza que permite actuar como disruptor de coágulos (07 ) conformado por aros disruptores (08); a! hacer succión con el embolo de la jeringa v forzar y dirigir el flujo menstrual a través de dicho disruptor de coágulos (07) conformado por a ros disruptores (08) para lograr que flujo continuo su camino hacia la bolsa colectora de! dispositivo cerrado (04 ).

Dicho dispositivo cerrado (02) d irige el flujo menstrual a través del receptor del flujo (03 ), a través del orificio en la base del receptor del flujo (05), hacia la tubería o tubo anexo (06) que dirige hacia el disruptor de coágulos (07) conformado por aros disruptores (08) y posteriormente hacia la bolsa colectora del dispositivo cerrado (04) la cual se encuentra constituida con plásticos o polímeros de materiales permitidos para su uso en humanos y para la colecta de sangre como su traslado. Dicha bolsa colectora del dispositivo cerrado (04) está establecida con compuertas o portales de entrada que permiten el ingreso de lenngas para la colecta de la muestra y su postenor procesamiento en el laboratorio; la bolsa colectora del dispositivo cerrado (04) puede tener un volumen variable de contención volumétrica por lo que puede constituirse para cualquier volumen necesario La bolsa colectora del dispositivo cerrado (04) se separa, sella y envía al laboratorio técnico para su procesamiento siguiendo los criterios internacionales para el envío de muestras biológicas; esto con miras para su aplicación en el aislamiento y cultivo de micro-expiantes aislados del flujo menstrual (01 ) y el cultivo de las células derivadas de estos micro-expiantes aislados del flujo menstrual (0 1 ) de tej ido endometrial para su uso terapéutico, ingeniería de tejidos e ingeniería genética. La muestra de flujo menstrual colectada por medio del dispositivo cerrado (02) es extraída de los contenedores de transportación para su limpieza y esterilización y registro en la base de datos del laboratorio de procesamiento Esta bolsa colectora del dispositivo cerrado (04) se introduce al área de trabaio de recepción de muestras en donde se inspecciona sus características físicas externas e internas, el cual confirma que no muestra ningún indicio de ruptura o alteración en su contenido La bolsa colectora del dispositivo cerrado (04) desinfectada es introducida a la campana de flujo laminar (09) o cualquier otro tipo de gabinete de seguridad o área estéril de trabajo para evitar que las muestras de flujo menstrual se contaminen durante su manipulación \ procesamiento.

Utilizando técnicas asépticas, se procede a diluir las muestras de flujo menstrual, ! : l con solución salina, medio de cultivo, solución amortiguadora de fosfatos, cualquier solución isotónica o cualquier solución fisiológica o que garantice la estabilidad de la muestra y no cause n ingún daño a la misma y por lo tanto no afecte la y características fisiológicas de las células que se pretenden aislar A continuación se procede a la homogenización la muestra pudiendo ser este paso de manera manual ó mecánica, la homogenización manual se realizara dentro del gabinete de biosegundad, invirtiendo y moviendo vanas veces el conten ido de la bolsa; de manera mecánica se logra la homogenización de la muestra utilizando cualquier agitador rotatorio, v ibrante u oscilatorio a una revolución adecuada que no dañe el contenido de las muestras de flujo menstrual; terminado dicho proceso se punciona uno de los portales con goma para sacar el contenido total con un jeringa y embolo de volumen suficiente para contener la totalidad del volumen contenido en la bolsa colectora del dispositivo cerrado (04 ) relativo a , el cual contenido en la jeringa se enrosca al dispositivo dis ruptor de imicinas ( 1 ).

Dicho dispositivo disruptor de mucinas ( 10) está compuesto por una bolsa de procesamiento de volumen fijo, este v olumen fijo puede estar determinado de fabricación y no limitada a un volumen específico, lo que significa que a pesar de ser de volumen fi|o, este puede l legar a fabricarse con cualquier volumen final, 5. 10, 20, o50 mi; asimismo presenta una entrada especial para anexo de jeringa, conteniendo a las muestras de flujo menstrual y esta a su vez se enlaza con un dispositivo disruptor de mucinas ( 10) que queda justo en medio entre la bolsa de procesamiento de volumen fijo y la jeringa, procediendo a que ¡as muestras de fl ujo menstrual se hagan fl uir en vanas ocasiones a través del dispositivo disruptor de mucinas ( 10 ) para lograr la licuefacción de la muestra y con esto eliminar los hilos densos de mucma presentes en las muestras de flujo menstrual, llevándose a cabo mediante la apl icación de fuerza de empuje y llenado, succión y vaciamiento de las muestras de flujo menstrual La licuefacción consiste en eliminar o disminui r la densidad/viscosidad elevada o incrementada por efecto de la presencia de mucinas siendo que en una muestra licuada, el proceso de licuefacción rompe los hilos densos y largos de mucma, reduciéndolos de tamaño y perdiéndose asi la v iscosidad característica del fl ujo menstrual , siendo de suma relevancia ya que este permitirá el adecuado asentamiento de las células endometriales o trozos de tej ido endometrial ( I I ) para conseguir su adherencia a las placas de cultivo celu lar ( 1 2 ) Se procede a real izar la siembra de células endometriales o trozos de tejido endometrial ( 1 1 en placas de cultivo celular ( 1 2 ), dichas placas tratadas o no con proteínas que incremen ten la capacidad de adherencia, al igual de existir la posibilidad de uti lizar cualquier dispositivo o bio-reactor que permite ei crecimiento masivo de los micro-explantes aislados del flujo menstrual (01 ) y células endometriales o trozos de tejido endometrial ( 1 1 ) adherente Estas células se al imentan con medio Dulbecco's odi fied Eagle Médium DM EM bajo en glucosa, sin piruvato y magnesio, este medio mínimo esencial se suplementa con una sol ución de antibióticos y antimicóticos; adicionalmente se suplementan con suero fetal bovino, lizado plaquetano o con citocínas y factores de crecimiento reeombinantes humanos, generando medio de cultivo de expansión. Los micro-explantes aislados del flujo menstrual (01 ) se adhieren a la superficie de las placas de cultivo celular ( 12), dentro de las primeras 24 a 72 horas de cultivo de las muestras de flujo menstrual procesadas bajo el método descrito, después de este plazo se desecha el excedente de la muestra procesada y se lava la placa con cualquier solución amortiguadora de fosfatos, cualquier solución salina a ph fisiológico o cualquier medio de cultivo celular con ph fisiológico. Estos lavados se realizan vertiendo de 10 a 20 mi de dichas soluciones en las placas de cultivo celular ( 1 2) que contiene los micro-explantes aislados del flujo menstrual (01 ) adheridos en la superficie de la placa; higieniza realizando movimientos gentiles laterales para que se desprendan los eritrocitos, muemas y otros elementos celulares no adherentes y que se pretenden elim inar a través de estos lavados La eficiencia de los lavados se puede vigilar al observar bajo al microscopio la cantidad de material remanente después de! primer lavado, en general se realizan de 2 a 3 lavados por cada una de las píacas de cultivo celular ( 12), para asegurar que se el iminarán todos los elementos celulares no adherentes; de igual forma es viable utilizar cualquier tipo de agitador orbital o de agitación con velocidad regulable para permitir un movimiento gentil del contenido de la solución de lavado dentro de la placa de cultivo celular Después se procede a colocar una cantidad conocida de medio de cultivo de expansión medio de cultivo complementado y que permite el apropiado crecimiento de las células adherentes que se pretenden expandir in Varo: a partir de estos micro-ex plan tes aislados del flujo menstrual (01 ) se real izara la expansión cionogénica de las células estromales adherentes aislados.

Las placas de cultivo celular ( 12 ) serán vigiladas para determinar su esterilidad y su patrón de crecimien to para llevar un registro detal lado de la dinámica de crecimiento celular, este registro es digital y en medios físicos, el medio de cultivo se reemplaza cada tercer d ía para permitir que las condiciones fisio lógicas dentro de las placas de cultivo celular ( 1 2 ) sean las apropiadas y permitan su adecuado crecimiento celular y la expansión cionogén ica de las células estromales adherentes aisladas Cada medio condicionado que se coseche de estas placas será preservado en refrigeración/congelación para su posterior uso en la construcción de los apositos biológicos ( 13), cada medio condicionado producto de la permanencia y contacto con las células estromales endometnales adherentes en crecimiento dentro de las placas de cultivo celular ( 12 ), resulta neo en factores de crecimiento e interieucinas y atoci nas derivadas de estas el cual tienen un alto valor biológico y regenerativo importantes para el propósito de la presente invención Una vez que las placas de cultivo celular ( 1 2 ) alcanza el 100% de confl uencia, defin iendo a esta como el crecimiento máximo celular que abarca el 1 00% de la superficie de la placa de cultivo en ¡a que se encuentran creciendo las células estromales adherentes deri vadas de los micro-expl ntes aislados del flujo menstrual (0 1 ) , se procede a realizar la cosecha de estas cél ulas empleando métodos estandarizados para la cosecha de células adherentes; en este caso, se util iza la enzima tripsina al 0 25% con E I A para remitir una estabil idad y adecuado funcionamiento de la enzi ma, se uti liza a razón de 2-4 mi por placa y se incuba a 37° por a l menos 5 minutos para permitir que se desprendan la totalidad de las células adheridas a la placa de cultivo, posteriorme te se vigila en el microscopio invertido para constatar el desprendiendo de las células y en la campana de flujo laminar (09) se procede a parar la reacción colocando de 4 a 8 mi de medio completo suplementado con 20% de suero letal de bov ino, el conten ido total de la placas de cultivo celular ( 12) se traspasa a un tubo cónico estéril de 15 mi ( 14) para proceder a centrifugarlo a 2000 rpm por 1 0 minutos, transcurrido este tiempo se desecha el sobrenadante y el botón celular recuperado se homogeniza para posteriormente agregar a! menos 10 mi de cualquier solución de lavado con la finalidad de eliminar los residuos de tripsina y medio de cultivo, en dos ocasiones agregando la solución de lavado y centrifugando a 2000 rpm por 10 minutos, la solución de lavado consiste en una solución fisiológica, solución amortiguadora de fosfatos o cualquier otra solución con pH fisiológico; complementado lo anterior las células se resuspenden en un volumen conocido para ser cnopreserv adas o para ser incluidas en la construcción de los apositos biológicos ( 13) La cnopreserv ación de las células o células criopreservadas se realiza siguiendo métodos estandarizados en este caso al concentrado celular se le agrega la solución de cnopreserv ación la cual contiene 50% de di metí I sulfoxido DIVISO y 50% de DEXTAN 40, esta solución deberá constituir el 25% del volumen final a cnopreserv ar. en su aplicación se uti lizan volúmenes finales de 1 , 2, 5 y 10 mi en cnoviales comerciales y validados para este proposito Para realizar y conseguir las células cnopreservadas contenidas en los crioviales de criopreservación ( 15) se someten a un programa de congelación a tasa controlada el programa de congelación es el siguiente Postenor a esto se procede a almacenar los mov íales de criopreservación ( 1 5) en un tanque de nitrógeno l íquido a menos l c>6 grados centígrados o bien en dispositivos que uti lizan una solución de alcohol y que contienen una cámara para colocar los cnoviales en un contenedor de almacenamiento ( 16) que contenga ¡unto con las células, solución de criopreservación y solución de alcohol se introduce en un congelador de -80 grados centígrados, también conocidos como ultracongelado es, esta técnica manual también promueve una congelación continua en donde se logra bajar la temperatura a una razón de un grado centígrado por minuto Estas células cnopreservadas son descongeladas para ser utilizadas en la construcción de los apositos biológicos ( 13) Las descongelación se realiza siguiendo métodos estandarizados, en donde los criováales (He criopresei vación (15) se sustraen del contenedor de almacenamiento (16) y se introducen a un baño maría que está a una temperatura de 37 grados centígrados. El tubo criovial se introduce y se mantiene dentro del agua a la temperatura marcada aplicando ligeros movimientos de homogenizacíón del contenido a la vez que en cuanto se observa la remanencia de algunos cristales de hielo en el interior del tubo, se procede a su apertura para introducir un mililitro de medio completo a 37 grados centígrados para terminar de descongelar en su totalidad a la muestra Todo esto se realiza en campana de flujo laminar (09) utilizando técnicas de manipulación que garanticen la esterilidad de la muestra, postei tormente se procede a trasladar el contenido del criovial a un tubo cónico estéril de 15 mi (14) y se completa a un volumen de ai menos 10 mi con medio completo; de forma inmediata se procede a lavar ias células para eliminar los residuos de dimetil sulfóxido DMSO centrifugando la muestra a 2000 rpm durante 10 minutos, postenor mente se descarta el sobrenadante y se re-suspende el botón de células con solución de lavado para volver a centrifugar y tener una solución celular lista para ser utilizada en la construcción de los apositos biológicos (13) Los apositos biológicos (13) se construye empleando una malla de alginato de calcio (17) gelatina grado médico (18), células estromales adherentcs clonogénicas y medio condicionado derivado del cultivo de las células estromales adherentes de origen endometnal, la malla de alginato de calcio (17) que se emplea para la construcción del aposito biológico es de origen comercial, por lo que se puede emplear cualquiera de estas que se encuentren en el mercado ya sea en su presentación de malla de 10 X 1 0 cm o 10 x 20 cm. en su presentación de tiras ó cualquier otro formato de malla de alginato de calcio (17); la gelatina grado médico ( 18) es de origen comercial, por lo que se puede utilizar cualquier marca que se encuentre en el mercado y su presentación sea en líquido ó en polvo, las células madre mesenqu imales endometriales ( 19) se obtienen bajo métodos estandarizados, estas células se aislan, expanden y cnopreservan a través de métodos señalados; finalmente e! medio condicionado se obtiene tras la exposición de medio de cultivo de expansión bajo en glucosa al crecimiento i Vi tro de las células estromales adherentes clonogénicas de estirpe mesenquimales obtenidas del tejido endomctnai de donadoras sanas.

Par la preparación de la gelatina grado médico (18) se pesan 2 gramos de gelatina grado médico ( 18) y se disuelv en en 30 mi de solución Hanks ó cualquier otra solución balanceada con Ph fisiológico, la cual se calienta por 10 segundos en homo de microondas para lograr la disolución total de la gelatina que se deja enfriar a una temperatura de 37 grados centígrados, permaneciendo la solución en estado líquido; a continuación se procede a la inclusión de las células adherentes endometriales y del medio condicionado a la gelatina.

Se cosechan o colectan siete millones de células estromales adherentes clonogénicas derivadas del tejido endometnal, para tal efecto se toma una de las placas de cultivo celular ( 12 ) de 75 mm a! 100 % de confluencia, se cosechan 20 mi del medio condicionado y se ia a la placas de cultivo celular ( 12) con 20 mi de solución salina, se descarta la solución sal ina v se agregan 3 mi de una solución de tripsina LíD i .V al 0 25% Se permite su incubación por un periodo de tres minutos, para posteriormente parar la reacción con 6 mi de medio Dulbecco's Modified Eagle Médium DM EM bajo en glucosa, v H) % de suero bov ino fetal, el contenido se vierte a un tubo cónico estéril de 15 mi ( 14 ) y se centrifuga a 2000 PM durante 1 0 minutos Pasado este tiempo se descarta el sobrenadante y se realiza un lavado de las células con 10 m i de solución salina, se centrifuga a 2000 RPM , se descarta el sobrenadante y el botón cel u lar se resuspende en solución Hanks en un volumen de 3 mi; Las células resuspendidas en 3 ni i se agregan a 20 mi de medio condicionado cosechado con antelación y postei ionnente esta mezcla se agrega a los 30 m i de gelatina ya preparada y que permanecía en incubación a 37C La malla de alginato de calcio ( 17) de 1 0 x 1 0 cm se coloca sobre una hoja de papel alum in io previamente esteril izada, con una pipeta volumétrica de 10 mi estéril (20)sc agrega la mezcla de la gelatina con las células y el medio condicionado sobre la malla de algi ato de calcio ( 1 7) procurando distri buir homogéneamente sobre la mal la; esta operación se real iza hasta la saturación de la malla de alginato de calcio ( 17), una vez lográndose la saturación , se deja geliftcar el o los apositos biológicos ( 13 ) por un periodo de 10 minutos, transcurrido este tiempo se cubre la malla de alginato de calcio ( ¡ 7) con los borde del pape! alum in io de tal suerte que la malla queda protegida en su totalidad por el papel aluminio Posteriormente se coloca en refrigeración hasta su empacado fi nal

Claims

REIVIND ICAC ION ES Habiendo descrito mi invención, como antecede, considero como una novedad y reclamo de mi propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones I .- El método de formación de aposito biológico para regeneración de piel (tegumento ) y sus anexos tegumentarios mediante células adherentes clonogénicas de origen endometna se encuentra conformado por las células adherentes provenientes de los micro-explantes a islados del flujo menstrual, a través de dispositivos de creación propia con funciones específicos para su recolección higiénica, manejo estéri l y tratamiento de homogenización. conservación a bajas temperaturas, reproducción mediante ambientes y soluciones establecidas como preparación en apositos para uso médico
2 - Un dispositivo y método para la procuración del flujo endometrial a través de un nuevo dispositivo cerrado, que preserva la esterilidad de la muestra colectada, dicho dispositivo cerrado dirige el flujo menstrual a través del receptor del flujo a través del orificio en la base hacia la tubería que dirige el flujo hacia el disruptor de coágulos conformado por aros disruptores y posteriormente hacia la bolsa colectora del dispositivo cerrado la cua i se encuentra constituida con plásticos o polímeros de materiales permitidos para su uso en humanos y para la colecta de sangre como su traslado, la cual está establecida con compuertas de entrada que permiten el ingreso de jeringas para la colecta de la muestra y su postenor procesamiento en el laboratorio
3 - Un método y dispositivo para el procesamiento y disrupción de mucmas contenidas en la muestra de flujo endometrial; el cual está compuesto por una bolsa de procesamiento de volumen con una entrada especial para anexo de jeringa conteniendo a las muestras de ti mo menstrual y esta a su vez se enlaza con un disposit ivo disruptor de mucmas que queda j usto en med io entre la bolsa de procesamiento de volumen fijo y la jeringa, procediendo a que las muestras se hagan fluir en vanas ocasiones a través de! dispositivo d isruptor de mucmas para lograr eliminar los hilos densos de muctna l levándose a cabo mediante succión y vaciamiento de las muestras de flujo menstrual
4 - Un método para el aislamiento directo de microexplantes adherentes aislados del fl ujo endomena!, estas células se alimentan con med io Dulbecco's odified Plagie Médium DM E1VI bajo en glucosa, sin piruvato y magnesio, este medio mínimo esencial se supiemen ta con una solución de antibióticos y antimicoticos; ad icional mente se suplemental! con suero fetal bov ino. Iizado plaquetano o con citocinas y factores de crecimiento recombinantes humanos, generando medio de cultiv o de expansión; mientras que los micro-expiantes aislados del flujo menstrual se adhieren a la superficie de las placas de cultivo, se desecha el excedente de la muestra procesada y se lava la placa con cualquier sol ución amortiguadora de fosfatos, dichos lavados se realizan vertiendo de 1 0 a 20 mi de dichas soluciones en las placas de cultivo celular. Después se procede a colocar una cantidad conocida de med io de cultivo de expans ión que permite el apropiado creci miento de las células adherentes q ue se pretenden expandir in V itro
5- Un método para la construcción de un aposito biológico para la regeneración de la piel y sus anexos tegumentarios, dicho aposito es creado mediante el uso de la malla de alginato de calcio de 10 x 10 cm se coloca sobre una hoja de papel aluminio previamente esterilizada, con una pipeta volumétrica de 10 mi estéril se agrega la mezcla de la gelatina con las células y el medio condicionado sobre la malla procurando distribuir homogéneamente sobre la malla; esta operación se realiza hasta la saturación de la malla una vez lográndose la saturación, se deja gelificar el o los apositos biológicos por un periodo de 10 minutos, transcurrido este tiempo se cubre la malla con los borde del papel aluminio de tal suerte que la malla queda protegida en su totalidad por el papel aluminio.
6 - El uso de microexplantes y las células adherentes clonogénicas de origen endometrial derivadas de estas como agente biológico de regeneración de la piel y sus anexos tegumentarios contenidos en el aposito biológico construido con éstas; estás celular obtenidas de forma mucho menos costosas que otra diversas y surgida de una fuente novedosa al ser recolectadas de forma específica. Dichos microexplantes son instrumentos de gran eficacia debido a su proceso de desarrollo como su origen que los vuelven económica y médicamente viables.
7 - El uso de medio condicionado derivado del cultivo in Vitro de células adherentes de origen endometrial como agente biológico para la regeneración de la piel y sus anexos tegumentarios, este medio es preparada mediante el uso de gelatina grado médico en 2 gramos que se disuelven en 30 mi de solución Hanks la cual se calienta por 10 segundos en horno de microondas para lograr la disolución total de la gelatina que se deja enfriar a una temperatura de 37 grados centígrados, permaneciendo la solución en estado líquido; a continuación se procede a la inclusión de las células adherentes endometriales y del medio condicionado a la gelatina.
8 - El uso de mallas de alginato para la construcción del aposito biológico para la regeneración de la piel y su anexos tegumentarios, esta malla permite el desarrollo de los apositos de forma manipulable en un ámbito contralado que permite de igual forma su aplicación de forma contratada sin requisitos indispensables excepto de su conservación.
9. - El uso de gelatina grado médico para la construcción de apositos biológicos en conjunto con mallas de alginato, células adherentes clonogénicas de origen endometrial y medios condicionados producidas por las mismas; como se ha señalado la misma permite crear el medio condicionado que permite el desarrollo de la células como su reproducción, la cual se desarrolló sobre la malla de alginato para crear un aposito biológico aplicable en cuestiones médicas.
10. - La regeneración de la piel en la que pretende ser usado este aposito biológico incluye lesiones de la piel por accidentes por fricción, calor, exposición a químicos y agentes corrosivos, radiación, en úlceras producidas por posición permanente o enfermedades crónico degenerativas; el uso de dichos apositos no presenta reacciones de rechazo dado al alto grado de asimilación de los mismos con las células de la herida correspondiente.
11 - El uso de células adherentes clonogénicas de origen endometrial, estas células son de origen alogénico y pueden se frescas o criopreservadas; su uso es sustentable y de alto cuidado higiénico, con una reproducción y recolección estrictamente contratada por los dispositivos integrantes del método originales y creados de forma específica para la obtención de las muestras necesarias para el desarrollo de los apositos.
12 - El uso de células adherentes clonogénicas endometriales frescas para la preparación del apósito biológico, lo cual la distingue de diversas del giro al ser una fuente novedosa cuya viabilidad y sustentabilidad surge tanto de sus dispositivos de recolección, de traslado, de preparación y reproducción de las células correspondientes.
13 - El uso de células adherentes clonogénicas endometriales criopreservadas para la construcción del apósito biológico; esa criopreservación permite que el tiempo de vida de las muestras se extienda considerablemente lo que permite la plena explotación de una muestra estableciéndose como una fuente de origen sustentable, novedosa y viable en el desarrollo de apositos con el objeto de reparación de órganos extenores del tegumento.
14 - El empleo de gelatina grado médico de cualquier origen animal ya sea de mamífero ó pez, independientemente del tejido fuente; dado que sus cualidades de forma general generan un ambiente o medio condicionados que al ser tratado resulta adecuado para la reproducción efectiva y eficiente de los micro-explantes necesarios para el desarrollo de los apositos biológicos para la reparación de tejidos dañados por una diversas de razones.