MX2014001345A

MX2014001345A - Metodo y formulacion para inhalacion.

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Publication number: MX2014001345A
Application number: MX2014001345A
Authority: MX
Inventors: Michelle Mcintosh; David Morton; Thomas Sou; Livesey Olerile; Richard Prankerd
Original assignee: Univ Monash
Priority date: 2011-08-01
Filing date: 2011-11-07
Publication date: 2014-11-13
Also published as: WO2013016754A1; PL2739268T3; US20170224762A1; TR201900670T4; RS58456B1; ES2708218T3; AU2011374218B2; CY1121373T1; HRP20190080T1; US20220152145A1; EP2739268A1; CN103841960B; CA2879317A1; MX355833B; AU2011374218A1; US20140294969A1; US12186361B2; ZA201401526B; SMT201900058T1; US11065297B2

Abstract

Esta invención se refiere al suministro de fármaco y, en particular, al suministro de agentes biológicamente activos en la forma de polvos secos para inhalación. La invención también se refiere a métodos para preparar dichas formulaciones en polvo seco y métodos para su uso.

Description

METODO Y FORMULACION PARA INHALACION DESCRIPCION Esta invención se refiere al suministro de fármaco y, en particular, al suministro de agentes biológicamente activos en la forma de polvos secos para inhalación. La invención también se refiere a métodos para preparar tales formulaciones de polvo seco y métodos para su uso.

Cada año, más de 150,000 mujeres, en su mayoría en países en desarrollo, mueren debido a hemorragia posparto. Esta condición es muy prevenible con la administración de fármacos uterotónicos, tales como oxitocina, en la tercera etapa de parto. La Organización Mundial de la Salud ha aprobado oxitocina como la terapia más efectiva en el tratamiento de hemorragia posparto. El uso de oxitocina en países en desarrollo presenta varias dificultades. La oxitocina es un péptido con estabilidad relativamente pobre en solución. Esto entonces requiere de almacenamiento refrigerado, por ejemplo a 2-8°C, que es problemático en países en desarrollo. Una consideración adicional con el uso de oxitocina es que requiere agujas y jeringas esterilizadas y personal entrenado para su administración, otro requisito que no puede garantizarse en naciones en desarrollo. Por lo tanto, un problema que se va a resolver es el desarrollo de un sistema para suministro efectivo y económico de oxitocina para uso apropiado en países en desarrollo, con el fin de prevenir muertes en alumbramiento debido a PPH. Una solución posible a este problema puede ser crear un sistema de suministro pulmonar de polvo seco, adecuado para administración efectiva y solventable de oxitocina, u otros péptidos o proteínas biológicamente activos, que sea adecuado para uso en regiones remotas y ambientalmente demandantes de naciones en desarrollo.

Se ha propuesto el suministro pulmonar por ser una ruta sistémica adecuada para agentes biológicos tales como péptidos, proteínas, vacunas, y agentes basados en ácido nucleico. Los retos al suministrar tales grandes macromolécu las son sustanciales y resultan en una incertidumbre amplia y mayor riesgo en cuanto a la posibilidad de éxito. Los retos comienzan con la generación de un aerosol de dosis apropiada que es adecuado para suministro de pulmón profundo eficiente y consistente. Si puede lograrse tal suministro, el material debe disolverse o volverse disponible en tal forma que puede transportarse a través de las membranas biológicas y otras barreras tales como superficies colindantes de agente tensoactivo y de mucosa. La cinética de disolución determinará el grado de solubilización, y se esperaría que esto se evite por formulaciones hidrofóbicas y por lo tanto se somete material a plazos de limpieza pulmonar antes de ocuparse sistémicamente, como se describió por O'Donnel y Smythe en "Suministro de Fármaco Pulmonar Controlado", Springer 2011, ISBN 978-1-4419-9744-9. Antes que pueda transportarse una macromolecular la circulación sistémica, entonces debe ser capaz de sobrevivir un ataque de los mecanismos de defensa del cuerpo, incluyendo la escalera mucociliar, de peptidasas y de macrófagos. Estos retos se revisan y describen claramente en el texto experto reciente, "Suministro de Fármaco Pulmonar Controlado", publicado por Springer 2011, ISBN 978-1-4419-9744-9. Por ejemplo, se concluyó por Olsson y otros que "para objetivos sistémicos de péptidos y proteínas, el reto parece ser lograr la absorción a una velocidad que es competitiva con relación a la velocidad de mecanismos de limpieza con el fin de asegurar biodisponibilidad suficiente" y "que constituyen las características óptimas en cada caso particular y como éstas puede practicarse a partir de propiedades resumidas permanece lejos de estar claro y nuestro entendimiento actual". Se ha propuesto un inicio rápido de acción para suministro pulmonar con relación a suministro oral de moléculas pequeñas seleccionadas, tal como menos de 781 Da, que son principalmente hidrófilas. Sin embargo, para macromoléculas tales como péptidos y proteínas de peso molecular típicamente del orden 1000 Da y superior, el inicio de acción es altamente incierto y probablemente se va a evitar por una necesidad de mecanismos de difusión paracelular. Las vidas medias para remoción del epitelio pulmonar en la sangre a través de tales membranas son altamente variables e inciertas, pero típicamente parecen requerir varios minutos e incluso más de cientos de minutos, como se describió por Sakagami y Gumbleton en "Suministro de Fármaco Pulmonar Controlado", publicado por S pringer 2011, ISBN 978-1-4419-9744-9. Por lo tanto, claramente una absorción farmacocinética rápida e inicio f armacodinámico del orden de 1 o 2 minutos para un péptido del orden de 1000 Da y mayor no se asumiría sino que sería sorprendente, desde una macromolécula suministrada pulmonar. Habría sido especialmente sorprendente si el sistema de suministro pulmonar compuesto comprendiera un polvo que requirió disolución, e incluso más si esa particular tuviera una superficie hidrófoba.

Cambios adicionales en este contexto incluyen producir un producto física y químicamente estable que se mantiene durante producción, almacenamiento y transporte, y en uso. También es importante que los agentes no causen broncoconstricción. Un péptido tal como oxitocina, que causa contracciones uterinas puede interactuar con receptores presentes en el sistema pulmonar y por lo tanto causar broncoconstricción. También es importante que los agentes no estén metabolizados en el pulmón. Si pueden satisfacerse estos múltiples retos y muy significativos, el suministro pulmonar puede proporcionar ventajas únicas, incluyendo evitar uso de agujas, evitar metabolismo de primer paso a través de la ruta oral, y estabilidad extra ofrecida por formulaciones en polvo.

El secado por aspersión fue muy utilizado durante muchos años para producir productos en polvo en las áreas tal como comida, detergente y químicos industriales. En muchos casos, se producen partículas relativamente grandes y que fluye libremente. A un menor grado, la técnica ha sido adaptada para generar partículas finas y ultra finas, y la innovación aquí ayer ha sido guiada por las industrias de materiales inorgánicos, tal como productores de cerámicas técnicas (T.T. Kodas, Adv. Mater., 1989, 6, 189). Este aspecto para generar pequeñas gotas de soluciones frecuentemente complejas, para formar un aerosol, y luego secar éstas como unidades aisladas en partículas ha sido reconocido como proporcionando control mejorado sobre morfología, estequiometria, pureza, tamaño así como estructura de partícula. Las ventajas pueden observarse como un híbrido entre los aspectos "de arriba abajo" y "de abajo a arriba" de ingeniería de partícula. Sin embargo, la industria farmacéutica únicamente ha reconocido de manera relativa recientemente las ventajas de esta ruta para diseñar partículas finas (R. Vehríng, Pharm Res., 2008, 25(5), 999), y materiales secados recientemente por aspersión han aparecido en sistemas de inhalador de polvo seco comercialmente disponibles. La mayoría de la tensión en esta área ha sido dirigida al impacto de forma, densidad y rugosidad sobre aerosolización.

Sin embargo, es un reto suministrar moléculas de fármaco dentro del tracto respiratorio e incluso dentro del pulmón inferior para proporcionar un efecto terapéutico, especialmente fármacos que son sólidos a la temperatura de administración. Con respecto a eso, mientras los polvos secos presentan un medio atractivo de suministro de fármaco, generar partículas micronizadas adecuadas para aerolización altamente eficiente permanece siendo un reto técnico muy significativo.

Después de la inhalación, las partículas de fármaco aerolizadas más grandes tienden a depositarse por impacto y sedimentación gravitacional en la parte posterior de la garganta y tracto respiratorio superior en donde son propensas a limpieza mucociliar dentro del tracto gastrointestinal y metabolismo subsecuente. También, las partículas de fármaco más grandes no pueden progresar más adentro en el pulmón inferior debido al estrechamiento de los bronquiolos. Se cree que para transporte y suministro de aerosol local efectivo para el sistema respiratorio incluyendo tráquea, bronquios y alveolos, se prefieren partículas de menos de 5 µp? de diámetro aerodinámico, mientras para pulmón profundo, bronquiolos y alveolos, se prefieren partículas de menos de 3 µ?t?, especialmente para absorción sistémica.

Mientras el suministro de inhalación es un medio deseable, una barrera tecnológica significativa a esto sigue siendo la viabilidad de diseñar un aerosol adecuado para suministro altamente eficiente, (por ejemplo: >50% de suministro de dosis al sitio de tratamiento), suministro reproducible (por ejemplo, que tiene un coeficiente de variación (%CV) de suministro de fármaco <10%) y alta carga útil (por ejemplo >1 mg de suministro en polvo al sitio de tratamiento) en un formato práctico y económico que comprende un dispositivo y una formulación. El suministro de polvo seco proporciona un formato de suministro atractivo. Sin embargo, generar partículas micronizadas adecuadas para aerolización altamente eficiente sigue siendo un reto técnico muy significativo. Además de los problemas mencionados anteriormente, cualquier sistema de suministro de inhalación práctico para polvos secos necesitaría evitar o minimizar aglomeración de las partículas al momento de inhalación, tener baja variación en dosis suministrada debido a propiedades de flujo deficientes o aglomeración inconsistente, y evitar o minimizar remoción incompleta del polvo del dispositivo de suministro causado por adhesión de polvos a las paredes del dispositivo.

En años recientes se ha propuesto una nueva generación de formulaciones en polvo "inteligentes" para inhalación de biomoléculas, frecuentemente formadas a través de secado por aspersión. En muchos casos, estas formulaciones están diseñadas empíricamente, y comprenden un coctel de excipientes cada uno de los cuales se propone para proporcionar uno o más papeles funcionales en la fase sólida. Uno de esos excipientes utilizado en este contexto ha sido el aminoácido L-leucina. Las propiedades ventajosas potenciales proporcionadas al agregar L-leucina, ya sea mediante co-molienda o mediante condensación/precipitación, se demostró primero por Staniforth y Ganderton y otros (Ver por ejemplo WO 96/23485 y WO 00/33811 ). Este trabajo indicó que propiedades físicas peculiares de este aminoácido proporcionaron su comportamiento que mejora el desempeño. Desde entonces varios grupos han estudiado el beneficio que proporciona L-leucina a aerolización en polvo, especialmente cuando se co-rocía con activos y excipientes, sin embargo, la verdadera naturaleza de la relación de estructura-desempeño en tales sistemas permanece poco clara. Más ampliamente, parece claro que ciertos péptidos/proteínas en estructuras de partícula secadas por aspersión, por ejemplo albúminas, isoleucina o tri-leucina, también puedan conferir desempeño de aerosolización mejorado en uso. Alternativamente, materiales de lípido y ácido graso también proporcionan algún beneficio con respecto a esto, tal como fosfolípidos (por ejemplo DPPC), lecitinas o sales de ácido graso (por ejemplo estearato de sodio o magnesio).

Ahora se ha encontrado sorprendentemente que L-leucina puede utilizarse para tomar ventaja en procedimientos para preparar polvos secos para inhalación a través de secado por aspersión, y puede resultar en la formación de polvos secos adecuados en circunstancias en donde, en la ausencia de L-leucina, partículas adecuadas no se formarán en absoluto o inmediatamente se fundirían o se aglomerarían de manera irreversible.

Por consiguiente, en un primer aspecto la presente invención proporciona un método para preparar un polvo seco para inhalación que comprende: preparar una solución y/o suspensión acuosa que comprende una proteína o péptido biológicamente activo, uno o más mono, di- o polisacáridos y/o aminoácidos capaces de formar una matriz de vidrio amorfa, y L-leucina; y el secado por aspersión de la solución o suspensión acuosa para producir un polvo seco adecuado para inhalación.

Sin desear estar limitado por teoría, se cree que la L-leucina se concentra en la superficie de las partículas formadas, posiblemente debido a su hidrofobia, de tal forma que se estabilizan las partículas y de manera que se inhibe aglomeración. También se ha encontrado que las partículas así formadas han sido protegidas de degradación, disminución de temperatura de transición de vidrio y recristalización de humedad atmosférica u otra, de manera que no requieren el uso de un ambiente de empaque libre de humedad al mismo grado que formulaciones en polvo seco actuales. Esto también permite que los polvos secos de la presente invención se utilicen en regiones remotas y ambientalmente demandantes de naciones en desarrollo. Los retos al producir un polvo que contiene una macromolécula biológica que es adecuada para inhalación, son bien reconocidos y han sido reportados de manera extensiva siguiendo la falla para comercializar exitosamente el producto de insulina inhalado Exúbera. Aunque algunos de los retos técnicos fueron atendidos al desarrollar el producto Exúbera, fue necesario proporcionar un dispositivo inhalador muy complejo, costoso e impráctico, además el polvo fue extremadamente sensible a húmeda teniendo que manejarse en ambientes de muy baja humedad. Muchos factores adicionales contribuyeron a su falla, incluyendo biodisponibilidad e incertidumbre en su destino en el pulmón. Esta falla de producto ha enfatizado la complejidad extrema al desarrollar una solución al problema aquí descrito.

Como se utiliza aquí el término "matriz de vidrio amorfa" se refiere a una matriz en la cual se dispersa proteína o péptido biológicamente activo que es sustancialmente no cristalino, o no tiene regiones sustanciales de cristalinidad u orden molecular estructural repetitivo regular.

La solución/dispersión además puede incluir componentes, que incluyen otros aminoácidos, albúminas y derivados de aminoácido tales como tri-leucina, que también puede ayudar en la formación y estabilización de la formulación de polvo seco. Dependiendo del uso final de la formulación, pueden incorporarse otros fármacos, incluyendo fármacos no peptídicos. La proteína o péptido biológicamente activo, otros fármacos u otros componentes pueden estar en solución o suspensión, y también pueden incluirse excipientes adicionales, tales como agentes estabilizadores, tensoactivos y similares.

Por consiguiente, como se utiliza aquí, una referencia a una "solución y/o suspensión" o "solución/suspensión" indica una mezcla de agua y otros componentes en los cuales pueden disolverse algunos componentes (es decir en solución) y algunos componentes pueden estar en suspensión, o pueden estar en la forma de una nano-suspensión, emulsión o micro-emulsión. La solución acuosa puede incluir otros co-solventes en algunas modalidades.

El líquido acuoso puede incluir otros co-solventes en algunas modalidades. El término "acuoso" se entenderá que hace referencia a un líquido que está constituido al menos en parte por agua pero puede incluir otros líquidos miscibles con agua tal como un alcohol (por ejemplo etanol, isopropanol). En cualquier caso el experto reconocerá que el líquido acuoso debe ser adecuado para secado por aspersión de acuerdo con los métodos de la invención.

Las formulaciones de polvo seco de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento o prevención de enfermedades o condiciones, dependiendo de los péptidos o proteínas biológicamente activos incorporados en las formulaciones. Cuando el péptido o proteína biológicamente activo es un antígeno, la formulación en polvo seco puede utilizarse como una vacuna.

El agente biológicamente activo puede de ser cualquier proteína o péptido, o combinación de los mismos. La presente invención es específicamente adecuada para formulaciones del péptido, oxitocina, sus derivados (incluyendo análogos y agonistas) así como otros agentes similares tal como vasopresina y desmopresina. Pueden utilizarse formulaciones que contienen oxitocina y/o sus derivados en el tratamiento o prevención de hemorragia postparto (PPH). En tales circunstancias la formulación también puede incluir otros componentes adecuados para tratar o prevenir PPH, tal como ergometrina y fármacos relacionados. Las formulaciones que contienen oxitocina y/o sus derivados también pueden ser útiles al tratar ansiedad y autismo, así como para inducir modificación de comportamiento. Por ejemplo, enfermedades psiquiátricas o condiciones incluyendo autismo, esquizofrenia, ansiedad, estrés y depresión incluyendo depresión posparto: cáncer incluyendo de pecho, de ovario y carcinoma endometrial, como un fármaco de estilo de vida que involucra confiar, unir y tratar disfunción sexual, el tratamiento de dolor tal como dolor de cabeza crónico, en lactancia y en fertilidad, masculino o femenino.

Los componentes utilizados para formar la matriz de vidrio amorfa en el polvo seco por aspersión final pueden ser cualquiera adecuado de mono, di- o polisacárido y/o aminoácido. Por ejemplo, este componente puede comprender D-manitol y glicina. Estos componentes generalmente se disolverán en el agua de la solución/suspensión acuosa.

En otra modalidad este componente puede comprender trehalosa o inulina. Un experto en la técnica estaría consciente de sacáridos y/o aminoácidos adecuados para este propósito. Alcoholes de azúcar por ejemplo pueden incluir xilitol y sorbitol. Monosacáridos, por ejemplo, pueden incluir pero no están limitados a glucosa (dextrosa), fructosa (levulosa), galactosa, xilosa y ribosa, y pueden incluir cualquier combinación de estereoisómeros. Los disacáridos pueden, por ejemplo, incluir pero no están limitados a lactosa, sacarosa, trehalosa, maltosa. Alternativamente puede incluir trisacárido tal como rafinosa, tetrasacáridos tales como estaquiosa, pentasacáridos tales como verbascosa.

Las partículas micronizadas, que opcionalmente contienen uno o más agentes fisiológicamente activos, además pueden incluir uno o más portadores, diluyentes o excipiente farmacéuticamente aceptables. Otros excipientes pueden incluir, pero no están limitados a, agentes volumétricos, agentes reguladores de pH y estabilizadores tales como citrato de sodio, potenciadores de absorción, proteasa e inhibidores de peptidasa, agentes modificadores de sabor u olor, modificadores de adhesión, agentes de flujo, modificadores de disolución, o mucolíticos.

Los polvos p ueden formularse adicionalmente por combinación con cualquiera de las partículas portadoras conocidas, u otros existentes aditivos tales como modificadores de sabor, olor o sentido organoléptico. También puede lograrse una mejora el granular el polvo en pellas suaves con flujo de polvo mejorado, y selección apropiada de inhalador de polvo seco por consiguiente.

Las partículas de la formulación en polvo seco típicamente tienen un diámetro aerodinámico medio de masa de menos de 10 mieras, más preferiblemente menos de 5 pm y muy preferiblemente menos de 3 pm. Preferiblemente la L-leucina representará entre 5 y 50% en peso de los ingredientes secos de la formulación. Más preferiblemente, la L-leucina comprenderá entre 10 y 40% en peso de los ingredientes secos de la formulación.

Como se utiliza aquí el término "diámetro aerodinámico" (Dae) se define como el diámetro de una esfera de volumen equivalente de densidad de unidad con la misma velocidad de asentamiento terminal que la particular real en cuestión. La deposición pulmonar de polvos farmacéuticos generalmente se expresa en términos de comportamiento aerodinámico de la partícula. Las partículas bajo la influencia de gravedad se asentarán a la tierra a cierta velocidad. En diámetro aerodinámico, se asume que esa velocidad puede medirse y toma en cuenta la densidad de unidad de partícula (pa), densidad de partícula (pp), densidad de unidad de una esfera equivalente (Deq), factor de forma dinámico (X). Para partículas más grandes que aproximadamente 1 µ?t?, aplica la siguiente ecuación para hacer referencia a diámetro aerodinámico y esfera de volumen equivalente de densidad de unidad.

El término "diámetro aerodinámico medio de masa" ("MMAD") es una representación estadística de la distribución de tamaños de partícula graduados de acuerdo con diámetro aerodinámico, definido aquí como el diámetro aerodinámico medio expresado en una base pesada en masa, y es un parámetro ampliamente aceptado utilizado por científicos de aerosol. El diámetro aerodinámico medio de masa (MMAD) puede medirse por un método de impactador de farmacopea como se definió por la Farmacopea de E.U.A., utilizando un impactador de cascada de Andersen, o por Impactador de Siguiente Generación (NGI). Con respecto a esto, con el fin de que el polvo seco sea altamente aerolizable, las partículas generalmente tendrán un diámetro aerodinámico medio de masa de menos de 10 pm, pero preferiblemente menos de 6 µ?t?, preferiblemente menos de 5 µ??, más preferiblemente menos de 3.5 µ?? o muy preferiblemente menos de 2 pm.

La dosis emitida (ED) es la masa total del agente activo emitido del siguiente accionamiento de dispositivo. No incluye el material izquierdo en las superficies internas o externas del dispositivo, o en el sistema de medición incluyendo, por ejemplo, la cápsula o blíster.

La ED se mide al recolectar la más emitida total del dispositivo. Puede conducirse en un aparato frecuentemente identificado como un aparato de muestreo de uniformidad de dosis (DUSA), y al recuperar esto por un ensayo químico húmedo cuantitativo validado (es posible un método gravímetro, pero esto es menos preciso). Alternativamente, en donde se utiliza un impactador o absorbedor, la ED se mide al combinar la dosis recolectada a través de todas las etapas del sistema de impactador o absorbedor respectivo.

La dosis de partícula fina (FPD) es la masa total de agente activo que se emite del dispositivo siguiendo accionamiento que está presente en un tamaño de partícula aerodinámico más pequeño que un límite definido. Este límite generalmente se le toma para ser 5 µ?t? si no se menciona expresamente para ser un límite alternativo, tal como 3 µ?t?, 2 µ?? o 1 µ?t?, etc. La FPD se mide utilizando un impactador o absorbedor, tal como un absorbedor de etapa doble (TSI), absorbedor de etapa múltiple (MSI), impactador de cascada de Andersen (ACI) o un impactador de siguiente generación (NGI). Cuando se utiliza un TSI, la FPD generalmente se toma a 6.4 µp? ya que su absorbedor tiene únicamente un punto cortado que se estima en este valor. Cada impactador o absorbedor tiene puntos cortados de recolección de tamaño de partícula aerodinámica predeterminados para cada etapa. El valor de FPD entonces se obtiene por interpretación de la recuperación de agente activo etapa por etapa cuantificada por un ensayo químico húmedo cuantitativo validado (es posible un método gravimétrico, pero esto es menos preciso) en donde se utiliza un corte de tapa simple para determinar FPD o se utiliza un interpolación matemática más compleja de la deposición de etapa por etapa.

La fracción de partícula fina (FPF) se define normalmente como la FPD dividida por la ED y expresada como porcentaje. Aquí, la FPF de ED se indica como FPF (ED) y se calcula como FPF(ED) = (EPD/ED) x 100%.

La fracción de partícula fina (FPF) también puede definirse como la FPD dividida entre la MD y expresada como un porcentaje.

El secado por aspersión puede llevarse a cabo utilizando equipo de secado por aspersión bien conocido por un experto la técnica. Se ha encontrado que el uso de L-leucina en la solución para secado por aspersión permite que se logre secado por aspersión a temperaturas más bajas que las temperaturas generalmente requeridas para este propósito. Ya que las temperaturas utilizadas en el procedimiento de secado por aspersión pueden causar la descomposición del agente activo esto es una ventaja particular de la presente invención. Por ejemplo, el secado por aspersión de las soluciones/suspensiones de la presente invención puede lograrse a temperaturas de menos de 80°C, preferiblemente menos de 60°C, más preferiblemente menos de 40°C y muy preferiblemente menos de 70°C o a temperaturas ambiente. Dependiendo de la configuración de secadora por aspersión, estas temperaturas pueden indicar la temperatura de entrada de secadora o temperatura de salida, pero preferiblemente indicará la temperatura experimentada por las pequeñas gotas de secado, que debido al efecto de enfriamiento evaporativo es frecuentemente la temperatura de salida del sistema.

El polvo seco preparado por la presente invención es novedoso y presenta un aspecto adicional de la presente invención. De acuerdo con este aspecto se proporciona una formulación en polvo seco que comprende: una proteína o péptido biológicamente activo, una matriz de vidrio amorfa que comprende uno o más mono, di- o polisacáridos y/o aminoácidos, y L-leucina.

En una modalidad preferida la matriz de vidrio amorfa comprende D-manitol y glicina, trehalosa y/o inulina. Alternativamente, puede comprender un polímero tal como un dextrana, un PVA o PVP, o cualquier material que forma vidrio conocido tal como aquellos conocidos en liofilización de secado por congelamiento.

Las partículas de formulación en polvo seco tendrán al menos una porción de la L-leucina localizada en la superficie. En una modalidad preferida, la superficie comprenderá al menos una cobertura de 50% por la L-leucina, más preferiblemente más de 75% y muy preferiblemente más de 90%. La valoración de presencia de L-leucina en la superficie puede medirse directamente utilizando una técnica tal como ToFSIMS (espectroscopia de masa de ion secundaría de tiempo de vuelo) o XPS (espectroscopia de fotoelectrón de rayos X). Alternativamente puede valorarse por cromatografía de gas de fase inversa. Un método preferido para valorar es el acercamiento indirecto descrito a continuación a través de medición de cohesión de polvo.

Como se mencionó anteriormente, se cree que la concentración de L-leucina en la superficie actúa para proteger las partículas secas de aglomeración y la entrada de humedad.

Los polvos secos de la presente invención pueden administrase utilizando equipo y técnicas conocidas en la técnica. Con respecto a esto, existen muchos dispositivos de inhalación descritos en la técnica para el propósito de permitir a un paciente inhalar un polvo seco y este equipo puede utilizarse para la administración de los polvos secos de la presente invención.

Los dispositivos inhaladores de polvo seco (DPI) son bien conocidos en la técnica y existe una variedad de diferentes tipos. Generalmente, el polvo seco se almacena dentro del dispositivo y se extrae del lugar de almacenamiento con accionamiento, del dispositivo, después de lo cual el polvo se expulsa del dispositivo en la forma de un humo de polvo que se va a inhalar por el sujeto. En la mayoría de los DPI, el polvo se almacena en una forma unitaria, por ejemplo en blíster o cápsulas que contienen una cantidad predeterminada de la formulación en polvo seco.

Algunos DPI tienen un depósito de polvo y se miden dosis del polvo dentro del dispositivo. Estos dispositivos de depósito pueden estar menos favorecidos en donde el tratamiento es probable que sea uno o un pequeño número de dosis en un tratamiento aislado.

Los inhaladores de polvo seco pueden ser pasivos o activos. Los inhaladores pasivos son aquellos por los cuales se aeroliza polvo utilizando el flujo de aire extraído a través del dispositivo por los pacientes por la respiración hacia adentro de los pacientes, y dispositivos activos son aquellos por los cuales se aeroliza el polvo por una fuente separada de energía, que puede ser, por ejemplo, una fuente de gas comprimido tal como el dispositivo Nekiar Exúbera o dispositivo Vectura Aspirar, o una forma de energía mecánica tal como vibración (tal como el dispositivo de microdosis) o impacto.

Los dispositivos inhaladores de polvo seco adecuados para usarse en la presente invención incluyen dispositivos de "dosis individual", por ejemplo el Rotahaler (marca registrada), el Spinhaler (marca registrada) y el Diskhaler (marca registrada) en donde se introducen dosis individuales de la composición en polvo dentro del dispositivo, por ejemplo, en cápsulas o blísteres de dosis individual. Los dispositivos pueden presentarse como pre-medidos por ejemplo con polvo en una tira de blíster (como con el dispositivo GSK Diskus) en donde el formato pre-medido comprende múltiples dosis) o en donde el paciente inserta una forma de dosis externa pre-medida, tal como una cápsula que contiene el fármaco, por ejemplo Boehringer Ingelheim Handihaler, o Miat Monodosis) .

Alternativamente, el dispositivo puede ser un dispositivo de depósito, en donde se mide la dosis de polvo dentro del dispositivo de un depósito de polvo durante manejo de paciente (por ejemplo el Astra Turbuhaler). Puede utilizarse cualquiera de estos tipos de dispositivo inhalador.

El dispositivo puede ser preferiblemente un dispositivo de uso individual, o uno que está diseñado para usarse con un pequeño número de dosis, y puede ser desechable. Por ejemplo, el dispositivo Twincer, el dispositivo Direct Haler, el dispositivo TwinCaps o el Puff-haler. Una ventaja de estos dispositivos es su simplicidad, pequeño número de componentes y bajo costo. Preferiblemente se prefiere un dispositivo con menos de 10 componentes independientes. Más preferiblemente, 5 o menos, muy preferiblemente 3 o menos.

Existe un número de factores asociados con los dispositivos de suministro que afectarán la eficiencia de dosificación lograda. En primer lugar, existe la extracción de la dosis. Adicionalmente, la dinámica del humo de polvo generado también afectará suministro de dosificación. Preferiblemente, el dispositivo permitirá una alta dosis emitida, y desaglomeración de alta eficiencia. La desaglomeración de alta eficiencia frecuentemente está asociada con altos niveles de impacto de polvo en accionamiento. El dispositivo puede tener una resistencia de flujo de aire media baja o alta.

Se debe apreciar, que las composiciones de la presente invención pueden administrase ya sea con dispositivos inhaladores ya sea pasivos o activos.

El suministro de proteínas y péptidos biológicamente activos en la ruta pulmonar utilizando una formulación en polvo seco inhalable requiere la solubilización de las partículas cuando entran en contacto con la membrana de mucosa de los pulmones y liberación y absorción subsecuentes de la proteína o péptido. Aunque se cree que la L-leucina proporciona una forma de revestimiento hidrófobo a las partículas secadas por aspersión suficiente para proporcionar estabilidad mejorada y vida útil, particularmente en ambientes calientes y húmedos, se ha encontrado sorprendentemente que no interfiere con la capacidad de que los polvos liberen las proteínas y péptidos para absorción en el pulmón. Previamente, se ha mostrado que las partículas de revestimiento con excipientes hidrófobos pueden retrasar la disolución por períodos significativos, como en WO 01/76575. De hecho se encontró que para una formulación secada por aspersión que comprende oxitocina que la absorción de oxitocina y el tiempo de inicio de acción es particularmente rápido, y considerablemente más rápido que los métodos actuales y la formulación utilizada para administrar oxitocina durante el parto. Por consiguiente, se encontró sorprendentemente que el suministro de oxitocina a través de inhalación dentro del pulmón proporciona ventajas significativas sobre rutas de administración actuales.

Por consiguiente, en un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un polvo seco para inhalación que comprende oxitocina y/o un derivado de la misma, y un portador pulmonar aceptable, tal como una matriz de vidrio amorfa para la oxitocina, en donde más de 40%, preferiblemente más de 50%, más preferiblemente más de 60% y muy preferiblemente más de 65% de las partículas de polvo seco con inhalación tiene un diámetro aerodinámico de menos de 5 µ??, más preferiblemente menos de 3 µ??. Preferiblemente el diámetro aerodinámico medio de masa (MMAD) de la nube de aerosol generada es menor que 5 prn, más preferiblemente menor que 3 µ?t?, más preferiblemente incluso menor que 2.5 µ?p, y muy preferiblemente menor de 2 pm.

Las formulaciones en polvo seco de acuerdo con este aspecto de la invención son especialmente adecuadas para usarse en el tratamiento o prevención de hemorragia postparto (PPH). La invención también proporciona el uso de oxitocina y/o un derivado de oxitocina en la fabricación de un polvo seco para inhalación para el tratamiento o prevención de PPH. La invención también proporciona un método para el tratamiento o prevención de PPH que comprende administrar a un sujeto que lo necesita por inhalación una cantidad efectiva de un polvo seco que comprende oxitocina o un derivado de oxitocina. Preferiblemente la formulación en polvo seco está en la forma descrita anteriormente.

En una modalidad preferida de este aspecto de la invención la matriz de vidrio amorfa comprende uno o más mono-, di- o polisacáridos y/o aminoácidos, y muy preferiblemente la matriz incluirá L-leucina, preferiblemente en cantidades y proporciones como se describió anteriormente. Sin embargo, en otras modalidades la matriz de vidrio amorfa comprende un polímero inerte adecuado para suministro pulmonar, tal como una polivinilpirrolidona o alcohol polivinílico o polímero de políetilenglicol o propilenglicol o copolímeros. Las matrices compuestas de estos polímeros también pueden incluir componentes tales como Ieucina, isoleucina o tri-leucina para mejorar la estabilidad de las partículas y para asegurar que tienen un diámetro aerodinámico apropiado.

De acuerdo con esta modalidad el polvo seco además puede incluir uno o más de otros agentes fisiológicamente activos, y además incluir uno o más componentes farmacéuticamente aceptables o pulmonares aceptables, tales como aquellos descritos previamente. En una modalidad preferida el portador pulmonar aceptable incluye citrato de sodio, o un estabilizador para el componente de oxitocina.

Las partículas micronizadas de acuerdo con este aspecto de la invención típicamente son preparadas mediante secado por aspersión como se describió anteriormente bajo condiciones adecuadas que pueden determinarse por el experto. El término "secado por aspersión" pretende abarcar cualquier procedimiento en el cual se forma una solución de uno o más solutos o suspensión en un líquido, por lo cual el líquido es físicamente atomizado d entro de pequeñas gotas individuales que entonces se secan para formar un polvo en partículas seco. Puede abarcar cualquier forma de un procedimiento de formación de pequeña gota a partícula, y puede abarcar procedimientos relacionados tales como secado por congelamiento por aspersión, congelamiento por aspersión y secado intermitente por aspersión. Las pequeñas gotas pueden formarse por cualquier procedimiento de atomización conocido, incluyendo pero no limitado a atomización por presión, atomización neumática, atomización de dos fluidos o múltiple, atomización de disco giratorio, atomización electrohidrodinámica, atomización ultrasónicas, y cualquier variante de tales procedimientos de atomización. La atomización puede ocurrir de una fuente de aspersión o múltiples fuentes. La aspersión de vehículo líquido puede o no ser acuosa y puede comprender opcionalmente co-solventes más componentes adicionales disueltos o suspendidos. El líquido puede incluir un material que es un vapor o sólido a condiciones ambientales pero existe como un líquido bajo las condiciones de procedimiento seleccionadas. Las pequeñas gotas formadas pueden secarse al aplicar calor en la forma de un gas desecado calentado, o puede aplicarse calor en otras formas, por ejemplo de manera radiante de las paredes de la cámara de secado o como microondas. Una vez recolectadas de este procedimiento de secado, las partículas además pueden secarse o acondicionarse a un nivel de humedad controlado a través un procedimiento tal como secado por vacío o secado por congelamiento. Alternativamente el secado puede lograrse mediante congelamiento seguido por secado o por aplicación de vacío.

Se reconocerá que cualquier otro medio para obtener tales partículas también se contempla aquí, por ejemplo síntesis de fluido supercrítica, síntesis de emulsiones o cualquier otra forma de precipitación controlada que forma partículas sustancialmente esféricas. Alternativamente puede utilizarse cualquier forma de reducción de tamaño, titulación, molienda o co-molienda para obtener partículas de tamaño adecuado.

Las partículas pueden obtenerse y diseñarse en cualquier sistema de ingeniería de partícula conocido, tal como pero no limitado por lo siguiente: tecnología de Pulmosphere™ o Pulmosol™ desarrollada por Nektar, tecnología de partícula porosa AIR™ desarrollada por Alkermes, tecnología de Technosphere™ desarrollada por Mannkind, tecnología de Powderhale™ desarrollada por Vectura, partículas creadas por métodos de sonocristalización Prosonix, partículas creadas por tecnologías de nano-molienda húmedas o secas por ejemplo desarrolladas por Elan, Hovione o Savara.

Las partículas micronizadas del polvo seco para inhalación son de un tamaño adecuado para aerolización e inhalación, teniendo un tamaño físico menor que 15 µ?p, tal como menor que 10 µ?t?, o menor que 6 µ??, o menor que 5 pm, o menor que 3 pm o menor que 2 pm. Las partículas de acuerdo con esta modalidad tendrán un diámetro aerodinámico medio de masa de menos de 10 µ??, pero preferiblemente menor que 5 pm, o menor que 3 pm.

Típicamente, además de los equivalentes de tamaño discutidos anteriormente, 90% de las partículas en volumen pueden tener un diámetro aerodinámico de menos de 10 pm, menos de 8 pm, o menos de 6 pm o menos de 5 pm o menos de 3 pm. El diámetro aerodinámico medio de masa puede medirse por un método impactador de farmacopea como se definió por la Farmacopea de E.U.A., al utilizar un impactador de cascada de Andersen, o por Impactador de Siguiente Generación (NGI). Las partículas de acuerdo con esta modalidad pueden tener un diámetro medio de masa de menos de 5 pm, o menos de 3 pm, que podría medirse por un método de dispersión de luz láser, tal como utilizando un instrumento Malvern Mastersizer 2000.

Con el fin de obtener una alta eficiencia en aerolización también es ventajoso que las partículas exhiban un bajo nivel de cohesión. Típicamente, puede medirse cohesión utilizando una prueba de celda de corte de polvo, tal como la celda de corte de reómetro de polvo Freeman FT4. Ventajosamente, un polvo exhibiría un valor de cohesión medio de menos de 2, más preferiblemente menos de 1.5 y muy preferiblemente menos de 1.

En una modalidad adicional, el suministro respiratorio de oxitocina y/o sus derivados también puede incluir suministro nasal. El suministro nasal involucra inspiración a través de la nariz pero en donde el polvo se recolecta principalmente en la cavidad nasal y cornetes, y en donde la absorción en la circulación sistémica también ocurre. La inhalación nasal es similar a administración pulmonar ya que proporciona una ruta no invasiva de suministro a la circulación sistémica. El suministro nasal evita agujas y permite administración repetida de un dispositivo individual.

Los rangos de dosis pueden calcularse fácilmente y la administración sin importar el volumen de líquido (no dependiente de volumen). Los dispositivos de suministro para suministro nasal en polvo pueden ser diferentes de aquellos requeridos para suministro pulmonar. Ejemplos incluyen dispositivos de Optinose, el Via Nase (Kurve), el Direct-Haler, el Monopowder (Valois) o sistemas de polvo nasales de Bespack. El tamaño de partícula medio de masa para suministro nasal es preferiblemente excedente de 5 pm y más preferiblemente mayor que 10 pm ya que reduce el material que pasa a través de la cavidad nasal y maximiza su deposición en los cornetes nasales. Las formulaciones nasales incluirán un portador nasalmente aceptable y pueden incluir excipientes adicionales tales como polímeros bioadhesivos y potenciadores de penetración, por ejemplo quitosán, HPMC o carbopoles. Es una modalidad especialmente preferida que puedan suministrarse oxitocina o uno de sus análogos o derivados como un polvo formulado que comprende una matriz vidriosa a través de la nariz, en un tamaño de partícula medio de masa mayor que 10 pm para el tratamiento de PPH, u otras condiciones maternales relacionadas tal como depresión posparto, y preferiblemente tienen un inicio rápido de acción. Los polvos secos preparados para suministro pulmonar también pueden inhalarse a través del pasaje nasal dentro del sistema pulmonar, por ejemplo en donde un paciente tiene dificultad inhalando el polvo a través de la boca, aunque este no es un modo preferido de suministro de tales polvos.

La oxitocina es el agente uterotónico de elección de acuerdo con la Organización Mundial de la Salud para uso en el manejo activo de tercera etapa de trabajo de parto, debido al inicio rápido de acción, perfil de efecto secundario mínimo y la falta de contraindicaciones. De acuerdo con las guías de práctica clínicas del The Royal Women's Hospital (Melbourne, Aus) debe administrarse oxitocina profiláctica a la mujer con la salida del hombro anterior, o dentro de 1 a 2 minutos del nacimiento del bebé. El tiempo de administración es crítico al prevenir atonía uterina, y existe un beneficio claro para proporcionar una forma suministrada con el inicio más rápido siguiendo tal nacimiento para reducir el riesgo de pérdida de sangre continua.

Además de la prevención de PPH, se utiliza oxitocina como un tratamiento para PPH a una dosificación de 30-40 IU en una infusión intravenosa. En entornos clínicos bien controlados se indica oxitocina de baja dosis (0.5-1 mU/ml, infusión IV) para el inicio o mejora de contracciones uterinas, en donde es deseable y se considera adecuado para razones de preocupación fetal o materna, con el fin de lograr parto vaginal.

Más recientemente la literatura científica y médica han reportado un enlace entre bajos niveles de oxitocina endógena y depresión posparto, y puede existir una ventaja al desarrollar una forma práctica, económica y no invasiva de oxitocina en sus derivados terapéuticamente efectivos para suministro sistémico dentro o alrededor de esta área de indicación.

En países en desarrollo la administración parenteral de uso de oxitocina encuentra un número de obstáculos incluyendo la necesidad de almacenamiento de cadena fría para prevenir degradación química, la necesidad de personal médico entrenado para administración de inyecciones IV o IM, el potencial para que las jeringas sean reutilizadas en un esfuerzo por reducir costos que aumenta la posibilidad de transmisión del virus transportado en sangre y una falta general de acceso a productos de oxitocina de alta calidad para la prevención y/o tratamiento de PPH. En un esfuerzo por aumentar el acceso a oxitocina los asistentes para parto en algunos países están entrenados para administrar inyecciones IM de oxitocina, sin embargo existen numerosos reportes de uso inapropiado del producto parenteral para aumento de trabajo de parto. Una formulación de oxitocina inhalada superaría muchas de las limitaciones asociadas con formulaciones parenterales. Un sistema de forma de dosis de unidad individual y eliminaría el potencial de uso en aumento de trabajo de parto ya que no sería posible suministrar la dosificación baja requerida. Proporcionar oxitocina en una forma de polvo seco inhalable también proporciona más flexibilidad con dosificación en vista de la ausencia de un portador líquido o gaseoso y la falta de dependencia de volumen. También evita la necesidad de agujas, minimiza el riesgo de contaminación, y permite la flexibilidad de administración repetida para un dispositivo individual.

El rápido inicio de acción logrado a través de las formulaciones en polvo seco de la presente invención proporciona la capacidad de titular rápidamente la dosificación durante el tratamiento de PPH en donde la dosis terapéutica usual está entre 30-40 IU. Las parteras/asistentes de parto típicamente sienten los úteros para valorar cuando la magnitud de la contracción es suficiente para controlar PPH. La absorción rápida e inicio de acción (como se demostró en un modelo de ovejas) indica que sería posible que se administren múltiples dosis inhaladas para lograr los niveles de plasma necesario requeridos para contracciones uterinas efectivas. El amplio índice terapéutico de oxitocina también es benéfico para una terapia inhalada ya que la variabilidad en eficiencia de suministro o absorción no causaría efectos secundarios serios en pacientes.

De acuerdo con la presente invención del inicio de acción después de inhalación de un polvo seco que comprende oxitocina y/o un derivado de oxitocina en el sistema pulmonar, según medido por contracción uterina puede lograrse dentro de 200 segundos de inhalación, preferiblemente dentro de 150 segundos de inhalación, más preferiblemente dentro de 100 segundos de inhalación y muy preferiblemente dentro del 60 segundos de inhalación. Preferiblemente el tiempo entre administración pulmonar de una formulación de polvo seco de acuerdo con la invención y el inicio de contracciones uterinas en comparación con el inicio de acción después de inyección I.M. de una solución de oxitocina y/o un derivado de oxitocina es menor que 80%, preferiblemente menor que 60% y muy preferiblemente menor que 40% del tiempo entre inyección I.M. y el inicio de contracciones uterinas.

Puede formularse un amplio rango de péptidos y proteínas de acuerdo con la presente invención. La presente invención es particularmente adecuada para la administración de oxitocina o derivados, y péptidos similares tal como vasopresina y desmopresina. Ejemplos de derivados de oxitocina incluyen desamino-oxitocina, aquellos descritos en Endocrinologica Experimentalis Vol. 14, p 151 , 1980, y agonistas de oxitocina, tal como carbetocina que tiene usos similares a oxitocina, enfocándose en el control de sangrado después del parto. Otros derivados de oxitocina incluyen deamino-1 -monocarba-(2-0-metiltirosina)-oxitocina, sintometrina y atosiban [d(CUMOT)]. Sin embargo, la invención también puede utilizarse para proporcionar formulaciones en polvo seco de otras proteínas incluyendo insulina y vacunas tales como vacunas de influenza. En el caso de vacunas, la formulación también puede requerir componentes inmunoestimulantes adicionales. Ejemplos de proteínas y péptidos que pueden formularse de acuerdo con la presente invención y suministrarse por la ruta pulmonar incluyen citocinas, hormonas, factores de coagulación, vacunas y anticuerpos monoclonales.

La siguiente es una lista de proteínas que puede utilizarse como el agente activo en las composiciones y procedimientos de acuerdo con la presente invención. Calcitonina, eritropoyetina (EPO), factor IX, factor estimulante de colonia de granulocito (G-CSF), factor estimulante de colonias de macrófago de granulocitos (GM-CSF), hormona de crecimiento, insulina tipo I, ¡nterferón alfa, interferón beta, interferón gamma, interleucina-2, hormona que libera hormona luteinizante (LHRH), análogo de somatostatina, análogo vasopresina, hormona estimulante de folículo (FSH), amilina, factor neurotrófico ciliar, factor de liberación de hormona de crecimiento (GRF), factor de crecimiento similar a insulina, insulinotropina, antagonista de receptor de ínterleucina-1 , interleucina-3, interleucina-4, interleucina-6, factor estimulante de colonia de macrófago (M-CSF), factor de crecimiento nervioso, hormona paratiroidea, análogo de somatostatina, timosina alfa 1, inhibidor llb/lllba, alfa antitripsina, relaxina, anticuerpo anti-RSV, regulador de transmembrana de fibrosis quística (CFTR), desoxirribonucleasa (DNase), proteína bactericida/que aumenta permeabilidad (BPI), anticuerpo anti-CMV y receptor de interleucina-1.

La invención se describirá ahora con referencia a algunos ejemplos y dibujos específicos. Sin embargo, se entenderá que la particularidad de la siguiente descripción no va a superar la generalidad de la invención como se describió aquí anteriormente.

Haciendo referencia a los dibujos: La Figura 1 es una representación esquemática de un aparato para secado mediante rociado.

La Figura 2 es una representación esquemática de un Absorbedor de Etapa Doble para medir la deposición de aerosol in vitro de polvos secos.

La Figura 3 proporciona difractogramas de rayos X de Trehalosa cruda (cruda) y trehalosa secada por aspersión (SD) después de secar por aspersión bajo condiciones especificadas.

La Figura 4 proporciona difractogramas de rayos X de trehalosa secada por aspersión y trehaíosa secada por aspersión con I eucina al 10% y 20% p/p después de secar por aspersión bajo las condiciones especificadas.

La Figura 5 es una imagen de microscopio electrónico de escaneo de trehaíosa después de secado por aspersión bajo condiciones especificadas.

La Figura 6 proporciona imágenes de microscopio electrónico de escaneo de trehaíosa con leucina a 10% p/p (izquierdo) y 20% p/p (derecho) después de secado por aspersión bajo la condición especificada.

La Figura 7 es un rastro de EMG que muestra contracción uterina después de inhalación de oxitocina. La flecha denota el retraso entre administración y contracción. La explosión inicial es rodeada con una línea punteada. La línea negra representa una muestra de 30 minutos aleatoria de actividad inducida por oxitocina. La línea puntada representa la actividad uterina inducida por oxitocina del tiempo total que duró antes de regresar a la línea base.

La Figura 8 es una serie de cuadros que proporcionan un análisis de comportamiento EMG uterino durante el periodo postparto inmediato y después de suministro de oxitocina intra-pulmonar (IP) e intramuscular (IM). (a) retraso entre administración de oxitocina y respuesta EMG; (b) longitud de la primera explosión EMG; (c) número de explosiones de EMG en los primeros 30 minutos; (d) duración total de actividad de EMG. Los datos expresados como media + SEM. P > 0.05 RM ANOVA; n = 5. Las barras verdes representan actividad uterina inmediatamente después de nacimiento, las barras azules representan actividad uterina después del suministro de polvo seco y las barras rojas representan actividad uterina después de administración intramuscular.

La Figura 9 muestra imágenes de video de broncoscopio de una tráquea de oveja antes (a) y después (b) de suministro de polvo.

La Figura 10 muestra distribuciones de energía de superficie no polares en dilución finita en cromatografía de gas inversa.

La Figura 11 muestra distribuciones de energía de superficie polar en dilución finita en cromatografía de gas inversa.

La Figura 12 muestra distribuciones de energía d e superficies totales en dilución finita en cromatografía de gas inversa.

La Figura 13 muestra trabajo de distribuciones de energía de superficie de cohesión determinadas en dilución finita en cromatografía de gas inversa.

La Figuras 14 muestra energía de superficie en dilución infinita de cromatografía de gas inversa.

La Figura 15a es un rastro de EMG que muestra contracción uterina después de inhalación de oxitocina suministrada por la formulación 1 del ejemplo 10 que contiene manitol, glicina y leucina en cantidades iguales. La línea punteada muestra el tiempo de suministro de formulación y la línea sólida el inicio de contracción uterina. El eje x es en hh:mm:ss y el eje y es en mV.

La Figura 15b es un rastro de EMG que muestra contracción uterina después de inhalación de oxitocina suministrada por formulación 2 del ejemplo 10 que contiene 90% de trehalosa y 10% de leucina. La línea punteada muestra el tiempo de suministro de formulación y la línea sólida el inicio de contracción uterina. El eje x es en hh.mm:ss y el eje y es en mV.

La Figura 16a es un rastro de EMG que muestra contracción uterina después de inhalación de oxitocina suministrada por la formulación 3 del ejemplo 10 que contiene 90% de PVP(30) y 10% de leucina. La línea punteada muestra el tiempo de suministro de formulación y la línea solida el inicio de contracción uterina. El eje x es en hh:mm:ss y el eje y es en mV.

La Figura 16b es un rastro de EMG que muestra contracción uterina después de suministro intramuscular de oxitocina (formulación 4 del ejemplo 10). La línea punteada muestra el tiempo de suministro de formulación y la línea sólida el inicio de contracción uterina. El eje x es en hh:mm:ss y el eje y es en mV.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Secado por Aspersión El secado por aspersión es un procedimiento de un paso que involucra la formación de polvos de una solución de partida del material disuelto deseado. En definición, es la transformación de alimentación de un estado libre en una forma seca al rociar la alimentación del líquido en un medio de secado caliente. Cuatro etapas clave en el procedimiento de secado por aspersión son: (i) atomización de alimentación a través de la boquilla, (ii) contacto de aire por aspersión entre las pequeñas gotas de líquido y el gas de secado, (¡ii) secado de partículas a través de evaporación del líquido, y (iv) recolección del polvo final.

Haciendo referencia al esquema en la Figura 1, el aire se toma dentro del sistema 1 y se calienta por el calentador suministrado 2 antes de la medición de la temperatura de entrada 3. La alimentación del líquido se extrae separadamente en la boquilla 4 en donde se forman las pequeñas gotas y se dispersan en la cámara de secado 5 que se mezcla con el aire caliente. En este punto, se forma una partícula seca. La temperatura de salida se mide 6 a medida que las partículas se mueven en el ciclón 7 en donde se separa el polvo del aire. El polvo se atrapa en el recipiente de recolección 8 para recuperarse mientras el aire se filtra de todas las partículas finas que pueden permanecer en la corriente de aire en el filtro de bolsa 9. La circulación de aire en el secado por aspersión continúa por el trabajo de la aspiradora 10.

La atomización es una parte muy crucial al definir las pequeñas gotas, y por lo tanto el tamaño y distribución de partículas subsecuentes. Involucra formar una aspersión de pequeñas gotas del líquido a granel a medida que se bombea la alimentación a través de un pequeño orificio en la boquilla. En el caso de una boquilla de dos fluidos, el gas suministrado impacta en el volumen de I íquido en la boquilla a altas velocidades. El gas a alta velocidad crear altas fuerzas de fricción sobre las superficies del líquido, causando que el líquido se desintegre y forme pequeñas gotas de aspersión, que se proyectan dentro de la cámara de secado.

Las propiedades del material disuelto y las condiciones de secado influenciarán las características de polvo finales. Con la evaporación del solvente líquido de la superficie de pequeña gota (agua en este caso) ocurre la precipitación de disoluto. Frecuentemente a medida que se está formando la partícula, puede formarse una corteza y I a corteza puede ser porosa, semi-porosa o no porosa permitiendo la remoción de humedad o diferentes velocidades y con efectos variables. Por lo tanto se pueden formar partículas de morfología variable. Por lo tanto el control de condiciones de secado es una consideración importante.

De acuerdo con los experimentos realizados, las formulaciones de los polvos y sus parámetros de secado de aspersión varían. En todas las formulaciones en polvo, se utilizó manitol como el material de línea base, con aminoácidos variables agregados. Los parámetros de secado de aspersión que permanecieron constantes fueron la configuración de aspiradora, establecida en flujo completo de la velocidad de flujo de aire de atomizador (800 l/hora).

Para cada formulación, se secaron por aspersión el manitol, glicina y oxitocina a cantidades fijas con cantidades variables de leucina. Se fijaron las condiciones de secado de aspersión con la temperatura de salida establecida a 70°C.

Los parámetros que se utilizaron se muestran en el Cuadro 1 a continuación. Los porcentajes mostrados de los aminoácidos se calcularon con aquellos de la cantidad de manitol únicamente, no todo el contenido de polvo. El porcentaje mostrado de oxitocina fue aquel de todo el contenido de polvo.

CUADRO 1 Se pesaron los polvos y se disolvieron en la cantidad apropiada de agua Milli-Q para lograr la concentración de alimentación deseada. Las soluciones entonces se secaron por aspersión para producir polvos secos utilizando la Mini Secadora por aspersión Buchi 190 (Buchi, Suiza).

Ejemplo 2 Deposición de Aerosol In Vitro La deposición aerosol in vitro de los polvos se midió utilizando el absorbedor de Etapa Doble (TSI) (Copley Scientific Ltd., Nottingham, Reino Unido). Los métodos TSI y la configuración se realizaron de acuerdo con la Farmacopea Británica 2011 como se muestra en la Figura 2. En la parte de artículos de vidrio D y la parte H, se agregaron 7 mi y 30 mi de agua respectivamente durante el ensamble del TSI.

El TSI es un modelo simple del tracto respiratorio; con las cámaras superior (etapa 1) e inferior (etapa 2) que representan las vías respiratorias superiores e inferiores respectivamente. El diámetro aerodinámico recortado en la primera etapa es 6.4 pm. Idealmente deben recolectarse partículas más grandes que 6.4 µ?t? en los 7 mi de líquido; partículas más pequeñas (menor que 6.4 pm) que no se recolectan procederán a la tapa inferior, que contiene 30 mi de líquido. La mayoría de las partículas se recolectarán en la etapa inferior debido al exceso de líquido, sin embargo si el tamaño de partícula es demasiado pequeño para recolección en la etapa inferior, se emitirán en la salida.

Se hicieron mediciones de cada muestra de poro en cuatro réplicas. Para cada réplica, se llenaron manualmente cinco cápsulas HPLC de tamaño 3 con 20.4 +.0.24 mg con la muestra de polvo y se colocaron en 5 inhaladores de Monodosis (Miat, Italia). Se fijó una bomba de vacío a la parte F y la velocidad de flujo de aire se calibró a 60 L/minuto y se estableció a 5 segundos. La cápsula se perforó en el dispositivo y se colocó sobre el adaptador (parte A) lista para activarse por la bomba de vacío. Cuando se encendió la bomba, se transportó el polvo desde el dispositivo de inhalación dentro del aparato TSI.

Se activaron cinco cápsulas en el mismo TSI. Las cápsulas utilizadas y los inhaladores entonces se lavaron con agua Milli-Q dentro de un frasco volumétrico de 100 mi y forma formaron a volumen. Esto se llamó la etapa 'residual'. Las partes que formaron la Etapa 1 (partes A, B, C y D) se lavaron dentro de un matraz volumétrico de 200 mi y las partes que formaron la Etapa 2 (partes E, F, G y H) se lavaron dentro de un frasco volumétrico de 50 mi con agua Milli-Q y las llamadas "etapa 1' y 'etapa 2' respectivamente. Las cantidades de oxitocina en cada etapa del TSI se determinaron por ensayo LC/ S. La fracción de partícula fina (FPF) se calculó como la cantidad de polvo que alcanzó la etapa 2 del aparato TSI dividido por la cantidad total de fármaco que se ensayó. Esta prueba fue la medida más importante ya que puede determinar si puede formularse un polvo que contiene oxitocina con deposición de aerosol adecuada, y absorción consecuente del pulmón.

CUADRO 2 Las partículas que pasan a la porción inferior del dispositivo TSI, es decir, etapa 2, se consideraron respirables, por lo tanto, entre más altas sea la fracción de partícula fina (FPF), superior es la posibilidad de que el fármaco alcance los alveolos y se absorba dentro del flujo sanguíneo, que es ideal en un DPI. La FPF de las cinco pruebas mostradas en el Cuadro 2 fue alta comparado con una FPF promedio de polvos de formulación de portador tradicionales (-10-20%).

Los resultados mostraron que la FPF podría alcanzar entre 55 y 75% lo que significa que se lograron niveles muy eficiente de aerosolizacion y altas cantidades de oxitocina en las formulaciones se suministraron como la dosis terapéuticamente activa requerida.

Estabilidad de oxitocina Los péptidos pueden desnaturalizarse potencialmente debido a calor extremo. Para las pruebas que se condujeron en este estudio, la única indicación en cuanto a estabilidad de oxitocina fue el contenido de ensayo de 1.C/MS que sigue los experimentos TSI. Cuando se ensayó contenido de oxitocina de todas las etapas del aparato TSI, cápsulas y los dispositivos de inhalación, se recuperó un promedio 90.23 +.5.41% de la dosis de cápsula inicial, sugiriendo que la oxitocina no se degrado de las temperaturas utilizadas en el procedimiento de secado por aspersión o de los procedimientos de manejo.

Ejemplo 3 T re halos a/Leu ciña La trehalosa es una a zúcar no reductora con alta temperatura de transición de vidrio (?µ) de 117°C que se utilizó como un excipiente en varios estudios para estabilización de proteína en formulaciones de estado sólido seco. Las moléculas de azúcar generalmente se utilizan como excipientes estabilizadores en este contexto ya que contienen grupos carboxilo que son capaces de formar enlaces de hidrógeno con la proteína de interés y por lo tanto estabilizar la bio-macromolécula con reemplazo de enlace de hidrógeno en estado sólido seco. El secado por aspersión se ha utilizado exitosamente en varios estudios para la fabricación de formulaciones de polvos secos inhalables ya que el procedimiento es capaz de producir partículas finas con rango de tamaño de partícula que es adecuado para suministro pulmonar.

En un intento para formular farmacéuticos de proteína inhalables para suministro pulmonar, se produjo trehalosa secada por aspersión a temperatura de salida relativamente baja de 70°C con el fin de minimizar el impacto de tensión de calor sobre la estabilidad de procesamiento de la proteína relevante. De otra forma las condiciones fueron las mismas que los ejemplos descritos con manitol y aminoácidos.

Aunque la trehalosa es relativamente cristalina como una materia prima, la trehalosa secada por aspersión bajo las condiciones secadas por aspersión especificadas parecen ser completamente amorfas (ver Figura 3). Esta formulación resultante además puede estabilizar la proteína de interés con estabilización de estado vidrioso al proporcionar una matriz amorfa que reduce movilidad molecular de la bio-macromolécula en la formulación.

La formulación resultante de trehalosa únicamente está, sin embargo, compuesta de estructuras primarias fusionada con gran tamaño de partícula que es poco probable que sea adecuada para suministro pulmonar (Figura 5). La incorporación de leucina a la formulación de una concentración de 10% p/p mejora sustancialmente el tamaño de partícula y morfología de la formulación secada por aspersión bajo las condiciones especificadas (Figura 6). La incorporación de leucina parece que a partir de esto es capaz de prevenir fusión de las estructuras de partícula primarias de otra forma altamente higroscópicas de trehalosa a partir del procedimiento de secado por aspersión, y por lo tanto retiene el rango de tamaño de partícula fina adecuado para suministro pulmonar. Además, la presencia de leucina también es capaz de mejorar estas propiedades de partícula sobre almacenamiento de mayor plazo, al proporcionar una protección de humedad de la matriz amorfa interna de las formulaciones de trehalosa secadas por aspersión (Figura 4).

Ejemplo 4 Materiales Se obtuvo D-manitol de VWR International Ltd. (Poole, B1115 LTD, Inglaterra). La L-leucina (LEU), glicina (GLI) y L-alanina (ALA) se obtuvieron de Sigma-Aldrich Chemicals (Castle Hill, NSW, Australia).

Preparación de polvos secados por aspersión Se disolvieron soluciones acuosas que contienen manitol y aminoácidos seleccionados (LEU, GLY, ALA) en varias composiciones como se mostró en el Cuadro 1 en 200 mi de agua Milli-Q. Se incorporó una pequeña cantidad de azul de metileno (10 mg) en cada formulación para permitir una cuantificación simple de polvo por análisis espectrofotométrico UV-VIS como se describe a continuación. Las formulaciones preparadas se secaron por aspersión subsecuentemente utilizando un Mini Secador por aspersión Buchi 190 con boquilla de dos fluidos de 0.5 mi, utilizando la siguientes condiciones operativas estándares: velocidad de flujo de aire, 800 L/h; establecimiento de bomba, 5 (6.67 mL/min); establecimiento de aspiradora, 20; temperatura de salida, 75°C.

Análisis de distribución de tamaño de partícula Se determinó la distribución de tamaño de partícula de los polvos por dispersión de los láser utilizando el Malvern Mastersizer 2000 (Malvern Instruments Ltd, Worcestershire, Reino Unido) equipado con una celda Scirocco y una unidad de dispersión de polvo seco Scirocco 2000. Se dispersaron los polvos en aire a una presión de corte de 300 a 400 kilopascales, que se seleccionó para lograr desaglomeración adecuada. Se midió el tamaño de partícula promedio en tres réplicas para cada muestra. Se derivó el diámetro medio de volumen (D50) de los datos de difracción utilizando el software incorporado para cada muestra.

Aerolización de polvo in vitro y deposición de partícula El desempeño de realización de poro in vitro y deposición de partícula se valoraron utilizando un absorbedor de etapa doble (TSI, aparato, A; Farmacopea Británica, 2000) con el inhalador de monodosis (Miat S.p.A., Milán, Italia) como el dispositivo de dispersión de aerosol. Se ajustó la velocidad de flujo a 60 l/minuto utilizando un Modelo de Controlador de Flujo Crítico TPK 2000 y modelo de medidor de flujo DFM 2000 (Copley Scientific Limited, Nottingham, Reino Unido). Se llenaron aproximadamente 20 mg de cada polvo en cápsulas HPMC de tamaño 3 (Capsugel, Peapack, NJ, E.U.A.) para las pruebas que se realizaron en un laboratorio con aire acondicionado (20 +. 2°C, 50 +. 5% de humedad relativa). Cada cápsula se accionó del inhalador durante 4 segundos para cada medición (n = 5). La cantidad de polvo depositada en diferentes etapas se determinó utilizando un espectrómetro de luz UV-VIS como se describe a continuación. El diámetro cortado para el TSI a 60 l/minutos es de aproximadamente 6.3 µ?? (Hallworth y Westmoreland, 1987) La cantidad total de polvo depositada en el inhalador, etapa 1 (S y etapa 2 (S2) fue la dosis recuperada (RD). La cantidad de polvo depositado en la tapa 1 y 2 fue la dosis emitida (ED) y se calculó como el porcentaje de la RD (Ecuación 1). La fracción de partícula fina (FPF) se definió como el porcentaje de RD depositado en etapa 2 (Ecuación 2).

(S, -r 5,) X 100 RD (1) 5, X 100 RD (2).

Microscopía electrónica de barrido (SEM) Se visualizó la morfología de las partículas bajo un microscopio de electrón de barrido (Phenom™, FEI Company. E.U.A.). Las muestras de polvos se vaciaron suavemente sobre una cinta de carbono de doble cara montada sobre un soporte de muestra para examen bajo para la SEM. Se removió polvo excedente para dejar una capa fina de partícula sobre la superficie de la cinta. Las muestras se revistieron por pulverización con oro utilizando un potencial eléctrico de 2.0 kV a 25 mA durante 6 minutos con un revestidor por pulverización (K550X, EMITECH). Se capturaron micrógrafos SEM utilizando el software de captura de imagen incorporado.

Resultados El tamaño de partícula media de volumen (D50) de todas las formulaciones medidas utilizando Mastersizer 2000 se enlista en el Cuadro 4. El secado por aspersión manitol sólo produjo pequeñas partículas con D50 de 1.87 µ??. Sin embargo, este polvo fue completamente cristalino y no tuvo la estructura de vidrio amorfa requerida para estabilizar bio-moléculas.

La Leucina es un excipiente que puede utilizarse para mejorar la aerosolización de partículas secadas por aspersión, pero también la leucina ayuda en la formación de partículas de tamaño pequeño adecuadas. Sin embargo, la glicina y alanina, aunque son estructuralmente similares a leucina, no fueron capaces de lograr efectos similares ya que aumenta significativamente el tamaño de partícula de las formulaciones. Cabe notar que aunque la concentración inicial en solución de alimentación fue un determinante conocido de tamaño de partícula, el rango de carga sólida utilizado dentro del espacio del diseño de estudio no pareció tener una fuerte influencia sobre el tamaño de partícula geométrico cuando se midió por difracción láser. La carga de sólido total en la solución de alimentación varió de 2.50% a 3.72% en el estudio actual. Se propuso que el cambio en tamaño de partícula dentro del rango relativamente pequeño de carga sólida fuera imperceptible comparado con los efectos de los excipiente de formulación sobre cohesión y forma. Además, considerando los tamaños de partícula producidos de los aminoácidos mezclados, es posible que el uso de combinación de estos aminoácidos con leucina a concentraciones apropiadas también pueda influenciar tamaño de partícula que contrasta con aquel logrado por leucina sola.

Dispersabilidad de polvo v desaglomeración El manitol secado por aspersión produjo partículas con D50 de 2.83 µ?t? que parece indicar una dispersabilidad satisfactoria para formulaciones en polvo seco inhalables, pero también produce la dosis emitida más baja (ED). La retención de polvo en el dispositivo después del experimento fue visualmente evidente, y sugiere un polvo más cohesivo que otras formulaciones aquí. La presencia de aminoácidos en todas las combinaciones resultó en ED mejorada (Cuadro 4). El efecto benéfico de leucina fue evidente en su capacidad para desplazar el efecto de los otros dos aminoácidos sobre D50 y mejorar tanto desaglomeración como ED.

Aerosolizacion in vitro y deposición de partícula El TSI se utilizó como un filtro preliminar en este rango de formulaciones para proporcionar información de aerosol aerodinámica.

Los resultados de fracción de partícula fina (FPF) muestran las formulaciones que contienen I eucina, con D 50 bajo 5 \ig demuestran la FPF más alta de más de 68% (Cuadro 4). Los polvos que contienen aminoácidos sin leucina, con D50 sobre 5 pm muestran FPF significativamente inferior como se demostró por formulaciones que contienen glicina/alanina 30/30%, alanina 30% y glicina 30%, con FPF de 2.96%, 9.11% y 34.62%, respectivamente. Aunque manitol sólo muestra FPF razonable de 66.20%, esta formulación también demuestra la ED más baja). Los aminoácidos combinados a 15% fueron más efectivos al mejorar FPF (Cuadro 4). Estos resultados sugieren que la inclusión de glicina y alanina con leucina a las concentraciones apropiadas puede mejorar desempeño de aerolización de formulación.

Morfología de superficie Se observó al manitol secado por aspersión como un material base sólo para formar partículas esféricas pequeñas que fueron aglomeradas de manera pesada. El resultado es consistente con los datos de distribución de tamaño de partícula del Masterizer. Con la adición de aminoácidos, se conservaron partículas esféricas en todas las formulaciones que contienen leucina sin importar la presencia de glicina y/o alanina. Otras formulaciones que contienen glicina y/o alanina sin la adición de leucina formaron partículas mucho más grandes de forma irregular con superficies ásperas.

El resultado sugiere que la presencia de leucina ayude en la formación de partículas esféricas al revestir la superficie de partícula de secado, y por lo tanto al proporcionar una coraza protectora que conserva las partículas individuales a medida que se recolectan, previniendo cualquier fusión, mientras la presencia de glicina y alanina no previno este efecto. Los resultados previos indicaron que una concentración relativamente alta de leucina (es decir mayor que 5% p/p) tiende a llevar a partículas corrugada. La morfología de partículas que contienen leucina en el presente estudio parece comportarse de manera diferente. Las concentraciones de leucina utilizadas dentro del espacio de diseño de estudio (15 a 30% molar), que corresponde a aproximadamente 10 a 18% p/p, no formaron partículas corrugadas. Por lo tanto se especuló que la presencia de glicina y/o alanina alteró la estructura del núcleo de las partículas de secado esféricas, aunque la leucina tendió a residir sobre la superficie de partícula, proporcionando un revestimiento para reducir cohesión de superficie y prevenir fusión en el procedimiento de secado.

En el estudio actual, la leucina fue capaz de mejorar el desempeño de aerosolización de las formulaciones de manitol sin necesitar la formación de partículas corrugadas. Además, los resultados de FPF sugieren que esto puede ser ventajoso.

CUADRO 3 Abreviatura: ED, dosis emitida; SD, secado por aspersión; TSI, absorbedor de doble etapa.

CUADRO 4 * Indica el punto central del diseño. Abreviatura: n/a, no disponible.

Ejemplo 5 Prueba in vivo Se anestesiaron ovejas hembra preñadas de edad gestacional de 135 días (n = 5) con tiopentona en preparación para cirugía. Se utilizó isuflorano (2.5% en oxígeno) para mantener anestesia y depomicina, penicilina procaína y dihidroestreptomicina se proporcionaron para alivio de dolor y para reducir el riesgo de infección. Cada oveja hembra se rasuró y se hizo una incisión de 10 cm en la piel abdominal en la línea media bajo la cicatriz umbilical para exponer la pared uterina, se tuvo cuidado de evitar vasos sanguíneos grandes.

Se incorporaron tres alambres de acero inoxidable esterilizados para medir la actividad electromiográfica (EMG) (0.07 mm de diámetro, dentro de un catéter de 2 mm) en la capa de músculo liso del miometrio que rodea la matriz y se mantuvo ahí por dos puntadas. Los electrodos pasaron a través un catéter y hacia fuera de la oveja hembra a través de una incisión pequeña (2 cm) a través del lado derecho. Se insertó un catéter en la yugular derecha para permitir muestras sanguíneas y para inducir trabajo de parto. Se regresaron las ovejas hembra a jaulas metabólicas y se les dieron 3-5 días para recuperarse de cirugía.

Se indujo trabajo de parto con dos inyecciones intravenosas de 5 mi de dexametasona (que consiste de 5 mg de fosfato de dexametasona y 10 mg de fenilpropionato de dexametasona) con 24 horas de espacio. El trabajo de parto ocurrió 54 ± 2 horas después de la primera inyección de dexametasona.

Se realizaron administraciones de oxitocina, como se detalló anteriormente, dentro de 15 horas de suministro. Cada oveja recibió una dosis intra-traqueal de formulación de oxitocina en polvo seco, una instilación intra-traqueal de oxitocina en solución y una inyección intramuscular de oxitocina. Hubo al menos un periodo de lavado de una y media horas entre cada tratamiento.

Para administración intra-traqueal, se pasó a un endoscopio a través del pasaje nasal en la tráquea y se colocó cerca de la primera bifurcación bronquial, en donde se liberó una alícuota de 1 mi de oxitocina en solución (101U) o 10 mg (promedio) de polvos secos se suministró a través de un dispositivo de suministro de polvo de PennCentury modificado.

La formulación en polvo seco comprende una composición secada por aspersión, como se describió en el ejemplo 1. Este polvo contuvo 13 unidades de oxitocina por miligramo en masa, secada por co-aspersión con proporciones iguales en masa de manitol, glicina y leucina.

Durante este procedimiento, se capturaron imágenes de video de broncoscopio utilizando una cámara de video Linvatee IM3301 fijada a un endoscopio (Pentax FG-16X), que se guardó como un archivo digital sobre una computadora utilizando Software de Captura de Video. Se proporcionaron ejemplos de las imágenes en las Figuras 9a y 9b. La imagen en la Figura 9a muestra la tráquea de oveja antes del suministro de polvo, y la Figura 9b muestra la imagen aproximadamente 30 segundos después del suministro. La Figura 9b muestra un clara evidencia de polvo no disuelto blanco, con parches blancos no presentes antes de suministro, indicando la disolución inmediata que no ocurrió dentro de sistema pulmonar.

Un Cyberamp 380 en conjunto con hardware MACLAB (velocidad de muestra de 400 Hz) y software de Chart 4 (rango de entrada de 10B) se utilizó para presentar y registrar el potencial de acción que se origina de células de músculo liso dentro del útero. El cyberamp 380 utilizó la sonda AI401 con entrada positiva establecida a AC y entrada negativa establecida a Tierra. El recorte de AC fue 10 Hz y la ganancia de prefiltro establecida a 100 mV. El filtro de paso bajo se estableció a 300 Hz, el filtro de muescas se estableció a apagado, la ganancia de salida se estableció a 5 y la ganancia total se dejó a 500. Se realizó ANOVA de medición repetida bidireccional para determinar la importancia estadística de nuestros datos. Ver Figura 7.

Se analizó un número de propiedades de actividad EMG registrada. Con respecto al tiempo transcurrido (retraso) de suministro de oxitocina a la explosión inicial de actividad EMG, suministro a través de los pulmones resulta en un tiempo más rápido de inicio para la primera contracción en contraste al suministro IM (Figura 8a). No se observaron diferencias en la longitud de la explosión inicial de actividad de EMG (Figura 8b) no existió una diferencia en el número de expulsiones ocurridas sobre los primeros 30 minutos siguiendo la explosión inicial de actividad (Figura 8). Sin embargo, la duración total de actividad de EMG fue significativamente más prolongada para IM de oxitocina comparada con suministro de vía respiratoria y la actividad normal observada inmediatamente posparto (Figura 8).

Estos estudios in vivo demuestran que las respuestas de contracción uterina a oxitocina administrada a través de suministro pulmonar ocurren en promedio después de aproximadamente 120 segundos en contraste con el suministro IM que ocurre en promedio desde de aproximadamente 250 segundos. Sorprendentemente, el inicio de acción del suministro pulmonar en polvo fue significativamente más rápido comparado con suministro intramuscular, y también fue consistente con los perfiles de plasma contratiempo. El inicio promedio de acción fue aproximadamente 50% menor que para IM. Esto es a pesar del hecho que las partículas de polvo seco contienen aproximadamente 30% de leucina que es un aminoácido pobremente soluble e hidrófobo, que podría esperarse para retrasar la disolución. Además, se espera que una proporción sustancial de la leucina esté presente en la superficie del polvo. La imagen 9b soportar este concepto que la disolución rápida de tal polvo no se espera en este ambiente. Los datos también demuestran que las respuestas de contracción uterina a oxitocina en polvo seco pulmonar imita la actividad vista naturalmente en el periodo postparto inmediato, como se observó con la longitud de la explosión inicial de actividad uterina y el número total de explosiones de actividad de EMG registrada sobre los 30 minutos.

Ejemplo 6 Formulación de antígeno de influenza en polvo seco El polvo seco de antígeno de influenza, hemaglutinina (HA), se disolvió primero con otros excipientes (es decir, manitol 45% p/p, glicina 45% p/p y leucina 10% p/p) dentro de una solución acuosa para producir una formulación final con una carga de antígeno de 5 pg de HA por miligramo de polvo. Esta solución entonces se secó por aspersión en un secador de aspersión de laboratorio Buchi 190, a una temperatura relativamente baja es decir temperatura de salida de 70°C para minimizar el efecto de tensión de calor sobre la integridad del antígeno en las siguientes condiciones de secado por aspersión: configuración de bomba 6.7 ml/minuto; aspiradora, 20 (100%); flujo de aire, 800 L/hora. La formulación de antígeno de influenza secada por aspersión entonces se recolectó del recipiente recolector para almacenamiento.

Ejemplo 7 Método para probar la actividad biológica de la formulación de antígeno de influenza en polvo seco Lo siguiente describe el método para la prueba de actividad biológica de la formulación de antígeno de influenza en polvo seco secada por aspersión que contiene hemaglutinina (HA) como la proteína activa. El ensayo de hemaglutinación (ensayo HA) se utilizó para probar la integridad de la proteína HA en la formulación en polvo seco. La formulación de antígeno de influenza en polvo seco de interés se reconstituyó primero con solución salina regulada en su pH de fosfato (PBS) e inmediatamente antes de la prueba en una solución de concentración de proteína HA estándar. Una pequeña cantidad de esta solución reconstituida entonces se colocó en la primera columna de una placa de 96 cavidades. La solución entonces se diluyó 1:2 con PBS a través de la placa de 96 cavidades con disolución en serie. Una cantidad estándar de solución de glóbulos rojos de gallina con una concentración de glóbulos rojos estándar (es decir 1%) se agregó entonces a cada cavidad de la placa. La placa se incubó temperatura ambiente durante 30 minutos inmediatamente después de adición de los glóbulos rojos. Ya que proteína HA intacta causará hemaglutinación de glóbulos r ojos, e I nivel de dilución que la solución que contiene HA es capaz de sostener antes que ya no sea capaz de causar hemaglutinación a 30 minutos indicará la cantidad de proteína HA intacta en la formulación. Se encontró que el oxígeno es excedente de 95% activo, dentro de los límites de este procedimiento.

Ejemplo 8 Medición de cuestión de partículas v valores de cohesión preferidos Aparatos y materiales Los aparatos utilizados fueron módulo de celda de corte de 1 mi, y pistón ventilado, como parte de unidad del reómetro FT4 FREEMAN (Freeman Technology, Reino Unido) e interfase de usuario de computadora y módulo de acondicionamiento condiciones de celda de corte de 1 mililitro. Los materiales utilizados fueron polvos secados por aspersión de 1:99% p/p leucina/manitol, 3:97% p/p leucina/manitol, 5:95% p/p leucina/manitol, y 10:90% p/p leu/manitol. Estos polvos se produjeron siguiendo las condiciones del Ejemplo 1 anterior.

Se cargó una muestra en polvo dentro de la celda y se acondicionó. Durante acondicionamiento, se empleó el módulo de acondicionamiento de celda de corte de 1 mililitro para interrumpir suavemente el polvo a medida que se mueve a través de toda la muestra. El propósito de esto fue homogeneizar el polvo al remover aire excedente y aislando partículas en polvo pre-compactadas. Después de acondicionamiento, el polvo se comprimió. Esto se ejecutó por el pistón ventilado de superficie plana con el fin de asegurar interacciones de partícula-partícula uniformes. La compresión estuvo seguida por corte. Durante corte, se empleó una celda de corte de 24 mm (un componente de unidad de: base, diapositiva, cuña divisoria y módulo de celda de corte). La cabeza de corte que comprende 18 aspas, movidas verticalmente hacia abajo incluyendo tensión de corte normal mientras las aspas de cabeza de corte perforaron la superficie de polvo. La tención de corte entonces se midió y estuvo al máximo cuando el polvo falló al resistir la tensión de corte. La gráfica de tención de corte contra tensión normal se generó por software integrado FT4 FREEMAN. A partir de la gráfica, la y-intercepción extrapolada proporciona la cohesión del polvo a consolidación cero. El ffc [la relación de la tención principal mayor (tensión de consolidación), s1, a la resistencia de generación no confinada, ae] datos también se registró.

CUADRO 5 A partir de un contenido de leucina de 1 a 10%, un aumento en contenido de leucina disminuye cohesión y mejora parámetro de fluidez (ffc).

El experimento entonces se repitió utilizando leucina secada por aspersión y PVP, producida y probada bajo condiciones similares. Los resultados fueron como continuación: CUADRO 6 Ejemplo 9 Mediciones de energía de superficie Muestras Se secaron por aspersión dos lotes de polvo de agua utilizando las condiciones como se describió en el Ejemplo 1, pero en donde los polos comprendieron composiciones de manitol puro y manitol con 10% p/p de L-leucina agregado.

Determinación de energía de superficie por cromatografía de gas inversa Se determinaron energías de superficie de estos polvos utilizando cromatografía de gas i nversa (IGC, Surface Measurement Systems Ltd, y Londres, Reino Unido). Se empacaron aproximadamente 0.33 g de cada polvo en columnas de vidrio presionadas (diámetro interno de 300 mm x 3 mm) que se detuvieron de manera floja con lana de vidrio silanada en ambos extremos. Las columnas llenas de polvo se acondicionaron durante 2 horas a 303 K antes de cada medición con el fin de remover impurezas de la superficie. Se llevaron a cabo sondas en la columna por helio con una velocidad de flujo de gas de 10 sccm (centímetro cúbico estándar por minuto) y se detectan los tiempos de retención por un detector de ionización de flama. El volumen muerto se calculó basándose en el tiempo de elución de metano que corrió a una concentración de 0.1 p/p° (en donde p denota la presión parcial y p° la presión de vapor).

Determinación de energía de superficie en dilución infinita Hexano de grado GC, heptano, octano, nonano y decano (todos de Sigma-Aldrich GmBII, Steinheim, Alemania) de energía de superficie no polar (???), y dos sondas polares (es decir, diclorometano y etil acetato) para energía de superficie polar (??) se utilizaron a una concentración de 0.03 p/p°. El detalle del cálculo ?? se describió en otra parte (Thielmann y otros, Investigación de las propiedades de ácido-base de un catalizador de óxido de rutenio soportado por MCM por cromatografía de gas inverso y absorción de vapor dinámico. Jackson, S. D., Hargreaves, J. S. J., Lennon, D., editors. Catálisis en aplicación Gran Bretaña, Royal Soc. Chem., p. 237 (2003), y Traini y otros, Desarrollo de Fármaco y Farmacia Industrial 34: 992-1001 (2008). La Figura 1 muestra las contribuciones de energía de superficie en dilución infinita: La energía de superficie total (?t) fue el resultado aditivo de contribuciones no polares (???) y polares (??) (Grimsey y otros, Diario de Ciencias Farmacéuticas 91: 571-583 (2002). El trabajo de cohesión (Wco) se calculó (ver Vanoss y otros, Langmuir 4:884-891 (1988) y Tay, y otros, Diario Internacional de Farmacéutica (Kidlington) 383:62-69 (2010). Estos experimentos se ejecutaron por triplicado.

Distribuciones de energía de superficie v d eterminación de área de superficie en dilución finita Los perfiles de distribución y energía de superficie no polar (perfil ???) se determinaron de acuerdo con el método descrito en otra parte (F. Thielmann y otros, Desarrollo de Fármaco y Farmacia Industrial 33:1240-1253 (2007) e Yla-Maihaniemi, y otros, Langmuir 24 9551-9557 (2008)). Esto se muestra en la Figura 10. Las energía de superficie no polares en todas las coberturas se redujeron claramente para el polvo que contiene leucina, y en este caso muestra una reducción por más de 30% a un nivel de cobertura de 1%. La distribución de energía de superficie polar se muestra en la Figura 11.

El área de superficie de Brunauer-Emmet-Teller (BET) se calculó de isotermos de absorción de hexano. La división de la cantidad adsorbida (n) entre la capacidad de monocapa (Nm, el número de moles de la sonda adsorbidos para cobertura de monocapa), se calculó la cobertura de superficie (n/nm). En cada cobertura de superficie, el volumen de retención neto (VN) se calculó para cada sonda. La energía de superficie no polar (???) se calculó de la inclinación (2 NA VyNP) de una gráfica de RT1nVN contra un VyNP de aléanos. Los ?? y ?t se calcularon en cada cobertura de superficie y sus perfiles de distribución entonces se construyeron (como se describió en Das y otros, Langmuir 27:521-523 (2011a)).

Las Figuras 12 y 13 muestran que las distribuciones de energía de superficie total calculadas y el trabajo de cohesión también se redujeron sustancialmente en el caso en donde se agregó leucina, por ejemplo por 20% o más a una cobertura de superficie de aproximadamente 1%.

Ejemplo 10 Prueba \n vivo de otras formulaciones En cuanto al Ejemplo 5 se preparó a una oveja hembra preñada individual por cirugía para implantar los electrodos EMG y un catéter para permitir recolección de sangre. La inducción de trabajo de parto comenzó el mismo día de la cirugía también de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 5. El trabajo de parto y el nacimiento ocurrieron 2 días después del inicio del periodo de inducción.

Las administraciones de oxitocina, como se detalla continuación, comenzaron dentro de 22 horas del nacimiento. Hubo un período de lavado de una hora y media entre cada tratamiento.

Para administración intra-traqueal, se pasó un endoscopio a través del pasaje nasal dentro de la tráquea y se colocó cerca de la primera bifurcación bronquial, en donde una dosis de polvo seco (como se detalla a continuación) se suministró a través de un dispositivo de suministro de polvo PennCentury modificado. Además del suministro de polvo seco al pulmón también se suministró una inyección intramuscular de oxitocina (de acuerdo con el Ejemplo 5).

Las formulaciones de polvo seco comprendieron composiciones secadas por aspersión hechas como se describió en el Ejemplo 1. Las composiciones de estos polvos junto con la dosis suministrada nominal se mostraron en el Cuadro 7, tiempo transcurrido (retraso) de suministro de oxitocina a la explosión inicial de actividad de EMG. El retraso, tiempo transcurrido del suministro de oxitocina a la explosión inicial de actividad de EMG también se muestra en el Cuadro 7, rastros de EMG de emerger de estas cuatro dosis se muestran en las Figuras 15 y 16.

CUADRO 7 Sorprendentemente, el inicio de acción del suministro pulmonar en polvo fue significativamente más rápido comparado con suministro intramuscular, y también fue consistente con los perfiles de plasma contra tiempo. Los datos también muestran que la rápida respuesta puede lograrse con formulaciones en polvo seco hechas con un rango de excipiente tal como polioles, azúcares, aminoácidos y polímeros. Esto es a pesar del hecho que las partículas de polvo seco contienen entre 10-30% de leucina que es un aminoácido pobremente soluble e hidrófobo, que podría esperarse para retrasar disolución. Además, se esperó que una proporción sustancial de la leucina esté presente en la superficie del polvo.

La invención ha sido descrita a manera de ejemplo no limitante únicamente y pueden hacerse muchas modificaciones y variaciones a estas sin apartarse del espíritu y alcance de la invención descrita.

A través de esta especificación y las reivindicaciones a continuación, a menos que el contexto lo requiera de otra forma, la palabra "comprenden", y variaciones tal como "comprende" y "que comprende", se entenderán para implicar la inclusión de un número entero o paso o grupo de números enteros mencionados o pasos pero no la exclusión de cualquier otro número entero o paso o grupo de números enteros o pasos.

La referencia en esta especificación a cualquier publicación previa (o información derivada de ésta), o a cualquier material que es conocido, no es, y no debe tomarse como un conocimiento o admisión o cualquier forma de sugerencia de aquella publicación previa (o información derivada de ésta) o material conocido forma parte del conocimiento general común en el campo de trabajo al cual se refiere esta especificación.

Claims

REIVINDICACIONES

1.- Un método para preparar un polvo seco para inhalación que com prende: preparar una solución y/o suspensión acuosa que comprende una proteína o péptido biológicamente activo, uno o más mono, di- o polisacáridos y/o aminoácidos capaces de formar una matriz de vidrio amorfa, y L-leucina; y secar por aspersión la solución o suspensión acuosa para producir un polvo seco adecuado para inhalación.

2.- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la L-leucina está presente en una cantidad de 5 a 50% en peso basándose en el peso seco del polvo.

3.- Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la L-leucina está presente en una cantidad de 10 a 40% en peso.

4.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el péptido o proteína biológicamente activo es oxitocina y/o un derivado de oxitocina.

5. - Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde uno o más mono, di- o polisacáridos y/o aminoácidos capaces de formar una matriz de vidrio amorfa comprende D-manitol y glicina.

6. - Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el secado por aspersión se lleva a cabo a una temperatura por abajo de 80°C.

7.- Una formulación en polvo seco, que comprende: una proteína o péptido biológicamente activo, una matriz de vidrio amorfa que comprende uno o más mono, di- o polisacáridos y/o aminoácidos, y L-leucina.

8.- Una formulación en polvo seco de acuerdo con la reivindicación 7, en donde al menos una porción de la L-leucina está localizada en la superficie de las partículas del polvo seco.

9. - Un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad o condición, que comprende administrar por inhalación una formulación en polvo seco de acuerdo con la reivindicación 6 o reivindicación 7.

10. - Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la proteína o péptido biológicamente activo es oxitocina y/o un derivado de oxitocina.

11.- Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la enfermedad o condición se selecciona de hemorragia postparto, enfermedades o condiciones psiquiátricas, cáncer, dolor, lactancia y trastornos de fertilidad, disfunción sexual, o condiciones que involucran falta de confianza o unión.

12.- Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la enfermedad o condición es hemorragia postparto.

13.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde dicho polvo seco es inhalado en el sistema pulmonar a través de la boca.

14.- Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde el polvo seco es inhalado nasalmente.

15. - Un polvo seco para inhalación que comprende oxitocina y/o un derivado de la misma, y un portador aceptable pulmonar, en donde más de 40% de las partículas del polvo seco después de inhalación tienen un diámetro aerodinámico de menos de 5 pm.

16. - Un polvo seco de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el portador pulmonar aceptable comprende uno o más mono-, di- o polisacáridos y/o aminoácidos capaces de formar una matriz de vidrio amorfa.

17. - Un polvo seco de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el portador pulmonar aceptable comprende un polímero inerte capaz de formar una matriz de vidrio amorfa.

18. - Un polvo seco de acuerdo con la reivindicación 14 y reivindicación 15, en donde el portador pulmonar aceptable comprende L-leucina.

19. - Un método para el tratamiento o prevención de hemorragia postparto, que comprende administrar una cantidad efectiva de un polvo seco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 a un sujeto que lo necesita.

20. - Uso de oxitocina y/o un derivado de la misma en la fabricación de un polvo seco para inhalación para el tratamiento de hemorragia postparto.

21. - Uso de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el polvo seco es para administración nasal.