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MX2014000040A - Emulsiones cationicas de aceite en agua. - Google Patents

Emulsiones cationicas de aceite en agua.

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MX2014000040A
MX2014000040A MX2014000040A MX2014000040A MX2014000040A MX 2014000040 A MX2014000040 A MX 2014000040A MX 2014000040 A MX2014000040 A MX 2014000040A MX 2014000040 A MX2014000040 A MX 2014000040A MX 2014000040 A MX2014000040 A MX 2014000040A
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MX
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oil
mol
water emulsion
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rna
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MX2014000040A
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MX350258B (es
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Luis Brito
Michelle Chan
Andrew Geall
Derek O'hagan
Manmohan Singh
Original Assignee
Novartis Ag
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Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
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Publication of MX350258B publication Critical patent/MX350258B/es

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Abstract

Esta invención se refiere generalmente a emulsiones catiónicos de aceite en agua que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y tienen una relación aceite:lípido definida. El lípido catiónico puede interactuar con la molécula cargada negativamente anclando de este modo la molécula a las partículas de emulsión. Las emulsiones catiónicos descritas en la presente son útiles para suministrar moléculas cargadas negativamente, tales como moléculas de ácido nucleico a células, y para formular vacunas a base de ácidos nucleicos.

Description

EMULSIONES CATIONICAS DE ACEITE EN AGUA ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los terapéuticos de ácido nucleico son promisorios para tratar enfermedades que varían desde trastornos ¦ heredados, hasta ..condic,iones, adquiridas . tales .como, cáncer,, trastornos infecciosos (SIDA) , enfermedad cardiaca, artritis y trastornos neurodegenerativos (por ejemplo, Parkinson y Alzheimer) . No sólo los genes funcionales pueden ser suministrados para reparar una deficiencia genética o inducir la expresión de productos genéticos exógenos, sino que el ácido nucleico también puede ser suministrado para inhibir expresión de genes endógenos para proporcionar un efecto terapéutico. La inhibición de la expresión génica puede ser mediada por, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, moléculas de ARN de doble hebra (por ejemplo, siARNs ; miARNs) , o ribozimas.
Una etapa clave para esta terapia es suministrar moléculas de ácido nucleico al interior de células in vivo. Sin embargo, el suministro in vivo de moléculas de ácido nucleico, en particular moléculas de ARN, enfrenta un número de obstáculos técnicos. Primero, debido a las nucleasas celulares y séricas, la vida media de ARN inyectado in vivo es de sólo aproximadamente 70 segundos (véase, por ejemplo, Kurreck, Eur. J. Bioch. 270:1628-44 (2003)). Se han hecho REF.: 245866 esfuerzos por incrementar la estabilidad de ARN inyectado mediante el uso de modificaciones químicas; sin embargo, hay varios casos en los que las alteraciones químicas llevaron a efectos citotóxicos incrementados o a pérdida de o función reducida. En un ejemplo específico, las células fueron intolerantes a dosis de un dúplex de AR i en el cual cada segundo fosfato fue reemplazado por fosforotioato (Harborth, et al., Antisense Nucleic Acid Drug Rev. 13(2): 83-105 (2003)) . De esta manera, existe la necesidad por desarrollar sistemas de suministro que puedan desarrollar cantidades suficientes de moléculas de ácido nucleico (en particular moléculas de ARN in vivo) para provocar una respuesta terapéutica, pero que no sean tóxicas para el anfitrión.
Las vacunas a base de ácido nucleico son un enfoque atractivo a la vacunación. Por ejemplo, la inmunización intramuscular (IM) de ADN plasmídico que codifica para antígenos puede inducir respuestas inmunes celulares y humorales y proteger contra ataque. Las vacunas de ADN ofrecen ciertas ventajas sobre las vacunas tradicionales que usan antígenos de proteínas, o patógenos atenuados. Por ejemplo, en comparación con las vacunas de proteínas, las vacunas de ADN pueden ser más efectivas para producir un antígeno adecuadamente doblado en su conformación activa, y para generar una respuesta inmunitaria celular. Las vacunas de ADN tampoco tienen algunos de los problemas de seguridad asociados con patógenos eliminados o atenuados. Por ejemplo, una preparación de virus eliminados puede contener virus vivos residuales, y un virus atenuado puede mutar y revertirse a un fenotipo patógeno.
Una limitación de las vacunas a base de ácido nucleico es que grandes dosis de ácido nucleico se requieren generalmente para obtener potentes respuestas inmunitarias en primates no humanos y humanos. Por lo tanto, se requieren sistemas de suministro y adyuvantes para incrementar la potencia de las vacunas a base de ácido nucleico. Se han desarrollado varios métodos para introducir moléculas de ácido nucleico en células, tales como transfección con fosfato de calcio, transfección de polipreno, fusión a protoplastos , electroporación, microinyección y lipofección.
Los lípidos catiónicos han sido formulados como liposomas para suministrar genes a células. Además, las emulsiones de lípidos catiónicos han sido desarrolladas para suministrar moléculas de ADN al interior de células. Véase, por ejemplo, Kim, et al., International Journal of Pharmaceutics, 295, 35-45 (2005) .
Ott et al. (Journal of Controlled Reléase, volumen 79, páginas 1-5, 2002) describe un enfoque que incluye una emulsión en sub-micras catiónica como un sistema de suministro/adyuvante para ADN. El enfoque de mulsión en sub-mieras se basa en MF59, un potente escualeno en adyuvante de agua que es un componente de producto comercialmente aprobado Fluad*. 1, 2-Dioleoil-3-triemtilamonio-propano (DOTAP) se usó para facilitar el suministro intracelular de ADN plasmídico.
Yi et al. (Pharmaceutical Research, 17, 314-320 (2000) ) describe emulsiones catiónicas de aceite en agua que usan aceite de soya y DOTAP como el líquido catiónico. Colesterol, DOPE y lípidos poliméricos también fueron incluidos en algunas de las emulsiones. Las emulsiones mostraron incrementar la eficiencia de transfección in vitro de ADN en presencia de hasta 90% de suero. El tamaño promedio de las partículas de la emulsión varió de 181 nm a 344 nm, y el tamaño de partículas se incrementó después de que las emulsiones fueron diluidas en regulador de pH de PBS.
Kim et al. (Pharmaceutical Research, vol . 18, páginas 54-60, 2001) y Chung et al, (Journal of Controlled Reléase, volumen 7, páginas 339-350, 2001) describen varias emulsiones de aceite en agua que se usaron para incrementar la eficiencia de transfección in vitro e in vivo de moléculas de ADN. Entre los lípidos catiónicos probados, DOTAP formó la emulsión más estable y eficiente para el suministro de ADN. Entre los aceites probados, escualeno, aceite mineral ligero y aceite de grano de jojoba formaron emulsiones estables con partículas pequeñas. Las eficiencias de la transfección in vitro mostraron correlacionarse con la estabilidad de las emulsiones (por ejemplo, la emulsión formulada por escualeno a 100 mg/mL y DOTAP a 24 mg/mL mostraron alta eficiencia de transfección in vitro) . Las emulsiones se prepararon al mezclar primero el lípido catiónico con agua para formar una suspensión de liposomas (por sonicación) . Después se añadieron liposomas al aceite (tales como escualeno) y la mezcla se sonicó para formar una emulsión de aceite en agua.
Moléculas de ARN que codifican para un antígeno o un derivado del mismo también pueden ser usadas como vacunas. Las vacunas de ARN ofrecen ciertas ventajas en comparación con las vacunas de ADN. Sin embargo, en comparación con las vacunas a base de ADN, atención relativamente menor se ha dado a las vacunas a base de ARN. Las moléculas de ARN son altamente susceptibles a degradación por nucleasas cuando se administran como un terapéutico o vacuna. Además, las moléculas de ARN no son transportadas activamente al interior de células. Véase, por ejemplo, Vajdy, M. , et al., Mucosal adjuvants and delivery systems for protein-, ???- and KNA-based vaccines, Immunol Cell Biol, 2004, 82(6): páginas 617-27.
Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar sistemas de suministro para moléculas de ácido nucleico u otras moléculas cargadas negativamente. Los sistemas de suministro son útiles para vacunas a base de ácido nucleico, en particular vacunas a base de ARN.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención se refiere a emulsiones catiónicas de aceite en agua que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y tienen una relación aceite : lípido definida. El aceite y lípido catiónico son componentes separados de las emulsiones, y de preferencia el aceite no es iónico. El lípido catiónico puede interactuar con la molécula cargada negativamente anclando de esta manera la molécula a las partículas de emulsión. Las emulsiones catiónicas descritas en la presente son útiles para suministrar moléculas cargadas negativamente, tales como moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN que codifique para un antígeno) , a células, y para formular vacunas a base de ácido nucleico.
En un aspecto, la invención proporciona una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que son dispersas en una fase continua acuosa, en donde la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas es de alrededor de 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, en donde (i) la relación de aceite : lípido catiónico (mol:mol) es de al menos alrededor de 8:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM, y (iii) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol . De preferencia, la emulsión de aceite en agua es estable. En algunas modalidades, la relación de aceite : lípido (mol:mol) es de aproximadamente 10:1 (mol:mol) a alrededor de 43:1 (mol:mol). La emulsión de aceite en agua puede contener alrededor de 0.2% a aproximadamente 8% (p/v) de aceite. En algunas modalidades, el aceite es escualeno o escualano.
En otro aspecto, la invención proporciona una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que son dispersas en una fase continua acuosa, en donde la emulsión se caracteriza por: (a) e diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, en donde (i) la relación de aceite : lípido catiónico (mol:mol) es de aproximadamente 4:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM, (iii) el aceite está presente de alrededor de 0.2% a aproximadamente 8% (p/v); y (iv) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol . De preferencia, la emulsión de aceite en agua es estable. En algunas modalidades, la relación de aceite : lípido (mol:mol) es de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a alrededor de 43:1 (mol:mol). En algunas modalidades, el aceite es escualeno o escualano. En algunas modalidades, el aceite está presente de 0.6% a 4% (p/v) . En algunas modalidades, el aceite está presente de alrededor de 1% a aproximadamente 3.2% (p/v) .
La emulsión de aceite en agua de este aspecto puede comprender además un tensioactivo, tal como un tensioactivo no iónico. De preferencia, el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG) -lípido. El tensioactivo puede estar presente en una cantidad de alrededor de 0.01% a aproximadamente 2.5% (p/v) . En algunas modalidades, el tensioactivo es SPAN85 (trioleato de sorbitán) , Tween 80 (polisorbato 80), o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, la emulsión de aceite en agua contiene cantidades iguales de SPA 85 (trioleato de sorbitán) y Tween 80 (polisorbato 80), por ejemplo 0.5% (p/v) de cada uno.
De preferencia el grupo de cabeza del lípido catiónico comprende una amina cuaternaria. Por ejemplo, en algunas modalidades el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1 , 2-dioleoiloxi-3- (trimetilamonio) ropano (DOTAP) , 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC) , cloruro de N, N-dioleoil -N, N-dimetilamonio (DODAC) y cloruro de N-[l-(2,3-dioleiloxi) ropil] -N, N, -trimetilamonio (DOTMA) .
En algunas modalidades, la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas de emulsión es de alrededor de 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y DOTAP, en donde (i) la relación de aceite: DOTAP (mol:mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), y (ii) la concentración de DOTAP en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.58 mM (1.8 mg/mL) , o de alrededor de 2.58 mM (1.8 mg/mL) a aproximadamente 7.16 mM (5 mg/mL). El aceite puede ser escualeno o escualano.
En algunas modalidades, la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas de emulsión es de aproximadamente 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) al emulsión comprende un aceite y DOTAP, en donde (i) la relación de aceite :D0TAP (mol:mol) es de al menos aproximadamente 4:1 (mol:mol), (ii) la concentración de DOTAP en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.58 mM (1.8 mg/mL) y (iii) el aceite está presente de alrededor de 0.2% a aproximadamente 8% (p/v) . En algunas modalidades, el aceite es escualeno o escualano. En algunas modalidades, la concentración de DOTAP es de alrededor de 2.58 mM (1.8 mg/mL) a alrededor de 7.16 mM (5 mg/mL). En algunas modalidades, el aceite está presente de 0.6% a 4% (p/v) . En algunas modalidades, el aceite está presente de alrededor de 1% a aproximadamente 3.2% (p/v).
La invención también proporciona un método para preparar una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que son dispersas en una fase continua acuosa, en donde la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, en donde (i) la relación de aceite : lípido catiónico (mol: mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM, y (iii) con la condición de que el lipido catiónico no sea DC-colesterol, el método comprende (a) disolver directamente el lipido catiónico en el aceite para formar una fase de aceite; (b) proporcionar una fase acuosa de la emulsión; y (c) dispersar la fase de aceite en la fase acuosa por homogeneización . El aceite puede ser calentado hasta una temperatura de entre aproximadamente 30°C a alrededor de 65 °C para facilitar la disolución del lipido catiónico en el aceite. También se pueden usar temperaturas más altas, siempre y cuando no haya degradación significativa del aceite o lipido catiónico.
La invención también proporciona un método para preparar una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que son dispersas en una fase continua acuosa, en donde la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm de diámetro; (b) la emulsión comprende un aceite y un lipido catiónico, en donde (i) la relación de aciete : lipido catiónico (mol: mol) es de al menos aproximadamente 4:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lipido catiónico en la emulsión es de a menos aproximadamente 2.5 mM, (iii) el aceite está presente de alrededor de 0.2% a aproximadamente 8% (p/v) ; y (iv) con la condición de que el lipido catiónico no sea DC-colesterol, el método comprende (a) disolver directamente el lipido catiónico en el aceite para formar una fase de aceite; (b) proporcionar una fase acuosa de la emulsión; y (c) dispersar la fase de aceite en la fase acuosa por homogeneización . El aceite puede ser calentado hasta una temperatura de entre aproximadamente 30°C a alrededor de 65 °C para facilitar la disolución del lípido catiónico en el aceite. Temperaturas más altas también pueden ser usadas, siempre y cuando no haya degradación significativa del aceite o el lípido catiónico.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico (de preferencia una molécula de ARN) acomplejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, en donde la partícula comprende un aceite que está en fase líquida a 25°C, y un lípido catiónico; y (i) la relación de aceite : lípido (mol:mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol); (ii) la concentración de lípido catiónico en la composición es de al menos aproximadamente 1.25 mM; y (iii) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol . De preferencia, el diámetro promedio de las partículas de emulsión es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, o alrededor de 80 nm a 150 nm, o aproximadamente 80 nm a alrededor de 130 nm, y la relación N/P de la composición es de al menos aproximadamente 4:1, o de aproximadamente 4:1 a alrededor de 20:1, o de aproximadamente 4:1 a alrededor de 15:1. En ciertas modalidades, la relación de aceite : lípido (mol:mol) es de aproximadamente 10:1 (mol:mol) a alrededor de 43:1 (mol:mol). La emulsión de aceite en agua puede contener alrededor de 0.1% a aproximadamente 5% (p/v) de aceite. En algunas modalidades, el aceite es escualeno o escualano.
En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico (de preferencia una molécula de ARN acomplejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, en donde la partícula comprende un aceite que está en fase líquida a 25°C, y un lípido catiónico; y (ii) la relación de aceite : lípido (mol:mol) es de al menos aproximadamente 4:1 (mol:mol); (ii) la concentración de lípido catiónico en la composición es de al menos aproximadamente 1.25 mM; (iii) el aceite está presente de alrededor de 0.1% a aproximadamente 4% (p/v) ; y (iv) con la condición de que el lípido catiónico no sea DC-colesterol . De preferencia, el diámetro promedio de las partículas de emulsión es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, o de alrededor de 80 nm a 150 nm, o aproximadamente 80 nm a alrededor de 130 nm, y la relación N/P de la composición es de al menos aproximadamente 4:1, o de alrededor de 4:1 a aproximadamente 20:1, o de alrededor de 4:1 a aproximadamente 15:1. En ciertas modalidades, la relación aceite : lípido (mol:mol) es de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a alrededor de 43:1 (mol.-mol). En algunas modalidades, el aceite es escualeno o escualano. En algunas modalidades, el aceite está presente de 0.6% a 4% (p/v) . En algunas modalidades, el aceite está presente de alrededor de 1% a aproximadamente 3.2% (p/v) .
La emulsión aceite en agua de este aspecto puede comprender además un tensioactivo, tal como un tensioactivo no iónico. De preferencia, el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG) -lípido . El tensioactivo puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.005% a alrededor de 1.25% (p/v) . En algunas modalidades, el tensioactivo es SPAN85 (trioleato de sorbitán) , Tween 80 (polisorbato 80), o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, la emulsión de aceite en agua contiene cantidades iguales de SPAN85 (trioletato de sorbitán) y Tween 80 (polisorbato 80), por ejemplo 0.25% o 0.5% (p/v) de cada uno .
De preferencia el grupo de cabeza de lípido catiónico comprende una amina cuaternaria. Por ejemplo, en algunas modalidades el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1, 2-dioleoxiloxi-3- (trimetilamonio) propano (DOTAP) , 1 , 2 -dioleoil-sn-glicero-3 -etilfosfocolina (DOEPC) , cloruro de N, N-dioleoil -N, N-dimetilamonio (DODAC) y cloruro de N-[l-(2,3-dioleiloxi) propil] -N, , N-trimetilamonio (DOTMA) .
En algunas modalidades, la invención proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico (de preferencia una molécula de AR ) complejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, en donde la partícula comprende un aceite que está en fase líquida a 25°C y DOTAP; y (i) la relación de aceite :DOTAP (mol:mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol); (ii) la concentración de DOTAP en la composición es de la menos aproximadamente 1.29 mM, o alrededor de 1.29 mM (0.9 mg/mL) a alrededor de 3.58 mM (2.5 mg/mL) : El aceite puede ser escualeno o escualano. Opcionalmente , la relación N/P es de al menos 4:1.
En modalidades preferidas, la composición es regulada en pH (por ejemplo, con un regulador de pH de citrato, regulador de pH de succinato, regulador de pH de acetato) y tiene un pH de alrededor de 6.0 a aproximadamente 8.0, preferiblemente alrededor de 6.2 a aproximadamente 6.8. La composición puede comprender además una sal inorgánica, y la concentración de sal inorgánica de preferencia no es mayor que 30 mM. Opcionalmente la composición puede comprender además un agente tonificador no iónico, y de preferencia es isotónica .
La invención también proporciona un método para preparar una composición que comprenda una molécula de ácido nucleico (de preferencia una molécula de AR ) comple ada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, que comprende: (i) proporcionar una emulsión de aceite en agua como la descrita en la presente; (ii) proporcionar una solución acuosa que comprende la molécula de ARN; y (iii) combinar la emulsión de aceite en agua de (i) y la solución acuosa de (ii) , preparando de esta manera la composición. En algunas modalidades, la emulsión catiónica de aceite en agua y solución de ARN se combinan a aproximadamente una relación de 1:1 (v/v) . La solución acuosa que comprende la molécula de ARN es de preferencia regulada en pH (por ejemplo, con un regulador de pH de citrato, regulador de pH de succinato, regulador de pH de acetato) , puede contener una sal inorgánica (por ejemplo, NaCl) , la cual esté preferiblemente presente a alrededor de 20 mM o menos. En una modalidad, la solución acuosa que comprende la molécula de ARN contiene 2 mM de regulador de pH de citrato y 20 mM de NaCl . Opcionalmente , la solución acuosa que comprende la molécula de ARN comprende además un agente tonificador no iónico, y es isotónica. En una modalidad, la solución acuosa comprende además alrededor de 560 mM de sacarosa. Opcionalmente, la solución acuosa que comprende la molécula de ARN comprende además un polímero o tensioactivo no iónico, tal como Pluronic<s F127, a alrededor de 0.05% a aproximadamente 20% (p/v) .
En otro aspecto, la invención proporciona una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que son dispersas en una fase continua acuosa, en donde la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, el aceite está presente de 0.6% a 4% (p/v) ; y la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 1.25 mM. Preferiblemente, la emulsión de aceite en agua es estable. En algunas modalidades, la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM. En algunas modalidades, el aceite es escualeno o escualano.
La emulsión de aceite en agua de este aspecto puede comprender además un tensioactivo, tal como un tensioactivo no iónico. De preferencia, el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG) -lípido. El tensioactivo puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.01% a alrededor de 2.5%T (p/v). En algunas modalidades, el tensioactivo es SPA 85 (trioleato de sorbitán) , Tween 80 (polisorbato 80) , o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, la emulsión de aceite en agua contiene cantidades iguales de SPA 85 (trioleato de sorbitán) , Tween 80 (polisorbato 80) , por ejemplo 0.25% o 0.5% (p/v) de cada uno.
De preferencia el grupo de cabeza del lípido catiónico comprende una amina cuaternaria. Por ejemplo, en algunas modalidades el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1 , 2 -dioleoiloxi-3 - (trimetilamonio) propano (DOTAP) , 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC) , cloruro de N, N-dioleoil-N, N- dimetilamonio (DODAC) y cloruro de N-[l-(2,3-dioleiloxi ) ropi1] -N, , N-trimeti1amonio (DOTMA) .
La invención proporciona una composición que comprende una molécula de ácido nucleico (de preferencia una molécula de ARN) complejada con una partícula de una emulsión de aceite en agua que contiene partículas que son dispersas en una fase continua acuosa, en donde la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, el aceite está presente de 0.6% a 4% (p/v) ; y la concentración del lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 1.25 rriM. De preferencia, la emulsión de aceite en agua es estable. En algunas modalidades, la concentración del lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM. En algunas modalidades, el aceite es escualeno o escualano. De preferencia, la relación N/P de la composición es de al menos aproximadamente 4:1.
En modalidades preferidas, la composición es regulada en pH (por ejemplo, con un regulador de pH de citrato, regulador de pH de succinato, regulador de pH de acetato) y tiene un pH de alrededor de 6.0 a aproximadamente 8.0, preferiblemente alrededor de 6.2 a aproximadamente 6.8. La composición puede comprender además una sal inorgánica, y la concentración de sal inorgánica es de preferencia no mayor que 30 mM. Opcionalmente, la composición puede comprender además un agente tonificador no iónico, y de preferencia es isotónica.
La invención se refiere también a un método para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que lo requiera la composición como la descrita en la presente. De preferencia la cantidad del lípido catiónico administrado al sujeto (como un componente de la composición) en una sola administración no es mayor que aproximadamente 30 mg. En modalidades particulares, el lípido catiónico es DOTAP y la cantidad total de DOTAP administrada al sujeto en una sola administración no es mayor que aproximadamente 24 mg, o no mayor que alrededor de 4 mg.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 es un esquema de replicones de ARN pentacistrónico, A526, A527, A554, A555 y A556, que codifican para cinco proteínas de CMV. Los promotores subgenómicos se muestran por flechas, otros elementos de control están marcados .
La figura 2 es un histograma de fluorescencia que muestra que células BHKV transíectadas con el replicón de ARN A527 expresan el complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131. Se llevó a cabo tinción celular usando un anticuerpo que se une a un epítopo de conformación presente en el complejo pentamérico.
La figura 3 es un esquema y gráfica. El esquema muestra replicones de ARN bicistrónico, A160 y A531-A537, que codifican para gH y gL de CMV. La gráfica muestra la actividad neutralizante de sueros inmunes de ratones inmunizados con VRPs que contenían los replicones.
La figura 4 es una gráfica que muestra la respuesta de anticuerpo anti-proteína VZV en sueros inmunes de ratones inmunizados con replicones de ARN monocistrónico que codificaban para proteínas VZV o replicones de ARN bicistrónicos que codificaban para gE y gl, o gH y gL de VZV. Los ratones fueron inmunizados con 7 ug de ARN formulado con CMF32.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION 1. Perspectiva general La invención se refiere generalmente a emulsiones catiónicas de aceite en agua que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y tienen una relación aceite : lípido catiónico definida. El aceite y lípido catiónico son componentes separados de las emulsiones, y de preferencia no es iónico. El lípido catiónico puede interactuar con una molécula cargada negativamente, tal como un ácido nucleico, anclando de esta manera la molécula cargada negativamente a las partículas de emulsión. Las emulsiones catiónicas descritas en la presente son útiles para suministrar moléculas cargadas negativamente, tales como moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN que codifique para una proteína o péptido, ARN de interferencia pequeño, ARN de autoreplicación, y similares) , a células in vivo, y para formular vacunas a base de ácido nucleico.
En particular, la presente invención se basa en el descubrimiento de que emulsiones catiónicas de aceite en agua estables que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y tienen una relación aceite : lípido catiónico definida pueden elaborarse exitosamente. Las emulsiones que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos permiten que más moléculas cargadas negativamente (tales como moléculas de ARN) sean formuladas con partículas de emulsión, incrementando así la eficiencia de suministro. En particular, para muchos terapéuticos tales como vacunas, se prefieren pequeños volúmenes (por ejemplo, 0.5 mL por dosis) para administración. Emulsiones que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y tienen una relación aceite : lípido catiónico definida, como las descritas en la presente, permitirán el suministro de una dosis más alta de ARN dentro de un volumen especificado.
En modalidades preferidas, una molécula de ARN es complejada con una partícula de la emulsión de aceite en agua. La molécula de AR complejada es estabilizada y protegida contra la degradación mediada por RNasa, y es más eficientemente absorbida por células con relación al ARN libre ("desnudo").
Además, cuando el ARN es suministrado para inducir la expresión de una proteína codificada, tal como en el contexto de una vacuna de ARN, emulsiones que contengan altas concentraciones de lípidos catiónicos pueden incrementar la cantidad de moléculas de ARN que sean complejadas con partículas de emulsión. Al ser suministradas más moléculas de ARN a células hospederas, más alta es la cantidad de antígeno de proteína codificado que se produce, lo cual a su vez incrementa la potencia e inmunogenicidad de la vacuna de ARN. Finalmente, la inmunogenicidad de la proteína codificada puede ser incrementada debido a los efectos adyuvantes de la emulsión. Por lo tanto, además de un suministro más eficiente de una molécula cargada negativamente (por ejemplo, una molécula de ARN que codifica para un antígeno) , las emulsiones catiónicas también pueden incrementar la respuesta inmunitaria a través de actividad adyuvante. Por ejemplo, como se describe y ejemplifica en la presente, formulaciones en las cuales moléculas de ARN (que codifican para proteína F del virus sincitial respiratorio (RSV) ) fueron complejadas con emulsiones de alto contenido de DOTAP generaron respuestas inmunitarias más altas en un modelo de ratón y un modelo de rata algodón de RSV, en comparación con moléculas de ARN complejadas con emulsiones de bajo contenido de DOTAP.
En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que son dispersas en una fase continua acuosa, en donde la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm (b) la emulsión comprende un aceite y un lipido catiónico, en donde (i) la relación de aceite : lipido catiónico (mol:mol) es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lipido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM, y (iii) el lipido catiónico no es DC-colesterol.
En otro aspecto, la invención proporciona una emulsión de aceite en agua que comprende partículas que son dispersas en una fase continua acuosa, en donde la emulsión se caracteriza por: (a) el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm; (b) la emulsión comprende un aceite y un lipido catiónico, en donde (i) la relación de aceite: lipido catiónico (mol:mol) es de al menos aproximadamente 4:1 (mol:mol), (ii) la concentración de lipido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM, (iii) el aceite está presente de alrededor de 0.2% a aproximadamente 8% (p/v) ; y (iv) con la condición de que el lipido catiónico no sea DC-colesterol.
Las emulsiones cationicas pueden comprender además un tensioactivo (por ejemplo, Tween 80, SPA 85, o una combinación de los mismos) .
En otro aspecto, la invención también proporciona varias formulaciones específicas de emulsiones cationicas de aceite en agua que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y se pueden usar para suministrar moléculas cargadas negativamente.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar una emulsión de aceite en agua, que comprende: (1) disolver directamente un lípido catiónico en un aceite para formar una fase de aceite; (2) proporcionar una fase acuosa de la emulsión; y (3) dispersar la fase de aceite en la fase acosa (por ejemplo, para homogeneización) . Si se desea, el aceite puede ser calentado hasta una temperatura de entre aproximadamente 30°C a alrededor de 65°C para facilitar la disolución de lípido en el aceite. Preferiblemente, la relación de aceite : lípido catiónico (mol:mol) en la fase de aceite es de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), y como alternativa o además, el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, y/o la concentración de lípido catiónico en la fase de aceite es de al menos aproximadamente 5 mM.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar una composición que comprende una molécula cargada negativamente (tal como una molécula de ARN) complejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, que comprende: (i) proporcionar una emulsión de aceite en agua como la descrita en la presente; (ii) proporcionar una solución acuosa que comprenda la molécula de ARN; y (iii) combinar la solución acuosa de (ii) y la emulsión de aceite en agua de (i) , preparando así la composición. Si se desea, la solución acuosa que comprenda la molécula de ARN puede comprender una sal (por ejemplo, NaCl) , un regulador de pH (por ejemplo, un regulador de pH de citrato) , un agente tonificador no iónico (por ejemplo, sacarosa, trehalosa, sorbitol o dextrosa) , un polímero (por ejemplo, Pluronic^ F127) , o cualquier combinación de los mismos .
Las emulsiones catiónicas de la invención pueden usarse para suministrar una molécula cargada negativamente, tal como un ácido nucleico (por ejemplo, ARN) . Las composiciones pueden administrarse a un sujeto que lo requiera para generar o potenciar una respuesta inmunitaria. Las composiciones también pueden ser co-suministradas con otra molécula inmunogénica, composición o vacuna inmunogénica para incrementar la efectividad de la respuesta inmunitaria inducida. 2. Definiciones El término "aproximadamente", según se usa aquí, se refiere a +/- 5% de un valor.
Un "antígeno" se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos (ya sea lineales, de conformación o ambos) .
Un "regulador de pH" se refiere a una solución acuosa que resiste cambios en el pH de la solución.
Según se usa aquí, "análogo de nucleótido" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que contiene una o más modificaciones químicas (por ejemplo, sustituciones) en o sobre la base nitrogenosa del nucleósido (por ejemplo, citosina (C) , timina (T) o uracilo (U) ) , adenina (A) o guanina (G) ) .
Según se usa en la presente, una "partícula" de emulsión se refiere a una gotilla de aceite suspendida en la fase acuosa (continua) de una emulsión de aceite en agua. La partícula comprende además un líquido catiónico, y opcionalmente componentes adicionales, tales como un tensioactivo .
El término "polímero" se refiere a una molécula que consiste en porciones químicas individuales, las cuales pueden ser iguales o diferentes, que están unidas juntas. Según se usa en la presente, el término "polímero" se refiere a porciones químicas individuales que están unidas extremo con extremo para formar una molécula lineal, así como a porciones químicas individuales unidas juntas en forma de una estructura ramificada (por ejemplo, de "varios brazos" o "forma de estrella") . Ejemplos de polímeros incluyen, por ejemplo, poloxámeros. Los poloxameros son copolímeros de tres bloques no iónicos que tienen una cadena hidrófoba central de polioxipropileno (óxido de poli (propileno) ) flanqueada por dos cadenas hidrófilas de polioxietileno (óxido de poli (etileno) ) . 2 Según se usa en la presente, "sacárido" abarca monosacáridos, oligosacáridos o polisacáridos en formas de cadena recta o anillo, o una combinación de los mismos para formar una cadena de sacáridos . Los oligosacáridos son sacáridos que tienen dos o más residuos de monosacáridos. Ejemplos de sacáridos incluyen glucosa, maltosa, maltotriosa, maltotetraosa , sacarosa y trehalosa.
Una emulsión es "estable" cuando las partículas de la emulsión permanecen separadas sin aglomeración o coalescencia significativa durante al menos un mes, de preferencia al menos dos meses, a 4°C. El diámetro de partícula promedio (diámetro en número promedio) de una emulsión estable no cambia en más de 10% cuando la emulsión se almacena a 4°C durante un mes, o de preferencia dos meses.
El término "tensioactivo" es un término de la técnica y se refiere generalmente a cualquier molécula que tenga tanto un grupo hidrófilo (por ejemplo, un grupo polar) , el cual prefiere energéticamente solvatación por agua, como un grupo hidrófobo el cual no es bien solvatado por agua. El término "tensioactivo no iónico" es un término conocido en la técnica y se refiere generalmente a una molécula tensioactivo cuyo grupo hidrófilo (por ejemplo, grupo polar) no está cargado electrostáticamente.
El "potencial zeta" de una emulsión se determina por la movilidad electroforética de las partículas de emulsión. La velocidad de una partícula en un campo eléctrico unitario se conoce como su movilidad electroforética . El potencial zeta está relacionado con la movilidad electroforética por la ecuación de Henry: = lezfjká) 3? en donde UE = movilidad electroforética, z potencial zeta, £ = constante dieléctrica, ? = viscosidad y f (ka) = función de Henry. El potencial zeta se mide típicamente usando un aparato de movilidad electroforética , tal como un Zetasizer Nano Z (Malven Instruments Ltd. , Reino Unido) . 3. Emulsiones catiónicas de aceite en agua Las emulsiones catiónicas de aceite en agua descritas en la presente generalmente se describen de la manera que es convencional en la técnica, por concentraciones de componentes que se usan para preparar las emulsiones. Se entiende en la técnica que durante el proceso de producir emulsiones, incluyendo esterilización y otros procesos hacia abajo, pequeñas cantidades de aceite (por ejemplo, escualeno) , lípido catiónico (por ejemplo, DOTAP) , u otros componentes pueden perderse, y las concentraciones reales de estos componentes en el producto final (por ejemplo, una emulsión esterilizada y envasada que esté lista para su administración) podría ser ligeramente menor que las cantidades de partida, algunas veces en hasta aproximadamente 10%, hasta alrededor de 20%, hasta aproximadamente 25%, o hasta alrededor de 35%.
Esta invención se refiere generalmente a emulsiones catiónicas de aceite en agua que contienen altas concentraciones de lípidos catiónicos y una relación aceite : lipido catiónico definida. Las emulsiones son particularmente adecuadas para suministrar moléculas cargadas negativamente, tales como una molécula de AR , a una célula. El lipido catiónico puede interactuar con la molécula cargada negativamente, por ejemplo a través de fuerzas electrostáticas e interacciones hidrófobas/hidrófilas , anclando de esta manera la molécula a las partículas de emulsión. Las emulsiones catiónicas descritas en la presente son útiles para suministrar una molécula cargada negativamente, tal como una molécula de ARN que codifique para un antígeno o ARN de interferencia pequeño a células in vivo. Por ejemplo, las emulsiones catiónicas descritas aquí proporcionan ventajas para suministrar moléculas de ARN que codifican para uno o más antígenos, incluyendo moléculas de ARN de autoreplicación, como vacunas.
La fase discreta (o fase dispersa) de la emulsión comprende un aceite y un lipido catiónico, en donde el lipido catiónico facilita dispersar el aceite en la fase acuosa (continua) . Uno o más componentes opcionales pueden estar presentes en la emulsión, tales como tensioactivos (por ejemplo, tensioactivos no iónicos) como se describe abajo.
Las partículas de las emulsiones de aceite en agua tienen un diámetro promedio (es decir, diámetro en número promedio) de 1 miera o menos. Es particularmente deseable que el diámetro de partícula promedio de las emulsiones catiónicas sea de aproximadamente 180 nm o menos, alrededor de 170 nm o menos, aproximadamente 160 nm o menos, alrededor de 150 nm o menos, aproximadamente 140 nm o menos, alrededor de 130 nm o menos, aproximadamente 120 nm o menos, alrededor de 110 nm o menos, o aproximadamente 100 nm o menos; por ejemplo, de aproximadamente 80 nm a 180 nm, de alrededor de 80 nm a 170 nm, de aproximadamente 80 nm a 160 nm, de alrededor de 80 nm a 150 nm, de aproximadamente 80 nm a 140 nm, de alrededor de 80 nm a 160 nm, de aproximadamente 80 nm a 150 nm, de alrededor de 80 nm a 140 nm, de aproximadamente 80 nm a 130 nm, de alrededor de 80 nm a 120 nm, de aproximadamente 80 nm a 110 nm, o de alrededor de 80 nm a 100 nm. Un diámetro de partícula promedio que se prefiere particularmente es alrededor de 100 nm, o de aproximadamente 100 nm a alrededor de 130 nm.
El tamaño (diámetro promedio) de las partículas de emulsión puede ser variado al cambiar la relación de tensioactivo a aceite (incrementar la relación reduce el tamaño de partícula) , presión operativa de homogeneización (incrementar la presión operativa de la homogeneización típicamente reduce el tamaño de partícula) , temperatura ( (incrementar la temperatura reduce el tamaño de partícula) , cambiar el tipo de aceite, inclusión de ciertos tipos de reguladores de pH en la fase acuosa, y otros parámetros de proceso, como se describe en detalle abajo. En algunos casos, el tamaño de las partículas de emulsión puede afectar la inmunogenicidad del complejo ARN-emulsión, como se ejemplifica en la presente.
Las emulsiones de aceite en agua descritas en la presente son estables.
Las partículas de las emulsiones descritas en la presente pueden ser complejadas por una molécula cargada negativamente. Antes de la complej ación con la molécula cargada negativamente, la carga neta total de las partículas (medida típicamente como potencial zeta) debe ser positiva (catiónica) . La carga neta total de las partículas puede variar, dependiendo del tipo de lípido catiónico y de la cantidad del lípido catiónico en la emulsión, la cantidad de aceite en la emulsión (por ejemplo, un porcentaje más alto de aceite se traduce típicamente en menos carga sobre la superficie de las partículas) , y también se puede ver afectada por un componente adicional (por ejemplo, tensioactivos) que esté presente en la emulsión. De preferencia, el potencial zeta de las partículas antes de la complej ación no es mayor que aproximadamente 50 mv, no más de alrededor de 45 mV, no más de alrededor de 40 mV, no más de aproximadamente 35 mV, no más de alrededor de 30 mV, no más de aproximadamente 25 mV, no más de alrededor de 20 mV; de alrededor de 5 mV a aproximadamente 50 mV, de alrededor de 10 mV a aproximadamente 50 mV, de alrededor de 10 mV a aproximadamente 45 mV, de alrededor de 10 mV a aproximadamente 40 mV, de alrededor de 10 mV a aproximadamente 35 mV, de alrededor de 10 mV a aproximadamente 30 mV, de alrededor de 10 mV a aproximadamente 25 mV, o de alrededor de 10 mV a aproximadamente 20 mV. El potencial zeta puede ser afectado por (i) pH de la emulsión, (ii) conductividad de la emulsión (por ejemplo, salinidad) y (iii) la concentración de los diferentes componentes de la emulsión (polímero, tensioactivos no iónicos, etc.) . El potencial zeta de las emulsiones catiónicas de aceite en agua se mide usando un alvern Nanoseries Zetasizer ( estborough, MA) . La muestra se diluye 1:100 en agua (viscosidad: 0.8872 cp, RI : 1.330, constante dieléctrica: 78.5) y se añade a una celda capilar de látex de poliestireno (Malvern, Westborough, MA) . El potencial zeta se mide a 25°C con un tiempo de equilibrio de 2 minutos y se analiza usando el modelo de Smoluchowski (F(Ka) valor = 1.5). Los datos se reportan en mV.
Un ejemplo de emulsión catiónica de la invención se denomina en la presente "CMF32" . El aceite de CMF32 es escualeno (a 4.3% p/v) y el lípido catiónico es DOTAP (a 3.2 mg/mL) : CMF32 también incluye los tensioactivos SPA 85 (trioleato de sorbitán a 0.5% v/v) y Tween 80 (polisorbato 80; monooleato de polioxietuilensorbitán; a 0.5% v/v). Así, las partículas de emulsión de C F32 comprenden escualeno, SPA 85, Tween80, y DOTAP . Las moléculas de ARN mostraron formar complejos con partículas de CMF32 eficientemente a relaciones N/P de 4:1, 6:1, 8:1, 10:1, 12:1 y 14:1. Otros ejemplos de emulsiones catiónicas incluyen, por ejemplo, las emulsiones denominadas en la presente "CMF34" (4.3% p/v de escualeno, 0.5% de Tween 80, 0.5% de SPAN85 y 4.4 mg/mL de DOTAP), "CMF35" (4.3% p/v de escualeno, 0.5% de Tween 80, 0.5% de SPA 85, 5.0 mg/mL de DOTAP), y otras emulsiones descritas en la presente.
Ciertos ejemplos de emulsiones catiónicas de aceite en agua de la invención comprenden DOTAP y escualeno a concentraciones de 2.1 mg/ml a 2.84 mg/ml (preferiblemente 2.23 mg/ml a 2.71 mg/ml), y 30.92 mg/ml a 41.92 mg/ml (de preferencia 32.82 mg/ml a alrededor de 40.02 mg/ml), respectivamente, y comprenden además cantidades iguales de SPAN85 y Tween 80 (por ejemplo, aproximadamente 0.5% cada una) . Otros ejemplos de emulsiones catiónicas de aceite en agua de la invención comprenden DOTAP y escualeno a concentraciones de 2.78 mg/ml a 3.76 mg/ml (de preferencia 2.94 mg/ml a 3.6 mg/ml), y 18.6 mg/ml a 25.16 mg/ml (preferiblemente 19.69 mg/ml a alrededor de 24.07 mg/ml), respectivamente, y comprenden además cantidades iguales de SPA 85 y Tween80 (por ejemplo, aproximadamente 0.5% cada una) . De preferencia, las partículas de estas emulsiones tienen un diámetro promedio de 80 nm a 180 nm.
Los componentes individuales de las emulsiones de aceite en agua de la presente invención se conocen en la técnica, aunque estas composiciones no han sido combinadas de la manera descrita aquí. En consecuencia, los componentes individuales, aunque descritos abajo tanto generalmente como en cierto detalle para modalidades preferidas, se conocen bien en la técnica, y los términos usados en la presente, tales como aceite, tensioactivo, etc., son suficientemente bien conocidos por un experto en la técnica sin descripción adicional. Además, aunque los intervalos preferidos de la cantidad de los componentes individuales de las emulsiones son proporcionados, las relaciones reales de los componentes de una emulsión particular pueden tener que ser ajustadas de tal manera que las partículas de emulsión de un tamaño y propiedad física deseadas se formen adecuadamente. Por ejemplo, si una cantidad particular de aceite es usada (por ejemplo, 5% v/v de aceite) , entonces la cantidad de tensioactivo debe estar a un nivel que sea suficiente para dispersar la partícula de aceite en la fase acuosa para formar una emulsión estable. La cantidad real de tensioactivo requerida para dispersar el aceite en la fase acuosa depende del tipo de tensioactivo y de tipo de aceite usado para la emulsión; y la cantidad de aceite también puede variar de acuerdo con el tamaño de la partícula deseado (ya que esto cambia el área superficial entre las dos fases) . Las cantidades reales y las proporciones relativas de los componentes de una emulsión deseada pueden determinarse fácilmente por un experto en la técnica.
A. Aceite Las partículas de las emulsiones catiónicas de aceite en agua comprenden un aceite. El aceite está de preferencia en la fase líquida a 1°C o más, y es inmiscible en agua.
De preferencia, el aceite es un aceite no tóxico metabolizable; muy preferiblemente uno de aproximadamente 6 a alrededor de 30 átomos de carbono incluyendo, pero no limitado a, alcanos, alquenos, alquinos y sus ácidos y alcoholes correspondientes, los éteres y ásteres de los mismos, y mezclas de los mismos. El aceite puede ser cualquier aceite vegetal, aceite de pescado, aceite animal o aceite preparado sintéticamente que pueda ser metabol izado por el cuerpo de un sujeto al cual se administrará la emulsión, y no sea tóxico para el sujeto. El sujeto puede ser un animal, típicamente un mamífero, y de preferencia un humano.
En ciertas modalidades, el aceite está en fase líquida a 25°C. El aceite está en fase líquida a 25°C, cuando despliega las propiedades de un fluido (según se distingue de sólido y gas; y con un volumen definido pero no una forma definida) cuando se almacena a 25 °C. La emulsión, sin embargo, puede ser almacenada y usada a cualquier temperatura adecuada. De preferencia, el aceite está en fase líquida a 4°C.
El aceite puede ser un alcano, alqueno o alquino de cadena larga, o un ácido derivado de alcohol del mismo ya sea como el ácido libre, su sal o un éster tal como un mono- o di- o triéster, tal como los triglicéridos y ésteres de 1,2-propanodiol o alcoholes poli-hidroxílicos similares. Los alcoholes pueden ser acilados empleando un ácido mono- o poli-funcional, por ejemplo ácido acético, ácido propanoico, ácido cítrico o similares. Los éteres derivados de alcoholes de cadena larga que sean aceites y cumplan los demás criterios mostrados en la presente también pueden ser usados.
La porción de alcano, alqueno o alquino individual y sus derivados de ácido o alcohol generalmente tendrán alrededor de 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. La porción puede tener una estructura de cadena recta o ramificada. Puede ser completamente saturada o tener uno o más dobles o triples enlaces. Cuando se empleen aceites a base de mono o poliéster o éter, la limitación de aproximadamente 6 a alrededor de 30 carbonos aplica a las porciones de ácido graso o alcohol graso individuales, no al recuento de carbonos total .
Cualesquiera aceites adecuados a partir de una fuente animal, de pescado o vegetal pueden ser usados. Las fuentes de aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos, y los aceites adecuados aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite de coco y aceite de oliva y similares. Otros aceites de semilla adecuados incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de ajonjolí y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz y el aceite de otros granos de cereal tales como trigo, avena, centeno, arroz, tef, triticale y similares pueden ser usados también. La tecnología para obtener aceites vegetales está bien desarrollada y se conoce bien. Las composiciones de éstos y otros aceites similares pueden encontrarse en, por ejemplo, el índice Merck, y los materiales de origen en alimentos, nutrición y tecnología de alimentos.
Esteres de ácido graso de aproximadamente seis a alrededor de diez carbonos de glicerol y 1 , 2-propanodiol , aunque no se presentan naturalmente en aceites de semilla, pueden ser preparados por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales adecuados iniciando a partir de los aceites de nuez y semilla. Estos productos están disponibles comercialmente con el nombre NEOBEES de PVO International, Inc., Chemical Specialties División, 416 División Street, Boongon, N.J., y otros.
Aceites y grasas animales comúnmente están en fase sólida a temperaturas fisiológicas debido al hecho de que existen como triglicéridos y tienen un alto grado de saturación que los aceites de pescado o vegetales. Sin embargo, los ácidos grasos se pueden obtener de grasas animales por saponificación de triglicéridos parcial o completa la cual proporciona los ácidos grasos libres. Las grasas y aceites de leche de mamífero son metabolizables y pueden por lo tanto ser usadas en la práctica de esta invención. Los procedimientos para separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros a partir de fuentes animales se conocen bien en la técnica .
La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que pueden ser fácilmente recuperados. Por ejemplo, aceite de hígado de bacalao, aceite de hígado de tiburón y aceite de ballena tal como espermaceti son ejemplos de varios de los aceites de pescado que pueden ser usados en la presente. Un número de aceites de cadena ramificada son sintetizados bioquímicamente en unidades isopreno de 5 carbonos y se conocen generalmente como terpenoides. El escualeno (2, 6, 10, 15, 19, 23 -hexametil-2 , 6, 10, 14, 18,22-tetracosahexaeno) , un terpenoide ramificado e insaturado, es particularmente preferido en la presente. Una principal fuente de escualeno es el aceite de hígado de tiburón, aunque aceites de plantas (principalmente aceites vegetales) , incluyendo aceites de semilla de amaranto, salvado de arroz, germen de trigo y oliva, también son fuentes adecuadas. El escualeno también se puede obtener de levadura u otros microbios adecuados. En algunas modalidades, el escualeno se obtiene de preferencia de fuentes animales, tales como de olivas, aceite de oliva o levadura. El escualano, el análogo saturado del escualeno, también se prefiere. Aceites de pescado, incluyendo escualeno y escualano, están disponibles fácilmente de fuentes comerciales o pueden obtenerse mediante métodos conocidos en la técnica.
En ciertas modalidades, el aceite comprende un aceite que se selecciona del grupo que consiste en: aceite de resino, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de onagra, aceite de pescado, aceite de jojoba, aceite de manteca, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de cacahuate, aceite de cártamo, aceite de ajonjolí, aceite de soya, escualeno, escualano, aceite de girasol y aceite de germen de trigo. En modalidades ejemplares, el aceite comprende escualeno o escualano.
El componente de aceite de la emulsión puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0.2% a alrededor de 10% (v/v) . Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender de aproximadamente 0.2% a alrededor de 10% (v/v) de aceite, de aproximadamente 0.2% a alrededor de 8% (v/v) de aceite, de aproximadamente 0.2% a alrededor de 7% (v/v) de aceite, de aproximadamente 0.2% a alrededor de 6% (v/v) de aceite, de aproximadamente 0.2% a alrededor de 5% (v/v) de aceite, de aproximadamente 0.3% a alrededor de 10% (v/v) de aceite, de aproximadamente 0.4% a alrededor de 10% (v/v) de aceite, de aproximadamente 0.5% a alrededor de 10% (v/ de aceite, de aproximadamente 1% a alrededor de 10% (v/v) de aceite, de aproximadamente 2% a alrededor de 10% (v/v ) de aceite , de aproximadamente 3% a alrededor de 10% (v/v] de aceite , de aproximadamente 4% a alrededor de 10% (v/v) de aceite , de aproximadamente 5% a alrededor de 10% (v/v) de aceite, de aproximadamente 0.2% a alrededor de 10% (p/v ) de aceite , de aproximadamente 0.2% a alrededor de 9% (p/v) de aceite , de aproximadamente 0.2% a alrededor de 10% (p/v ) de aceite , de aproximadamente 0.2% a alrededor de 9% (p/v) de aceite, de aproximadamente 0.2% a alrededor de 8% (p/v) de aceite , de aproximadamente 0.2% a alrededor de 7% (p/v) de aceite , de aproximadamente 0.2% a alrededor de 6% (p/v) de aceite, de aproximadamente 0.2% a alrededor de 5% (p/v) de aceite , de aproximadamente 0.2% a alrededor de <¦ 1.3% (p/v ) de aceite , de aproximadamente 0.6% a alrededor de 4% (p/v) de aceite , de aproximadamente 0.7% a alrededor de 4% (p/v) de aceite , de aproximadamente 0.8% a alrededor de 4% (p/v) de aceite , de aproximadamente 0.9% a alrededor de 4% (p/v) de aceite , de aproximadamente 1.0% a alrededor de 4% (p/v) de aceite, de aproximadamente 0.6% a alrededor de 3.5% (p/v) de aceite, de aproximadamente 0.6% a alrededor de 3% (p/v) de aceite, de aproximadamente 0.5% (v/v) de aceite, alrededor de 0.6% (v/v) de aceite, aproximadamente 0.7% (v/v) de aceite, alrededor de 0.8% (v/v) de aceite, aproximadamente 0.9% (v/v) de aceite, alrededor de 1% (v/v) de aceite, aproximadamente 1.5% (v/v) de aceite, alrededor de 2% (v/v) de aceite, aproximadamente 2.5% (v/v) de aceite, alrededor de 3% (v/v) de aceite, aproximadamente 3.5% (v/v) de aceite, alrededor de 4% (v/v) de aceite, aproximadamente 5% (v/v) de aceite, alrededor de 10% (v/v) de aceite, aproximadamente 0.5% (p/v) de aceite, alrededor de 1% (p/v) de aceite, alrededor de 1.5% (p/v) de aceite, aproximadamente 2% (p/v) de aceite, alrededor de 2.5% (p/v) de aceite, alrededor de 3% (p/v) de aceite, aproximadamente 3.5% (p/v) de aceite, alrededor de 4% (p/v) de aceite, aproximadamente 4.3% (p/v) de aceite, alrededor de 5% (p/v) de aceite, aproximadamente 5.5% (p/v) de aceite, alrededor de 6% (p/v) de aceite, aproximadamente 6.5% (p/v) de aceite, alrededor de 7% (p/v) de aceite, aproximadamente 7.5% (p/v) de aceite, o alrededor de 8% (p/v) de aceite.
La emulsión catiónica de aceite en agua también puede comprender alrededor de alrededor de 0.2% a aproximadamente 8% (v/v) de aceite, por ejemplo, de 0.6% (p/v) a 4% (p/v) , de alrededor de 1% (p/v) a aproximadamente 3.2% (p/v) , alrededor de 1% (p/v) , alrededor de 1.1% (p/v) , alrededor de 1.2% (p/v), alrededor de 1.3% (p/v), alrededor de 1.4% (p/v), alrededor de 1.5% (p/v), alrededor de 1.6 % (p/v), alrededor de 1.7 % (p/v), alrededor de 1.8 % (p/v), alrededor de 1.9% (p/v), alrededor de 2.0% (p/v), alrededor de 2.1% (p/v), alrededor de 2.15% (p/v), alrededor de 2.2% (p/v), alrededor de 2.3% (p/v), alrededor de 2.4% (p/v), alrededor de 2.5% (p/v), alrededor de 2.6% (p/v), alrededor de 2.7% (p/v), alrededor de 2.8% (p/v), alrededor de 2.9% (p/v), 3.0% (p/v), alrededor de 3.1% (p/v), alrededor de 3.2% (p/v), alrededor de 3.3% (p/v), alrededor de 3.4% (p/v), alrededor de 3.5% (p/v), alrededor de 3.6% (p/v), alrededor de 3.7% (p/v), alrededor de 3.8% (p/v), alrededor de 3.9% (p/v), o alrededor de 4.0% (p/v) de aceite.
En una modalidad ejemplar, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende alrededor de 5% (v/v) de aceite. En otra modalidad ejemplar, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende aproximadamente 4.3% (p/v) de escualeno. En otras modalidades ejemplares, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de 0.6% (p/v) a 4% (p/v) de escualeno, por ejemplo, de alrededor de 1% (p/v) a aproximadamente 3.2% (p/v) de escualeno, tal como 1.08% (p/v), 2.15% (p/v) o 3.23% (p/v) de escualeno, como se muestra en los ejemplos.
Como se indicó arriba, el porcentaje de aceite descrito arriba se determina con base en la cantidad inicial del aceite que se usa para preparar las emulsiones. Se entiende en la técnica que la concentración real del aceite en el producto final (por ejemplo, una emulsión envasada y esterilizada que está lista para administración) puede ser ligeramente más baja, algunas veces en hasta aproximadamente 10%, en hasta aproximadamente 20%, en hasta alrededor de 25% o en hasta aproximadamente 35%.
B. Lípidos catiónicos Las partículas de la emulsión descritas en la presente comprenden un lípido catiónico, el cual puede interactuar con la molécula cargada negativamente de esta manera anclando la molécula a las partículas de emulsión.
Cualquier lípido catiónico adecuado puede ser usado. Generalmente, el lípido catiónico contiene un átomo de nitrógeno que está cargado positivamente bajo condiciones fisiológicas. El grupo de cabeza del lípido catiónico puede comprender una amina terciaria o, de preferencia, una amina cuaternaria. Ciertos lípidos catiónicos adecuados comprenden dos cadenas de ácido graso saturadas o ínsaturadas (por ejemplo, cadenas laterales que tienen alrededor de 10 a aproximadamente 30 átomos de carbono) .
El lípido catiónico puede tener una carga positiva a alrededor de 12 pH, aproximadamente 11 pH, alrededor de 10 pH, aproximadamente 9 pH, alrededor de 8 pH, aproximadamente 7 pH, o alrededor de 6 pH.
Los lípidos catiónicos adecuados incluyen, cloruro de benzalconio (BAK) , cloruro de benzetonio, cetrimida (la cual contiene bromuro de tetradeciltrimetilamonio y posiblemente pequeñas cantidades de bromuro de dodeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetilamonio) , cloruro de cetilpiridinio (CPC) , cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC) , aminas primarias, aminas secundarias, aminas terciarias, incluyendo pero no limitadas a, ?,?' ,?' -polioxietileno (10) -N-sebo-1, 3-diaminopropano, otras sales de amina cuaternaria, incluyendo pero no limitadas a bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetilamonio, bromuro de alquil-trimetil-amonio mixto, cloruro de bencildimetildodecilamonio, cloruro de bencildimetilhexadecil-amonio, metóxido de benciltrimetilamonio, bromuro de cetildimetilamonio, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB) , cloruro de metilbenzetonio, cloruro de decametonio, cloruro de trialquil amonio mixto, cloruro de metil trioctilamonio) , cloruro de N,N-dimetil-N- [2- (2-metil-4- (1, 1, 3 , 3-tetrametilbutil) -fenoxi] -etoxi) etil] -bencenmeta-naminio (DEBDA) , sales dialquildimetilamonio, cloruro de [1- (2,3-dioleiloxi) -propil] -?,?,?-trimetilamonio, 1, 2-diacil-3- (trimetilamonio)propano (grupo acilo-dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo) , 1,2-diacil-3 (dimetilamonio) propano (grupo acilo = dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleioilo) , 1, 2-dioleioil-3- (4' -trimetil-amonio)butanoil-sn-glicerol, éster 3-succinil-sn-glicerol colina 1,2-dioleoilo, coloesteril (4 ' -trimetilamonio) butanoato) , sales N-alquil piridinio (por ejemplo, bromuro de cetilpiridinio y cloruro de cetilpiridinio) , sales N-alquilpiperidinio, electrolitos bolaformes dicatiónicos (d2Me6; Ci2Bu6) , dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-a dioleoilfosfatidiletanolamina, éster colínico de colesterol hemisuccinato, lipopoliaminas, incluyendo, pero no limitadas a dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS) , dipalmitoil fosfatidiletanol-amidoespermina (DPPES) , lipopoli-L (o D) -lisina (LPLL, LPDL) , poli (L (o D) -lisina conjugada a N-glutarilfosfatidiletanolamina, éster de didodecil glutamato con un grupo amino pendiente (Ci2GluPhCn +) , éster de ditetradecil glutamato con grupo amino pendiente (C^GluCnKT) , derivados catiónicos de colesterol, incluyendo pero no limitados a sal ß-oxisuccinamidoetilentrimetilamonio de colesterilo, ß-oxisuccinamidoetilendimetilamina de colesterilo-3 , sal p-carboxiamidoetilentrimetilamonio de colesterilo-3 , ß-oxisuccinamidoetilendimetilamina de colesterilo-3, sal ß-carboxiamidoetilentrimetilamonio de colesterilo-3, ß-carboxiamidoetilendimetilamina de colesterilo-3 y 3?-[?-(?',?-dimetilaminoetancarbomoil] colesterol) (DC-colesterol) , 1,2-dioleoiloxi-3- (trimetilamonio) ropano (DOTAP) , dimetildiocadecilamonio (DDA) , 1, 2-dimiristoil-3-trimetilamoniopropano (DMTAP) , dipalmitoil (Ci6-o) trimetil amonio propano (DPTAP) , distearoiltrimetilamonio propano (DSTAP) , cloruro de N- [1- (2 , 3 -dioleiloxi ) propil] -N, N, N-trimetilamonio (DOTMA), cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (DODAC) , 1, 2-dioleioil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC) , 1, 2-dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP) , 1, 2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLinDMA) , y combinaciones de los mismos.
En modalidades preferidas, el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en 1, 2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio) ropano (DOTAP) , 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC), cloruro de N, N-dioleoil-N, N-dimetilamonio (DODAC) y cloruro de N-[l-(2,3-dioleiloxi ) propil] -N, , N-trimetilamonio (DOTMA). En ciertas modalidades, el lípido catiónico no es DC-colesterol.
De preferencia, el lípido catiónico seleccionado para la emulsión es soluble en el aceite que se selecciona para la emulsión. Esto permite que se logren altas concentraciones de lípidos catiónicos de la emulsión, al disolver directamente el lípido en el aceite antes de su dispersión en la fase móvil. Está dentro del conocimiento en la técnica determinar si un lípido particular es soluble en el aceite y seleccionar una combinación adecuada de aceite y lípido en consecuencia. Por ejemplo, la solubilidad puede ser predicha con base en las estructuras de lípido y aceite (por ejemplo, la solubilidad de un lípido puede determinarse por la estructura de su cola) . Por ejemplo, lípidos que tengan una o dos cadenas de ácido graso insaturadas (por ejemplo, colas de oleoilo o colas de linolilo) , tales como DOTAP, DOEPC, DODAC, DOTMA, son solubles en escualeno o escualano. Como alternativa, la solubilidad puede determinarse de acuerdo con la cantidad del lípido que se disuelva en una cantidad dada del aceite para formar una solución saturada. Estos métodos se conocen en la técnica. La solubilidad de los ejemplos de ácidos grasos saturados o insaturados en escualeno también se proporciona en los ejemplos. De preferencia, la concentración de saturación de lípido en el aceite es de al menos aproximadamente 1 mg/ml, al menos alrededor de 5 mg/ml, al menos aproximadamente 10 mg/ml, al menos alrededor de 25 mg/ml, al menos aproximadamente 50 mg/ml o al menos alrededor de 100 mg/ml.
Preferiblemente, la concentración de lípido catiónico en la emulsión antes de que la molécula cargada negativamente sea complejada es de al menos aproximadamente 1.25 mM, al menos aproximadamente 1.5 mM, al menos aproximadamente 1.75 mM, al menos aproximadamente 2.0 mM, al menos aproximadamente 2.25 mM, al menos aproximadamente 2.5 mM, al menos aproximadamente 2.75 mM, al menos aproximadamente 3.0 mM, al menos aproximadamente 3.25 mM, al menos aproximadamente 3.5 mM, al menos aproximadamente 3.75 mM, al menos aproximadamente 4.0 mM, al menos aproximadamente 4.25 mM, al menos aproximadamente 4.5 mM, al menos aproximadamente 4.75 mM, al menos aproximadamente 5.0 mM, al menos aproximadamente 5.25 mM, al menos aproximadamente 5.5 mM, al menos aproximadamente 5.75 mM, al menos aproximadamente 6 mM, al menos aproximadamente 6.25 mM, al menos aproximadamente 6.5 mM, al menos aproximadamente 6.75 mM, al menos aproximadamente 7 mM, al menos aproximadamente 7.25 mM, al menos aproximadamente 7.5 mM, al menos aproximadamente 7.75 mM, al menos aproximadamente 8 mM, al menos aproximadamente 8.25 mM, al menos aproximadamente 8.5 mM, al menos aproximadamente 8.75 mM, al menos aproximadamente 9 mM, al menos aproximadamente 9.25 mM, al menos aproximadamente 9.5 mM, al menos aproximadamente 9.75 mM, o al menos aproximadamente 10 mM.
En ciertas modalidades, el lípido catiónico es DOTAP. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender alrededor de 0.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de DOTAP. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOTAP a alrededor de 1 .7 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 1. 8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2. 0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2. 2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2. 4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2. 6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2. 8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3. 0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3.2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3.4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3.6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4.0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4.4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/mi , de alrededor de 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 1.7 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml , de alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 7 mg/mi , de alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml , de alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 9 mg/ml , alrededor de 1. ' 7 mg/mi , aproximadamente 1. 8 mg/mi , alrededor de 2. 0 mg/ml, aproximadamente 2. 2 mg/ml, alrededor de 2. 4 mg/mi , aproximadamente 2. 6 mg/mi , alrededor de 2. 8 mg/ml, aproximadamente 3. 0 mg/ml, alrededor de 3. 2 mg/mi , aproximadamente 3 . mg/ml , alrededor de 3. É mg/mi , aproximadamente 3. 8 mg/ml, alrededor de 4. 0 mg/mi , aproximadamente 4. 2 mg/ml, alrededor de 4. 4 mg/ml , aproximadamente 4. 6 mg/ml , alrededor de 4. 8 mg/ml , aproximadamente 5. 0 mg/ml , alrededor de 5. 2 mg/mi , aproximadamente 5.5 mg/ml , alrededor de 6. 0 mg/ml , al menos aproximadamente 0.8 mg/ml , al menos alrededor de 0. .85mg/ml , al menos aproximadamente 0.9 mg/ml, al menos alrededor de 1.0 mg/ml, al menos aproximadamente 1.1 mg/ml, al menos alrededor de 1.2 mg/ml, al menos aproximadamente 1.3 mg/ml, al menos alrededor de 1.4 mg/ml, al menos aproximadamente 1.5 mg/ml, al menos alrededor de 1.6 mg/ml, al menos aproximadamente 1.7 mg/ml, etc.
En una modalidad ejemplar, la emulsión catiónica de aceite en agua comprende alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 5.0 mg/ml de DOTAP.
En ciertas modalidades, el líquido catiónico es DOEPC. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender alrededor de 0.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de DOEPC. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOEPC en alrededor de 1 .7 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 1. 8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2. 0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2. 2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2. 4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2. 6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2. 8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3. 0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3. 2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3. 4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3. 6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4. 0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de alrededor de 4.4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de alrededor de 5 mg/mi a aproximadamente 10 mg/ml, de alrededor de 1.7 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de alrededor de 1.8 mg/mi a aproximadamente 5 mg/ml , de alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml, de al ededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 7 mg/ml, de alrededor de 1.8 mg/mi a aproximadamente 8 mg/ml, de alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 9 mg/ml, alrededor de 1. 7 mg/ml , aproximadamente 1. 8 mg/ml, alrededor de 2. 0 mg/ml , aproximadamente 2. 2 mg/ml, alrededor de 2. 4 mg/ml , aproximadamente 2. 6 mg/ml, alrededor de 2. 8 mg/ml , aproximadamente 3. 0 mg/ml, alrededor de 3. 2 mg/ml , aproximadamente 3 .4mg/ml, a 1rededor de 3.( mg/ml , aproximadamente 3. 8 mg/ml, alrededor de 4. 0 mg/ml , aproximadamente 4. 2 mg/ml, alrededor de 4. 4 mg/ml , aproximadamente 4. 6 mg/ml, alrededor de 4. 8 mg/ml , aproximadamente 5. 0 mg/ml, alrededor de 5. 2 mg/ml , aproximadamente 5.5 mg/ml, alrededor de 6.0 mg/ml, al menos aproximadamente 0.8 mg/ml, al menos alrededor de 0.85mg/ml, al menos aproximadamente 0.9 mg/ml, al menos alrededor de 1.0 mg/ml, al menos aproximadamente 1.1 mg/ml, al menos alrededor de 1.2 mg/ml, al menos aproximadamente 1.3 mg/ml, al menos alrededor de 1.4 mg/ml, al menos aproximadamente 1.5 mg/ml, al menos alrededor de 1.6 mg/ml, al menos aproximadamente 1.7 mg/ml, etc.
En ciertas modalidades, el lípido catiónico es DODAC. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender de aproximadamente 0.8 mg/ml a alrededor de 10 mg/ml de DODAC. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DODAC a alrededor de 1. 7 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 1 .8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2 .0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2 .2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2 .4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2 .6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2 .8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3 .0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3 .2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3 .4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3 .6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4 .0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4 .4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4 .8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 1 .7 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de alrededor de 1. 8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de alrededor de 1. 8 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml , de alrededor de 1. 8 mg/ml a aproximadamente 7 mg/ml, de alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml, de alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 9 mg/ml, alrededor de 1.7 mg/ml, alrededor de 1.8 mg/ml, alrededor de 2.0 mg/ml, alrededor de 2.2 mg/ml, alrededor de 2.4 mg/ml, alrededor de 2.6 mg/ml, alrededor de 2.8 mg/ml, alrededor de 3.0 mg/ml, alrededor de 3.2 mg/ml, alrededor de 3.4mg/ml, alrededor de 3.6 mg/ml, alrededor de 3.8 mg/ml, alrededor de 4.0 mg/ml, alrededor de 4.2 mg/ml, alrededor de 4.4 mg/ml, alrededor de 4.6 mg/ml, alrededor de 4.8 mg/ml, alrededor de 5.0 mg/ml, alrededor de 5.2 mg/ml, alrededor de 5.5 mg/ml, alrededor de 6.0 mg/ml, al menos aproximadamente 0.8 mg/ml, al menos aproximadamente 0.85mg/ml, al menos aproximadamente 0.9 mg/ml, al menos aproximadamente 1.0 mg/ml, al menos aproximadamente 1.1 mg/ml, al menos aproximadamente 1.2 mg/ml, al menos aproximadamente 1.3 mg/ml, al menos aproximadamente 1.4 mg/ml, al menos aproximadamente 1.5 mg/ml, al menos aproximadamente 1.6 mg/ml, al menos aproximadamente 1.7 mg/ml, etc.
En ciertas modalidades, el lípido catiónico es DOTMA. La emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender alrededor de 0.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de DOTMA. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender DOTMA a alrededor de 1.7 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de alrededor de 1.8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2.0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2 .2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2 .4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2 .6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 2 .8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3 .0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3 .2 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 3 .4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/mi , de alrededor de 3 .6 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4 .0 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4 .4 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 4 .8 mg/ml a aproximadamente 10 mg/mi , de ! alrededor de 5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml , de alrededor de 1 .7 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de alrededor de 1. .8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml , de alrededor de 1 , .8 mg/ml a aproximadamente 6 mg/ml , de alrededor de 1. .8 mg/ml a aproximadamente 7 mg/ml , de alrededor de 1. , 8 mg/ml a aproximadamente 8 mg/ml , de alrededor de 1. .8 mg/ml a aproximadamente 9 mg/ml , aproximadamente 1.7 mg/ml , aproximadamente 1. 8 mg/ml, aproximadamente 2.0 mg/ml , aproximadamente 2. 2 mg/ml, aproximadamente 2.4 mg/ml , aproximadamente 2. 6 mg/ml, aproximadamente 2.8 mg/ml , aproximadamente 3. 0 mg/ml, aproximadamente 3.2 mg/ml , aproximadamente 3 . mg/ml , aproximadamente 3.6 mg/ml , aproximadamente 3.8 mg/ml, aproximadamente 4.0 mg/ml, aproximadamente 4.2 mg/ml, aproximadamente 4.4 mg/ml, aproximadamente 4.6 mg/ml, aproximadamente 4.8 mg/ml, aproximadamente 5.0 mg/ml, aproximadamente 5.2 mg/ml, aproximadamente 5.5 mg/ml, aproximadamente 6.0 mg/ml, al menos aproximadamente 0.8 mg/ml, al menos aproximadamente 0.85mg/ml, al menos aproximadamente 0.9 mg/ml, al menos aproximadamente 1.0 mg/ml, al menos aproximadamente 1.1 mg/ml, al menos aproximadamente 1.2 mg/ml, al menos aproximadamente 1.3 mg/ml, al menos aproximadamente 1.4 mg/ml, al menos aproximadamente 1.5 mg/ml, al menos aproximadamente 1.6 mg/ml, al menos aproximadamente 1.7 mg/ml, etc.
Como se indicó arriba, la concentración de un lipido descrito arriba se determina con base en la cantidad inicial del lipido que se usa para preparar las emulsiones. Se entiende en la técnica que la concentración real del aceite en el producto final (por ejemplo, una emulsión envasada, esterilizada que está lista para administración) podría ser ligeramente más baja, algunas veces en hasta aproximadamente 10%, en hasta alrededor de 20%, hasta alrededor de 25%, o hasta aproximadamente 35%.
C. Relación aceite a lipido Las emulsiones catiónicas de aceite en agua de la invención tienen una relación aceite : lipido definida. Por ejemplo, la relación de aceite : lípido (mol:mol) de la emulsión puede ser de al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 8.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 9:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 9.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 10:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 10.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 11:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 11.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 12:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 12.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 13:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 13.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 14:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 14.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 15:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 15.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 16:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 16.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 17:1 (mol:mol), de alrededor de 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de alrededor de 9:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de alrededor de 10:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de alrededor de 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 49:1 (mol:mol), de alrededor de 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 48:1 (mol:mol), de alrededor de 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 47:1 (mol:mol), de alrededor de 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 46:1 (mol:mol), de alrededor de 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 45:1 (mol:mol), de alrededor de 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 44:1 (mol:mol), de alrededor de 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol) , de alrededor de 8:1 (mol:mol) a aproximadamente 42:1 (mol:mol), de alrededor de 8:1 (molrmol) a aproximadamente 41:1 (mol:mol), de alrededor de 9:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 10:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 11:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 12:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 13:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 14:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 15:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 16:1 (mol .-mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 17:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), etc.
Si se desea, la relación de aceite : lípido (mol:mol) de la emulsión puede ser de al menos aproximadamente 4:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 4.2:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 4.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 5.5:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 6:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 6.5:1 (mol:mol), 7:1 (mol:mol), al menos aproximadamente 7.5:1 (mol:mol), de alrededor de 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de alrededor de 5:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de alrededor de 6:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de alrededor de 7:1 (mol:mol) a aproximadamente 50:1 (mol:mol), de alrededor de 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 49:1 (mol :mol) , de alrededor de 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 48:1 (mol:mol), de alrededor de 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 47:1 (mol:mol), de alrededor de 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 46:1 (mol:mol), de alrededor de 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 45:1 (mol:mol), de alrededor de 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 44:1 (mol:mol), de alrededor de 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 42:1 (mol:mol), de alrededor de 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 41:1 (mol:mol), de alrededor de 5:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 6:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), de alrededor de 7:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol), etc.
Algunas veces, puede ser necesario lograr un equilibrio entre el deseo de incrementar la concentración de un lípido catiónico (incrementando de esta manera la cantidad de moléculas de ácido nucleico cargadas en la partícula de emulsión) , y toxicidad o tolerabilidad del lípido cuando se administre in vivo. Por ejemplo, se ha reportado que altas dosis de DOTAP pueden tener efectos tóxicos. Véase, por ejemplo, Lappalainen et al., Pharm. Res. Volumen 11(8):1127-31 (1994) . El intervalo óptimo de dosis de lípidos en una emulsión particular puede determinarse de acuerdo con el conocimiento de un médico experto.
Si el aceite comprende una mezcla de moléculas, la concentración molar del aceite puede calcularse con base en el peso molecular promedio del aceite. Por ejemplo, el peso molecular promedio de aceite de soya (292.2) puede calcularse de acuerdo con la distribución de ácido graso promedio (un porcentaje de 12% en peso de ácido palmítico; porcentaje de 52% en peso de ácido linolénico; etc.), y el peso molecular de cada componente .
C. Componentes adicionales Las emulsiones catiónicas de aceite en agua descritas en la presente pueden comprender además componentes adicionales. Por ejemplo, las emulsiones pueden comprender componentes que puedan promover la formación de partículas, mejorar la complej ación entre las moléculas cargadas negativamente y las partículas catiónicas, o incrementar la estabilidad de la molécula cargada negativamente (por ejemplo, para evitar la degradación de una molécula de ARN) . Si se desea, la emulsión catiónica de aceite en agua puede contener un antioxidante, tal como citrato, ascorbato o sales de los mismos .
Tensioactivos En ciertas modalidades, la emulsión catiónica de aceite en agua como la desrita en la presente comprende además un tensioactivo .
Un número sustancial de tensioactivos han sido usados en las ciencias farmacéuticas. Estas incluyen materiales derivados naturalmente tales como gomas de árboles, proteína vegetal, polímeros a base de azúcar tales como alginatos, y similares. Ciertos oxipolímeros o polímeros que tienen un hidróxido u otro sustituyente hidrófilo en el esqueleto de carbono tienen actividad tensioactiva, por ejemplo, povidona, alcohol polivinílico y compuestos mono- y poli-funcionales a base de éter glicólico. Los detergentes iónicos o no iónicos y compuestos derivados de ácidos grasos de cadena larga también se pueden usar en esta invención.
Ejemplos específicos de tensioactivos adecuados incluyen los siguientes: 1. Jabones hidrosolubles, tales como las sales sodio, potasio, amonio y alcanolamonio de ácidos grasos superiores (C10-C22) en particular jabones de sebo y coco de sodio y potasio. 2. Tensioactivos no de jabón sintéticos y aniónicos, los cuales pueden representarse por las sales solubles en agua de productos de reacción con ácido sulfúrico orgánico que tengan en su estructura molecular un radical alquilo que contenga alrededor de 8 a 22 átomos de carbono y un radical seleccionado del grupo que consiste en radicales éster de ácido sulfúrico y ácido sulfúrico. Ejemplos de éstos son los alquil sulfatos de sodio o potasio, derivados de aceite de sebo o coco; alquil vencen sulfonatos de sodio o potasio éter sulfonatos de alquil glicerilo de sodio; sulfonatos y sulfatos de monoglicéridos de ácido graso de aceite de coco de sodio; sales sodio o potasio de esteres de ácido sulfúrico del producto de reacción de una mol de un alcohol graso superior y aproximadamente 1 a 6 moles de óxido de etileno; éter sulfonatos de óxido de etileno de alquil fenol de sodio o potasio, con 1 a 10 unidades de óxido de etileno por molécula y en los cuales los radicales alquilo contienen de 8 a 12 átomos de carbono; el producto de reacción de ácidos grasos esterificados con ácido isetiónico y neutralizados con hidróxido de sodio; sales sodio o potasio de amida de ácido graso de una metil taurida; y sales de sodio y potasio de a-olefinas de Ci0-C24 sulfonadas con S03. 3. Tensioactivos sintéticos no iónicos hechos por la condensación de grupos de óxido de alquileno con un compuesto hidrófobo orgánico. Los grupos hidrófobos típicos incluyen productos de condensación de óxido de propileno con propilenglicol , alquil fenoles, producto de condensación de óxido de propileno y etilendiamina, alcoholes alifáticos que tengan 8 a 22 átomos de carbono y amidas de ácidos grasos. 4. Tensioactivos no iónicos, tales como óxidos de amina, óxidos de fosfina y sulfóxidos, que tengan características semipolares. Ejemplos específicos de óxidos de amina terciaria de cadena larga incluyen óxidos de dimetildodecilamina y bis (2-hidroxietil) dodecilamina . Ejemplos específicos de óxidos de fosfina se encuentran en la patente de E.U.A. No. 3,304,263, expedida el 14 de febrero de 1967, e incluyen óxido de dimetildodecilfosfina y óxido de dimetil- (2-hidroxidodecil) fosfina. 5. Sulfóxidos de cadena larga, incluyendo aquellos que correspondan a la fórmula R^SO-R2 en donde R1 y R2 son radicales alquilo sustituidos o no sustituidos, el primero conteniendo alrededor de 10 a aproximadamente 28 átomos de carbono, mientras que R2 contiene de 1 a 3 átomos de carbono. Ejemplos específicos de estos sulfóxidos incluyen sulfóxido de dodecil metilo y sulfóxido de 3-hidroxi tridecil metilo. 6. Tensioactivos sintéticos anfolíticos, tales como 3-dodecilaminopropionato de sodio y 3-dodecilaminopropan sulfonato de sodio. 7. Tensioactivos sintéticos zwitteriónicos , tales como 3 - (N, N-dimetil-N-hexadecilamonio) propan-l-sulfonato y 3- (N, N-dimetil-N-hexadcilamonio) -2 -hidroxipropan- 1-sulfonato .
Además, todos los siguientes grupos de tensioactivos pueden usarse en una composición de la presente invención: (a) jabones (es decir, sales alcalinas de ácidos grasos, ácidos de colofonia y aceite de sebo; (b) alquil aren sulfonatos; (c) alquil sulfatos, incluyendo tensioactivos con grupos hidrófobos tanto de cadena ramificada como de cadena recta, así como grupos sulfato primarios y secundarios; (d) sulfatos y sulfonatos que contengan un enlace intermedio entre los grupos hidrófobos e hidrófilos, tales como las metil tauridas aciladas grasas y los monoglicéridos grasos sulfatados; (e) ésteres de ácido de cadena larga de polietilenglicol , especialmente los ésteres de aceite de sebo; (f) éteres polietilenglicólicos de alquil fenoles; (g) éteres polietilenglicólicos de alcoholes y mercaptanos de cadena larga; y (h) acil dietanolamidas de grasas. Ya que los tensioactivos pueden clasificarse en más de una manera, un número de clases de tensioactivos mostrados en este párrafo se superponen con las clases de tensioactivos descritas previamente.
Existe un número de tensioactivos designados específicamente para y usados comúnmente en situaciones biológicas. Estos tensioactivos se dividen en cuatro tipos básicos: aniónicos, catiónicos, zwitteriónicos (anfotéricos) y no iónicos. Ejemplos de tensioactivos aniónicos incluyen, por ejemplo, perfluorooctanoato (PFOA o PFO) , perfluorooctansulfonato (PFOS) , sales alquil sulfato tales como dodecil sulfato de sodio (SDS) o lauril sulfato de amonio, laureth sulfato de sodio (conocido también como lauril éter sulfato de sodio, SLES) , alquil vencen sulfonato y sales de ácido graso. Ejemplos de tensioactivos catiónicos incluyen, por ejemplo, sales alquiltrimetilamonio tales como bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB, o bromuro de hexadeciltrimetilamonio) , cloruro de cetilpiridinio (CPC) , sebo amina polietoxilada (POEA) , cloruro de benzalconio (BAC) , cloruro de bencetonio (BZT) . Ejemplos de tensioactivos zwitteriónicos (anfotéricos) incluyen, por ejemplo, dodecil betaína, cocamidopropil betaína y coco anfoglicinato . Ejemplos de tensioactivos no iónicos incluyen, por ejemplo, óxido de alquil polietileno, óxido de alquilfenol polietileno, copolímeros de óxido de polietileno y óxido de polipropileno (llamados comercialmente poloxámeros o poloxaminas) , acil oliglucósidos (por ejemplo, octil glucósido o decil maltósido) , alcoholes grasos (por ejemplo, alcohol cetílico o alcohol oleílico) , cocamida MEA, cocamida ® DEA, Pluronic F-68 (copolimero de bloques de polioxietileno-polioxipropileno) y polisorbatos , tales como Tween 20 (polisorbato 20), Tween 80 (polisorbato 80; monooleato de polioxietilensorbitán) , óxido de dodecil dimetilamina y succinato de propilenglicol de tocoferol de vitamina E (TPGS de vitamina E) .
Un grupo particularmente útil de tensioactivos son los tensioactivos no iónicos a base de sorbitán. Estos tensioactivos se preparan por la deshidratación de sorbitol para dar 1,4 -sorbitán el cual es luego hecho reaccionar con uno o más equivalentes de un ácido graso. La porción sustituida con ácido graso puede hacerse reaccionar más con ócido de etileno para dar un segundo grupo de tensioactivos.
Los tensioactivos de sorbitán sustituidos con ácidos grasos se hacen al hacer reaccionar 1,4 -sorbitán con un ácido graso tal como ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido oleico o un ácido graso de cadena larga similar para dar el monoéster de 1, 4-sorbitán, sesquiéster de 1,4-sorbitán o triéster de 1 , 4-sorbitán. Los nombres comunes para estos tensioactivos incluyen, por ejemplo, monolaurato de sorbítán, monopalmitato de sorbítán, monoestearato de sorbitán, monooleato de sorbitán, sesquioleato de sorbitán y trioleato de sorbitán. Estos tensioactivos están disponibles comúnmente con el nombre SPAN° o ARLACEL®, normalmente con una designación de una letra o número que los distingue entre los diferentes sorbitanos sustituidos con mono, di- y triéster.
Los tensioactivos SPAN8 y ARLACEL® son hidrófilos y generalmente son solubles o dispersables en aceite. También son solubles en la mayoría de los solventes orgánicos. En agua son generalmente insolubles pero dispersables. Generalmente estos tensioactivos tendrán un número de equilibrio hidrófilo- lipófilo (HLB) de entre 1.8 a 8.6. Estos tensioactivos pueden hacerse fácilmente por medios conocidos en la técnica o están disponibles comercialmente .
Un grupo relacionado de tensioactivos comprende monoésteres de olioxietilensorbitán y triésteres de olioxietilensorbitán . Estos materiales se preparan por la adición de óxido de etileno a un monoéster o triéster de 1,4-sorbitán. La adición de polioxietileno convierte al tensioactivo de mono- o triéster de sorbitán lipófilo en un tensioactivo hidrófilo generalmente soluble o dispersable en agua y soluble a grados variables en líquidos orgánicos.
Estos materiales, disponibles comercialmente con la marca TWEEN , son útiles para preparar emulsiones y dispersiones de aceite en agua, o para la solubilización de aceites y elaboración de pomadas anhidras hidrosolubles o lavables. Los tensioactivos TWEEN® pueden combinarse con tensioactivos de monoéster o triéster de sorbitán relacionados para promover estabilidad en la emulsión. Los tensioactivos TWEEN° generalmente tienen un valor HLB que cae entre 9.6 a 16.7. Los tensioactivos TWEEN^ están disponibles comercialmente .
Un tercer grupo de tensioactivos no iónicos que podrían usarse solos o en conjunto con tensioactivos SPA S, ARLACEL® y TWEEN° son los ácidos grasos de polioxietileno elaborados mediante la reacción de óxido de etileno con un ácido graso de cadena larga. El tensioactivo de este tipo más comúnmente disponible se vende con el nombre MYRJ* y es un derivado de polioxietileno de ácido esteárico. Los tensioactivos NYRJ* son hidrófilos y solubles o dispersables en agua al igual que los tensioactivos TWEEN°. Los tensioactivos MYRJ® pueden mezclarse con tensioactivos TWEEN° o con mezclas de tensioactivos TWEEN<B/SPANS> o ARLACEL0 para usarse en la formación de emulsiones. Los tensioactivos MYRJ° se pueden elaborar por métodos conocidos en la técnica o están disponibles comercialmente.
Un cuarto grupo de tensioactivos no iónicos a base de polioxietileno son los éteres de ácido graso de polioxietileno derivados de alcoholes laurílicos, acetílicos, estearílicos y oleílicos. Estos materiales se preparan como arriba mediante la adición de óxido de etileno o un alcohol graso. El nombre comercial para estos tensioactivos es BRIJE. Los tensioactivos BRIJ° pueden ser hidrófilos o lipófilos dependiendo del tamaño de la porción de polioxietileno en el tensioactivo . Aunque la preparación de estos compuestos está disponible de la técnica, también están fácilmente disponibles de fuentes comerciales.
Otros tensioactivos no iónicos que podrían usarse potencialmente son, por ejemplo, polioxietileno, ésteres de ácido graso de poliol, éter de polioxietileno, éteres grasos de polioxipropileno, derivados de cera de abeja que contienen polioxietileno, derivado de lanolina de polioxietileno, glicéridos grasos de polioxietileno, ésteres de ácido graso glicerólicos u otros derivados de alcohol o éter de ácido de polioxietileno de ácidos de cadena larga de 12-22 átomos de carbono .
Ya que las emulsiones y formulaciones de la invención están destinadas a ser sistemas de varias fases, es preferible seleccionar un tensioactivo no iónico formador de emulsión que tenga un valor HLB en el intervalo de aproximadamente 7 a 16. Este valor puede obtenerse a través del uso de un solo tensioactivo no iónico tal como un tensioactivo TWEEN o se puede lograr mediante el uso de una mezcla de tensioactivos tal como con un tensioactivo a base de mono- di- o triéster de sorbitán; un ácido graso de polioxietileno de éster de sorbitan; un éster de sorbitán en combinación con un tensioactivo derivado de lanolina de polioxietileno; un tensioactivo de éster de sorbitán en combinación con un tensioactivo de éter graso de polioxietileno de alto HLB; o un tensioactivo de éter graso de polietileno o ácido graso de polioxietilensorbitán .
En ciertas modalidades, las emulsión comprende un solo tensioactivo no iónico, más particularmente, un tensioactivo TWEEN ®, como e,l tensi.oacti.vo no i.ó,nico estabilizador de emulsión. En una modalidad ejemplar, la emulsión comprende TWEEN° 80, conocido de otra manera como polisorbato 80 o monooleato de polioxietilen sorbitán 20. En otras modalidades, la emulsión comprende dos o más tensioactivos no iónicos, en particular un tensioactivo TWEEN8 y un tensioactivo SPAN*. En una modalidad ejemplar, la emulsión comprende TWEEN 80 y SPAN 85.
Las emulsiones de aceite en agua pueden contener alrededor de 0.01% a aproximadamente 2.5% de tensioactivo (p/v) , alrededor de 0.01% a aproximadamente 2% de tensioactivo, 0.01% a aproximadamente 1.5% de tensioactivo, 0.01% a aproximadamente 1% de tensioactivo, 0.01% a aproximadamente 0.5% de tensioactivo, 0.05% a aproximadamente 0.5% de tensioactivo, 0.08% a aproximadamente 0.5% de tensioactivo, alrededor de 0.08% de tensioactivo, alrededor de 0.1% de tensioactivo, alrededor de 0.2% de tensioactivo, alrededor de 0.3% de tensioactivo, alrededor de 0.4% de tensioactivo, alrededor de 0.5% de tensioactivo, alrededor de 0.6% de tensioactivo, alrededor de 0.7% de tensioactivo, alrededor de 0.8% de tensioactivo, alrededor de 0.9% de tensioactivo, o alrededor de 1% de tensioactivo.
Como alternativa o además, las emulsiones de aceite en agua pueden contener 0.05% a aproximadamente 1%, 0.05% a alrededor de 0.9%, 0.05% a aproximadamente 0.8%, 0.05% a alrededor de 0.7%, 0.05% a aproximadamente 0.6%, 0.05% a alrededor de 0.5%, aproximadamente 0.08%, a alrededor de 0.1%, aproximadamente 0.2%, a alrededor de 0.3%, aproximadamente 0.4%, alrededor de 0.5%, aproximadamente 0.6%, alrededor de 0.7%, aproximadamente 0.8%, alrededor de 0.9%, o aproximadamente 1% (p/v) de Tween 80 (polisorbato 80; monooleato de polioxietilensorbitán) .
En una modalidad ejemplar, la emulsión de aceite en agua contiene 0.08% (p/v) de Tween 80 (polisorbato 80; monooleato de polioxietilensorbitán) .
Como alternativa o además, las emulsiones de aceite en agua pueden contener 0.05% a aproximadamente 1%, 0.05% a alrededor de 0.9%, 0.05% a aproximadamente 0.8%, 0.05% a alrededor de 0.7%, 0.05% a aproximadamente 0.6%, 0.05% a alrededor de 0.5%, aproximadamente 0.08%, a alrededor de 0.1%, aproximadamente 0.2%, a alrededor de 0.3%, aproximadamente 0.4%, alrededor de 0.5%, aproximadamente 0.6%, alrededor de 0.7%, aproximadamente 0.8%, alrededor de 0.9%, o aproximadamente 1% (p/v) de SPAN85 (trioleato de sorbitán) .
Las emulsiones de aceite en agua pueden contener una combinación de tensioactivos descritos en la presente. Por ejemplo, se puede usar una combinación de Tween 80 (polisorbato 80; monooleato de polioxietilensorbitán) y SPAN85 (trioletato de sorbitán) . Las emulsiones pueden contener varias cantidades de Tween 80 y SPAN85 (por ejemplo, aquellas ejemplificadas arriba) o cantidades iguales. Por ejemplo, las emulsiones de aceite en agua pueden contener (p/v) aproximadamente 0.05% de Tween 80 y alrededor de 0.05% de SPA 85, aproximadamente 0.1% de Tween 80 y alrededor de 0.1% de SPAN85, aproximadamente 0.2% de Tween 80 y alrededor de 0.2% de SPAN85 , aproximadamente 0.3% de Tween 80 y aproximadamente 0.3% de SPAN85, aproximadamente 0.4% de Tween 80 y alrededor de 0.4% de SPA 85, aproximadamente 0.5% de Tween 80 y alrededor de 0.5% de SPAN85, aproximadamente 0.6% de Tween 80 y alrededor de 0.6% de SPA 85, aproximadamente 0.7% de Tween 80 y alrededor de 0.7% de SPAN85 , aproximadamente 0.8% de Tween 80 y alrededor de 0.8% de SPAN85, aproximadamente 0.9% de Tween 80 y alrededor de 0.9% de SPAN85, o aproximadamente 1% de Tween 80 y alrededor de 1.0% de SPAN85.
En ciertas modalidades, el tensioactivo es un polietilenglicol (PEG) -lípido. En otras modalidades, la emulsión no comprende un lípido de PEG. Los lípidos de PEG, tales como PEG acoplado a dialquiloxipropilos (PEG-DAA) , PEG acoplado a diacilglicerol (PEG-DAG) , PEG acoplado a fosftidiletanolamina (PE (PEG-PE) o algunos otros fosfolípidos (PEG-fosfolípidos) , PEG conjugado a ceramidas (PEG-Cer) , o una combinación de los mismos, también se pueden usar como tensioactivos (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 5,885,613; solicitudes de patente de E.U.A. Nos. de publicación 2003/0077829, 2005/0175682 y 2006/0025366) . Otros lípidos de PEG adecuados incluyen, por ejemplo, lípidos de PEG-dialquiloxipropilo (DAA) o lípidos de PEG-diacilglicerol (DAG) . Ejemplos de lípidos de PEG-DAG incluyen, por ejemplo, lípidos de PEG-dilauroilglicerol (C12) , lípidos de PEG-dimiristoilglicerol (Ci4) , lípidos de PEG-dipalmitoilglicerol (Ci6) o lípidos de PEG-distearoilglicerol (Cía) . Ejemplos de lípidos de PEG-DAA incluyen, por ejemplo, lípidos de PEG-dilauriloxipropilo {C12) , lípidos de PEG-dimiristoiloxipropilo (C14) , lípidos de PEG-dipalmitoiloxipropilo (Ci6) , o lípidos de PEG-distearoiloxipropilo (Ci8) .
Los PEGs se clasifican por sus pesos moleculares; por ejemplo, PEG 2000 tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2,000 daltons, y PEG 5000 tiene un peso molecular promedio de alrededor de 5,000 daltons. Los PEGs están disponibles comercialmente de Sigma Chemical Co. , así como de otras compañías e incluyen, por ejemplo, los siguientes: monometoxipolietilenglicol (MePEG-OH) , succinato de monometoxipolietilenglicol (MePEG-S) , succinimidil succinato de monometoxipolietilenglicol (MePEG-S NHS) , monometoxipolietilenglicol -amina (MePEG-NH2) , tresilato de monometoxipolietilenglicol (MePEG-TRESD) , y monometoxipolietilenglicol-imidazolil-carbonilo (MePEG-IM) . Además, monometoxipolietilenglicol -ácido acético (MePEG-CH2C00H) , es particularmente útil para preparar los conjugados de PEG-lípido incluyendo, por ejemplo, conjugados de PEG-DAA.
D. Fase acuosa (fase continua) La fase acuosa (fase continua) de las emulsiones de aceite en agua es agua, o una solución acuosa que puede contener una sal (por ejemplo, NaCl) , un regulador de pH (por ejemplo, un regulador de pH de citrato) , un agente tonificador no iónico (por ejemplo, un sacárido) , un polímero, un tensioactivo o cualquier combinación de los mismos. La fase acuosa de las emulsiones precomplejadas (emulsiones de aceite en agua antes de la adición de las moléculas cargadas negativamente) puede diferir de la fase acuosa de las emulsiones post -complej adas (emulsiones de aceite en agua en las cuales las moléculas cargadas negativamente sean complejadas con las partículas de emulsión). En general, las emulsiones precomplej adas se preparan en un solvente acuoso que promueve la formación de partículas con propiedades deseadas (por ejemplo, diámetro promedio, y similares) . Las emulsiones precomplej adas son diluidas con una solución acuosa que contiene la molécula cargada negativamente, y otros componentes deseados, para producir la emulsión catiónica de aceite en agua final, la cual contiene la fase acuosa final con osomolaridad y tonicidad deseadas. La fase acuosa puede contener un antioxidante, tal como citrato, ascorbato o sales de los mismos .
Cuando las emulsiones se formulan para administración in vivo, es preferible constituir la solución final de tal manera que la tonicidad y la osmolaridad de la emulsión sean sustancialmente iguales a las de los fluidos fisiológicos normales para de esta manera prevenir consecuencias post-administración no deseadas, tales como hinchazón o rápida absorción de la composición. También es preferible regular el pH de la fase acuosa para mantener un pH compatible con condiciones fisiológicas normales. Asimismo, en ciertos casos, puede ser deseable mantener el pH a un nivel particular para de esta manera asegurar la estabilidad de ciertos componentes de la emulsión . Por ej emplo , puede ser deseable preparar una emulsión que sea isotónica e isosmótica . Para controlar la tonicidad, la emulsión puede comprender una sal f isiológica , tal como una sal sodio . Cloruro de sodio (NaCl ) , por ej emplo, puede ser usado a aproximadamente 0 . 9% (p/v) ( solución sal ina f isiológica) . Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio , fosfato diácido de potasio , fosfato disódico , cloruro de magnesio, cloruro de calcio , etc . Los agentes tonif icadores no iónicos también se pueden usar para controlar la tonicidad. Un número de agentes modificadores de tonicidad no iónicos conocidos ordinariamente por aquellos expertos en la técnica pueden ser usados. Estos son típicamente carbohidratos de varias clasificaciones (véase, por ejemplo, Voet y Voet (1990) Biochemistry (Jchn iley & Sons, Nueva York) . Los monosacáridos clasificados como aldosas tales como glucosa, mañosa, arabinosa y ribosa, así como aquellos clasificados como cetosas tales como fructosa , sorbosa y xilulosa pueden ser usados como agentes tonif icadores no iónicos en la presente invención . También se pueden usar disacáridos tales como sacarosa , maltosa , trehalosa y lactosa . Además , aldi toles (polihidroxi alcoholes acíclicos , también denominados alcoholes de azúcar) tales como glicerol , manitol , xilitol y sorbitol son agentes tonif icadores no iónicos útiles en la presente invención .
Los agentes modificadores de tonicidad no iónicos pueden estar presentes a una concentración de aproximadamente 0.1% a alrededor de 10% o alrededor de 1% a aproximadamente 10%, dependiendo del agente que sea usado.
La fase acuosa puede ser regulada en pH. Cualquier regulador de pH fisiológicamente aceptable puede usarse en la presente, tal como agua, reguladores de pH de citrato, reguladores de pH de fosfato, reguladores de pH de acetato, reguladores de pH tris, reguladores de pH de bicarbonato, reguladores de pH de carbonato, regulador de pH de succinato o similares. El pH del componente acuoso preferiblemente será de entre 6.0-8.0, muy preferiblemente alrededor de 6.2 a aproximadamente 6.8. En una modalidad ejemplar, el regulador de pH es regulador de pH de citrato 10 mM con un pH a 6.5. En otra modalidad ejemplar, la fase acuosa es, o el regulador de pH se prepara usando, agua libre de R asa o agua tratada con DEPC. En algunos casos, la alta concentración de sal en el regulador de pH podría interferir con la complej ación de una molécula cargada negativamente a la partícula de emulsión p r lo tanto se evita. En otros casos, cierta cantidad de sal en el regulador de pH puede ser incluida.
En una modalidad ejemplar, el regulador de pH es regulador de pH de citrato 10 mM con un pH a 6.5. Si se desea la fase acuosa es, o el regulador de pH se prepara usando, agua libre de RNasa o agua tratada con DEPC.
La fase acuosa también puede comprender componentes adicionales tales como moléculas que cambien la osmolaridad de la fase acuosa o moléculas que estabilicen la molécula cargada negativamente después de la complej ación . De preferencia , la osmolaridad de la fase acuosa se aj usta usando un agente tonif icador no iónico, tal como un azúcar (por ej emplo, trehalosa , sacarosa, dextrosa, fructosa , palatinosa reducida, etc . ) , un alcohol reducido (tal como manitol , sorbitol , xilitol , eritritol , lactitol , maltitol , glicerol , etc . ) . Si se desea puede usarse un polímero de polímero no iónico (por ej emplo , un poli (alquilglicol ) tal como polietilenglicol , poipropilenglicol o polibutilenglicol ) o tensioactivo no iónico .
En ciertas modalidades , la fase acuosa de la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender un polímero o un tensioactivo, o una combinación de los mismos . En una modalidad ej emplar, la emulsión de aceite en agua contiene un poloxámero. Los poloxámeros son copolímeros de tres bloques no iónicos que tienen una cadena hidrófoba central de óxido de polioxipropilen (poli (propileno) ) flanqueada por dos cadenas hidrófilas de óxido de polioxietilen (poli (etileno) ) . Los poloxámeros también se conocen con el nombre comercial polímeros Pluronic . Los polímeros de poloxámero pueden llevar a una mayor estabilidad y a una resistencia a RNasa incrementada de la molécula de AR después de la complej ación de ARN .
Como alternativa o además, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender de aproximadamente 0.1% a alrededor de 20% (p/v) de polímero, o alrededor de 0.05% a aproximadamente 10% (p/v) de polímero. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender un polímero (por ejemplo, un poloxámero tal como Pluronic° F127 ( (copolímero de bloques de óxido de etileno/óxido de propileno: H (0CH2CH2) x (OCH3CHCH3) ) y (OCH2CH2) 20H) ) a alrededor de 0.1% a aproximadamente 20% (p/v), de alrededor de 0.1% a aproximadamente 10% (p/v), de alrededor de 0.05% a aproximadamente 10% (p/v), o de alrededor de 0.05% aproximadamente 5% (p/v) .
En una modalidad ejemplar, la emulsión de aceite en agua comprende alrededor de 4% (p/v) , o aproximadamente 8% (p/v) de Pluronic® F127.
La cantidad del componente acuoso empleada en estas composiciones será aquella cantidad necesaria para llevar el valor de la composición a la unidad. Es decir, una cantidad de componente acuoso suficiente para hacer 100% será mezclada, con los demás componentes listados arriba para llevar las composiciones a volumen. 4. Moléculas cargadas negativamente Cuando una molécula cargada negativamente va a ser suministrada, puede ser complejada con las partículas de las emulsiones catiónicas de aceite en agua. La molécula cargada negativamente es complejada con las partículas de emulsión mediante, por ejemplo, interacciones entre la molécula cargada negativamente y el lípido catiónico sobre la superficie de las partículas, así como interacciones hidrófobas/hidrófilas entre la molécula cargada negativamente y la superficie de las partículas. Aunque no se desea ser limitados por ninguna teoría particular, se cree que las moléculas cargadas negativamente interactúan con el lípido catiónico a través de interacciones de carga iónica no covalentes (fuerzas electrostáticas) , y la fuerza de complejo así como la cantidad de compuesto cargado negativamente que se puede complejar con una partícula están relacionadas con la cantidad de lípido catiónico en la partícula. Además, las interacciones hidrófobas/hidrófilas entre la molécula cargada negativamente y la superficie de las partículas también puede jugar un papel.
Ejemplos de moléculas cargadas negativamente incluyen péptidos, polipéptidos o proteínas cargadas negativamente, moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN de una sola o de doble hebra) , moléculas pequeñas (por ejemplo, potenciadores inmunitarios de molécula pequeña (SMIPs) , fosfonato, fluorofosfonato, etc.) y similares. En aspectos preferidos, la molécula cargada negativamente es una molécula de ARN, tal como un ARN que codifica para un péptido, polipéptido o proteína, incluyendo moléculas de ARN autoreplicantes , o ARN de interferencia pequeño.
El complejo puede formarse usando técnicas conocidas en la técnica, ejemplos de las cuales se describen en la presente. Por ejemplo, un complejo ácido nucleico-partícula puede formarse al mezclar una emulsión catiónica con la molécula de ácido nucleico, por ejemplo por remolinado. La cantidad de molécula cargada negativamente y lípido catiónico en las emulsiones puede ajustarse u optimizarse para proporcionar la fuerza deseada de unión y capacidad de unión. Por ejemplo, como se describe y ejemplifica en la presente, ejemplos de complejos ARN-partículas se produjeron al variar las relaciones ARN: lípido catiónico (según se mide por la "relación N/P"). El término relación N/P se refiere a la cantidad (moles) de átomos de nitrógeno protonables en el lípido catiónico dividida entre la cantidad (moles) de fosfatos en el ARN.
Las relaciones N/P que se prefieren van de aproximadamente 1:1 a alrededor de 20:1, de aproximadamente 2:1 a alrededor de 18:1, de aproximadamente 3:1 a 16:1, de alrededor de 4:1 a aproximadamente 14:1, de aproximadamente 6:1 a alrededor de 12:1, aproximadamente 3:1, alrededor de 4:1, aproximadamente 5:1, alrededor de 6:1, aproximadamente 7:1, alrededor de 8:1, aproximadamente 9:1, alrededor de 10:1, aproximadamente 11:1, alrededor de 12:1, aproximadamente 13:1, alrededor de 14:1, aproximadamente 15:1, o alrededor de 16:1. Como alternativa, las relaciones N/P que se prefieren son de al menos aproximadamente 3:1, al menos alrededor de 4:1, al menos aproximadamente 5:1, al menos alrededor de 6:1, al menos aproximadamente 7:1, al menos alrededor de 8:1, al menos aproximadamente 9:1, al menos alrededor de 10:1, al menos aproximadamente 11:1, al menos alrededor de 12:1, al menos aproximadamente 13:1, al menos alrededor de 14:1, al menos aproximadamente 15:1 o al menos alrededor de 16:1. Una relación N/P que más se prefiere es aproximadamente 4:1 o más alta.
Cada emulsión puede tener su propia relación N/P óptima o preferida para producir efectos deseados (por ejemplo, nivel de expresión deseado del ARN complejado) , lo cual se puede determinar experimentalmente (por ejemplo, usando los ensayos descritos en la presente u otras técnicas conocidas en la técnica, tales como medir el nivel de expresión de una proteína que sea codificada por el ARN, o medir el porcentaje de las moléculas de ARN que sean liberadas del complejo en presencia de heparina) . Generalmente, la relación N/P debe estar en un valor en el que al menos aproximadamente 5%, alrededor de 10%, aproximadamente 15%, alrededor de 20%, aproximadamente 25%, alrededor de 30%, aproximadamente 35%, alrededor de 40%, aproximadamente 45%, alrededor de 50%, aproximadamente 55%, alrededor de 60-5, aproximadamente 65%, alrededor de 70%, aproximadamente 75%, alrededor de 80%, aproximadamente 85%, alrededor de 90% o aproximadamente 95% de las moléculas de ARN sean liberadas de los complejos ARN-partícula cuando los complejos ARN-partícula sean absorbidos por células. En algunas modalidades, la relación N/P es un valor que proporciona la liberación de al menos 0.5% o al menos 1% de las moléculas de ARN son liberadas de los complejos ARN-partículas cuando los complejos ARN-partículas son absorbidos por células.
El nivel de expresión de un antígeno codificado por la molécula de ARN podría no necesariamente correlacionarse con la inmunogenicidad del antígeno. En tales casos, una relación N/P preferida u óptima para inmunogenicidad puede determinarse al, por ejemplo, medir títulos de anticuerpo específicos.
Las emulsiones catiónicas de aceite en agua descritas en la presente son particularmente adecuadas para formar vacunas a base de ácido nucleico (por ejemplo, vacunas de ADN, vacunas de ARN) . La formación de un complejo ácido nucleico-partícula de emulsión facilita la absorción del ácido nucleico al interior de células hospederas, y protege a la molécula de ácido nucleico contra la degradación por nucleasas. Las células transíectadas pueden luego expresar el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico, la cual puede producir una respuesta inmunitaria al antígeno. Al igual que los virus vivos o atenuados, las vacunas a base de ácido nucleico pueden acoplar efectivamente tanto las vías MHC-l como MHC-II permitiendo la inducción de respuestas de células T CD8+ y CD4+, mientras que el antígeno presente en forma soluble, tal como proteína recombinante , generalmente induce sólo respuestas de anticuerpo.
En ciertas modalidades, la molécula cargada negativamente descrita en la presente es una molécula de ARN. En ciertas modalidades, la molécula de ARN codifica para un antígeno (péptido, polipéptido o proteína) y la emulsión catiónica de aceite en agua es adecuada para usarse como una vacuna a base de ARN. La composición puede contener más de una especie de molécula de ARN que codifique para un antígeno, por ejemplo, dos, tres, cinco o diez especies diferentes de moléculas de ARN que sean complejadas a las partículas de emulsión. Es decir, la composición puede contener una o más especies diferentes de moléculas de ARN, cada una codificando para un antígeno diferente. Como alternativa o además, una molécula de ARN también puede codificar para más de un antígeno, por ejemplo, una molécula de ARN bicistrónica o tricistrónica que codifique para antígenos diferentes o idénticos. En consecuencia, la emulsión catiónica de aceite en agua es adecuada para usarse como una vacuna a base de ARN, que sea monovalente o multivalente. Si se desea, la molécula de ARN puede ser policistrónica .
La secuencia de la molécula de ARN puede ser optimizada en codones o desoptimizada para expresión en un anfitrión deseado, tal como una célula humana.
La secuencia de la molécula de ARN puede modificarse si se desea, por ejemplo para incrementar la eficacia de expresión o replicación del ARN, o para proporcionar estabilidad adicional o resistencia a degradación. Por ejemplo, la secuencia de ARN puede modificarse con respecto a su uso de codones, por ejemplo, para incrementar la eficiencia de traducción y vida media del ARN. Una cola poli A (por ejemplo, de aproximadamente 30 residuos de adenosina o más) (SEQ ID NO: 28) puede ser unida al extremo 3' del ARN para incrementar su vida media. El extremo 5' del ARN puede ser tapado con un ribonucleótido modificado con la estructura m7G (5') ppp (5') N (estructura de tapa 0) o un derivado del mismo, el cual puede incorporarse durante la síntesis de ARN o se puede manipular enzimáticamente después de la transcripción de ARN (por ejemplo, usando enzima de tapado de virus de la vaccinia (VCE) que consiste en ARNm trifosfatasa, guanilil-transíerasa y guanina-7-metiltransferasa, la cual cataliza la construcción de estructuras de tapa 0 N7-monometiladas) . La estructura de tapa 0 juega un papel importante en mantener la estabilidad y eficiencia de traducción de la molécula de ARN. El tapa 5' de la molécula de ARN puede modificarse más por una 2 ' -O-metiltransferasa lo cual dé como resultado la generación de una estructura de tapa 1 [m7Gpp [m2 ' -0] N) , que puede incrementar más la eficiencia de traducción.
Si se desea, la molécula de ARN puede comprender uno o más nucleótidos modificados además de cualquier estructura de tapa 5' . Hay más de 96 modificaciones de nucleósidos de origen natural que se encuentran en ARN de mamífero. Véase, por ejemplo, Limbach et al., Nucleic Acids Research, 22 (12) : 2183-2196 (1994) . La preparación de nucleótidos y nucleótidos y nucleósidos modificados se conoce bien en la técnica, por ejemplo, de las patentes de E.U.A. Números 4373071, 4458066, 4500707, 4668777, 4973679,5047524, 5132418, 5153319, 5262530, 5700642 todas las cuales se incorporan por referencia en su totalidad en la presente, y muchos nucleósidos modificados y nucleótidos modificados están disponibles comercialmente .
Las nucleobases modificadas que pueden incorporarse en nucleósidos y nucleótidos modificados y estar presentes en las moléculas de ARN incluyen: m5C (5-metilcitidina) , m5U (5-metiluridina) , m6A (N6-metiladenosina) , s2U (2- tiouridina) , Um (2 ' -O-metiluridina) , mlA (1-metiladenosina) ; m2A (2-metiladenosina) ; Am (2-1-0-metiladenosina) ; ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenosina) ; i6A (N6-isopentiladenosina) ; ms2i6A (2-metiltio-N6isopenteniladenosina) ; io6A (N6- (cis-hidroisopentenil) adenosina) ; ms2io6A (2-metiltio-N6- [cis-hidroxiisopentenil) adenosina) ; g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina) t6A (N6-treonil carbamoiladenosina) ; ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina) ; m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina) ; hn6A (N6-hidroxinorvalilcarbamoil adenosina) ; ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina) ; Ar(p) (2' -O-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina) ; mil (1-metilinosina) ; m'Im (1,2' -O-dimetilinosina) ; m3C (3-metilcitidina) ; Cm (2T-0-metilcitidina) ; s2C (2-tiocitidina) ; ac4C (N4-acetilcitidina) ; f5C (5-fonilcitidina) ; m5CM (5, 2-0-dimetilcitidina) ; ac4Cm (N4acetil2T0metilcitidina) ; k2C (lisidina) ; mlG (1-metilguanosina) ; m2G (N2-metilguanosina) ; m7G (7-metilguanosina) ; Gm (2' -O-metilguanosina) ; m22G (N2,N2-dimetilguanosina) ; m2Gm (N2, 2' -O-dimetilguanosina) ; m22Gm (N2, 2, 2' -O-trimetilguanosina) ; Grt (p) (2' -O-ribosilguanosina (fosfato) ) ; y (wybutosina) ; o2yW (peroxiwibutosina) ; OHyW (hidroxiwibutosina) ; OHyW* (hidroxiwibutosina no modificada) ; imG (wiosina) ; mimG (metilguanosina) ; Q (queuosina) ; oQ (epoxiqueuosina) ; galQ (galtactosil-queuosina) ; manQ (manosil-queuosina) ; preQo (7-ciano-7-desazaguanosina) ; preQi (7-aminometil-7-desazaguanosina) ; G* (arcaeosina); D (dihidrouridina); m5Urn (5, 2' -O-dimetiluridina) ; s4U (4-tiouridina) ; m5s2U (5-metil-2-tiouridina) ; s2Um (2-tio-2'-0-metiluridina) ; acp3U (3- (3amino-3-carboxipropil)uridina) ; ho5U (5-hidroxiuridina) ; mo5U (5-metoxiuridina) ; cmo5U (ácido 5-oxiacético de uridina) ; mcmo5U (éster metílico de ácido 5-oxiacético de uridina) ; chm5U (5- (carboxihidroximetil) uridina) ) ; mchm5U (éster metílico de ( 5- (carboxihidroximetil ) uridina) ; mem5U (5-metoxicarbonil metiluridina) ; mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil -2-O-metiluridina) ; mem5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina) ; mm5s2U ( 5 -aminometil-2 -tiouridina) ; mnm5U (5-metilaminometiluridina) ; mnm5s2U ( 5-metilaminometil -2 - tiouridina) ; mnm5se2U (5-metilaminomet±l=-2 -selenouridina) ; mcm5U (5-carbamoilmetil uridina) ; ncm5Um (5-carbamoilmetil-2 ' -O-metiluridina) ; cranmSU (5-carboximetilaminometiluridina) ; crumSUm (5-carboximetil aminometil-2L-0metil uridina) ; cmnm5s2U (5-carboximetilamincmetil-2-tiouridina) ; m62A (N6,N6-dimetiladenosina) ; 1m (2' -O-metilinosina) ; m4C (N4-metilcitidina) ; m4Qn (N4,2-0-diraetilcitidina) ; hm5C (5-hidroximetilcitidina) ; m3U (3-metiluridina) ; cm5U (5-carboxiraetiluridina) ; m6Am (N6,T-O-dimetiladenosina) ; m62Am (N6,N6,0-2-trimetiladenosina) ; m2' 7G (N2, 7-dimetilguanosina) ; m2'2' 7G (N2,N2,7-trimetilguanosina) ; m3Um (3, 2T-0-dimetiluridina) ; m5D (5-metildihidroiiridina) ; f5Cm (5-fo.anil-2' -O-metilcitidina) ; mlGm (1,2' -0-dimetilguanosina) ; m'Am (1,2-0-dimetiladenosina) irinometiluridina) ; tm5s2U (S-taurinometil-2-tiouridina) ) ; irtiG-14 (4-demetilguanosina) ; imG2 (isoguanosina) ; ac6A (N6-acetiladenosina) ; hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, 7- derivados sistituidos de los mismos, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-alquiluracilo de (Ci-C6) , 5-metiluracilo, 5-alqueniluracilo de (02-(¾) , 5-alquiniluracilo de (C2-C6) , 5- (hidroximetil)uracilo, B-cloro!iracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-alquilcitosina de (Ci-C6) , 5-metilcitosina, 5-alquenilcitosina de (C2-Q5) , 5-alquinilcitosina de (C2-C6) , 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7-desdazaguanina, 8-azaguanina, 7-desaza-7-guanina sustituida, 7-desaza-7-alquinilguanina de (C2-C6) , 7-desaza-8-guanina sustituida, 8-hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2- amino-6-cloropurina, 2 , 4 -diaminopurina, 2 , 6-diaminopurina, 8-azapurina, 7-desazapurina sustituida, 7-desaza-7-purina sustituida, 7-desaza-8-purina sustituida, hidrógeno (residuo abásico) , m5C, m5U, m6A, s2U, W, o 2 ' -O-metil-U. Muchas de estas nucleobases modificadas y sus ribonucleósidos correspondientes están disponibles de proveedores comerciales. Véase, por ejemplo, WO 2011/005799 que se incorpora en la presente por referencia.
Si se desea, la molécula de ARN puede contener enlaces de fosforamidato, fosforotioato y/o metilfosfonato .
En algunas modalidades, la molécula de ARN no incluye nucleótidos modificados, por ejemplo, no incluye nucleobases modificadas, y todos los nucleótidos en la molécula de ARN son ribonucleótidos estándares convencionales A, U, G y C, con la excepción de un tapa 5' opcional que puede incluir, por ejemplo, 7-metilguanosina . En otras modalidades, el ARN puede incluir un tapa 5' que comprenda una 7 ' -metilguanosina, y los primeros 1, 2 ó 3 5'-ribonucleótidos pueden ser metilados en la posición 2' de la ribosa .
A. ARN autoreplicante En algunos aspectos, la emulsión catiónica de aceite en agua contiene una molécula de ARN autoreplicante . En ciertas modalidades, la molécula de ARN autoreplicante se deriva de o es a base de un alfavirus.
Moléculas de ARN autoreplicante se conocen bien en la técnica y pueden producirse usando elementos de replicación derivados de, por ejemplo, alfavirus, y sustituyendo las proteínas virales estructurales con una secuencia de nucleótidos que codifique para una proteína de interés. Células transfectadas con ARN autoreplicante producen brevemente antígeno antes de sufrir muerte apoptósica. Esta muerte es probablemente resultado de los intermedios de ARN de doble hebra (ds) necesarios, los cuales también han mostrado súper activar células dendríticas. Así, la inmunogenicidad incrementada de ARN autoreplicante puede ser el resultado de la producción de ARN de doble hebra pro-inflamatorio, el cual imita una infección por virus de ARN de células hospederas.
Adecuadamente, la maquinaria de la célula se usa por moléculas de ARN autoreplicantes para generar un incremento exponencial de productos génicos codificados, tales como proteínas o antígenos, que pueden acumularse en las células o ser secretados de las células. La sobreexpresión de proteínas o antígenos por moléculas de ARN autoreplicantes toma ventaja de los efectos adyuvantes inmunoestimuladores, incluyendo estimulación de receptores tipo toll (TLR) , 3, 7 y 8 y vías no TLR (por ejemplo, RIG-1, MID-5) por los productos de replicación y amplificación de ARN, y traducción que induce apoptosis de la célula transfectada.
El ARN autoreplicante generalmente contiene por lo menos uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en replicasas virales, proteasas virales, helicasas virales y otras proteínas virales no estructurales, y también comprende secuencias de replicación cis-activas del extremo 5' y 3', y si se desea, secuencias heterólogas que codifican para secuencias de aminoácidos deseadas (por ejemplo, un antígeno de interés) . Un promotor subgenómico que dirija la expresión de la secuencia heteróloga puede incluirse en el ARN autoreplicante. Si se desea, la secuencia heteróloga (por ejemplo, un antígeno de interés) puede fusionarse en cuadro a otras regiones de codificación en el ARN autoreplicante y/o puede estar bajo el control de un sitio de entrada de ribosomas interno (IRES) .
En ciertas modalidades, la molécula de ARN autoreplicante no es encapsulada en una partícula tipo virus. Las moléculas de ARN autoreplicantes de la invención pueden diseñarse de tal manera que la molécula de ARN autoreplicante no pueda inducir la producción de partículas virales infecciosas. Esto se puede lograr, por ejemplo, al omitir uno o varios genes virales que codifiquen para proteínas estructurales que sean necesarias para la producción de partículas virales en el ARN autoreplicante. Por ejemplo, cuando la molécula de ARN autoreplicante se basa en un alfa virus, tal como virus Sindbis (SIN), virus de la tapa de Semliki y virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) , uno o más genes que codifiquen para proteínas estructurales virales, tales como glicoproteínas de cápside y/o envoltura, pueden ser omitidos.
Si se desea, las moléculas de ARN autoreplicantes de la invención también pueden diseñarse para inducir la producción de partículas virales infecciosas que sean atenuadas o virulentas, o para producir partículas virales que sean capaces de una sola ronda de infección subsecuente.
Cuando se suministre a una célula de vertebrado, una molécula de ARN autorepl icante puede llevar a la producción de varias moléculas de ARN hijas por transcripción a partir de sí misma (o a partir de una copia antisentido de ella misma) . El ARN autoreplicante puede ser directamente traducido después de su suministro a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que luego produce transcritos a partir de ARN suministrado. Así, el ARN suministrado lleva a la producción de varias moléculas de ARN hijas. Estos transcritos son antisentido con relación al ARN suministrado y pueden traducirse ellos mismos para proporcionar expresión in situ de un producto génico, o pueden transcribirse para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido que el ARN suministrado que sean traducidos para proporcionar expresión in situ del producto génico.
Un sistema adecuado para lograr autoreplicación es usar un replicón de ARN a base de alfa virus. Los alfa virus comprenden un conjunto de virus de origen artrópodo genética, estructural y serológicamente relacionados de la familia Togaviridae. Veintiséis virus conocidos y subtipos de virus han sido clasificados dentro del género alfa virus, incluyendo, virus Sindbis, virus del bosque de Semliki, virus del río Ross y virus de la encefalitis equina venezolana. De esta manera, el ARN autoreplicante de la invención puede incorporar una ARN replicasa derivada del virus del bosque Semliki (SFV) , virus Sindbis (SIN) , virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) , virus del río Ross (RRV) u otros virus que pertenezcan a la familia de alfa virus.
Vectores de expresión de "replicones" a base de alfa virus pueden usarse en a invención. Los vectores de replicón pueden utilizarse en varios formatos, incluyendo ADN, ARN y partículas de replicón recombinantes. Estos vectores de replicón han sido derivados de alfa virus que incluyen, por ejemplo, virus Sindbis (Xiong et al. (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky et al., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan et al. (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo et al. (1999) PNAS 96:4598-4603), virus del bosque Semliki (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund et al. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565), y virus de la encefalitis equina venezolana (Pushko et al. (1997) Virology 239:389-401). Los replicones derivados de alfa virus generalmente son muy similares en características similares (por ejemplo, estructura, replicación) , los alfa virus individuales pueden exhibir cierta propiedad particular (por ejemplo, unión a receptores, sensibilidad a interferón y perfil de enfermedad) que sea única. Por lo tanto, los replicones de alfa virus quiméricos hechos a partir de familias de virus divergentes también pueden ser útiles.
Los replicones a base de alfa virus son replicones de hebra (+) que pueden ser traducidos después de su suministro a una célula para dar una replicasa (o replicasa-transcriptasa) . La replicasa es traducida como una poliproteína que se autocorta para proporcionar un complejo de replicación que crea copias de hebra (-) genómicas del ARN suministrado de hebra +. Estos transcriptos de hebra (-) pueden a su vez ser transcriptos para dar copias adicionales del ARN progenitor de hebra ( +) y también para dar un transcripto subgenomico que codifique para el producto génico deseado. La traducción del transcrito subgenomico lleva entonces a expresión in situ del producto génico deseado por la célula infectada. Los replicones de alfa virus adecuados pueden usar una replicasa de un virus sindbis, un virus del bosque semliki, un virus de la encefalitis equina oriental, un virus de la encefalitis equina venezolana, etc.
Una molécula de ARN autoreplicante que se prefiere codifica entonces para (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN a partir de la molécula de ARN autoreplicante y (ii) un antígeno polipéptido. La polimerasa puede ser una replicasa de alfa virus, por ejemplo, que comprenda proteína de alfa virus nsP4.
Mientras que los genomas de alfa virus naturales codifican para proteínas de virión estructurales además de la replicasa no estructural, se prefiere que una molécula de ARN autoreplicante a base de alfa virus de la invención no codifique para proteínas estructurales de alfa virus. De esta manera el ARN autoreplicante puede llevar a la producción de copias de ARN genómicas de sí mismo en una célula, pero no a la producción de viriones de alfa virus que contengan ARN. La incapacidad de producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfa virus tipo silvestre, la molécula de ARN autoreplicante no puede perpetuarse a sí misma en forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfa virus que son necesarias para perpetuación en virus tipo silvestre están ausentes de las moléculas de ARN autoreplicantes de la invención y su lugar es tomado por genes que codifican para el producto génico deseado, de tal manera que el transcripto subgenómico codifique para el producto génico deseado en lugar de las proteínas de virión de alfa virus estructurales.
Así, una molécula de ARN autoreplicante útil con la invención puede tener dos marcos de lectura abiertos. El primer marco de lectura abierto (5') codifica para una replicasa; el segundo marco de lectura abierto (3') codifica para un antígeno polipéptido. En algunas modalidades el ARN puede tener marcos de lectura abierta adicionales (hacia el extremo 3')/ por ejemplo, que codifiquen para otros productos génicos deseados. Una molécula de ARN autoreplicante puede tener una secuencia 5' que sea compatible con la replicasa codificada .
En otros aspectos, la molécula de ARN autoreplicante se deriva de o es a base de un virus que no es un alfa virus, de preferencia, un virus de ARN de hebra positiva, y muy preferiblemente un picornavirus , flavivirus, rubivirus, pestivirus, hepacivirus, calicivirus o coronavirus. Las secuencias de alfa virus tipo silvestre adecuadas se conocen bien y están disponibles de depósitos de secuencias, tales como la Colección Americana de Tipos de Cultivos, Rockville, Md. Ejemplos representativos de alfa virus adecuados incluyen Aura (ATCC VR-368) , virus Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR-1240) , Cabassou (ATCC VR-922), virus Chikungunya (ATCC VR-64, ATCC VR-1241) , virus de la encefalomielitis equina oriental (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), yzylagach (ATCC VR-927) , Mayaro (ATCC VR-66), virus Mayaro (ATCC VR-1277) , Middleburg (ATCC VR-370) , virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371) , virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245) , virus del río Ross (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), bosque Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR-1247) , virus dindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248) , Tonate (ATCC VR-925) , Triniti (ATCC VR-469) , Una (ATCC VR-374), encefalomielitis equina venezolana (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250, ATCC VR-1249, ATCC VR-532), encefalomielitis equina occidental (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252) , Whataroa (ATCC VR- 926) y Y-62-33 (ATC VR-375) .
Las moléculas de ARN autoreplicantes de la invención son más grandes que otros tipos de ARN (por ejemplo, AR m) . Típicamente, las moléculas de ARN autoreplicantes de la invención contienen al menos aproximadamente 4 kb. Por ejemplo, el ARN autoreplicante puede contener al menos aproximadamente 5kb, al menos aproximadamente 6kb, al menos aproximadamente 7kb, al menos aproximadamente 8kb, al menos aproximadamente 9kb, al menos aproximadamente lOkb, al menos aproximadamente llkb, al menos aproximadamente 12kb o más de 12kb. En ciertos ejemplos, el ARN autoreplicante tiene aproximadamente 4kb a alrededor del2kb, aproximadamente 5kb a alrededor de 12kb, aproximadamente 6kb a alrededor de 12kb, aproximadamente 7kb a alrededor de 12kb, aproximadamente 8kb a alrededor de 12kb, aproximadamente 9kb a alrededor de 12kb, aproximadamente lOkb a alrededor de 12kb, aproximadamente llkb a alrededor de 12kb, aproximadamente 5kb a alrededor de llkb, aproximadamente 5kb a alrededor de lOkb, aproximadamente 5kb a alrededor de 9kb , aproximadamente 5kb a alrededor de 8kb, aproximadamente 5kb a alrededor de 7kb , aproximadamente 5kb a alrededor de 6kb , aproximadamente 6kb a alrededor de 12kb , aproximadamente 6kb a alrededor de llkb, aproximadamente 6kb a alrededor de lOkb, aproximadamente 6kb a alrededor de 9kb, aproximadamente 6kb a alrededor de 8kb, aproximadamente 6kb a alrededor de 7kb, aproximadamente 7kb a alrededor de llkb, aproximadamente 7kb a alrededor de lOkb, aproximadamente 7kb a alrededor de 9kb, aproximadamente 7kb a alrededor de 8kb, aproximadamente 8kb a alrededor de llkb, aproximadamente 8kb a alrededor de lOkb, aproximadamente 8kb a alrededor de 9kb, aproximadamente 9kb a alrededor de llkb, aproximadamente 9kb a alrededor de lOkb, o aproximadamente lOkb a alrededor de llkb.
Las moléculas de ARN autoreplicantes de la invención pueden comprender uno o más nucleótidos modif icados (por ejemplo, pseudouridina , N6 -metiladenosina , 5 -metilcitidina , 5 -metiluridina) .
La molécula de ARN autoreplicante puede codif icar para un solo antígeno polipéptido o , opcionalmente , dos o más antígenos polipéptidos ligados juntos de una manera tal que cada una de las secuencias conserve su identidad (por ejemplo, enlazados en serie) cuando sea expresada como una secuencia de aminoácidos . Los polipéptidos generados a partir del ARN autoreplicante pueden ser luego producidos como un polipéptido de fusión o manipulados de tal manera que den como resultado secuencias de polipéptidos o péptidos separadas.
El ARN autoreplicante de la invención puede codificar para uno o más antígenos polipéptidos que contengan una gama de epítopos . De preferencia epítopos capaces de provocar ya sea una respuesta de células T auxiliares o una respuesta de células T citotóxica o ambas.
Las moléculas de ARN autoreplicantes descritas en la presente pueden ser manipuladas para expresar varias secuencias de nucleótidos, a partir de dos o más marcos de lectura abiertos, permitiendo así la co-expresión de proteínas, tal como dos o más antígenos juntos con citosinas u otros inmunomoduladores , los cuales pueden potenciar la generación de una respuesta inmune. Esta molécula de ARN autoreplicante puede ser particularmente útil, por ejemplo, en la producción de varios productos génicos (por ejemplo, proteínas) al mismo tiempo, por ejemplo, como una vacuna bivalente o multivalente .
Las moléculas de ARN autoreplicantess de la invención pueden prepararse usando cualquier método adecuado. Se conocen en la técnica varios métodos adecuados para la producción de moléculas de ARN que contienen nucleótidos modificados. Por ejemplo, una molécula de ARN autoreplicante que contenga nucleótidos modificados puede prepararse al transcribir (por ejemplo, transcripción in vitro) un ADN que codifique para la molécula de ADN autoreplicante usando una ARN polimerasa dependiente de ADN adecuada, tal como ARN polimerasa de fago T7, ARN polimerasa de fago SP6, ARN polimerasa de fago T3 , y similares, o mutantes de estas polimerasas que permitan la incorporación eficiente de nucleótidos modificados en moléculas de ARN. La reacción de transcripción contendrá nucleótidos y nucleótidos modificados, y otros componentes que soporten la actividad de la polimerasa seleccionada, tal como un regulador de pH adecuado, y sales adecuadas. La incorporación de análogos de nucleótido en un ARN autoreplicante puede manipularse, por ejemplo, para alterar la estabilidad de estas moléculas de ARN, para incrementar resistencia contra RNasas, para establecer replicación después de introducción en células hospederas adecuadas ( "infectividad" del ARN), y/o para inducir o reducir respuestas inmunitarias innatas y adaptivas .
Los métodos sintéticos adecuados pueden usarse solos, o en combinación con uno o más de otros métodos (por ejemplo, tecnología de ADN o ARN recombinante) , para producir una molécula de ARN autoreplicante de la invención. Métodos adecuados para síntesis de novo se conocen bien en la técnica y pueden ser adaptados para aplicaciones particulares. Ejemplos de métodos incluyen, por ejemplo, síntesis química usando grupos protectores adecuados tales como CEM (Masuda et al., (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51:3-4), el método de ß-cianoetil fosforamidita (Beaucage S L et al. (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); el método de nucleósido H-fosfonato (Garegg P et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler B C et al . (1986) Nucí Acid Res 14:5399-407; Garegg P et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8; Gaffney B L et al. (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22). Estas químicas pueden llevarse a cabo o adaptarse para usarse con sintetizadores de ácido nucleico automáticos que están disponibles comercialmente . Métodos sintéticos adecuados adicionales se describen en Uhlmann et al. (1990) Chem Rev 90:544-84, y Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165. La síntesis de ácido nucleico también se puede llevar a cabo usando métodos recombinantes adecuados que se conozcan bien y sean convencionales en la técnica, incluyendo clonación, procesamiento y/o expresión de polinucleótidos y productos génicos codificados por tales polinucleótidos. La reclasificación de ADN por fragmentación aleatoria y reensamble por PCR de fragmentos génicos y polinucleótidos sintéticos son ejemplos de técnicas conocidas que se pueden usar para diseñar y manipular secuencias de polinucleótidos. Se puede usar mutagénesis dirigida a sitio para alterar ácidos nucleicos y las proteínas codificadas, por ejemplo, para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar preferencia de codones, producir variantes de empalme, introducir mutaciones y similares. Métodos adecuados para la transcripción, traducción y expresión de secuencias de ácido nucleico se conocen y son convencionales en la técnica, (véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, Vol . 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience , Ch. 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash. , D.C., Ch. 3, 1986; Bitter, et al., in Methods in Enzymology 153:516-544 (1987) ; The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces , Eds . Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982; and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989.) La presencia y/o cantidad de uno o más nucleótidos modificados en una molécula de AR autoreplicante pueden determinarse usando cualquier método. Por ejemplo, un ARN autoreplicante puede ser digerido a monofosfatos (por ejemplo, usando nucleasa Pl) y desfosforilado (por ejemplo, usando una fosfatasa adecuada tal como CIAP) , y los nucleósidos resultantes analizados por HPLC de fase inversa (por ejemplo, usando una columna YMC Pack ODS-AQ (5 mieras, 4.6 X 250 mm) y eluir usando un gradiente, 30% B (0-5 min) a 100% B (5-13 min) y a 100% B (13-40) min, velocidad de flujo (0.7 ml/min) , detección UV (longitud de onda: 260 nra) , temperatura de columna (30°C) . Regulador de pH A (20 mM de ácido acético - acetato de amonio, pH 3.5/metanol [90/10])) .
Opcionalmente, las moléculas de ARN autoreplicantess de la invención pueden incluir uno o más nucleótidos modificados de tal manera que la molécula de ARN autoreplicante tenga menos actividad inmunomodul dora después de su introducción o entrada en una célula hospedera (por ejemplo, una célula humana) en comparación con la molécula de ARN autoreplicante correspondiente que no contenga nucleótidos modificados.
Si se desea, las moléculas de ARN autoreplicantes pueden ser tamizadas o analizadas para confirmar sus propiedades terapéuticas o profilácticas usando varios métodos de prueba in vitro o in vivo que se conozcan por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, vacunas que comprendan molécula de ARN autoreplicante pueden probarse para su efecto en la inducción de proliferación o función efectora del tipo de interés de linfocito particular, por ejemplo, células B, células T, líneas de células T y clones de células T. Por ejemplo, células esplénicas de ratones inmunizados pueden ser aisladas y la capacidad de los linfocitos T citotóxicos para lisar células objetivo autólogas que contengan una molécula de ARN autoreplicante que codifique para un antígeno polipéptido. Además, la diferenciación de células T auxiliares puede ser analizada al medir la proliferación o producción de citosinas THl (IL-2 e IFN-?) y/o TH2 (IL-4 e IL-5) por ELISA o directamente en células T CD4+ por tinción con citosinas citoplásmicas y citometría de flujo.
Las moléculas de ARN autoreplicantes que codifican para un antígeno polipéptido también pueden probarse para capacidad para inducir respuestas inmunitarias humorales, como se evidencia, por ejemplo, por la inducción de la producción de células B de anticuerpos específicos para un antígeno de interés. Estos ensayos pueden llevarse a cabo usando, por ejemplo, linfocitos B periféricos de individuos inmunizados. Estos métodos de ensayo se conocen por aquellos expertos en la técnica. Otros ensayos que se pueden usar para caracterizar las moléculas de ARN autoreplicantes de la invención pueden implicar detectar la expresión del antígeno codificado por las células objetivo. Por ejemplo, se puede usar FACS para detectar la expresión de antígenos en la superficie de la célula o intracelularmente . Otra ventaja de la selección por FACS es que uno puede clasificar diferentes niveles de expresión; algunas veces se puede desear expresión inferior. Otro método adecuado para identificar células que expresen un antígeno particular incluye paneo usando anticuerpos monoclonales en una placa o captura usando esferas magnéticas recubiertas con anticuerpos monoclonales.
B. Antígenos En ciertas modalidades, la molécula cargada negativamente descrita en la presente es una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, una molécula de ARN) que codifica para un antígeno. Los antígenos adecuados incluyen, pero no están limitados a, un antígeno bacteriano, un antígeno viral, un antígeno fúngico, un antígeno de protozoario, un antígeno vegetal, un antígeno de cáncer o una combinación de los mismos.
Los antígenos adecuados incluyen proteínas y péptidos de un patógeno tal como un virus, bacteria, hongo, protozoario, planta o de un tumor. Los antígenos virales e inmunógenos que pueden ser codificados por la molécula de ARN autoreplicante incluyen, pero no están limitados a, proteínas y péptidos de ortomixovirus, tales como influenza A, B y C; virus Paramixoviridae , tales como neumovirus (RSV) , paramixovirus (PIV) , metaneumovirus y morbilivirus (por ejemplo, sarampión) ; Pneumovirus, tales como virus sincitial respiratorio (RSV) , virus sincitial respiratorio bovino, virus de la neumonía de ratones y virus de rinotraqueítis del pavo; paramixovirus, tales como virus e la parainfluenza tipos 1-4 (PIV), VIRUS DE LAS PAPERAS, VIRUS Sendai, virus simiano 5, virus de la parainfluenza bovina, nipavirus, henipavirus y virus de enfermedad de Newcastle; virus de la viruela, incluyendo un ortopoxvirus tal como Varióla vera (incluyendo pero no limitado a, Varióla ajor y Varióla minor) ; metaneumovirus tales como metaneumovirus humano (hMPV) y metaneumovirus aviarios (aMPV) ; morbilivirus, tales como sarampión; picornavirus , tales como enterovirus, rinovirus, heparnavirus , parecovirus, cardiovirus y aftovirus; enterovirus, tales como virus de la polio tipos 1, 2 ó 3, virus de coxsackie A tipos 1 a 22 y 24, virus de coxsackie B tipos 1 a 6, virus ecovirus (ECHO) tipos 1 a 9, 11 a 27 y 29 a 34 y enterovirus 68 a 71, bunyavirus, incluyendo un ortobunyavirus tal como virus de la encefalitis de California; un flebovirus, tal como virus de fiebre del Valley Rift; un nairovirus, tal como virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo; heparnavirus, tales como virus de la hepatitis A (HAV) ; togavirus (rubéola) , tales como rubivirus, un alfavirus o un arterivirus; flavivirus, tales como virus de la encefalitis ocasionada por garrapatas (TBE) , virus del dengue (tipos 1, 2, 3 ó 4) , virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus del bosque Kyasanur, virus de la encefalitis del Nilo Occidental, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis de primavera-verano ruso, virus de la encefalitis de Powassan; pestivirus, tales como diarrea viral bovina (BVDV) , fiebre porcícola clásica (CSFV) o enfermedad de Border (BDV) ; hepadnavirus , tales como virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C; rhabdovirus, tales como lisavirus (virus de la rabia) y vesiculovirus (VSV) , claciviridae , tales como virus de Norwalk y virus tipo Norwalk, tales como virus de Hawai y virus de la Montaña Nevada; coronavirus, tales como SARS, coronavirus respiratorio humano, bronquitis infecciosa aviaria (IBV) , virus de la hepatitis de ratón (MHV) y virus de la gastroenteritis transmisible por porcinos (TGEV) ; retrovirus tales como un oncovirus, un lentivirus o un espumavirus; reovirus, como un ortorreovirus , un rotavirus, un orbivirus, o un coltivirus; parvovirus, tales como parvovirus B19; virus de la hepatitis delta (HDV) ; virus de la hepatitis E (HEV) ; virus de la hepatitis G (HGV) ; virus del herpes humano, tales como, por medio de virus del herpes simple (HSV) , virus de la varicela zoster (VZV) , virus de Epstein-Barr (EBV) , citomegalovirus (CMV) , virus del herpes humano 6 (HHV6), virus del herpes humano 7 (HHV7) y virus del herpes humano 8 (HHV8) ; papovavirus, tales como virus del papiloma y virus del polioma, adenovirus y arenavirus.
En algunas modalidades, el antígeno provoca una respuesta inmunitaria contra virus que infecta peces, tal como: virus de la anemia del salmón infecciosa (ISAV) , virus de la enfermedad pancreática del salmón (SPDV) , virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) , virus del bagre de canal (CCV) ; virus de la enfermedad de linfocistis de peces (FLDV) , virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (IHNV), virus del herpes koi, virus tipo picorna de salmón (conocido también como virus tipo picorna del salmón del Atlántico) , virus del salmón sin litoral (LSV) , rotavirus del salmón del Atlántico (ASR) , virus de la enfermedad de la fresa de la trucha (TSD) , virus del tumor de salmón plateado (CSTV) o virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV) .
En algunas modalidades, el antígeno provoca una respuesta inmunitaria contra un parásito del género plasmodium, tal como P. falciparum, P. vivax, P. malarie o P. ovale. Así, la invención puede usarse para inmunizar contra paludismo. En algunas modalidades el antígeno provoca una respuesta inmunitaria contra un parásito de la familia Caligidae, particularmente aquellos de los géneros Lepeophtheirus y Caligus, por ejemplo, piojos de mar tales como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi.
Los antígenos e inmunógenos bacterianos que pueden codificarse por la molécula de AR autoreplicante incluyen, pero no están limitados a, proteínas y péptidos de Neisseria meningitides, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Burkholderia sp. (por ejemplo, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei y Burkholderia cepacia) , Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Haemophilus influenzae, Clostridium tetani (tétanos) , Clostridium perfringens, Clostridium botulinums (botulismo) , Cornynebacterium diphtheriae (difteria) , Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Coxiella burnetii , Brucella sp. (por ejemplo, B. abortus, B. canis, B. melitensis, B. neotomae, B. ovis, B. suis y B. pinnipediae, ) , Francisella sp. (por ejemplo, F. novicida, F. philomiragia y F. tularensis) , Streptococcus agalactiae, Neiserria gonorrhoeae, Chla ydia trachomatis, Treponema pallidum (Syphilis) , Haemophilus ducreyi , Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Helicobacter pylori , Staphylococcus saprophyticus, Yersinia enterocolitica , E. coli (tal como E. coli enterotoxigénico (ETEC) , E. coli enteroagregat ivo (EAggEC) , E. coli de adherencia difusa (DAEC) , E. coli enteropatógeno (EPEC) , E. col i patógeno extraintestinal (ExPEC; tal como E. coli uropatógeno (UPEC) y E. coli asociado con meningitis/sepsis (M EC) ) y/o E. coli enterohemorrágico (EHEC) , Bacillus anthracis (ántrax) , Yersinia pestis (plaga) , Mycobacterium tuberculosis , Rickettsia, Listeria monocytogenes, Chlamydia pneu oniae, Vibrio cholerae, Salmonella typhi (fiebre tifoidea) , Borrelia burgdorfer, Porphyromonas gingivalis, Klebsiella , Mycoplasma pneumoniae, etc.
Los antígenos e inmunógenos fúngicos que pueden ser codificados por la molécula de ARN autoreplicante incluyen, pero no están limitados a, proteínas y péptidos de dermatóf itos, incluyendo: Epider ophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini , Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. álbum, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum, y/o Trichophyton faviforme; o de Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi , Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi , Cladosporium carrionii , Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp. , Septata intestinalis y Enterocytozoon bieneusi; los menos comunes son Brachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidíosum, Pityrosporu ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii , Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii , Trichosporon beigelii , Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp . , Sporothrix spp., Basidiobolus spp. , Conidiobolus spp . , Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaría spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp, y Cladosporium spp.
Los antígenos e inmunógenos de protozoarios que pueden ser codificados por la molécula de ARN autoreplicante incluyen, pero no están limitados a, proteínas y péptidos de Entamoeba histolytica, Giardia lambli, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayatanensis y Taxoplasma.
Los antígenos e inmunógenos vegetales que pueden ser codificados por la molécula de ARN autoreplicante incluyen, pero no están limitados a, proteínas y péptidos de Ricinus communis.
Los antígenos adecuados incluyen proteínas y péptidos de un virus tal como, por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de la hepatitis A (HAV) , virus de la hepatitis B (HBV) , virus de la hepatitis C (HCV) , virus del herpes simple (HSV) , citomegalovirus (CMV) , virus de la influenza (gripe) , virus sincitial respiratorio (RSV) , parvovirus, norovirus, virus del papiloma humano (HPV) , rinovirus, virus de la fiebre amarilla, virus de la rabia, virus de la fiebre dengue, virus de sarampión, virus de paperas, virus de rubéola, virus de varicela zoster enterovirus (por e emplo, enterovirus 71) , virus ébola y virus de la diarrea bovina. De preferencia, la sustancia antigénica se selecciona del grupo que consiste en glicoproteína gD de HSV, glicoproteína gpl20 de VIH, glicoproteína gp40 de VIH, p55 gag de VIH y polipéptidos de las regiones pol y tat. En otras modalidades preferidas de la invención, el antígeno es una proteína o péptido derivado de una bacteria tal como, por ejemplo, Helicobacter pylori, Haemophilus influenza, Vibrio cholerae (cólera) , C. diphtheriae (difteria) , C. tetani (tétanos) , Neisseria meningitidis, B. pertussis, Mycobacterium tuberculosis, y similares .
Los antígenos de VIH que pueden ser codificados por las moléculas de ARN autoreplicantes de la invención se describen en la solicitud de E.U.A. No. de serie 490,858, presentada el 9 de marzo de 1990 y solicitud europea publicada No. 181150 (14 de mayo de 1986) , así como solicitudes de E.U.A. Nos. De serie 60/168,471, 09/475,515, 09/475,504 y 09/610,313, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.
Los antígenos de citomegalovirus que pueden ser codificados por las moléculas de ARN autoreplicantes de la invención se describen en la patente de E.U.A. No. 4,689,225, solicitud de E.U.A. No. De serie 367,363, presentada el 16 de junio de 1989 y publicación de PCT WO 89/071243, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.
Los antígenos de la hepatitis C que pueden ser codificados por las moléculas de AR autoreplicantes de la invención se describen en PCT/US88/04125 , solicitud europea publicada número 318216 (31 de mayo de 1989) , solicitud japonesa publicada número 1-500565 presentada el 18 de noviembre de 1988, solicitud canadiense 583,561 y EPO 388,232, descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. Un conjunto diferente de antígenos de HCV se describe en la solicitud de patente europea 90/302866.0, presentada el 16 de marzo de 1990 y solicitud de E.U.A. No. De serie 456,637, presentada el 21 de diciembre de 1989, y PCT/UJS90/ 01348 , las descripciones de las cuales se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.
En algunas modalidades, el antígeno se deriva de un alérgeno, tal como alérgeno del polen (alérgenos del polen de árboles, hierbas, malezas y céspedes); alérgenos de insectos o arácnidos (alérgenos inhalantes, de saliva y veneno, por ejemplo, alérgenos de ácaros, alérgenos de cucarachas y mosquitos, alérgenos de veneno de himenopteros); alérgenos de pelaje animal y caspa (de, por ejemplo, perro, gato, caballo, rata, ratón, etc.); y alérgenos de alimentos (por ejemplo, una gliadina) . Alérgenos de polen importantes de árboles, céspedes y hierbas son tales que se originan de los órdenes taxonómicos de fágales, oléales, piñales y platanáceos incluyendo, pero no limitados a, abedul (Betula) , aliso (Alnus) , avellano {Corylus) , carpe (Carpinus) y olivo (Olea) , cedro {Cryptomeria y Juniperus) , plátano de sombra (Platanus) , el orden de Poales incluyendo gramíneas de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Sécale y sorgo, las órdenes de Asterales y Urticales incluyendo hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y Parietaria . Otros alérgenos de inhalación importantes son aquellos de ácaros del polvo doméstico del género Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaros de almacenamiento por ejemplo, Lepidoglyphys, Glycyphagus y Tyrophagus, aquellos de las cucarachas, mosquitos y pulgas por ejemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocepphalides , y los de mamíferos como gato, perro y caballo, alérgenos de veneno incluyendo aquellos procedentes de los insectos que pican o que muerden, como los del orden taxonómico de himenópteros incluyendo abejas (Apidae) , avispas (Vespidea) , y hormigas [Formicoidae) .
En ciertas modalidades, un inmunógeno tumoral o antígeno, o inmunógeno o antígeno de cáncer, puede ser codificado por la molécula de ARN autoreplicante. En ciertas modalidades, los inmunógenos y antígenos tumorales son antígenos tumorales que contienen péptidos, tales como un antígeno tumoral de polipéptido o antígenos tumorales de glicoproteínas .
Los inmunógenos y antígenos tumorales adecuados para usarse en la presente abarcan una amplia variedad de moléculas, tales como (a) antígenos tumorales que contienen polipéptidos , incluyendo polipéptidos (que pueden variar, por ejemplo, de 8-20 aminoácidos de largo, aunque longitudes fuera de este intervalo también son comunes) , lipopolipéptidos y glicoproteínas.
En ciertas modalidades, los inmunógenos tumorales son, por ejemplo, (a) moléculas de longitud completa asociadas con células cancerosas, (b) homólogos y formas modificadas de las mismas, incluyendo moléculas con porciones suprimidas, añadidas y/o sustituidas, y (c) fragmentos de los mismos. Los inmunógenos tumorales incluyen, por ejemplo, antígenos restringidos clase I reconocidos por linfocitos CD8+ o antígenos restringidos clase II reconocidos por linfocitos CD4+.
En ciertas modalidades, los inmunógenos tumorales incluyen, pero no están limitados a, (a) antígenos de cáncer de testículo tales como NY-ESO-I, SSX2, SCPI así como los polipéptidos de las familias RAGE, BAGE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1 , GAGE-2 , MAGE-1 , MAGE-2 , MAGE-3 , MAGE-4 , MAGE-5 , MAGE-6 y MAGE-12 (los cuales pueden ser usados, por ejemplo, para tratar melanoma, tumores de pulmón, cabeza y cuello, NSCLC, seno, gastrointestinales y de vejiga), (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociados con varios tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, pulmonar, cabeza y cuello) , p21/Ras (asociado con, por ejemplo, melanoma, cáncer pancreático y cáncer colorrectal) , CDK4 (asociado con, por ejemplo, melanoma) , MUM1 (asociado con, por ejemplo, melanoma) , caspasa-8 (asociado con, por ejemplo, cáncer de cabeza y cuello) , CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cáncer de vejiga) , HLA-A2 -R1701 , beta catenina (asociado con, por ejemplo, melanoma) , TCR (asociado con, por ejemplo, linfoma no Hodgkin de células T) , BCR-abl (asociado con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica) , triosefosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27 y LDLR-FUT, (c) antígenos sobre-expresados, por ejemplo, galectina 4 (asociado con, por ejemplo, cáncer colorrectal), galectina 9 (asociada con, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin) , proteinasa 3 (asociada con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica) , WT 1 (asociada con, por ejemplo, varias leucemias) , anhidrasa carbónica (asociada con, por ejemplo, cáncer renal), aldolasa A (asociada con, por ejemplo, cáncer pulmonar) , PRAME (asociado con, por ejemplo, melanoma), HER-2/neu (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, colon, pulmón y ovario) , alfa- fetoproteína (asociado con, por ejemplo, hepatoma) , KSA (asociado con, por ejemplo, cáncer colorrectal), gastrina (asociada con, por ejemplo, cáncer pancreático y gástrico) , proteína catalítica de telomerasa, MUC-1 (asociada con, por ejemplo, cáncer de mama y ovario) , G-250 (asociado con, por ejemplo, carcinoma de células renales) , p53 (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama y colon) , y antígeno carcinoembrionario (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer pulmonar y cánceres del tracto gastrointestinal tales como cáncer colorrectal) , (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación melanomas-melanocitos tales como MART- 1/Melan A/ gplOO, MC1R, receptor de hormona estimuladora de melanocitos, tirosinasa, proteína relacionada con tirosinasa-l/TRPl y proteína relacionada con tirosinasa-2/TRP2 (asociada con, por ejemplo, melanoma) , (e) antígenos asociados a próstata, tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados con, por ejemplo, cáncer de próstata, (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados con mieloma y linfornas de células B, por ejemplo) .
En ciertas modalidades, los inmunógenos tumorales incluyen, pero no están limitados a, pl5, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRI, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos de virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos de virus del papiloma humano (HPV) , incluyendo E6 y E7, antígenos del virus de la hepatitis B y C, antígenos del virus linfotrópico de células T humanas, TSP-180, pl85erbB2, pl80erbB-3, c-met, mn-23Hl, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, pl6, TAGE, PSCA, CT7 , 43-9F, 5T4 , 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29/BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68/KP1, CO-029, FGF-5 , Ga733 (EpCAM) , HTgp-175, 344, A-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-O-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2/proteína asociada a ciclofilina C) , TAAL6, TAG72, TLP, TPS, y similares.
C. Formulaciones para la molécula cargada negativamente La molécula cargada negativamente (tal como AR ) se proporciona generalmente en forma de una solución acuosa, o una forma que pueda ser fácilmente disuelta en una solución acuosa (por ejemplo, liofilizada) . La solución acuosa puede ser agua, o una solución acuosa que comprenda una sal (por ejemplo, NaCl) , un regulador de pH (por ejemplo, un regulador de pH de citrato) , un agente tonificante no iónico (por ejemplo, un sacárido) , un polímero, un tensioactivo o una combinación de los mismos. Si la formulación está destinada para administración in vivo, es preferible que la solución acuosa sea un regulador de pH fisiológicamente aceptable que mantenga un pH que sea compatible con condiciones fisiológicas normales. Asimismo, en ciertos casos, puede ser deseable mantener el pH a un nivel particular para volver a asegurar la estabilidad de ciertos componentes de la formulación.
Por ejemplo, puede ser deseable preparar una solución acuosa que sea isotónica y/o isosmótica. Las soluciones hipertónicas e hipotónicas algunas veces podrían causar complicaciones y efectos no deseables cuando se inyecten, tales como hinchazón post-administración o rápida absorción de la composición debido a concentraciones de iones diferenciales entre la composición y fluidos fisiológicos. Para controlar la tonicidad, la emulsión puede comprender una sal fisiológica, tal como una sal sodio. Cloruro de sodio (NaCl) , por ejemplo, puede ser usado a aproximadamente 0.9% (p/v) (solución salina fisiológica) . Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, fosfato diácido de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc. En una modalidad ejemplar, la solución acuosa comprende 10 mM de NaCl y otras sales o agentes tonificantees no iónicos. Como se describe en la presente, los agentes tonificantees no iónicos también pueden usarse para controlar tonicidad.
La solución acuosa puede ser regulada en pH. Se puede usar en la presente cualquier regulador de pH fisiológicamente aceptable, tal como reguladores de pH de citrato, reguladores de pH de fosfato, reguladores de pH de acetato, regulador de pH de succinato, reguladores de pH tris, reguladores de pH de bicarbonato, reguladores de pH de carbonato o similares. El pH de la solución acuosa será preferiblemente de entre 6.0-8.0, muy preferiblemente alrededor de 6.2 a aproximadamente 6.8. En algunos casos, cierta cantidad de sal puede incluirse en el regulador de pH. En otros casos, sal en el regulador de pH podría interferir con la complej ación de la molécula cargada negativamente a la partícula de emulsión, y por lo tanto se evita.
La solución acuosa puede comprender también componentes adicionales tales como moléculas que cambien la osmolaridad de la solución acuosa o moléculas que estabilicen la molécula cargada negativamente después de la complej ación . Por ejemplo, la osmolaridad puede ajustarse usando un agente tonificante no iónico, los cuales son generalmente carbohidratos pero también pueden ser polímeros. (Véase, por ejemplo, Voet y Voet (1990) Biochemistry (John Wiley & Sons, Nueva York) . Ejemplos de agentes tonificantees no iónicos adecuados incluyen azúcares (por ejemplo, un monosacárido, un disacárido o un polisacárido, tales como trehalosa, sacarosa, dextrosa, fructosa) , alcoholes de azúcar (por ejemplo, manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, lactitol, maltitol, glicerol, palatinosa reducida), y combinaciones de los mismos. Si se desea, se puede usar un polímero no iónico (por ejemplo, un poli (alquilglicol ) , tal como polietilenglicol , polipropilenglicol o polibutilenglicol ) , o tensioactivo no iónico. Estos tipos de agentes, en particular azúcar y alcoholes de azúcar, también son crioprotectores que pueden proteger ARN, y otras moléculas cargadas negativamente, cuando sean liofilizados . En modalidades ejemplares, el regulador de pH comprende alrededor de 560 nM a 600 mM de trehalosa, sacarosa, sorbítol o dextrosa. En otras modalidades ejemplares, el regulador de pH comprende alrededor de 500 nM a 600 mM de trehalosa, sacarosa, sorbitol o dextrosa.
En algún caso, puede ser preferible preparar una solución acuosa que comprenda la molécula cargada negativamente como una solución hipertónica, y preparar la emulsión catiónica usando agua no adulterada o un regulador de pH hipotónico . Cuando la emulsión y la molécula cargada negativamente se combinan, la mezcla se vuelve isotónica. Por ejemplo, una solución acuosa que comprenda ARN puede ser una solución hipertónica 2X, y la emulsión catiónica puede prepararse usando regulador de pH de citrato 10 mM. Cuando la solución de ARN y la emulsión se mezclan a una relación 1:1 (v/v) , la composición se vuelve isotónica. Con base en cantidades relativas deseadas de la emulsión a la solución acuosa que comprende la molécula cargada negativamente (por ejemplo, mezcla 1:1 (v/v), mezcla 2:1 (v/v), mezcla 1:2 (v/v) , etc.), se puede determinar fácilmente la tonicidad de la solución acuosa que se requiera para poder lograr una mezcla isotónica.
Similarmente , composiciones que tengan osmolaridad fisiológica pueden ser deseables para administración in vivo. La osmolaridad fisiológica es de aproximadamente 255 mOsm/kg de agua a alrededor de 315 mOsm/kg de agua. Algunas veces, puede ser preferible preparar una solución acuosa que comprenda la molécula cargada negativamente con una solución hiperosmolar, y preparar la emulsión catiónica usando agua no adulterada o un regulador de pH hipoosmolar. Cuando la emulsión y la molécula cargada negativamente se combinan, se logra osmolaridad fisiológica. Con base en las cantidades relativas de la emulsión a la solución acuosa que comprende la molécula cargada negativamente (por ejemplo, mezcla 1:1 (v/v) , mezcla 2:1 (v/v) , mezcla 1:2 (v/v) , etc.), se puede determinar fácilmente la osmolaridad de la solución acuosa que se requiera para poder lograr una mezcla iso-osmolar.
En ciertas modalidades, la solución acuosa que comprende la molécula cargada negativamente puede comprender además un polímero o un tensioactivo, o una combinación de los mismos. En una modalidad ejemplar, la emulsión de aceite en agua contiene un poloxámero. En particular, los ® inventores han observado que añadir Pluronic F127 a la solución acuosa de ARN antes de la complej ación a partículas de emulsión catiónicas llevó a mayor estabilidad y resistencia a RNasa incrementada de la molécula de ARN. La adición de pluronic F127 a la solución acuosa de ARN también se encontró que reduce el tamaño de partícula del complejo ARN/CNE. LOS polímeros de poloxámero pueden facilitar también la descomplej ación/liberación adecuada de la molécula de ARN, evitar la agregación de las partículas de emulsión y tener efecto inmunomodulado . Otros polímeros que pueden usarse incluyen, por ejemplo, Pluronic* F68 o PEG300.
Como alternativa o además, la solución acuosa que comprende la molécula cargada negativamente puede comprender alrededor de 0.5% a aproximadamente 20% (p/v) de polímero. Por ejemplo, la emulsión catiónica de aceite en agua puede comprender un polímero (por ejemplo, un poloxámero tal como Pluronic® F127, Pluronic® F68 o PEG300) a alrededor de 0.05% a aproximadamente 10% (p/v), tal como.0.05%, 0.5%, 1% o 5%.
El sistema regulador de pH puede comprender cualquier combinación de dos o más moléculas descritas arriba (sal, regulador de pH, sacárido, polímero, etc.). En una modalidad preferida, el regulador de pH comprende 560 m de sacarosa, 20 mM de NaCl y 2 mM de citrato, los cuales pueden mezclarse con una emulsión catiónica de aceite en agua descrita en la presente para producir una fase acuosa final que comprenda 280 mM de sacarosa, 10 mM de NaCl y 1 mM de citrato. 5. Métodos de preparación En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar las emulsiones de aceite en agua como las descritas en la presente, que comprende: (1) combinar el aceite y el lípido catiónico para formar la fase de aceite de la emulsión (2) proporcionar una solución acuosa para formar la fase acuosa de la emulsión; y (3) dispersar la fase de aceite en la fase acuosa, por ejemplo, por homogeneización . La homogeneización puede lograrse de cualquier forma adecuada, por ejemplo, usando un homogeneizador comercial (por ejemplo, homogeneizador IKA T25, disponible en VWR International (West Chester, PA) .
En ciertas modalidades, las emulsiones de aceite en agua se preparan al (1) disolver directamente el lípido catiónico en el aceite para formar una fase de aceite; (2) proporcionar la fase acuosa de la emulsión; y (3) dispersar la fase de aceite en la fase acuosa por homogeneización. El método no usa un solvente orgánico (tal como cloroformo (CHC13) , diclorometano (DCM) , etanol, acetona, tetrahidrofurano (THF) , 2, 2, 2 -trifluoroetanol , acetonitrilo, acetato de etilo, hexano, dimetilformamida (DMF) , sulfóxido de dimetilo (DMSO) , etc.), para solubilizar el lípido catiónico primero antes de añadir el lípido al aceite.
Puede ser deseable calentar el aceite hasta una temperatura de entre aproximadamente 37°C a alrededor de 65°C para facilitar la disolución del lípido. La cantidad deseada del lípido catiónico (por ejemplo, DOTAP) puede medirse y añadirse directamente al aceite para alcanzar una concentración final deseada.
Si la emulsión comprende uno o más tensioactivos, los tensioactivos pueden incluirse en la fase de aceite o la fase acuosa de acuerdo con la práctica convencional en la técnica. Por ejemplo, SPA 85 puede disolverse en la fase de aceite (por ejemplo, escualeno) , y Tween 80 puede disolverse en la fase acuosa (por ejemplo, en un regulador de pH de citrato) .
En otro aspecto, la invención proporciona un método para preparar una composición que comprende una molécula cargada negativamente (tal como ARN) complejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, que comprende: (i) proporcionar una emulsión catiónica de aceite en agua como la descrita en la presente; (ii) proporcionar una solución acuosa que comprenda la molécula cargada negativamente (tal como ARN) ; y (iii) combinar la emulsión de aceite en agua de (i) y la solución acuosa de (iii) , de tal manera que la molécula cargada negativamente se compleje con la partícula de la emulsión.
Por ejemplo, una emulsión catiónica de aceite en agua puede combinarse con una solución de ARN acuosa en cualesquiera cantidades relativas deseadas, por ejemplo, alrededor de 1 : 1 (v/v) , aproximadamente 1. .5 ; : 1 (v/v) alrededor de 2 :1 (v/v) , aproximadamente 2. .5 : : 1 (v/v) alrededor de 3 : 1 (v/v) , aproximadamente 3. .5 : : 1 (v/v) alrededor de 4:1 (v/v), aproximadamente 5:1 (v/v), alrededor de 10:1 (v/v); aproximadamente 1:1.5 (v/v), alrededor de 1:2 (v/v), aproximadamente 1:2.5 (v/v), alrededor de 1:3 (v/v), aproximadamente 1:3.5 (v/v) , alrededor de 1:4 (v/v) , aproximadamente 1:1.5 (v/v), o alrededor de 1:1.10 (v/v), etc .
Se pueden incluir etapas opcionales y adicionales para promover la formación de partículas, para mejorar la complej ación entre las moléculas cargadas negativamente y las partículas catiónicas, para incrementar la estabilidad de la molécula cargada negativamente (por ejemplo, para prevenir la degradación de una molécula de AR ) , para facilitar la descomplejación/liberación adecuada de las moléculas cargadas negativamente (tal como una molécula de ARN) , o para prevenir la agregación de las partículas de emulsión. Por ejemplo, un polímero (por ejemplo, un polímero (por ejemplo, PluronicS F127) o un tensioactivo puede ser añadido a la solución acuosa que comprenda la molécula cargada negativamente (tal como ARN) .
El tamaño de las partículas de emulsión puede variarse al cambiar la relación de tensioactivo a aceite (incrementar la relación reduce el tamaño de partícula), presión operativa (incrementar la presión operativa reduce el tamaño de partícula) , temperatura (incrementar la temperatura reduce el tamaño de partícula y otros parámetros del proceso. El tamaño de partícula real también variará con el tensioactivo, aceite y lípido catiónico particular usado, y con las condiciones operativas particulares seleccionadas. 12 El tamaño de la partícula de emulsión puede verificarse mediante el uso de instrumentos de dimensionamiento, tales como el analizador de partículas en submicras comercial (modelo N4MD) fabricado por Coulter Corporation, y los parámetros pueden ser variados usados los lineamientos establecidos arriba hasta que el diámetro promedio de las partículas sea menor que aproximadamente 200 nm, menor que aproximadamente 150 nm o menor que aproximadamente 100 nm. De preferencia, las partículas tienen un diámetro promedio de aproximadamente 180 nm o menos, aproximadamente 150 nm o menos, aproximadamente 140 nm o menos, o aproximadamente 130 nm o menos, aproximadamente 120 nm o menos, o aproximadamente 100 nm o menos, de alrededor de 50 nm a 200 nm, de alrededor de 80 nm a 200 nm, de alrededor de 50 nm a 180 nm, de alrededor de 60 nm a 180 nm, de alrededor de 70 a 180 nm, o de alrededor de 80 nm a 180 nm, de alrededor de 80 nm a aproximadamente 170 nm, de alrededor de 80 nm a aproximadamente 160 nm, de alrededor de 80 nm a aproximadamente 150 nm, de alrededor de 80 nm a aproximadamente 140 nm, de alrededor de 80 nm a aproximadamente 130 nm, de alrededor de 80 nm a aproximadamente 120 nm, de alrededor de 80 nm a aproximadamente 110 nm, o de alrededor de 80 nm a aproximadamente 100 nm. Emulsiones en las que el tamaño de partícula medio sea de alrededor de 200 nm o menos permiten la filtración estéril.
Procesos opcionales para preparar la emulsión catiónica de aceite en agua (emulsión precomplej ación) , o el complejo molécula cargada negativamente-emulsión, incluye, por ejemplo, esterilización, selección de tamaño de partícula (por ejemplo, remoción de partículas grandes) , relleno, empaque y marcado, etc. Por ejemplo, si la emulsión precomplej ación, o el complejo molécula cargada negativamente-emulsión se formula para administración in vivo, se puede esterilizar. Por ejemplo, la formulación puede ser esterilizada al filtrar a través de un filtro grado esterilización (por ejemplo, a través de un filtro de 0.22 mieras) . Otras técnicas de esterilización incluyen un proceso térmico, o un proceso de esterilización con radiación, o el uso de luz pulsada para producir una composición estéril.
La emulsión catiónica de aceite en agua descrita en la presente puede usarse para fabricar vacunas. Emulsiones de aceite en agua catiónicas estériles y/o grado clínico pueden prepararse usando métodos similares a los descritos para MF59. Véase, por ejemplo, Ott et al., Methods in Molecular Medicine, 2000, volumen 42, 211-228, in VACCINE ADJUA TS (O'Hagan ed.), Humana Press. Por ejemplo, de manera similar al proceso de fabricación de MF59, la fase de aceite y la fase acuosa de la emulsión pueden combinarse y procesarse en un homogeneizador de estator giratorio, o un homogeneizador en línea, para producir una emulsión gruesa. La emulsión gruesa puede ser luego alimentada a un microfluidizador, en donde puede procesarse más para obtener una emulsión en submicras estable. La emulsión gruesa puede pasarse a través de la cámara de interacción del microfluidizador repetidamente hasta que se obtenga el tamaño de partícula deseado. La emulsión global puede ser luego filtrada (por ejemplo, a través de un filtro de 0.22 µt? bajo nitrógeno) para remover partículas grandes, produciendo un volumen de emulsión que pueda ser llenado en recipientes adecuados (por ejemplo, botellas de vidrio) . Para antígenos de vacuna que hayan demostrado estabilidad a largo plazo en presencia de emulsión de aceite en agua para autoalmacenamiento, el antígeno y emulsión pueden combinarse y filtrarse estérilmente (por ejemplo, a través de una membrana de filtración de 0.22 µp?) . La vacuna de un solo frasco combinada puede ser llenada en recipientes de una sola dosis. Por antígenos de vacuna en donde la estabilidad a largo plazo aún no ha sido demostrada, la emulsión puede demostrarse como un vial separado. En tales casos, el grueso de la emulsión puede ser filtrado y esterilizado (por ejemplo, a través de una membrana de filtración de 0.22 \xm) , llenado y envasado en viales de una sola dosis finales.
El control de calidad puede llevarse a cabo opcionalmente en una muestra pequeña del volumen de emulsión o vacuna mezclada, y el volumen o vacuna mezclada se envasará en dosis sólo si la muestra pasa la prueba de control de calidad. 6. Kits, composiciones farmacéuticas y administración En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una molécula cargada negativamente (tal como ARN) complejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, como la descrita en la presente, y puede comprender además uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. En modalidades preferidas, la composición farmacéutica es una composición inmunogénica, la cual se puede usar como una vacuna .
Como alternativa, las composiciones descritas en la presente pueden usarse para suministrar una molécula cargada negativamente a células. Por ejemplo, moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) pueden ser suministradas a células para una variedad de propósitos, tales como para inducir la producción de un producto génico deseado (por ejemplo, proteína) , para regular la expresión de un gen, para terapia génica y similares. Las composiciones descritas en la presente también se pueden usar para suministrar una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) a células para efectos terapéuticos, tal como para tratar una enfermedad tal como cánceres o trastornos proliferativos , enfermedades metabólicas, enfermedades cardiovasculares, infecciones, alergias, para inducir una respuesta inmunitaria y similares. Por ejemplo, moléculas de ácido nucleico pueden ser suministradas a células para inhibir la expresión de un gen objetivo. Estas moléculas de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, moléculas de ARN de doble hebra, tales como ARNs de interferencia pequeños y similares. Las moléculas de ARN de doble hebra, tales como moléculas de ARN de interferencia pequeñas, pueden desencadenar la interferencia de ARN, lo cual silencia específicamente al gen objetivo correspondiente (supresión génica) . Los oligonucleótidos antisentido son hebras individuales de ADN o ARN que son complementarias a una secuencia seleccionada. Generalmente, el ARN anti-sentido puede evitar la traducción de proteínas de ciertas hebras de ARN mensajero al unirse a ellas. ADN anti-sentido se puede usar para dirigirse a un ARN complementario y específico (de codificación o no codificación) . Por lo tanto, las emulsiones catiónicas descritas en la presente son útiles para suministrar oligonucleótidos antisentido o moléculas de ARN de doble hebra para el tratamiento de, por ejemplo, cáncer al inhibir la producción de un objetivo de oncología.
La invención también proporciona kits, en donde la molécula cargada negativamente (tal como ARN) y la emulsión catiónica de aceite en agua están en recipientes separados. Por ejemplo, el kit puede contener un primer recipiente que comprenda una composición que comprenda la molécula cargada negativamente (tal como ARN) , y un segundo recipiente que comprenda la emulsión catiónica de aceite en agua. Los dos componentes pueden ser mezclados antes de su administración, por ejemplo, dentro de aproximadamente 72 horas, alrededor de 48 horas, aproximadamente 24 horas, alrededor de 12 horas, aproximadamente 10 horas , alrededor de 9 horas , aproximadamente 8 horas , al ededor de 7 horas , aproximadamente 6 horas , alrededor de 5 horas , aproximadamente 4 horas , alrededor de 3 horas , aproximadamente 2 horas, alrededor de 1 hora, aproximadamente 45 minutos, alrededor de 30 minutos, aproximadamente 15 minutos, alrededor de 10 minutos, aproximadamente 5 minutos antes de su administración. Los dos componentes también se pueden mezclar aproximadamente 1 minuto o inmediatamente antes de su administración.
La molécula cargada negativamente (por ejemplo, ARN) puede estar en forma líquida o puede estar en forma sólida (por ejemplo, liofilizada) . Si está en forma sólida, el kit puede comprender un tercer recipiente que comprenda una solución acuosa adecuada para rehidratar la molécula cargada negativamente. Soluciones acuosas adecuadas incluyen reguladores de pH farmacéuticamente aceptables tales como solución salina de pH regulado con fosfato, solución de Ringer, solución de dextrosa o cualquiera de las soluciones acuosas descritas arriba. En ciertas modalidades, se puede usar agua estéril como la solución acuosa para rehidratación, en particular en casos en los que componentes adicionales, tales como agentes tonificantees y/o agentes de ajuste de osmolaridad sean liofilizados junto con la molécula cargada negativamente (por ejemplo, ARN) . Como alternativa, la molécula cargada negativamente liofilizada (por ejemplo, ARN) puede mezclarse directamente con la emulsión catiónica.
Si la composición (por ejemplo, una vacuna) comprende una molécula cargada negativamente (por ejemplo, ARN) y un componente adicional, tal como un inmunógeno de proteína, ambos componentes pueden ser congelados y liofilizados (ya sea por separado, o como una mezcla) , y reconstituidos y mezclados con la emulsión catiónica antes de su administración.
El kit puede comprender además otros materiales útiles para el usuario final, incluyendo otras soluciones de formulación farmacéuticamente aceptables tales como reguladores de pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas u otro dispositivo de suministro. Por ejemplo, el kit puede incluir una jeringa de doble cámara que contenga agua o la emulsión en una cámara, y la molécula cargada negativamente (por ejemplo, ARN) se proporciona en forma sólida (por ejemplo, liofilizada) en la otra cámara.
El kit puede incluir además otro recipiente que comprenda un adyuvante (tal como un adyuvante que contenga aluminio o MF59) . En general, los adyuvantes que contienen aluminio no se prefieren porque pueden interferir con la complej ación de la molécula cargada negativamente con la emulsión catiónica.
Los recipientes adecuados para las composiciones incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales, incluyendo vidrio o plástico. Un recipiente puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser un bolsa para solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . También se puede usar una jeringa de doble cámara, en donde la molécula cargada negativamente (por ejemplo, AKN) sea liofilizada, y ya sea reconstituida con agua en la jeringa, o reconstituida directamente con una emulsión catiónica descrita en la presente.
El kit también puede comprender un inserto de envase que contenga instrucciones escritas para métodos para inducir inmunidad o para tratar infecciones. El inserto de envase puede ser un inserto de envase en borrador no aprobado o puede ser un inserto de envase aprobado por la administración de alimentos y fármacos (FDA) u otro cuerpo regulador.
La invención también proporciona un dispositivo de suministro prellenado con las composiciones descritas arriba.
Las composiciones farmacéuticas provistas en la presente pueden ser administradas individualmente o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. El método de administración incluye, pero no está limitado a, administración oral, administración rectal, administración parenteral, administración subcutánea, administración intravenosa, administración intravítrea, administración intramuscular, inhalación, administración intranasal, administración tópica, administración oftálmica o administración ótica.
Una cantidad terapéuticamente efectiva de las composiciones descritas en la presente variará dependiendo de, entre otras, la enfermedad indicada, la severidad de la enfermedad, la edad y salud relativa del sujeto, la potencia del compuesto administrado, el modo de administración y el tratamiento deseado.
En otras modalidades, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden ser administradas en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales pueden incluir, pero no están limitados a antibióticos o agentes antibacterianos, agentes antieméticos, agentes antifúngicos , agentes antiinflamatorios, agentes antivirales, agentes inmunomoduladores , citosinas, antidepresivos, hormonas, agentes alquilantes, antimetabolitos , antibióticos antitumor, agentes antimitóticos , inhibidores de topoisomerasa, agentes citostáticos, agentes anti-invasión, agentes antiangiogénicos, de inhibidores de la función de factor de crecimiento, inhibidores de replicación viral, inhibidores de enzimas virales, agentes anticáncer, a-interferones , ß-interferones , ribavirina, hormonas y otros moduladores de receptores tipo toll, inmunoglobulinas (Igs) , y anticuerpos que modulen la función de Ig (tales como anti-IgE (omalizumab) ) .
En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas provistas en la presente se usan en el tratamiento de enfermedades infecciosas incluyendo, pero no limitadas a, enfermedad causada por los patógenos descritos en la presente, incluyendo enfermedades virales tales como verrugas genitales, verrugas comunes, verrugas plantares, rabia, virus sincitial respiratorio (RSV) , hepatitis B, hepatitis C, virus del dengue, fiebre amarilla, virus del herpes simple (a manera de ejemplo únicamente, HSV-I, HSV-II, CMV, o VZV) , molluscu contagiosum, virus de la viccinia, viruela, lentivirus, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , virus del papiloma humano (HPV) , virus de la hepatitis (virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis A) , citomegalovirus (CMV) , virus de la varicela zoster (VZV) , rinovirus, enterovirus (por ejemplo, EV71) , adenovirus, coronavirus (por ejemplo, SARS) , influenza, para- influenza, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubéola, papovavirus , hepadnavirus , flavivirus , retrovirus , arenavirus (a manera de ejemplo únicamente, LCM, virus Junin, virus Machupo, virus Guanarito y de la fiebre de Lassa) y filovirus (a manera de ejemplo únicamente, virus del ebola o virus de marburg) .
En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas provistas en la presente se usan en el tratamiento de infecciones bacterianas, fúngicas y protozoarias incluyendo, pero no limitadas a, paludismo, tuberculosis y micobacterium avium, lepra; pneumocystis camii, criptosporidiosis, histoplasmosis, toxoplasmosis , infección por tripanoso as , leishmaniasis , infecciones causadas por bacterias de los géneros Escherichia, Enterobacter, Salmonella, Staphylococcus , Klebsiella, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus y Chlamydia, e infecciones fúngicas tales como candidiasis , aspergilosis , histoplasmosis y meningitis criptocócica .
En ciertas modalidades , las composiciones farmacéuticas provistas en la presente se usan en el tratamiento de enfermedades y/o trastornos respiratorios , trastornos dermatológicos , enfermedades y/o trastornos oculares , enfermedades y/o trastornos genitourinarios incluyendo rechazo de aloinj ertos , autoinmunes y alérgicos , cáncer o piel dañada o en envej ecimiento tal como cicatrización y arrugas .
En otro aspecto , la invención proporciona un método para generar o potenciar una respuesta inmunitaria en un suj eto que lo requiera , tal como un mamífero, que comprende administrar una cantidad efectiva de una composición como la descrita en la presente . La respuesta inmunitaria es de preferencia protectora y preferiblemente incluye anticuerpos y/o inmunidad mediada por células . El método se puede usar para inducir una respuesta inmunitaria primaria y/o para reforzar una respuesta inmunitaria .
En ciertas modalidades , las composiciones descritas en la presente se pueden usar como un medicamento, por ejemplo, para usarse en provocar o incrementar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo requiera, tal como un mamífero.
En ciertas modalidades, las composiciones descritas en la presente pueden usarse en la fabricación de un medicamento para generar o potenciar una respuesta inmunitaria en un sujeto que lo requiera, tal como un mamífero.
El mamífero es de preferencia un humano, pero puede ser, por ejemplo, una vaca, un cerdo, un pollo, un gato o un perro, toda vez que los patógenos cubiertos en la presente pueden ser problemáticos a través de una amplia variedad de especies . Cuando la vacuna sea para uso profiláctico, el humano es de preferencia un niño (por ej emplo , un niño pequeño o bebé) , un adolescente o un adulto ; cuando la vacuna sea para uso terapéutico, el humano es de preferencia un adolescente o un adulto . Una vacuna destinada para niños también puede administrarse a adultos , por ej emplo, para evaluar seguridad, dosif icación, inmunogenicidad, etc .
Una manera de revisar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorear la infección por patógenos después de la administración de las composiciones o vacunas descritas en la presente. Una manera de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico incluye monitorear respuestas inmunitarias , sistémicamente (tal como monitorear el nivel de producción de IgGl e IgG2a) y/o mucosalmente (tal como monitorear el nivel de producción de IgA, contra el antígeno. Típicamente, las respuestas de anticuerpos de suero específicos de antígenos son determinadas post-inmunización pero preataque mientras que las respuestas a anticuerpos de mucosas específicos de antígenos se determinan post-inmunización y post-ataque.
Otra forma de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones o vacunas descritas en la presente cuando la molécula de ácido nucleico (por ejemplo, el ARN) codifique para un antígeno de proteínas es la de expresar el antígeno de proteínas recombinantemente para analizar sueros de pacientes o secreciones mucosas por inmunoblot y/o microdisposiciones . Una reacción positiva entre la proteína y la muestra de paciente indica que el paciente ha montado una respuesta inmunitaria a la proteína en cuestión. Este método también se puede usar para identificar antígenos inmunodominantes y/o epítopos dentro de los antígenos de proteínas.
La eficacia de las composiciones también se puede determinar in vivo al atacar modelos animales adecuados del patógeno de infección de interés.
La dosis puede ser mediante un solo programa de dosis o un programa de varias dosis. Dosis múltiples pueden usarse en un programa de inmunización primario y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiples las diferentes dosis pueden darse por la misma o diferentes rutas, por ejemplo, una primera parenteral y refuerzo de mucosas, una primera en mucosas y refuerzo parenteral, etc. varias dosis típicamente se administrarán al menos 1 semana aparte (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, alrededor de 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, alrededor de 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, alrededor de 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, alrededor de 16 semanas, etc.) .
En ciertas modalidades, la cantidad total de lípido catiónico, tal como DOTAP, que se administre al sujeto en una sola administración no es mayor que aproximadamente 30 mg, o no más de alrededor de 24 mg.
En ciertas modalidades, la cantidad total de lípido catiónico, tal como DOTAP, que se administra al sujeto en una sola administración no es mayor que 4 mg.
Las composiciones descritas en la presente que incluyen uno o más antígenos o se usan en conjunto con uno o más antígenos pueden usarse para tratar tanto niños como adultos. Así, un sujeto humano puede tener menos de 1 año de edad, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad o al menos 55 años de edad. Los sujetos preferidos para recibir las composiciones son los ancianos (por ejemplo, > 50 años de edad, > 60 años de edad y de preferencia > 65 años) , los jóvenes (por ejemplo, < 5 años de edad) , pacientes hospitalizados, trabajadores de cuidado de salud, fuerzas armadas y personal militar, mujeres embarazadas, aquellos crónicamente enfermos o pacientes inmunodeficientes . Las composiciones no son adecuadas únicamente para estos grupos, sin embargo, y se pueden usar más generalmente en una población.
Las composiciones descritas en la presente que incluyen uno o más antígenos o se usan en conjunto con uno o más antígenos pueden administrarse a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta o visita médica a un profesional del cuidado de salud o centro de vacunación) otras vacunas, por ejemplo sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna para sarampión, una vacuna para paperas, una vacuna para rubéola, una vacuna para MMR, una vacuna para varicela, una vacuna para MMRV, una vacuna para difteria, una vacuna para tétenos, una vacuna para tosferina, una vacuna para DTP, una vacuna para H. influenzae tipo b conjugada, una vacuna para poliovirus inactivada, una vacuna para virus de la hepatitis B, una vacuna conjugada meningocócica (tal como vacuna A C W135 Y tetravalente) , una vacuna para virus sincitial respiratorio, etc.
En ciertas modalidades, las composiciones provistas en la presente incluyen o incluyen opcionalmente uno o más agentes inmunorreguladores tales como adyuvantes. Ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no están limitados a, un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2 , descritos más abajo. En ciertas modalidades, los adyuvantes usados en las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente incluyen, pero no están limitados a: 1. Composiciones que contienen minerales; 2. Emulsiones de aceite; 3. Formulaciones de saponina; 4. Virosomas y partículas tipo virus; 5. Derivados bacterianos o microbianos; 6. Bioadhesivos y mucoadhesivos ; 7. Liposomas ; 8. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno; 9. Polifosfaceno (PCPP) ; 10. Péptidos de muramilo; 11. Compuestos de imidazoquinolona ; 12. Compuestos de tiosemicarbazona; 13. Compuestos de triptantrina; 1 . Inmunomoduladores humanos 15. Lipopéptidos ; 16. Benzonaftiridinas ; 17. Micropartículas ; 18. Polinucleótido imunoestimulador (tal como ARN o ADN; por ejemplo, oligonucleótidos que contengan CpG) .
Ej emplificación La invención habiendo sido ahora descrita generalmente, se entenderá más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos, los cuales se incluyen simplemente para efectos de ilustración de ciertos aspectos y modalidades de la presente invención, y no se intenta que limiten la invención .
Ejemplo 1: Desarrollo de emulsiones catiónicas de aceite en agua En este ejemplo, se desarrollaron nanoemulsiones catiónicas (denominadas aquí "CNEs") que contienen altas concentraciones de lípido catiónico (DOTAP) para el suministro de ARN de autoreplicación .
Las formulaciones CNE se resumen en la siguiente tabla 1, y se modificaron con base en CNE01. Se usaron CNE01, CMF40, CNE16 , CNE02 y CNE17 como muestras de referencia para estudios comparativos.
Tabla 1 CNEs Fueron preparadas de manera similar a F59 cargado como se describió previamente (Ott et al., Journal of Controlled Reléase, volumen 79, páginas 1-5, 2002) , con una modificación principal. Se disolvió DOTAP en el escualeno directamente, y no se usó solvente orgánico. Se descubrió que la inclusión de un solvente en emulsiones que contenían más de 1.6 mg/ml de DOTAP producía una corriente de alimentación espumosa que no podía ser microfluidizada para producir una emulsión. El calentamiento de escualeno a 37°C permitió que DOTAP fuera directamente disuelto en escualeno, y luego la fase de aceite pudo ser dispersa exitosamente en la fase acuosa (por ejemplo, por homogeneización) para producir una emulsión. DOTAP Es soluble en escualeno y concentraciones más altas de DOTAP en escualeno que aquellas listadas en la tabla 1 pueden ser logradas. Sin embargo, se ha reportado que altas dosis de DOTAP pueden tener efectos tóxicos. Véase, por ejemplo, Lappalainen et al., Pharm. Res., vol. 11 (8) : 1127-31 (1994).
Brevemente, escualeno se calentó a 37°C y DOTAP se disolvió directamente en escualeno en presencia de SPAN85. La fase de aceite resultante se combinó después con la fase acuosa (Tween 80 en regulador de pH de citrato) e inmediatamente se homogeneizó durante 2 minutos usando un homogeneizador IKA T25 a 24K RPM para producir una corriente de alimentación homogénea (emulsiones primarias) . Las emulsiones primarias fueron pasadas 3 a 5 veces a través de un microfluidizador M-110S o un microfluidizador M-110P (Microfluidics , Newton, A) con una bobina de enfriamiento por baño de hielo a una presión de homogeneización de aproximadamente 1,054-1,406 kg/cm2 (15K-20K PSI) . Las muestras de lote de 20 mi fueron retiradas de la unidad y almacenadas a 4°C.
Se debe notar que las concentraciones de los componentes de las CNEs, como se describe en la tabla 1, son concentraciones calculadas de acuerdo con las cantidades iniciales de estos componentes que se usaron para preparar las emulsiones. Se entiende que durante el proceso de producir emulsiones, o durante el proceso de esterilización en filtro, pequeñas cantidades de escualeno, DOTAP u otros componentes pueden perderse, y las concentraciones reales de estos componentes en el producto final (por ejemplo, una emulsión envasada y esterilizada que esté lista para administración) debe ser ligeramente más baja, típicamente en hasta alrededor de 20%, algunas veces en hasta alrededor de 25%, o hasta aproximadamente 35%. Sin embargo, la práctica convencional en la técnica es describir la concentración de un componente particular con base en la cantidad inicial que se use para preparar la emulsión, en lugar de la concentración real en el producto final.
La siguiente tabla 2 muestra la diferencia entre las concentraciones "teóricas" de escualeno y DOTAP (calculadas de acuerdo con las cantidades iniciales de escualeno y DOTAP que fueron usadas para preparar las emulsiones) , y las concentraciones reales de escualeno y DOTAP medidas en el producto final.
Tabla 2 Ejemplo 2: Preparación de complejos ARN-partícula 1. Síntesis de ARN ADN plasmídico que codificaba para un replicón de alfa virus (ARN de autoreplicación) se usó como una plantilla para la síntesis de ARN in vitro. Cada replicón contiene los elementos genéticos necesarios para la replicación de ARN pero carece de secuencias que codifican para productos génicos que son necesarios para el ensamble de partículas. Los genes estructurales del genoma del alfa virus fueron reemplazados por secuencias que codifican para una proteína heteróloga ( cuya expresión es conducida por el promotor subgenómico de alfa virus ) . Después del suministro de los repl icones a células eucarióticas , el ARN de célula posit iva se traduce para producir cuatro proteínas no estructurales , las cuales repl ican j untas el ARN genómico y transcriben abundantes moléculas de ARN subgenómicas que codi f ican para la proteína heteróloga . Debido a la falta de expresión de las proteínas estructurales de alfa virus , los replicones son incapaces de generar partículas infecciosas . Un promotor de bacteriófago T7 se ubica hacia el extremo 5' del ADNc de alfa virus para facilitar la síntesis del ARN de replicón in vitro, y la ribozima de virus delta de la hepatitis (HDV) ubicada inmediatamente hacia el extremo 3 ' de la cola poli (A) genera el extremo 3' correcto a través de su actividad de autocorte .
Después de la linearización del ADN plasmídico hacia el extremo 3 ' de la ribozima HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, transcritos que se derramaban fueron sintetizados in vitro usando ARN polimerasa dependiente de ARN derivada de bacteriófago T7 o SP6 . Las transcripciones se llevaron a cabo durante 2 horas a 37°C en presencia de 7 . 5 mM (ARN pol imerasa T7 ) o 5 mM (ARN pol imerasa SP6 ) de concentración f inal de cada uno de los trifosfatos de nucleósido (ATP , CTP , GTP y UTP) siguiendo las instrucciones provistas por el manufacturante (Ambion, Aust in, TX) . Después de la transcripción , el ADN de planti lla se digi rió con TURBO DNase (Ambion , Austin , TX) . El ARN de repl icón se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua libre de nucleasa. ARN No tapado fue tapado post-transcripcionalmente con enzima de tapado de Vaccinia (VCE) usando el ScriptCap m7G Capping System (Epicentre Biotechnologies , Madison, I) como se detalla en el manual de usuario. El ARN tapado después de la transcripción se precipitó con LiCl y se reconstituyó en agua libre de nucleasa. Como alternativa, los replicones pueden ser bloqueados al complementar las reacciones de transcripción con 6 mM (para ARN polimerasa T7) o 4 mM (para ARN polimerasa SP6) m7G ( 5 ' ) ppp (5 ' ) G, un análogo de estructura de tapa no reversible (New England Biolabs, Beverly, MA) y reduciendo la concentración de trifosfato de guanosina a 1.5 mM (para ARN polimerasa T7) o 1 mM (para ARN polimerasa SP6) . Los transcritos pueden ser luego purificados por digestión con TURBO DNase (Ambion, Austin, TX) seguid por precipitación con LiCL y un lavado en 75% de etanol .
La concentración de las muestras de ARN se determinó al medir la densidad óptica a 260 nm. La integridad de los transcritos in vi ro se confirmó por electroforesis en gel con agarosa de desnaturalización para la presencia de la construcción de longitud completa. 2. Complejación de ARN El término relación N/P se refiere a la cantidad de nitrógeno en el lípido catiónico en relación a la cantidad de fosfatos en el ARN. El nitrógeno es el elemento portador de carga dentro de los lípidos catiónicos probados. El fosfato puede encontrarse en el esqueleto del ARN. Una relación de carga N/P de 10/1 indica que hay 10 nitrógenos cargados positivamente del lípido catiónico presente para cada fosfato cargado negativamente en el ARN.
El número de nitrógenos en solución se calculó a partir de la concentración de lípido catiónico, DOTAP por ejemplo tiene un nitrógeno que puede ser protonado por molécula. La concentración de ARN se usó para calcular la cantidad de fosfato en solución usando un estimado de 3 mmoles de fosfato por microgramo de ARN. Al variar la cantidad de ARN: lípido, la relación N/P puede ser modificada. ARN Fue complejado a las CNEs en un intervalo de relaciones nitrógeno/fosfato (N/P). El cálculo de la relación N/P se hizo al calcular el número de moles de nitrógenos protonables en la emulsión por mililitro. Para calcular el número de fosfatos, se usó una constante de 3 nmoles de fosfato por microgramo de ARN. Una vez que se determinaron los valores, la relación adecuada de la emulsión se añadió al ARN. Usando estos valores, el ARN fue diluido hasta la concentración adecuada y añadido directamente a un volumen igual de emulsión mientras se remolinaba ligeramente. La solución se dejó asentar a temperatura ambiente durante alrededor de 2 horas. Una vez complejada la solución resultante se diluyó hasta la concentración adecuada y se usó dentro de 1 hora. 3. Ensayo de tamaño de partícula El tamaño de partícula de la emulsión se midió usando un Zetasiser Nano ZS (Malvern Instruments, orcestershire, RU) de acuerdo con las instrucciones del manufacturante. Los tamaños de partícula se reportan como el promedio Z (ZAve) con el índice de polidispersidad (pdi) . Todas las muestras fueron diluidas en agua antes de las mediciones. Además, el tamaño de partícula de la emulsión se midió usando un dimensionador de partículas Horiba LA- 930 (Horiba Scientific, E.U.A.). Las muestras fueron diluidas en agua antes de las mediciones. El potencial Z se midió usando Zetasizer Nano ZS usando muestras diluidas de acuerdo con las instrucciones del manufacturante. 4. Partículas de replicón viral (VRP) Para comparar vacunas de ARN con enfoques de vectores de ARN tradicionales para lograr expresión in vivo de genes reporteros o antígenos, utilizamos partículas de replicón viral (VRPs) producidas en células BHK mediante los métodos descritos por Perri et al., J. Virol. 77:10394-10403 (2003)). En este sistema, los replicones de antígeno (o gen reportero) consistieron en replicones quiméricos de alfa virus (VCR) derivados del genoma de virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV) manipulados para contener las secuencias 3' terminales (3' UTR) de virus Sindbis y una señal de empaque de virus Sindibs (PS) (véase figura 2 de Perri S., et al., J Virol 77:10394-10403 (2003)). Estos replicones fueron empacados en VRPs al co-electroporarlos en células de riñon de hámster bebé (BHK) junto con moléculas de ARN auxiliares defectuosas que codificaban para cápside de virus sindbis y genes de glicoproteína (véase figura 2 de Perri et al . ) . Las VRPs fueron luego cosechadas y tituladas mediante métodos estándares e inoculadas en animales en fluido de cultivo u otros reguladores de pH isotónicos.
Ejemplo 3: El efecto de la concentración de DOTAP en inmunogenicidad Este ejemplo muestra que las emulsiones catiónicas de aceite en agua hechas con altas concentraciones de DOTAP incrementaron la inmunogenicidad de un replicón de ARN que codifica para el antígeno de RSV-F en un modelo de ratón. 1. Materiales y métodos Ensayos de unión a heparina ARN fue complejado como se describió arriba. El complejo ARN/CNE se incubó con varias concentraciones de sulfato de heparina (Alfa Aesar, Ward Hill MA) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las soluciones resultantes fueron luego puestas en una centrífuga de alta velocidad Airfuge (Beckman Coulter, Brea, CA) durante 15 minutos. Los tubos centrífugos fueron perforados con una jeringa de tuberculina y el subnadante fue removido. La solución se ensayó después para concentración de ARN usando el ensayo Ribogreen (Invitrogen, Carlsbad CA) de acuerdo con las instrucciones del manufacturante. Las muestras se analizaron en un lector de placa fluorescente Biotek Synergy 4 (Winooski, VT) . Los valores de ARN libre se calcularon usando una curva estándar. 2. El efecto de la concentración de DOTAP en interacciones ARN-partícula La tabla 3 muestra el efecto de la concentración de DOTAP en interacciones ARN-partícula (según se determina por el ensayo de unión a heparina, el cual midió la estrechez de las interacciones ARN-partícula) e inmunogenicidad.
Tabla 3 nt = no probado Como se muestra en la tabla 3, las moléculas de ARN se unieron fuertemente a partículas de emulsión que se hicieron con altas concentraciones de DOTAP (1.8 mg/mL o más altas) . 3. El efecto de la concentración de DOTAP en carga de ARN La tabla 4 muestra el efecto de la concentración de DOTAP en carga de ARN. Incrementar la concentración de DOTAP dio como resultado una cantidad más alta de moléculas de ARN que son formuladas en complejos ARN-partícula .
Tabla 4 4. El efecto de la concentración de DOTAP en inmunogenicidad La tabla 5 muestra el efecto de la concentración de DOTAP en la inmunogenicidad del antígeno RSV F en un modelo de ratón in vivo.
El replicón vA317 que expresa la glicoproteína de fusión en superficie de RSV (RSV-F) se usó para este estudio. Ratones BALB/c, edad 8-10 semanas y con un peso de aproximadamente 20 g, 10 animales por grupo, fueron administrados con vacunas intramusculares bilaterales. Todos los animales fueron inyectados en el cuádriceps en las dos patas traseras cada uno obteniendo un volumen equivalente (50 µ?? por pierna) los días 0 y 21 con ARN autorepl icant e desnudo que expresaba RSV-F (vA317, 1 µg) , 1 i ¡ de A317 formulado en un liposoma que contenía 40% de DlinDMA, 10% de DSPC, 48% de Chol, 2% de PEG DMG 2000 (RV01 (15)), o ARN autoreplicante formulado en las CNEs indicadas (1 µ9 de vA317) . Para cada administración, las formulaciones se prepararon frescamente. Se recolectó suero para análisis de anticuerpos los días (2wpl) y 35 (2wp2) .
Como se muestra en la tabla 5, incrementar la concentración de DOTAP se tradujo en que una cantidad más alta de ARN fuera cargada a las partículas de emulsión, lo cual a su vez incrementó la respuesta inmunitaria del anfitrión. Un incremento de 3 veces en título de anticuerpo (a 2 p2) para CMF31 se observó en comparación con CNE17. En este modelo, una meseta en inmunogenicidad fue observada a 2.6 mg/mL de DOTAP (CMF31) .
Cuando las cantidades de ARN y DOTAP administradas a cada ratón se mantuvieron constantes (significando para emulsiones con concentraciones más altas de DOTAP, se usaron volúmenes más pequeños de emulsión para preparar el complejo ARN/emulsión; luego, antes de la inmunización, las formulaciones de ARN/emulsión fueron diluidas de tal manera que los volúmenes de las formulaciones de ARN/emulsión inyectadas al ratón fueran los mismos), los títulos de IgG totales específicos de F fueron comparables con diferentes formulaciones de CNE (tabla 6) . Se usó el replicón de vA317 para todas las formulaciones de CEN . Las moléculas de ARN se hicieron con el kit Ambion. Los datos de GMT reflejan el título medio geométrico de ratones individuales en cada grupo (8 ratones/grupo) . El resultado demuestra que una cantidad más pequeña de las formulaciones se requirió para emulsiones con concentraciones más altas de DOTAP.
Tabla 6 Los títulos de suero preinmunización contenían títulos indetectables .
Cuando la cantidad de escualeno y relación N/P (DOTAP: ARN) administrada a cada ratón se mantuvieron constantes, los títulos de IgG total específicos de F se incrementaron al incrementarse la cantidad de ARN y DOTAP en las formulaciones (tabla 7) . El replicón de vA317 se usó para todas las formulaciones de CNE. Las moléculas de ARN se hicieron con el kit Ambion. Los datos de GMT reflejan el título medio geométrico de ratones individuales en cada grupo (8 ratones/grupo) . El resultado muestra que incrementar la concentración de DOTAP en que una cantidad más alta de ARN se cargara en las partículas de emulsión, lo cual a su vez incrementó la respuesta inmunitaria del anitrión.
Tabla 7 CMF32 y CMF34 se estudiaron más usando diferentes relaciones N/P. La tabla 8 muestra los títulos de IgG total específicos de F de las formulaciones . Las relaciones N/P teóricas reflejan las relaciones N/P calculadas de acuerdo con las cantidades iniciales de DOTAP y ARN que se usaron para preparar las formulaciones. Las relaciones N/P reales fueron ligeramente más bajas que las relaciones N/P teóricas debido a que pequeñas cantidades de DOTAP se perdieron durante la preparación de las emulsiones. El vA317 se usó para todas las formulaciones de CNE y CMF. Los datos de GMT reflejan el título logio medio de ratones individuales en cada grupo (8 ratones/grupo) . Todas las formulaciones fueron ajustadas a 300 mOsm/kg con sacarosa. No se observaron aspectos de tolerabilidad obvios (por ejemplo, peso corporal, citocinas séricas tempranas) ya sea con las formulaciones de CMF32 o CMF34.
Las relaciones N/P reales se determinaron al cuantificar el contenido de DOTAP en lotes de CNE o CMF usando HPLC con un detector de aerosol cargado (Corona Ultra. Chelmsford, MA) . Las muestras de CNE y CMF se diluyeron en isopropanol y se inyectaron en una columna XTera C18 4.6 x 150 mm, 3.5 um (Waters, Milford, MA) . El área bajo la curva se tomó a partir del pico de DOTAP en el cromatograma y la concentración se interpoló fuera de una curva estándar de DOTAP. Usando la concentración de DOTAP real, se calculó una relación N/P real.
Tabla 8 Ejemplo : El efecto de la concentración de DOTAP en inmunogenicidad Este ejemplo demuestra que las emulsiones catiónicas de aceite en agua hechas con altas concentraciones de DOTAP incrementaron la inmunogenicidad de un replicón de ARN que codifica para el antígeno RSV-F en un modelo de rata algodón. 1. Materiales y métodos Replicón de ARN. La secuencia del replicón de ARN, vA142 RSV-F-delFP-ribozima completa.
Vacunación de ratas algodón. Ratas algodón hembra [Sigmodon hispidis) fueron obtenidas de Harían Laboratories. Todos los estudios se aprobaron y llevaron a cabo de acuerdo con el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Novartis. Los grupos de animales fueron inmunizados intramuscularmente (i.m., 100 µ?) con las vacunas indicadas el día 0. Muestras de suero se recolectaron 3 semanas después de cada inmunización. Animales de control inmunizados o no vacunados fueron atacados intranasalmente (i.n.) con lxlO5 PFU RSV 4 semanas después de la inmunización final.
Vacuna de subunidad del trímero RSV-F. El trímero RSV-F es una proteína recombinante que comprende el ectodominio de RSV F con una supresión de la región de péptido de fusión impidiendo la asociación con otros trímeros. La construcción resultante forma un trímero homogéneo, según se observa por cromatografía de exclusión de tamaño, y tiene un fenotipo esperado consistente con una conformación de F post- fusión como se observa por microscopía electrónica. La proteína se expresó en células de insecto o células CHO y se purificó en virtud de un marcado HIS en fusión con el extremo C-terminal de la construcción seguido por cromatografía de exclusión de tamaño usando técnicas convencionales. La muestra de proteína resultante exhibe más de 95% de pureza. Para la evaluación in vivo de la vacuna de subunidad F, 100 µg/mL de proteína de trímero fueron adsorbidos sobre 2 mg/mL de alumbre usando 10 mM de regulador de pH de histidina, pH 6.3 y la isotonicidad se ajustó con cloruro de sodio a 150 mM. La proteína de subunidad F fue adsorbida en alumbre durante la noche con agitación suave a 2-8°C.
ELISA específico de RSV F. Muestras de suero individuales se ensayaron para la presencia de IgG específica de RSV F por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) . Placas de ELISA (MaxiSorp de 96 pocilios, Nunc) fueron recubiertas durante la noche a 4°C con 1 pg/ml de RSV F purificado (delp23-furdel-trunc no cortado) en PBS . Después de lavar (PBS con 0.1% de Tween-20) , las placas fueron bloqueadas con regulador de pH de tapado Superblock PBS (Thermo Scientific) durante al menos 1.5 horas a 37°C. Las placas fueron luego lavadas, se añadieron diluciones en serie de suero en diluyente de ensayo (PBS con 0.1% de Tween-20 y 5% de suero de cabra) a partir de ratas de control experimentales o de control, y las placas se incubaron durante 2 horas a 37°C. Después de lavar, las placas se incubaron con IgG anti-rata algodón de pollo conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) (Immunology Consultants Laboratory, Inc. diluido 1:5,000 en diluyente de ensayo) durante 1 hora a 37°C. Finalmente, las placas se lavaron y 100 µ? de solución de substrato de peroxidasa TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc) se añadieron a cada pocilio. Las reacciones se detuvieron por la adición de 100 µ? de H3P0 1M, y la absorbancia se leyó a 450 nm usando un lector de placa. Para cada muestra de suero, una gráfica de densidad óptica (OD) versus logaritmo de la dilución sérica recíproca se generó por regresión muy lineal (GraphPadPrism) . Los títulos se definieron como la dilución en suero recíproca a una OD de aproximadamente 0.5 (normalizada a una norma, sueros agrupados a partir de ratas algodón infectadas con RSV con un título definido de 1:2,500, que se incluyó en cada placa). 1 1 Ensayo de micro neutralización. Muestras de suero fueron probadas para la presencia de anticuerpos neutralizantes por una prueba de neutralización de reducción de placa (PRUT) . Diluciones en serie dos veces de suero HI (en PBS con 5% de HI-FBS) fueron añadidas a un volumen igual de RSV largo previamente titulado para dar aproximadamente 115 PFU/25 µ? . Mezclas de suero/virus fueron incubadas durante 2 horas a 37°C y 5% de C02, para permitir que se presentara la neutralización del virus, y luego 25 µ? de esta mezcla (que contenía aproximadamente 115 PFU) se inocularon en pocilios duplicados de células HEp-2 en placas de 96 pocilios. Después de 2 horas a 37°C y 5% de C02 , las células fueron cubiertas con 0.75% de metilcelulosa/EMEM 5% HI-FBS e incubadas durante 42 horas. El número de partículas de virus infecciosas se determinó por la detección de la formación de sincitios por inmunotinción seguida por conteo automático. El título de neutralización se define como el recíproco de la dilución sérica que produce al menos una reducción del 60% en el número de sincitios por pocilio, en relación con controles (sin suero) . 2. El efecto de la concentración de DO AP en inmunogenicidad La tabla 9 muestra el efecto de la concentración de DOTAP en la inmunogenicidad de antígeno RSV F en un modelo de rata algodón in vivo. Las primeras dos vacunaciones usaron las formulaciones de AR/CE como las mostradas en la tabla 9. Para la tercera vacunación, 3 g de proteína de subunidad RSV F (en alumbre) se usaron para todos los animales excepto el grupo nai e.
Tabla 9 ARN Ambion MegaScript y ARN sintetizado en casa se prepararon usando diferentes procesos.
Los datos de la tabla 9 muestran que todas las formulaciones de CNE-ARN indujeron respuestas inmuni tarias dependientes de dosis en los anfitriones (títulos de IgG totales así como títulos de anticuerpo neutralizante) . Administrar formulaciones de CMF31-ARN y CMF34-ARN produjo títulos de IgG total específicos de F, y cada uno fue mayor que aquél de CNE17 a cada una de las dosis de ARN indicadas. Además, todas las formulaciones de CNE-ARN indujeron buenos títulos de anticuerpo neutralizante a 10 \ig de ARN. Los títulos de anticuerpos neutralizantes para los grupos C F31-ARN, CMF34-ARN y CNE17-ARN fueron similares, excepto por un título sorprendentemente alto para el grupo de 1 µg de ARN/CMF31.
Ejemplo 5: Evaluación de los efectos de composiciones reguladoras de pH e inmunogenicidad En este ejemplo, se prepararon varias emulsiones a base de CMF34 pero con diferentes componentes reguladores de pH .
La tabla 10 resume los resultados de estudios de inmunogenicidad en murinos cuando moléculas de ARN formuladas con CMF34 se prepararon usando diferentes sistemas reguladores de pH .
Tabla 10 * Replicón vA375 Ejemplo 6: Estabilidad de las emulsiones La estabilidad de CMF34 se evaluó al medir el diámetro promedio de las partículas de emulsión polidispersidad después de que la emulsión fue producida (T 0) y después de 1 mes a 4°C (T = 1 mes) y luego de 2 meses 4°C (T = 1 mes) . La estabilidad también se evaluó después de 3, 6 y 12 meses a 4°C. Los resultados presentados en la tabla 11 demuestran que la emulsión fue estable durante al menos 12 me Tabla 11 Ejemplo 7: Inmunogenicidad de replicones que codifican para proteínas de virus del herpes A. Proteínas de CMV Replicones de alfa virus bicistrónico y pentacistrónico que expresan complejos de glicoproteína de citomegalovirus humano (HCMV) fueron preparados, y se muestran esquemáticamente en las figuras 1 y 3. Los replicones de alfavirus se basaron en virus de la encefalitis equina venezolana (VEE) . Los replicones fueron empacados en partículas de replicones virales (VRPs) , encapsulados en nanopartículas lípidas (LNP) , o formulados con CMF34. La expresión de las proteínas de HCMV codificadas y complejos de proteínas de cada uno de los replicones se confirmó por inmunoblot, co- inmunoprecipitación, y citometría de flujo. La citometría de flujo se usó para verificar la expresión del complejo gH/gL/UL128/UL130/UL131 pentamérico a partir de replicones pentaméricos que codificaban para los componentes de proteínas del complejo, usando anticuerpos monoclonales humanos específicos para epítopos de conformación presentes en el complejo pentamérico (Macagno et al (2010), J. Virol. 84 (2) : 1005-13) . La figura 2 muestra que estos anticuerpos se unen a células BHKV transfectadas con AR de replicón que expresaba el complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131 de HCMV (A527) . Resultados similares se obtuvieron cuando células fueron infectadas con VRPs hechas a partir de la misma construcción de replicón. Esto demuestra que los replicones diseñados para expresar el complejo pentamérico de hecho expresan el antígeno deseado y no el subproducto potencial gH/gL.
Las VRPs , ARN encapsulado en LNPs, y ARN formulado con CMF34 se usaron para inmunizar ratones Balb/c por inyecciones intramusculares en el cuádriceps posterior. Los ratones fueron inmunizados tres veces, tres semanas aparte, y muestres de suero se recolectaron antes de cada inmunización así como tres semanas después de la tercera y final inmunización. Los sueros fueron evaluados en ensayos de microneutralización y para medir la potencia de la respuesta del anticuerpo neutralizante que se provocó por las vacunas. Los títulos se expresan como 50% del título neutralizante.
La inmunogenicidad de un número de diferentes configuraciones de un cásete de expresión bicistrónico para un complejo gH/gL de HCMV soluble en VRPs fue evaluada. La figura 3 muestra que VRPs que expresaban el complejo gH/gL de longitud completa anclado a membrana desarrollaron potentes anticuerpos neutralizantes a títulos ligeramente más altos que el complejo soluble (gHsol/gL) expresado a partir de un cásete de expresión bicistrónico similar. Cambiar el orden de los genes que codifican para gHsol y gL o reemplazar uno de los promotores subgenómicos con un IRES o un sitio FMDV 2A no mejoró sustancialmente la inmunogenicidad .
Para ver si los replicones bicistrónicos y pentacistrónicos que expresaban los complejos gH/gL y pentaméricos podrían desarrollar anticuerpos neutralizantes en diferentes formulaciones, ratas algodón fueron inmunizadas con replicones bicistrónicos o pentacistrónicos mezclados con CMF34. La tabla 12 muestra que los replicones en CMF34 desarrollaron títulos de anticuerpo neutralizante comparables a los mismos replicones encapsulados en LNPs .
Tabla 12 B. Proteínas VZV Ácidos nucleicos que codificaban para proteínas VZV fueron clonados en un vector de replicón VEE para producir replicones monocistrónicos que codificaban para gB, gH, gL, gE y gl , y para producir replicones bicistrónicos que codif icaban para gH/gL o gE/gl . En los replicones bicistrónicos , la expresión de cada marco de lectura abierta de VZV fue conducida por un promotor subgenómico separado.
Para preparar ARN de replicón, plásmido que codificaba para el replicón se linearizó por digestión por Pmel, y el plásmido linearizado se extrajo con fenol /cloroformo/ alcohol isoamílico, se precipitó en acetato de sodio/etanol y resuspendió en 20 µ? de agua libre de R asa.
Se preparó ARN por transcripción in vitro de 1 ug de ADN linearizado usando el kit MEGAscript (AMBION # AM1333) . Una reacción de 20 µ? se estableció de acuerdo con la instrucción del manufacturante sin análogo de tapado y se incubó durante 2 horas a 32 °C. Se añadió TURBO DNase (1 µ?) a la mezcla y se incubó durante 30 minutos a 32 °C . Agua libre de RNasa ( 30 µ? ) y solución de acetato de amonio ( 30 µ? ) fueron añadidos . La solución se mezcló y enfrió durante al menos 30 minutos a - 20 °C . Luego la solución se centrifugó a velocidad máxima durante 25 minutos a 4 °C . El sobrenadante fue descartado, y el sedimento se enjuagó con 70% de etanol , y se centrifugó de nuevo a velocidad máxima durante 10 minutos a 4 °C . El sedimento se secó al aire y se resuspendió en 50 µ? de agua libre de RNasa . La concentración de ARN se midió y la calidad se verificó en un gel desnaturalizante .
El ARN fue tapado usando el sistema de tapado ScriptCap m7G Capping System (Epicentre #SCCE0625) . La reacción se escaló al combinar el ARN y agua libre de RNasa. El ARN se desnaturalizó después durante 5-10 minutos a 65 °C. El ARN desnaturalizado fue transferido rápidamente a hielo y los siguientes reactivos fueron añadidos en el siguiente orden. Regulador de pH de tapado ScriptCap, 10 mM de GTP, 2 mM de SAM preparado fresco, inhibidor de RNasa ScriptGuard y enzima de tapado ScriptCap. La mezcla se incubó durante 60 minutos a 37°C. La reacción se detuvo al añadir agua libre de RNasa y LiCl 7.5, mezclando bien y almacenando la mezcla durante al menos 30 minutos a -20°C. Luego, la mezcla se centrifugó a velocidad máxima durante 25 minutos a 4°C, el sedimento se enjuagó con 70% de etanol, se centrifugó de nuevo a velocidad máxima durante 10 minutos a 4°C y el sedimento se secó al aire. El sedimento se resuspendió en agua libre de RNasa. La concentración de ARN se midió y la calidad se verificó en un gel desnaturalizante.
Transfección de ARN Células (células BHK-V) fueron sembradas en placas de 6 pocilios llevadas a una confluencia de 90-95% en el momento de la transfección. Para cada transfección 3 ig de ARN se diluyeron en 50 mL de medio OPTIMEM en un primer tubo. Se añadió Lipofectamine 2000 a un segundo tubo que contenía 50 mL de medio OPTIMEM. El primero y segundo tubos fueron combinados y mantenidos durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los medios de cultivo en las placas de 6 pocilios fueron reemplazados con medio fresco, y el complejo ARN-Lipofectamine se puso sobre las células, y se mezcló al mecer suavemente la placa. Las placas fueron incubadas durante 24 horas a 37°C en una incubadora de C02.
Para inmunofluorescencia, células transíectadas fueron cosechadas sembradas en una placa de 96 pocilios, y se llevó a cabo tinción intracelular usando mAbs de ratón disponibles comercialmente (intervalo de dilución 1:100 1:400) . Los sedimentos celulares se fijaron y permeabilizaron con soluciones Citofix-Citoperm. Un reactivo secundario, F(ab' )2 anti-ratón de cabra marcado con alexa488 (dilución final 1:400), fue usado.
La expresión de las proteínas de VZV gE y gl se detectó en células transíectadas con construcciones monocistrónicas (gE o gl) , y la expresión tanto de gE como de gl se detectó en células transíectadas con una construcción gE/gl bicistrónica en western blots usando anticuerpos de ratón disponibles comercialmente, 13B1 para gB y 8C4 para gl . La expresión de la proteína gB de VZV se detectó en células transíectadas con una construcción monocistrónica que codificaba para gB, por inmunofluorescencia usando anticuerpo 10G6 disponible comercialmente. La expresión del complejo de proteínas VZV gH/gL, se detectó por inmunofluorescencia en células transíectadas con gH monocistrónico y gL monocistrónico, o con una construcción gH/gL bicistrónica . El complejo gH/gL se detectó usando anticuerpo SG3 disponible comercialmente .
Estudios de inmungenicidad en murinos Grupos de 8 ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad y con un peso de aproximadamente 20 g fueron inmunizados intramuscularmente con 7.0 ó 1.0 µg de AR de replicón formulado con CMF32 o LNP (RV01) en los días 0, 21 y 42. Se tomaron muestras de sangre de los animales inmunizados 3 semanas después de la 2a inmunización y 3 semanas después de la 3a inmunización. Los grupos se muestran en la tabla 13.
Tabla 13 Respuesta inmunitaria a antígenos VZV.
Muestras de suero se probaron para la presencia de anticuerpos para gB, por tinción intracelular de células MRC- 5 transfectadas con replicón de VZV. Las células MRC-5 fueron mantenidas en medio Eagle modificado de Dulbecco con 10% de suero bovino fetal. El inoculo de la cepa Oka de VZV (obtenido de la ATCC) se usó para infectar un cultivo de células MRC-5 y células enteras infectadas fueron usadas para el subpasa e de virus. La relación entre células infectadas y no infectadas fue 1:10. Treinta horas después de la infección, las células fueron dispersas con tripsina para sembrar en una placa de 96 pocilios para llevar a cabo una tinción intracelular con fondos de sueros de ratón (escala de dilución 1:200 a 1:800) obtenidos después de la inmunización. Se usaron anticuerpos monoclonales comerciales como controles para cuantificar el nivel de infección. Los sedimentos celulares fueron preparados y permeabilizados con soluciones Citofix-Citoperm. Un reactivo secundario, F(ab' )2 anti-ratón de cabra marcado con Alexa488 fue usado (dilución final 1:400) .
Anticuerpos comerciales contra gB (10G6), gH (SG3) y gE (13B1 (SBA) 8612 (Millipore) fueron usados como controles positivos, y cada células MRC-5 infectadas teñidas intracelularmente . Sueros inmunitarios obtenidos 3 semanas después de la tercera inmunización ya sea con 1 ó 7 µ de ARN formulado con CMF32 fueron diluidos 1/200, 1/400 y 1/800 y usados para teñir intracelularmente células MRC-5 infectadas. Los resultados se muestran en la figura 4 (estudio 1, grupos 1, 5, 7, 9, 11, 13 y 15, formulación de CMF32) .
Ensayo de neutralización Cada suero de ratón inmunizado fue diluido en serie por incrementos de dos veces iniciando a 1:20 en medio de cultivo estándar, y se añadieron al volumen igual de suspensión VZV en presencia de complemento de cobayo. Después de incubación durante 1 hora a 37°C, la línea de células epiteliales humanas A549 fue añadida. Las células infectadas pueden ser medidas después de una semana de cultivo al contar placas formadas en el cultivo bajo microscopio. A partir del número de placa el porcentaje de inhibición a cada dilución de suero fue calculado. Una gráfica para cada muestra de suero se hizo al graficar el valor de % de inhibición contra la escala logarítmica del factor de dilución. Posteriormente una línea de relación aproximada entre factor de dilución y % de inhibición fue dibujada. Luego el título de neutralización al 50% se determinó como el factor de dilución cuando la línea cruzó el valor de 50% de inhibición.
La tabla 14 muestra que sueros obtenidos de ratones inmunizados con gE monocistrónico, gE/gl bicistrónico y gH/gL bicistrónico contenían títulos de anticuerpo neutralizante robustos .
Tabla 14 Ejemplo 8: La solubilidad de ácidos grasos en escualeno En este ejemplo, se examinó la solubilidad de varios ácidos grasos en escualeno, y se muestra en la tabla 15. Los ácidos grasos a cantidades indicadas (40 , 20, 10 ó 5 mg/mL) , fueron mezclados con escualeno a 60°C. En la tabla 15, (V) significa que el ácido graso fue soluble en escualeno a la concentración especificada; "x" significa que el ácido graso no fue soluble en escualeno a la concentración especificada; y "-" significa que la solubilidad del ácido graso a la concentración especificada no se probó (debido a que el ácido graso era soluble a una concentración más alta) . Una vez que los ácidos grasos fueron disueltos en escualeno, 7 las soluciones se dejaron a 4°C durante la noche. La columna marcada 4°C durante la noche muestra la solubilidad de las soluciones en las cuales cada ácido graso estuvo en su concentración más superior. Por ejemplo, el ácido oleico fue soluble en escualeno a 40 mg/ml y permaneció soluble en escualeno a 4°C durante la noche.
Tabla 15 Secuencias La secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica para ARN de vA317, que codifica para antígeno de RSV-F (SEQ ID NO: 1) .
La secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica para ARN de vA142 (SEQ ID NO : 2) .
La secuencia de nucleótidos de un ADN que codifica para ARN de vA375 (SEQ ID NO: 3) .
Vector A526: SGP-gH-SGP-gL-SGP-UL128-2A-UL130-2Amod-UL131 (SEQ ID NO: 4) .
Vector A527: SGP-gH-SGP-gL-SGP-UL128-EMCV-UL130-EV71-UL131 (SEQ ID NO: 5) .
Vector A531: SGP-gHsol-SGP-gL (SEQ ID NO: 6).
Vector A532: SGP-gHsol -2A-gL (SEQ ID NO: 7).
Vector A533: SGP-gHsol-EV71-gL (SEQ ID NO: 8).
Vector A534: SGP-gL-EV71-gH (SEQ ID NO: 9). Vector A535: SGP-342-EV71-gHsol-2A-gL (SEQ ID NO: 10) Vector A536: SGP-342-EV71-gHsol-EMCV-gL (SEQ ID NO: 11) · Vector A537: SGP-342-EV71-gL-EMCV-gHsol (SEQ ID NO: 12) .
Vector A554 : SGP-gH-SGP-gL-SGP-UL128-SGP-UL130-SGP- UL131 (SEQ ID NO: 13) .
Vector A555: SGP-gHsol-SGP-gL-SGP-UL128-SGP-UL130-SGP-UL131 (SEQ ID NO : 14) .
Vector A556: SGP-gHsol6His-SGP-gL-SGP-UL128-SGP-UL130-SGP-UL131 (SEQ ID NO: 15) .
VZV gB (SEQ ID NO: 16) .
VZV gH (SEQ ID NO: 17) .
VZV gL (SEQ ID NO: 18) .
VZV gl (SEQ ID NO: 19) .
VZV gE (SEQ ID NO: 20) .
VZV VEERep . SGPgB (SEQ ID NO: 21) .
VZV VEERep. SGPgH (SEQ ID NO: 22) .
VZV VEERep. SGPgL (SEQ ID NO: 23) .
VZV VEERep. SGPgH-SGPgL (SEQ ID NO: 24) .
VZV VEERep. SGPgE (SEQ ID NO: 25) .
VZV VEERep . SGPgl (SEQ ID NO : 26 ) .
VZV VEErep . SGPgE-SGPgl (SEQ ID NO : 27 ) .
La descripción se entiende más a fondo a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas en la misma . Las modalidades dentro de la descripción proporcionan una ilustración de modalidades de la invención y no se deben interpretar como limitando el alcance de la invención . El experto en la técnica reconoce fácilmente que muchas otras modalidades son abarcadas por la invención. Todas las publicaciones y patentes citadas en esta descripción se incorporan por referencia en su totalidad. En la medida en que el material incorporado por referencia contradiga o sea incompatible con esta descripción, la descripción sustituirá a el material . La citación de cualquier referencia en este documento no es una admisión de que tal referencia sea técnica anterior a la presente invención.
Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descrita en el presente documento. Tales equivalentes están destinados a ser abarcados por las siguientes modalidades .
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una emulsión de aceite en agua caracterizada porque comprende partículas que se dispersan en una fase continua acuosa, en donde el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm; la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, y en donde : (i) la relación de aceite : lípido catiónico (mol:mol) es al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol); (ii) la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM; y (iii) el lípido catiónico no es DC-colesterol. 2. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 150 nm. 3. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 130 nm. 4. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada porque es estable. 5. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizada porque la relación de aceite : lípido (mol:mol) es de aproximadamente 10:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol :mol) . 6. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizada porque comprende de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 8% (w/v) de aceite. 7. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada porque el aceite es escualeno o escualano. 8. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada porque las partículas comprenden además un tensioactivo. 9. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque el tensioactivo es un tensioactivo no iónico. 10. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 8 o 9, caracterizada porque el tensioactivo no es un Polietilenglicol (PEG) -lípido . 11. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8-10, caracterizada porque la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 2.5% (v/v) de tensioactivo . 12. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizada 5 porque el tensioactivo es SPA 85 (trioleato de sorbitán) , Tween 80 (polisorbato 80), o una combinación de los mismos. 13. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de aproximadamente 0.5% 0 (v/v) de Tween 80 y aproximadamente 0.5% (v/v) de SPAN85. 14. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizada porque el grupo de cabeza del lípido catiónico comprende una amina cuaternaria. $ 15. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizada porque el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1, 2-dioleoiloxi-3- (trimetilamonio) ropano (DOTAP) , 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC) , 0 cloruro de N,N-dioleoil-N, N-dimetilamonio (DODAC) , y cloruro de N- [1- (2 , 3 -dioleiloxi ) ropil] -N , N, -trimetilamonio (DOTMA) . 16. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el lípido catiónico es DOTAP. 5 IV. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la concentración de DOTAP en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.58 mM (1.8 mg/mL). 18. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la concentración de DOTAP en la emulsión es desde alrededor de 2.58 mM (1.8 mg/mL) a aproximadamente 7.16 mM (5 mg/mL). 19. Un método para preparar la emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque comprende: (a) disolver directamente el lípido catiónico en el aceite para formar una fase de aceite; (b) proporcionar una fase acuosa de la emulsión; y (c) dispersar la fase oleosa en la fase acuosa por homogeneización. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la etapa (a) comprende además calentar el aceite a una temperatura entre aproximadamente 30°C a aproximadamente 65°C. 21. Una composición caracterizada porque comprende una molécula de ARN complejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, en donde la partícula comprende un aceite que se encuentra en fase líquida a 25 °C, y un lípido catiónico; en donde: (i) la relación de aceite : lípido (mol:mol) es al menos aproximadamente 8:1 (mol:mol); (ii) la concentración de lípido catiónico en la composición es de al menos aproximadamente 1.25 mM; y (iii) el lípido catiónico no es DC-colesterol . 22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm. 23. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 150 nm. 24. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 130 nm. 25. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-24, caracterizada porque la relación N/P de la composición es de al menos aproximadamente 4:1. 26. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-24, caracterizada porque la relación N/P de la composición es de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 20:1. 27. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-24, caracterizada porque la relación N/P de la composición es de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 15:1. 28. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-27, caracterizada porque la relación de aceite : lípido (molrmol) es de aproximadamente 10:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol). 29. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-28, caracterizada porque la emulsión de aceite en agua comprende de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 5% (w/v) de aceite. 30. La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el aceite es escualeno o escualano. 31. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-30, caracterizada porque las partículas comprenden además un tensioactivo. 32. La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el tensioactivo es un tensioactivo no iónico. 33. La composición de conformidad con la reivindicación 31 ó 32, caracterizada porque el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG) -lípido . 34. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-33, caracterizada porque la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 1.25% (v/v) de tensioactivo . 35. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 31-33, caracterizada porque el tensioactivo es SPA 85 (trioleato de sorbitán) , Tween 80 (polisorbato 80), o una combinación de los mismos. 36. La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la emulsión catiónica de aceite en agua comprende aproximadamente 0.25% (v/v) de Tween 80 y aproximadamente 0.25% (v/v) de SPA 85. 37. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-36, caracterizada porque el grupo de cabeza del lípido catiónico comprende una amina cuaternaria . 38. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-36, caracterizada porque el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1,2-dioleoiloxi-3 - (trimetilamonio) propano (DOTAP) , 1 , 2 -dioleoil -sn-glicero-3 -etilfosfocolina (DOEPC) , cloruro de N,N-dioleoil-N, N-dimetilamonio (DODAC) , y cloruro de N-[l-(2,3-dioleiloxi) propil] -N, N, N-trimetilamonio (DOTMA) . 39. La composición de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque el lípido catiónico es DOTA . 40. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la concentración de DOTAP en la composición es de al menos aproximadamente 1.29 mM (0.9 mg/mL) . 41. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la concentración de DOTAP en la composición es de aproximadamente 1.29 mm (0.9 mg/mL) a aproximadamente 3.58 mM (2.5 mg/mL). 42. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-41, caracterizada porque la molécula de ARN es una molécula de ARN autoreplicante que codifica para un antígeno. 43. La composición de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque el ARN autoreplicante es un replicón de ARN derivado de alfavirus. 44. Un método para preparar una composición que comprende una molécula de ARN complejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, caracterizado porque comprende : (i) proporcionar la emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18; (ii) proporcionar una solución acuosa que comprenda la molécula de ARN; y (iii) combinar la emulsión de aceite en agua de (i) y la solución acuosa de (ii), preparando de este modo la composición. 45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la emulsión catiónica de aceite en agua de (i) y solución de ARN de (ii) se combinan en una relación de alrededor de 1:1 (v/v) . 46. El método de conformidad con la reivindicación 44 ó 45, caracterizado porque la solución acuosa que comprende la molécula de ARN comprende una sal. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la sal es NaCl . 48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la solución acuosa comprende aproximadamente 20 mM de NaCl. 49. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-48, caracterizado porque la solución acuosa que comprende la molécula de ARN es un regulador de pH. 50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el regulador de pH es un regulador de pH de citrato. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque el regulador de pH comprende aproximadamente 2 mM de citrato. 52. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-51, caracterizado porque la solución acuosa que comprende la molécula de ARN comprende un agente tonificante no iónico. 53. El método de conformidad con la reivindicación 52 , caracterizado porque el agente tonificante no iónico es un azúcar o alcohol de azúcar . 54 . El método de conformidad con la reivindicación 53 , caracterizado porque el agente tonif icante no iónico se selecciona del grupo que consiste en sacarosa , trehalosa , sorbitol , dextrosa y combinación de los mismos . 55 . El método de conformidad con la reivindicación 52 , caracterizado porque el agente tonificante no iónico es sacarosa. 56 . El método de conformidad con la reivindicación 55 , caracterizado porque la solución acuosa comprende aproximadamente 560 mM sacarosa . 57 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 44-56, caracterizado porque la solución acuosa que comprende la molécula de ARN comprende un polímero. 58 . El método de conformidad con la reivindicación 57 , caracterizado porque el polímero es Pluronic® F127 . 59 . El método de conformidad con la reivindicación 57 ó 58, caracterizado porque la solución acuosa comprende de aproximadamente 0.05% a aproximadamente 20% (w/v) de polímero. SO . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 57- 59 , caracterizado porque la solución acuosa comprende aproximadamente 1% (w/v) de Pluronic® F127 . 61 . Una emulsión de aceite en agua caracterizada porque comprende partículas que se dispersan en una fase continua acuosa , en donde la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm, el aceite está presente de 0.6% a 4% (w/v) , y la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 1.25 mM. 62. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque es estable. 63. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 61 ó 62, caracterizada porque la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM . 64. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-63, caracterizada porque el aceite es escualeno o escualano. 65. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-64, caracterizada porque la partícula comprende además un tensioactivo . 66. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada porque el tensioactivo es un tensioactivo no iónico. 67. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG) -lípido . 68. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65-67, caracterizada porque la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 2.5% (v/v) de tensioactivo . 69. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 65-68, caracterizada porque el tensioactivo es SPAN85 (trioleato de sorbitán) , Tween 80 (polisorbato 80), o una combinación de los mismos. 70. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-69, caracterizada porque el grupo de cabeza del lípido catiónico comprende una amina cuaternaria. 71. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-69, caracterizada porque el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1 , 2 -dioleoiloxi-3- (trimetilamonio) propano (DOTAP) , 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC) , cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (DODAC) , y cloruro de N- [1- (2 , 3 -dioleiloxi) ropil] -N , N, N-trimetilamonio (DOTMA) . 72. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 71, caracterizada porque el lípido catiónico es DOTAP. 73. Una composición caracterizada porque comprende una molécula de AR complejada con una partícula de la emulsión catiónica de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-72. 74. La composición de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque la relación N/P de la composición es de al menos aproximadamente 4:1. 75. La composición de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque la relación N/P de la composición es de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 20:1. 76. La composición de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada porque la relación N/P de la composición es de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 15:1. 77. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-76, caracterizada porque la molécula de ARN es una molécula de ARN autoreplicante que codifica para un antígeno. 78. La composición de conformidad con la reivindicación 77, caracterizada porque el ARN autoreplicante es un replicón de ARN derivado de alfavirus. 79. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 73-78, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas de la emulsión es de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 180 nm. 80. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-43 y 73-79, caracterizada porque la es regulada en pH y tiene un pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 8.0. 81. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-43 y 73-80, caracterizada porque además comprende una sal inorgánica, y la concentración de sal inorgánica no es mayor que 30 mM. 82. La composición de conformidad con las reivindicaciones 21-43 y 73-81, caracterizada porque además comprende un agente tonificante no iónico, y es isotónica. 83. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizada porque es estable. 84. Una composición caracterizada porque comprende una molécula de ARN complejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, en donde la composición se prepara mediante un proceso que comprende : (i) proporcionar la emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 61-72; (ii) proporcionar una solución acuosa que comprende la molécula de ARN; y (iii) combinar la emulsión de aceite en agua de (i) y la solución acuosa de (ii) , preparando de este modo la composición . 85. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-43, 73-82 y 84, caracterizada porque la molécula de ARN es un ARN policistrónico que codifica para dos o más antígenos. 86. La composición de conformidad con la reivindicación 85, caracterizada porque el ARN policistrónico es un replicón de alfavirus. 87. composición de conformidad con reivindicación 86, caracterizada porque el replicón de alfavirus contiene una primera secuencia de nucleótidos que codifica para un primer antígeno y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para un segundo antígeno, en donde la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están enlazadas operativamente a elementos de control . 88. La composición de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque la primera secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un primer elemento de control y la segunda secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un segundo elemento de control . 89. composición de conformidad con reivindicación 87 u 88, caracterizada porque además comprende una tercera secuencia de nucleótidos que codifica para una tercera proteína o fragmento de la misma, en donde la tercera secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente a un elemento de control . 90. composición de conformidad con reivindicación 89, caracterizada porque la tercera secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un tercer elemento de control . 91. La composición de conformidad con la reivindicación 89 ó 90, caracterizada porque además comprende una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica para cuarta proteína o fragmento de la misma, en donde la cuarta secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente a un elemento de control . 92. La composición de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque la cuarta secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un cuarto elemento de control . 93. La composición de conformidad con la reivindicación 91 ó 92, caracterizada porque además comprende una quinta secuencia de nucleótidos que para codifica una quinta proteína o fragmento de la misma, en donde la quinta secuencias de nucleótidos está enlazada operativamente a un elemento de control. 94. La composición de conformidad con la reivindicación 93, caracterizada porque la quinta secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un quinto elemento de control. 95. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 87-94, caracterizada porque los elementos de control se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un promotor subgenómico, un IRES, y un sitio 2A viral. 96. Un método para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto, caracterizada porque comprende administrar a un sujeto que lo requiera la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-43, 73-82 y 84-95. 97. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la cantidad total del lípido catiónico administrada al sujeto en una única administración es no más de aproximadamente 30 mg. 98. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la cantidad total de DOTAP administrada al sujeto en una única administración es no más de aproximadamente 24 mg. 99. El método de conformidad con la reivindicación 96, caracterizado porque la cantidad total de DOTAP administrada al sujeto en una única administración es no más de aproximadamente 4 mg. 100. Una emulsión de aceite en agua caracterizada porque comprende partículas que se dispersan en una fase continua acuosa, en donde el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm; la emulsión comprende un aceite y un lípido catiónico, y en donde : (i) la relación de aceite : lípido (mol:mol) es de al menos aproximadamente 4:1 (mol: mol); (ii) la concentración de lípido catiónico en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.5 mM; (iii) el aceite está presente de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 8% (w/v) ; y (iv) el lípido catiónico no es DC-colesterol. 101. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque el aceite está presente de 0.6% a 4% (w/v) . 102. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 100 ó 101, caracterizada porque el aceite está presente de aproximadamente 1% a aproximadamente 3.2% (w/v) . 103. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-102, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 150 nm. 104. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-103, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 130 nm. 105. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-104, caracterizada porque es estable. 106. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-105, caracterizada porque la relación de aceite : lípido (mol: mol) es de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol :mol) . 107. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-106, caracterizada porque el aceite es escualeno o escualano. 108. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-107, caracterizada porque además las partículas comprenden un tensioactivo . 109. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 108, caracterizada porque el tensioactivo es un tensioactivo no iónico. 110. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 108 o 109, caracterizada porque el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG) -lípido . 111. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 108-110, caracterizada porque la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 2.5% (v/v) de tensioactivo . 112. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiéra de las reivindicaciones 108-111, caracterizada porque el tensioactivo es SPAN85 (trioleato de sorbitán) , Tween 80 (polisorbato 80), o una combinación de los mismos. 113. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque la emulsión catiónica de aceite en agua comprende aproximadamente 0.5% (v/v) de Tween 80 y aproximadamente 0.5% (v/v) de SPAN85. 114. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-113, caracterizada porque el grupo de cabeza del lípido catiónico comprende una amina cuaternaria. 115. La emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-113, caracterizada porque el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1 , 2 -dioleoiloxi-3- (trimetilamonio) propano (DOTAP) , 1, 2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC) , cloruro de N, -dioleoil-N, N-dimetilamonio (DODAC) , y cloruro de N- [1- (2 , 3 -dioleiloxi) propil] -N, , N-trimetilamonio (DOTMA) . 116. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque el lípido catiónico es DOTAP. 117. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 116, caracterizada porque la concentración de DOTAP en la emulsión es de al menos aproximadamente 2.58 mM (1.8 mg/mL) . 118. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 116, caracterizada porque la concentración de DOTAP en la emulsión es desde alrededor de 2.58 mM (1.8 mg/mL) a aproximadamente 7.16 mm (5 mg/mL). 119. Un método para preparar la emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-118, caracterizado porque comprende: (a) disolver directamente el lípido catiónico en el aceite para formar una fase de aceite; (b) proporcionar una fase acuosa de la emulsión; y (c) dispersar la fase oleosa en la fase acuosa por homogeneización . 120. El método de conformidad con la reivindicación 119, caracterizado porque además la etapa (a) comprende calentar el aceite a una temperatura entre aproximadamente 30°C a aproximadamente 65 °C. 121. Una composición caracterizada porque comprende una molécula de ARN complejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, en donde la partícula comprende un aceite que se encuentra en fase líquida a 25°C, y un lípido catiónico; en donde: (i) la relación de aceite : lípido (mol:mol) es de al menos aproximadamente 4:1 (molrmol); (ii) la concentración de lípido catiónico en la composición es de al menos aproximadamente 1.25 mM; y (iii) el aceite está presente de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 4% (w/v) ; y (iv) el lípido catiónico no es DC-colesterol. 122. La composición de conformidad con la reivindicación 121, caracterizada porque el aceite está presente de 0.3% a 2% (w/v) . 123. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 121 o 122, caracterizada porque el aceite está presente de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 1.6% (w/v). 124. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-123, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 180 nm. 125. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-124, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a 150 nm. 126. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-125, caracterizada porque el diámetro promedio de las partículas es de aproximadamente 80 nm a aproximadamente 130 nm. 127. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-126, caracterizada porque la relación N/P de la composición es al menos aproximadamente 4:1. 128. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-126, caracterizada porque la relación N/P de la composición es de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 20:1. 129. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-126, caracterizada porque la relación N/P de la composición es de aproximadamente 4:1 a aproximadamente 15:1. 130. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-129, caracterizada porque la relación de aceite : lípido (mol:mol) es de aproximadamente 4:1 (mol:mol) a aproximadamente 43:1 (mol:mol). 131. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-130, caracterizada porque el aceite es escualeno o escualeno. 132. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-131, caracterizada porque además las partículas comprenden un tensioactivo . 133. La composición de conformidad con la reivindicación 132, caracterizada porque el tensioactivo es un tensioactivo no iónico. 134. La composición de conformidad con la reivindicación 132 ó 133, caracterizada porque el tensioactivo no es un polietilenglicol (PEG) -lípido . 135. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 132-134, caracterizada porque la emulsión catiónica de aceite en agua comprende de aproximadamente 0.005% a aproximadamente 1.25% (v/v) de tensioactivo. 136. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 132-135, caracterizada porque el tensioactivo es SPA 85 (trioleato de sorbitán) , Tween 80 (polisorbato 80), o una combinación de los mismos. 137. La composición de conformidad con la reivindicación 136, caracterizada porque la emulsión catiónica de aceite en agua comprende aproximadamente 0.25% (v/v) de Tween 80 y aproximadamente 0.25% (v/v) de SPA 85. 138. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-137, caracterizada porque el grupo de cabeza del lípido catiónico comprende una amina cuaternaria . 139. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-138, caracterizada porque el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en: 1, 2-dioleoiloxi-3- (trimetilamonio) propano (DOTAP) , 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-etilfosfocolina (DOEPC) , cloruro de N,N-dioleoil-N,N-dimetilamonio (DODAC) , y cloruro de N- [1-(2,3-dioleiloxi)propil] -N, N, N-trimetilamonio (DOTMA) . 140. La composición de conformidad con la reivindicación 139, caracterizada porque el lípido catiónico es DOTAP. 141. La composición de conformidad con la reivindicación 140, caracterizada porque la concentración de DOTAP en la composición es de al menos aproximadamente 1.29 mM (0.9 mg/mL) . 142. La composición de conformidad con la reivindicación 140, caracterizada porque la concentración de DOTAP en la composición es de aproximadamente 1.29 mm (0.9 mg/mL) a aproximadamente 3.58 mM (2.5 mg/mL). 143. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-142, caracterizada porque la molécula de ARN es una molécula de ARN autoreplicante que codifica para un antígeno. 144. La composición de conformidad con la reivindicación 143, caracterizada porque el ARN autoreplicante es un replicón de ARN derivado de alfavirus. 145. Un método para preparar una composición que comprende una molécula de ARN complejada con una partícula de una emulsión catiónica de aceite en agua, caracterizado porque comprende : (i) proporcionar la emulsión de aceite en agua de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 100-118; (ii) proporcionar una solución acuosa que comprenda la molécula de ARN; y (iii) combinar la emulsión de aceite en agua de (i) y la solución acuosa de (ii) , preparando de este modo la composición . 146. El método de conformidad con la reivindicación 145, caracterizado porque la emulsión catiónica de aceite en agua de (i) y la solución de ARN de (ii) se combinan en una relación de alrededor de 1:1 (v/v) . 147. La emulsión de aceite en agua de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque el aceite está presente de aproximadamente 1% a aproximadamente 3.2% (w/v) . 148. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-144, caracterizada porque la molécula de ARN es un ARN policistrónico que codifica para dos o más antígenos. 149. La composición de conformidad con la reivindicación 148, caracterizada porque el ARN policistrónico es un replicón de alfavirus. 150. La composición de conformidad con la reivindicación 149, caracterizada porque el replicón de alfavirus contiene una primera secuencia de nucleótidos que codifica para un primer antígeno y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica para un segundo antígeno, en donde la primera secuencia de nucleótidos y la segunda secuencia de nucleótidos están enlazadas operativamente a elementos de control . 151. La composición de conformidad con la reivindicación 150, caracterizada porque la primera secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un primer elemento de control y la segunda secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente a un segundo elemento de control . 152. La composición de conformidad con la reivindicación 150 ó 151, caracterizada porque además comprende una tercera secuencia de nucleótidos que codifica para una tercera proteína o fragmento de la misma, en donde la tercera secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente a un elemento de control . 153. La composición de conformidad con la reivindicación 152, caracterizada porque la tercera secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente a un tercer elemento de control . 154. La composición de conformidad con la reivindicación 152 ó 153, caracterizada porque además comprende una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica para una cuarta proteína o fragmento de la misma, en donde la cuarta secuencia de nucleótidos está enlazada opera ivamente a un elemento de control . 155. La composición de conformidad con la reivindicación 154, caracterizada porque la cuarta secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente a un cuarto elemento de control. 156. La composición de conformidad con la reivindicación 154 ó 155, caracterizada porque además comprende una quinta secuencia de nucleótidos que codifica para una quinta proteína o fragmento de la misma, en donde la quinta secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente a un elemento de control . 157. La composición de conformidad con la reivindicación 156, caracterizada porque la quinta secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente a un quinto elemento de control . 158. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 150-157, caracterizada porque los elementos de control se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un promotor subgenómico, un IRES, y un sitio 2A viral . 159. Un método para generar una respuesta inmunitaria en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar a un sujeto que lo requiera la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 121-144. 160. El método de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque la cantidad total del lípido catiónico administrada al sujeto en una única administración es no más de aproximadamente 30 mg. 161. El método de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque la cantidad total de DOTAP administrada al sujeto en una única administración es no más de aproximadamente 24 mg. 162. El método de conformidad con la reivindicación 159, caracterizado porque la cantidad total de DOTAP administrada al sujeto en una única administración e no más de aproximadamente 4 mg. 163. La emulsión de aceite en agua o 1 composición de conformidad con cualquiera de la reivindicaciones 1-18, 21-43, 61-83, 85-95, 100-118, 121-14 ó 147-158, caracterizada porque además comprende u antioxidante .
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